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特表2024-520068リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20240514BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240514BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240514BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALI20240514BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240514BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20240514BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20240514BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240514BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06 ZNA
C12Q1/68
C12Q1/6806
C12Q1/6837 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6874
C12Q1/689 Z
C12N15/09 Z
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573155
(86)(22)【出願日】2021-05-26
(85)【翻訳文提出日】2024-01-22
(86)【国際出願番号】 IB2021054614
(87)【国際公開番号】W WO2022248917
(87)【国際公開日】2022-12-01
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510324975
【氏名又は名称】ウニベルシダ・デ・チリ
(71)【出願人】
【識別番号】523239619
【氏名又は名称】ファンダシオン コペック ウニベルシダ カトリカ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レイエス、アンジェリカ
(72)【発明者】
【氏名】ナバレッテ、パオラ
(72)【発明者】
【氏名】チンニッチ、ガエタン
(72)【発明者】
【氏名】パッラ、アンヘル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ16
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AA72X
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、魚、肉、又は果物などの複雑な食品マトリックス、又は水などの単純なマトリックス、又は食品接触面を含む、食品製造に関連する任意の種類の試料からのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法に言及する。本発明の方法は、ｑＰＣＲ反応のために設計されたプライマーの特異性のおかげで、上述の病原体の特異的定量化を同時に可能にする。この方法は、マトリックス内の病原体の定量化を適切に制御するシステムを含むため、信頼性も高い。このシステムは、プロセス全体のためのインターナルコントロール宿主として機能する、キメラ配列を担持する既知濃度の形質転換された微生物（宿主）を試料に接種することを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時又は独立した検出及び定量化のための方法であって、以下の工程：（ａ）キメラポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを担持する、既知量のインターナルコントロール宿主（Ｉ．Ｃ．）を試料に添加する工程；
（ｂ）インターナルコントロール（Ｉ．Ｃ．）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）、又はそれらの組合せの核酸の検出及び定量化のために試料を評価する工程；
（ｃ）病原体の各々について行われる標準曲線分析によって病原体濃度を決定する工程；
（ｄ）（ａ）で使用される濃度に従ってシグナルを与えるはずであるＩ．Ｃ．についての結果を用いてプロセスを検証する工程
を含む方法。
【請求項2】
インターナルコントロール宿主が細菌、古細菌又は酵母から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記キメラポリヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７から選択されるフォワードプライマーの配列；２０～７０ｂｐの中央リンカー領域；並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８から選択されるリバースプライマーに相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
相補的逆配列が配列番号３６～４４から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記キメラポリヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５のいずれかと、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記キメラポリヌクレオチド配列の全長配列が、配列番号２１、４５～６１から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記キメラポリヌクレオチド配列が、配列番号７、９、１１のいずれかと、配列番号２、４、６、１４、１６、１８のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項４に記載の方法。
【請求項10】
前記キメラポリヌクレオチド配列の全長配列が配列番号６２～７９から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記キメラポリヌクレオチド配列が、配列番号１３、１５、１７のいずれかと、配列番号２、４、６、８、１０、１２のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
前記キメラポリヌクレオチド配列の全長配列が、配列番号２０、８０～９６から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記宿主が、配列番号２０、２１、４４～９６から選択されるキメラ配列を含むポリヌクレオチドを担持する形質転換、編集又はトランスフェクトされた宿主である、請求項２に記載の方法。
【請求項14】
微生物を試料から分離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記微生物分離の工程が、濾過、遠心分離、選別、磁気ビーズ又はそれらの組合せによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
試料から核酸を抽出する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記核酸検出が、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＬｉｎＤＡ、ＤＮＡマイクロアレイ、ハイスループットシーケンシングと組み合わせたＰＣＲ、ＰＣＲ ＤＧＧＥ／ＴＴＧＥ、又はそれらの組合せによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の核酸検出が、配列番号１～６、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の核酸検出が、配列番号２２～２５、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用するｑＰＣＲによって行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＳＴＥＣの核酸検出が、配列番号７～１２、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
ＳＴＥＣの核酸検出が、配列番号２６～２９、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用するｑＰＣＲによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）型細菌の核酸検出が、配列番号１３～１８、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項23】
サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の核酸検出が、配列番号３０～３３、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用するｑＰＣＲによって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ｃ）工程が、試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）濃度を決定し、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の各病原体の濃度についての標準曲線上で、工程（ｂ）でｑＰＣＲによって得られたＣｑ値を補間し、工程（ｄ）で得られたＩ．Ｃ．シグナルについての値によってそれを検証する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記ＩＣの核酸検出が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列をフォワードプライマーとして、並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列をリバースプライマーとして使用して行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ＩＣの核酸検出が、配列番号３４～３５、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用するｑＰＣＲによって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記試料が、肉、家禽、海産物、ソーセージ、乳製品、果物、野菜、インスタント食品、飲料、水から選択される生物学的試料又は表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項28】
