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▶ エーバイオケム バイオテクノロジー カンパニー，リミティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】糖転移酵素及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20240514BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240514BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240514BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240514BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/63 Z
C12N9/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573659
(86)(22)【出願日】2022-06-01
(85)【翻訳文提出日】2023-11-29
(86)【国際出願番号】 CN2022096683
(87)【国際公開番号】W WO2022253282
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】202110610098.2
(32)【優先日】2021-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111602506.6
(32)【優先日】2021-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520385157
【氏名又は名称】エーバイオケム バイオテクノロジー（グループ）カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウー、ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ティエン、チェンホア
(72)【発明者】
【氏名】ワン、シュウ
(72)【発明者】
【氏名】チョン、シアオフー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA26X
4B065BA02
4B065CA60
(57)【要約】
糖転移酵素及びその使用であり、前記糖転移酵素のアミノ酸配列番号は配列番号１１２に示されるか、又は配列番号１１２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に示される。本発明の糖転移酵素は酵素活性が高く、安定性も良好であり；ステビオール配糖体の製造に使用した場合、親糖転移酵素と比較して触媒活性が大幅に向上し、転換率が大幅に向上し、グリコシル供与体ＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）のコストが高い問題が解決され、それによって反応コストを削減され、産業生産に有利である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列が配列番号１１２に示されるか、或いは配列番号１１２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に示される糖転移酵素。
【請求項2】
前記配列番号１１２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１１２と比較して、Ｖ１４Ｉ；
Ｅ９９Ｌ；
Ｔ２５４Ｇ；
Ｌ２５７Ａ；
Ｑ４５１Ｅ；
Ｑ２６５Ｅ；
Ｐ２７１Ａ；
Ｒ３３３Ｋ；
Ｒ１２Ｑ；
Ａ１１８Ｓ；
Ｅ４１８Ｄ；
Ｓ４５５Ｒから選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基の違いを含み、
好ましくは、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は配列番号１１２と比較して、Ｋ３４７Ｐ残基位置から選択されるアミノ酸残基の違いを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の糖転移酵素。
【請求項3】
前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、配列番号１１２と比較して、Ｖ１４Ｉ、Ｅ９９Ｌ、Ｔ２５４Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｑ４５１Ｅ、Ｑ２６５Ｅ、Ｐ２７１Ａ、Ｒ３３３Ｋ、Ｒ１２Ｑ、Ａ１１８Ｓ、Ｅ４１８Ｄ又はＳ４５５Ｒから選択される一つの残基位置でのアミノ酸残基の違いを更に含み；或いは、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、配列番号１１２と比較して、Ｑ２６５Ｅ及びＰ２７１Ａから選択される残基位置でのアミノ酸残基の違いを更に含み；
或いは、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、配列番号１１２と比較して、Ｒ３３３Ｋ及びＫ３４７Ｐから選択される残基位置での酸残基の違いを更に含むことを特徴とする、請求項２に記載の糖転移酵素。
【請求項4】
前記糖転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列：配列番号４１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０７及び配列番号１０８から選択されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の糖転移酵素。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の糖転移酵素をコードし、好ましくは、ヌクレオチド配列が配列番号４１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０７、配列番号１０８から選択されることを特徴とする、単離された核酸。
【請求項6】
請求項５に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項7】
請求項５に記載の核酸又は請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞であり；好ましくは、前記宿主細胞はエシェリキア属菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、形質転換体。
【請求項8】
請求項１～４のいずれか１項に記載の糖転移酵素の製造方法であって、前記方法は前記糖転移酵素の発現に適した条件下で請求項７に記載の形質転換体を培養するステップを含む、方法。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか１項に記載の糖転移酵素を含む、組成物。
【請求項10】
基質のグリコシル化方法であって、前記方法は請求項１～４のいずれか一項に記載の糖転移酵素の少なくとも１つの基質を提供するステップと、前記基質がグリコシル化されて少なくとも１つのグリコシル化産物を生成させる条件下で、前記基質と前記糖転移酵素とを接触させるステップを含む、方法。
【請求項11】
レバウジオシドＡの製造方法であって、前記方法は請求項１～４のいずれか１項に記載の糖転移酵素の存在下で、ステビオシドとグリコシル供与体とを反応させてレバウジオシドＡを得るステップを含み；
好ましくは：
前記糖転移酵素は、糖転移酵素細菌スラリーの形態で存在し；
及び／或いは、前記ステビオシドの濃度は１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは１００ｇ／Ｌであり；
及び／或いは、前記グリコシル供与体とステビオシドのモル比は、１：１～５：１であり；
及び／或いは、前記グリコシル供与体はＵＤＰ－グルコースであり、好ましくは、スクロースシンターゼの存在下でスクロースとＵＤＰとで製造し、前記スクロースの濃度は、好ましくは１００～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌであるり、前記ＵＤＰの濃度は好ましくは０．０５～０．２ｇ／Ｌであり、例えば０．１ｇ／Ｌであり；
及び／或いは、前記反応の反応溶媒のｐＨは５～８であり、好ましくは６であり；
及び／或いは、前記反応時の回転速度は５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは６００ｒｐｍであり；
及び／或いは、前記反応の反応系の温度は２０～９０℃であり、好ましくは６０℃であることを特徴とする、製造方法。
【請求項12】
レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭの製造方法であって、請求項１１に記載の製造方法によりレバウジオシドＡを製造するステップを含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項13】
糖転移酵素の存在下でレバウジオシドＡとグリコシル供与体とを反応させるステップを含むレバウジオシドＩの製造方法であって、前記糖転移酵素は請求項１～４のいずれか１項に記載の通りであり、前記製造方法は、
前記糖転移酵素は、糖転移酵素菌、粗酵素液、純粋酵素、純粋酵素液、又は固定化酵素の形態で存在し；
前記グリコシル供与体は、ＵＤＰ－グルコース及び／又はＡＤＰ－グルコースであり；
