特表 2024-520019 腸オルガノイド製造用培地組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】腸オルガノイド製造用培地組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240514BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/38 20150101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12Q1/02

A61P1/04

A61P1/00

A61K35/38

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572875

(86)(22)【出願日】2022-11-11

(85)【翻訳文提出日】2023-11-24

(86)【国際出願番号】 KR2022017750

(87)【国際公開番号】W WO2023191225

(87)【国際公開日】2023-10-05

(31)【優先権主張番号】10-2022-0039992

(32)【優先日】2022-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519427985

【氏名又は名称】オルガノイドサイエンシーズ・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＯＲＧＡＮＯＩＤＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】（ＳＡＭＰＹＥＯＮＧ－ＤＯＮＧ， ＫＯＲＥＡ ＰＡＰＥＲＬＥＳＳ ＴＲＡＤＥ ＣＥＮＴＥＲ）， ６Ｆ， ３３８ ＰＡＮＧＹＯ－ＲＯ， ＢＵＮＤＡＮＧ－ＧＵ， ＳＥＯＮＧＮＡＭ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＧＩ－ＤＯ， １３４９３， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ヒョギョン

(72)【発明者】

【氏名】チェ，スヒ

(72)【発明者】

【氏名】カン，ウンソ

(72)【発明者】

【氏名】タク，ジ・ヘ

(72)【発明者】

【氏名】パク，ジュン‐ヒョク

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヨン‐イル

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS36

4B063QS40

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BB19

4B065BC50

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB50

4C087MA65

4C087NA20

4C087ZA66

4C087ZA68

(57)【要約】

本発明は、腸オルガノイド製造用培地組成物に関する。また、本発明は、前記培地組成物で培養するステップを含む腸オルガノイドの製造方法、および前記製造方法で製造された腸オルガノイドに関する。本発明の腸オルガノイド製造用培地は、腸オルガノイドの増殖を促進し、腸オルガノイドの幹細胞能を保持させることができる。したがって、前記培地は、優れた品質の腸オルガノイドを多い量で製造することに活用されることができ、前記培地で製造された腸オルガノイドは、腸関連疾患の予防または治療製剤、または腸関連疾患の動物実験モデルに対する代替案などとして活用されることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む、腸オルガノイド製造用培地組成物。

【請求項2】

前記腸オルガノイドは、ＰＴＫ７（チロシンプロテインキナーゼ様７）を発現するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記組成物は、基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ）をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記基本培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、α－ＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはアドバンスト（Ａｄｖａｎｃｅｄ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物は、ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、アムホテリシン（Ａｍｐｏｔｅｒｉｃｉｎ）およびストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）からなる群より選択される一つ以上の抗生剤をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物は、ＩＧＦ１をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

請求項１に記載の培地組成物で個体から分離した腸由来細胞を培養するステップを含む、腸オルガノイドの製造方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法で製造された、腸オルガノイド。

【請求項9】

請求項８に記載の腸オルガノイドを含む、腸疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項10】

前記腸疾患は、炎症性腸疾患、炎症性腸疾患による潰瘍および炎症性腸疾患による瘻孔からなる群より選択される一つ以上である、請求項９に記載の薬学組成物。

【請求項11】

前記炎症性腸疾患は、放射線性大腸炎、放射線性直腸炎、虚血性大腸炎、ベーチェット大腸炎、クローン病、潰瘍性大腸炎および潰瘍性直腸炎からなる群より選択される一つ以上である、請求項１０に記載の薬学組成物。

【請求項12】

前記瘻孔は、痔瘻および腸皮瘻からなる群より選択される一つ以上である、請求項１０に記載の薬学組成物。

【請求項13】

請求項８に記載の腸オルガノイドを利用して薬物の効能を評価する、方法。

【請求項14】

前記薬物は、腸疾患の予防または治療用薬剤である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

請求項８に記載の腸オルガノイドを含む、薬物効能評価システム。

【請求項16】

請求項８に記載の腸オルガノイドを利用して薬物をスクリーニングする、方法。

【請求項17】

前記薬物は、腸疾患の予防または治療用薬剤である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

請求項８に記載の腸オルガノイドを含む、薬物スクリーニングシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸オルガノイド製造用培地組成物に関する。また、本発明は、前記培地組成物で培養するステップを含む腸オルガノイドの製造方法、および前記製造方法で製造された腸オルガノイドに関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は、特有の分化能力（ｍｕｌｔｉ－ｐｏｔｅｎｃｙ）と自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）特徴を有していることにより、これを不治の病の治療、疾病モデリング、組織または器官の移植などに多様に活用するための研究が弛まず進められている。特に、幹細胞を適切な３次元試験管環境で培養する場合、生体内器官と類似した構造および組織特性を有する細胞塊が形成されるという事実が明らかになり、このような細胞塊は、オルガノイドと命名される。

