特表 2024-520400 新規な酢酸代謝調節因子Ａ変異体及びそれを用いたＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】新規な酢酸代謝調節因子Ａ変異体及びそれを用いたＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/34 20060101AFI20240517BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240517BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C07K14/34 ZNA

C12N15/31

C12N1/21

C12P21/02 C

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572664

(86)(22)【出願日】2022-07-22

(85)【翻訳文提出日】2023-11-22

(86)【国際出願番号】 KR2022010784

(87)【国際公開番号】W WO2023027348

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】10-2021-0114069

(32)【優先日】2021-08-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】イ、ヒソク

(72)【発明者】

【氏名】キム、ソン ヘ

(72)【発明者】

【氏名】チェ、スン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジュ－ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ビョン フン

(72)【発明者】

【氏名】シム、ジヒョン

(72)【発明者】

【氏名】オ、ヘナ

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ヒョジン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AE03

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA20

4B065AA24X

4B065AA24Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA17

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA11

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、新規な酢酸代謝調節因子Ａ変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記変異体または上記ポリヌクレオチドを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物及び上記微生物を用いたＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のアミノ酸配列で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された酢酸代謝調節因子Ａ変異体。

【請求項2】

前記変異体は、配列番号３のアミノ酸配列で５２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸でさらに置換された、請求項１に記載の変異体。

【請求項3】

前記変異体は、配列番号３の５６番目の位置に対応するアミノ酸がアラニンで置換された、請求項１に記載の変異体。

【請求項4】

前記変異体は、配列番号３の５６番目の位置に対応するアミノ酸がアラニンで、５２番目の位置に対応するアミノ酸がバリンで置換された、請求項２に記載の変異体。

【請求項5】

前記変異体は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の変異体。

【請求項6】

前記変異体は、配列番号５で記載されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の変異体。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項8】

請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物。

【請求項9】

前記微生物は、配列番号３のポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物と比較してＬ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した、請求項８に記載のＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物。

【請求項10】

前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物である、請求項８に記載のＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物。

【請求項11】

前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１０に記載のＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物。

【請求項12】

請求項８に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産方法。

【請求項13】

前記培地から目的物質を回収する段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、新規な酢酸代謝調節因子Ａ変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記変異体または上記ポリヌクレオチドを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物及び上記微生物を用いたＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－アミノ酸はタンパク質の基本構成単位であり、薬品原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。特に、分岐鎖アミノ酸（Ｂｒａｃｈｅｄ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，ＢＣＡＡ）は、必須アミノ酸であるＬ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンを総称するものであり、上記分岐鎖アミノ酸は、抗酸化効果及び筋肉細胞のタンパク質合成作用を直接的に促進させる効果があることが知られている。

【0003】

一方、微生物を用いた分岐鎖アミノ酸の生産は、主に、エシェリキア属微生物またはコリネバクテリウム属微生物を通じて行われ、ピルビン酸から複数の段階を経てケトイソカプロン酸（２－ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏａｔｅ）を前駆体として生合成されることが知られている［大韓民国特許登録番号第１０－０２２００１８号、大韓民国特許登録番号第１０－０４３８１４６号］。しかし、上記微生物を通じたＬ－分岐鎖アミノ酸の生産は、工業的に大量製造が容易ではない問題がある。

【0004】

このような背景の下で、本発明者らは、微生物を用いたＬ－分岐鎖アミノ酸の生産能を向上させるための目的で微生物の酢酸代謝調節因子Ａ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａ、以下ＲａｍＡ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００６ Ａｐｒ；１８８（７）：２５５４－６７．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０１８） １０２：５９０１－５９１０）活性が強化された変異型を導入した時、Ｌ－分岐鎖アミノ酸の生産能が顕著に増加することを確認した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】大韓民国特許登録番号第１０－０２２００１８号

【特許文献2】大韓民国特許登録番号第１０－０４３８１４６号

【特許文献3】米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２

【特許文献4】米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２

【特許文献5】米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２

【特許文献6】大韓民国登録特許第１０－１１１７０２２号

【特許文献7】大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号

【特許文献8】国際公開特許第２００８－０３３００１号

【特許文献9】大韓民国登録特許第１０－１３３５７８９号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】J Bacteriol. 2006 Apr;188(7):2554-67.,Applied Microbiology and Biotechnology (2018) 102:5901-5910

