▶ エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】再集合体ロタウイルスの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/00 20060101AFI20240514BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240514BHJP
C12N 15/46 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
C12N7/00 ZNA
C12N15/113 100Z
C12N15/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573626
(86)(22)【出願日】2022-03-25
(85)【翻訳文提出日】2023-12-13
(86)【国際出願番号】 KR2022004185
(87)【国際公開番号】W WO2022255607
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】10-2021-0070036
(32)【優先日】2021-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519038714
【氏名又は名称】エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョン－ウン
(72)【発明者】
【氏名】クォン，テウ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
(57)【要約】
再集合体ロタウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を製造する方法に関するものであって、再集合体ロタウイルスに対する選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）として抑制性ＲＮＡを用いた逆遺伝学プラットホームが提供され, 前記方法によって再集合の確率が飛躍的に高め、短時間と低費用で所望の再集合体ロタウイルスを製造することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルスを回収するステップと、を含む、
再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルスを製造する方法。
【請求項2】
第１ロタウイルスが、非人間ロタウイルス、牛（ｂｏｖｉｎｅ）ロタウイルス、猿（ｓｉｍｉａｎ）ロタウイルス、豚（ｐｏｒｃｉｎｃｅ）ロタウイルス、犬（ｃａｎｉｎｅ）ロタウイルスまたは黒ヤギ（ｇｏａｔ）ロタウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第１ロタウイルスが、ＷＣ３ロタウイルス株（ｓｔｒａｉｎ）またはその子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
第２ロタウイルスが、人間ロタウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
第２ロタウイルスが、Ｐ１、Ｐ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４またはＧ９人間ロタウイルス血清型である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
第２ロタウイルスが、ＷＩ７９、Ｗａ、Ｄ、ＷＩＳＣ２、ＤＳ－１、ＷＩ７８、Ｐ、ＨＣＲ３Ａ、Ｂｒ（Ｂｒｉｃｏｕｔ）Ｂ、ＳＴ－３、ＢｒＢ－９、ＷＩ７９－９、ＳＣ２－９、またはＷＩ７８－８ロタウイルス株（ｓｔｒａｉｎ）またはその子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記特定遺伝子分節が、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびＮＳＰ５の中から選択される蛋白質をコーディングする遺伝子分節である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記特定遺伝子分節が、ＶＰ７またはＶＰ４をコーディングする遺伝子分節である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記抑制性ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記抑制性ＲＮＡが、配列番号３、配列番号４および配列番号５の標的部位からなる群より選択されるいずれか一つ以上を標的とするものである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記抑制性ＲＮＡが、ｍｉＲＮＡであり、前記細胞株は、前記ｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むベクターが導入されたものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された一つ以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ベクターは、標的部位が互いに異なる２種以上のｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする２種以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む同時発現ベクターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡが、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップ以降、継代培養を通じて前記再集合体ロタウイルスを濃化させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞株が、ＭＲＣ－５、ＭＡ－１０４、ベロ（Ｖｅｒｏ）、ＢＨＫ－２１、ＣＯＳ－７、２９３Ｔ、ＣＶ－１またはＴＦ－１０４細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
牛（ｂｏｖｉｎｅ）のＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節に対するｍｉＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株をＷＣ３ロタウイルスに感染させるステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含むものである、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
請求項１に記載の再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルスを製造する方法に用いるための、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるいずれか一つ以上の標的部位を抑制する、抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
【請求項19】
請求項１に記載の再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルスを製造する方法に用いるための、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願（等）との相互引用
本出願は、２０２１年５月３１日付の韓国特許出願第１０－２０２１－００７００３６号に基づいた優先権の利益を主張して、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０２１年５月３１日付の韓国特許出願第１０－２０２１－００７００３６号に基づいた優先権の利益を主張して、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
再集合体ロタウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を製造する方法に関するものであって、再集合体ロタウイルスに対する選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）として抑制性ＲＮＡを用いた逆遺伝学プラットホームが提供される。
【背景技術】
【0003】
ロタウイルスは、全世界的に乳幼児および小児で胃腸炎を誘発する最もありふれた原因で、毎年、全世界的に５才以下で約１億人がロタウイルス胃腸炎を病んで約６０万人が死亡する。死亡は主に開発途上国で発生するが、開発途上国や先進国での有病率は同様である。したがって、ロタウイルス胃腸炎を予防してロタウイルス感染による死亡率を下げるためにはワクチン開発が何よりも重要である。
【0004】
ロタウイルスは、１１本のｄｓＲＮＡ分節（ｓｅｇｍｅｎｔ）から構成された遺伝体を有しているので、ある細胞に様々なウイルス株（ｓｔｒａｉｎ）が同時感染する場合、互いに異なる株のＲＮＡ分節が入り混じった再集合体ウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ）が生成されることがある。例えば、人には病毒性がない牛（ｂｏｖｉｎｅ）ロタウイルスのＲＮＡ分節と、人にロタウイルス胃腸炎を誘発する人間ロタウイルスのＲＮＡ分節とが混ざった再集合体ウイルスが生成されることがある。このような牛－人間（ｂｏｖｉｎｅ－ｈｕｍａｎ）再集合体ウイルスのうち、人に対する病毒性を示すＶＰ４をコーディングする分節は、牛（ｂｏｖｉｎｅ）ロタウイルスのＲＮＡ分節であり、中和エピトープを多く含むＶＰ７をコーディングする分節は、人間ロタウイルスのＲＮＡ分節からなる再集合体ウイルスの場合、人に病毒性がないため胃腸炎を誘発することはないが、人間ロタウイルスに対する中和抗体の形成を誘導することができ、人間ロタウイルスに対するワクチンとして用いることができる。その例が、牛と人間で分離されたロタウイルスを再集合して弱毒化した５価ワクチンであるロタテック（Ｒｏｔａｔｅｑ（登録商標））である。
【0005】
再集合体ウイルスを製造する一般的な方法は、一つの細胞株に二種類のロタウイルスを同時感染させて再集合体ウイルスを得ることであるが、逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｓ）方法を適用して再集合が起こる確率をより高めることができる。逆遺伝学方法は、再集合させようとする遺伝子のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに転写可能なＤＮＡを細胞に過量注入すると共に、ヘルパーロタウイルス（ｈｅｌｐｅｒ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を細胞に感染させ、注入されたｍＲＮＡとヘルパーロタウイルスの遺伝子が再集合するように誘導する方法である。