Ｉ．Ｃ．宿主が、１ｍＬ当たり１０２～１０１０細胞又はＣＦＵの濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）を検出及び定量化するのに有用なＩＣを得るためのポリヌクレオチドであって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７から選択されるフォワードプライマーの配列；２６ｂｐの中央リンカー領域；並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８から選択されるリバースプライマーに相補的な配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項30】
相補的逆配列が配列番号３６～４４から選択される、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項31】
前記中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項32】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、３、５のいずれかと、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項33】
前記ポリヌクレオチド配列の全長配列が配列番号２１、４５～６１から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項34】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７、９、１１のいずれかと、配列番号２、４、６、１４、１６、１８のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ポリヌクレオチド配列の全長配列が配列番号６２～７９から選択される、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３、１５、１７のいずれかと、配列番号２、４、６、８、１０、１２のいずれかの相補体との組合せから選択され、中央リンカー領域が配列番号１９である、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項37】
前記ポリヌクレオチド配列の全長配列が配列番号２０、８０～９６から選択される、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項38】
前記ポリヌクレオチドのキメラが、配列番号２０、２１、４４～９６から選択される配列を含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項39】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミド、カセット、エピソーム、ＤＮＡ構築物、又はそれらの組合せに含まれる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項40】
前記ポリヌクレオチドが、細菌、古細菌又は酵母から選択される宿主によって担持される、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項41】
前記宿主が、ポリヌクレオチドで形質転換、編集又はトランスフェクトされる、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項42】
前記宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、魚、肉、又は果物などの複雑な食品マトリックス、又は水などの単純なマトリックス、又は食品接触面を含む、食品製造に関連する任意の種類の試料からのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法に言及する。
【背景技術】
【0002】
病原性細菌によって、又はそれらの毒素を介して引き起こされる細菌性食品媒介疾患は、果物、肉、又は魚などの食品における主要な食事性リスクの１つである。
【0003】
その関連する疾患の重症度に起因する、最も危険な細菌の中には、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）がある。例えば、ＳＴＥＣで汚染された食物を摂取した後、細菌は志賀毒素として公知の毒素を放出する。これらの志賀毒素は、急性下痢、出血性大腸炎、及び場合によっては急性腎障害を引き起こす。サルモネラ感染症は、嘔吐、悪心及び下痢を引き起こす。リステリア症は、発熱性胃腸炎から重度の侵襲性疾患に及ぶ症状を有する重篤な疾患であり、特に妊婦、２歳未満の小児、高齢者及び免疫無防備状態の人々が罹患する。
【0004】
したがって、食品及び衛生規制は、食品マトリックス中の病原体を制御及び特定するために厳格である。同時に、これらの微生物は食品加工内で生存することができるため、最終製品の安全性を保証するために、食品接触面又は器具の汚染の可能性を監視して、生産プロセスを徹底的に制御する必要がある。
【0005】
細菌培養は、食品中の食品媒介病原体を同定及び定量化するための従来の方法である。この方法は、単離された細菌コロニーからの形態学的、生化学的、生理学的及び免疫学的特徴の同定に基づく。しかしながら、このアプローチが長年にわたって非常に有用であったとしても、面倒であり、結果を得るのに時間がかかりすぎるなどの制限がある。例えば、培養法による任意の病原体の同定は、少なくとも４日かかり得る。
【0006】
したがって、結果を得るための時間短縮は、農業食品産業の経済に直接影響を与える重要な側面になる。例えば、腐敗しやすい食品に存在する病原体を同定することが一般的に必要とされるため、食品の安全性を確認する際の遅延は、貯蔵コストに重大な影響を及ぼし、販売機会も減少させる。さらに、製造プロセス制御の観点から、起こり得る汚染の迅速な検出は、起こり得る交差汚染も低減しながら、是正措置を適時に講じることを可能にする。
【0007】
さらに、公衆衛生の観点から、大流行の場合、迅速な同定はまた、汚染された食品の販売の制御（リコール）及び罹患者の適切な治療を可能にする。
【0008】
迅速性は、ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ及びマルチプレックスリアルタイムＰＣＲなどの様々な分子生物学技術によって達成されている。これらの病原体のための様々なＰＣＲ検出キットが市販されているにしても、それらは定性的であり、言い換えれば、食品媒介病原体の存在又は非存在のみをスクリーニングする。製造プロセスにおける消毒及び安全性プロトコルを評価するために、工業レベルでマトリックス上に存在する微生物を定量化することは適切である。しかしながら、市場で利用できる迅速な定量的方法は存在しない。さらに、分子生物学ツールを使用して食品マトリックスからの試料を扱うことは、それらの複雑さ、及び偽陰性をもたらす、結果に影響を及ぼし得るか又は干渉し得る食品からの阻害因子の存在のために、依然として困難である。この状況は、本発明の適用分野である、食品媒介病原体についての迅速な、同時かつ定量的な方法を開発する機会を提供する。
【0009】
食品媒介病原体の検出及び定量化の重要性を考慮すると、それらの微生物をスクリーニングすることを目的としたいくつかの開示されている方法があるが、先行技術から公知の方法は、完全なプロセスの有効性を保証するシステムを有していないか、又は試験される複雑なマトリックスの１つの特定の種類のみに焦点を合わせており、前記方法が他の種類の試料で機能するかどうかは不明のままである。以下の段落では、最も近い先行技術を検討する：
スペイン特許第ＥＳ２５４０１５８（Ｂ１）号は、標的配列として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）を含む７つの異なる病原体についてのマルチプレックスＰＣＲに基づく同時スクリーニング方法について言及している。キメラＤＮＡに対応するインターナルコントロールは、増幅段階において排他的に使用される。本発明は、使用されるＰＣＲプライマー、インターナルコントロール（増幅段階を評価するために使用されるだけでなく）並びに後述するさらなる工程において、この特許とは異なる。
スペイン特許第ＥＳ２５４０１５８（Ｂ１）号は、標的配列として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）を含む７つの異なる病原体についてのマルチプレックスＰＣＲに基づく同時スクリーニング方法について言及している。キメラＤＮＡに対応するインターナルコントロールは、増幅段階において排他的に使用される。本発明は、使用されるＰＣＲプライマー、インターナルコントロール（増幅段階を評価するために使用されるだけでなく）並びに後述するさらなる工程において、この特許とは異なる。
【0010】
Ｗｅｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ．の科学刊行物（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｉｎ ｍｉｌｋ．３ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｎ．２０１８，８：７６）は、マルチプレックスＰＣＲによる乳からの同時検出（非定量的）を指摘している。また、この刊行物では、インターナルコントロールが増幅段階においてのみ使用されている。
【0011】
国際公開第２０１６１６４４０７（Ａ２）号は、ｑＰＣＲによる、ＳＴＥＣ、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）を含む病原体の同時検出について言及している。内部ＤＮＡ対照を増幅段階で使用し、検出前に濃縮培地を用いて３７℃で２４時間の微生物濃縮工程を必要とする。明らかに、前記濃縮工程は、病原体濃度を人為的に増加させる一方で、偽陰性結果を減少させるために実施される。この工程は病原体の検出をより容易にするが、実際の食品試料の元の病原体濃度を決定することを不可能にする。
