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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-23
(54)【発明の名称】細胞のプログラム凍結方法、そのシステム及びその装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240516BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240516BHJP
A01N 1/02 20060101ALI20240516BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12M1/00 Z
A01N1/02
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573073
(86)(22)【出願日】2022-05-25
(85)【翻訳文提出日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 CN2022094851
(87)【国際公開番号】W WO2022247845
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】202110584162.4
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519211959
【氏名又は名称】上海理工大学
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【住所又は居所原語表記】Ｃｈｉｎａ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｙａｎｇｐｕ， Ｊｕｎｇｏｎｇ Ｒｏａｄ， Ｎｏ．５１６
(74)【代理人】
【識別番号】100067356
【弁理士】
【氏名又は名称】下田 容一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100160004
【弁理士】
【氏名又は名称】下田 憲雅
(74)【代理人】
【識別番号】100120558
【弁理士】
【氏名又は名称】住吉 勝彦
(74)【代理人】
【識別番号】100148909
【弁理士】
【氏名又は名称】瀧澤 匡則
(74)【代理人】
【識別番号】100192533
【弁理士】
【氏名又は名称】奈良 如紘
(72)【発明者】
【氏名】李 維傑
(72)【発明者】
【氏名】申 敬
(72)【発明者】
【氏名】秦 延斌
(72)【発明者】
【氏名】李 智新
(72)【発明者】
【氏名】顔 宏利
(72)【発明者】
【氏名】漆 琴
(72)【発明者】
【氏名】劉 宝林
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4H011
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029DG10
4B029GA02
4B065AA90X
4B065BD09
4B065BD12
4H011CA01
4H011CB08
4H011CC05
4H011CD06
(57)【要約】
【要約】細胞プログラム凍結方法、システム及び装置であって、細胞冷凍技術分野に属し、方法には、降温速度ｋ及び液体窒素が収容されている保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得するステップＳ１と、ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で、細胞保存チューブが保温キャビティ内で下降するように制御し、細胞保存チューブが下降する過程で、細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２を、同じ時刻及び同じ高さでリアルタイムに取得するステップＳ２と、Ｔ１とＴ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はＳ４に進み、そうでない場合は、Ｓ２を続行して、所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまで細胞保存チューブを制御するステップＳ３と、細胞保存チューブが停止するように制御し、Ｔ１とＴ２の差Δｔが所定の温度差閾値以下になるとＳ２を続行するステップＳ４を含む。前記方法、システム及び装置は、細胞凍結効果及び蘇生率を効果的に向上できる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞プログラム凍結方法であって、降温速度ｋ及び液体窒素が収容されている保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得するステップＳ１であって、ここで、ｈは、温度測定点から保温キャビティの上縁までの距離であり、Ｔは、前記温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃは、いずれも定数である、前記ステップＳ１と、
ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で前記保温キャビティ内において下降するように細胞保存チューブを制御し、前記細胞保存チューブが下降する過程において、同じ時刻及び同じ高さでの前記細胞保存チューブの内側温度と外側温度とであるＴ１とＴ２をリアルタイムに取得するステップＳ２と、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はステップＳ４に進み、そうでない場合は、前記細胞保存チューブを制御して所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまで前記ステップＳ２を続行するステップＳ３と、
停止するように前記細胞保存チューブを制御し、前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の前記差Δｔが前記温度差閾値以下になると前記ステップＳ２を続行する前記ステップＳ４と、を含むことを特徴とする細胞プログラム凍結方法。
