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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】抗ＣＤ９８抗体及びその応用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240514BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240514BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240514BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240514BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240514BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P35/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575348
(86)(22)【出願日】2021-06-02
(85)【翻訳文提出日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 CN2021098027
(87)【国際公開番号】W WO2022252167
(87)【国際公開日】2022-12-08
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523455541
【氏名又は名称】フアフイ ヘルス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スイ，ジアンフア
(72)【発明者】
【氏名】ティエン，シンシン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、マウスＣＤ９８（ｍＣＤ９８）又はｈＣＤ９８（ｈＣＤ９８）に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。具体的には、本開示の抗体は、その標的にｐＨ依存的に結合する。さらに、前記抗体又はその断片をコードするヌクレオチド、前記抗体又はその断片を含む組成物又は組み合わせ、及び前記抗体又はその断片を用いることにより、例えばがんのような疾患を治療する方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト又はマウスＣＤ９８に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその断片、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３に記載の抗体又はその断片。
【請求項5】
以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、請求項３に記載の抗体又はその断片、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ。
【請求項6】
前記抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に対する結合がｐＨ依存性を有し、酸性ｐＨでの結合活性が中性ｐＨでの結合活性よりも高い、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項7】
結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した場合、抗体とｈＣＤ９８との結合を測定すると、前記抗体又はその断片の酸性ｐＨでのＥＣ５０は、中性ｐＨでのＥＣ５０よりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍低い、請求項６に記載の抗体又はその断片。
【請求項8】
前記酸性ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８であり、前記中性ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５又は７．６であり、好ましくは、前記酸性ｐＨは、６．５であり、前記中性ｐＨは、７．４である、請求項６又は７に記載の抗体又はその断片。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項13】
治療有効量の請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体若しくはその断片、又は請求項１２に記載の組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防のための方法。
【請求項14】
前記腫瘍又はがんは、ＣＤ９８を発現する腫瘍又はがんである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記腫瘍又はがんは、酸性ｐＨを呈する微小環境を有し、前記酸性ｐＨは、例えばｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下であり、前記被験者における正常生理的ｐＨは、約ｐＨ７．４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記腫瘍又はがんは、リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、肝細胞がん、膵臓がん、膵臓類上皮がん、乳がん、結腸直腸腺がん、皮膚類表皮がん、メラノーマ、繊維肉腫、非小細胞肺がん、胃がん、急性骨髄性白血病、グリオーマ、舌がん、下咽頭扁平上皮がん、胆管がん、骨軟化症、骨肉腫、腎臓がん、及び神経芽細胞腫から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、モノクローナル抗体、特に、ヒト又はマウスＣＤ９８に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。また、抗ＣＤ９８抗体をコードする核酸分子、ならびに前記核酸分子を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。また、抗ＣＤ９８抗体を含む薬物組成物、コンジュゲート及び多特異性抗体を開示する。また、様々な疾患、特に腫瘍、例えばＣＤ９８を発現する腫瘍を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
ＩＩ型膜貫通タンパク質ＣＤ９８（ＣＤ９８重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）又は４Ｆ２ｈｃとも呼ばれ、ＳＬＣ３Ａ２遺伝子によってコードされる）は、複数の軽鎖と相互作用し、異なるヘテロダイマーアミノ酸トランスポーター（ＨＡＴ）を形成する。軽鎖は、アミノ酸輸送過程において作用するが、ＣＤ９８は、軽鎖構造を安定化させ、軽鎖の細胞膜への局在化に寄与することにより輸送活性に関与する。ＣＤ９８は、アミノ酸輸送活性を促進することにより、腫瘍の形成、腫瘍の進行及び転移に関与し、細胞の生存を促進し、インテグリンシグナル伝達を増強し、細胞の拡散、遊走、生存及び増殖を増加させることが証明されている。過去１０年間において、ＣＤ９８は、様々な種類の固形腫瘍及び血液系悪性腫瘍において発現がアップレギュレートされ、不良な臨床転帰に関連することから、がん治療法を開発するための注目される標的となっている。なお、ＣＤ９８タンパク質は、脳、脾臓、腎臓、小腸、精巣、造血系などを含む正常組織において広く発現されるものである。
【0003】
Ｈａｙｅｓら（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １３７（２０１５），７１０－７２０）によると、抗ヒトＣＤ９８（ｈＣＤ９８）抗体ＩＧＮ５２３は、白血病、リンパ腫及び肺がんの異種移植腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示している。
【0004】
ＣＮ１０５３８５６９４Ｂには、ＣＤ９８と結合するモノクローナル抗体が開示されており、また、そのキャリアとして抗腫瘍又は抗炎症剤を送達するための応用が教示されている。ＣＮ１０５３８５６９４Ｂの開示内容には、抗ＣＤ９８抗体が細胞溶解液中に肺がん細胞と結合できることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏデータのみが提供されているが、ｉｎ ｖｉｖｏデータが示されていない。抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのパフォーマンス、例えば腫瘍特異的結合活性又は薬物動態学的性質は、知られていない。
【0005】
ＷＯ２００７１１４４９６Ａには、複数種の抗ＣＤ９８抗体が開示されており、そのうちのいくつかの抗体は、膀胱がん細胞株におけるロイシン摂取に阻害作用を有し、ｈＣＤ９８／ｈＬＡＴ１－ＥＧＦＰを発現するマウスＣＴ２６結腸がん細胞株を担持したマウスに抗腫瘍作用を示している。クローンの１つであるＣ２ＩｇＧ１は、ヒトバーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓを移植したマウスに抗腫瘍作用を示している。
【0006】
また、ＡｂｂＶｉｅによるＷＯ２０１７２１４４５６Ａ１、ＷＯ２０１７２１４４５８Ａ２、ＷＯ２０１７２１４４６２Ａ２、及び第一三共株式会社（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ Ｌｔｄ．）によるＷＯ２０１５１４６１３２Ａ１を含む他の特許出願開示は、抗ＣＤ９８抗体、及びＢｃｌ－ｘＬ阻害剤のような薬物を含むコンジュゲートを提供している。
【0007】
しかしながら、上記の文献の何れにおいても、正常組織における抗ＣＤ９８抗体とＣＤ９８との結合に起因し得る問題点については議論されていない。この問題点は、ｈＣＤ９８を発現させるように遺伝子工学的に改変されたがん細胞株を担持した動物モデル又は異種移植モデルには存在しておらず、これは、動物モデルの正常組織がマウスＣＤ９８を発現するが、それが抗体の標的ではないためである。抗ＣＤ９８抗体のオンターゲット・オフ腫瘍(Ｏｎ ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ ｔｕｍｏｒ)結合は、正常組織に存在するＣＤ９８の機能を破壊する可能性がある一方、抗体の標的腫瘍細胞に対する抗腫瘍作用を弱める可能性がある。
【0008】
実際、正常組織におけるＣＤ９８の広範な発現は、臨床応用にいくつかの主要な課題をもたらす。ＣＤ９８遺伝子の標的化破壊は、胚死をもたらす（Ｔｓｕｍｕｒａら、（２００３），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３０８、第８４７－８５１頁）。ＣＤ９８のコンディショナルノックアウトは、造血幹細胞及び前駆細胞の増殖及び再生能力を損なう（Ｂａｊａｊら、（２０１６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３０、第７９２－８０５頁）。したがって、標的化副作用及び「抗原シンク（ａｎｔｉｇｅｎ ｓｉｎｋ）」の問題は、ＣＤ９８を標的とする抗体療法を開発するための主な注目点となっている。
【0009】
現在、抗腫瘍療法としての抗ＣＤ９８抗体への需要は、未だに満たされていない。また、ＣＤ９８の正常生理機能への影響が小さく、「抗原シンク」現象の副作用を低減させる抗ＣＤ９８抗体の開発が望まれている。
【発明の概要】
【0010】
本発明者らは、異種移植及びＣＤ９８ヒト化マウスによって構築された同系腫瘍モデルにおいて、ＣＤ９８の生理機能を妨害することに依存せず、広域スペクトルのＦｃ依存性抗腫瘍活性を引き起こす抗ＣＤ９８抗体（Ｓ１－Ｆ４）を同定することに成功した。Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性は、ＦｃγＲｓ、マクロファージ、樹状細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む自然免疫及び適応性免疫成分を必要とする。そして、正常組織におけるＣＤ９８抗体結合による「抗原シンク」の問題を克服するために、本発明者らは、Ｓ１－Ｆ４／ＣＤ９８複合体の構造を解析し、一連のｐＨ依存性結合バリアントを生成し、腫瘍特異的結合を増加させ、薬物動態学的特徴を顕著に改善することにより、全体的な抗腫瘍活性を促進した。
【0011】
第１の側面において、本開示は、ヒト又はマウスＣＤ９８に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片に関する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片に関する。
【0012】
一実施形態において、前記抗体又はその断片は、以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
以上の（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する。
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
以上の（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する。
【0013】
一実施形態において、抗体又はその断片は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
【0014】
別の実施形態において、抗体又はその断片は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＬ、を含む。
【0015】
１つの具体的な実施形態において、抗体又はその断片は、以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
以上の（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
以上の（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する。
【0016】
一実施形態において、抗ＣＤ９８抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に対する結合がｐＨ依存性を有し、酸性ｐＨでの結合活性が中性ｐＨでの結合活性よりも高い。例えば、酸性ｐＨでの結合活性は、中性ｐＨでの結合活性に比べて、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又は１００倍高い。結合活性は、従来技術で公知の任意の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ又は表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））によって測定することができる。例えば、ｈＣＤ９８との結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した場合、抗体又はその断片の酸性ｐＨでのＥＣ５０は、中性ｐＨでのＥＣ５０よりも、少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍又は１００倍低い。酸性ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８、特に６．５である。中性ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５又は７．６、特に７．４である。一実施形態において、抗体又はその断片は、酸性ｐＨにおいて所望の結合活性を有するが、中性ｐＨにおいて結合活性を有さないか、又はかなり低い結合活性を有する。
【0017】
一実施形態において、抗ＣＤ９８抗体又はその断片は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞内に存在しないｈＣＤ９８と比べて、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞内に存在するｈＣＤ９８に優先的に結合することを示す。具体的には、このような結合プリファレンスは、抗体またはその断片がｈＣＤ９８とｐＨ依存的に結合することによって実現される。例えば、抗ＣＤ９８抗体又はその断片とｈＣＤ９８との結合活性は、被験者(例えばヒト)の腫瘍微小環境ｐＨにおいて、被験者(例えばヒト)の正常生理的ｐＨにおける結合活性よりも有意に大きい。例えば、ＥＬＩＳＡ法によりｈＣＤ９８との結合活性を測定する場合、抗体又はその断片の腫瘍微小環境ｐＨにおけるＥＣ５０は、正常生理的ｐＨにおけるＥＣ５０よりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は１００倍低い。一実施形態において、腫瘍微小環境ｐＨは、約６．０から７．０のｐＨ、例えば、ｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下、例えば、ｐＨ６．５であってもよい。別の実施形態において、正常生理的ｐＨは、正常な血液又は血清のｐＨ、例えばｐＨ７．４であってもよい。一実施形態において、抗体又はその断片は、腫瘍微小環境において必要な結合活性を有するとともに、正常生理的ｐＨにおいて結合活性を有さないか、又はかなり低い結合活性を有する。
【0018】
一実施形態において、本願は、上記の抗体又はその抗原結合断片のいずれかが結合するｈＣＤ９８上の同一エピトープに結合する抗体又はその断片に関する。具体的には、前記抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の１３５、３７６－３８４及び３９１－３９９番目のアミノ酸残基におけるエピトープに結合する。より具体的には、抗体又はその断片は、アミノ酸残基Ｈ１３５、Ｅ３８４、Ｅ３９２、Ｄ３９７が抗体結合に直接関与するエピトープに直接結合する。
【0019】
一実施形態において、抗ＣＤ９８抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域又はそのバリアント、及びκ又はλタイプの軽鎖定常領域又はそのバリアントを含む。１つの好ましい実施形態において、抗ＣＤ９８抗体は、ＩｇＧ１の重鎖定常領域を含む。
【0020】
一実施形態において、抗原結合断片は、一本鎖可変領域、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｄｓ－ｓｃＦｖである。
【0021】