前記レバウジオシドＡの濃度は、１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは、１００ｇ／Ｌであり；
前記糖転移酵素菌とレバウジオシドＡとの質量比は、１：（３～１０）であり、好ましくは、３：２０であり；
前記反応の反応溶媒のｐＨは、５～８であり、好ましくは５．５～６であり；
前記反応の反応系の温度は、２０～９０℃であり、好ましくは、６０℃であり；
前記反応の反応時間は、５～３０時間であり、好ましくは、２４時間である；
条件の一つ又は複数を満たすことを特徴とする、製造方法。
【請求項14】
前記グリコシル供与体は、スクロース及びスクロースシンターゼの存在下で、ＵＤＰ及び／又はＡＤＰにより製造され；及び／或いは、前記スクロースの濃度は、１００～３００ｇ／Ｌであり、好ましくは、２００ｇ／Ｌであり、前記ＵＤＰ又は前記ＡＤＰノ濃度は０．０５～０．２ｇ／Ｌであり、好ましくは、０．１ｇ／Ｌであり；
及び／或いは、前記ｐＨは緩衝液で制御し、前記緩衝液は、好ましくは、リン酸緩衝液であり；
及び／或いは、前記反応の回転速度は、５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは、６００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項15】
ステビオール配糖体の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の糖転移酵素の使用であって、前記ステビオール配糖体は、好ましくは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ又はレバウジオシドＩである使用。
【請求項16】
請求項１～４のいずれか一項に記載の糖転移酵素と、配列が配列番号３２に示されるスクロースシンターゼとを含む触媒酵素組成物。
【請求項17】
前記糖転移酵素とスクロース合成酵素の質量比が（２～１０）：１であり、好ましくは５：１であることを特徴とする、請求項１６に記載の触媒酵素組成物。
【請求項18】
レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ又はレバウジオシドＩの製造における、請求項１６又は１７に記載の触媒酵素組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、出願日が２０２１年６月１日である中国特許出願２０２１１０６１００９８２、出願日が２０２１年１２月２４日である中国特許出願２０２１１１６０２５０６６の優先権を主張する。本出願は上記中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
本発明は、糖転移酵素、及びステビオール配糖体のグリコシル化反応におけるその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ステビオール配糖体（Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ、ステビオールグリコサイドとも呼ばれる）は、キク科の草本植物であるステビアの葉から抽出された天然甘味料であり、複数の配糖体の混合物であり、異なるステビオール配糖体は、味と品質に大きな違いが存在する。ステビオール配糖体は純粋な天然物（純粋な天然植物ステビア由来）、高甘味度（スクロースの２５０～４５０倍）、低カロリー（白砂糖のわずか１／３００）、低使用コスト（コストはスクロースのわずか１／３）、優れた安定性（耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、分解しにくい）、高い安全性（毒性の副作用がない）等のメリット、並びに抗高血糖、抗高血圧、抗炎症、抗腫瘍、下痢止めなどの潜在的な治療効果を有している。
【0004】
ステビオール配糖体（ステビオール配糖体系化合物）の構造式は下記の通りである。
【0005】
【化1】
【0006】
上記のステビオール配糖体系化合物は、共通のアグリコンであるステビオール（Ｓｔｅｖｉｏｌ）を有し、違いは、Ｃ－１３とＣ－１９の位置に接続されている糖基の数と種類にあり、主にステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ａ、Ｒｅｂ Ａ）、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＩ、ダルコシド、ステビオールビオシドなどの様々な配糖体を含む。ステビアの葉は、最大１０～２０％（乾燥重量に基づく）のステビオール配糖体を蓄積することができる。ステビアの葉で発見された主な配糖体は、レバウジオシドＡ（２～１０％）、ステビオシド（２～１０％）、及びレバウジオシドＣ（１～２％）である。レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＩ、ステビオールビオシド、ルブソシドなどの他の配糖体は、はるかに低いレベル（約０～０．２％）で検出されている。その中でもレバウジオシドＡは最も甘味度が高く、その甘味度はスクロースに似ており、高甘味度、低カロリー、溶け易さ、耐熱性、安定性を兼ね備えた新規な天然甘味料であり、その含有量や純度もステビアの品質の主な指標である。また、レバウジオシドＡは、レバウジオシドＤ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｄ、ＲｅｂＤ、ＲＤ）、レバウジオシドＥ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｅ、ＲｅｂＥ、ＲＥ）、レバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ、ＲｅｂＭ、ＲＭ）、レバウジオシドＩ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｉ、ＲｅｂＩ、ＲＩ）等のステビア糖系化合物を合成する重要な中間体でもある。
【0007】
ステビオール配糖体は高強度甘味料ではあるが、苦味と渋みがあるという欠点があり、食品や飲料などの味覚が要求される分野での使用が著しく制限されている。ステビオール配糖体の苦味と渋みの本質的な原因はその内部分子構造にあり、ステビオール配糖体のＲ１基とＲ２基に連結されている糖基が多いほど味が良くなる。一般に、ステビオシドはスクロースの１１０～２７０倍甘く、レバウジオシドＡの１５０～３２０倍甘いことが知られているが、高度に精製された状態でも、ステビオール配糖体は苦味、甘い後味、甘草の味などの望ましくない味の特性を依然として持っている。
【0008】
レバウジオシドＤは、最も有望なステビオール配糖体であり、他のステビオール配糖体と比較して、甘味が高く、スクロースの約３００～３５０倍であり、甘味は純粋で、味もスクロースに近く、苦味や甘草の味がなく、安定性も良好であり、理想的な天然高甘味度製品である。ステビア葉に含まれているレバウジオシドＤの含有量は非常に少なく（５％未満である）、抽出によるレバウジオシドＤの製造には、多量のステビア原料が必要となることに加え、レバウジオシドＤを濃縮する工程が煩雑であり、抽出後、複数のカラムパス及び脱塩、脱色、再結晶化が必要であり、製造過程で大量の廃水が発生するため、製造コストが高く、産業的な大量生産には適していない。
【0009】
現在のレバウジオシドＤの生酵素合成法は、高価なＵＤＰ－グルコースを加える必要があり、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＵＧＴと略称する）の作用により、基質としてステビオシド又はレバウジオシドＡを使用して、レバウジオシドＤの生成を触媒する。しかし、ＵＤＰ－グルコースの販売価格が非常に高いため、レバウジオシドＤの産業的製造の実現可能性はほぼ完全に制限されており、経済性が低く、市場競争力が欠如している。
【0010】
レバウジオシドＭ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ、ＲｅｂＭ）はより優れた味覚特性を持っているが、葉の乾燥重量中のその含有量は０．１％未満であるため、分離コストが高く、価格も高い。高濃度のレバウジオシドＭを得る生体触媒法は学者の注目を集めている。現在、ステビア由来の組換え酵素がレバウジオシドＤからレバウジオシドＭへの変換を触媒できることが報告されているが、収率は低い。レバウジオシドＤを基質として用い、微生物の酵素触媒作用によりレバウジオシドＭを得ることができるため、従来の抽出法と比較して、製造プロセスが改善されるだけではなく、環境汚染が軽減され、標的製品レバウジオシドＭの収率を向上する。しかし、現在の生物学的酵素触媒法には主に次のような幾つかの問題がある。（１）生体酵素でレバウジオシドＤを触媒してレバウジオシドＭを製造するコストは高く、酵素触媒収率をさらに最適化する必要がある；（２）触媒に使用される糖転移酵素は製品から分離してリサイクルすることが難しく、失活し易い；（３）天然植物中のレバウジオシドＡの含有量は非常に多いのに対し、レバウジオシドＤの含有量は非常に少なく、レバウジオシドＡを低コストでレバウジオシドＤに直接に変換することも緊急の課題である。
【0011】
グルコシルトランスフェラーゼは、酵素反応においてグルコシルのみを転移させる酵素であり、当該酵素の作用機序は、グリコシル供与体のグルコース残基の糖受容体分子への転移を触媒し、それによって受容体分子の活性を調節することである。
【0012】
