▶ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズの特許一覧
特表2024-520423弱接着細胞を収容するための二次マトリックスを有する生分解性組織スキャフォールド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】弱接着細胞を収容するための二次マトリックスを有する生分解性組織スキャフォールド
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20240517BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20240517BHJP
A61L 27/18 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/56 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/44 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/34 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20240517BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20240517BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240517BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240517BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20240517BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240517BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12N5/079
A61L27/18
A61L27/56
A61L27/58
A61L27/44
A61L27/22
A61L27/34
A61L27/38 200
A61L27/38 300
A61L27/38 100
A61L27/36 100
A61P27/02
A61P27/06
A61K35/30
A61K47/34
A61K47/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572792
(86)(22)【出願日】2022-05-26
(85)【翻訳文提出日】2024-01-23
(86)【国際出願番号】 US2022031107
(87)【国際公開番号】W WO2022251477
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】63/194,770
(32)【優先日】2021-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514144836
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マミニシュキス， アルヴィーダス
(72)【発明者】
【氏名】バーティ， カピル
(72)【発明者】
【氏名】オルトラン， ダビデ
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ， ルチ
(72)【発明者】
【氏名】グエン， エリック
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C076
4C081
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B029DG08
4B029GA08
4B029GB09
4B065AA90X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BB40
4B065BC42
4B065CA44
4C076AA99
4C076BB24
4C076CC10
4C076EE21
4C076EE24
4C081AB21
4C081BA16
4C081CA16
4C081CA17
4C081CA20
4C081CD112
4C081CD172
4C081CD34
4C081DA02
4C081DB03
4C081DC03
4C081DC04
4C081EA01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB56
4C087BB64
4C087MA05
4C087MA67
4C087NA14
4C087ZA33
(57)【要約】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞、またはその両方を付着させるための２つの層を含むスキャフォールドが提供される。スキャフォールドは、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む第１の層と、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを含む第２の層とを含む。成熟ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を含有するスキャフォールドを対象の眼に移植して、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
約０．２５：３～３：０．２５のＤＬ－ラクチド／グリコリド比および少なくとも約１５０ｎｍの繊維径を有するポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む、高さが少なくとも約５ミクロン、直径が少なくとも約０．２ミクロンの平均孔径を有する第１の層と、前記第１の層に付着された、少なくとも約５ミクロンの直径を有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを含む第２の層と、
を含む、スキャフォールド。
【請求項2】
前記第１の層が、約５～約４０ミクロンの高さを有する、請求項１に記載のスキャフォールド。
【請求項3】
前記ＰＬＧＡが、約１：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比を有する、請求項１または２に記載のスキャフォールド。
【請求項4】
前記ＰＬＧＡが、約０．２～２ミクロンの平均孔径を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項5】
前記ＰＬＧＡが、約１５０～約６５０ｎｍの繊維径を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項6】
前記ＰＣＬループが約５～約３００ミクロンの直径を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項7】
前記第２の層が、電界紡糸または化学エッチングを使用して前記第１の層に付着される、請求項１～５のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項8】
前記電界紡糸が、少なくとも５ｋＶの電界電圧、
少なくとも１０ｋＰａ（例えば、約１００ｋＰａ～約４００ｋＰａ）のガス噴出圧力、
少なくとも１０ｍｍのノズルとＰＬＧＡスキャフォールドとの間の作業距離、および
少なくとも２分間の電界紡糸時間、
を含む、請求項７に記載のスキャフォールド。
【請求項9】
細胞接着タンパク質のコーティングをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項10】
前記細胞接着タンパク質が、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせである、請求項９に記載のスキャフォールド。
【請求項11】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞、またはＲＰＥ細胞とＰＲＰ細胞の両方をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項12】
前記スキャフォールドが、少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、
少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または
少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞と少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞
をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項13】
前記ＲＰＥ細胞が、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞である、請求項１１～１２のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項14】
前記ＲＰＥ細胞が、黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞であり、ａ）多能性幹細胞を網膜誘導培地中で培養して、前記細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させる工程；
ｂ）前記ＲＰＥ前駆細胞を網膜分化培地中で培養して、前記ＲＰＥ前駆細胞を拘束ＲＰＥ細胞にさらに分化させる工程；
ｃ）前記拘束ＲＰＥ細胞を網膜培地中で培養して未成熟ＲＰＥ細胞を形成する工程；ならびに
ｄ）前記未成熟ＲＰＥ細胞をレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で培養し、それによりヒトＲＰＥ細胞を産生する工程；を含む方法によって生成され、
前記ヒトＲＰＥ細胞が、黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞であり、
前記培養工程が、前記スキャフォールド上で実施され得、前記方法が、前記多能性幹細胞を前記スキャフォールド上に播種する工程を含み、前記黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞が前記スキャフォールド上で成熟するか、または前記培養工程が前記スキャフォールド上で実施されず、前記黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞が前記スキャフォールド上に播種される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項15】
前記幹細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１４に記載のスキャフォールド。
【請求項16】
前記ＲＡＲアンタゴニストが、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、またはリアロゾールジヒドロクロリドである、請求項１４または請求項１５に記載のスキャフォールド。
【請求項17】
前記カノニカルＷｎｔ阻害剤が、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、またはＴＣ－Ｅ ５００１である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項18】
前記ＲＰＥ成熟培地が少なくとも１つの一次繊毛インデューサーを含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のスキャフォールド。
【請求項19】
前記少なくとも１つの一次繊毛インデューサーがプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィディコリンである、請求項１８に記載のスキャフォールド。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか１項に記載のスキャフォールドを含む、非生分解性多孔質ポリカーボネート膜。
【請求項21】
請求項１～１９のいずれか１項に記載のスキャフォールドまたは請求項２０に記載の非生分解性多孔質ポリカーボネート膜；およびビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、スナップウェル培養システム、（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）Ｏリング、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜成熟培地、網膜培地、非生分解性多孔質ポリカーボネート膜、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞のうちの１またはそれより多く、
を含む、キット。
【請求項22】
処置を必要とする対象を処置するための方法であって、請求項１～１９のいずれか１項に記載のスキャフォールドまたは請求項２０に記載の非生分解性多孔質ポリカーボネート膜を前記対象の網膜に移植する工程を含む、方法。
【請求項23】
前記対象が、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記網膜変性疾患が、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性黄斑変性、ベスト病、遅発性網膜変性、ベアトラックジストロフィー、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記網膜損傷が、レーザー、炎症性、感染性、放射線、新生血管または外傷性傷害によって引き起こされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記対象が哺乳動物である、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
請求項２２～２６のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項１～２０のいずれか１項に記載のスキャフォールドを含む医薬組成物。
【請求項28】
黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を、請求項１～１９のいずれか１項に記載のスキャフォールドまたは請求項２０に記載の非生分解性多孔質ポリカーボネート膜上に培養する工程であって、前記黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞が、ａ）多能性幹細胞を網膜誘導培地中で培養して、前記細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させること；
ｂ）前記ＲＰＥ前駆細胞を網膜分化培地中で培養して、前記ＲＰＥ前駆細胞を拘束ＲＰＥ細胞にさらに分化させること；
ｃ）前記拘束ＲＰＥ細胞を網膜培地中で培養して未成熟ＲＰＥ細胞を形成すること；ならびに
ｄ）前記未成熟ＲＰＥ細胞をレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で培養し、それにより黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞を産生すること；を含む方法によって生成される、工程と、
続いて、前記黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞の上でＰＲＰ細胞を培養する工程と
を含む、方法。
【請求項29】
前記培養工程が網膜成熟培地の存在下で行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記スキャフォールド上に黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を培養することにより、前記スキャフォールド上の前記黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞の単層が形成される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項31】
前記黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を生成するために使用される前記培養工程が、前記スキャフォールドの存在下で行われる、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記スキャフォールドが、前記移植工程後約１年以内に分解し；前記スキャフォールドの第１の層が、前記移植工程後約３ヶ月以内に分解し；および／または
前記スキャフォールドの第１第２が、前記移植工程後約１年以内に分解する、