【非特許文献2】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444

【非特許文献3】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【非特許文献4】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献5】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献6】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献7】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献8】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献9】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献10】Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358 (1979)

【非特許文献11】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745

【非特許文献12】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual、2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York、1989

【非特許文献13】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York、9.50-9.51,11.7-11.8

【非特許文献14】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16

【非特許文献15】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012

【非特許文献16】“Manual of Methods for General Bacteriology”by the American Society for Bacteriology (Washington D.C.,USA、1981)

【非特許文献17】Metabolic Engineering,Volume 48,2018,Pages 1-12,ISSN 1096-7176,https://doi.org/10.1016/j.ymben.2018.05.004.

【非特許文献18】van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999

【非特許文献19】ilvN(A42V);Biotechnology and Biopr℃ess Engineering,June 2014,Volume 19,Issue 3,pp 456-467

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、Ｌ－分岐鎖アミノ酸の生産を増大させる新規な酢酸代謝調節因子Ａ変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記変異体または上記ポリヌクレオチドを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物及び上記微生物を用いたＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法を開発し、本出願を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願の一つの目的は、配列番号３のアミノ酸配列で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された酢酸代謝調節因子Ａ変異体を提供することにある。

【0009】

本出願のもう一つの目的は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

【0010】

本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体または上記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物を提供することにある。

【0011】

本出願の他の一つの目的は、上記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産方法を提供することにある。

【0012】

本出願の他の一つの目的は、本出願の変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；これを培養した培地；またはこれらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用組成物を提供することにある。

【0013】

本出願の他の一つの目的は、配列番号３のアミノ酸配列で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された酢酸代謝調節因子Ａ変異体のＬ－分岐鎖アミノ酸生産用途を提供することにある。

【発明の効果】

【0014】

本出願の酢酸代謝調節因子Ａの変異体を含む、微生物を培養する場合、既存の非変形ポリペプチドを有する微生物に比べて高収率のＬ－分岐鎖アミノ酸の生産が可能である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

これを具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。また、本明細書全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【0016】

本出願の一つの様態は、配列番号３のアミノ酸配列で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された酢酸代謝調節因子Ａ変異体を提供する。

【0017】

本出願の上記変異体は、既存の酢酸代謝調節因子Ａアミノ酸配列において、特異的位置のアミノ酸が置換されて活性が強化されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0018】

一つの具現例として、上記酢酸代謝調節因子Ａ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列に１以上または２以上のアミノ酸の置換を含む、酢酸代謝調節因子Ａ変異体であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0019】

具体的には、本出願の変異体は、配列番号３の５６番目の位置及び／又は５２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、上記変異体は、上記位置においていずれか一つ以上または二つの位置の両方またはこれらの対応する位置で他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0020】

上記「他のアミノ酸」は、置換前のアミノ酸と異なるものであれば、制限されない。例えば、「配列番号３で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された」と記載する場合、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）を除いたフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパルテート（ａｓｐａｒｔａｔｅ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、バリン（ｖａｌｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）またはスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）で置換されることを意味し、「配列番号３で５２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された」と記載する場合、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）を除いたアスパラギン、グリシン、アルギニン、アスパルテート、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、メチオニンまたはスレオニンで置換されることを意味してもよいが、これに制限されるものではない。

【0021】

一方、当業者であれば、当業界に知られている配列アラインメントを通じて任意のアミノ酸配列で本出願の配列番号３の５６番目、５２番目の位置に対応するアミノ酸を把握でき、本出願において別途に記載しなくても「特定配列番号で特異的位置のアミノ酸」を記載する場合、任意のアミノ酸配列においてそれと「対応する位置のアミノ酸」まで含む意味であることは自明である。したがって、配列番号３の５６番目、５２番目の位置に対応するアミノ酸で構成された群から選択されるいずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列も本出願の範囲に含まれる。

【0022】

一例として、配列番号３の５６番目、５２番目の位置に対応するアミノ酸中、１以上または２以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合、非置換された（非変形された）アミノ酸配列よりさらに高い活性を有する変異体を提供することができる。