【0006】
しかし、逆遺伝学を用いて再集合が起こる確率を高めても、再集合体ウイルスは、野生型（ＷＴ）ウイルスに比べて非常に数が少なく弱毒化しており、選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を加えなければ継代が進行するほどますます比率が減少することになって、所望の再集合体ウイルスを分離して救済（ｒｅｓｃｕｅ）することが非常に難しい。したがって、成功的な再集合体ロタウイルスを得るためには適切な選別（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程が必須的に導入されなければならない。
【0007】
現在、選別過程に用いられる方法は、交替させる遺伝子（例えば、牛ロタウイルスのＶＰ７遺伝子）の蛋白質には特異的に結合して中和させるが、交替された遺伝子（例えば、人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子）の蛋白質には結合しない単クローン中和抗体を用いる方法である（例えば、米国特許４，５７１，３８５号）。しかし、前記単クローン中和抗体を用いる方法は、中和抗体の確保に多くの時間と費用が要求され、ロタウイルス菌株は、互いに配列、機能および構造が類似する遺伝子で構成されるので、特定菌株の蛋白質にだけ特異的な中和抗体を確保し難いという問題があって、選択圧を加えられる別途の技術に対する研究開発が必要な実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、再集合体ロタウイルスを製造する方法に関するものであって、再集合体ロタウイルスに対する選択圧として抑制性ＲＮＡを用いた逆遺伝学プラットホームを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
一例としては、第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、
再集合体ロタウイルスを製造する方法を提供する。
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、
再集合体ロタウイルスを製造する方法を提供する。
【0010】
他の例としては、前述した再集合体ロタウイルスを製造する方法に用いるための、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるいずれか一つ以上の標的部位を抑制する抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。
【0011】
他の例として、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるいずれか一つ以上の標的部位を抑制する抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、前述した再集合体ロタウイルスを製造する方法に用いるための組成物を提供する。
【0012】
他の例としては、前述した再集合体ロタウイルスを製造する方法に用いるための、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供する。
【0013】
他の例として、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、前述した再集合体ロタウイルスを製造する方法に用いるための組成物を提供する。
【0014】
他の例として、前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株製造用組成物を提供する。
【0015】
他の例として、前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株製造用組成物が提供される。
【0016】
他の例として、前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株を提供する。
【0017】
他の例として、前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株が提供される。
【発明の効果】
【0018】
本発明に係るロタウイルス再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）方法は、逆遺伝学方法を用いるので、一つの細胞株に二種類のロタウイルスを同時感染させて再集合体ウイルスを得る古典的な方法に比べて、再集合の確率が飛躍的に高いため、所要時間を非常に短縮できると期待される。また、再集合体ウイルスを選別（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）するとき、単クローン中和抗体を用いないため、単クローン中和抗体を確保するのにかかる費用と時間を減らすことができる。したがって、本発明を用いて既存の方法に比べて短時間と低費用で所望の再集合体ロタウイルスを製造することができ、これをワクチンとして活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1a】図１ａないし図１ｃは、ＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号１）とＢｒｂ９ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号２）の核酸配列の整列結果を示す。灰色の陰影は二つの遺伝子の核酸が異なる部位を示し、下線と太字は本願の一実施例によって選択した標的部位３ヶ所を示す。
【図1b】図１ａないし図１ｃは、ＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号１）とＢｒｂ９ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号２）の核酸配列の整列結果を示す。灰色の陰影は二つの遺伝子の核酸が異なる部位を示し、下線と太字は本願の一実施例によって選択した標的部位３ヶ所を示す。
【図1c】図１ａないし図１ｃは、ＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号１）とＢｒｂ９ロタウイルスのＶＰ７遺伝子（配列番号２）の核酸配列の整列結果を示す。灰色の陰影は二つの遺伝子の核酸が異なる部位を示し、下線と太字は本願の一実施例によって選択した標的部位３ヶ所を示す。
【図2】図２は、本願の一実施例に係る、ＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子から選別されたｍｉＲＮＡ標的部位の配列、前記標的部位に結合（混成化）可能なｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングするＤＮＡ配列を含む上部鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）とその相補体である下部鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）、および前記二本鎖が４ｎｔオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有するように結合させて形成されたｄｓＤＮＡオリゴを示す。
【図6】図６は、本願の一実施例に係るＰ１（Ｐａｓｓａｇｅ １）をプラーク分離（ｐｌａｑｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）により分離した１０本のクローンの再集合の確認のためのＲＴ－ＰＣＲ結果である。Ｌａｎｅ １ないし１０は各単一クローンを示し、ＷはＷＣ３ウイルスＲＮＡ（ＰＣＲ陰性対照群）を示し、ＧはＧ４ウイルスＲＮＡを示し（ＰＣＲ陽性対照群）、Ｍは１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒを示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の一側面により、第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、
再集合体ロタウイルスを製造する方法が提供される。
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、
再集合体ロタウイルスを製造する方法が提供される。
【0021】
一具現例として、第１ロタウイルスは、非人間ロタウイルスであってもよく、例えば、牛（ｂｏｖｉｎｅ）ロタウイルス、猿（ｓｉｍｉａｎ）ロタウイルス、豚（ｐｏｒｃｉｎｃｅ）ロタウイルス、犬（ｃａｎｉｎｅ）ロタウイルスまたは黒ヤギ（ｇｏａｔ）ロタウイルスであってもよい。好ましい例として、牛（ｂｏｖｉｎｅ）のＷＣ３ロタウイルス株（ｓｔｒａｉｎ）またはその子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）であってもよい。
【0022】
一具現例として、第２ロタウイルスは、人間（ｈｕｍａｎ）ロタウイルスであってもよく、例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４またはＧ９人間ロタウイルス血清型であってもよい。また、第２ロタウイルスは、ＷＩ７９、Ｗａ、Ｄ、ＷＩＳＣ２、ＤＳ－１、ＷＩ７８、Ｐ、ＨＣＲ３Ａ、Ｂｒ（Ｂｒｉｃｏｕｔ）Ｂ、ＳＴ－３、ＢｒＢ－９、ＷＩ７９－９、ＳＣ２－９、またはＷＩ７８－８ロタウイルス株またはその子孫であってもよい。
【0023】
一具現例として、前記特定遺伝子分節は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびＮＳＰ５の中から選択される蛋白質をコーディングする遺伝子分節であってもよく、好ましい例として、ＶＰ７またはＶＰ４をコーディングする遺伝子分節であってもよい。
【0024】
一具現例として、抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。
【0025】
一具現例として、抑制性ＲＮＡは、発現を抑制しようとする前記特定遺伝子分節の互いに異なる標的部位を標的とする２以上の抑制性ＲＮＡであってもよく、前記２以上の抑制性ＲＮＡは、それぞれのベクターに含まれるか一つのベクター内に含まれて細胞株に導入されてもよい。
【0026】
一具現例として、抑制性ＲＮＡは、配列番号３、配列番号４および配列番号５の標的部位からなる群より選択される一つ以上を標的とすることができる。
【0027】
一具現例として、抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡであり、前記細胞株は、前記ｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むベクターが導入されたものであってもよい。