【請求項2】
前記ステップＳ２おいて、前記内側温度Ｔ１温度を取得するステップには、前記細胞保存チューブと同じ高さに対照チューブを配置するステップと、
前記対照チューブ内に熱物性が前記細胞保存チューブ内の液体の熱物性と一致する対照溶液を収容するか、或いは、前記対照チューブに前記細胞保存チューブと同じ液体を収容するステップと、
測温素子を介して前記対照チューブ内の液体の温度を収集して前記内側温度Ｔ１温度とするステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞プログラム凍結方法。
【請求項3】
前記ステップＳ３において、前記所定の保温温度Ｔ０の位置ｈ０は、前記保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃによって算出されることを特徴とする請求項１に記載の細胞プログラム凍結方法。
【請求項4】
前記ステップＳ３において、前記細胞保存チューブを制御して前記所定の保温温度Ｔ０の位置に達することは、リアルタイムに取得した前記内側温度Ｔ１と前記所定の保温温度Ｔ０を比較し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さいかどうかを判断し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さい場合は前記細胞保存チューブを下降し続けるように制御し、そうでない場合は前記細胞保存チューブを停止するように制御するステップによって実現されることを特徴とする請求項１に記載の細胞プログラム凍結方法。
【請求項5】
前記ステップＳ３において、前記細胞保存チューブを制御して所定の保温温度Ｔ０の位置に達した後にさらに、所定の保温時間長さを待機した後、前記保温キャビティから取り出されるまで前記保温キャビティ内で上昇するように、前記細胞保存チューブを制御するステップＳ５を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞プログラム凍結方法。
【請求項6】
細胞プログラム凍結システムであって、前記細胞プログラム凍結システムは、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞プログラム凍結方法を実行するために使用され、前記細胞プログラム凍結システムには、降温速度ｋ、保温キャビティの温度分布関数、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２、所定の保温温度Ｔ０、所定の温度差閾値及び所定の保温時間長さを取得するために使用される取得モジュールと、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、前記細胞保存チューブが所定の保温温度Ｔ０の位置に達しているかどうかを判断するために使用される判断モジュールと、
前記判断モジュールの判断結果に応じて昇降指令を生成して、前記昇降指令によって、昇降装置が前記細胞保存チューブを前記保温キャビティ内で昇降させるように制御するために使用される昇降制御モジュールと、
を含むことを特徴とする細胞プログラム凍結システム。
【請求項7】
細胞プログラム凍結装置であって、台座と、
前記台座の上に配置され、内部に液体窒素が収容される保温キャビティと、
細胞保存チューブが設置されるチューブラックと、
前記細胞保存チューブの内側と外側両方の同じ高さ位置の温度を同じ時刻でそれぞれ測定するように、少なくとも２つ設置される測温素子と、
前記台座に設置され、前記保温キャビティ内で前記チューブラックを昇降させるために、出力端が前記チューブラックに固定接続されている昇降装置と、
電子機器を含み、且つ前記電子機器は前記測温素子及び前記昇降装置に電気的に接続される制御装置と、
を含み、
前記電子機器には、実行可能なプログラムコードを記憶するメモリと、メモリに結合されたプロセッサとを含み、ここで、プロセッサは、メモリに記憶された実行可能なプログラムコードを呼び出して、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞プログラム凍結方法を実行する
ことを特徴とする細胞プログラム凍結装置。
【請求項8】
対照チューブをさらに含み、
前記対照チューブは、前記チューブラックに固定設置され、前記対照チューブと前記細胞保存チューブは、同じ高さに配置され、ここで、前記対照チューブ内には、前記細胞保存チューブの内側の温度を間接的に取得するために、前記測温素子を配置することを特徴とする請求項７に記載の細胞プログラム凍結装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０２１年５月２７日に中国特許局に提出された出願番号が２０２１１０５８４１６２．４であり、発明の名称が「細胞プログラム凍結方法、システム、機器、媒体及び装置」の中国特許出願の優先権を主張し、その全ての内容は、参照により本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、細胞凍結の技術分野に属し、特に、細胞プログラム凍結方法、システム及び装置に関する。
【背景技術】
【0003】
近年、現代の生物医学が、分子医学とパーソナライズされた診断及び治療の時代に移行するにつれて、大規模で高品質の生物標本及び関連情報リソースの需要も、急速に増加している。多くの先進国は、ヒトの遺伝資源の保護と開発を非常に重視しており、さまざまなバイオバンク、人口ベースのバイオバンク、バーチャル・バイオバンクを設立して、これらを生物医学分野の中核となる競争力を発展させるための戦略的手段とみなしている。生物細胞リソースバンクを設立し、生物細胞（現在は主に精子細胞、胚又は卵細胞、或いは、幹細胞）を保存することは、種資源の保存、育種、生殖などの分野にとって非常に重要である。
【0004】
プログラム（プログラムされた）降温は効果的な降温方法として、細胞の凍結保存プロセスで広く使用されており、中でも液体窒素燻蒸法は、その装置がシンプルであるため広く使用されている。この方法では、液体窒素表面の異なる気体層の温度を利用してサンプル（試料）を予冷し、予冷完了後、そのサンプルを液体窒素に浸漬してその凍結を完了させる。