【0012】
結論として、先行技術が上述の３つの病原体の同時検出方法を提供する場合でも、食品、水又は表面などのその性質に関係なく、異なるマトリックスに適合可能であり、偽陰性を得る可能性を最小限に抑えるためにプロセスのすべての段階の制御も可能にする定量的方法が依然として必要とされている。記載のインターナルコントロールは、ｑＰＣＲ増幅反応を制御するためのプロトコルの最後の部分に含まれるように設計されている。しかしながら、それらは、マトリックスからの病原体の回収及びＤＮＡ抽出手順を制御しなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、マトリックスから微生物を分離する前に分析される食品試料に添加され、プロセスのすべての工程の制御を可能にし、したがって、偽陰性結果の数を減少させ、定量的結果を得ることを可能にする、対照細菌を含む新しい方法によってこの技術的課題を解決した。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】病原体の定量化のための検量線：ａ）Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ｂ）サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及びｃ）ＳＴＥＣ。すべての曲線は、試料上の各微生物の濃度（Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ又はＬｏｇ１０ＣＦＵ／ｃｍ２）に対するＣｑ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、魚、肉、又は果物などの複雑な食品マトリックス、又は水などの単純なマトリックス、又は食品接触面を含む、食品製造に関連する任意の種類の試料からのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法に言及する。
【0016】
本発明は、ｑＰＣＲ反応のために設計されたプライマーの特異性のおかげで、上述した病原体の特異的定量化を同時に可能にする。この方法は、マトリックス内の病原体の定量化を適切に制御するシステムを含むため、信頼性も高い。このシステムは、プロセス全体のためのインターナルコントロール（内部対照）宿主として機能する、キメラ配列を担持する既知濃度の形質転換された微生物（宿主）を試料に接種することを含む。
【0017】
このようにして、プロセス全体の正確な制御を維持し、結果が有効であるか否かを判定することが可能である。背景技術の項において先に確立されたように、分子技術を使用してこれらの細菌の存在を判定する際の重要な問題（今日まで未解決）は、偽陰性を得る可能性である。ＰＣＲを使用してこれらの細菌を同定するためのほとんどの方法は、ＤＮＡの増幅（ｑＰＣＲ）である、プロセスの最後の工程のみを制御する。試料からの細菌の分離及び細菌ＤＮＡの抽出を含む第１段階では制御が欠如している。それに対して、本発明は、マトリックスからの病原体収集、ＤＮＡ抽出及びｑＰＣＲ反応を確実にするすべての段階に対する固有の制御を含む。
【0018】
したがって、本発明は、すべてのプロセス工程の正確な適用を確実にするインターナルコントロール（Ｉ．Ｃ．）としての宿主（細菌のような）を含む、異なるマトリックスからのリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の同時検出及び定量化のための方法にある。本発明は、同じインターナルコントロール宿主を使用して１つ又は同時に２つもしくは３つの病原体を検出及び定量化するために適用することができることに留意することが重要である。したがって、本発明は以下の工程を含む：
（ａ）キメラポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを担持する、既知量のインターナルコントロール宿主（Ｉ．Ｃ．）を試料に添加する工程；
（ｂ）インターナルコントロール（Ｉ．Ｃ．）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）、又はそれらの組合せの核酸の検出及び定量化のために試料を評価する工程；
（ｃ）病原体の各々について行われる標準曲線分析によって病原体濃度を決定する工程；
（ｄ）（ａ）で使用される濃度に従ってシグナルを与えるはずであるＩ．Ｃ．についての結果を用いてプロセスを検証する工程。
（ａ）キメラポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを担持する、既知量のインターナルコントロール宿主（Ｉ．Ｃ．）を試料に添加する工程；
（ｂ）インターナルコントロール（Ｉ．Ｃ．）及びＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）、又はそれらの組合せの核酸の検出及び定量化のために試料を評価する工程；
（ｃ）病原体の各々について行われる標準曲線分析によって病原体濃度を決定する工程；
（ｄ）（ａ）で使用される濃度に従ってシグナルを与えるはずであるＩ．Ｃ．についての結果を用いてプロセスを検証する工程。
【0019】
Ｉ．Ｃ．に関して、当業者は、形質転換される微生物種の選択は重大な問題ではなく、したがって、先行技術で利用可能な任意の細菌、古細菌又は酵母種を使用できることは明らかだと考えるべきである。しかしながら、好ましく使用される形質転換細菌種は、志賀毒素を産生せず、非病原性である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0020】
同様に、キメラ配列の性質もまた、病原体の検出及び定量化の方法に影響を及ぼさないが、含まれる配列は人工的であり、検討中のいかなる細菌ゲノムとも相同ではない。本発明の方法のために好都合には、本発明者らは、本発明のプライマーの一方の配列を有し、本発明のプライマーの他方の配列を有する第３の領域から２０～７０ｂｐの領域によって分離された領域で構築されたキメラ配列を使用した。このようにして、対照宿主に組み込まれたキメラ配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７から選択されるフォワードプライマーの配列；２０～７０ｂｐの中央リンカー領域；並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８から選択されるリバースプライマーに相補的な配列を担持する。好都合には、両方のプライマーは２つの異なる病原体から選択される。本発明の好ましい実施形態では、中央リンカー領域は２６ｂｐを有し、その配列は配列番号１９に定義されているものである。
【0021】
したがって、第１の実施形態では、前記キメラポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５のいずれかと、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８のいずれかの相補体（すなわち配列番号３９、４０、４１、４２、４３及び４４）との組合せ、すなわち配列番号２１、４５～６１から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0022】
第２の実施形態では、前記キメラポリヌクレオチド配列は、配列番号７、９、１１のいずれかと、配列番号２、４、６、１４、１６、１８のいずれかの相補体（すなわち配列番号３６、３７、３８、４２、４３及び４４）との組合せ、すなわち配列番号６２～７９から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0023】
第３の実施形態では、前記キメラポリヌクレオチド配列は、配列番号１３、１５、１７のいずれかと、配列番号２、４、６、８、１０、１２のいずれかの相補体（すなわち配列番号３６、３７、３８、３９、４０及び４１）との組合せ、すなわち配列番号２０、８０～９６から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0024】
本発明に従って使用することができるキメラ配列の好ましい例は、配列番号２０及び２１である。例えば、配列番号２０は、配列番号１３で定義されるプライマーであるサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に相当する領域、配列番号１９で定義される２６ｂｐ領域の配列、及び配列番号８で定義されるプライマーであるＳＴＥＣに相補的な領域（すなわち配列番号３８）によって形成される。また、配列番号２１は、配列番号１で定義されるプライマーであるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に相当する領域、配列番号１９で定義される２６ｂｐ領域の配列、及び配列番号１０で定義されるプライマーであるＳＴＥＣに相補的な領域（すなわち配列番号４０）によって形成される。
【0025】
本発明の方法は、試料から微生物を分離する工程をさらに含む。微生物分離の前記工程は、濾過、遠心分離、選別、磁気ビーズ又はそれらの組合せによって行われる。
【0026】
本発明の方法は、試料から核酸を抽出する工程をさらに含む。
【0027】
前記核酸検出が、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＬｉｎＤＡ、ＤＮＡマイクロアレイ、ハイスループットシーケンシングと組み合わせたＰＣＲ、ＰＣＲ ＤＧＧＥ／ＴＴＧＥ、又はそれらの組合せによって行われる、本発明の方法。
【0028】
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の前記核酸検出は、配列番号１～６、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われ、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の前記核酸検出がｑＰＣＲによって行われる場合、配列番号２２～２５、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用する。
【0029】
ＳＴＥＣの前記核酸検出は、配列番号７～１２、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われ、ＳＴＥＣの前記核酸検出がｑＰＣＲによって行われる場合、配列番号２６～２９、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用する。
