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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ヘキソキナーゼ由来のペプチドおよびその治療的使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240514BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240514BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240514BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240514BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240514BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240514BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K14/435 ZNA
C12N15/85 Z
A61P25/00
A61P9/10
A61P35/00
A61P3/10
A61P17/00
A61P1/16
A61P25/02
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
A61K38/10
A61K38/08
C12N15/12
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573058
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2024-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2022064320
(87)【国際公開番号】W WO2022248615
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】21305690.6
(32)【優先日】2021-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513246469
【氏名又は名称】インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
(71)【出願人】
【識別番号】515011944
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ
(71)【出願人】
【識別番号】523444040
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドゥ ペルピニャン ヴィア ドミティア
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＰＥＲＰＩＧＮＡＮ ＶＩＡ ＤＯＭＩＴＩＡ
(71)【出願人】
【識別番号】518027472
【氏名又は名称】エコール プラティーク デ オート エチュード
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＰＲＡＴＩＱＵＥ ｄｅｓ ＨＡＵＴＥＳ ＥＴＵＤＥＳ
(71)【出願人】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(74)【代理人】
【識別番号】100179648
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 咲江
(74)【代理人】
【識別番号】100222885
【弁理士】
【氏名又は名称】早川 康
(74)【代理人】
【識別番号】100140338
【弁理士】
【氏名又は名称】竹内 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100227695
【弁理士】
【氏名又は名称】有川 智章
(74)【代理人】
【識別番号】100170896
【弁理士】
【氏名又は名称】寺薗 健一
(74)【代理人】
【識別番号】100219313
【弁理士】
【氏名又は名称】米口 麻子
(74)【代理人】
【識別番号】100161610
【弁理士】
【氏名又は名称】藤野 香子
(72)【発明者】
【氏名】トリコー，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】アンギンベール，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】ゴーティエ，ブノワ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA16
4C084ZA20
4C084ZA36
4C084ZA75
4C084ZA89
4C084ZB26
4C084ZC35
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA40
4H045EA21
4H045EA27
4H045FA74
(57)【要約】
本発明者らは以前、ミトコンドリアＶＤＡＣ１が、ＭＡＰＫ経路を介したシュワン細胞の脱髄、並びに坐骨神経損傷、糖尿病性ニューロパチーおよびＣＭＴ１Ａ後のｃ－ｊｕｎ活性化を直接誘導することを実証した。彼らは、ＶＤＡＣ１の遮断によるミトコンドリアのカルシウム放出の減少が、ｉｎｖｉｖｏでの脱髄シュワン細胞の数を大幅に減少させ、糖尿病、ギラン・バレー症候群、およびシャルコー・マリー・トゥース病モデルにおける神経伝導並びに神経筋活動を改善することを発見した。本明細書において、発明者らは、欠失研究によって完了したａｌａスキャンを通じて、Ｎ末端ＨＫ－１ヘリックスの結合領域を正確にマッピングした。さらに、ヘリックス誘導剤として知られるα－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）による非必須アミノ酸の置換によるヘリックスの安定化を通じて、ＨＫ由来ペプチドを最適化した。さらに、彼らは、ペプチドの効力を決定することを可能にするＶＤＡＣからＨＫを分離するＭＪの能力に基づいたin-houseの細胞スクリーニングアッセイについて説明した。全体として、彼らのデータは、ＶＤＡＣに作用するＮ末端ＨＫ由来ペプチドが脱髄プロセスの研究に有望なツールであることを裏付けている。したがって、本発明は、最適化されたＨＫ由来ペプチド、並びに末梢脱髄疾患、心筋疾患（文献１０、１１）、がん（文献１２、１３－１５）、糖尿病（文献１４、１４－１６）、狼瘡様疾患（文献１７）、非アルコール性脂肪肝疾患（文献２４、２５）、化学誘発性神経障害（文献９）、アルツハイマー病（文献１８、１９）、パーキンソン病（文献２０）、ハンチントン病（文献２１）、ＡＬＳ（文献２２、２３）、およびより一般的にはタンパク質凝集に関連するすべての神経変性疾患（文献２８）の治療におけるその使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－Ｘ４（配列番号１）を含み、Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）であり、
ＨＫ由来ペプチドは配列番号９５に示されるアミノ配列からなるものではなく、ＨＫ由来ペプチドは配列番号９６に示されるアミノ配列を含まない、ＨＫ由来ペプチド。
【請求項2】
アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－Ｘ４－スレオニン（Ｔ）－グルタミン酸（Ｅ）－Ｘ５－リジン（Ｋ）（配列番号２）を含み、Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ５はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）である、
請求項１に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項3】
Ｘ３がα－アミノイソ酪酸（Ｕ）である、請求項１または２に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項4】
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸を含む、請求項１または３に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項5】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２および配列番号５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項6】
配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項５に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項7】
配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）または配列ＡＵ（配列番号５５）が結合している、請求項１～６のいずれかに記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項8】
ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］ＵがＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合しており、ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕが以下の式を有する、【化1】
【請求項9】
細胞膜透過配列が結合している、請求項１～８のいずれかに記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項10】
前記細胞膜透過配列がｔａｔ（配列番号５８）である、請求項９に記載のＨＫ由来ペプチド。
【請求項11】
請求項１～１０に記載のＨＫ由来ペプチドを含むベクター。
【請求項12】
治療に使用するための、請求項１～１０に記載のＨＫ由来ペプチドまたは請求項１１に記載のベクター。
【請求項13】
末梢脱髄疾患、心筋疾患、がん、糖尿病、狼瘡様疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、化学誘発性ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＬＳなどの神経変性疾患の治療に使用するための、請求項１～１０に記載のＨＫ由来ペプチドまたは請求項１１に記載のベクター。
【請求項14】
前記末梢脱髄疾患が、レフサム病、アベータリポタンパク血症、タンジール病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ファブリー病、デジェリン・ソッタス症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫麻痺を伴う遺伝性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、家族性アミロイドニューロパチー、遺伝性感覚性ニューロパチーＩＩ型（ＨＳＮ ＩＩ）、遺伝性ポルフィリン症、筋ジストロフィー、デジェリン・ソッタス症候群、糖尿病性ニューロパチー、免疫介在性ニューロパチー、急性運動性ニューロパチー、急性感覚性ニューロパチー、急性自律性ニューロパチー、ミラー・フィッシャー症候群、慢性多発神経障害、血管炎または末梢神経における血管の炎症に関連する末梢脱髄疾患、モノクローナル免疫グロブリン血症に関連する末梢脱髄疾患、腫瘍または新生物に関連する末梢脱髄疾患、薬剤による末梢脱髄疾患、感染症による末梢脱髄疾患、栄養バランスの崩れによる末梢脱髄疾患、腎臓疾患による末梢脱髄疾患、甲状腺機能低下症ニューロパチー、アルコールおよび毒素による末梢脱髄疾患、外傷または圧迫による末梢脱髄疾患、並びに特発性末梢脱髄疾患からなる群より選択される、請求項１３に記載の用途に使用されるＨＫ由来ペプチド。
【請求項15】
請求項１～１０に記載のペプチドまたは請求項１１に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項16】
治療を必要とする対象における末梢脱髄疾患の治療方法であって、治療有効量の請求項１～１０に記載のＨＫ由来ペプチドまたは請求項１１に記載のベクターを前記対象に投与することを含む方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ－）由来ペプチド、および特に末梢脱髄疾患もしくは神経変性疾患またはがんを治療するための、それらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）に存在する電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）は、ミトコンドリアとサイトゾル細胞コンパートメントとの間での、イオン（文献１）と代謝産物との交換に不可欠である（文献２）。ＶＤＡＣは、分子ゲート機能を提供するチャネル透過性に影響する細孔壁に垂直に横たわるＮ末端ヘリックスを持つβ－バレル構造を持つ膜貫通タンパク質である（文献３、４、５）。ＶＤＡＣのＮ末端ヘリックスの動きにより、細胞の恒常性に影響を与える開状態と閉状態との切り替えが可能になる。また、これはＶＤＡＣの多量体化も制御し、この多量体化は、サイトゾルシトクロムＣおよびカルシウムの放出によりアポトーシスを引き起こし、カスパーゼを活性化する（文献６、７）。さらに、ＶＤＡＣは最大２００個のタンパク質に対する特権的なドッキング部位であり（文献８、９）、そのうちのいくつかは心筋疾患（文献１０，１１）、がん（文献１２，１３－１５）、糖尿病（文献１４、１４－１６）、狼瘡様疾患（文献１７）、アルツハイマー病（文献１８、１９）、パーキンソン病（文献２０）、ハンチントン病（文献２１）、ＡＬＳ（文献２２、２３）、非アルコール性脂肪肝疾患（文献２４、２５）、および化学誘発性ニューロパチー（文献９）を含むいくつかの病態に関与する（文献９）。したがって、ＶＤＡＣは治療標的を構成しており、その透過性を調節したり、パートナータンパク質への結合を破壊／強化したりできる薬剤が精査されている。ＶＤＡＣと相互作用することが知られているタンパク質の中で、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）ＩおよびＩＩは主要なリガンドである。いくつかの疾患におけるこのタンパク質／タンパク質相互作用の極めて重要な役割により、ＨＫの両アイソフォームのＶＤＡＣへの結合に関与するアミノ酸が同定されている。結合部位はＨＫのＮ末端配列の最初の２０アミノ酸内にあり、より正確には最初の１０アミノ酸が必須である（文献２３、２６）。ＨＫ１とＨＫ２のＮ末端領域との間には強い配列相同性が観察され、両方のＨＫアイソフォームの多くが細胞内のミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）に局在することが知られている。ＨＫのミトコンドリア画分およびＨＫ－ＶＤＡＣ１複合体は、神経変性疾患において大幅に減少することが判明し、神経変性疾患に関与するいくつかのミスフォールドタンパク質はＶＤＡＣに結合するようである（文献２７、１９、２８）。この状況を踏まえて、ＶＤＡＣ１もシュワン細胞（ＳＣ）脱髄の重要な役割を果たすことが特定された（文献２９、３０）。
【0003】
シュワン細胞（ＳＣ）は、末梢神経系におけるミエリン生成を担う。これらの細胞は軸索を包み込み、軸索を保護するように結合した状態を維持し、正確かつ効率的な活動電位伝達を可能にする（文献４６）。残念なことに、末梢神経系（ＰＮＳ）の遺伝性および後天性脱髄疾患は数多くあり、罹患する人々の数はますます増えている（文献４７）。後天性脱髄疾患には、糖尿病性末梢性ニューロパチー（文献４８）、薬剤関連の末梢脱髄疾患、ハンセン病、および炎症性病因による末梢脱髄疾患（文献４９）が含まれるため、さらに一般的である。脱髄性末梢性ニューロパチーは糖尿病の主要な合併症であり、かなりの罹患率の原因となっている（文献５０）。このニューロパチーの慢性型は、シュワン細胞の脱髄並びに軸索の喪失および／または変性を特徴とし、その結果、神経伝導速度が遅くなる（文献５１、５２）。さらに、糖尿病患者の少なくとも５０％が、診断後２５年以内に１つまたは複数の形態の糖尿病性ニューロパチーを発症することが報告されている（文献５３）。
【0004】
植物ホルモンであるジャスモン酸メチル（ＭＪ）は、ＨＫをＶＤＡＣ１（文献３１）から切り離すことができ、自発的な脱髄を誘導する（文献２９）。一方、シュワン細胞のＶＤＡＣをサイレンシングするか、ＶＤＡＣに結合する神経保護薬オレソキシム（文献３２、３３）で治療すると、ミトコンドリアのカルシウム放出が防止され、脱髄がブロックされる（文献２９）。したがって、ＨＫ／ＶＤＡＣの緊密な関連を回復することは、ＶＤＡＣの透過性が関係するいくつかの疾患を治療する魅力的な機会となる。筋萎縮性側索硬化症というこの特定の状況では、Ｎ末端ＨＫ－１由来ペプチドがin-vitroおよびin-celluloでＶＤＡＣと相互作用し、ＶＤＡＣ／ＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ相互作用を防止することが報告されている（文献２３）。さらに、遺伝性脱髄性末梢性ニューロパチーＣＭＴ４Ｇでは、ＨＫ１の５’非コード配列の変異により、ＨＫ１の通常のＮ末端が欠如した選択的スプライシングアイソフォームの発現が促進される（文献３４）。ＣＭＴ４Ｇ患者の末梢血単核細胞およびこの疾患を模倣するＨＥＫ２９３細胞では、これによりＨＫとＶＤＡＣとの相互作用が欠如する（図１Ａ～Ｃ）。変異体ＨＫ１は、この疾患を模倣しているＨＥＫ２９３細胞において、ＶＤＡＣを介したミトコンドリアのカルシウム放出を遮断しない（図２）。最後に、野生型ＨＫ１のＮ末端に由来するペプチドは、ＭＪ処理後のミトコンドリアのカルシウム放出を防ぐことができるが（図３）、変異型ＨＫ１に由来するペプチドは効果を持たない（図３）。したがって、野生型ＨＫ１のＮ末端領域を含むペプチドを使用してカルシウム流出を遮断し、ＣＭＴ４Ｇなどのいくつかの末梢神経疾患における脱髄プロセスを停止できる可能性がある。このペプチドは、ＶＤＡＣ透過性が関与するすべての疾患に対する治療法の提案となる可能性もある。
【0005】
本明細書において、発明者らは、ＶＤＡＣ、特にＶＤＡＣ１に対する向上した安定性および親和性を有する最適化されたＨＫ由来ペプチドを開発した。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、アミノ酸配列：ＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＹＸ４（配列番号１）を含むＨＫ由来ペプチドに関し、
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）である。
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）である。
【0007】
特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A-C】患者の血液の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）内、および野生型ＨＫまたはＣＭＴ４Ｇ変異ＨＫ（または何もなし－対照）を発現するＨＥＫ２９３細胞内で、ＨＫと免疫共沈降するＶＤＡＣ１の量。Ａ．ＣＭＴ４Ｇ患者または対照の末梢血からＰＢＭＣを遠心分離によって収集し、洗浄し、洗剤溶液で溶解してタンパク質を抽出した。Ｇタンパク質と結合したセファロースビーズを使用して、ＨＫを特異的モノクローナル抗体で沈殿させた。洗浄後、免疫共沈降したタンパク質を、ＶＤＡＣ１に対するポリクローナル抗体を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。免疫共沈降したＶＤＡＣ１の量を、細胞溶解物中のタンパク質の量に対して正規化した。Ｂ．各アイソフォームのＮ末端配列に対するエクソン１および２、ならびに代替エクソンＴ３およびＴ４の寄与を示す、ヒトＨＫ１の主要アイソフォームおよび選択的にスプライシングされたＡｌＴ２アイソフォームの配列。Hantke, J. et al.2009を参照。Ｃ．ＨＥＫ２９３細胞を、野生型（ｗｔ）Ｆｌａｇタグ付きヒトＨＫ１またはＣＭＴ４Ｇ変異型Ｆｌａｇタグ付きヒトＨＫ１を発現するプラスミドでトランスフェクトした。４８時間後、細胞を洗浄し、洗剤溶液で溶解してタンパク質を抽出した。Ｇタンパク質と結合したセファロースビーズを使用して、ＨＫをモノクローナル抗Ｆｌａｇ抗体で沈殿させた。洗浄後、免疫共沈降したタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＶＤＡＣ１に対するポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した。免疫共沈降したＶＤＡＣ１の量を、細胞溶解物中のタンパク質の量に対して正規化した。
【図2】野生型ＨＫまたはＣＭＴ４Ｇ変異ＨＫ（または何もなし－対照）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるミトコンドリアカルシウムプローブの蛍光強度。ＨＥＫ２９３細胞を、ミトコンドリアマトリックス中のカルシウムを検出する蛍光プローブであるｍｉｔｏ－ＧＣａＭＰ２を発現するプラスミド単独で（対照）、または野生型Ｆｌａｇタグ付きヒトＨＫ１もしくはＣＭＴ４Ｇ変異型Ｆｌａｇタグ付きヒトＨＫ１を発現するプラスミドと一緒にトランスフェクトした。４８時間後、細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで処理して核を検出した。ＧＦＰ蛍光は、LSM700 Zeiss共焦点顕微鏡を使用して記録され、各写真のバックグラウンド値に対して正規化された。
【図3】ジャスモン酸メチル（ＭＪ、６ｍＭ）、および野生型ＨＫ１のＮ末端ペプチド（ＨＫ１－Ｎｔペプチド）または変異型ＨＫ１のＮ末端ペプチド（ＨＫｍｕｔ－Ｎｔペプチド）で処理したＨＥＫ２９３細胞におけるミトコンドリアのカルシウムプローブの蛍光強度のタイムラプス記録。ＨＥＫ２９３細胞にｍｉｔｏ－ＧＣａＭＰ２を発現するプラスミドをトランスフェクトした。４８時間後、ライブイメージング用に設計されたZeiss Axio-observerを使用して細胞をイメージングし、ＭＪ（６ｍＭ）および／または５ｍＭのペプチドで処理した。ペプチド配列：野生型ＨＫ１ペプチドＡｃ－ＭＩＡＡＱＬＬＡＹＹＦＴＥＬＫＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ－ＮＨ２（配列番号９０）、ＣＭＴ４Ｇ変異ＨＫ１ペプチドＡｃ－ＭＧＱＩＣＱＲＥＳＡＴＡＡＥＫＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ－ＮＨ２（配列番号９１）および対照ペプチドＡｃ－ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ－ＮＨ２（配列番号９２）。
【図4】ＶＤＡＣへの結合を最適化するために設計されたペプチドライブラリ１～６。１ａおよび２ａは、ａｌａスキャン、欠失、最適化および安定化アッセイに供されたペプチドのイニシャル配列を表す。ｎＬは、メチオニンの非酸化性代替物であるノルロイシンを表す。ｔａｔ配列は青色で強調表示され、ＮＨＫ１認識配列は赤色で表示され、先頭に配列番号が付けられる。
【図5】ミトコンドリア内およびサイトゾル内のｍｉｔｏＧＣａＭＰ２（Ａ）およびＧＣａＭＰ２（Ｂ）それぞれの蛍光レベルの経時的定量化。ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２（Ａ）およびＧＣａＭＰ２（Ｂ）プローブでトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞の蛍光レベルの定量化。対照（丸）は、ＭＪおよび化合物の可溶化に使用される希釈剤０．１ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨで細胞を処理したときのミトコンドリアの蛍光レベルを表す。ＭＪは６ｍＭで、化合物１ａは３３μＭで試験された。二元配置分散分析とそれに続くTukeysの多重比較検定（Ｎ＝３の独立した実験）を使用した統計分析。結果を平均値±ＳＥＭとして表す。**p<0.01、****p<0.0001、nsは有意差がないことを示し、Ａ．Ｕは任意単位である。
【図6A-D】図６は、化合物１ａおよび２ａに対するａｌａスキャン研究（Ａ、Ｂ）および欠失研究（Ｃ、Ｄ）の効果を示す。すべての化合物は１０μＭでスクリーニングアッセイによりテストされた（Ｎ＝５の独立した実験）。ａｌａスキャン置換は太字で表示される。化合物１ａ（ＡおよびＣは濃灰色プロット）または２ａ（ＢおよびＤは濃灰色プロット）と他の化合物との間の一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定を示す統計分析。青色プロットは、ａｌａスキャン研究によりＶＤＡＣとの相互作用に関与する重要なアミノ酸が明らかになった化合物、または欠失研究により活性の重大な損失が生じた化合物を表す。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。特記しない場合、統計検定は有意ではない（白色プロット）。結果を平均値±ＳＤとして表す。Ａ．Ｕは任意単位である。
【図7A-B】化合物３ｃ（Ａ）および４ｄ（Ｂ）におけるＶＤＡＣ相互作用に関与するアミノ酸に対する等価体置換の組み合わせの影響。置換は太字で表示される。化合物３ｃおよび４ｄを１０μＭ（濃灰色プロット）および３μＭ（薄灰色プロット）でテストした以外は、全ての化合物を３μＭでテストした（Ｎ＝３の独立した実験）。３μＭの化合物３ｃまたは４ｄと他の化合物との間の一元配置分散分析とそれに続くダネットの多重比較検定を示す統計分析。赤色プロットは、等価体置換の組み合わせが活性の最も顕著な増加をもたらした化合物を表す。*p<0.05、**p<0.01。特記しない場合、統計検定は有意ではない。結果を平均値±ＳＤとして表す。Ａ．Ｕは任意単位である。