「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」とは、核酸塩基（即ち、窒素含有塩基）及び五炭糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）を含むグリコシルアミン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｅｓ）を指す。ヌクレオチドの非限定的な実施例は、シチジン（ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、及びイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）を含む。
【0013】
「ヌクレオチド二リン酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」は、核酸塩基（即ち、窒素含有塩基）、五炭糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）、及び二リン酸（即ち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。「ヌクレオチド二リン酸」を「ＮＤＰ」と略してもよい。ヌクレオチド二リン酸の非限定的な実施例は、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、及びイノシン二リン酸（ＩＤＰ）を含む。
【0014】
ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－グルコースをグリコシル供与体とするグルコシルトランスフェラーゼの一種で、ほぼすべての生物に存在する。ＵＤＰ－グルコースはウリジン二リン酸グルコース（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ）の略称であり、ＵＤＰ－グルコース又はＵＤＰＧとも呼ばれ、ウリジン二リン酸とブドウ糖から構成されるビタミンであり、「活性ブドウ糖」とみなすことができ、植物、動物、及び微生物の細胞内に広く分布し、スクロース、デンプン、グリコーゲン、及びその他のオリゴ糖や多糖の合成における最も一般的なグリコシル供与体である。ＵＤＰ－グルコースに加えて、ＡＤＰ－グルコース、ＴＤＰ－グルコース、ｄＴＤＰ－グルコース（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ）、ＣＤＰ－グルコース、ＩＤＰ－グルコース又はＧＤＰ－グルコース等もグリコシル供与体化合物として一般的に使用される。これらのグリコシル供与体は高価であり、産業生産には適していない。
【0015】
クロースシンターゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳＵＳ、ＳｕＳｙ／ＳＳ等でも略称、ＥＣ２．４．１．１３）は、ＮＤＰ－グルコース＋Ｄ－フルクトースからＮＤＰとスクロースへの化学反応を可逆的に触媒し、糖転移酵素-４サブファミリーに属し、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）胚芽で最初に同定された。各タンパク質は四量体として存在する。各サブユニットの分子量は約９０ｋＤａである。遺伝子のサイズは一般に５．９ｋｂであり、ｃＤＮＡのサイズは約２．７ｋｂである。コードされたアミノ酸配列の全長は約８００個のアミノ酸残基（Ｒｏｓｓ及びＤａｖｉｅｓ １９９２）である。スクロースシンターゼはＮＤＰに対して異なる親和性を持っており、親和性の大きさは順次にＵＤＰ＞ＡＤＰ＞ｄＴＤＰ＞ＣＤＰ＞ＧＤＰである。
【0016】
Ｏｈｔａら（Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．， ５７，１９９～２０９ （２０１０））は、ステビアの葉からレバウジオシドＩ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｉ、Ｒｅｂ Ｉ、ＲＩ）の単離を最初に報告した。Ｉｎｄｒａ Ｐｒａｋａｓｈら（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４， １９， １７３４５－１７３５５）は、ＲＡを原材料とし、グルコースシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１の突然変異体ＵＧＴ７６Ｇ１－Ｒ１１－Ｆ１２を用いてＲＩを製造する生合成法を最初に報道し、この方法は、グリコシル供与体としてＵＤＰ－グルコースを使用し、３０℃の振とうフラスコ内で、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ２の条件下で反応させ、ＲＩ収率は２２．５％であった。Ｉｎｄｒａ Ｐｒａｋａｓｈが発明者である特許出願ＣＮ１０６７９５５２３Ａは、グルコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＲ０６９１２．１を開示し、ＤＮＡ配列を開示した。ＣＮ１１０９１４４４５ＡはＲＡを原材料としたＲＩの製造を触媒するグルコースシルトランスフェラーゼＵＧＴ７６Ｇ１の突然変異体をスクリーニングし、スクリーニング条件はｐＨ７．０、１０．３ｍＭのＭｇＣｌ２、３５℃の温度であった。ＣＮ１０６７９５５２３Ａは、ＲＩの甘味度及びＲＩを含む組成物を報告した。上記先行技術には、ＲＡからＲＩへの合成を触媒する活性を有するグルコシルトランスフェラーゼ又はその突然変異体が開示されているのみであり、これらの酵素は活性が低く、産業生産には適していない。
【0017】
現在、天然甘味料ステビアの広範な使用、及び生体触媒技術の発展に伴い、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼはステビオール配糖体の生体触媒製造の分野でますます使用されている。ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼには多くの種類があり、現在ステビオール配糖体の生酵素的製造分野で使用されている酵素のほとんどは植物細胞由来の野生型酵素であり、この種の野生酵素は、酵素活性が低い、安定性が低いなどの欠点があることが多く、ステビオール配糖体の産業生産のコストは高くなっている。従って、産業化生産により良いサービスを提供するために、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼを改変して、より高い酵素活性とより良好な安定性を備えた改変酵素を製造する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明が解決しようとする技術的課題は、既存のＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼが、ステビオール配糖体の生体触媒の製造に使用される場合に酵素活性が低く、安定性が低いため、ステビオール配糖体の触媒として使用すると転換率が低い欠点であるり、従って、本発明は、糖転移酵素（即ち、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ）、及びステビオール配糖体の製造におけるその使用を提供する。本発明の糖転移酵素（ＧＴ）は、酵素活性が高く、安定性も良好であり；ここで、スクロースとＵＤＰ（及び／又はＡＤＰ）はＳＵＳの触媒作用によりＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）を生成し、それによりＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）の再生を実現して、グリコシル供与体ＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）のコストが高い問題を解決し；ステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、又はレバウジオシドＩ）の製造に使用すると、親糖転移酵素と比較して触媒活性が大幅に向上し、転換率が有意に向上するため、反応コストが削減され、大規模な産業生産を実現するためにプロセス条件を最適化したより多くのオプションを提供し、産業生産に有利である。
【課題を解決するための手段】
【0019】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、配列番号１１２に示されるか、又は配列番号１１２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に示される糖転移酵素を提供する。
【0020】
好ましくは、前記「配列番号１１２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列」は、配列番号１１２と比較して、下記から選択される１つ又は複数の残基位置でのアミノ酸残基が違うことである。
Ｖ１４Ｉ；
Ｅ９９Ｌ；
Ｔ２５４Ｇ；
Ｌ２５７Ａ；
Ｑ４５１Ｅ；
Ｑ２６５Ｅ；
Ｐ２７１Ａ；
Ｒ３３３Ｋ；
Ｒ１２Ｑ；
Ａ１１８Ｓ；
Ｅ４１８Ｄ；
Ｓ４５５Ｒ。
Ｖ１４Ｉ；
Ｅ９９Ｌ；
Ｔ２５４Ｇ；
Ｌ２５７Ａ；
Ｑ４５１Ｅ；
Ｑ２６５Ｅ；
Ｐ２７１Ａ；
Ｒ３３３Ｋ；
Ｒ１２Ｑ；
Ａ１１８Ｓ；
Ｅ４１８Ｄ；
Ｓ４５５Ｒ。
【0021】
より好ましくは、上記に基加え、配列番号１１２と比較して、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、下記から選択される残基位置でのアミノ酸残基の違いをさらに含み得る：Ｋ３４７Ｐ。
【0022】
