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特表2024-520180ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体標的放射性医薬品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-21
(54)【発明の名称】ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体標的放射性医薬品
(51)【国際特許分類】
A61K 51/10 20060101AFI20240514BHJP
A61K 31/555 20060101ALI20240514BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240514BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240514BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240514BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20240514BHJP
A61K 33/245 20190101ALI20240514BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240514BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240514BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240514BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20240514BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20240514BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240514BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240514BHJP
G01T 1/161 20060101ALI20240514BHJP
【ＦＩ】
A61K51/10 100
A61K31/555
A61K39/395 L
A61K9/08
A61K9/10
A61K33/24
A61K33/245
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P35/04
A61P11/00
A61P15/00
A61P13/08
A61P25/00
A61P13/10
A61P1/18
A61P1/00
A61K47/68 ZNA
G01T1/161 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516731
(86)(22)【出願日】2022-05-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 US2022030272
(87)【国際公開番号】W WO2022246210
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/191,506
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/191,499
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523439415
【氏名又は名称】ノーススター メディカル テクノロジーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー
(71)【出願人】
【識別番号】323008073
【氏名又は名称】モノパー セラピューティクス、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100093300
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】マザー アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】ハーヴィー ジェームズ ティー
(72)【発明者】
【氏名】フランク アール キース
(72)【発明者】
【氏名】サイモン ジェイミー
(72)【発明者】
【氏名】ロジャーズ ジェイソン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C188
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA16
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC26
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF14
4C084AA12
4C084MA17
4C084MA21
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA59
4C084ZA66
4C084ZA81
4C084ZB21
4C084ZB26
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA10
4C086HA05
4C086HA06
4C086HA07
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA21
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA81
4C086ZB21
4C086ZB26
4C188EE02
4C188FF04
4C188FF07
4C188KK33
(57)【要約】
以下の化学式Ｉの標的放射性医薬品が開示され、式中、Ｑ+3は、三価放射性同位体イオンであり；Ｍは、プロトン（Ｈ+）、アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオンであり；「ｇ」は１～約１２の数であり；ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学的に結合したヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１を表し；かつＹ-はイオン電荷のバランスをとるのに必要な量で存在する任意選択の陰イオンを表す。望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有する哺乳動物宿主を治療及び／又は診断するための方法と同様に、薬学上許容可能な希釈剤中に溶解又は分散したセラノスティック有効量の式Ｉの標的放射性医薬品を含む医薬組成物もまた開示される。また、式Ｉのものと同様であるが、放射性同位体を含まない標的プロ放射性医薬品構築物（式ＩＩＩ）も企図される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の化学式Ｉを有する標的放射性医薬品。【化1】
式中、
Ｑ+3は、三価放射性同位体イオンであり、
Ｍは、プロトン（Ｈ+）、アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオンであり、
「ｇ」は、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はそのパラトープ含有部分の各分子当たりのキレート化ＰＣＴＡキレート化三価放射性イオンの平均数を示す、平均値が１～約１２である数であり、
ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学的に結合したモノクローナルＩｇＧ１κ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）タイプの抗体又はその抗原結合フラグメントを表し、そのκ鎖可変領域（ＶL）は、それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５のアミノ酸残基配列の各一連の組合せを有するＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含み、その重鎖可変領域（ＶH）は、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸残基配列の各一連のタイプ１の組合せを有するＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含み、そして
Ｙ-は、イオン電荷のバランスをとるために必要な量で存在する任意選択の陰イオンである。
【請求項2】
前記ＶLが、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸残基配列を有する、請求項１に記載の標的放射性医薬品。
【請求項3】
前記κ鎖定常領域（ＬC）が、配列番号７のアミノ酸残基配列を有する、請求項１に記載の標的放射性医薬品。
【請求項4】
前記重鎖可変（ＶＨ）領域が、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸残基配列を有する、請求項１に記載の標的放射性医薬品。
【請求項5】
前記重鎖タイプ１定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが一緒に）が、配列番号１４のアミノ酸残基配列を有する、請求項１に記載の標的放射性医薬品。
【請求項6】
薬学上許容可能な希釈剤中に溶解又は分散したセラノスティック有効量の請求項１に記載の標的放射性医薬品を含む、医薬組成物。
【請求項7】
前記薬学上許容可能な希釈剤が、周囲温度で水性液であり、非経口投与用に適合されている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記組成物が、意図される哺乳動物種宿主レシピエントの血液と等張である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記意図される哺乳動物種宿主レシピエントが、ヒトである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、平均約３～約１２結合されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
Ｑ+3が、Ａｃ－２２５、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｚｒ－８９又はＩｎ－１１１イオンである、請求項１に記載の標的放射性医薬品。
【請求項12】
望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有する哺乳動物宿主を治療するための方法であって、前記宿主に、請求項６に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記セラノスティック有効量が、前記標的放射性医薬品の標的化細胞殺傷有効量である、方法。
【請求項13】
前記疾患、障害又は病態が、癌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記癌が、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、膵臓癌又は結腸癌の１以上からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記哺乳動物宿主が、ヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記投与が、反復される、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記標的放射性医薬品が、前記哺乳動物宿主に約８０～約１２０ｋＢｑ／ｋｇ体重を与えるのに十分な量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記投与が、反復される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記投与が、約６０日間隔で反復される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有する哺乳動物宿主をアッセイするための方法であって、ａ）前記宿主に請求項６に記載の医薬組成物を投与する工程であって、前記セラノスティック量が、前記標的放射性医薬品の診断上有効な量である工程、
ｂ）前記放射性医薬品が標的細胞に結合するまでの約１時間～数日の期間、前記宿主を維持する工程、及び
ｃ）維持された宿主をスキャンして、標的細胞に結合した標的放射性医薬品によって放出された放射線を検出し、位置を特定する工程、
を含む、方法。
【請求項21】
前記疾患、障害又は病態が癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記癌が肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、膵臓癌又は結腸癌の１以上からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記哺乳動物宿主が、ヒトである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記投与が、反復される、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
前記標的放射性医薬品が、前記ヒトに約０．５～約６．０ｍＣｉの量で投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
下式ＩＩＩ、【化2】
で表される標的プロ放射性医薬品ＰＣＴＡキレート構築物であって、前記キレート剤が、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ヒト化モノクローナル抗体に化学的に結合され、
式中、Ｍは、プロトン（Ｈ+）、アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオンであり、
「ｇ」は、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はそのパラトープ含有部分の各分子当たりの化ＰＣＴＡキレート分子の平均数を示す、平均値が約１～約１２である数であり、
ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学的に結合したモノクローナルＩｇＧ１κ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）タイプの抗体又はその抗原結合フラグメントを表し、
前記ＶＫ２可変領域（ＶL）は、配列番号１のアミノ酸残基配列を有し、前記κ鎖定常領域（ＬC）は、配列番号７のアミノ酸残基配列を有し、かつ
その重鎖可変領域（ＶH）が、配列番号８のアミノ酸残基配列を有し、重鎖タイプ１定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが一緒に）が、配列番号１のアミノ酸残基配列を有する、
構築物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第６３／１９１，４９９号及び同第６３／１９１，５０６号（双方とも２０２１年５月２１日出願）の優先権を主張するものであり、これらの開示は参照により本明細書の一部として援用される。
本願は、米国仮特許出願第６３／１９１，４９９号及び同第６３／１９１，５０６号（双方とも２０２１年５月２１日出願）の優先権を主張するものであり、これらの開示は参照により本明細書の一部として援用される。
【0002】
配列表
本願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書の一部として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿であり、このテキストファイルは＿＿＿＿＿＿＿＿＿ＫＢであり、２０２２年＿＿＿＿＿＿日に作成され、本明細書の提出とともにＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される。
本願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書の一部として援用される。配列表を含むテキストファイルの名称＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿であり、このテキストファイルは＿＿＿＿＿＿＿＿＿ＫＢであり、２０２２年＿＿＿＿＿＿日に作成され、本明細書の提出とともにＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出される。
【0003】
発明の背景
放射性医薬品は一般に、標的化部分又は担体に結合された放射性同位体を含む。放射性同位体は担体によって標的まで運ばれ、そこで崩壊する。同位体の崩壊様式によって放射性医薬品の種類が決まる。
一般に、構築物の運命を検出するためにガンマ線放出同位体が使用され、診断目的に使用される。治療には粒子放出剤を用いた構築物が好ましい。以前はβ線放出核種が使用されていたが、近年はα線放出核種が優れた有効性を示している。
α線放出放射性核種は、粒子の飛程が短く、線エネルギー付与（ＬＥＴ）が高いこともあって、細胞を殺傷するのに効果的である。Ｐｏｔｙ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ２０１８ Ｊｕｎ： ５９（６０）：８７８－８８４）には、治療用放射性医薬品へのα線放出剤の使用が記載されている。
放射性医薬品は一般に、標的化部分又は担体に結合された放射性同位体を含む。放射性同位体は担体によって標的まで運ばれ、そこで崩壊する。同位体の崩壊様式によって放射性医薬品の種類が決まる。
一般に、構築物の運命を検出するためにガンマ線放出同位体が使用され、診断目的に使用される。治療には粒子放出剤を用いた構築物が好ましい。以前はβ線放出核種が使用されていたが、近年はα線放出核種が優れた有効性を示している。
α線放出放射性核種は、粒子の飛程が短く、線エネルギー付与（ＬＥＴ）が高いこともあって、細胞を殺傷するのに効果的である。Ｐｏｔｙ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ２０１８ Ｊｕｎ： ５９（６０）：８７８－８８４）には、治療用放射性医薬品へのα線放出剤の使用が記載されている。
【0004】
α線放出放射性核種アクチニウム２２５（Ａｃ－２２５）の半減期が他のα線放出剤に比べて比較的長いことが、癌治療のための治療用放射性同位体として普及した理由の一つである。この同位体を使用した構築物を用いた臨床試験は優れた結果を示している。約１０日間の半減期は、モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的半減期とよく一致しており、Ａｃ－２２５とその娘核種により産生される複数のα線放出は、高率の腫瘍細胞死滅を担った。しかしながら、Ａｃ－２２５を標的化部位に結合させるのに必要な化学的性質が欠けていた。
Ａｃ－２２５イオンは＋３の原子価を示し、イオン半径は１１２ｐｍであるとされている。分極性がないため、Ａｃ+3は、Ｈａｒｄ ａｎｄ Ｓｏｆｔ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｂａｓｅｓ （ＨＳＡＢ） ［Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９６３， ８５：３５３３－３５３９］理論によると、「硬質」ルイス酸に分類され、従って同様に、アニオン性酸素供与体などの「硬質」非分極性、電気陰性ルイス塩基を好むと予測される。特定のイオンの酸塩基の硬軟特性は、絶対化学硬度（η）という概念を用いて定量化することができる。イオンの絶対化学硬度（η）は、式（η）＝（Ｉ－Ａ）／２で与えられ、式中、Ｉはイオン化エネルギーであり、Ａは対象種の電子親和力である。［Ｐａｒｒ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９８３；１０５：７５１２―７５１６； ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９８８； ２７：７３４－７４０］。
