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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-22
(54)【発明の名称】マトリクス層を伴うサンプルホルダ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240515BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240515BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023569672
(86)(22)【出願日】2022-05-10
(85)【翻訳文提出日】2023-12-14
(86)【国際出願番号】 EP2022062537
(87)【国際公開番号】W WO2022238355
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】21173070.0
(32)【優先日】2021-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517071081
【氏名又は名称】シングル テクノロジーズ アクティエボラーグ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100092624
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴田 準一
(74)【代理人】
【識別番号】100114018
【弁理士】
【氏名又は名称】南山 知広
(74)【代理人】
【識別番号】100153729
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 有一
(74)【代理人】
【識別番号】100211177
【弁理士】
【氏名又は名称】赤木 啓二
(72)【発明者】
【氏名】ベングト サールグレーン
(72)【発明者】
【氏名】ヨーアン ストレームクビスト
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029FA15
4B063QA01
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR62
4B063QS24
4B063QX02
(57)【要約】
複数のサンプル部位（１３０）においてアッセイを行なうように構成された器具（３００）のためのサンプルホルダ（１００）において、各サンプル部位がコンカテマを含んでいるサンプルホルダ（１００）が開示される。サンプルホルダは、回転可能な本体（１１０）と、マトリクス層（１２０）と、マトリクス層の上に配設された液体層とを含む。複数のサンプル部位は、マトリクス層内でマトリクス層の横方向および厚み方向の両方に分布しており、回転可能な本体は器具内に配設されて、複数のサンプル部位においてアッセイが行なわれている間、軸（Ａ）を中心にして回転可能となるように構成されている。対応する方法（２００）および器具（３００）も同様に開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のサンプル部位（１３０）においてアッセイを行なうように構成された器具（３００）のためのサンプルホルダ（１００）において、回転可能な本体（１１０）と；
前記回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆し厚みが１００μｍ未満であるマトリクス層（１２０）と；
前記マトリクス層の外周を被覆する液体層と；
を含むサンプルホルダであって、
前記複数のサンプル部位が、前記マトリクス層内で、前記マトリクス層の横方向および厚み方向の両方に分布しており；ここで前記複数のサンプル部位の各々のサンプル部位がコンカテマを含み；かつ
前記回転可能な本体が前記器具内に配設されかつ、前記複数のサンプル部位において前記アッセイが行なわれている間、軸（Ａ）を中心にして回転可能となるように構成されている、
サンプルホルダ。
【請求項2】
前記回転可能な本体が円筒形本体であり、前記外側表面が前記円筒形本体の側方表面である、請求項１に記載のサンプルホルダ。
【請求項3】
前記マトリクス層がゲル、例えばヒドロゲルを含む、請求項１または２に記載のサンプルホルダ。
【請求項4】
前記マトリクス層が、１．３０～１．３５の範囲内の屈折率を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のサンプルホルダ。
【請求項5】
前記コンカテマ間の平均ピッチが５μｍ未満である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のサンプルホルダ。
【請求項6】
前記マトリクス層が細孔（１４０）を含み、前記細孔が１μｍ未満の平均幅を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のサンプルホルダ。
【請求項7】
前記液体層が５００μｍ未満の平均厚みを有する、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のサンプルホルダ。
【請求項8】
前記器具により読み取られるように構成された識別子をさらに含み、前記器具が複数のサンプルホルダを収容するように構成されている、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のサンプルホルダ。
【請求項9】
複数のコンカテマのアッセイを行なうための方法（２００）において：回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆し厚みが１００μｍ未満であるマトリクス層内に前記複数のコンカテマを提供するステップ（２１０）であって、前記複数のコンカテマが横方向および厚み方向の両方で前記マトリクス層内に分布している、提供するステップと；
軸を中心として前記回転可能な本体を回転させるステップ（２２０）と；
前記マトリクス層の外周を被覆する液体層を提供するステップと；
前記サンプルホルダを回転させながら前記複数のコンカテマの前記アッセイの少なくとも一部を行なうステップ（２３０）と；
を含む方法。
【請求項10】
前記回転可能な本体が、前記回転可能な本体のアイデンティティと結び付けられた情報を担持する識別子を含み、前記識別子を読み取り、前記回転可能な本体の前記アイデンティティを検索するステップと；
前記アイデンティティと結び付けられた少なくとも１つのアッセイパラメータを検索するステップと；
検索された前記少なくとも１つのアッセイパラメータにしたがって、前記アッセイを調整するステップと；
をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記アッセイの前記少なくとも一部を行なうステップが、前記軸に沿って前記回転可能な本体を走査するステップを含み、前記走査の範囲が、前記少なくとも１つのアッセイパラメータによって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記アッセイの前記少なくとも一部を行うステップが、温度を制御するステップを含み、前記温度の設定点が前記少なくとも１つのアッセイパラメータによって決定される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記アッセイを行なうステップが、前記液体層に対し試薬を添加するステップ（２６０）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記試薬が、前記少なくとも１つのアッセイパラメータに基づいて選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記試薬がフルオロフォアを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記複数のコンカテマを提供するステップが、前記マトリクス層内で複数の環状化ＤＮＡフラグメントを分布させるステップおよび前記環状化ＤＮＡフラグメントを増幅して前記コンカテマを形成するステップを含む、請求項９ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記環状化ＤＮＡフラグメントを増幅するステップが、ローリングサークル増幅ＲＣＡを用いて行なわれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