【図8A-C】Ａ）７ｆで導入されたＮ末端修飾の構造。３ｃまたは５ｘ配列におけるヘリコジェニックＡｉｂ（Ｕ）の導入の効果。修飾されたアミノ酸は太字で示されている。すべての化合物を１０μＭ（Ａ）および３μＭ（Ｂ）でテストした。対照条件（点線）は、ＭＪおよび化合物の可溶化に使用される希釈剤０．１ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨで細胞を処理したときのミトコンドリアの蛍光レベルを表す。ＭＪ（線）は、６ｍＭのＭＪのみで細胞を処理したときのミトコンドリアの蛍光レベルを表す。一元配置分散分析を使用した統計分析と、それに続く３ｃまたは５ｘと他の化合物間のダネット多重比較検定（Ｎ＝３の独立した実験）（１０μＭを濃灰色、３μＭを薄灰色で示す）。赤色プロットは、活性の大幅な増加を示すペプチドに対応する。結果を平均値±ＳＤとして表す。*p<0.05、***p<0.001。nsは有意差がないことを示し、Ａ．Ｕは任意単位である。
【図9】活性の向上を示す、ＶＤＡＣを介したミトコンドリアＣａ２＋流出におけるＳＡＲ最適化研究の効果。グラフは、スクリーニングアッセイにおける化合物１ａ、５ｘ、および７ｇの代表的な用量反応曲線を示す。ＩＣ５０を各化合物について示す（Ｎ＝３の独立した実験）。結果を均値±ＳＤとして表す。Ａ．Ｕは任意単位である。
【図10】ラット血清に対するＮＨＫＩ由来配列（３ｃ’、７ａ’、７ｄ’、７ｆ’－ｇ’の安定性の研究（Ｎ＝３の独立した実験）。すべてのペプチドは、３７℃で２４時間インキュベートした後、２５％（ｖ／ｖ）のラット血清および水の存在下、６６．６μｍｏｌ／Ｌの濃度で試験された。エラーバーは標準偏差を示す。
【図11】血清を補充した培地中で培養した坐骨神経外植片に対するＮＨＫＩ由来ペプチド３ｃ、５ｘ、７ｄおよび７ｇの効果。（Ａ）収集され、４％ＰＦＡで直ちに固定された無傷の坐骨神経のミエリン（緑色）と、陰性対照と呼ばれるＦＢＳを補充した培地で培養された坐骨神経外植片を示す代表的なＣＡＲＳ画像。（Ｂ）ＮＨＫＩ由来ペプチドを３μＭ含みＦＢＳを添加した培地で２４時間培養した坐骨神経外植片のミエリン（緑色）を示す代表的なＣＡＲＳ画像。すべての神経を縦断面図で表す。健康なミエリン鞘（白色矢印）、ランヴィエ結節（白色星）、およびミエリン球（オレンジ色矢印）を示す。スケールバー：２０μｍ。（Ｃ）無傷の神経（白色プロット）、陰性対照（薄灰色プロット）、３ｃおよびその類似体７ｄ（青色プロット）、５ｘおよびその類似体７ｇ（赤色プロット）における損傷した線維の割合を示すグラフ。（Ｎ＝３の独立した実験）。結果を平均値±ＳＤとして表す。一元配置分散分析およびそれに続くダネットの多重比較検定を使用した統計分析。*p<0.05、**p<0.01。nsは有意差がないことを示す。
【図12】ＡＡＶ９は、標的細胞における抗脱髄ペプチドの発現を持続する効率的な方法を表す。ＨＥＫ２９３細胞に対照ＡＡＶ９またはＡＡＶ９－ＨＫペプチドを感染させたか、あるいは感染させなかった。２日後、ミトコンドリア内のカルシウムで蛍光を発する蛍光色素Ｒｈｏｄ－２とともに細胞をインキュベートした。１５分後、感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）とともにインキュベートし、非感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）＋５ｚペプチド（５μＭ）とともに４０分間インキュベートした。Ｒｈｏｄ－２色素をイメージングする写真を５分ごとに撮影した。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明者らは、欠失研究によって完了したａｌａスキャンを通じて、Ｎ末端ＨＫ－１ヘリックスの結合領域を正確にマッピングした。さらに、ヘリックス誘導剤として知られるα－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）による非必須アミノ酸の置換によってヘリックスを安定化させることを通じて、ＨＫ由来ペプチドを最適化した。さらに、彼らは、ペプチドの効力を決定することを可能にするＶＤＡＣからＨＫを分離するＭＪの能力に基づいたin-houseの細胞スクリーニングアッセイについて説明した。全体として、彼らのデータは、ＶＤＡＣに作用するＮ末端ＨＫ由来ペプチドが脱髄プロセスの研究に有望なツールであることを裏付けている。
【0010】
＜本発明のペプチド＞
本発明は、アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－Ｘ４（配列番号１）、を含むＨＫ由来ペプチドに関し、
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ｄ）－異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）である。
本発明は、アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－Ｘ４（配列番号１）、を含むＨＫ由来ペプチドに関し、
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ｄ）－異性体アラニン（ＡＤ）またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）である。
【0011】
本明細書で使用される「ヘキソキナーゼ」（ＨＫ）という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、ヘキソース（六炭糖）をリン酸化してヘキソースリン酸を形成する酵素を指す。キソキナーゼＩおよびＩＩはヘキソキナーゼの２つのアイソフォームであり、ＶＤＡＣの主要なリガンドである。
【0012】
本明細書で使用される場合、「ＶＤＡＣ」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、電位依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質１を指す。ＶＤＡＣは、ミトコンドリア外膜の主要成分であり、ミトコンドリア外膜を横切る代謝産物およびイオンの交換を促進し、ミトコンドリアの機能並びに細胞の生理および分化を調節している可能性がある。このタンパク質は細胞膜内に多量体チャネルも形成し、アポトーシスおよび経膜電子輸送に関与している可能性がある。選択的スプライシングにより、複数の転写産物の変異が生じる。ＶＤＡＣには、その透過性を制御する多数の結合パートナー、特にヘキソキナーゼ（ＨＫ）がある。ＨＫがＶＤＡＣに結合すると、特にカルシウムに対する細孔の透過性が低下する。ＶＤＡＣには、ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２およびＶＤＡＣ３の３つのＶＤＡＣアイソフォームが含まれる。
【0013】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、タンパク質ファミリーに属する化学物質に対応する。ペプチドはいくつかのアミノ酸の混合物で構成されている。関与するアミノ酸の数に応じて、ペプチドは２つのアミノ酸で構成されるジペプチド、３つのアミノ酸で構成されるトリペプチドなどに分類される。１０個以上のアミノ酸から構成されるペプチドをポリペプチドと呼ぶ。したがって、本発明のペプチドはポリペプチドとみなすことができる。
【0014】
本発明によるペプチドは、従来の自動ペプチド合成法または組換え発現によって生成することができる。タンパク質を設計および作製するための一般原理は、当業者にはよく知られている。
【0015】
本発明のペプチドは、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上で合成することができる。さまざまな自動シンセサイザーが市販されており、Stewart and Young; Tam et al., 1983、Merrifield, 1986、およびBarany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979に記載されている既知のプロトコルに従って使用できる。本発明のペプチドは、例示的なペプチド合成装置を使用する固相技術によって合成することもできる。自動ペプチド合成または組換え法によって生成された任意のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して測定できる。各ペプチドの化学的信頼性は、当業者に周知の任意の方法によって確立され得る。自動ペプチド合成の代替として、選択したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、本明細書において以下に記載する発現に適した条件下で培養する、組換えＤＮＡ技術を使用することもできる。組換え法は、より長いポリペプチドを生成するために特に好ましい。様々な発現ベクター／宿主系を利用して、ペプチドまたはタンパク質コード配列を含有および発現させることができる。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母（Giga-Hama et al., 1999）、ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス、Ghosh et al., 2002を参照）、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされた、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド；例えば、Babe et al., 2000を参照）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、哺乳動物のタンパク質発現を最適化するための様々な技術を知っており、Kaufman、2000; Colosimo et al., 2000が例示される。組換えタンパク質の生産に有用な哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ－７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、および２９３細胞が含まれるが、これらに限定されない。細菌、酵母および他の無脊椎動物におけるペプチド基質または融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコルは当業者に公知であり、以下に簡単に説明される。米国特許第6,569,645号；米国特許第6,043,344号；米国特許第6,074,849号；および米国特許第6,579,520号は、ペプチドの組換え生成の具体例を提供しており、これらの特許は、それらの教示について参照により本明細書に明示的に組み込まれる。組換えタンパク質を発現させるための哺乳類宿主系も当業者にはよく知られている。宿主細胞株は、発現されたタンパク質を処理する特定の能力、またはタンパク質活性を提供するのに有用な特定の翻訳後修飾を生成する能力に基づいて選択され得る。ポリペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能にとって重要である可能性がある。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などのさまざまな宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的な機構を有しており、導入された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【0016】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、キラルアミノ酸のＤ立体異性体およびＬ立体異性体である天然または非天然アミノ酸を指す。アミノ酸および、例えばペプチジル構造に存在するような対応するアミノ酸残基の両方を指すことが理解される。天然アミノ酸および非天然アミノ酸は当技術分野でよく知られている。一般的な天然アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）が含まれるが、これらに限定されない。一般的でなく非天然のアミノ酸には、α－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ、Ｕ）、アリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、４－グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｇｕ））、ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）、ホモリシン（ｈＬｙｓ）、２－ナフチルアラニン（２－Ｎａｌ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ、Ｆｘ）およびペンタフルオロフェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＫ由来ペプチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のアミノ酸を含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＫ由来ペプチドは、アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－ロイシン（Ｌ）－ロイシン（Ｌ）－アラニン（Ａ）－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－フェニルアラニン（Ｆ）（配列番号９５）からなるものではない。
【0019】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＫ由来ペプチドは、アラニン（Ａ）－アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－ロイシン（Ｌ）－ロイシン（Ｌ）－アラニン（Ａ）－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－フェニルアラニン（Ｆ）－スレオニン（Ｔ）－グルタミン酸（Ｅ）－ロイシン（Ｌ）－リシン（Ｋ）（配列番号９６）からなるものではなく、この配列を含まない。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、アミノ酸配列：アラニン（Ａ）－グルタミン（Ｑ）－Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－チロシン（Ｙ）－チロシン（Ｙ）－Ｘ４－スレオニン（Ｔ）－グルタミン酸（Ｅ）－Ｘ５－リジン（Ｋ）（配列番号２）、を含み、
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）、またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ５はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）である。
Ｘ１はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ２はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）であり、
Ｘ３はアラニン（Ａ）、Ｄ異性体アラニン（ＡＤ）、またはα－アミノイソ酪酸（Ｕ）であり、
Ｘ４はフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）またはチロシン（Ｙ）であり、
Ｘ５はロイシン（Ｌ）またはトリプトファン（Ｗ）である。
【0021】
いくつかの実施形態では、Ｘ３はα－アミノイソ酪酸（Ｕ）である。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、表１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0023】
【表1-1】
【0024】
【表1-2】
【0025】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0026】
さらに、本発明者らは、ＨＫ由来ペプチドの安定性を高めるために、Ｎ末端に融合されたＡＵＡＵパッチまたは３－ＣＦ３－Ｐｈ［Ｔｚ］Ａｉｂの重要性を実証した（図７を参照）。本発明者らは、ＨＫ由来ペプチドの安定性を高めるために、２番目のアラニンをα－アミノイソ酪酸で置換することが重要であることも実証した。
【0027】
本発明者らは以前の研究で、Ｎ末端キャッピングとしての３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕジペプチドが膜内へのペプチド挿入を促進することを示した（図４ＡおよびDasら、Chemistry、2017年12月24日を参照)。
【0028】
本明細書で使用する場合、３－ＣＦ３Ｐｈ［ＴＺ］Ｕジペプチドという用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、２－メチル－２－｛４－［（３－トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１イル｝プロパン酸を指し、これは式Ｃ１６Ｈ１６Ｆ３Ｎ３Ｏとして表される、α－アミノイソ酪酸と結合した１，４－二置換－１，２，３－トリアゾールとしても知られる。
【0029】
【化1】
【0030】
いくつかの実施形態では、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）またはＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドに結合される。
【0031】
いくつかの実施形態では、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）またはＡＵ（配列番号５５）が、ＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合される。
【0032】
いくつかの実施形態では、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）またはＡＵ（配列番号５５）が、ＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合される。
【0033】
いくつかの実施形態では、ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕは、ＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合される。
【0034】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドに結合される。
【0035】
本明細書で使用する「細胞膜透過配列」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、本発明のペプチドの細胞への取り込み（intake）および吸収（uptake）を促進する短い配列を指す。ペプチドの起源に基づいて、ＣＰＰはキメラ、タンパク質由来および合成に分類される。細胞膜透過配列には、ペネトラチン（penetratin）、オクタアルギニン（Ｒ８）、ｔａｔ、トランスポータン（Transportan）およびゼントリー（Xentry）が含まれるが、これらに限定されない。ペネトラチンは、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメインに由来する、第一世代の細胞膜透過ペプチドである。ペネトラチンは、マクロピノサイトーシス経路を通じて哺乳動物細胞の細胞膜の障壁を克服し、生物学的に活性な形態で分子積荷を効率的に送達する。ｔａｔペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスの転写活性化因子（ｔａｔ）に由来する。ＴＡＴはアルギニンが豊富なペプチドであり、細胞膜および安定化ＤＮＡに直接浸透する。トランスポータンは、ガラニンとマストパランに由来するキメラＣＰＰである。ゼントリーは、Ｂ型肝炎ウイルスのＸタンパク質のＮ末端領域に由来する短いペプチドである。ゼントリーは、シンデカン－４を侵入の入り口として使用して接着細胞に浸透する。ホートンペプチドは、ミトコンドリアに侵入できる合成細胞膜透過性ペプチドである。ＭＰＰの配列は、細胞膜およびミトコンドリア膜の両方を通過するのに重要であることが知られている、２つの特性、すなわちHorton et al, Chem Biol. 2008年（文献58）で説明される正電荷および親油性を示すように設計された。
【0036】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する。
【0037】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過配列は、表２の配列からなる：
【0038】
【表2】
【0039】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過配列はｔａｔ（配列番号５８）である。
【0040】
いくつかの実施形態では、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）またはＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合し、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合する。
【0041】
いくつかの実施形態では、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）またはＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合し細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合する。
【0042】
いくつかの実施形態では、ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］ＵがＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合し、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合する。
【0043】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］ＵがＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合する。
【0044】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）または配列ＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合する。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、ジペプチド３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］ＵがＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合し、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合する。
【0046】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）または配列ＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合し、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合する。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＨＫ由来ペプチドは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、配列ＡＵＡＵ（配列番号５４）または配列ＡＵ（配列番号５５）がＨＫ由来ペプチドのＣ末端に結合し、細胞膜透過配列がＨＫ由来ペプチドのＮ末端に結合する。
【0048】
いくつかの実施形態では、細胞膜透過配列はｔａｔ（配列番号５８）である。
【0049】
第２の態様では、本発明は、本発明のＨＫ由来ペプチドを含むベクターに関する。
【0050】