【0028】
一具現例として、前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択される一つ以上の配列対で形成された一つ以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0029】
一具現例として、前記ベクターは、恒常性プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含んでもよい。
【0030】
一具現例として、前記ベクターは、標的部位が異なる２種以上のｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする２種以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む同時発現ベクターであってもよい。
【0031】
一具現例として、前記第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡは、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって得られたものであってもよい。
【0032】
一具現例として、前記再集合体ロタウイルスの製造方法は、細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップ以降、継代培養を通じて前記再集合体ロタウイルスを選別するステップをさらに含んでもよい。
【0033】
一具現例として、前記細胞株は、ＭＲＣ－５、ＭＡ－１０４、ベロ（Ｖｅｒｏ）、ＢＨＫ－２１、ＣＯＳ－７、２９３Ｔ、ＣＶ－１またはＴＦ－１０４細胞株であってもよい。
【0034】
一具現例として、前記再集合体ロタウイルスの製造方法は、牛（ｂｏｖｉｎｅ）のＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節に対するｍｉＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株をＷＣ３ロタウイルスに感染させるステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む方法であってもよい。
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株をＷＣ３ロタウイルスに感染させるステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む方法であってもよい。
【0035】
本発明の他の側面により、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるいずれか一つ以上の標的部位を抑制する抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドが提供される。
【0036】
一具現例として、前記抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。
【0037】
他の具現例として、前記抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡであってもよい。
【0038】
本発明の他の側面により、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが提供される。
【0039】
一具現例として、前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、前述した再集合体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）ロタウイルスを製造する方法に用いるためのものである。
【0040】
本発明のまた別の側面により、前述した抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株製造用組成物が提供される。
【0041】
また、前述した抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株製造用組成物が提供される。
【0042】
本発明のまた別の側面により、前述した抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株が提供される。
【0043】
また、前述した抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株が提供される。
【0044】
以下、本発明をより詳しく説明する。
本願に記載されたものと類似するか同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を説明する。
本願に記載されたものと類似するか同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を説明する。
【0045】
異に定義されない限り、本願で使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。また、本願に使用される用語および関する定義は、単に説明を目的として用いられ、制限しようとするものではないことが理解されるべきである。
【0046】
本願に使用される単数形態は、文法的対象中の一つまたは一つ以上（つまり、少なくとも一つ）を称すために本願で使用される。例えば、「要素」は一つの要素または一つ以上の要素を意味する。
【0047】
本願に使用された「約」は、一般的に与えられた値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、さらに好ましくは５％以内を意味する。
【0048】
本明細書に記載された、「（所定の成分を）含む」とは、記載された成分以外の成分を包含可能なこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、または記載された成分を必須的に含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）ことを意味する。
【0049】
本願の一例としては、ロタウイルスの特定遺伝子に対する抑制性ＲＮＡを常時発現する細胞株を用いた逆遺伝学方法によって、目的とする再集合体ロタウイルスを製造する方法を提供する。
【0050】
逆遺伝学方法は、再集合させようとする遺伝子のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに転写可能なＤＮＡを細胞に過量注入すると共に、ヘルパーロタウイルス（ｈｅｌｐｅｒ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）を細胞に感染させ、注入されたｍＲＮＡとヘルパーロタウイルスの遺伝子が再集合するように誘導する方法である。後述する本願の一実施例では、ヘルパーウイルスとして、牛のＷＣ３ロタウイルス株を用い、再集合させるために注入する遺伝子は人間Ｇ４ロタウイルス株であるＢｒＢ９（Ｂｒｉｃｏｕｔ Ｂ ９）のＲＮＡ分節９番であるＶＰ７を用いており、前記ヘルパーウイルスと注入遺伝子との再集合結果物として、ＷＣ３／Ｂｒｂ９－ＶＰ７再集合体ウイルスを製造した例を示すが、これは、本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【0051】
本願で、ロタウイルスの特定遺伝子に対する抑制性ＲＮＡを常時発現する細胞株は、目的の再集合体ロタウイルスを選別して分離するための選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を提供する。特に、従来の単クローン中和抗体を用いて選択圧を加える方法は、中和抗体の確保に多くの時間と費用が要求され、ロタウイルス菌株は、互いに配列、機能および構造が類似する遺伝子で構成されるので、特定菌株の蛋白質のみに特異的な中和抗体を確保し難いという問題があるが、本発明は、抑制性ＲＮＡの標的配列が短く（約２１ｂｐ）、類似の菌株の遺伝子間でも互いに異なる部分を容易に見つけることができ、選択圧を加えることが容易であり、いくつかの標的部位を用いる場合、より強い選択圧を加えることができ、ロタウイルスの特定遺伝子に対する抑制性ＲＮＡを常時発現する細胞株を容易に製作できるというメリットがある。
【0052】
好ましい一具現例として、本願の再集合体ロタウイルス製造方法は、以下のステップを含む。
第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルス由来の遺伝子分節のｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップ。
第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルス由来の遺伝子分節のｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップと、
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップ。
【0053】
一例として、前記特定遺伝子が１種の遺伝子の場合、このように製造された再集合体ロタウイルスは、１１本の遺伝子分節中の前記特定遺伝子分節に対応する遺伝子分節は第２ロタウイルス由来のものであり、その他の残りの１０本の遺伝子分節は第１ロタウイルス由来のものから構成される。
【0054】
他の例として、特定遺伝子がｎ種の遺伝子の場合、このように製造された再集合体ロタウイルスは、１１本の遺伝子分節中の前記ｎ種の特定遺伝子分節に対応する遺伝子分節は第２ロタウイルス由来のものであり、その他の残り（１１－ｎ本）の遺伝子分節は第１ロタウイルス由来のものから構成される。
【0055】
ロタウイルスは、一般的に１１本の遺伝子分節、つまり構造蛋白質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、ＶＰ６、およびＶＰ７をそれぞれコーディングする６本の遺伝子分節と、非構造蛋白質ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、およびＮＳＰ５をそれぞれコーディングする５本の遺伝子分節で構成される。この中で、ＶＰ７とＶＰ４は、表面に存在する構造蛋白質であって、ウイルスの血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を決め、特にＶＰ７はＧ血清型を決め、ＶＰ４はＰ血清型を決める。したがって、ロタウイルスの血清型はＧ型とＰ型を共に表記し、Ｇ型は、血清型と遺伝型とが同一であるので、血清型を数字で表記し（例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３）、Ｐ型は、血清型と遺伝型とが同一でないため、血清型は数字で表記し、遺伝子型は［］中に数字で表記するか（例えば、Ｐ１Ａ［８］、Ｐ１Ｂ［４］）または遺伝型だけを単独で表記することもある（例えば、Ｐ［８］、Ｐ［４］）。