【0003】

オルガノイドの作製技術は、理論的に幹細胞だけで殆どすべての種類の臓器を作製することができるため、多様な疾病の治療剤開発に活用されると期待されている。オルガノイドは、２次元で作った細胞組織より新薬の安全性と効能を試験するのにさらに効果的であり得、損傷されるか、十分に発達されていない臓器に移植されることで、状態を改善するのに活用することができるとされている。これにより、最近、再生医学観点でもオルガノイド関連研究がより活発になる傾向にあり、様々な分野にオルガノイドを広く利用することができると見込まれている。

【0004】

しかし、オルガノイドの製造および培養技術は、まだ研究初期段階水準であって、培地添加物質の組み合わせまたは割合を確立するなど、各器官に対して特異的な培地組成物およびこれを活用したオルガノイドの製造方法に対する多様な研究および開発が依然として要求されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者らは、優れた品質の腸オルガノイドを効率的に製造するための多様な研究を進めた。その結果、多様な培地成分のなかでも、腸オルガノイドの増殖促進および幹細胞能保持を極大化させ得る特定組み合わせを確認し、その効果を実験的に立証することにより、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明において開示されたそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用されることができる。すなわち、本発明において開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述された具体的な叙述によって、本発明の範疇が制限されるものと認められない。

【0007】

また、本明細書において、特に定義されない用語に対しては、本発明の属する技術分野において通常的に使用される意味を有するものと理解されなければならない。また、文脈上特に定義しない場合であれば、単数は複数を含み、複数は単数を含む。

【0008】

本発明の一様態は、ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む、腸オルガノイド製造用培地組成物を提供する。

【0009】

本発明の培地組成物は、腸オルガノイドの増殖を促進して数多くの腸オルガノイドを形成させることができ、形成された殆どの腸オルガノイドが幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を保持することができるようにする。このように培養して調製される腸オルガノイドは、再生治療剤、細胞治療剤、薬物スクリーニング、薬物評価などの多様な分野で適用されることができる。

【0010】

本明細書において使用される用語「オルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉｄ）」は、３Ｄ立体構造を有する細胞塊を意味する。動物などから収集、取得、採取せず人工的な培養過程を通じて製造したものであって、縮小し且つ単純化されたバージョンの器官と定義される。本発明によるオルガノイドは、腸オルガノイドであってよく、前記腸オルガノイドは、小腸オルガノイド、十二指腸オルガノイド、大腸オルガノイド、直腸オルガノイドまたは結腸オルガノイドであってよいが、これに制限されない。

【0011】

本明細書において使用される用語「ＨＧＦ」は、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）を意味し、そのタンパク質配列などに対する情報は、公知になっているデータベース（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００５９２、ＮＰ＿００１０１０９３１、ＮＰ＿００１０１０９３２、ＮＰ＿００１０１０９３３、ＮＰ＿００１０１０９３４）などを通じて確認することができる。前記ＨＧＦは、本発明の培地組成物に１～１００ｎｇ／ｍｌの濃度、より具体的に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれることができるが、これに制限されない。

【0012】

本明細書において使用される用語「ＮＲＧ１」は、ＮＲＧ１遺伝子によってコードされるニューレグリン１（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ １）タンパク質を意味する。そのタンパク質配列などに対する情報は、公知になっているデータベース（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１５３４６７、ＮＰ＿００１１５３４６８、ＮＰ＿００１１５３４７１、ＮＰ＿００１１５３４７３、ＮＰ＿００１１５３４７４）などを通じて確認することができる。前記ＮＲＧ１は、本発明の培地組成物に５０～１５０ｎｇ／ｍｌの濃度、より具体的に１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれることができるが、これに制限されない。

【0013】

本発明においては、前記ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む培地で腸オルガノイドを培養する場合、腸オルガノイドの増殖が促進され、取得できる腸オルガノイドの数が顕著に増加し、同時に、形成された殆どのオルガノイドが幹細胞能を保持するなどの腸オルガノイドの製造効果に優れることを確認した。

【0014】

具体的に、本発明による腸オルガノイドは、ＰＴＫ７（チロシンプロテインキナーゼ様７：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ７）を発現するものであってよい。

