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特表2024-520103フィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】フィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20240514BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20240514BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573464

(86)(22)【出願日】2022-05-31

(85)【翻訳文提出日】2023-11-28

(86)【国際出願番号】 KR2022007782

(87)【国際公開番号】W WO2022255793

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】10-2021-0070778

(32)【優先日】2021-06-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523442828

【氏名又は名称】ヴァクセル－バイオ

【氏名又は名称原語表記】ＶＡＸＣＥＬＬ－ＢＩＯ

(71)【出願人】

【識別番号】515020429

【氏名又は名称】コンジュナショナルユニバーシティインダストリー－ユニバーシティコオポレイションファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＮＧＪＵＮＡＴＩＯＮＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】５６，Ｇｏｎｇｊｕｄａｅｈａｋ－ｒｏＧｏｎｇｊｕ－ｓｉＣｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｎａｍ－ｄｏ３１４－７０１，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子修平

(74)【代理人】

【識別番号】100179648

【弁理士】

【氏名又は名称】田中咲江

(74)【代理人】

【識別番号】100222885

【弁理士】

【氏名又は名称】早川康

(74)【代理人】

【識別番号】100140338

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100227695

【弁理士】

【氏名又は名称】有川智章

(74)【代理人】

【識別番号】100170896

【弁理士】

【氏名又は名称】寺薗健一

(74)【代理人】

【識別番号】100219313

【弁理士】

【氏名又は名称】米口麻子

(74)【代理人】

【識別番号】100161610

【弁理士】

【氏名又は名称】藤野香子

(72)【発明者】

【氏名】キムサンギ

(72)【発明者】

【氏名】イジュンヘン

(72)【発明者】

【氏名】イジェジュン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB02

4B065BB19

4B065BB20

4B065BB23

4B065BB40

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA60

(57)【要約】

本発明は、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物及びナチュラルキラー細胞増殖方法に関する。具体的には、本発明は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を用いてナチュラルキラー細胞を増殖する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞を含む、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ）増殖用組成物。

【請求項2】

ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現することを特徴とする、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞増殖用組成物。

【請求項3】

Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５を発現するフィーダー細胞を含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞増殖用組成物。

【請求項4】

Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを発現するフィーダー細胞を含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞増殖用組成物。

【請求項5】

前記フィーダー細胞が、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞増殖用組成物。

【請求項6】

前記フィーダー細胞が、ＡＲＨ７７細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞増殖用組成物。

【請求項7】

Ｂ７Ｈ６を発現する、フィーダー細胞株。

【請求項8】

前記フィーダー細胞株が、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現することを特徴とする、請求項７に記載のフィーダー細胞株。

【請求項9】

前記フィーダー細胞株が、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞株であることを特徴とする、請求項７に記載のフィーダー細胞株。

【請求項10】

（１）Ｂ７Ｈ６遺伝子をウイルス発現ベクターで形質転換して組換えウイルスを産生するステップと、
（２）フィーダー細胞に前記組換えウイルスを添加して培養するステップとを含む、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞の製造方法。

【請求項11】

前記ステップ（１）において、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに形質転換することを特徴とする、請求項１０に記載のフィーダー細胞の製造方法。

【請求項12】

前記フィーダー細胞が、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載のフィーダー細胞の製造方法。

【請求項13】

前記ウイルスが、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であることを特徴とする、請求項１０に記載のフィーダー細胞の製造方法。

【請求項14】

Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞と末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ）を培養するステップを含む、ナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項15】

前記フィーダー細胞が、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現することを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項16】

前記フィーダー細胞が、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項17】

培養液が、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）ヒト血清（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ）、メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）及び亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項18】

培養液が、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ヒト血清（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ）、メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）及び亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項19】

組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、組換えヒトインターロイキン－２１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）及び組換えヒトインターロイキン－１５（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５）からなる群から選択される少なくとも１つを添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項20】

（ａ）組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、及び組換えヒトインターロイキン－２１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）を添加し、（ｂ）組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、及び組換えヒトインターロイキン－１５（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５）を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載のナチュラルキラー細胞増殖方法。

【請求項21】

請求項１４に記載の方法で製造された、ナチュラルキラー細胞株。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

【背景技術】

【0002】

ナチュラルキラー細胞（ＮａｔｕｒａｌＫｉｌｌｅｒＣｅｌｌ；ＮＫ細胞）は、自然免疫を担う代表的な細胞であり、様々な種類の腫瘍細胞とウイルスに感染した細胞に細胞傷害性を示し、大きな顆粒を保有しているリンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ヒト末梢血リンパ球の５～１０％を占めており、Ｔ細胞とは異なり、肝臓や骨髄で成熟する。一般に、免疫細胞は、それらの表面に提示した主要組織適合複合体（Ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）タンパク質を介して感染した細胞を検知し、様々なサイトカインとアポトーシスを誘導する化学物質を分泌することによって感染した細胞を除去するが、ＮＫ細胞は、抗原と結合した主要組織適合複合体がなくても異常な細胞を認識して除去することができるため、即時の免疫反応を誘導することができる。

