特表 2024-520155 機能強化幹細胞および調節性Ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-21

(54)【発明の名称】機能強化幹細胞および調節性Ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/545 20150101AFI20240514BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240514BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240514BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20240514BHJP

   A61K 35/35 20150101ALI20240514BHJP

   A61K 35/50 20150101ALI20240514BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20240514BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240514BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20240514BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20240514BHJP

【ＦＩ】

A61K35/545

A61P37/08

A61P17/00

A61K35/17

A61P43/00 121

A61K35/15

A61K35/35

A61K35/50

A61K35/51

C12N5/0783

C12N5/077

C12N5/02

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574719

(86)(22)【出願日】2022-05-30

(85)【翻訳文提出日】2023-11-30

(86)【国際出願番号】 KR2022007696

(87)【国際公開番号】W WO2022255759

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】10-2021-0070810

(32)【優先日】2021-06-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521385817

【氏名又は名称】エスシーエム ライフサイエンス カンパニー リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】523453879

【氏名又は名称】テライミューン、リミテッド、ライアビリティー、カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＴＥＲＡＩＭＭＵＮＥ， ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ソン、スンウク

(72)【発明者】

【氏名】キム、シナ

(72)【発明者】

【氏名】ムン、チョンヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ジョンホン

(72)【発明者】

【氏名】ビョン、ナリ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065BB19

4B065BB20

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB58

4C087BB59

4C087BB63

4C087MA17

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB13

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、プライミングされた機能強化幹細胞および調節性Ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物、キットおよびそれを利用したアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療方法に関する。本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αまたはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理された機能強化幹細胞を調節性Ｔ細胞と併用して処理すると、アトピー性皮膚炎患者のＴｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を改善することができ、アトピー性皮膚炎患者の状態をＴｈ１にシフティングできるので、多様なアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療分野において広く活用されてもよい。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項3】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項4】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項３に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項5】

前記幹細胞および調節性Ｔ細胞は併用投与されるものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項6】

前記幹細胞は、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の中間葉幹細胞である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項7】

前記調節性Ｔ細胞は、血液、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の調節性Ｔ細胞である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項8】

前記幹細胞は、ＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）の発現、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現およびＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現からなる群から選択された１種以上が増進されたものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項9】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用キット。

【請求項10】

前記キットは、（ａ）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物と、を含み、前記第１の組成物および第２の組成物は、それぞれ個別容器に入れられた形態、または一つ以上の区画に分けられた一つの容器内に入れられた形態で包装された形態のものであり、前記ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンである、請求項９に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用キット。

【請求項11】

幹細胞プライミング用ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを含む１区画と、
幹細胞を含む２区画と、
調節性Ｔ細胞を含む３区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項12】

前記１区画は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含むものである、請求項１１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項13】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む１区画と、調節性Ｔ細胞を含む２区画と、を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項14】

前記１区画は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含むものである、請求項１３に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項15】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項16】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理されたものである、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項17】

前記第１の組成物は静脈投与用であり、第２の組成物は皮内投与用である、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項18】

１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞をこれを必要とする個体に投与するステップと、
２）調節性Ｔ細胞を前記個体に投与するステップと、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法。

【請求項19】

前記１）ステップの幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがともに処理されたものである、請求項１８に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療方法。

【請求項20】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞と、調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。

【請求項21】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項２０に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プライミングされた機能強化幹細胞および調節性Ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物、キットおよびそれを利用したアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療方法に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞は未分化細胞であって、自己再生を通じて長期間分裂することができ、特定の環境下においては、多様な種類の細胞に分化できる細胞のことを言う。幹細胞は、起源になる組織に応じて胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と成体幹細胞（Ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とに分けられ、胚性幹細胞を利用した治療実験が倫理的な面と腫瘍形成の可能性から難しい点があるのに対し、成体幹細胞は、多様な組織から容易に得られるという長所があることから、多様な疾患の治療に適用しようとする研究が活発に進められている。

【0003】

現在まで多くの化合物免疫抑制剤または抗炎症剤が開発されており、臨床的に最もよく用いられる免疫抑制剤としては、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ、Ｃｉｐｏｌ Ａ）、アザチオプリン（ｉｍｕｒａｎ）、プレドニゾロン（一種のステロイド）がある。前記免疫抑制剤は、抗原刺激から抗体生成に至る過程でマクロファージによる抗原の貪食、リンパ球などによる抗原認識、細胞分裂、Ｔ細胞とＢ細胞の分裂、抗体の生成などの幾つかの過程を阻害することによって、免疫抑制を惹起する。このような薬物は、大部分の抗腫瘍活性を同時に有しており、その理由は、ＤＮＡ障害、ＤＮＡ合成阻止などを媒介にして細胞分裂を阻止するためである。しかし、これに伴う代表的な副作用として、高血圧と腎毒性（腎機能が低下される）があり、その副作用の発生率が高いため、使用時に十分に経過を観察しなければならないなどの問題点がある。その他の副作用として、稀に震え、発作、肝炎、胆汁うっ滞、血中尿酸の増加、筋力の低下、多毛症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）、歯肉肥大（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）などがある。よく用いられる抑制剤のうち、アザチオプリンは、白血球数値の減少、貧血、血小板の減少などの骨髄機能を抑制したりし、膵炎、肝炎、胆汁うっ滞とともに稀に脱毛、発熱などが見られる合併症があり得る。ステロイド製剤の一つのプレドニゾロンは免疫抑制剤の中で一番先に用いられ始めたが、動脈硬化症を促進させるだけでなく、高血圧、胃潰瘍、糖尿、成長阻害、骨粗鬆症、白内障、緑内障などを引き起こすため、注意しなければならない薬物である。従って、安全な免疫抑制剤または抗炎症剤の必要性が台頭している。

【0004】

このような問題点を解決するために、最近、幹細胞を利用した治療法が炎症および免疫疾患の治療のために試みされている。特に、中間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、炎症を抑制させるかまたは調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇｓ）の生成を誘導するかまたは細胞死滅に関与する免疫細胞の死滅を誘導することが知られており、それを利用した多様な治療剤の開発が活発に行われている。

【0005】

しかしながら、幹細胞を利用した多様な臨床試験において、効果の持続性や、長期追跡の結果、生体内の生存割合が極めて低いという問題点が報告されており、幹細胞治療剤を改善するための多様な試みがなされている。例えば、治療効果を高めるために幹細胞に特定遺伝子を挿入するか、幹細胞の機能をブースティングすることができる多様な化学物、ペプチドなどを前処理する方法、培養時の低酸素、温度、光のような刺激条件を追加する方法が試みられるか、幹細胞の生存率を高めるために支持体とともに投与する方法が研究されている。幹細胞の機能強化のための多様な研究のうち遺伝子操作を利用した機能改善方法は効果的であるかもしれないが、導入される遺伝子の安全性などの問題点が指摘される。