一実施形態において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体、ダイァボディ、又はミニ抗体であってもよい。
【0022】
１つの好ましい実施形態において、抗体又はその断片は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、６つのＣＤＲのいずれかにおける１つ又は複数のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）に突然変異し、若しくはヒスチジン（Ｈ）に突然変異し、抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８にｐＨ依存的に結合することを示す。好ましくは、Ｄ又はＥに突然変異したアミノ酸は、ｈＣＤ９８上の結合エピトープ内又は結合エピトープ付近のヒスチジンと密接に相互作用する位置にあり、又はＨに突然変異したアミノ酸は、ｈＣＤ９８上の結合エピトープ内又は結合エピトープ付近のアスパラギン酸又はグルタミン酸と密接に相互作用する位置にある。
【0023】
一実施形態において、抗体又はその断片は、抗体による治療に使用される。
【0024】
第２の側面において、本開示は、第１の側面の抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、前記単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１９、２４、２９、３４、３９、４４、４９、５４、５９、６４、６９、７４又は７９から選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９８％の相同性、又は１００％の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0025】
第３の側面において、本開示は、第２の側面の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【0026】
第４の側面において、本開示は、第２の側面の単離されたポリヌクレオチド又は第３の側面の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0027】
第５の側面において、本開示は、第１の側面の抗ＣＤ９８抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物、例えば薬物組成物に関する。好ましくは、前記薬物組成物は、治療有効量の抗ＣＤ９８抗体又はその断片を含む。
【0028】
第６の側面において、本開示は、治療有効量の第１の側面の抗ＣＤ９８抗体若しくはその断片、又は第５の側面の組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防のための方法を提供する。
【0029】
第７の側面において、本開示は、治療有効量の第１の側面の抗ＣＤ９８抗体若しくはその断片、又は第５の側面の組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における自己免疫疾患を治療するための方法を提供する。
【0030】
第８の側面において、本開示は、薬物の製造における第１の側面に記載の抗ＣＤ９８抗体又はその断片の使用を提供する。一実施形態において、前記薬物は、腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、がんの再発の予防に使用される。一実施形態において、前記薬物は、自己免疫疾患の治療に使用される。
【0031】
第６の側面又は第８の側面の一実施形態において、前記腫瘍又はがんは、ＣＤ９８、特にｈＣＤ９８を発現する。第６の側面又は第８の側面の一実施形態において、前記腫瘍又はがんにおける微小環境のｐＨは、被験者の正常生理的ｐＨより低い。例えば、前記腫瘍又はがんにおける微小環境は、酸性ｐＨを有し、例えばｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下、例えば約ｐＨ６．５であり、且つ被験者の正常生理的ｐＨは、正常な血液又は血清のｐＨ、例えばｐＨ７．４である。より具体的には、前記がんは、リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、肝細胞がん、膵臓がん、膵臓類上皮がん、乳がん、結腸直腸腺がん、皮膚類表皮がん、メラノーマ、繊維肉腫、非小細胞肺がん、胃がん、急性骨髄性白血病、グリオーマ、舌がん、下咽頭扁平上皮がん、胆管がん、骨軟化症、骨肉腫、腎臓がん、及び神経芽細胞腫から選ばれる。
【0032】
第７の側面又は第８の側面の一実施形態において、前記自己免疫疾患は、免疫細胞、例えばＴ細胞又はＢ細胞の異常増幅によって引き起こされるものである。一実施形態において、前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、又は関節リウマチから選ばれる。
【0033】
最近の研究では、ＣＤ９８ｈｃは、強力な受容体媒介性細胞質輸送（ＲＭＴ）標的として特定され、治療用抗体の脳送達を促進し増強させることができる（Ｙ．Ｊｏｙ Ｙｕ Ｚｕｃｈｅｒｏら、Ｎｅｕｒｏｎ ８９、第７０－８２頁、２０１６年１月６日）。血液脳関門（ＢＢＢ）透過性が低い抗体は、抗ＣＤ９８抗体とペアにして二重特異性抗体とすることにより、それらの血液脳関門を透過する輸送及び脳蓄積を改善することができる。
【0034】
したがって、第９の側面において、本開示は、第１の側面のｈＣＤ９８に特異的に結合する抗原結合断片である第１の抗原結合断片と、第１の側面の抗原結合断片が結合するものとは異なる第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合断片とを含む融合タンパク質、例えば二重特異性抗体に関する。一実施形態において、二重特異性抗体は、治療用抗体又は診断用抗体である。一実施形態において、前記二重特異性抗体は、全身的投与後、第２の抗原に特異的に結合する単一特異性抗体よりも高い脳蓄積を示す。
【0035】
第１０の側面において、本願は、（ａ）第１の側面の抗ｈＣＤ９８抗体と、（ｂ）第２の抗腫瘍試薬とを含む、腫瘍を治療するための組み合わせ、コンジュゲート、又は組成物に関する。一実施形態において、前記第２の抗腫瘍試薬は、免疫チェックポイントタンパク質を調節する試薬であってもよく、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ３、２Ｂ４を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質を調節する試薬は、免疫チェックポイントタンパク質に特異的に結合する抗体である。
【0036】
本発明者らは、本願の抗ｈＣＤ９８抗体がその抗腫瘍作用を発揮するためにマクロファージ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とすることを見出した。従って、第１０の側面の好ましい実施形態において、第２の抗腫瘍剤は、マクロファージの貪食機能を増強させる試薬であってもよく、又はＣＤ８＋Ｔ細胞の作用を増強させる試薬であってもよい。一実施形態において、前記第２の抗腫瘍剤は、貪食阻害因子（例えば、ＣＤ４７）を標的とすることによりマクロファージの貪食機能を増強させる試薬である。１つの具体的な実施形態において、マクロファージの貪食機能を増強させる試薬は、抗ＣＤ４７抗体である。別の実施形態において、前記第２の抗腫瘍試薬は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の作用を増強させ、例えば、細胞媒介性免疫応答の負的制御を遮断又は逆転させることにより、例えば、阻害性受容体を標的とすることにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の作用を増強させる。１つの具体的な実施形態において、前記第２の抗腫瘍試薬は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１又は４－１ＢＢに特異的に結合する抗体である。別の実施形態において、本願の抗ＣＤ９８抗体は、マクロファージを枯渇させる試薬（例えば、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体）と併用することができない。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１は、Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおけるＨＮ２－Ｇ９及び対照としてのＩＧＮ５２３の抗腫瘍活性を示す。Ｒａｊｉ腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを平均腫瘍体積が類似する３群にランダムに分ける。１０ｍｇ／ｋｇの抗体の抗腫瘍活性を測定する。腫瘍体積は、平均値±ＳＥＭとして示す。（ｎ．ｓ．：有意差がない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析）。同様の統計的方法及び図例は、後述する腫瘍体積に関する全ての線付きスキャッタグラムに適用される。
【図2】図２は、ＦＡＣＳにより測定した、ＩＧＮ５２３、ＨＮ２－Ｇ９及びＳ１－Ｆ４の結合特異性及び親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）を示す。野生型（ＷＴ）ＣＨＯ又はＣＨＯ－ｈＣＤ９８細胞は、示された濃度の各抗体とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。結合は、ＦＩＴＣの蛍光強度から特定される。
【図4】図４は、Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４、及び対照としてのリツキシマブとＩＧＮ５２３の抗腫瘍活性を示す。Ｒａｊｉ腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを平均腫瘍体積が類似する３群にランダムに分ける。１０ｍｇ／ｋｇの抗体の抗腫瘍活性を測定する。
【図6】図６及び図７は、ＨｅｐＧ２（図６）及びＲａｍｏｓ（図７）腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を示す。ＨｅｐＧ２腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス又はＲａｍｏｓ腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを平均腫瘍体積が類似する４－５群にランダムに分け、示された使用量のＳ１－Ｆ４で処理する。
【図7】図６及び図７は、ＨｅｐＧ２（図６）及びＲａｍｏｓ（図７）腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を示す。ＨｅｐＧ２腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス又はＲａｍｏｓ腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを平均腫瘍体積が類似する４－５群にランダムに分け、示された使用量のＳ１－Ｆ４で処理する。
【図8】図８は、ＨＬ６０、ＨＣＴ－８、ＢｘＰＣ－３及びＰＡＮＣ－１腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を示す。ＨＬ６０、ＢｘＰＣ－３又はＨＣＴ－８腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス又はＰＡＮＣ－１腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを、腫瘍体積が類似する対照群又はＳ１－Ｆ４（１５ｍｇ／ｋｇ）投与群の２群にランダムに分ける。抗体処理の時点は、矢印で表記する。
【図9】図９は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウスを、平均腫瘍体積が類似する溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）とＳ１－Ｆ４（１５ｍｇ／ｋｇ）の２群にランダムに分ける。模式図は、腫瘍接種のタイムライン及びＳ１－Ｆ４処理スキームを示す。腫瘍接種後８、１８、２９、４１日目に生物発光イメージング分析を行う。
【図10】図１０は、ＨＣＴ １１６、Ａ５４９、Ａ－４３１、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨＴ－２９腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を示す。ＨＣＴ １１６、Ａ５４９又はＡ－４３１腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス又はＨｅｐ３Ｂ又はＨＴ－２９腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウスを、平均腫瘍体積が類似する溶媒又はＳ１－Ｆ４（１５ｍｇ／ｋｇ）の２群にランダムに分ける。抗体処理の時点は、矢印で表記する。腫瘍体積は、平均値±ＳＥＭとして示す。（ｎ．ｓ．：有意差がない、二元配置分散分析）。
【図11A-E】図１１Ａ－Ｆは、ＣＤ９８ヒト化マウスの構築ストラテジー及びＣＤ９８発現の分析を示す。（Ａ）模式図は、ｈＣＤ９８ ＥＣＤカセットをマウスＳｌｃ３ａ２遺伝子座に挿入するストラテジーを示す。ｓｇＲＮＡ－ＣＤ９８及び示されたＰＣＲプライマーの標的アレル及び野生型アレルにおける位置を示す。（Ｂ－Ｄ）Ｆ０世代マウスのゲノムＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動である。使用したプライマー対（表２参照）は、Ｙ１－Ｆ／Ｙ１－Ｒ（Ｂ）、ＷＴ１－Ｆ／ＷＴ１－Ｒ（Ｃ）、及びＩＦ－１／Ｙ１－Ｒ（Ｄ）である。（Ｅ）マウスＣＤ９８（ｍＣＤ９８）ＥＣＤに対する抗マウスＣＤ９８抗体ＢＣ８の結合の動力学的分析である。（Ｆ）ＦＡＣＳによりＢＣ８の結合特異性及び親和性を測定する。ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ｍＣＤ９８細胞を示された濃度のＢＣ８とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。結合は、ＦＩＴＣの蛍光強度から特定される。
【図11F】図１１Ａ－Ｆは、ＣＤ９８ヒト化マウスの構築ストラテジー及びＣＤ９８発現の分析を示す。（Ａ）模式図は、ｈＣＤ９８ ＥＣＤカセットをマウスＳｌｃ３ａ２遺伝子座に挿入するストラテジーを示す。ｓｇＲＮＡ－ＣＤ９８及び示されたＰＣＲプライマーの標的アレル及び野生型アレルにおける位置を示す。（Ｂ－Ｄ）Ｆ０世代マウスのゲノムＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ反応産物のゲル電気泳動である。使用したプライマー対（表２参照）は、Ｙ１－Ｆ／Ｙ１－Ｒ（Ｂ）、ＷＴ１－Ｆ／ＷＴ１－Ｒ（Ｃ）、及びＩＦ－１／Ｙ１－Ｒ（Ｄ）である。（Ｅ）マウスＣＤ９８（ｍＣＤ９８）ＥＣＤに対する抗マウスＣＤ９８抗体ＢＣ８の結合の動力学的分析である。（Ｆ）ＦＡＣＳによりＢＣ８の結合特異性及び親和性を測定する。ＷＴ ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３Ｔ－ｍＣＤ９８細胞を示された濃度のＢＣ８とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。結合は、ＦＩＴＣの蛍光強度から特定される。
【図12】図１２は、免疫蛍光染色法によるマウスの腎臓におけるＣＤ９８の発現の分析を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣＤ９８ヒト化マウス由来の腎臓サンプルを、ＢＣ８（ｍＣＤ９８特異的抗体、１５μｇ／ｍｌ）又はＩＧＮ５２３（ｈＣＤ９８特異的抗体、１５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。拡大倍率は×１．３である。
【図13】図１３は、ＦＡＣＳ分析によるマウスの白血球におけるＣＤ９８の発現を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣＤ９８ヒト化マウスの白血球をＢＣ８又はＳ１－Ｆ４（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。
【図14】図１４は、ＦＡＣＳ分析によるマウスのがん細胞におけるｈＣＤ９８及びｍＣＤ９８の発現を示す。細胞をＳ１－Ｆ４又はＢＣ８（１５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で標識する。
【図16】図１６Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４及びそのＦｃバリアントによって誘導されるＡＤＣＣエフェクター機能を示す。ＡＤＣＣ活性をＬＤＨ放出法で測定する。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。（Ａ）エフェクター細胞としてＮＫ９２－ＭＩｈＣＤ１６細胞を用い、標的細胞としてＲａｊｉ又はＨｅｐＧ２細胞を用いる。Ｅ：Ｔ比は７：１である。示された濃度の抗体を測定する。（ｎ．ｓ．：有意差がない、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析）。（Ｂ）標的細胞としてＲａｊｉ細胞を用いる。左：エフェクター細胞としてｍＢＭＤＭを用いる。示された濃度の対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４を測定する。Ｅ：Ｔ比は１：１である。（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析）。右：エフェクター細胞としてｈＰＢＭＣを用いる。溶媒又はＳ１－Ｆ４（１０μｇ／ｍｌ）とする。Ｅ：Ｔ比は１０：１である。（＊＊ｐ＜０．０１、ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図17A】図１７Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４及びそのＦｃバリアントによって誘導されるＡＤＣＰエフェクター機能を示す。（Ａ）Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）をＣＦＳＥ蛍光色素で標識した後、抗Ｆ４／８０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３抗体で標識したマウス骨髄由来マクロファージ（ｍＢＭＤＭ）と混合する。Ｅ：Ｔ比は１：２である。ＡＤＣＰ活性を蛍光顕微鏡でモニターし、１００個のエフェクター細胞あたりのＣＦＳＥ陽性標的細胞の数として貪食指数を測定する。縮尺は１００μｍである。（Ｂ）エフェクター細胞としてｈＰＢＭＣを用いる。Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）は、ＣＦＳＥ蛍光色素で標識された後、Ｄｅｅｐ－Ｒｅｄで標識されたｈＰＢＭＣと混合される。対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４（１０μｇ／ｍｌ）とする。Ｅ：Ｔ比は１．５：１である。ＡＤＣＰ活性を蛍光顕微鏡でモニターする。典型的な顕微鏡写真を示す。縮尺は１００μｍである。