典型的には、ペプチドはベクターと結合して送達され得る。本発明のＨＫ由来ペプチドは、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの適切なベクターに含まれる。したがって、本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドを含むベクターに関する。典型的には、ベクターはウイルスベクターであり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、または感染性ウイルスである。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」という用語は、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０およびその変異型を含むがこれに限定されない。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の全体もしくは一部が欠失するが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持する、１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子を有することができる。レトロウイルスは、大量の外来遺伝物質を移入し、広範囲の種および細胞型に感染し、特殊な細胞株内にパッケージされ、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込むことができることから、遺伝子送達ベクターとして選択される可能性がある。レトロウイルスベクターを構築するには、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入し、複製欠損ウイルスを生成する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよび／またはパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列とともにこの細胞株に導入されると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物は、ウイルス粒子にパッケージされることが可能になり、その後に培地に分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、必要に応じて濃縮し、遺伝子導入に使用する。レトロウイルスベクターは、さまざまな種類の細胞に感染できる。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を持つ他の遺伝子を含む。複雑性が高まると、潜伏感染の過程のように、ウイルスはライフサイクルを調節できるようになる。レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、たとえば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆが削除されており、ベクターは生物学的に安全である。レンチウイルスベクターは当技術分野で知られており、例えば、米国特許第6,013,516号および第5,994,136号を参照し、どちらも参照により本明細書に組み込まれる。一般に、ベクターはプラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込み、選択、および宿主細胞への核酸の導入に必須の配列を保持するように構成されている。目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子も当技術分野で知られている。したがって、関連する遺伝子が選択されたベクターにクローン化され、目的の標的細胞を形質転換するために使用される。非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスにおいて、適切な宿主細胞は、ｒｅｖおよびｔａｔと同様に、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを担持する２つ以上のベクターでトランスフェクトされ、このレンチウイルスは米国特許第5,994,136号に記載され、かつこの特許は参照により本明細書に組み込まれる。これは、ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を提供できる第１のベクター、ならびにパッケージング細胞を産生するウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供できる別のベクターを記載する。異種遺伝子を提供するベクターをそのパッケージング細胞に導入すると、目的の外来遺伝子を運ぶ感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。ｅｎｖは、好ましくは、ヒトおよび他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。典型的には、本発明の核酸分子またはベクターは、「制御配列」を含み、制御配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的に指し、これらは集合的にレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を担う。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写、翻訳できる限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。別の核酸配列は「プロモーター」配列であり、本明細書では通常の意味でDNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、調節配列は、RNAポリメラーゼに結合することができると共に下流（3'方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される。）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される。）、および「構成的プロモーター」を含み得る。
【0051】
いくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【0052】
いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０である。
【0053】
＜治療方法＞
シュワン細胞による末梢神経軸索周囲のミエリン鞘の形成は、活動電位の迅速な伝播に不可欠である。いくつかの末梢性ニューロパチーには、病理学的生理機能として脱髄のプロセスがある。本発明者らは以前、ミトコンドリアＶＤＡＣ１が、ＭＡＰＫ経路を介したシュワン細胞の脱髄、並びに坐骨神経損傷、糖尿病性ニューロパチーおよびＣＭＴ１Ａ後のｃ－ｊｕｎ活性化を直接誘導することを実証した。彼らは、ＶＤＡＣ１の遮断によるミトコンドリアのカルシウム放出の減少が、ｉｎｖｉｖｏでの脱髄シュワン細胞の数を大幅に減少させ、糖尿病、ギラン・バレー症候群、およびシャルコー・マリー・トゥース病モデルにおける神経伝導並びに神経筋活動を改善することを発見した。
シュワン細胞による末梢神経軸索周囲のミエリン鞘の形成は、活動電位の迅速な伝播に不可欠である。いくつかの末梢性ニューロパチーには、病理学的生理機能として脱髄のプロセスがある。本発明者らは以前、ミトコンドリアＶＤＡＣ１が、ＭＡＰＫ経路を介したシュワン細胞の脱髄、並びに坐骨神経損傷、糖尿病性ニューロパチーおよびＣＭＴ１Ａ後のｃ－ｊｕｎ活性化を直接誘導することを実証した。彼らは、ＶＤＡＣ１の遮断によるミトコンドリアのカルシウム放出の減少が、ｉｎｖｉｖｏでの脱髄シュワン細胞の数を大幅に減少させ、糖尿病、ギラン・バレー症候群、およびシャルコー・マリー・トゥース病モデルにおける神経伝導並びに神経筋活動を改善することを発見した。
【0054】
したがって、ＨＫ／ＶＤＡＣの緊密な関係を回復することは、異なる末梢脱髄疾患およびＶＤＡＣ透過性が関与する他のすべての疾患に対して魅力的な機会となる。
【0055】
すなわち、本発明は、医薬として使用するための本発明のＨＫ由来ペプチドまたはベクターに関する。
【0056】
言い換えれば、本発明は、治療に使用するための本発明のＨＫ由来ペプチド又はベクターに関する。
【0057】
より具体的には、本発明は、末梢脱髄疾患の治療に使用するための本発明のＨＫ由来ペプチドまたはベクターに関する。
【0058】
言い換えれば、本発明は、治療有効量の本発明のＨＫ由来ペプチド又は本発明のベクターを対象に投与することを含む、治療を必要とする対象における末梢脱髄疾患の治療方法に関する。
【0059】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。典型的には、対象は、末梢神経系に影響を与える疾患に罹患しているか、罹患する可能性がある。典型的には、対象は末梢脱髄疾患に罹患しているか、罹患する可能性がある。
【0060】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、治癒的または疾患を修飾する治療、および予防的（prophylactic）または予防的（preventive）な治療の両方を指し、疾患に罹患するリスクがある対象もしくは疾患に罹患している疑いのある対象、および病気にかかっているか、または疾患もしくは医学的状態に苦しんでいると診断された対象の治療、並びに臨床的再発の抑制も含む。治療は、障害または再発性障害の１つまたは複数の症状について予防、治癒、発症の遅延、重症度の軽減、もしくは改善するために、またはそのような治療がない場合に予想される以上に被験者の生存を延長するために、医学的障害を有する対象または最終的に障害を発症する可能性のある対象に施されてもよい。「治療レジメン」とは、病気の治療パターン、例えば、治療中に使用される投薬パターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメンおよび維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」または「導入期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、治療レジメンの初期期間中に対象に高レベルの薬剤を提供することである。導入レジメンでは、（部分的または全体的に）「ローディングレジメン」を採用する場合があり、これには、医師が維持レジメン中に採用するよりも多量の薬剤を投与すること、医師が維持レジメン中に薬剤を投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、またはその両方が含まれる場合がある。「維持レジメン」または「維持期間」という語句は、疾患の治療中に対象を維持するため、例えば、対象を長期間（数月または数年）に渡って寛解状態に保つために、使用される治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続療法（例えば毎週、毎月、毎年などの一定の間隔で薬物を投与すること）、または断続的療法（例えば、中断された治療、断続的な治療、再発時の治療、または特定の所定の基準を達成したときの治療［例えば、疾患の発現など］）を採用し得る。
【0061】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」とは、患者に治療効果を与えるために必要な活性薬剤（すなわち、本発明のペプチド）の最小量を意味する。例えば、患者に対する「活性薬剤の治療有効量」は、患者に影響を与える疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行もしくは身体状態の改善を誘発、促進、または引き起こす活性薬剤の量である。本発明の化合物および組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事；使用した特定の化合物の投与時間、投与経路、排泄速度；治療期間；使用される特定のポリペプチドと組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物；および医療分野でよく知られている同様の要因を含むさまざまな要因によって異なる。
【0062】
本明細書で使用される場合、「末梢脱髄疾患」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、軸索およびグリア細胞、特に末梢神経系（ＰＮＳ）におけるシュワン細胞（ＳＣ）に対する実質的な損傷を伴う一連の疾患を指す。末梢脱髄疾患によって示される多種多様な形態は、それぞれ同様に多種多様な原因に固有に起因する可能性がある。例えば、末梢脱髄疾患は、遺伝的に発生することもあり（「遺伝性末梢脱髄疾患」）、全身疾患に起因することもあり、または毒性物質もしくは感染因子によって誘発されることもある（「後天性末梢脱髄疾患」）。
【0063】
本発明の方法は、末梢神経節ニューロン、交感神経ニューロン、感覚ニューロン、並びに有髄運動および感覚ニューロンを含む末梢神経の調節に影響を与える末梢脱髄疾患の治療または予防に広く適用可能である。
【0064】
特に、本発明の方法は、例えば目の神経、内耳および聴神経、ならびに有髄運動および感覚ニューロンを救出するように設計された治療に有用である。特に、本発明の方法は、末梢神経の脱髄を予防するのに特に適している。
【0065】
本発明のペプチドは、遺伝性末梢脱髄疾患の治療に適している。
【0066】
遺伝性末梢脱髄疾患は、世代から世代へと伝わる遺伝子異常によって引き起こされる。これらのいくつかについては、遺伝的欠陥がわかっており、診断および出生前カウンセリングのために検査が利用可能である。特に、遺伝性末梢脱髄疾患の診断は、通常、特に家族歴が陽性である場合、ニューロパチー症状の早期発症により示唆される。最近の遺伝的進歩以前は、筋電図検査および神経生検における神経伝導の顕著な低下という典型的な所見によって診断が裏付けられていた。神経生検の典型的な所見は、いわゆるたまねぎ様構造の存在を含み、これは神経線維の脱髄と再髄鞘化が繰り返されていることを示す。末梢神経脱髄に直接的または間接的に関連する遺伝性ニューロパチーがいくつかある。例としては、リフサム病、アベータリポタンパク血症、タンジール病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病、ファブリー病、圧迫麻痺を伴う遺伝性ニューロパチー（ＨＮＰＰ）、家族性アミロイドニューロパチー、遺伝性感覚性ニューロパチーＩＩ型（ＨＳＮ ＩＩ）、遺伝性ポルフィリン症、先天性筋ジストロフィー１Ａなどの筋ジストロフィー、およびデジェリン・ソッタス（Dejerine-Sottas）症候群が含まれるが、これらに限定されない。
【0067】
いくつかの実施形態では、遺伝性脱髄疾患はシャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病である。
【0068】
ＣＭＴ疾患は、最も一般的な遺伝性神経疾患である。これは、末梢神経の部分的な脱髄およびそれに伴う軸索および前角細胞の変性による筋肉の衰弱および萎縮を特徴とする。過去１５年間で、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）の遺伝的基盤に関する知識が大幅に増加し、現在６０以上の遺伝子が知られている。定期的に更新されるリストは、http://www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/Home/IPN.cfmで閲覧できる。常染色体優性遺伝が一般的であり、フリードライヒ運動失調などの、関連する中枢神経系変性疾患もよく見られる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｇ型および１Ａ型の治療に使用することができる。
【0069】
本発明のペプチドは、後天性末梢脱髄疾患の治療にも適している。
【0070】
後天性末梢脱髄疾患は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、糖尿病性ニューロパチー、免疫介在性ニューロパチー；急性および慢性の運動性ニューロパチー；急性および慢性の感覚性ニューロパチー；急性および慢性の自律神経系神経障害；注視麻痺、協調運動障害および不安定な歩行が見られるミラー・フィッシャー症候群を含むが、これらに限定されない。
【0071】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、糖尿病性ニューロパチーの治療に使用される。糖尿病は、ニューロパチーの最も一般的な既知の原因である。糖尿病患者の約５０％に症状が現れる。ほとんどの場合、ニューロパチーは主に感覚性であり、手と足の痛みと感覚喪失を伴う。しかし、一部の糖尿病患者は、慢性脱髄性ニューロパチー、１つもしくは複数の神経の衰弱を引き起こす単神経炎もしくは多発性単神経炎、または脚の衰弱、炎症、壊死および膿瘍を引き起こす腰仙神経叢障害または筋萎縮症を患っている。
【0072】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、免疫介在性ニューロパチーの治療に使用される。免疫系の主な機能は、外部から侵入する感染性微生物から体を守ることである。しかし場合によっては、免疫系が体に反抗し、自己免疫疾患を引き起こすこともある。免疫系は、Ｔリンパ球を含む数種類の白血球（これらも免疫応答を制御する）；および「抗体」と呼ばれる特殊なタンパク質を分泌するＢリンパ球または形質細胞で構成される。時々、未知の理由で、免疫系が誤って末梢神経などの身体の部分を攻撃することがある。「これが「自己免疫性」末梢性ニューロパチーである。攻撃される末梢神経の部分と免疫反応の種類に応じて、いくつかの異なるタイプがある。例えば、本発明の方法は、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）の治療に適している。突然または急速に発症する急性神経障害である。ギラン・バレー症候群は、発症後数日または数週間以内に麻痺および呼吸不全に進行することがある。ニューロパチーは、免疫系が運動神経と感覚神経のミエリン鞘を破壊することで引き起こされる。多くの場合、感染、ワクチン接種または外傷が先行しており、それが自己免疫反応を引き起こすものと考えられている。この病気は自然治癒し、６～８週間以内に自然に回復する。しかし、回復は不完全であることがよくある。
【0073】
本発明のペプチドによって治療され得る別の後天性末梢脱髄疾患は、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）である。ＣＩＤＰは、ギラン・バレー症候群の慢性的でより緩徐な形態であると考えられている。この病気は、再発と呼ばれる発作を繰り返すか、段階的または着実に進行する。ＧＢＳと同様に、抗体とＴリンパ球によるミエリン鞘の破壊があるようである。しかし、ＣＩＤＰには特別な検査がないため、診断は臨床的および検査室の特徴に基づいて行われる。
【0074】
末梢神経に対する抗体を伴う慢性多発神経障害は、本発明のペプチドが使用できる別の後天性末梢脱髄疾患である。いくつかの種類の慢性ニューロパチーでは、神経の特定の成分に対する抗体が同定されている。これらには、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）に対する抗体に関連する脱髄性末梢疾患、ガングリオシドＧＭ１またはＧＤｌａに対する抗体に関連する運動性ニューロパチー、および抗スルファチドまたはＧＤ１ｂガングリオシド抗体に関連する感覚性ニューロパチーが含まれる。このような場合の抗体は、神経内のタンパク質（糖タンパク質）または脂質（糖脂質またはガングリオシド）に結合しているオリゴ糖または糖様分子に結合する。
【0075】
本発明のペプチドはまた、血管炎または末梢神経における血管の炎症に関連する末梢脱髄疾患を治療するために使用することもできる。末梢脱髄疾患は、末梢神経における血管の炎症である血管炎によって引き起こされることもある。それは末梢神経の経路に沿って小さな「卒中（stroke）」を引き起こし、神経に限定される場合もあれば、皮膚の発疹を含んだり、他の臓器に影響を及ぼしたりと、全身性である場合もある。関節リウマチ、狼瘡、結節性動脈周囲炎またはシェーグレン症候群などのいくつかのリウマチ性疾患は全身性血管炎と関連しており、末梢神経に影響する場合もある。血管炎は、病変の分布と重症度に応じて、多発性神経炎、単神経炎または多発性単神経炎を引き起こす可能性がある。
【0076】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、モノクローナル免疫グロブリン血症に関連する末梢脱髄疾患の治療に適している。モノクローナル免疫グロブリン血症では、骨髄またはリンパ器官内のＢ細胞または形質細胞の単一クローンが増殖して良性または悪性腫瘍を形成し、抗体を分泌する。「モノクローナル」というのは、抗体の単一クローンが存在するためである。そして、「免疫グロブリン血症（Gammopathy）」は抗体の別名である免疫グロブリンに対応する。場合によっては、抗体は神経成分と反応し、他の場合に、抗体の断片がアミロイド沈着を形成する。
【0077】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、腫瘍または新生物に関連する末梢脱髄疾患の治療に適している。ニューロパチーは、腫瘍細胞による神経への直接浸潤、または腫瘍の間接的な影響が原因である可能性がある。後者は腫瘍随伴性ニューロパチーと呼ばれる。いくつかのタイプが説明されている。例えば、本発明の方法は、肺がんに関連する感覚性ニューロパチーを管理するために使用することができる。同様に、本発明の方法は、多発性骨髄腫に関連する末梢脱髄疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ワルデンストロム大球血症、慢性リンパ球性白血病またはＢ細胞リンパ腫に関連する末梢脱髄疾患の治療に適している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、局所照射の結果であるか、または化学療法剤によって引き起こされる末梢脱髄疾患を伴うがんの患者の治療のための治療プロトコルの一部として使用される。感覚性および／または運動性ニューロパチーを引き起こすことが知られている化学療法剤には、シスプラチン、タキソールなどと共に、血液悪性腫瘍や肉腫の治療に使用される抗悪性腫瘍薬であるビンクリスチンが含まれる。神経毒性は用量に関連しており、腸の運動性の低下、および特に手足の遠位筋における末梢性ニューロパチー、起立性低血圧、並びに膀胱の無緊張として現れる。同様の問題がタキソールとシスプラチンについても報告されている（MoUman, J. E., 1990, New Eng Jour Med. 322:126-127）が、シスプラチン関連の神経毒性は神経成長因子（ＮＧＦ）で軽減できる（Apfel, S. C. et al. 1992、Annals of Neurology 31:76-80）。神経毒性は神経毒性物質の除去後に可逆的な場合があるが、回復は非常に遅いプロセスになる可能性がある（Legha, S.、1986、Medical Toxicology 1:421-427; Olesen, et al、1991、Drug Safety 6:302- 314）。
【0078】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、クロロキン、ＦＫ５０６（タクロリムス）、ペルヘキシリン、プロカインアミドおよびジメルジンなどの薬物によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に適している。
【0079】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、感染によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に適している。末梢脱髄疾患は、末梢神経の感染によって引き起こされる可能性がある。末梢脱髄疾患を引き起こすウイルスには、ゆっくりと進行する感覚神経障害を引き起こすＡＩＤＳウイルスすなわちＨＩＶ－Ｉ、急速に進行する麻痺性ニューロパチーを引き起こすサイトメガロウイルス、帯状疱疹を引き起こす帯状疱疹ウイルス、運動性ニューロパチーを引き起こすポリオウイルスなどがある。Ｂ型またはＣ型肝炎感染は、血管炎性ニューロパチーを伴うことがある。ニューロパチーを引き起こす細菌感染症には、斑状の感覚性ニューロパチーを引き起こすハンセン病、および急速に進行する麻痺性神経障害を引き起こすジフテリアなどがある。ニューロパチーを引き起こす他の感染症には、スピロヘータによって引き起こされるライム病、寄生虫によって引き起こされるトリパノソーマ症が含まれる。どちらも一般に多巣性ニューロパチーを伴う。
【0080】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、栄養の不均衡によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に適している。たとえば、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）またはビタミンＥの欠乏は、末梢神経軸索の変性を伴う多発性神経障害を引き起こす可能性がある。これは、食生活の乱れ、または胃もしくは腸からの栄養素の吸収能力の低下が原因である可能性がある。さらに、ビタミンＢ６の大量摂取は末梢脱髄疾患を引き起こす可能性があり、本発明のペプチドはそのような場合の解毒プログラムの一部として使用することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、腎臓疾患で生じる末梢脱髄疾患の治療に適している。慢性腎不全は、末梢神経軸索の変性を伴う主に感覚性の末梢性ニューロパチーを引き起こす可能性がある。
【0082】
いくつかの実施形態において、本発明のペプチドは、甲状腺機能低下症神経障害の治療に適している。甲状腺機能低下症は、軸索変性を伴い痛みを生じる感覚性多発神経障害と関連することがある。単神経障害または多発性単神経障害は、腫れた組織による末梢神経の圧迫によって発生することもある。
【0083】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、アルコールおよび毒素によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に適している。特定の毒素は末梢性ニューロパチーを引き起こす可能性がある。鉛の毒性は、運動性ニューロパチーに関連し；ヒ素および水銀は感覚性ニューロパチーを引き起こし；タリウムは感覚性および自律性ニューロパチーおよび自律神経障害を引き起こす可能性があり、いくつかの有機溶剤および殺虫剤も同様に多発神経障害を引き起こす可能性がある。アルコールは神経に直接有毒であり、アルコール乱用は神経障害の主な原因である。本発明のペプチドは、いくつかの実施形態では、より広範な解毒プログラムの一部として使用することができる。さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、薬物によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に使用することができる。いくつかの薬物は神経障害を引き起こすことが知られている。それらには、とりわけ、腎盂腎炎に使用されるニトロフラントイン、不整脈におけるアミオダロン、アルコール依存症におけるジスルフィラム、ＡＩＤＳにおけるｄｄＣおよびｄｄｌ、並びにハンセン病の治療に使用されるダプソンが含まれる。上記のように、本発明のペプチドは、いくつかの実施形態では、より広範な解毒プログラムの一部として使用することができる。