Ａｃ－２２５イオンは＋３の原子価を示し、イオン半径は１１２ｐｍであるとされている。分極性がないため、Ａｃ+3は、Ｈａｒｄ ａｎｄ Ｓｏｆｔ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｂａｓｅｓ （ＨＳＡＢ） ［Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９６３， ８５：３５３３－３５３９］理論によると、「硬質」ルイス酸に分類され、従って同様に、アニオン性酸素供与体などの「硬質」非分極性、電気陰性ルイス塩基を好むと予測される。特定のイオンの酸塩基の硬軟特性は、絶対化学硬度（η）という概念を用いて定量化することができる。イオンの絶対化学硬度（η）は、式（η）＝（Ｉ－Ａ）／２で与えられ、式中、Ｉはイオン化エネルギーであり、Ａは対象種の電子親和力である。［Ｐａｒｒ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９８３；１０５：７５１２―７５１６； ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｉｎｏｒｇ Ｃｈｅｍ １９８８； ２７：７３４－７４０］。
【0005】
このようにして計算されたＡｃ+3とＬａ+3の絶対化学硬度は、それぞれ１４．４ｅＶと１５．４ｅＶであった。Ａｕ+、Ａｇ+、及びＣｕ+などの軟質イオンは、５．７～６．３ｅＶの絶対化学硬度値を示すが、Ｓｃ+3及びＡｌ+3のような従来の硬質イオンは、２４ｅＶより大きい絶対化学硬度値を特徴とする。Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏ， ２０１８ ３３（８）：３３６－３４８。
Ａｃ（ＩＩＩ）の最も慣用されるキレートは８～１２配位の範囲であるので、Ａｃ+3の大きなイオンサイズは、高い歯質の大きな多座キレーターに適している。アクチニウムは、他のアクチノイド及び希土類元素と類似しており、キレート剤の不在下で溶液中で加水分解を受けて［Ａｃ（ＯＨ）3-x］x-を形成することができ、サブピコモル濃度のＡｃ－２２５が、次に、水酸化物種に反応容器などの表面に結合する放射性コロイドを形成させる。
Ａｃ（ＩＩＩ）の最も慣用されるキレートは８～１２配位の範囲であるので、Ａｃ+3の大きなイオンサイズは、高い歯質の大きな多座キレーターに適している。アクチニウムは、他のアクチノイド及び希土類元素と類似しており、キレート剤の不在下で溶液中で加水分解を受けて［Ａｃ（ＯＨ）3-x］x-を形成することができ、サブピコモル濃度のＡｃ－２２５が、次に、水酸化物種に反応容器などの表面に結合する放射性コロイドを形成させる。
【0006】
Ａｃ－２２５の崩壊連鎖における複数のα粒子の放出のために、Ａｃ－２２５は癌細胞を殺傷するために特に効果的な同位体となるが、それでもなお核種とその崩壊娘核種の指向性輸送を困難にしている。運動量の保存のため、エネルギーを有するα粒子の放出は、いずれの化学結合の結合エネルギーよりも１０００倍高い、１００ｋｅＶを超える反跳エネルギーを娘核種に与えることが多い。この結果、娘核種は元の送達ベクターのキレーターから放出される。その後、α線放出娘核種がｉｎ ｖｉｖｏで再分布すると、標的外の健康な組織に実質的な害を及ぼし、治療効果を低下させる可能性がある。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９， ２６（５）：５８１－５８９は、Ａｃ－２２５のｉｎ ｖｉｖｏでの挙動に関しては限られた情報しかないと報告している。予備的研究では、動物モデルにおける組織取り込み、生体内分布、及び腫瘍向性に関して、クエン酸塩と錯化したＡｃ－２２５を評価した。ポリアミノカルボン酸キレーター、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ＣＨＸ－ＤＴＰＡ）のいずれかと錯化したＡｃ－２２５を用いた以前の研究では、非錯化Ａｃ－２２５と比較して、様々な組織向性及び高い血液クリアランスが示された。
Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９， ２６（５）：５８１－５８９は、Ａｃ－２２５のｉｎ ｖｉｖｏでの挙動に関しては限られた情報しかないと報告している。予備的研究では、動物モデルにおける組織取り込み、生体内分布、及び腫瘍向性に関して、クエン酸塩と錯化したＡｃ－２２５を評価した。ポリアミノカルボン酸キレーター、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、又はシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（ＣＨＸ－ＤＴＰＡ）のいずれかと錯化したＡｃ－２２５を用いた以前の研究では、非錯化Ａｃ－２２５と比較して、様々な組織向性及び高い血液クリアランスが示された。
【0007】
担癌ヌードマウスでの生物動態学的挙動を測定するために使用されたＡｃ－２２５－ＣＨＸ－ＤＴＰＡ－モノクローナル抗体（Ｍａｂ）錯体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの錯化は成功したが、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性は低かった。このように、Ａｃ－２２５は放射線治療モデルにおいて有用である可能性があるが、潜在的に効果的なキレーター及びそのようなＡｃ－２２５錯体のｉｎ ｖｉｖｏにおける相対的安定性に関する情報は不足している。
Ａｃ－２２５放射性医薬品に関する最近の総説文献であるＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ， ２０１８， １１（３）：１５６－１７２は、十分な安定性でＡｃ（ＩＩＩ）と結合し、その娘核種の放出も制御するキレート剤の発見は依然として課題であると指摘している。更に、Ａｃ－２２５の世界的な利用可能性が限られ、安定した代替核種がないために、この同位体の研究は、信頼できるＡｃ－２２５の供給を確保している世界中の一握りの機関に限られている。
上記の総説の著者らは、上記のＤａｖｉｓらの論文を含み、精製されたＡｃ－２２５錯体のそれぞれの８日間にわたる生体分布プロファイルが、各錯体の９２ｋＢｑ（２．５ｍＣｉ）を注射することによって評価され、対照としてＡｃ－２２５酢酸塩の生体分布と比較されたことを示している。
Ａｃ－２２５放射性医薬品に関する最近の総説文献であるＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ， ２０１８， １１（３）：１５６－１７２は、十分な安定性でＡｃ（ＩＩＩ）と結合し、その娘核種の放出も制御するキレート剤の発見は依然として課題であると指摘している。更に、Ａｃ－２２５の世界的な利用可能性が限られ、安定した代替核種がないために、この同位体の研究は、信頼できるＡｃ－２２５の供給を確保している世界中の一握りの機関に限られている。
上記の総説の著者らは、上記のＤａｖｉｓらの論文を含み、精製されたＡｃ－２２５錯体のそれぞれの８日間にわたる生体分布プロファイルが、各錯体の９２ｋＢｑ（２．５ｍＣｉ）を注射することによって評価され、対照としてＡｃ－２２５酢酸塩の生体分布と比較されたことを示している。
【0008】
非錯体Ａｃ－２２５は主に肝臓に蓄積し、骨、腎臓、心臓には少量しか蓄積しないので、キレートのＡｃ－２２５肝臓取り込みが高いことは、ｉｎ ｖｉｖｏでは不安定な錯体であることを示す。シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸「ａ」異性体（ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ）、及び１，４，７，１０，１３－ペンタアザシクロ－ペンタデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’，Ｎ””五酢酸（ＰＥＰＡ）は、錯体のＡｃ－２２５の肝臓取り込みをＡｃ－２２５酢酸の５．５倍を超えて低下させ、Ｄａｖｉｓらのデータは－ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡがｉｎ ｖｉｖｏでの安定性に関して最も効果的な供試キレーター錯体であることを示唆したが、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらの総説の著者らは、「非標的組織への蓄積を更に減少させるためになお改善が可能である」と記している［Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 第１６４頁］。
従って、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡではＡｃ（ＩＩＩ）のキレート化が不十分である。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらがコメントした最初のｉｎ ｖｉｖｏ研究のもう一つの重要な発見は、１８５ｋＢｑ（５ｍＣｉ）以上の線量では、注射後（ｐ．ｉ．）１時間という早い段階で重度の組織障害が観察され、最終的に試験動物の死に至り、ｐ．ｉ．８日目までに１００％の死亡率を引き起こしたことから、Ａｃ－２２５－ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡの最大耐容線量が１８５ｋＢｑ（５ｍＣｉ）未満であったことである。
従って、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡではＡｃ（ＩＩＩ）のキレート化が不十分である。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎらがコメントした最初のｉｎ ｖｉｖｏ研究のもう一つの重要な発見は、１８５ｋＢｑ（５ｍＣｉ）以上の線量では、注射後（ｐ．ｉ．）１時間という早い段階で重度の組織障害が観察され、最終的に試験動物の死に至り、ｐ．ｉ．８日目までに１００％の死亡率を引き起こしたことから、Ａｃ－２２５－ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡの最大耐容線量が１８５ｋＢｑ（５ｍＣｉ）未満であったことである。
【0009】
アクチニウムの標的化分子への結合は、Ｓｈｅｉｎｂｅｒｇの研究グループ （Ｓｈｅｉｎｂｅｒｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ｎｏｖ １６； ２９４（５５４６）：１５３７－１５４０． ｄｏｉ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０６４１２６）によって達成された。選択されたキレーターはＤＯＴＡベースの二官能性分子であった。しかしながら、Ｓｈｅｉｎｂｅｒｇグループの報告では、標的化部分に十分なＡｃ－２２５を得るために２段階の方法が用いられた。更に、Ａｃ－２２５出発物質に基づく収率は非常に低く、標的化部分に取り込まれた同位体は１０％未満であった。９０％を超える同位体が無駄になった。この方法の比放射能は、抗体１ｍｇ当たり約５０～７０μＣｉの範囲であった。明らかに、より収率の高い１段階法が望ましい。
Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ研究グループによる可能性のあるキレーターの更なる研究［ＭｃＤｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐ． Ｒａｄｉａｔ． Ｉｓｏｔ．， ２００２， ５７（６）：８４１－８４７］は、研究された６つの可能性のあるキレーターのうち、ＤＯＴＡと１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラプロピオン酸（ＤＯＴＭＰ）だけが、３７℃で２時間後、それぞれ＞９９％と７８％の放射化学的収率（ＲＣＹ）で、Ａｃ２２５の錯化を示した。しかしながら、その後の血清中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイから、Ａｃ－２２５ ＤＯＴＡ錯体は堅牢で、１０日後も９０％を超えるものが無傷のままであることが示唆されたが、Ａｃ－２２５－ＤＯＭＴＭＰ錯体は急速に解離した。
Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ研究グループによる可能性のあるキレーターの更なる研究［ＭｃＤｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐ． Ｒａｄｉａｔ． Ｉｓｏｔ．， ２００２， ５７（６）：８４１－８４７］は、研究された６つの可能性のあるキレーターのうち、ＤＯＴＡと１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトラプロピオン酸（ＤＯＴＭＰ）だけが、３７℃で２時間後、それぞれ＞９９％と７８％の放射化学的収率（ＲＣＹ）で、Ａｃ２２５の錯化を示した。しかしながら、その後の血清中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性アッセイから、Ａｃ－２２５ ＤＯＴＡ錯体は堅牢で、１０日後も９０％を超えるものが無傷のままであることが示唆されたが、Ａｃ－２２５－ＤＯＭＴＭＰ錯体は急速に解離した。
【0010】
最初に二官能性ＤＯＴＡ－ＮＣＳ配位子を放射性標識し、次にｍＡｂを結合させる（ｐＨ８．７、３７℃、５２分間）ことを必要とする２段階の標識法を再び採用した。全体の放射化学的収率はわずか９．８±４．５％と低かったが、妥当な比放射能（４．１±２．６ＧＢｑ／ｇ、又は０．１１±０．０７Ｃｉ／ｇ）が達成され、前臨床治療研究が可能となった。低い収率は、ＤＯＴＡ－ＮＣＳの最初のＡｃ－２２５標識工程が加熱を必要とし、その結果、イソチオシアネートリンカーの分解が起こり、次の工程でのｍＡｂの結合ンが不十分となることに起因した。
Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇグループと共同研究者［ＭｃＧｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．， ２０１４， ５５（９）：１４９２－１４９８］は後に、Ａｃ－２２５－ＤＯＴＡ－抗体構築物の調製のための１段階法を報告した。この過程は、ＤＯＴＡ－抗体構築物とＡｃ－２２５+3の添加に放射線防護剤としてＬ－アスコルビン酸を添加した２Ｍ酢酸テトラメチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７．５）で進行し、典型的な最終反応ｐＨ値は５．８であった。３７℃で２時間加熱することにより、これまでの２段階法（６～１２％）と比較して放射化学的収率が１０倍（８０％）増加し、最大３０倍高い比放射能（３．７～１４．８ＧＢｑ／ｇに対して１２０ＧＢｑ／ｇ）を有するバイオコンジュゲートの調製が可能となった。達成された最高の非活性は、抗体２５個に１個のアクチニウムに相当した。
Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇグループと共同研究者［ＭｃＧｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．， ２０１４， ５５（９）：１４９２－１４９８］は後に、Ａｃ－２２５－ＤＯＴＡ－抗体構築物の調製のための１段階法を報告した。この過程は、ＤＯＴＡ－抗体構築物とＡｃ－２２５+3の添加に放射線防護剤としてＬ－アスコルビン酸を添加した２Ｍ酢酸テトラメチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７．５）で進行し、典型的な最終反応ｐＨ値は５．８であった。３７℃で２時間加熱することにより、これまでの２段階法（６～１２％）と比較して放射化学的収率が１０倍（８０％）増加し、最大３０倍高い比放射能（３．７～１４．８ＧＢｑ／ｇに対して１２０ＧＢｑ／ｇ）を有するバイオコンジュゲートの調製が可能となった。達成された最高の非活性は、抗体２５個に１個のアクチニウムに相当した。
【0011】
米国特許出願公開第２００４／００６７９２４（Ａ１）号明細書（Ｆｒａｎｋ）は、Ａｃ－２２５を錯化するための１２員大環状アミンベースのポリアセテート及びポリホスホネートキレート剤の使用を教示している。ＤＯＴＡベースのキレート剤は、Ａｃ－２２５をキレート化するのに有用であることが見出された。
その特許公開公報の段落［００８２］には、示された１つのＤＯＴＡキラントのニトロベンジル基をアニリンに還元することができ、そのアミンをその後イソチオシアネートに変換して、標的化ペプチド抗体又は他の実体に連結するための二官能性化合物を形成することができると記載されている。ＰＣＴＡの二官能性類似体（下記）は、酢酸炭素の１つに連結基を結合させることによって調製できるとされている。
その特許公開公報の段落［００８２］には、示された１つのＤＯＴＡキラントのニトロベンジル基をアニリンに還元することができ、そのアミンをその後イソチオシアネートに変換して、標的化ペプチド抗体又は他の実体に連結するための二官能性化合物を形成することができると記載されている。ＰＣＴＡの二官能性類似体（下記）は、酢酸炭素の１つに連結基を結合させることによって調製できるとされている。
【0012】
３，６，９，１５－テトラ－アザビシクロ－［９．３．１］ペンタデカ－１（１５），１１，１３－トリエン－３，６，９－酢酸（ＰＣＴＡ）ベースのキレート剤がＦｌａｎｋ出願の本文中に記載され、アクチニウムとの結合データが示された。示され使用されたＰＣＴＡ化合物は、キレート化カルボキシル基の１つを使用する可能性以外には、ペプチド又は抗体などの標的化分子への連結には適合しなかった。ＰＣＴＡを用いる標的化構築物は開示されていなかった。
Ｙａｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｊｕｎｅ ２０１３ １２（４）：２６３－２７２は、腫瘍血管系のＰＥＴスキャン研究で使用するためのＣｕ－６４［Ｃｕ（ＩＩ）－６４］のキレート化に、ＰＣＴＡ、ＤＰＴＡ、及び１－オキサ－４，７，１０－トリアザシクロドデカン－４，７，１０－トリ酢酸（Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ）を使用することを報告した。このキレートは、環状ペプチドの付加リジンにベンジルイソチオシアネート結合を介して環状テトラペプチドである環状（ＲＧＤｙＫ）に結合された。
Ｙａｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｊｕｎｅ ２０１３ １２（４）：２６３－２７２は、腫瘍血管系のＰＥＴスキャン研究で使用するためのＣｕ－６４［Ｃｕ（ＩＩ）－６４］のキレート化に、ＰＣＴＡ、ＤＰＴＡ、及び１－オキサ－４，７，１０－トリアザシクロドデカン－４，７，１０－トリ酢酸（Ｏｘｏ－ＤＯ３Ａ）を使用することを報告した。このキレートは、環状ペプチドの付加リジンにベンジルイソチオシアネート結合を介して環状テトラペプチドである環状（ＲＧＤｙＫ）に結合された。
【0013】
以前の１段階法は、Ｓｉｍｏｎ，国際公開第２０１１／０１１５９２（Ａ１）号パンフレットに開示されている。この特許出願は、第１段階としてキレーターと結合したタンパク質の調製を教示している。過剰のキレート剤を除去した後、タンパク質キレート結合体を同位体と反応させた。ここでも、ＤＯＴＡベースのキレーターが研究に使用され、当技術分野における現在の考え方がなおＤＯＴＡベースのキレーターがＡｃ－２２５に最適であるということを示している。
Ｓｉｍｏｎの開示の方法では、高濃度の酢酸イオンの使用と高いキレーター：抗体比（ＣＡＲ）を必要とした。開始反応は、ＣＡＲ数が１０～１２になるように、抗体当たり１００キレーターのモル反応体比を用いて行われた。
より低いＣＡＲ数の結合体で高い比放射能のＡｃ－２２５構築物を作製することが望ましい。これは、ＣＡＲ数が増加するにつれて、抗体の生物学的標的化が低下するためである。従って、Ａｃ－２２５とＤＯＴＡタイプのキレーターを用いて１段階法が教示されるとしても、ＤＯＴＡタイプのキレート剤を用いると必要なＣＡＲ数が高かった。Ａｃ－２２５構築物の調製には、より優れたキレート剤が必要であることは明らかである。
Ｓｉｍｏｎの開示の方法では、高濃度の酢酸イオンの使用と高いキレーター：抗体比（ＣＡＲ）を必要とした。開始反応は、ＣＡＲ数が１０～１２になるように、抗体当たり１００キレーターのモル反応体比を用いて行われた。
より低いＣＡＲ数の結合体で高い比放射能のＡｃ－２２５構築物を作製することが望ましい。これは、ＣＡＲ数が増加するにつれて、抗体の生物学的標的化が低下するためである。従って、Ａｃ－２２５とＤＯＴＡタイプのキレーターを用いて１段階法が教示されるとしても、ＤＯＴＡタイプのキレート剤を用いると必要なＣＡＲ数が高かった。Ａｃ－２２５構築物の調製には、より優れたキレート剤が必要であることは明らかである。
【0014】