【0015】

本明細書において使用される用語「ＰＴＫ７（チロシンプロテインキナーゼ様７：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ７）」は、幹細胞マーカーとして使用される遺伝子を意味し、ＰＴＫ７を発現する腸オルガノイドは、高い自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）および再播種（ｒｅ－ｓｅｅｄｉｎｇ）能力を有するなどの幹細胞能を示すと知られている（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５ Ｄｅｃ ８；５（６）：９７９－９８７．）。

【0016】

また、本発明の腸オルガノイド製造用培地組成物は、ＩＧＦ１をさらに含むことができる。

【0017】

本明細書において使用される用語「ＩＧＦ１」は、ＩＧＦ１遺伝子によってコードされるインスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）タンパク質を意味する。そのタンパク質配列などに対する情報は、公知になっているデータベース（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００６０９．１、ＮＰ＿００１１０４７５３．１、ＮＰ＿００１１０４７５４．１、ＮＰ＿００１１０４７５５．１、ＸＰ＿０１６８７４７４８．１、ＸＰ＿０１６８７４７５０．１、ＸＰ＿０１６８７４７５１．１、ＸＰ＿０１６８７４７５２．１）などを通じて確認することができる。前記ＩＧＦ１は、本発明の培地組成物に５０～１００ｎｇ／ｍｌの濃度、より具体的に１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれることができるが、これに制限されない。

【0018】

前記ＨＧＦ、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１の入手経路は、特に制限されない。例えば、市販される物質を使用するか、当業界に公知になっている方法によって遺伝子（タンパク質）組換え技術を使用して製造することができる。

【0019】

本発明において、前記腸オルガノイドは、７継代以上培養されるか、９継代以上培養されるか、または１５継代以上培養されるものであってよい。また、前記腸オルガノイドは、２０継代以上培養されるものであってよい。

【0020】

本明細書において使用される用語「継代」は、細胞またはオルガノイドを健康な状態に持続的に長期培養するために細胞の代を引き続き培養する方法において、培養容器を取り替えることまたは細胞群を分けて培養することを意味する。１継代は、１回培養容器を取り替えるか、または１回細胞群を分けて培養することであり、２０継代は、２０回培養容器を取り替えるか、または２０回細胞群を分けて培養することである。継代が増加するほど数多くのオルガノイドを取得することができるが、既存の当業界において使用されていた培養培地は、継代が増加するほどオルガノイドを構成する細胞が死滅して長期間の培養が不可能となる問題点があった。本発明によるＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む培地組成物は、腸オルガノイドを２０継代以上長期培養することができる。本明細書において、前記「継代」は、「世代」と相互交換的に使用され得る。

【0021】

本明細書において使用される用語「培地」は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞またはオルガノイドの成長、生存、拡張または分化を可能にする栄養物質の混合物を意味し、当業界において使用される適切な通常の培地をすべて含む。細胞またはオルガノイドの種類によって当業界の技術的水準で培地の種類と培養条件を選択することができる。前記培地は、炭素源、窒素源および微量元素を含む細胞培養用基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ）であってよく、具体的な例として、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ´ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（最少必須培地：Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（イーグル基礎培地：Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、α－ＭＥＭ（α－最少必須培地：α－Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（グラスゴー最少必須培地：Ｇｌａｓｇｏｗ´ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（イフコフ改変ダルベッコ培地：Ｉｓｃｏｖｅ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）またはアドバンスト（Ａｄｖａｎｃｅｄ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２であってよいが、これに制限されるものではない。

【0022】

オルガノイド製造方法に対する当業界の従来技術は、成分がそれぞれ異なる最小２種類の培養培地を使用している。例として、培養初期には、オルガノイドを形成させ、サイズなどを成長させるための成長培地を使用し、以後、前記成長培地を除去した後にオルガノイドの数を増加させるための拡張培地を使用した。しかし、互いに異なる成分の培養培地を２種類以上使用する既存のオルガノイド製造方法は、費用が多くかかり、製造工程が複雑になる短所があった。

【0023】

また、オルガノイドは、その特性上、培養条件によって製造結果が顕著に変わる特徴を有する。培養条件の例として、培養日、培養温度、培養培地、培養基質などの培養条件がオルガノイドの特性を決定する重要な要因であり、その中でも培地条件が幹細胞に多様なシグナル伝達経路を調節することで、オルガノイドが所望の組織または器官と類似した特性を有するように成長させるのに最も大きい役割を遂行する。

