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特表2024-520094菌株の分離および培養のための方法、菌株、その使用、それを培養するための培地ならびにスキネトミンの形態
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】菌株の分離および培養のための方法、菌株、その使用、それを培養するための培地ならびにスキネトミンの形態
(51)【国際特許分類】
C12N 1/12 20060101AFI20240514BHJP
A61Q 17/04 20060101ALI20240514BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20240514BHJP
C12P 17/18 20060101ALN20240514BHJP
A61K 8/99 20170101ALN20240514BHJP
【ＦＩ】
C12N1/12 A
C12N1/12 B
C12N1/12 C
A61Q17/04
A61K8/49
C12P17/18 B
A61K8/99
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573379
(86)(22)【出願日】2022-05-27
(85)【翻訳文提出日】2024-01-26
(86)【国際出願番号】 PL2022050034
(87)【国際公開番号】W WO2022250557
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】P.437991
(32)【優先日】2021-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523447041
【氏名又は名称】ウベラ、スポルカ、アクツィナ
【氏名又は名称原語表記】ＵＶＥＲＡ ＳＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】アダム、キチャク
(72)【発明者】
【氏名】マグダレナ、ヤンダー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C083
【Ｆターム（参考）】
4B064AE57
4B064CA02
4B064CA08
4B064CC03
4B064CC06
4B064CC07
4B064CC12
4B064CC15
4B064CD02
4B064CD21
4B064CE03
4B064CE08
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA83X
4B065AC14
4B065BA22
4B065BB02
4B065BB03
4B065BB04
4B065BB22
4B065BC02
4B065BC03
4B065BC48
4B065BD14
4B065BD16
4B065BD18
4B065CA02
4B065CA16
4B065CA18
4B065CA50
4C083AA031
4C083AA032
4C083AC851
4C083AC852
4C083BB46
4C083CC19
4C083EE17
4C083FF01
(57)【要約】
本発明の目的は、菌株の分離および培養のための方法、菌株、その使用、それを培養するための培地ならびにスキネトミンの形態である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）株、特に、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番またはＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されているものの分離および培養のための方法であって、ａ）培地１０００ｍＬ当たり以下の組成：１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．０ｍｇクエン酸、６．０ｍｇクエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２ｇ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＬ微量金属Ａ５ブレンド（Ａ５ブレンド水溶液１０００ｍＬ当たり以下の組成：２．８６ｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．２２２ｇ ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４９．４ｍｇ Ｃｏ（ＮＯ３）２×６Ｈ２Ｏを有する）を有する培地水溶液１０００ｍＬ当たり２００ｇの量の、質量百分率で以下の含量：９７．６％石英、０．４％白雲母－黒雲母、１．２％アパタイト、および０．８％のその他の微量の鉱物を含む、ヌビア層に由来する天然砂岩に見られる微量および多量栄養素を富化し、次いで得られた懸濁液を２５℃で２４時間撹拌し、その後２５℃で５時間沈降させ、それを濾過することによって増殖培地を調製すること；
ｂ）環境から細菌を採取すること；
ｃ）段階ｂ）で採取された生物材料を、段階ａ）で得られた、すなわち、表１による、石で富化された液体培地中で、好ましくは各４週間の５段階の３つの中間段階、すなわち２つの端点段階（初期、最終）および３つの中間段階で、開始時２重量％～終了時０．５重量％の間の端点含量の寒天を追加して継代培養すること、ここで、中間段階の増殖培地は、段階ａ）で得られた培地に対して以下の量：１．７５重量％、１．５重量％、１重量％の追加寒天をそれぞれ含む；
ｄ）最終段階ｃ）の、すなわち０．５％の寒天を含有する培養溶液を、組成が段階Ａで開示された培地水溶液に溶解させるが、石の添加と２５℃で２週間の撹拌培養は行わないこと
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項2】
ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されている、新規細菌株。
【請求項3】
ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されている、新規細菌株。
【請求項4】
ＵＶ吸収特性を有する色素、特に、スキネトミンまたはその誘導体の製造のための請求項２または３に記載の菌株の使用。
【請求項5】
化粧品、特に、サンスクリーンの製造のための、得られた色素、特に、スキネトミンまたはその誘導体の適用を含んでなる、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
培地水溶液１０００ｍＬ中、１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．０ｍｇクエン酸、６．０ｍｇクエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２ｇ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＬ微量金属のＡ５ブレンド（Ａ５ブレンド水溶液１０００ｍＬ当たり以下の組成：２．８６ｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０，２２２ｇ ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４９．４ｍｇ Ｃｏ（ＮＯ３）２×６Ｈ２Ｏを含む）を含有し、質量百分率で以下の含量：９７．６％石英、０．４％白雲母－黒雲母、１．２％アパタイトおよび０．８％のその他の微量鉱物を有する天然ヌビア砂岩を２００ｇ摩砕石／１０００ｍＬ培地の量で含有することを特徴とする、シアノバクテリアを培養するための培地。
【請求項7】
２θ角度２．５００°、４．５８９°、５．０６２°、８．６３０および９．１９７°に特徴的なピークを有するＸ線粉末回折スペクトル、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）で３３４５、３０６５、２９６１、２９２６、１７１３、１５９１、１５１６、１４４９、１２９６、１１７５、１１４５、９５７、９３２、９３０、８３３［ｃｍ－１］の特異的な赤外線吸収帯、
熱重量／示差熱分析（加熱／冷却速度：１５／２０℃／分）において約３８０．３℃にピークを有する３６５℃～３８０．３℃の範囲の分解温度、
ピリジン－ｄ５において記録された１Ｈ ＮＭＲスペクトルがδ８．９８ｐｐｍ；７．９９ｐｐｍ；７．８６ｐｐｍ；７．７５ｐｐｍ；７．４８ｐｐｍ；７．３３ｐｐｍ；７．２２ｐｐｍにシグナルを含む、
表４～７に挙げられ、図８ａ～ｄに示された幾何パラメーターにより記載される構造的Ｘ線分析（ＸＲＤ）に基づく構造モデル、
ＤＭＳＯ中１％ ３９３ｎｍにおける比吸収係数：７３０およびＤＭＳＯ中１％ ３０５ｎｍにおける比吸収係数：３３０
から選択される少なくとも１つの特性を有するスキネトミン結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の目的は、菌株の分離および培養のための方法、菌株、その使用、それを培養するための培地ならびにスキネトミンの形態である。本発明は、生物工学および化粧品工業に適用可能である。
【背景技術】
【0002】
エンド分解（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）微小環境、例えば、石の穴から生物材料を、直接、培養培地（ＢＧ１１）に採取する（Ｓｉｎｇｈら，２０１４）か、または分離した生物材料を、モノクローナルなシアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の選択のために、２％寒天とＢＧ１１増殖培地を含むプレートに置き（Ｗｏｌｋ，１９９８による）、次いで、コロニーをＢＧ１１液体培地に直接移す（ＡｎａｈａｓおよびＭｕｒａｌｉｔｈａｒａｎ，２０１５）ことを含む、標準的な分離および培養方法が知られている（Ｒｉｐｐｋａら，１９７９；ＡｎａｈａｓおよびＭｕｒａｌｉｔｈａｒａｎ，２０１５；Ｓｉｎｇｈら，２０１４）。ＢＧ１１液体培地への生物材料の直接採取は、モノクローナル細菌株の精製と分離の追加工程が必要となるため、多くの場合で適用できない。ＡｎａｈａｓおよびＭｕｒａｌｉｔｈａｒａｎ（２０１５）が報告した寒天とＢＧ１１含むプレート上での培養および精製方法（Ｗｏｌｋ，１９９８）では、極度に乾燥した環境から採取したシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）コロニーは増殖が極めて遅いか、全く増殖しないため、期待した結果が得られない。環境から分離された様々なシアノバクテリア株（当技術分野で知られている方法では実験室条件での培養が不可能であるか、少なくとも達成が困難である）を容易に増殖させることができる培養方法を提供することが望まれる。この方法を適用することにより、結果として、特に色素の生産性が高く、天然の紫外線（ＵＶ）フィルターでもあるという、独自の有利な特性を有する新規のシアノバクテリア株の分離が可能になると期待される。本発明は、前述の問題を予想外に解決した。