【図17B】図１７Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４及びそのＦｃバリアントによって誘導されるＡＤＣＰエフェクター機能を示す。（Ａ）Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）をＣＦＳＥ蛍光色素で標識した後、抗Ｆ４／８０－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３抗体で標識したマウス骨髄由来マクロファージ（ｍＢＭＤＭ）と混合する。Ｅ：Ｔ比は１：２である。ＡＤＣＰ活性を蛍光顕微鏡でモニターし、１００個のエフェクター細胞あたりのＣＦＳＥ陽性標的細胞の数として貪食指数を測定する。縮尺は１００μｍである。（Ｂ）エフェクター細胞としてｈＰＢＭＣを用いる。Ｒａｊｉ細胞（標的細胞）は、ＣＦＳＥ蛍光色素で標識された後、Ｄｅｅｐ－Ｒｅｄで標識されたｈＰＢＭＣと混合される。対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４（１０μｇ／ｍｌ）とする。Ｅ：Ｔ比は１．５：１である。ＡＤＣＰ活性を蛍光顕微鏡でモニターする。典型的な顕微鏡写真を示す。縮尺は１００μｍである。
【図18】図１８Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４及びそのバリアントによるＣＤＣエフェクター機能（Ａ）及びヒトＣ１ｑとの結合（Ｂ）を示す。（Ａ）１０％ヒト補体血清の存在下で、Ｒａｊｉ細胞を示された抗体とインキュベートする。ＬＤＨ放出法でＣＤＣ活性を測定する。１０μｇ／ｍｌで抗体を測定する。（Ｂ）Ｓ１－Ｆ４、Ｓ１－Ｆ４のＦｃバリアント、リツキシマブとヒトＣ１ｑとの結合は、ＥＬＩＳＡ法によって測定する。
【図19】図１９は、Ｓ１－Ｆ４によるＨｅｐＧ２とＲａｊｉ細胞のＨＰＧ輸送に対する影響を示す。ＨｅｐＧ２細胞又はＲａｊｉ細胞をそれぞれ対照ＩｇＧ（１５μｇ／ｍｌ）、Ｓ１－Ｆ４（１５μｇ／ｍｌ）又はＢＣＨ（１０ｍＭ）とインキュベートした後、ＨＰＧ（７０μＭ）を含む培地で培養する。その後、細胞溶解物中のＨＰＧをビオチン標識し、ＥＬＩＳＡ法による検出方法で、ストレプトアビジン－ＨＲＰを用いてビオチン化されたＨＰＧを検出する。ＨＰＧ摂取活性は、対照ＩｇＧ処理群のＨＰＧ摂取量に対する測定対象サンプルのＨＰＧ摂取量の百分率として示す。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。（ｎ．ｓ．：有意差がない、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）
【図20】図２０は、Ｓ１－Ｆ４によるＲａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＨｅｐＧ２及びＨＣＴ－８細胞の増殖に対する影響を示す。ＷＳＴ－８セルカウンティングキット－８（ＷＳＴ－８ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）を用いて細胞増殖を分析する。細胞を対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４と７２時間インキュベートする。細胞増殖百分率は、未処理群の検出値に対する測定対象サンプル群の百分率として示す。Ｒａｊｉ細胞又はＲａｍｏｓ細胞を示された濃度の対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４とインキュベートする。（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析）。ＨｅｐＧ２細胞又はＨＣＴ－８細胞を対照ＩｇＧ又はＳ１－Ｆ４（１５μｇ／ｍｌ）とインキュベートする。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。（ｎ．ｓ．：有意差がない、ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
【図21】図２１は、Ｓ１－Ｆ４及びそのＦｃバリアントによる、ＥＬ４－ｈＣＤ９８又はＭＣ３８－ｈＣＤ９８腫瘍を担持した（Ｓ１－Ｆ４又はＳ１－Ｆ４ＤＡＮＡ、５０ｍｇ／ｋｇ）ＣＤ９８ヒト化マウスにおける抗腫瘍活性、Ｒａｊｉ腫瘍を担持したＮＯＤ ＳＣＩＤマウス又はＨｅｐＧ２腫瘍を担持したＣＢ－１７ ＳＣＩＤマウス（対照ＩｇＧ、Ｓ１－Ｆ４、Ｓ１－Ｆ４ＫＡ又はＳ１－Ｆ４ＤＡＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇ）における抗腫瘍活性を示す。
【図22】図２２は、Ｓ１－Ｆ４抗体処理により、後続の腫瘍攻撃において抗腫瘍免疫を誘導したことを示す。Ｓ１－Ｆ４処理後に完全奏効（ＣＲ）に達したＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣ５７ＢＬ／６マウスに、最初に腫瘍細胞を接種してから７７日目に、それぞれＥＬ４－ｈＣＤ９８、ＥＬ４、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８又はＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞で再度攻撃をかける。年齢が類似する未試験のマウスを対照マウスとする。腫瘍細胞を（再度）接種した後、腫瘍の大きさを評価する。腫瘍体積は、平均値±ＳＥＭとして示す。無腫瘍マウスの割合を示す。
【図23】図２３Ａ－Ｂは、サル及びマウスにおけるＳ１－Ｆ４の薬物動態及び生物分布を示す。カニクイザルとマウスの血清におけるＳ１－Ｆ４濃度の時間に対するグラフである。Ｓ１－Ｆ４処理時間は、矢印で表記する。Ｓ１－Ｆ４の血清濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、平均値±ＳＥＭとして示す。サルへのＳ１－Ｆ４の単回投与量（ｉ．ｖ．）は、２０ｍｇ／ｋｇである（Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６又はＣＤ９８ヒト化マウスへのＳ１－Ｆ４の単回投与量（ｉ．ｐ．）は、１５ｍｇ／ｋｇである（Ｂ）。
【図24A】図２４Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７（１５ｍｇ／ｋｇ）又は溶媒を注射してから５３時間後に処分したＣＤ９８ヒト化マウスの典型的な解剖画像（Ａ）を示す。腎臓におけるＳ１－Ｆ４の濃化（Ｂ）は、免疫蛍光染色により分析する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣＤ９８ヒト化マウスを溶媒又はＳ１－Ｆ４（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理し、２日後にマウス腎臓サンプルを採取し、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体でインキュベートする。その後、ＦＩＴＣの蛍光強度からＳ１－Ｆ４の濃化を測定する。拡大倍率はＸ１．３である。
【図24B】図２４Ａ－Ｂは、Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７（１５ｍｇ／ｋｇ）又は溶媒を注射してから５３時間後に処分したＣＤ９８ヒト化マウスの典型的な解剖画像（Ａ）を示す。腎臓におけるＳ１－Ｆ４の濃化（Ｂ）は、免疫蛍光染色により分析する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＣＤ９８ヒト化マウスを溶媒又はＳ１－Ｆ４（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理し、２日後にマウス腎臓サンプルを採取し、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体でインキュベートする。その後、ＦＩＴＣの蛍光強度からＳ１－Ｆ４の濃化を測定する。拡大倍率はＸ１．３である。
【図29】図２９及び図３０は、Ｈ１５Ｌ５４が腫瘍中のＣＤ９８と優先的に結合することを示す。Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７又はＨ１５Ｌ５４－Ｃｙ７（１５ｍｇ／ｋｇ）でＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣＤ９８ヒト化マウスを処理する。注射後の４６時間、９０時間及び１６０時間で器官に対してイメージング分析を行う。（Ａ）典型的画像である。（Ｂ）定量化された組織生物分布である。平均発光強度は、平均値±ＳＥＭとして示す。
【図30】図２９及び図３０は、Ｈ１５Ｌ５４が腫瘍中のＣＤ９８と優先的に結合することを示す。Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７又はＨ１５Ｌ５４－Ｃｙ７（１５ｍｇ／ｋｇ）でＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣＤ９８ヒト化マウスを処理する。注射後の４６時間、９０時間及び１６０時間で器官に対してイメージング分析を行う。（Ａ）典型的画像である。（Ｂ）定量化された組織生物分布である。平均発光強度は、平均値±ＳＥＭとして示す。
【図31】図３１は、ＣＤ９８ヒト化マウスの腎臓細胞における示された抗体の濃化を示す。マウスを１５ｍｇ／ｋｇの示された抗体で処理する。２日後にマウス腎臓サンプルを採取し、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体とインキュベートする。その後、ＦＩＴＣの蛍光強度からＳ１－Ｆ４の濃化を測定する。画像は、ＩｎｆｏｒｍソフトによりＩＨＣ画像に変換される。拡大倍率はＸ２０である。
【図32】図３２は、ＣＤ９８ヒト化マウスの血清中における抗体濃度の経時変化を示すグラフである。０日目に、示された抗体（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）でマウスを処理する。Ｓ１－Ｆ４又はＨ１５Ｌ５４の血清濃度は、ＥＬＩＳＡ法により測定し、平均値±ＳＥＭとして示す。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本明細書の他の箇所に明確に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野における当業者に一般的に理解される意味を有する。
【0039】
材料及び方法
実験モデル及び実験対象の詳細
承認されたＩＡＣＵＣスキームに従ってＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）でカニクイザル実験を行った。
実験モデル及び実験対象の詳細
承認されたＩＡＣＵＣスキームに従ってＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）でカニクイザル実験を行った。
【0040】
中国国家実験動物の飼育及び介護ガイドラインに従い、且つ承認されたＩＡＣＵＣスキームで、北京生命科学研究所でマウス実験を行った。Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＢ－１７ ＳＣＩＤ及びＮＯＤ ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した。ＣＤ１１ｃ－ＤＴＲマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ実験室から購入した。ＣＤ９８ヒト化マウスは、北京生命科学研究所の動物介護施設で飼育及び維持された。
【0041】
ＣＨＯ又はＣＨＯ誘導細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｔ誘導細胞株、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ、Ａ５４９、ＰＡＮＣ－１、ＥＬ４－ｈＣＤ９８及びＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）で培養した。Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＨＬ６０、ＢｘＰＣ－３、ＨＣＴ－８、ＨＴ－２９、ＨＣＴ １１６、Ａ－４３１、ＭＣ３８－ｈＣＤ９８及びＭＣＡ２０５－ｈＣＤ９８細胞は、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。これらの細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーターで培養した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであり、メーカーのプロトコールに従って培養した。
【0042】
タンパク質の発現及び精製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、Ｈｉｓ６－Ａｖｉタグ付きの融合タンパク質ＣＤ９８ ＥＣＤ又はＦｃγＲｓを産生し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全長ＩｇＧ抗体は、ＧＣ３３（Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、２００８）及びＩＧＮ５２３（Ｈａｙｅｓら、２０１５）を含み、それぞれＶＨ及びＶＬのコード配列をヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖（ＨＣ）発現ベクター及びＬ鎖（ＬＣ）発現ベクターにサブクローニングした。２種類のＩｇＧ発現プラスミド（ＨＣプラスミド＋ＬＣプラスミド）を１：１の割合で２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション３－６日後、細胞培養上清を収集し、プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）アフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧ１を精製した。
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞を一過性トランスフェクションすることにより、Ｈｉｓ６－Ａｖｉタグ付きの融合タンパク質ＣＤ９８ ＥＣＤ又はＦｃγＲｓを産生し、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。全長ＩｇＧ抗体は、ＧＣ３３（Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、２００８）及びＩＧＮ５２３（Ｈａｙｅｓら、２０１５）を含み、それぞれＶＨ及びＶＬのコード配列をヒトＩｇＧ１ Ｈ鎖（ＨＣ）発現ベクター及びＬ鎖（ＬＣ）発現ベクターにサブクローニングした。２種類のＩｇＧ発現プラスミド（ＨＣプラスミド＋ＬＣプラスミド）を１：１の割合で２９３Ｆ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション３－６日後、細胞培養上清を収集し、プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）アフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧ１を精製した。
【0043】
抗体ライブラリーのパンニング及び抗ＣＤ９８抗体のスクリーニング
抗ｈＣＤ９８抗体（例えばＨＮ２－Ｇ９）又は抗マウスＣＤ９８抗体（例えばＢＣ８）を生成するために、ヒト又はマウスＣＤ９８のＥＣＤとＨｉｓ６－Ａｖｉタグとを融合させ、ＢｉｒＡリガーゼによりビオチン標識した。これらの２種類のタンパク質は、ヒト非免疫抗体ライブラリー（Ｌｉら、２０１７）を用いたパンニング実験において抗原として用いられた。ＣＤ９８ ＥＣＤに特異的に結合する２回のパンニングにより、ファージ－ｓｃＦｖをスクリーニングした。約４００個のモノクローナルをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡ法によりヒト又はマウスＣＤ９８と結合するモノクローナルをスクリーニングした。選択されたクローンにより、精製されたファージ－ｓｃＦｖ粒子を生成し、又はさらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
抗ｈＣＤ９８抗体（例えばＨＮ２－Ｇ９）又は抗マウスＣＤ９８抗体（例えばＢＣ８）を生成するために、ヒト又はマウスＣＤ９８のＥＣＤとＨｉｓ６－Ａｖｉタグとを融合させ、ＢｉｒＡリガーゼによりビオチン標識した。これらの２種類のタンパク質は、ヒト非免疫抗体ライブラリー（Ｌｉら、２０１７）を用いたパンニング実験において抗原として用いられた。ＣＤ９８ ＥＣＤに特異的に結合する２回のパンニングにより、ファージ－ｓｃＦｖをスクリーニングした。約４００個のモノクローナルをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡ法によりヒト又はマウスＣＤ９８と結合するモノクローナルをスクリーニングした。選択されたクローンにより、精製されたファージ－ｓｃＦｖ粒子を生成し、又はさらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
【0044】
ＶＨ鎖置換サブライブラリの構築及び選択
ＨＮ２－Ｇ９のＶＬ遺伝子を、９３名の健常ドナーからの非免疫ＶＨ遺伝子（～１×１０１０）のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を含むファージベクターにクローニングした。構築された鎖置換サブライブラリーのサイズは、～１×１０８である。捕捉されたＣＤ９８ ＥＣＤ－Ｈｉｓ６Ａｖｉを利用した上記の抗体ライブラリー選択と同様に、ライブラリー選択を３回行ったが、相違点は、３回目のパンニングにおいてＨＮ２－Ｇ９ ＩｇＧ１を競合抗体として導入したことである。約４００個のモノクローナルをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡ法によりｈＣＤ９８と結合するモノクローナルをスクリーニングした。選択されたクローンにより、精製されたファージ－ｓｃＦｖ粒子を生成し、又はさらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