ある好ましい実施形態においては、配列番号１１２と比較して、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、下記から選択される残基位置でのアミノ酸残基の違いを含む：Ｖ１４Ｉ、Ｅ９９Ｌ、Ｔ２５４Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｑ４５１Ｅ、Ｑ２６５Ｅ、Ｐ２７１Ａ、Ｒ３３３Ｋ、Ｒ１２Ｑ、Ａ１１８Ｓ、Ｅ４１８Ｄ又はＳ４５５Ｒ。
【0023】
ある好ましい実施形態において、配列番号１１２と比較して、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、下記の二つから選択される残基位置でのアミノ酸残基の違いをさらに含む：Ｑ２６５Ｅ及びＰ２７１Ａ。
【0024】
ある好ましい実施形態において、配列番号１１２と比較して、前記糖転移酵素のアミノ酸配列は、下記の二つから選択される残基位置でのアミノ酸残基の違いをさらに含む：Ｒ３３３Ｋ及びＫ３４７Ｐ。
【0025】
好ましい実施形態において、前記糖転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、下記の配列から選択され得る：配列番号４１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０７及び配列番号１０８。
【0026】
幾つかの実施形態において、糖転移酵素のアミノ酸配列は、上記の特定の位置以外の位置でさらに１－２、１－３、１－４、１－５、１－６、１－７、１－８、１－９、１－１０、１－１１、１－１２、１－１３、１－１４、１－１５、１－１６、１－１７、１－１８、１－１９、１－２０個のアミノ酸残基の違いを含み得；これらの残基の違いには保存的アミノ酸残基による置換が含まれる。一般に、これらの置換は糖転移酵素の酵素活性に影響を与えない。
【0027】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、上記の糖転移酵素をコードする単離された核酸を提供する。
【0028】
好ましくは、前記核酸のヌクレオチド配列は下記の配列から選択され得る：配列番号４１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０７及び配列番号１０８。
【0029】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、上記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0030】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、上記核酸又は上記組換え発現ベクターを含む宿主細胞である形質転換体を提供する。
【0031】
前記宿主細胞は当技術分野の通常なものであってもよく、好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
【0032】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、前記糖転移酵素の発現に適した条件下で前記形質転換体を培養することを含む、上記糖転移酵素の製造方法を提供する。
【0033】
前記形質転換体が糖転移酵素を発現した後、例えば、粗酵素液を製造し、粗酵素液を製造した後通常の濃縮、置換を実行してもよく、また、粗酵素液を、さらにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及びモレキュラーシーブクロマトグラフィー等の精製工程の一つ又は複数を経て前記糖転移酵素を精製する等、当技術分野で一般的に使用される技術的手段で抽出することができる。ある一つの好ましい実施形態において、下記のステップを使用することができる：（１）前記糖転移酵素を含む形質転換体を抗生物質を含む培地例えばＬＢ培地に植菌し、振とう培養して種液を得る；（２）（１）の種液を抗生物質を含む培地例えばＴＢ培地に移し、振とう培養する；（３）（２）の培地にＩＰＴＧを加えて一晩誘導させ、遠心分離した後菌体を収集する；（４）（３）で収集した菌体を洗浄、再懸濁させ、破砕した後、遠心分離して前記糖転移酵素を含む粗酵素液を得る。
【0034】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は、上記の糖転移酵素を含む組成物を提供する。前記組成物は、例えば、酵素製剤の形態で存在してもよい。
【0035】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、基質のグリコシル化に用いられる方法を提供し、この方法は、前記糖転移酵素等の少なくとも１つの基質を提供し、前記基質がグリコシル化されて少なくとも１つのグリコシル化産物を生成させるような条件下で、前記基質と前記糖転移酵素とを接触させることを含み；前記基質は、好ましくは、ステビオシド、レバウジオシドＡ又はレバウジオシドＤなどの少なくとも１つのステビオール配糖体を含む。
【0036】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、下記の工程を含む、レバウジオシドＡの製造方法を提供する：前記糖転移酵素の存在下で、ステビオシド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）とグリコシル供与体とを反応させて（例えば、ステビオシドがグリコシル化されてレバウジオシドＡを生成させる条件下である）、レバウジオシドＡを得る。
【0037】
好ましくは、前記糖転移酵素は、糖転移酵素細菌スラリーの形態で存在する。
【0038】
好ましくは、前記ステビオシドの濃度は１～１５０ｇ／Ｌであり、好ましくは１００ｇ／Ｌである。
【0039】
好ましくは、前記グリコシル供与体とステビオシドのモル比は、１：１～５：１であり、例えば２．５：１である。
【0040】
好ましくは、前記グリコシル供与体はＵＤＰ－グルコースである。ある一つの好ましい実施形態において、使用されるグリコシル供与体は、スクロースシンターゼの存在下でスクロースとＵＤＰとで製造されることが好ましく、前記スクロースの濃度は、好ましくは１００～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌであるり、前記ＵＤＰの濃度は好ましくは０．０５～０．２ｇ／Ｌであり、例えば０．１ｇ／Ｌである。シンターゼ（例えば、スクロースシンターゼ又はトレハロースシンターゼ）は一般に反対方向に作用して、ヌクレオチド二リン酸とグルコース供与体（例えば、スクロース、トレハロース、又はデンプンなど）でヌクレオチド二リン酸グルコース化合物を形成させる。本発明において、前記スクロースシンターゼ（スクロースシンターゼとも呼ばれ、Ｓｕｃｒｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＳｕＳｙ又はＳＵＳと略される）は可逆的なグルコースシル転移反応を触媒し、スクロースシンターゼがスクロースとＵＤＰを触媒することによりＵＤＰ－グルコースを生成させ、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼにＵＤＰ－グリコシル供与体を効果的に提供する。スクロース合成酵素とＵＤＰ－糖転移酵素によって構築される反応系において、ＵＤＰサイクルが生成され、ＵＤＰ－グルコースの再生を実現し、高価なＵＤＰグルコースの直接使用を避けることで、生産コストを削減する。
【0041】
好ましくは、前記反応のための反応溶媒のｐＨは５～８であり、好ましくは６である。
【0042】
好ましくは、前記反応時の回転速度は５００～１０００ｒｐｍであり、好ましくは６００ｒｐｍである。
【0043】
好ましくは、前記反応の反応系の温度は２０～９０℃であり、好ましくは６０℃である。
【0044】
上記の技術的問題を解決するために、本発明は、上記の製造方法によりレバウジオシドＡを製造するステップを含む、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭの製造方法を提供する。
【0045】
ある一つの好ましい実施形態において、前記方法は、ステビオシド基質、グリコシル供与体、及び前記糖転移酵素を提供し、ステビオシド基質、グリコシル供与体及び糖転移酵素を、レバウジオシドＤ又はレバウジオシドＭを生成させる条件下で反応させることを含む。
【0046】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、前述の通りである糖転移酵素の存在下でレバウジオシドＡとグリコシル供与体とを反応させるレバウジオシドＩの製造方法を提供する。
【0047】
前記製造方法において、前記糖転移酵素は、糖転移酵素菌、粗酵素液、純粋酵素、純粋酵素液、又は固定化酵素の形態で存在する。
【0048】
前記製造方法において、前記グリコシル供与体は、ＵＤＰ－グルコース及び／又はＡＤＰ－グルコースである。
【0049】
前記製造方法において、前記レバウジオシドＡの濃度は、好ましくは１～１５０ｇ／Ｌであり、例えば１００ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌである。
【0050】
前記製造方法において、前記糖転移酵素菌とレバウジオシドＡとの質量比は、好ましくは、１：（３～１０）であり、例えば３：２０、１：５、１：８である。
【0051】
前記製造方法において、前記反応に用いされる反応溶媒のｐＨは、好ましくは５～８であり、より好ましくは５．５～６である。
【0052】
前記製造方法において、前記反応の反応系の温度は、好ましくは２０～９０℃であり、例えば６０℃、３０℃、５０℃、７０℃である。
【0053】