【0023】

具体的には、本出願の変異体は、上記配列番号３の５６番目、５２番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0024】

具体的な例として、本出願の変異体は、配列番号３の５６番目の位置に対応するアミノ酸であるロイシンがアラニンで、５２番目の位置に対応するアミノ酸であるアラニンがバリンで置換されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0025】

より具体的な例として、本出願の変異体は、配列番号１または配列番号５と記載されたアミノ酸配列を有したり、上記アミノ酸配列で必須的に構成され（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）てもよい。

【0026】

また、本出願の変異体は、上記配列番号１または配列番号５で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号３のＮ－末端から５６番のアミノ酸及び／又は５２番のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたことを含むことができる。また、このような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0027】

例えば、上記アミノ酸配列のＮ－末端、Ｃ－末端そして／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然的に発生しうる突然変異、潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。

【0028】

本出願において用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び／又は化学的性質を有するもう一つのアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて発生することができる。例えば、正で荷電された（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リシン、及びヒスチジンを含み；負で荷電された（酸性）アミノ酸はグルタミン酸及びアスパルテートを含み；芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含み、疎水性アミノ酸はアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。また、アミノ酸は、電荷を帯びる（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸と電荷を帯びない（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸に分類することができ、電荷を帯びる側鎖を有するアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンを含み、電荷を帯びない側鎖を有するアミノ酸は、さらに非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸または極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ）に分類することができ、非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンを含むものに分類することができる。通常、保存性置換は、生成されたポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさなかいか、または影響を及ぼさない。通常、保存的置換は、タンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。

【0029】

また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含むことができる。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与するタンパク質Ｎ－末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートすることができる。また、上記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製、または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートできる。

【0030】

本出願において用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、上記変異体の変異前のアミノ酸配列と相違するが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを指す。このような変異体は、一般に、上記ポリペプチドのアミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸を変形し、上記変形されたポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）され得る。即ち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変わらなかったり、または減少する。また、一部の変異体は、Ｎ－末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）のような一つ以上の部分が除去された変異体を含むことができる。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ－及び／又はＣ－末端から一部分が除去された変異体を含むことができる。上記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異されたタンパク質、変異及び変異体などの用語（英文表現ではｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｕｔａｎｔ，ｍｕｔｅｉｎ，ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）が混用されてもよく、変異された意味で用いられる用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、上記変異体は、配列番号３の５６番目の位置に対応するアミノ酸であるロイシンがアラニンで置換された、配列番号１で記載されたアミノ酸配列；または配列番号３の５６番目の位置に対応するアミノ酸であるロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）がアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）で置換され、５２番目の位置に対応するアミノ酸であるアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）がバリン（ｖａｌｉｎｅ）で置換された、配列番号５；で記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。

【0031】

また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含むことができる。例えば、変異体のＮ－末端には翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートできる。また、上記変異体は、確認、精製、または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートできる。

【0032】

本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似の程度を意味し、百分率で表示することができる。用語、相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に利用され得る。

【0033】

保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用できる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列全体または一部分と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドで一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。

【0034】

任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。

【0035】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ（１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）２進法比較マトリックス（同一性のために１そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８（１９７９）により開示された通り、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０，ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。

【0036】

本出願の一例として、本出願の変異体は、酢酸代謝調節因子Ａ活性を有することができる。また、本出願の変異体は、酢酸代謝調節因子Ａ活性を有する野生型ポリペプチドに比べてＬ－分岐鎖アミノ酸生産能を増加させる活性を有することができる。

【0037】

本出願において、用語「酢酸代謝調節因子Ａ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｅｔａｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ａ）」は、本出願の目的タンパク質として酢酸代謝に関連した調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味し、ｒａｍＡ遺伝子によりコードすることができる。

【0038】

本出願において、上記酢酸代謝調節体Ａは、その発現が強化されてもよく、上記発現の強化によりＬ－分岐鎖アミノ酸の生産能の増加をもたらすことができる。

【0039】

本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することであってもよい。本出願に用いられた「対応領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。

【0040】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号３と整列（ａｌｉｇｎ）し、これに基づいて上記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号３のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）と比較してアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。