ＨＮ２－Ｇ９のＶＬ遺伝子を、９３名の健常ドナーからの非免疫ＶＨ遺伝子（～１×１０１０）のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を含むファージベクターにクローニングした。構築された鎖置換サブライブラリーのサイズは、～１×１０８である。捕捉されたＣＤ９８ ＥＣＤ－Ｈｉｓ６Ａｖｉを利用した上記の抗体ライブラリー選択と同様に、ライブラリー選択を３回行ったが、相違点は、３回目のパンニングにおいてＨＮ２－Ｇ９ ＩｇＧ１を競合抗体として導入したことである。約４００個のモノクローナルをランダムに選択し、ＥＬＩＳＡ法によりｈＣＤ９８と結合するモノクローナルをスクリーニングした。選択されたクローンにより、精製されたファージ－ｓｃＦｖ粒子を生成し、又はさらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
【0045】
ファージディスプレイヒト非免疫ＦａｂライブラリーからのｐＨ依存性抗ｈＣＤ９８抗体のスクリーニング
ｐＨ依存性抗体をスクリーニングするために、構築されたファージ－ＦａｂライブラリーとｈＣＤ９８ ＥＣＤ－Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－Ｂｉｏｔｉｎタンパク質をｐＨ６．５の溶液でインキュベートし、ｐＨ６．５の洗浄緩衝液で洗浄した後、ｐＨ７．４の緩衝液で溶出した。次に、モノクローナルをランダムに選択し、ｐＨ６．５及びｐＨ７．４でｈＣＤ９８と結合するモノクローナルをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ｐＨ６．５でのＣＤ９８との結合がｐＨ７．４よりも顕著に良いクローンは、さらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
ｐＨ依存性抗体をスクリーニングするために、構築されたファージ－ＦａｂライブラリーとｈＣＤ９８ ＥＣＤ－Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－Ｂｉｏｔｉｎタンパク質をｐＨ６．５の溶液でインキュベートし、ｐＨ６．５の洗浄緩衝液で洗浄した後、ｐＨ７．４の緩衝液で溶出した。次に、モノクローナルをランダムに選択し、ｐＨ６．５及びｐＨ７．４でｈＣＤ９８と結合するモノクローナルをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ｐＨ６．５でのＣＤ９８との結合がｐＨ７．４よりも顕著に良いクローンは、さらなる特徴付けに用いられるために全長ヒトＩｇＧ１の形式に変換した。
【0046】
ＥＬＩＳＡ法による結合測定
ＥＬＩＳＡ法による抗体と抗原の結合分析を行うために、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ(登録商標)）によってビオチン化されたタンパク質抗原を捕捉した。その後、連続希釈した抗体を加え、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより検出した。
ＥＬＩＳＡ法による抗体と抗原の結合分析を行うために、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ(登録商標)）によってビオチン化されたタンパク質抗原を捕捉した。その後、連続希釈した抗体を加え、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより検出した。
【0047】
ＥＬＩＳＡ法による抗体とヒトＣ１ｑとの結合分析を行うために、連続希釈した抗体を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ(登録商標)）にコーティングした。その後、３％ヒト由来の補体血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、ＨＲＰ標識ヒツジポリクローナル抗ヒトＣ１ｑ（Ａｂｃａｍ）を添加することにより検出した。
【0048】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合動力学解析
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において抗ＣＤ９８抗体と、ＣＤ９８のＥＣＤ及びＦｃγＲｓのＥＣＤとの結合の動力学解析を行った。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、抗ｈＦｃ抗体又はプロテインＡ／Ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＣＭ５センサチップの表面に共有結合させた。チップ上に最適濃度の抗体を捕捉し、その後２倍連続希釈した濃度の分析物（ＣＤ９８又はＦｃγＲｓ）を流した。１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて結合動力学を評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトを用いてｋａ、ｋｄ及びＫＤ値を算出した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において抗ＣＤ９８抗体と、ＣＤ９８のＥＣＤ及びＦｃγＲｓのＥＣＤとの結合の動力学解析を行った。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、抗ｈＦｃ抗体又はプロテインＡ／Ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＣＭ５センサチップの表面に共有結合させた。チップ上に最適濃度の抗体を捕捉し、その後２倍連続希釈した濃度の分析物（ＣＤ９８又はＦｃγＲｓ）を流した。１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルを用いて結合動力学を評価した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトを用いてｋａ、ｋｄ及びＫＤ値を算出した。
【0049】
細胞株のフローサイトメトリー解析
腫瘍細胞株におけるＣＤ９８の発現を検査するために、抗ＣＤ９８抗体で腫瘍細胞を標識した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。ＦＩＴＣにより腫瘍細胞株におけるＣＤ９８発現を検出した。
腫瘍細胞株におけるＣＤ９８の発現を検査するために、抗ＣＤ９８抗体で腫瘍細胞を標識した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。ＦＩＴＣにより腫瘍細胞株におけるＣＤ９８発現を検出した。
【0050】
ＣＤ９８バリアントに結合した抗体を検査するために、異なるアラニン突然変異を含むｈＣＤ９８－ＧＬ発現プラスミドを構築した。そして、これらのプラスミドでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。２日後、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＩＧＮ５２３（Ｈａｙｅｓら、２０１５）、Ｓ１－Ｆ４又は抗ＧＬ抗体（ＧＣ３３）（Ｉｓｈｉｇｕｒｏら、（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８、第９８３２－９８３８頁）で標識し、次いでヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。
【0051】
組織処理及び免疫細胞のフローサイトメトリー解析
腫瘍体積が５００ｍｍ３を超えた場合、異種移植モデルマウスを抗体で処理した。処理３日後、マウスから腫瘍を採取し、単細胞懸濁液でＦＡＣＳ解析を行った。簡単に説明すると、腫瘍を単離し、赤血球溶解液（Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で処理した。細胞懸濁液を４０μｍのセルフィルターに通し、単細胞懸濁液を得た。そして、各種の抗体（主要資源表、Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔａｂｌｅ）で細胞を標識した。
腫瘍体積が５００ｍｍ３を超えた場合、異種移植モデルマウスを抗体で処理した。処理３日後、マウスから腫瘍を採取し、単細胞懸濁液でＦＡＣＳ解析を行った。簡単に説明すると、腫瘍を単離し、赤血球溶解液（Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）で処理した。細胞懸濁液を４０μｍのセルフィルターに通し、単細胞懸濁液を得た。そして、各種の抗体（主要資源表、Ｋｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔａｂｌｅ）で細胞を標識した。
【0052】
ヒト又はマウスＣＤ９８発現細胞株の構築
まず、ヒト又はマウスＣＤ９８コードＤＮＡを挿入することにより、発現プラスミドを構築した。その後、発現プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＥＬ４、ＭＣ３８、ＭＣＡ２０５又はＢ１６Ｆ１０細胞にトランスフェクトした。ｈＣＤ９８を安定的に発現した細胞株を生成するために、トランスフェクション後、ＦＡＣＳでｈＣＤ９８を発現した細胞を選別し、Ｇ４１８を含む培地で培養した。
まず、ヒト又はマウスＣＤ９８コードＤＮＡを挿入することにより、発現プラスミドを構築した。その後、発現プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＥＬ４、ＭＣ３８、ＭＣＡ２０５又はＢ１６Ｆ１０細胞にトランスフェクトした。ｈＣＤ９８を安定的に発現した細胞株を生成するために、トランスフェクション後、ＦＡＣＳでｈＣＤ９８を発現した細胞を選別し、Ｇ４１８を含む培地で培養した。
【0053】
細胞増殖測定
ＷＳＴ－８セルカウンティングキット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞増殖を分析した。１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（１０,０００－２５,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに播種し、７２時間インキュベートした。その後、各ウェルにＣＣＫ－８溶液（１０μｌ）を加え、３７℃で１－４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖百分率は、未処理群の細胞総数に対する測定対象サンプル群の細胞総数の百分率として表される。
ＷＳＴ－８セルカウンティングキット－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞増殖を分析した。１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した細胞（１０,０００－２５,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６ウェルプレートに播種し、７２時間インキュベートした。その後、各ウェルにＣＣＫ－８溶液（１０μｌ）を加え、３７℃で１－４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖百分率は、未処理群の細胞総数に対する測定対象サンプル群の細胞総数の百分率として表される。
【0054】
アミノ酸摂取測定
増殖培地において、細胞を１５μｇ／ｍｌの抗体と２４時間インキュベートした。その後、Ｍｅｔを含まないＤＭＥＭを用いて３７℃で細胞を３０分間平衡化した。細胞に最終濃度が７０μＭのＨＰＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。ＨＰＧの添加と同時に、陽性対照として、最終濃度が１０μＭのＢＣＨ（２－アミノ－２－ノルボルナン－カルボン酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。２－３時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解バッファー（１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で細胞を溶解した。細胞溶解液中のＨＰＧを、メーカーの取扱説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってビオチン標識した。その後、細胞溶解液を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ(登録商標)）に移し、４℃で一晩インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡ法による測定により、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞溶解物中のＨＧＰの量を検出した。
増殖培地において、細胞を１５μｇ／ｍｌの抗体と２４時間インキュベートした。その後、Ｍｅｔを含まないＤＭＥＭを用いて３７℃で細胞を３０分間平衡化した。細胞に最終濃度が７０μＭのＨＰＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えた。ＨＰＧの添加と同時に、陽性対照として、最終濃度が１０μＭのＢＣＨ（２－アミノ－２－ノルボルナン－カルボン酸）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。２－３時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む溶解バッファー（１％ＳＤＳを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で細胞を溶解した。細胞溶解液中のＨＰＧを、メーカーの取扱説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってビオチン標識した。その後、細胞溶解液を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ(登録商標)）に移し、４℃で一晩インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡ法による測定により、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞溶解物中のＨＧＰの量を検出した。
【0055】
ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ測定
ＡＤＣＣ測定を行うために、標的細胞（１０,０００－２０,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＵ形底の９６ウェル細胞培養プレートのウェルに接種し、各濃度の異なる抗体としばらくインキュベートした。その後、エフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝４：１－１０：１）を標的細胞と抗体を含むウェルに加え、５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃で４－８時間インキュベートした。Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の取扱説明書に従って、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によりＡＤＣＣ活性を測定した。細胞傷害率は、メーカーの取扱説明書に従って算出した。
ＡＤＣＣ測定を行うために、標的細胞（１０,０００－２０,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）をＵ形底の９６ウェル細胞培養プレートのウェルに接種し、各濃度の異なる抗体としばらくインキュベートした。その後、エフェクター細胞（Ｅ：Ｔ＝４：１－１０：１）を標的細胞と抗体を含むウェルに加え、５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃で４－８時間インキュベートした。Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）の取扱説明書に従って、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出によりＡＤＣＣ活性を測定した。細胞傷害率は、メーカーの取扱説明書に従って算出した。
【0056】
ＡＤＣＰ測定を行うために、マウス骨髄由来マクロファージ（ｍＢＭＤＭ）とヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脛骨及び大腿骨からマウス骨髄細胞を採取し、Ｌ９２９上清中でＧＭ－ＣＳＦにより３日間誘導し、ｍＢＭＤＭを作製した。Ｒａｊｉ細胞をＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、標的細胞として用いた。抗マウスＦ４／８０－Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でｍＢＭＤＭを標識した後、標的細胞とインキュベートした。ＣＦＳＥ標識標的細胞を異なる抗体と室温で１５分間インキュベートした後、１：２のＥ：Ｔ比率で、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中の標識されたｍＢＭＤＭに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ニコンＡ１Ｒ共焦点顕微鏡を用いて、抗マウスＦ４／８０抗体標識マクロファージによるＣＦＳＥ標識標的細胞に対する貪食作用を記録した。２０ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）でｈＰＢＭＣを９日間分化誘導し、それをエフェクターマクロファージとして使用した。ｈＰＢＭＣによるＡＤＣＰ測定は、ｈＰＢＭＣをＤｅｅｐ－Ｒｅｄ色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した以外は、上記と同様である。
【0057】
ＣＤＣ測定を行うために、標的細胞を４００,０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＵ形底の９６ウェルプレートに接種し、５％のヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で各種抗体とインキュベートした。２時間インキュベートした後、Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して各ウェルの上清中のＬＤＨ放出を分析した。