【0030】
サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｓｐｐ．）の前記核酸検出は、配列番号１３～１８、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプライマーを使用して行われ、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｓｐｐ．）の前記核酸検出がｑＰＣＲによって行われる場合、配列番号３０～３３、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用する。
【0031】
ＩＣの前記核酸検出は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列をフォワードプライマーとして、並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列をリバースプライマーとして使用して行われ、ＩＣの前記核酸検出がｑＰＣＲによって行われる場合、配列番号３４～３５、その誘導体、又はそれらの組合せから選択される配列を含むプローブを使用する。
【0032】
本発明の方法（工程（ａ）～（ｄ））において、前記（ｃ）工程は、試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）濃度を決定し、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の各病原体の濃度についての標準曲線上で、工程（ｂ）で得られた、ｑＰＣＲによって得られたＣｑ値を補間し、工程（ｄ）で得られたＩ．Ｃ．シグナルについての値によってそれを検証する工程を含む。
【0033】
本発明の方法は、肉、家禽、海産物、ソーセージ、乳製品、果物、野菜、インスタント食品、飲料、もしくは水から選択される生物学的試料、又は表面などの様々な種類の試料での作業を可能にする。
【0034】
Ｉ．Ｃ．宿主を、１ｍＬ当たり１０２～１０１０細胞又はＣＦＵの濃度で試料に添加する。
【0035】
試料中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び／又は志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）を検出及び定量化するのに有用なＩＣを得るためのポリヌクレオチドは：
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７から選択されるフォワードプライマーの配列；２６ｂｐの中央リンカー領域；並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８から選択されるリバースプライマーに相補的な配列（すなわち配列番号３６～４４）を含む。好ましい実施形態における前記中央リンカー領域は配列番号１９である。
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５及び１７から選択されるフォワードプライマーの配列；２６ｂｐの中央リンカー領域；並びに配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６及び１８から選択されるリバースプライマーに相補的な配列（すなわち配列番号３６～４４）を含む。好ましい実施形態における前記中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0036】
第１の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５のいずれかと、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８のいずれかの相補体（すなわち配列番号３９、４０、４１、４２、４３及び４４）との組合せ、すなわち配列番号２１、４５～６１から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0037】
第２の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７、９、１１のいずれかと、配列番号２、４、６、１４、１６、１８のいずれかの相補体（すなわち配列番号３６、３７、３８、４２、４３及び４４）との組合せ、すなわち配列番号６２～７９から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0038】
第３の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３、１５、１７のいずれかと、配列番号２、４、６、８、１０、１２のいずれかの相補体（すなわち配列番号３６、３７、３８、３９、４０及び４１）との組合せ、すなわち配列番号２０、８０～９６から選択され、中央リンカー領域は配列番号１９である。
【0039】
特に好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドキメラは、配列番号２０（配列番号１３、１９及び８によって形成される）又は配列番号２１（配列番号１、１９及び１０によって形成される）から選択される配列を含む。
【0040】
ポリヌクレオチドは、プラスミド、カセット、エピソーム、ＤＮＡ構築物、又はそれらの組合せに含めることができ、細菌、古細菌又は酵母から選択される宿主によって担持される。前記宿主は、前記ポリヌクレオチドで形質転換、編集又はトランスフェクトされる。好ましい一実施形態では、前記宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0041】
本発明の好ましい一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（宿主）をインターナルコントロールの構築に使用し、次いで先に定義されたキメラ配列を含むベクターｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを使用して形質転換体を選択する。
【0042】
先に確立されたように、評価される試料に、キメラ配列を担持するベクターで形質転換された細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２）に対応する予め既知の量のインターナルコントロール宿主を接種する。好ましくは、１０２～１０１０ＣＦＵ／ｍＬの細菌懸濁液の１０～２００μＬアリコートを添加する。
【0043】
上記のように、インターナルコントロール宿主（Ｉ．Ｃ．）は、キメラ配列で形質転換された細菌であり、当業者には、形質転換された細菌の濃度とキメラ配列との間に線形相関があることは明らかであろう。したがって、論じられるプロセスの段階に応じて、Ｉ．Ｃ．という用語は、本明細書では、形質転換された対照細菌宿主又はキメラ配列の両方の用語を互換的に指すために使用される。
【0044】
試料からの微生物の分離に言及する工程は、試料の性質に応じて任意の先行技術の方法を使用して実施することができる。本発明の一実施形態では、試料からすべての微生物を分離することは、例えば濾過のみによって水から；洗剤溶液を使用した脱離洗浄とその後の濾過によって食品から；表面のふき取り、輸送培地への再懸濁及びさらなる濾過によって表面から、などのように行われる。
【0045】
微生物が収集された後、ＤＮＡ抽出工程が進行し、これは先行技術で利用可能な任意の技術を使用して達成され得る。次いで、ＤＮＡをヌクレアーゼフリー水に再懸濁する。
【0046】
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ＳＴＥＣ及びキメラ配列の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、試料から抽出したＤＮＡを用いて行う。ｑＰＣＲ結果は、キメラ配列のＣｑ値に従って検証される。結果が期待値と一致しない場合、測定を繰り返さなければならない。
【0047】
試料の病原体濃度を決定するために、ｑＰＣＲ技術に関連する増幅サイクル（Ｃｔ又はＣｑ）に対して、評価される病原体のそれぞれについて既知の濃度標準に基づいて検量線又は標準曲線を構築することは、当業者には明らかなはずである。このようにして、本発明の方法は、各病原体（Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及びＳＴＥＣ）についてのＣｔ又はＣｑを提供する。したがって、試験試料中の各微生物の濃度は、各病原体についての標準曲線においてｑＰＣＲ反応で得られたＣｔ値を補間することによって決定される。
【0048】
接種された対照細菌宿主の濃度及びそれらの対応する期待Ｃｑ値は予め既知であるので、単にこのＣｑ値を使用することによって方法を検証することができる。
【0049】
本発明の以下の好ましい実施形態は単に例として説明され、当業者が組み込む又は修正し得る技術的変形を限定するものではなく、したがって、これらもまた、本明細書で特許請求される発明概念の範囲内に含まれる。
【実施例】
【0050】
例１．サケにおけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の定量化及び従来の方法との比較。
【0051】
本発明の方法を使用する利点を確立するために、標的病原体であるＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ｓｐｐ．）及びＳＴＥＣを、本発明の方法を使用することによって、並びに異なる量のこれらの病原体を接種した試料に適用される従来の「ゴールドスタンダード」培養法によって、並行して決定した。
【0052】
従来の方法は、各細菌に特異的な培地を含む異なる培養プレートに試料を２４～４８時間播種し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数し、次いで、各微生物に対して従来のＰＣＲなどの同定試験を行うことからなる。
【0053】
１．１ 既知の濃度及びＩ．Ｃ．（インターナルコントロール宿主）の添加を使用した病原体の接種。
それぞれ１００ｇの１０の生の新鮮なサケ試料に、表１、２及び３に記載の異なる濃度の３つの病原体を接種した。試料を本発明の方法及びゴールドスタンダード試験（培養技術）で処理した。本発明の方法を用いて処理した試料に、１０２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で２５μＬのＩ．Ｃ．も接種した。