【0041】

このような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅｍａｎプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）などを利用することができるが、これに制限させず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適切に用いることができる。

【0042】

本出願のもう一つの様態は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することである。

【0043】

本出願において用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、上記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

【0044】

本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号５で記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことができる。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号６の配列を有したり含むことができる。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号６の配列からなるか、必須的に構成されてもよい。

【0045】

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有したり含んだり、または配列番号２または配列番号６の配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列で構成されても必須的に構成されてもよいが、これに制限されない。この時、上記相同性または同一性を有する配列において、配列番号１または配列番号５の５６番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、アラニンをコードするコドン中の一つであってもよく、配列番号５の５２番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、バリンをコードするコドン中の一つであってもよい。

【0046】

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造されてもよいプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションできる配列であれば、制限なく含まれ得る。上記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性が低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。

【0047】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドはまた、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。

【0048】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用いて上述の条件を用いて探知することができる。また、上記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適切に調節することができる。

【0049】

上記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は、当該技術分野によく知られている（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上）。

【0050】

本出願のもう一つの態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。上記ベクターは、上記ポリヌクレオチドを微生物で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに制限されない。

【0051】

本出願において用語「ベクター」は、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように適した発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含むことができる。上記発現調節領域は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な微生物内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係がなく複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。

【0052】

本出願で用いられるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。

【0053】

一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これに限定されない。上記染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入の有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。

【0054】

本出願において用語「形質転換」は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを微生物内に導入して微生物内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、微生物内で発現できれば、微生物の染色体内に挿入されて位置したり染色体外に位置したりに関係なくこれらすべてを含むことができる。また、上記ポリヌクレオチドは、目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、微生物内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態でも導入することができる。例えば、上記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で微生物に導入することができる。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができる。上記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で微生物に導入されて微生物で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。

【0055】

また、上記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。

【0056】

本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを含む、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産用微生物を提供することである。

【0057】

具体的には、上記微生物は、コリネバクテリウム属微生物、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0058】

本出願の微生物は、本出願の変異型ポリペプチド、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含むことができる。

【0059】

本出願において用語「微生物（または、菌株）」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因により特定の機序が弱化されたり強化された微生物であり、目的とするポリペプチド、タンパク質または産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。

【0060】

本出願の菌株は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクター中のいずれか一つ以上を含む菌株；本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを発現するように変形された菌株；本出願の変異体、または本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これに制限されない。

【0061】

本出願の菌株は、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産能を有する菌株であってもよい。

【0062】

本出願の菌株は、自然的に酢酸代謝調節因子ＡまたはＬ－分岐鎖アミノ酸生産能を有している微生物、または酢酸代謝調節因子ＡまたはＬ－分岐鎖アミノ酸生産能がない親株に本出願の変異体またはこれをコードするポリヌクレオチド（または上記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されたり及び／又はＬ－分岐鎖アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよいが、これに制限されない。

【0063】

一例として、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含めてＬ－分岐鎖アミノ酸を生産できる微生物をすべて含むことができる。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物またはＬ－分岐鎖アミノ酸を生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることにより酢酸代謝調節因子Ａ変異体が発現し、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した組換え菌株であってもよい。上記Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物または酢酸代謝調節因子Ａ非変形微生物（即ち、野生型酢酸代謝調節因子Ａ（配列番号３）を発現する微生物または変異型（配列番号１または配列番号５）タンパク質を発現しない微生物）に比べてＬ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。一例として、本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した菌株は、配列番号３のポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物と比較してＬ－分岐鎖アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されない。

【0064】

一例として、上記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物のＬ－分岐鎖アミノ酸生産能に比べて約１％以上、具体的には、約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上、約１４％以上、約１４．１％以上、約１４．２％以上、約１４．３％以上、約１４．４％以上、約１４．５％以上または約１４．６％以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下または約１５％以下であってもよい）増加したものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。他の例において、上記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物に比べて、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産能が約１．１倍以上、約１．１２倍以上、約１．１３倍以上または１．１４倍以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、約２倍以下、約１．５倍以下または約１．２倍以下であってもよい）増加したものであってもよいが、これに制限されない。上記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であり、約という用語の後に出てくる数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むが、これに制限されない。