【0056】
一具体例として、第１ロタウイルスは、非人間ロタウイルスであり、第２ロタウイルスは、人間ロタウイルスであってもよい。これは、非人間ロタウイルスが人間で減少した毒性を示すことがあるというアイディアに基づいたものである。しかし、本発明がこれに制限されることはなく、第１ロタウイルスおよび第２ロタウイルスの両方が非人間ロタウイルスであるか、いずれも人間ロタウイルスであってもよい。
【0057】
好ましい一具体例として、第１ロタウイルスは、非人間ロタウイルス、例えば、牛（ｂｏｖｉｎｅ）、猿（ｓｉｍｉａｎ）ロタウイルス、豚（ｐｏｒｃｉｎｃｅ）ロタウイルス、犬（ｃａｎｉｎｅ）ロタウイルスまたは黒ヤギ（ｇｏａｔ）ロタウイルスであってもよい。牛ロタウイルスの例としては、ロタウイルス株ＮＣＤＶ、ＷＣ３またはＵＫなどが挙げられ、猿ロタウイルスの例としては、リーサス（ｒｈｅｓｕｓ）猿ロタウイルス（ＲＲＶ）株ＴＵＣＨ、ＭＭＵ １８００６またはＭＭＵ１７９５９、ベルベット猿（ｖｅｒｖｅｔ ｍｏｎｋｅｙ）ロタウイルス株ＳＡ１１、または豚尾猿（ｐｉｇ－ｔａｉｌｅｄ ｍａｃａｑｕｅ）ロタウイルス株ＰＴＲＶ（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）またはＹＫ－１（ｍａｃａｑｕｅｓ）などが挙げられるが、これに制限されない。
【0058】
好ましい他の具体例として、第２ロタウイルスは、人間ロタウイルスであってもよく、これらは任意のＰ血清型またはＧ血清型を有してもよいが、好ましくは、病気を主に起こす血清型であるＰ１、Ｐ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４またはＧ９血清型であってもよい。Ｇ１血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＷＩ７９、Ｗａ、Ｄなどが挙げられ、Ｇ２血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＷＩＳＣ２またはＤＳ－１などが挙げられ、Ｇ３血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＷＩ７８、ＰまたはＨＣＲ３Ａなどが挙げられ、Ｇ４血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株Ｂｒ（Ｂｒｉｃｏｕｔ）ＢまたはＳＴ－３などが挙げられ、Ｇ９血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＷＩ６１などが挙げられ、Ｐ１血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＷＩ７９、ＷＩ７８、ＷＩ６１またはＷａなどが挙げられ、Ｐ２血清型の人間ロタウイルスとしては、ロタウイルス株ＤＳ－１などが挙げられるが、これに制限されない。
【0059】
代案として、第１ロタウイルスまたは第２ロタウイルス、または両方は、従来の公知された再集合体ウイルスであってもよく、例えば、ＢｒＢ－９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ５６５０９３）、ＷＩ７９－９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ５６５０６０）、ＳＣ２－９（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ５６５０７１）、ＷＩ７８－８（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ５６５０８２）、またはＷＩ７９－４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ５６５０４９）であってもよいが、これに制限されない。
【0060】
本願で、抑制性ＲＮＡは、標的遺伝子の発現を配列特異的に抑制ないし減少可能な核酸分子をいう。抑制性ＲＮＡは、標的遺伝子またはそのｍＲＮＡに結合（混成化）して転写および／または発現を抑制ないし減少させるために、標的遺伝子またはそのｍＲＮＡに十分相補的であってもよい。抑制性ＲＮＡは、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を通じて標的遺伝子の転写および／または発現を抑制ないし減少させる。好ましい具体例として、抑制性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）であってもよい。
【0061】
ＲＮＡｉとは、短い長さ（通常、１２～２１ｍｅｒ）の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的に遺伝子発現が抑制される現象をいう。これらのｄｓＲＮＡは、これと相補的な標的ｍＲＮＡを選択的に分解することによって標的遺伝子の転写および／または蛋白質合成を中断させることができる。したがって、ＲＮＡｉは、所望の遺伝子を沈黙（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）させるために幅広く用いられる。ＲＮＡｉを起こす代表的な小さい（ｓｍａｌｌ）ＲＮＡであるｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ－特異的なエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＲＮａｓｅ ＩＩＩグループに属するダイサー（ｄｉｃｅｒ）酵素がｄｓＲＮＡ前駆体を切り出す過程で生成される。
【0062】
ｓｉＲＮＡは、約２１個のヌクレオチドで構成されたｄｓＲＮＡであって、約１９個の塩基対と３'側に存在する２個のヌクレオチド突出部位（ｏｖｅｒｈａｎｇ）で構成される。この３'突出部位は、ＲＮＡｉ過程で中間媒介体として機能する。ｓｉＲＮＡは、トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、ウイルスまたは生体内の遺伝子から長さが長いｄｓＲＮＡが作られるか、外部で人為的にｄｓＲＮＡを細胞内に注入した時に生成される。以降、ｓｉＲＮＡは、単一鎖に分離され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に含まれることになり、ＲＩＳＣに統合された以後、標的ｍＲＮＡに相補的な対を成すが、標的ｍＲＮＡとの相補性程度によってｍＲＮＡを切断および分解するか、ｍＲＮＡ翻訳を抑制することになる。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉは、試験管内で標的塩基配列に対するｄｓＲＮＡを直接細胞に核酸伝達感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させることによって、特定核酸配列による遺伝子発現抑制効果を示すことができる。
【0063】
ｓｈＲＮＡを用いたＲＮＡｉの場合、合成ｄｓＲＮＡを直接注入する代わりに、ヘアピン構造の単一鎖ＲＮＡを転写するプラスミドＤＮＡを用いる。細胞中に注入されたＤＮＡから転写されたｓｈＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターで調節されるプラスミドが標的細胞の核で短いヘアピン（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ）形態の単一鎖ＲＮＡに転写した後、エクスポーチン－５（ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５）によって細胞質に移動し、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）による処理過程を経てｓｉＲＮＡに変換される。
【0064】
ｍｉＲＮＡは、細胞内で自然に作られるが、蛋白質を生成する遺伝情報を有していないＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの形成過程は、以下の通りである。核で遺伝子によってｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｉＲＮＡ）に転写した後、ドロシャ（ｄｒｏｓｈａ）によって切断され、短いヘアピン（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ）形態のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡ）となり、以降、エクスポーチン－５（ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５によって核で細胞質に移動する。細胞質内でｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）酵素によって３'側に２ｎｔ突出部位（ｏｖｅｒｈａｎｇ）構造を有する約～２２ｎｔのｄｓＲＮＡに切断され、以降、ＲＩＳＣに含まれた後、単一鎖の成熟（ｍａｔｕｒｅ）ｍｉＲＮＡに転換し、標的ｍＲＮＡに相補的な対を成すが、標的ｍＲＮＡとの相補性程度によってｍＲＮＡを切断および分解するか、ｍＲＮＡ翻訳を抑制することになる。
【0065】
一例として、本願の抑制性ＲＮＡは、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ｍｉＲＮＡであってもよく、標的部位と完全に相補的であるので（ｆｕｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、標的ｍＲＮＡを切断することができる。操作されたｍｉＲＮＡは、細胞内で安定的に発現できるように、これをコーディングするＤＮＡを含むベクターを通じて細胞内に導入することができる。「安定的発現」とは一時的発現に対比されることであり、目的とする核酸が常時発現、恒常的発現、または永久的発現することをいう。
【0066】
好ましい具体例として、本願の抑制性ＲＮＡが操作されたｍｉＲＮＡであり、前記ｍｉＲＮＡに対する操作されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むベクターを通じて細胞に導入することができる。前記ベクターは、細胞に導入された後、転写されてｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを発現するが、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、内因性ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造と類似のヘアピン形態のステムループ構造を形成し、前述したようなｍｉＲＮＡの発現および作用機作を通じて成熟した形態のｍｉＲＮＡに転換し、標的ｍＲＮＡを切断および分解して標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【0067】