それぞれ１００ｇの１０の生の新鮮なサケ試料に、表１、２及び３に記載の異なる濃度の３つの病原体を接種した。試料を本発明の方法及びゴールドスタンダード試験（培養技術）で処理した。本発明の方法を用いて処理した試料に、１０２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で２５μＬのＩ．Ｃ．も接種した。
【0054】
Ｉ．Ｃ．は、反応プライマーを用いて設計された配列番号３１として定義されるキメラ配列を担持するベクターｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の形質転換によって得た。試料にＩ．Ｃ．を接種するために、この形質転換細菌をＬＢ（ルリア－ベルターニ）ブロス＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で増殖させた。
【0055】
１．２ 従来の方法（ゴールドスタンダード）
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の定量化は、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｈｉｔｃｈｉｎｓ，Ａ．，Ｊｉｎｎｅｍａｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ １０．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ、オンラインで入手可能）に記載されているプロトコルを用いて行った。サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の定量化は、Ｂｒｉｃｈｔａ－Ｈａｒｈａｙ ＤＭ，Ａｒｔｈｕｒ ＴＭ，Ｋｏｏｈｍａｒａｉｅ Ｍ，Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｏｍ ｐｏｕｌｔｒｙ ｃａｒｃａｓｓ ｒｉｎｓｅｓ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８；４６（２）：１８６－１９１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７２－７６５Ｘ．２００７．０２２８９．ｘに記載されている方法を用いて行った。
Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の定量化は、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｈｉｔｃｈｉｎｓ，Ａ．，Ｊｉｎｎｅｍａｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃｈａｐｔｅｒ １０．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ、オンラインで入手可能）に記載されているプロトコルを用いて行った。サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の定量化は、Ｂｒｉｃｈｔａ－Ｈａｒｈａｙ ＤＭ，Ａｒｔｈｕｒ ＴＭ，Ｋｏｏｈｍａｒａｉｅ Ｍ，Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｆｒｏｍ ｐｏｕｌｔｒｙ ｃａｒｃａｓｓ ｒｉｎｓｅｓ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８；４６（２）：１８６－１９１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１４７２－７６５Ｘ．２００７．０２２８９．ｘに記載されている方法を用いて行った。
【0056】
ＳＴＥＣの定量化のためのゴールドスタンダード法はない。
【0057】
１．３ 本発明の方法
マトリックスから細菌を分離するために、洗剤溶液を試料に添加した。洗剤溶液に再懸濁した試料を、滅菌ガーゼを用いて濾過し、次いで濾液を孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルタに通して細菌を保持した。濾過は真空ポンプを使用して行った。
マトリックスから細菌を分離するために、洗剤溶液を試料に添加した。洗剤溶液に再懸濁した試料を、滅菌ガーゼを用いて濾過し、次いで濾液を孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルタに通して細菌を保持した。濾過は真空ポンプを使用して行った。
【0058】
細菌を含むニトロセルロースフィルタを、滅菌ピンセットを用いて回収し、次いで、ＤＮＡ試料抽出を進めるために２ｍＬ遠心管に入れた。
【0059】
次いで、フェノール：クロロホルムを使用する標準的な抽出技術によって細菌ＤＮＡ抽出を行った。このプロトコルは、酵素的作用（リゾチーム及びプロテイナーゼ）及び化学的作用（ドデシル硫酸ナトリウム又はＳＤＳ）によって細菌を溶解することを可能にする。次いで、ＤＮＡを最終的にヌクレアーゼフリー水又はＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ）緩衝液に再懸濁する。
【0060】
ＤＮＡが得られたら、各病原体及びキメラ配列の検出のためにｑＰＣＲを実施する。このために、１μＬの再懸濁したＤＮＡを各反応に三連で使用した。
【0061】
配列番号１及び２のプライマーをＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に使用し、配列番号９及び１０のプライマーをＳＴＥＣに使用し、配列番号１５及び１６のプライマーをサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に使用し、配列番号１及び１０のプライマーをキメラ配列（Ｉ．Ｃ．）に使用した。検出に使用したプローブは、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２４）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）（配列番号３３）、ＳＴＥＣ（配列番号２６）及びＩＣ（配列番号３４）。
【0062】
ｑＰＣＲ反応後、各病原体及びＩ．Ｃ．についてＣｑ値を得た。各病原体の濃度は、先に構築された標準曲線（図１に示すように、Ｃｑ対ＣＦＵ／ｇ）を使用してＣＦＵ／ｇサケで推定した。より低いＣｑは、ＣＦＵ／ｇとして表される各病原体のより高い濃度を意味する。
【0063】
本発明の方法を使用して得られた結果を、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）については表１、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）については表２、ＳＴＥＣについては表３に示す。表は、各試料に添加した各微生物（接種材料）の濃度、及びゴールドスタンダード試験を適用して得られた結果を含む。さらに、表は、Ｉ．Ｃ．について得られたＣｑ値を示す。アッセイの有効性を実証するために、ＩＣのＣｑ値は２８～３３．５の範囲内でなければならない。
【表1】
【表2】
【表3】
【0064】
本発明の方法を用いてＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及びＳＴＥＣについて得られた結果を比較すると、それらは同様の定量化限界を示す（それぞれＬｏｇ１０１．５９、Ｌｏｇ１０１．７６、及びＬｏｇ１０１．６４ＣＦＵ／ｇ）。本発明の方法は、ゴールドスタンダード法の限界と比較して１０倍高い定量化限界を示した。ＳＴＥＣ定量化について、本発明者らの結果と比較するために利用可能な標準プロトコルはなく、本発明者らの結果を試料に添加した接種材料と比較した。
結果は、本発明の方法を適用した場合、得られた濃度値のほとんどが、ゴールドスタンダード法によって得られたものよりも、試料に添加された接種材料に近いことを示す。
結果は、本発明の方法を適用した場合、得られた濃度値のほとんどが、ゴールドスタンダード法によって得られたものよりも、試料に添加された接種材料に近いことを示す。
【0065】
試料処理が開始されてから要した時間を考慮すると、本発明の方法は８時間しかかからなかったが、従来の試験では、結果を得るために２日間が必要であった。したがって、本発明の方法は、実質的により短い期間で、ゴールドスタンダード試験を使用して得られる結果と同様の結果をもたらす。
【0066】
例２．表面試験システムに使用される輸送培地中のリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及び志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＳＴＥＣ）の定量化。
表面の微生物学的分析のための様々なサンプリングプロトコルがあり、これらは標準化されている。これらのプロトコルの中には、１００ｃｍ２の面積にわたって（異なる方向に）繰り返し擦る滅菌スワブによる試料採取がある。その後、このスワブをＬｅｔｈｅｅｎ輸送培地に浸漬する。
表面の微生物学的分析のための様々なサンプリングプロトコルがあり、これらは標準化されている。これらのプロトコルの中には、１００ｃｍ２の面積にわたって（異なる方向に）繰り返し擦る滅菌スワブによる試料採取がある。その後、このスワブをＬｅｔｈｅｅｎ輸送培地に浸漬する。
【0067】
２．１ 既知の濃度及びＩ．Ｃ．（インターナルコントロール宿主）の添加を使用した病原体の接種。
本発明の方法を用いた結果をゴールドスタンダード試験と対比するために、Ｌｅｔｈｅｅｎ緩衝液（２０ｍＬ）に浸漬したスワブに異なる病原体濃度を接種して、表４、５及び６に詳述するように分析した。その後、１０ｍＬの接種したＬｅｔｈｅｅｎ緩衝液を本発明の方法を用いて処理し、別の１０ｍＬをゴールドスタンダード法によって分析した。本発明の方法を用いて処理した試料に、１０２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で２５μＬのＩ．Ｃ．も接種した。
本発明の方法を用いた結果をゴールドスタンダード試験と対比するために、Ｌｅｔｈｅｅｎ緩衝液（２０ｍＬ）に浸漬したスワブに異なる病原体濃度を接種して、表４、５及び６に詳述するように分析した。その後、１０ｍＬの接種したＬｅｔｈｅｅｎ緩衝液を本発明の方法を用いて処理し、別の１０ｍＬをゴールドスタンダード法によって分析した。本発明の方法を用いて処理した試料に、１０２ＣＦＵ／ｍＬの濃度で２５μＬのＩ．Ｃ．も接種した。
【0068】
２．２ ゴールドスタンダード法。