【0058】
サルにおけるＳ１－Ｆ４の薬物動態及び安全性評価
体重約３ｋｇの健康なカニクイザル（３－４歳）に対して、０日目と１５日目にＳ１－Ｆ４を静脈注射（ｉ．ｖ．）した。異なる時点で血液試料を採取し、ｈＣＤ９８結合ＥＬＩＳＡ法により抗体の血清濃度を測定した。その後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で抗体血清濃度を算出してプロットした。ＰＫデータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで評価した。ＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）で、所定の時点での体重、体温、血液生化学（アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びクレアチニン）、赤血球含量（ＲＢＣ）及び白血球含量（ＷＢＣ）を評価した。
体重約３ｋｇの健康なカニクイザル（３－４歳）に対して、０日目と１５日目にＳ１－Ｆ４を静脈注射（ｉ．ｖ．）した。異なる時点で血液試料を採取し、ｈＣＤ９８結合ＥＬＩＳＡ法により抗体の血清濃度を測定した。その後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で抗体血清濃度を算出してプロットした。ＰＫデータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで評価した。ＪＯＩＮＮ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）で、所定の時点での体重、体温、血液生化学（アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びクレアチニン）、赤血球含量（ＲＢＣ）及び白血球含量（ＷＢＣ）を評価した。
【0059】
マウスにおける薬物動態分析
６－８週齢のＣ５７ＢＬ／６又はＣＤ９８ヒト化マウスを本実験に用いた。分析対象抗体を一回腹腔注射（ｉ．ｐ．）した後、異なる時点で血液を採取した。ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、血清中の抗体濃度を測定した。その後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で抗体血清濃度を算出してプロットした。ＰＫデータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで評価した。
６－８週齢のＣ５７ＢＬ／６又はＣＤ９８ヒト化マウスを本実験に用いた。分析対象抗体を一回腹腔注射（ｉ．ｐ．）した後、異なる時点で血液を採取した。ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ定量キット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、血清中の抗体濃度を測定した。その後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で抗体血清濃度を算出してプロットした。ＰＫデータをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで評価した。
【0060】
Ｓ１－Ｆ４ ｓｃＦｖ及びｈＣＤ９８ ＥＣＤ複合体の構造特徴付け
Ｘ線結晶学的解析を行うために、Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６とｈＣＤ９８ ＥＣＤ組換えタンパク質を用いた。ｈＣＤ９８ ＥＣＤのアミノ酸配列は、ｈＣＤ９８のＧｌｕ１１１－Ａｌａ５２９残基に対応する。Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞で発現され、ｈＣＤ９８ ＥＣＤは、大腸菌で発現された。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースマイクロビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりＳ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６を精製し、まず同じマイクロビーズ、続いてＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりｈＣＤ９８ ＥＣＤを精製した。そして、Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６とｈＣＤ９８ ＥＣＤとを混合して複合体を形成し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。タンパク質１μＬ（１０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解させた）を０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム二水和物（ｐＨ５．０、９％ＰＥＧ２００００、５％ＰＥＧ４００、９％グリセロール）を含むストック溶液１μＬと混合し、精製したＳ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６／ｈＣＤ９８ ＥＣＤ複合体をハンギングドロップ蒸気拡散法により２０℃で濃縮し、結晶化させた。
Ｘ線結晶学的解析を行うために、Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６とｈＣＤ９８ ＥＣＤ組換えタンパク質を用いた。ｈＣＤ９８ ＥＣＤのアミノ酸配列は、ｈＣＤ９８のＧｌｕ１１１－Ａｌａ５２９残基に対応する。Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞で発現され、ｈＣＤ９８ ＥＣＤは、大腸菌で発現された。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースマイクロビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によりＳ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６を精製し、まず同じマイクロビーズ、続いてＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりｈＣＤ９８ ＥＣＤを精製した。そして、Ｓ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６とｈＣＤ９８ ＥＣＤとを混合して複合体を形成し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。タンパク質１μＬ（１０ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解させた）を０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム二水和物（ｐＨ５．０、９％ＰＥＧ２００００、５％ＰＥＧ４００、９％グリセロール）を含むストック溶液１μＬと混合し、精製したＳ１－Ｆ４－ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ６／ｈＣＤ９８ ＥＣＤ複合体をハンギングドロップ蒸気拡散法により２０℃で濃縮し、結晶化させた。
【0061】
７日後にラメラ結晶が現れた。上海同期放射光源のビームラインＢＬ１９Ｕ１でＸ線回折データを収集し、ＸＤＳにより処理した。ｈＣＤ９８ ＥＣＤ（ＰＤＢ ２ＤＨ２）構造を出発モデルとし、フェイザーによる分子置換法により２．８Åの分解能で構造を特定した。分子置換の初期モデルをＰｈｅｎｉｘでさらに完備させ、Ｃｏｏｔにより手動で再構築した。最終モデルは、Ｓ１－Ｆ４ ｓｃＦｖにおける２３５個の残基と、ｈＣＤ９８ ＥＣＤにおける１１５－５２６番目の残基とを含む。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ分析により、９６．５５％の残基がｆａｖｏｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎに位置しており、３．４１％の残基がａｌｌｏｗｅｄ ｒｅｇｉｏｎに位置していることが示された。
【0062】
インビボ腫瘍アッセイ
マウス腫瘍モデルは、６－８週齢のマウスに（１００μＬのＤＰＢＳ又は培地における）各種腫瘍細胞を皮下接種した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ細胞は雌マウスの乳腺脂肪パッドに接種した以外、残りの細胞は全て右側に接種した。異種移植腫瘍モデルは、マウスを類似した平均腫瘍体積に基づき、ランダムに群分けし（ｎ＝２－６／群）、各種抗体で腹腔注射した。同系腫瘍モデルは、腫瘍細胞（１×１０５個の細胞を含むＤＰＢＳ）を接種した後、マウスをランダムに群分けし（ｎ＝３－１０／群）、各種抗体で腹腔注射した。電子ノギスで腫瘍体積を測定し、修正された楕円体式１／２×（縦×横２）で腫瘍体積を算出した。腫瘍の長さが２ｃｍに達し、又は虚弱が観察された場合、マウスを処分した。異種移植腫瘍モデルに関する他の情報は、以下の表１に示す。
マウス腫瘍モデルは、６－８週齢のマウスに（１００μＬのＤＰＢＳ又は培地における）各種腫瘍細胞を皮下接種した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ細胞は雌マウスの乳腺脂肪パッドに接種した以外、残りの細胞は全て右側に接種した。異種移植腫瘍モデルは、マウスを類似した平均腫瘍体積に基づき、ランダムに群分けし（ｎ＝２－６／群）、各種抗体で腹腔注射した。同系腫瘍モデルは、腫瘍細胞（１×１０５個の細胞を含むＤＰＢＳ）を接種した後、マウスをランダムに群分けし（ｎ＝３－１０／群）、各種抗体で腹腔注射した。電子ノギスで腫瘍体積を測定し、修正された楕円体式１／２×（縦×横２）で腫瘍体積を算出した。腫瘍の長さが２ｃｍに達し、又は虚弱が観察された場合、マウスを処分した。異種移植腫瘍モデルに関する他の情報は、以下の表１に示す。
【0063】
【0064】
ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を除去するために、Ｓ１－Ｆ４処理の１日前に、腫瘍を担持したＣＤ９８ヒト化マウスに１５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ８α抗体（クローン２．４３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を３－５日毎に注射した。ＮＫ細胞を除去するために、Ｓ１－Ｆ４処理の１日前に、マウスに２．５ｍｇ／ｋｇの抗Ａｓｉａｌｏ－ＧＭ１ポリクローナル抗体（Ｐｏｌｙ２１４６０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を６日ごとに注射した。好中球を除去するために、Ｓ１－Ｆ４処理の１日前に、マウスに２０ｍｇ／ｋｇの抗Ｌｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を３日ごとに注射した。マクロファージを除去するために、Ｓ１－Ｆ４処理の１－２日前に、マウスに２５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＳＦ１Ｒ抗体（クローンＡＦＳ９８、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を３日ごとに注射した。樹状細胞を除去するために、Ｓ１－Ｆ４処理の１日前に、マウスに４μｇ／ｋｇのジフテリア毒素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２日ごとに注射した。上記の免疫細胞枯渇方法の有効性は、腫瘍非担持（ｔｕｍｏｒ－ｎａｉｖｅ）マウスを用いて実証された。
【0065】
腫瘍再攻撃研究を行うために、１×１０５個の腫瘍細胞を、Ｓ１－Ｆ４処理後にＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍完全奏効（ＣＲ）を示したＣ５７ＢＬ／６マウス及び年齢が類似する未試験のＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に接種した（左側にＥＬ４及びＥＬ４－ｈＣＤ９８を接種し、右側にＢ１６Ｆ１０及びＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８を接種した）。上記のように腫瘍を計測した。
【0066】
免疫蛍光標識アッセイ
マウスの腎臓における抗体の濃化を検出するために、各種抗体を注射してから２－３日後にマウスを処分した。そして、マウス腎臓を採取し、冷凍切片を作製した。腎臓切片をヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ポリクローナル抗体で標識した。Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、ＦＩＴＣにより腎臓細胞表面におけるＣＤ９８発現を検出した。
マウスの腎臓における抗体の濃化を検出するために、各種抗体を注射してから２－３日後にマウスを処分した。そして、マウス腎臓を採取し、冷凍切片を作製した。腎臓切片をヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ポリクローナル抗体で標識した。Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、ＦＩＴＣにより腎臓細胞表面におけるＣＤ９８発現を検出した。
【0067】
腫瘍中のＣＤ９８発現を検査するために、腫瘍を採取して凍結切片を作製した。腫瘍切片をＢＣ８又はＩＧＮ５２３（１０μｇ／ｍｌ）で標識した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。ニコンＡ１Ｒ共焦点顕微鏡を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３により腫瘍細胞表面におけるＣＤ９８発現を検出した。
【0068】
マウス組織におけるＣＤ９８発現を検査するために、各種のマウス組織を採取して凍結切片を作製した。切片をＢＣ８又はＩＧＮ５２３（１０μｇ／ｍｌ）で標識した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。ＦＩＴＣによりマウス組織におけるＣＤ９８発現を検出した。
【0069】
担腫瘍マウスにおける光学イメージング
ＩＶＩＳ分光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、担腫瘍マウスを光学イメージングし、Ｌｉｖｅ Ｉｍａｇｅ ４．４ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。同一の照明設定を用いて１つの実験での全ての画像を取得し、生物発光イメージングにおける通常の操作に従って蛍光発光スペクトルを正規化した。
ＩＶＩＳ分光計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、担腫瘍マウスを光学イメージングし、Ｌｉｖｅ Ｉｍａｇｅ ４．４ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。同一の照明設定を用いて１つの実験での全ての画像を取得し、生物発光イメージングにおける通常の操作に従って蛍光発光スペクトルを正規化した。
【0070】
ＣＤ９８ヒト化マウスにおける抗体－Ｃｙ７分布の蛍光イメージングを行うために、担腫瘍ＣＤ９８ヒト化マウス（ｎ＝２－３／群）に溶媒又はＣｙ７標識抗体（Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７（Ｃｙ７／抗体＝０．８４５）又はＨ１５Ｌ５４－Ｃｙ７（Ｃｙ７／抗体＝１．０７６））を腹腔内注射した。マウスを解剖し、異なる時点の蛍光画像を得た。蛍光画像は、７４５ｎｍ励起及び８００ｎｍ発光フィルタを備えたＩＶＩＳ分光計により取得した。
【0071】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ腫瘍モデルの生物発光イメージングは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ＬＮ腫瘍を担持したマウス（腹腔）に１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－フルオレセイン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注射した。Ｄ－フルオレセイン注射から１０分後に、腫瘍の生物発光を測定した。全ての群の全てのマウスが生存している最後の日まで、４－５日ごとにイメージングを行った。
【0072】
統計分析
本明細書において、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ)を用いて具体的比較を行い、ｐ値を関連図例に示す。二元配置分散分析又はｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を採用する。二元配置分散分析により抗腫瘍活性を分析する。ｐ＜０．０５は統計学的に有意であると考えられる（ｎ．ｓ．：有意差がない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
実施例
本明細書において、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ)を用いて具体的比較を行い、ｐ値を関連図例に示す。二元配置分散分析又はｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を採用する。二元配置分散分析により抗腫瘍活性を分析する。ｐ＜０．０５は統計学的に有意であると考えられる（ｎ．ｓ．：有意差がない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
実施例
【0073】
実施例１．抗ｈＣＤ９８抗体Ｓ１－Ｆ４の生成