【0003】

ＮＫ細胞の機能に対する欠陥は、多くの疾患で報告されており、特に癌患者の場合、ほとんとのＮＫ細胞が不活化されていることが知られている。一部の研究者は、ＮＫ細胞をインビトロで増殖させ、活性化する方法について研究を進め、インビトロで増幅されたＮＫ細胞を様々な癌腫に対して反応させたところ、優れた細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すことを証明した。

【0004】

よって、ＮＫ細胞を増殖するための方法が研究されており、ＮＫ細胞の選択的増幅のための効率的な方法の一つとして、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）を利用する研究が行われている。しかしながら、ＮＫ細胞を増幅する方法の明確なメカニズムは知られていない。

【0005】

ＮＫ細胞の増幅のためのフィーダー細胞として、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）及び癌細胞株（Ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ）が用いられており、癌細胞株としては、ＨＦＷＴ、ａＷｉｌｍｓｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌｌｉｎｅ、ＥＢＶ－ＬＣＬ（ＥＢＶｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄｃｅｌｌｓ）などが知られている。

【0006】

本発明者らは、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞が優れたＮＫ細胞増殖効果を有することを発見し、また、これまで知られていたフィーダー細胞に加えて、ＡＲＨ７７細胞も優れたフィーダー細胞であり、ＮＫ細胞増殖効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】ＨｉｒｏｙｕｋｉＦｕｊｉｓａｋｉ，ＨａｒｕｍｉＫａｋｕｄａ，ＮｏｒｉｋｏＳｈｉｍａｓａｋｉ，ＣｈｉｈａｙａＩｍａｉ，ＪｉｎｇＭａ，ＴｉｍｏｔｈｙＬｏｃｋｅｙ，ｅｔａｌ．（２００９）ＥＸＰＡＮＳＩＯＮＯＦＨＩＧＨＬＹＣＹＴＯＴＯＸＩＣＨＵＭＡＮＮＡＴＵＲＡＬＫＩＬＬＥＲＣＥＬＬＳＦＯＲＣＡＮＣＥＲＣＥＬＬＴＨＥＲＡＰＹ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．Ａｕｔｈｏｒｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ．２００９Ｍａｙ１；６９（９）：４０１０－４０１７

【非特許文献2】ＤｅｎｍａｎＣＪ，ＳｅｎｙｕｋｏｖＶＶ，ＳｏｍａｎｃｈｉＳＳ，ＰｈａｔａｒｐｅｋａｒＰＶ，ＫｏｐｐＬＭ，ｅｔａｌ．（２０１２）Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ＢｏｕｎｄＩＬ－２１ＰｒｏｍｏｔｅｓＳｕｓｔａｉｎｅｄＥｘＶｉｖｏＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＮａｔｕｒａｌＫｉｌｌｅｒＣｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＯＮＥ７（１）：ｅ３０２６４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物を提供することを目的とする。

【0009】

また、本発明は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞株及びそれを用いたナチュラルキラー細胞増殖方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、Ｂ７Ｈ６遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物を提供する。

【0011】

本発明は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物を提供する。

【0012】

本発明の組成物は、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞を含んでもよく、前記フィーダー細胞は、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現してもよい。

【0013】

好ましくは、本発明の組成物は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５を発現するフィーダー細胞を含んでもよい。

【0014】

より好ましくは、本発明の組成物は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαを発現するフィーダー細胞を含んでもよい。

【0015】

本発明のフィーダー細胞は、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であってもよく、好ましくは、ＡＲＨ７７細胞であってもよい。

【0016】

本発明は、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞株を提供する。

【0017】

本発明のフィーダー細胞株は、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現してもよい。

【0018】

本発明のフィーダー細胞株は、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞株であってもよい。

【0019】

さらに、本発明は、
（１）Ｂ７Ｈ６遺伝子をウイルス発現ベクターで形質転換して組換えウイルスを産生するステップと、
（２）フィーダー細胞に前記組換えウイルスを添加して培養するステップと、
を含む、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞の製造方法を提供する。

【0020】

本発明の前記形質転換遺伝子は、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子をさらに含んでもよい。

【0021】

本発明の前記ウイルスは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であってもよい。

【0022】

本発明の前記フィーダー細胞は、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であってもよい。

【0023】

また、本発明は、Ｂ７Ｈ６を発現するフィーダー細胞と末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ）を培養するステップを含む、ナチュラルキラー細胞増殖方法を提供する。