同様に、例１．２で説明したように、表面試料中に存在する病原体、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の定量化を、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ゴールドスタンダード試験）及びＢｒｉｃｈｔａ－Ｈａｒｈａｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）に記載されているプロトコルによって処理した。
同様に、例１．２で説明したように、表面試料中に存在する病原体、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）の定量化を、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ゴールドスタンダード試験）及びＢｒｉｃｈｔａ－Ｈａｒｈａｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）に記載されているプロトコルによって処理した。
【0069】
ＳＴＥＣ定量のためのゴールドスタンダード法はないので、本発明の方法のみを用いてこの病原体の定量化を決定した。
【0070】
２．３ 本発明の方法
培地からの細菌の分離：Ｌｅｔｈｅｅｎブロスを、これらの細菌を保持することができる孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルタで濾過した。濾過は真空ポンプを使用して行った。
培地からの細菌の分離：Ｌｅｔｈｅｅｎブロスを、これらの細菌を保持することができる孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルタで濾過した。濾過は真空ポンプを使用して行った。
【0071】
細菌を含むフィルタを、滅菌ピンセットを用いて回収し、次いで２ｍＬ遠心管に入れた。
【0072】
次いで、フィルタ内に存在する細菌のＤＮＡ抽出を、先の例の詳細に従って、フェノール：クロロホルムを使用する標準的な抽出技術によって行った。ＤＮＡをヌクレアーゼフリー水又はＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ用）緩衝液に再懸濁した。
【0073】
ＤＮＡが得られたら、各病原体及びキメラ配列の検出のためにｑＰＣＲを実施する。１μＬの懸濁したＤＮＡを各反応に三連で使用した。
【0074】
配列番号３及び４のプライマーをＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に使用し、配列番号７及び８のプライマーをＳＴＥＣに使用し、配列番号１３及び１４のプライマーをサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に使用し、配列番号１３及び８のプライマーをキメラ配列（Ｉ．Ｃ．）に使用した。使用したプローブは、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（配列番号２５）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）（配列番号３２）、ＳＴＥＣ（配列番号２７）及びＩＣ（配列番号３５）。
【0075】
ｑＰＣＲ反応後、各病原体及びＩ．Ｃ．についてＣｑ値を得た。各病原体の濃度は、先に構築された標準曲線（図１に示すように、Ｃｑ対ＣＦＵ／ｃｍ２）を使用してＣＦＵ／ｃｍ２表面で推定した。
【0076】
本発明の方法を使用した後の結果を、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）については表４に、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）については表５に、ＳＴＥＣについては表６に示す。表は、各試料に添加した各微生物（接種材料）の濃度、及びゴールドスタンダード試験を適用して得られた結果を含む。さらに、表は、Ｉ．Ｃ．について得られたＣｑ値を示す。アッセイの有効性を実証するために、ＩＣのＣｑ値は２８～３３．５の範囲内でなければならない。
【表4】
【表5】
【表6】
【0077】
結果は、本発明の方法を使用して、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）及びＳＴＥＣを、このマトリックスについての方法の検出限界に対応する、それぞれＬｏｇ１００．９８、Ｌｏｇ１０１．１６及びＬｏｇ１０１．０４ＣＦＵ／ｃｍ２より高い濃度で定量化することが可能であることを示す。
【0078】
さらに、本発明の方法によって決定された値は、ゴールドスタンダード試験によって定量化された値と比較して、表面試料に接種された濃度により近い。
【0079】
予想通りに、インターナルコントロールはすべての試料について本発明の方法を使用して成功裏に検出され、このＩＣのＣｑ値は、このＩ．Ｃ．について予測されたように２８から３３．５の間で変動した。
【0080】
一方、本発明の方法を使用すると、ゴールドスタンダード法に必要な２日超と比較して、試料処理の開始から８時間後に結果が得られたことを強調することが重要である。さらに、本発明の方法は３つの病原体を同時に定量化するが、ゴールドスタンダードは１つずつを別々に処理する。
【配列表フリーテキスト】
【0081】
配列表１ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に（フォワード）結合する
配列表２ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表３ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にフォワード結合する
配列表４ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表５ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にフォワード結合する
配列表６ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表７ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表８ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表９ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表１０ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表１１ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表１２ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表１３ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１４ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１５ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１６ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１７ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１８ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１９ ＜２２３＞インターナルコントロール（ＩＣ）に対する中央領域
配列表２０ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号８の逆配列（すなわち配列番号３９）を使用して構築したインターナルコントロールの例
配列表２１ ＜２２３＞配列番号１、配列番号９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）を使用して構築したインターナルコントロールの例
配列表２２ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２３ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２４ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２５ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２６ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２７ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２８ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２９ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表３０ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３１ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３２ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３３ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３４ ＜２２３＞インターナルコントロールに対するプローブ
配列表３５ ＜２２３＞インターナルコントロールに対するプローブ
配列表３６ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する２
配列表３７ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する４
配列表３８ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する６
配列表３９ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する８
配列表４０ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する１０