【発明の概要】
【0003】
本発明の第１の目的は、シアノバクテリア株、特に、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番またはＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されているものの分離および培養のための方法であって、
ａ）培地１０００ｍＬ当たり以下の組成：１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ ａ）培地１０００ｍＬ当たり以下の組成：１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．０ｍｇクエン酸、６．０ｍｇクエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２ｇ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＬ微量金属Ａ５ブレンド（Ａ５ブレンド水溶液１０００ｍＬ当たり以下の組成：２．８６ｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．２２２ｇ ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４９．４ｍｇ Ｃｏ（ＮＯ３）２×６Ｈ２Ｏを有する）を有する培地水溶液１０００ｍＬ当たり２００ｇの量の、質量百分率で以下の含量：９７．６％石英、０．４％白雲母－黒雲母、１．２％アパタイト、および０．８％のその他の微量の鉱物を含む、ヌビア層に由来する天然砂岩に見られる微量および多量栄養素を富化し、次いで得られた懸濁液を２５℃で２４時間撹拌し、その後２５℃で５時間沈降させ、それを濾過することによって増殖培地を調製すること；純粋なＢＧ１１培地、または寒天を含まないＢＧ１１培地、またはＢＧ１１培地、またはＲｉｐｐｋａら（１９７９）による培地、または表１の組成を有する培地、または組成が段階ａ）に開示されているが石を添加しない培地、という表現を出願人が使用する場合には、これが下記に表１に挙げられている組成を有する培地を意味する；
ａ）培地１０００ｍＬ当たり以下の組成：１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ ａ）培地１０００ｍＬ当たり以下の組成：１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．０ｍｇクエン酸、６．０ｍｇクエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２ｇ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＬ微量金属Ａ５ブレンド（Ａ５ブレンド水溶液１０００ｍＬ当たり以下の組成：２．８６ｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．２２２ｇ ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４９．４ｍｇ Ｃｏ（ＮＯ３）２×６Ｈ２Ｏを有する）を有する培地水溶液１０００ｍＬ当たり２００ｇの量の、質量百分率で以下の含量：９７．６％石英、０．４％白雲母－黒雲母、１．２％アパタイト、および０．８％のその他の微量の鉱物を含む、ヌビア層に由来する天然砂岩に見られる微量および多量栄養素を富化し、次いで得られた懸濁液を２５℃で２４時間撹拌し、その後２５℃で５時間沈降させ、それを濾過することによって増殖培地を調製すること；純粋なＢＧ１１培地、または寒天を含まないＢＧ１１培地、またはＢＧ１１培地、またはＲｉｐｐｋａら（１９７９）による培地、または表１の組成を有する培地、または組成が段階ａ）に開示されているが石を添加しない培地、という表現を出願人が使用する場合には、これが下記に表１に挙げられている組成を有する培地を意味する；
【0004】
【表1】
ｃ）段階ｂ）で採取された生物材料を、段階ａ）で得られた、すなわち、表１による、石で富化された液体培地中で、好ましくは各４週間の５段階の３つの中間段階、すなわち２つの端点段階（初期、最終）および３つの中間段階で、開始時２重量％～終了時０．５重量％の間の端点含量の寒天を追加して継代培養すること、ここで、中間段階の増殖培地は、段階ａ）で得られた培地に対してそれぞれ以下の量：１．７５重量％、１．５重量％、１重量％の追加寒天を含む；
ｄ）最終段階ｃ）の、すなわち０．５％の寒天を含有する培養溶液を、組成が段階ａ）で開示されているが石の添加と２５℃で２週間の撹拌インキュベーションは行わない培地水溶液に溶解させること
を含んでなることを特徴とする、方法である。
【0005】
本発明の第２の目的は、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されている細菌株である。
【0006】
本発明の第３の目的は、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されている細菌株である。
【0007】
本発明の第４の目的は、ＵＶ吸収特性を有する色素、特に、スキネトミンまたはその誘導体の調製のための本発明の第２の目的として定義された本発明の菌株の使用である。同等に好ましくは、本発明の使用は、化粧品、特に、サンスクリーンの製造のための、得られた色素、特に、スキネトミンまたはその誘導体の適用を含んでなる。
【0008】
本発明の第５の目的は、培地水溶液１０００ｍＬ中、１．５ｇ ＮａＮＯ３、０．０４ｇ Ｋ２ＨＰＯ４、０．０７５ｇ ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３６ｇ ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、６．０ｍｇクエン酸、６．０ｍｇクエン酸鉄アンモニウム、１ｍｇ ＥＤＴＡ、０．０２ｇ Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＬ微量金属のＡ５ブレンド（Ａ５ブレンド水溶液１０００ｍＬ当たり以下の組成：２．８６ｇ Ｈ３ＢＯ３、１．８１ｇ ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０，２２２ｇ ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．３９ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、０．０７９ｇ ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、４９．４ｍｇ Ｃｏ（ＮＯ３）２×６Ｈ２Ｏを含有し、質量百分率で以下の含量：９７．６％石英、０．４％白雲母－黒雲母、１．２％アパタイトおよび０．８％のその他の微量鉱物を有する天然ヌビア砂岩を２００ｇ摩砕石（ｇｒｏｕｎｄ ｓｔｏｎｅ）／１０００ｍＬ培地の量で含有することを特徴とする、シアノバクテリアを培養するための培地である。開示される培地は、色素、特に、スキネトミンを産生するシアノバクテリアを培養するために適している。
【0009】
本発明の第６の目的は、
２．５００°、４．５８９°、５．０６２°、８．６３０°および９．１９７°の２θ角度の特徴的なピークを有するＸ線粉末回折スペクトル、
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）で３３４５、３０６５、２９６１、２９２６、１７１３、１５９１、１５１６、１４４９、１２９６、１１７５、１１４５、９５７、９３２、９３０、８３３［ｃｍ－１］に特異的な赤外線吸収帯、
熱重量／示差熱分析（加熱／冷却速度：１５／２０℃／分）において約３８０．３℃にピークを有する３６５℃～３８０．３℃の範囲の分解温度、
ピリジン－ｄ５において記録された１Ｈ ＮＭＲスペクトルがδ８．９８ｐｐｍ、７．９９ｐｐｍ、７．８６ｐｐｍ、７．７５ｐｐｍ、７．４８ｐｐｍ、７．３３ｐｐｍおよび７．２２ｐｐｍにシグナルを含む、
から選択される少なくとも１つの特性を有するスキネトミン結晶である。
２．５００°、４．５８９°、５．０６２°、８．６３０°および９．１９７°の２θ角度の特徴的なピークを有するＸ線粉末回折スペクトル、
ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）で３３４５、３０６５、２９６１、２９２６、１７１３、１５９１、１５１６、１４４９、１２９６、１１７５、１１４５、９５７、９３２、９３０、８３３［ｃｍ－１］に特異的な赤外線吸収帯、
熱重量／示差熱分析（加熱／冷却速度：１５／２０℃／分）において約３８０．３℃にピークを有する３６５℃～３８０．３℃の範囲の分解温度、
ピリジン－ｄ５において記録された１Ｈ ＮＭＲスペクトルがδ８．９８ｐｐｍ、７．９９ｐｐｍ、７．８６ｐｐｍ、７．７５ｐｐｍ、７．４８ｐｐｍ、７．３３ｐｐｍおよび７．２２ｐｐｍにシグナルを含む、
から選択される少なくとも１つの特性を有するスキネトミン結晶である。
【0010】
本発明によれば、天然環境から分離された望ましいシアノバクテリア株（当技術分野で公知の方法によっては実験室条件での培養が不可能であるか、少なくとも達成が困難である）の容易な増殖を可能とした培養方法を効果的に提供することが可能となった。本発明の方法の使用によれば、極めて有利な特性、特に、式１のスキネトミン、特に、その酸化形態の高い生産性、すなわち、シアノバクテリアの乾燥重量当たり少なくとも１．５％の生産性を有する特定のシアノバクテリア株が分離できた。
【0011】
【化1】
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ＳＰＦ３０および５０の選択された市販のクリーム（サンプル１～３）ならびにスキネトミンを添加したサンプル（４番）の吸光度（ＡおよびＢ）ならびに透過率（ＣおよびＤ）試験の比較結果を示し、これらの試験は、薄層材料を用いて人工皮膚（３Ｍ（登録商標）サージカルテープ）を刺激して行った。
【図2】ＳＣＹサンプルのＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図3】サンプル加熱温度による重量減少曲線（黒色の曲線）および３５０～５２０℃の温度範囲におけるヒートフロー曲線（灰色の曲線）を示し、最大分解温度は３８０．３℃である。