【0024】

本発明の前記フィーダー細胞は、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つをさらに発現してもよい。

【0025】

本発明の前記フィーダー細胞は、ＡＲＨ７７またはＫ５６２細胞であってもよい。

【0026】

本発明の前記培養液は、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）ヒト血清（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ）、メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）及び亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）からなる群から選択される少なくとも１つを含んでもよく、好ましくは、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）、ヒト血清（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍ）、メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）及び亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）からなる群から選択される少なくとも１つを含んでもよい。

【0027】

本発明の前記増殖方法は、組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、組換えヒトインターロイキン－２１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２1）及び組換えヒトインターロイキン－１５（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５）からなる群から選択される少なくとも１つを添加するステップをさらに含んでもよい。

【0028】

好ましくは、（ａ）組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、及び組換えヒトインターロイキン－２１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２1）を添加し、（ｂ）組換えヒトインターロイキン－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、及び組換えヒトインターロイキン－１５（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５）を添加するステップをさらに含んでもよい。

【0029】

また、本発明の増殖方法で製造されたナチュラルキラー細胞株を提供する。

【発明の効果】

【0030】

本発明によるＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択された少なくとも１つの遺伝子が発現されたフィーダー細胞を用いてナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を増殖させると、周知のフィーダー細胞を用いる方法と比較して、より高いレベルの増幅率、純度及び細胞傷害性を有するＮＫ細胞が得られるといった効果を奏することにより、ＮＫ細胞を用いた様々な免疫細胞治療などで非常に有用に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】レンチウイルスベクター構造を示す図である。

【図2a】ＡＲＨ７７細胞において、各遺伝子導入の順序及び遺伝子発現細胞の選択過程を示す図である。

【図2b】ＡＲＨ７７細胞において、各遺伝子導入の順序及び遺伝子発現細胞の選択過程を示す図である。

【図3】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の増幅率を示す図である。

【図4】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の増幅率を示す図である。

【図5】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図6】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図7】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。

【図8】Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。

【図9】ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の増幅率を示す図である。

【図10】ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図11】ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。

【図12】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞の増幅率を示す図である。

【図13】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図14】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図15】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。

【図16】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図17】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図18】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図19】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図20】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図21】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図22】ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞のＮＫ細胞活性において重要な役割を果たす受容体発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図23】Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の増幅率を示す図である。

【図24】Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の純度を示す図である。

【図25】Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、添付図面を参照して、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の実施形態及び実施例について詳しく説明する。しかしながら、本願は、様々な形態で実施され得るので、以下に説明する実施形態及び実施例に限定されるものではない。

【0033】

本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」という場合、これは特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいことを意味する。

【0034】

本発明は、Ｂ７Ｈ６遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物及び増殖方法に関する。

【0035】

本発明は、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現するように形質転換されたフィーダー細胞を含むナチュラルキラー細胞増殖用組成物及び増殖方法に関する。

【0036】

本発明において、「Ｂ７Ｈ６」なる用語は、ナチュラルキラー細胞受容体ＮＫｐ３０のリガンドを意味する。

【0037】

本発明に係るＢ７Ｈ６遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなってもよく、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。

【0038】

本発明において、「ＣＤ１３７Ｌ」なる用語は、ＣＤ１３７のリガンドを意味する。

【0039】

本発明に係るＣＤ１３７Ｌ遺伝子は、配列番号２の塩基配列からなってもよく、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。

【0040】

本発明において、「ＩＬ－１５」なる用語は、インターロイキン－１５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５）であり、上皮細胞で産生されるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を意味する。

【0041】

本発明に係るＩＬ－１５遺伝子は、配列番号３の塩基配列からなってもよく、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。

【0042】

本発明において、「ＩＬ－１５Ｒα」なる用語は、インターロイキン１５受容体アルファ鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１５ｒｅｃｅｐｔｏｒ α－ｃｈａｉｎ）を指す。

【0043】

本発明に係るＩＬ－１５Ｒα遺伝子は、配列番号４の塩基配列からなってもよく、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列とそれぞれ７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。

【0044】

本発明に用いられる用語「フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓ；支持細胞）」は、分裂して増殖する能力はないが、代謝活性があるため、様々な代謝物質を産生して標的ＮＫ細胞の増殖を助ける細胞を意味する。本発明で用いてもよいフィーダー細胞としては、遺伝子が導入された動物細胞株（ｃｅｌｌｌｉｎｅ）や各種サイトカインまたは化合物で処理された末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）、自己または他人の末梢血白血球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞または多単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などがあり、好ましくは、遺伝子が導入された動物細胞株を用いてもよく、より好ましくは、ＡＲＨ７７細胞であってもよいが、それらに限定されるものではない。本発明が属する技術分野において通常使用可能であることが知られている他のフィーダー細胞も本発明の目的に合致する限り、制限なく使用することができる。