【0065】

本出願において用語「非変形微生物」は、微生物に自然的に発生しうる突然変異を含む菌株を除くものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味し得る。例えば、上記非変形微生物は、本明細書に記載された酢酸代謝調節因子Ａ変異体が導入されていないか、導入される前の菌株を意味し得る。上記「非変形微生物」は「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。

【0066】

本出願のまた他の一例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。

【0067】

本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」は、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。上記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上向き調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上向き調節、過発現、増加は、本来有していなかった活性を示すことになること、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すことになることをすべて含むことができる。上記「内在的活性」は、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「強化」、「上向き調節」、「過発現」または「増加」するとは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。

【0068】

上記強化は、外来のポリペプチドを導入したり、内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。上記ポリペプチドの活性の強化の有無は、当該ポリペプチドの活性程度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。

【0069】

上記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野によく知られた多様な方法の適用が可能であり、目的ポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したことであってもよいが、これに制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０，Ｖｏｌ． ２． １－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。

【0070】

具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。

【0071】

より具体的には、
上記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と関係がなく複製され、機能できるベクターの微生物内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されることであってもよい。上記染色体内への導入は、微生物内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが微生物内に導入されることにより行われてもよいが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。

【0072】

上記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性が強力な配列での交換は、例えば、上記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有する配列での交換であってもよい。上記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、そして転写及び解読の終結を調節する配列などを含むことができる。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターで交換させることであってもよいが、これに制限されない。

【0073】

公知となった強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これに制限されない。

【0074】

上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これに制限されない。

【0075】

上記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異発生、またはさらに強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列での交換であってもよいが、これに限定されるものではない。上記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われてもよいが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含むことができる。上記選別マーカーは、前述した通りである。

【0076】

上記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、上記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの微生物内への導入であってもよい。上記外来ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限がない。上記導入に利用される方法は、公知となった形質転換方法を当業者が適切に選択して行われてもよく、宿主細胞内で上記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成され、その活性が増加する。

【0077】

上記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが微生物内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したことであるか、または外来ポリヌクレオチドが微生物内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したことであってもよい。

【0078】

上記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を公知のタンパク質の配列情報が保存されたデータベースと比較することにより配列の類似性程度に応じて鋳型タンパク質候補を決定し、これに基づいて構造を確認し、変形したり化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。

【0079】

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現したポリペプチドの活性または濃度を基準として増加したり、当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加されることであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0080】

本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全体の変形は、（ａ）微生物内染色体挿入用ベクターを利用した相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を利用したゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質処理により誘導されてもよいが、これに制限されない。上記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれてもよい。例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを上記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起きるようにすることにより遺伝子の一部または全体の欠損が行われる。上記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0081】

本出願の微生物において、変異体、ポリヌクレオチド及びＬ－分岐鎖アミノ酸などは、上記他の様態で記載した通りである。

【0082】

本出願のもう一つの態様は、上記微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－分岐鎖アミノ酸生産方法を提供する。

【0083】

具体的には、本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドまたは本出願のベクターを含むコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を培地で培養する段階を含んでもよいが、これに制限されるものではない。

【0084】

本出願において、用語「培養」は、本出願の微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行われる。このような培養過程は、選択される菌株により当業者が容易に調整して用いることができる。具体的には、上記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0085】

本出願において用語、「培地」は、本出願の微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水を始めとして栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば、特別な制限なくいずれも用いられるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節して培養することができる。

【0086】

例えば、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）］で調べることができる。

【0087】

本出願において、上記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などが含まれ得る。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いてもよく、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（即ち、還元糖で転換された糖蜜）などのような炭水化物が用いられてもよく、その他の適正量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これら炭素源は、単独で用いられても２種以上を組合わせて用いられてもよく、これに限定されるものではない。

【0088】

上記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が用いられる。これら窒素源は、単独で用いられても２種以上を組合わせて用いられてもよく、これに限定されるものではない。

【0089】

上記リン源としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、またはこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられてもよく、その他に、アミノ酸、ビタミン及び／又は適切な前駆体などが含まれてもよい。これら構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。