【図4】本発明のスキネトミン形態のＰＸＲＤ（多結晶Ｘ線回折法）を用いて得られたＸ線回折図を示し、主要なピークには「＊」が付されている。
【図5】ピリジン－ｄ５で記録されたスキネトミンサンプルのプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルをδスケール［ｐｐｍ］で示す。
【図6】実施例２．２に開示された化粧品に使用される選択された溶液中のスキネトミンの分散度に関する調査結果を示す。
【図7】実施例８に記載された結晶を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
シアノバクテリア株の分類学的特徴は、光学顕微鏡分析とＫｏｍｅｒｅｋら（２０１４）に発表された最新のガイドラインおよびその論文に見られる文献報告に基づいて決定された。試験菌株の微形態学的特徴は、それがＣｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｄａｃｅａｅ科（Ｋｏｍｅｒｅｋら，２０１４）およびＣｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ属（Ｇｅｉｔｌｅｒ，１９３２）に属することを示している。
【0014】
得られた菌株の微形態学的記述：
本発明の培養で得られシアノバクテリア細胞は以下の特徴を有した：
ａ）色：青緑、黄色～淡褐色；
ｂ）形態：直径１．５～５μｍの単一の球形細胞で、クラスターをなし数個から２０個未満のコロニーとなっているか、または凝集塊を形成し、通常、明瞭な鞘に囲まれている；
ｃ）分裂：細胞は２つ以上の平面に沿って分裂する。分裂後、細胞被膜は通常伸びて娘細胞を含み、これはコロニー鞘の層状化として見られる；
ｄ）チラコイドの配置：細胞壁付近に円形に配置されている。
本発明の培養で得られシアノバクテリア細胞は以下の特徴を有した：
ａ）色：青緑、黄色～淡褐色；
ｂ）形態：直径１．５～５μｍの単一の球形細胞で、クラスターをなし数個から２０個未満のコロニーとなっているか、または凝集塊を形成し、通常、明瞭な鞘に囲まれている；
ｃ）分裂：細胞は２つ以上の平面に沿って分裂する。分裂後、細胞被膜は通常伸びて娘細胞を含み、これはコロニー鞘の層状化として見られる；
ｄ）チラコイドの配置：細胞壁付近に円形に配置されている。
【0015】
本発明の実施形態を図面で示す。図１は、ＳＰＦ３０および５０の選択された市販のクリーム（サンプル１～３）ならびにスキネトミンを添加したサンプル（４番）の吸光度（ＡおよびＢ）ならびに透過率（ＣおよびＤ）試験の比較結果を示し、これらの試験は、薄層材料を用いて人工皮膚（３Ｍ（登録商標）サージカルテープ）を刺激して行った。図１ａはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）、ＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）から８００ｎｍまでの範囲、１ＢはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）からＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）の範囲のサンプルの吸光度曲線を示し、図１ＣはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）、ＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）から８００ｎｍまでの範囲、１ＤはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）からＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）までの範囲のサンプルの透過率曲線を示し、曲線記号は、連続線「ボルト」は、スキネトミンを添加した配合物４；サンプル１は、－－－－－；サンプル２は、－．－．－．－、サンプル３は、－ － － －。図２は、ＳＣＹサンプルのＦＴＩＲスペクトルを示す。図３は、サンプル加熱温度による重量減少曲線（黒色の曲線）および３５０～５２０℃の温度範囲におけるヒートフロー曲線（灰色の曲線）を示し、最大分解温度は３８０．３℃である。図４は、本発明のスキネトミン形態のＰＸＲＤ（多結晶Ｘ線回折法）を用いて得られたＸ線回折図を示し、主要なピークには「＊」が付されている。図５および５ａは、ピリジン－ｄ５で記録されたスキネトミンサンプルのプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルをδスケール［ｐｐｍ］で示し、図５は、完全なスペクトル（範囲：－０．５～１０．５ｐｐｍ）を含み、図５ａは、７．１～９．１ｐｐｍの拡張範囲を示す。図６は、実施例２．２に開示された化粧品に使用される選択された溶液中のスキネトミンの分散度に関する調査結果を示す。図７ａおよび７ｂは、実施例８に記載された結晶を示し、図８ａ～８ｄは、ＭＥＲＣＵＲＹソフトウエアを使用して得られたＳＣＹ構造のグラフィックモデル（Ｍａｃｒａｅら，２０２０）：非対称単位（図８ａ）、単位格子充填の全体図（図８ｂ）、および単位格子充填、［００１］方向に沿った図（図８ｃ）および［１００］方向に沿った図（図８ｄ）。
【実施例】
【0016】
実施例１
１．１ 増殖培地の調製
増殖培地の調製には、シアノバクテリアが起源するヌビア層由来の砂岩に含まれる微量および多量栄養素の富化が含まれる。従って、滅菌した石２００ｇをメノウ乳鉢で摩砕し、表１による純粋なＢＧ１１培地１０００ｍＬ当たりに添加した。次に、得られた混合物を２５℃で２４時間撹拌し、最終的に５時間沈殿させ、直径２５ｍｍ、孔径０．２μｍのフィルター（Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した。砂岩由来の微量および多量栄養素を富化したＢＧ１１培地を６０℃に加熱した。その後、得られた溶液に、乾燥寒天を２重量％の最終量で添加した。次に、寒天が溶解するまで全内容物を撹拌し、ペトリ皿（Ｒ）に注ぎ、２５℃まで冷却し、無菌状態で蓋をして維持し、環境からシアノバクテリアを採取し、培地を入れたプレートに播種した。
１．１ 増殖培地の調製
増殖培地の調製には、シアノバクテリアが起源するヌビア層由来の砂岩に含まれる微量および多量栄養素の富化が含まれる。従って、滅菌した石２００ｇをメノウ乳鉢で摩砕し、表１による純粋なＢＧ１１培地１０００ｍＬ当たりに添加した。次に、得られた混合物を２５℃で２４時間撹拌し、最終的に５時間沈殿させ、直径２５ｍｍ、孔径０．２μｍのフィルター（Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ Ｔｒａｃｋ－Ｅｔｃｈ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した。砂岩由来の微量および多量栄養素を富化したＢＧ１１培地を６０℃に加熱した。その後、得られた溶液に、乾燥寒天を２重量％の最終量で添加した。次に、寒天が溶解するまで全内容物を撹拌し、ペトリ皿（Ｒ）に注ぎ、２５℃まで冷却し、無菌状態で蓋をして維持し、環境からシアノバクテリアを採取し、培地を入れたプレートに播種した。
【0017】
１．１．１．
石の特徴
エンド分解性微生物を含む石はヌビア砂岩層に起源する。Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて、総重量５２ｇの石５サンプルの鉱物組成を定量分析した。砂岩の平均含有量は、石英９７．６％、白雲母－黒雲母０．４％、アパタイト１．２％、およびその他の微量鉱物０．８％であった。
石の特徴
エンド分解性微生物を含む石はヌビア砂岩層に起源する。Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて、総重量５２ｇの石５サンプルの鉱物組成を定量分析した。砂岩の平均含有量は、石英９７．６％、白雲母－黒雲母０．４％、アパタイト１．２％、およびその他の微量鉱物０．８％であった。
【0018】
１．２ 環境からのシアノバクテリアの採取
本発明の目的である２つのシアノバクテリア株がエンド分解的に定着している２つの小さな石片を、滅菌ランセットを用いて機械的に掻き取り、上記項目１．１のペトリ皿に入れ、これにより、２つの菌株について、ヌビア砂岩の微量および多量栄養素が富化された２つの別個の培養物が樹立された。シアノバクテリアは２５℃、明暗法（１２／１２時間）で播種し、ＰＡＲ（光合成活性放射、４００～７００ｎｍ）域の光強度は約３０～５０μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１で、１８Ｗの冷蛍光ランプ（ＰｈｉｌｉｐｓＴＬＤ１８Ｗ／３３）により提供した。５～１０週間後、Ｅｕｒｏｍｅｘ Ｏｘｉｏｎ Ｉｎｖｅｒｓｏ ＯＸ．２０５３－ＰＬ光学顕微鏡＋Ｃｍｅｘ ３カメラを用いて、寒天皿のシアノバクテリアのコロニーの有無を検査した。
本発明の目的である２つのシアノバクテリア株がエンド分解的に定着している２つの小さな石片を、滅菌ランセットを用いて機械的に掻き取り、上記項目１．１のペトリ皿に入れ、これにより、２つの菌株について、ヌビア砂岩の微量および多量栄養素が富化された２つの別個の培養物が樹立された。シアノバクテリアは２５℃、明暗法（１２／１２時間）で播種し、ＰＡＲ（光合成活性放射、４００～７００ｎｍ）域の光強度は約３０～５０μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１で、１８Ｗの冷蛍光ランプ（ＰｈｉｌｉｐｓＴＬＤ１８Ｗ／３３）により提供した。５～１０週間後、Ｅｕｒｏｍｅｘ Ｏｘｉｏｎ Ｉｎｖｅｒｓｏ ＯＸ．２０５３－ＰＬ光学顕微鏡＋Ｃｍｅｘ ３カメラを用いて、寒天皿のシアノバクテリアのコロニーの有無を検査した。
【0019】
１．３ 継代培養
段階１．２からの生物学的材料の段階的継代培養は、段階１．１で得られた固体培地上で行い、開始時の培地の２重量％の追加寒天含量から終了時の０．５％まで、好ましくは寒天含量１．７５重量％、１．５重量％、１重量％の３つの中間段階で行った。継代期間は、各中間段階と最終段階について４週間、２５℃、ＰＡＲ（４００～７００ｎｍ）連続照射３５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１であった。
段階１．２からの生物学的材料の段階的継代培養は、段階１．１で得られた固体培地上で行い、開始時の培地の２重量％の追加寒天含量から終了時の０．５％まで、好ましくは寒天含量１．７５重量％、１．５重量％、１重量％の３つの中間段階で行った。継代期間は、各中間段階と最終段階について４週間、２５℃、ＰＡＲ（４００～７００ｎｍ）連続照射３５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１であった。