【0006】

従って、幹細胞自体に遺伝子を導入して機能を強化するよりは、培養中に多様なプライミング要素の処理によって幹細胞の内在的な機能を強化するための多様な研究が試みられている。

【0007】

一方、我らの体のＴ細胞のうち一つである調節性Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇｓ）は、過多な炎症と免疫反応の発生を自然的に防止する重要な役割を果たし、自己免疫疾患と慢性炎症性疾患が生じると、むしろ調節性Ｔ細胞の機能と数字が顕著に減ることが知られている。アトピー性皮膚炎の発生機序に対しては明確に究明されていないが、個人の遺伝的な要因によって環境のアレルギー抗原に対する不適切なＴｈ２開始反応が原因になることが知られている。Ｔｈ２タイプ細胞は、血清内の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の濃度を増加させ、増加されたＩｇＥによって肥満細胞が活性化されることでアトピー性皮膚炎を発生させる。また、Ｔｈ１タイプ細胞の反応欠陥もまたアトピー性皮膚炎の悪化と関わっていると考えられる。従って、アトピー性皮膚炎の治療のための戦略として、Ｔｈ１とＴｈ２細胞との間の機能的な拮抗作用によってＴｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を調節することで、アトピー性皮膚炎を治療しようとする研究が進められている。最近では、バクテリアＣｐＧモチーフ（ｍｏｔｉｆ）またはトール様受容体９リガンドのような病原体関連分子を利用したＴ補助細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）の分化調節を通じて、Ｔｈ１の反応を促進させＴｈ２の反応を抑制し、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を調節する研究を通じてアトピー性皮膚炎を治療しようとする試みがある。

【0008】

しかしながら、まだこのような不均衡を調節してアトピー性皮膚炎を治療する方法に対しては多くの研究が行われておらず、特に、幹細胞を利用したアトピー性皮膚炎の治療において、Ｔｈ２疾患であるアトピー性皮膚炎患者の状態をＴｈ１にシフティングすることができる治療法については多く報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者は、幹細胞の機能をより強化するために研究していたところ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；を処理すれば、幹細胞のアトピー性皮膚炎の予防または治療効果が顕著に増進できることを確認し、調節性Ｔ細胞を併用して処理する場合、さらに優れたアトピー性皮膚炎の治療効果が示されることを確認し、本発明を完成した。

【0010】

従って、本発明の目的は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；でプライミングされた幹細胞および調節性Ｔ細胞を含むアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療用組成物、キットおよびそれを利用したアトピー性皮膚炎の治療方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

上記のような目的を達成するために、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0012】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記組成物を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用キットを提供する。

【0014】

また、本発明は、幹細胞プライミング用ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを含む１区画と、幹細胞を含む２区画と、調節性Ｔ細胞を含む３区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットを提供する。

【0015】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンを含む１区画と、幹細胞を含む２区画と、調節性Ｔ細胞を含む３区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットを提供する。

【0016】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む１区画と、調節性Ｔ細胞を含む２区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットを提供する。

【0017】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞を含む１区画と、調節性Ｔ細胞を含む２区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットを提供する。

【0018】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物とを含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤を提供する。

【0019】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物とを含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤を提供する。

【0020】

また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を個体に投与するステップと、２）調節性Ｔ細胞を前記個体に投与するステップと、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法を提供する。

【0021】

また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞を個体に投与するステップと、２）調節性Ｔ細胞を前記個体に投与するステップと、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法を提供する。

【0022】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞と、調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。

【0023】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンで処理された幹細胞と、調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。

【発明の効果】

【0024】

本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αまたはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理された機能強化幹細胞を調節性Ｔ細胞と併用して処理すると、アトピー性皮膚炎患者のＴｈ１／Ｔｈ２細胞の不均衡を改善することができ、アトピー性皮膚炎患者の状態をＴｈ１にシフティングすることができるので、多様なアトピー性皮膚炎の予防、改善または治療分野において広く活用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＴＮＦ－αの処理濃度によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（０ｎｇ／ｍＬ））。

【図2】ＩＦＮ－γの処理濃度によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（０ｎｇ／ｍＬ））。

【図3】ＩＦＮ－αの処理濃度によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（０ｎｇ／ｍＬ））。

【図4】表１に示した組成物によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）（０：未処理対照群、１：ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）、２：ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）、３：ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）、４：ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）、５：ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）、６：ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）、７：ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ））。

【図5】表２に示したビタミン単独処理によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（０：未処理対照群、１：ビタミンＡ（１０μｇ／ｍＬ）、２：ビタミンＢ１（５０μｇ／ｍＬ）、３：ビタミンＢ２（５μｇ／ｍＬ）、４：ビタミンＢ３（５０μｇ／ｍＬ）、５：ビタミンＢ５（５０μｇ／ｍＬ）、６：ビタミンＢ６（５０μｇ／ｍＬ）、７：ビタミンＢ１２（５０μｇ／ｍＬ）、８：ビタミンＤ２（１０μｇ／ｍＬ）、９：ビタミンＤ３（１０μｇ／ｍＬ））。

【図6】ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンをそれぞれ追加した表３に示した組成物処理によるＩＤＯとＴＳＧ６の発現増加を確認した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｇｒｏｕｐ １）（０：未処理対照群、１：ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－α、２：実験群１にビタミンＡを添加、３：実験群１にビタミンＢ１を添加、４：実験群１にビタミンＢ２を添加、５：実験群１にビタミンＢ３を添加、６：実験群１にビタミンＢ５を添加、７：実験群１にビタミンＢ６を添加、８：実験群１にビタミンＢ１２を添加、９：実験群１にビタミンＤ２を添加、１０：実験群１にビタミンＤ３を添加）。

【図7】ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンをそれぞれ追加した表３に示した組成物処理によるＩＣＡＭ１とＶＣＡＭの発現増加を確認した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｇｒｏｕｐ １）（０：未処理対照群、１：ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－α、２：実験群１にビタミンＡを添加、３：実験群１にビタミンＢ１を添加、４：実験群１にビタミンＢ２を添加、５：実験群１にビタミンＢ３を添加、６：実験群１にビタミンＢ５を添加、７：実験群１にビタミンＢ６を添加、８：実験群１にビタミンＢ１２を添加、９：実験群１にビタミンＤ２を添加、１０：実験群１にビタミンＤ３を添加）。

【図8】ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ６処理された幹細胞（ｐｃＭＳＣ２）の免疫調節能力を確認するために、ＰＨＡ刺激ＰＢＭＣとｐｃＭＳＣ２または未処理ｃＭＳＣを共培養し、炎症性サイトカインＩＦＮ－γおよび抗炎症性サイトカインＩＬ－１０を確認した結果を示した図である（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｃＭＳＣ、Ｐ１：ＰＨＡで刺激していない、陰性対照群）。

【図9】流動細胞分類器を利用した調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）と非－調節性Ｔ細胞の分類戦略および分類純度（Ｐｕｒｉｔｙ）を示した図である。