【0005】
しかし、液体窒素の表面温度は一定ではないため、凍結プロセスにおける細胞サンプルの降温速度や予冷温度が一定せず、細胞の保存効果に、大きなばらつきが生じてしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
細胞のプログラム凍結中に降温速度と予冷温度とが一致しないという従来技術の問題を考慮して、本発明は、細胞の、プログラムされた凍結方法、システム及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の目的を達成するための、本発明の技術的解決策は、次のとおりである。
第１態様では、本発明は、細胞プログラム凍結方法を提供し、
降温速度ｋ及び液体窒素が入った保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得するステップＳ１であって、ここで、ｈは、温度測定点から保温キャビティの上縁までの距離であり、Ｔは、前記温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃは、いずれも定数である、前記ステップＳ１と、
ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で前記保温キャビティ内において下降するように細胞保存チューブを制御し、前記細胞保存チューブが下降する過程において、同じ時刻及び同じ高さでの前記細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２をリアルタイムに取得するステップＳ２と、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はステップＳ４に進み、そうでない場合は、前記細胞保存チューブを制御して所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまで前記ステップＳ２を続行するステップＳ３と、
停止するように前記細胞保存チューブを制御し、前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の前記差Δｔが前記温度差閾値以下になると前記ステップＳ２を続行するステップＳ４と、を含む。
第１態様では、本発明は、細胞プログラム凍結方法を提供し、
降温速度ｋ及び液体窒素が入った保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得するステップＳ１であって、ここで、ｈは、温度測定点から保温キャビティの上縁までの距離であり、Ｔは、前記温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃは、いずれも定数である、前記ステップＳ１と、
ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で前記保温キャビティ内において下降するように細胞保存チューブを制御し、前記細胞保存チューブが下降する過程において、同じ時刻及び同じ高さでの前記細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２をリアルタイムに取得するステップＳ２と、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はステップＳ４に進み、そうでない場合は、前記細胞保存チューブを制御して所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまで前記ステップＳ２を続行するステップＳ３と、
停止するように前記細胞保存チューブを制御し、前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の前記差Δｔが前記温度差閾値以下になると前記ステップＳ２を続行するステップＳ４と、を含む。
【0008】
また、前記内側温度Ｔ１温度を取得する前記ステップＳ２は、
前記細胞保存チューブと同じ高さに対照チューブを配置するステップと、
前記対照チューブ内に熱物性が前記細胞保存チューブ内の液体の熱物性と一致する対照溶液を収容するか、或は、前記対照チューブに前記細胞保存チューブと同じ液体を収容するステップと、
測温素子を介して前記対照チューブ内液体の温度を収集して前記内側温度Ｔ１温度とするステップと、を含んでもよい。
前記細胞保存チューブと同じ高さに対照チューブを配置するステップと、
前記対照チューブ内に熱物性が前記細胞保存チューブ内の液体の熱物性と一致する対照溶液を収容するか、或は、前記対照チューブに前記細胞保存チューブと同じ液体を収容するステップと、
測温素子を介して前記対照チューブ内液体の温度を収集して前記内側温度Ｔ１温度とするステップと、を含んでもよい。
【0009】
また、前記ステップＳ３において、前記所定の保温温度Ｔ０の位置ｈ０は、前記保温キャビティの温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃによって算出されてもよい。
【0010】
また、前記ステップＳ３において、前記細胞保存チューブを制御して前記所定の保温温度Ｔ０の位置に達することは、
リアルタイムで取得した前記内側温度Ｔ１と前記所定の保温温度Ｔ０を比較し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さいかどうかを判断し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さい場合は前記細胞保存チューブを下降し続けるように制御し、そうでない場合は前記細胞保存チューブを停止するように制御するステップによって実現されてもよい。
リアルタイムで取得した前記内側温度Ｔ１と前記所定の保温温度Ｔ０を比較し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さいかどうかを判断し、前記内側温度Ｔ１が前記所定の保温温度Ｔ０より小さい場合は前記細胞保存チューブを下降し続けるように制御し、そうでない場合は前記細胞保存チューブを停止するように制御するステップによって実現されてもよい。
【0011】
また、前記ステップＳ３において、前記細胞保存チューブを制御して前記所定の保温温度Ｔ０の位置に達した後にさらに、