【0045】

本発明に用いられる「発現ベクター」なる用語は、適切な宿主細胞において標的タンパク質または標的ＲＮＡを発現することができるベクターであり、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子制作物を言う。

【0046】

本発明において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」なる用語は、一般的な機能を果たすように、核酸発現制御配列と、標的タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列とが機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｎｋａｇｅ）されていることを意味する。例えば、プロモーターと、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列とは機能的に連結され、コードする核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる。組換え発現ベクターとの作動的連結は、当技術分野において周知の遺伝子組み換え技術を用いて達成することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野において一般に知られている酵素などを用いる。

【0047】

本発明で使用可能な発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられるが、それらに限定されるものではなく、好ましくは、ウイルスベクターであってもよく、より好ましくは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）またはレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ベクターであってもよいが、それらに限定されるものではない。さらに、適切な発現ベクターとしては、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｃｏｄｏｎ）、終止コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などの発現制御配列に加えて、膜標的化または分泌のためのシグナル配列（ｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）など、目的に応じて様々に製造してもよい。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製が可能な発現ベクターである場合、複製起点を含む。

【0048】

本発明において、「末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）」なる用語は、血液中に存在する球状の核を有する細胞を意味し、そのような末梢血単核球には、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫｃｅｌｌ；ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌ）などの免疫細胞が含まれている。

【0049】

本発明の「ＩＬ－２（インターロイキン－２）」は、成熟したＮＫ細胞の増殖と活性化を促進する機能を有していることが報告されている。ＩＬ－２を欠くヒトとマウスでは、ＮＫ細胞の数が著しく減少するという報告があるが、一方では、ＩＬ－２及びＩＬ－２Ｒａの欠乏は、間接的にＮＫ細胞の数と活性化に影響を及ぼすという研究結果もあり、ＩＬ－２Ｒ鎖は、ＩＬ－１５受容体の形成に関与することが知られている。

【0050】

本発明の「ＩＬ－１５（インターロイキン－１５）」に関して、ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαを欠くマウスでは、ＮＫ細胞が認められないという事実と、ＩＬ－１５産生に必要な転写因子インターフェロン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ；ＩＦＮ）－調節因子１を欠くマウスでは、ＮＫ細胞が欠乏していることが判明された。よって、ＩＬ－１５がＮＫ細胞分化に関与することと、ＩＬ－１５は、ＮＫ細胞で発現されるＩＬ－１５受容体を介してＮＫ細胞の増殖と分化を直接的に促進することが知られている。

【0051】

本発明の「ＩＬ－２１（インターロイキン－２１）」は、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－３（ＳＴＡＴ－３）を刺激することによりＮＫ細胞のテロメア長（ｔｅｌｏｍｅｒｅｌｅｎｇｔｈ）を増加させ、ＮＫ細胞の活性、成長、増幅に重要な役割を果たすことが知られている。特に、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞において、ＩＬ－１５との組合せによってＮＫ細胞の成長を助けることが報告されており、膜結合型の（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ；ｍｂ）ＩＬ－２１を介してＮＫ細胞を増幅する際に、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮ－γ）の発現や細胞傷害性が増加することが確認された。さらに、培養液へのＩＬ－２１の継続した注入よりも、最初の１回だけ注入することがＮＫ細胞の増幅に有効であることが報告されている。

【0052】

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、下記の実施例は説明を目的とするものに過ぎず、本願発明の範囲を限定しようとする意図ではない。

【0053】

［製造例］
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞の産生
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαの遺伝子をクローニングし、次いで各遺伝子のｃＤＮＡをレンチウイルス発現ベクターであるｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ（Ｔａｋａｒａ社，日本）プラスミドにトランスファーすることで、レンチウイルスを産生した。

【0054】

図１に示すように、ＣＤ１３７Ｌ遺伝子、Ｂ７Ｈ６とＥＧＦＰ遺伝子、ＩＬ－１５とＲＦＰ－６４７遺伝子、及びＩＬ－１５ＲαとＢＦＰ遺伝子を、それぞれのｐＬＶＸ－ＥＦ１α－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏプラスミドマルチクローニング部位に挿入した。各遺伝子が導入されたレンチウイルスプラスミド（１０μｇ）をＬｅｎｔｉ－ＸＴＭＰａｃｋａｇｉｎｇＳｉｎｇｌｅｓｈｏｔｓ（Ｔａｋａｒａ社）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液中で４８～７２時間培養し、組換えレンチウイルスを産生した。