【図10】培養１２日目の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）で調節性Ｔ細胞の特性を見せる転写因子Ｆｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現を示した図である。

【図11】培養１２日目の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）から分泌されるＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１７Ａを示した図である。

【図12】アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、ｐｃＭＳＣ２と調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の投与周期および時点に関する模式図を示した図である。

【図13】Ｇ１：Ｎａｉｖｅ、Ｇ２：Ｖｅｈ．（ｆｏｒ ｐｃＭＳＣ２）、Ｇ３：Ｖｅｈ．（ｆｏｒ Ｔｒｅｇｓ）、Ｇ４：ｐｃＭＳＣ２、Ｇ５：Ｔｒｅｇｓ、Ｇ６：ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ（Ｄ４４）の各群に該当する実験物質の投与後、皮膚病弁の変化を確認した結果を示した図である。

【図14】アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｐｃＭＳＣ２）、細胞安定化剤（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｔｒｅｇｓ）、ｐｃＭＳＣ２、Ｔｒｅｇｓ、ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ（Ｄ４４）の投与による血清内の総ＩｇＧ１の生産量の変化をＥＬＩＳＡ分析によって確認した結果を示した図である（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｖｅｈ．）。

【図15】アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｐｃＭＳＣ２）、細胞安定化剤（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｔｒｅｇｓ）、ｐｃＭＳＣ２、Ｔｒｅｇｓ、ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ（Ｄ４４）の投与による総ＩｇＧ１の生産量の変化を統計分析（Ｔ－ｔｅｓｔ）した結果を示した図である。

【図16】アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｐｃＭＳＣ２）、細胞安定化剤（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｔｒｅｇｓ）、ｐｃＭＳＣ２、Ｔｒｅｇｓ、ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ（Ｄ４４）の投与による血清内の総ＩｇＧ２ａの生産量の変化をＥＬＩＳＡ分析によって確認した結果を示した図である（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｖｅｈ．）。

【図17】アトピー性皮膚炎の動物モデルにおいて、ＰＢＳ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｐｃＭＳＣ２）、細胞安定化剤（ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ Ｔｒｅｇｓ）、ｐｃＭＳＣ２、Ｔｒｅｇｓ、ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ（Ｄ４４）の投与による血清内の総ＩｇＧ２ａの生産量の変化を統計分析（Ｔ－ｔｅｓｔ）した結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミン；で処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物に関する。

【0027】

本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミン；で処理されていない幹細胞と比較して、抗炎症作用および免疫調節能が優れているので、アトピー性皮膚炎の予防または治療に有用に活用されてもよく、特に、それを調節性Ｔ細胞と併用して処理すると、アトピー性皮膚炎の治療効果がさらに顕著に改善され得る。

【0028】

本発明におけるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミン；で処理された幹細胞は「プライミングされた幹細胞」または「機能強化された幹細胞」と表示してもよく、「プライミングされた幹細胞」と「機能強化された幹細胞」は互換的に用いられてもよい。プライミングされた幹細胞は、本発明のプライミング因子処理によって幹細胞の免疫調節および炎症調節能が顕著に増加され、優れたアトピー性皮膚炎の治療効果を示す幹細胞を意味する。

【0029】

本発明における「プライミング因子」は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせまたは前記組み合わせにビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含む組み合わせを意味してもよい。

【0030】

前記プライミング因子の組み合わせは、それらの単一成分を幹細胞に処理することと比較してシナジー効果を示すことができ、低い処理濃度でも目的とする幹細胞の機能強化を効果的に誘導してもよい。

【0031】

本発明における「機能強化」は、プライミング因子処理によって幹細胞が有している固有の性質および効果が増進されたことを意味し、特に、好ましくは、アトピー性皮膚炎の予防、改善または治療効果が改善されたことを意味してもよい。

【0032】

具体的に、本発明のプライミングされた幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞であってもよい。より具体的に、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１～３：０．１～３：０．１～３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、好ましくは、１：１：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、さらに好ましくは、１：１：１乃至３（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：１乃至２．５（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬおよび２０ｎｇ／ｍＬの濃度の組み合わせで幹細胞に処理して培養し、幹細胞のアトピー性皮膚炎の治療効果を確認した。

【0033】

また、本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせに加えてビタミンでさらに処理された幹細胞であってもよく、具体的に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがさらに処理された幹細胞であってもよい。ビタミンをさらに含むプライミング因子の組み合わせを幹細胞に処理してプライミングすれば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの処理によって誘導される幹細胞の機能強化がさらに顕著に増進されることができ、アトピー性皮膚炎の予防または治療効果も顕著に増進されることができる。前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６，０００（ｗ／ｖ）の割合で幹細胞に処理されてもよい。より具体的に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ２が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：３００乃至１，０００（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：３００乃至６００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：４００乃至５５０（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：２：５００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよく、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは１：１：０．１乃至３：４，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、さらに具体的な例として、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至５，５００（ｗ／ｖ）の割合、さらに好ましくは、１：１：２：５，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。

【0034】

本発明の一具現例においては、複合処理のための濃度としてＴＮＦ－α １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－γ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－α ２０ｎｇ／ｍＬを選定し、ビタミンＢ２ ５μｇ／ｍＬ、ビタミンＢ３ ５０μｇ／ｍＬ、ビタミンＢ５ ５０μｇ／ｍＬおよびビタミンＢ６ ５０μｇ／ｍＬを選定して幹細胞に処理し、免疫調節および炎症調節機能の強化を確認した。その結果、ビタミンを添加した実験群においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理と比較してＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現増加だけでなく、幹細胞の表面に発現する付着因子であるＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）とＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現が有意に増加されることを確認した。

【0035】

特に、本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンＢ６の組み合わせのプライミング因子処理によってアトピー性皮膚炎の治療効果が増大された幹細胞が製造されてもよいことを確認し、それを「ｐｃＭＳＣ２（Ｐｒｉｍｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２）」と名付けた。

【0036】

本発明における「プライミング処理」または「プライミング因子処理」は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせまたは前記組み合わせにビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含む組み合わせを幹細胞に１２時間乃至３６時間、好ましくは２０時間乃至２５時間にかけて処理し、幹細胞を培養することを意味してもよい。前記培養は、当分野に広く知られた幹細胞の培養培地を制限なく利用してもよい。

【0037】

本発明の薬学的組成物に含まれたＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン処理によって機能が強化されるプライミングされた幹細胞および調節性Ｔ細胞は、それぞれ順次または同時に併用投与されるものであってもよい。

【0038】

本発明におけるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン処理によって機能が強化されるプライミングされた幹細胞は、自己複製能力を有しつつ、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞のことを言い、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）に分類してもよい。前記幹細胞は、目的に応じて適切に制限なく選択されてもよく、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトから由来した公知になっているすべての組織、細胞などの成体細胞から由来してもよく、例えば、脂肪、骨髄、胎盤（または胎盤組織細胞）、または臍帯血由来の中間葉幹細胞であってもよい。また、前記幹細胞はクローナル幹細胞を意味してもよい。