各コンカテマが少なくとも１つのＤＮＡ鎖を含み、前記方法がデオキシリボース、ｄＮＴＰを含むヌクレオシドトリホスフェートを前記ＤＮＡ鎖に付着させるステップをさらに含み、前記ｄＮＴＰが蛍光標識を含む、請求項９ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記アッセイがさらに、共焦点顕微鏡画像化を含む、請求項９ないし１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
複数のコンカテマのアッセイを行なうように構成された器具（３００）において：複数のサンプル部位（１３０）を含むサンプルホルダ（１００）と；
前記サンプルホルダに対し試薬を含む液体を提供するように配設された液体ディスペンサ（１６０）と；
前記複数のサンプル部位を照射し、前記複数のサンプル部位から発出または散乱した光子を検出するように構成された顕微鏡（３１０）を含む器具であって、
前記サンプルホルダが：
回転可能な本体（１１０）と；
前記回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆し厚みが１００μｍ未満であるマトリクス層（１２０）と；
を含み、
前記マトリクス層が、前記マトリクス層の横方向と厚み方向の両方において前記マトリクス層内で分布させられるような形で前記複数のサンプル部位を含み；
前記複数のサンプル部位の各サンプル部位がコンカテマを含み；
前記液体ディスペンサが、前記マトリクス層の外周を被覆するために前記液体層を提供するように構成されており；
前記サンプルホルダは、前記器具内に配設され、前記顕微鏡が前記複数のサンプル部位から発出または散乱した前記光子を検出している間前記器具により回転させられるように構成されている、
器具。
【請求項21】
前記サンプルホルダが、前記サンプルホルダのアイデンティティと結び付けられた情報を担持する識別子を含み、前記器具が、前記識別子を読み取って前記サンプルホルダの前記アイデンティティを検索するように構成された読取り機をさらに含む、請求項２０に記載の器具。
【請求項22】
前記サンプルホルダと前記顕微鏡を互いとの関係において並進運動させるように配設されたスキャナをさらに含み、前記並進運動の範囲が、検索されたアイデンティティに基づくものである、請求項２０または２１に記載の器具。
【請求項23】
さらに、前記検索されたアイデンティティに基づいて前記試薬を選択するように構成されている、請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の器具。
【請求項24】
前記アッセイ中に温度を制御するように配設された温度調節器をさらに含み、前記温度の設定点が前記検索されたアイデンティティによって決定される、請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載の器具。
【請求項25】
さらに、前記検索されたアイデンティティに基づいて、既定のスキャナ範囲；
既定の試薬；および
既定の温度設定点；
のうちの少なくとも１つをデータベースから検索するように構成されている、請求項２０ないし２４のいずれか１項に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は概して、サンプルに対してアッセイを行なうための技術、詳細にはＤＮＡの配列決定に関する。
【背景技術】
【0002】
生化学的アッセイは、分析物またはサンプルの存在、量または機能的活性を定性的に査定するかまたは定量的に測定するための調査手順として知られている。このような手順の一例は、特許文献（国際公開第２０１６／０３０４６４号）の中で開示されており、共焦点スキャナおよび回転サンプルホルダが関与している。サンプルホルダは、円筒形本体を含み、サンプルは、円筒の外側表面上のウェルまたは溝内に配設される。スキャナは、ホルダがその長手方向軸を中心にして回転するにつれてサンプルを照射し画像化するように構成された共焦点顕微鏡を含んでいてよい。この技術は、例えばＤＮＡの配列を決定するために利用されてよく、ここで、ＤＮＡの固定化された一本鎖のサンプルは、フルオロフォアの備わったヌクレオチド溶液（または試薬）でフラッシングされ、その後に、蛍光を測定しどのヌクレオチド（存在する場合）が鎖上に取込まれたかを決定するための画像化ステップが続く。回転するサンプルホルダの走査は、時間単位あたりの走査済みサンプル数の観点から見て比較的高いスループットを可能にし、これにより、統計学的方法およびビッグデータ解析の利用が可能になる。しかしながら、スループットは、各アッセイにおいて処理できるサンプルの最大数および最大走査速度などの実践上の考慮事項により制限されることが分かっている。
【0003】
概して１回のランにおいて処理可能なサンプルの数は、これらのサンプルをいかに密に充填することができるかによって制限され、これは、光回折限界およびサンプルホルダ上の利用可能な表面積によってそれ自体究極的に制限される。したがって、１回のランあたりのサンプル数を増加させるには、サンプルホルダをより大きくすることが必要になると思われる。このアプローチは、サンプルホルダの取扱いおよび走査に関して非実用的な解決法を導く場合がある。
【0004】
さらに一層大量の生物学的関連データの追求が、ハイスループットのアッセイ技術の開発を後押ししている。研究に広く採用され、これらの技術が臨床の場で実践される路を開くためには、アッセイ中で分析可能なサンプルの数を増大させ一回のアッセイあたりのコストを引き下げることが、極めて望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０３０４６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、サンプルのアッセイを行なうための改良型技術を提供し、先行技術に付随する欠陥の少なくともいくつかを克服または軽減することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明力ある構想の第１の態様では、複数のサンプル部位においてアッセイを行なうように構成された器具のためのサンプルホルダにおいて、各サンプル部位が、それぞれのサンプルを収容するように構成されているサンプルホルダが提供されている。サンプルホルダは、回転可能な本体と、回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆するマトリクス層を含む。複数のサンプル部位は、マトリクス層内でマトリクス層の横方向および厚み方向の両方に分布していてよい。さらに回転可能な本体は器具内に配設されて、複数のサンプル部位においてアッセイが行なわれている間、軸を中心にして回転可能となるように構成されている。
【0008】
第２の態様では、複数のサンプルのアッセイを行なうための方法が提供されている。該方法によると、複数のサンプルは、回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆するマトリクス層内に提供されている。複数のサンプルは、横方向および厚み方向の両方でマトリクス層内に分布していてよい。さらにアッセイの少なくとも一部は、回転可能な本体が軸を中心として回転させられている間に行われる。