【0090】

また、本出願の微生物の培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよく、これに限定されるものではない。

【0091】

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持してもよく、約１０～１６０時間培養してもよいが、これに限定されるものではない。

【0092】

本出願の培養により生産されたＬ－分岐鎖アミノ酸は、培地中に分泌されたり細胞内に残留することができる。

【0093】

本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、上記菌株を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（手順に無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、上記培養する段階以前に、さらに含むことができる。

【0094】

本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法は、上記培養による培地（培養が行われた培地）または本出願の微生物からＬ－分岐鎖アミノ酸を回収する段階をさらに含むことができる。上記回収する段階は、上記培養する段階後にさらに含んでもよい。

【0095】

上記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して目的とするＬ－分岐鎖アミノ酸を収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはこれらの方法を組み合わせて用いられてもよく、当該分野に公知となった適切な方法を利用して培地または微生物から目的とするＬ－分岐鎖アミノ酸を回収することができる。

【0096】

また、本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法は、追加的に精製段階を含むことができる。上記精製は、当該技術分野に公知となった適切な方法を利用して行うことができる。一例において、本出願のＬ－分岐鎖アミノ酸生産方法が回収段階と精製段階をすべて含む場合、上記回収段階と精製段階は、手順に関係なく連続的または非連続的に行われても、同時にまたは一つの段階で統合されて行われてもよいが、これに制限されるものではない。

【0097】

本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物などは、上記他の様態で記載した通りである。

【0098】

本出願のもう一つの態様は、本出願の変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクターまたは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物；これを培養した培地；またはこれらのうちの２以上の組み合わせを含むＬ－分岐鎖アミノ酸生産用組成物を提供することである。

【0099】

本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適した賦形剤をさらに含んでもよく、このような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0100】

本出願の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地及びＬ－分岐鎖アミノ酸などは、上記他の様態で記載した通りである。

【0101】

本出願の他の一つの目的は、配列番号３のアミノ酸配列で５６番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された酢酸代謝調節因子Ａ変異体のＬ－分岐鎖アミノ酸生産用途を提供することにある。

【0102】

本出願の用途において、変異体及びＬ－分岐鎖アミノ酸などは、上記他の様態で記載した通りである。

【0103】

以下、本出願を実施例により、より詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定するとは意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解して容易に行うことができる。

【0104】

実施例１． 人工変異法を通じたバリン生産能増加変異株の選別
実施例１－１． ＵＶ照射を通じた人工突然変異の誘発
バリン生産能が増加した変異株を選別するために、バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（大韓民国登録特許第１０－１１１７０２２号）を寒天を含む栄養培地に塗抹して３０℃で３６時間培養した。次いで、得られた数百個のコロニーを室温でＵＶを照射して菌株内ゲノム上にランダム為突然変異を誘発させた。

【0105】

実施例１－２． 突然変異誘発菌株の発酵力価の評価及び菌株選別
親株として用いられたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに比べてＬ－バリンの生産能が増加した変異株を選別するために、ランダム突然変異が誘発された菌株を対象に発酵力価の実験を行った。それぞれのコロニーは栄養培地で継代培養された後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。上記栄養培地及び生産培地の組成は、下記の通りである。

【0106】

［栄養培地（ｐＨ ７．２）］
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0107】

［生産培地（ｐＨ ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0108】

培養終了後、ＨＰＬＣを利用してＬ－バリンの生産量を測定し、分析したＬ－バリンの濃度は、下記表１の通りである。

【0109】

【表1】

【0110】

上記の表１で示されるように、対照群であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株に比べてバリン生産量が最も多く増加したＣ１３菌株を選別した。

【0111】

実施例２． 遺伝子シーケンシングを通じた変異確認
バリン生産能が増加した上記Ｃ１３菌株の主な遺伝子をシーケンシングしてＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７野生型菌株と比較した。その結果、上記Ｃ１３菌株はｒａｍＡ遺伝子ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）領域の特定位置に塩基配列変異を含めていることを確認した。具体的には、Ｃ１３菌株は、上記ｒａｍＡ遺伝子の開始コドンから下位１６６－１６７ｂｐに位置した塩基配列に２個の変異が導入され、既存のＣＴＧからＧＣＧに変わり、Ｎ末端から５６番目のアミノ酸であるロイシンがアラニンで置換された形態の酢酸代謝調節因子Ａ（ｒａｍＡ）変異体であることを確認した。