上述のようなＡｃ－２２５のキレート剤としてＤＯＴＡを使用することの難しさはともかく、Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒ Ｒａｄｉｏ， ２０１８ ３３（８）：３３６－３４８は、２０１８年と最近になって、総説の一節に「ＤＯＴＡ：現在のゴールドスタンダード」（３４０で）という表現を用いている。それらの著者のＤＯＴＡの節の最後の文には、「まとめると、これらの欠点は、ＤＯＴＡは225Ａｃ－ＴＡＴ［225Ａｃ標的α療法］応用における使用には理想的ではないことを示し、225Ａｃのより適切なキレート足場の必要性を強調している。」と記載されている。
Ａｃ－２２５を標的化部位に結合させることに関連する化学は、使用者及び著者にとって困難であった。Ａｃ－２２５を分子に結合させるより良い方法が必要であることは明らかである。本発明はその必要性に取り組む助けとなる。驚くことに、我々は、ＰＣＴＡベースのキレート剤が、温和な条件下で、先行する「ゴールドスタンダード」であるＤＯＴＡを使用した場合に以前に報告されたよりも低いＣＡＲ数でＡｃ－２２５と安定なキレートを形成することを見出した。更に、我々のデータは、娘Ｂｉ－２１３イオンもＰＣＴＡベースのキレート剤によって保持され、従って、選択された標的部位以外に移動する放射能はたとえあるとしてもわずかであることを示している。
Ａｃ－２２５を標的化部位に結合させることに関連する化学は、使用者及び著者にとって困難であった。Ａｃ－２２５を分子に結合させるより良い方法が必要であることは明らかである。本発明はその必要性に取り組む助けとなる。驚くことに、我々は、ＰＣＴＡベースのキレート剤が、温和な条件下で、先行する「ゴールドスタンダード」であるＤＯＴＡを使用した場合に以前に報告されたよりも低いＣＡＲ数でＡｃ－２２５と安定なキレートを形成することを見出した。更に、我々のデータは、娘Ｂｉ－２１３イオンもＰＣＴＡベースのキレート剤によって保持され、従って、選択された標的部位以外に移動する放射能はたとえあるとしてもわずかであることを示している。
【0015】
Ｂｉ－２１３はＡｃ－２２５の放射性崩壊生成物であり、Ｂｉ－２１２はウラン２３４（Ｕ－２３４）の段階的崩壊後の鉛－２１２（Ｐｂ－２１２）の放射性崩壊によって生成される。Ｂｉ－２１２とＢｉ－２１３は半減期が短いため、これらの放射性核種の放射性核種療法への応用が制限される可能性がある。
ビスマス同位体であるＢｉ－２１２とＢｉ－２１３も放射免疫療法に使用するための候補である。一方、他方、又は両方の同位体を利用したいくつかの前臨床試験が公表されている。
ビスマス同位体であるＢｉ－２１２とＢｉ－２１３も放射免疫療法に使用するための候補である。一方、他方、又は両方の同位体を利用したいくつかの前臨床試験が公表されている。
【0016】
例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ２０２０ １１６（２０）：４２３１－４２３９は、ラモスリンパ腫の異種移植片を持つマウスを、ストレプトアビジンと融合した抗ＣＤ２０抗体、その後［213Ｂｉ］ＤＯＴＡ－ビオチンで処置した前臨床試験を報告している。腫瘍を有する処置マウスは顕著な増殖遅延を示し、平均生存期間は非処置対照の約４倍長かった。Ｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＩＭＳ Ｍｅｄ Ｓｃｉ， ２０２１， ２（３）：２２８－２４５による総説では、ＨＥＲ２に結合するｍＡｂであるトラスツズマブにキレーターである２－（４－イソチオ－シアナトベンジル－１，４，７，１０－テトラアザ－１，４，７，１０－テトラ－（２－カルバモニルメチル）シクロドデカン（ＴＣＭＣ）を連結したものを用いた研究など、標的α粒子療法（ＴＡＴ）にＰｂ－２１２／Ｂｉ－２１２を使用した最近の研究が述べられている。Ｍｕｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００５， ４６（１ Ｓｕｐｐｌ）：１９９Ｓ－２０４Ｓによる総説では、上記のビスマス同位体の一方又は他方を利用するいくつかのＴＡＴ療法が述べられている。
【0017】
上記のＹｏｎｇらに述べられているように、Ｂｉ－２１２又はＢｉ－２１３の代わりに前駆体Ｐｂ－２１２で生体分子を標識すると、Ｂｉ－２１２の半減期６０分又はＢｉ２１３では４６分であるのに対し、１０．６時間という半減期の結合体が得られるとい利点がある。Ｐｂ－２１２をＤＯＴＡキレーターと錯体を形成させた潜在的ｉｎ ｖｉｖｏジェネレーターを作製しようとした以前の試みは、β粒子によってＰｂ－２１２が崩壊してＢｉ－２１２を形成する結果としてＢｉの約３６％が漏れ出し、ＤＯＴＡによって保持されないという報告があることから失敗した。遊離ビスマスイオンは腎臓に局在するので、Ｐｂ－２１２の崩壊で形成されたＢｉ－２１２が担体に結合したままであることは重要であるかもしれない。Ｂａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｒａｄｉｏａｎａｌ Ｎｕｃｌ Ｃｈｅｍ， ２０１３ ２９５：２０５－２０９。
【0018】
ジルコニウムは原子価を持ち、Ｚｒ－８９はガンマ線（９０９ｋｅＶ）と約３９７ｋｅＶの陽電子を放出し、どちらの放出も診断に有用であるという点で、ジルコニウム－８９ももう１つの有用な放射性同位体である。Ｚｒ－８９の半減期は３．３日で、これは医療に用いられる多くのモノクローナル抗体の循環半減期と同様である。これらの同位体は、陽電子放射断層撮影法（Ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ）におけるｍＡｂの放射性標識及び評価に使用されている ［Ｓａｌｅｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ Ｗｏｒｌｄ Ｊ ２０１４， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２６９６０５， 第９頁］。Ｚｒ－８９の最終崩壊生成物は、安定な非放射性同位体であるイットリウム－８９である。
本発明で更に有用な同位体はインジウム－１１１である。インジウムも＋３の原子価を持ち、Ｉｎ－１１１の半減期は約２．８日である。インジウム－１１１の崩壊は０．１７１ＭｅＶと０．２４５ＭｅＶのガンマ線を提供し、単一光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法などの診断スキャンに使用できる。Ｉｎ－１１１は崩壊して、非放射性で安定なカドミウム－１１１となる。
本発明で更に有用な同位体はインジウム－１１１である。インジウムも＋３の原子価を持ち、Ｉｎ－１１１の半減期は約２．８日である。インジウム－１１１の崩壊は０．１７１ＭｅＶと０．２４５ＭｅＶのガンマ線を提供し、単一光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法などの診断スキャンに使用できる。Ｉｎ－１１１は崩壊して、非放射性で安定なカドミウム－１１１となる。
【0019】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの研究から得られた相当な量の証拠により、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）系が転移過程の中心であり、癌治療薬開発の有望な標的となることが確認された（Ｍａｚａｒ， ｅｔ ａｌ．， １９９９ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ３：１５－３２）。ｕＰＡに加え、その細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）は、癌治療薬及び診断薬の設計及び開発に適した標的であり（Ｍａｚａｒ， ２００１ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ １２：３９７－４００）、これは以下の理由による：
（ａ）ｕＰＡＲは転移性腫瘍細胞及び血管新生内皮細胞（「ＥＣ」）に選択的に発現するが、他の細胞には発現しない；
（ｂ）ｕＰＡＲは、転移に必要ないくつかの細胞外及び細胞内経路において重要な役割を担っており、それらは現在活発な薬剤開発努力の対象となっている；及び
（ｃ）ｕＰＡは、ｕＰＡ経路のいくつかの異なるポイントで干渉することが可能である。
従って、ｕＰＡとｕＰＡＲは、多くの異なるタイプの腫瘍／癌に対して有用な診断薬及び治療薬の開発に有望な標的である。
（ａ）ｕＰＡＲは転移性腫瘍細胞及び血管新生内皮細胞（「ＥＣ」）に選択的に発現するが、他の細胞には発現しない；
（ｂ）ｕＰＡＲは、転移に必要ないくつかの細胞外及び細胞内経路において重要な役割を担っており、それらは現在活発な薬剤開発努力の対象となっている；及び
（ｃ）ｕＰＡは、ｕＰＡ経路のいくつかの異なるポイントで干渉することが可能である。
従って、ｕＰＡとｕＰＡＲは、多くの異なるタイプの腫瘍／癌に対して有用な診断薬及び治療薬の開発に有望な標的である。
【0020】
当技術分野で「ｓｕＰＡＲ」と呼ばれる可溶性型のｕＰＡＲも有用な標的である。ｓｕＰＡＲは、血漿、血清、尿、唾液、及び脳脊髄液などの多くの体液で検出された。それ以来、循環ｓｕＰＡＲの上昇は多くの病態において記載されており、免疫系の活性化状態を反映している（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．， （Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０２１） Ｆｒｏｎｔ Ｍｅｄ． ８：７４５８３８）。
ｕＰＡＲには３つの細胞外ドメインがあり、タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＤ１、Ｄ２及びＤ３と呼ばれている。いくつかの酵素がＤ１とＤ２の間のドメインを切断し、ドメインＤ２とＤ３をｓｕＰＡＲとして提供することが報告されている。可溶性組換えｕＰＡＲの活性化は、Ｒｅｓｎａｔｉ ｅｔ ａｌ． ［１９９６ ＥＭＢＯ Ｊ １５（７）：１５７２－１６８２ ａｎｄ ２００２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９９（３）：１３５９－１３６４］が述べているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ドメインＤ１とＤ２の間をキモトリプシンで切断し、残基８８で始まるカルボキシル末端断片（D2D3８８－２７４）を生成することによって達成され得る。本抗ｓｕＰＡＲ ｍＡｂは、ｓｕＰＡＲの最小グリコシル化アイソタイプを発現するショウジョウバエＳ２細胞で発現された可溶型ｓｕＰＡＲによって誘導された。
ｕＰＡＲには３つの細胞外ドメインがあり、タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＤ１、Ｄ２及びＤ３と呼ばれている。いくつかの酵素がＤ１とＤ２の間のドメインを切断し、ドメインＤ２とＤ３をｓｕＰＡＲとして提供することが報告されている。可溶性組換えｕＰＡＲの活性化は、Ｒｅｓｎａｔｉ ｅｔ ａｌ． ［１９９６ ＥＭＢＯ Ｊ １５（７）：１５７２－１６８２ ａｎｄ ２００２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９９（３）：１３５９－１３６４］が述べているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ドメインＤ１とＤ２の間をキモトリプシンで切断し、残基８８で始まるカルボキシル末端断片（D2D3８８－２７４）を生成することによって達成され得る。本抗ｓｕＰＡＲ ｍＡｂは、ｓｕＰＡＲの最小グリコシル化アイソタイプを発現するショウジョウバエＳ２細胞で発現された可溶型ｓｕＰＡＲによって誘導された。
【0021】
免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる抗体（Ａｂ）は、細菌及びウイルスのような免疫原と呼ばれる有害物質を検出した際に、身体の免疫システムによって産生される大きなＹ字型のタンパク質である。抗体の産生は免疫系の主要な機能であり、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）と呼ばれる白血球の一種と、形質細胞と呼ばれる分化したＢ細胞により行われる。産生された抗体は、ｕＰＡＲのような癌細胞上のものなどの外部因子及び細胞表面構造に発現される抗原と呼ばれる免疫原の特定の部分に結合する。
抗体は重い（約１５０ｋＤａ）球状の血漿タンパク質である。全ての抗体の基本構造は同じである。
典型的な哺乳動物抗体は、後述するようなラクダ科のものを除き、４本のポリペプチド鎖を含み、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖が、ジスルフィド結合によって互いに、またそれ自身と結合している。軽鎖（Ｌ）は約２２，０００Ｄａのポリペプチドであり、重鎖（Ｈ）は約５０，０００Ｄａ以上の質量を有するより大きなポリペプチドである。Ｉｇ重鎖にはギリシャ文字でα、δ、ε、γ、及びμで表される５つのタイプがある。Ｉｇ軽鎖には２つのタイプがあり、ラムダ（λ）とカッパ（κ）と呼ばれる。
抗体は重い（約１５０ｋＤａ）球状の血漿タンパク質である。全ての抗体の基本構造は同じである。
典型的な哺乳動物抗体は、後述するようなラクダ科のものを除き、４本のポリペプチド鎖を含み、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖が、ジスルフィド結合によって互いに、またそれ自身と結合している。軽鎖（Ｌ）は約２２，０００Ｄａのポリペプチドであり、重鎖（Ｈ）は約５０，０００Ｄａ以上の質量を有するより大きなポリペプチドである。Ｉｇ重鎖にはギリシャ文字でα、δ、ε、γ、及びμで表される５つのタイプがある。Ｉｇ軽鎖には２つのタイプがあり、ラムダ（λ）とカッパ（κ）と呼ばれる。
【0022】
各抗体の重鎖と軽鎖は、Ｎ末端可変領域とそれに続く定常領域を含む。可変（Ｖ）領域は約１００～１１０アミノ酸からなり、抗体ごとに異なる。各可変領域は、４つのフレームワーク領域で区切られた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは主に免疫原の抗原領域に結合する配列である。
分子内の各重鎖と軽鎖の残りの部分は定常領域（Ｃ）で、２つの軽鎖サブタイプと５つの重鎖サブクラスを定義する限定的なバリエーションを示す。重鎖は３つの定数領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、軽鎖は定数領域（ＣＬ）を１つのみ含む。
分子内の各重鎖と軽鎖の残りの部分は定常領域（Ｃ）で、２つの軽鎖サブタイプと５つの重鎖サブクラスを定義する限定的なバリエーションを示す。重鎖は３つの定数領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、軽鎖は定数領域（ＣＬ）を１つのみ含む。
【0023】
一部の重鎖（α、δ、γ）はプロリンに富んだヒンジ領域も含む。エフェクター機能はカルボキシ末端ドメインにより媒介される。ヒンジ領域のないε及びμ重鎖は、分子中央に付加的なドメインを含む。
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つの抗体タイプ（アイソタイプ）は、重鎖定常領域のタイプによって分類され、体内での分布及び機能が異なっている。ここで特に注目されるＩｇＧアイソタイプには、４つのヒトサブクラス（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4）があり、それぞれ異なる重鎖を含んでいる。それらは相同性が高く、主にヒンジ領域及び宿主免疫系を活性化する程度が異なる。ＩｇＧ1とＩｇＧ4はヒンジ領域に２つの鎖間ジスルフィド結合を含むが、ＩｇＧ2は４つ、ＩｇＧ3は１１である。これらのアイソタイプは、本明細書では論じないが、それ自体さらに再分される。
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つの抗体タイプ（アイソタイプ）は、重鎖定常領域のタイプによって分類され、体内での分布及び機能が異なっている。ここで特に注目されるＩｇＧアイソタイプには、４つのヒトサブクラス（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4）があり、それぞれ異なる重鎖を含んでいる。それらは相同性が高く、主にヒンジ領域及び宿主免疫系を活性化する程度が異なる。ＩｇＧ1とＩｇＧ4はヒンジ領域に２つの鎖間ジスルフィド結合を含むが、ＩｇＧ2は４つ、ＩｇＧ3は１１である。これらのアイソタイプは、本明細書では論じないが、それ自体さらに再分される。
【0024】
以下に開示する発明は、治療と診断（セラノスティック(theranostic)）の両方の用途に特定の様々な標的化種分子と単一のキレート剤とを使用し、両方の用途に単一のキレーター連結標的化システムを提供することを教示する。このようなセラノスティックは、放射性同位体の標識は別個であるが、標的化種とキレート化剤の製造工程は共通であり得るので、開発及び製造において重要な利点を有する。これにより、開発、非標識標的キレーターを用いた毒性試験、共通の安定性、及び原薬において、時間とコストのいくつかの利点が提供される。
【発明の概要】
【0025】
発明の概要
本発明は、Ａｃ－２２５、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｚｒ－８９及びＩｎ－１１１などの三価の放射性同位体イオンと、又、驚くことに標的化種分子と安定な金属配位子錯体を容易に作り出して放射線治療薬又は放射性診断薬（若しくは一般には放射性医薬品）を形成する、構造中にピリジン環が埋め込まれた１２員大環状アミンを含むキレート剤の使用に関する。これらの放射性医薬品はラジオセラノスティックス薬とも呼ばれる。
キレート剤は、特定の標的化種分子に結合され、分子のその部分へのＱ+3イオンのキレート化を可能とする。従って、キレート剤は、標的化分子のその標的に到達する能力を妨げない標的化分子の部分に結合される。標的化種は、放射性医薬品を、殺傷する細胞、又はその存在、位置、サイズ、及び形状の１以上が決定される細胞に結合させる。
本発明は、Ａｃ－２２５、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｚｒ－８９及びＩｎ－１１１などの三価の放射性同位体イオンと、又、驚くことに標的化種分子と安定な金属配位子錯体を容易に作り出して放射線治療薬又は放射性診断薬（若しくは一般には放射性医薬品）を形成する、構造中にピリジン環が埋め込まれた１２員大環状アミンを含むキレート剤の使用に関する。これらの放射性医薬品はラジオセラノスティックス薬とも呼ばれる。
キレート剤は、特定の標的化種分子に結合され、分子のその部分へのＱ+3イオンのキレート化を可能とする。従って、キレート剤は、標的化分子のその標的に到達する能力を妨げない標的化分子の部分に結合される。標的化種は、放射性医薬品を、殺傷する細胞、又はその存在、位置、サイズ、及び形状の１以上が決定される細胞に結合させる。
【0026】
より具体的には、標的化種は、キレート化三価放射性同位体イオンＱ+3を有するＰＣＴＡキレーターに化学的に結合されて、下記に式Ｉで示される一般構造式を有する、又、キレート化される放射性同位体に応じて、標的細胞を殺傷するか、又は標的細胞に結合して、結合した細胞の存在、位置、サイズ若しくは形状の１以上のシグナルを得るために治療的に使用され得るセラノスティック放射性医薬品を形成する。
上式において、Ｍは、プロトン（Ｈ+）、アンモニウムイオン又はアルカリ金属イオンである。ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学結合したヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１のヒト化マウスモノクローナル抗体ＡＴＮ－６５８から調製されたそのパラトープ含有部分を表す。「ｇ」は、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はそのパラトープ含有部分の各分子当たりのキレート化ＰＣＴＡキレート化三価放射性イオンの平均数を示す、平均値が約１～約１２である数である。例示的なキレート化Ｑ+3イオンとしては、三価Ａｃ－２２５、Ｂｉ－２１３、Ｂｉ－２１２、Ｚｒ－８９又はＩｎ－１１１が挙げられる。任意選択の陰イオンＹ-は、イオン電荷のバランスをとるのに必要な量で存在することができる。
【化1】
【0027】
まずＱ+3イオンとのキレート化反応を行い、その後標的化種分子Ｔに結合させることができる。同位体を２回取り扱うため、これは２段階法と呼ばれる。或いは、まず結合反応（キレート剤を標的化種に結合させる）を行い、その後Ｑ+3イオンを挿入することもできる。これは、同位体の取り扱いが１回だけなので１段階法と呼ばれ、好ましい。アクチニウム－２２５は好ましいＱ+3イオンである。