【0039】

本発明のプライミングされた幹細胞は、前記プライミング因子の組み合わせが処理されていない幹細胞と比較して、ＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）の発現、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現およびＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現からなる群から選択された１種以上が増進された幹細胞であってもよく、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の治療効果を示すことができる。

【0040】

本発明において、調節性Ｔ細胞は、血液、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の調節性Ｔ細胞であってもよく、好ましくは、臍帯血由来であってもよく、臍帯血単核細胞からＣＤ４＋細胞のみを選別分離した後、ＣＤ４＋細胞から分離されたものであってもよい。本発明の調節性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５^{＋／ｈｉｇｈ}ＣＤ１２７^ｌｏｗ細胞であってもよい。本発明の調節性Ｔ細胞は分離後にＣＤ３およびＣＤ２８を通じて活性化されてもよく、培養５乃至１０日目にマイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）が処理された同一の供与者由来のＣＤ４－細胞で刺激された調節性Ｔ細胞であってもよい。本発明の調節性Ｔ細胞はこれに制限されるものではなく、分離後５乃至２５日、１０乃至２０日培養された細胞であってもよい。このように培養された調節性Ｔ細胞は体外培養により発生し得る免疫機能の低下なく調節性Ｔ細胞の特性を維持することができる。

【0041】

本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いる適切な担体、賦形剤および希釈制をさらに含んでもよい。また、薬学組成物の製造には固体または液体の製剤用添加物を用いてもよい。製剤用添加物は有機または無機のいずれであってもよい。

【0042】

賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン（ｃｏｒｎ ｓｔａｒｃｈ）、デンプン、タルク、ソルビトール、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素などが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、ゼラチン、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、通常医薬品に添加することが許可されているものであれば、いずれも使用してもよい。それらの錠剤、顆粒剤には、糖衣、ゼラチンコーティング、その他、必要に応じて適宜コーティングすることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加してもよい。

【0043】

本発明の薬学的組成物は、当業界において通常製造されるいかなる剤形で製造されてもよく（例：文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最新版；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ］）、製剤の形態は特に限定されるものではないが、好ましくは外用剤であってもよい。本発明の外用剤には、シート剤、液状塗布剤、噴霧剤、ローション剤、クリーム剤、パップ剤、粉剤、浸透パッド剤、噴霧剤、ゲル剤、パスタ剤、リニメント剤、軟膏剤、エアゾール、粉末剤、懸濁液剤、経皮吸収剤などの通常の外用剤の形態が含まれてもよい。それらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知になっている処方書である文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ］に記述されている。

【0044】

本発明の薬学的有効量は、患者の傷の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などによって変わり得る。使用量は、特に限定されないが、通常、本発明の薬学組成物の１日有効量を患者に適用するとき、０．００００１乃至１００００μｇであってもよい。前記１日量は、１日に１回、または適当な間隔をおいて１日に２～３回に分けて投与してもよく、数日間隔で間欠投与してもよい。本発明の幹細胞治療剤の投与量は、好ましくは１日あたり１×１０^２～１×１０^１２細胞／ｋｇであってもよい。

【0045】

しかし、本発明の薬学的組成物の前記使用量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度、傷の種類、適用部位、処理回数、処理時間、剤形、患者の状態、補助剤の種類などの様々な関連因子に照らして決定されるものであるので、前記有効量は、いかなる側面においても本発明の範囲を制限するものと理解されてはならない。

【0046】

また、本発明は、前記薬学的組成物を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用キットに関する。

【0047】

本発明のキットは、（ａ）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物と、を含み、前記第１の組成物および第２の組成物は、それぞれ個別容器に入れられた形態、または一つ以上の区画に分けられた一つの容器内に入れられた形態で包装された形態のものであり、前記ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンであることを特徴としてもよい。

【0048】

また、本発明は、幹細胞プライミング用ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；を含む１区画と、幹細胞を含む２区画と、調節性Ｔ細胞を含む３区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットに関する。

【0049】

アトピー性皮膚炎の治療のために、先ず、１区画の幹細胞プライミング用ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；を２区画の幹細胞に処理して機能強化された幹細胞を製造してもよく、これをまた３区画の調節性Ｔ細胞とともに同時にまたは順次に併用投与してアトピー性皮膚炎を予防または治療してもよい。

【0050】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を含む１区画と、調節性Ｔ細胞を含む２区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キットに関する。

【0051】

前記第１の区画に含まれている幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；のような本発明のプライミング因子処理によって機能が強化された状態の幹細胞であってもよい。アトピー性皮膚炎の治療のために１区画または２区画の成分をアトピー性皮膚炎の治療が必要な個体に同時にまたは順次に投与してもよい。

【0052】

前記キットにおいて、ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンであってもよい。

【0053】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物とを含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤に関する。

【0054】

本発明の治療剤は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を介して投与されてもよく、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの様々な因子によって適宜選択されてもよい。好ましくは非経口で投与してもよく、静脈内注入、皮下注入、皮内注入、筋肉注入および腹腔注入などで投与してもよい。

【0055】

前記第１の組成物は、好ましくは静脈投与用であってもよく、第２の組成物は皮内投与用であってもよい。静脈投与用組成物とは、液状の薬物が静脈に直接注入されて作用するようにする無菌組成物を意味する。静脈投与用組成物は、通常の注射剤の製造に用いられてもよいすべての組成物を含み、調剤法によって、水性注射剤、非水性注射剤、懸濁注射剤、凍結乾燥注射剤などを含むが、これに限定されるものではない。第２の組成物は皮内投与用であってもよく、皮内投与用組成物は、液状の薬物を注射液の形態で表皮真下層である真皮に注射する用途の組成物を意味する。

【0056】

第１の組成物と第２の組成物の注射順序はそれに制限されるものではなく、第１の組成物を注射し、第２の組成物を注射してもよく、第２の組成物を注射し、第１の組成物を注射するか、同時に注射してもよい。第１の組成物および第２の組成物は個体に必要なだけ繰り返し投与されてもよく、患者の状態や治療条件などによって繰り返し投与間隔を調節してもよい。

【0057】

本発明のキットは、それぞれの成分を含む個別容器を含む形態、または一つ以上の区画に分けられた容器の区画内にそれぞれの成分を含む形態で包装された形態であってもよい。それらの個別容器または区画内に含まれている成分は、それを必要とする患者に同時に、個別的にまたは順次に投与されてもよい。

【0058】

また、本発明は、１）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を、それを必要とする個体に投与するステップと、２）調節性Ｔ細胞を前記個体に投与するステップと、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療方法に関する。