【0020】
１．４ 培養
寒天含量が０．５重量％の培地からの２株について段階１．３から得られたコロニーを、石由来の微量および多量栄養素を添加して改変されていない、表１に組成が開示されている段階１．１の培地の水溶液に溶解させ、２５℃で２週間、ＩＫＡ ＫＳ ５０１オービタルシェーカーを用いた同時連続オービタル振盪（２０ｒｐｍ）および３５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１の連続ＰＡＲ照射（４００～７００ｎｍ）でインキュベートし、本発明の対象である２つの菌株の２つの別個の培養物をさらに維持した。
寒天含量が０．５重量％の培地からの２株について段階１．３から得られたコロニーを、石由来の微量および多量栄養素を添加して改変されていない、表１に組成が開示されている段階１．１の培地の水溶液に溶解させ、２５℃で２週間、ＩＫＡ ＫＳ ５０１オービタルシェーカーを用いた同時連続オービタル振盪（２０ｒｐｍ）および３５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１の連続ＰＡＲ照射（４００～７００ｎｍ）でインキュベートし、本発明の対象である２つの菌株の２つの別個の培養物をさらに維持した。
【0021】
段階１．１の培地中で、石由来の微量および多量栄養素を添加して改変されていない、本発明の２株のモノクローナル安定培養物の調製
顕微鏡下で分離したシアノバクテリアのコロニーを、ｐＨ８．２、温度２５℃、ＰＡＲ光強度２０μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１で、石を添加しない、組成が表１に挙げられている段階１．１の培地水溶液中に入れ、一定の間隔で振盪して再懸濁させた。培養液の一部（２ｍＬ）を２週間ごとに、石を添加しない段階１．１の１００ｍＬの新鮮な標準培地に加えて新鮮な培養液を維持した。液体培地でのシアノバクテリア培養中の光周期は、連続または混合様式で、明期１０～１２時間、暗期１２～１４時間であった。
顕微鏡下で分離したシアノバクテリアのコロニーを、ｐＨ８．２、温度２５℃、ＰＡＲ光強度２０μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１で、石を添加しない、組成が表１に挙げられている段階１．１の培地水溶液中に入れ、一定の間隔で振盪して再懸濁させた。培養液の一部（２ｍＬ）を２週間ごとに、石を添加しない段階１．１の１００ｍＬの新鮮な標準培地に加えて新鮮な培養液を維持した。液体培地でのシアノバクテリア培養中の光周期は、連続または混合様式で、明期１０～１２時間、暗期１２～１４時間であった。
【0022】
シアノバクテリア培養物のスキネトミン合成誘導およびその生産性の決定
ＦｌｅｍｉｎｇおよびＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ（２００７）の方法を採用した。簡単に述べれば、上記の培地、すなわち、段階１．１からの、石を添加しないシアノバクテリア溶液を濾過し、フィルターを寒天含量２％のＢＧ－１１固体寒天培地上に置いた。フィルターを入れた皿にＰＡＲ（６５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１、４０Ｗ／ｍ２）とＵＶ照射（１．８Ｗ／ｍ２）を行った。照射されたシアノバクテリアを含む数枚のフィルターで、３日ごとにスキネトミン含量を分析した。そこで、以下に示すような分光光度法を用いた：
ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイシングルビーム分光光度計（ヒューレット・パッカード、東京、日本）を用い、抽出（メタノール／酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１））したスキネトミンの吸収スペクトルを得た。特定の波長（それぞれの色素の最大ピーク）に対する吸光度値を、三色方程式および消衰係数（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，１９８７）を用いて、スキネトミンの半定量的アッセイ［ｍｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ）］のために選択した。
ＦｌｅｍｉｎｇおよびＣａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ（２００７）の方法を採用した。簡単に述べれば、上記の培地、すなわち、段階１．１からの、石を添加しないシアノバクテリア溶液を濾過し、フィルターを寒天含量２％のＢＧ－１１固体寒天培地上に置いた。フィルターを入れた皿にＰＡＲ（６５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１、４０Ｗ／ｍ２）とＵＶ照射（１．８Ｗ／ｍ２）を行った。照射されたシアノバクテリアを含む数枚のフィルターで、３日ごとにスキネトミン含量を分析した。そこで、以下に示すような分光光度法を用いた：
ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイシングルビーム分光光度計（ヒューレット・パッカード、東京、日本）を用い、抽出（メタノール／酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１））したスキネトミンの吸収スペクトルを得た。特定の波長（それぞれの色素の最大ピーク）に対する吸光度値を、三色方程式および消衰係数（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，１９８７）を用いて、スキネトミンの半定量的アッセイ［ｍｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ）］のために選択した。
【0023】
１．５ 本発明のスキネトミンの生産性の評価方法
培養終了後、段階１．４のシアノバクテリアを含有する培養液を０．２μｍフィルターで濾過した。フィルターをＢＧ－１１固形寒天培地（２％）上に置いた。フィルターを入れた皿に、６５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１（または４０Ｗ／ｍ２）のＰＡＲ照射および１．８Ｗ／ｍ２のＵＶＡ照射を行った。照射されたシアノバクテリアを含む数枚のフィルターで、３日ごとにスキネトミン含量を分析した。そこで、以下に示すような分光光度法を用いた：
ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイシングルビーム分光光度計（ヒューレット・パッカード、東京、日本）を用い、抽出（メタノール／酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１））したスキネトミン（他の色素も含む）の吸収スペクトルを得た。特定の波長（それぞれの色素の最大ピーク）に対する吸光度値を、三色方程式および消衰係数（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，１９８７）を用いて、スキネトミンの半定量的アッセイ［ｍｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ）］のために選択した。
培養終了後、段階１．４のシアノバクテリアを含有する培養液を０．２μｍフィルターで濾過した。フィルターをＢＧ－１１固形寒天培地（２％）上に置いた。フィルターを入れた皿に、６５μｍｏｌ光子ｍ－２ｓ－１（または４０Ｗ／ｍ２）のＰＡＲ照射および１．８Ｗ／ｍ２のＵＶＡ照射を行った。照射されたシアノバクテリアを含む数枚のフィルターで、３日ごとにスキネトミン含量を分析した。そこで、以下に示すような分光光度法を用いた：
ＨＰ ８４５２Ａダイオードアレイシングルビーム分光光度計（ヒューレット・パッカード、東京、日本）を用い、抽出（メタノール／酢酸エチル（ｖ／ｖ １：１））したスキネトミン（他の色素も含む）の吸収スペクトルを得た。特定の波長（それぞれの色素の最大ピーク）に対する吸光度値を、三色方程式および消衰係数（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ，１９８７）を用いて、スキネトミンの半定量的アッセイ［ｍｇ／ｇ乾燥重量（ＤＷ）］のために選択した。
【0024】
得られたスキネトミン生産性は、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂに寄託されている細菌株およびＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番としてＢａｎｃｏ Ｅｓｐａｎｏｌ ｄｅ Ａｌｇａｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｌａｓ Ｐａｌｍａｓ ｄｅ ＧＣに寄託されている細菌株について、シアノバクテリアの乾燥重量当たり少なくとも１．７５％であり、すなわち、シアノバクテリアの乾燥重量（ＤＷ）当たり０．０３～０．０９％のスキネトミンであった当該技術分野のもの（Ｂａｌｓｋｕｓら、２０１１）よりはるかに高く、従って、生産性は１９倍～５８倍であった。
【0025】
１．６ スキネトミンの抽出および精製
培養液中に懸濁された上記項目の記載に従って得られたバイオマスを、遠心分離（または濾過）によって分離する。得られたバイオマスに対して、クロロホルム：ヘキサン混合物（ｖ／ｖ １：１）中で予備精製を行う。この段階で、溶媒混合物を含むバイオマスを１０分間振盪し、また１０分間超音波処理も行う。続いてこれを遠心分離し（６０００ｒｐｍ、１０分間）、沈殿物の上から上清を回収する。新しい溶媒混合物を沈殿物に加え、この手順を繰り返す。さらに遠心分離を行った後、両方の遠心分離の上清を合わせ、再利用のために真空エバポレーターを用いて精製することもできる。続いて、第一段階の精製後のバイオマスに対して、酢酸エチル：メタノール混合物（ｖ／ｖ １：１）またはアセトン中での一次抽出を行う。この段階では、１０分サイクルの遠心分離と超音波処理も用いる。遠心分離はサイクルごとに行い、上清を回収する。上清の色が落ち始めるまで（通常３～５回）、さらに新しい溶媒で抽出を繰り返す。回収した上清を、次に真空エバポレーター（４０℃）を用いて蒸発させて再利用する。蒸発後の乾燥残渣に対して最終精製手順を行う。この段階でもクロロホルム：ヘキサン（ｖ／ｖ １：１）を使用し、振盪、超音波処理および遠心分離を行う。精製段階の回数はサンプルの汚染度によって異なり、遠心分離後に無色透明の上清が得られるまで繰り返す。これが達成されたら、沈殿物（スキネトミン）をさらにヘキサンで２回洗浄する。最後の遠心分離と沈殿物の上からの上清の回収の後、真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、その後重量を測定する。乾燥した沈殿物はＨＰＬＣでアッセイして、得られた生成物の純度を評価する。