本発明に従って、放射性医薬品は、３価の放射性同位元素であるＱ+3イオンをキレート化するキレート剤と化学的に結合される標的化種分子として、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのパラトープ含有部分を使用する。より具体的には、そのｍＡｂは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）自体に、又、二元ｕＰＡ－ｕＰＡＲ複合体、すなわちｕＰＡＲに、又、ｕＰＡＲとウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）から形成される複合体に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。
本発明に従って、放射性医薬品は、３価の放射性同位元素であるＱ+3イオンをキレート化するキレート剤と化学的に結合される標的化種分子として、特定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのパラトープ含有部分を使用する。より具体的には、そのｍＡｂは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）自体に、又、二元ｕＰＡ－ｕＰＡＲ複合体、すなわちｕＰＡＲに、又、ｕＰＡＲとウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）から形成される複合体に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【0028】
ヒト化抗体又はそのパラトープ含有部分（又は抗原結合フラグメント）は、以下の構造要素を含む。ヒト化抗体は、ＩｇＧ１κ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）タイプである。好ましいｍＡｂは、ＭＮＰＲ－１０１と称され、ヒト化型のマウスモノクローナルＡＴＮ－６５８である。ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１を有するハイブリドーマによって産生される。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＮＰＲ－１０１は、以下に詳細に記載される。
抗体又は抗原結合フラグメントは、
（Ａ）それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５の各一連のアミノ酸残基配列の組合せを有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含むＶLκ鎖；並びに
（Ｂ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の各一連のタイプ１のアミノ酸残基配列の組合せを有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含むＶH鎖
を含む。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＮＰＲ－１０１は、以下に詳細に記載される。
抗体又は抗原結合フラグメントは、
（Ａ）それぞれ配列番号３、配列番号４及び配列番号５の各一連のアミノ酸残基配列の組合せを有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２及びＣＤＲ Ｌ３を含むＶLκ鎖；並びに
（Ｂ）配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の各一連のタイプ１のアミノ酸残基配列の組合せを有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ３を含むＶH鎖
を含む。
【0029】
一実施形態では、κ鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸残基配列を含む。別の実施形態では、κ鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸残基配列を含む。κ鎖定常領域は、配列番号７のアミノ酸残基配列を有する。
一実施形態では、重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号８のアミノ酸残基配列を有する。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸残基配列を有する。重鎖タイプ１定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが一緒になって）は、配列番号１４のアミノ酸残基配列を有する。
一実施形態では、重鎖可変（ＶＨ）領域は、配列番号８のアミノ酸残基配列を有する。別の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸残基配列を有する。重鎖タイプ１定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが一緒になって）は、配列番号１４のアミノ酸残基配列を有する。
【0030】
薬学上許容可能な希釈剤中に溶解又は分散した式Ｉの治療上有効な量の標的放射性医薬品を含む医薬組成物が企図される。好ましくは、薬学上許容可能な希釈剤は、周囲温度で水性液であり、非経口投与用に適合されている。
一実施形態では、その医薬組成物は、宿主に標的細胞殺傷（治療）有効量の標的放射性医薬品を投与することを含む、望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有する哺乳動物宿主を治療するための方法で使用される。
更なる実施形態では、企図される標的放射性医薬品は診断薬として使用される。従って、本発明は、宿主に標的細胞結合有効量の標的放射性医薬品を投与し、その後、結合した標的放射性医薬品によって放出された放射線を検出し、位置を特定するために宿主をスキャンすることにより、望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有すると思われる又は有することが分かっている哺乳動物宿主をアッセイするための方法を企図する。
一実施形態では、その医薬組成物は、宿主に標的細胞殺傷（治療）有効量の標的放射性医薬品を投与することを含む、望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有する哺乳動物宿主を治療するための方法で使用される。
更なる実施形態では、企図される標的放射性医薬品は診断薬として使用される。従って、本発明は、宿主に標的細胞結合有効量の標的放射性医薬品を投与し、その後、結合した標的放射性医薬品によって放出された放射線を検出し、位置を特定するために宿主をスキャンすることにより、望まれない血管新生、腫瘍成長及び／又は腫瘍転移を特徴とする疾患、障害又は病態を有すると思われる又は有することが分かっている哺乳動物宿主をアッセイするための方法を企図する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
発明の詳細な説明
本発明は、三価放射性同位体Ｑ+3イオンをキレート化するキレート剤ＰＣＴＡ（後述）と化学的に結合したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのパラトープ含有部分標的化種を含む標的放射性医薬品に関する。
三価放射性イオンＱ+3は、二元ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）－ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）複合体（ｕＰＡ－ｕＰＡＲ）を標的とし、それに結合し（それを免疫反応する）、且つ、ｕＰＡ－ｕＰＡＲ二元複合体形成を妨げない場所でｕＰＡＲとも特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体に化学的に結合された（連結された）ＰＣＴＡによってキレート化される。本発明の企図される標的放射性医薬品は、下記に式Ｉで示す一般構造式を有する。
上式で、Ｍは、プロトン（Ｈ+），アンモニウムイオン又はアルカリ金属陽イオンである。ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学的に結合したヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はパラトープ含有部分から調製されたパラトープ含有部分を表す。「ｇ」は、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はそのパラトープ含有部分の各分子当たりのキレート化ＰＣＴＡキレート化三価放射性イオンの平均数を示す、平均値が１～約１２である数である。任意選択の陰イオンＹ-は、イオン電荷のバランスをとるのに必要な量で存在することができる。
本発明は、三価放射性同位体Ｑ+3イオンをキレート化するキレート剤ＰＣＴＡ（後述）と化学的に結合したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はそのパラトープ含有部分標的化種を含む標的放射性医薬品に関する。
三価放射性イオンＱ+3は、二元ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）－ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）複合体（ｕＰＡ－ｕＰＡＲ）を標的とし、それに結合し（それを免疫反応する）、且つ、ｕＰＡ－ｕＰＡＲ二元複合体形成を妨げない場所でｕＰＡＲとも特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体に化学的に結合された（連結された）ＰＣＴＡによってキレート化される。本発明の企図される標的放射性医薬品は、下記に式Ｉで示す一般構造式を有する。
【化2】
上式で、Ｍは、プロトン（Ｈ+），アンモニウムイオン又はアルカリ金属陽イオンである。ボックスのｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１は、化学的に結合したヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はパラトープ含有部分から調製されたパラトープ含有部分を表す。「ｇ」は、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１又はそのパラトープ含有部分の各分子当たりのキレート化ＰＣＴＡキレート化三価放射性イオンの平均数を示す、平均値が１～約１２である数である。任意選択の陰イオンＹ-は、イオン電荷のバランスをとるのに必要な量で存在することができる。
【0033】
ヒト化抗体又はそのパラトープ含有部分（又は抗原結合フラグメント）は、以下の構造要素を含む。ヒト化抗体は、ＩｇＧ１κ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）タイプのモノクローナル抗体である。ｍＡｂは、ＭＮＰＲ－１０１と称され、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１を有するハイブリドーマによって産生されるヒト化型のマウスモノクローナルＡＴＮ－６５８である。
キレート剤のいくつかのバージョンは、ピリジンベースの１２員テトラアザ大環状配位子又はＰＣＴＡと呼ばれる（初出：２０１９年４月２日 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｅｕｒｏｐｅ．ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／－ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１９００２８０）。
それ以外の点では均質なモノクローナル抗体調製物には反応しない抗体もあればよく反応する抗体もあるので、抗体分子当たりに結合したキレーターの数ｇは平均数である。キレーターのイソチオシアネート基が無傷抗体に結合している場合、抗体分子当たりに結合したキレーターの平均数は１～約１２、好ましくは約３～約１２、より好ましくは約８～約１０である。そのパラトープ含有部分（又は抗原結合フラグメント）が標的化種である場合、重鎖の２対のＣＨ２及びＣＨ３部分が存在しない場合、イソチオシアネート基が反応できるリジンアミノ基などの反応性基の数が少なくなるので、標的化種１分子当たりのＰＣＴＡキレーターの数は、約１～約５などと少なくなる傾向がある。
キレート剤のいくつかのバージョンは、ピリジンベースの１２員テトラアザ大環状配位子又はＰＣＴＡと呼ばれる（初出：２０１９年４月２日 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－ｅｕｒｏｐｅ．ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／－ｄｏｉ／ａｂｓ／１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１９００２８０）。
それ以外の点では均質なモノクローナル抗体調製物には反応しない抗体もあればよく反応する抗体もあるので、抗体分子当たりに結合したキレーターの数ｇは平均数である。キレーターのイソチオシアネート基が無傷抗体に結合している場合、抗体分子当たりに結合したキレーターの平均数は１～約１２、好ましくは約３～約１２、より好ましくは約８～約１０である。そのパラトープ含有部分（又は抗原結合フラグメント）が標的化種である場合、重鎖の２対のＣＨ２及びＣＨ３部分が存在しない場合、イソチオシアネート基が反応できるリジンアミノ基などの反応性基の数が少なくなるので、標的化種１分子当たりのＰＣＴＡキレーターの数は、約１～約５などと少なくなる傾向がある。
【0034】
好ましいキレーターは、当技術分野ではＰＣＴＡと呼ばれる。特に好ましい形態のＰＣＴＡの化学式は、キレート剤を二官能性とすることができる下記に式ＩＩで示す未反応のイソチオシアネート連結基であり、ここで、Ｍは従前に記載されている通りである。
式ＩＩのキレーターは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ Ｉｎｃ．（ダラス、ＴＸ）からｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－ＰＣＴＡの名称で市販されている。
【化3】
【0035】
本発明において企図される標的化種は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＮＰＲ－１０１、又はそのパラトープ含有部分である。ひと度、標的細胞に結合すると、三価放射性同位体Ｑ+3イオン、例えば好ましいＡｃ－２２５イオンにキレート化された抗体及びその化学的に結合したＰＣＴＡは、望まれない細胞に取り込まれ、この際にＡｃ－２２５又はその娘原子の１つが崩壊して望まれない細胞内でその細胞傷害性α粒子を放出し得る。
「抗体」という用語は、無傷のｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１分子並びにＩｇ分子のタンパク質分解切断により生産することができるか又は緯線的若しくは化学的に操作することができるその抗原結合フラグメント（パラトープ含有部分）の両方を含むことを意味する。ＭＮＰＲ－１０１は、ｕＰａ－ｕＰＡＲ ２元複合体と特異的に結合する（免疫反応する）ＩｇＧ１ κ ｍＡｂである。
「抗体」という用語は、無傷のｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１分子並びにＩｇ分子のタンパク質分解切断により生産することができるか又は緯線的若しくは化学的に操作することができるその抗原結合フラグメント（パラトープ含有部分）の両方を含むことを意味する。ＭＮＰＲ－１０１は、ｕＰａ－ｕＰＡＲ ２元複合体と特異的に結合する（免疫反応する）ＩｇＧ１ κ ｍＡｂである。
【0036】
パラトープ含有部分又は抗原結合フラグメントとしては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖが含まれ、それぞれが抗原に結合することができる。これらのフラグメントは、無傷抗体（Ａｂ）のＦｃフラグメントを欠いており、治療に使用した場合、無傷抗体よりも循環からより迅速に除去され、非特異的な組織結合が少ないという付加的利点がある。
無傷のＩｇのパパイン処理によりＦａｂフラグメントが生じ；ペプシン処理によりＦ（ａｂ’）2フラグメントが生じる。これらのフラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して、遺伝子工学又はタンパク質工学によって作製することもできる。
無傷のＩｇのパパイン処理によりＦａｂフラグメントが生じ；ペプシン処理によりＦ（ａｂ’）2フラグメントが生じる。これらのフラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して、遺伝子工学又はタンパク質工学によって作製することもできる。
【0037】
Ｆａｂフラグメント又は部分は、共有結合したＩｇ重（Ｈ）鎖とＩｇ軽（Ｌ）鎖の免疫学的に活性な部分を含み、抗原と特異的に結合できるＩｇ分子の部分からなる二量体タンパク質である。Ｆａｂフラグメントは、一般に、当技術分野で周知の方法を使用して、実質的に無傷のＩｇ分子をパパインでタンパク質分解消化することによって調製される。しかしながら、Ｆａｂフラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して、ＩｇＨ鎖及びＬ鎖の所望の部分を適切な宿主細胞内で発現させることによって調製することもできる。
Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、カルボキシ末端位置から無傷抗体ヒンジ位置までの無傷抗体のペプシン切断によって形成され得る四量体である。ペプシン切断中には、Ｆｃフラグメントのいくつかのより小さい部分も一般に産生されるが、パパイン切断は一般に単一のＦｃ二量体を産生する。
Ｆｖフラグメントは、共有結合したＩｇＨ鎖可変（Ｖ）領域（ＶH）とＩｇＬ鎖Ｖ領域（ＶL）の免疫学的に活性な部分を含有する多量体タンパク質であり、抗原と特異的に結合することができる。Ｆｖフラグメントは、一般に、当技術分野で周知の方法を使用した好適な宿主細胞でのＩｇ ＶH領域及びＶL領域の所望の部分の発現によって調製される。
Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも約４アミノ酸残基（一般に小さな中性アミノ酸）の配列をコードするリンカーに連結される。この融合によってコードされたタンパク質は、元のＡｂの特異性と親和性を保持する機能的可変領域の構築を可能にする。
Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、カルボキシ末端位置から無傷抗体ヒンジ位置までの無傷抗体のペプシン切断によって形成され得る四量体である。ペプシン切断中には、Ｆｃフラグメントのいくつかのより小さい部分も一般に産生されるが、パパイン切断は一般に単一のＦｃ二量体を産生する。
Ｆｖフラグメントは、共有結合したＩｇＨ鎖可変（Ｖ）領域（ＶH）とＩｇＬ鎖Ｖ領域（ＶL）の免疫学的に活性な部分を含有する多量体タンパク質であり、抗原と特異的に結合することができる。Ｆｖフラグメントは、一般に、当技術分野で周知の方法を使用した好適な宿主細胞でのＩｇ ＶH領域及びＶL領域の所望の部分の発現によって調製される。
Ｈ鎖及びＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも約４アミノ酸残基（一般に小さな中性アミノ酸）の配列をコードするリンカーに連結される。この融合によってコードされたタンパク質は、元のＡｂの特異性と親和性を保持する機能的可変領域の構築を可能にする。
【0038】
本明細書で企図されるｍＡｂは、ＫＬＨに結合したｓｕＰＡＲのＤ２Ｄ３ドメインでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫することによって作製され、その後、融合研究を行い、組換えタンパク質を用いたウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように、ｕＰＡＲのＤ２Ｄ３ドメインと特異的な交差反応性を有する親クローンが作製された。これらの親クローンに限界希釈を行い、Ｄ２Ｄ３に特異的なｍＡｂパネルを得た。これらのＡｂのうち４つのものの特性を下表にまとめている。アイソタイピングにより、全てのクローンがＩｇＧ１，κと同定された。ｕＰＡＲに対する特異性はウェスタンブロッティングにより確認した。ｍＡｂの親和性は直接結合アッセイを用いて決定した。示されているように、５つのｍＡｂのうち３つは約１～約５ｎＭの親和性を示した。