【0059】

前記１）および２）の投与は、順次にまたは同時に投与されてもよい。

【0060】

前記「順次に」は、１）ステップの後に２）ステップを行ってもよく、２）ステップの後に１）ステップを行ってもよい。

【0061】

本発明の個体はヒトを含むすべての動物を意味してもよい。前記動物は、ヒトだけでなく前記アトピー性皮膚炎と類似した症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、レイヨウ、犬、猫などの哺乳動物であってもよく、ヒトを除いた動物であってもよいが、これに制限されるものではない。前記個体は、アトピー性皮膚炎の治療を必要とする患者であって、アトピー性皮膚炎を治療中の患者、治療を受けたことがある患者、アトピー性皮膚炎の治療を受ける必要がある患者をすべて含んでもよい。

【0062】

また、本発明のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンで処理された幹細胞は、既存のアトピー性皮膚炎の治療のための薬物または治療方法と併用して処理されてもよく、特に、本発明のように調節性Ｔ細胞とともに併用して処理される場合、さらに顕著なアトピー性皮膚炎の治療効果を達成してもよい。

【0063】

前記治療方法において、ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがともに処理されたものであってもよく、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１～３：０．１～３：０．１～３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、好ましくは、１：１：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、さらに好ましくは、１：１：１乃至３（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：１乃至２．５（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。

【0064】

また、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは１：１：０．１乃至３：３００乃至６，０００（ｗ／ｖ）の割合で幹細胞に処理されてもよい。より具体的に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ２が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：３００乃至１，０００（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：３００乃至６００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：４００乃至５５０（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：２：５００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよく、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、さらに具体的な例として、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至５，５００（ｗ／ｖ）の割合、さらに好ましくは、１：１：２：５，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。

【0065】

また、本発明は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物を提供する。

【0066】

より具体的に、前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１～３：０．１～３：０．１～３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、好ましくは、１：１：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものであってもよく、さらに好ましくは、１：１：１乃至３（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：１乃至２．５（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。本発明の一具現例においては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬおよび２０ｎｇ／ｍＬの濃度の組み合わせで幹細胞に処理して培養し、幹細胞を得てそのアトピー性皮膚炎の予防または改善効果を確認した。

【0067】

また、本発明の幹細胞は、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの組み合わせに加えてビタミンでさらに処理された幹細胞であってもよく、具体的に、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンがさらに処理された幹細胞であってもよい。

【0068】

ビタミンをさらに含むプライミング因子の組み合わせを幹細胞に処理してプライミングすると、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αの処理によって誘導される幹細胞の機能強化がさらに顕著に増進されることができ、アトピー性皮膚炎の予防または改善効果も顕著に増進されることができる。前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは、１：１：０．１乃至３：３００乃至６，０００（ｗ／ｖ）の割合で幹細胞に処理されてもよい。より具体的に、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ２が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：３００乃至１，０００（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：３００乃至６００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：４００乃至５５０（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：２：５００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよく、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αにビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６が追加される場合、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、よりさらに好ましくは、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至６，０００（ｗ／ｖ）、さらに具体的な例として、１：１：０．１乃至３：４，０００乃至５，５００（ｗ／ｖ）の割合、さらに好ましくは、１：１：２：５，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されてもよい。

【0069】

本発明のプライミングされた幹細胞は、肥満細胞の減少、総ＩｇＥの減少、ＩｇＧ２ａの生産増加およびヒスタミンの減少からなる群から選択された１種以上のアトピー性皮膚炎の改善効果を示すものであってもよい。また、本発明のプライミングされた幹細胞および調節性Ｔ細胞を併用して処理すると、総ＩｇＧ１の減少効果およびＩｇＧ２ａの増加効果を達成することができ、それを通じてＴｈ１にシフティングが行われ、免疫不均衡を解消してアトピー性皮膚炎の治療効果を達成することができる。

【実施例】

【0070】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明しようとする。これらの実施例はひたすら本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解析されないことは、当業界における通常の知識を有した者にとって自明のことである。

【0071】

実施例１．幹細胞の培養および候補物質の選定
３７℃および５％のＣＯ_２インキュベーターで、保存状態（ＬＮ_２ ｔａｎｋ保管）の中間葉幹細胞を解凍して培養し、このとき、１０％のＦＢＳまたは４％のｈＰＬを含む培地（ＤＭＥＭ、ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）で細胞コンフルエンスが８０％程度に増殖されるまで培養した。培養した中間葉幹細胞を１００ｍｍ ｄｉｓｈにｓｅｅｄｉｎｇした後、中間葉幹細胞の機能強化のための候補物質を２４時間にかけて処理した後、機能強化のための１次候補物質の濃度を設定した。

【0072】

１次候補物質としては、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γＩＦＮ－αを選定し、機能強化を確認するためにＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）とＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現を増加させることができる最低有効濃度を確認するために、ＴＮＦ－α ５、１０、２０ｎｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－γ ５、１０、２０ｎｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－α １０、２０、４０ｎｇ／ｍＬをそれぞれ幹細胞に処理し、ＴＳＧ６およびＩＤＯの発現変化を確認した。

【0073】

ＩＤＯはＴ細胞の増殖に必須のトリプトファンをキヌレン酸（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ）に替えることで、Ｔ細胞のような免疫細胞の増殖を抑制する免疫調節因子と知られており、ＴＳＧ６は、中間葉幹細胞が分泌する抗炎症調節因子と知られている。幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。各候補物質の濃度別の処理によるＴＳＧ６およびＩＤＯの結果を図１、図２および図３に示した。

【0074】

図１乃至図３に示したように、ＴＳＧ６およびＩＤＯの発現をすべて顕著に増加誘導することができる最低有効濃度でＴＮＦ－α １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－γ １０ｎｇ／ｍＬおよびＩＦＮ－α ２０ｎｇ／ｍＬを確認し、以後、実験して該当濃度を基準として処理した。

【0075】

実施例２．幹細胞の機能強化のための組み合わせの選定
前記実施例１を通じて、幹細胞の機能強化を誘導することが確認された候補物質および最低有効濃度を基礎として、さらに強化された機能強化組成物を探索するために、選定された候補物質およびそれらの濃度の組み合わせを表１のように設定した。下記表１に記載されている候補の組み合わせを２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0076】

【表1】

【0077】

これによって、免疫および抗炎症調節の代表的な因子であるＩＤＯ、ＴＳＧ６の発現変化を確認し、その結果を図４に示した。

【0078】

図４に示したように、未処理対照群グループ０と比較して、すべての単一候補物質ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α処理群（実験群１乃至３）において、ＩＤＯ、ＴＳＧ６の発現増加が確認されたが、それらをそれぞれ組み合わせた実験群４乃至６において、単一候補物質処理群に対比してさらに顕著な発現の増加が確認された。特に、ＴＮＦ－αにＩＦＮ－γまたはＩＦＮ－αを処理した実験群４、５は、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αのみを組み合わせた実験群６と比較して優れた効果を示し、３種類の候補物質をすべて組み合わせた処理群においては、驚くべきことに２つの組み合わせに対比して２倍以上増加された機能強化効果が確認された。