請求項２２～２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２８日に出願された米国特許出願第６３／１９４，７７０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２８日に出願された米国特許出願第６３／１９４，７７０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府支援の記載
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によって、プロジェクト番号Ｚ０１＃：ＺＩＡ ＥＹ０００５３３－０４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所、国立眼科研究所によって、プロジェクト番号Ｚ０１＃：ＺＩＡ ＥＹ０００５３３－０４の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0003】
本開示の分野
これは、眼科の分野に関し、具体的には、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の層と、ＰＬＧＡに付着されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを含む層とを有するスキャフォールドに関する。そのようなスキャフォールドは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞を播種し、次いで、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置するために対象の網膜に移植することができる。
これは、眼科の分野に関し、具体的には、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の層と、ＰＬＧＡに付着されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを含む層とを有するスキャフォールドに関する。そのようなスキャフォールドは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞を播種し、次いで、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置するために対象の網膜に移植することができる。
【背景技術】
【0004】
背景
網膜色素上皮は、眼の背部に位置する細胞の単層である。頂端側では、ＲＰＥ細胞は、頂端突起を介して光受容体との接触を形成する。基底側では、脈絡膜の毛細血管に面する。網膜色素上皮の主な機能は、代謝産物を光受容体および脈絡膜血管と交換し、網膜の恒常性を維持することである。
網膜色素上皮は、眼の背部に位置する細胞の単層である。頂端側では、ＲＰＥ細胞は、頂端突起を介して光受容体との接触を形成する。基底側では、脈絡膜の毛細血管に面する。網膜色素上皮の主な機能は、代謝産物を光受容体および脈絡膜血管と交換し、網膜の恒常性を維持することである。
【0005】
ヒトの中心網膜には、鋭い色覚を担う、黄斑と呼ばれる錐体が濃縮された領域がある。証拠は、ヒトＲＰＥ単層が、表現型的および機能的に不均一な細胞集団であることを示唆している。表現型的には、黄斑ＲＰＥ細胞は、末梢ＲＰＥ細胞よりもサイズが小さく（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，２２，８９８－９１６２０１６，２０１６）、錐体光受容体を主に支持する花弁状の頂端突起を有する。対照的に、末梢ＲＰＥ細胞は、桿体光受容体を主に支持する指状の頂端突起を有する（Ｐｆｅｆｆｅｒ＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７６（２），１５８－１７２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－５３２０（８１）８００１４－７１９８１；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ Ｆｕｒ Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｓｃｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｅ，１４３（４），４５１－４６３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ００３０６７６５１９７３）。機能的には、末梢ＲＰＥ細胞は、黄斑ＲＰＥ細胞よりも高レベルのＮａ／Ｋ ＡＴＰａｓｅを発現する（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２（７），２０４２－２０４６，１９９１）。ＲＰＥリソソーム酵素活性も領域的に異なる：カテプシンＤは黄斑ＲＰＥ細胞でより活性である（Ｂｏｕｌｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，７８（２），１２５－１２９，１９９４；Ｂｕｒｋｅ＆Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，７８（２），１２５－１２９，１９８８；Ｃａｂｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１（４），６７０－６７６．１９９０）が、酸性ホスファターゼ、β－グルクロニダーゼ、およびＮ－アセチル－β－グルコサミニダーゼは末梢ＲＰＥ細胞でより活性である（Ｃａｂｒａｌ ｅｔ ａｌ．、前出、１９９０）。少なくとも５％の遺伝子が、黄斑ＲＰＥ細胞と末梢ＲＰＥ細胞との間で差次的に発現される（Ｒａｄｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８５（３），３６６－３８０，２００７；ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，１３，１６０８－１６１７，２００７）。代謝的に、黄斑および末梢ヒトＲＰＥ／脈絡膜は、異なるレベルの代謝産物を消費および放出する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，２０２０．０７．１０．１９６２９５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．１０．１９６２９５，２０２０）。黄斑ＲＰＥおよび末梢ＲＰＥなどの異なる種類のＲＰＥ細胞を分化させる方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，２２，８９８－９１６２０１６，２０１６
【非特許文献2】Ｐｆｅｆｆｅｒ＆Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７６（２），１５８－１７２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－５３２０（８１）８００１４－７１９８１
【非特許文献3】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ Ｆｕｒ Ｚｅｌｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｓｋｏｐｉｓｃｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｅ，１４３（４），４５１－４６３，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ＢＦ００３０６７６５１９７３
【非特許文献4】Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２（７），２０４２－２０４６，１９９１
【非特許文献5】Ｂｏｕｌｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，７８（２），１２５－１２９，１９９４
【非特許文献6】Ｂｕｒｋｅ＆Ｔｗｉｎｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，７８（２），１２５－１２９，１９８８
【非特許文献7】Ｃａｂｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１（４），６７０－６７６．１９９０
【非特許文献8】Ｒａｄｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８５（３），３６６－３８０，２００７
【非特許文献9】ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，１３，１６０８－１６１７，２００７
【非特許文献10】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，２０２０．０７．１０．１９６２９５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．１０．１９６２９５，２０２０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の概要
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞、またはＲＰＥ細胞とＰＲＰ細胞の両方、例えば開示される方法を使用して生成されたＲＰＥ細胞を播種するために使用することができるスキャフォールドが本明細書で提供される。ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を含有するスキャフォールドを対象の眼に移植して、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置することができる。
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞、またはＲＰＥ細胞とＰＲＰ細胞の両方、例えば開示される方法を使用して生成されたＲＰＥ細胞を播種するために使用することができるスキャフォールドが本明細書で提供される。ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を含有するスキャフォールドを対象の眼に移植して、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置することができる。
【0008】
本明細書では、２つの層を含むスキャフォールドが提供される。いくつかの例における第１の層は、高さ（例えば、厚さ）が少なくとも約５ミクロン（例えば約５～約４０ミクロン、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ミクロン）であり、直径が少なくとも約０．２ミクロン（例えば約０．２～約２ミクロン、例えば０．２、０．５、１、または２ミクロン）の平均孔径を有する。第１の層は、少なくとも約０．２５：０．２５（例えば１：１）のＤＬ－ラクチド／グリコリド比および少なくとも１５０ｎｍ（例えば約１５０～約６５０ｎｍ、例えば１５０、２００、３００、４００、４５０、５００、６００、または６５０ｎｍ）の繊維径を有するポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む。第２の層は、少なくとも５ミクロン（例えば約５～約３００ミクロン、例えば５、１０、２５、３０、５０、１００、２００、または３００ミクロン）の直径を有するポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを含み、第２の層は第１の層に付着している。いくつかの例では、ＰＣＬループの第２の層は、電界紡糸を使用して第１の層に付着される。
【0009】
開示されるスキャフォールドは、ビトロネクチン、ラミニン、およびフィブロネクチンのうちの１またはそれより多くなどの組換え細胞接着タンパク質を含有するコーティングをさらに含むことができる。
【0010】
開示されるスキャフォールドは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞、またはＲＰＥ細胞とＰＲＰ細胞の両方、例えば本明細書で提供される方法を使用して作製されたＲＰＥ細胞（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）をさらに含むことができる。したがって、いくつかの例では、開示されるスキャフォールドは、ＲＰＥ細胞を生成するためにスキャフォールド上で培養される誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む。一例では、ＲＰＥ細胞は、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞であり、ａ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞を網膜誘導培地中で培養して、細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させること；ｂ）ＲＰＥ前駆細胞を網膜分化培地中で培養して、ＲＰＥ前駆細胞を拘束ＲＰＥ細胞にさらに分化させること；ｃ）拘束ＲＰＥ細胞を網膜培地中で培養して未成熟ＲＰＥ細胞を形成すること；ならびにｄ）未成熟ＲＰＥ細胞をレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で培養し、それにより黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を産生することを含む方法によって生成される。いくつかの実施形態では、そのような培養方法は、スキャフォールド上で行われる（例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞をスキャフォールドに添加し、本明細書に記載されるように培養して、黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、黄斑ヒトＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ成熟培地は、ＲＡＲアンタゴニストを含むが、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含まない。さらなる実施形態では、本方法は、中心ヒトＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ成熟培地は、ＲＡＲアンタゴニストとカノニカルＷｎｔ阻害剤の両方を含む。さらに他の実施形態では、本方法は、末梢ヒトＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ成熟培地は、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含むが、ＲＡＲアンタゴニストを含まない。そのような方法は、限定されないがヒトＲＰＥ細胞を含む任意の哺乳動物からＲＰＥ細胞を調製するために使用することができる。
【0011】
本明細書に開示されるスキャフォールドを含有する非生分解性多孔質ポリカーボネート膜も提供される。
【0012】
本明細書に開示されるスキャフォールドを含むキットも提供される。そのようなキットは、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、スナップウェル培養システム、（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）Ｏリング、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜成熟培地、網膜培地、非生分解性多孔質ポリカーボネート膜、ＲＰＥ細胞、およびＰＲＰ細胞のうちの１またはそれより多くをさらに含んでもよい。
【0013】
例えば、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失の処置に使用するための、本明細書で提供されるスキャフォールドを含む医薬組成物も提供される。
【0014】
対象の網膜にスキャフォールドを移植することによって、それを必要とする対象を処置するために本明細書で提供されるスキャフォールドを使用する方法も提供される。いくつかの例では、対象は、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を有する。いくつかの例では、本明細書に開示されるスキャフォールドを網膜に移植した後、スキャフォールドの第１の層は約３ヶ月以内に分解するが、スキャフォールドの第２の層はより長く、例えば約１年まで残る。
【0015】
例えば、本明細書で提供される処置方法で使用するために、ＲＰＥおよびＰＲＰ細胞を細胞上に培養する方法も提供される。
【0016】