【表1】
【0039】
ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１と呼ばれる、本明細書で使用されるｍＡｂは、ヒト化型のマウスｍＡｂ ＡＴＮ－６５８であり、そのハイブリドーマはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１を有し、米国特許第８１０１７２６号で開示され特許請求されている。米国特許第８１０１７２６号で又、開示され特許請求されているマウスｍＡｂ ＡＴＮ－６１５は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９２のハイブリドーマによって分泌される。ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１パラトピックアミノ酸残基配列（ＣＤＲ；相補性決定領域；可変領域）は、ＡＴＮ－６５８とほとんど同一で（約９５．８％）、重鎖定数領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）はヒトＩｇＧ１抗体のものである。
【0040】
ＭＮＰＲ－１０１を調製するためのＡＴＮ－６５８のヒト化には、Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ， １９９２ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２９（９）：１１４１－１１４６（以下Ｋａｂａｔ）に報告されているヒト抗体アミノ酸残基配列とヒト化される抗体の可変領域の配列を組み合わせて１以上のコンセンサス配列を形成しているものを用いるＸｏｍａ ＨＥ（商標）合成プラットフォームを使用した。この方法には次のようないくつかの工程がある。
（１）ＸＯＭＡ Ｃｏｒｐ．（エメリービル、ＣＡ）独自のＨＥ（商標）法を用いたＡＴＮ－６５８軽鎖及び重鎖のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ（商標）（ＨＥ（商標））による、低リスク及び低リスク＋中リスクのＨＥ（商標）変異体の作製；
（２）ＨＥ（商標）可変（Ｖ）領域配列のコドンの最適化、エネルギーの最小化及び遺伝子合成；
（３）ヒトγ－１及びκ定常領域モジュールを含むＸＯＭＡ独自の一過性発現ベクターへの４つのＨＥ（商標）Ｖ領域のクローニング；
（４）ＨＥ（商標）変異体の一過性発現；
（５）ヒト化抗体の精製、及びそれらの純度と内毒素の特性決定；並びに
（６）４つのＨＥ（商標）変異体の親和性の確認。
上記及び以下で議論される「低リスク」という表現は、マウスからヒトへのアミノ酸残基の変化が、結合親和性に影響を与える可能性がほとんどなく、治療免疫原性の大幅な低下をもたらすかどうかに関する。もう１つの表現「高リスク」は、マウスからヒトへのアミノ酸残基の変化が、治療免疫原性の実際の低下がほとんど又は全くなく、結合活性の低下又は消失をもたらす位置の改変に関する。
（１）ＸＯＭＡ Ｃｏｒｐ．（エメリービル、ＣＡ）独自のＨＥ（商標）法を用いたＡＴＮ－６５８軽鎖及び重鎖のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ（商標）（ＨＥ（商標））による、低リスク及び低リスク＋中リスクのＨＥ（商標）変異体の作製；
（２）ＨＥ（商標）可変（Ｖ）領域配列のコドンの最適化、エネルギーの最小化及び遺伝子合成；
（３）ヒトγ－１及びκ定常領域モジュールを含むＸＯＭＡ独自の一過性発現ベクターへの４つのＨＥ（商標）Ｖ領域のクローニング；
（４）ＨＥ（商標）変異体の一過性発現；
（５）ヒト化抗体の精製、及びそれらの純度と内毒素の特性決定；並びに
（６）４つのＨＥ（商標）変異体の親和性の確認。
上記及び以下で議論される「低リスク」という表現は、マウスからヒトへのアミノ酸残基の変化が、結合親和性に影響を与える可能性がほとんどなく、治療免疫原性の大幅な低下をもたらすかどうかに関する。もう１つの表現「高リスク」は、マウスからヒトへのアミノ酸残基の変化が、治療免疫原性の実際の低下がほとんど又は全くなく、結合活性の低下又は消失をもたらす位置の改変に関する。
【0041】
Ｘｏｍａ ＨＥ（商標）プラットフォームを使用してｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１を作出するためのＡＴＮ－６５８のヒト化は、以下の刊行物、特許及び特許出願で示唆されている「低リスク」、「中リスク」、及び「高リスク」置換に従って実行された：１）国際公開第９３／１１７９４号“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ”；２）米国特許第５７６６８８６号“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ”；３）米国特許第５７７０１９６号“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ”；４）米国特許第５８２１１２３号“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ”；５）米国特許第５８６９６１９号、“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ”、及び６）Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ７：８０５－８１４、これらの開示は全て参照により本明細書の一部として援用される。
【0042】
マウスｍＡｂ ＡＴＮ－６５８の可変（Ｖ）領域アミノ酸残基配列のヒト化
ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８の軽鎖可変領域（ＶL）及び重鎖可変領域（ＶH）ポリペプチドのコンセンサスアミノ酸配列（一文字コード）は、Ｐａｒｒｙ ａｎｄ Ｍａｚａｒの米国特許第８，１９１，７２６号に示され、ここでは繰り返さないが、参照により本明細書の一部として援用される。ＡＴＮ－６５８及び可変領域を発現するハイブリドーマから抽出された全ＲＮＡからｃＤＮＡを、標準的な技術を用いて、調製し、増幅させ、配列決定した。
上記のＳｔｕｄｎｉｃｋａらにより示されている手順に従って、ヒトＶκ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）及びヒト重鎖サブグループ１（ＶＨ１）コンセンサス配列を用いた。コグネイトマウスシグナル配列は保持した。
ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８の軽鎖可変領域（ＶL）及び重鎖可変領域（ＶH）ポリペプチドのコンセンサスアミノ酸配列（一文字コード）は、Ｐａｒｒｙ ａｎｄ Ｍａｚａｒの米国特許第８，１９１，７２６号に示され、ここでは繰り返さないが、参照により本明細書の一部として援用される。ＡＴＮ－６５８及び可変領域を発現するハイブリドーマから抽出された全ＲＮＡからｃＤＮＡを、標準的な技術を用いて、調製し、増幅させ、配列決定した。
上記のＳｔｕｄｎｉｃｋａらにより示されている手順に従って、ヒトＶκ軽鎖サブグループ２（ＶＫ２）及びヒト重鎖サブグループ１（ＶＨ１）コンセンサス配列を用いた。コグネイトマウスシグナル配列は保持した。
【0043】
軽鎖と重鎖の可変領域それぞれについて２つの配列が調製された。各鎖の一方の配列は低リスクの変化のみを含み、ＶＫ２領域とＶＨ１領域については低リスクと中程度のリスクの両方の変化を含む他方配列を作製し、合計４つの配列を準備した。軽鎖フレームワーク配列には１０個の低リスク変化と１個の中リスク変化が導入され、重鎖フレームワーク配列には１１個の低リスク変化と５個の中リスク変化が導入された。低リスクの残基位置の変化は、溶媒に曝されるが抗原結合又は抗体構造には寄与しないもので、結合親和性にはほとんど又は全く影響を与えずに免疫原性を低下させる可能性が高い。
これらのアミノ酸残基配列は、コドン（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及び発現の最適化のためにＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＰ（ボセル、ＷＡ）へ送った。最適化されたＤＮＡ配列を受け取り、遺伝子合成のためにＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎに送り返した。
これらのアミノ酸残基配列は、コドン（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及び発現の最適化のためにＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＰ（ボセル、ＷＡ）へ送った。最適化されたＤＮＡ配列を受け取り、遺伝子合成のためにＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎに送り返した。
【0044】
一過性発現ベクターの構築
コドン及び発現に最適化された低リスク及び低＋中リスクのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）軽鎖及び重鎖を、ヒトκ及びγ－１定常領域モジュールを含むＸＯＭＡ独自の一過性抗体発現ベクターにインフレームでクローニングした。発現を開始するためにＤＮＡ配列を確認した（ＥＬＩＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、ヘイワード、ＣＡにて）。
コドン及び発現に最適化された低リスク及び低＋中リスクのＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）軽鎖及び重鎖を、ヒトκ及びγ－１定常領域モジュールを含むＸＯＭＡ独自の一過性抗体発現ベクターにインフレームでクローニングした。発現を開始するためにＤＮＡ配列を確認した（ＥＬＩＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、ヘイワード、ＣＡにて）。
【0045】
Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８抗体の生産
４つのＨＥ（商標）ＡＴＮ－６５８変異体（ＨＥ（商標）ＡＴＮ－１、ＨＥ（商標）ＡＴＮ－２、ＨＥ（商標）ＡＴＮ－３及びＨＥ（商標）ＡＴＮ－４と呼ばれる）を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションにより生産した。ＸＯＭＡの一過性トランスフェクションアプローチは、２００５ ＡＳＣＢ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇのポスタープレゼンテーションに詳細に記載されている。
簡単に述べれば、２リットルの振盪フラスコを用い、軽鎖と重鎖を、ＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，アーバイン，ＣＡ）で増殖させたＸＯＭＡの懸濁適応ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に共導入した。振盪フラスコで２４時間後、２００ｍｌのトランスフェクト細胞を遠心分離し、４０ｍｌの新鮮培地に再懸濁させ、生産のためにＩｎｔｅｇｒａフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューブライトン、ＭＮ）に移した。７日間インキュベートした後、細胞懸濁液をＩｎｔｅｇｒａフラスコから取り出し、遠心分離し、培養上清を保持した。培養上清中の抗体をプロテインＡスピンカラム（Ｐｒｏ－Ｃｈｅｍ）で精製し、ＰＢＳで透析後、濃縮し、濾過除菌した。
４つのＨＥ（商標）ＡＴＮ－６５８変異体（ＨＥ（商標）ＡＴＮ－１、ＨＥ（商標）ＡＴＮ－２、ＨＥ（商標）ＡＴＮ－３及びＨＥ（商標）ＡＴＮ－４と呼ばれる）を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における一過性トランスフェクションにより生産した。ＸＯＭＡの一過性トランスフェクションアプローチは、２００５ ＡＳＣＢ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇのポスタープレゼンテーションに詳細に記載されている。
簡単に述べれば、２リットルの振盪フラスコを用い、軽鎖と重鎖を、ＩＳ２９３培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，アーバイン，ＣＡ）で増殖させたＸＯＭＡの懸濁適応ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に共導入した。振盪フラスコで２４時間後、２００ｍｌのトランスフェクト細胞を遠心分離し、４０ｍｌの新鮮培地に再懸濁させ、生産のためにＩｎｔｅｇｒａフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューブライトン、ＭＮ）に移した。７日間インキュベートした後、細胞懸濁液をＩｎｔｅｇｒａフラスコから取り出し、遠心分離し、培養上清を保持した。培養上清中の抗体をプロテインＡスピンカラム（Ｐｒｏ－Ｃｈｅｍ）で精製し、ＰＢＳで透析後、濃縮し、濾過除菌した。
【0046】
これら４つの抗体の可変領域構成配列を下記の表１に示す。
【表2】
【0047】
濃度は１．５２の消光係数を用いてＡ280により決定した。タンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～２０％）により純度を、ＬＡＬアッセイを用いて内毒素を分析した。精製結果は、全ての抗体調製物が１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度を有し、９０％を超える純度で、低レベルの内毒素（＜１ＥＵ／ｍｇ）であったことを示している。
【0048】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ法によるＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８抗体の親和性の評価
マウスモノクローナル抗体ＡＴＮ－６５８及びＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８変異体抗体の動態解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）表面プラズモン共鳴装置分析機（ウプサラ、スウェーデン）で行い、抗体－表面相互作用に基づくセンソグラムを作成した。動態決定は捕捉法を用いて行った。
マウス親ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、ウサギ抗マウス捕捉表面上に注入した。ＨＥ（商標）変異体は１μｇ／ｍＬに希釈し、プロテインＡ／Ｇ表面上に注入した。抗体注入は１００～２００ＲＵの抗体濃度になるように最適化した。
可溶性ｕＰＡＲ（ｓｕＰＡＲ）の３倍連続希釈液を６つ、ランニングバッファー（ＰＢＳ）で調製し、各希釈液を２５℃にて無作為な順序で３回注入した。バッファーの注入は、実施中、均等に行った。バルクシフト又は非特異的結合を補正するため、サンプル注入はブランクフローセルとバッファー注入に関して二重参照とした。データはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアで解析した。センサーグラムは、１：１のラングミュアモデルを用いてフィッティングした。
マウスモノクローナル抗体ＡＴＮ－６５８及びＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８変異体抗体の動態解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（登録商標）表面プラズモン共鳴装置分析機（ウプサラ、スウェーデン）で行い、抗体－表面相互作用に基づくセンソグラムを作成した。動態決定は捕捉法を用いて行った。
マウス親ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、ウサギ抗マウス捕捉表面上に注入した。ＨＥ（商標）変異体は１μｇ／ｍＬに希釈し、プロテインＡ／Ｇ表面上に注入した。抗体注入は１００～２００ＲＵの抗体濃度になるように最適化した。
可溶性ｕＰＡＲ（ｓｕＰＡＲ）の３倍連続希釈液を６つ、ランニングバッファー（ＰＢＳ）で調製し、各希釈液を２５℃にて無作為な順序で３回注入した。バッファーの注入は、実施中、均等に行った。バルクシフト又は非特異的結合を補正するため、サンプル注入はブランクフローセルとバッファー注入に関して二重参照とした。データはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアで解析した。センサーグラムは、１：１のラングミュアモデルを用いてフィッティングした。
【0049】
ヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１
ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と比較して、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１の６つのＣＤＲに到達する際に、ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８のＣＤＲ配列（ＣＤＲ Ｌ１及びＣＤＲ Ｈ２）と比較して、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のＶＫ２及びＶＨ１領域のそれぞれの１つのＣＤＲにおいて１残基が変更された。ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のパラトピック領域に存在する各可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を以下の表２に示す。
ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と比較して、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１の６つのＣＤＲに到達する際に、ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８のＣＤＲ配列（ＣＤＲ Ｌ１及びＣＤＲ Ｈ２）と比較して、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のＶＫ２及びＶＨ１領域のそれぞれの１つのＣＤＲにおいて１残基が変更された。ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のパラトピック領域に存在する各可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を以下の表２に示す。
【表3】
【0050】
配列
ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のＦａｂ部分のＶＬ及びＶＨ領域並びにＣＬ及びＣＨ領域の配列、又、両鎖の可変領域の低リスク配列（ＨＥ（商標）ＡＴＮ－１）も以下に示す。
配列番号１－［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＶＬ］
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
配列番号２－［ＨＥ（商標） ＡＴＮ－１ ＶＬ］
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
配列番号３［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ１］
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
配列番号４［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ２］
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ
配列番号５ｍＡｂ［ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ３］
Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
配列番号６［ＬＣシグナル配列］
ＭＳＰＡＱＦＬＦＬＬ ＶＬＷＩＲＥＴＮＧ
配列番号７［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＬＣ定常領域配列］