【0055】

フィーダー細胞に各遺伝子を形質導入するために、ＡＲＨ７７細胞とＫ５６２細胞をそれぞれ２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０^５個ずつ分注し、その後、各ウェルに組換えレンチウイルスをｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（８μｇ／ｍＬ）と共に加えた。温度２５℃、１，５００ｇで２時間遠心分離し、その後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下の培養器で４８時間培養した後、培養液を除去し、新鮮な培養液に（２ｍＬ／ウェル）交換しながら培養を維持し続けた。形質導入１週間後、全ての細胞をそれぞれ回収し、細胞分類装置であるＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）ＩＩＩを用いて蛍光陽性細胞のみを分離し、それらの細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培養液中で培養し続けた。

【0056】

前記と同様の方法で、ＡＲＨ７７細胞とＫ５６２細胞に各遺伝子を図２に示すような手順で導入し、選別過程を経てＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα及びＫ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα細胞を生産した。

【0057】

Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαの塩基配列を下記表１に示す。

【0058】

【表1】

【実施例1】

【0059】

Ｂ７Ｈ６またはＣＤ１３７Ｌ発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞活性の効果
１－１．ＮＫ細胞増幅率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎｒａｔｅ）の評価
Ｂ７Ｈ６またはＣＤ１３７Ｌの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を用いて、ＮＫ細胞の増幅率を評価した。

【0060】

密度勾配遠心分離法を用いて、健康な共血者の末梢血液からＰＢＭＣを分離してＰＢＳで２回洗浄し、その後、３×１０^６個のＰＢＭＣを１００Ｇｙでガンマ放射線照射した、それぞれのフィーダー細胞（Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６細胞またはＫ５６２－ＣＤ１３７Ｌ細胞）５×１０^５個と共に、２４ウェルプレートで２ｍＬ／ウェルの培養液で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下の培養器で共助培養した。

【0061】

培養液は、ＲＰＭＩ１６４０培養液に１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び４ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミンを添加して使用し、培養開始日から１週間は、培養液に１０Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン（ｒｈＩＬ）－２と５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－２１を添加し、培養１週間後からは、培養液に１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２と５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５を添加して２８日間培養した。培養液を１～２日ごとに新しい培養液に交換した。

【0062】

培養１４日、２１日及び２８日に培養した細胞を回収し、回収された細胞内のＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋細胞）の割合（純度）をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認し、回収された細胞のうち生きている細胞の総数にＮＫ細胞の割合を掛けて、総ＮＫ細胞数を計算した。同様の方法で、培養前ＰＢＭＣ内のＮＫ細胞の総数を計算し、培養１４日目、２１日目及び２８日目のそれぞれのＮＫ細胞総数を培養前のＮＫ細胞数で除して、ＮＫ細胞の増幅率を計算した。

【0063】

前記実験結果を下記表２及び３、並びに図３及び４に示す。

【0064】

【表2】

【0065】

【表3】

【0066】

表２及び図３に示すように、Ｋ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週培養後に２９１倍の増幅率を示したのに対し、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週培養後に１，３８３倍の増幅率を示した。

【0067】

また、表３及び図４に示すように、ＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞が得られたＮＫ細胞は、４週間培養後に３，３４４倍増幅率を示した。

【0068】

よって、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞は、Ｋ５６２細胞と比較して４倍以上の増幅率を示し、ＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞は、１１倍以上の増幅率を示しており、より優れたＮＫ細胞の増幅効果を有することが分かる。

【0069】

１－２．ＮＫ細胞の純度（ｐｕｒｉｔｙ）の評価
Ｂ７Ｈ６またはＣＤ１３７Ｌの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を用いて、ＮＫ細胞の純度を評価した。

【0070】

実施例１－１と同様の方法でＰＢＭＣを分離し、放射線照射された各フィーダー細胞と共助培養した。培養前のＰＢＭＣと培養後１４日、２１日及び２８日に回収した各細胞を、蛍光結合したヒトＣＤ３及びＣＤ５６モノクローナル抗体で染色し、その後、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞の純度を評価した。各細胞内のＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を、ＮＫ細胞の純度で評価した。

【0071】

前記実験結果を下記表４及び５、並びに図５及び６に示す。

【0072】

【表4】

【0073】

【表5】

【0074】

表４及び５、並びに図５及び６に示すように、Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、いずれも９０％以上の純度を示した。

【0075】

よって、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞は、いずれも高純度のＮＫ細胞を増殖させ得ることが分かる。

【0076】

１－３．ＮＫ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価
Ｂ７Ｈ６またはＣＤ１３７Ｌの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、Ｋ５６２細胞、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を用いて、増殖したＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性能を評価した。