【0009】
第３の態様においては、以上で標示されているように、複数のサンプルのアッセイを行なうように構成された器具が提供される。この器具は、第１の態様にしたがったサンプルホルダと、複数のサンプル部位を照射し、複数のサンプル部位から発出または散乱した光子を検出するように構成された顕微鏡を含む。サンプルホルダは、回転可能な本体と、回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆するマトリクス層と、を含み、ここで、複数のサンプル部位は、マトリクス層内でマトリクス層の横方向と厚み方向の両方に分布していてよい。サンプルホルダは、器具内に配設され、顕微鏡が複数のサンプル部位から発出または散乱した光子を検出している間器具により回転させられるように構成されている。
【0010】
当該発明力ある構想は、層の横方向のみならず層の厚み方向にも分布した複数のサンプル部位を有するマトリクス層を提供することによってホルダがより多数のサンプルを収容できるという洞察に基づくものである。換言すると、マトリクス層は、サンプルを２次元表面上のみではなくむしろ３次元体積内に分布させることを可能にする。これにより、アッセイの間に大量のデータを獲得することが可能になる。したがって、当該発明力ある構想により、サンプルホルダのサイズを相応した程度に増大させる必要なく、より多数のサンプルが一回のランにおいて分析できるようになる。個別のサンプル部位間の平均ピッチは、いくつかの実施例において、５μｍ未満、例えば２μｍ未満、例えば１μｍ未満であってよい。
【0011】
いくつかの実施形態によると、回転可能な本体は、好ましくは直円柱に適合する円筒形本体であってよい。円筒形本体は、アッセイ中、円筒の長手方向軸を中心として回転させられるように構成されていてよい。変形実施形態において、回転可能な本体は、ディスクに適合する形状を有するか、または、上にマトリクス層を配設できるディスク状の領域を少なくとも含んでいてよい。ディスク状の本体（または領域）は、マトリクス層が上に配設されている表面に対し垂直な軸を中心として回転するように構成されていてよい。
【0012】
回転可能な本体を使用することの利点は、本体を比較的恒常な形で回転させることができ、こうして、加速無く定常状態運動を維持することが可能であるという点にある。運動手段としての回転は、精度の観点から見て有利であり、アッセイ中のサンプルの比較的予測可能で正しく制御された軌道を可能にする。好ましくは、軸は、サンプルホルダの回転対称軸であってよい。サンプルホルダがアッセイの一部の間回転させられ、アッセイの別の部分の間は固定位置に保たれる実施形態が、発明力ある構想の範囲内に包含されている。
【0013】
一実施形態によると、回転可能な本体は、複数のサンプル部位の各々がアッセイ中、またはサンプルの画像化を含めたアッセイの少なくとも一部の間に観察体積を通って移動させられるような形で回転するように構成されてよい。観察体積とは、その中では光源からの光および器具の検出器の視野が重なり合い、そこから観察体積内に配設されたサンプルの画像化中に光子が発出または散乱させられるマトリクス層内の体積として定義されてよい。
【0014】
サンプルホルダは、回転運動を生成するための手段と係合させられるように構成された結合用配設を含んでいてよい。結合用配設は、例えば、サンプルホルダと回転運動生成手段の間の機械的接触の無いトルク伝達を可能にする磁力を用いて動作してよい。結合用配設は例えば、サンプルを保持するために使用されるサンプルホルダの部品と干渉しないようにサンプルホルダの端部表面上に具備されてよい。さらに、結合用配設は、いくつかの実施例において、回転中にサンプルホルダを支持する回転軸受と係合するのに好適な表面部分を含む。回転軸受は例えば、空気軸受を構成していてよい。
【0015】
結合用配設は、器具への、器具からのそして器具内部の輸送などのサンプルホルダの取扱いを容易にすることができる。これは、例えば、結合用配設によりサンプルホルダを把持しサンプルホルダを目標の場所まで輸送するロボットアームなどの把持用配設を用いて達成されてよい。結合用配設はさらに、器具または器具の内部および／または外部の異なる場所へまたはそこからのサンプルホルダの挿入および取出しを容易にするように構成されていてよく、好ましくは、目標の場所において対応する収容構造と協働するように構成されていてよい。サンプルホルダの輸送は、例えば、アッセイが異なる物理的場所またはステーション全体に分散していて、サンプルの画像化を１つの場所で、そして反応を別の場所で行なう可能性のある場合などに必要とされ得る。
【0016】
さらに、１つのアッセイ中または一連のアッセイ中に複数のサンプルホルダが使用されてよく、第１のサンプルホルダの画像化が終了した時点で第１のサンプルホルダを第２のサンプルホルダで置換することができる。画像化の後、第２のサンプルホルダが画像化されている間に第１のサンプルホルダを別のステーションへ輸送して反応を実施し、反応を行なうために、次に第２のサンプルホルダの画像化が終了した時点で第１のサンプルホルダを画像化ステーションに戻すことができる。いくつかの実施例において、複数のサンプルホルダを予め、すなわち「オフラインで」準備し、アッセイの開始を待つ間中間保管場所に保管してもよい。これにより、器具の使用可能時間を延長し、アッセイのリードタイムを短縮することができる。
【0017】
この目的のため、サンプルホルダは、器具によって読取られ、器具が個別のサンプルホルダを識別しその経過を追うことができるようにする識別子を含んでいてよい。器具はさらに、アイデンティティと結び付けられた少なくとも１つのアッセイパラメータを検索し、パラメータにしたがってアッセイを調整または構成するように構成されてよい。パラメータは、例えば、アッセイ中にサンプルホルダが回転する中心となる軸に沿って、走査範囲を決定することができる。パラメータは、さらなる実施例において、アッセイを実施し得る温度の設定点を決定することができる。この設定点を用いて、器具は温度を相応して制御することができる。さらなる実施例では、アッセイのために使用される試薬は、アッセイパラメータに基づいて決定されてよい。
【0018】
アッセイパラメータは、識別子が通信可能に接続されてよいデータベース中に記憶されてよい。データベースは、サンプルホルダのアイデンティティと結び付けられたアッセイパラメータならびに、例えばスキャナ範囲およびスキャナ設定値などの他のパラメータのリストを含んでいてよい。
【0019】
マトリクス層とは、アッセイ中にサンプルホルダにサンプルを保持するかまたは定着させる能力を有する材料または構成要素として理解されてよい。より具体的には、マトリクス層は、サンプルを内部に少なくとも部分的に包埋し、ホルダの回転中機械的に固定することのできる複数のサンプル部位を提供するように構成されてよい。したがって、マトリクス層は、内部にサンプルをそれぞれのサンプル部位に分布させ配設することのできる連続相に類似していてよい。したがって、サンプル部位なる用語は、マトリクス層内の実際のサンプルの空間的場所として言及されてよい。
【0020】
いくつかの実施形態によると、マトリクス層は、ゲル、例えばヒドロゲルを含んでいてよい。ヒドロゲルの例としては、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）ゲル、およびアガロースゲルが含まれる。ゲルは、ほとんどまたは全く流動性を示さない可能性のある架橋系として理解されてよい。有利には、ゲルは、液体状態で回転可能な本体に提供され、その後重合プロセスを用いて（実質的に）非流動性状態にされてよい。重合プロセスは例えば、ゲル化剤の添加、加熱または紫外線への曝露によって開始されてよい。回転可能な本体は、外側表面に対する充分な接着を促すためにゲルを提供する前に結合剤で処理されてよい。しかしながら、本発明の範囲内には、回転可能な本体に対しゲルを適用する他の方法も包含されており、例えば、接着剤を用いて回転可能な本体の外側表面に重合ゲルシートを貼付してもよい。サンプルは、重合の前または後でゲルに添加されてよい。ＤＮＡフラグメントを含むサンプルの場合、フラグメントを重合後にゲルに添加し、ゲル内で増幅させてよい。