前記製造方法において、前記反応の反応系の反応時間は、好ましくは５～３０時間であり、例えば、２４時間、１０時間、１５時間、２０時間、２８時間である。
【0054】
前記製造方法において、前記グリコシル供与体は、スクロース及びスクロースシンターゼの存在下で、ＵＤＰ及び／又はＡＤＰにより製造されることが好ましい。
【0055】
前記スクロースの濃度は、好ましくは１００～３００ｇ／Ｌであり、例えば２００ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌである。
【0056】
前記ＵＤＰ又は前記ＡＤＰの濃度は、好ましくは０．０５～０．２ｇ／Ｌであり、例えば０．１ｇ／Ｌである。
【0057】
前記製造方法において、前記ｐＨは好ましくは緩衝液で制御し、前記緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液である。
【0058】
前記製造方法において、前記反応の回転速度は、好ましくは５００～１０００ｒｐｍであり、例えば６００ｒｐｍ、８００ｒｐｍである。
【0059】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、ステビオール配糖体の製造における前記糖転移酵素の使用を提供し；前記ステビオール配糖体は、好ましくは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、又はレバウジオシドＩである。
【0060】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、前述の通りである糖転移酵素及び配列が配列番号３２に示された通りであるスクロースシンターゼを含む触媒酵素組成物を提供する。
【0061】
前記触媒酵素組成物において、前記糖転移酵素とスクロースシンターゼの質量比は、好ましくは（２～１０）：１であり、例えば５：１、３：１、８：１である。
【0062】
上記技術的問題を解決するために、本発明は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ又はレバウジオシドＩの製造における前記触媒酵素組成物の使用を提供する。
【0063】
本発明において、前記ステビオール配糖体（Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）はステビオールグリコサイドとも呼ばれ、その構造式と含まれる化合物の種類の詳細については、本発明の背景技術部分を参照されたい。
【発明の効果】
【0064】
本発明の積極的な進歩効果は次の通りである。
本発明の糖転移酵素（ＧＴ）は、酵素活性が高く、安定性も良好であり；ステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、又はレバウジオシドＩなど）の製造に使用すると、親糖転移酵素と比較して触媒活性が大幅に向上し、転換率が大幅に向上し、グリコシル供与体ＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）の価格が高い問題を解決して、反応コストが削減され、大規模な産業生産を実現するためにプロセス条件を最適化したより多くのオプションを提供し、産業生産に有利である。
本発明の糖転移酵素（ＧＴ）は、酵素活性が高く、安定性も良好であり；ステビオール配糖体（例えば、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、又はレバウジオシドＩなど）の製造に使用すると、親糖転移酵素と比較して触媒活性が大幅に向上し、転換率が大幅に向上し、グリコシル供与体ＵＤＰＧ（及び／又はＡＤＰＧ）の価格が高い問題を解決して、反応コストが削減され、大規模な産業生産を実現するためにプロセス条件を最適化したより多くのオプションを提供し、産業生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】本発明の実施例１～７におけるステビオシドからレバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭを製造する経路の模式図である。
【図2】本発明の実施例１～７の酵素触媒の反応系によりレバウジオシドＡを合成し、生体触媒反応におけるＵＤＰＧのリサイクルを実現する図である。
【図3】実施例１～７の第２ラウンドのスクリーニングで使用した基質ステビオシドのスペクトルであり、ステビオシドの保持時間は１２．７６分である。
【図4】実施例１～７における生成物レバウジオシドＡ対照品のスペクトルであり、保持時間は１２．３８分である。
【図5】表１０における、ＲＡ合成のＥｎｚ．１１の触媒活性の再スクリーニングのＨＰＬＣチャートである。
【図6】表１０における、ＲＡ合成のＥｎｚ．２４の触媒活性の再スクリーニングのＨＰＬＣチャートである。
【図7】ステビオシドからレバウジオシドＡ及びレバウジオシドＩを製造する合成経路である。
【図8】実施例８～１１のＨＰＬＣ検出法を使用した、レバウジオシドＡ対照品のスペクトルである。
【図9】実施例８～１１のＨＰＬＣ検出法を使用した、レバウジオシドＩ対照品のスペクトルである。
【図10】実施例１１の８時間反応したＨＰＬＣパターンである。
【図11】実施例１１の２４時間反応したＨＰＬＣパターンである。
【発明を実施するための形態】
【0066】
以下、実施例によって本出願を具体的に説明するが、本発明に不利な制限を意味するものではない。下記の実施例において具体的な条件を示していない実験方法は、一般的方法及び条件、又は商品の説明書に従って選択されるべきである。
【0067】
本発明における実験方法は、特に説明されていない限り、いずれも一般的な方法であり、具体的な遺伝子クローニング操作については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編「分子クローニング実験ガイド」を参照されたい。
【0068】
本発明におけるアミノ酸の略号は、特に説明されていない限りいずれも本技術分野における一般的なものであり、具体的に略号に対応するアミノ酸は表１に示された通りである。
【0069】
【表1】
【0070】
前記アミノ酸の対応するコドンも本技術分野における一般的なものであり、具体的に、アミノ酸とコドンとの対応関係は表２に示された通りである。
【0071】
【表2】
【0072】
ＫＯＤ Ｍｉｘ酵素はＴＯＹＯＢＯ ＣＯ．，ＬＴＤ．，から購入し、ＤｐｎＩ酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（上海）から購入し；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ１０コンピテントセルはＧｅｎｖｉｅｗから購入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルはＧｅｎｖｉｅｗから購入た。スクロースはＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）から購入した。実施例１～７の第一ラウンドのスクリーニングで使用した反応基質及び実施例８～１１のＲＡ６０（ステビオシド、その中でＲＡの含有量は６０％であり、ステビオシドの含有量は約３０％である）は、製品仕様ＴＳＧ９０／ＲＡ６０であり、Ｃｈｅｎｇｕａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。第二ラウンドのスクリーニングで使用した反応基質であるステビオシドは、Ｂｉｄｅ Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈから購入した（純度：９５％）。ＲｅｂＡ及びＲｅｂＩ対照品はＭｃＬｅａｎから購入した。
【0073】
実施例１～７における転換率のＨＰＬＣ検出法：クロマトグラフィーカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ ５ ＴＣ－Ｃ１８（２）（２５０×４．６ｍｍ）。移動相：０．１％のＦＡ水溶液を移動相Ａとし、０．１％のＦＡアセトニトリル溶液を移動相Ｂとし、下記の表３に従って勾配溶出を実行した。検出波長：２１０ｎｍ、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、注入量：２０μｌ、カラム温度：４０℃。ステビオシドのピーク時間：１２．７６分、ＲｅｂＡのピーク時間：１２．３８分。
【0074】
【表3】
【0075】
実施例８～１１における転換率のＨＰＬＣ検出法：ＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ１８ （４．６ｍｍ＊１５０ｍｍ，３．５ｕｍ）。移動相：０．１％のＴＦＡ水溶液を移動相Ａとし、０．１％のＴＦＡアセトニトリル溶液を移動相Ｂとし、下記の表４に従って勾配溶出を実行した。検出波長：２１０ｎｍ、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、注入量：２０μｌ、カラム温度：３５℃。図８に示されるように、ＲｅｂＡのピーク時間：１４．５０４分であり、図９に示されるように、ＲｅｂＩのピーク時間：１４．２１６分であった。
【0076】
【表4】
【0077】
実施例１～７では、主にＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼの親Ｅｎｚ．１を鋳型として使用したが、第一ラウンドのスクリーニングでは、３０８位がＮに突然変異した糖転移酵素突然変異体Ｅｎｚ．１１をスクリーニングし、第二ラウンドのスクリーニングはＥｎｚ．１１を鋳型としてスクリーニングし、２箇所又は３箇所の突然変異を有するＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼをスクリーニングした。