【0024】

本発明においては、実際の組織と形態および機能が非常に類似し、特に、増殖能および幹細胞能が増加して、再生治療剤、薬物スクリーニング、薬物評価などに活用することができる程度で十分な数の腸オルガノイドを取得することができる特定培地条件は、ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含むものであることを確認した。さらに、前記培養培地を使用する場合には、２種類以上の培養培地を使用せず、１種類の培養培地のみを使用しても、腸オルガノイドの形成、成長および拡張を成功的に誘導することができることを確認した。

【0025】

本明細書において、「製造用」は、「培養用」と同じ意味で相互交換的に使用することができる。したがって、前記腸オルガノイドの製造用培地組成物は、腸オルガノイドの培養用培地組成物であってよく、また腸オルガノイドの形成用培地組成物であってよく、また腸オルガノイドの拡張用培地組成物であってよい。このとき、前記「形成用」は、腸由来細胞で腸オルガノイドを形成することを意味し、腸の固有の機能を遂行することができるように器官または組織特性を示すことを意味する。また、前記「拡張用」は、形成された腸オルガノイドの数を増加させることで、目的とする用途で使用できる十分な量を取得するためのものであって、２世代以上の継代培養が可能であることを意味する。

【0026】

本発明において、前記培地組成物は、抗生剤をさらに含むものであってよく、前記抗生剤は、当業界で細胞またはオルガノイドの培養に使用される適切な通常の抗生剤をすべて含む。具体的な例として、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、アムホテリシン（ａｍｐｏｔｅｒｉｃｉｎ）、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）およびストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）からなる群より選択される一つ以上であってよいが、これに制限されない。

【0027】

本発明の他の一様態は、前記培地組成物で個体から分離した腸由来細胞を培養するステップを含む、腸オルガノイドの製造方法を提供する。

【0028】

本発明による腸オルガノイドの製造方法において、各用語は、特に言及しない限り、前記腸オルガノイドの製造用培地組成物において説明したところと同じ意味を有する。

【0029】

本明細書において使用される用語「個体」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物などを制限なく含むことができる。前記非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、犬、牛、馬、豚、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどであってよい。本明細書において、前記「個体」は、「対象体」または「患者」と相互交換的に使用されることができる。

【0030】

前記分離した腸由来細胞は、小腸または大腸の腸組織を切断する過程と酵素分解過程を通じて分離されるものであってよい。具体的に、前記切断は、物理的な切断または機械的な切断をすべて含み、当業界に知られている一般的な組織の切断方法で遂行されることができる。また、前記酵素分解は、当業界に知られている一般的な酵素分解条件で遂行されることができ、例として、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）ＩＩ、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）Ｉおよびコラーゲン分解酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）ＩＩからなる群より選択された一つ以上の酵素を使用して遂行されることができる。

【0031】

本発明において、前記培養は、２０継代以上培養するものであってよく、前記１継代は、１～１０日間遂行されるものであってよい。

【0032】

本発明のまた他の一様態は、前記腸オルガノイドの製造方法で製造された、腸オルガノイドを提供する。

【0033】

本発明による腸オルガノイドにおいて、各用語は、特に言及しない限り、前記腸オルガノイドの製造用培地組成物において説明したところと同じ意味を有する。

【0034】

本発明による腸オルガノイドは、幹細胞能を保持しており、ヒトの腸と非常に類似した組織学的構成および機能を有しているため、生体内に投与される場合、腸の損傷された部位に生着されて、これを再生させることができる。したがって、前記腸オルガノイドは、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット腸炎、直腸炎などの炎症性腸疾患、または前記炎症性腸疾患による潰瘍または瘻孔などの腸関連疾患の予防または治療製剤として使用されることができ、また、腸関連疾患の動物実験モデルに対する代替案として使用されることができる。

【0035】

本明細書において使用される用語「治療」は、本発明による腸オルガノイドの移植または投与によって腸関連症状が好転するか、または完治されるすべての行為を意味する。また、用語「予防」は、本発明による腸オルガノイドの移植または投与によって腸関連症状を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。

【0036】

本発明のまた他の一様態は、前記腸オルガノイドを含む、腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0037】