培養液中に懸濁された上記項目の記載に従って得られたバイオマスを、遠心分離（または濾過）によって分離する。得られたバイオマスに対して、クロロホルム：ヘキサン混合物（ｖ／ｖ １：１）中で予備精製を行う。この段階で、溶媒混合物を含むバイオマスを１０分間振盪し、また１０分間超音波処理も行う。続いてこれを遠心分離し（６０００ｒｐｍ、１０分間）、沈殿物の上から上清を回収する。新しい溶媒混合物を沈殿物に加え、この手順を繰り返す。さらに遠心分離を行った後、両方の遠心分離の上清を合わせ、再利用のために真空エバポレーターを用いて精製することもできる。続いて、第一段階の精製後のバイオマスに対して、酢酸エチル：メタノール混合物（ｖ／ｖ １：１）またはアセトン中での一次抽出を行う。この段階では、１０分サイクルの遠心分離と超音波処理も用いる。遠心分離はサイクルごとに行い、上清を回収する。上清の色が落ち始めるまで（通常３～５回）、さらに新しい溶媒で抽出を繰り返す。回収した上清を、次に真空エバポレーター（４０℃）を用いて蒸発させて再利用する。蒸発後の乾燥残渣に対して最終精製手順を行う。この段階でもクロロホルム：ヘキサン（ｖ／ｖ １：１）を使用し、振盪、超音波処理および遠心分離を行う。精製段階の回数はサンプルの汚染度によって異なり、遠心分離後に無色透明の上清が得られるまで繰り返す。これが達成されたら、沈殿物（スキネトミン）をさらにヘキサンで２回洗浄する。最後の遠心分離と沈殿物の上からの上清の回収の後、真空乾燥機（４０℃）で乾燥させ、その後重量を測定する。乾燥した沈殿物はＨＰＬＣでアッセイして、得られた生成物の純度を評価する。
【0026】
実施例２ スキネトミンの使用
２．１． 日焼け防止効率
シアノバクテリウム抽出物に基づくスキネトミンを有効成分とする様々な銘柄のサンスクリーン剤および本出願人らが提案したサンスクリーン製品（サンプル４）の日焼け防止効率を実証するために、分光光度法を使用した。そこで、市販のサンスクリーン製品および試験サンプル４について、人の皮膚を模擬したもの（３Ｍサージカルテープ）を用いた実験で吸光度および透過率を分析した。市販の３Ｍ（Ｒ）テープを２×２ｃｍの石英ガラステープに貼り、その上に評価対象製品を薄く塗布した。ＦＬＡＭＥ－Ｓ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，フロリダ州，ＵＳＡ）システムと分光計を用い、これらのプレートで２０分後の吸光度と透過率を調べた。
２．１． 日焼け防止効率
シアノバクテリウム抽出物に基づくスキネトミンを有効成分とする様々な銘柄のサンスクリーン剤および本出願人らが提案したサンスクリーン製品（サンプル４）の日焼け防止効率を実証するために、分光光度法を使用した。そこで、市販のサンスクリーン製品および試験サンプル４について、人の皮膚を模擬したもの（３Ｍサージカルテープ）を用いた実験で吸光度および透過率を分析した。市販の３Ｍ（Ｒ）テープを２×２ｃｍの石英ガラステープに貼り、その上に評価対象製品を薄く塗布した。ＦＬＡＭＥ－Ｓ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，フロリダ州，ＵＳＡ）システムと分光計を用い、これらのプレートで２０分後の吸光度と透過率を調べた。
【0027】
本発明のスキネトミン製品の日焼け防止効率は図１に示され、この図では、ＳＰＦ（Ｓｕｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｇｒｅｉｔｅｒ，１９７４）が３０および５０の選択された市販製品（サンプル１～３）と、スキネトミンを添加したサンプル４について、吸光度（ＡおよびＢ）と透過率（ＣおよびＤ）を試験した比較結果を示している。試験は、人工皮膚を模擬した薄層材料（３Ｍ（登録商標）サージカルテープ）を用いて行った。図１ＡはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）、ＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）から８００ｎｍまでの範囲、図１ＢはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）からＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）の範囲のサンプルの吸光度曲線を示し、図１ＣはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）、ＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）から８００ｎｍまでの範囲、１ＤはＵＶＢ（２８０～３２０ｎｍ）からＵＶＡ（３２０～４００ｎｍ）までの範囲のサンプルの透過率曲線を示し、曲線記号は、連続線「ボルト」は、スキネトミンを添加した配合物４；サンプル１は、－－－－－；サンプル２は、－．－．－．－、サンプル３は、－ － － －。
【0028】
特定の組成が以下に示されている市販の製品を比較分析のために選択した。
サンプル１ ２－エチルヘキシル４－メトキシ桂皮酸／オクチノキサート＋２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン／オキシベンゾン＋二酸化チタン（ＴｉＯ２）［製品の含量パーセンテージ：それぞれ７．５％、４％および１０％］＋ｑ．ｓ．（適量）：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール。
サンプル２ 二酸化チタン（ＴｉＯ２）＋酸化亜鉛（ＺｎＯ）［製品の含量パーセンテージ：それぞれ１０％および１７％］＋ｑ．ｓ．：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
サンプル３ 酸化亜鉛（ＺｎＯ）＋（４－メトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル）／オクチノキサート［製品の含量パーセンテージ：それぞれ１５．５％および７．５％］＋ｑ．ｓ．：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
サンプル４ ０．８％スキネトミン＋Ｄｉｐｒｏｂａｓｅ ｑ．ｓ．（組成：白色ワセリン、液体パラフィン、マクロゴールセトステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、リン酸二水素ナトリウム二水和物、クロロクレゾール、水酸化ナトリウム、濃リン酸、精製水）
サンプル１ ２－エチルヘキシル４－メトキシ桂皮酸／オクチノキサート＋２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン／オキシベンゾン＋二酸化チタン（ＴｉＯ２）［製品の含量パーセンテージ：それぞれ７．５％、４％および１０％］＋ｑ．ｓ．（適量）：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール。
サンプル２ 二酸化チタン（ＴｉＯ２）＋酸化亜鉛（ＺｎＯ）［製品の含量パーセンテージ：それぞれ１０％および１７％］＋ｑ．ｓ．：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
サンプル３ 酸化亜鉛（ＺｎＯ）＋（４－メトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル）／オクチノキサート［製品の含量パーセンテージ：それぞれ１５．５％および７．５％］＋ｑ．ｓ．：グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
サンプル４ ０．８％スキネトミン＋Ｄｉｐｒｏｂａｓｅ ｑ．ｓ．（組成：白色ワセリン、液体パラフィン、マクロゴールセトステアリルエーテル、セトステアリルアルコール、リン酸二水素ナトリウム二水和物、クロロクレゾール、水酸化ナトリウム、濃リン酸、精製水）
【0029】
観察：スキネトミンを添加した配合物は、ＵＶＢとＵＶＡの領域で高い吸光度値と低い透過率を示し、ＳＰＦ３０および５０の市販クリームと同様のレベルであった。
【0030】
２．２ 化粧品に使用される選択された溶液中でのスキネトミンの分散度の試験
２．２．１
０．５ｍｇのスキネトミンを分析天秤で秤量し、１ｇの下記溶液に懸濁させた。
１）プロピレングリコール（ＩＮＣＩ：プロピレングリコール）
２）精製アプリコット油（ＩＮＣＩ：Ｐｒｕｎｕｓ Ａｒｍｅｎｉａｃａ（アプリコット）カーネルオイル）
３）グリセリン（ＩＮＣＩ：グリセリン）
４）イソヘキサデカン（ＩＮＣＩ：イソヘキサデカン）
５）２－オクチルドデカン－１－オールＯＤＤ（ＩＮＣＩ：オクチルドデカノール）
６）ＳＬＰ乳化剤（ＩＮＣＩ：ラウリン酸ソルビタン／ラウリン酸ポリグリセリル－４／クエン酸ジラウリル）
次に、シェーカーを用いて約１分間サンプルを混合し、超音波槽で１０分間維持してより高い分散度を達成した。
２．２．１
０．５ｍｇのスキネトミンを分析天秤で秤量し、１ｇの下記溶液に懸濁させた。
１）プロピレングリコール（ＩＮＣＩ：プロピレングリコール）
２）精製アプリコット油（ＩＮＣＩ：Ｐｒｕｎｕｓ Ａｒｍｅｎｉａｃａ（アプリコット）カーネルオイル）
３）グリセリン（ＩＮＣＩ：グリセリン）
４）イソヘキサデカン（ＩＮＣＩ：イソヘキサデカン）
５）２－オクチルドデカン－１－オールＯＤＤ（ＩＮＣＩ：オクチルドデカノール）
６）ＳＬＰ乳化剤（ＩＮＣＩ：ラウリン酸ソルビタン／ラウリン酸ポリグリセリル－４／クエン酸ジラウリル）
次に、シェーカーを用いて約１分間サンプルを混合し、超音波槽で１０分間維持してより高い分散度を達成した。
【0031】
結果：
１．有効成分の高い分散度；グリコール溶液はすぐに茶緑色となり、懸濁の小粒子が見られる（図６ａ参照）。
２．溶液中の有効成分の極めて低い分散度；溶解していない懸濁が明確に見られ、これが経時的に沈殿する（図６ｂ参照）。
３．有効成分の低い分散度；懸濁が明確に見られ、これが経時的に徐々に溶解し、溶液がわずかに色づく（図６ｃ参照）。
４．有効成分の高い分散度。懸濁後、一様に分散した灰色がかった懸濁液が得られ、物質の粒子が見られ（極めて微細）、これが経時的に沈殿する（図６ｄ参照）。
５．有効成分の比較的高い分散度。淡緑色溶液が得られ、底に沈降している懸濁物が見られる（図６ｅ参照）。
６．乳化剤溶液中の有効成分の低い分散度。底に沈降している微粒子が見られ、溶液が経時的に徐々に着色する（図６ｆ参照）。
１．有効成分の高い分散度；グリコール溶液はすぐに茶緑色となり、懸濁の小粒子が見られる（図６ａ参照）。