【0084】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、外傷または圧迫によって引き起こされる末梢脱髄疾患の治療に適している。局所的なニューロパチーは、外部からの圧力、または腱および他の組織を覆うことによる神経の圧迫によって生じることがある。これらの中で最もよく知られているのは、手首の圧迫によって生じる手根管症候群、および脊椎から出る際の神経根の圧迫によって生じる頸椎または腰部神経根症（坐骨神経痛）である。他の一般的な神経圧迫部位には、肘、脇の下および膝の裏が含まれる。
【0085】
本発明のペプチドは、様々な特発性末梢脱髄疾患の治療にも有用である。「特発性」という用語は、末梢脱髄疾患の原因が見つからない場合に使用される。これらの場合、末梢脱髄疾患はその症状、すなわち感覚性、運動性または感覚運動性の突発性多発神経障害に従って分類される。
【0086】
ＶＤＡＣ細孔は、多くの疾患に関与するタンパク質の特別なドッキング部位であり、パートナータンパク質との結合を破壊または強化できる薬剤の治療標的となっている。活性化されるシグナル伝達経路の上流でこのチャネルを遮断することは、心筋疾患（文献１０、１１）、がん（文献１２、１３－１５）、糖尿病（文献１４、１４－１６）、狼瘡様疾患（文献１７）、非アルコール性脂肪肝疾患（文献２４、２５）、化学誘発性ニューロパチー（文献９）、アルツハイマー病（文献１８、１９）、パーキンソン病（文献２０）、ハンチントン病（文献２１）、ＡＬＳ（文献２２、２３）、およびより一般的にはタンパク質凝集に関連するすべての神経変性疾患（文献２８）との闘いにおいて重要である。
【0087】
したがって、本発明は、心筋疾患、がん、糖尿病、狼瘡様疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、化学誘発性ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（文献１）またはＡＬＳなどの神経変性疾患の治療に使用するための本発明のＨＫ由来ペプチドまたは本発明のベクターにも関する。
【0088】
本明細書で使用する「狼瘡様疾患」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、特発性全身性エリテマトーデスに類似した臨床的、組織学的および免疫学的特徴を有する障害を指す。
【0089】
本明細書で使用する場合、「非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、肝臓における脂肪の蓄積によって引き起こされる症状を指す。ＮＡＦＬＤの主な段階は、単純性脂肪肝（脂肪症）；肝臓が炎症を起こした非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；持続的な炎症により肝臓とその近くの血管の周囲に瘢痕組織が生じる線維症、および長年の炎症の後に発生する最も重度の段階であり、肝臓が縮小して瘢痕化して塊状になる肝硬変である。
【0090】
本明細書で使用する「神経変性疾患」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、ニューロンの死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性の喪失である神経変性を伴う疾患を指す。筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病を含む多くの神経変性疾患は、神経変性プロセスの結果として発生する。このような病気は不治の病であり、進行性の変性および／またはニューロン細胞の死をもたらす。研究が進むにつれて、これらの疾患を細胞内レベルで相互に関連付ける多くの類似点が明らかになる。これらの類似点の発見は、多くの病気を同時に改善できる治療の進歩への希望をもたらす。異型タンパク質凝集および誘導細胞死を含むさまざまな神経変性疾患の間には、多くの類似点がある（Rubinsztein DC (2006). Nature. 443 (7113): 780-6 and Bredesen DE, et al (2006). Nature. 443 (7113): 796-802）。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、タンパク質凝集に関連する疾患である（文献２８）。
【0091】
経変性疾患には、アルツハイマー病、特に化学誘発性ニューロパチー、アルツハイマー病（文献１８、１９）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、前頭側頭型認知症を伴う筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、骨および／または前頭側頭のパジェット病を伴う封入体ミオパチー認知症（ＩＢＭＰＦＤ）、前頭側頭葉変性症、シヌクレオパチー、ハンチントン病およびパーキンソン病、アミロイド血管症を含むアミロイド症、１７番染色体に関連するパーキンソン病を伴う前頭側頭型認知症を含むタウオパチー、タンパク質封入体を伴う神経筋疾患、ならびにダウン症候群を含む発達性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【0092】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、化学誘発性ニューロパチー、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病もしくはＡＬＳを治療するか、または少なくともその重症度を軽減するために使用することができる。
【0093】
本明細書で使用される「糖尿病」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、慢性高血糖を特徴とする一般的な代謝障害を指す。糖尿病は、心臓病、脳卒中、末梢性ニューロパチー、腎臓病、失明、切断のリスクが高まることと関連している。糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病の３つの主な種類がある。以前の研究では、ＶＤＡＣ１阻害によりβ細胞機能が回復し、糖尿病マウスの高血糖が予防されることが実証された。
【0094】
本明細書で使用される「がん」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、体の他の部分に浸潤または拡散する可能性のある異常な細胞増殖を指す。がん細胞は、アポトーシスを避けるなど、正常細胞と異なるいくつかの特徴を共有している。アポトーシス調節の欠陥、あるいはアポトーシスの回避さえも、がんの特徴である。ＶＤＡＣ１は、エネルギー、代謝、アポトーシスの重要な調節因子としての役割を果たしているため、抗がん治療のユニークな標的となる（文献８）電位依存性アニオンチャネル１は、正常細胞におけるレベルと比較して、多くの種類のがんで高度に発現されている（文献８）。本発明のペプチドは、ヘキソキナーゼなどの抗アポトーシスタンパク質のＶＤＡＣへの結合を妨害し、それによりアポトーシスの誘導を可能にすることにより、がんの治療に適している。
【0095】
本発明によれば、がんは、副腎皮質がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳および中枢神経系のがん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキン病疾患、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭および下咽頭がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、口腔がんおよび中咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、膣がん、外陰がん、子宮がんからなる群より選択され得る。
【0096】
＜医薬組成物＞
本発明のペプチドは、医薬組成物中で使用または調製され得る。
本発明のペプチドは、医薬組成物中で使用または調製され得る。
【0097】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを含む医薬組成物に関する。
【0098】
本発明は、末梢髄鞘形成疾患、心筋疾患、がん、糖尿病、狼瘡様疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、または化学誘発性ニューロパチー（文献９）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＬＳなどの神経変性疾患の治療に使用するための本発明のペプチドまたは本発明のベクターを含む医薬組成物に関する。
【0099】
典型的には、本発明のペプチドは、薬学的に許容される賦形剤、および場合により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成することができる。
【0100】
本明細書で使用される場合、「薬学的に」または「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の種類の製剤補助剤を指す。
【0101】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の医薬組成物において、有効成分は、単独で、または別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬担体と混合して動物や人間に投与され得る。適切な単位投与形態には、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口懸濁液または溶液などの経口経路形態、舌下および口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内および鼻腔内投与形態、並びに直腸投与形態が含まれる。好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤として薬学的に許容される賦形剤（vehicles）を含む。これらは、場合によって、滅菌水または生理食塩水を加えることで、注射用溶液の構成を可能にする、特に等張性、滅菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムの塩化物など、またはこれら塩の混合物）または乾燥、特に凍結乾燥組成物であり得る。注射可能な使用に適した薬学的形態は、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む配合物；および滅菌注射用溶液または分散液を即時に調製するための滅菌粉末を含む。いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性がなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対抗するように保存されなければならない。本発明の阻害剤を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、並びに油中で調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤には微生物の増殖を防ぐ防腐剤が含まれる。本発明の阻害剤は、中性または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）を含み、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン中で使用することで、もたらされ得る。
【0102】
無菌注射液は、上に列挙した他の成分のいくつかとともに、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じてさらに濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤（vehicles）に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と、任意の追加の所望の成分との粉末を予め無菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。製剤化の際、溶液は、投与製剤と適合する方法で、治療上有効な量で投与される。製剤は、上述の注射用溶液の種類などの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。例えば、水溶液での非経口投与の場合、溶液は必要に応じて適切に緩衝され、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者には既知である。投与量の多少の変動は、治療を受ける被験者の状態に応じて、必然的に発生する。いずれにせよ、投与責任者は個々の被験者に適切な用量を決定する。
【0103】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。しかしながら、これらの例および図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【0104】
［実施例１］
＜材料と方法＞
ＳＡＲ研究（トランケーションおよびＡｌａ－スキャン）で使用したペプチド１ａ～６ｒは、Proteomic Solutions（Saint-Marcel、フランス）から購入した。ペプチド７ａ～ｇ、３ｃ’、５ｘ’、７ａ’～ｇ’は、自動マイクロ波ペプチド合成装置CEM Liberty One（CEM Corporation）で合成した。アミノ酸およびRink Amide MBHA 樹脂はIris Biotech（ドイツ）から購入し、Rink Amide MBHA LL樹脂はSigma-Aldrich/Novabiochem（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。Oxyma pureおよびDICはIris Biotech（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から入手した。HOBt、DIEAおよびTISはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手し、ジクロロメタンとアセトニトリルはVWR Chemicals（米国ペンシルベニア州ラドナー）から入手した。ＤＭＦはCarlo Erba Reagents（ヴァル・ド・ルイユ、フランス）から入手し、ピペリジンはAcros Organics（イルキルヒ、フランス）から入手し、無水酢酸はProlabo（パリ、フランス）から入手した。ラット血清とジメチルスルホキシドは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。エラスターゼ（ブタ膵臓由来、EC 3.4.21.36）はPromega（マディソン、ウィスコンシン州、米国）から購入した。
＜材料と方法＞
ＳＡＲ研究（トランケーションおよびＡｌａ－スキャン）で使用したペプチド１ａ～６ｒは、Proteomic Solutions（Saint-Marcel、フランス）から購入した。ペプチド７ａ～ｇ、３ｃ’、５ｘ’、７ａ’～ｇ’は、自動マイクロ波ペプチド合成装置CEM Liberty One（CEM Corporation）で合成した。アミノ酸およびRink Amide MBHA 樹脂はIris Biotech（ドイツ）から購入し、Rink Amide MBHA LL樹脂はSigma-Aldrich/Novabiochem（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。Oxyma pureおよびDICはIris Biotech（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）から入手した。HOBt、DIEAおよびTISはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手し、ジクロロメタンとアセトニトリルはVWR Chemicals（米国ペンシルベニア州ラドナー）から入手した。ＤＭＦはCarlo Erba Reagents（ヴァル・ド・ルイユ、フランス）から入手し、ピペリジンはAcros Organics（イルキルヒ、フランス）から入手し、無水酢酸はProlabo（パリ、フランス）から入手した。ラット血清とジメチルスルホキシドは、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。エラスターゼ（ブタ膵臓由来、EC 3.4.21.36）はPromega（マディソン、ウィスコンシン州、米国）から購入した。
【0105】
〔固相ペプチド合成〕
すべてのペプチドは、CEM Liberty Oneマイクロ波支援ペプチド合成機でのＦｍｏｃ法を使用した標準的な固相ペプチド合成によって調製された。使用した樹脂は、０．１ｍｍｏｌスケールで１２～１６ペプチド残基（化合物３ｃ’、５ｘ’、７ａ’～ｆ’）を合成するためのRink Amide MBHA（１００～２００メッシュ、ローディング０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）、および０．０３３ｍｍｏｌまたは０．０５５ｍｍｏｌスケールでの２５～２９ペプチド残基（化合物５ｘ、７ａ～ｆ）のためのRink Amide MBHA LL（１００～２００メッシュ、ローディング０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）であった。ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（ＤＭＦ中０．５Ｍ／２Ｍ）を、５倍過剰の各保護アミノ酸を含むカップリング試薬として使用した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHカップリングの場合、二重カップリングを行った。２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液をＦｍｏｃ基の脱保護に使用した。樹脂を反応容器内でＤＭＦ中で一晩膨潤させ、次いでマイクロ波照射下で伸長プロセスを実行した（１ｍＬのＤＩＣ＋０．５ｍＬのOxyma pure、７０℃（２５Ｗ）で１０分間）。脱保護サイクルは、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用いて実施した（７ｍＬを７５℃で３０秒間、次に７ｍＬを７０℃で３分間）。Ｎ末端部分でさらなる修飾／追加のアミノ酸が必要な場合（化合物７ａ、７ｂ、７ｄ、７ｅ、７ｆ）、樹脂を２つまたは３つに分割した。合成の完了後、ペプチド結合樹脂を１５ｍＬのＤＭＦで２回、および１５ｍＬのＤＣＭで２回洗浄した。最後に、側鎖の脱保護および樹脂からのペプチドの切断を行い、ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５）で２～３時間処理することによってペプチドを樹脂から切断した。トリフルオロ酢酸溶液を減圧下で蒸発させ、続いてジエチルエーテル沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄して、粗ペプチドを白色粉末として得た。類似体をＣ１８カラムでのＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、生成物の同一性をＬＣＭＳによって確認した。ペプチドの純度は、すべてのペプチドについて９５％以上の純度であることがわかった。
すべてのペプチドは、CEM Liberty Oneマイクロ波支援ペプチド合成機でのＦｍｏｃ法を使用した標準的な固相ペプチド合成によって調製された。使用した樹脂は、０．１ｍｍｏｌスケールで１２～１６ペプチド残基（化合物３ｃ’、５ｘ’、７ａ’～ｆ’）を合成するためのRink Amide MBHA（１００～２００メッシュ、ローディング０．６７ｍｍｏｌ／ｇ）、および０．０３３ｍｍｏｌまたは０．０５５ｍｍｏｌスケールでの２５～２９ペプチド残基（化合物５ｘ、７ａ～ｆ）のためのRink Amide MBHA LL（１００～２００メッシュ、ローディング０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）であった。ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（ＤＭＦ中０．５Ｍ／２Ｍ）を、５倍過剰の各保護アミノ酸を含むカップリング試薬として使用した。Fmoc-Arg(Pbf)-OHカップリングの場合、二重カップリングを行った。２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液をＦｍｏｃ基の脱保護に使用した。樹脂を反応容器内でＤＭＦ中で一晩膨潤させ、次いでマイクロ波照射下で伸長プロセスを実行した（１ｍＬのＤＩＣ＋０．５ｍＬのOxyma pure、７０℃（２５Ｗ）で１０分間）。脱保護サイクルは、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン溶液を用いて実施した（７ｍＬを７５℃で３０秒間、次に７ｍＬを７０℃で３分間）。Ｎ末端部分でさらなる修飾／追加のアミノ酸が必要な場合（化合物７ａ、７ｂ、７ｄ、７ｅ、７ｆ）、樹脂を２つまたは３つに分割した。合成の完了後、ペプチド結合樹脂を１５ｍＬのＤＭＦで２回、および１５ｍＬのＤＣＭで２回洗浄した。最後に、側鎖の脱保護および樹脂からのペプチドの切断を行い、ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５）で２～３時間処理することによってペプチドを樹脂から切断した。トリフルオロ酢酸溶液を減圧下で蒸発させ、続いてジエチルエーテル沈殿させ、ジエチルエーテルで洗浄して、粗ペプチドを白色粉末として得た。類似体をＣ１８カラムでのＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、生成物の同一性をＬＣＭＳによって確認した。ペプチドの純度は、すべてのペプチドについて９５％以上の純度であることがわかった。
【0106】
〔分析用ＨＰＬＣ〕
Thermo Fisher Scientific ＬＣ－ＭＳデバイス、エレクトロスプレーイオン化源を備えるＬＣＱフリートに接続されたAccela HPLCおよび３Ｄイオントラップアナライザー（コーン電圧は３０Ｖ）でペプチドを分析した。使用したカラムはPhenomenex BioZen（商標）２．６μｍペプチドXB-C18（ＬＣカラム５０×２．１ｍｍ）で、０．１％ギ酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）で溶出し、溶出勾配：０～２分、２０％Ｂ；２～５分、２０～９０％Ｂ；５－６分、９０％Ｂ；７～１０分、２０％Ｂ、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、１０μＬ注入とした。
Thermo Fisher Scientific ＬＣ－ＭＳデバイス、エレクトロスプレーイオン化源を備えるＬＣＱフリートに接続されたAccela HPLCおよび３Ｄイオントラップアナライザー（コーン電圧は３０Ｖ）でペプチドを分析した。使用したカラムはPhenomenex BioZen（商標）２．６μｍペプチドXB-C18（ＬＣカラム５０×２．１ｍｍ）で、０．１％ギ酸水溶液（溶媒Ａ）および０．１％ギ酸アセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）で溶出し、溶出勾配：０～２分、２０％Ｂ；２～５分、２０～９０％Ｂ；５－６分、９０％Ｂ；７～１０分、２０％Ｂ、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、１０μＬ注入とした。
【0107】
〔ＨＰＬＣ精製〕
Breezeソフトウェアによって操作され、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍに設定されたWaters 2487可変吸光度検出器を備えたWaters 1525クロマトグラフィーシステムを使って、セミ分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。GRACE Vydac C-18カラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）を使用し、流速は３ｍＬ／ｍｉｎであった。ペプチドの極性に応じて２つの精製勾配を実行した。
Breezeソフトウェアによって操作され、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍに設定されたWaters 2487可変吸光度検出器を備えたWaters 1525クロマトグラフィーシステムを使って、セミ分取ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。GRACE Vydac C-18カラム（２５０×１０ｍｍ、５μｍ）を使用し、流速は３ｍＬ／ｍｉｎであった。ペプチドの極性に応じて２つの精製勾配を実行した。
【0108】
方法Ａ．０．１％ギ酸水溶液（バッファーＡ）および０．１％ギ酸アセトニトリル（バッファーＢ）で、Ａ／Ｂ（９０：１０）からＡ／Ｂ（５０：５０）まで３０分間、次にＡ／Ｂ（９０：１０）で５分間、続いてＡ／Ｂ（９０：１０）で２分間のアイソクラティック勾配で、粗ペプチドを溶出させた。
【0109】
方法Ｂ．０．１％ギ酸水溶液（バッファーＡ）および０．１％ギ酸アセトニトリル（バッファーＢ）でＡ／Ｂ（８０：２０）からＡ／Ｂ（３０：７０）まで３０分間、次にＡ／Ｂ（９０：１０）で５分間、続いてＡ／Ｂ（９０：１０）で２分間のアイソクラティック勾配で、粗ペプチドを溶出させた。
【0110】
〔ＣＤ分光法〕
円二色性（ＣＤ）実験は、Ｊａｓｃｏ Ｊ８１５分光偏光計で記録した。ＭｅＯＨまたはｐＨ７のＤＰＢＳ中で、１ｍｍの光路長ＣＤキュベットを使用し、２０℃で、１９０～２６０ｎｍの波長範囲にわたってスペクトルを得た。０．２ｎｍステップかつ２ｎｍの帯域幅で、１．０秒の応答で連続スキャンモードを使用した。各三回のスキャンの平均からスペクトラムを得ることで信号対雑音比を改善した。サンプルスペクトルからバックグラウンドを差し引くことによってベースラインを補正した。アルファヘリックス含量は、次の方程式を使用して決定した：％ヘリシティ＝([θ]obs x 100)/(-39500 x (1-2.57)/N)、ここで、[θ]obsは２２０ｎｍでの平均残留楕円率であり、Nはペプチド結合の数である。