一例として、前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、以下のように構成されてもよい。（ｉ）ベクターにクローニングするための５'末端突出部位（ｏｖｅｒｈａｎｇ）；（ｉｉ）標的部位に相補的なアンチセンス配列（つまり、成熟ｍｉＲＮＡ配列）コーディング部位；（ｉｉｉ）末端ループ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌｏｏｐ）構造を形成するためのスペーサ配列；（ｉｖ）ステム構造を形成するための、部位（ｉｉ）に相補的な配列コーディング部位（つまり、標的部位に対するセンス配列）；および（ｖ）ベクターにクローニングするための３'末端の突出部位（ｏｖｅｒｈａｎｇ）。選択的に、部位（ｉｖ）は、遺伝子発現抑制効率をより高めるために、一部ヌクレオチド（例えば、約２ｎｔ）が結実して、短い内部ループ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｌｏｏｐ）を形成することができる。
【0068】
また、前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、前記のように構成された上部鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）とその相補体である下部鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）で形成されてもよい。
【0069】
一例として、本願のベクターは、抑制性ＲＮＡを安定的に発現するために、恒常性プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含んでもよい。前記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターであってもよい。その以外にも、ベクターは、通常の発現調節配列を含んでもよい。例えば、アダプターまたはリンカー、エンハンサー、選別マーカー（例えば、抗生剤耐性マーカー）、複製可能単位、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）信号配列、精製用タグまたは原核細胞または真核細胞またはウイルスの遺伝子の 発現を調節又は発現を誘導することが知られている他の他の配列およびこれらの様々な組み合わせなどを適切に含んでもよい。
【0070】
ｍｉＲＮＡは、標的配列によってＲＮＡｉ効果の効率性が決められるが、ここ数年間数多くのｍｉＲＮＡの塩基配列とそれによるＲＮＡｉ効率を調査したデータベースに基づいて、ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉＲＮＡをデザイン可能なアルゴリズムが開発され、様々なウェッブサイト（ｗｗｗ.ａｍｂｉｏｎ.ｃｏｍ、ｗｗｗ.ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ.ｃｏｍ、ｗｗｗ.ｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅａ．ｃｏｍ）を通じてサービスされている。しかし、アルゴリズムを通じて決められたｍｉＲＮＡが必ず標的ｍＲＮＡを効果的に分解できるわけではなく、効率的な抑制のために、一つの標的部位だけでは不充分なこともあるので、一遺伝子当り２ヶ所以上の標的部位を選定してｍｉＲＮＡを製造することが遺伝子抑制実験の成功確率を高めることができる。
【0071】
そのため、本願のベクターは、標的部位が異なる２種以上のｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする２種以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む２以上のベクターであるか、または、標的部位が異なる２種以上のｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする２種以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む同時発現ベクターであってもよい。
【0072】
ベクターとしては、当業界の公知されたプラスミドベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）、またはウイルスベクターを用いてもよいが、これに制限されない。細胞への導入は当業界の公知された方法、例えば、リン酸カルシウム法、または各種のトランスフェクション試薬（例えば、オリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、またはリポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）など）を用いた方法によって適切に行うことができる。
【0073】
本願の一実施例に係る非制限的な例示として、抑制性ＲＮＡは、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択される一つ以上の標的部位を標的とすることができる。
【0074】
前記三つの標的部位は、第１ロタウイルスと第２ロタウイルスの塩基配列の間で互いに相同性（％）が低い塩基配列部位だけを選別して選定されたものであり、他の標的部位をターゲットにする抑制性ＲＮＡを用いる場合、配列相同性（％）が高くなり標的部位に対する発現抑制効果がより低くなるか、効果がないこともある。
【0075】
本願の一実施例に係る非制限的な例示として、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択される一つ以上の配列対で形成された一つ以上の二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0076】
本願で第１ロタウイルスの１１本の遺伝子分節中の特定遺伝子分節に対する抑制性ＲＮＡを安定的に発現する細胞株は、ロタウイルスに対して高い感受性を有する細胞であってもよい。例えば、前記細胞株は、ＭＲＣ－５、ＭＡ－１０４、ベロ（Ｖｅｒｏ）、ＢＨＫ－２１、ＣＯＳ－７、２９３Ｔ、ＣＶ－１またはＴＦ－１０４細胞株であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0077】
一方、本願の再集合体ウイルス製造方法で、第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入される。
【0078】
第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスの遺伝子分節のｍＲＮＡが細胞に導入される場合、前記ｍＲＮＡは、当業界の公知された方法によって合成されるか、またはインビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって得られてもよい。この場合、天然ロタウイルスのｍＲＮＡが５'末端にキャップ構造を有しており、ゲノムの複製と翻訳に影響を与えるという点を考慮して、得られたｍＲＮＡをキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）することが好ましい。
【0079】
代案として、第１ロタウイルスの前記特定遺伝子分節に対応する第２ロタウイルスのＲＮＡ分節をコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡが細胞に導入される場合、一般的には、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素によって認識されるＴ７プロモーターを用いてもよい。しかし、その以外にも多様なＲＮＡ重合酵素によって認識されるプロモーターを用いてもよく、例えば、Ｔ３ ＲＮＡ重合酵素またはＳｐ６ ＲＮＡ重合酵素などが挙げられるが、これに制限されない。前記ＤＮＡまたはｃＤＮＡは公知のベクターを用いて導入されてもよい。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いる場合、公知されたＴ７発現ベクターを用いてもよく、市販のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋／－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ社）、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）などが挙げられるが、これに制限されない。また、前記のようにＤＮＡまたはｃＤＮＡが細胞に導入される場合、これを細胞に導入する前または後に、ＲＮＡ重合酵素を発現する核酸コンストラクトを導入することができ、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素を供給するために用いる核酸コンストラクト内にキャッピング酵素をコーディングする配列が発現可能な状態で含まれてもよい。
【0080】
第２ロタウイルスの遺伝子分節が細胞に導入された後、前記細胞は、ヘルパーウイルスとして第１ロタウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、天然に存在する野生型ウイルスであってもよいが、これに制限されず、天然に存在する変異型ウイルスまたは人為的に遺伝子変更を施した組換えウイルスも可能である。好ましい具体例として、感染を促進するためにトリプシンまたはキモトリプシンの存在下で感染を行ってもよい。
【0081】
本願の再集合体ウイルス製造方法は、細胞株を第１ロタウイルスに感染させるステップ以降、継代培養を通じて前記再集合体ロタウイルスを濃化させるステップをさらに含んでもよい。
【0082】
本願の方法は、ロタウイルスの特定遺伝子に対する抑制性ＲＮＡを常時発現する細胞株を用いるために、これによって再集合体ロタウイルスを選別して分離するための選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が加わる。具体的には、本願の細胞は、抑制性ＲＮＡによって第１ロタウイルスの特定遺伝子分節のｍＲＮＡ量が低下しており、これに対応する第２ロタウイルスの特定遺伝子分節は過量導入された状態であるので、ウイルスの複製および組立て過程で、第２ロタウイルスの特定遺伝子分節のｍＲＮＡが第１ロタウイルスの特定遺伝子分節のｍＲＮＡの代わりに用いられ、再集合体ウイルスが発生する確率が増加する。また、継代が続くことにつれて細胞が発現するｍｉＲＮＡによってヘルパーウイルス（例えば、野生型ＷＣ３ウイルス）は継続的に複製することが阻害されるが、再集合体ウイルスは影響を受けないため再集合体ウイルスを濃化することができる。
【0083】