所定の保温時間長さを待機した後、前記保温キャビティから取り出されるまで前記保温キャビティ内で上昇するように、前記細胞保存チューブを制御するステップＳ５を含んでもよい。
所定の保温時間長さを待機した後、前記保温キャビティから取り出されるまで前記保温キャビティ内で上昇するように、前記細胞保存チューブを制御するステップＳ５を含んでもよい。
【0012】
第２態様では、本発明は、細胞プログラム凍結システムを提案し、前記システムは、上記の方法を実行するために使用され、前記システムは、
降温速度ｋ、保温キャビティの温度分布関数、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２、所定の保温温度Ｔ０、所定の温度差閾値及び所定の保温時間長さを取得するために使用される取得モジュールと、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、前記細胞保存チューブが所定の保温温度Ｔ０の位置に達しているかどうかを判断するために使用される判断モジュールと、
前記判断モジュールの判断結果に応じて昇降指令を生成し、前記昇降指令によって、前記細胞保存チューブを前記保温キャビティ内で昇降させるように昇降装置を制御するための昇降制御モジュールと、を含む。
降温速度ｋ、保温キャビティの温度分布関数、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブの内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２、所定の保温温度Ｔ０、所定の温度差閾値及び所定の保温時間長さを取得するために使用される取得モジュールと、
前記内側温度Ｔ１と前記外側温度Ｔ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、前記細胞保存チューブが所定の保温温度Ｔ０の位置に達しているかどうかを判断するために使用される判断モジュールと、
前記判断モジュールの判断結果に応じて昇降指令を生成し、前記昇降指令によって、前記細胞保存チューブを前記保温キャビティ内で昇降させるように昇降装置を制御するための昇降制御モジュールと、を含む。
【0013】
第３態様では、本発明は、細胞プログラム凍結装置を提案し、
台座と、
前記台座の上に配置され、内部に液体窒素が収容される保温キャビティと、
細胞保存チューブが設置されるチューブラックと、
前記細胞保存チューブの内側と外側の両方の同じ高さ位置の温度を同じ時刻でそれぞれ測定するように、少なくとも２つ設置される測温素子と、
前記台座に設置され、前記保温キャビティ内で前記チューブラックを昇降させるために、出力端が前記チューブラックに固定接続されている昇降装置と、
電子機器を含み、且つ前記電子機器は前記測温素子及び前記昇降装置に電気的に接続される制御装置と、を含み、
前記電子機器には、実行可能なプログラムコードを記憶するメモリと、メモリに結合されたプロセッサと、を含み、ここで、プロセッサは、メモリに記憶された実行可能なプログラムコードを呼び出して、上述の方法を実行する。
台座と、
前記台座の上に配置され、内部に液体窒素が収容される保温キャビティと、
細胞保存チューブが設置されるチューブラックと、
前記細胞保存チューブの内側と外側の両方の同じ高さ位置の温度を同じ時刻でそれぞれ測定するように、少なくとも２つ設置される測温素子と、
前記台座に設置され、前記保温キャビティ内で前記チューブラックを昇降させるために、出力端が前記チューブラックに固定接続されている昇降装置と、
電子機器を含み、且つ前記電子機器は前記測温素子及び前記昇降装置に電気的に接続される制御装置と、を含み、
前記電子機器には、実行可能なプログラムコードを記憶するメモリと、メモリに結合されたプロセッサと、を含み、ここで、プロセッサは、メモリに記憶された実行可能なプログラムコードを呼び出して、上述の方法を実行する。
【0014】
また、さらに対照チューブを含み、前記対照チューブは前記チューブラックに固定設置され、且つ前記対照チューブと前記細胞保存チューブは同じ高さに配置され、ここで、前記対照チューブ内には、前記細胞保存チューブの内側温度を間接的に取得するために、前記測温素子を配置してもよい。
【発明の効果】
【0015】
本発明によって提供される特定の実施形態によれば、本発明は以下の技術的効果を開示する。
本発明は、細胞プログラム凍結方法、システム及び装置を提案し、液体窒素を収容した保温キャビティ内での細胞保存チューブの下降を制御する過程において、細胞保存チューブの内側温度と外側温度を連続的に取得することで、下降過程中に、細胞保存チューブの内側と外側の温度差が所定の温度差閾値より常に低いことを保証し、温度差が当該温度差閾値を超えると下降を停止させ、温度差が当該温度差閾値を下回ると所定の保温温度の位置に達するまで下降を継続することにより、プログラム凍結プロセス中の細胞の保存効果を効果的に向上でき、従来技術に存在する細胞プログラム凍結プロセス中の降温速度と予冷温度の不一致によって引き起こされる細胞の保存効果が悪いという問題を解決できる。
本発明は、細胞プログラム凍結方法、システム及び装置を提案し、液体窒素を収容した保温キャビティ内での細胞保存チューブの下降を制御する過程において、細胞保存チューブの内側温度と外側温度を連続的に取得することで、下降過程中に、細胞保存チューブの内側と外側の温度差が所定の温度差閾値より常に低いことを保証し、温度差が当該温度差閾値を超えると下降を停止させ、温度差が当該温度差閾値を下回ると所定の保温温度の位置に達するまで下降を継続することにより、プログラム凍結プロセス中の細胞の保存効果を効果的に向上でき、従来技術に存在する細胞プログラム凍結プロセス中の降温速度と予冷温度の不一致によって引き起こされる細胞の保存効果が悪いという問題を解決できる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
本発明の技術的解決策をより明確に説明するために、実施例又は従来技術の説明で必要な図面を以下に簡単に紹介するが、明らかに、以下の説明における図面は、本発明の一部の実施例に過ぎず、他の図面は、当業者であれば、創造的な労力を要することなく、これらの図面から得ることができる。