円二色性（ＣＤ）実験は、Ｊａｓｃｏ Ｊ８１５分光偏光計で記録した。ＭｅＯＨまたはｐＨ７のＤＰＢＳ中で、１ｍｍの光路長ＣＤキュベットを使用し、２０℃で、１９０～２６０ｎｍの波長範囲にわたってスペクトルを得た。０．２ｎｍステップかつ２ｎｍの帯域幅で、１．０秒の応答で連続スキャンモードを使用した。各三回のスキャンの平均からスペクトラムを得ることで信号対雑音比を改善した。サンプルスペクトルからバックグラウンドを差し引くことによってベースラインを補正した。アルファヘリックス含量は、次の方程式を使用して決定した：％ヘリシティ＝([θ]obs x 100)/(-39500 x (1-2.57)/N)、ここで、[θ]obsは２２０ｎｍでの平均残留楕円率であり、Nはペプチド結合の数である。
【0111】
〔ＮＭＲ立体構造解析〕
ＮＭＲサンプルは、ＮＨＫＩ類似体（３ｃ’、７ｃ’、７ｄ’、および７ｇ’）をｐＨ６．８のＰＢＳ（１０％Ｄ２Ｏ）に最終濃度２ｍＭになるまで溶解することによって調製した。必要に応じて、微量の０．１ＭＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を使用してｐＨを調整した。溶解性に問題がある場合には、最大１０％のＤＭＳＯを追加した。化合物３ｃ’、７ｄ’、および７ｆ’は、４０％ＴＦＥ（ＰＢＳ、１０％Ｄ２Ｏ、ｐＨ６．８）の存在下で研究した。化学シフトはトリメチルシリルプロパン酸（ＴＳＰ）を参照した。
ＮＭＲサンプルは、ＮＨＫＩ類似体（３ｃ’、７ｃ’、７ｄ’、および７ｇ’）をｐＨ６．８のＰＢＳ（１０％Ｄ２Ｏ）に最終濃度２ｍＭになるまで溶解することによって調製した。必要に応じて、微量の０．１ＭＮａＯＨまたはＨＣｌ溶液を使用してｐＨを調整した。溶解性に問題がある場合には、最大１０％のＤＭＳＯを追加した。化合物３ｃ’、７ｄ’、および７ｆ’は、４０％ＴＦＥ（ＰＢＳ、１０％Ｄ２Ｏ、ｐＨ６．８）の存在下で研究した。化学シフトはトリメチルシリルプロパン酸（ＴＳＰ）を参照した。
【0112】
すべてのスペクトルは、モンペリエ大学（ＵＭ）の「Laboratoire de Mesures Physiques (LMP)」にある５ｍｍ三重共鳴凍結プローブ（１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ）を備えたBruker Avance 600 AVANCE III分光計に記録した。同核２ＤスペクトルDQF-COSY、TOCSY (DIPSI2)、ROESY、およびNOESYは通常、２５６～４００実数（ｔ１）×２０４８（ｔ２）複素数データポイントのデータ行列として、States-TPPI法を使用した位相感応モードで記録し；ｔ１増分ごとに１．０～１．５秒の回復遅延を伴う８～４８回のスキャン、および両次元で６００９Ｈｚのスペクトル幅を使用した。混合時間は、TOCSY実験では８０ミリ秒、ROESY／NOESY実験では１５０ミリ秒であった。スペクトルはTopspin（Bruker Biospin）で処理し、Linux(登録商標)ステーション上のTopspinまたはNMRview 64で視覚化した。Ｆ１ドメインでのシフト正弦二乗乗算と線形予測によるアポダイゼーションの後、行列を１０２４（ｔ１）×２０４８（ｔ２）点までゼロフィルした。
【0113】
〔タンパク質分解安定性アッセイ〕
１ｍｇ／ｍＬのエラスターゼのストック溶液を、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む）中で調製した。ストック溶液を、４２μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液中の６５８μＬのストック溶液で０．９４ｍｇ／ｍＬに希釈した。すべてのペプチドをＤＭＳＯに溶解し、６．６６ｍｍｏｌ／Ｌのストック溶液を調製した。さらに希釈したペプチド溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を、６３０μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８中の７０μＬのストック溶液で調製した。１．５ｍＬエッペンドルフに、８９０μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８を導入し、続いて１００μＬのペプチド溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、分解前に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、１０μＬのエラスターゼ溶液（０．９４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応混合物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４時間までインキュベートした。アリコート（５０μＬ）をさまざまな時点で採取し、４５０μＬのＭｅＯＨで反応停止し、４℃で２０分間（１４０００ｒｐｍ）遠心分離した。上清を注射バイアルに移し、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリルの溶出プログラムを使用してＬＣ－ＭＳによって分析した（分析データのセクションを参照）。残りのペプチドおよび切断産物の相対濃度は、ＨＰＬＣクロマトグラム／ＭＳトレースの対応するピークの積分によって算出された。対照ペプチド溶液は酵素を用いずに調製された。対照ペプチド溶液の加水分解は、化合物５ｘ’を除き、Ｔｒｉｓ緩衝液中３７℃で４時間後も安定であることがわかった。すべてのタンパク質分解実験を３回繰り返して実行した。
１ｍｇ／ｍＬのエラスターゼのストック溶液を、Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む）中で調製した。ストック溶液を、４２μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液中の６５８μＬのストック溶液で０．９４ｍｇ／ｍＬに希釈した。すべてのペプチドをＤＭＳＯに溶解し、６．６６ｍｍｏｌ／Ｌのストック溶液を調製した。さらに希釈したペプチド溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を、６３０μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８中の７０μＬのストック溶液で調製した。１．５ｍＬエッペンドルフに、８９０μＬのＴｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８を導入し、続いて１００μＬのペプチド溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、分解前に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、１０μＬのエラスターゼ溶液（０．９４ｍｇ／ｍＬ）を添加した。反応混合物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４時間までインキュベートした。アリコート（５０μＬ）をさまざまな時点で採取し、４５０μＬのＭｅＯＨで反応停止し、４℃で２０分間（１４０００ｒｐｍ）遠心分離した。上清を注射バイアルに移し、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリルの溶出プログラムを使用してＬＣ－ＭＳによって分析した（分析データのセクションを参照）。残りのペプチドおよび切断産物の相対濃度は、ＨＰＬＣクロマトグラム／ＭＳトレースの対応するピークの積分によって算出された。対照ペプチド溶液は酵素を用いずに調製された。対照ペプチド溶液の加水分解は、化合物５ｘ’を除き、Ｔｒｉｓ緩衝液中３７℃で４時間後も安定であることがわかった。すべてのタンパク質分解実験を３回繰り返して実行した。
【0114】
〔構造計算〕
１Ｈ化学シフトは古典的な手順に従って割り当てられた。ＮＯＥクロスピークは、NMRViewソフトウェア内で統合され、割り当てられた。メチレン対プロトン間のＮＯＥピークの体積を１．８Åの基準として使用した。すべての制約の下限を１．８Åに固定し、上限を強い相関、中程度の相関、弱い相関に対してそれぞれ２．７、３．３、および５．０Åに固定した。前述のように、未解決の芳香族、メチレン、およびメチルプロトンのシグナルに対して上限の擬似原子補正を適用した。AMBER 16を使用した構造計算を、クッキング、一般化ボルン陰的溶媒モデルを使用した模擬アニーリングの２段階で実行した。クッキングステージを１０００Ｋで実行し、１００個の初期ランダム構造を生成した。シミュレートされたアニーリング計算を２０ｐｓ（２００００ステップ、長さ１ｆｓ）の間で実行した。まず、温度を急速に上昇させ、最初の５０００ステップでは１０００Ｋに維持し、次にシステムを５００１ステップから１８０００ステップまで１０００Ｋから１００Ｋに徐々に冷却し、最後に残りの２０００ステップで温度を０Ｋに下げた。最初の３０００ステップでは、距離拘束の力定数を２．０から２０ｋｃａｌ・ｍｏｌ－１・Åまで徐々に増加させた。シミュレーションの残りの部分（ステップ３００１～２００００）では、力定数を２０ｋｃａｌ・ｍｏｌ－１・Åに維持した。０．３Åを超える違反のない２０個の最低エネルギー構造がペプチド構造を代表すると考えられた。MOLMOLおよびPyMOLを使用して表現と定量分析を実行した。
１Ｈ化学シフトは古典的な手順に従って割り当てられた。ＮＯＥクロスピークは、NMRViewソフトウェア内で統合され、割り当てられた。メチレン対プロトン間のＮＯＥピークの体積を１．８Åの基準として使用した。すべての制約の下限を１．８Åに固定し、上限を強い相関、中程度の相関、弱い相関に対してそれぞれ２．７、３．３、および５．０Åに固定した。前述のように、未解決の芳香族、メチレン、およびメチルプロトンのシグナルに対して上限の擬似原子補正を適用した。AMBER 16を使用した構造計算を、クッキング、一般化ボルン陰的溶媒モデルを使用した模擬アニーリングの２段階で実行した。クッキングステージを１０００Ｋで実行し、１００個の初期ランダム構造を生成した。シミュレートされたアニーリング計算を２０ｐｓ（２００００ステップ、長さ１ｆｓ）の間で実行した。まず、温度を急速に上昇させ、最初の５０００ステップでは１０００Ｋに維持し、次にシステムを５００１ステップから１８０００ステップまで１０００Ｋから１００Ｋに徐々に冷却し、最後に残りの２０００ステップで温度を０Ｋに下げた。最初の３０００ステップでは、距離拘束の力定数を２．０から２０ｋｃａｌ・ｍｏｌ－１・Åまで徐々に増加させた。シミュレーションの残りの部分（ステップ３００１～２００００）では、力定数を２０ｋｃａｌ・ｍｏｌ－１・Åに維持した。０．３Åを超える違反のない２０個の最低エネルギー構造がペプチド構造を代表すると考えられた。MOLMOLおよびPyMOLを使用して表現と定量分析を実行した。
【0115】
〔ラット血清におけるin-vitro代謝安定性〕
分解前に、ラット血清のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイによって測定したところ、１０８ｍｇ／ｍＬであることがわかった。各ペプチドについて、ＤＭＳＯ中のストック溶液を６．６６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で調製した。溶液７０μＬを取り出し、６３０μＬのMilliQ水に加えてペプチド水溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液５０μＬを添加する前に、３２５μＬのMilliQ水および３７℃で約１０～１５分間プレインキュベートした１２５μＬの非希釈ラット血清を反応させた。混合物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。異なる時点（０分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、５時間、７時間、２４時間、４８時間）でアリコート（２５μＬ）を採取し、２２５μＬのＭｅＯＨで酵素反応を停止させ、すべての血清タンパク質を沈殿させた。エッペンドルフチューブを４℃で２０分間直接遠心分離（１４０００ｒｐｍ）し、沈殿したタンパク質をペレット化することで除去した。上清を注射バイアルに移し、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリル溶出プログラムを使用してＬＣ－ＭＳによって分析した（分析データのセクションを参照）。残りのペプチドおよび切断産物の相対濃度は、ＨＰＬＣクロマトグラム／ＭＳトレースの対応するピークの積分によって計算された。
分解前に、ラット血清のタンパク質含有量をブラッドフォードアッセイによって測定したところ、１０８ｍｇ／ｍＬであることがわかった。各ペプチドについて、ＤＭＳＯ中のストック溶液を６．６６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で調製した。溶液７０μＬを取り出し、６３０μＬのMilliQ水に加えてペプチド水溶液（０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌ）を調製した。０．６６６ｍｍｏｌ／Ｌのペプチド溶液５０μＬを添加する前に、３２５μＬのMilliQ水および３７℃で約１０～１５分間プレインキュベートした１２５μＬの非希釈ラット血清を反応させた。混合物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。異なる時点（０分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、５時間、７時間、２４時間、４８時間）でアリコート（２５μＬ）を採取し、２２５μＬのＭｅＯＨで酵素反応を停止させ、すべての血清タンパク質を沈殿させた。エッペンドルフチューブを４℃で２０分間直接遠心分離（１４０００ｒｐｍ）し、沈殿したタンパク質をペレット化することで除去した。上清を注射バイアルに移し、０．１％ギ酸水溶液および０．１％ギ酸アセトニトリル溶出プログラムを使用してＬＣ－ＭＳによって分析した（分析データのセクションを参照）。残りのペプチドおよび切断産物の相対濃度は、ＨＰＬＣクロマトグラム／ＭＳトレースの対応するピークの積分によって計算された。
【0116】
対照ペプチド溶液はラット血清を含めずに調製された。すべてのペプチド対照溶液は、３７℃の水中で４８時間にわたって安定であることが判明した。すべての血清安定性実験を３回繰り返して実行した。
【0117】
〔細胞培養とトランスフェクション〕
ＨＥＫ－２９３細胞はＡＴＣＣ（American type culture collection, USA）から購入した。それらを、１０％熱不活化ＦＢＳ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）および１％ＰＳ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）を添加したＤＭＥＭ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）中で５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。
ＨＥＫ－２９３細胞はＡＴＣＣ（American type culture collection, USA）から購入した。それらを、１０％熱不活化ＦＢＳ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）および１％ＰＳ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）を添加したＤＭＥＭ（Gibco、Thermo Fisher Scientific、フランス）中で５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーター内で培養した。
【0118】
ペプチドスクリーニングアッセイおよびライブイメージング実験では、メーカーの推奨に従って、jet-PRIME試薬（Polyplus-transfection S.A.、フランス）を使用して細胞にｍｉｔｏＧＣａＭＰ２およびＧＣａＭＰ２プラスミドをトランスフェクトした。これら２つのプラスミドは、それぞれミトコンドリアを標的とするＧＣａＭＰ２タンパク質とサイトゾルを標的とするＧＣａＭＰ２タンパク質を発現する。
【0119】
〔ライブイメージング〕
ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２またはＧＣａＭＰ２プラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞に対してライブイメージング実験を実行した。ウェルあたり５００，０００個の細胞を６ウェルマイクロプレート（NUNC、参照番号153066、Thermo Fisher Scientific、フランス）の１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加した１ｍｌのＤＭＥＭに播種した。播種から４８時間後、メーカーのプロトコルに従って、jet-PRIME試薬を使用して、２μｇのｍｉｔｏＧＣａＭＰ２またはＧＣａＭＰ２プラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、マイクロプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿チャンバーを備えたビデオ顕微鏡下に置いた。次に、６ｍＭの予熱したＭＪ（３７℃）を、３３μＭのペプチド１ａを含むＤＭＥＭ１ｍｌを含むか、または含まず、赤色フェノールを含まず、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳが添加され、０．１５％ＤＭＳＯおよび５％エタノールを含むウェルに添加した。並行して、赤色フェノールを含まず、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳ、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＤＭＥＭ１ｍｌのみを含むウェルを対照条件として使用した。ペプチド１ａの有無にかかわらず、ＭＪを添加したときに、ライブイメージングの取得を開始した。対照条件として、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含み、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加し、赤色フェノールを含まないＤＭＥＭ１ｍｌの添加後に画像取得を開始した。倒立型Zeiss Axio Observer Z1（Zeiss、フランス）と２０ｘ／０．４対物レンズ（Zeiss、フランス）を使用して３０分間２分ごとに動画を取得した。各条件について、３つの独立した実験を実行した。全体として、Zenソフトウェア（Zen 2.3 lite、Zeiss、フランス）およびImageJソフトウェア(バージョン1.52o、NIH、米国）を使用して、条件ごとに５つのＲＯＩを分析した。結果を、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン８．０．１）を使用して、平均値±ＳＥＭとして表す。
ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２またはＧＣａＭＰ２プラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞に対してライブイメージング実験を実行した。ウェルあたり５００，０００個の細胞を６ウェルマイクロプレート（NUNC、参照番号153066、Thermo Fisher Scientific、フランス）の１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加した１ｍｌのＤＭＥＭに播種した。播種から４８時間後、メーカーのプロトコルに従って、jet-PRIME試薬を使用して、２μｇのｍｉｔｏＧＣａＭＰ２またはＧＣａＭＰ２プラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、マイクロプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿チャンバーを備えたビデオ顕微鏡下に置いた。次に、６ｍＭの予熱したＭＪ（３７℃）を、３３μＭのペプチド１ａを含むＤＭＥＭ１ｍｌを含むか、または含まず、赤色フェノールを含まず、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳが添加され、０．１５％ＤＭＳＯおよび５％エタノールを含むウェルに添加した。並行して、赤色フェノールを含まず、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳ、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＤＭＥＭ１ｍｌのみを含むウェルを対照条件として使用した。ペプチド１ａの有無にかかわらず、ＭＪを添加したときに、ライブイメージングの取得を開始した。対照条件として、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含み、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加し、赤色フェノールを含まないＤＭＥＭ１ｍｌの添加後に画像取得を開始した。倒立型Zeiss Axio Observer Z1（Zeiss、フランス）と２０ｘ／０．４対物レンズ（Zeiss、フランス）を使用して３０分間２分ごとに動画を取得した。各条件について、３つの独立した実験を実行した。全体として、Zenソフトウェア（Zen 2.3 lite、Zeiss、フランス）およびImageJソフトウェア(バージョン1.52o、NIH、米国）を使用して、条件ごとに５つのＲＯＩを分析した。結果を、GraphPad Prismソフトウェア（バージョン８．０．１）を使用して、平均値±ＳＥＭとして表す。
【0120】
〔スクリーニングアッセイ〕
設計された化合物の活性を、ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２でトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞で評価した。ウェル当たり４０，０００個の細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加したＤＭＥＭ２００μｌ中のポリ－Ｄ－リジン（参照番号655946、Greiner Bio-One、フランス）でコーティングした９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種から２４時間後、メーカーの推奨に従って、jet-PRIME試薬（Polyplus-transfection S.A.、フランス）を使用して、細胞をウェルあたり５０ｎｇのｍｉｔｏＧＣａＭＰ２プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、マイクロプレートリーダーCLARIOstar（登録商標）（BMG Labtech、フランス）を使用して蛍光の最初の測定を実行した。この測定値は、トランスフェクション時のミトコンドリアへのＣａ２＋の基底レベルを表した。１００μｌのＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＰＢＳ中の、最終濃度６ｍＭの予熱した（３７℃）ＭＪおよび所定の最終濃度の化合物の混合物とともに、細胞をインキュベートした。細胞インキュベーター内で３５分後、マイクロプレートリーダーCLARIOstar（登録商標）を使用して蛍光の２回目の測定を実行した。この測定値は、ペプチド活性に応じたミトコンドリアＣａ２＋のレベルを表した。化合物を、マイクロプレートごとに３回、各ペプチドについて３回または５回の独立した実験でテストした。用量効果曲線については、化合物をマイクロプレートごとに３回、および３回の独立した実験でテストした。結果を２回目と１回目の測定値間の比として表し、これは０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＰＢＳのみを含む化合物を含まない条件に対して正規化されている。結果をGraphPad Prism software (version 8.0.1)を使用したヒストグラムプロットおよび用量反応曲線の平均±ＳＤとして表す。
設計された化合物の活性を、ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２でトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３細胞で評価した。ウェル当たり４０，０００個の細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを添加したＤＭＥＭ２００μｌ中のポリ－Ｄ－リジン（参照番号655946、Greiner Bio-One、フランス）でコーティングした９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種から２４時間後、メーカーの推奨に従って、jet-PRIME試薬（Polyplus-transfection S.A.、フランス）を使用して、細胞をウェルあたり５０ｎｇのｍｉｔｏＧＣａＭＰ２プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、マイクロプレートリーダーCLARIOstar（登録商標）（BMG Labtech、フランス）を使用して蛍光の最初の測定を実行した。この測定値は、トランスフェクション時のミトコンドリアへのＣａ２＋の基底レベルを表した。１００μｌのＰＢＳで洗浄した後、０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＰＢＳ中の、最終濃度６ｍＭの予熱した（３７℃）ＭＪおよび所定の最終濃度の化合物の混合物とともに、細胞をインキュベートした。細胞インキュベーター内で３５分後、マイクロプレートリーダーCLARIOstar（登録商標）を使用して蛍光の２回目の測定を実行した。この測定値は、ペプチド活性に応じたミトコンドリアＣａ２＋のレベルを表した。化合物を、マイクロプレートごとに３回、各ペプチドについて３回または５回の独立した実験でテストした。用量効果曲線については、化合物をマイクロプレートごとに３回、および３回の独立した実験でテストした。結果を２回目と１回目の測定値間の比として表し、これは０．１％ＤＭＳＯおよび５％ＥｔＯＨを含むＰＢＳのみを含む化合物を含まない条件に対して正規化されている。結果をGraphPad Prism software (version 8.0.1)を使用したヒストグラムプロットおよび用量反応曲線の平均±ＳＤとして表す。