再集合体ウイルスの回収は、培養後の培養液および／または細胞破砕液を回収することにより行うことができる。選択的に、回収された培養液および／または細胞破砕液をまた他の宿主細胞（第２宿主細胞、第３宿主細胞）に添加（接種）することによってウイルスを再感染させて継代培養した後、回収することができる。ウイルスの回収は、プラーク分離（ｐｌａｑｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を通じて行うことができ、回収された組換えウイルスは、必要に応じて精製することができる。例えば、遠心分画、密度勾配遠心分離、カラムクロマトグラフィーなどを適切に組み合わせてウイルスの精製を行うことができる。
【0084】
本願の一実施例に係る例示は、
牛（ｂｏｖｉｎｅ）のＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節に対するｍｉＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株をＷＣ３ロタウイルスに感染させるステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、再集合体ウイルスの製造方法を提供し、各ステップに対する具体的な説明は前述した通りである。
牛（ｂｏｖｉｎｅ）のＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節に対するｍｉＲＮＡを安定的に発現する細胞株を提供するステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節のｍＲＮＡ、またはこれをコーディングするＤＮＡまたはｃＤＮＡを前記細胞株に導入するステップと、
前記細胞株をＷＣ３ロタウイルスに感染させるステップと、
人間ロタウイルスのＶＰ７遺伝子分節を含む再集合体ロタウイルスを回収するステップと、を含む、再集合体ウイルスの製造方法を提供し、各ステップに対する具体的な説明は前述した通りである。
【0085】
本発明は、さらに、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より選択されるいずれか一つ以上の標的部位を抑制する抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドに関するものである。好ましい具体例として、前記抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。好ましい他の具現例として、前記抑制性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡまたは前記ｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡであってもよい。
【0086】
本発明は、さらに、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、および配列番号１０および配列番号１１からなるグループから選択されるいずれか一つ以上の配列対で形成された二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド；前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株製造用組成物；前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株製造用組成物；前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは前記二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、野生型ＷＣ３ロタウイルスの生産が抑制された細胞株；および前記抑制性ＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが導入された、牛ロタウイルスのＶＰ７蛋白質の生成が抑制された細胞株を提供し、これらは前述したような再集合体ウイルスの製造方法に用いられてもよい。
【実施例】
【0087】
［発明を実施するための形態］
以下、本発明を以下の実施例によってより具体的に説明することにする。しかし、これらは、本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨から外れない範囲で変形可能であることは当業者らにとって自明である。
以下、本発明を以下の実施例によってより具体的に説明することにする。しかし、これらは、本発明を例示するためのものであるだけで、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。下記に記載された実施例は、発明の本質的な要旨から外れない範囲で変形可能であることは当業者らにとって自明である。
【0088】
実施例１．ＷＣ３野生型ロタウイルスでＶＰ７遺伝子の転写および発現抑制のための標的部位の選別
ＷＣ３／Ｂｒｂ９－ＶＰ７再集合体ウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ）製作のためにロタウイルスに対して高い感受性を有する細胞に形質転換を起こし、再集合体されない牛（ｂｏｖｉｎｅ）ＷＣ３野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ウイルス生産を抑制可能な安定した細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の構築を行った。前記形質転換は、ＷＣ３ウイルスのＶＰ７遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術を用いた。
ＷＣ３／Ｂｒｂ９－ＶＰ７再集合体ウイルス（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ）製作のためにロタウイルスに対して高い感受性を有する細胞に形質転換を起こし、再集合体されない牛（ｂｏｖｉｎｅ）ＷＣ３野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ウイルス生産を抑制可能な安定した細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の構築を行った。前記形質転換は、ＷＣ３ウイルスのＶＰ７遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）技術を用いた。
【0089】
具体的には、ＷＣ３ロタウイルスのＶＰ７遺伝子内でＷＣ３に特異的であり、人間ロタウイルスであるＢｒＢ９のＶＰ７には特異性を示さないｍｉＲＮＡ標的部位３ヶ所を選定した。本願で構築しようとする安定した細胞株は、これらの標的部位に対するｍｉＲＮＡを常時発現するように意図される。前記ｍｉＲＮＡ（成熟形態）は、ＲＮＡｉ標的部位に対して完全に相補的なアンチセンス配列に該当する２１ｂｐの短い干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ類型であり、これらは、ＷＣ３ ＶＰ７遺伝子の転写と発現を抑制することになる。ｍｉＲＮＡ選別時に、ＲＮＡｉ発現のために用いたベクターシステムで提供するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉＴＭ Ｐｒｅ－Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｗｅｂ－ｔｏｏｌ（ｗｗｗ.ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ.ｃｏｍ/ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ）を用いた。ＷＣ３ ＶＰ７遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＹ０５０２７２（配列番号１）を、Ｂｒｂ９ ＶＰ７遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ＧＵ５６５０９０（配列番号２）を参考にした。図１は、ＷＣ３ ＶＰ７遺伝子（配列番号１）とＢｒｂ９ ＶＰ７遺伝子（配列番号２）の核酸配列の整列結果を示す。図１に示されているように、ＷＣ３ ＶＰ７遺伝子（配列番号１）とＢｒｂ９ ＶＰ７遺伝子（配列番号２）の核酸配列の相同性は、７４．３％（１０６２ｂｐのうち、７８９ｂｐ一致）であるが、標的部位の部分はこれより低い相同性を示す部分から選別した。具体的に、図１で標的部位として選別した３ヶ所を下線を引いた太字で表示しており、５'から３'方向に順に標的部位１（配列番号３）は７１．４％１５／２１、標的部位２（配列番号４）は６６．７％１４／２１、および標的部位３（配列番号５）は６１．９％（１３／２１の配列相同性を有する。
【0090】
実施例２．ｍｉＲＮＡ発現ベクターの製作
実施例１で選別した３ヶ所のｍｉＲＮＡ標的部位に対するｍｉＲＮＡを発現させるために、これのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする配列をそれぞれｍｉＲＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にそれぞれ製造社のマニュアルに従い、クローニングした。このために、まず各標的部位に結合可能なｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが転写可能なＤＮＡ配列と、これに相補的な配列を４ｎｔのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有するようにデザインおよび合成してアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、ｄｓＤＮＡオリゴを製作した（表１および図２）。
実施例１で選別した３ヶ所のｍｉＲＮＡ標的部位に対するｍｉＲＮＡを発現させるために、これのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコーディングする配列をそれぞれｍｉＲＮＡ発現ベクターであるｐｃＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にそれぞれ製造社のマニュアルに従い、クローニングした。このために、まず各標的部位に結合可能なｍｉＲＮＡに対するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが転写可能なＤＮＡ配列と、これに相補的な配列を４ｎｔのオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有するようにデザインおよび合成してアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）し、ｄｓＤＮＡオリゴを製作した（表１および図２）。
【0091】
【表1】
【0092】