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１低＋中リスク－ＶＨ］
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
配列番号９［ＨＥ（商標） ＡＴＮ－１ ＶＨ］
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
配列番号１０［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｈ１］
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号１１［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ ＣＤＲ Ｈ２］
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
配列番号１２［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ ＣＤＲ Ｈ３］
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号１３［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣシグナル配列］
ＭＧＷＩＷＩＦＬＦＬ ＬＳＧＴＡＧＶＨＳ
配列番号１４［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ定常領域配列］
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰ ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ ＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣ ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
コード核酸を発現ベクターに挿入するために、ＳａｌＩ制限部位を重鎖と軽鎖のそれぞれのコードされたＮ末端の上流にインフレームで、又、ＸｈｏＩ部位をそれぞれの鎖のコードされたＣ末端の下流にインフレームで挿入した。
ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１のＦａｂ部分のＶＬ及びＶＨ領域並びにＣＬ及びＣＨ領域の配列、又、両鎖の可変領域の低リスク配列（ＨＥ（商標）ＡＴＮ－１）も以下に示す。
配列番号１－［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＶＬ］
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
配列番号２－［ＨＥ（商標） ＡＴＮ－１ ＶＬ］
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
配列番号３［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ１］
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ
配列番号４［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ２］
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ
配列番号５ｍＡｂ［ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｌ３］
Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
配列番号６［ＬＣシグナル配列］
ＭＳＰＡＱＦＬＦＬＬ ＶＬＷＩＲＥＴＮＧ
配列番号７［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＬＣ定常領域配列］
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１低＋中リスク－ＶＨ］
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
配列番号９［ＨＥ（商標） ＡＴＮ－１ ＶＨ］
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
配列番号１０［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＣＤＲ Ｈ１］
Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｈｉｓ
配列番号１１［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ ＣＤＲ Ｈ２］
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
配列番号１２［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ ＣＤＲ Ｈ３］
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ
配列番号１３［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣシグナル配列］
ＭＧＷＩＷＩＦＬＦＬ ＬＳＧＴＡＧＶＨＳ
配列番号１４［ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ ＨＣ定常領域配列］
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰ ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ ＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥ ＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣ ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
コード核酸を発現ベクターに挿入するために、ＳａｌＩ制限部位を重鎖と軽鎖のそれぞれのコードされたＮ末端の上流にインフレームで、又、ＸｈｏＩ部位をそれぞれの鎖のコードされたＣ末端の下流にインフレームで挿入した。
【0051】
ＭＮＰＲ－１０１の生産
モノクローナル抗体候補の重鎖と軽鎖をｐＵＣ１９プラスミドにパッケージし、モノクローナル抗体コードするｃＤＮＡインサートをクローニングし、重鎖と軽鎖ポリペプチドを発現ベクターに挿入した。
配列の確認後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＸ Ｂ１１を、軽鎖及び重鎖含有ベクターとカチオン性リポソーム混合物（リポフェクタミン（登録商標）２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ジェネティシン（Ｇ４１８）及び２０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）存在下、プリンを含まない増殖培地を用いて９６ウェルディッシュで細胞をサブクローニングした。
モノクローナル抗体候補の重鎖と軽鎖をｐＵＣ１９プラスミドにパッケージし、モノクローナル抗体コードするｃＤＮＡインサートをクローニングし、重鎖と軽鎖ポリペプチドを発現ベクターに挿入した。
配列の確認後、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株ＤＵＸ Ｂ１１を、軽鎖及び重鎖含有ベクターとカチオン性リポソーム混合物（リポフェクタミン（登録商標）２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カールスバッド、ＣＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ジェネティシン（Ｇ４１８）及び２０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）存在下、プリンを含まない増殖培地を用いて９６ウェルディッシュで細胞をサブクローニングした。
【0052】
選択後、全てのサブクローンを、ｈＩｇＧベチルＥＬＩＳＡキットを用いてスクリーニングした。１２の最良サブクローンそれぞれについて、３つのバイアルを凍結した。次いで、上位６つの最良産生サブクローンを、漸増量の、ＤＨＦＲの阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）を添加した培地に移した。ＭＴＸ濃度は、選抜過程で２０から１，０００ｎＭまで、その後１，５００ｎＭ ＭＴＸまで順次増加させた。増殖したＭＴＸ耐性クローンをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。最初の一連の増幅の後、１，０００ｎＭのＭＴＸを含む培地で２つの最高発現集団サブクローンが得られた。これら２つのクローンは、１，５００ｎＭ ＭＴＸまで増幅された後、１，０００ｎＭ及び１，５００ｎＭ ＭＴＸでサブクローニングされた。これらのサブクローンは現在６ウェルプレートに拡大され、数日中にＥＬＩＳＡによりスクリーニングされる予定である。上位２～３の最良サブクローンは、無血清培地に適応させた後、研究用細胞バンクの作製のために拡大される予定である。
【0053】
結果
マウスｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と上述のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８抗体の配位子結合動態を１回測定した。各アッセイのセンサーグラムの結果から、一過性発現抗体は全てｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と同様の親和性を示し、又、それら自体の中でも同様の親和性を示した。２本のＶＬ鎖と２本のＶＨ鎖の４つの組合せの結果を表３に示す。
マウスｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と上述のＨｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）ＡＴＮ－６５８抗体の配位子結合動態を１回測定した。各アッセイのセンサーグラムの結果から、一過性発現抗体は全てｍＡｂ ＡＴＮ－６５８と同様の親和性を示し、又、それら自体の中でも同様の親和性を示した。２本のＶＬ鎖と２本のＶＨ鎖の４つの組合せの結果を表３に示す。
【表4】
【0054】
本発明の別の態様はキレート剤がｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１ヒト化モノクローナル抗体に化学的に結合され、Ｍ、及び「ｇ」は上記の通りである、式ＩＩＩで示される標的プロ放射性医薬品構築物である。
式ＩＩＩの標的プロ放射性医薬品構築物は、放射性実体を輸送する危険性を恐れることなく商業的に移動できる非放射性化学物質である。使用部位又はその近傍に到着したところで、式ＩＩＩの標的プロ放射性医薬品構築物を、225Ａｃ+3イオンなどの３価の放射性同位体イオンＱ+3を添加することができるか、又は既に存在する適切な媒体に溶解又は分散させて、式Ｉの対応する標的放射性医薬品を形成することができる。
【化4】
式ＩＩＩの標的プロ放射性医薬品構築物は、放射性実体を輸送する危険性を恐れることなく商業的に移動できる非放射性化学物質である。使用部位又はその近傍に到着したところで、式ＩＩＩの標的プロ放射性医薬品構築物を、225Ａｃ+3イオンなどの３価の放射性同位体イオンＱ+3を添加することができるか、又は既に存在する適切な媒体に溶解又は分散させて、式Ｉの対応する標的放射性医薬品を形成することができる。
【0055】
本明細書では、「プロ放射性医薬品」という語を、その実地はそれ自体放射性ではなく、放射性医薬品の生理活性を持たないことを意味して使用される。しかしながら、３価の放射性同位体イオンＱ+3をキレート化すると、生理活性のある放射性医薬品となる。
企図される標的放射性医薬品を形成するための適切な媒体は、医薬組成物を形成するために後述するような水性媒体である。このように形成された標的放射性医薬品は、一般に、このような組成物の合成に関して後述の実施例で述べるように、哺乳動物宿主に投与する前に、キレート化されていない放射性同位体から分離され、所望により単離することができる。標的放射性医薬品の濃度は又、投与のために所望のレベルに調整することができ、塩、緩衝剤などが、有効量の標的放射性医薬品を含有する企図された医薬組成物を形成するために、その時点で混合される得る。
企図される標的放射性医薬品を形成するための適切な媒体は、医薬組成物を形成するために後述するような水性媒体である。このように形成された標的放射性医薬品は、一般に、このような組成物の合成に関して後述の実施例で述べるように、哺乳動物宿主に投与する前に、キレート化されていない放射性同位体から分離され、所望により単離することができる。標的放射性医薬品の濃度は又、投与のために所望のレベルに調整することができ、塩、緩衝剤などが、有効量の標的放射性医薬品を含有する企図された医薬組成物を形成するために、その時点で混合される得る。
【0056】
医薬組成物
薬学上許容可能な希釈剤中に溶解又は分散された治療上有効な量の企図される標的放射性医薬品を含有する医薬組成物が、企図される治療方法において使用される。一実施形態では、処置が治療的である場合、治療上有効な量は、標的細胞殺傷有効量である。このような組成物は、癌細胞及び異常な免疫細胞などの望まれない標的細胞に結合して殺傷するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて哺乳動物宿主動物に投与される。
例示的な望まれない標的細胞としては、望まれない細胞転移、浸潤、増殖、免疫応答又は血管新生に関連する細胞が挙げられる。このような細胞の例としては、異常な免疫細胞、並びに、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、膵臓癌及び結腸癌の癌細胞などの癌細胞がある。ＣＤ３３マーカーを発現する急性骨髄性白血病などの血液癌、及びＨＥＲ２マーカーを発現する乳癌の治療も企図される。
薬学上許容可能な希釈剤中に溶解又は分散された治療上有効な量の企図される標的放射性医薬品を含有する医薬組成物が、企図される治療方法において使用される。一実施形態では、処置が治療的である場合、治療上有効な量は、標的細胞殺傷有効量である。このような組成物は、癌細胞及び異常な免疫細胞などの望まれない標的細胞に結合して殺傷するために、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて哺乳動物宿主動物に投与される。
例示的な望まれない標的細胞としては、望まれない細胞転移、浸潤、増殖、免疫応答又は血管新生に関連する細胞が挙げられる。このような細胞の例としては、異常な免疫細胞、並びに、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳癌、膀胱癌、頭頸部癌、膵臓癌及び結腸癌の癌細胞などの癌細胞がある。ＣＤ３３マーカーを発現する急性骨髄性白血病などの血液癌、及びＨＥＲ２マーカーを発現する乳癌の治療も企図される。
【0057】
標的細胞殺傷有効量を提供するために投与される標的放射性医薬品Ｑ+3イオンの量は、通常、患者及び癌状況における腫瘍量などの疾患の重症度によって異なる。しかしながら、隔月（ひと月おき、約６０日間隔）の約８０～約１２０ｋＢｑ／ｋｇ体重が一般に良好な結果を示す。前立腺癌患者において、ペプチド模倣薬標的化種に連結されたＤＯＴＡベースのキレート剤を利用する225ＡＣ－ＰＳＭＡ－６１７を使用し、同じ投与計画で３サイクルの約１００ｋＢｑ／ｋｇ体重を使用すると良好な結果が得られ、一部の患者では完全寛解に至ることが報告されている。Ｋｒａｔｏｃｈｗｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１６ ５７（１２）：１９４１－１９４４； Ｌａｎｇｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１９ ６０：１３Ｓ－１９Ｓ；及びＥｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２０２２ １５：２６７参照。このような用量は、他の病態の治療的処置のための用量の基礎を提供するために使用することができる。
【0058】
診断目的のために、宿主には、標的放射性医薬品の標的細胞結合（診断）有効量であるセラノスティック量が投与される。その後、宿主は、放射性医薬品が標的細胞に結合するように約１時間～数日、より通常には約１～約４時間の期間維持される。維持時間は、使用する三価同位体の崩壊速度及び標的放射性医薬品のクリアランス速度などのいくつかの要因によって異なり得る。その後、維持された宿主哺乳動物は、陽電子放出のＰＥＴスキャン（ＰＥＴスキャン）又はγ線検出器（例えば、ＳＰＥＣＴスキャン）によってスキャンされ、標的細胞に結合した標的放射性医薬品によって放出された放射線を検出及び位置特定し、それにより以下のうちの１以上を特定する：１）標的細胞が宿主内に存在していたこと、２）標的細胞の宿主体内の位置、３）大きさ、場合によっては４）標的化種によって結合された細胞塊の形状。
投与される標的放射性医薬品の診断有効量は、一般には成人の場合約０．５～約６ｍＣｉを提供するのに十分な放射性同位体であり、小児の場合は適切に少ない量である。Ｉｎ－１１１は、一般には、平均的な成人（７０ｋｇ）への静脈内投与の場合、約１１１ＭＢｑ（３ｍＣｉ）～約２２２ＭＢｑ（６ｍＣｉ）で使用される。患者は、全身ＰＥＴスキャンのために静脈内投与により約０．５～約２ｍＣｉのＺｒ－８９を受容することができる。
投与される標的放射性医薬品の診断有効量は、一般には成人の場合約０．５～約６ｍＣｉを提供するのに十分な放射性同位体であり、小児の場合は適切に少ない量である。Ｉｎ－１１１は、一般には、平均的な成人（７０ｋｇ）への静脈内投与の場合、約１１１ＭＢｑ（３ｍＣｉ）～約２２２ＭＢｑ（６ｍＣｉ）で使用される。患者は、全身ＰＥＴスキャンのために静脈内投与により約０．５～約２ｍＣｉのＺｒ－８９を受容することができる。
【0059】
企図される標的放射性医薬品医薬組成物は、注射による非経口投与を意図しているので、このような組成物は電解質を含むべきであり、好ましくはレシピエントとして意図される哺乳動物種のおよその生理学的浸透圧及びｐＨ値を有するべきである。標的放射性医薬品医薬組成物中の一価の電解質イオンの好ましい濃度は、約０．５～約１．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．８～約１．２％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度である。約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度は、ヒトにとってほぼ等張溶液に相当するので、特に好ましい。更に好ましい実施形態では、化学切除性医薬組成物中の電解質は塩化ナトリウムである。
このようなレベルの電解質は、標的放射性医薬品医薬組成物の浸透圧を増加させる。従って、電解質濃度の範囲を指定する代わりに、浸透圧を使用して、組成物の電解質レベルを部分的に特徴付けることができる。組成物の浸透圧は、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、約５２０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であることが好ましく、組成物の浸透圧は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きいことがより好ましく、約３００～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが最も好ましい。
このようなレベルの電解質は、標的放射性医薬品医薬組成物の浸透圧を増加させる。従って、電解質濃度の範囲を指定する代わりに、浸透圧を使用して、組成物の電解質レベルを部分的に特徴付けることができる。組成物の浸透圧は、約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、約５２０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であることが好ましく、組成物の浸透圧は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きいことがより好ましく、約３００～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇであることが最も好ましい。