【0079】

従って、前記結果によってＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせを幹細胞に処理すると、非常に顕著な幹細胞の免疫および抗炎症機能強化が達成できることを確認した。

【0080】

実施例３．ビタミンの追加による幹細胞の機能強化効果の確認
３．１ ビタミン単独添加による幹細胞の機能強化効果の確認
ビタミンは幹細胞の培養過程中に添加するとき、幹細胞の増殖能力を改善させ、幹細胞のｓｔｅｍｎｅｓｓを維持させることが知られている。従って、多様なビタミンを幹細胞の培養過程に処理し、ビタミンが幹細胞の抗炎症および免疫機能強化効果を達成できるか否かを確認するための実験を行った。具体的に、下記表２に示した多様なビタミンの種類を実施例１に記載されている方法に応じて幹細胞に処理し、各候補物質の処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認した結果を図５に示した。

【0081】

【表2】

【0082】

図５に示したように、ビタミン処理群は、幹細胞の抗炎症および免疫調節機能に関与するＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化には有意な効果を示さなかった。

【0083】

３．２ ビタミンとＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αの組み合わせによる幹細胞の機能強化効果の確認
上記のように単一物質としては、幹細胞の抗炎症および免疫調節機能強化の効果が示されていないビタミンを、実施例２において確認した機能強化物質の組み合わせに添加する場合、シナジー効果を示すことができるか否かを確認するために、下記表３のように、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ－α（２０ｎｇ／ｍＬ）にそれぞれのビタミンを添加し、各組み合わせの処理によるＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現変化を確認し、その結果を図６に示した。

【0084】

【表3】

【0085】

図６に示したように、ビタミン未処理実験群１と比較して、実験群２、３、８、９においては、ＩＤＯおよびＴＳＧ６の発現が有意に増加しておらず、実験群１０は、ＴＳＧ６の発現は増加したが、ＩＤＯにおいては、対照群に対比して発現増加が確認されていない。一方、ビタミンＢ２（実験群４）、ビタミンＢ３（実験群５）、ビタミンＢ５（実験群６）、ビタミンＢ６（実験群７）の場合は、有意にＩＤＯとＴＳＧ６の発現がすべて増加されることを確認した。ＴＳＧ６の場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αを処理した実験群１と比較したとき、実験群４、５ ６、７において、それぞれ４９％、３０％、３５％、４５％増加し、ＩＤＯの場合、実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ２５％、３７％、３１％、１８％増加されることを確認した。

【0086】

上記のような結果は、ビタミンを単独で幹細胞に処理する場合、幹細胞の抗炎症および免疫調節能を向上させることはできないが、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αとビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６を組み合わせて処理する場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αの効果がさらに高められることを示す結果である。

【0087】

実施例４．ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭの発現変化の確認
ＩＣＡＭ１とＶＣＡＭはＴ細胞と結合を通じて、Ｔ細胞の増殖を抑制して死滅を誘導することで過度な免疫と炎症反応を減少させ、多様な免疫および炎症関連疾患に効果を示すことができる。従って、前記実施例３の表３に記載されている同一の実験群で、２４時間にかけて中間葉幹細胞に処理し、実施例１のように幹細胞を培養した後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して総ＲＮＡを分離した。以後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（ＴａＫａＲａ）を利用して総ＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0088】

幹細胞の免疫疾患および炎症疾患治療効果が増進しているか否かを確認するために、幹細胞の表面に発現する付着因子であるＩＣＡＭ１（（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）とＶＣＡＭ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｎｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現を確認し、その結果を図７に示した。

【0089】

図７に示したように、ＩＣＡＭ１の場合、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ＋ＩＦＮ－αを処理した実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ４５％、１００％、３５％、４５％増加し、ＶＡＣＭの場合、実験群１と比較したとき、実験群４、５、６、７において、それぞれ５２％、６９％、５２％、６９％増加されることを確認した。

【0090】

従って、ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γＩＦＮ－αとビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５またはビタミンＢ６の組み合わせを幹細胞に処理する場合、ＩＣＡＭ１およびＶＣＡＭの発現が顕著に増加し、これによって、幹細胞の免疫調節能および抗炎症効能が促進されてもよい。

【0091】

実施例５．炎症および免疫調節能力の確認
ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭのような免疫および炎症調節因子を強化させた、前記実施例４において確認したプライミング処理条件の組み合わせが実際に過度な免疫反応を誘発した条件で炎症および免疫反応を抑制し、機能強化されていないｃＭＳＣに対比してさらに優れた効果を示すかを確認した。以下においては、表３のうち実験群７であるＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γＩＦＮ－αとビタミンＢ６の組み合わせをｃＭＳＣに処理し、前記組み合わせでプライミング処理されたＭＳＣを「ｐｃＭＳＣ２（Ｐｒｉｍｅｄ ｃｌｏｎａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２）」と名付けた。

【0092】

ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）刺激リンパ球培養実験は、リンパ球の細胞分裂の促進を誘導するＰＨＡという試薬を利用する方法であって、過度な免疫活性を誘導する方法である。ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ；末梢血液細胞）を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにｗｅｌｌあたり２×１０^５ｃｅｌｌｓに分注し、ＰＨＡ １μｇ／ｍＬで刺激して５×１０^４ｃｅｌｌのｃＭＳＣまたはｐｃＭＳＣ２と４日間共培養した。培養が完了した後、上澄液を集めて炎症性サイトカインであるＩＦＮ－ｇａｍｍａと抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０をＥＬＩＳＡによって確認し、その結果を図８に示した。陰性対照群としては、ＰＨＡで刺激されていないグループを利用し、Ｐ１で示した。

【0093】

図８に示したように、ＩＦＮ－ｇａｍｍａはＰＨＡで刺激した場合、１６０１３ｐｇ／ｍＬのように顕著に増加したか、ｃＭＳＣと共培養した場合、５０４８ｐｇ／ｍＬ減少し、ｐｃＭＳＣ２と共培養した場合、１７００ｐｇ／ｍＬまで有意に減少することを確認した。また、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２を比較した場合は、機能強化されたｐｃＭＳＣ２でｃＭＳＣより約６６％程度ＩＦＮ－ｇａｍｍａがさらに有意に減少することを確認した。抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の場合、ｃＭＳＣとｐｃＭＳＣ２のいずれもにおいてＩＬ－１０の増加を確認することができ、特に、ｃＭＳＣより機能強化されたｐｃＭＳＣ２と共培養した条件で、約２２％多いＩＬ－１０が分泌されることを確認した。