本開示の上記および他の特徴は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】黄斑および末梢ｉＰＳＣ－ＲＰＥ分化プロトコル。黄斑および末梢ｉＰＳＣ－ＲＰＥ分化プロトコルのスキーム。ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１をＲＰＥ成熟培地中のｉＰＳＣ－ＲＰＥに添加して、それぞれ黄斑表現型または末梢表現型を得る。このフローチャートは、薬物がＲＰＥ成熟培地に添加されることを示し、各工程に対応する細胞運命状態を示す。
【図2】ヒト黄斑および末梢ＲＰＥ細胞は表現型が異なる。ヒトＲＰＥ単層は、表現型的および機能的に不均一な細胞集団である。この図は、黄斑および末梢ＲＰＥの間の２つの表現型の違いを示す。上の、エキソビボで成長させたｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像は、花弁状または指状の頂端突起が濃縮された細胞の例を示す。花弁状の頂端突起は、錐体光受容体を包む頂端ＲＰＥ細胞膜のシート状突起（うねりを有する）である；これらは黄斑に豊富である。指状の頂端突起は、微絨毛に似ており、末梢網膜に富む桿体光受容体を選択的に支持する（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８７（１０８９），４６１－４７８，１９７４；Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０６（２），１３１－１４５，１９８２）。図の下において、黄斑および末梢領域からのＲＰＥ細胞境界の２つの画像は、細胞面積の差を示す。棒グラフは、黄斑と周辺部との間の細胞面積の定量化を示す（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ，２２，８９８－９１６，２０１６）。
【図3】ヒトＲＰＥ細胞の領域形態計測分析。全ヒトＲＰＥフラットマウントを調製し、ＲＰＥ細胞境界について染色して、ＲＰＥ形状測定基準を分析した（左）。拡大図は、抗ＺＯ１抗体で細胞境界を染色した個々のＲＰＥ細胞を示す。機械学習アルゴリズムを訓練して、ＲＰＥ細胞境界を同定およびセグメント化した。アルゴリズムは、細胞形状分析のためのＲＥＳｈＡＰＥソフトウェアの入力となるＲＰＥ細胞のバイナリ画像を生成する。
【図4】ヒトＲＰＥ細胞の領域形態計測分析。ＲＥＳｈＡＰＥ（網膜上皮形状および色素評価器（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｓｈａｐｅ Ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ））は、成功裏にセグメント化された視野内のすべての細胞を分析するために使用され、ＲＥＳｈＡＰＥは、２５を超える異なる形状測定基準の定量化を提供する。生データは、統計分析を可能にするためにスプレッドシートに保存される。さらに、ソフトウェアは、分析された測定基準ごとにセグメント化された細胞の画像を作成し、すべての細胞は生の値に従って色分けされる。この画像では、セグメント化されたＲＰＥ細胞は、それらの領域に従って色分けされている。小さい細胞は、より暗い細胞（スケールの左側）に現れ、大きい細胞は灰色（スケールの右側）に現れる。サーマルスケールはインサートとして示されている。
【図5】ヒトＲＰＥ細胞の領域形態計測分析。ヒトＲＰＥ単層全体の低倍率マップ。これは約３００万～４００万個のＲＰＥ細胞を含み、これらは細胞面積に従って色分けされている。サーマルスケールを使用した。濃い灰色は面積が小さいＲＰＥ細胞に対応し、面積が大きいＲＰＥ細胞も示されている（スケールを参照のこと）。フラットマウントの中央の暗いスポットは、黄斑ＲＰＥ細胞を表す。ＲＰＥ細胞面積は、小さいＲＰＥ細胞の末梢リングを除いて、偏心して徐々に成長する。細胞面積を参照として使用して、５つの有意に異なるＲＰＥ集団を同定し、これらを「集団１」（Ｐ１）～「集団５」（Ｐ５）と命名した（図６参照）。この図では、黄斑細胞から末梢細胞に進んでいる。
【図6】ヒトＲＰＥ細胞の領域形態計測分析。同定された各ヒトＲＰＥ集団（Ｐ１～Ｐ５）について単一細胞を表示するための高倍率画像。サーマルスケールを使用した。面積が小さいＲＰＥ細胞および面積が大きいＲＰＥ細胞を同定した。ボックスプロットは、各ＲＰＥ集団に対するＲＰＥ細胞面積の値を示す。ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。一元配置ＡＮＯＶＡの表は、各ＲＰＥ集団間の多重比較を示す。ＲＰＥ集団は、細胞サイズに従って集団中央値±２標準偏差として定義され、これはデータの９５％を包含する。値を右側の表に示す。
【図7】ヒトＲＰＥ細胞とｉＰＳＣ－ＲＰＥとの間の形態計測の比較。１１５個の化合物をｉＰＳＣ－ＲＰＥでスクリーニングして、ヒトＲＰＥ集団の形態計測を再現した。化合物は、発生経路の活性化剤および阻害剤である。（概略フローチャートに示すように）３０日間ＲＰＥ成熟培地に添加することによって、すべての化合物を試験した。処理の終了時に、ＲＥＳｈＡＰＥを用いて細胞面積を定量した。結果を黄斑ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞の測定値と比較して、ヒトＲＰＥの寸法を再現する化合物を選択した。図の下側は、（フラットマウントからの）黄斑および末梢ヒトＲＰＥと、異なる化合物で処理したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞との間の細胞面積の比較の概略図を示す。
【図8】ヒトＲＰＥ細胞とｉＰＳＣ－ＲＰＥとの間の形態計測の比較。化合物のスクリーニングの結果は、レチノイン酸阻害剤、例えばＡＧＮ １９３１０９、またはカノニカルＷｎｔ阻害剤、例えばｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を、ｉＰＳＣ－ＲＰＥに添加すると、それぞれインビトロで黄斑および末梢細胞サイズが再現されることを示す。ヒトＲＰＥ集団Ｐ３を、末梢ＲＰＥ細胞の参照として選択した。一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のための事後検定を統計分析に使用した。ＤＭＳＯで処理したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞もまた、未処理ｉＰＳＣ－ＲＰＥの対照としてグラフに示されている。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。
【図9】ヒトＲＰＥ細胞とｉＰＳＣ由来ＲＰＥとの間の形態計測の比較。細胞面積によって色分けされた画像は、ヒトＲＰＥ細胞とｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞との比較を実証する。ヒトＲＰＥ集団Ｐ３を、末梢ＲＰＥ細胞の参照として選択した。レチノイン酸阻害剤、例えばＡＧＮ １９３１０９、またはカノニカルＷｎｔ阻害剤、例えばｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を、ｉＰＳＣ－ＲＰＥに添加すると、それぞれインビトロで黄斑および末梢細胞サイズが再現される。同じ範囲のパラメータを色分けされた画像のサーマルスケールに使用した。したがって、画像間で面積を直接比較することができる。このデータは、前の図のボックスプロットグラフを補完する。スケールバー＝１００ｕｍ。
【図10】処理されたｉＰＳＣ由来ＲＰＥ間の頂端構造の比較。ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞の上面から下面までの図は、頂端突起の構造を示す。ＡＧＮ １９３１０９は、黄斑ＲＰＥ細胞に特徴的な、うねりを伴う花弁様の頂端突起を有する細胞を濃縮した。Ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１は、末梢ＲＰＥ細胞の特徴である指状の頂端突起を有する細胞を濃縮した。どちらのタイプの頂端突起もＤＭＳＯ対照で見ることができる。
【図11】花弁状（うねり）および指状の頂端突起を画定する。頂端突起の横断面を測定して、それらの形状を正確に画定した。ＲＰＥ細胞をＡＧＮ １９３１０９で処理することによって得られる花弁状の頂端突起は、１．６８μｍの平均横断長さ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌ ｌｅｎｇｔｈ）（長さ最小０．５、最大４μｍ）および０．２０μｍの幅（幅最小０．１、最大１μｍ）を有する。花弁状の頂端突起もまた、それらの長さに沿って波状である。うねりの幅は、０．２～２μｍの範囲である。ＲＰＥ細胞をｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１で処理することによって得られる指状の頂端突起は、円筒形であり、同じ平均横断長さおよび０．２３μｍの幅を有する（最小０．１、最大１ミクロン）。頂端突起の測定がどのように行われたかの例が、処理された各タイプの頂端について示されている。
【図12】細胞面積の比較。グラフは、カノニカルＷｎｔ経路を阻害する異なる薬物で処理した黄斑ＲＰＥ細胞および遠位末梢ＲＰＥ細胞（それぞれＰ１およびＰ４）とｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞との間の細胞面積の比較を示す。このデータは、ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１の同定をもたらした化合物のスクリーニングから得られる。ＤＭＳＯで処理したｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞も、未処理のｉＰＳＣ－ＲＰＥの対照としてグラフに示されている。グラフは、他のカノニカルＷｎｔ阻害剤を使用して、末梢ＲＰＥ表現型を再現することができることを示す。実際、すべてのカノニカルＷｎｔ阻害剤は、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞面積を末梢ＲＰＥ細胞の寸法まで増加させた（Ｐ３）。結果は、カノニカルＷｎｔ阻害が末梢ＲＰＥ細胞を生成することを示した。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。一元配置ＡＮＯＶＡおよび多重比較のための事後検定を統計分析に使用した。
【図13】黄斑（Ｐ１）、中心（Ｐ２）および末梢（Ｐ３）細胞を再現するために、異なる濃度のＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を試験する。黄斑、中心および末梢ＲＰＥ集団（それぞれＰ１、Ｐ２およびＰ３と標識される）を再現するために使用することができるＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１の濃度範囲を試験した。集団１（Ｐ１、黄斑細胞）は、０．１ｍＭ～０．２ｍＭのＡＧＮ １９３１０９を用いて再現することができる。集団３（Ｐ３、末梢）は、１ｍＭ～４ｍＭのｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を用いて再現することができる。ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１の勾配を使用して、ヒトＲＰＥ集団２（Ｐ２、中心）－中心ＲＰＥ細胞を複製することができた。１つの例において、これは、２５ｎＭ～５０ｎＭのＡＧＮ １９３１０９および０．１ｍＭ～０．５ｍＭのｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を用いて再現することができる。ＤＭＳＯ、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３に対する箱ひげ図を、細胞サイズ比較のための参照としてグラフの左側にプロットする。ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１について５つの濃度を試験した。
【図14】異なるＲＰＥ集団は、異なる網膜疾患に罹患している。異なる眼疾患（Ａ）コロイデレミア；（Ｂ）遅発性網膜変性（ＬＯＲＤ）；（Ｃ）未診断の網膜変性におけるＲＰＥの異なる領域における損傷を示す患者の眼の眼底画像。異なるタイプの網膜変性疾患は、ＲＰＥ集団の異なるサブセットに影響を及ぼすようである。異なる疾患におけるＲＰＥ変性が眼底画像において観察され、それらの位置を定量化することができる。（Ｄ）表は、どのＲＰＥ集団が主に異なる疾患に罹患しているかをまとめたものである。塗りつぶされた四角は、ＲＰＥ集団全体が影響を受けることを意味する。ドットの四角は、集団が部分的に影響を受けることを示す。ＲＰＥ集団の場合、括弧内の数字は、眼の中心からの各ＲＰＥ集団の距離（ミリメートル単位）を示す。疾患については、括弧内の数字は、眼の中心からのミリメートルとして表されるＲＰＥ変性の位置を指定する。ＡＭＤは急性黄斑変性であり、ＲＤは未同定の変異を有する患者における網膜変性である。ドットまたは塗りつぶされた四角の集団を、示された対象の処置に使用することができる。Ｐ１は黄斑であり、Ｐ２は中心であり、Ｐ３は末梢ＲＰＥであり、Ｐ４は遠位末梢であり、Ｐ５は鋸状縁ＲＰＥ細胞である。ドットは、後期の疾患段階における変性を示す（早期段階における部分変性も意味する）。四角は、早期の疾患段階における変性を示す。四角領域は、ドット領域よりも疾患過程において早期に移植される。したがって、ドットおよび四角は、特定の細胞集団が使用され得るタイミングに関する情報を提供する。
【図15】本明細書で提供される例示的な二層「ファジー」スキャフォールド構築物のデジタル走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、ＰＬＧＡ紡糸スキャフォールドの上のより暗いおよびより薄いＰＣＬループのメッシュ状構造を示す（より暗いＰＣＬループ間の灰色の外観）。
【図16A】ＲＰＥ細胞および光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞を播種した、本明細書で提供される例示的な二層「ファジー」スキャフォールド構築物のデジタル走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（Ａ）１００×倍率、（Ｂ）１０００×倍率。（Ｂ）において、矢印は、健康で成熟したＲＰＥ細胞の指標であるＲＰＥ頂端突起を示す。
【図16B】ＲＰＥ細胞および光受容体前駆（ＰＲＰ）細胞を播種した、本明細書で提供される例示的な二層「ファジー」スキャフォールド構築物のデジタル走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（Ａ）１００×倍率、（Ｂ）１０００×倍率。（Ｂ）において、矢印は、健康で成熟したＲＰＥ細胞の指標であるＲＰＥ頂端突起を示す。
【図17】移植されたスキャフォールドを示すデジタル（Ａ）走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）画像（矢印）および（Ｂ）移植されたスキャフォールドにわたる光干渉断層法（ＯＣＴ）Ｂスキャン。
【図18A】（Ａ）２ヶ月前にインプラントが配置された領域（目的領域）を示す、切開固定眼組織のデジタル画像。（ＢおよびＣ）スキャフォールドを横切って撮影したＨ＆Ｅ染色パラフィン包埋切片のデジタル画像。０．１７３μｍ／ピクセル解像度のＡｘｉｏＳｃａｎ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、２０倍対物レンズで画像を収集した。このデバイスは、必要に応じてズームインおよびズームアウトすることができる画像を生成する。
【図18B】（Ａ）２ヶ月前にインプラントが配置された領域（目的領域）を示す、切開固定眼組織のデジタル画像。（ＢおよびＣ）スキャフォールドを横切って撮影したＨ＆Ｅ染色パラフィン包埋切片のデジタル画像。０．１７３μｍ／ピクセル解像度のＡｘｉｏＳｃａｎ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、２０倍対物レンズで画像を収集した。このデバイスは、必要に応じてズームインおよびズームアウトすることができる画像を生成する。
【図18C】（Ａ）２ヶ月前にインプラントが配置された領域（目的領域）を示す、切開固定眼組織のデジタル画像。（ＢおよびＣ）スキャフォールドを横切って撮影したＨ＆Ｅ染色パラフィン包埋切片のデジタル画像。０．１７３μｍ／ピクセル解像度のＡｘｉｏＳｃａｎ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、２０倍対物レンズで画像を収集した。このデバイスは、必要に応じてズームインおよびズームアウトすることができる画像を生成する。
【図19】（Ａ）第１の層ＰＬＧＡスキャフォールド１０２と、ＰＣＬループ１０４を含む第２の層１０３とを含む例示的な二層スキャフォールド１００を示す概略図（一定の拡大縮小比ではない）。ここでは、ループ１０４は「閉じている」ように示されているが、開いていてもよい（例えば、線形）。第１の層１０２は、上面１１２と、下面１１４とを含む。（Ｂ）ＲＰＥ細胞１０６（本明細書中に提供される方法を使用して、ｉＰＳｃｓなどの多能性幹細胞からスキャフォールド上に生成され得る）およびＰＲＰ細胞１０８を播種した二層スキャフォールド１００。