ｈＣＤ９８細胞外ドメイン（ｈＣＤ９８ ＥＣＤ）を含む組換えタンパク質を生成し、非免疫ファージディスプレイ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ライブラリー（Ｌｉら、（２０１７）Ｅｌｉｆｅ６）から抗ｈＣＤ９８抗体を選択するために用いた。ｈＣＤ９８を発現したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＤ９８）に結合する抗体について、ＦＡＣＳによる解析を行い、パフォーマンスが最も良い抗体をスクリーニングした。７つの候補からＨＮ２－Ｇ９を同定し、異種移植マウス腫瘍モデル（Ｒａｊｉ、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫）を用いてその抗腫瘍活性を評価した。ＨＮ２－Ｇ９は、上記従来技術の抗ＣＤ９８抗体ＩＧＮ５２３（Ｈａｙｅｓら、２０１５）に相当する抗腫瘍活性を示した（図１）。しかしながら、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により、ＩＧＮ５２３に比べて、ＨＮ２－Ｇ９のＣＤ９８に対する結合親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）が比較的に低い（１．２９μＭ）ことを示した（図３）。
ｈＣＤ９８細胞外ドメイン（ｈＣＤ９８ ＥＣＤ）を含む組換えタンパク質を生成し、非免疫ファージディスプレイ一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ヒト抗体ライブラリー（Ｌｉら、（２０１７）Ｅｌｉｆｅ６）から抗ｈＣＤ９８抗体を選択するために用いた。ｈＣＤ９８を発現したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＣＤ９８）に結合する抗体について、ＦＡＣＳによる解析を行い、パフォーマンスが最も良い抗体をスクリーニングした。７つの候補からＨＮ２－Ｇ９を同定し、異種移植マウス腫瘍モデル（Ｒａｊｉ、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫）を用いてその抗腫瘍活性を評価した。ＨＮ２－Ｇ９は、上記従来技術の抗ＣＤ９８抗体ＩＧＮ５２３（Ｈａｙｅｓら、２０１５）に相当する抗腫瘍活性を示した（図１）。しかしながら、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により、ＩＧＮ５２３に比べて、ＨＮ２－Ｇ９のＣＤ９８に対する結合親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）が比較的に低い（１．２９μＭ）ことを示した（図３）。
【0074】
ＨＮ２－Ｇ９のＣＤ９８に対する結合親和性を向上させるために、可変領域重鎖（ＶＨ）の鎖置換法を採用し、ＨＮ２－Ｇ９に対して遺伝子工学的改変を行った（Ｌｉら、２０１７）。ＦＡＣＳ及びＳＰＲ分析の両方において、抗体（Ｓ１－Ｆ４）がＨＮ２－Ｇ９に比べて有意に高い結合親和力（５８．２ｎＭ）を有することが同定された（図２－３）。
【0075】
そして、Ｒａｊｉ異種移植腫瘍に対するＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を測定した。その結果、ＩＧＮ５２３よりも顕著に強い抗腫瘍作用を発揮し、且つリツキシマブ（ＦＤＡによって承認されたＢ細胞リンパ腫を治療するための抗ＣＤ２０抗体）の抗腫瘍作用と類似していることを示した（図４）。
【0076】
実施例２．異種移植腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の広域スペクトル抗腫瘍活性
ＣＤ９８は、多くの腫瘍タイプにおいて高発現するため、様々な異種移植腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用を評価した。
ＣＤ９８は、多くの腫瘍タイプにおいて高発現するため、様々な異種移植腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用を評価した。
【0077】
インビボ研究に先立って、異なる組織由来の１３種類のヒト腫瘍細胞株（Ｒａｊｉを含む）におけるＣＤ９８発現を検出した（図５）。試験された細胞株は、全て高レベルのＣＤ９８を発現した。従って、これらの細胞株を用いて免疫不全のＣＢ－１７ ＳＣＩＤ又はＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植腫瘍モデルを確立し、Ｓ１－Ｆ４の治療作用を評価した。
【0078】
Ｓ１－Ｆ４処理は、１３種類の異種移植モデルのうちの８種類において広域抗腫瘍作用を示した（図４、図６－図１０）。特に注目すべきは、低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のＳ１－Ｆ４処理がＨｅｐＧ２（肝細胞がん）腫瘍モデルにおいて腫瘍の完全な退縮をもたらすことである（図６）。
【0079】
実施例３．ｈＣＤ９８を発現するマウスモデルの生成（ＣＤ９８ヒト化マウス）
Ｓ１－Ｆ４は、ヒト及びサルＣＤ９８と結合するが、マウスＣＤ９８（ｍＣＤ９８）と結合しないことが見出された（表１）。ＣＤ９８がヒトの多くの正常組織において広く発現されていることを考慮すると、上記のヒト異種移植片を有するマウスモデルから得られた結果は、Ｓ１－Ｆ４のヒトに対する潜在的な効果及び／又は安全性を正確に反映できない可能性がある。
Ｓ１－Ｆ４は、ヒト及びサルＣＤ９８と結合するが、マウスＣＤ９８（ｍＣＤ９８）と結合しないことが見出された（表１）。ＣＤ９８がヒトの多くの正常組織において広く発現されていることを考慮すると、上記のヒト異種移植片を有するマウスモデルから得られた結果は、Ｓ１－Ｆ４のヒトに対する潜在的な効果及び／又は安全性を正確に反映できない可能性がある。
【0080】
表１．Ｓ１－Ｆ４と異なる由来のＣＤ９８との結合親和性
【表1】
【0081】
この問題を解決するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により、Ｃ５７ＢＬ／６遺伝背景における（Ｃ５７ＢＬ／６マウスをレシピエントとして使用する）ｍＣＤ９８ ＥＣＤをそのヒトの対応する部分に置き換え、ＣＤ９８ヒト化マウスモデルを生成した（図１１Ａ－Ｄ）。ｈＣＤ９８ ＥＣＤ（１０７－５２９番目のアミノ酸）配列をＣ５７ＢＬ／６マウス生殖細胞のＳｌｃ３ａ２遺伝子座に組み込み、マウスＳｌｃ３ａ２遺伝子を除去するために、第１イントロン内の配列を標的とするｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ－ＣＤ９８：ｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｇｔｇａｇｃｔｇｃｃｔｇｔ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を使用した。相同性指向修復（ＨＤＲ）の鋳型として、ｈＣＤ９８の１０７－５２９番目のアミノ酸をコードする１２７２ｂｐ配列、ｐｏｌｙＡエレメント、ｓｇＲＮＡ－ＣＤ９８標的部位から伸びた８２９ｂｐの上流断片及び９４５ｂｐの下流断片を含む標的ベクターを構築した（図１１Ａ）。Ｃａｓ９タンパク質、ｓｇＲＮＡ－ＣＤ９８及び標的ベクターをＣ５７ＢＬ／６受精卵に前核微量注入し、２匹の生体マウス（Ｆ０）を得た。複数対のプライマーにより、２匹のＦ０マウスにおけるｈＣＤ９８ ＥＣＤの正確な挿入を検証した（図１１Ａ－Ｄ、表２）。ヘテロ接合Ｆ０マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑させ、Ｆ１世代マウスを得た。そして、ヘテロ接合Ｆ１動物を交雑させ、ホモ接合性ｈＣＤ９８ノックインマウス（ＣＤ９８ヒト化マウスと命名）を生成した。
【0082】
表２．ＣＤ９８ヒト化マウスの同定に用いたＰＣＲプライマー
【表2】
【0083】
生成されたＣＤ９８ヒト化マウスモデルは、ｍＣＤ９８の生理的機能を保留しているため、正常組織においてＳ１－Ｆ４でＣＤ９８の発現を検出することが可能であり、且つ免疫系がインタクトである。免疫蛍光標識アッセイにより、確立されたＣＤ９８ヒト化マウスの異なる組織におけるｈＣＤ９８の発現スペクトルを検出したところ、組織におけるｈＣＤ９８の発現パターンが野生型マウスにおけるｍＣＤ９８の発現と類似していることを確認した（図１２－１３）。
【0084】
実施例４．Ｓ１－Ｆ４による侵襲性及び難治性腫瘍に対する抗腫瘍活性
ＣＤ９８ヒト化マウスを用いて、４種類の侵襲性及び難治性マウス腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４による抗腫瘍活性を評価した。ｈＣＤ９８を安定的に発現するマウス腫瘍細胞株を用いてモデルを確立した（図１４）。
ＣＤ９８ヒト化マウスを用いて、４種類の侵襲性及び難治性マウス腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４による抗腫瘍活性を評価した。ｈＣＤ９８を安定的に発現するマウス腫瘍細胞株を用いてモデルを確立した（図１４）。
【0085】
Ｓ１－Ｆ４処理は、４種類の腫瘍モデルのうち、ＥＬ４－ｈＣＤ９８、ＭＣ３８－ｈＣＤ９８及びＭＣＡ２０５－ｈＣＤ９８の３種類に対して顕著な抗腫瘍作用を有するが、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８腫瘍に対して顕著な作用がないことを示した（図１５Ａ）。これらの結果から、Ｓ１－Ｆ４が免疫不全異種移植及び免疫活性化同系マウスモデルにおいて、多種の悪性腫瘍に対して有効な広域スペクトル抗腫瘍活性を発揮していることを示した。
【0086】
なお、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（即ち、非腫瘍組織においてｈＣＤ９８が一切発現されていないマウス）において、Ｓ１－Ｆ４処理によるＥＬ４－ｈＣＤ９８及びＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８腫瘍に対する効果をアッセイしたところ、Ｓ１－Ｆ４処理は、２種類の腫瘍モデルのいずれにおいても腫瘍増殖に対する顕著な抑制を誘導した（図１５Ｂ）。Ｓ１－Ｆ４が野生型マウスにおいてＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８に対する抗腫瘍作用を示したが、ＣＤ９８ヒト化マウスにおいてその作用がなかったことは、野生型マウスにおける「抗原シンク」の欠乏が、このような高侵襲性腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用に寄与し得ることを示す。「抗原シンク」とは、細胞膜抗原を標的とする抗体の抗原媒介性クリアランスを意味する。これらの結果は、ヒト異種移植片を有する野生型マウスにおいて観察された抗ＣＤ９８抗体の抗腫瘍作用から、必ずしもヒトにおけるその抗腫瘍作用を合理的に予想するものではないことを示す。
【0087】
実施例５．Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性のＦｃ－ＦｃγＲ相互作用に対する依存性
本実施例は、抗ｈＣＤ９８抗体の抗腫瘍活性がＦｃ媒介免疫応答、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は貪食作用（ＡＤＣＰ）に依存するか否かを検討した。
本実施例は、抗ｈＣＤ９８抗体の抗腫瘍活性がＦｃ媒介免疫応答、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は貪食作用（ＡＤＣＰ）に依存するか否かを検討した。
【0088】
Ｓ１－Ｆ４のＦｃ関連機能を解析するために、Ｓ１－Ｆ４ＫＡとＳ１－Ｆ４ＤＡＮＡの２つのＳ１－Ｆ４バリアントを生成した（図３）。Ｓ１－Ｆ４ＫＡは、ＦｃとＣ１ｑとの結合を解消し、ＣＤＣ機能を喪失させるためのＫ３２２Ａ（ＫＡ）突然変異を担持し、Ｓ１－Ｆ４ＤＡＮＡは、ＦｃとＦｃγＲｓとの結合を解消し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ機能を喪失させるためのＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＤＡＮＡ）突然変異を担持した。Ｓ１－Ｆ４及びその２つの変形体がＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣを媒介する能力を測定した。インビトロアッセイにより、Ｓ１－Ｆ４及びＳ１－Ｆ４ＫＡがＲａｊｉ及び／又はＨｅｐＧ２細胞に対するＡＤＣＣ（図１６Ａ、図１６Ｂ）及びＡＤＣＰ殺傷効果（図１７Ａ、図１７Ｂ）を誘導したが、Ｓ１－Ｆ４ＤＡＮＡバリアントが誘導しなっかたことを示した。Ｓ１－Ｆ４及び測定された変異体は、いずれもヒトＣ１ｑと結合できず、Ｒａｊｉ細胞に対するＣＤＣ殺傷効果を引き起こすこともできなっかた（図１８Ａ、図１８Ｂ）。
【0089】
これらの結果は、Ｓ１－Ｆ４がＦｃγＲｓと結合してＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ殺傷効果を誘導することができ、Ｃ１ｑと結合したりＣＤＣ殺傷効果を誘導することができないことを示した。
【0090】
実施例６．ＣＤ９８の機能に対するＳ１－Ｆ４の影響
本実施例は、Ｓ１－Ｆ４が以前に発見されたＳ１－Ｆ４処理に対して高度な感受性がある腫瘍細胞株におけるＣＤ９８の生化学又は細胞生物学的機能を干渉するか否かを検討した。
本実施例は、Ｓ１－Ｆ４が以前に発見されたＳ１－Ｆ４処理に対して高度な感受性がある腫瘍細胞株におけるＣＤ９８の生化学又は細胞生物学的機能を干渉するか否かを検討した。
【0091】
アミノ酸摂取アッセイを行い、Ｓ１－Ｆ４のアミノ酸輸送における作用を分析した。メチオニン模擬分子であるＬ－ホモプロパルギルグリシン（ＨＰＧ）は、ＬＡＴ１（Ｌ型／大型中性アミノ酸トランスポーター１）／ＣＤ９８ヘテロダイマーＨＡＴ複合体の追跡可能な基質として使用され、ＬＡＴ１／ＣＤ９８複合体の阻害剤ＢＣＨ（２－アミノ－２－ノルボルナン－カルボン酸）は、輸送機能を破壊する陽性対照として使用された。
【0092】
図１９に示すように、対照ＩｇＧ、Ｓ１－Ｆ４及びＢＣＨで処理した細胞のＨＰＧ摂取効率を比較したところ、ＢＣＨのみがＨＡＴ複合体の輸送活性を損なった。これらの結果は、Ｓ１－Ｆ４がアミノ酸輸送に影響を与えないことを示した。
【0093】
ＣＤ９８は、インテグリンシグナル伝達を増強して細胞増殖を増加させるため、細胞増殖アッセイにおいてＳ１－Ｆ４によるＨｅｐＧ２、ＨＣＴ－８、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞（Ｓ１－Ｆ４に高感受的な４種の細胞株）増殖に対する抑制作用を測定した。
【0094】
図２０に示すように、Ｓ１－Ｆ４は、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞増殖を用量依存的に抑制したが、Ｓ１－Ｆ４を介したＨｅｐＧ２及びＨＣＴ－８細胞増殖への影響は観察されなかった。これらの結果は、細胞増殖の抑制がＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に必要ではないことを示した。
【0095】
本発明者らは、また、異種移植及び同系腫瘍モデルにおけるＳ１－Ｆ４及びその２種類のＦｃバリアントの抗腫瘍効果を比較することにより、Ｓ１－Ｆ４の作用メカニズム（ＭＯＡ）を調査した。異種移植腫瘍モデルは、ＨｅｐＧ２とＲａｊｉ腫瘍を、それぞれＳ１－Ｆ４による細胞増殖抑制に対する典型的な耐性細胞及び感受性細胞として選択した。同系腫瘍モデルは、ＥＬ４－ｈＣＤ９８及びＭＣ３８－ｈＣＤ９８細胞を選択して、ＣＤ９８ヒト化マウスにおいて腫瘍を確立した。
【0096】
Ｓ１－Ｆ４ＤＡＮＡは、４種類のモデルのいずれにおいても治療作用を示さず（図２１）、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性がＦｃ－ＦｃγＲの相互作用に依存することを示した。また、Ｒａｊｉ異種移植腫瘍モデルにおいて、Ｓ１－Ｆ４とＳ１－Ｆ４ＫＡの腫瘍増殖に対する抑制作用が類似しており（図２１、左下の図）、ＣＤＣ機能がＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に必要ではないことが実証された。要するに、これらの結果は、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性がＦｃ－ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるＡＤＣＣ及びＡＤＣＰに依存することを示した。
【0097】
実施例７：Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に対する免疫細胞の関与
どの免疫細胞亜集団がＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用に関与するかを確定するために、ＨｅｐＧ２腫瘍モデルを用いて実験を行い、Ｓ１－Ｆ４治療前及び治療中に、亜集団特異的抗体を用いてマクロファージ、ＮＫ細胞又は好中球をそれぞれ除去した。マクロファージのクリアランスによってＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を喪失させているが、好中球のクリアランス及びＮＫ細胞のクリアランスによってＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に影響を与えていないことを発見した。ＨｅｐＧ２異種移植モデルにおいて、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性は、マクロファージに依存すると推定される。
どの免疫細胞亜集団がＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用に関与するかを確定するために、ＨｅｐＧ２腫瘍モデルを用いて実験を行い、Ｓ１－Ｆ４治療前及び治療中に、亜集団特異的抗体を用いてマクロファージ、ＮＫ細胞又は好中球をそれぞれ除去した。マクロファージのクリアランスによってＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性を喪失させているが、好中球のクリアランス及びＮＫ細胞のクリアランスによってＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に影響を与えていないことを発見した。ＨｅｐＧ２異種移植モデルにおいて、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性は、マクロファージに依存すると推定される。
【0098】
２種類（Ａ５４９、Ａ－４３１）の異種移植モデルは、Ｓ１－Ｆ４処理に対して耐性を有し、Ｓ１－Ｆ４処理によるマクロファージ浸潤に対する影響を検出した。Ｓ１－Ｆ４処理により、ＨｅｐＧ２腫瘍におけるマクロファージの割合が２倍超顕著に増加していることが分かった。これに対し、Ｓ１－Ｆ４処理は、Ｓ１－Ｆ４耐性のＡ－４３１腫瘍又はＨＣＴ １１６腫瘍に浸潤したマクロファージの数を増加させなかった。これらの結果から、腫瘍内のマクロファージ浸潤不足は、腫瘍細胞がＳ１－Ｆ４処理に対して耐性を有する原因の１つであリ得ることを示した。