【0021】
マトリクス層は、マトリクス層とサンプルホルダに存在し得るいずれかの水性液体との間の光の透過を容易かつ単純にするため、液体水の屈折率に類似する屈折率を有していてよい。このことは、以下で論述するように、マトリクス層が液体層により被覆されている場合に極めて有利である。屈折率は、例えば、１．３０～１．３５の範囲内にあり、例えば１．３３であってよい。
【0022】
マトリクス層は、２つ以上の層で適用されてよく、したがって、複数の副層で形成されていてよい。一実施例において、サンプルは、第１の副層を含むホルダにサンプルを提供し、その後、第１の副層の上または外部に配設された第２の副層に包埋されるかまたは被覆されてよい。副層は互いに類似の組成を有していてもよく、または異なるものであってもよい。
【0023】
マトリクス層は、マトリクス層を通した試薬などの物質の拡散または輸送を可能にするように構成されていてよい。これは、例えば、マトリクス層が多孔質材料で形成されかつ／またはマトリクス層を通って延在する細孔構造を含んでいることによって達成または促進され得る。細孔は、５０μｍ未満、例えば１０μｍ未満、例えば１μｍ未満の平均幅を有していてよい。ヒドロゲルがこのような多孔質材料の例である。ポリアクリルアミドゲルを含む実施形態において、多孔質は、未重合ゲル中のアクリルアミドの適切な濃度およびアクリルアミドとビス－アクリルアミドの間の適切な比率を選択することによって、ゲルの調製中に制御されてよい。
【0024】
さらに、マトリクス層は、試薬などの添加される物質が、拡散によりサンプルにアクセスできるようにするため、比較的薄いものであってよい。層の使用可能な厚みはさらに、走査深度および共焦点分解能（共焦点顕微鏡の場合）などの、画像化システムの利用可能な性能によって決定されてよい。共焦点画像化を使用することにより、マトリクス層内に異なる深度で分布させられたサンプルを、異なる共焦点平面を使用して画像化することができ、したがって、マトリクス層の深さ方向のサンプルの充填密度は、画像化システムの利用可能な共焦点分解能によって制限され得る。一実施例において、走査深度は例えば約１００μｍで、共焦点分解能は約０．７μｍであってよい。したがって、いくつかの実施形態によると、マトリクス層は、０．１～１０００μｍ、例えば１～１００μｍかつ、例えば１０～３０μｍの範囲内の厚みを有していてよい。具体的実施例において、マトリクス層は、１００μｍ以下、例えば４０μｍ未満の厚みを有していてよい。さらに、サンプル部位は、０．７μｍ以上の平均距離で厚み方向に分布していてよい。
【0025】
さらに、マトリクス層の厚みは、マトリクス層自体の機械的特性、例えば回転中充分な機械的安定性を維持することのできる最大厚みに基づいて決定されてよい。
【0026】
マトリクス層の拡散特性は、サンプルに試薬を添加するステップを含むアッセイを可能にし得る。試薬は、例えば液体中に含まれていてよく、これをマトリクス層上に液体層の形で提供することができる。液体層は例えば、サンプルホルダが回転してマトリクス層全体にわたる液体の均等な分布を促す間にマトリクス層上に提供されてよく、こうして、液体層はマトリクス層の外周を被覆することになる。スピニングディスクとして整形されている回転可能な本体については、液体層は、スピンコーティングを用いて形成されてよい。液体層はさらに、円筒形のサンプルホルダにとって極めて有利であり得るスキージー、ドクターブレード、またはスライドガラスなどの整形ツールを用いて形成されてよい。マトリクス層と整形ツールとの間の毛細管力が、整形ツールの幅全体にわたりサンプルホルダに加えられる液体の分布を補助し得る。液体層は、回転により誘発された粘性せん断力によって、マトリクス層の表面上に保定されてよい。液体層の外側表面は、空気に曝露されてよい。比較的薄い液体層内に試薬を添加することには、試薬をマトリクス層内部で比較的急速にかつ効率良く分散させることができるという利点がある。さらに、試薬は、マトリクス層の深さ方向にも分散したサンプルに達することができるため、マイクロ流体フローセルなどの先行技術に比べてより効率良く使用され得る。したがって、試薬単位体積あたりのサンプル数は、先行技術と比べて増大し得る。
【0027】
一実施形態によると、液体および／または試薬をサンプルホルダに供給するために液体ディスペンサを具備してよい。液体ディスペンサは、サンプルホルダ上の所与の位置および／または時間に液体層内に存在するように特定のまたは追加の反応物質を提供するように構成されていてよく、これにより液体層の化学的組成および特性を迅速に調節することが可能となる。
【0028】
上述の態様および実施形態は、ＤＮＡフラグメントなどのＤＮＡを含むサンプルのアッセイを行なうために利用されてよい。好ましくは、アッセイ由来の結果は、ＤＮＡ配列を決定するために処理されてよい。ＤＮＡフラグメントは、精確さを向上させかつ画像化積分時間を短縮するために増幅されてよい。増幅されたＤＮＡフラグメントは、アンプリコンと呼ばれる。ＤＮＡフラグメントは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いて増幅されてよい。ＲＣＡには等温であるというメリットがあり、それによりコピーは原初のＤＮＡフラグメントから作られることから増幅プロセスが単純化され誤差は削減され得る。代替的には、ポロニー増幅を応用してもよい。これは、ポリアクリルアミド基質上でＤＮＡをインサイチュで増幅するための方法である。ＤＮＡの運動はポリアクリルアミドゲル中では制限されていることから、増幅されたＤＮＡはゲル内で局在化され、いわゆる「ポロニー」すなわちポリメラーゼコロニーを形成する。本発明の範囲から逸脱することなく、マトリクス内でアンプリコンを創出するために他の増幅方法を使用してもよい。
【0029】
ＲＣＡによって創出されたアンプリコン、すなわち増幅されたフラグメントの長い反復的一本鎖は、コンカテマまたはＲＣＡ産物と呼ばれてよく、その自己崩壊特性の結果として、綛様形成を呈し得る。ＲＣＡ産物は、横方向およびマトリクス層の厚み方向に沿っての両方に分布することができ、こうして、サンプルが表面上でのみ分布している従来のサンプルホルダに比べてサンプル数を１０～１０００倍増加させることから、極めて有用である。さらに、ＰＣＡ産物には、マトリクス層の細孔内に捕捉され得る幾何形状を有する傾向があり、これにより、サンプルを化学的に結合または定着させる必要性が削減されるということが考察されている。
【0030】
合成による配列決定（ＳＢＳ）は、いくつかの実施形態にしたがって利用可能な配列決定技術の一例である。しかしながら、ハイブリダイゼーションおよびライゲーション方法などの他の方法も同様に構想可能である。ＳＢＳ中、増幅されたＤＮＡフラグメントは、典型的には或る種のブロッキング分子を伴う、蛍光標識ヌクレオチド、およびポリメラーゼ、すなわちプロセスの触媒として作用するための酵素を用いて、塩基毎に並行して合成されてよい（全て、集合的に配列決定化学と呼ばれる）。さまざまな精確さおよびリード長（すなわち、合成すべき可能な塩基数）に関連して、さまざまな配列決定化学が知られている。
【0031】
例えば次世代のＤＮＡ配列決定において、並列化されたアッセイを行なう場合、化学反応および画像化ステップは典型的に何回も反復される。単一のサイクルには例えば、ブロッカおよび蛍光標識を備えたヌクレオチド溶液（または反応媒質）での、一本鎖ＤＮＡを含む固定化されたサンプルのフラッシングステップ、余剰のヌクレオチドを除去するための第２のフラッシング作業、そして蛍光を測定しどのヌクレオチドがそれぞれの鎖上に取込まれたかを決定するための画像化ステップが関与してよい。情報が抽出された時点で、ブロッカおよび蛍光標識を付着したヌクレオチドから除去することができ、かつそれぞれの鎖上への取込みおよびＤＮＡ鎖の次の文字の読取りのために、別の試薬セットを添加することができる。これらの作業およびステップは、ＤＮＡ配列が確立されるまで、何度も反復してよい。