【0112】

上記変異領域を分析して見た結果、酢酸代謝調節因子Ａタンパク質のＥｆｆｅｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎに影響を与えることが確認され、当該タンパク質の活性が強化されると予想した。

【0113】

実施例３． ｒａｍＡ変異が導入されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株製作及びバリン生産能の確認
実施例３－１． コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株でｒａｍ Ａ変異が導入された菌株製作及びＬ－バリン生産能の評価
配列番号１で示されるｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）変異型をグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに挿入するために、ターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、上記Ｃ１３菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ． Ｎｏ １７０４５）を利用してキットに提供されたプロトコルにより抽出し、上記ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号７と配列番号８を利用して１０００ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片１」と命名する）を得た。

【0114】

上記得られた変異導入断片１を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクター（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号及び国際公開特許第２００８－０３３００１号）とＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を利用してライゲーションした。上記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得て上記変異導入断片１を含むベクターｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）を製造した。

【0115】

【表2】

【0116】

次いで、既に公知となったリシンを生産能に関連したｒａｍＡ遺伝子の５２番目のアミノ酸であるアラニンがバリンで変異されたｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ）（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ ４８，２０１８，Ｐａｇｅｓ １－１２，ＩＳＳＮ １０９６－７１７６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｂｅｎ．２０１８．０５．００４．）変異型をさらにグルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに導入するためにターゲット変異を含むベクターを製作した。具体的には、Ｃ１３菌株のゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ． Ｎｏ １７０４５）を利用してキットに提供されたプロトコルにより抽出し、上記ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で１５０秒間重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行い、配列番号９と配列番号１０を利用して５０２ｂｐのＰＣＲ結果（以下、「変異導入断片２」と命名する）及び配列番号１１と配列番号１２を利用して５００ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片３」と命名する）をそれぞれ得た。

【0117】

上記得られた変異導入断片２、３を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理されたｐＤＺベクター（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号及び国際公開特許第２００８－０３３００１号）とＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。上記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得て上記変異導入断片２、３を含むベクターｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）を製造した。

【0118】

【表3】

【0119】

次いで、上記ｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号７と配列番号８を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｒａｍＡ遺伝子のＯＲＦ内の配列番号３のアミノ酸５６番の位置にロイシンがアラニンで置換された菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）と命名した。

【0120】

上記ｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号９と配列番号１２を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｒａｍＡ遺伝子のＯＲＦ内の配列番号３のアミノ酸５２番の位置にアラニンがバリンで、アミノ酸５６番の位置にロイシンがアラニンでそれぞれ置換された菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）と命名した。

【0121】

バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）のバリン生産能を比較するために、フラスコ評価を行った。それぞれ菌株を栄養培地で継代培養した後、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。

【0122】

［栄養培地（ｐＨ ７．２）］
ブドウ糖１０ｇ、肉抽出物５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母抽出物５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0123】

［生産培地（ｐＨ ７．０）］
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、とうもろこし浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン－ＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）

【0124】

培養終了後、ＨＰＬＣを利用してＬ－バリンの生産能を測定した。分析したＬ－バリンの濃度は、下記表４の通りである。

【0125】

【表4】

【0126】

上記の表４で示されるように、変異体が導入されたＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）菌株のＬ－バリン生産能は、親株である野生型菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ比それぞれ１１％、１４．６％増加することを確認した。

【0127】

実施例３－２：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ菌株でＲａｍＡ変異が導入された菌株製作及びＬ－バリン生産能の評価
Ｌ－バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株でもＬ－バリン生産能増加効果があるかどうかを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒ℃ｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７］を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した。

【0128】

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡをＧ－ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Ｉｎｔｒｏｎ社、Ｃａｔ． Ｎｏ １７０４５）を利用してキットに提供されたプロトコルにより抽出した。上記ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ｉｌｖＮ遺伝子にＡ４２Ｖ変異を導入するベクターを製作するために、配列番号１３と配列番号１４のプライマー対及び配列番号１５と配列番号１６のプライマー対を利用して遺伝子断片（Ａ、Ｂ）をそれぞれ得た。ＰＣＲの条件は、９４℃で５分間変性した後；９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で６０秒間の重合を２５回繰り返した後；７２℃で７分間重合反応を行った。