【0078】
実施例１ 第一ラウンドのＧＴ０１０－３０８突然変異体ライブラリーの構築
配列番号１に示される番号がＥｎｚ．１であるβ－１，３－糖転移酵素（β－１，３－ＧＴａｓｅ）酵素遺伝子を完全に合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＧＴ０１０を得、遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。Ｅｎｚ．１のアミノ酸配列は配列番号２に示された通りである。
配列番号１に示される番号がＥｎｚ．１であるβ－１，３－糖転移酵素（β－１，３－ＧＴａｓｅ）酵素遺伝子を完全に合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＧＴ０１０を得、遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。Ｅｎｚ．１のアミノ酸配列は配列番号２に示された通りである。
【0079】
ｐＥＴ２８ａ－ＧＴ０１０プラスミドを鋳型として使用し、表５に示されるプライマー配列を使用し、ＧＴ０１０－Ｌ３０８Ｘ－Ｆ／ＥＴ－Ｒ及びＥＴ－Ｆ／ＧＴ０１０－Ｌ３０８Ｘ－Ｒをそれぞれプライマー（ここで、Ｘは：Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｗである）として使用し、ＫＯＤ酵素を使用してＰＣＲを実行し、標的ＤＮＡフラグメントとベクターフラグメントを増幅させた。
【0080】
【表5】
【0081】
ＰＣＲ増幅反応系：
【表6】
【0082】
増幅手順は下記の通りである：
【表7】
【0083】
ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化させ、ゲル電気泳動とゲル回収を実行して標的ＤＮＡフラグメントを得た。ヴァザイムの２つのフラグメント相同リコンビナーゼ(Exnase II)を介てライゲーションを実行した。ライゲーション後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ１０コンピテントセルに形質転換させ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に散布し、３７℃で一晩培養し；コロニーを選択して培養し、配列決定を実行して突然変異遺伝子を含む組換えプラスミドを得た。
【0084】
実施例２ ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の製造
１．突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
正しい配列を有する上記の組換えプラスミドを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、点突然変異を含む遺伝子操作株を得た。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体（即ち、菌体スラリー）を回収した。後で使用するために－２０℃で保管した。
１．突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
正しい配列を有する上記の組換えプラスミドを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、点突然変異を含む遺伝子操作株を得た。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体（即ち、菌体スラリー）を回収した。後で使用するために－２０℃で保管した。
【0085】
２．粗酵素液の製造：
５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られた菌体スラリーを（Ｍ／Ｖ）１：５で懸濁し、ホモジナイズして粗酵素液を得、粗酵素液を遠心分離し、上清を採取してＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の粗酵素液を得た。
５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られた菌体スラリーを（Ｍ／Ｖ）１：５で懸濁し、ホモジナイズして粗酵素液を得、粗酵素液を遠心分離し、上清を採取してＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の粗酵素液を得た。
【0086】
実施例３ スクロースシンターゼＳＵＳの製造
配列番号３１に示される番号がＥｎｚ．２であるスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）遺伝子を完全に合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＳＵＳを得た。遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。スクロースシンターゼのアミノ酸配列は配列番号３２に示された通りである。
配列番号３１に示される番号がＥｎｚ．２であるスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）遺伝子を完全に合成し、当該遺伝子をｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＳＵＳを得た。遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。スクロースシンターゼのアミノ酸配列は配列番号３２に示された通りである。
【0087】
プラスミドｐＥＴ２８ａ－ＳＵＳを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、Ｅｎｚ．２遺伝子組換え細胞株を得た。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培養液を１００００ｒｐｍで１０分間（実施例４～７の場合）、或いは４０００ｒｐｍで２０分間（実施例８～１１の場合）遠心分離し、上清を捨て、菌体を収集した。後で使用するために－２０℃で保管した。
【0088】
実施例４～７の場合、５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られたＥｎｚ．２菌体スラリーを（Ｍ／Ｖ）１：５で懸濁させ、ホモジナイズして粗酵素液を得、粗酵素液を遠心分離し、上清を取ってスクロースシンターゼＳＵＳ（酵素番号はＥｎｚ．２であり、アミノ酸配列は配列番号３２に示される）の粗酵素液を得た。
【0089】
実施例８～１１の場合、５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られた細菌スラリーを１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させ、その後、高圧ホモジナイズ（５５０Ｍｂａｒ、１．５分間）し、次に、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離してスクロースシンターゼ反応酵素液を得た。
【0090】
実施例４ 第一ラウンドの突然変異体のスクリーニング
実施例２及び実施例３で得られた粗酵素液をそれぞれ８０℃の恒温で２０分間培養し、上清を遠心分離して、それぞれＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体反応酵素液及びスクロースシンターゼ反応酵素液を得た。
実施例２及び実施例３で得られた粗酵素液をそれぞれ８０℃の恒温で２０分間培養し、上清を遠心分離して、それぞれＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体反応酵素液及びスクロースシンターゼ反応酵素液を得た。
【0091】
ＲＡ６０を基質として使用し、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の反応酵素液１５０μＬを１ｍＬ反応系に加え、ＲＡ６０の最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、ＵＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ反応酵素溶液は３０μＬであり、最後に最終の緩衝液の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。調製した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで６０分間反応させ、反応液を５０倍に希釈し、ＨＰＬＣによりＲｅｂＡの濃度を分析した（詳細は表６のＲｅｂＡ％を参照する）。（スクロースシンターゼは、スクロースのグルコシルをＵＤＰに転移してＵＤＰＧを合成するために使用される。）。予備スクリーニングの結果は表６に示された通りである。
【0092】
【表8】
【0093】
表６の予備スクリーニング結果から、Ｅｎｚ．１よりＥｎｚ．１１が良い触媒効果を有し、ＲｅｂＡの収率がより高いことが分かった。
【0094】
２．再スクリーニング
ＢｏｉｌとＵｎＢｏｉｌの２つの反応条件を使用して再スクリーニングし、Ｂｏｉｌ再スクリーニングの反応条件は予備スクリーニングの反応条件と同じで、ＵｎＢｏｉｌとは加熱なしで反応することを指し、その他の反応条件はＢｏｉｌ反応条件と同じである。再スクリーニング結果は表７に示された通りである（表の％値は反応液中のＲｅｂＡ含有量に相当する）。