【0121】
〔研究に使用したマウス〕
すべてのマウス実験は、ラングドック・ルシヨン地方の「動物実験委員会」および「最高研究省」（認可2017032115087316および2016091313354892）によって承認された。すべての手順は、動物処置に関するフランスの規制（フランス法令2013-118および2020-274）および動物福祉の保護に関する欧州連合の特定のガイドライン（指令2010/63/EU）に従って実行した。マウスは、湿度４０～６０％、周囲温度２１～２２℃、１２時間暗所、１２時間明所のサイクルで維持した。マウス実験は、Janvier Labs（フランス）から購入した１２週齢のC57BL6/Jで実施した。
すべてのマウス実験は、ラングドック・ルシヨン地方の「動物実験委員会」および「最高研究省」（認可2017032115087316および2016091313354892）によって承認された。すべての手順は、動物処置に関するフランスの規制（フランス法令2013-118および2020-274）および動物福祉の保護に関する欧州連合の特定のガイドライン（指令2010/63/EU）に従って実行した。マウスは、湿度４０～６０％、周囲温度２１～２２℃、１２時間暗所、１２時間明所のサイクルで維持した。マウス実験は、Janvier Labs（フランス）から購入した１２週齢のC57BL6/Jで実施した。
【0122】
〔坐骨神経外植片培養とＣＡＲＳイメージング〕
１２週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをペントバルビタール（５４．７ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｋｇ、Centravet、フランス）を使用して安楽死させた。まず、坐骨神経を収集し、ＰＢＳで洗浄し、神経上膜を除去した。次に、５ｍｍ長の神経を、２４ウェルマイクロプレート（NUNC、Thermo Fisher Scientific、フランス）内のＤＭＥＭ５００μｌ中に入れ、DMEMは０．１％ＤＭＳＯを含む３μＭの化合物を含む１０％ＦＢＳと共に、または単独で１％ＰＳを含み、さらに、加湿チャンバー内で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。陰性対照は、化合物を含まない坐骨神経外植片培養物から構成された（１％ＰＳを補充したＤＭＥＭのみ、１０％ＦＢＳおよび０．１％ＤＭＳＯを含むかまたは含まない）。無傷の坐骨神経を収集し、直ちに４％ＰＦＡで固定したものは、ＣＡＲＳイメージング用の健康なミエリン鞘の対照として用いた。２４時間培養した後、坐骨神経外植片をＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡ水溶液（電子顕微鏡科学、サーモフィッシャーサイエンティフィック、フランス）中で室温で１時間固定した。すべてのＣＡＲＳ画像を、遅延線で補完されたＯＰＯ（Zeiss、フランス）に接続された２光子顕微鏡LSM 7 MPで取得した。２０倍の水浸対物レンズ（W Plan Apochromat DIC VIS-IR、Zeiss、フランス）を画像取得に使用した。各取得は３つの独立した実験で行なった。各実験では、Zenソフトウェア（Zen 2.3 lite、Zeiss、フランス）を使用して、条件ごとに３つのＲＯＩを使用して、フィールドごとに損傷した線維の割合を定量化した。結果を平均値±ＳＤとして表す。
１２週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをペントバルビタール（５４．７ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｋｇ、Centravet、フランス）を使用して安楽死させた。まず、坐骨神経を収集し、ＰＢＳで洗浄し、神経上膜を除去した。次に、５ｍｍ長の神経を、２４ウェルマイクロプレート（NUNC、Thermo Fisher Scientific、フランス）内のＤＭＥＭ５００μｌ中に入れ、DMEMは０．１％ＤＭＳＯを含む３μＭの化合物を含む１０％ＦＢＳと共に、または単独で１％ＰＳを含み、さらに、加湿チャンバー内で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。陰性対照は、化合物を含まない坐骨神経外植片培養物から構成された（１％ＰＳを補充したＤＭＥＭのみ、１０％ＦＢＳおよび０．１％ＤＭＳＯを含むかまたは含まない）。無傷の坐骨神経を収集し、直ちに４％ＰＦＡで固定したものは、ＣＡＲＳイメージング用の健康なミエリン鞘の対照として用いた。２４時間培養した後、坐骨神経外植片をＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡ水溶液（電子顕微鏡科学、サーモフィッシャーサイエンティフィック、フランス）中で室温で１時間固定した。すべてのＣＡＲＳ画像を、遅延線で補完されたＯＰＯ（Zeiss、フランス）に接続された２光子顕微鏡LSM 7 MPで取得した。２０倍の水浸対物レンズ（W Plan Apochromat DIC VIS-IR、Zeiss、フランス）を画像取得に使用した。各取得は３つの独立した実験で行なった。各実験では、Zenソフトウェア（Zen 2.3 lite、Zeiss、フランス）を使用して、条件ごとに３つのＲＯＩを使用して、フィールドごとに損傷した線維の割合を定量化した。結果を平均値±ＳＤとして表す。
【0123】
〔統計分析〕
データはExcel（Microsoft Office Standard 2016）およびGraphPad Prism（バージョン8.0.1）ソフトウェア（Graphpadソフトウェア）で分析し、図の凡例に示すように平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表した。平均値間の統計的差異を、図の凡例に示すように、一元配置分散分析の後にダネットの多重比較検定を使用するか、二元配置分散分析の後にテューキーの多重比較検定を使用して検定した。値間の差異は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001で有意であると見なされる。nsは、有意差がないことを示す。
データはExcel（Microsoft Office Standard 2016）およびGraphPad Prism（バージョン8.0.1）ソフトウェア（Graphpadソフトウェア）で分析し、図の凡例に示すように平均±ＳＤまたはＳＥＭとして表した。平均値間の統計的差異を、図の凡例に示すように、一元配置分散分析の後にダネットの多重比較検定を使用するか、二元配置分散分析の後にテューキーの多重比較検定を使用して検定した。値間の差異は、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001で有意であると見なされる。nsは、有意差がないことを示す。
【0124】
＜結果＞
〔ペプチドの合成１～７〕
ａｌａスキャンを可能にするペプチドライブラリ１、２、欠失研究に使用した３、４、および最適化の最初のラウンドに使用した５は、Proteomic Solutionsで購入した。ペプチドライブラリ６および７は、Ｒｉｎｋアミド樹脂を使用した固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法によって合成された伸長が完了した後、ＴＦＡを使用してペプチドを樹脂から切断し、各合成ペプチドの収率がｘ％～ｘ％の範囲で、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析で判断した場合の純度が少なくとも９５％の目的の化合物を得た。ライブラリー７’のペプチドを除くすべてのペプチド１～７には、in cellulo結合アッセイ中にペプチドの内部移行を確実にするために使用されるＴａｔ細胞膜透過ペプチドが含まれている。ＶＤＡＣ認識に対するＴａｔの効果を評価するために、ＴａｔをＨＫフラグメントのＣ末端またはＮ末端に配置した（図４）。
〔ペプチドの合成１～７〕
ａｌａスキャンを可能にするペプチドライブラリ１、２、欠失研究に使用した３、４、および最適化の最初のラウンドに使用した５は、Proteomic Solutionsで購入した。ペプチドライブラリ６および７は、Ｒｉｎｋアミド樹脂を使用した固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法によって合成された伸長が完了した後、ＴＦＡを使用してペプチドを樹脂から切断し、各合成ペプチドの収率がｘ％～ｘ％の範囲で、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析で判断した場合の純度が少なくとも９５％の目的の化合物を得た。ライブラリー７’のペプチドを除くすべてのペプチド１～７には、in cellulo結合アッセイ中にペプチドの内部移行を確実にするために使用されるＴａｔ細胞膜透過ペプチドが含まれている。ＶＤＡＣ認識に対するＴａｔの効果を評価するために、ＴａｔをＨＫフラグメントのＣ末端またはＮ末端に配置した（図４）。
【0125】
〔結合アッセイ〕
ペプチドの生物学的スクリーニングは、時間および用量依存的にミトコンドリアＶＤＡＣのＨＫ－１に結合および分離するジャスモン酸メチル（ＭＪ）の能力に基づいている（文献１６、２０）。この目的のために、我々はin celluloスクリーニングアッセイを開発し、この研究では、細胞質ＶＤＡＣおよびＨＫ２５を発現するＨＥＫ２９３細胞が、細胞質Ｃａ２＋感知プローブであるＧＣａＭＰ２、またはミトコンドリアマトリックスを対象とする同じプローブであるｍｉｔｏＧＣａＭＰ２をトランスフェクトされる。これらのプローブの使用により、上述のとおりin vivoで示されたように、細胞質およびミトコンドリアのＣａ２＋レベルをリアルタイムでモニタリングすることが可能となった。ＶＤＡＣからＨＫを除去するＭＪを使用することで、細胞内のｍｉｔｏＧＣａＭＰ２蛍光の低下とＧＣａＭＰ２蛍光の増加を通じて測定されるミトコンドリア外へのＣａ２＋放出が誘導された。ＮＨＫＩ配列を模倣する化合物は、ＭＪの存在下でこの放出を遮断し、ＶＤＡＣへの結合を通じてミトコンドリアと細胞質の蛍光レベルを維持する。一方、ＶＤＡＣの活性が低い化合物は、ＭＪの添加で観察されるように、蛍光のミトコンドリアでの減少と細胞質での増加をもたらす。
ペプチドの生物学的スクリーニングは、時間および用量依存的にミトコンドリアＶＤＡＣのＨＫ－１に結合および分離するジャスモン酸メチル（ＭＪ）の能力に基づいている（文献１６、２０）。この目的のために、我々はin celluloスクリーニングアッセイを開発し、この研究では、細胞質ＶＤＡＣおよびＨＫ２５を発現するＨＥＫ２９３細胞が、細胞質Ｃａ２＋感知プローブであるＧＣａＭＰ２、またはミトコンドリアマトリックスを対象とする同じプローブであるｍｉｔｏＧＣａＭＰ２をトランスフェクトされる。これらのプローブの使用により、上述のとおりin vivoで示されたように、細胞質およびミトコンドリアのＣａ２＋レベルをリアルタイムでモニタリングすることが可能となった。ＶＤＡＣからＨＫを除去するＭＪを使用することで、細胞内のｍｉｔｏＧＣａＭＰ２蛍光の低下とＧＣａＭＰ２蛍光の増加を通じて測定されるミトコンドリア外へのＣａ２＋放出が誘導された。ＮＨＫＩ配列を模倣する化合物は、ＭＪの存在下でこの放出を遮断し、ＶＤＡＣへの結合を通じてミトコンドリアと細胞質の蛍光レベルを維持する。一方、ＶＤＡＣの活性が低い化合物は、ＭＪの添加で観察されるように、蛍光のミトコンドリアでの減少と細胞質での増加をもたらす。
【0126】
このアッセイを検証するために、ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２またはその細胞質型ＧＣａＭＰ２をトランスフェクトしたＨＥＫ－２９３細胞のタイムラプスイメージングを実施した。ミトコンドリアまたはサイトゾル内のＣａ２＋の基底レベルは、治療前の少なくとも３０分間は安定していた。ＭＪによる処理（Ｔ＝０）が、少なくとも３０分間、ｍｉｔｏＧＣａＭＰ２蛍光の有意な減少を誘導したことは（図５Ａ）、ミトコンドリアからのＣａ２＋流出を示す。
【0127】
一方で、同じ時間枠で、ＧＣａＭＰ２蛍光が大幅に増加したことは（図５Ｂ）、ミトコンドリアのＣａ２＋放出と同時に細胞質Ｃａ２＋が増加したことを示す。ＭＪ処理によって誘導された蛍光変化は、ＮＨＫ－１配列を模倣するペプチド１ａ（図５ＡのＭＪ＋ペプチド１ａの条件）またはサイトゾル（図５ＢのＭＪ＋ペプチド１ａの条件）によって遮断され、このペプチドが、時間の経過とともにＶＤＡＣを介してミトコンドリアカルシウムの放出を遮断できたことを示す。
【0128】
したがって、このin celluloシステムは、ＶＤＡＣを介したミトコンドリアＣａ２＋放出に対する化合物の活性を測定するための関連アッセイを構成する。このアッセイを使用して、化合物１ａおよび２ａのＩＣ５０はそれぞれ１５．６±２μＭおよび１３．９±３．１μＭと測定された（データは示さず）。これらのデータに沿って、これらの条件を使用して１０μＭでの新しいペプチド活性をスクリーニングした。Ｎ末端またはＣ末端におけるＴａｔペプチドの位置は、ＮＨＫＩペプチドの活性に影響を与えなかった。
【0129】
〔ペプチド１ａおよび２ａにおけるａｌａスキャン〕
ＶＤＡＣ認識に関与するペプチド１ａおよび２ａのアミノ酸を同定するために、両方のペプチドに対してａｌａスキャンを実行した。我々は、すべてのアミノ酸がアラニン送達シリーズ１ｂ－ｍおよび２ｂ－ｍで置換された各ペプチドの１２の誘導体を合成した（図６Ａ、６Ｂ）。シリーズ１およびシリーズ２でＮ末端またはＣ末端におけるＴａｔの位置がそれぞれ異なる２つのシリーズを、上記の結合アッセイを使用して１０μＭ濃度でテストした。２つのシリーズは同等に挙動する。実際、化合物１ｅ－ｆ、１ｉ、２ｅ－ｆ、および２ｉでのＮＨＫ１におけるロイシン６、７およびフェニルアラニン１１のアラニンによる置換は、ＶＤＡＣに対する親和性の低下を引き起こす。化合物１ｌでロイシン１４をアラニンに置換する、同様の低下が引き起こされるが、これは対応する化合物２ｌでは見られない。
ＶＤＡＣ認識に関与するペプチド１ａおよび２ａのアミノ酸を同定するために、両方のペプチドに対してａｌａスキャンを実行した。我々は、すべてのアミノ酸がアラニン送達シリーズ１ｂ－ｍおよび２ｂ－ｍで置換された各ペプチドの１２の誘導体を合成した（図６Ａ、６Ｂ）。シリーズ１およびシリーズ２でＮ末端またはＣ末端におけるＴａｔの位置がそれぞれ異なる２つのシリーズを、上記の結合アッセイを使用して１０μＭ濃度でテストした。２つのシリーズは同等に挙動する。実際、化合物１ｅ－ｆ、１ｉ、２ｅ－ｆ、および２ｉでのＮＨＫ１におけるロイシン６、７およびフェニルアラニン１１のアラニンによる置換は、ＶＤＡＣに対する親和性の低下を引き起こす。化合物１ｌでロイシン１４をアラニンに置換する、同様の低下が引き起こされるが、これは対応する化合物２ｌでは見られない。
【0130】
〔ペプチド１ａ、２ａの欠失研究〕
このａｌａスキャンは、ＶＤＡＣへの適切な結合に有用な最小限の配列を同定するために、ＮＨＫ１配列の欠失研究によって遂行された（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｎ末端欠失は、１ａに基づく７つのペプチド３ａ～ｇの合成を通じて検査され、Ｃ末端欠失は、２ａに由来するペプチドの同等のセット４ａ～ｇによって調査された。２つのシリーズは１０μＭの濃度でテストされた。化合物３ａ～ｃによって証明されるように、残基１～３に及ぶＮＨＫ１のＮ末端部分は必須ではないと思われる。ａｌａスキャンの結果を確認すると、化合物３ｆ～ｇにおけるロイシン６および７の欠失は、ＶＤＡＣとの相互作用に有害である。化合物４ａ～ｃで証明されているように、化合物２ａの最後の３つのＣ末端アミノ酸（ＥＬＫ）を欠失させると、蛍光の低下が誘導された。驚くべきことに、化合物４ｄは、ＶＤＡＣに対して顕著な親和性を保持しており、フェニルアラニン１１がＶＤＡＣとの相互作用における重要な役割を果たしていることが改めて強調される。したがって、ａｌａスキャン研究と欠失研究との組み合わせによって証明されるように、ＮＨＫ１ペプチドの疎水性配列ＡＱＬＬＡＹＹＦ（配列番号８９）は、ＶＤＡＣとの相互作用の核を構成する。
このａｌａスキャンは、ＶＤＡＣへの適切な結合に有用な最小限の配列を同定するために、ＮＨＫ１配列の欠失研究によって遂行された（図６Ｃ、６Ｄ）。Ｎ末端欠失は、１ａに基づく７つのペプチド３ａ～ｇの合成を通じて検査され、Ｃ末端欠失は、２ａに由来するペプチドの同等のセット４ａ～ｇによって調査された。２つのシリーズは１０μＭの濃度でテストされた。化合物３ａ～ｃによって証明されるように、残基１～３に及ぶＮＨＫ１のＮ末端部分は必須ではないと思われる。ａｌａスキャンの結果を確認すると、化合物３ｆ～ｇにおけるロイシン６および７の欠失は、ＶＤＡＣとの相互作用に有害である。化合物４ａ～ｃで証明されているように、化合物２ａの最後の３つのＣ末端アミノ酸（ＥＬＫ）を欠失させると、蛍光の低下が誘導された。驚くべきことに、化合物４ｄは、ＶＤＡＣに対して顕著な親和性を保持しており、フェニルアラニン１１がＶＤＡＣとの相互作用における重要な役割を果たしていることが改めて強調される。したがって、ａｌａスキャン研究と欠失研究との組み合わせによって証明されるように、ＮＨＫ１ペプチドの疎水性配列ＡＱＬＬＡＹＹＦ（配列番号８９）は、ＶＤＡＣとの相互作用の核を構成する。
【0131】
〔結合の最適化〕
したがって、ＶＤＡＣとの相互作用に関与すると疑われるアミノ酸を等価体対応物に置換することを目的とする２番目の最適化のために、配列を短縮したペプチド３ｃおよび４ｄを保持した。こうして、化合物３ｃは、スレオニンが持つヒドロキシル部分の重要性を研究するために、ＮＨＫ１配列の１２位の固有のスレオニンがチロシン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびバリンで置換された新しい一連の化合物５ａ～ｈを提供する。同じシリーズでは、ベータ分岐アミノ酸または芳香族アミノ酸の影響を評価するために、ロイシン１４がバリン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンに置き換えられた。同じ置換を化合物４ｄのロイシン６および７に適用し、ロイシン、トリプトファンおよびチロシンをフェニルアラニン１１の代用物として使用した（データは示さず）。
したがって、ＶＤＡＣとの相互作用に関与すると疑われるアミノ酸を等価体対応物に置換することを目的とする２番目の最適化のために、配列を短縮したペプチド３ｃおよび４ｄを保持した。こうして、化合物３ｃは、スレオニンが持つヒドロキシル部分の重要性を研究するために、ＮＨＫ１配列の１２位の固有のスレオニンがチロシン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびバリンで置換された新しい一連の化合物５ａ～ｈを提供する。同じシリーズでは、ベータ分岐アミノ酸または芳香族アミノ酸の影響を評価するために、ロイシン１４がバリン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンに置き換えられた。同じ置換を化合物４ｄのロイシン６および７に適用し、ロイシン、トリプトファンおよびチロシンをフェニルアラニン１１の代用物として使用した（データは示さず）。
【0132】
５ａ～ｄのスレオニン１２置換は、負に荷電したアスパラギン酸が導入された場合には効率的ではなく、有害ですらあった（５ｂ）。逆に、トリプトファンによるロイシンの置換は、化合物５ｈおよび６ｄによって示されるように、ＶＤＡＣとの相互作用をわずかに増強したが、ロイシン７が置換された６ｈではより有意なレベルであった。最後に、化合物５ｈのロイシン１４をトリプトファンに置換すると、活性が大幅に向上した。したがって、ＮＨＫ１とＶＤＡＣの相互作用は主に疎水性残基によって媒介され、アミノ酸の疎水性スケールに従って最も疎水性の残基と考えられるトリプトファンがそのような相互作用を強化する（文献３５、３６）。
【0133】
これらの結果を活用するために、ポジティブな効果をもたらす修飾を化合物５ｉ－ｚおよび６ｌ－ｒを提供するように組み合わせ、３μＭでテストし、それぞれ３ｃおよび４ｄと比較した（図６）。一連の化合物５ｉ～ｚおよび６ｌ～ｒでは、化合物３ｃおよび４ｄがベンチマークとして機能する。参照濃度を１０μＭから３μＭに下げると、ＶＤＡＣを部分的に閉じた状態に維持できるようになり、カルシウム流出を遮断する化合物をよりよく区別できるトリプトファンによる疎水性ロイシン６または７の個々の置換は中程度の親和性の増加を伴ったが、化合物５ｘ、５ｚ、および６ｑで示されるように、単一のペプチドにおける２つの置換を組み合わせるとより大きな効果が得られた。それにもかかわらず、フェニルアラニン１１の置換の分析はそれほど明白ではないが、５ｌ、６ｑのロイシンまたは５ｔ、５ｍ、６ｍ、６ｏのチロシンはこの位置に同様に収容される。最後に、トリプトファンによるロイシン１４の置換も、化合物５ｌ、５ｔ、５ｘ、および５ｚに有益な効果をもたらす。
【0134】
〔らせん折りの強化による結合の最適化〕
我々が導入した最後の修正は、ＮＨＫ１配列で採用されているらせん折りを検討することを目的としていた（文献３７）。この目的のために、ペプチドシリーズ７を送達するＨＫ－１配列のＮ末端側に、いずれもα－ヘリックス誘導物質であるアラニンおよびα－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ、Ｕ）を交互に配置した配列を導入した。さらに、この修飾は、タンパク質分解による切断に対する化合物の感受性を低下させることが期待される。ｉｏさらに、疎水性相互作用が適切なＶＤＡＣ相互作用を条件付けたため、以前の研究で膜内へのペプチド挿入を強化することが示されたＮ末端キャッピングとして（文献３８）、３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕジペプチドを導入した（図８Ａ）。
我々が導入した最後の修正は、ＮＨＫ１配列で採用されているらせん折りを検討することを目的としていた（文献３７）。この目的のために、ペプチドシリーズ７を送達するＨＫ－１配列のＮ末端側に、いずれもα－ヘリックス誘導物質であるアラニンおよびα－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ、Ｕ）を交互に配置した配列を導入した。さらに、この修飾は、タンパク質分解による切断に対する化合物の感受性を低下させることが期待される。ｉｏさらに、疎水性相互作用が適切なＶＤＡＣ相互作用を条件付けたため、以前の研究で膜内へのペプチド挿入を強化することが示されたＮ末端キャッピングとして（文献３８）、３－ＣＦ３Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕジペプチドを導入した（図８Ａ）。
【0135】
シリーズ７ａ～ｇは、スクリーニングアッセイで１０μＭおよび３μＭでテストされた（図８Ａ～Ｂ）。このシリーズの中で、１０μＭで試験した場合、７ｂ、７ｄ、７ｆ、および７ｇは化合物３ｃおよび５ｘよりも有意に高い活性を示したが（図８Ａ）、３μＭでは７ｆと７ｇのみが依然として有意に高い活性を示した（図８Ｂ）。したがって、それらの活性を正確に定義するために、７ｆおよび７ｇをスクリーニングアッセイで用量反応方式テストした（データは示さず）。それらのＩＣ５０は、それぞれ２．６±０．６μＭおよび１．７±０．２μＭと評価された。このＳＡＲ研究を要約すると、ＨＫのＡＱＬＬＡＹＹＦ配列（配列番号３６）には、ＨＫとの相互作用に関与する重要な残基が含まれる。より具体的には、ロイシン６、７およびフェニルアラニン１１で構成される疎水性パッチが相互作用を支配し、トリプトファンによるそれらの置換が相互作用を強化した。さらに、スクリーニングアッセイで化合物１ａ、５ｘ、および７ｇに対して行われた用量反応実験で示されるように、最適化のさまざまなステップにより、ＶＤＡＣを介したミトコンドリアＣａ２＋流出に対する活性が１０倍増加する（図９）。さらに、異なる一連の化合物のヘリカルホイール投影により、ＶＤＡＣ相互作用に関与する残基はヘリックスの同じ面に配置された（データは示さず）。
【0136】
〔円二色性〕
ＰＢＳ緩衝液中の化合物３ｃ、５ｘ、７ａ～ｆを円二色性により分析した。化合物３ｃ、５ｘ、７ａは構造化されていないが、化合物７ｂ～ｆは、α－ヘリックスで部分的に構造化されたペプチドと一致する約２１０および２２０ｎｍ負の最大値を示す（データは示さず）。ＮＨＫ１ペプチドの構造におけるＮ末端に導入されたＡｉｂの寄与を評価するために、Ｔａｔ配列を含まない化合物３ｃ’、７ａ’、７ｂ’、および７ｃ’を合成した（データは示さず）。ＰＢＳ溶液中では、化合物７ｂ’および７ｃ’で観察されるように、ＮＨＫ配列のＮ末端に導入されたＡＵ反復配列により、化合物がらせんとして徐々に折りたたまれることが可能になる（データは示さず）。ＰＢＳ溶液ではＣＤスペクトルが対象の波長範囲全体に拡張できないため、メタノール中で分析を実行した。化合物３ｃは、ＰＢＳ中でランダムコイル構造をとりながら、メタノールのコスモトロピック効果によりらせんとして折り畳まれ始める。それにもかかわらず、３つのＡｉｂを含む化合物７ｄ’がシリーズの中で最も構造化されているため、配列に導入されたＡｉｂの量に応じてフォールディングに関してＰＢＳで観察された傾向が確認された（データは示さず）。