その後、製造社のマニュアルに従い、４ｎｔオーバーハングを有するｄｓＤＮＡオリゴと線形化したｐｃＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した後、コロニーを選別して配列を分析して完成されたｍｉＲＮＡ発現プラスミドを得ており、それぞれｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ１、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ２、およびｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ３と命名した。
【0093】
実施例３．三重（ｔｒｉｐｌｅ）ｍｉＲＮＡ発現ベクターの製作
一つのベクターで３個のｍｉＲＮＡが同時に転写可能な発現ベクターをデザインし、製作社のマニュアルに従い、クローニングした。まず、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約１５１ｂｐの挿入断片（ｉｎｓｅｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を精製した。ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ２は、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約５．６ｋｂのベクター断片を精製した。挿入断片とベクター断片とを連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した後、コロニーを得て配列分析した後、完成された二重（ｄｕａｌ）ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。その後、二重ｍｉＲＮＡ発現ベクターをＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約２５０ｂｐの挿入断片２を精製し、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ３をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約５．６ｋｂのベクター断片２を精製した。挿入断片２とベクター断片２とを連結し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した後、コロニーを得て配列分析した後、完成された三重（ｔｒｉｐｌｅ）ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。製作した三重ｍｉＲＮＡ発現ベクターをＤｒａＩ制限酵素で切断し、ＥｍＧＦＰ断片を除去した後、再び連結してＧＦＰ遺伝子がない三重ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作してｐｃＤＮＡ－Ｔｒｉ－ｍｉＲＮＡと命名した（図３）。
一つのベクターで３個のｍｉＲＮＡが同時に転写可能な発現ベクターをデザインし、製作社のマニュアルに従い、クローニングした。まず、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約１５１ｂｐの挿入断片（ｉｎｓｅｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を精製した。ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ２は、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約５．６ｋｂのベクター断片を精製した。挿入断片とベクター断片とを連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した後、コロニーを得て配列分析した後、完成された二重（ｄｕａｌ）ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。その後、二重ｍｉＲＮＡ発現ベクターをＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約２５０ｂｐの挿入断片２を精製し、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ／ｍｒ３をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断し、約５．６ｋｂのベクター断片２を精製した。挿入断片２とベクター断片２とを連結し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した後、コロニーを得て配列分析した後、完成された三重（ｔｒｉｐｌｅ）ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作した。製作した三重ｍｉＲＮＡ発現ベクターをＤｒａＩ制限酵素で切断し、ＥｍＧＦＰ断片を除去した後、再び連結してＧＦＰ遺伝子がない三重ｍｉＲＮＡ発現ベクターを製作してｐｃＤＮＡ－Ｔｒｉ－ｍｉＲＮＡと命名した（図３）。
【0094】
実施例４．三重（ｔｒｉｐｌｅ）ｍｉＲＮＡを安定的に発現する細胞株の製作およびＷＣ３感染阻害テスト
三重ｍｉＲＮＡが安定して（ｓｔａｂｌｅ）発現する細胞株を得るために、ＴＦ－１０４（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）細胞株に前記ｐｃＤＮＡ－Ｔｒｉ－ｍｉＲＮＡプラスミドをトランスフェクションし、ベクター内に含まれたブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）抗生剤抵抗性遺伝子を用いてｍｉＲＮＡを発現する単一細胞を選別した。抗生剤であるブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ）をトランスフェクションした細胞に１０～２０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理して、トランスフェクションされていない細胞の成長を阻害し、トランスフェクションされた細胞を選別する過程を数回繰り返してブラストサイジンに抵抗性がある単一細胞コロニーのうち４４個のコロニーを拡張継代して４４個のクローンを確保した。
三重ｍｉＲＮＡが安定して（ｓｔａｂｌｅ）発現する細胞株を得るために、ＴＦ－１０４（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）細胞株に前記ｐｃＤＮＡ－Ｔｒｉ－ｍｉＲＮＡプラスミドをトランスフェクションし、ベクター内に含まれたブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）抗生剤抵抗性遺伝子を用いてｍｉＲＮＡを発現する単一細胞を選別した。抗生剤であるブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ Ｓ）をトランスフェクションした細胞に１０～２０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理して、トランスフェクションされていない細胞の成長を阻害し、トランスフェクションされた細胞を選別する過程を数回繰り返してブラストサイジンに抵抗性がある単一細胞コロニーのうち４４個のコロニーを拡張継代して４４個のクローンを確保した。
【0095】
２４－ウォールプレートに前記各クローンおよび野生型（ＷＴ）ＴＦ－１０４細胞を９０％コンフルエンシでプレーティングし、ＷＣ３ウイルスをウォール当り１００ｐｆｕ、１ｐｆｕ感染させた。感染後、３日と５日後に細胞変性効果（ＣＰＥ：Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を比較して、ＷＴ ＴＦ－１０４に比べて感染が阻害したクローンを選別した。その結果、表２に示しているように、６、１３、１４、１９、３１、４４番クローンが、ＷＣ３感染を効果的に阻害しており、特に４４番クローンが最も阻害効果が大きいことが分かった。
【0096】
【表2】
【0097】
ＷＣ３ウイルスを感染させた６、１３、１４、１９、３１、４４クローンの培地を除去し、ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１０ｕｇ／ｍｌのブラストサイジン培地に取り替え、拡張継代培養を行い、ウイルスに感染していない細胞を救済（ｒｅｓｃｕｅ）し、それぞれＴＫ６ｒ、ＴＫ１３ｒ、ＴＫ１４ｒ、ＴＫ１９ｒ、ＴＫ３１ｒ、ＴＫ４４ｒと命名した。
【0098】
実施例５．Ｇ４ Ｂｒｂ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡの製作
再集合に用いられる人間ロタウイルスＧ４ Ｂｒｂ９のＶＰ７遺伝子は、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程とキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）過程を経てｍＲＮＡに作った後、ｍＲＮＡを形質導入する方式で行った。プラスミドＤＮＡ形態にすぐに形質導入することもできるが、この場合、効率的な転写のために一般的にＴ７プロモーターを用いる。Ｔ７プロモーターは特異的でかつ強力であり、細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）でも転写が可能であるため、プラスミドが核内まで伝達されず、細胞質に留まっても転写されるというメリットがあるが、これのためにＴ７ポリメラーゼを発現可能な発現ベクターを、まず細胞に形質導入しなければならないという点と、細胞質で転写されたＲＮＡは、キャッピングできないため不安定であるというデメリットを有している。Ｂｒｂ９ ＶＰ７遺伝子の再集合効率を高めるためには、ウイルスｍＲＮＡと同一の形態のキャッピングされている形態が有利であるので、本実施例ではプラスミドＤＮＡを形質導入する方法の代わりに、試験管内でウイルスｍＲＮＡと同一の形態で転写を行い、このｍＲＮＡを導入する方式を選択した。
再集合に用いられる人間ロタウイルスＧ４ Ｂｒｂ９のＶＰ７遺伝子は、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程とキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）過程を経てｍＲＮＡに作った後、ｍＲＮＡを形質導入する方式で行った。プラスミドＤＮＡ形態にすぐに形質導入することもできるが、この場合、効率的な転写のために一般的にＴ７プロモーターを用いる。Ｔ７プロモーターは特異的でかつ強力であり、細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）でも転写が可能であるため、プラスミドが核内まで伝達されず、細胞質に留まっても転写されるというメリットがあるが、これのためにＴ７ポリメラーゼを発現可能な発現ベクターを、まず細胞に形質導入しなければならないという点と、細胞質で転写されたＲＮＡは、キャッピングできないため不安定であるというデメリットを有している。Ｂｒｂ９ ＶＰ７遺伝子の再集合効率を高めるためには、ウイルスｍＲＮＡと同一の形態のキャッピングされている形態が有利であるので、本実施例ではプラスミドＤＮＡを形質導入する方法の代わりに、試験管内でウイルスｍＲＮＡと同一の形態で転写を行い、このｍＲＮＡを導入する方式を選択した。