【図20】色素沈着および細胞形態。化合物が有害でないことを確実にするために、ＤＭＳＯ／対照（Ａ、Ｂ）、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１（Ｃ、Ｄ）またはＡＧＮ １９３１０９（Ｅ、Ｆ）で処理した後に、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ色素沈着レベル（Ａ、Ｃ、Ｅ）を調べた。肉眼的細胞形態もまた、起こり得る異常を検出するために分析した（中央）。透過型電子顕微鏡を用いて、微細な細胞内構造を変化について調べた（右）。Ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１およびＡＧＮ １９３１０９は、色素沈着レベルも肉眼的または微細な細胞形態も変化させなかった。
【図21】経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）。ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞について観察されたＴＥＲ（単層の緊密さ（ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）の尺度）を示すグラフ。４００オーム＊センチメートル平方のカットオフを使用して、低いＴＥＲを有する細胞を除外した。ＡＧＮ １９３１０９処理細胞およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞は、閾値を十分に上回った。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。
【図22】単一細胞ＲＮＡシーケンシング、各ドットは単一細胞のトランスクリプトームを表す。ドット間の距離は、これらの細胞がどの程度異なるか（近いほど類似している）を示す。３つのセットは、互いに別々にクラスター化する。したがって、それらのトランスクリプトームはかなり明確である。ＡＧＮ １９３１０９処理細胞；ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞およびＤＭＳＯ処理細胞を示す。
【図23】バルクＲＮＡシーケンシング。３つのヒートマップは、文献から特定の遺伝子の発現レベルを示している（Ｒａｄｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８５（３），３６６－３８０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｅｒ．２００７．０５．００６（２００７）；Ｗｈｉｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２９，９３－１０６，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｊ．ＥＸＥＲ．２０１４．１１．００１（２０１４）；Ｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８４，２３４－２４２，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｊ．ＥＸＥＲ．２０１９．０５．００１（２０１９）．ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ １３，１６０８－１７，ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１７８９３６６２（２００７）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ｉＳｃｉｅｎｃｅ ２３（１１），１０１６７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｓｃｉ．２０２０．１０１６７２（２０２０）；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４５（９），３２９１，ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．０４－０１６８（２００４）を上段に、バルクＲＮＡシーケンシングを下段に示す。Ｘ軸は、目的の遺伝子で標識されている。濃い灰色は、黄斑（文献）またはＡＧＮ １９３１０９処理細胞（現在のデータ、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）でより発現される遺伝子に対応する。薄い灰色は、周辺部（文献）またはｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞（現在のデータ、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）でより発現される遺伝子に対応する。
【図24】食作用試験。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。
【図25】酸性ホスファターゼ活性。ＡＧＮ １９３１０９処理細胞（黄斑ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）におけるｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１よりも高い酸性ホスファターゼ活性を示すグラフ。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。
【図26】２種類のＲＰＥ細胞の代謝過程。Ｐ－ＲＰＥは、より高い解糖速度を示すＭ－ＲＰＥ（上のバー）と比較して、ＯＸＰＨＯＳを行う能力が高い（下のバー）。
【発明を実施するための形態】
【0018】
いくつかの実施形態の詳細な説明
いくつかの異なるタイプのＲＰＥ細胞が網膜に存在することが本明細書で開示される。ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞を調製するための方法が本明細書に開示される。これらの方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で未成熟ＲＰＥ細胞を培養して、黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を産生することを含む。いくつかの例では、未成熟ＲＰＥ細胞は、本明細書に提供されるスキャフォールド、例えばＰＬＧＡおよびＰＣＬループを含むスキャフォールド上で培養され、その結果、スキャフォールドは、本明細書に提供される培養工程から産生される黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を最終的に含む。開示される方法で生成された黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞は、網膜変性を処置するため、細胞型に特異的な薬物を発見するため、特定の細胞型に対する薬物毒性を試験するため、および異なるＲＰＥ領域に特異的なハイスループット薬物スクリーニングを実施するための細胞療法として使用することができる。黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞はまた、異なる条件における局所ＲＰＥ効果を研究するためのモデル系を提供する。
いくつかの異なるタイプのＲＰＥ細胞が網膜に存在することが本明細書で開示される。ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞を調製するための方法が本明細書に開示される。これらの方法は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で未成熟ＲＰＥ細胞を培養して、黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を産生することを含む。いくつかの例では、未成熟ＲＰＥ細胞は、本明細書に提供されるスキャフォールド、例えばＰＬＧＡおよびＰＣＬループを含むスキャフォールド上で培養され、その結果、スキャフォールドは、本明細書に提供される培養工程から産生される黄斑ヒトＲＰＥ細胞、中心ヒトＲＰＥ細胞または末梢ヒトＲＰＥ細胞を最終的に含む。開示される方法で生成された黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞は、網膜変性を処置するため、細胞型に特異的な薬物を発見するため、特定の細胞型に対する薬物毒性を試験するため、および異なるＲＰＥ領域に特異的なハイスループット薬物スクリーニングを実施するための細胞療法として使用することができる。黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞はまた、異なる条件における局所ＲＰＥ効果を研究するためのモデル系を提供する。
【0019】
用語
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７に見出され得る。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、「カノニカルＷｎｔ阻害剤」という用語は、単数または複数のカノニカルＷｎｔ阻害剤を含み、「少なくとも１つのカノニカルＷｎｔ阻害剤」という語句と等価であると見なすことができる。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本出願を通して、用語「約」は、デバイスが指定されたときに、５パーセント以内、または値がデバイスの固有の誤差の変動を含むことを示すために使用される。
特に明記しない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における多くの一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７に見出され得る。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、「カノニカルＷｎｔ阻害剤」という用語は、単数または複数のカノニカルＷｎｔ阻害剤を含み、「少なくとも１つのカノニカルＷｎｔ阻害剤」という語句と等価であると見なすことができる。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本出願を通して、用語「約」は、デバイスが指定されたときに、５パーセント以内、または値がデバイスの固有の誤差の変動を含むことを示すために使用される。
【0020】
さらに、別段の指示がない限り、核酸またはポリペプチドについて与えられるありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明目的のために提供されることを理解されたい。本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適切な方法および材料を本明細書に記載する。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。様々な実施形態の検討を容易にするために、以下の用語の説明が提供される。
【0021】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）：ＡＭＤは、網膜の黄斑への損傷によって引き起こされる。ＡＭＤの発症は無症候性であり得るが、ＡＭＤは経時的に徐々に悪化し、一般に片眼または両眼の視野の中心にかすみ目または視覚なしをもたらす。顔を認識すること、運転すること、読むこと、または日常生活の他の活動を行うことが困難になる可能性があり、また、視覚的な幻覚も起こり得る。ＡＭＤは、典型的には、約５０歳以上の対象などの高齢者に発生する。遺伝的要因および喫煙が役割を果たす可能性がある。診断には完全な視力検査が含まれ、重症度は早期型、中間型および後期型の範囲であり得、後期型は「ドライ」および「ウェット」形態をさらに含み得る。
【0022】
ドライＡＭＤは経時的に発生し、黄斑組織が薄くなり崩壊する。症状には、視覚的な歪み、片目または両目の中心視力の低下、読書または近接作業のためのより明るい光の必要性、低い光レベルへの適応の困難さの増加、印刷された単語のぼやけの増加、色の強度または明るさの減少、および顔の認識の困難さが含まれ得る。ドライＡＭＤは、ドルーゼンについて眼の背部を検査すること；視覚の中心の欠陥を試験すること（例えば、Ａｍｓｌｅｒグリッドを使用して、グリッド内の直線が徐々に見えなくなるか、途切れているか、または歪んでいるかを識別する（ドライＡＭＤの存在を示す））；フルオレセインまたはインドシアニングリーン血管造影（異常な血管または網膜の変化について調べる）；および／または光干渉断層法（網膜の菲薄化、肥厚、または腫脹について調べる）によって診断される。現在利用可能な処置には、中心視力の喪失に適応するためのリハビリテーション（低視力リハビリテーション）および望遠レンズの移植が含まれる。
【0023】
ウェットＡＭＤは、ドライＡＭＤの後に続き、異常な血管成長ならびに眼の背部の流体蓄積を含み、これは黄斑に隆起を生じ、歪みの視力喪失を引き起こし得る。ドライＡＭＤの症状に加えて、ウェットＡＭＤの症状には、視界内の明確に画定されたぼやけたスポットまたは盲点、視界全体の全般的なかすみ、ならびに症状の突然の発症および急速な悪化も含まれ得る。現在利用可能な処置には、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））およびアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））などの新しい血管の成長を停止させることを目的とした薬物療法；光線力学的治療；光凝固；低視力リハビリテーションが含まれる。
【0024】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、ウェットまたはドライＡＭＤを処置するために使用される。
【0025】
対立遺伝子：２またはそれを超える形態の遺伝子のうちの１つ。ヒトなどの二倍体生物は、各染色体の２つのコピーを含有し、したがって、それぞれに１つの対立遺伝子を有する。
【0026】
「ホモ接合」という用語は、特定の遺伝子座に２つの同じ対立遺伝子を含有すると定義される。「ヘテロ接合」という用語は、特定の遺伝子座に２つの異なる対立遺伝子を含有することを指す。「ハプロタイプ」は、単一の染色体に沿った複数の遺伝子座における対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、単一染色体上の一塩基多型（ＳＮＰ）のセットおよび／または主要組織適合複合体中の対立遺伝子に基づき得る。本明細書で使用される場合、「ハプロタイプ一致」という用語は、細胞（例えば、ｉＰＳＣ細胞）および処置されている対象が１またはそれを超える主要組織適合遺伝子座ハプロタイプを共有すると定義される。対象のハプロタイプは、当技術分野で周知のアッセイを使用して容易に決定することができる。ハプロタイプ一致ｉＰＳＣ細胞は、自己または同種であり得る。組織培養（例えば、エクスビボ）で増殖させ、ＲＰＥ細胞に本質的に分化させた自己細胞は、対象とハプロタイプ一致である。「実質的に同じＨＬＡ型」は、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘導することによって得られた移植細胞が、それらが患者に移植されるときに生着され得る程度に、ドナーのＨＬＡ型が患者のＨＬＡ型と一致することを示す。「スーパードナー」は、本明細書では、特定のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子についてホモ接合性である個体を指す。これらのホモ接合個体はスーパードナーとして働くことができ、それらの細胞（それらの細胞を含む組織および他の材料を含む）は、そのハプロタイプについてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかである個体に移植することができる。スーパードナーは、それぞれＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰまたはＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座／遺伝子座対立遺伝子についてホモ接合性であり得る。
【0027】
変化：目的の物質またはパラメータ、例えばポリヌクレオチド、ポリペプチドの有効量または細胞の特性の変化。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは活性の変化は、細胞の分化、増殖または生存などの細胞の生理学的特性に影響を及ぼし得る。物質の量は、生成される物質の量の違い、所望の機能を有する物質の量の違い、または物質の活性化の違いによって変化し得る。変化は、増加または減少であり得る。変化は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態において、変化させることは、細胞の分化、増殖および／または生存の有効量（レベル）の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の増加または減少である。