２．溶液中の有効成分の極めて低い分散度；溶解していない懸濁が明確に見られ、これが経時的に沈殿する（図６ｂ参照）。
３．有効成分の低い分散度；懸濁が明確に見られ、これが経時的に徐々に溶解し、溶液がわずかに色づく（図６ｃ参照）。
４．有効成分の高い分散度。懸濁後、一様に分散した灰色がかった懸濁液が得られ、物質の粒子が見られ（極めて微細）、これが経時的に沈殿する（図６ｄ参照）。
５．有効成分の比較的高い分散度。淡緑色溶液が得られ、底に沈降している懸濁物が見られる（図６ｅ参照）。
６．乳化剤溶液中の有効成分の低い分散度。底に沈降している微粒子が見られ、溶液が経時的に徐々に着色する（図６ｆ参照）。
【0032】
要約：
有効成分の最良の分散度は、０．５ｍｇ／ｇグリコール濃度のサンプル１で得られた。連続するサンプルでは、以下の順序で分散レベルの低下が見られた（サンプルは、マトリックス中のスキネトミンの分散度の最高から最低へと並べられている）：１＞４＞５＞６＞３＞２。
有効成分の最良の分散度は、０．５ｍｇ／ｇグリコール濃度のサンプル１で得られた。連続するサンプルでは、以下の順序で分散レベルの低下が見られた（サンプルは、マトリックス中のスキネトミンの分散度の最高から最低へと並べられている）：１＞４＞５＞６＞３＞２。
【0033】
２．２．２
調製：
０．５ｍｇのスキネトミンを分析天秤で秤量し、５ｇの組成物中に懸濁させた。
７）グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
このサンプルを、実験室用攪拌機を用いて５分間撹拌した。
調製：
０．５ｍｇのスキネトミンを分析天秤で秤量し、５ｇの組成物中に懸濁させた。
７）グリセリン＋ステアリン酸グリセロール＋水＋シリカ＋アルコール
このサンプルを、実験室用攪拌機を用いて５分間撹拌した。
【0034】
結果：
有効成分を含む原料基剤を混合した後、目に見えるスキネトミン粒子を伴う均質な灰白色基剤が得られた。物質は溶解しなかったが、分解してより小さな粒子となった。効果はイソヘキサデカン（懸濁液）を含むサンプル４と同等であった－図６ｇ参照。
有効成分を含む原料基剤を混合した後、目に見えるスキネトミン粒子を伴う均質な灰白色基剤が得られた。物質は溶解しなかったが、分解してより小さな粒子となった。効果はイソヘキサデカン（懸濁液）を含むサンプル４と同等であった－図６ｇ参照。
【0035】
１＞４、７＞５＞６＞３＞２
【0036】
実施例３ 比較例－現況技術－標準的な分離および培養方法
ＢＧ１１培地での培養を用いたＲｉｐｐｋａら（１９７９）；ＢＧ－１１Ｎ０培地での培養を用いたＡｎａｈａｓおよびＭｕｒａｌｉｔｈａｒａｎ（２０１５）；１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３で改変したＢＧ１１培地での培養を用いたＳｉｎｇｈら（２０１４）による標準的方法を使用しても、本特許出願の目的である菌株の細菌は分離できず、ましてや培養はできなかった。細菌コロニーは早期に死滅し、スキネトミンを生産するために必要なバイオマスを得ることはできなかった。
ＢＧ１１培地での培養を用いたＲｉｐｐｋａら（１９７９）；ＢＧ－１１Ｎ０培地での培養を用いたＡｎａｈａｓおよびＭｕｒａｌｉｔｈａｒａｎ（２０１５）；１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３で改変したＢＧ１１培地での培養を用いたＳｉｎｇｈら（２０１４）による標準的方法を使用しても、本特許出願の目的である菌株の細菌は分離できず、ましてや培養はできなかった。細菌コロニーは早期に死滅し、スキネトミンを生産するために必要なバイオマスを得ることはできなかった。
【0037】
実施例４
熱重量／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）を用いたフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）
サンプル同定：ＳＣＹ
粉末形態の暗褐色固体
重量：８．３ｍｇ
熱重量／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）を用いたフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）
サンプル同定：ＳＣＹ
粉末形態の暗褐色固体
重量：８．３ｍｇ
【0038】
導入
寄託番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂの本発明の目的である菌株から得られたサンプル（以下、ＳＣＹと称する）を、以下に記載する技術を用いてさらに分析するために調製した：示差熱分析／熱重量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を、以下に記載する特定の手順に従って行った。この分析に事前のサンプル調製は必要なかった。続いて、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ株のサンプルについても実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。実施例で示した結果は総て、本発明の目的である２つの菌株から得られた同じ物質を指す。
寄託番号ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００７５Ｂの本発明の目的である菌株から得られたサンプル（以下、ＳＣＹと称する）を、以下に記載する技術を用いてさらに分析するために調製した：示差熱分析／熱重量測定（ＴＧ／ＤＴＡ）およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を、以下に記載する特定の手順に従って行った。この分析に事前のサンプル調製は必要なかった。続いて、ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ株のサンプルについても実験を繰り返したところ、同様の結果が得られた。実施例で示した結果は総て、本発明の目的である２つの菌株から得られた同じ物質を指す。
【0039】
ＳＣＹのサンプルは、分析まで密閉容器にて室温で保存した。
【0040】
４．１
ＦＴＩＲ
１１０℃で５時間予め乾燥させた２０９．９ｍｇのＫＢｒをＦＴＩＲ分析のために秤量し、真空デシケーター内で室温まで冷ました。０．４ｍｇのサンプルをＫＢｒに加え、混合物を、水分の吸収を避けるために赤外線ランプ下、メノウ乳鉢で摩砕した。
ＦＴＩＲ
１１０℃で５時間予め乾燥させた２０９．９ｍｇのＫＢｒをＦＴＩＲ分析のために秤量し、真空デシケーター内で室温まで冷ました。０．４ｍｇのサンプルをＫＢｒに加え、混合物を、水分の吸収を避けるために赤外線ランプ下、メノウ乳鉢で摩砕した。
【0041】
スペクトルは以下の条件で得た。
装置
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴＩＲ ８４００分光光度計（島津製作所、京都、日本）
ＰＩＫＥプレス（Ｐｉｋｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マディソン、ＵＳＡ）
測定パラメーター：
方法：透過率％
範囲：４００～４０００ｃｍ－１
アポダイゼーション：Ｈａｐｐ－Ｇｅｎｚｅｌ
スキャン数：４５
分解能：４．０
装置
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＦＴＩＲ ８４００分光光度計（島津製作所、京都、日本）
ＰＩＫＥプレス（Ｐｉｋｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マディソン、ＵＳＡ）
測定パラメーター：
方法：透過率％
範囲：４００～４０００ｃｍ－１
アポダイゼーション：Ｈａｐｐ－Ｇｅｎｚｅｌ
スキャン数：４５
分解能：４．０
【0042】
結果：
データは島津製作所のソフトウエアを用いて処理してピーク値を求めた。ピーク値とバンドは、利用可能な文献（Pretsch, E. et al.: “Tablas para la elucidacion estructural de compuestos organicos por metodos espectroscopicos” Ed. Alhambra. Madrid, 1980およびFlett, M. “Characteristic Frequencies of Chemical Groups in the Infra-red” Elsevier Monographs. Elsevier, 1963）に従って割り当て、図２は、ＳＣＹのサンプル（実施例１で得られた）のＦＴＩＲスペクトルを示し、主要なバンドに印を付けた。表２は、同定された最も可能性の高い官能基／結合に割り当てられた波数値を示す。
データは島津製作所のソフトウエアを用いて処理してピーク値を求めた。ピーク値とバンドは、利用可能な文献（Pretsch, E. et al.: “Tablas para la elucidacion estructural de compuestos organicos por metodos espectroscopicos” Ed. Alhambra. Madrid, 1980およびFlett, M. “Characteristic Frequencies of Chemical Groups in the Infra-red” Elsevier Monographs. Elsevier, 1963）に従って割り当て、図２は、ＳＣＹのサンプル（実施例１で得られた）のＦＴＩＲスペクトルを示し、主要なバンドに印を付けた。表２は、同定された最も可能性の高い官能基／結合に割り当てられた波数値を示す。
【0043】
【表2】
【0044】
ＢＥＡ＿ＩＤＡ＿００６８Ｂ番として寄託されている菌株から、実施例１で調製した化合物について同様の分析を行った。得られたスペクトルは図２と同じであった。
【0045】
４．２ ＴＧ／ＤＴＡ
３．７ｍｇのサンプルをアルミナるつぼに秤量し、３４．６ｍｇの純金ワイヤー（９９．９９９％）を加え、ロッドウェイトとマイクロ天秤のカウンターウェイトのバランスをとった。
３．７ｍｇのサンプルをアルミナるつぼに秤量し、３４．６ｍｇの純金ワイヤー（９９．９９９％）を加え、ロッドウェイトとマイクロ天秤のカウンターウェイトのバランスをとった。
【0046】
サンプル調製
分析に特別な調整は必要なかった。
分析に特別な調整は必要なかった。
【0047】
装置
ＳＥＴＡＲＡＭ ＳＥＴＳＹＳ ６０００アナライザー
実験条件
測定パラメーター：
２気圧のアルゴン流
サンプル重量：３．７ｍｇ
るつぼ：１００μＬ Ａｌ２Ｏ３
参照るつぼ：Ａｌ２Ｏ３
温度傾斜：
ＳＥＴＡＲＡＭ ＳＥＴＳＹＳ ６０００アナライザー
実験条件
測定パラメーター：
２気圧のアルゴン流