ＰＢＳ緩衝液中の化合物３ｃ、５ｘ、７ａ～ｆを円二色性により分析した。化合物３ｃ、５ｘ、７ａは構造化されていないが、化合物７ｂ～ｆは、α－ヘリックスで部分的に構造化されたペプチドと一致する約２１０および２２０ｎｍ負の最大値を示す（データは示さず）。ＮＨＫ１ペプチドの構造におけるＮ末端に導入されたＡｉｂの寄与を評価するために、Ｔａｔ配列を含まない化合物３ｃ’、７ａ’、７ｂ’、および７ｃ’を合成した（データは示さず）。ＰＢＳ溶液中では、化合物７ｂ’および７ｃ’で観察されるように、ＮＨＫ配列のＮ末端に導入されたＡＵ反復配列により、化合物がらせんとして徐々に折りたたまれることが可能になる（データは示さず）。ＰＢＳ溶液ではＣＤスペクトルが対象の波長範囲全体に拡張できないため、メタノール中で分析を実行した。化合物３ｃは、ＰＢＳ中でランダムコイル構造をとりながら、メタノールのコスモトロピック効果によりらせんとして折り畳まれ始める。それにもかかわらず、３つのＡｉｂを含む化合物７ｄ’がシリーズの中で最も構造化されているため、配列に導入されたＡｉｂの量に応じてフォールディングに関してＰＢＳで観察された傾向が確認された（データは示さず）。
【0137】
〔タンパク質分解安定性アッセイ〕
Ｔａｔは、ＮＨＫ１由来ペプチドなどの生物活性カーゴの送達に適切なＣＰＰであることが示されているが、血清安定性が低いため、その使用は制限されている（文献３９、４０）。実際、Ｔａｔ配列の血清中での半減期は６分未満である（文献４１、４２）。さらに、血清はさまざまな切断部位を識別できない酵素の混合物で構成されている。予備実験では、２５％ラット血清中のペプチド３ｃの溶液により、５分後に３ｃの１０％だけが残るため、この不安定性が確認された（データは示さず）。さらに、複数の切断部位により生成される断片が多すぎるため、その濃度はＬＣ－ＭＳ装置の検出限界を下回り、同定が不可能になる。したがって、一般に、好ましい切断部位を同定するには、定義済みのタンパク質分解酵素を使用する方が便利である。
Ｔａｔは、ＮＨＫ１由来ペプチドなどの生物活性カーゴの送達に適切なＣＰＰであることが示されているが、血清安定性が低いため、その使用は制限されている（文献３９、４０）。実際、Ｔａｔ配列の血清中での半減期は６分未満である（文献４１、４２）。さらに、血清はさまざまな切断部位を識別できない酵素の混合物で構成されている。予備実験では、２５％ラット血清中のペプチド３ｃの溶液により、５分後に３ｃの１０％だけが残るため、この不安定性が確認された（データは示さず）。さらに、複数の切断部位により生成される断片が多すぎるため、その濃度はＬＣ－ＭＳ装置の検出限界を下回り、同定が不可能になる。したがって、一般に、好ましい切断部位を同定するには、定義済みのタンパク質分解酵素を使用する方が便利である。
【0138】
私たちの研究室で利用可能な酵素の中のセリンエンドペプチダーゼエラスターゼ（EC 3.4.21.36）は、血清と同様に膵臓に存在し、ＡＱＬＬＡＹＹＦ配列（配列番号：８９）に存在する２つのアミノ酸であるＰ１位のアラニンとロイシンに対する顕著な一次特異性を考慮して選択され、この配列は、ＶＤＡＣ認識のために無傷のままである必要があるが、ＴＡＴには存在しない（文献４３、４４）。したがって、ＮＨＫ１配列はＶＤＡＣへの適切な結合に重要であるため、我々は、Ｔａｔを含まないＮＨＫ１配列の研究に焦点を当て、化合物３ｃ’、５ｘ’、７ａ’および７ｄ’－ｆ’をｐＨ８のＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液中で２時間かけてエラスターゼに曝露した（データは示さず）。
【0139】
この一連の化合物のうち、最初の最適化ステップ後に最も高い活性を誘導したＮＨＫＩ配列を含むペプチド３ｃ’および５ｘ’は、３０分未満で完全に分解された。これらのペプチドの７ｃ’および７ｅ’のＮ末端にＡＵＡＵパッチを追加しても、代謝安定性の改善には効果がなかった（データは示さず）。ただし、７ａ’および７ｄ’のＡｉｂによる８位のアラニン置換により、エラスターゼに対する安定性が向上する。さらに、Ｎ末端がトリアゾール誘導体でキャップされた化合物７ｆ’は、８位のアラニンが保存されているにもかかわらず、最も安定な化合物であった（データは示さず）。半減期が短縮された化合物（３ｃ’、５ｘ’、７ｃ’、および７ｅ’）にはこのアラニンが含まれていたため、エラスターゼの主な切断部位がアラニン８のＣ末端にあったことは注目に値する。したがって、酵素フラグメントはエラスターゼ特異性に従っており、８位のアラニンをＡｉｂに置き換えると安定性が向上した。
【0140】
この安定化がより複雑な媒体中で維持されるかどうかを検証するために、エラスターゼに対して最も高い安定性を示す化合物７ａ’、７ｄ’および７ｆ’、並びにアラニンの代わりに８位にＡｉｂを有する７ｆ’の類似体である化合物７ｇ’を数百のペプチダーゼを含むラット血清中でテストした（文献４３）。化合物３ｃ’および５ｘ’は参照として用いた（図１０）。
【0141】
エラスターゼで得られたデータによれば、化合物３ｃ’はラット血清中に存在するタンパク質分解酵素によって容易に処理され、１時間後には８％のみが残った（図１０）。化合物７ｆ’は同等の速度で消失し、これは、ペプチドをトリアゾール基でキャッピングするだけでは血清中で十分ではないことを示唆する。しかし、８位のアラニンを７ｇのＡｉｂで置換すると、２４時間後も化合物の５４％が維持された。化合物７ａ’は時間の経過とともにより遅い分解を示し、２４時間のインキュベーション後に約６５％の化合物が残存したが、Ｎ末端にＡＵＡＵパッチを含む７ａ’の類似体である７ｄ’は、７５％の化合物の残存という最高の血清ペプチダーゼ耐性を示した。（図１０）。酵素フラグメントは、高分解能タンデム質量分析法によって同定された。
【0142】
結論として、これらの安定性研究は、８位のアラニンがＮＨＫＩ由来ペプチドの酵素的切断の優先部位であると思われることを示した。実際、８位にＡｉｂを付加すると、血清プロテアーゼに対するＮＨＫＩの安定性が向上した。この安定性は、Ｎ末端を３－ＣＦ３－Ｐｈ［Ｔｚ］Ｕ誘導体またはＡＵＡＵパッチでキャッピングすることによってさらに強化された。
【0143】
〔坐骨神経外植片培養物に対するex vivo活性〕
次に、我々は、ＶＤＡＣ１（文献４４、４５、９）を介したミトコンドリアのＣａ２＋放出を含む機構を通じてシュワン細胞が脱髄する坐骨神経外植片培養物に対するＮＨＫＩ由来化合物の活性をテストした。コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）非線形顕微鏡を使用して、坐骨神経外植片における無傷のミエリンを画像化および定量化した。このイメージング方法は特定の標識を必要とせず、ミエリン鞘の分析に適する（文献４７，４８）。ＣＡＲＳを使用して画像化された無傷の坐骨神経では、ＳＣによって生成されたミエリン鞘は、ランヴィエ絞輪を除いて（図１１）、軸索を囲む連続した線を形成する（図１１）。細胞培養培地中で神経をインキュベートしてから２４時間後、球の形成を特徴とする自発的脱髄が起こる（図１１）。画像化された線維の総数に対する損傷した線維、つまり球形成を示す線維の割合を測定することによって脱髄を定量化した。
次に、我々は、ＶＤＡＣ１（文献４４、４５、９）を介したミトコンドリアのＣａ２＋放出を含む機構を通じてシュワン細胞が脱髄する坐骨神経外植片培養物に対するＮＨＫＩ由来化合物の活性をテストした。コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）非線形顕微鏡を使用して、坐骨神経外植片における無傷のミエリンを画像化および定量化した。このイメージング方法は特定の標識を必要とせず、ミエリン鞘の分析に適する（文献４７，４８）。ＣＡＲＳを使用して画像化された無傷の坐骨神経では、ＳＣによって生成されたミエリン鞘は、ランヴィエ絞輪を除いて（図１１）、軸索を囲む連続した線を形成する（図１１）。細胞培養培地中で神経をインキュベートしてから２４時間後、球の形成を特徴とする自発的脱髄が起こる（図１１）。画像化された線維の総数に対する損傷した線維、つまり球形成を示す線維の割合を測定することによって脱髄を定量化した。
【0144】
最初の実験セットでは、スクリーニングアッセイの最も活性な化合物、つまり７ｄおよび７ｇ、および対照として使用した関連化合物３ｃおよび５ｘを、培地中で血清を含まない３μＭでテストした（データは示さず）。無血清培地中で２４時間後、化合物３ｃは陰性対照と同じ割合の損傷線維を示したが、他のすべての化合物は損傷線維のレベルを有意に減少させた（データは示さず）。以前の実験と一致して、最適化された化合物７ｄおよび７ｇは、参照化合物３ｃおよび５ｘよりも大幅に活性が高かった。さらに、これらの最適化された化合物は、無傷の神経と同じミエリン鞘パターンを顕著に示した（データは示さず）。無血清培地条件で得られた結果は、最適化された化合物がミトコンドリアのＣａ２＋放出の遮断に対する活性を増強しているため、スクリーニングアッセイから得られた結果と相関する。
【0145】
次の一連の実験では、血清を添加した培地中で同じ化合物を３μＭで試験した（図１１Ａ～Ｃ）。A試験したすべての化合物の中で、化合物７ｄおよび７ｇによる治療のみが神経線維損傷を有意に減少させ、これらのペプチドが脱髄を阻止するのに有効であり、効果を発揮するのに十分な期間血清中で安定していることを示す。注目すべきことに、これらの２つの化合物は、無傷の神経と同様のレベルでミエリン鞘を有意に保存することができた（図１１Ａ～Ｃ）。
【0146】
結論として、以上の結果は化合物７ｄおよび７ｇのより高いタンパク質分解安定性、つまりＡＵＡＵパッチまたはＮ末端のトリアゾール部分と組み合わせて使用される８位のＡ８Ｕ置換のポジティブな効果を確認した。
【0147】
＜考察＞
ＨＫ１およびＨＫ２に結合したＶＤＡＣ１の構造に基づく２つの分子モデルが提案された（文献４６、４７）。どちらのモデルも細孔の上部に位置するＨＫを持つ同様の形状をしており、チャネルを閉じている。ＨＫＮ末端ヘリックスを構成する２５残基は、Ｎ末端ＶＤＡＣヘリックスとバレルの壁の間に挟まれている。ＨＫ２のセリンを無極性ロイシンに変異させると、変異体の安定性およびＶＤＡＣへの結合が増加した。Ａｌａスキャンと欠失研究とを組み合わせることで、ＡＱＬＬＡＹＹＦ配列（配列番号８９）とそのロイシンおよびフェニルアラニンがＶＤＡＣ相互作用において極めて重要であることを同定することができる。これら３つのアミノ酸をトリプトファンなどのより疎水性の高いものに置換すると、ＶＤＡＣとの相互作用が強化され、疎水性と結合能力との関係の仮説が裏付けられた（文献４８）。ＨＫのＮ末端配列はらせん構造をとっており（文献３７）、我々は、ロイシン６、７およびフェニルアラニン１１がヘリックスの同じ面に位置する疎水性パッチを構成する可能性を考慮した。そこで、ＨＫ配列にＡｉｂなどのヘリックス誘導因子を加えることにより、ヘリックス構造を強化することを試みた。予想通り、このような置換はヘリックス構造を誘導し、ヘリックス構造は緩衝液よりもメタノールのような有機溶媒中でより顕著であり、細孔への結合親和性の増加を伴う。それにもかかわらず、この結果は、水で満たされた細孔内のＮ末端ヘリックスを塞ぐ分子モデルに関しては直観に反したものであった。実際、ポリンチャネルはほとんどが正に帯電しているが、負に帯電した残基Ｅ６６、Ｅ７３、Ｋ７４、Ｄ７８、Ｅ１８９、Ｅ２０３は、ＶＤＡＣの細胞質露出ループ上に位置し、ＨＫの結合に必須であることが確認されているが（文献４９）、結合に関与するＨＫのＮ末端領域の残基についてほとんど知られていない（文献５０）。実際、ＶＤＡＣとの適切な相互作用に不可欠なＨＫのＮ末端ヘリックスは、大部分が疎水性残基で構成されており、荷電したＶＤＡＣ残基に直接結合することができない。それにもかかわらず、さまざまな研究では、ＨＫ結合の重要な残基としてＥ７３が強調されており（文献５１）、これはＨＫ１結合を無効にするＥ７３Ｑ変異によって裏付けられている。Ｅ７３はβ－バレルの外面の異常な位置にあり、膜の方向を向いている（文献５２、３、４）。Ｅ７３は、光親和性アプローチによって、コレステロールおよびニューロステロイドへの特別な結合部位であることも同定された（文献５３）。この場合、ＶＤＡＣへのステロイドの結合はそのコンダクタンス容量に影響を与えないが、ステロイド結合部位がチャネル二量体化またはヘキソキナーゼ媒介シグナル伝達に関与している可能性が高いことを示唆する。コレステロール負荷がＶＤＡＣへのＨＫ結合に影響を与えるという証拠により、コレステロールヒドロキサム酸誘導体であるオレソキシムの開発が行われた。最近、疎水性の高いオレソキシムが水で満たされたＶＤＡＣ細孔に入らず、タンパク質脂質界面で相互作用することが示された（文献５４）。したがって、脂質二重層内に挿入されていると考えられるＨＫヘリックスについても示唆されているように（文献５０）、疎水性３－ＣＦ３－Ａｒ［Ｔｚ］タグを持つ化合物７ｆは、ＶＤＡＣのβバレルの疎水性外部と相互作用する同様の挙動を示す可能性がある。さらに、化合物７ｆに存在するものと同様の分子パターンを特徴とするさまざまな小分子は、ＶＤＡＣ－１と相互作用することができ、それらの結合はマイクロスケール熱泳動によって測定された（文献５５、５６）。この研究で開発した疎水性の安定化ヘリックスの性質により、膜とＶＤＡＣの間の膜界面でのヘリックスの直接相互作用が促進される。したがって、電気生理学的測定によって裏付けられたモデルで最近提案されているように、ＨＫヘリックスは、ＨＫ／ＶＤＡＣ相互作用を開始する膜アンカーとして定義できる（文献５７）。この文脈において、このようなヘリックスは、ＶＤＡＣインターフェイス上のＮＨＫ１配列を正しく配置できる架橋プローブの開発ツールとして機能する。
ＨＫ１およびＨＫ２に結合したＶＤＡＣ１の構造に基づく２つの分子モデルが提案された（文献４６、４７）。どちらのモデルも細孔の上部に位置するＨＫを持つ同様の形状をしており、チャネルを閉じている。ＨＫＮ末端ヘリックスを構成する２５残基は、Ｎ末端ＶＤＡＣヘリックスとバレルの壁の間に挟まれている。ＨＫ２のセリンを無極性ロイシンに変異させると、変異体の安定性およびＶＤＡＣへの結合が増加した。Ａｌａスキャンと欠失研究とを組み合わせることで、ＡＱＬＬＡＹＹＦ配列（配列番号８９）とそのロイシンおよびフェニルアラニンがＶＤＡＣ相互作用において極めて重要であることを同定することができる。これら３つのアミノ酸をトリプトファンなどのより疎水性の高いものに置換すると、ＶＤＡＣとの相互作用が強化され、疎水性と結合能力との関係の仮説が裏付けられた（文献４８）。ＨＫのＮ末端配列はらせん構造をとっており（文献３７）、我々は、ロイシン６、７およびフェニルアラニン１１がヘリックスの同じ面に位置する疎水性パッチを構成する可能性を考慮した。そこで、ＨＫ配列にＡｉｂなどのヘリックス誘導因子を加えることにより、ヘリックス構造を強化することを試みた。予想通り、このような置換はヘリックス構造を誘導し、ヘリックス構造は緩衝液よりもメタノールのような有機溶媒中でより顕著であり、細孔への結合親和性の増加を伴う。それにもかかわらず、この結果は、水で満たされた細孔内のＮ末端ヘリックスを塞ぐ分子モデルに関しては直観に反したものであった。実際、ポリンチャネルはほとんどが正に帯電しているが、負に帯電した残基Ｅ６６、Ｅ７３、Ｋ７４、Ｄ７８、Ｅ１８９、Ｅ２０３は、ＶＤＡＣの細胞質露出ループ上に位置し、ＨＫの結合に必須であることが確認されているが（文献４９）、結合に関与するＨＫのＮ末端領域の残基についてほとんど知られていない（文献５０）。実際、ＶＤＡＣとの適切な相互作用に不可欠なＨＫのＮ末端ヘリックスは、大部分が疎水性残基で構成されており、荷電したＶＤＡＣ残基に直接結合することができない。それにもかかわらず、さまざまな研究では、ＨＫ結合の重要な残基としてＥ７３が強調されており（文献５１）、これはＨＫ１結合を無効にするＥ７３Ｑ変異によって裏付けられている。Ｅ７３はβ－バレルの外面の異常な位置にあり、膜の方向を向いている（文献５２、３、４）。Ｅ７３は、光親和性アプローチによって、コレステロールおよびニューロステロイドへの特別な結合部位であることも同定された（文献５３）。この場合、ＶＤＡＣへのステロイドの結合はそのコンダクタンス容量に影響を与えないが、ステロイド結合部位がチャネル二量体化またはヘキソキナーゼ媒介シグナル伝達に関与している可能性が高いことを示唆する。コレステロール負荷がＶＤＡＣへのＨＫ結合に影響を与えるという証拠により、コレステロールヒドロキサム酸誘導体であるオレソキシムの開発が行われた。最近、疎水性の高いオレソキシムが水で満たされたＶＤＡＣ細孔に入らず、タンパク質脂質界面で相互作用することが示された（文献５４）。したがって、脂質二重層内に挿入されていると考えられるＨＫヘリックスについても示唆されているように（文献５０）、疎水性３－ＣＦ３－Ａｒ［Ｔｚ］タグを持つ化合物７ｆは、ＶＤＡＣのβバレルの疎水性外部と相互作用する同様の挙動を示す可能性がある。さらに、化合物７ｆに存在するものと同様の分子パターンを特徴とするさまざまな小分子は、ＶＤＡＣ－１と相互作用することができ、それらの結合はマイクロスケール熱泳動によって測定された（文献５５、５６）。この研究で開発した疎水性の安定化ヘリックスの性質により、膜とＶＤＡＣの間の膜界面でのヘリックスの直接相互作用が促進される。したがって、電気生理学的測定によって裏付けられたモデルで最近提案されているように、ＨＫヘリックスは、ＨＫ／ＶＤＡＣ相互作用を開始する膜アンカーとして定義できる（文献５７）。この文脈において、このようなヘリックスは、ＶＤＡＣインターフェイス上のＮＨＫ１配列を正しく配置できる架橋プローブの開発ツールとして機能する。
【0148】
［実施例２］
ＨＫペプチド５ｚを発現するＡＡＶ９ウイルス（ＡＡＶ９－ＨＫペプチド）を作製した。ＨＥＫ２９３細胞に対照ＡＡＶ９またはＡＡＶ９－ＨＫペプチドを感染させたか、あるいは感染させなかった。２日後、ミトコンドリア内のカルシウムで蛍光を発する蛍光色素Ｒｈｏｄ－２とともに細胞をインキュベートした。１５分後、感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）とともにインキュベートし、非感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）＋５ｚペプチド（５μＭ）とともに４０分間インキュベートした。Ｒｈｏｄ－２色素をイメージングする写真を５分ごとに撮影した。
ＨＫペプチド５ｚを発現するＡＡＶ９ウイルス（ＡＡＶ９－ＨＫペプチド）を作製した。ＨＥＫ２９３細胞に対照ＡＡＶ９またはＡＡＶ９－ＨＫペプチドを感染させたか、あるいは感染させなかった。２日後、ミトコンドリア内のカルシウムで蛍光を発する蛍光色素Ｒｈｏｄ－２とともに細胞をインキュベートした。１５分後、感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）とともにインキュベートし、非感染細胞をジャスモン酸メチル（６ｍＭ）＋５ｚペプチド（５μＭ）とともに４０分間インキュベートした。Ｒｈｏｄ－２色素をイメージングする写真を５分ごとに撮影した。
【0149】
ジャスモン酸メチルは、以前の実験で非感染細胞に見られた減少と同様に、対照ウイルスに感染した細胞のミトコンドリアにおいてＲｈｏｄ－２蛍光の減少を誘導した。５ｚペプチドを発現するウイルスに感染した細胞、または５ｚペプチドで処理した細胞では減少は起こらなかった（図１２）。
【0150】
これは、５ｚペプチドを発現するＡＡＶ９ウイルスが、ペプチド５ｚのように、ジャスモン酸メチルの存在下でミトコンドリアのカルシウム放出を防止することを示している。ＡＡＶ９の発現は、標的細胞における抗脱髄ペプチドの発現を持続する効率的な方法となる。
【0151】
＜参考文献＞
本出願全体を通じて、さまざまな参考文献が本発明に関係する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
1. Sander, P., Gudermann, T. & Schredelseker, J. A Calcium Guard in the Outer Membrane: Is VDAC a Regulated Gatekeeper of Mitochondrial Calcium Uptake? Int. J. Mol. Sci. 22, (2021).
2. Shoshan-Barmatz, V. et al. VDAC, a multi-functional mitochondrial protein regulating cell life and death. Mol. Aspects Med. 31, 227-285 (2010).
3. Hiller, S. et al. Solution Structure of the Integral Human Membrane Protein VDAC-1 in Detergent Micelles. Science321, 1206-1210 (2008).
4. Ujwal, R. et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Åresolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17742-17747 (2008).
5. Choudhary, O. P. et al. Structure guided simulations illuminate the mechanism of ATP transport through VDAC1. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 626-632 (2014).
6. De Pinto, V. et al. Determination of the Conformation of the Human VDAC1 N-Terminal Peptide, a Protein Moiety Essential for the Functional Properties of the Pore. ChemBioChem 8, 744-756 (2007).
7. Manzo, G. et al. Folded Structure and Membrane Affinity of the N-Terminal Domain of the Three Human Isoforms of the Mitochondrial Voltage-Dependent Anion-Selective Channel. ACS Omega3, 11415-11425 (2018).
8. Shoshan-Barmatz, V., Pittala, S. & Mizrachi, D. VDAC1 and the TSPO: Expression, Interactions, and Associated Functions in Health and Disease States. Int. J. Mol. Sci. 20, 3348 (2019).
9. Winquist, R. J. & Gribkoff, V. K. Targeting putative components of the mitochondrial permeability transition pore for novel therapeutics. Biochem. Pharmacol. 177, 113995 (2020).
10. Klapper-Goldstein, H. et al. VDAC1 in the diseased myocardium and the effect of VDAC1-interacting compound on atrial fibrosis induced by hyperaldosteronism. Sci. Rep. 10, (2020).
11. Wilting, F. et al. The antiarrhythmic compound efsevin directly modulates voltage-dependent anion channel 2 by binding to its inner wall and enhancing mitochondrial Ca2+ uptake. Br. J. Pharmacol. 177, 2947-2958 (2020).
12. van Delft, M. F. et al. A small molecule interacts with VDAC2 to block mouse BAK-driven apoptosis. Nat. Chem. Biol. 15, 1057-1066 (2019).
13. Shoshan-Barmatz, V., Krelin, Y., Shteinfer-Kuzmine, A. & Arif, T. Voltage-Dependent Anion Channel 1 As an Emerging Drug Target for Novel Anti-Cancer Therapeutics. Front. Oncol. 7, (2017).
14. Zhang, E. et al. Preserving Insulin Secretion in Diabetes by Inhibiting VDAC1 Overexpression and Surface Translocation in β Cells. Cell Metab. (2018) doi:10.1016/j.cmet.2018.09.008.
15. Pittala, S. et al. The VDAC1-based R-Tf-D-LP4 Peptide as a Potential Treatment for Diabetes Mellitus. Cells 9, (2020).
16. Sohlang, M. N. & Majaw, S. Altered VDAC-HK association and apoptosis in mouse peripheral blood lymphocytes exposed to diabetic condition: an in vitro and in vivo study. Arch. Physiol. Biochem. 1-11 (2021) doi:10.1080/13813455.2020.1867187.
17. Kim, J. et al. VDAC oligomers form mitochondrial pores to release mtDNA fragments and promote lupus-like disease. Science 366, 1531-1536 (2019).
18. Smilansky, A. et al. The Voltage-dependent Anion Channel 1 Mediates Amyloid β Toxicity and Represents a Potential Target for Alzheimer Disease Therapy. J. Biol. Chem. 290, 30670-30683 (2015).