【0028】
動物：生きている多細胞脊椎動物生物、例えば哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒト対象と獣医学的対象の両方、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、ラットおよびウシを含む。
【0029】
アンタゴニストまたは阻害剤：受容体または受容体のリガンドに結合したときに生化学的または生物学的応答を遮断または減衰させる薬剤。アンタゴニストは、アゴニスト誘導性応答を防止することによって、受容体相互作用を介してそれらの効果を媒介する。一実施形態では、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）（Ｆｚｄ）アンタゴニストは、Ｆｚｄ受容体またはＦｚｄリガンド（Ｗｎｔなど）に結合し、Ｗｎｔ／ベータ－カテニンシグナル伝達経路を減少または阻害する（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の減少）。
【0030】
ベアトラックジストロフィー（ｂｅａｒ ｔｒａｃｋ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）：網膜色素上皮（ＣＨＲＰＥ）の群化した先天性肥大として知られる障害の一部を形成する状態、すなわち、その特徴的な検眼鏡的外観によって診断される網膜色素上皮の特有の先天異常。この障害は、通常、正常な視力、色覚、正常な視野、暗順応、網膜電図検査および眼電図検査所見を有する患者では機能的な結果を伴わない。ＣＨＲＰＥの主な鑑別診断には、脈絡膜母斑、脈絡膜黒色腫、脈絡網膜瘢痕、網膜下血腫、色素性網膜上膜、および反応性網膜色素上皮過形成が含まれる。
【0031】
細胞：独立して複製することができ、膜によって囲まれ、生体分子および遺伝物質を含有する生物の構造的および機能的単位。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【0032】
「細胞集団」という用語は、典型的には一般的な種類の細胞の群を指す。細胞集団は、共通の前駆細胞に由来し得るか、または１つよりも多くの細胞型を含み得る。「濃縮された」細胞集団は、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞などの特定の細胞型の割合が、出発集団におけるその細胞型の割合よりも多い、出発細胞集団（例えば、未分画の不均一な細胞集団）に由来する細胞集団を指す。細胞集団は、１またはそれを超える細胞型が濃縮され、１またはそれを超える細胞型が枯渇し得る。
【0033】
細胞接着タンパク質：細胞接着と呼ばれるプロセスにおいて、細胞の他の細胞への結合または細胞外マトリックスに関与するタンパク質。細胞接着タンパク質には、ビトロネクチン、フィブリンおよびラミニンが含まれるが、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンとの細胞－ＥＣＭ相互作用を媒介するインテグリン、同種親和性カルシウム依存性糖タンパク質であるカドヘリン、およびフコシル化炭水化物に依存する異種親和性タンパク質（Ｅ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン）のファミリーであるセレクチンも含まれる。いくつかの例では、細胞接着タンパク質は組換えである。
【0034】
コロイデレミア（ｃｈｏｒｉｏｄｅｒｅｍｉａ）：おおまかに男性５０，０００人に１人が罹患する遺伝性網膜変性の稀なＸ連鎖劣性型。この疾患は、小児期の夜盲から始まって徐々に視力を喪失させ、その後、周辺視野の喪失が続き、後の人生で中心視力喪失に進行する。進行は個体の生涯を通して続くが、変化率および視力喪失の程度の両方が、同じ家族内であっても罹患者の間で変動し得る。コロイデレミアを有する多くの個体が気づく最初の症状は、夜間視力の著しい喪失であり、これは若年時に始まる。周辺視野の喪失が徐々に起こり、視力喪失のリングとして始まり、成人期には「トンネル視」まで続く。コロイデレミアの個体は、４０歳代まで良好な視力を維持する傾向があるが、最終的には５０～７０歳の年齢範囲のある時点ですべての視力を失う。いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、コロイデレミアを処置するために使用される。
【0035】
規定されたまたは完全に規定された：培地、細胞外マトリックスまたは培養条件に関して使用される場合、ほぼすべての構成要素の化学組成および量が既知である培地、細胞外マトリックスまたは培養条件を指す。例えば、規定された培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの規定されていない因子を含有しない。一般に、規定された培地は、組換えアルブミン、化学的に規定された脂質、および組換えインスリンが補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝液、酸化防止剤およびエネルギー源を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２またはロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。例示的な完全に規定された培地は、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）培地である。
【0036】
糖尿病性網膜症：糖尿病性網膜症は、網膜組織の血管が損傷している糖尿病合併症であり、その症状は、発症時などの無症状または軽度から失明にまで及び得る。いくつかの実施形態では、糖尿病性網膜症は、例えば、異常な血管；網膜の腫脹、血液または脂肪沈着物；新生血管および瘢痕組織の成長；眼の中心（硝子体）を満たす透明でゼリー状の物質の出血；網膜剥離；視神経の異常を識別するための包括的な拡張眼科検査によって診断される。さらなる診断検査には、例えば、流体が網膜組織に漏れているかどうかを決定するための、視覚、緑内障および白内障検査、ならびにフルオレセイン血管造影または光干渉断層法が含まれる。現在利用可能な処置には、光凝固、焦点レーザー処置、汎網膜光凝固、硝子体切除、および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤などの薬物の硝子体内投与が含まれる。いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、糖尿病性網膜症を処置するために使用される。
【0037】
分化：特殊化されていない細胞が、構造的および／または機能的特性の変化を伴って、より特殊化されたタイプになるプロセス。成熟細胞は、典型的には、変化した細胞構造および組織特異的タンパク質を有する。より具体的には、本方法の文脈において、幹細胞が、前記ＲＰＥ細胞が黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞であることを示す特徴を有するＲＰＥ細胞の細胞特性を取得するプロセスを示す。
【0038】
本明細書で使用される場合、「未分化」は、胚または成体起源の最終分化細胞と明確に区別する未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特徴を示す細胞を指す。
【0039】
胚：雌に移植されたかどうかに関係なく、人工的に再プログラムされた核を有する接合子または活性化卵母細胞の１またはそれを超える分裂によって得られる細胞塊。「桑実胚」は、一般に１２～３２個の細胞（割球）で構成される固体塊である場合、受精後３～４日の着床前胚である。「胚盤胞」は、約３０～１５０個の細胞の胎盤哺乳動物（マウスでは受精後約３日、ヒトでは受精後約５日）における着床前胚を指す。胚盤胞期は桑実胚期に続き、その独特の形態によって区別することができる。胚盤胞は、一般に、細胞の層（栄養外胚葉）、流体で満たされた空洞（胞胚腔または胚盤胞腔）、および内部の細胞のクラスター（内側細胞塊、ＩＣＭ）で構成される球体である。未分化細胞からなるＩＣＭは、胚盤胞が子宮に移植された場合に胎児になるものを生じさせる。
【0040】
胚様体：多能性幹細胞の三次元凝集体。これらの細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞に分化することができる。単層培養とは対照的に、多能性幹細胞が凝集したときに形成されるスフェロイド構造は、懸濁物中でのＥＢの非接着培養を可能にし、これはバイオプロセシングアプローチに有用である。ＥＢ微小環境内での複雑な細胞接着およびパラクリンシグナル伝達の確立を含む三次元構造は、分化および形態形成を可能にする。
【0041】
拡大：細胞培養物中の細胞の数または量が細胞分裂に起因して増加するプロセス。同様に、「拡大」または「拡大された」という用語は、このプロセスを指す。「増殖する」、「増殖」、または「増殖した」という用語は、「拡大させる」、「拡大」、または「拡大された」という用語と互換的に使用され得る。典型的には、拡大期の間、細胞は分化して成熟細胞を形成しないが、分裂してより多くの細胞を形成する。
【0042】
胚様体（ＥＢ）：内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞に分化することができる多能性幹細胞の凝集体。多能性幹細胞が凝集するとスフェロイド構造が形成され、懸濁物中でのＥＢの非接着培養を可能にする。
【0043】
胚性幹細胞：必要に応じて細胞株として連続継代された胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞。この用語は、好ましくは胚の残りの部分を破壊することなく、胚の１またはそれを超える割球から単離された細胞を含む。この用語はまた、体細胞核移植によって産生される細胞を含む。「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）には、必要に応じて細胞株として連続継代されたヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する胚性細胞が含まれる。ｈＥＳ細胞は、卵細胞と精子またはＤＮＡとの受精、核移植、単為生殖、またはＨＬＡ領域においてホモ接合性を有するｈＥＳ細胞を生成する手段に由来し得る。ヒトＥＳ細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、単為生殖、またはクロマチンの再プログラミングおよび胚性細胞を産生するためのその後の再プログラミングされたクロマチンの原形質膜への組み込みによって産生される接合体、割球、または胚盤胞期哺乳動物胚から産生することができるか、または由来することができる。ヒト胚性幹細胞には、ＭＡＯ１、ＭＡＯ９、ＡＣＴ－４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４およびＡＣＴ３０胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。ヒト胚性幹細胞は、その供給源またはそれらを産生するために使用される特定の方法にかかわらず、（ｉ）３つすべての胚葉の細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ－４およびアルカリホスファターゼの発現、および（ｉｉｉ）免疫無防備状態の動物に移植されたときに奇形腫を産生する能力に基づいて同定することができる。
【0044】
本質的に存在しない：特定の構成要素に関して、本質的に存在しないとは、本明細書では、特定の構成要素のいずれも組成物に意図的に配合されておらず、および／または汚染物質としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の構成要素の総量は、０．０１％未満など、０．０５％をはるかに下回る。いくつかの実施形態では、特定の構成要素の量は、標準的な分析方法で検出することができない。
【0045】
フィーダー層：培養皿の底部などの細胞のコーティング層。フィーダー細胞は、培養培地中に栄養素を放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着することができる表面を提供することができる。
【0046】
フィーダーフリーまたはフィーダー非依存性：フィーダー細胞層の代替物としてサイトカインおよび成長因子を補充した培養物。したがって、「フィーダーフリー」またはフィーダー非依存性の培養系および培地を使用して、多能性細胞を未分化および増殖状態で培養および維持し得る。場合によっては、フィーダーフリー培養物は、動物ベースのマトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、またはフィブロネクチン、コラーゲンもしくはビトロネクチンなどの基材上で増殖される。これらのアプローチにより、ヒト幹細胞は、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずに、本質的に未分化な状態のままであることが可能になる。
【0047】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）：任意の動物に由来する任意の適切な線維芽細胞成長因子、およびその機能的断片、例えば受容体に結合し、受容体の活性化に関連する生物学的効果を誘導するもの。例示的なＦＧＦとしては、ＦＧＦ－１（酸性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦ－２（塩基性線維芽細胞成長因子、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ－３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ－４（ｈｓｔ／Ｋ－ＦＧＦ）、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９およびＦＧＦ－９８が挙げられるが、これらに限定されない。「ＦＧＦ」は、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９もしくはＦＧＦ－９８などの線維芽細胞成長因子タンパク質、またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体を指す。ＦＧＦは、任意の動物種に由来し得る。一実施形態では、ＦＧＦは、げっ歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むがこれらに限定されない哺乳動物ＦＧＦである。多くのＦＧＦを作製するためのアミノ酸配列および方法は公知である。
【0048】
ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列およびその組換え発現のための方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４３９，８１８号に開示されている。ウシｂＦＧＦのアミノ酸配列およびその組換え発現のための様々な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１５５，２１４号に開示されている。１４６残基形態を比較すると、それらのアミノ酸配列はほぼ同一であり、異なる残基は２つだけである。組換えｂＦＧＦ－２および他のＦＧＦは、米国特許第４，９５６，４５５号に詳細に記載されている技術を使用して薬学的品質（９８％またはそれを超える純度）に精製することができる。
【0049】
ＦＧＦインデューサーは、ＦＧＦの活性断片を含む。その最も単純な形態では、活性断片は、メチオニンアミノペプチダーゼによる処理などのＮ末端メチオニン除去のための周知の技術を使用して、Ｎ末端メチオニンの除去によって作製される。第２の望ましい切断は、そのリーダー配列のないＦＧＦを含む。当業者は、リーダー配列を、細胞膜の通過を容易にするが、活性に必要ではなく、成熟タンパク質上には見られないタンパク質のＮ末端における一連の疎水性残基として認識する。ヒトおよびマウスのｂＦＧＦは市販されている。
【0050】
成長因子：細胞の成長、生存および／または分化を促進する物質。成長因子には、成長刺激因子（マイトジェン）として機能する分子、細胞遊走を刺激する因子、走化性因子として機能するかまたは腫瘍細胞の細胞遊走もしくは浸潤を阻害する因子、細胞の分化機能を調節する因子、アポトーシスに関与する因子、または成長および分化に影響を及ぼすことなく細胞の生存を促進する因子が含まれる。成長因子の例は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ－２など）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、およびアクチビンＡである。