ＢｏｉｌとＵｎＢｏｉｌの２つの反応条件を使用して再スクリーニングし、Ｂｏｉｌ再スクリーニングの反応条件は予備スクリーニングの反応条件と同じで、ＵｎＢｏｉｌとは加熱なしで反応することを指し、その他の反応条件はＢｏｉｌ反応条件と同じである。再スクリーニング結果は表７に示された通りである（表の％値は反応液中のＲｅｂＡ含有量に相当する）。
【0095】
【表9】
【0096】
表７の再スクリーニング結果から、Ｅｎｚ．１よりＥｎｚ．１１が効果が高く、その反応効果はＥｎｚ．１に相当することが分かる。
【0097】
実施例５ 第二ラウンドの突然変異体ライブラリーの構築
第一ラウンドで得られた糖転移酵素（β－１，３－ＧＴａｓｅ）Ｅｎｚ．１１をコードする遺伝子をベクターｐＥＴ２８ａに結合させて、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１１組換えプラスミドを得、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１１を鋳型として、表８に示されるプライマー配列を使用し、ＫＯＤ酵素でＰＣＲ増幅を実行して、標的突然変異体Ｅｎｚ．１６～Ｅｎｚ．３４の遺伝子フラグメント及びベクターフラグメントを得た。
第一ラウンドで得られた糖転移酵素（β－１，３－ＧＴａｓｅ）Ｅｎｚ．１１をコードする遺伝子をベクターｐＥＴ２８ａに結合させて、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１１組換えプラスミドを得、ｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１１を鋳型として、表８に示されるプライマー配列を使用し、ＫＯＤ酵素でＰＣＲ増幅を実行して、標的突然変異体Ｅｎｚ．１６～Ｅｎｚ．３４の遺伝子フラグメント及びベクターフラグメントを得た。
【0098】
ｐＥＴ２８ａ～Ｅｎｚ．３４プラスミドを鋳型とし、ＧＴ０２９－Ｌ３７８Ｇ－Ｆ／Ｋｍ－Ｒ及びＫｍ－Ｆ／ＧＴ０２９－Ｌ３７８Ｇ－Ｒをプライマー配列として使用して、ＰＣＲにより標的突然変異体Ｅｎｚ．３５の遺伝子フラグメント及びベクターフラグメントを増幅させた。
【0099】
【表10】
【0100】
【表11】
【0101】
ＰＣＲ増幅反応系は表９－１に示される通りである。
【表12】
【0102】
増幅手順は下記の表９－２に示される通りである。
【表13】
【0103】
ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで消化させ、ゲル電気泳動とゲル回収を実行した。ヴァザイムの２つのフラグメント相同リコンビナーゼを使用してライゲーションを実行した。ライゲーションが完了した後、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｒａｎｓ１０コンピテントセルに形質転換させ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地に広げ、３７℃で一晩培養し；コロニーを選択して培養し、配列決定を実行して突然変異遺伝子を含む組換えプラスミドを得た。
【0104】
実施例６ ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の製造
１．突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
実施例５で正確に配列決定された組換えプラスミドを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、点突然変異を含む遺伝子操作株を得た。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体（即ち、菌体スラリー）を収集した。後で使用するために－２０℃で保管した。
１．突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
実施例５で正確に配列決定された組換えプラスミドを宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、点突然変異を含む遺伝子操作株を得た。シングルコロニーを採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、２５℃で２０時間誘導培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体（即ち、菌体スラリー）を収集した。後で使用するために－２０℃で保管した。
【0105】
２．粗酵素液の製造：
５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られた菌体スラリーを（Ｍ／Ｖ）１：１０で懸濁させ、ホモジナイズして粗酵素液を得、粗酵素液を遠心分離し、上清を取っててＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の粗酵素液を得た。後で使用するために－４℃で保管した。
５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を調製し、上記で得られた菌体スラリーを（Ｍ／Ｖ）１：１０で懸濁させ、ホモジナイズして粗酵素液を得、粗酵素液を遠心分離し、上清を取っててＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の粗酵素液を得た。後で使用するために－４℃で保管した。
【0106】
実施例７ 第二ラウンドの突然変異体のスクリーニング
１．予備スクリーニング
実施例６及び実施例２で得られた粗酵素液をそれぞれ８０℃の恒温で１５分間培養し、上清を遠心分離して、それぞれＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ反応酵素液及びスクロースシンターゼ反応酵素液を得た。
１．予備スクリーニング
実施例６及び実施例２で得られた粗酵素液をそれぞれ８０℃の恒温で１５分間培養し、上清を遠心分離して、それぞれＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ反応酵素液及びスクロースシンターゼ反応酵素液を得た。
【0107】
ステビオシド（ステビオシド含有率：９５％、バイド製薬社）を基質とし、ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の反応酵素液１５０μＬを１ｍＬの反応系に加え、ステビオシドの最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、ＵＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、スクロースシンターゼ合成酵素は３０μＬであり、最後に最終の緩衝液の体積が１ｍＬになるまで５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで６０分間反応させた後、５０倍に希釈し、Ｒｅｂ Ａ濃度をＨＰＬＣ分析した。Ｅｎｚ．１及びＥｎｚ．１１を二重対照として使用して、２０個の突然変異体をスクリーニングした。予備スクリーニングの結果は表１０に示された通りである。
【0108】
【表14】
【0109】
表１０の予備スクリーニング結果から、Ｅｎｚ．１７、Ｅｎｚ．１８、Ｅｎｚ．２１、Ｅｎｚ．２２、Ｅｎｚ．２４、Ｅｎｚ．２６、Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２８、Ｅｎｚ．３１、Ｅｎｚ．３２はいずれも対照より１０％以上優れていることが分かり、これらの突然変異体を選択して再スクリーニングした。なお、上記の反応は、粗酵素液を８０℃の恒温で１５分間培養し、上清を遠心分離して反応酵素液を得てから反応を実行することであり、酵素液の安定性が良好であることがわかる。
【0110】
２．再スクリーニング
再スクリーニングの反応条件は予備スクリーニングの反応条件と同じである。再スクリーニングの結果は表１１に示された通りである。
再スクリーニングの反応条件は予備スクリーニングの反応条件と同じである。再スクリーニングの結果は表１１に示された通りである。
【0111】
【表15】
【0112】
表１１の再スクリーニング結果から、Ｅｎｚ．１７、Ｅｎｚ．１８、Ｅｎｚ．２１、Ｅｎｚ．２２、Ｅｎｚ．２４、Ｅｎｚ．２６、Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．２８、Ｅｎｚ．３１、Ｅｎｚ．３２はいずれも親対照より１０％以上優れていることが分かる。ＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼの親Ｅｎｚ．１と比較して、上記で得られたＵＤＰ－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体は触媒活性が大幅に向上した。
【0113】
図１は、本発明の実施例において、ステビオシドからレバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＭを製造する経路の模式図を示す。図２は、本発明の実施例における酵素触媒反応系によりレバウジオシドＡを合成し、生体触媒反応においてＵＤＰＧのリサイクルを実現することを示す。図３は第二ラウンドのスクリーニングで使用した基質ステビオシドのスペクトルであり、保持時間は１２．７６分であった。図４は生成物レバウジオシドＡ対照品のスペクトルであり、保持時間は１２．３８分であった。図５は、表１１における、ＲＡの合成を触媒するＥｎｚ．１１の再スクリーニングのＨＰＬＣチャートである。図５は、表１１における、ＲＡの合成を触媒するＥｎｚ．２４の再スクリーニングのＨＰＬＣチャートである。