【0060】
標的放射性医薬品組成物のｐＨ値は、水性ビヒクル中での標的放射性医薬品の溶解度を最大にし、生物組織との適合性を確保するためには、約４～約９であることが好ましい。特に好ましいｐＨ値は約５～約８であり、より好ましくは約６～約７．５である。
標的放射性医薬品医薬組成物のｐＨ値は、当業者に公知の任意の好適な手段によって調節又は調整可能である。組成物は緩衝させることもできるし、又は酸若しくは塩基などの添加によりｐＨ値を調整することもできる。
標的放射性医薬品医薬組成物のｐＨ値は、当業者に公知の任意の好適な手段によって調節又は調整可能である。組成物は緩衝させることもできるし、又は酸若しくは塩基などの添加によりｐＨ値を調整することもできる。
【0061】
企図される標的放射性医薬品医薬組成物は非経口投与経路を意図しているので、米国薬局方（ＵＳＰ）＜７１＞に適合するために必要なように無菌であること、更には、含まれるの発熱性物質は無視できるレベルであること、そのために、１ｍＬ当たり（ＮＭＴ）１０内毒素単位（ＥＵ）以下に相当する発熱物質若しくは内毒素レベルで、ＵＳＰ＜８５＞（カブトガニ血球抽出成分（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）アッセイ）若しくはＵＳＰ＜１５１＞（ウサギ発熱物質検査）、又は実質的に同等の要件に適合することが更に好ましい。更に、医薬組成物は、ＵＳＰ＜７８８＞で定義されるような粒子状物質の含有量を制限する要件（すなわち、容器当たりサイズが１０ミクロンを超える場合はＮＭＴ ３０００粒子、サイズが２５ミクロンを超える場合はＮＭＴ ３００粒子）、又は実質的に同等の要件に適合する要がある。ＵＳＰからのこれらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書の一部として援用される。
【0062】
企図される標的放射性医薬品組成物を投与することができる例示的哺乳類動物宿主としては、ヒトなどの霊長類；チンパンジー若しくはゴリラなどの類人猿；カニクイザル若しくはマカクなどのサル；ラット、マウス若しくはウサギなどの実験動物；イヌ、ネコ、ウマなどの愛玩動物；又はウシ若しくは去勢牛、ヒツジ、子ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマなどの食用動物などが挙げられる。
企図される医薬組成物は通常、数週間又は数か月にわたって哺乳動物宿主に複数回投与される。上述したように、通常の投与計画は隔月で実施される。投与間の宿主のスクリーニングにより、主治医が更なる治療に関する決定を下せるように最新情報が得られる。従前に述べたように、種々のＡｃ－２２５含有標的放射性医薬品の組成物を隔月（約６０日間隔）で各１００ｋＢｑ／ｋｇで３回連続投与すると、一部の前立腺癌患者で完全寛解が得られた。
企図される医薬組成物は通常、数週間又は数か月にわたって哺乳動物宿主に複数回投与される。上述したように、通常の投与計画は隔月で実施される。投与間の宿主のスクリーニングにより、主治医が更なる治療に関する決定を下せるように最新情報が得られる。従前に述べたように、種々のＡｃ－２２５含有標的放射性医薬品の組成物を隔月（約６０日間隔）で各１００ｋＢｑ／ｋｇで３回連続投与すると、一部の前立腺癌患者で完全寛解が得られた。
【0063】
非経口組成物の製剤化は、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ， Ｊｏｈｎ Ｅ．， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ； １９７５及びＬｉｂｅｒｍａｎ， Ｈ．Ａ． ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ， Ｌ．，Ｅｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８０に述べられている。
注射用製剤の場合、例えば、無菌注射用水性懸濁液は、適切な分散又は湿潤化合物及び懸濁材料を使用して公知の技術に従って製剤することができる。無菌注射用調製物は又、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝生理食塩水などの周囲温度の水性液体がある。液体医薬組成物としては、例えば、非経口投与に適した溶液が挙げられる。水、エタノール、ＤＭＳＯ又はプロピレングリコールを含む溶媒中の、標的放射性医薬品の無菌水溶液又は標的放射性医薬品の無菌溶液は、非経口投与に適した液体組成物の例である。
無菌溶液は、標的放射性医薬品成分を所望の溶媒系に溶解させ、次いで得られた溶液をメンブランフィルターに通してそれを除菌することか、或いは予め滅菌した溶媒に、無菌条件下で無菌化合物を溶解させることによって調製することができる。
注射用製剤の場合、例えば、無菌注射用水性懸濁液は、適切な分散又は湿潤化合物及び懸濁材料を使用して公知の技術に従って製剤することができる。無菌注射用調製物は又、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝生理食塩水などの周囲温度の水性液体がある。液体医薬組成物としては、例えば、非経口投与に適した溶液が挙げられる。水、エタノール、ＤＭＳＯ又はプロピレングリコールを含む溶媒中の、標的放射性医薬品の無菌水溶液又は標的放射性医薬品の無菌溶液は、非経口投与に適した液体組成物の例である。
無菌溶液は、標的放射性医薬品成分を所望の溶媒系に溶解させ、次いで得られた溶液をメンブランフィルターに通してそれを除菌することか、或いは予め滅菌した溶媒に、無菌条件下で無菌化合物を溶解させることによって調製することができる。
【実施例】
【0064】
実施例１
２種類の二官能性キレート剤をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、ダラス、ＴＸから購入した。これら２つの構造を以下に示す。それらはＤＯＴＡ及びＰＣＴＡと呼ばれる。
モノクローナル抗体（ＭＮＰＲ－１０１）との結合反応は、金属を含まないバイアル中で行われ、ガラス器具は酸洗浄して潜在的な金属混入を除去した。反応は、２ｍｇの抗体を使用し、二官能性キレート剤のモル反応物比を増加させて行った。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＮＰＲ－１０１は、米国特許第８１０１７２６号及びＭｏｎｏｐａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．のＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１のヒト化型ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８である。ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１パラトープアミノ酸残基配列（ＣＤＲ；相補性決定領域）はＡＴＮ－６５８のものと同じであるが、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１抗体のものである。
ＰＣＴＡキレート剤の場合、モル反応比は１、３、５、１０及び２０である。ＤＯＴＡレート剤の場合、モル反応比は、３、１０、２５，５０及び１００である。溶液のｐＨは、１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3で９．２に調整した。反応は３７℃で１．５時間行った。
２種類の二官能性キレート剤をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、ダラス、ＴＸから購入した。これら２つの構造を以下に示す。それらはＤＯＴＡ及びＰＣＴＡと呼ばれる。
【化5】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＭＮＰＲ－１０１は、米国特許第８１０１７２６号及びＭｏｎｏｐａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．のＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－８１９１のヒト化型ｍＡｂ ＡＴＮ－６５８である。ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１パラトープアミノ酸残基配列（ＣＤＲ；相補性決定領域）はＡＴＮ－６５８のものと同じであるが、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１抗体のものである。
ＰＣＴＡキレート剤の場合、モル反応比は１、３、５、１０及び２０である。ＤＯＴＡレート剤の場合、モル反応比は、３、１０、２５，５０及び１００である。溶液のｐＨは、１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3で９．２に調整した。反応は３７℃で１．５時間行った。
【0065】
分子量カットオフ６，０００ダルトンのＢｉｏ－Ｒａｄ １０ＤＧ重力供給カラムを使用して結合体を精製した。カラムを、０．１Ｍ ＮａＣｌ中の０．１Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー１５ｍＬですすいだ。バッファーのｐＨは７．３であった。反応バイアルの全内容物をカラムの上部に導入し、２ｍＬチューブに回収した。同じバッファーを使用した複数の０．５ｍＬ溶出液も別のチューブに採取した。各画分の２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定して、タンパク質含有画分を決定した。通常、タンパク質は４つの画分に溶出し、それらを合わせた。合わせた画分のタンパク質含量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡアッセイキットを用いて測定した。生成したタンパク質結合体の濃度は約１ｍｇ／ｍＬであった。
各結合体の分析はサイズ排除ＨＰＬＣで行った。カラムはＩＧＭ Ｔｏｓｏｈ（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘ１；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ，キングオブプルシア、ＰＡ）製であった。移動相はリン酸緩衝生理食塩水であり、流速は１ｍＬ／分であった。２８０ｎｍのＵＶ検出器を使用した。ＨＰＬＣの結果は、高純度結合体と一致する保持時間約８分の溶出の早いピークを示した。結合体の保持時間は、抗体へのキレート剤の添加と一致して、二官能性キレーターの比率が高くなるとわずかに減少した。
各結合体の分析はサイズ排除ＨＰＬＣで行った。カラムはＩＧＭ Ｔｏｓｏｈ（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷｘ１；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ，キングオブプルシア、ＰＡ）製であった。移動相はリン酸緩衝生理食塩水であり、流速は１ｍＬ／分であった。２８０ｎｍのＵＶ検出器を使用した。ＨＰＬＣの結果は、高純度結合体と一致する保持時間約８分の溶出の早いピークを示した。結合体の保持時間は、抗体へのキレート剤の添加と一致して、二官能性キレーターの比率が高くなるとわずかに減少した。
【0066】
実施例２
結合体は、キレート剤とタンパク質のモル反応比を１２及び２５とした以外は、実施例１の方法により調製した。典型的な反応収率は約３０％である。従って、反応では平均ＣＡＲ数が約４及び８であると予想される。
Ａｃ－２２５は、ＯＲＮＬ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オークリッジ、ＴＮ）から入手した。反応バイアルには固体Ａｃ－２２５が含まれており、これを０．２Ｍ ＨＣｌを用いて溶解させた。前節に記載したものと同じ４つの結合体を使用して、Ａｃ－２２５キレートを調製した。５０μｇのＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡキレート剤結合体に対して５０μＣｉのＡｃ－２２５の比率を使用し、収率が１００％であれば比放射能は１ｍＣｉ／ｍｇとなるようにした。反応は１００μＬの容量で行った。この量には、０．２Ｍ ＨＣｌ中約４μＬのＡｃ－２２５、６０μＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、及び３６μＬのＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡ結合体又はＭＮＰＲ－１０１－ＤＯＴＡ結合体が含まれていた。反応物をｐＨ５．８及び３７℃で６０分間インキュベートした。
結合体は、キレート剤とタンパク質のモル反応比を１２及び２５とした以外は、実施例１の方法により調製した。典型的な反応収率は約３０％である。従って、反応では平均ＣＡＲ数が約４及び８であると予想される。
Ａｃ－２２５は、ＯＲＮＬ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オークリッジ、ＴＮ）から入手した。反応バイアルには固体Ａｃ－２２５が含まれており、これを０．２Ｍ ＨＣｌを用いて溶解させた。前節に記載したものと同じ４つの結合体を使用して、Ａｃ－２２５キレートを調製した。５０μｇのＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡキレート剤結合体に対して５０μＣｉのＡｃ－２２５の比率を使用し、収率が１００％であれば比放射能は１ｍＣｉ／ｍｇとなるようにした。反応は１００μＬの容量で行った。この量には、０．２Ｍ ＨＣｌ中約４μＬのＡｃ－２２５、６０μＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、及び３６μＬのＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡ結合体又はＭＮＰＲ－１０１－ＤＯＴＡ結合体が含まれていた。反応物をｐＨ５．８及び３７℃で６０分間インキュベートした。
【0067】
反応の放射化学収率は、反応液の５０μＬアリコートをバッファーで３ｍＬに希釈し、３０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）フィルターに通すことによって決定した。キレート化されていない小さなＡｃ－２２５イオンはフィルターを通過するが、結合体はフィルターに保持される。サンプルは、Ａｃ－２２５の最初の娘核種（Ｆｒ－２２１）を使用して、４５分後にＧｅ検出器でカウントした。更に、Ａｃとその娘核種を一晩（約１８時間）平衡化した後、ドーズキャリブレーターを使用してサンプルをカウントした。キレート化の結果を以下に示す。
上記の表は、両方のＰＣＴＡ結合体の定量的収率を示すが、ＤＯＴＡ結合体の収率は遙かに低く、１２：１と２５：１結合体の間に有意な差がある。驚くことに、ＣＡＲ数が低くても、ＰＣＴＡ結合体は高い収率を示す。
【表5】
【0068】
ＰＣＴＡから形成されたキレートの比放射能は１，０００μＣｉ／ｇであったが、ＤＯＴＡから調製された結合体からのキレートの比放射能は約２１６～２８４μＣｉ／ｇの範囲であった。このＤＯＴＡとＰＣＴＡの直接比較は、Ａｃのキレート化に関してＤＯＴＡキレーターと比較してＰＣＴＡキレーターの優位性を示している。
リン酸緩衝生理食塩水を移動相としてサイズ排除カラムを使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、上記サンプルの純度を決定した。ＨＰＬＣデータは、濾過法と実質的に同じ結果を示した。
リン酸緩衝生理食塩水を移動相としてサイズ排除カラムを使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、上記サンプルの純度を決定した。ＨＰＬＣデータは、濾過法と実質的に同じ結果を示した。
【0069】
実施例３
キレート剤と抗体開始反応液比が１２：１である実施例２のＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体をＡｃ－２２５でキレート化した。反応が定量的であれば、これにより１ｍＣｉ／ｍｇの比放射能が得られる。キレート剤と抗体のモル反応比を２５：１として、ＭＮＰＲ－１０１のＤＯＴＡ結合体を用いて同じキレート化反応を行った。更に、キレート剤を添加していないウシ血清アルブミンを陰性対照として使用した。
各反応の総量は１５０μＬであった。実施例２の濾過法を使用して、それぞれの反応の収率を測定した。保持液中の活性のパーセントを反応の収率として使用した。
キレート剤と抗体開始反応液比が１２：１である実施例２のＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体をＡｃ－２２５でキレート化した。反応が定量的であれば、これにより１ｍＣｉ／ｍｇの比放射能が得られる。キレート剤と抗体のモル反応比を２５：１として、ＭＮＰＲ－１０１のＤＯＴＡ結合体を用いて同じキレート化反応を行った。更に、キレート剤を添加していないウシ血清アルブミンを陰性対照として使用した。
各反応の総量は１５０μＬであった。実施例２の濾過法を使用して、それぞれの反応の収率を測定した。保持液中の活性のパーセントを反応の収率として使用した。
【0070】
並行研究で、更に３５μＬの０．１Ｍジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含む上記の反応を行い、反応液を室温で１時間静置した。この際、収率又は純度を決定するために、濾過法を再度使用した。両方の研究の結果を下表に示す。
ＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ（１２）の初期収率は９９．１％であった。ＤＴＰＡ添加後、キレートは活性の約１％を失ったに過ぎなかった。これに対して、ＭＮＰＲ－ＤＯＴＡ（２５）の初期収率は８．９％に過ぎず、ＤＴＰＡ添加後には５．６％に低下した。更に、対照ＢＳＡは、タンパク質に関連する活性（非特異的結合）の３．４％を示すに過ぎず、ＤＴＰＡ洗浄後には１．３％に低下した。このデータは、より低いＣＡＲ比率でもＡｃ－２２５をキレート化する能力においてＰＣＴＡがＤＯＴＡを上回っていることと一致している。更に、裸のＢＳＡとの結合が無かったことは、非特異的結合が問題ではないことを示す。
【表6】
【0071】
実施例４
ＭＮＰＲ－１０１（ＭＮＰＲ）とＰＣＴＡの結合体は、Ａｃ－２２５を効率的にキレート化することが示されている。直接比較では、Ａｃ－２２５は、ＤＯＴＡ結合体よりもＰＣＴＡ結合体に対して遙かに効率的にキレート化した。
Ａｃ－２２５はＯＲＮＬから得られたものである。これらの反応に用いた結合体は、従前に調製され、上記野実施例２及び３に記載されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、キレート剤が結合していない陰性対照タンパク質として使用した。ＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ（１２）は、ＰＣＴＡと抗体の開始モル反応比が１２：１であるＰＣＴＡを用いて作製されたＭＮＰＲ－１０１結合体を指す。ＭＮＰＲ－ＤＯＴＡ（２５）は、抗体に対してキレーターが２５の開始モル反応比でのＭＮＰＲ－１０１の結合体を指す。
ＭＮＰＲ－１０１（ＭＮＰＲ）とＰＣＴＡの結合体は、Ａｃ－２２５を効率的にキレート化することが示されている。直接比較では、Ａｃ－２２５は、ＤＯＴＡ結合体よりもＰＣＴＡ結合体に対して遙かに効率的にキレート化した。
Ａｃ－２２５はＯＲＮＬから得られたものである。これらの反応に用いた結合体は、従前に調製され、上記野実施例２及び３に記載されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、キレート剤が結合していない陰性対照タンパク質として使用した。ＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ（１２）は、ＰＣＴＡと抗体の開始モル反応比が１２：１であるＰＣＴＡを用いて作製されたＭＮＰＲ－１０１結合体を指す。ＭＮＰＲ－ＤＯＴＡ（２５）は、抗体に対してキレーターが２５の開始モル反応比でのＭＮＰＲ－１０１の結合体を指す。
【0072】
抗体へのＡｃの組み込みが１００％であると仮定して、反応は１ｍＣｉ／ｍｇを生成することを目標とした。反応は１５０μＬの容量で行い、ｐＨ５．８、３７℃で６０分間インキュベートした。反応後、各反応液の３５μＬアリコートを３５μＬの１Ｍジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）と混合し、室温で１時間静置した。