【0051】
インデューサー：細胞内の遺伝子を活性化するなどの遺伝子発現を調節する分子。インデューサーは、リプレッサーまたはアクチベーターに結合することができる。インデューサーは、リプレッサーを無効にすることによって機能する。
【0052】
単離された：「単離された」細胞は、生物または培養物中の他の細胞から実質的に分離または精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％純粋、少なくとも９５％純粋または少なくとも９０％純粋であり得る。
【0053】
ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物：培養中に幹細胞などの未分化細胞を増殖および維持するように最適化された無血清製剤。
【0054】
遅発性網膜変性：ＲＰＥとブルッフ膜との間に脂質が豊富な厚い沈着物が存在することを特徴とする、稀な常染色体優性障害。この疾患は１９９０年代半ばに最初に見られ、Ｃ１ＱＴＮＦ５遺伝子の変異に関連している。１１ｑ２３上に位置するＣ１ＱＴＮＦ５遺伝子は、２８１アミノ酸タンパク質をコードし、ＲＰＥ、水晶体、および毛様体上皮で高度に発現される。
【0055】
Ｌ－ＯＲＤを有する個人は、多くの場合、５０～６０歳前後の中年まで眼障害を示さない。臨床的には、疾患過程の初期症状には、明順応および暗順応が困難であり、薄暗い光または夜間で見ることができないことが含まれる。次いで、疾患の進行は、中心および周辺視野の喪失、脈絡膜血管新生および網膜全体の色素性網膜症をもたらす。最終的に、視力の低下は完全な視力喪失をもたらす。
【0056】
眼科検査は、夜間視力の低下が始まった後でさえ、最初は正常であり得る。しかしながら、疾患が進行するにつれて、中位周辺部（ｍｉｄ－ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）に微細な黄白色のドルーゼン様ドットが出現することが、Ｌ－ＯＲＤの最初の眼科的徴候である。これらのドルーゼン様の「ドット」または沈着物は、その後、網膜全体に広がる萎縮領域を形成する。眼底自発蛍光は、主に網膜の中位周辺部および後極におけるＲＰＥおよび脈絡網膜萎縮の広範で明確に画定された波形領域を示す。黄斑は、通常、萎縮性になるが、時には円盤状の瘢痕を形成し得る。視神経円板も淡色に変化する。
【0057】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、Ｌ－ＯＲＤを処置するために使用される。
【0058】
レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）：出生時または人生の初期段階（乳児期または幼児期）に現れ、主に網膜を冒す稀な遺伝性眼疾患。症状（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は、それが複数の遺伝子と関連しているため、様々であり得る。しかしながら、それは、眼振、羞明、瞳孔反応の鈍化または欠如、および重度の視力喪失または失明を特徴とする。遺伝の一般的な様式は、常染色体劣性および常染色体優性である。
【0059】
瞳孔は、通常、眼に入る光の量に応じて拡張および収縮し、光に対して正常に反応しない。代わりに、それらは通常よりもゆっくりと拡張および収縮するか、または光に全く反応しない可能性がある。さらに、眼の透明な前面被覆（角膜）は、円錐形であり、異常に薄く、円錐角膜として知られる状態であり得る。フランチェセッティの眼－デジタル徴候と呼ばれる特定の挙動がＬＣＡの特徴である。この徴候は、拳または指で目をつつく、押す、およびこすることからなる。
【0060】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、ＬＣＡを処置するために使用される。
【0061】
哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。哺乳動物の例としては、ヒトならびに獣医学的動物および実験動物、例えばブタ、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウサギおよびマウスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
膜電位：外部浴溶液などの環境に対する細胞内部の電位。当業者は、例えば従来の全細胞技術を使用することによって、細胞の膜電位を容易に評価することができる。膜電位は、従来の全細胞アクセスを使用するなどの多くのアプローチを使用して、または例えば有孔パッチ全細胞および細胞付着構成を使用して評価することができる。
【0063】
培地：特定の細胞集団の増殖（細胞増殖／拡大）および／または分化を支援するのに必要な栄養素を含む培養条件の合成セット。一実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣなどの幹細胞である。別の実施形態では、細胞はＲＰＥ細胞である。培地は、一般に、炭素源、窒素源、およびｐＨを維持するための緩衝液を含む。一実施形態では、増殖培地は、幹細胞増殖を増強するために様々な栄養素が補充されたＤＭＥＭなどの最小必須培地を含む。さらに、最小必須培地には、ウマ、仔ウシまたはウシ胎仔血清などの添加剤を補充してもよい。
【0064】
Ｎｏｇｇｉｎ：ＮＯＧ遺伝子によってコードされるタンパク質。Ｎｏｇｇｉｎは、ＴＧＦ－βファミリーリガンドに結合し、それらがそれらの対応する受容体に結合するのを妨げることによって、ＴＧＦ－βシグナル伝達を阻害する。Ｎｏｇｇｉｎは、他のＴＧＦ－βシグナル伝達阻害剤（例えば、コルジンおよびフォリスタチンなど）とともに、ＢＭＰ４を阻害することによって神経誘導において重要な役割を果たす。Ｎｏｇｇｉｎの例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＰ＿００５４４１．１およびＮＭ＿００５４５０．４（２０１３年１月１３日）であり、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0065】
Ｏｃｔ－４：Ｏｃｔ－４遺伝子の遺伝子産物である、ＰＯＵ５－Ｆ１またはＭＧＣ２２４８７またはＯＣＴ３またはＯＣＴ４またはＯＴＦ３またはＯＴＦ４としても公知のタンパク質。この用語は、任意の種または供給源からのＯｃｔ－４を含み、ｉＰＳＣの産生に使用される能力を保持するＯｃｔ－４の類似体および断片または部分を含む。Ｏｃｔ－４タンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）などの公的な供給源から得ることができるＯｃｔ－４についての任意の公開された配列を有し得る。そのような配列の例には、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２７０１が含まれるが、これらに限定されない。
【0066】
薬学的に許容され得る担体：従来の薬学的に許容され得る担体は、本明細書に開示される方法を実施し、組成物を形成するのに有用である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５には、本明細書に開示される化合物の薬学的送達に適した組成物および製剤の例が記載されている。
【0067】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容され得る流体をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの少量の非毒性補助物質を含有することができる。
【0068】
プレコンフルエント：組織培養表面全体が細胞で覆われておらず、細胞分裂が起こり得る細胞培養物。細胞によって覆われている培養表面の割合は、約６０～８０％であり得る。通常、プレコンフルエントは、培養表面の約７０％が細胞によって覆われている培養物を指す。
【0069】
精製された：精製された組成物は、絶対純度を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、精製された細胞集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えてまたは１００％純粋であり、例えば、本質的に他の細胞型を含まない。
【0070】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト：ＲＡＲ受容体は、全トランス型レチノイン酸および９－シス型レチノイン酸によって活性化される核内受容体である。これらの受容体の最もよく知られている作用機序は、レチノイド応答性遺伝子のプロモーターにおけるＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）へのそれらの結合を含む。レチノイド受容体はまた、転写因子アクチベータータンパク質の抑制などのＲＡＲＥ非依存性機構を介して転写に影響を及ぼす。ＲＡＲ受容体には３つのサブタイプがある；汎ＲＡＲアンタゴニストは、すべてのサブタイプを阻害する。
【0071】
網膜：眼の内面を裏打ちする組織の光感受性の層。
【0072】
網膜剥離：網膜剥離は、視覚に浮かぶ斑点（浮遊物）の数の突然の増加、片眼または両眼の閃光、視野の「カーテン」または影、および即時の処置なしでは永久的な視力喪失を含む症状を伴って、網膜がその正常な位置から引き離される状態である。
【0073】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、網膜剥離を処置するために使用される。
【0074】
網膜疾患および障害：網膜疾患には、網膜の機能または構造が損傷または減少する疾患が含まれる。網膜の構造または機能が経時的に悪化する網膜変性疾患が含まれる。眼の血管の構造または機能が影響を受ける網膜疾患などの網膜血管疾患が含まれる。
【0075】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、網膜疾患を処置するために使用される。
【0076】
網膜系統細胞：ＲＰＥ細胞を生じ得るまたはそれに分化し得る細胞。
【0077】
網膜誘導培地（ＲＩＭ）：ＷＮＴ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤を含み、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の網膜系統細胞への分化をもたらし得る増殖培地。ＲＩＭはまた、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む。
【0078】
網膜分化培地（ＲＤＭ）：ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）（またはＦＧＦ）阻害剤を含み、網膜細胞を分化させる培地。ＲＤＭには、ＴＧＦβ経路阻害剤も含まれる。
【0079】
網膜培地（ＲＭ）：アクチビンＡおよびニコチンアミドを含む、網膜細胞を培養するための増殖培地。
【0080】
ＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ－ＭＭ）：タウリンおよびヒドロコルチゾンを含む、ＲＰＥ細胞の成熟のための培地。ＲＰＥ－ＭＭには、トリヨードチロニンも含まれる。ＲＰＥ－ＭＭはまた、ＰＤ０３２５９０１またはＰＧＥ２を含み得る。
【0081】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞：ＲＰＥ細胞は、色素沈着、上皮形態、および頂端－基底極性化細胞に基づいて認識することができる。ＲＰＥ細胞は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、Ｐａｘ６、ＭＩＴＦ、ＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィンおよび／またはＯｔｘ２のうちの１またはそれより多くを発現する。特定の他の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で、Ｐａｘ－６、ＭｉｔＦおよびチロシナーゼのうちの１またはそれより多くを発現する。ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ－４、ｎａｎｏｇまたはＲｅｘ－１を（いかなる検出可能なレベルでも）発現しない。具体的には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価した場合、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣよりもＲＰＥ細胞において約１／１００～１／１０００である。分化したＲＰＥ細胞はまた、それらの形態および色素の初期外観によって視覚的に認識することができる。さらに、分化したＲＰＥ細胞は、単層を横切る経上皮抵抗／ＴＥＲおよび経上皮電位／ＴＥＰ（ＴＥＲ＞１００オーム＊ｃｍ２；ＴＥＰ＞２ｍＶ）を有し、流体およびＣＯ２を頂端側から基底側に輸送し、サイトカインの極性のある分泌を調節する。ＲＰＥ細胞には、末梢、中心および黄斑ＲＰＥ細胞が含まれる。
【0082】
ヒトでは、「黄斑」ＲＰＥ細胞は、約１５０μｍ２＋３３μｍ２の面積および花弁状の頂端突起を有し、これらは約０．５～約４μｍの長さ、約０．１～約１μｍの幅、および約０．２～約２μｍのうねりの幅を有する。中心ＲＰＥ細胞は、約１９９μｍ２＋４０μｍ２の面積を有し、花弁状および指状の頂端突起が混在している。「末梢」ＲＰＥ細胞は、約２３９μｍ２＋３８μｍ２の面積と、約０．１～約１μｍの長さおよび約０．１～約１μｍの幅を有する指状の頂端突起とを有する。
【0083】
「成熟」ＲＰＥ細胞は、本明細書では、Ｐａｘ６などの未成熟ＲＰＥマーカーの発現がダウンレギュレートされ、ＲＰＥ６５などの成熟ＲＰＥマーカーの発現がアップレギュレートされたＲＰＥ細胞と呼ばれる。
【0084】
ＲＰＥ細胞の「成熟」とは、本明細書では、ＲＰＥ発生経路を調節して成熟ＲＰＥ細胞を生成するプロセスを指す。例えば、繊毛機能の調節は、ＲＰＥの成熟をもたらし得る。本明細書における「網膜系統細胞」は、ＲＰＥ細胞を生じ得るまたはそれに分化し得る細胞を指す。
【0085】
網膜色素変性（ＲＰ）：ＲＰは、網膜における桿体光受容体細胞の進行性変性に起因する重度の視力障害を引き起こす遺伝性変性眼疾患である。この形態の網膜ジストロフィーは、年齢とは無関係に初期症状を呈する。ＲＰの初期網膜変性症状は、夜間視力の低下（夜盲）および中位周辺視野の喪失を特徴とする。桿体光受容体細胞は、低光視を担い、網膜周辺部に配向され、この疾患の非症候性形態の間に最初に影響を受ける網膜突起である。視力低下は、遠位周辺視野に比較的急速に進行し、最終的にトンネル視が増加するにつれて中心視野に広がる。視力および色覚は、色覚、視力、および中心視野の視力を担う錐体光受容体細胞の付随する異常のために損なわれる可能性がある。疾患症状の進行は対称的に起こり、左右の両眼が同様の速度で症状を経験する。
【0086】
いくつかの例では、本明細書で提供される方法を使用して生成された細胞集団（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）の１またはそれより多くは、ＲＰを処置するために使用される。
【0087】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト：ＲＡＲ受容体は、全トランス型レチノイン酸および９－シス型レチノイン酸によって活性化される核内受容体である。これらの受容体の１つの作用機序は、レチノイド応答性遺伝子のプロモーターにおけるＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）へのそれらの結合を含む。レチノイド受容体はまた、転写因子アクチベータータンパク質の抑制などのＲＡＲＥ非依存性機構を介して転写に影響を及ぼす。ＲＡＲ受容体には３つのサブタイプがある；汎ＲＡＲアンタゴニストは、すべてのサブタイプを阻害する。
【0088】
いくつかの例では、ＲＡＲアンタゴニストは、活性を少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％低下させる。
【0089】
ＲＡＲアンタゴニストの例としては、ＡＧＮ １９３１０９（４－［２－［５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－（４－メチルフェニル）－２－ナフタレニル］エチニル］－安息香酸）、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、およびリアロゾールジヒドロクロリドが挙げられる。
【0090】
スキャフォールド：多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞などの細胞を付着させることができる固体支持体。いくつかの例では、スキャフォールドは生分解性である。いくつかの例では、スキャフォールドは、ＰＬＧＡ層と、ＰＬＧＡ層に付着されたＰＣＬループの層との２つの層を含む。いくつかの例では、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞が含まれ、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞（ヒトＲＰＥ細胞など）を生成するために、本明細書に提供される特定の試薬の存在下で培養される。