【0099】
免疫不全異種移植腫瘍モデルに加えて、ＣＤ９８ヒト化マウスを用いて確立されたＥＬ４－ｈＣＤ９８同系腫瘍モデルにおいても、Ｓ１－Ｆ４抗腫瘍効能に対するマクロファージ、ＮＫ細胞又は好中球枯渇の効果を評価した。ＨｅｐＧ２腫瘍モデルで得られた結果と一致して、マクロファージのクリアランスのみがＳ１－Ｆ４の抗腫瘍効果に影響を及ぼしたが、好中球のクリアランスもＮＫのクリアランスもＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に影響を及ぼしなかった。したがって、異種移植モデルと同系腫瘍モデルの両方において、マクロファージは、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍作用にとって非常に重要である。
【0100】
ＣＤ９８ヒト化マウスは、インタクトな免疫系を有するため、Ｓ１－Ｆ４抗腫瘍効能におけるＴ細胞免疫応答の作用を研究するために適切なモデル系を提供する。Ｓ１－Ｆ４がＴ細胞を動員して腫瘍細胞を攻撃することができるかどうかを測定するために、ＣＤ９８ヒト化マウスにおいて確立されたＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍モデルを利用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞のクリアランスによるＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に対する影響を評価した。その結果、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去してもＳ１－Ｆ４の抗腫瘍活性は変わらず、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が明らかにＳ１－Ｆ４の抗腫瘍作用に関与していないことを示した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のクリアランスは、Ｓ１－Ｆ４のＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍増殖に対する抑制作用を有意に弱めた。したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｓ１－Ｆ４の抗腫瘍活性に関与し、マクロファージのみでは長期間にわたる抗腫瘍作用を誘導するには不十分である。
【0101】
本発明者らは、さらに、樹状細胞（ＤＣ）がＳ１－Ｆ４処理の過程において、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＡＰＣを交差活性化（ｐｒｉｍｅ）する役割を果たすか否かを検討した。具体的には、Ｓ１－Ｆ４処理前に（及び過程中に）、ＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣＤ１１ｃ－ＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体）（Ｉｔｇａｘ－ＤＴＲ／ＥＧＦＰ）マウスを、ジフテリア毒素（ＤＴ）で処理してＤＣを除去した。ＤＣ細胞のクリアランスは、Ｓ１－Ｆ４によるＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍増殖に対する抑制作用に有意に影響を及ぼした。従って、ＤＣは、Ｓ１－Ｆ４によって誘導される完全な抗腫瘍応答にとって非常に重要である。
【0102】
最後に、Ｓ１－Ｆ４処理によってＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍に対して完全奏効（ＣＲ）が示されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、その後同じＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍細胞、又はＥＬ４、Ｂ１６Ｆ１０若しくはＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８腫瘍細胞に攻撃された場合に保護され、腫瘍増殖の顕著な遅延又は完全な腫瘍拒絶を示すことを発見し、これは、Ｓ１－Ｆ４が腫瘍再発を防止する効果を有することを示した（図２２）。予想通りに、ＣＲマウスは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞の攻撃中に生存していくことができず（図２２）、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞とＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍細胞とには共通の抗原を有する可能性が低く、これは、Ｓ１－Ｆ４処理が抗原特異的な抗腫瘍免疫記憶を誘導できることをサポートした。
【0103】
これらの結果を総合的に考慮して、本発明者らは、以下のことを得た。Ｓ１－Ｆ４のＭＯＡは、１）Ｓ１－Ｆ４がそのＦｃを介してマクロファージ上のＦｃγＲｓに結合し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを誘導してＣＤ９８を発現する腫瘍細胞を攻撃するステップ、２）ステップ１）による腫瘍細胞の死亡により、腫瘍細胞関連抗原を生じて、これらの抗原がその後ＤＣによってＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示されるステップ、及び、３）ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化され、腫瘍細胞を攻撃するステップを含む。この過程において、マクロファージは、抗腫瘍応答の開始において役割を果たすが、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗腫瘍応答の開始後に誘導され、特にＤＣ媒介性の交差提示の増強により、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導をもたらす。従って、Ｓ１－Ｆ４処理は、天然免疫系と適応性Ｔ細胞免疫系を架橋させて腫瘍細胞を攻撃し、長期的免疫記憶を誘導する可能性がある。
【0104】
実施例８．ｐＨ依存性抗ｈＣＤ９８抗体の生成
本発明者らは、カニクイザルにおけるＳ１－Ｆ４の安全性及び薬物動態（ＰＫ）特性を評価した。２剤のＳ１－Ｆ４処理（０日目に２０ｍｇ／ｋｇ及び１５日目に１０ｍｇ／ｋｇ）は、顕著な副作用を引き起こしておらず、これはＳ１－Ｆ４が治療有効量において必要な安全性を有することを示した。
本発明者らは、カニクイザルにおけるＳ１－Ｆ４の安全性及び薬物動態（ＰＫ）特性を評価した。２剤のＳ１－Ｆ４処理（０日目に２０ｍｇ／ｋｇ及び１５日目に１０ｍｇ／ｋｇ）は、顕著な副作用を引き起こしておらず、これはＳ１－Ｆ４が治療有効量において必要な安全性を有することを示した。
【0105】
しかし、サルにおいて、Ｓ１－Ｆ４血清濃度は、時間の経過とともに急速に低下し（図２３Ａ）、半減期は非常に短った（ｔ１／２～２９．５ｈｒ）。また、単剤投与後のＣ５７ＢＬ／６及びＣＤ９８ヒト化マウスにおけるＳ１－Ｆ４血清濃度も測定したところ、ＣＤ９８ヒト化マウスでは急速に下降した（ｔ１／２～６９．６ｈｒ）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは緩やかに下降した（ｔ１／２～３４１．５ｈｒ）ことが分かった（図２３Ｂ）。
【0106】
蛍光標識されたＳ１－Ｆ４（Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７）の投与処理後、ＣＤ９８ヒト化マウスの腎臓に強い蛍光シグナルが観察され（図２４Ａ）、腎臓におけるマウスＣＤ９８の強い発現と一致していた。免疫蛍光標識によっても、Ｓ１－Ｆ４処理後、Ｓ１－Ｆ４がＣＤ９８ヒト化マウスの腎臓に大量に濃化されたが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはなかったことを示した（図２４Ｂ）。カニクイザル及びＣＤ９８ヒト化マウスにおけるＳ１－Ｆ４の迅速なクリアランスは、「抗原シンク」現象（Ｓ１－Ｆ４が正常組織に存在するＣＤ９８タンパク質と結合すること）によるものと推測される。
【0107】
抗原シンク効果の影響を克服し、ＰＫ特徴を改善することを求めるために、本発明者らは、創造的にＳ１－Ｆ４を、酸性条件（例えば、腫瘍微小環境）下（ｐＨ６．５－６．９）ではＣＤ９８と強力に結合するが、ほとんどの正常組織における中性（ｐＨ７．２－７．５）条件下では弱く結合する（又は全く結合しない）というｐＨ依存性抗体になるように遺伝子工学的に改変した。好適なｐＨ依存性抗体は、Ｓ１－Ｆ４抗腫瘍活性を維持しつつ、固形腫瘍中の抗原に優先的に結合することができる。
【0108】
Ｓ１－Ｆ４の合理的な遺伝子工学的改変をサポートするために、ｈＣＤ９８ ＥＣＤとＳ１－Ｆ４との複合体の結晶構造を解析し、結合界面に関する正確な情報を取得した（図２５）。Ｓ１－Ｆ４ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ９８ ＥＣＤ複合体の結晶構造を２．８Åの解像度で解析したところ、Ｓ１－Ｆ４は、ｈＣＤ９８ ＥＣＤ上の、２つの環状領域に由来する３７６－３８４番目と３９１－３９９番目の残基を含むコンフォメーションエピトープを認識することを示した（図２４）。この構造から、７個のｈＣＤ９８ ＥＣＤ残基（Ｌ３７８、Ｐ３７９、Ｖ３８７、Ｌ３８９、Ｆ３９５、Ｉ３９８及びＶ４０２）が疎水性コアを形成することにより、２つのループのコンフォメーションを安定させ、コンフォメーションエピトープの形成を促進することが分かった（図２５）。
【0109】
エピトープがＳ１－Ｆ４のＶＨ及び可変軽鎖（ＶＬ）に結合した特定の構造に対する評価により、ｈＣＤ９８ ＥＣＤの３９１－３９９番目の残基がＳ１－Ｆ４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ３及びＨＣＤＲ３に結合することを示した。Ｓ１－Ｆ４ ＬＣＤＲ１のＹ２７ｄ及びＹ３２残基の側鎖ヒドロキシル基は、それぞれＣＤ９８ ＥＣＤ残基Ｅ３９２及びＰ３９６の主鎖アミド基と水素結合を形成した。また、Ｓ１－Ｆ４ ＬＣＤＲ１のＹ３２及びＬＣＤＲ３のＹ９２の芳香族側鎖は、非極性相互作用によりＣＤ９８ ＥＣＤのＰ３９９残基を挟んでいた（図２５）。ＣＤ９８ ＥＣＤのＤ３９７側鎖は、Ｓ１－Ｆ４ ＨＣＤＲ３領域におけるＲ１００ｄ主鎖と水素結合を形成した。また、Ｓ１－Ｆ４ ＶＨは、抗体とＣＤ９８ ＥＣＤの３７６－３８４番目の残基との相互作用を媒介した。このループでは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３にそれぞれ位置するＳ１－Ｆ４ ＶＨ残基Ｙ３３、Ｉ５０及びＩ１００ｆを含む疎水溝に、Ｐ３７９及びＧ３８０によって形成されたキンクがしっかりと嵌合していた。このエピトープの付近において、ＣＤ９８ ＥＣＤのＨ１３５の側鎖とＳ１－Ｆ４ ＨＣＤＲ３のＹ９７とは、水素結合していた（図２５）。
【0110】
ＦＡＣＳによる結合アッセイにより、結合界面に位置する２つのアミノ酸のアラニン置換（Ｌ３８９Ａ及びＰ３９９Ａ）がＳ１－Ｆ４とｈＣＤ９８との結合を顕著に弱めることが示され、これは、該コンフォメーションエピトープがＳ１－Ｆ４ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ９８ ＥＣＤ複合体の結合を確実に媒介することをサポートした。Ｌ３７８Ａ、Ｆ３９５Ａ及びＤ３９７Ａ変異も結合を弱め、これらの疎水性コアにある残基がＳ１－Ｆ４ ｓｃＦｖ－ｈＣＤ９８ ＥＣＤの結合親和性の安定性に影響を与えることをサポートした。なお、これらのアラニン置換変異は、いずれもＩＧＮ５２３とｈＣＤ９８との結合に影響を与えず、これはＳ１－Ｆ４及びＩＧＮ５２３が異なるエピトープと結合することを示した。
【0111】
従来の研究では、ヒスチジン（Ｈ）のような電離可能な残基のプロトン化がｐＨ依存性結合を促進できることが示されている（Ｃｈａｐａｒｒｏ－Ｒｉｇｇｅｒｓら、２０１２；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、２０１９；Ｓａｒｋａｒら、２００２）。そこで、本発明者らは、Ｈと酸性アミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ））との相互作用の度合いを高めることにより、Ｓ１－Ｆ４とＣＤ９８とのｐＨ依存性結合が促進され得ると仮定した。構造により、４つの酸性残基（Ｅ３８４、Ｄ３９１、Ｅ３９２、Ｄ３９７）がｈＣＤ９８ ＥＣＤ上のＳ１－Ｆ４エピトープ内に位置し（図２６）、Ｈ１３５がエピトープ付近に位置し、Ｓ１－Ｆ４ ＨＣＤＲ３のＹ９７と密接に接触することが示され（図２５）、それによりｐＨ依存性Ｓ１－Ｆ４バリアント抗体に対する合理的な遺伝子工学的改変に分子基礎を提供する。
【0112】
まず、Ｓ１－Ｆ４ ＨＣＤＲ３にＹ９７Ｅ変異を導入し、Ｓ１－Ｆ４ Ｙ９７Ｅを生成した。ＥＬＩＳＡ法による測定において、ＣＤ９８ ＥＣＤに対するＳ１－Ｆ４の結合活性は、ｐＨ６．５（ＥＣ５０＝０．０５９ｎＭ）及びｐＨ７．４（ＥＣ５０＝０．０４６ｎＭ）では同等であった。これに対して、Ｓ１－Ｆ４ Ｙ９７ＥのＣＤ９８に対する結合は、ｐＨ７．４での結合（ＥＣ５０＝４．５２７ｎＭ）よりもｐＨ６．５で（ＥＣ５０＝１．６８６ｎＭ）有意に強く（図２７）、エピトープにおける酸性残基と密接に接触する残基を酸性残基に変更することが、ｐＨ依存性抗原結合を有する抗体改変体を得るための有効なストラテジーであることが検証された。
【0113】
また、結合活性及びｐＨ依存性が向上した抗ＣＤ９８抗体を得るために、本発明者らは、ＨＣＤＲ３に面するＤ３９７、ＨＣＤＲ２に面するＥ３８４、及びＬＣＤＲ１に面するＤ３９１とＥ３９２の、ＣＤ９８に面する４つの酸性残基位置での突然変異を反映した、Ｓ１－Ｆ４ ＶＨＹ９７Ｅ由来のファージディスプレイサブライブラリーをスクリーニングした（図２６）。別のｐＨ依存性抗ｈＣＤ９８抗体Ｈ１５Ｌ５４を同定した。
【0114】
Ｈ１５Ｌ５４は、ｐＨ６．５での結合活性（ＥＣ５０＝０．２４７ｎＭ）がＳ１－Ｆ４ Ｙ９７Ｅ（ＥＣ５０＝１．６８６ｎＭ）よりも約７倍高く、且つその結合のｐＨ依存性（ＥＣ５０比、ｐＨ７．４／６．５＝３８．０）がＳ１－Ｆ４ Ｙ９７Ｅ（ＥＣ５０比、ｐＨ７．４／６．５＝２．７）よりも約１４倍高かった（図２７）。ＦＡＣＳにより、Ｓ１－Ｆ４は、ｐＨ６．５又はｐＨ７．４ではＡ－４３１細胞との結合に有意差がないが、Ｈ１５Ｌ５４は、ｐＨ６．５でＡ－４３１細胞との結合がｐＨ７．４での結合よりも有意に強いことを示した（図２８）。
【0115】
ＰｙＭＯＬで人工的に構築されたモデル構造により、Ｓ１－Ｆ４が遺伝子工学的に改変された後、Ｈ１５Ｌ５４とＣＤ９８との間に４対のＨ－Ｄ／Ｅ相互作用が形成され、Ｈ１５Ｌ５４のＶＨ Ｈ５４、ＶＨＥ９７、ＶＨ Ｈ１００ｄ及びＶＬ Ｈ２７ｆがそれぞれＣＤ９８ ＥＣＤのＥ３８４、Ｈ１３５、Ｄ３９７及びＥ３９２と相互作用することを示した。これらの４対のＨ－Ｄ／Ｅ相互作用は、低いｐＨでのＨ１５Ｌ５４とＣＤ９８との間の高度に選択的結合に寄与し得る。
【0116】
実施例９．ｐＨ依存性抗ｈＣＤ９８抗体と腫瘍中のＣＤ９８との優先的な結合及び向上した抗腫瘍活性
蛍光標識したＨ１５Ｌ５４－Ｃｙ７抗体でＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣＤ９８ヒト化マウスを処理することにより、抗体の分布を調べた。Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７が腎臓に蓄積されることに対し、Ｈ１５Ｌ５４－Ｃｙ７は、主に腫瘍に蓄積されていた（図２９－３０）。免疫蛍光標識を用いて、ＣＤ９８ヒト化マウスの腎臓におけるＳ１－Ｆ４及びＨ１５Ｌ５４抗体の濃化を検出した。以前の発見と一致して、Ｓ１－Ｆ４で処理されたマウスは、腎臓において強いＦＩＴＣシグナルを有したが、Ｈ１５Ｌ５４又は対照ＩｇＧで処理されたマウスは、腎臓において非常に弱いＦＩＴＣシグナルしか有していなかった（図３１）。ＣＤ９８ヒト化マウスにおけるＳ１－Ｆ４とＨ１５Ｌ５４のＰＫ特性の比較から、Ｈ１５Ｌ５４の血清濃度（ｔ１／２～２１７．１ｈｒ）は、Ｓ１－Ｆ４（ｔ１／２～６９．６ｈｒ）よりも遥かに遅く低下したことが示された（図３２）。これらの結果は、Ｈ１５Ｌ５４がそのｐＨ依存性結合特性により、インビボでの生理的ｐＨの正常組織よりも、腫瘍中のＣＤ９８と優先的に結合することをサポートした。
蛍光標識したＨ１５Ｌ５４－Ｃｙ７抗体でＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したＣＤ９８ヒト化マウスを処理することにより、抗体の分布を調べた。Ｓ１－Ｆ４－Ｃｙ７が腎臓に蓄積されることに対し、Ｈ１５Ｌ５４－Ｃｙ７は、主に腫瘍に蓄積されていた（図２９－３０）。免疫蛍光標識を用いて、ＣＤ９８ヒト化マウスの腎臓におけるＳ１－Ｆ４及びＨ１５Ｌ５４抗体の濃化を検出した。以前の発見と一致して、Ｓ１－Ｆ４で処理されたマウスは、腎臓において強いＦＩＴＣシグナルを有したが、Ｈ１５Ｌ５４又は対照ＩｇＧで処理されたマウスは、腎臓において非常に弱いＦＩＴＣシグナルしか有していなかった（図３１）。ＣＤ９８ヒト化マウスにおけるＳ１－Ｆ４とＨ１５Ｌ５４のＰＫ特性の比較から、Ｈ１５Ｌ５４の血清濃度（ｔ１／２～２１７．１ｈｒ）は、Ｓ１－Ｆ４（ｔ１／２～６９．６ｈｒ）よりも遥かに遅く低下したことが示された（図３２）。これらの結果は、Ｈ１５Ｌ５４がそのｐＨ依存性結合特性により、インビボでの生理的ｐＨの正常組織よりも、腫瘍中のＣＤ９８と優先的に結合することをサポートした。
【0117】
多種の腫瘍モデルにおいてＨ１５Ｌ５４の抗腫瘍活性を評価した。ＣＤ９８ヒト化マウスで確立されたＥＬ４－ｈＣＤ９８及びＭＣ３８－ｈＣＤ９８腫瘍モデル（いずれもＳ１－Ｆ４処理に感受的である。）において、Ｈ１５Ｌ５４は、顕著な抗腫瘍活性を示した（図３３Ａ－Ｂ）。また、ＣＤ９８ヒト化マウスで確立されたＢ１６Ｆ１０－ｈＣＤ９８腫瘍モデル及びＡ－４３１異種移植腫瘍モデルを含むＳ１－Ｆ４処理耐性の腫瘍モデルにおいても、Ｈ１５Ｌ５４は、顕著な抗腫瘍活性を示した（図３３Ｃ－Ｄ）。従って、ｐＨ依存性抗ｈＣＤ９８抗体Ｈ１５Ｌ５４は、その腫瘍微小環境における比較的低いｐＨ条件での優先的な抗原結合により、Ｓ１－Ｆ４に起こり得る「抗原シンク」問題を回避し、向上した抗腫瘍活性及び必要なＰＫ特性を与えた。
【0118】
実施例１０．ｐＨ依存性抗ＣＤ９８抗体
Ｈ１５Ｌ５４に加えて、ｐＨ依存性抗体Ａｂ８３３２、Ｈ１５Ｌ１及びＨ１５Ｌ３５も同様の方法で同定された。マウスモデルにおいて、それらの結合活性、ｐＨ依存性及び抗体分布を調べた。