本発明による薬学組成物において、各用語は、特に言及しない限り、前記腸オルガノイドの製造用培地組成物において説明したところと同じ意味を有する。

【0038】

本発明による薬学組成物は、再生治療剤または細胞治療剤組成物であってよい。

【0039】

本明細書において使用される用語「再生治療剤」は、損傷された人体細胞、組織または臓器を代替するか、または再生することで、正常機能を修復するか、または新たに作り出す治療剤を意味する。本明細書において使用される用語「細胞治療剤」は、再生治療剤の１種類であって、生きている自己（ａｕｔｏｌｏｇｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を予防、治療または診断などの目的で製造した医薬品を意味する。前記細胞治療剤は、損傷されるか、または欠損された細胞または組織の再生用途で使用されることができ、損傷されるか、または欠損された細胞または組織の機能および形態を修復させるために使用されることができる。

【0040】

本発明による薬学組成物は、腸オルガノイドを有効量で含み、腸疾患の予防または治療を必要とする対象体に投与されることができる。

【0041】

本発明の薬学組成物が予防または治療することができる腸疾患には、例えば、炎症性腸疾患、炎症性腸疾患による潰瘍および炎症性腸疾患による瘻孔（ｆｉｓｔｕｌａ）からなる群より選択される一つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。また、前記炎症性腸疾患は、放射線性大腸炎（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｃｏｌｉｔｉｓ）、放射線性直腸炎（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｔｉｔｉｓ）、虚血性大腸炎（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット腸炎（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂｅｈｃｅｔ´ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ´ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）および潰瘍性直腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｔｉｔｉｓ）からなる群より選択される一つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。また、前記潰瘍および瘻孔は、炎症性腸疾患によって発生する合併症であって、前記瘻孔は、痔瘻（Ａｎａｌ ｆｉｓｔｕｌａ）および腸皮瘻（ｅｎｔｅｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｆｉｓｔｕｌａ）からなる群より選択される一つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。

【0042】

一方、前記有効量は、「治療有効量」または「予防有効量」であってよい。用語「治療有効量」は、薬物または治療剤が単独でまたは他の治療剤と組み合わされて使用される場合に、疾患症状の重症度減少、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患苦痛による損傷または障害の防止を示すことができる任意の量を意味する。用語「予防有効量」は、個体で腸疾患の発生または再発を抑制する任意の量を意味する。前記有効量の水準は、対象体の重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られている要素などによって決定できる。

【0043】

用語「投与」は、関連技術分野における通常の技術者にとって公知になっている多様な方法および伝達システムのうち任意のものを使用して組成物を対象体に物理的に導入することを意味する。本発明の薬学組成物のための投与経路は、例えば、粘膜下投与、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入による投与経路を含むが、これに制限されるものではない。また、前記投与は、カテーテルのような装置を利用した非外科的投与が可能であり、疾患部位切開後に注入または移植などの外科的投与方法のいずれも可能である。本発明の組成物のための投与回数は、例えば、単回、複数回、または一つ以上の延長された期間にわたって遂行されることができる。

【0044】

本発明の薬学組成物は、対象体の年齢、性別、体重によって変わり、具体的に対象体の症状によって前記薬学組成物を一日単回～数回投与するか、または数日～数ヶ月間隔で投与することができる。また、その投与量は、本発明の薬学組成物に含まれた腸オルガノイドが５×１０^５個／ｃｍ^２～５×１０^６個／ｃｍ^２の細胞数で投与されるように調節することができるが、これに制限されるものではなく、投与経路、疾病の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されることができる。

【0045】

本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常的に使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでよい。組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤は、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アラビアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油であってよいが、これに制限されない。

【0046】

本発明の薬学組成物は、他の治療剤と併用して投与されることができる。この場合、本発明の薬学組成物と他の治療剤は、同時に、順次に、または個別的に投与されることができる。前記他の治療剤は、腸疾患の予防、治療および改善効果を有する化合物、タンパク質などの薬物であってよいが、これに制限されるものではない。

【0047】

また、本発明の薬学組成物は、他の治療剤と同時に、順次に、または個別的に投与されるように剤形化されることができる。例えば、腸オルガノイドおよび他の治療剤は、一つの製剤に同時に投与されてよく、または別個の製剤に同時に、順次にまたは個別的に投与されてよい。同時に、順次にまたは個別的に投与するために、本発明の薬学組成物に含まれる腸オルガノイドおよび他の治療剤は、それぞれ別途の容器に分離させて剤形化するか、または同じ容器で共に剤形化してよい。また、本発明の薬学組成物に含まれる腸オルガノイドおよび他の治療剤は、薬学的有効量、投与時間、投与間隔、投与経路、治療期間などが互いに同一であるか、または異なってよい。