【0094】

実施例６．調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の分離および培養
ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した臍帯血単核細胞を解凍した後、ヒトのＣＤ４を認知するｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を利用してＣＤ４＋細胞のみを選別分離した。ＣＤ４＋細胞分離過程は、製造会社のプロトコルに応じて実施した。簡略に、全体臍帯血単核細胞をＣＤ４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄと混ぜた後、磁場コラムを利用してＣＤ４＋細胞のみを純粋分離した。分離されたＣＤ４＋細胞で調節性Ｔ細胞を分類するために、ａｎｔｉ－ＣＤ４ ＦＩＴＣ（Ｔｏｎｂｏ）、ａｎｔｉ－ＣＤ２５ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１２７ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）抗体および流動細胞分類器（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｍｅｌｏｄｙ）を利用して４℃で採光を遮断した条件で２０分間染色を行った。流動細胞分析器を利用した調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５^{＋／ｈｉｇｈ}ＣＤ１２７^ｌｏｗ、４～６％）分離の分類戦略および分類純度を図９に示した。

【0095】

流動細胞分類器によって得られた臍帯血由来の調節性Ｔ細胞（３×１０^５）を２００μｌ培地に浮遊して９６ ｗｅｌｌ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅで培養を始めた。調節性Ｔ細胞のＣＤ３およびＣＤ２８を通じた活性化のために、ＧＭＰ ＭＡＣＳ Ｔ ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）が添加されており、培養培地は、ＡＩＭ－Ｖ ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）、５％のＨｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ＡＢ（ＧＥＭＣＥＬＬ）、５００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）、５００ｍｇ／ｍＬのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）、１．４６ｍｇ／ｍＬのＧｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ）、３００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）、２μＭのＢＨＫｐｓ２５（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｂａｃｋｂｏｎｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＴｒｉＬｉｎｋ）、および２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＴＧＦ－１β（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．）を含む培地を用いた。培養開始後の３日から５日間（７２時間）は１００ｎＭのｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加した。

【0096】

培養６日あるいは７日目に調節性Ｔ細胞を再刺激するために、ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が処理された同一の供与者由来のＣＤ４－細胞を調節性Ｔ細胞の１０倍の量で追加し、同時に５０ｎｇ／ｍＬのａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を処理した。１７～１９日間培養された臍帯血由来の調節性Ｔ細胞の数は最初に対比して供与者によって２７０～４００倍に増加した。

【0097】

実施例７．臍帯血由来の調節性Ｔ細胞の性質の確認
分離された臍帯血由来の調節性Ｔ細胞の特徴が約２週間の培養の間に変形されたかを確認し、他の細胞へ分化しているか否かを確認するために、培養１２日目に流動細胞分析による調節性Ｔ細胞と分化Ｔ細胞のマーカー確認実験を行った。

【0098】

免疫慣用機能がまともに維持される調節性Ｔ細胞の場合、特異的な転写因子であるＦｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓの発現を維持すると知られているので、培養中の細胞の一部を得て、該当抗体を利用して染めた後、発現変化を確認し、その結果を図１０に示した。

【0099】

図１０に示したように、１２日間培養された臍帯血由来の調節性Ｔ細胞は９０％の細胞が該当転写因子をすべて発現していることが確認できた。一方、対照群として用いられた非－調節性Ｔ細胞の場合、ほぼＦｏｘｐ３およびＨｅｌｉｏｓを発現していなかった。

【0100】

追加的に分類して培養された調節性Ｔ細胞が培養基間の間に別の細胞に分化されていないことを確認するために、サイトカイン分泌量の測定を行った。ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を４時間にかけて調節性Ｔ細胞に処理して細胞がサイトカインを分泌するように刺激し、タンパク質移動阻害剤（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）をともに処理することで、細胞内の分泌されたサイトカイン量を培養液への流出なしに測定した。調節性Ｔ細胞はどのようなサイトカインも分泌しないことが知られているので、Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １ ｃｅｌｌ（Ｔｈ１）およびＮａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ（ＮＫ ｃｅｌｌ）へ分化しているか否かを確認するために、ＩＬ－２とＩＦＮ－γＴ ｈｅｌｐｅｒ ２ ｃｅｌｌ（Ｔｈ２）へ分化しているか否かを確認するために、ＩＬ－４、最後に、Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １７ ｃｅｌｌ（Ｔｈ１７）へ分化しているか否かを確認するためにＩＬ－１７Ａの分泌を確認し、その結果を図１１に示した。

【0101】

図１１に示したように、分離された後、１２日間培養された臍帯血由来の調節性Ｔ細胞は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＦＮ－γの発現がいずれも１％未満であると確認され、これは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、ＮＫ ｃｅｌｌ、Ｔｈ１７への分化可能性がないことを示す。従って、流動細胞分類器によって分類された後、１２日間培養された臍帯血由来の調節性Ｔ細胞は、別の細胞への分化誘導なしに調節性Ｔ細胞の固有の機能を維持したことを確認し、以後、分離された調節性Ｔ細胞を実験に用いた。

【0102】

実施例８．アトピー性皮膚炎の動物モデルを利用した併用投与の効果
実施例５において機能強化効果が確認されたｐｃＭＳＣ２と実施例６において分離された調節性Ｔ細胞を併用投与し、アトピー性皮膚炎の治療効果を確認した。

【0103】

８．１ アトピー性皮膚炎モデルの製造および投与プロトコル
アトピー性皮膚炎試験は、雌６週齢のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ（１５～２０ｇ）をＳＬＣ，Ｉｎｃ（Ｓｈｉｚｕｏｋａ、Ｊａｐａｎ）から供給を受けて用い、１週間の間馴化期間を経た後、実験を進行した。仁荷大学医科大学の生命科学研究所で温度２２～２５℃、湿度４０～６０％、昼夜１２時間交代に１５０～３００Ｌｕｘの照明で滅菌蒸溜水と固形飼料を自由に摂取できるように飼育環境を維持して実験を行った。７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）５０μｇ／５０μｌ（ＰＢＳ）とＡｌｕｍ Ａｄｊｕｖａｎｔ ４ｍｇ／１００μｌを混合して週に１回３週間、計３回にわたって腹腔と皮下投与して免疫化を進行した。３回すべて同じ部位に投与するとき、該当疾患と関係のない炎症を誘発することがあるため、それぞれ他の部位に投与した。ＯＶＡ＋ａｌｕｍ投与の３週間後、１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼにＯＶＡ ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした後、除毛した皮膚に週に２～３回、２週間にかけて付着してアトピー性皮膚炎を誘導した。誘導後の１３～１４日目に実験動物を補正した後、２６ １／２ ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅが装着されたＢＤ社の１ｍＬ ｓｙｒｉｎｇｅを利用してＰＢＳ、細胞安定化剤、ｐｃＭＳＣ２、調節性Ｔ細胞、ｐｃＭＳＣ２＋調節性Ｔ細胞をそれぞれ注入した。