【0077】

実施例１－１と同様の方法で増殖したＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する殺傷能力を、ＷＳＴ－８（Ｂｉｏｔｏｏｌ社，米国）を用いた高感度比色分析（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙ）で測定した。ＮＫ細胞の標的癌細胞であるＫ５６２細胞（１×１０^５個／１００μＬ培養液）を９６ウェルプレートに分注し、次いで、２．５×１０^４個の増殖したＮＫ細胞を入れて混合した後（ｅｆｆｅｃｔｏｒ：ｔａｒｇｅｔｒａｔｉｏ＝０．２５：１）１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、それを３７℃、５％ＣＯ_２条件下の培養器で培養した。培養３時間後、各ウェルに１０μＬ容量のＷＳＴ－８を加え、さらに１時間培養した後、４５０ｎｍ波長でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社，米国）を用いて吸光度（Ａ４５０）を測定し、以下の計算式を用いて、ＮＫ細胞により死滅した癌細胞の割合（％）を算出した。

【0078】

毒性（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、％）＝１００％－１００×［Ａ４５０ｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｔｒｅａｔｅｄｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓ－Ａ４５０ｏｆｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓ］／［Ａ４５０ｏｆｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓ－Ａ４５０ｏｆｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔＷＳＴ－８］

【0079】

前記実験結果を下記表６及び７、並びに図７及び８に示す。

【0080】

【表6】

【0081】

【表7】

【0082】

表６及び７、並びに図７及び８に示すように、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、Ｋ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞よりも高い細胞傷害性を示した。

【0083】

よって、Ｂ７Ｈ６発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６）細胞及びＣＤ１３７Ｌ発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－ＣＤ１３７Ｌ）細胞は、より高いレベルの細胞傷害性を示すＮＫ細胞を増殖させ得ることが分かる。

【実施例2】

【0084】

ＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞活性の効果
２－１．ＮＫ細胞増幅率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎｒａｔｅ）の評価
ＩＬ１５Ｒαの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いて、ＮＫ細胞の増幅率を評価した。

【0085】

実施例１－１と同様の方法で実験を行い、培養液にはＩＬ－２とＩＬ－１５のみを添加して培養し、３週間評価した。前記実験結果を下記表８及び図９に示す。

【0086】

【表8】

【0087】

表８及び図９に示すように、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞は、３週間培養後に２２２倍の増幅率を示したのに対し、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、３週間培養後に３８８倍の増幅率を示した。

【0088】

よって、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞は、ＡＲＨ７７細胞と比較して１．５倍以上の増幅率を示しており、より優れたＮＫ細胞の増幅効果を有することが分かる。

【0089】

２－２．ＮＫ細胞の純度（ｐｕｒｉｔｙ）の評価
ＩＬ１５Ｒαの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いて、ＮＫ細胞の純度を評価した。

【0090】

実施例１－２と同様の方法で実験を行い、３週間評価した。前記実験結果を下記表９及び図１０に示す。

【0091】

【表9】

【0092】

表９及び図１０に示すように、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞は、５９～７０％の純度を示したのに対し、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞はｍ６３～７９％とより高い純度を示した。

【0093】

よって、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、より高い純度を有し、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞は、より高い純度のＮＫ細胞を増殖させ得ることが分かる。

【0094】

２－３．ＮＫ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価
ＩＬ１５Ｒαの発現によるＮＫ細胞活性の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いて、増殖したＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性能を評価した。

【0095】

実施例１－３と同様の方法で実験を行い、３週間評価した。前記実験結果を下記表１０及び図１１に示す。

【0096】

【表10】

【0097】

表１０及び図１１に示すように、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞よりも高い細胞傷害性を示した。

【0098】

よって、ＩＬ１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－ＩＬ１５Ｒα）細胞は、より高いレベルの細胞傷害性を示すＮＫ細胞を増殖させ得ることが分かる。

【実施例3】

【0099】

ＡＲＨ７７細胞のＮＫ細胞刺激の効果
３－１．ＮＫ細胞増幅率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎｒａｔｅ）の評価
ＡＲＨ７７細胞のＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いてＮＫ細胞の増幅率を評価した。

【0100】

実施例１－１と同様の方法でＰＢＭＣを分離し、放射線照射されたＡＲＨ７７細胞またはＫ５６２細胞と共助培養した。培養前のＰＢＭＣと培養後１４日、２１日及び２８日に回収した各細胞を、蛍光結合したヒトＣＤ３及びＣＤ５６モノクローナル抗体で染色し、その後、フローサイトメトリーによりＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞）の純度を評価した。回収された細胞のうち生きた細胞の総数にＮＫ細胞の割合を乗じて、総ＮＫ細胞数を計算した。同様の方法で、培養前ＰＢＭＣ内のＮＫ細胞の総数を計算し、培養１４日目、２１日目及び２８日目のそれぞれのＮＫ細胞総数を培養前のＮＫ細胞数で除して、ＮＫ細胞の増幅率を計算した。