【図1】本発明実施例で提供される細胞プログラム凍結装置の構造概略図である。
【図2】本発明実施例で提供される細胞プログラム凍結方法のフローチャートである。
【図3】本発明実施例で提供される細胞プログラム凍結方法において細胞保存チューブの内側温度を取得する方法のフローチャートである。
【図4】本発明実施例で提供される別の細胞プログラム凍結方法のフローチャートである。
【図5】本発明実施例で提供される細胞プログラム凍結システムの構造概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明の特定の実施形態について、図面を参照して以下にさらに説明する。ここで、これらの実施形態の説明は、本発明の理解を助けるために使用されるものであり、本発明を限定するものではないことに留意されたい。また、以下に説明する本発明の様々な実施形態に係る技術的特徴は、互いに矛盾しない限り、互いに組み合わせることができる。
【0018】
なお、本発明の説明において、「上」、「下」、「左」、「右」、「前」、「後」等の用語で示される向きや位置関係は、図面に基づく本発明構造の説明であり、本発明を簡単に説明することのみを意図したものであり、言及される装置又は素子が特定の向きを持たなければならないこと、特定の向きで構築及び操作される必要があることを示唆又は暗示するものではなく、したがって、本発明の限定として解釈できない。
【0019】
本技術的解決策における「第１」や「第２」は、同じ又は類似の構造、又は同様の機能を実行する対応する構造の名前の区別に過ぎず、これらの構造の重要性の順位付けではなく、大きさのランク付けや比較、或はその他の意味を持つものでもない。
【0020】
また、特に明示的に規定及び限定されない限り、「設置」及び「接続」という用語は、広い意味で理解されるべきである。例えば、接続は、固定接続、取り外し可能な接続、又は一体型の接続であってもよく、機械的接続又は電気的接続であってもよく、直接接続、中間媒体を介した間接接続、又は2つの構造内部の連通であってもよい。当業者であれば、本発明における上記の用語の具体的な意味は、本発明の総体的な考えに基づいて、本解決策の文脈の具体的な状況と併せて理解することができる。
【0021】
実施例１
本実施例により提案される細胞プログラム凍結装置は、図１に示すように、制御装置１、保温キャビティ３、チューブラック４、細胞保存チューブ６、測温素子、昇降装置及び台座１４を含む。
本実施例により提案される細胞プログラム凍結装置は、図１に示すように、制御装置１、保温キャビティ３、チューブラック４、細胞保存チューブ６、測温素子、昇降装置及び台座１４を含む。
【0022】
ここで、台座１４は、プラットフォームとして構成され、使用時には机上に設置される。保温キャビティ３は、熱伝導率の低い材料（発泡材料など）で作られた、上部に開口部が設けられた円筒状構造として構成され、或いは、保温キャビティ３は、真空カップとして構成できる。保温キャビティ３内には液体窒素が収容されており、液体窒素の液面は、通常、保温キャビティ３の上縁から１０ｃｍなどの一定の距離にある。さらに、保温キャビティ３の液面以上の温度分布は、温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを満たし、ここで、ｈは温度測定点から保温キャビティ３の上縁までの距離、Ｔは温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃはいずれも定数であり、実験により求められる。
【0023】
ここで、前記細胞保存チューブ６は、凍結しようとする細胞を搭載するために使用され、当該細胞保存チューブ６は、チューブラック４に固定的に設置されて、細胞保存チューブ６は、チューブラック４により保温キャビティ３内を昇降するように駆動され、プログラム降温される。一方、昇降装置は、台座１４の上に設置され、当該昇降装置の出力端は、チューブラック４に固定接続されて、チューブラック４が保温キャビティ３内を昇降するように駆動する。本実施例では、昇降装置は、電動プッシュロッドと湾曲アーム９とを含むように構成される。電動プッシュロッドは、垂直に、台座１４の上に配置され、湾曲アーム９の一端は、電動プッシュロッドの出力端に固定され、湾曲アーム９の他端は、チューブラック４に固定接続される。図１に示すように、電動プッシュロッドは、スライダ１０、スクリュー１１、ガイドレール１２及びモータ１３を含む。ここで、ガイドレール１２は、台座１４の上に垂直に配置されて固定される。スクリュー１１は、ガイドレール１２と平行であり、また、スクリュー１１の上端及び下端はそれぞれ、ベアリングを介してガイドレール１２頂部の横板及び台座１４の上に回転可能に接続される。モータ１３は、台座１４に固定され、また、モータ１３の出力軸は、カップリングや歯車伝達機構を介してスクリュー１１の下端に接続される。スライダ１０は、ガイドレール１２にスライド可能に接続され、また、スライダ１０には、スクリュー１１に適合するねじ穴が設けられて、それにより、モータ１３が起動すると、スクリュー１１が回転駆動され、そしてスクリュー１１によりスライダ１０は昇降し、湾曲アーム９を介して、チューブラック４及びその上に設置された細胞保存チューブ６が保温キャビティ３内を昇降できるように駆動する。或いは、別の実施例では、昇降装置は、シリンダとして構成されてもよく、シリンダの本体は、台座１４の上に固定的に設置され、その出力端は湾曲アーム９を固定するために使用される。
【0024】
また、測温素子によって、細胞保存チューブ６の内側及び外側の両方の温度をそれぞれ測定する。例えば、本実施例では、測温素子は、第１測温素子７と第２測温素子８とを含むように構成される。第１測温素子７と第２測温素子８はいずれも、熱電対として選択され、ここで、第１測温素子７のプローブは、細胞保存チューブ６の内部に延びて、その内側の温度を取得し、第２測温素子８のプローブは、細胞保存チューブ６の外部に位置してその外側の温度を取得し、且つ、第１測温素子７のプローブと第２測温素子８のプローブは、同じ高さ位置にある。当業者が容易に理解できることは、測温素子は、細胞保存チューブ６の内側及び外側の温度をそれぞれ同時に取得するために、少なくとも２つ配置されるが、温度測定精度を向上させるために、片側単一点での測定誤差を低減するように、測温素子は複数配置されてもよい。