【0048】

本発明の他の一様態は、腸疾患の予防または治療を必要とする対象体に前記腸オルガノイドを投与するステップを含む、腸疾患の予防または治療方法を提供する。

【0049】

本発明による腸疾患の予防または治療方法において、各用語は、特に言及しない限り、前記腸オルガノイドの製造用培地組成物および前記腸疾患の予防または治療用薬学組成物において説明したところと同じ意味を有する。

【0050】

本発明による腸疾患の予防または治療方法において、前記腸オルガノイドは、他の治療剤と同時に、順次に、または個別的に対象体に投与されてよい。

【0051】

前記「同時」投与は、腸オルガノイドおよび他の治療剤を一つの製剤に一度に投与することを意味する。または、腸オルガノイドおよび他の治療剤を別途の製剤に一度に投与することを意味し、この場合、腸オルガノイドおよび他の治療剤の投与経路は、互いに異なってよい。

【0052】

前記「順次」投与は、腸オルガノイドおよび他の治療剤を比較的連続的に投与することを意味し、投与間隔に消耗する時間として可能な最小限の時間を許諾する。

【0053】

前記「個別的」投与は、腸オルガノイドおよび他の治療剤を、一定時間間隔を置いて投与することを意味する。前記腸オルガノイドおよび他の治療剤の投与方法は、対象体の治療効能、副作用などを考慮して、当業界の医師または専門家が適切に選択することができる。

【0054】

本明細書において使用される単語は、単数または複数の意味を含む。例えば、「成分」は、一つの成分または一つ以上の成分を意味する。

【発明の効果】

【0055】

本発明の腸オルガノイド製造用培地は、腸オルガノイドの増殖を促進し、腸オルガノイドの幹細胞能を保持させることができる。したがって、前記培地は、優れた品質の腸オルガノイドを多い量で製造することに活用されることができ、前記培地で製造された腸オルガノイドは、腸関連疾患の予防または治療製剤、または腸関連疾患の動物実験モデルに対する代替案などとして活用されることができる。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】互いに異なる成分の培地で製造された腸オルガノイドの様子を示すイメージである。「Ａｌｌ」は、ＨＧＦ、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む培地、「－ＨＧＦ」は、ＨＧＦを除いて、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む培地、「－ＮＲＧ１」は、ＮＲＧ１を除いて、ＨＧＦおよびＩＧＦ１を含む培地、「－ＩＧＦ１」は、ＩＧＦ１を除いて、ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む培地を意味する（下記図２～５においても同一）。

【図2】互いに異なる成分の培地で製造された腸オルガノイドの数を示すグラフであって、３０日以内の短期培養結果に関する。

【図3】互いに異なる成分の培地で製造された腸オルガノイドの数を示すグラフであって、３７日～５５日の長期培養結果に関する。

【図4】互いに異なる成分の培地で製造された腸オルガノイドの幹細胞能を示すグラフであって、ＰＴＫ遺伝子を発現する腸オルガノイドの割合に関する。前記腸オルガノイドは、計５５日（５継代８日）間培養された。

【図5】互いに異なる成分の培地で製造された腸オルガノイドの幹細胞能を示すグラフであって、腸オルガノイドの物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）に関する。図５Ａは、腸オルガノイドの物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）を示すイメージであり、図５Ｂは、前記図５Ａに示された物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）を測定した結果を示すグラフである。前記腸オルガノイドは、計５５日（５継代８日）間培養された。

【図6】ＨＧＦ、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む培地（「Ａｌｌ」）で培養されたオルガノイドの遺伝学的安定性検査のうち一つである核型分析（Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）結果を示すイメージである。７継代、９継代、１５継代または２０継代培養されたオルガノイドに対して核型を分析した。

【発明を実施するための形態】

【0057】

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されない。

【0058】

実施例１．腸オルガノイド製造用培地組成物の製造
腸オルガノイドを効率的に培養するための培地組成物を開発するために、基本培地としてアドバンスト（Ａｄｖａｎｃｅｄ）ＤＭＥＭ Ｆ／１２を使用し、ＨＧＦ、ＮＲＧ１またはＩＧＦ１を含んでいるか否かによって、次のように実験群を分けた。ここで、ＨＧＦは５０ｎｇ／ｍｌ、ＮＲＧ１は１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ１は１００ｎｇ／ｍｌで使用した。
（１）「Ａｌｌ」：ＨＧＦ、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む
（２）「－ＨＧＦ」：ＨＧＦを除いて、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む
（３）「－ＮＲＧ１」：ＮＲＧ１を除いて、ＨＧＦおよびＩＧＦ１を含む
（４）「－ＩＧＦ１」：ＩＧＦ１を除いて、ＨＧＦおよびＮＲＧ１を含む