【0101】

前記実験結果を下記表１１及び図１２に示す。

【0102】

【表11】

【0103】

表１１及び図１２に示すように、Ｋ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週間培養後に６２７倍の増幅率を示したのに対し、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週間培養後に１３７６倍の増幅率を示した。

【0104】

よって、ＡＲＨ７７細胞は、２倍以上優れたＮＫ細胞の増幅効果を有することが分かる。

【0105】

３－２．ＮＫ細胞の純度（ｐｕｒｉｔｙ）の評価
ＡＲＨ７７細胞のＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて、得られたＮＫ細胞の純度を評価した。

【0106】

実施例１－２と同様の方法で、フローサイトメトリーにより細胞内ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を測定して純度を評価した。実験結果を下記表１２、並びに図１３及び１４に示す。

【0107】

【表12】

【0108】

表１２、並びに図１３及び１４に示すように、Ｋ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４６．１～６８．７％の純度を示したのに対し、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞は、６９．０～８３．１％のより高い純度を示した。

【0109】

よって、ＡＲＨ７７細胞を介して得られたＮＫ細胞が、より高い純度を有することが分かる。

【0110】

３－３．ＮＫ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価
ＡＲＨ７７細胞のＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて、得られたＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。

【0111】

実施例１－３と同様の方法で、ＡＲＨ７７細胞またはＫ５６２細胞を用いて得られたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性能を測定した。実験結果を下記表１３及び図１５に示す。

【0112】

【表13】

【0113】

表１３及び図１５に示すように、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を介して得られたＮＫ細胞の細胞傷害性は、有意であることが確認された。

【0114】

よって、ＡＲＨ７７細胞は、Ｋ５６２細胞と同様のレベルの細胞傷害性を示すＮＫ細胞を増殖させ得ることが分かる。

【0115】

３－４．ＮＫ細胞発現形質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の評価
ＡＲＨ７７細胞のＮＫ細胞刺激効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて得られたＮＫ細胞の受容体発現（ｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を評価した。その結果を下記表１４～２０、及び図１６～２２に示す。

【0116】

【表14】

【0117】

【表15】

【0118】

【表16】

【0119】

【表17】

【0120】

【表18】

【0121】

【表19】

【0122】

【表20】

【0123】

表１４～２０、及び図１６～２２に示すように、ＡＲＨ７７細胞は、ＣＤ１５８ｂを除く全ての測定値においてＫ５６２細胞よりさらに高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、ＮＫ細胞の機能を抑制するＣＤ１５８ｂでは、さらに低い平均蛍光強度を示した。よって、ＡＲＨ７７細胞は、Ｋ５６２細胞よりもＮＫ細胞活性に重要な受容体をより良好に発現することが確認された。

【0124】

そこから、Ｋ５６２細胞と比較して、ＡＲＨ７７細胞がフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）としてより優れたＮＫ細胞刺激効果を有することが分かる。

【実施例4】

【0125】

Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞のＮＫ細胞刺激の効果
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５－及びＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いてそれぞれの遺伝子を発現させ、下記実験を行った。

【0126】

４－１．ＮＫ細胞増幅率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎｒａｔｅ）の評価
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、前記遺伝子を発現させたＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて、ＮＫ細胞の増幅率を評価した。

【0127】

実施例１－１と同様の方法でＰＢＭＣを分離し、放射線照射された各フィーダー細胞と共助培養した。培養前のＰＢＭＣと培養後１４日、２１日及び２８日に回収した細胞において、フローサイトメトリーによってＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞）の純度を評価し、その後、前記と同様の方法でＮＫ細胞の増幅率を計算した。

【0128】

前記実験結果を下記表２１に示す。

【0129】

【表21】

【0130】

表２１に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞は、３週目に最も優れたＮＫ細胞の増幅率を示すことが確認された。

【0131】

４－２．ＮＫ細胞の純度（ｐｕｒｉｔｙ）の評価
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、前記遺伝子を発現させたＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて、ＮＫ細胞の純度を評価した。

【0132】

実施例１－２と同様の方法で、フローサイトメトリーにより細胞内ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を測定して純度を評価した。実験結果を下記表２２に示す。

【0133】

【表22】

【0134】

表２２に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、及びＩＬ－１５発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、並びにＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週目までに約９０％以上の純度を示すことが確認された。