【0032】
上述の液体ディスペンサは、マトリクス層に対して液体および／または試薬を添加するために使用され得、このマトリクス層はそれ自体、アッセイ中のサンプル部位に対する液体および／または試薬の効率の良い拡散を可能にするように構成されていてよい。
【0033】
したがって、該方法は、マトリクス層に対して蛍光標識されたヌクレオチドとポリメラーゼを含む試薬を添加するステップを含むことができる。試薬は、例えば、サンプルのＤＮＡ鎖中の第１塩基に結合し得る、デオキシリボースを含有するヌクレオシドトリホスフェートｄＮＴＰを含んでいてよい。試薬はさらに、さらなるｄＮＴＰが鎖に付着するのを防止する第１のタイプのブロッカを含んでいてよい。蛍光標識されたヌクレオチドは、その後、例えば共焦点式に画像化されてよい。いくつかの実施例において、該方法は、ＤＮＡの構築ブロックを表わすために使用される４文字、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに対応する、４つのタイプのブロッカを伴う蛍光標識ヌクレオチドを添加するステップを含んでいてよい。典型的には、各々の文字を標識するために、１つのタイプのフルオロフォアが使用される。したがって、共焦点画像化は、各文字に１つずつの４つの画像化ステップを含んでいてよい。情報が抽出された時点で、付着されたヌクレオチドからブロッカおよび蛍光標識を除去してよく、ＤＮＡ鎖の次の文字を読取るために、別の試薬セットを添加することができる。当業者にとっては明白であるように、この主題についてのいくつかの変形形態が構想可能である。例えば、それぞれの文字各々に対応するヌクレオチドを、中間画像化ステップと共に１つずつ追加することができる。このようにして、２つ以上のタイプのヌクレオチドを標識するために、同じタイプのフルオロフォアを使用することができる。さらに、いくつかの化学反応において、ブロッカを削除することができる。
【0034】
上述のサンプルホルダおよび器具は、タンパク質またはＲＮＡサンプルなどの、ＤＮＡサンプル以外のサンプルのアッセイを行なうためにも等しく適正に使用することができる。いくつかの実施形態において、サンプルは、マトリクス層内に分布した組織および／または細胞を含む場合がある。サンプルは、ゲノムの特定の部分またはＲＮＡ鎖に付着したカスタマイズされた遺伝子タグを含むことができる。タグを増幅してアンプリコン、例えばコンカテマを形成し、上述の方法で読取ることができる。これにより、サンプル中のどこで特定の遺伝子が発現されているかの空間的情報を提供することができる。
【0035】
本発明のさらなる目的、特徴および利点は、以下の詳細な開示、図面および添付クレームを検討することで明白になるものである。当業者であれば、本発明の異なる特徴が、たとえ異なるクレーム中に記載されていても、以下で説明するもの以外の実施形態中で組合せ可能であることを認識する。
【0036】
本発明のこの態様および他の態様についてここで、本発明の実施形態を示す添付図面を参照しながらさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【発明を実施するための形態】
【0038】
図１ａ～ｂは、回転可能な本体１１０を含むサンプルホルダ１００を概略的に示す。サンプルホルダ１００はさらに、マトリクス層１２０を含み、ここでマトリクス層１２０は回転可能な本体１１０の外側表面を少なくとも部分的に被覆する。マトリクス層１２０は、ポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲルなどのヒドロゲルであってよく、これは回転可能な本体１１０の外側表面上に配設されてよい。サンプルは、サンプルホルダ１００上に配設される前にマトリクス層１２０内に分布し／包埋されていてよい。これにより、マトリクス層１２０内の統合および固着を促進することができる。サンプルは、配設後にマトリクス層１２０内に分布し／包埋され、ヒドロゲルの場合には、回転可能な本体の外側表面上で重合させられてよい。マトリクス層１２０の厚みＴ１は、好ましくは１００μｍ未満、より好ましくは４０μｍ未満であってよい。マトリクス層１２０は、複数のサンプル部位１３０でサンプルを収容するように構成されており、複数のサンプル部位１３０は、マトリクス層１２０内でマトリクス層１２０の横方向および厚み方向の両方に分布している。ここで、厚み方向は、回転可能な本体１１０の長手方向軸からの半径方向として定義されてよい。
【0039】
図１ａ～ｂにおいて、回転可能な本体１１０は、円筒形であるものとして例示されている。回転可能な本体１１０は、複数のサンプル部位でアッセイが行なわれている間、その軸を中心として回転するように構成されている。換言すると、回転可能な本体１１０は、サンプルに対してアッセイを行なうことができるような形でマトリクス層１２０内に存在するサンプルを移動させるために軸を中心にして回転させられるように構成されている。サンプル部位１３０は、マトリクス層１２０の３次元体積内のどこに配設されてもよく、例えば、この３次元体積は、複数のサンプル部位１３０により収容された複数のサンプルが半径方向で互いの上に配設されることを可能にする。
【0040】
図１ａに標示されているように、回転可能な本体１１０は、回転運動を生成するための手段および／またはサンプルホルダ１００を輸送するための手段（図示せず）と係合されるように構成された結合用配設１１２を含んでいてよい。結合用配設１１２は、マトリクス層１２０と干渉しないように回転可能な本体１１０の端部表面上に具備されてよい。結合は、回転運動の非接触式伝達を提供する磁気結合であってよく、さらに、器具内へのサンプルの挿入または器具からのサンプルの取出しを容易にするように構成されていてよい。代替的にまたは付加的に、結合用配設は、回転運動を生成するための手段内の対応する構造と嵌合可能な軸受座１１４を形成する表面部分を含んでいてよい。例示的軸受は、回転中の無摩擦懸架を提供する空気軸受である。
【0041】
図２ａ～ｂは、ディスク状のサンプルホルダ１００の上面図および断面側面図を概略的に示す。図２ａ～ｂは、図１ａ～ｂ内のサンプルホルダ１００と類似したものであってよいサンプルホルダ１００を例示している。しかしながら、図２ａ～ｂ中のサンプルホルダ１００は、形状が円筒ではなくディスクの形状であるという点で、図１ａ～ｂ中のサンプルホルダ１００と異なっている。サンプルホルダ１００の構成および動作の多くの特徴が図１ａ～ｂ中に描かれているものと実質的に類似していてよいことから、図１ａ～ｂ中に例示されている実施形態に共通の特徴についての詳細な説明は、簡潔さのために省略されている。
【0042】
図２ａ～ｂ中では、回転可能な本体１１０は、実質的に平担なディスクであってよい。サンプルホルダ１００は、その中心軸Ａを中心に回転可能となるように構成されている。マトリクス層１２０は、回転可能な本体１１０の外側表面の１つを少なくとも部分的に被覆するように配設されており、外側表面は、軸Ａに実質的に直交する平面内にある。図２ａ～ｂにおいて、厚み方向は軸Ａと平行である。
【0043】
図３ａ～ｂは、器具３００用のサンプルホルダ１００の断面図を概略的に示す。サンプルホルダ１００は、図１ａ～ｂおよび２ａ～ｂの実施形態と類似の形で構成されてよく、したがって、回転可能な本体１１０、マトリクス層１２０およびサンプル部位１３０を含んでいてよい。器具３００は、複数のサンプル部位１３０においてアッセイを行なうように構成され、各サンプル部位１３０は１つのサンプルを収容するように構成されている。マトリクス層１２０は、複数のサンプル部位１３０への試薬の拡散を可能にする細孔１４０を含むヒドロゲルなどの多孔質材料で形成されていてよい。細孔１４０は、試薬を担持する液体がマトリクス層１２０内に拡散できるようにし、こうしてサンプル部位１３０におけるサンプルへの試薬の輸送を可能にするチャネルまたは通路として定義されてよい。試薬は、サンプルに付着させられるように構成されてよい。さらに、試薬は、照射時に光を発出するように構成されたフルオロフォアを含んでいてよい。細孔１４０はいくつかの実施例において、１μｍ未満の平均幅を有していてよい。細孔は、複数のサンプル部位１３０への試薬の拡散を少なくとも部分的に可能にするかぎりにおいて、さまざまな形状およびサイズを有していてよいということを理解すべきである。