【0059】

以後、内視鏡を通じて採取した患者の腸組織または手術を通じて得た腸組織を洗浄液で３回以上洗浄した。洗浄した腸組織に対して、３７℃、１５分間１Ｘ ＴｒｙｐＬＥで処理し、ＤＰＢＳに混合した０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン：ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を腸組織にさらに処理してピペッティングすることで、腸幹細胞が含まれたクリプト（Ｃｒｙｐｔ）を分離した。分離したクリプトを７０μｍ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒに通過させた後、遠心分離した。以後、前記取得したクリプトを細胞外基質（コラーゲン）とともに１：１で混合して３次元形態で培養し、１継代当たり４～７日間、計７継代間３次元培養した。

【0060】

実施例２．培地組成物造成によるオルガノイドの培養結果
下記実施例２－１～２－４を通じて、前記培地組成物を構成する多様な成分のうちから、如何なる成分がオルガノイドの培養に最も効果的且つ必須的であるかを確認した。

【0061】

実施例２－１．製造されたオルガノイド数の比較
前記実施例１によって各培地成分で製造された腸オルガノイドの数を比較した。本実施例においては、再生治療剤、薬物スクリーニング、薬物評価などの目的で使用できる程度に十分な数のオルガノイドが製造されるか否かを分析した。

【0062】

その結果、図１～３から見られるように、ＮＲＧ１を含まない培地（「－ＮＲＧ１」）を使用する場合には、オルガノイドが培養開始後４日までのみ成長し、培養開始後１３日が経過するとこれ以上成長せず、すべて死滅することを確認した。

【0063】

また、ＨＧＦを含まない培地（「－ＨＧＦ」）を使用する場合には、オルガノイドが培養開始後５５日（５継代８日）までの長時間にわたって成長が可能であるが、製造されるオルガノイドの数はすべての成分を含む培地（「Ａｌｌ」）に比べて約１／１０程度に減少することを確認した。一方、図１のイメージでは、「－ＨＧＦ」の場合、培養開始３０日後から培養開始５５日まで対照群である「Ａｌｌ」よりオルガノイドの数がさらに増加するように見える。しかし、「－ＨＧＦ」で撮影されたオルガノイドの殆どは、死滅されたものであって、イメージ撮影後に遂行した継代培養時に死滅および分化されたオルガノイドをウォッシュアウト（ｗａｓｈ－ｏｕｔ）し、生存したオルガノイドの数だけ測定して、グラフで示した（図２および３）。

【0064】

また、ＩＧＦ１を含まない培地（「－ＩＧＦ１」）を使用する場合には、オルガノイドが培養開始後５５日（５継代８日）までの長時間にわたって成長が可能であり、製造されるオルガノイドの数は、すべての成分を含む培地（「Ａｌｌ」）と類似した程度であることを確認した。

【0065】

前記結果は、培養時に腸オルガノイドの増殖を促進して、数多くの腸オルガノイドを確保するためには、ＮＲＧ１およびＨＧＦが必須成分であることを示唆する。

【0066】

実施例２－２．幹細胞マーカー発現量の比較
前記実施例１によって各培地成分で製造された腸オルガノイドにおいて、幹細胞マーカー遺伝子の発現量を比較した。本実施例においては、長期間（計５５日、５継代８日）の培養にもオルガノイドが幹細胞能を保持するか否かを分析し、これのために幹細胞マーカーとしてＰＴＫ７（チロシンプロテインキナーゼ様７：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ ７）を使用した。ＰＴＫ７を発現する腸オルガノイドは、高い自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）および再播種（ｒｅ－ｓｅｅｄｉｎｇ）能力を有することが知られている（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５ Ｄｅｃ ８；５（６）：９７９－９８７）。

【0067】

【表1】

【0068】

その結果、前記表１および図４から見られるように、ＨＧＦを含まない培地（「－ＨＧＦ」）を使用する場合には、製造された総オルガノイドのうちからＰＴＫ７を発現するオルガノイドの割合が約７５．４％であることを確認した。一方、ＩＧＦ１を含まない培地（「－ＩＧＦ１」）を使用する場合には、製造された総オルガノイドのうちからＰＴＫ７を発現するオルガノイドの割合が約９３．６％であって、製造された殆どのオルガノイド幹細胞能を依然として保持していることを確認した。