19. Shoshan-Barmatz, V., Nahon-Crystal, E., Shteinfer-Kuzmine, A. & Gupta, R. VDAC1, mitochondrial dysfunction, and Alzheimer’s disease. Pharmacol. Res. 131, 87-101 (2018).
20. Rostovtseva, T. K. et al. α-Synuclein Shows High Affinity Interaction with Voltage-dependent Anion Channel, Suggesting Mechanisms of Mitochondrial Regulation and Toxicity in Parkinson Disease*. J. Biol. Chem. 290, 18467-18477 (2015).
21. Karachitos, A., Grobys, D., Kulczynska, K., Sobusiak, A. & Kmita, H. The Association of VDAC with Cell Viability of PC12 Model of Huntington’s Disease. Front. Oncol. 6, (2016).
22. Israelson, A. et al. Misfolded Mutant SOD1 Directly Inhibits VDAC1 Conductance in a Mouse Model of Inherited ALS. Neuron 67, 575-587 (2010).
23. Magri, A. et al. Hexokinase I N-terminal based peptide prevents the VDAC1-SOD1 G93A interaction and re-establishes ALS cell viability. Sci. Rep. 6, 34802 (2016).
24. Pittala, S., Krelin, Y., Kuperman, Y. & Shoshan-Barmatz, V. A Mitochondrial VDAC1-Based Peptide Greatly Suppresses Steatosis and NASH-Associated Pathologies in a Mouse Model. Mol. Ther. 27, 1848-1862 (2019).
25. Pittala, S., Krelin, Y. & Shoshan-Barmatz, V. Targeting Liver Cancer and Associated Pathologies in Mice with a Mitochondrial VDAC1-Based Peptide. Neoplasia N. Y. N 20, 594-609 (2018).
26. Bryan, N. & Raisch, K. P. Identification of a mitochondrial-binding site on the N-terminal end of hexokinase II. Biosci. Rep. 35, (2015).
27. Abramov, A. Y., Berezhnov, A. V., Fedotova, E. I., Zinchenko, V. P. & Dolgacheva, L. P. Interaction of misfolded proteins and mitochondria in neurodegenerative disorders. Biochem. Soc. Trans. 45, 1025-1033 (2017).
28. Magri, A. & Messina, A. Interactions of vdac with proteins involved in neurodegenerative aggregation: an opportunity for advancement on therapeuti c molecules. Curr. Med. Chem. 24, 4470-4487 (2017).
29. Tricaud, N. et al. Schwann cell demyelination is triggered by a transient mitochondrial calcium release through Voltage Dependent Anion Channel 1. bioRxiv581157 (2019) doi:10.1101/581157.
30. Tricaud, N. & Park, H. T. Wallerian demyelination: chronicle of a cellular cataclysm. Cell. Mol. Life Sci. 74, 4049-4057 (2017).
31. Goldin, N. et al. Methyl jasmonate binds to and detaches mitochondria-bound hexokinase. Oncogene 27, 4636-4643 (2008).
32. Magalon, K. et al. Olesoxime accelerates myelination and promotes repair in models of demyelination. Ann. Neurol. 71, 213-226 (2012).
33. Weber, J. J., Clemensson, L. E., Schioth, H. B. & Nguyen, H. P. Olesoxime in neurodegenerative diseases: Scrutinising a promising drug candidate. Biochem. Pharmacol. 168, 305-318 (2019).
34. Hantke, J. et al. A mutation in an alternative untranslated exon of hexokinase 1 associated with hereditary motor and sensory neuropathy -- Russe (HMSNR). Eur. J. Hum. Genet. EJHG17, 1606-1614 (2009).
35. Wilce, M. C. J., Aguilar, M.-Isabel. & Hearn, M. T. W. Physicochemical Basis of Amino Acid Hydrophobicity Scales: Evaluation of Four New Scales of Amino Acid Hydrophobicity Coefficients Derived from RP-HPLC of Peptides. Anal. Chem. 67, 1210-1219 (1995).
36. Wimley, W. C. & White, S. H. Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol. 3, 842-848 (1996).
37. Mulichak, A. M., Wilson, J. E., Padmanabhan, K. & Garavito, R. M. The structure of mammalian hexokinase-1. Nat. Struct. Biol. 5, 555-560 (1998).
38. Das, S. et al. Enhancing the Antimicrobial Activity of Alamethicin F50/5 by Incorporating N-terminal Hydrophobic Triazole Substituents. Chem. - Eur. J. 23, 17964-17972 (2017).
39. Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J. & Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: Proteolytic stability requirements. Drug Deliv. 18, 377-384 (2011).
40. Young Kim, H., Young Yum, S., Jang, G. & Ahn, D.-R. Discovery of a non-cationic cell penetrating peptide derived from membrane-interacting human proteins and its potential as a protein delivery carrier. Sci. Rep. 5, 11719 (2015).
41. Stalmans, S. et al. Cell-Penetrating Peptides Selectively Cross the Blood-Brain Barrier In Vivo. PLOS ONE 10, e0139652 (2015).
42. Rizzuti, M., Nizzardo, M., Zanetta, C., Ramirez, A. & Corti, S. Therapeutic applications of the cell-penetrating HIV-1 Tat peptide. Drug Discov. Today 20, 76-85 (2015).
43. Lee, V. H. L. & Yamamoto, A. Penetration and enzymatic barriers to peptide and protein absorption. Adv. Drug Deliv. Rev. 4, 171-207 (1989).
44. Hooper, N. M. Proteolytic enzymes: A practical approach Edited by R J Beynon and J S Bond. pp 259. IRL Press at Oxford University Press, Oxford. 1989. #29 (spiral bound)/ #19 (paper) ISBN 0-19-963058-5/963059-3. Biochem. Educ.18, 55-55 (1990).
45. Maffioli, E. et al. High-Resolution Mass Spectrometry-Based Approaches for the Detection and Quantification of Peptidase Activity in Plasma. Molecules 25, 4071 (2020).
46. Rosano, C. Molecular model of hexokinase binding to the outer mitochondrial membrane porin (VDAC1): Implication for the design of new cancer therapies. Mitochondrion 11, 513-519 (2011).
47. Zhang, D., Yip, Y. M. & Li, L. In silico construction of HK2-VDAC1 complex and investigating the HK2 binding-induced molecular gating mechanism of VDAC1. Mitochondrion 30, 222-228 (2016).
48. Gelb, B. D. et al. Targeting of hexokinase 1 to liver and hepatoma mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 202-206 (1992).
49. Abu-Hamad, S., Zaid, H., Israelson, A., Nahon, E. & Shoshan-Barmatz, V. Hexokinase-I Protection against Apoptotic Cell Death Is Mediated via Interaction with the Voltage-dependent Anion Channel-1: MAPPING THE SITE OF BINDING. J. Biol. Chem. 283, 13482-13490 (2008).
50. Xie, G. & Wilson, J. E. Rat brain hexokinase: The hydrophobie N-terminus of the mitochondrially bound enzyme is inserted in the lipid bilayer. Arch. Biochem. Biophys. 267, 803-810 (1988).
51. Zaid, H., Abu-Hamad, S., Israelson, A., Nathan, I. & Shoshan-Barmatz, V. The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death. Cell Death Differ. 12, 751 (2005).
52. Bayrhuber, M. et al. Structure of the human voltage-dependent anion channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15370-15375 (2008).
53. Cheng, W. W. L. et al. Multiple neurosteroid and cholesterol binding sites in voltage-dependent anion channel-1 determined by photo-affinity labeling. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Biol. Lipids 1864, 1269-1279 (2019).
54. Rovini, A. et al. Molecular mechanism of olesoxime-mediated neuroprotection through targeting α-synuclein interaction with mitochondrial VDAC. Cell. Mol. Life Sci. (2019) doi:10.1007/s00018-019-03386-w.
55. Ben-Hail, D. & Shoshan-Barmatz, V. VDAC1-interacting anion transport inhibitors inhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Res. 1863, 1612-1623 (2016).
56. Ben-Hail, D. et al. Novel Compounds Targeting the Mitochondrial Protein VDAC1 Inhibit Apoptosis and Protect against Mitochondrial Dysfunction. J. Biol. Chem. 291, 24986-25003 (2016).
57. Haloi, N. et al. Structural Basis of Complex Formation Between Mitochondrial Anion Channel VDAC1 and Hexokinase-II. bioRxiv 2020.11.18.365965 (2020) doi:10.1101/2020.11.18.365965.
58. Horton K. L., Stewart K. M., Fonseca S. B., Guo Q., Kelley S. O. Mitochondria-penetrating peptides. Chem Biol. 2008 Apr;15(4):375-82.
本出願全体を通じて、さまざまな参考文献が本発明に関係する最先端技術を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
1. Sander, P., Gudermann, T. & Schredelseker, J. A Calcium Guard in the Outer Membrane: Is VDAC a Regulated Gatekeeper of Mitochondrial Calcium Uptake? Int. J. Mol. Sci. 22, (2021).
2. Shoshan-Barmatz, V. et al. VDAC, a multi-functional mitochondrial protein regulating cell life and death. Mol. Aspects Med. 31, 227-285 (2010).
3. Hiller, S. et al. Solution Structure of the Integral Human Membrane Protein VDAC-1 in Detergent Micelles. Science321, 1206-1210 (2008).
4. Ujwal, R. et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Åresolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 17742-17747 (2008).
5. Choudhary, O. P. et al. Structure guided simulations illuminate the mechanism of ATP transport through VDAC1. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 626-632 (2014).
6. De Pinto, V. et al. Determination of the Conformation of the Human VDAC1 N-Terminal Peptide, a Protein Moiety Essential for the Functional Properties of the Pore. ChemBioChem 8, 744-756 (2007).
7. Manzo, G. et al. Folded Structure and Membrane Affinity of the N-Terminal Domain of the Three Human Isoforms of the Mitochondrial Voltage-Dependent Anion-Selective Channel. ACS Omega3, 11415-11425 (2018).
8. Shoshan-Barmatz, V., Pittala, S. & Mizrachi, D. VDAC1 and the TSPO: Expression, Interactions, and Associated Functions in Health and Disease States. Int. J. Mol. Sci. 20, 3348 (2019).
9. Winquist, R. J. & Gribkoff, V. K. Targeting putative components of the mitochondrial permeability transition pore for novel therapeutics. Biochem. Pharmacol. 177, 113995 (2020).
10. Klapper-Goldstein, H. et al. VDAC1 in the diseased myocardium and the effect of VDAC1-interacting compound on atrial fibrosis induced by hyperaldosteronism. Sci. Rep. 10, (2020).
11. Wilting, F. et al. The antiarrhythmic compound efsevin directly modulates voltage-dependent anion channel 2 by binding to its inner wall and enhancing mitochondrial Ca2+ uptake. Br. J. Pharmacol. 177, 2947-2958 (2020).
12. van Delft, M. F. et al. A small molecule interacts with VDAC2 to block mouse BAK-driven apoptosis. Nat. Chem. Biol. 15, 1057-1066 (2019).
13. Shoshan-Barmatz, V., Krelin, Y., Shteinfer-Kuzmine, A. & Arif, T. Voltage-Dependent Anion Channel 1 As an Emerging Drug Target for Novel Anti-Cancer Therapeutics. Front. Oncol. 7, (2017).
14. Zhang, E. et al. Preserving Insulin Secretion in Diabetes by Inhibiting VDAC1 Overexpression and Surface Translocation in β Cells. Cell Metab. (2018) doi:10.1016/j.cmet.2018.09.008.
15. Pittala, S. et al. The VDAC1-based R-Tf-D-LP4 Peptide as a Potential Treatment for Diabetes Mellitus. Cells 9, (2020).
16. Sohlang, M. N. & Majaw, S. Altered VDAC-HK association and apoptosis in mouse peripheral blood lymphocytes exposed to diabetic condition: an in vitro and in vivo study. Arch. Physiol. Biochem. 1-11 (2021) doi:10.1080/13813455.2020.1867187.
17. Kim, J. et al. VDAC oligomers form mitochondrial pores to release mtDNA fragments and promote lupus-like disease. Science 366, 1531-1536 (2019).
18. Smilansky, A. et al. The Voltage-dependent Anion Channel 1 Mediates Amyloid β Toxicity and Represents a Potential Target for Alzheimer Disease Therapy. J. Biol. Chem. 290, 30670-30683 (2015).
19. Shoshan-Barmatz, V., Nahon-Crystal, E., Shteinfer-Kuzmine, A. & Gupta, R. VDAC1, mitochondrial dysfunction, and Alzheimer’s disease. Pharmacol. Res. 131, 87-101 (2018).
20. Rostovtseva, T. K. et al. α-Synuclein Shows High Affinity Interaction with Voltage-dependent Anion Channel, Suggesting Mechanisms of Mitochondrial Regulation and Toxicity in Parkinson Disease*. J. Biol. Chem. 290, 18467-18477 (2015).
21. Karachitos, A., Grobys, D., Kulczynska, K., Sobusiak, A. & Kmita, H. The Association of VDAC with Cell Viability of PC12 Model of Huntington’s Disease. Front. Oncol. 6, (2016).
22. Israelson, A. et al. Misfolded Mutant SOD1 Directly Inhibits VDAC1 Conductance in a Mouse Model of Inherited ALS. Neuron 67, 575-587 (2010).
23. Magri, A. et al. Hexokinase I N-terminal based peptide prevents the VDAC1-SOD1 G93A interaction and re-establishes ALS cell viability. Sci. Rep. 6, 34802 (2016).
24. Pittala, S., Krelin, Y., Kuperman, Y. & Shoshan-Barmatz, V. A Mitochondrial VDAC1-Based Peptide Greatly Suppresses Steatosis and NASH-Associated Pathologies in a Mouse Model. Mol. Ther. 27, 1848-1862 (2019).
25. Pittala, S., Krelin, Y. & Shoshan-Barmatz, V. Targeting Liver Cancer and Associated Pathologies in Mice with a Mitochondrial VDAC1-Based Peptide. Neoplasia N. Y. N 20, 594-609 (2018).
26. Bryan, N. & Raisch, K. P. Identification of a mitochondrial-binding site on the N-terminal end of hexokinase II. Biosci. Rep. 35, (2015).
27. Abramov, A. Y., Berezhnov, A. V., Fedotova, E. I., Zinchenko, V. P. & Dolgacheva, L. P. Interaction of misfolded proteins and mitochondria in neurodegenerative disorders. Biochem. Soc. Trans. 45, 1025-1033 (2017).
28. Magri, A. & Messina, A. Interactions of vdac with proteins involved in neurodegenerative aggregation: an opportunity for advancement on therapeuti c molecules. Curr. Med. Chem. 24, 4470-4487 (2017).
29. Tricaud, N. et al. Schwann cell demyelination is triggered by a transient mitochondrial calcium release through Voltage Dependent Anion Channel 1. bioRxiv581157 (2019) doi:10.1101/581157.
30. Tricaud, N. & Park, H. T. Wallerian demyelination: chronicle of a cellular cataclysm. Cell. Mol. Life Sci. 74, 4049-4057 (2017).
31. Goldin, N. et al. Methyl jasmonate binds to and detaches mitochondria-bound hexokinase. Oncogene 27, 4636-4643 (2008).
32. Magalon, K. et al. Olesoxime accelerates myelination and promotes repair in models of demyelination. Ann. Neurol. 71, 213-226 (2012).
33. Weber, J. J., Clemensson, L. E., Schioth, H. B. & Nguyen, H. P. Olesoxime in neurodegenerative diseases: Scrutinising a promising drug candidate. Biochem. Pharmacol. 168, 305-318 (2019).
34. Hantke, J. et al. A mutation in an alternative untranslated exon of hexokinase 1 associated with hereditary motor and sensory neuropathy -- Russe (HMSNR). Eur. J. Hum. Genet. EJHG17, 1606-1614 (2009).
35. Wilce, M. C. J., Aguilar, M.-Isabel. & Hearn, M. T. W. Physicochemical Basis of Amino Acid Hydrophobicity Scales: Evaluation of Four New Scales of Amino Acid Hydrophobicity Coefficients Derived from RP-HPLC of Peptides. Anal. Chem. 67, 1210-1219 (1995).
36. Wimley, W. C. & White, S. H. Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol. 3, 842-848 (1996).
37. Mulichak, A. M., Wilson, J. E., Padmanabhan, K. & Garavito, R. M. The structure of mammalian hexokinase-1. Nat. Struct. Biol. 5, 555-560 (1998).
38. Das, S. et al. Enhancing the Antimicrobial Activity of Alamethicin F50/5 by Incorporating N-terminal Hydrophobic Triazole Substituents. Chem. - Eur. J. 23, 17964-17972 (2017).
39. Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J. & Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: Proteolytic stability requirements. Drug Deliv. 18, 377-384 (2011).
40. Young Kim, H., Young Yum, S., Jang, G. & Ahn, D.-R. Discovery of a non-cationic cell penetrating peptide derived from membrane-interacting human proteins and its potential as a protein delivery carrier. Sci. Rep. 5, 11719 (2015).
41. Stalmans, S. et al. Cell-Penetrating Peptides Selectively Cross the Blood-Brain Barrier In Vivo. PLOS ONE 10, e0139652 (2015).
42. Rizzuti, M., Nizzardo, M., Zanetta, C., Ramirez, A. & Corti, S. Therapeutic applications of the cell-penetrating HIV-1 Tat peptide. Drug Discov. Today 20, 76-85 (2015).
43. Lee, V. H. L. & Yamamoto, A. Penetration and enzymatic barriers to peptide and protein absorption. Adv. Drug Deliv. Rev. 4, 171-207 (1989).
44. Hooper, N. M. Proteolytic enzymes: A practical approach Edited by R J Beynon and J S Bond. pp 259. IRL Press at Oxford University Press, Oxford. 1989. #29 (spiral bound)/ #19 (paper) ISBN 0-19-963058-5/963059-3. Biochem. Educ.18, 55-55 (1990).
45. Maffioli, E. et al. High-Resolution Mass Spectrometry-Based Approaches for the Detection and Quantification of Peptidase Activity in Plasma. Molecules 25, 4071 (2020).
46. Rosano, C. Molecular model of hexokinase binding to the outer mitochondrial membrane porin (VDAC1): Implication for the design of new cancer therapies. Mitochondrion 11, 513-519 (2011).
47. Zhang, D., Yip, Y. M. & Li, L. In silico construction of HK2-VDAC1 complex and investigating the HK2 binding-induced molecular gating mechanism of VDAC1. Mitochondrion 30, 222-228 (2016).
48. Gelb, B. D. et al. Targeting of hexokinase 1 to liver and hepatoma mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 202-206 (1992).
49. Abu-Hamad, S., Zaid, H., Israelson, A., Nahon, E. & Shoshan-Barmatz, V. Hexokinase-I Protection against Apoptotic Cell Death Is Mediated via Interaction with the Voltage-dependent Anion Channel-1: MAPPING THE SITE OF BINDING. J. Biol. Chem. 283, 13482-13490 (2008).
50. Xie, G. & Wilson, J. E. Rat brain hexokinase: The hydrophobie N-terminus of the mitochondrially bound enzyme is inserted in the lipid bilayer. Arch. Biochem. Biophys. 267, 803-810 (1988).
51. Zaid, H., Abu-Hamad, S., Israelson, A., Nathan, I. & Shoshan-Barmatz, V. The voltage-dependent anion channel-1 modulates apoptotic cell death. Cell Death Differ. 12, 751 (2005).
52. Bayrhuber, M. et al. Structure of the human voltage-dependent anion channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15370-15375 (2008).
53. Cheng, W. W. L. et al. Multiple neurosteroid and cholesterol binding sites in voltage-dependent anion channel-1 determined by photo-affinity labeling. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Biol. Lipids 1864, 1269-1279 (2019).
54. Rovini, A. et al. Molecular mechanism of olesoxime-mediated neuroprotection through targeting α-synuclein interaction with mitochondrial VDAC. Cell. Mol. Life Sci. (2019) doi:10.1007/s00018-019-03386-w.
55. Ben-Hail, D. & Shoshan-Barmatz, V. VDAC1-interacting anion transport inhibitors inhibit VDAC1 oligomerization and apoptosis. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Res. 1863, 1612-1623 (2016).
56. Ben-Hail, D. et al. Novel Compounds Targeting the Mitochondrial Protein VDAC1 Inhibit Apoptosis and Protect against Mitochondrial Dysfunction. J. Biol. Chem. 291, 24986-25003 (2016).
57. Haloi, N. et al. Structural Basis of Complex Formation Between Mitochondrial Anion Channel VDAC1 and Hexokinase-II. bioRxiv 2020.11.18.365965 (2020) doi:10.1101/2020.11.18.365965.
58. Horton K. L., Stewart K. M., Fonseca S. B., Guo Q., Kelley S. O. Mitochondria-penetrating peptides. Chem Biol. 2008 Apr;15(4):375-82.
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】