【0044】
ヒドロゲルなどのマトリクス層１２０は、図３ｂ中で標示されているように、光がサンプルに到達できるようにし、かつサンプルによって発出された光がヒドロゲルから退出できるようにするべく構成されてよい。概して、ヒドロゲルは、ヒドロゲル層１２０とアッセイ中に存在し得るいずれかの追加の水性液体との間の光の透過を促すことのできる、水の屈折率に類似する屈折率、すなわち例えば１．３０～１．３５の範囲内の屈折率を含んでいてよい。
【0045】
したがってサンプルホルダ１００は、マトリクス層１２０内のサンプルを照射するために少なくとも１つの光源３１１によって発出された光を受光するように構成されていてよい。少なくとも１つの光源３１１は好ましくはレーザダイオードであってよい。サンプルは、少なくとも１つの光源３１１によって発出される入射光の結果として蛍光を発出できる。器具３００は、サンプルが発出したまたは散乱させた光を検出するように構成された検出器３２２を含んでいてよい。検出器３２２は、例えば、蛍光を検出できてよい。少なくとも１つの光源３１１および検出器３２２は、内部で少なくとも１つの光源３１１からの光と検出器３２２の視野が重なり、そこからアッセイ中に光子が発出されるかまたは散乱させられ得る観察体積（図３ｂ中に正方形で標示）を画定するように構成されている。器具はさらに、光源３１１から観察体積まで光を透過しかつ／または観察体積から検出器３２２まで光を透過するように配設された対物レンズ（図示せず）を含んでいてよい。
【0046】
図３ａ～ｂに標示されているように、観察体積と対物レンズの間に光学的接触を提供するために、サンプルホルダ１００上に液体層１５０を提供してよい。マトリクス層１２０が多孔質であることを条件として、液体層内に含まれる液体は、多孔質構造に浸透し、マトリクス層内に配設されたサンプルを包み込むことができる。したがって、液体層に追加された試薬は、マトリクス層内に流れ込み、マトリクス層内に包埋されたサンプルと相互作用することができる。任意には、対物レンズと液体層の間にカバーガラスを具備してよい。カバーガラスと対物レンズの間には、光学経路を提供するために液浸油を具備してよい。それぞれ光源、観察体積および検出器の間の光学的接触を保証するために、マトリクス層１２０が透明であると有利である。液体層のものに近い屈折率をマトリクス層１２０に具備することによって、観察体積へのおよび／または観察体積からの光の望ましくない屈折が防止される。例えば、液体層は、約１．３３の屈折率を有する水層を含んでいてよく、マトリクス層１２０は、１．３～１．３５の範囲内の屈折率を有するヒドロゲルを含んでいてよい。
【0047】
液体層１５０は、液体ディスペンサ１６０そして任意には液体層整形ツール１７０、例えばスキージー、ドクターブレード、カバーガラスなどを用いて提供されてよい。液体ディスペンサ１６０は、マトリクス層に液体を追加するように構成されていてよく、液体層整形ツール１７０は、サンプルホルダ１００が回転する間に液体を所望の厚みの実質的に均一な液体層に分布させるように構成されていてよい。液体層の厚みは、サンプルホルダ１００と液体層整形ツール１７０の間の潤滑圧力および毛細管力の間のバランスによって決定されてよい。液体層の厚みは、５００μｍ未満、例えば２５０μｍ未満、例えば１００μｍ未満であってよい。図２ａ～ｂにしたがったディスク状の回転可能な本体を含む実施形態において、類似の構成を提供してもよい。
【0048】
アッセイには、共焦点顕微鏡画像化または光シート蛍光顕微鏡画像化などの顕微鏡画像化が関与していてよい。顕微鏡のセットアップに応じて、アッセイには、例えばサンプルについての情報を得るためにサンプル部位全体にわたり顕微鏡の焦点を走査することによって、数百または数千もの観察体積を画像化するステップが関与していてよい。観察体積のサイズは、サンプルよりも小さくてよく、したがって、サンプルに関してより多くの情報を得るためには、多数の観察体積からのデータを考慮に入れる必要があるかもしれない。サンプルの画像化は、回転可能な本体１１０が回転し、こうして観察体積を通してサンプルを移動させるにつれて行なうことができる。
【0049】
図４ａは、複数のサンプルのアッセイを行なうための方法を概略的に示している。該方法２００は、回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆するマトリクス層内に複数のサンプルを提供するステップ２１０を含む。複数のサンプルは、マトリクス層内でマトリクス層の横方向および厚み方向の両方に分布させられる。マトリクス層は、ヒドロゲルなどのゲルを含んでいてよい。複数のサンプルは、回転可能な本体の外側表面上にマトリクス層が配設／適用される前にマトリクス層内に分布し／包埋されてよい。したがって、複数のサンプルは、ゲル構造上への統合および固着を促進するために、ゲルの重合前にゲル混合物に添加されてよい。さらに、複数のサンプルは、回転可能な本体の外側表面上に配設された後にマトリクス層に対し添加されてもよい。例えば、複数のサンプルがＤＮＡフラグメントを含み、マトリクス層がヒドロゲルを含む場合、回転可能な本体の外側表面上でのゲルの重合後にマトリクス層に対し複数のサンプルを添加してよい。該方法２００はさらに軸を中心として回転可能な本体を回転させるステップ２２０を含む。該方法２００はさらに、回転可能な本体を回転させながら複数のサンプルのアッセイを行なうステップ２３０を含む。アッセイは、共焦点顕微鏡の画像化を含んでいてよい。共焦点顕微鏡画像化は、複数のサンプルを画像化し、ＤＮＡ配列情報を検索するために応用されてよい。共焦点顕微鏡画像化システムの代替案は、２光子励起画像化システム、広視野画像化システム、多光子画像化システムおよび光シート画像化システムである。アッセイを行なうステップ２３０は、複数のサンプルに対して試薬を添加するステップを含んでいてよく、ここで試薬はフルオロフォアを含んでいてよい。例えば、蛍光標識されたヌクレオチド中に含まれ得るフルオロフォアが、複数のサンプルに結合し共焦点顕微鏡画像化を用いて画像化されるように構成される。該方法２００は、ＤＮＡの構築ブロック、ヌクレオチドを表わすのに用いられる４つの文字Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）およびＴ（チミジン）のうちのそれぞれ１つを標識するために４つのタイプのフルオロフォアを有するステップを含んでいてよい。典型的には、異なる文字を標識するために、異なるタイプのフルオロフォアが使用される。したがって、共焦点画像化には、各文字について１つずつの４つの画像を撮るステップが含まれていてよい。１つの文字／核酸塩基についての情報が抽出された時点で、その塩基に関連するフルオロフォアを除去し、別の試薬セットを添加して、ＤＮＡ鎖の次の塩基を合成し読取ることができる。
【0050】
図４ｂは、図４ａに描かれているステップ２１０、２２０および２３０を含む方法を示す。図４ｂ中、方法２００はさらに、マトリクス層上に試薬を含む液体層を提供するステップ２４０を含んでいてよい。液体層を提供するステップ２４０は、液体ディスペンサによって行なわれてよい。液体層を提供するステップ２４０により、複数のサンプルに対する試薬の添加ステップを容易にすることができる。液体層を提供するステップ２４０は、試薬を複数のサンプルに対しより均一に分布させることを可能にすることができる。これは特に、液体層が提供された時点２４０で回転可能な本体が回転している場合に言えることであり得る。