【0069】

一方、ＮＲＧ１を含まない培地（「－ＮＲＧ１」）を使用する場合には、オルガノイドが成長せずにすべて死滅するため、幹細胞マーカーの発現量を分析していない。

【0070】

前記結果は、長期間の培養にも一般細胞に分化されず、依然として幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を示す腸オルガノイドを確保するためには、ＨＧＦが必須培地成分であることを示唆する。

【0071】

実施例２－３．分化程度の比較
前記実施例１によって各培地成分で製造された腸オルガノイドの分化程度を比較した。

【0072】

本実施例においては、長期間（計５５日、５継代８日）の培養時にオルガノイドが幹細胞能を喪失し、一般細胞に分化されるか否かを分析した。これのために、オルガノイドのサイズ（周り）を意味する物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）を測定し、基本的に物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）が増加する場合、オルガノイドが成長すると分析することができるが、下記条件では、一般細胞に分化されたと判断した。幹細胞能を保持するオルガノイドは、３次元のスフェア（ｓｐｈｅｒｅ）形態で増殖するが、分化しながら３次元構造の出芽型（Ｂｕｄｄｉｎｇ）形態をなすようになり、完全に分化する場合、２次元形態で培養容器に付いて付着して成長するようになる。２次元形態で培養容器に付着されたオルガノイドは、３次元のスフェア形態のオルガノイドよりそのサイズがさらに大きく測定されるので、物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）が一定基準以上増加する場合、オルガノイドの分化が誘導されたものと判断した。このとき、物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）は、Ｂｉｏｔｅｋ装備の分析プログラムを通じて測定した。

【0073】

その結果、前記図５のＡおよびＢから見られるように、ＨＧＦを含まない培地（「－ＨＧＦ」）を使用する場合には、製造されたオルガノイドの物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）がすべての成分を含む培地（「Ａｌｌ」）に比べて約１．５倍程度に増加した。すなわち、ＨＧＦを含まない培地は、他の培地に比べて腸オルガノイドを幹細胞から一般細胞に分化させる程度が高さを確認した。ただし、２次元形態で培養容器に付着されて成長する腸オルガノイドは、放射形を示す凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）に分化することにより、物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）が限りなく増加することはない（図５のＡにおいて、「－ＨＧＦ」イメージの左側下段は凝集体を示す）。

【0074】

一方、ＩＧＦ１を含まない培地（「－ＩＧＦ１」）を使用する場合には、製造されたオルガノイドの物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）がすべての成分を含む培地（「Ａｌｌ」）と類似した。すなわち、ＩＧＦ１を含まない培地は、他の培地に比べて腸オルガノイドを幹細胞から一般細胞に分化させる程度が低いことを確認した。

【0075】

一方、ＮＲＧ１を含まない培地（「－ＮＲＧ１」）を使用する場合には、オルガノイドが成長せずにすべて死滅するため、物体領域（Ｏｂｊｅｃｔ Ａｒｅａ）を分析していない。

【0076】

前記結果は、長期間の培養にも一般細胞に分化されずに、依然として幹細胞能を示す腸オルガノイドを確保するためには、ＨＧＦが必須培地成分であることを示唆する。

【0077】

以上、実施例２－１～２－３の結果を総合した結果、数多くの腸オルガノイドを確保し、また製造された腸オルガノイドが長期培養されても、幹細胞能を保持するためには、腸オルガノイド製造用培地組成物にＨＧＦおよびＮＲＧ１が必須的な成分として含まれなければならないことを確認することができる。

【0078】

実施例２－４．核型分析（Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）結果
本発明による培養培地の遺伝学的安定性を確認するために、培養基間中に一定継代ごとにオルガノイドの核型分析（Ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）を進行した。

【0079】

具体的に、７継代、９継代、１５継代または２０継代の培養が進行されているオルガノイドに対して、当業界に知られている方法によって核型分析を遂行した。

【0080】

図６は、すべての成分を含む培地（「Ａｌｌ」）で培養されたオルガノイドの検査結果を示すものである。７継代、９継代、１５継代または２０継代培養されたオルガノイドで染色体の数的および構造的異常または遺伝子改変がないことを確認し、腫瘍に転換されなかったことを確認した。

【0081】

前記結果は、ＨＧＦ、ＮＲＧ１およびＩＧＦ１を含む培地は、培養されたオルガノイドに遺伝的に否定的な影響を及ぼさず、遺伝学的安定性を保持しながら長期培養が可能であることを示唆する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】