【0099】
Ｇ４ Ｂｒｂ９のＶＰ７遺伝子のｍＲＮＡをインビトロ転写するためのＤＮＡ鋳型をデザインした。ロタウイルスの３’ＵＴＲ配列は、翻訳過程で重要であるので、正確な部分で転写が始まって終わらなければならない。Ｔ７プロモーターの転写開始点は非常に正確な方であるが、終了地点はＴ７ターミネーターが存在しても、多少ヘテロジニアス（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）であるため、Ｔ７ターミネーターの前にデルタ感染ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列を導入して、ＶＰ７遺伝子が終わる位置で正確に切られるようにデザインした（配列番号１２および図４参照）。デザインされたＤＮＡ鋳型を合成し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で切断して、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングし、ｐＵＣ５７－Ｔ７－Ｂｒｂ９－ＶＰ７と命名した。
【0100】
ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）およびｐＵＣ５７－Ｔ７－Ｂｒｂ９－ＶＰ７ ＤＮＡ鋳型を用いて、製作者のマニュアルに従い、インビトロ転写および５’キャッピング過程を通じてＢｒｂ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡを製作した。
【0101】
実施例６．Ｇ４ Ｂｒｂ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡトランスフェクションおよびＷＣ３ウイルス感染
インビトロ転写されたＧ４ Ｂｒｂ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡを、実施例４で得られたＴＫ１４ｒ細胞株にリポゾーム（リポフェクタミン２０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）トランスフェクションした。トランスフェクション過程は、製作社のマニュアルで提供する通常の方法を用いた。トランスフェクション後、４時間３７℃、５％ＣＯ２培養器で細胞を培養し、この後、完全成長培地（１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）に培地を交換した。
インビトロ転写されたＧ４ Ｂｒｂ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡを、実施例４で得られたＴＫ１４ｒ細胞株にリポゾーム（リポフェクタミン２０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）トランスフェクションした。トランスフェクション過程は、製作社のマニュアルで提供する通常の方法を用いた。トランスフェクション後、４時間３７℃、５％ＣＯ２培養器で細胞を培養し、この後、完全成長培地（１０％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）に培地を交換した。
【0102】
２４時間トランスフェクションを行った後、培地を感染培地（０．５μｇ／ｍｌのトリプシン含有無血清ＥＭＥＭ）に交替して、トリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ０３０３、１０μｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃で３０分間活性化したＷＣ３（ＡＴＣＣ ＶＲ－２１０２）ウイルスをＭＯＩ １．０で細胞に感染させた。感染させた後、細胞は３７℃、５％ＣＯ２培養器で４８時間インキュベーションして細胞変性効果（ＣＰＥ）を確認した。
【0103】
ＴＫ１４ｒ細胞は、ｍｉＲＮＡを用いてＷＣ３のＶＰ７遺伝子の転写と発現を抑制し、感染した細胞内でＷＣ３ ＶＰ７ ｍＲＮＡ量は低下しており、ＢｒＢ９ ＶＰ７ ｍＲＮＡは、過量導入された状態であるので、ウイルスの複製および組立て過程で、ＢｒＢ９ ＶＰ７のｍＲＮＡが、ＷＣ３ ＶＰ７ ｍＲＮＡの代わりに用いられ、再集合体ウイルスが発生する確率が増加する。また、継代が続くことにつれて細胞が発現するｍｉＲＮＡによって、ＷＣ３ ＷＴウイルスは継続的に複製することが阻害されるが、再集合体ウイルスは影響を受けないため再集合体ウイルスが濃化する。
【0104】
実施例７．ＷＣ３／Ｂｒｂ９ ＶＰ７再集合体ウイルスの確認
前述した過程を通じてＣＰＥが発生した細胞を３回凍結－融解（ｆｒｅｅｚｉｎｇ－ｔｈａｗｉｎｇ）し、細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を確保し、これをＰａｓｓａｇｅ ０（Ｐ０）にした。Ｐ０をＴＫ１４ｒ細胞株またはＭＡ－１０４細胞株に再感染させた後、４８時間後に細胞を３回凍結－融解して細胞破片を除去した後、上澄み液を確保し、これをＰａｓｓａｇｅ １（Ｐ１）にした。
前述した過程を通じてＣＰＥが発生した細胞を３回凍結－融解（ｆｒｅｅｚｉｎｇ－ｔｈａｗｉｎｇ）し、細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を確保し、これをＰａｓｓａｇｅ ０（Ｐ０）にした。Ｐ０をＴＫ１４ｒ細胞株またはＭＡ－１０４細胞株に再感染させた後、４８時間後に細胞を３回凍結－融解して細胞破片を除去した後、上澄み液を確保し、これをＰａｓｓａｇｅ １（Ｐ１）にした。
【0105】
組換えした試料内の再集合を確認するために、ＷＣ３ ＶＰ７、ＢｒＢ９ ＶＰ７、並びにＷＣ３ ＶＰ４を特異的に検出可能なプライマーセットを製作し、交差反応性（ｃｒｏｓｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ）または偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）および偽陰性（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）結果は確認されないことを確認した（表３）。
【0106】
【表3】
【0107】
前記プライマ－を用いて試料内の再集合を確認するためにＲＴ－ＰＣＲ反応を行った。ＷＣ３ ＶＰ７、ＢｒＢ９ ＶＰ７、並びにＷＣ３ ＶＰ４は、それぞれ４２２ｂｐ、４０６ｂｐ、３９４ｂｐサイズのＲＴ－ＰＣＲ産物に増幅され、用いたＲＴ－ＰＣＲ条件は、以下の通りである（表４）。
【0108】
【表4】
【0109】
ＴＫ１４ｒ細胞株またはＭＡ－１０４細胞株にＰ０試料を感染させた後に得られた二種類のＰ１試料でウイルスＲＮＡを抽出してＲＴ－ＰＣＲを行った。５回の試みで、２回目はＴＫ１４ｒ細胞株を用いてＰ１を製造しており（図５、Ｌａｎｅ １、４）、３回目はＭＡ－１０４細胞株を用いてＰ１を製造した（図５、Ｌａｎｅ ２、３、５）。その結果、４回目と５回目の試みから得られた、Ｐ１でＢｒＢ９ ＶＰ７特異的な約４００ｂｐ大きさのバンドを確認した（図５、Ｌａｎｅ ４とＬａｎｅ ５）。
【0110】
ＶＰ４の場合、バックボーンウイルスであるＷＣ３に共通にあるもので、ＲＴ－ＰＣＲを行う際には内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）の意味で使用された。ＢｒＢ９ ＶＰ７がＷＣ３ウイルスに再集合された場合、試料からＢｒＢ９ ＶＰ７とＷＣ３ ＶＰ４信号が同時に確認され、ＷＣＶＰ７は検出されてはならない。したがって、４回目と５回目は成功的にＢｒＢ９ ＶＰ７がＷＣ３ウイルスに再集合されたことを確認した。
【0111】
実施例８．再集合体ウイルスの分離
Ｐ０、Ｐ１ステップのウイルスは、単一クローンでなく混合したクローンとして存在するので、再集合された単一クローンウイルスを分離するために、図５のＬａｎｅ ４に該当するＰ１試料を用い、プラーク分離（ｐｌａｑｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を行った。形成されたプラークを目視で観察するために、ニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）で細胞断層を染めてウイルスの増殖を確認した。
Ｐ０、Ｐ１ステップのウイルスは、単一クローンでなく混合したクローンとして存在するので、再集合された単一クローンウイルスを分離するために、図５のＬａｎｅ ４に該当するＰ１試料を用い、プラーク分離（ｐｌａｑｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を行った。形成されたプラークを目視で観察するために、ニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）で細胞断層を染めてウイルスの増殖を確認した。
【0112】
６０～１００個のプラークをピッキング（ｐｉｃｋｉｎｇ）して分析し、再集合体プラークを見つけるために一連の過程を３回以上持続的に繰り返した。プラークピッキング過程は、以下の通りである。１）顕微鏡または目視で再集合体プラーク候補に表示する。２）ピッキングする個数だけＥＭＥＭ（無血清）をｅ－チューブにそれぞれ３００ｕｌずつ分注する。３）滅菌したチップでピッキングして２）に入れる。４）－７０℃保管するか、トリプシン（Ｔ０３０３、１ｕｇ／ｍＬ）を添加して感染に用いる。プラーク分析を行った後、確認された１０個のプラークを分離した。プラーク分離した単一クローンは、ＴＫ１４ｒ細胞株（２４ｗｅｌｌ、１×１０Ｅ５／ｗｅｌｌ）に感染した後、３日間培養またはＣＰＥが確認されるまで培養した後、収穫する。収穫した試料からｖｉｒａｌ ＲＮＡを抽出し、それを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲ分析方法を用いて再集合されたウイルスであるか分析した。その結果、６番クローンと８番クローンが再集合されたクローンと確認された（図６参照）。Ｇ４再集合体プラークと確認された６番と８番クローンを、ＭＡ－１０４細胞株で培養して再集合体ウイルスストック（ｓｔｏｃｋ）を確保した（図７および図８参照）。
【0113】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明がその技術的な思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。したがって、前述した実施例はあらゆる面で例示的なものであって限定的なものではないと理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、並びにその等価の概念から導出されるすべての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】