【0025】
制御装置１は、電子機器を含み、当該電子機器は、実行可能なプログラムコードを格納するメモリと、当該メモリに結合されたプロセッサと、を含み、また、当該プロセッサは、上記の測温素子及び昇降装置にも電気的に接続される。ここで、プロセッサは、メモリに格納された実行可能なプログラムコードを呼び出し、それによって、実行可能なプログラムコードに載せられた細胞プログラム凍結方法のステップを実行する。
【0026】
使用時には、まず、保温キャビティ３の構造に応じて、実験によりその温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを事前に取得し、凍結しようとする細胞を必要な細胞保護剤と一緒に細胞保存チューブ６内に入れ、必要な降温速度ｋに基づいて、細胞保存チューブ６のリアルタイム下降速度ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈを取得し、ここで、ｋは、降温速度、ｈは、温度測定点から保温キャビティ３の上縁までの距離であり、ａとｂとｃは、いずれも定数である。次に、制御装置１の制御により、昇降装置は、チューブラック４とその上に固定設置された細胞保存チューブ６を当該速度で下降するように駆動し、ここで、ｈは、モータ１３の回転角から計算できる。次に、下降過程中に第１測温素子７と第２測温素子８の温度の差の値を比較し、当該差の値が所定の温度差閾値より小さいことを保証し、且つ差の値が当該温度差閾値に達すると、制御装置１により細胞保存チューブ６の下降を停止させ、このようにして、第１測温素子７により測定される温度データが凍結温度に達するまで行う。この実施例で提供される装置は、細胞プログラム凍結プロセスをリアルタイムで監視し、監視結果に基づいて迅速な調整を行うことができ、それによって凍結効果を向上できることが分かる。
【0027】
好ましい一実施例では、制御装置１は、表示画面２をさらに含むように構成される。表示画面２は、制御装置１におけるプロセッサに電気的に接続され、好ましくは、表示画面２は、タッチスクリーンである。これにより、制御パラメータ（降温（冷却）速度ｋ、温度差閾値など）は、表示画面２を介して入力及び変更される。
【0028】
実施例２
実施例２と実施例１との違いは、次のとおりである。実施例２では、図１に示すように、更に対照チューブ５を含み、当該対照チューブ５は、チューブラック４に固定設置され、且つ対照チューブ５と細胞保存チューブ６とは同じ高さに配置される。使用時、対照チューブ５内に、熱物性（結晶化エンタルピー、熱伝導率、比熱容量などを含む）が細胞保存チューブ６内の液体の熱物性と同じである等体積の対照溶液を充填するか、或は、直接に等体積の細胞保存チューブ６と同じ溶液を充填する。また、対照チューブ５内に測温素子（即ち、第１測温素子７）を配置して、間接測定方式により、この第１測温素子７で測定された温度を細胞保存チューブ６内の温度とし、同時に、実施例１で細胞保存チューブ６の内側に配置された第１測温素子７を廃止する。
実施例２と実施例１との違いは、次のとおりである。実施例２では、図１に示すように、更に対照チューブ５を含み、当該対照チューブ５は、チューブラック４に固定設置され、且つ対照チューブ５と細胞保存チューブ６とは同じ高さに配置される。使用時、対照チューブ５内に、熱物性（結晶化エンタルピー、熱伝導率、比熱容量などを含む）が細胞保存チューブ６内の液体の熱物性と同じである等体積の対照溶液を充填するか、或は、直接に等体積の細胞保存チューブ６と同じ溶液を充填する。また、対照チューブ５内に測温素子（即ち、第１測温素子７）を配置して、間接測定方式により、この第１測温素子７で測定された温度を細胞保存チューブ６内の温度とし、同時に、実施例１で細胞保存チューブ６の内側に配置された第１測温素子７を廃止する。
【0029】
このように設置すると、温度測定による凍結しようとする細胞への影響を回避でき、細胞の凍結効果をさらに向上できる。
【0030】
実施例３
本実施例は、細胞プログラム凍結方法を提案し、当該方法は、上記実施例１の装置に基づいて実施され、当該方法は、上記装置の電子機器によって実行されて、図２に示すステップを実現することができる。具体的なステップには、
降温速度ｋ及び液体窒素が入った保温キャビティ３の温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得し、ここで、ｈは温度測定点から保温キャビティ３の上縁までの距離であり、Ｔは温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃはいずれも定数である、ステップＳ１と、
昇降装置を介して、ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で保温キャビティ３内を下降するように細胞保存チューブ６を制御し、細胞保存チューブ６が下降する過程において、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブ６の内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２をリアルタイムに取得するステップＳ２と、
Ｔ１とＴ２の差Δｔ（絶対値）が所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はＳ４に進み、そうでない場合は、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまでＳ２を続行するステップＳ３であって、
ここで、所定の保温温度Ｔ０の位置ｈ０は、保温キャビティ３の温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃによって算出でき、或いは、以下のステップによって実現できる：
リアルタイムに取得したＴ１とＴ０を比較し、Ｔ１がＴ０より小さいか否かを判断し、小さい場合は昇降装置により細胞保存チューブ６を降下し続け、そうでない場合には昇降装置により細胞保存チューブ６を停止する、
前記ステップＳ３と、
昇降装置により、停止するように細胞保存チューブ６を制御し、Ｔ１とＴ２の差Δｔ（絶対値）が所定の温度差閾値以下になるとＳ２を続行するステップＳ４と、を含む。