【0135】

４－３．ＮＫ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価
Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα発現フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、前記遺伝子を発現させたＡＲＨ７７細胞及びＫ５６２細胞を用いて、増殖したＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性を評価した。

【0136】

実施例１－３と同様の方法で、各遺伝子発現フィーダー細胞を用いて増殖したＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性能を測定した。実験結果を下記表２３に示す。

【0137】

【表23】

【0138】

表２３に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、４週目まで毒性が維持されるが、残りの細胞を用いたＮＫ細胞は、毒性が低下することが確認された。

【0139】

よって、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞が、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）として優れたＮＫ細胞刺激の効果を有することが分かる。

【実施例5】

【0140】

ＮＫ細胞最適化培地におけるフィーダー細胞のＮＫ細胞刺激の効果
実施例３において、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）としてＮＫ細胞刺激に優れた効果を有するＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いて、以下の実験を行った。

【0141】

５－１．ＮＫ細胞増幅率（ｅｘｐａｎｓｉｏｎｒａｔｅ）の評価
前記３つの遺伝子組み換えフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）を用いたＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＮＫ細胞に最適化された培地を用いて、ＮＫ細胞の増幅率を評価した。

【0142】

実施例１－１と同様の方法でＰＢＭＣを分離し、放射線照射された各フィーダー細胞と共助培養した。培養液は、ＤＭＥＭ培養液に３０％のＨＡＭ’ＳＦ１２、１０％のヒト血清（ＨＳ）、１０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１ｘＧｌｕｔａｍａｘ、１０μＭのβ－メルカプトエタノール、５０μＭのエタノールアミン、２０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸及び５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムを添加して使用し、培養開始日から１週間は、培養液に１０Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン（ｒｈＩＬ）－２と５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－２１を添加し、培養１週間後からは、培養液に１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２と５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１５を添加して２８日間培養した。

【0143】

培養液を１～２日ごとに新しい培養液に交換した。培養１４日、２１日及び２８日に培養した細胞を回収し、回収された細胞内のＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋細胞）の割合（純度）をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で確認し、回収された細胞のうち生きている細胞の総数にＮＫ細胞の割合を掛けて、総ＮＫ細胞数を計算した。

【0144】

同様の方法で、培養前ＰＢＭＣ内のＮＫ細胞の総数を計算し、培養１４日目、２１日目及び２８日目のそれぞれのＮＫ細胞総数を培養前のＮＫ細胞数で除して、ＮＫ細胞の増幅率を計算した。

【0145】

前記実験結果を下記表２４及び図２３に示す。

【0146】

【表24】

【0147】

表２４及び図２３に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞は、ＮＫ細胞増幅に最も優れた効果を有することが確認された。

【0148】

具体的には、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いたＮＫ細胞は、４週間培養後のＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を用いたＮＫ細胞と比較して、増幅率が約３．５倍高いことが確認された。

【0149】

５－２．ＮＫ細胞の純度（ｐｕｒｉｔｙ）の評価
実施例４－１の３つの遺伝子組み換えフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＮＫ細胞に最適化された培地を用いて、ＮＫ細胞の純度を評価した。

【0150】

実施例１－２と同様の方法で、フローサイトメトリーにより細胞内ＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の割合を測定して純度を評価した。実験結果を下記表２５及び図２４に示す。

【0151】

【表25】

【0152】

表２５及び図２４に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、いずれも４週まで約８５％以上の純度を維持することが確認された。特に、ＡＲＨ７７細胞を用いたＮＫ細胞の純度が、より優れていることを確認した。

【0153】

５－３．ＮＫ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の評価
前記３つの遺伝子組み換えフィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）によるＮＫ細胞刺激の効果を確認するために、ＮＫ細胞に最適化された培地を用いて、ＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。

【0154】

実施例１－３と同様の方法で、各遺伝子発現フィーダー細胞を用いて増殖したＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞傷害性を測定した。実験結果を下記表２６及び図２５に示す。

【0155】

【表26】

【0156】

表２６及び図２５に示すように、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ及びＩＬ－１５発現ＡＲＨ－７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５）細胞、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞、及びＢ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現Ｋ５６２（Ｋ５６２－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞を介して得られたＮＫ細胞は、いずれも優れた細胞傷害性を示すことが確認された。

【0157】

結局、前記の実験結果から、Ｂ７Ｈ６、ＣＤ１３７Ｌ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα発現ＡＲＨ７７（ＡＲＨ７７－Ｂ７Ｈ６－ＣＤ１３７Ｌ－ＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒα）細胞が、フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌ）として最も優れたＮＫ細胞刺激の効果を有することが分かる。

【図1】