【0091】
幹細胞：適切な条件下で多様な範囲の特殊化された細胞型に分化することができるが、他の適切な条件下では自己再生し、本質的に未分化な多能性状態を維持することができる細胞。「幹細胞」という用語はまた、多能性幹細胞、多分化能幹細胞、前駆体細胞および前駆細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血幹細胞もしくは間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連する特定の転写因子の発現によってそれらを多能性状態に再プログラミングすることによって体細胞から産生され得る。これらの細胞は「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」と呼ばれる。
【0092】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞期の内部細胞塊などの初期段階の胚から得られるか、または人工的手段（例えば、核移植）によって産生され、胚または成体において生殖細胞（例えば、精子および卵）を含む任意の分化細胞型を生じ得る未分化多能性細胞である。
【0093】
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書では再プログラミング因子と呼ばれる）の組み合わせを発現またはその発現を誘導することによって体細胞を再プログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年または成人の体細胞を用いて作製することができる。特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラム化するために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞は、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子、または４つの再プログラミング因子を発現させて、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすることによって再プログラミングされる。
【0094】
「多能性」という用語は、胚体外細胞または胎盤細胞を除いて生物における他のすべての細胞型に分化する細胞の特性を指す。多能性幹細胞は、長期培養後でさえ、３つすべての胚葉（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞型）の細胞型に分化することができる。多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞を再プログラミングすることによって得られる誘導多能性幹細胞である。
【0095】
治療有効量：疾患または状態の処置のために対象に投与された場合、そのような処置を行うか、または疾患もしくは状態の症状を軽減するのに十分な化合物または細胞、例えばＲＰＥ細胞の量。網膜色素上皮の機能不全は、網膜色素上皮剥離、異形成、萎縮、網膜症、網膜色素変性、黄斑ジストロフィーおよび変性などのいくつかの視覚変化状態に関連する。
【0096】
組織置換インプラント：インビボで組織を置換するために使用することができる、インビトロで作製されるマトリックスおよび細胞の両方を含む生体適合性構造。組織置換インプラントは、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。組織置換インプラントはまた、桿体、錐体および／または血管細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例示的な組織置換インプラントは、ＲＰＥ細胞（例えば、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞）およびＰＲＰ細胞を含有する本明細書に開示されるスキャフォールドである。
【0097】
処置：診断された病的状態または障害を治癒する、減速させる、症状を軽減する、および／または進行を停止させる治療手段。特定の実施形態では、網膜障害を有する対象を処置すると、網膜の劣化の減少；網膜色素上皮細胞の数の増加、視力の改善、または効果のいくつかの組み合わせがもたらされる。ＲＰＥ細胞（例えば、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞）およびＰＲＰ細胞を含有する本明細書に開示されるスキャフォールドを対象の網膜に移植して、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を処置することができる。
【0098】
未分化：胚または成体起源の分化細胞と区別する未分化細胞の特徴的なマーカーおよび形態学的特徴を示す細胞。したがって、いくつかの実施形態では、未分化細胞は、ＲＰＥマーカーを含むがこれに限定されない細胞系統特異的マーカーを発現しない。
【0099】
Ｗｎｔ：細胞間相互作用を調節し、ショウジョウバエのセグメント極性遺伝子ｗｉｎｇｌｅｓｓに関連する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリー。ヒトでは、Ｗｎｔファミリーの遺伝子は、３８～４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。Ｗｎｔタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９－１３５８（１９９７）を参照）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質ベータ－カテニンの安定化を促進する能力のために、Ｗｎｔタンパク質は転写アクチベーターとして作用し、アポトーシスを阻害することができる。特定のＷｎｔタンパク質の過剰発現は、特定のがんに関連する。
【0100】
Ｗｎｔファミリーは、少なくとも１９個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なＷｎｔタンパク質としては、Ｗｎｔ－１、Ｗｎｔ－２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ－３、Ｗｎｔ－３ａ、Ｗｎｔ－４、Ｗｎｔ－５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ－６、Ｗｎｔ－７ａ、Ｗｎｔ－７ｂ、Ｗｎｔ－８ａ、Ｗｎｔ－８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ－１０ｂ、Ｗｎｔ－１１、およびＷｎｔ １６が挙げられる。これらの分泌リガンドは、少なくとも３つの異なるシグナル伝達経路を活性化する。カノニカル（またはＷｎｔ／ベータ－カテニン）Ｗｎｔシグナル伝達経路では、Ｗｎｔは、フリズルド（Ｆｚｄ）受容体ファミリーメンバーおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５または６（ＬＲＰ５／６）からなる受容体複合体を活性化する。Ｆｚｄリガンドに結合する受容体複合体を形成するために、Ｆｚｄ受容体は、６つのＹＷＴＤアミノ酸反復によって分離された４つの細胞外ＥＧＦ様ドメインを有する１回通過膜貫通タンパク質であるＬＲＰ５／６と相互作用する（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．１９：１７４９）。受容体結合時に活性化されるカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路は、Ｆｚｄ受容体と直接相互作用する細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）によって媒介され、細胞質安定化およびβ－カテニンの蓄積をもたらす。Ｗｎｔシグナルが存在しない場合、ベータ－カテニンは、腫瘍抑制タンパク質である腺腫性結腸ポリープ症（ＡＰＣ）およびＡｘｉｎを含む細胞質破壊複合体に局在する。これらのタンパク質は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）－３ベータがベータ－カテニンに結合してリン酸化することを可能にする重要なスキャフォールドとして機能し、ユビキチン／プロテアソーム経路を介した分解のためにそれをマークする。Ｄｖｌの活性化は、破壊複合体の解離をもたらす。次いで、蓄積した細胞質ベータ－カテニンは核内に輸送され、そこでＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのＤＮＡ結合タンパク質と相互作用して転写を活性化する。
【0101】
非カノニカルＷＮＴ経路は、これらのＷＮＴリガンドのうちの３つ－ＷＮＴ４、ＷＮＴ５ａおよびＷＮＴ１１によって調節される。これらのリガンドは、共受容体（ＬＲＰ５／６）の非存在下でＷＮＴ受容体フリズルドに結合する。これは、細胞質ベータ－カテニンを活性化することなく、ＲＨＯ ＧＴＰアーゼおよびＲＯＣＫキナーゼの活性化をもたらす。ＲＯＣＫは、細胞骨格を調節して、細胞の頂端－基底極性を調節する。同じ受容体に対する競合のために、非カノニカルＷＮＴリガンドもカノニカルＷＮＴシグナル伝達の阻害をもたらす。
【0102】
ゼノフリー（ＸＦ）：培地、細胞外マトリックスまたは培養条件に関して使用される場合、異種動物由来の構成要素を本質的に含まない培地、細胞外マトリックスまたは培養条件を指す。ヒト細胞を培養するために、マウスなどの非ヒト動物の任意のタンパク質はゼノ構成要素である。特定の態様では、ゼノフリーマトリックスは、非ヒト動物由来の構成要素を本質的に含まず、したがってマウスフィーダー細胞またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を除外し得る。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、ラミニン（主要構成要素）、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ニドゲンを含むように細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍であるＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物である。
【0103】
血管構造：血管構造は、特定の領域への血管の供給など、循環系（血管の配置など）またはその一部を含むことができる。
【0104】
スキャフォールド
本開示は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞またはＲＰＥ細胞をさらに含み得るスキャフォールドを提供する。例えば、多能性幹細胞を含むスキャフォールドは、本開示の方法で本明細書に記載の試薬の存在下で培養して、成熟哺乳動物（例えば、ヒト）ＲＰＥ細胞（例えば、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞）を含むスキャフォールドを得ることができる。そのような成熟ＲＰＥ細胞含有スキャフォールドは、網膜障害を処置するために、ヒトなどの対象の網膜に移植することができる。いくつかの例では、スキャフォールドは、例えば網膜への移植後少なくとも２０日間、例えば少なくとも３０日間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間、例えば網膜への移植後約２０日間～６ヶ月間、約３０日間～３ヶ月間、約３０～６０日間、または約３ヶ月～１年以内に生分解性である。いくつかの例では、スキャフォールドの第１のＰＬＧＡ層は、第２のＰＣＬループ含有層よりも急速に分解する。いくつかの例では、第１の層は、網膜への移植の約３ヶ月以内、例えば網膜へのスキャフォールドの移植後約３０日、約６０日、約９０日、約１００日、または約１２０日（例えば、約３０～９０日、約６０～１００日間または約７０～１２０日）以内に分解する。いくつかの例では、第２の層は、網膜への移植の約１年以内、例えば網膜へのスキャフォールドの移植後約６ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、または約１４ヶ月（例えば、約６ヶ月～１４ヶ月、約９ヶ月～１２ヶ月、または約１０ヶ月～１４ヶ月）以内に分解する。
本開示は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞またはＲＰＥ細胞をさらに含み得るスキャフォールドを提供する。例えば、多能性幹細胞を含むスキャフォールドは、本開示の方法で本明細書に記載の試薬の存在下で培養して、成熟哺乳動物（例えば、ヒト）ＲＰＥ細胞（例えば、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞）を含むスキャフォールドを得ることができる。そのような成熟ＲＰＥ細胞含有スキャフォールドは、網膜障害を処置するために、ヒトなどの対象の網膜に移植することができる。いくつかの例では、スキャフォールドは、例えば網膜への移植後少なくとも２０日間、例えば少なくとも３０日間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、または少なくとも１２ヶ月間、例えば網膜への移植後約２０日間～６ヶ月間、約３０日間～３ヶ月間、約３０～６０日間、または約３ヶ月～１年以内に生分解性である。いくつかの例では、スキャフォールドの第１のＰＬＧＡ層は、第２のＰＣＬループ含有層よりも急速に分解する。いくつかの例では、第１の層は、網膜への移植の約３ヶ月以内、例えば網膜へのスキャフォールドの移植後約３０日、約６０日、約９０日、約１００日、または約１２０日（例えば、約３０～９０日、約６０～１００日間または約７０～１２０日）以内に分解する。いくつかの例では、第２の層は、網膜への移植の約１年以内、例えば網膜へのスキャフォールドの移植後約６ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、または約１４ヶ月（例えば、約６ヶ月～１４ヶ月、約９ヶ月～１２ヶ月、または約１０ヶ月～１４ヶ月）以内に分解する。
【0105】
例示的なスキャフォールドを図１９Ａに示す。二次元（例えば、断面）で示されているが、当業者は、スキャフォールドが三次元であることを理解するであろう。スキャフォールド１００は、高さ／厚さ１１１を有する２つの層１０２、１０３を含む。第１の層１０２（例えば底部、図１９Ａ参照）はポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．９（１１）：１１８７－２０５，１９９８参照）を含み；第２の層１０３（例えば、上面、図１９Ａを参照）はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループ１０４を含む。したがって、スキャフォールドの材料は、一般に生理学的に許容され得るものであり、インビボ適用での使用に適している。いくつかの例では、スキャフォールド１００は、約少なくとも約１ミクロンの高さ（例えば、スキャフォールド１１１の高さは、少なくとも約１ミクロンであり得る）、少なくとも約１ミクロンの長さ、および少なくとも約１ミクロンの幅（例えば、少なくとも約２０ミクロンの高さ、少なくとも約２０ミクロンの長さ、および少なくとも約２０ミクロンの幅、例えば、少なくとも約１００ミクロンの高さ、少なくとも約１００ミクロンの長さ、および少なくとも約１００ミクロンの幅、例えば、少なくとも約２００ミクロンの高さ、少なくとも約２００ミクロンの長さ、および少なくとも約２００ミクロンの幅、例えば、少なくとも約１ｍｍの高さ、少なくとも約１ｍｍの長さ、および少なくとも約１ｍｍの幅、例えば、少なくとも約１０ｍｍの高さ、少なくとも約１０ｍｍの長さ、および少なくとも約１０ｍｍの幅、または例えば、少なくとも約１００ｍｍの高さ、少なくとも約１００ｍｍの長さ、および少なくとも約１００ｍｍの幅）であり得る。スキャフォールド１００は、長方形、楕円形、円形、正方形、または不規則などの任意の形状であり得る。
【0106】
ＰＬＧＡは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）とポリグリコール酸（ＰＧＡ）とのコポリマーである。ポリ乳酸は、典型的には古典的な立体化学の用語でＤ型またはＬ型として、時にはそれぞれＲ型およびＳ型として記載される不斉α－炭素を含有する。ポリマーＰＬＡのエナンチオマー形態は、ポリＤ－乳酸（ＰＤＬＡ）およびポリＬ－乳酸（ＰＬＬＡ）である。ＰＬＧＡは、ポリＤ、Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸であり、Ｄ－乳酸形態とＬ－乳酸形態とは一般に等しい比である。ＰＬＧＡは、そのエステル結合の加水分解によって生分解する。いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡスキャフォールドは、スキャフォールドからの大部分の乳酸放出がインビトロで起こるように十分な時間培養される。いくつかの実施形態では、乳酸放出の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％超がインビトロで起こる。乳酸放出は経時的に起こる。