本実施例は、細胞プログラム凍結方法を提案し、当該方法は、上記実施例１の装置に基づいて実施され、当該方法は、上記装置の電子機器によって実行されて、図２に示すステップを実現することができる。具体的なステップには、
降温速度ｋ及び液体窒素が入った保温キャビティ３の温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃを取得し、ここで、ｈは温度測定点から保温キャビティ３の上縁までの距離であり、Ｔは温度測定点の位置での温度であり、ａ、ｂ、ｃはいずれも定数である、ステップＳ１と、
昇降装置を介して、ｖ＝（ｋ－ｂ）／２ａｈのリアルタイム速度で保温キャビティ３内を下降するように細胞保存チューブ６を制御し、細胞保存チューブ６が下降する過程において、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブ６の内側温度と外側温度であるＴ１とＴ２をリアルタイムに取得するステップＳ２と、
Ｔ１とＴ２の差Δｔ（絶対値）が所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、超えている場合はＳ４に進み、そうでない場合は、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達するまでＳ２を続行するステップＳ３であって、
ここで、所定の保温温度Ｔ０の位置ｈ０は、保温キャビティ３の温度分布関数Ｔ＝ａ×ｈ２＋ｂ×ｈ＋ｃによって算出でき、或いは、以下のステップによって実現できる：
リアルタイムに取得したＴ１とＴ０を比較し、Ｔ１がＴ０より小さいか否かを判断し、小さい場合は昇降装置により細胞保存チューブ６を降下し続け、そうでない場合には昇降装置により細胞保存チューブ６を停止する、
前記ステップＳ３と、
昇降装置により、停止するように細胞保存チューブ６を制御し、Ｔ１とＴ２の差Δｔ（絶対値）が所定の温度差閾値以下になるとＳ２を続行するステップＳ４と、を含む。
【0031】
例えば、本実施例で提供される方法を精子凍結に適用する場合、次のようになる：
１.３人のボランティアから健康な精子２ｍｌをそれぞれ採取し、３７℃のインキュベーター内で自然に液化させる。
２.次に、精子計数ボードを使用して、顕微鏡下で精子の運動率を最初に検出し、検出はサンプルごとに２回繰り返し、毎回の検出では２００個の精子をカウントし、２回検出の測定値を比較し、２回の測定値の誤差率が許容できる範囲内になるまで行う。２回の測定値の誤差率が許容できる範囲内にない場合、検出サンプルを再調製し、再検出する。
３.精子のグレード分け方法は、ａグレード：素早く前進すること、ｂグレード：ゆっくりと前進すること、ｃグレード：その場で揺れること、ｄグレード：動かないことであり、前進運動精子凍結蘇生率（以下、精子凍結蘇生率という）を算出し、計算方法は、精子凍結蘇生率＝（凍結後のａグレード精子の百分率＋凍結後のｂグレード精子の百分率）／（凍結前のａグレード精子の百分率＋凍結前のｂグレード精子の百分率）である。
４.市販の精子保護液と１：１で混合し、それぞれ細胞保存チューブ６に入れて凍結する。
５.第１測温素子７と第２測温素子８を設置して上記ステップに従って凍結し、具体的なプログラムは、１０Ｋ／ｍｉｎの降温速度で、－８０℃まで降温し、２０分間保持することにより予備凍結を完成し、次に、１０Ｋ／ｍｉｎで降温し－１９６℃の液体窒素の中で２週間凍結してから取り出す。
１.３人のボランティアから健康な精子２ｍｌをそれぞれ採取し、３７℃のインキュベーター内で自然に液化させる。
２.次に、精子計数ボードを使用して、顕微鏡下で精子の運動率を最初に検出し、検出はサンプルごとに２回繰り返し、毎回の検出では２００個の精子をカウントし、２回検出の測定値を比較し、２回の測定値の誤差率が許容できる範囲内になるまで行う。２回の測定値の誤差率が許容できる範囲内にない場合、検出サンプルを再調製し、再検出する。
３.精子のグレード分け方法は、ａグレード：素早く前進すること、ｂグレード：ゆっくりと前進すること、ｃグレード：その場で揺れること、ｄグレード：動かないことであり、前進運動精子凍結蘇生率（以下、精子凍結蘇生率という）を算出し、計算方法は、精子凍結蘇生率＝（凍結後のａグレード精子の百分率＋凍結後のｂグレード精子の百分率）／（凍結前のａグレード精子の百分率＋凍結前のｂグレード精子の百分率）である。
４.市販の精子保護液と１：１で混合し、それぞれ細胞保存チューブ６に入れて凍結する。
５.第１測温素子７と第２測温素子８を設置して上記ステップに従って凍結し、具体的なプログラムは、１０Ｋ／ｍｉｎの降温速度で、－８０℃まで降温し、２０分間保持することにより予備凍結を完成し、次に、１０Ｋ／ｍｉｎで降温し－１９６℃の液体窒素の中で２週間凍結してから取り出す。
【0032】
更に、対照組を設置し、人工液体窒素燻蒸法により凍結し、即ち、精子と保護溶液を入れた凍結保存チューブを液体窒素の表面から１０ｃｍ離して１０分間置き、その後、凍結保存チューブを液体窒素の中に浸して、２週間保存後に取り出す。
【0033】
凍結終了した精子は全て３７℃の温水に入れて解凍し、解凍完了後、再度精子凍結蘇生率を計算する。結果は表１に示すとおりである。本実施例の方法を用いて凍結した細胞の蘇生率は、人工液体窒素燻蒸法を用いて凍結した細胞の蘇生率よりも高いことが分かる。
【0034】
【表1】
【0035】
実施例４
実施例４と実施例３の違いは、次のとおりである。本実施例４では、ステップＳ２において、細胞保存チューブ６の内側のＴ１温度を直接取得するのではなく、以下のステップにより間接的に取得する。図３に示すように、具体的に以下のステップを含む。
ステップＳ２１：細胞保存チューブ６と同じ高さの位置に対照チューブ５を配置し、
ステップＳ２２：対照チューブ５内に、熱物性が細胞保存チューブ６内の液体と同じ対照溶液を収容するか、或いは、対照チューブ５内に細胞保存チューブ６と同じ液体を収容し、例えば、好ましくは等量の人工精漿混合液を対照チューブ５に添加し、
ステップＳ２３：測温素子を介して対照チューブ５内の液体の温度を収集し、これが細胞保存チューブ６の内側のＴ１温度となる。
実施例４と実施例３の違いは、次のとおりである。本実施例４では、ステップＳ２において、細胞保存チューブ６の内側のＴ１温度を直接取得するのではなく、以下のステップにより間接的に取得する。図３に示すように、具体的に以下のステップを含む。