サンプル重量：３．７ｍｇ
るつぼ：１００μＬ Ａｌ２Ｏ３
参照るつぼ：Ａｌ２Ｏ３
温度傾斜：
【表3】
【0048】
結果
熱重量曲線に基づいて連続段階での重量損失を算出し、ヒートフロー曲線からサンプル加熱中の発熱過程と吸熱過程の有無を判定した。
熱重量曲線に基づいて連続段階での重量損失を算出し、ヒートフロー曲線からサンプル加熱中の発熱過程と吸熱過程の有無を判定した。
【0049】
図３は、３５０℃～５２０℃の温度範囲におけるサンプル加熱温度に依存する重量損失曲線（黒色の曲線）とヒートフロー曲線（灰色の曲線）を示している。この温度範囲では、ＳＣＹの明確な重量損失（黒色の曲線）が見られた。物質の熱分解は発熱過程であり（灰色の曲線上のヒートフロー値の増加）、３６５．４℃（図３の縦の破線）から始まり、３８０．３℃（図３の縦の実線）でその最大値に達する。発熱過程に関連して、ＳＣＹの４．３２％の重量損失が３６５．４℃～３８０．３℃の温度範囲で起こることが判明し、これにより、ＳＣＹの分解温度がこの温度範囲にあり、３８０．３℃に明確な最大値があることが確認された。吸熱過程（灰色の曲線上の値の減少）と関連したＳＣＹの重量損失はこの温度より高くても見られ、これにより、ＳＣＹ分解生成物の二次分解に関連した発熱過程が見られる４０５～４１２℃の温度範囲を除き、ガス放出とＳＣＹ分解生成物の再構築の過程が確認された。
ＳＣＹ分解のＴ範囲＝３６５．４～３８０．３℃
最大重量損失＝３８０．３℃
Δ重量＝０．１６ｍｇ（４．３２％）
ＳＣＹ分解のＴ範囲＝３６５．４～３８０．３℃
最大重量損失＝３８０．３℃
Δ重量＝０．１６ｍｇ（４．３２％）
【0050】
実施例１に従って培養および分離された本発明の目的である２株から得られた化合物についても同様のスペクトルが得られた。
【0051】
実施例５
多結晶Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）
測定方法
本発明の目的である２株からＳＣＹを抽出した後、溶媒を蒸発させ、２～２０μｍの大きさの針状単結晶、または針状結晶が放射状に配列したそれらの凝集体として８．３ｍｇの褐色粉末（結晶形、本発明の形態）を得た。この結晶材料の特徴を光学顕微鏡（ＡＸＩＯ Ｉｍａｇｅｒ ＤＭ２顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ、カールツァイス、ドイツ、Ａｐｏｃｈｒｏｍｅ ６３倍レンズ、ｎ＝１．４ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。
多結晶Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）
測定方法
本発明の目的である２株からＳＣＹを抽出した後、溶媒を蒸発させ、２～２０μｍの大きさの針状単結晶、または針状結晶が放射状に配列したそれらの凝集体として８．３ｍｇの褐色粉末（結晶形、本発明の形態）を得た。この結晶材料の特徴を光学顕微鏡（ＡＸＩＯ Ｉｍａｇｅｒ ＤＭ２顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ、カールツァイス、ドイツ、Ａｐｏｃｈｒｏｍｅ ６３倍レンズ、ｎ＝１．４ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。
【0052】
ＰＸＲＤ粉末分析は、本発明の目的である２株から得られたＳＣＹからなる結晶材料（本発明の形態）において行われ、２つの類似したＰＸＲＤ回折図が記録された。ＰＸＲＤ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８－Ｄｉｓｃｏｖｅｒ多結晶回折計を用いて行った。粉末回折図は、Ｘ線源としてＸ線管（Ｃｕアノード、Ｋα、５０ｋＶ、３０ｍＡ、スリット２ｍｍのコリメータ）を用いて室温で得られた。測定は連続作動モードで記録し、２θ角走査範囲は２～６０°、測定ステップは０．０２°、走査速度は０．７秒／測定ステップであった。
【0053】
得られた回折データの解析には、Ｄｉｆｆｒａｃ．ＥＶＡ ｖ５．１ソフトウエアを使用した。
【0054】
図４に示した粉末Ｘ線回折スペクトル（本発明の形態）の分析結果は以下のとおりである：
１．ＳＣＹの回折パターンは非晶質相を示さない。
２．ＰＸＲＤ回折パターンは、２θ角２～４３°の範囲に約３５個の有意な回折ピークを含む。回折パターンの質が悪く、この値以上のピークパラメーターを明確に決定（同定）することができなかったため、分析は行わなかった。
３．その特徴（結晶度が高いことを裏付ける半値全幅（ＦＷＨＭ）の低さ）を考慮すると、利用可能なソフトウエアに基づいて決定された以下の２θ角度：２．５００°、４．５８９°、５．０６２°、８．６３０°および９．１９７°における少なくとも５つの低角回折角を用いて材料を特定することができる。
図４では、ピークを「＊」で示す。
４．より高いＦＷＨＭ値で、より低くよりブロードな他のピークの存在は、結晶度の低い（結晶子サイズの小さい）結晶性物質がサンプル中に存在することを示す。
５．記録された回折ピークはＳＣＹに特異的であり、物質の同定に使用することができる。利用可能な多結晶データの結晶学的データベースに基づくと、この回折パターンを持つ既知の物質は他に見つからなかった。
１．ＳＣＹの回折パターンは非晶質相を示さない。
２．ＰＸＲＤ回折パターンは、２θ角２～４３°の範囲に約３５個の有意な回折ピークを含む。回折パターンの質が悪く、この値以上のピークパラメーターを明確に決定（同定）することができなかったため、分析は行わなかった。
３．その特徴（結晶度が高いことを裏付ける半値全幅（ＦＷＨＭ）の低さ）を考慮すると、利用可能なソフトウエアに基づいて決定された以下の２θ角度：２．５００°、４．５８９°、５．０６２°、８．６３０°および９．１９７°における少なくとも５つの低角回折角を用いて材料を特定することができる。
図４では、ピークを「＊」で示す。
４．より高いＦＷＨＭ値で、より低くよりブロードな他のピークの存在は、結晶度の低い（結晶子サイズの小さい）結晶性物質がサンプル中に存在することを示す。
５．記録された回折ピークはＳＣＹに特異的であり、物質の同定に使用することができる。利用可能な多結晶データの結晶学的データベースに基づくと、この回折パターンを持つ既知の物質は他に見つからなかった。
【0055】
実施例６
スキネトミンの１Ｈ ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）測定
スキネトミン（１．６ｍｇ）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ピリジン－ｄ５（０．７５ｍｌ）中、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ３００分光計にて、基本周波数３００．１３ＭＨｚ、室温で記録した。δ化学シフトはｐｐｍで示し、Ｊ結合定数の値はＨｚで示す。スペクトルは８．７２７ｐｐｍのピリジン－ｄ５のＨ－２プロトンの残留シグナルに対して正規化した。位相とベースラインは手動で補正した。積分領域も同様に選択した。シグナルは以前の文献データ（Ｐｒｏｔｅａｕら，１９９３）に基づいて割り当てた。実験のδ化学シフトデータは引用データと一致している。－ＯＨフェノール基の不安定なプロトンが急速に交換されるため、それらのシグナルは記述に含めなかった。微量不純物（水とｎ－ヘキサン）からのシグナルは、それぞれδ４．９３と約δ１．０に見られる。
スキネトミンの１Ｈ ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）測定
スキネトミン（１．６ｍｇ）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ピリジン－ｄ５（０．７５ｍｌ）中、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩ ３００分光計にて、基本周波数３００．１３ＭＨｚ、室温で記録した。δ化学シフトはｐｐｍで示し、Ｊ結合定数の値はＨｚで示す。スペクトルは８．７２７ｐｐｍのピリジン－ｄ５のＨ－２プロトンの残留シグナルに対して正規化した。位相とベースラインは手動で補正した。積分領域も同様に選択した。シグナルは以前の文献データ（Ｐｒｏｔｅａｕら，１９９３）に基づいて割り当てた。実験のδ化学シフトデータは引用データと一致している。－ＯＨフェノール基の不安定なプロトンが急速に交換されるため、それらのシグナルは記述に含めなかった。微量不純物（水とｎ－ヘキサン）からのシグナルは、それぞれδ４．９３と約δ１．０に見られる。
【0056】
【化2】
【0057】
１Ｈ ＮＭＲ（ピリジン－ｄ５）δ［ｐｐｍ］：８．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ８．７；Ｈ－１１，１５）；７．９９（ｓ，１Ｈ；Ｈ－９）；７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ７．５；Ｈ－８）；７．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ７．６；Ｈ－５）；７．４８（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ７．６，１．２；Ｈ－６）；７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ８．８；Ｈ－１２，１４）；７．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ－７／ピリジン－ｄ５ Ｈ－３プロトンの残留シグナル重複／）。
【0058】
図５および図５ａは、ピリジン－ｄ５中で記録されたスキネトミンサンプルのプロトンスペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）をδスケール［ｐｐｍ］で示し、図５は完全なスペクトル（－０．５～１０．５ｐｐｍの範囲）を含み、図５ａは７．１～９．１ｐｐｍの拡張範囲を含む。
【0059】
実施例７
実施例１で調製した化合物を室温（２５℃）で１０か月間保存した。保存試験前後の吸光度スペクトルは同一であり、化合物の安定性が確認された。さらに、スキトネミンの高い安定性は、論文（ＦｌｅｍｉｎｇおよびＣａｓｔｅｎｈｏｌｚ ２００７）および（ＲａｓｔｏｇｉおよびＩｎｃｈａｒｏｅｎｓａｋｄｉ ２０１４）において確認されており、スキトネミンは、２か月の連続ＵＶＡ照射（５Ｗ／ｍ２）または２か月間の６０℃への加熱後も、実質的に不変の特徴的な吸光度スペクトルを有していたことが示されている。本発明のスキトネミンの結晶形は安定である。