【0051】
複数のサンプルは、環状化されたＤＮＡフラグメントなどのＤＮＡフラグメントを含んでいてよい。複数のサンプルは、コンカテマまたはポロニーなどのＤＮＡアンプリコンを含んでいてよい。該方法２００はさらに、複数のサンプル中に存在するＤＮＡの増幅を行なうステップ２５０を含んでいてよい。ＤＮＡ増幅の例としては、ローリングサークル増幅、ＲＣＡ、ワイルドファイヤ増幅およびブリッジ増幅が含まれる。概して、増幅は、マトリクス層内に複数のサンプルを分布し／包埋する前、またはその後のいずれかで行なわれる。複数のサンプルは、少なくとも１つのＤＮＡ鎖を含んでいてよく、該方法２００はさらに、ＤＮＡ鎖にｄＮＴＰを付着させるステップ２６０を含んでいてよい。ｄＮＴＰは、デオキシリボースを含有するヌクレオシドトリホスフェートである。ｄＮＴＰは、さらなるｄＮＴＰがＤＮＡ鎖に付着するのを防止するブロッカを含んでいてよい。該方法２００はさらに、複数のサンプルのＤＮＡ配列情報を提供するステップ２７０を含んでいてよい。
【0052】
該方法２００は、ステップ２４０、２５０、２６０および２７０の任意の組合せを含んでいてよいということを理解すべきである。換言すると、該方法２００は、例えば、液体層を提供するステップ２４０を含むもののステップ２５０、２６０および２７０は含まなくてもよい。
【0053】
図５は、複数のサンプルのアッセイを行なうように構成された器具３００を概略的に示す。器具３００は、図１ａ～ｂ、２ａ～ｂおよび３ａ～ｂ中のサンプルホルダ１００に類似する複数のサンプルを収容するように構成されたサンプルホルダ１００を含む。サンプルホルダ１００の構成および動作の多くの特徴が、図１ａ～ｂ、２ａ～ｂおよび３ａ～ｂで描かれたものに実質的に類似することから、図１ａ～ｂ、２ａ～ｂおよび３ａ～ｂ中で例示された実施形態に共通の特徴の詳細な説明は、簡潔さのために省略されている。器具３００はさらに、複数のサンプルを照射し複数のサンプルから発出または散乱させられた光子を検出するように構成された共焦点顕微鏡３１０を含む。回転可能な本体１１０は、器具３００内に配設され、共焦点顕微鏡３１０が複数のサンプル由来の光／光子を検出する間、器具３００によって回転させられるように構成されている。回転可能な本体１１０は、軸を中心にして回転してよく、こうして回転可能な本体１１０の外側表面から一定の距離のところでマトリクス層１２０内に配設されたサンプルに由来する光子が回転可能な本体１１０の一回転中に検出されてよい。
【0054】
図５において、共焦点顕微鏡３１０は、複数のサンプルを照射するように構成された少なくとも１つの光源３１１を含む。少なくとも１つの光源３１１は、コリメート光ビームを発出するように構成された複数のレーザダイオードであってよく、ここで複数の光源３１１に由来する多数の光ビームは、ダイクロイックビームスプリッタ３１２を介して同じ光学経路内へと合体されてよい。同様に、ビームを異なる角度で偏向させるためにミラーを用いて同じ光学経路内に異なる光ビームを導くことも構想可能である。光ビームは、その後マイクロレンズアレイ３１４上で、任意にはミラー３１３を介して入射ビームにされ、マイクロレンズアレイ３１４の他方の側の焦平面３１５内で焦点アレイを生成することができる。チューブレンズ３１６を、その焦平面がマイクロレンズアレイ３１４の焦平面と一致する状態で設置することができる。したがって、チューブレンズ３１６は、コリメートビームの対応するアレイを生成する。このコリメートビームアレイは、その後、４５度の角度の付いたビームスプリッタ３１７に対して反射させられてよく、その後対物レンズ３１８上に入射してよい。他の実施形態において、コリメートビームは、半透明ミラーに対して反射させられてよい。対物レンズ３１８は好ましくは、前記対物レンズ３１８のアパーチャがチューブレンズ３１６の焦平面に設置されるような形で設置される。このようにして、最大限の光が対物レンズ３１８のアパーチャ内に入る。対物レンズ３１８内の光の通過によって、マトリクス層１２０上に定着させられた調査対象の回転するサンプルが通過する体積内において観察体積を画定する焦点アレイが生成される。
【0055】
サンプルホルダ１１０上に配設された照射されたサンプル内の観察体積からの散乱光および／または蛍光を、その後対物レンズ３１８によって収集し、視準させてビームスプリッタ３１７を通過させる。このとき、第２のチューブレンズ３１９が、ファイババンドル３２１を介して各観察体積からの光が検出器３２２上で入射光になる前に光を空間的に濾過するピンホール（または任意には光ファイバ）のアレイ３２０上に観察体積の画像を生成し得る。検出器３２２は好ましくは、ガイガーモードで作動するアバランシェフォトダイオードのアレイである。検出器３２２からの信号は、信号処理ユニット３２３内で処理される。照射光を生成するために使用されるレーザダイオードは、利用分野に応じて連続波モードかまたはパルスモードのいずれでも作動できる。フルオロフォアを励起するために照射光が使用される場合、パルス光が時として有利である。フルオロフォアによって発出された光のみが検出されることを保証するためには、ビームスプリッタ３１７とピンホール（または光ファイバ）アレイ３２０の間のビーム経路内のどこかに、好適なフィルタ（図示せず）を導入してよい。好ましくは、フィルタは、ビームスプリッタ３１７と第２のチューブレンズ３１９の間に設置される。
【0056】
複数のサンプルの共焦点画像化は典型的には、サンプルホルダが回転している間に行なわれる。さらに、器具３００は、複数のサンプルに対する試薬の添加を容易にするために、液体ディスペンサ１６０および液体層整形ツール１７０を含んでいてよい。
【0057】
器具３００は、いくつかの実施形態によると、サンプルホルダ１００のアイデンティティに結び付けられた情報を検査するための識別手段を含んでいてよい。情報は例えば、サンプルホルダ１００内に含まれた識別子内に含まれていてよく、サンプルホルダ１００が器具３００内に挿入されていくにつれて器具３００の識別手段が情報を読取ることを可能にする。サンプルホルダ１００に識別子を具備することにより、サンプルホルダのアイデンティティを、分析すべき特定のサンプルに関する情報と結び付けることが可能である。したがって、サンプルホルダのアイデンティティは、正しいまたは所望のアッセイを行なうのに必要とされる情報に対する鍵となり得る。アイデンティティは、例えばスキャナの設定値、タイプまたは試薬、またはアッセイを行なうべき温度に関するサンプル特異的（またはホルダ特異的）アッセイパラメータを、器具上または遠隔の場所のいずれかにあるデータベースからロードするために、器具によって使用されてよい。さらに、アイデンティティは、トレーサビリティ目的で使用されてもよい。
【0058】
識別子は例えば、必要な情報を保持するバーコードまたはＲＦＩＤの形で提供されてよい。しかしながら、当業者には明白であるように、他の形態の情報保持手段も同様に、発明力ある構想から逸脱することなく使用可能である。
【0059】
サンプルホルダは、いくつかの実施例において、器具により可読である第１の識別子、および人間のオペレータにより可読である第２の識別子を含んでいてよい。これによりオペレータは、器具が読取った情報を確認すると同時に、第１の識別子の読取りに失敗した場合に手作業で情報を入力することもできる。
【0060】
本明細書中で開示されている器具３００および共焦点顕微鏡３１０の特定の構成要素および正確なセットアップは、単に一例にすぎないということを理解すべきである。例えば、器具３００は、１つの光源３１１のみを使用すること、または異なる波長などの異なる特性を有する光を発出する多数の光源３１１を使用することが充分可能である。さらに、ミラー、ビームスプリッタ、アパーチャおよびピンホールの数および使用は、マトリクス層１２０内のサンプルの共焦点画像化を行なうことができるかぎり変動してもよい。
【0061】