【0104】

投与プロトコルを図１２に示し、ｐｃＭＳＣ投与は青い矢印で、調節性Ｔ細胞投与は赤い矢印で示した。図１２に示したように、ｐｃＭＳＣ２は４２日目に最初投与して２日間隔で計３回静脈投与し、１回あたり１．６６×１０^５／２００μｌずつ３回、計５．０×１０^５／６００μｌ投与した。Ｔｒｅｇｓは、単独投与群は、４４日目に計１．０×１０^６／２５０μｌを単回投与し、ｐｃＭＳＣ２＋Ｔｒｅｇｓ併用投与群は、ｐｃＭＳＣ２の投与プロトコルに加えて４４日目に計１．０×１０^６／２５０μｌの調節性Ｔ細胞を追加皮内投与（Ｄ４４）した。皮内投与は一部位あたり５０μｌ以上投与する場合、ｓｋｉｎ ｔｒａｕｍａを誘導することがあるので、２５０μｌに浮遊された細胞を５０μｌずつ５か所の部位にわたって注入した。Ｖｅｈ．群の実験動物は投与方法に応じてＶｅｈ．（ｐｃＭＳＣ２ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｖｅｈ．（Ｔｒｅｇｓ ｃｏｎｔｒｏｌ）の二つに分けて、それぞれＰＢＳを皮内投与、細胞安定化剤を静脈投与した。

【0105】

二日後に病弁部位を再び除毛した後、ＯＶＡ ６０μｇ／６０μｌ（ＰＢＳ）を濡らした１．２×１．２ｃｍサイズの滅菌ガーゼを除毛した背中の皮膚に２週間にかけて週３～４回付着してアトピー性皮膚炎を再誘導した（ブースティングステップ）。

【0106】

アトピー性皮膚炎に対する効果を確認するための血液サンプルは、次のような方式で得た。すべての実験動物は、細胞安定化剤または試験物質の投与後の約１０日目（実験５９日目）にイソフルランを利用して呼吸麻酔した後に腹部を切開して後大静脈を露出させた後に採血した。採血した血液は、ｓｅｒｕｍ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔｕｂｅに入れて３，０００ｒｐｍ／１５分、４℃で遠心分離した後、１．５ｍＬ ｅ－ｔｕｂｅに入れて－７０℃ ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒに保管した。

【0107】

８．２ 併用投与による皮膚病弁変化の確認
実施例８．１のアトピー性皮膚炎を誘発した実験動物にｐｃＭＳＣ２、調節性Ｔ細胞を上記のようなプロトコルで投与し、実験５９日目に皮膚病弁の状態を確認し、その結果を図１３に示した。

【0108】

図１３に示したように、アトピー性皮膚炎を誘発した実験動物に試験物質を注入した後、皮膚全般にわたって疾患誘発による傷、血痕、角質の有無などを観察した結果、単独投与群よりｐｃＭＳＣ２、調節性Ｔ細胞併用投与群（Ｄ４４）で皮膚が効果的に改善されることを確認した。

【0109】

８．３ 併用投与による総ＩｇＧ１の抑制効果およびＩｇＧ２の生産効果の確認
実施例８．１のアトピー性皮膚炎誘発動物モデルにｐｃＭＳＣ２、調節性Ｔ細胞を上記のようなプロトコルで投与し、総ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａを比較した。アトピー性皮膚炎の有効性評価のために、血清試料はＥＬＩＳＡ ｋｉｔを利用して血清内のｔｏｔａｌ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａの濃度を測定し、測定はキット内のプロトコルに準じて実施した。ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅに免疫グロブリンを認知することができる捕捉抗体をコーティング緩衝液とともに４℃に一晩中保管し、翌日１時間にかけて遮断過程を経た後、血清を１００倍以上希釈して５０μｌの量で２時間にかけて室温で反応させた。その後、免疫グロブリンを認知する２次抗体を入れた後、ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒであるＴＭＢ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れて、約１５分程度反応させた後、５０μｌのｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを入れた。ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ機を利用して４５０ｎｍのフィルターで値を測定した。確認結果を図１４乃至図１７に示した。

【0110】

図１４および図１５に示したように、Ｔｏｔａｌ ＩｇＧ１はＶｅｈ．を除いたすべての実験物質投与群で有意に減少されることを確認し、特に、ｐｃＭＳＣ２に調節性Ｔ細胞を併用注入したとき、最も大幅に減少した。

【0111】

図１６および図１７に示したように、ＩｇＧ２ａの場合は、ＩｇＧ１結果と反対されるパターンが確認され、Ｖｅｈ．に対比する調節性Ｔ細胞単独投与群を除いたすべての実験物質投与群で意味のある水準で数値が増加したことが確認された。また、ｐｃＭＳＣ２、調節性Ｔ細胞単独注入群と比較したとき、ｐｃＭＳＣ２に調節性Ｔ細胞を併用注入したとき、最も大幅に増加した。これは、Ｔｈ２疾患であるアトピー性皮膚炎モデルにｐｃＭＳＣ２および調節性Ｔ細胞を注入することでＴｈ１へのシフティングが行われ、これにより、免疫不均衡を調節してアトピー症状を緩和させ得ることを示す結果である。

【0112】

以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施形態であるだけであり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかなものである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言えるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2023-11-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞および調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項3】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項4】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミンは、０．１乃至３：０．１乃至３：０．１乃至３：１００乃至１０，０００（ｗ／ｖ）の割合で処理されるものである、請求項３に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項5】

前記幹細胞および調節性Ｔ細胞は併用投与されるものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項6】

前記幹細胞は、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の中間葉幹細胞である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項7】

前記調節性Ｔ細胞は、血液、脂肪、骨髄、胎盤または臍帯血由来の調節性Ｔ細胞である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項8】

前記幹細胞は、ＴＳＧ６（ＴＮＦα－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ－６）の発現、ＩＤＯ（Ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の発現、ＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）の発現およびＶＣＡＭ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の発現からなる群から選択された１種以上が増進されたものである、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項9】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組成物を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用キット。

【請求項10】

前記キットは、（ａ）ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－α；またはＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびビタミン；で処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物と、を含み、前記第１の組成物および第２の組成物は、それぞれ個別容器に入れられた形態、または一つ以上の区画に分けられた一つの容器内に入れられた形態で包装された形態のものであり、前記ビタミンは、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンである、請求項９に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用キット。

【請求項11】

幹細胞プライミング用ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αを含む１区画と、
幹細胞を含む２区画と、
調節性Ｔ細胞を含む３区画と、を含むアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項12】

前記１区画は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含むものである、請求項１１に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項13】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む１区画と、調節性Ｔ細胞を含む２区画と、を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項14】

前記１区画は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンをさらに含むものである、請求項１３に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用併用投与キット。

【請求項15】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞を含む第１の組成物と、調節性Ｔ細胞を含む第２の組成物を含む、アトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項16】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理されたものである、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項17】

前記第１の組成物は静脈投与用であり、第２の組成物は皮内投与用である、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の予防または治療用細胞治療剤。

【請求項18】

ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－αで処理された幹細胞と、調節性Ｔ細胞を含む、アトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。

【請求項19】

前記幹細胞は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６からなる群から選択された１種以上のビタミンでさらに処理された幹細胞である、請求項１８に記載のアトピー性皮膚炎の予防または改善用化粧料組成物。

【国際調査報告】