【0114】
実施例８～１２の経路の模式図は図７に示された通りである。
【0115】
実施例８ 第一ラウンドのβ－１．３－酵素突然変異体ライブラリーの構築
実施例１のように、配列番号１に示される番号がＥｎｚ．１であるβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧＴａｓｅ）酵素遺伝子を完全に合成し、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１を得、遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。Ｅｎｚ．１のアミノ酸配列は配列番号２に示された通りである。組換えプラスミドを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、トランスアミナーゼＥｎｚ．１遺伝子を含む遺伝子操作された株を得た。
実施例１のように、配列番号１に示される番号がＥｎｚ．１であるβ－１，３－グリコシルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧＴａｓｅ）酵素遺伝子を完全に合成し、ｐＥＴ２８ａプラスミドベクターに連結させて、組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－Ｅｎｚ．１を得、遺伝子合成会社はＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（上海）（Ｎｏ． ６９８， Ｘｉａｎｇｍｉｎ Ｒｏａｄ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ）であった。Ｅｎｚ．１のアミノ酸配列は配列番号２に示された通りである。組換えプラスミドを宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、トランスアミナーゼＥｎｚ．１遺伝子を含む遺伝子操作された株を得た。
【0116】
同じように、表１２におけるＥｎｚ．１遺伝子の部位特異的突然変異誘発により得られたトランスアミナーゼＥｎｚ．２．２～Ｅｎｚ．２．６の遺伝子、及びＥｎｚ．１６、Ｅｎｚ．１９、Ｅｎｚ．２３、Ｅｎｚ．２５、Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．３１、Ｅｎｚ．３２及びＥｎｚ．３５の遺伝子を、部位ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩを酵素で切断し、ベクターｐＥＴ２８ａに接続して、トランスアミナーゼＥｎｚ．２．２～Ｅｎｚ．２．６の遺伝子、及びＥｎｚ．１６、Ｅｎｚ．１９、Ｅｎｚ．２３、Ｅｎｚ．２５、Ｅｎｚ．２７、Ｅｎｚ．３１、Ｅｎｚ．３２及びＥｎｚ．３５の遺伝子をそれぞれ含む組換えプラスミドを得た。各組換えプラスミドをそれぞれ宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換させて、表１２のトランスアミナーゼ遺伝子を含む遺伝子操作された株を得た。
【0117】
【表16】
【0118】
実施例９ β－１．３－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体の製造
突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
実施例８の菌株のシングルコロニーそれぞれを選択して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加え、２５℃で２０時間培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を回収した。後で使用するために－２０℃で保管した。
突然変異ベクターのタンパク質への発現を実行
実施例８の菌株のシングルコロニーそれぞれを選択して、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で４時間振とう培養した。２ｖ／ｖ％の接種量を同じく５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ液体培地に移し、ＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で振とう培養し、最終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加え、２５℃で２０時間培養した。培養終了後、培地を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を回収した。後で使用するために－２０℃で保管した。
【0119】
実施例１０ β－１．３－グルコシルトランスフェラーゼ突然変異体のスクリーニング
反応酵素液の製造：
ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を製造し、上記実施例６及び９で得られた菌体それぞれを１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズ（５５０Ｍｂａｒ、１．５分間）し、ホモジナイズした酵素液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、各β－１，３－糖転移酵素反応酵素液を得た。
反応酵素液の製造：
ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を製造し、上記実施例６及び９で得られた菌体それぞれを１：１０（Ｍ／Ｖ、ｇ／ｍＬ）で懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いてホモジナイズ（５５０Ｍｂａｒ、１．５分間）し、ホモジナイズした酵素液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して、各β－１，３－糖転移酵素反応酵素液を得た。
【0120】
β－１．３－糖転移酵素反応酵素液１５０μＬを１ｍＬの反応系に加え、ＲＡ６０の最終濃度は５０ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、実施例３で製造したスクロースシンターゼ反応酵素液は３０μＬであり、最終的に５０ｍＭのｐＨ６．０リン酸緩衝液を加えて１ｍＬとした。製造した反応系を金属バスに入れ、６０℃、６００ｒｐｍで３０分間反応させ、反応液１０μＬをｐＨ２～３の塩酸９９０μＬに加え、ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析を実施してＲｅｂＩ濃度を分析した。ＨＰＬＣ検出方法を使用して得られた実験結果は表１３に示された通りである。
【0121】
【表17】
【0122】
表１３の予備スクリーニング結果から、Ｅｎｚ．３１が最も高い酵素活性を持っていることがわかり、その後の実験はＥｎｚ．３１を選択して実行した。
【0123】
実施例１１ 酵素Ｅｎｚ．３１によるＲＩ合成の触媒
１ｍＬの反応系に、Ｅｎｚ．３１反応酵素溶液１５０μＬ、スクロースシンターゼ反応酵素溶液３０μＬを加え、ＲＡ６０の最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ．／Ｌであり、最後にＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）を最終体積が１ｍＬになるように加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、それぞれ６０℃、６００ｒｐｍで反応させ、それぞれ１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、２４ｈで反応液１０μＬを取ってｐＨ２～３の塩酸９９０μＬに加え、ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ検出方法を使用して得られた実験結果は表１４に示された通りである。
１ｍＬの反応系に、Ｅｎｚ．３１反応酵素溶液１５０μＬ、スクロースシンターゼ反応酵素溶液３０μＬを加え、ＲＡ６０の最終濃度は１００ｇ／Ｌであり、スクロースの最終濃度は２００ｇ／Ｌであり、ＡＤＰの最終濃度は０．１ｇ．／Ｌであり、最後にＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ５．５）を最終体積が１ｍＬになるように加えた。製造した反応系を金属バスに入れ、それぞれ６０℃、６００ｒｐｍで反応させ、それぞれ１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、２４ｈで反応液１０μＬを取ってｐＨ２～３の塩酸９９０μＬに加え、ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ検出方法を使用して得られた実験結果は表１４に示された通りである。
【0124】
【表18】
【0125】
表１４の反応結果より、８時間反応した後、ＲＩのピーク面積比が７１％に達し、２４時間反応した後、ＲＩのピーク面積比が９７％に達し、ほぼ完全に反応したことが分かる。
【0126】
【0127】
以上、本発明の特定の実施形態について説明したが、当業者であれば、これらは単なる例であり、本発明の原理及び本質から逸脱することなく、これらの実施形態に対して様々な変更や修正を加えることができることを理解されたい。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】