Ｈ１５Ｌ５４に加えて、ｐＨ依存性抗体Ａｂ８３３２、Ｈ１５Ｌ１及びＨ１５Ｌ３５も同様の方法で同定された。マウスモデルにおいて、それらの結合活性、ｐＨ依存性及び抗体分布を調べた。
【0119】
示された時間（矢印）及び１５ｍｇ／ｋｇの用量（図３４）で投与した場合、Ａｂ８３３２は、ＣＤ９８ヒト化マウスで確立されたＥＬ４－ｈＣＤ９８腫瘍モデルにおいて、Ｓ１－Ｆ４に相当する腫瘍増殖抑制作用を示した。
【0120】
ＥＬＩＳＡ法を用いることにより、Ｓ１－Ｆ４及びＡｂ８３３２とｈＣＤ９８ ＥＣＤ－Ｈｉｓ６－Ａｖｉ－Ｂｉｏｔｉｎタンパク質とのｐＨ６．５及びｐＨ７．４での結合を検出し、Ａｂ８３３２のｐＨ依存性結合特性を確認した。図３５に示すように、Ａｂ８３３２のＥＣ５０比（ｐＨ７．４／６．５）は、５０．７と高かったが、Ｓ１－Ｆ４には何ら有意差もなかった。ＥＬＩＳＡ法による測定では、Ｈ１５Ｌ１及びＨ１５Ｌ３５のＥＣ５０比（ｐＨ７．４／６．５）は、それぞれ１１．８と１６．０であった（図３６）。また、ＦＡＣＳによって検出されたＨ１５Ｌ１及びＨ１５Ｌ３５とＡ－４３１腫瘍モデルとの結合もｐＨ依存性結合をサポートした（図２８）。
【0121】
Ｈ１５Ｌ５４と同様に、ＭＣ３８－ｈＣＤ９８腫瘍を担持したｈＣＤ９８ＥＣＤマウスにおいて、投与後２日目及び６日目にＡｂ８３３２－Ｃｙ７を蛍光イメージングしたところ、主に腎臓ではなく腫瘍に濃化されたことを示した（図３７）。
【0122】
配列表
Ｓ１－Ｆ４、Ｈ１５Ｌ５４及びＡｂ８３３２可変領域のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、以下の表に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯを有する配列表を参照することができる。本願では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに基づいて決定されるものである。
Ｓ１－Ｆ４、Ｈ１５Ｌ５４及びＡｂ８３３２可変領域のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、以下の表に示すＳＥＱ ＩＤ ＮＯを有する配列表を参照することができる。本願では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに基づいて決定されるものである。
【0123】
表３：Ｓ１－Ｆ４、Ｈ１５Ｌ１、Ｈ１５Ｌ３５、Ｈ１５Ｌ５４及び
８３３２抗ＣＤ９８抗体の配列情報
８３３２抗ＣＤ９８抗体の配列情報
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A-E】
【図11F】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト又はマウスＣＤ９８に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
以下の（ａ）から（ｇ）のいずれか、すなわち
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、或いは、
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
を含むを含む抗体又はその断片であって、
前記（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
前記（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、
請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項3】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項4】
以下の（ａ）から（ｇ）のいずれか、すなわち、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、或いは、
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、
を含む抗体又はその断片であって、
前記（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
前記（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、
請求項３に記載の抗体又はその断片。
【請求項5】
前記抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に対する結合がｐＨ依存性を有し、酸性ｐＨでの結合活性が中性ｐＨでの結合活性よりも高い、かつ／又は、
結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した場合、抗体とｈＣＤ９８との結合を測定すると、前記抗体又はその断片の酸性ｐＨでのＥＣ５０は、中性ｐＨでのＥＣ５０よりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍低く、
好ましくは、前記酸性ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８であり、前記中性ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５又は７．６であり、より好ましくは、前記酸性ｐＨは、６．５であり、前記中性ｐＨは、７．４である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項10】
腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防を必要とする被験者における腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防に使用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体若しくはその断片、又は請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記腫瘍又はがんが、ＣＤ９８を発現する腫瘍又はがんであり、好ましくは、前記腫瘍又はがんは、酸性ｐＨを呈する微小環境を有し、前記酸性ｐＨは、例えばｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下であり、前記被験者における正常生理的ｐＨは、約ｐＨ７．４である、請求項１０に記載の使用のための抗体若しくはその断片、又は組成物。
【請求項12】
前記腫瘍又はがんが、リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、肝細胞がん、膵臓がん、膵臓類上皮がん、乳がん、結腸直腸腺がん、皮膚類表皮がん、メラノーマ、繊維肉腫、非小細胞肺がん、胃がん、急性骨髄性白血病、グリオーマ、舌がん、下咽頭扁平上皮がん、胆管がん、骨軟化症、骨肉腫、腎臓がん、及び神経芽細胞腫から選ばれる、請求項１０に記載の使用のための抗体若しくはその断片、又は組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0123】
表３：Ｓ１－Ｆ４、Ｈ１５Ｌ１、Ｈ１５Ｌ３５、Ｈ１５Ｌ５４及び
８３３２抗ＣＤ９８抗体の配列情報
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１]ヒト又はマウスＣＤ９８に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
[２]以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、実施形態１に記載の抗体又はその断片、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３。
[３]ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態１又は２に記載の抗体又はその断片。
[４]ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態３に記載の抗体又はその断片。
[５]以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、実施形態３に記載の抗体又はその断片、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ。
[６]前記抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に対する結合がｐＨ依存性を有し、酸性ｐＨでの結合活性が中性ｐＨでの結合活性よりも高い、実施形態１～５のいずれかに記載の抗体又はその断片。
[７]結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した場合、抗体とｈＣＤ９８との結合を測定すると、前記抗体又はその断片の酸性ｐＨでのＥＣ５０は、中性ｐＨでのＥＣ５０よりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍低い、実施形態６に記載の抗体又はその断片。
[８]前記酸性ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８であり、前記中性ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５又は７．６であり、好ましくは、前記酸性ｐＨは、６．５であり、前記中性ｐＨは、７．４である、実施形態６又は７に記載の抗体又はその断片。
[９]実施形態１～８のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
[１０] 実施形態９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[１１] 実施形態１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[１２]実施形態１～８のいずれかに記載の抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
[１３]治療有効量の実施形態１～８のいずれかに記載の抗体若しくはその断片、又は実施形態１２に記載の組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防のための方法。
[１４]前記腫瘍又はがんは、ＣＤ９８を発現する腫瘍又はがんである、実施形態１３に記載の方法。
[１５]前記腫瘍又はがんは、酸性ｐＨを呈する微小環境を有し、前記酸性ｐＨは、例えばｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下であり、前記被験者における正常生理的ｐＨは、約ｐＨ７．４である、実施形態１３に記載の方法。
[１６]前記腫瘍又はがんは、リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、肝細胞がん、膵臓がん、膵臓類上皮がん、乳がん、結腸直腸腺がん、皮膚類表皮がん、メラノーマ、繊維肉腫、非小細胞肺がん、胃がん、急性骨髄性白血病、グリオーマ、舌がん、下咽頭扁平上皮がん、胆管がん、骨軟化症、骨肉腫、腎臓がん、及び神経芽細胞腫から選ばれる、実施形態１３に記載の方法。
８３３２抗ＣＤ９８抗体の配列情報
【表3】
[１]ヒト又はマウスＣＤ９８に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２１、３１、４１、５１、６１、及び７１から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、２２、３２、４２、５２、６２、及び７２から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２５、３５、４５、５５、６５、及び７５から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、２６、３６、４６、５６、６６、及び７６から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、２７、３７、４７、５７、６７、及び７７から選ばれるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片。
[２]以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、実施形態１に記載の抗体又はその断片、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６及び１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、２１及び２２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、２６及び２７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｃ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１及び３２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３６及び３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｄ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び４２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｅ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、５１及び５２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５、５６及び５７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｆ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１及び６２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６及び６７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３
（ｇ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０、７１及び７２のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７６及び７７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３。
[３]ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実施形態１又は２に記載の抗体又はその断片。
[４]ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、２３、３３、４３、５３、６３及び７３から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２８、３８、４８、５８、６８及び７８から選ばれるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、実施形態３に記載の抗体又はその断片。
[５]以下の（ａ）から（ｇ）のいずれかを含み、
（ａ）から（ｆ）のいずれかを含む抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に特異的に結合し、
（ｇ）を含む抗体又はその断片は、マウスＣＤ９８に特異的に結合する、実施形態３に記載の抗体又はその断片、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
（ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ。
[６]前記抗体又はその断片は、ｈＣＤ９８に対する結合がｐＨ依存性を有し、酸性ｐＨでの結合活性が中性ｐＨでの結合活性よりも高い、実施形態１～５のいずれかに記載の抗体又はその断片。
[７]結合活性をＥＬＩＳＡ法により測定した場合、抗体とｈＣＤ９８との結合を測定すると、前記抗体又はその断片の酸性ｐＨでのＥＣ５０は、中性ｐＨでのＥＣ５０よりも少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍低い、実施形態６に記載の抗体又はその断片。
[８]前記酸性ｐＨは、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７又は６．８であり、前記中性ｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５又は７．６であり、好ましくは、前記酸性ｐＨは、６．５であり、前記中性ｐＨは、７．４である、実施形態６又は７に記載の抗体又はその断片。
[９]実施形態１～８のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
[１０] 実施形態９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[１１] 実施形態１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[１２]実施形態１～８のいずれかに記載の抗体又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
[１３]治療有効量の実施形態１～８のいずれかに記載の抗体若しくはその断片、又は実施形態１２に記載の組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における腫瘍の低減、腫瘍細胞の増殖の抑制、がんの治療、又はがんの再発の予防のための方法。
[１４]前記腫瘍又はがんは、ＣＤ９８を発現する腫瘍又はがんである、実施形態１３に記載の方法。
[１５]前記腫瘍又はがんは、酸性ｐＨを呈する微小環境を有し、前記酸性ｐＨは、例えばｐＨ７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０又はそれ以下であり、前記被験者における正常生理的ｐＨは、約ｐＨ７．４である、実施形態１３に記載の方法。
[１６]前記腫瘍又はがんは、リンパ腫、急性前骨髄球性白血病、肝細胞がん、膵臓がん、膵臓類上皮がん、乳がん、結腸直腸腺がん、皮膚類表皮がん、メラノーマ、繊維肉腫、非小細胞肺がん、胃がん、急性骨髄性白血病、グリオーマ、舌がん、下咽頭扁平上皮がん、胆管がん、骨軟化症、骨肉腫、腎臓がん、及び神経芽細胞腫から選ばれる、実施形態１３に記載の方法。
【国際調査報告】