時間（１、２４及び７２時間）の関数として、上記のような濾過によって、タンパク質と会合したＡｃ－２２５のパーセントについて溶液を試験した。初期試験の結果を、時間の関数としてタンパク質と会合したＡｃ－２２５のパーセントとして下表に示す。
時間（１、２４及び７２時間）の関数として、上記のような濾過によって、タンパク質と会合したＡｃ－２２５のパーセントについて溶液を試験した。初期試験の結果を、時間の関数としてタンパク質と会合したＡｃ－２２５のパーセントとして下表に示す。
【表7】
【0073】
パーセンテージは、合計（フィルター＋濾液）と比較したフィルター内の活性の相対量を示す。ＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ（１２）は、ＤＴＰＡと１時間及び２４時間インキュベートした後、９９％及び９８％が抗体に結合する（フィルター上）という最良の結果をもたらした。７２時間後、純度は７３％に低下した。放射線防護剤は添加されておらず、Ａｃ－２２５が溶液に高い放射線量を与えることに留意されたい。同位体がタンパク質と会合したままであったという事実は、高度の安定性を示している。
【0074】
対照（ＢＳＡ）とＭＮＰＲ－ＤＯＴＡ（２５）はどちらも、タンパク質に関連する活性のパーセンテージが有意に低い。溶液の高分解能γ線分光分析は、表１の濾過結果と一致していた。
開始キレーターと抗体のモル反応比が１２：１であるＰＣＴＡと結合した抗体ＭＮＰＲ－１０１は、高収率及び高比放射能（１，０００μＣｉ／ｍｇ）で再現性よくＡｃ－２２５をキレート化することが示された。材料を過剰なＤＴＰＡ中でインキュベートすると、製剤が放射線防護剤を含んでいない場合でも、高度な安定性を示した。リガンドとタンパク質のモル比の開始比が２５：１でＤＯＴＡと結合させた同じ抗体との直接比較では、収率が遙かに低く、Ａｃ－２２５のキレート化に関してＤＯＴＡよりもＰＣＴＡの利点が示された。裸のＢＳＡを対照として使用したところ、少量の非特異的結合を示した。
開始キレーターと抗体のモル反応比が１２：１であるＰＣＴＡと結合した抗体ＭＮＰＲ－１０１は、高収率及び高比放射能（１，０００μＣｉ／ｍｇ）で再現性よくＡｃ－２２５をキレート化することが示された。材料を過剰なＤＴＰＡ中でインキュベートすると、製剤が放射線防護剤を含んでいない場合でも、高度な安定性を示した。リガンドとタンパク質のモル比の開始比が２５：１でＤＯＴＡと結合させた同じ抗体との直接比較では、収率が遙かに低く、Ａｃ－２２５のキレート化に関してＤＯＴＡよりもＰＣＴＡの利点が示された。裸のＢＳＡを対照として使用したところ、少量の非特異的結合を示した。
【0075】
実施例５
式Ｉによって示されるような、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１に結合したＰＣＴＡによってキレート化されたＡｃ－２２５を含む標的放射性医薬品を、前述のように調製した。キレーターと抗体の開始モル比は１２：１であった。５０μＣｉのＡｃ－２２５を５０μｇのＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体と混合し、ｐＨ値を３７℃で６０分間、酢酸アンモニウムで５．８に調整した。反応の総用量は１００μＬであった。
２５μＬ容量の反応混合物を、サイズ排除カラムを使用した高速液体クロマトグラフィーで分析した。移動相は、ｐＨ＝７．４の０．１Ｍリン酸バッファーであり、流速は１ｍＬ／分であった。検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収よって、又、放射測定検出器によっても行った。
式Ｉによって示されるような、ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１に結合したＰＣＴＡによってキレート化されたＡｃ－２２５を含む標的放射性医薬品を、前述のように調製した。キレーターと抗体の開始モル比は１２：１であった。５０μＣｉのＡｃ－２２５を５０μｇのＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体と混合し、ｐＨ値を３７℃で６０分間、酢酸アンモニウムで５．８に調整した。反応の総用量は１００μＬであった。
２５μＬ容量の反応混合物を、サイズ排除カラムを使用した高速液体クロマトグラフィーで分析した。移動相は、ｐＨ＝７．４の０．１Ｍリン酸バッファーであり、流速は１ｍＬ／分であった。検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収よって、又、放射測定検出器によっても行った。
【0076】
ＵＶ及び放射測定検出器の評価により、タンパク質と共溶出する放射能が示された。サイズ排除カラムは、化学物質をサイズに基づいて分離する。Ａｃ－２２５溶液からの放射能の大部分はその放射性娘核種に由来するため、タンパク質に結合していない放射性金属が後に溶出すると予想される。小分子と一致する保持時間の放射性シグナルは無かった。
この結果は、Ｂｉ－２１３などの放射性Ａｃ－２２５娘核種をキレートするＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体と一致する。理論に拘束されるものではないが、ＰＣＴＡ結合体の優れた結合特性は、キレーターがＡｃ－２２５だけでなく、Ｂｉ－２１３などの娘核種と結合する結果であると考えられる。
この結果は、Ｂｉ－２１３などの放射性Ａｃ－２２５娘核種をキレートするＭＮＰＲ－ＰＣＴＡ結合体と一致する。理論に拘束されるものではないが、ＰＣＴＡ結合体の優れた結合特性は、キレーターがＡｃ－２２５だけでなく、Ｂｉ－２１３などの娘核種と結合する結果であると考えられる。
【0077】
ビスマスイオンは、極めて不溶性であり、ビスマスイオンとアクチニウムイオンの両方を保持する沈殿を形成することができる。ＰＣＴＡキレート化官能基によるビスマス沈殿の防止は、Ａｃ－２２５のキレート化の助けとなり得る。
ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１に結合されたキレート剤としてＤＯＴＡを用いる、同様のサイズ排除カラム研究では、異なる結果が示された。このように、ＤＯＴＡを使用する場合、オンライン放射線検出器では、タンパク質に関連するシグナルはほとんど見られないこと、及び活性の大部分はタンパク質に結合していない放射性金属を示す後から溶出するピークにあることを示す。
ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１に結合されたキレート剤としてＤＯＴＡを用いる、同様のサイズ排除カラム研究では、異なる結果が示された。このように、ＤＯＴＡを使用する場合、オンライン放射線検出器では、タンパク質に関連するシグナルはほとんど見られないこと、及び活性の大部分はタンパク質に結合していない放射性金属を示す後から溶出するピークにあることを示す。
【0078】
実施例６
ＰＣＴＡ結合体を、ヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１を用いて、２つの他の例示的マウスモノクローナル抗体：ｍＡｂ ＡＴＮ－６１６及びｍＡｂ ＡＴＮ－２９２と並行して調製した。キレート剤とタンパク質のモル比１２：７５を用いて、続いてのＡｃ－２２５のキレート化を最適化した。
ＭＮＰＲ－１０１及びＡＴＮ－６１６をＰＣＴＡと、１２：１のモル反応比で結合させ、ＡＴＮ－２９２は、７５：１の過剰で結合させた。溶液のｐＨ値を１Ｍ ＮａＨ2ＣＯ3及び０．２Ｍ ＨＣｌで９．２に調整した。反応は３７℃で１．５時間行った。
ＰＣＴＡ結合体を、ヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１を用いて、２つの他の例示的マウスモノクローナル抗体：ｍＡｂ ＡＴＮ－６１６及びｍＡｂ ＡＴＮ－２９２と並行して調製した。キレート剤とタンパク質のモル比１２：７５を用いて、続いてのＡｃ－２２５のキレート化を最適化した。
ＭＮＰＲ－１０１及びＡＴＮ－６１６をＰＣＴＡと、１２：１のモル反応比で結合させ、ＡＴＮ－２９２は、７５：１の過剰で結合させた。溶液のｐＨ値を１Ｍ ＮａＨ2ＣＯ3及び０．２Ｍ ＨＣｌで９．２に調整した。反応は３７℃で１．５時間行った。
【0079】
このようにして形成された結合体を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ １０ＤＧ重力供給カラム（６，０００ダルトン（Ｄａ）分子量カットオフ）を用いて精製し、各結合体を０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーｐＨ５．７７で溶出させた。溶出画分（０．５ｍＬ）を１．５ｍＬの金属非含有チューブに採取し、２８０ｎｍでＵＶ吸光度を測定した。溶出液中のタンパク質濃度によって３又は４画分を合わせ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）濃縮器（３０ｋＤａ）を用いて再濃縮した。合わせた画分を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；最終タンパク質濃度は約２～３ｍｇ／ｍＬ）を用いて分析した。
前述のように、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーを利用して、リン酸緩衝生理食塩水溶媒及び流速１ｍＬ／分で結合体の純度を分析した。ＨＰＬＣ結果により、裸の抗体から観察される予想される約８分のピークと、二官能性キレーターＰＣＴＡの添加と一致した結合体の保持時間（Ｒｔ）の減少が明らかになった。
前述のように、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーを利用して、リン酸緩衝生理食塩水溶媒及び流速１ｍＬ／分で結合体の純度を分析した。ＨＰＬＣ結果により、裸の抗体から観察される予想される約８分のピークと、二官能性キレーターＰＣＴＡの添加と一致した結合体の保持時間（Ｒｔ）の減少が明らかになった。
【0080】
結果は、結合体とそれぞれの裸のｍＡｂの間で観察された保持時間の増加（ΔＲｔ）は、結合体のその後のＡｃ－２２５をキレートする能力に関連しており、ΔＲｔが大きいほど抗体に結合したキレート剤の数が多いことに相関することを示唆する。３種類の結合体と裸の抗体の保持時間の違いを以下に示す。
【表8】
【0081】
実施例７
固体Ａｃ－２２５を含む反応バイアルをＯＲＮＬから入手し、０．２Ｍ ＨＣｌを用いて溶解させた。実施例６からの３種類の結合体を用いて、Ａｃ－２２５キレートを調製した。全ての反応で、１００μｇのｍＡｂ－ＰＣＴＡキラント結合体に対して１００μＣｉのＡｃ－２２５の比率を使用し、収率が１００％であれば、比放射能は１ｍＣｉ／ｍｇとなるようにした。反応は、０．２Ｍ ＨＣｌ中の約１０μＬのＡｃ－２２５、６０μＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、及び４０μＬのｍＡｂ－ＰＣＴＡ結合体を含む約１１０μＬの容量で行い、これは各タンパク質濃度に応じ、各タンパク質濃度に対して正規化した。反応液はｐＨ５．７、３７℃で６０分間インキュベートした。
固体Ａｃ－２２５を含む反応バイアルをＯＲＮＬから入手し、０．２Ｍ ＨＣｌを用いて溶解させた。実施例６からの３種類の結合体を用いて、Ａｃ－２２５キレートを調製した。全ての反応で、１００μｇのｍＡｂ－ＰＣＴＡキラント結合体に対して１００μＣｉのＡｃ－２２５の比率を使用し、収率が１００％であれば、比放射能は１ｍＣｉ／ｍｇとなるようにした。反応は、０．２Ｍ ＨＣｌ中の約１０μＬのＡｃ－２２５、６０μＬの０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファー、及び４０μＬのｍＡｂ－ＰＣＴＡ結合体を含む約１１０μＬの容量で行い、これは各タンパク質濃度に応じ、各タンパク質濃度に対して正規化した。反応液はｐＨ５．７、３７℃で６０分間インキュベートした。
【0082】
各キレート化反応の２５μＬアリコートを、０．１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーを用いたＢｉｏ－Ｒａｄ １０ＤＧ重力供給カラムで０．５ｍＬ画分を溶出することにより精製した。Ａｃ標識結合体は３～４の「ピーク画分」で溶出すると予想され、これをカラムに残った活性と合計して放射化学収率を決定する。最低５時間後（Ａｃとその娘核種との平衡化させるため）、画分とそれぞれのカラムをドーズキャリブレーター（Ｃａｐｉｎｔｅｃ、設定番号０８６）で測定した。ドーズキャリブレーターで測定した各キレート化の重力供給画分の結果を下表に示す。
【表9】
【0083】
各反応のピーク画分を精製後２４時間と４８時間の時点で測定し、キレート剤がＡｃ－２２５娘同位体を保持する能力を決定した。ピーク活性が時間の関数として増加することは、キラントが娘同位体を効果的に制御しなかった証拠となる。しかしながら、活性がＡｃ－２２５の分解と一致する速度で低下した場合、キラントがＡｃ－２２５とその娘同位体を保持できたことを示唆する証拠となる。下表に見られる結果は、各ピーク活性が時間の関数として放射能上昇を示さないことから、３つのキレート系がＡｃ－２２５娘同位体を効果的に制御している証拠となる。
【表10】
【0084】
実施例８
各キレート化反応の２０μＬサンプルを、無勾配法（１×ＰＢＳ溶媒、ｐＨ７．４）を用いるＨＰＬＣにより、２８０ｎｍのＵＶ吸収と放射測定検出器による検出法を用いて分析した。毎分１ｍＬの画分を採取し、平衡化（５時間を超える）させた後、ワイドウィンドウのＮａＩ検出器で測定した。
実施例５で観察されたように、ＨＰＬＣの結果は、３つの反応からのタンパク質と共溶出する放射能を示した。低分子と一致する保持時間の放射性シグナルはなく、ＰＣＴＡキレーターがＡｃ－２２５及びその娘核種と結合するという推論を更に支持した。各反応収率の結果を下表に示す。
各キレート化反応の２０μＬサンプルを、無勾配法（１×ＰＢＳ溶媒、ｐＨ７．４）を用いるＨＰＬＣにより、２８０ｎｍのＵＶ吸収と放射測定検出器による検出法を用いて分析した。毎分１ｍＬの画分を採取し、平衡化（５時間を超える）させた後、ワイドウィンドウのＮａＩ検出器で測定した。
実施例５で観察されたように、ＨＰＬＣの結果は、３つの反応からのタンパク質と共溶出する放射能を示した。低分子と一致する保持時間の放射性シグナルはなく、ＰＣＴＡキレーターがＡｃ－２２５及びその娘核種と結合するという推論を更に支持した。各反応収率の結果を下表に示す。
【表11】
【0085】
ドーズキャリブレーターで分析した場合の３つの反応のピーク収率は、実施例７に記載したように、それぞれ８０．６％、７７．０％、及び７５．５％を示すが、ＨＰＬＣ精製及びＮａＩ検出を使用して分析した場合、これらの同じ反応は、それぞれ９６．２％、９２．７％、及び９７．８％の反応収率を示す。このばらつきは、サイズ排除カラムに残存する活性を測定する能力がないため、Ｂｉｏ－Ｒａｄ重力供給カラムとドーズキャリブレーター値から、より控えめな収率を観測することに起因すると理解される。
記載された方法と結果から、対象とする二官能性キレーターであるＰＣＴＡは、ヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１だけでなく、２種類のマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ＡＴＮ－６１６とｍＡｂ ＡＴＮ－２９２のような他の抗体とも同様に、Ａｃ－２２５と結合し、且つ、Ｂｉ－２１３などの娘崩壊生成物を保持する顕著な能力を示すことが示唆される。
記載された方法と結果から、対象とする二官能性キレーターであるＰＣＴＡは、ヒト化ｍＡｂ ＭＮＰＲ－１０１だけでなく、２種類のマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ ＡＴＮ－６１６とｍＡｂ ＡＴＮ－２９２のような他の抗体とも同様に、Ａｃ－２２５と結合し、且つ、Ｂｉ－２１３などの娘崩壊生成物を保持する顕著な能力を示すことが示唆される。
【0086】
実施例１０
企図されるＰＣＴＡ－ＭＮＰＲ－１０１キレーター標的化種を用いたＩｎ－１１１のキレート化特性及び安定性の初期研究。従って、タンパク質分析によって４．０ｍｇ／ｍＬを含むｐＨ値９．２の水溶液（１Ｍ ＮａＨＣＯ3及びＨＣｌ）中で新たに調製したＰＣＴＡ－ＭＮＰＲ－１０１（１２：１で作製）を３７℃で１．５時間インキュベートした。結合体（２２０．０ｍＬ ＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡ）は、ＰＤ１０カラムに通し、０．１Ｍ酢酸アンモニウムで溶出させることにより精製した。結合体を含むサンプルを回収し、３０ｋＤａアミコン（登録商標）濃縮機を用いて濃縮した（４０００ｒｐｍ、２０分間）。
３つの水性キレート化反応が設定され、それぞれ１０ｍＣｉ／ｍｇの目標比放射能に対して約２００μＣｉの放射能を持つ。それぞれをＢＷＸＴ Ｍｅｄｉｃａｌ、オタワ、ＯＮ、カナダから入手した塩化Ｉｎ－１１１と混合した。全ての反応物は４℃で保存し、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に安定性を測定した。
企図されるＰＣＴＡ－ＭＮＰＲ－１０１キレーター標的化種を用いたＩｎ－１１１のキレート化特性及び安定性の初期研究。従って、タンパク質分析によって４．０ｍｇ／ｍＬを含むｐＨ値９．２の水溶液（１Ｍ ＮａＨＣＯ3及びＨＣｌ）中で新たに調製したＰＣＴＡ－ＭＮＰＲ－１０１（１２：１で作製）を３７℃で１．５時間インキュベートした。結合体（２２０．０ｍＬ ＭＮＰＲ－１０１－ＰＣＴＡ）は、ＰＤ１０カラムに通し、０．１Ｍ酢酸アンモニウムで溶出させることにより精製した。結合体を含むサンプルを回収し、３０ｋＤａアミコン（登録商標）濃縮機を用いて濃縮した（４０００ｒｐｍ、２０分間）。
３つの水性キレート化反応が設定され、それぞれ１０ｍＣｉ／ｍｇの目標比放射能に対して約２００μＣｉの放射能を持つ。それぞれをＢＷＸＴ Ｍｅｄｉｃａｌ、オタワ、ＯＮ、カナダから入手した塩化Ｉｎ－１１１と混合した。全ての反応物は４℃で保存し、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に安定性を測定した。
【0087】
この文脈で安定性とは、放射性イオンの経時的キレート化の維持である。安定性は、比較のために重力供給ＳＥＣカラム（ＰＤ１０ ６，０００ダルトンカットオフ）、ＨＰＬＣ及びＴＬＣによって決定した。
目標比放射能１０ｍＣｉ／ｍｇに対して、それぞれ約２００μＣｉの放射能を持つ３つの水性キレート化反応を設定した。これらは以下の通りであった。
１）３７℃で３０分間のインキュベーション ４℃で７２時間の保存
２）室温で３０分間のインキュベーション ４℃で２４時間の保存
３）室温で１．５時間インキュベーション ４℃で４８時間の保存
目標比放射能１０ｍＣｉ／ｍｇに対して、それぞれ約２００μＣｉの放射能を持つ３つの水性キレート化反応を設定した。これらは以下の通りであった。
１）３７℃で３０分間のインキュベーション ４℃で７２時間の保存
２）室温で３０分間のインキュベーション ４℃で２４時間の保存
３）室温で１．５時間インキュベーション ４℃で４８時間の保存
【0088】
この初期研究の結果を下表に示す。
この初期研究の結果は、１０ｍＣｉ／ｍｇの目標比放射能で比較的高い収率のキレート化が得られたことを示した。収率を高めるために条件を最適化できる可能性が高い。３つの異なる分析方法のそれぞれで、キレートが形成されたことが示された。インジウム１１１の半減期が約２．８日であることを考えると、妥当なキレート化Ｉｎ－１１１の安定性が観察された。
【表12】
この初期研究の結果は、１０ｍＣｉ／ｍｇの目標比放射能で比較的高い収率のキレート化が得られたことを示した。収率を高めるために条件を最適化できる可能性が高い。３つの異なる分析方法のそれぞれで、キレートが形成されたことが示された。インジウム１１１の半減期が約２．８日であることを考えると、妥当なキレート化Ｉｎ－１１１の安定性が観察された。
【0089】
本明細書に引用される特許、特許出願、及び論文はそれぞれ、参照により援用される。冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は、１以上を含むものとする。
前述の説明及び実施例は例示を意図したものであり、限定として理解されるべきではない。本発明の趣旨及び範囲内で更に他の変形が可能であり、それら自体、当業者に容易に提示されるであろう。
前述の説明及び実施例は例示を意図したものであり、限定として理解されるべきではない。本発明の趣旨及び範囲内で更に他の変形が可能であり、それら自体、当業者に容易に提示されるであろう。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】