【0129】

その結果、断片Ａ、Ｂのいずれも５３７ｂｐのポリヌクレオチドが得られた。上記二つの断片を鋳型に配列番号１３と配列番号１６を利用してオーバーラッピング（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行い、１０４４ｂｐのＰＣＲ結果物（以下、「変異導入断片２」と命名する）を得た。

【0130】

上記得られた変異導入断片２を制限酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で処理した後、同一の制限酵素で処理されたｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を利用してライゲーションした。上記製作した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた後、これをカナマイシン含有ＬＢ培地で選別し、ＤＮＡ－ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（ｉＮｔＲＯＮ社）でＤＮＡを得た。上記ｉｌｖＮ遺伝子のＡ４２Ｖ変異の導入を目的とするベクターをｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。

【0131】

【表5】

【0132】

その後、上記ｐＤＺ－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を染色体上における相同組換えにより野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号１３と配列番号１６を利用したＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列分析を通じて変異挿入菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖと命名した。

【0133】

次いで、上記コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを上記実施例３－１のような方法でそれぞれのベクターを形質転換させた菌株を製作し、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）、ＣＪ７Ｖ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）と命名した。製作された菌株のＬ－バリン生産能を比較するために、上記実施例３－１と同様の方法で培養してＬ－バリンの濃度を分析し、分析したＬ－バリンの濃度を下記表６に示した。

【0134】

【表6】

【0135】

上記の表６で示されるように、変異体が導入されたＣＪ７Ｖ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）及びＣＪ７Ｖ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）菌株のＬ－バリン生産能は、ＣＪ７Ｖ菌株比それぞれ８．５％、１２．３％増加することを確認した。

【0136】

実施例４． Ｌ－イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ菌株でｒａｍＡ変異が導入された菌株の製作及びＬ－イソロイシン生産能の評価
Ｌ－イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカム菌株でＬ－イソロイシン生産能増加効果があるかどうかを確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＬ－イソロイシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（大韓民国登録特許第１０－１３３５７８９号）にｒａｍＡ変異が導入された菌株を製作した。

【0137】

具体的には、上記実施例３－１で製作したベクターｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号７と配列番号８を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｒａｍＡ遺伝子のＯＲＦ内の配列番号３のアミノ酸５６番の位置にロイシンがアラニンで置換された菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）と命名した。

【0138】

上記実施例３－１で製作したベクターｐＤＺ－ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）を染色体上における相同組換えによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した培地で選別した。その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号９と配列番号１２を利用したＰＣＲを通じて染色体上でｒａｍＡ遺伝子のＯＲＦ内の配列番号３のアミノ酸５２番の位置にアラニンがバリンで、アミノ酸５６番の位置にロイシンがアラニンでそれぞれ置換された菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）と命名した。

【0139】

イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）のイソロイシン生産能を比較するためにフラスコ評価を行った。イソロイシン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３２℃で６０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。

【0140】

［生産培地（ｐＨ ７．２）］
ブドウ糖１００ｇ、酵母抽出物２ｇ、硫酸アンモニウム１６ｇ、第一リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩１ｇ、硫酸鉄７水塩１０ｍｇ、硫酸マンガン１水塩１０ｍｇ、ビオチン２００μｇ （蒸溜水１リットル基準）

【0141】

培養終了後、ＨＰＬＣを利用してＬ－イソロイシンの生産能を測定した。分析したＬ－イソロイシンの濃度は、下記表７の通りである。

【0142】

【表7】

【0143】

上記の表７で示されるように、変異体が導入されたＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ｌ５６Ａ）及びＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：ｒａｍＡ（Ａ５２Ｖ＋Ｌ５６Ａ）菌株のＬ－イソロイシン生産能は、親株であるＫＣＣＭ１１２４８Ｐ比それぞれ６．８％、１３．６％増加することを確認した。

【0144】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【配列表】

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【国際調査報告】