ステップＳ２１：細胞保存チューブ６と同じ高さの位置に対照チューブ５を配置し、
ステップＳ２２：対照チューブ５内に、熱物性が細胞保存チューブ６内の液体と同じ対照溶液を収容するか、或いは、対照チューブ５内に細胞保存チューブ６と同じ液体を収容し、例えば、好ましくは等量の人工精漿混合液を対照チューブ５に添加し、
ステップＳ２３：測温素子を介して対照チューブ５内の液体の温度を収集し、これが細胞保存チューブ６の内側のＴ１温度となる。
【0036】
実施例５
実施例５と実施例３との違いは、次のとおりである。本実施例５では、ステップＳ３において、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達した後、更に、ステップＳ５を含み、図４に示すように、具体的には、
ステップＳ５：所定の保温時間長さを待機した後、細胞保存チューブ６は、保温キャビティ３から取り出されるまで、昇降装置により、保温キャビティ３内で上昇するように制御される。
実施例５と実施例３との違いは、次のとおりである。本実施例５では、ステップＳ３において、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達した後、更に、ステップＳ５を含み、図４に示すように、具体的には、
ステップＳ５：所定の保温時間長さを待機した後、細胞保存チューブ６は、保温キャビティ３から取り出されるまで、昇降装置により、保温キャビティ３内で上昇するように制御される。
【0037】
実施例６
本実施例は、細胞プログラム凍結システムを提案し、当該システムは、上記各実施例の方法を実行するために使用される。図５に示すように、システムには、
降温速度ｋ、保温キャビティ３の温度分布関数、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブ６の内側温度であるＴ１と細胞保存チューブ６の外側温度であるＴ２、及び所定の保温温度Ｔ０、所定の温度差閾値と所定の保温時間長さを取得するために使用される取得モジュールと、
Ｔ１とＴ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達しているかどうかを判断するために使用されており、容易に理解できることは、上記各実施例における差Δｔは絶対値である判断モジュールと、
判断モジュールの判断結果に応じて昇降指令を生成し、昇降指令によって、昇降装置が細胞保存チューブ６を保温キャビティ３内で昇降させるように制御するために使用される昇降制御モジュールと、を含む。
本実施例は、細胞プログラム凍結システムを提案し、当該システムは、上記各実施例の方法を実行するために使用される。図５に示すように、システムには、
降温速度ｋ、保温キャビティ３の温度分布関数、同じ時刻及び同じ高さでの細胞保存チューブ６の内側温度であるＴ１と細胞保存チューブ６の外側温度であるＴ２、及び所定の保温温度Ｔ０、所定の温度差閾値と所定の保温時間長さを取得するために使用される取得モジュールと、
Ｔ１とＴ２の差Δｔが所定の温度差閾値を超えているかどうかを判断し、細胞保存チューブ６が所定の保温温度Ｔ０の位置に達しているかどうかを判断するために使用されており、容易に理解できることは、上記各実施例における差Δｔは絶対値である判断モジュールと、
判断モジュールの判断結果に応じて昇降指令を生成し、昇降指令によって、昇降装置が細胞保存チューブ６を保温キャビティ３内で昇降させるように制御するために使用される昇降制御モジュールと、を含む。
【0038】
本発明は、本発明の実施例による方法、機器（システム）、及びコンピュータプログラム製品のフローチャート及び／又はブロック図を参照して説明される。理解されるべきことは、フローチャート及び／又はブロック図内の各手順及び／又はブロック、ならびにローチャート及び／又はブロック図内の手順及び／又はブロックの組み合わせは、コンピュータプログラム指令により実現できる。これらのコンピュータプログラム指令は、汎用コンピュータ、専用コンピュータ、組み込みプロセッサ、又はその他のプログラム可能なデータ処理装置のプロセッサに提供されてマシンを生成することで、コンピュータ又は他のプログラム可能なデータ処理装置のプロセッサによって実行される指令は、フローチャートの１つ又は複数の手順及び／又はブロック図の１つ又は複数のブロックで指定された機能を実現するための装置を生成することができる。
【0039】
これらのコンピュータプログラム指令は、コンピュータ又は他のプログラム可能なデータ処理装置を特定の方法で動作させることができるコンピュータにより読み取り可能なメモリに格納されてもよい。それにより、コンピュータにより読み取り可能なメモリに格納された指令は、指令装置を含む製品を生成する。当該指令装置は、フローチャートにおける一つの又は複数の手順、及び／又はブロック図における一つ又は複数のブロックで指定された機能を実現する。
【0040】
これらのコンピュータプログラム指令は、コンピュータ又は他のプログラム可能なデータ処理装置にロードされて、一連の操作ステップをコンピュータ又はその他のプログラム可能な装置上で実行して、コンピュータ実装プロセスを生成することができる。それにより、コンピュータ又は他のプログラム可能な装置上で実行される指令は、フローチャートの１つ又は複数の手順及び／又はブロック図の１つ又は複数のブロックで指定された機能を実現するためのステップを提供する。
【0041】
以上、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳細に説明したが、本発明はかかる実施形態に限定されない。当業者であれば、本発明の原理及び精神から逸脱することなく、これらの実施形態に対して様々な変更、修正、置換及び変形を行うことができ、それらも本発明の保護範囲内に含まれる。
【符号の説明】
【0042】
１ 制御装置、２ 表示画面、３ 保温キャビティ、４ チューブラック、５ 対照チューブ、６ 細胞保存チューブ、７ 第１測温素子、８ 第２測温素子、９ 湾曲アーム、１０ スライダ、１１ スクリュー、１２ ガイドレール、１３ モータ、１４ 台座。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】