実施例１で調製した化合物を室温（２５℃）で１０か月間保存した。保存試験前後の吸光度スペクトルは同一であり、化合物の安定性が確認された。さらに、スキトネミンの高い安定性は、論文（ＦｌｅｍｉｎｇおよびＣａｓｔｅｎｈｏｌｚ ２００７）および（ＲａｓｔｏｇｉおよびＩｎｃｈａｒｏｅｎｓａｋｄｉ ２０１４）において確認されており、スキトネミンは、２か月の連続ＵＶＡ照射（５Ｗ／ｍ２）または２か月間の６０℃への加熱後も、実質的に不変の特徴的な吸光度スペクトルを有していたことが示されている。本発明のスキトネミンの結晶形は安定である。
【0060】
実施例８
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いたスキネトミン構造モデル（ＳＣＹ）の決定
ＳＣＹの単結晶サンプルの調製
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いた分析のためのスキトネミンの単結晶サンプルを、２：１の容積比のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）－エタノール（ＥｔＯＨ）系で結晶化させることにより調製した。この方法では約３０ｍｇの化合物と１２ｍＬのＴＨＦ－ＥｔＯＨ混合液を使用した。サンプルを最初に８ｍＬのＴＨＦに溶解し、続いて４ｍＬのＥｔＯＨを加えた後、得られた溶液を室温で自由蒸発によりゆっくりと（約７日間）濃縮した。
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いたスキネトミン構造モデル（ＳＣＹ）の決定
ＳＣＹの単結晶サンプルの調製
Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いた分析のためのスキトネミンの単結晶サンプルを、２：１の容積比のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）－エタノール（ＥｔＯＨ）系で結晶化させることにより調製した。この方法では約３０ｍｇの化合物と１２ｍＬのＴＨＦ－ＥｔＯＨ混合液を使用した。サンプルを最初に８ｍＬのＴＨＦに溶解し、続いて４ｍＬのＥｔＯＨを加えた後、得られた溶液を室温で自由蒸発によりゆっくりと（約７日間）濃縮した。
【0061】
データ収集と削減
０．０１１ｍｍ×０．０３５ｍｍ×０．１３１ｍｍの寸法の暗褐色の平行六面体結晶１個を、試験サンプルから選択した（図７ａおよび７ｂ）。
０．０１１ｍｍ×０．０３５ｍｍ×０．１３１ｍｍの寸法の暗褐色の平行六面体結晶１個を、試験サンプルから選択した（図７ａおよび７ｂ）。
【0062】
選択したＳＣＹ結晶の回折データは、ＣｕＫα放射源（１．５４１８４Å）、グラファイトモノクロメーター、および低温測定用のＯｘｆｏｒｄ ＣｒｙｏＳｔｒｅａｍ ８００サンプル冷却システムを備えたＲｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｎｅｒｇｙ－Ｓ ４サイクル回折計を用いて１００Ｋで収集した。セルパラメーターの精密化とデータ削減は、回折計製造者のソフトウエア（Ｒｉｇａｋｕ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ，２０１８）を用いて行った。
【0063】
構造の解明と精密化
位相問題は固有位相法により解決され、構造モデル中の原子位置はＳＨＥＬＸＴ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２０１５－Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ）を用いて決定された。回折データの質を考慮し、構造因子２乗（Ｆ２（ｈｋｌ））に基づく非水素原子の位置と等方的原子変位パラメーターのフルマトリックス精密化のみを行った。構造の精密化を改善し、分子幾何学パラメーターを補正するために、ベンゼン環（ＡＦＩＸ ６６）およびカルボニル基を有する末端５員環（ＡＦＩＸ ５６）の幾何拘束を用いた。
位相問題は固有位相法により解決され、構造モデル中の原子位置はＳＨＥＬＸＴ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，２０１５－Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ）を用いて決定された。回折データの質を考慮し、構造因子２乗（Ｆ２（ｈｋｌ））に基づく非水素原子の位置と等方的原子変位パラメーターのフルマトリックス精密化のみを行った。構造の精密化を改善し、分子幾何学パラメーターを補正するために、ベンゼン環（ＡＦＩＸ ６６）およびカルボニル基を有する末端５員環（ＡＦＩＸ ５６）の幾何拘束を用いた。
【0064】
構造モデルの精密化と追加計算はＳＨＥＬＸＬ２０１４（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ， ２０１５－Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｃ）を用いて行った。
ＳＣＹの回折測定、結晶格子、および構造モデル精密化のパラメーターを表３に示す。ＳＣＹの幾何学的に決定された構造モデルのパラメーターを表４～７に示す。これらはそれぞれ、ＳＣＹの単位格子パラメーターの分数として表される原子座標（×１０４）および等価の等方原子変位パラメーターＵｅｑ（Å２×１０３）（ここで、Ｕｅｑ値は直交化ＵＩＪテンソルのトレースの１／３として定義される）（表４）、結合長（表５）、ならびに原子価（表６）およびねじれ角（表７）である。
ＳＣＹの回折測定、結晶格子、および構造モデル精密化のパラメーターを表３に示す。ＳＣＹの幾何学的に決定された構造モデルのパラメーターを表４～７に示す。これらはそれぞれ、ＳＣＹの単位格子パラメーターの分数として表される原子座標（×１０４）および等価の等方原子変位パラメーターＵｅｑ（Å２×１０３）（ここで、Ｕｅｑ値は直交化ＵＩＪテンソルのトレースの１／３として定義される）（表４）、結合長（表５）、ならびに原子価（表６）およびねじれ角（表７）である。
【0065】
ＳＣＹ構造モデルのグラフィック表示（図８ａ～ｄ）は、ＭＥＲＣＵＲＹソフトウエア（Ｍａｃｒａｅら，２０２０）を用いて得られたものである：非対称ユニット（図８ａ）、単位格子充填の全体図（図８ｂ）、単位格子充填、［００１］方向に沿った図（図８ｃ）、および［１００］方向に沿った図（図８ｄ）。
【0066】
【表4-1】
【表4-2】
【0067】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【0068】
【表6-1】
【表6-2】
【0069】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【0070】
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
【表8-4】
【表8-5】
【0071】
注記
この結晶は、収集した回折データの処理中に多重双晶であることが判明し、ソフトウエア製造者が実施した適切な手順を使用しなければならなかったことに留意されたい。構造モデル精密化パラメーター（Ｒ１、ｗＲ２、ＧｏＦ）（表４）は満足のいくものには程遠いが、位相問題解決中に得られたオリジナルモデルが予想と一致し、化学的に一貫していたことは、想定した構造モデルが適正であることを強く示唆した。さらに、このモデルは精密化中も比較的安定した挙動を示し、このことは、構造モデルが現実と一致しない場合によく起こることであるが、モデルの崩壊が起こらなかったことを意味する。
この結晶は、収集した回折データの処理中に多重双晶であることが判明し、ソフトウエア製造者が実施した適切な手順を使用しなければならなかったことに留意されたい。構造モデル精密化パラメーター（Ｒ１、ｗＲ２、ＧｏＦ）（表４）は満足のいくものには程遠いが、位相問題解決中に得られたオリジナルモデルが予想と一致し、化学的に一貫していたことは、想定した構造モデルが適正であることを強く示唆した。さらに、このモデルは精密化中も比較的安定した挙動を示し、このことは、構造モデルが現実と一致しない場合によく起こることであるが、モデルの崩壊が起こらなかったことを意味する。
【0072】
提案された構造モデルは、Ｐｃ空間群に一致する格子対称性を仮定している。非対称単位には２分子の被分析化合物が含まれる（図８ａ）。
【0073】
それぞれの分子は、ほぼ同一平面上の２つの断片からなる。そのため、ねじれ角がかなりの程度、被分析分子のコンフォメーションを決定する：それぞれＣ２－Ｃ１－Ｃ２２－Ｃ２３－１４２．９（１６）°およびＣ５２－Ｃ５１－Ｃ７２－Ｃ７３－１４４．８（１４）°。
【0074】
Ｏ２０とＯ７０末端ヒドロキシル酸素原子の間の２．７１Åの距離は、原子間の水素結合を示唆する。
【0075】
共有結合していない２つのＣ１０１とＣ１０２原子がモデル中に見られ、予備的に炭素原子と分類された。これらは得られたデータの質に起因するアーチファクトかもしれないが、ヒドロキシル酸素原子からの距離（Ｏ４１－Ｃ１０１ ２．６７９ÅとＯ９１－Ｃ１０２ ２．７３４Å）は、この位置に水素結合が存在する可能性を示唆している。従って、これらは残留溶媒分子に見られる酸素原子であると考えられる。
【0076】
実施例９
実施例１に従って得られたスキネトミンサンプルを１重量％の濃度となるようにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させ、続いて、分光光度計を標準的な手順に従って用い（製造者：Ｖａｒｉａｎ、モデル：ＣＡＲＹ １００ Ｓｃａｎ）、厚さ１ｃｍのキュベットで、２波長（３０５および３９３ｎｍ）で吸光度を測定した。以下の結果が得られた。
ＵＶ吸収および消衰係数：
・比吸収係数／１％ ３０５ｎｍ：３３０
・比吸収係数／１％ ３９３ｎｍ：７３０
実施例１に従って得られたスキネトミンサンプルを１重量％の濃度となるようにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させ、続いて、分光光度計を標準的な手順に従って用い（製造者：Ｖａｒｉａｎ、モデル：ＣＡＲＹ １００ Ｓｃａｎ）、厚さ１ｃｍのキュベットで、２波長（３０５および３９３ｎｍ）で吸光度を測定した。以下の結果が得られた。
ＵＶ吸収および消衰係数：
・比吸収係数／１％ ３０５ｎｍ：３３０
・比吸収係数／１％ ３９３ｎｍ：７３０
【0077】
参照文献
【表9-1】
【表9-2】
【0078】
【表10-1】
【表10-2】
【表10-3】
【表10-4】
【表10-5】
【表10-6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図5a】
【図6a】
【図6b】
【図6c】
【図6d】
【図6e】
【図6f】
【図6g】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【国際調査報告】