さらに、請求対象の発明を実践するにあたり、当業者は、図面、開示および添付のクレームを検討することによって、開示された実施例に対する変形形態を理解し、実施することができる。互いに異なる従属クレーム中に一定の対策が記載されているという事実だけで、これらの対策の組合せを有利に使用することは不可能であるということが標示されるわけではない。
【0062】
１つの態様に関連して説明された特徴は、他の態様にも取込むことができ、特徴の利点は、それが取込まれている全ての態様に適用可能である。当該発明力ある構想の他の目的、特徴および利点は、詳細な開示、添付クレームならびに図面から明白になるものである。
【0063】
概して、クレーム中で使用されている全ての用語は、本明細書中で明示的に別段の定義がなされているのでないかぎり、技術的分野におけるその通常の意味にしたがって解釈されるべきである。さらに、本明細書中の「第１の」、「第２の」、および「第３の」なる用語の使用は、いずれかの順序、数量または重要性を表しておらず、むしろ、１つの要素を別の要素と区別するために使用される。「ａ／ａｎ／ｔｈｅ［要素、装置、構成要素、手段、ステップなど］」に対する全ての言及は、明示的に別段の記述が無いかぎり、前記要素、装置、構成要素、手段、ステップなどの少なくとも１つの事例を意味するものとしてオープンに解釈されるべきものである。本明細書中で開示されているいずれの方法のステップも、明示的記述の無いかぎり、開示された正確な順序で行なわれなければならないわけではない。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-05-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のコンカテマのアッセイを行なうための方法（２００）において：回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆し厚みが１００μｍ未満であるマトリクス層内に前記複数のコンカテマを提供するステップ（２１０）であって、前記複数のコンカテマが横方向および厚み方向の両方で前記マトリクス層内に分布している、提供するステップと；
軸を中心として前記回転可能な本体を回転させるステップ（２２０）と；
液体ディスペンサを用いて前記回転可能な本体上の前記マトリクス層に液体を提供するステップと；
前記回転可能な本体が回転する間に、液体層整形ツールを用いて液体を所望の厚みの実質的に均一な液体層に分布させるステップと；
前記回転可能な本体を回転させながら前記複数のコンカテマの前記アッセイの少なくとも一部を行なうステップ（２３０）と；
を含む方法。
【請求項2】
前記アッセイを行なうステップが、前記液体層に対し試薬を添加するステップ（２６０）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記回転可能な本体が、前記回転可能な本体のアイデンティティと結び付けられた情報を担持する識別子を含み、前記識別子を読み取り、前記回転可能な本体の前記アイデンティティを検索するステップと；
前記アイデンティティと結び付けられた少なくとも１つのアッセイパラメータを検索するステップと；
検索された前記少なくとも１つのアッセイパラメータにしたがって、前記アッセイを調整するステップと；
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記アッセイの前記少なくとも一部を行なうステップが、前記軸に沿って前記回転可能な本体を走査するステップを含み、前記走査の範囲が、前記少なくとも１つのアッセイパラメータによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記アッセイの前記少なくとも一部を行うステップが、温度を制御するステップを含み、前記温度の設定点が前記少なくとも１つのアッセイパラメータによって決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記試薬が、前記少なくとも１つのアッセイパラメータに基づいて選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記試薬がフルオロフォアを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
前記複数のコンカテマを提供するステップが、前記マトリクス層内で複数の環状化ＤＮＡフラグメントを分布させるステップおよび前記環状化ＤＮＡフラグメントを増幅して前記コンカテマを形成するステップを含む、請求１または２に記載の方法。
【請求項9】
前記環状化ＤＮＡフラグメントを増幅するステップが、ローリングサークル増幅ＲＣＡを用いて行なわれる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
各コンカテマが少なくとも１つのＤＮＡ鎖を含み、前記方法がデオキシリボース、ｄＮＴＰを含むヌクレオシドトリホスフェートを前記ＤＮＡ鎖に付着させるステップをさらに含み、前記ｄＮＴＰが蛍光標識を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項11】
前記アッセイがさらに、共焦点顕微鏡画像化を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項12】
複数のコンカテマのアッセイを行なうように構成された器具（３００）において：複数のサンプル部位（１３０）を含むサンプルホルダ（１００）と；
前記サンプルホルダに対し試薬を含む液体を提供するように配設された液体ディスペンサ（１６０）と；
前記サンプルホルダ（１００）が回転する間に、前記液体を所望の厚みの実質的に均一な液体層に分布させるように構成された液体層整形ツール（１７０）と；
前記複数のサンプル部位を照射し、前記複数のサンプル部位から発出または散乱した光子を検出するように構成された顕微鏡（３１０）を含む器具であって、
前記サンプルホルダが：
回転可能な本体（１１０）と；
前記回転可能な本体の外側表面を少なくとも部分的に被覆し厚みが１００μｍ未満であるマトリクス層（１２０）と；
を含み、
前記マトリクス層が、前記マトリクス層の横方向と厚み方向の両方において前記マトリクス層内で分布させられるような形で前記複数のサンプル部位を含み；
前記複数のサンプル部位の各サンプル部位がコンカテマを含むよう構成されており；
前記液体ディスペンサ（１６０）および前記液体層整形ツール（１７０）が、前記マトリクス層の外周を被覆するために前記液体層を提供するように構成されており；
前記サンプルホルダは、前記器具内に配設され、前記顕微鏡が前記複数のサンプル部位から発出または散乱した前記光子を検出している間前記器具により回転させられるように構成されている、
器具。
【請求項13】
前記サンプルホルダが、前記サンプルホルダのアイデンティティと結び付けられた情報を担持する識別子を含み、前記器具が、前記識別子を読み取って前記サンプルホルダの前記アイデンティティを検索するように構成された読取り機をさらに含む、請求項１２に記載の器具。
【請求項14】
前記サンプルホルダと前記顕微鏡を互いとの関係において並進運動させるように配設されたスキャナをさらに含み、前記並進運動の範囲が、検索されたアイデンティティに基づくものである、請求項１３に記載の器具。
【請求項15】
さらに、前記検索されたアイデンティティに基づいて前記試薬を選択するように構成されている、請求項１３に記載の器具。
【請求項16】
前記アッセイ中に温度を制御するように配設された温度調節器をさらに含み、前記温度の設定点が前記検索されたアイデンティティによって決定される、請求項１３に記載の器具。
【請求項17】
さらに、前記検索されたアイデンティティに基づいて、既定のスキャナ範囲；
既定の試薬；および
既定の温度設定点；
のうちの少なくとも１つをデータベースから検索するように構成されている、請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の器具。
【国際調査報告】