配列表４１ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する１２
配列表４２ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１４
配列表４３ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１６
配列表４４ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１８
配列表４５ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４６ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４７ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４８ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４９ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５０ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５１ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５２ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５３ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５４ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５５ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５６ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５７ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５８ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５９ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６０ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６１ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６２ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６３ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６４ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６５ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６６ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６７ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６８ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６９ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７０ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７１ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７２ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７３ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７４ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７５ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７６ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７７ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７８ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７９ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８０ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８１ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８２ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８３ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８４ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８５ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８６ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８７ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８８ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８９ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９０ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９１ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９２ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９３ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９４ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９５ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９６ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表２ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表３ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にフォワード結合する
配列表４ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表５ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にフォワード結合する
配列表６ ＜２２３＞プライマー＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する
配列表７ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表８ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表９ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表１０ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表１１ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にフォワード結合する
配列表１２ ＜２２３＞プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する
配列表１３ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１４ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１５ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１６ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１７ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にフォワード結合する
配列表１８ ＜２２３＞プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する
配列表１９ ＜２２３＞インターナルコントロール（ＩＣ）に対する中央領域
配列表２０ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号８の逆配列（すなわち配列番号３９）を使用して構築したインターナルコントロールの例
配列表２１ ＜２２３＞配列番号１、配列番号９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）を使用して構築したインターナルコントロールの例
配列表２２ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２３ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２４ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２５ ＜２２３＞リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するプローブ
配列表２６ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２７ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２８ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表２９ ＜２２３＞志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）に対するプローブ
配列表３０ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３１ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３２ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３３ ＜２２３＞サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）に対するプローブ
配列表３４ ＜２２３＞インターナルコントロールに対するプローブ
配列表３５ ＜２２３＞インターナルコントロールに対するプローブ
配列表３６ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する２
配列表３７ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する４
配列表３８ ＜２２３＞プライマーの逆相補体＿リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）にリバース結合する６
配列表３９ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する８
配列表４０ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する１０
配列表４１ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿志賀毒素産生大腸菌（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）にリバース結合する１２
配列表４２ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１４
配列表４３ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１６
配列表４４ ＜２２３＞逆相補体プライマー＿サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）にリバース結合する１８
配列表４５ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４６ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４７ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４８ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表４９ ＜２２３＞配列番号１、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５０ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５１ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５２ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５３ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５４ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５５ ＜２２３＞配列番号３、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５６ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５７ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５８ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表５９ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６０ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６１ ＜２２３＞配列番号５、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６２ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６３ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６４ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６５ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６６ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６７ ＜２２３＞配列番号７、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６８ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表６９ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７０ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７１ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７２ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７３ ＜２２３＞配列番号９、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７４ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７５ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７６ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７７ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１４の逆相補的配列（すなわち配列番号４２）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７８ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１６の逆相補的配列（すなわち配列番号４３）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表７９ ＜２２３＞配列番号１１、配列番号１９、及び配列番号１８の逆相補的配列（すなわち配列番号４４）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８０ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８１ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８２ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８３ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８４ ＜２２３＞配列番号１３、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８５ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８６ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８７ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８８ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表８９ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９０ ＜２２３＞配列番号１５、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９１ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２の逆相補的配列（すなわち配列番号３６）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９２ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号４の逆相補的配列（すなわち配列番号３７）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９３ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号６の逆相補的配列（すなわち配列番号３８）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９４ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号８の逆相補的配列（すなわち配列番号３９）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９５ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号１０の逆相補的配列（すなわち配列番号４０）で構築されたインターナルコントロールの例
配列表９６ ＜２２３＞配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号１２の逆相補的配列（すなわち配列番号４１）で構築されたインターナルコントロールの例
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】