【0107】
第１の層１０２は、高さが少なくとも５ミクロン、高さが少なくとも１０ミクロン、高さが少なくとも２０ミクロン、高さが少なくとも３０ミクロン、または高さが少なくとも４０ミクロン、例えば高さが約５～約４０ミクロン、例えば高さが約５～約２５ミクロン、高さが約１０～約２０ミクロン、または高さが約１５～約２５ミクロン、例えば高さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ミクロンであり得る。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0108】
スキャフォールドのＰＬＧＡ層は、交差して接合部を形成するように、互いに交差するナノ繊維を含むことができる。スキャフォールドは、機械的強度を高めるために、ＰＬＧＡスキャフォールド内の繊維交差部の接合部でスキャフォールドの繊維を融合するように処理することができる。平均孔径は、ＰＬＧＡスキャフォールド内の繊維間の空間である。したがって、いくつかの例では、第１の層１０２は、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、または少なくとも２ミクロン、例えば約０．２～約２ミクロン、約０．５～約２ミクロン、約０．５～約１．５ミクロン、約１～約２ミクロン、例えば０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ミクロンの直径など、直径が少なくとも約０．２ミクロンの平均孔径を有するＰＬＧＡから構成される。いくつかの実施形態では、スキャフォールドのＰＬＧＡ層は、約２ミクロン未満、例えば約１．５ミクロン未満、約１．２５ミクロン未満、約１ミクロン未満、約０．５ミクロン未満、または約０．３ミクロン未満の孔径を有する。１つの例では、第１の層１０２のＰＬＧＡは、直径約１ミクロンまたはそれ未満の平均孔径を有する。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0109】
第１の層１０２のＰＬＧＡは、約０．２５：３～約３：０．２５、例えば約０．２５：３；約０．５：３、約１：３、約１：２．５、約１：２、約１：１．５、約１：１、約１．５：１、約１．５：２、約１．５：３、約２：１、約２．５：１または約３：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比を有する。１つの例では、第１の層１０２のＰＬＧＡは、約１：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比を有する。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0110】
第１の層１０２のＰＬＧＡは、少なくとも１５０ｎｍ、例えば少なくとも２００ｎｍ、少なくとも２５０ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも３５０ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも４５０ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも５５０ｎｍ、または少なくとも６００ｎｍの直径、例えば約１５０～約６５０ｎｍの直径、約１５０～約５００ｎｍ、約２００～約６００ｎｍ、約４００～約５００ｎｍの直径、例えば約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍの直径、例えば約４５０ｎｍの直径の繊維径を有する。１つの例では、第１の層１０２のＰＬＧＡは、約４５０ｎｍの繊維径を有する。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0111】
本明細書に記載の厚さ、孔径および繊維径のスキャフォールドのＰＬＧＡ層の特徴のいずれも組み合わせることができる。ＤＬ－ラクチド／グリコリド比を変えることにより、孔径および繊維径を変えることができる。したがって、開示された厚さ（例えば、高さ）、孔径および繊維径のＰＬＧＡスキャフォールドを製造することができる。任意の特徴を組み合わせて、ＤＬ－ラクチド／グリコリド比を変えることによって生成される特定の組み合わせに到達することができる。これらはすべて本明細書に開示されていると理解される。特定の非限定的な例では、スキャフォールドのＰＬＧＡ層は、１：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比、１ミクロン未満の平均孔径、および１５０～６００ｎｍの繊維径を有する。
【0112】
いくつかの実施形態では、スキャフォールドのＰＬＧＡ層の機械的強度を高めるために、スキャフォールドのＰＬＧＡ層内の接合部（繊維交差部）でスキャフォールドのＰＬＧＡ層の繊維を融合させるために、スキャフォールドのＰＬＧＡ層を熱で処理する。この熱処理はまた、接合部で繊維を融合することによって孔径を減少させ、したがって細胞がスキャフォールドの上層に単層を形成することを可能にする。いくつかの非限定的な例では、ＰＬＧＡは、適切な表面、例えば、処理のために所望の温度に設定されたオーブン内に配置されたエンベロープの形態などのアルミニウム箔などの金属表面に配置される。適切な温度は、約３５℃～約５５℃、例えば約４０℃～約５０℃、例えば約４３℃、４４℃、４５℃、４６℃または４７℃を含む。ＰＬＧＡは、約５～約２０分間、例えば約１０～約１５分間、例えば約１０、１１、１２、１３、１４または１５分間加熱することができる。一実施形態において、ＰＬＧＡは、約４５℃で約１０分間処理される。次いで、温度を第１の温度に対して、例えば約５０℃～約７０℃、例えば約５５℃～約６０℃、例えば約５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃または６０℃まで上昇させることができる。より高温の処理は、約４５分～約７５分、例えば約５０分～約７０分、または約５５分～約６５分であり得る。より高温の処理は、約５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５分間適用することができる。いくつかの実施形態では、スキャフォールドは、約６０℃で約６０分間処理される。非限定的な一例では、スキャフォールドは、約４５℃で約１０分間、次いで約６０℃で約６０分間処理することができる。熱処理後、スキャフォールドのＰＬＧＡ層を保存することができる。
【0113】
第２の層１０３は、第１の層１０２の一方の表面、例えば第１の層の他方の表面よりも表面積が大きい表面に付着される。第１の層１０２は、上面１１２と下面１１４とを有する。いくつかの例では、第２の層１０３は、第１の層１０２の上面１１２上にある。いくつかの例では、第２の層１０３は、少なくとも約１０ミクロン、例えば少なくとも約２０ミクロン、少なくとも約５０ミクロン、少なくとも約１００ミクロン、少なくとも約１５０ミクロン、少なくとも約２００ミクロン、少なくとも約５００ミクロン、または少なくとも約１０００ミクロン、例えば約１０～２００ミクロン、約５０～２００ミクロン、約１００～２００ミクロン、約１０～１０００ミクロン、または１００～５００ミクロンの高さである。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0114】
第２の層１０３は、複数のＰＣＬループ１０４から構成される。いくつかの例では、ループ１０４の繊維は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００ミクロン、例えば約５～約３００ミクロン、約５～約１０ミクロン、約１００～約３００ミクロン、約１０～約５０ミクロン、例えば５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００ミクロンの直径など、少なくとも５ミクロンの直径を有する。１つの例では、ＰＣＬループの繊維の直径は約５ミクロンである。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0115】
第２の層１０３のＰＣＬループ１０４の密度および数は、複数のＲＰＥ細胞１０６（例えば、１０～１０００個の細胞）が単層を形成するのに十分なギャップを提供するように決定することができる。１つの例では、第２の層１０３のＰＣＬループ１０４の密度は、少なくとも約１０ＰＣＬループ／ｍｍ、例えば少なくとも約２０ＰＣＬループ／ｍｍ、少なくとも約５０ＰＣＬループ／ｍｍ、少なくとも約７５ＰＣＬループ／ｍｍ、または少なくとも約１００ＰＣＬループ／ｍｍ、例えば１０～１００ＰＣＬループ／ｍｍ、１０～５０ＰＣＬループ／ｍｍ、１０～２００ＰＣＬループ／ｍｍ、または５０～１００ＰＣＬループ／ｍｍである。１つの例では、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、または少なくとも約１００のＰＣＬループなど、少なくとも約１０のＰＣＬループ１０４が第２の層１０３に存在する。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0116】
ＰＬＧＡの第１の層１０２上に堆積された第２の層１０３のＰＣＬループ１０４は、完全に閉じていてもよく（すなわち、ＰＣＬ繊維の両端は、例えば図１９Ｂに示すように、第１の層１０２と接触している）、開いていてもよく（例えば、ＰＣＬ繊維の一端は、第１の層１０２と接触しておらず、いくつかの例では、フック状構造を形成する）、それ自体で閉じていてもよく（例えば、文字「ｐ」または「ｂ」のように）、または第２の層１０３は、開いたＰＣＬループと閉じたＰＣＬループの混合物を含んでいてもよい。いくつかの例では、閉じたＰＣＬループ１０４は、少なくとも約１０ミクロン、例えば少なくとも約２０ミクロン、少なくとも約５０ミクロン、少なくとも約１５０ミクロン、または少なくとも約２００ミクロン、例えば約１０～約２００ミクロン、約１０～約１００ミクロン、約５０～約２０ミクロン、約１０～約５０ミクロン、例えば１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ミクロンの直径を有する。この文脈において、「約」は５％以内を示す。
【0117】
本明細書に記載の厚さ、密度および繊維径のスキャフォールドのＰＣＬループ層の特徴のいずれも組み合わせることができる。特定の非限定的な例では、スキャフォールドのＰＣＬ層は、５～３００ｎｍの繊維径を有し、電界紡糸を使用して第１の層に付着される。
【0118】
いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、組換え細胞接着タンパク質などの細胞接着タンパク質でコーティングされる。使用することができる例示的な細胞接着タンパク質には、ビトロネクチン、ラミニン、およびフィブロネクチンのうちの１またはそれより多くが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡスキャフォールドは、ビトロネクチンでコーティングされる。いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、または少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば約２０～９５ｎｇ／ｍｌ、約２０～８０ｎｇ／ｍｌ、約２０～７０ｎｇ／ｍｌ、約３０～６０ｎｇ／ｍｌ、約３０～５０ｎｇ／ｍｌ、約４０～５０ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５．５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、または９５ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質でコーティングされる。特定の例では、スキャフォールド１００は、４５．５ｎｇ／ｍｌのビトロネクチン、４５．５ｎｇ／ｍｌのラミニン、または４５．５ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチンなどの４５．５ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質でコーティングされる。
【0119】
いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、細胞外マトリックスまたはゼラチンでコーティングされる。細胞外マトリックスは、構造タンパク質、特殊化タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および哺乳動物組織内の細胞を取り囲み支持する成長因子を含むがこれらに限定されない構造および機能性生体分子および／または生体高分子の複雑な混合物であり、別段の指示がない限り、無細胞である。使用することができる細胞外マトリックスは、例えば、限定されないが、米国特許第４，９０２，５０８号；同第４，９５６，１７８号；同第５，２８１，４２２号；同第５，３５２，４６３号；同第５，３７２，８２１号；同第５，５５４，３８９号；同第５，５７３，７８４号；同第５，６４５，８６０号；同第５，７７１，９６９号；同第５，７５３，２６７号；同第５，７６２，９６６号；同第５，８６６，４１４号；同第６，０９９，５６７号；同第６，４８５，７２３号；同第６，５７６，２６５号；同第６，５７９，５３８号；同第６，６９６，２７０号；同第６，７８３，７７６号；同第６，７９３，９３９号；同第６，８４９，２７３号；同第６，８５２，３３９号；同第６，８６１，０７４号；同第６，８８７，４９５号；同第６，８９０，５６２号；同第６，８９０，５６３号；同第６，８９０，５６４号；および同第６，８９３，６６６号に開示されており；その各々は、参照によりその全体が組み込まれる。しかしながら、ＥＣＭは、任意の組織から、または、ＥＣＭが培養細胞によって産生され、天然ＥＣＭの１またはそれを超えるポリマー構成要素（成分）を含む、任意のインビトロ供給源から産生され得る。ＥＣＭ調製物は、細胞が供給源組織または培養物から除去されたことを意味する「脱細胞化された」または「無細胞」と考えることができる。いくつかの実施形態では、ＥＣＭは、脊椎動物から、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物の脊椎動物から単離される。ＥＣＭは、膀胱、腸、肝臓、心臓、食道、脾臓、胃および真皮を含むがこれらに限定されない任意の器官または組織に由来し得る。具体的な非限定的な例では、細胞外マトリックスは、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心臓組織、または骨格筋から単離される。ＥＣＭは、例えば、限定されないが、粘膜下組織、上皮基底膜、固有層などを含む、器官から得られる任意の部分または組織を含み得る。１つの非限定的な実施形態では、ＥＣＭは膀胱から単離される。
【0120】
スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）に細胞を播種することができる。例えば、図１９Ｂに示すように、スキャフォールド１００に、ＲＰＥ細胞１０６、光受容体前駆（ＰＲＰ）１０８細胞、またはその両方を最初に播種することができる。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞１０６は、スキャフォールド１００上に播種され、第１の層１０２および第２の層１０３の両方と接触する。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞１０６は単層を形成する。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞１０６をスキャフォールドに付着させた後、ＰＲＰ細胞１０８を添加し、ＲＰＥ細胞１０６の上に付着させる。スキャフォールド上に播種されたＲＰＥ細胞１０６は、開示された方法によって生成することができる。いくつかの例では、スキャフォールド１００に添加されるＲＰＥ細胞１０６は、黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞などの成熟ＲＰＥ細胞である。いくつかの例では、そのような成熟ＲＰＥ細胞は、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞である。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞１０６は、スキャフォールド１００に付着された多能性幹細胞から生成される。したがって、いくつかの例では、図１９Ｂに示すＲＰＥ細胞１０６は多能性幹細胞であり、第１の層１０２および第２の層１０３の両方と接触してスキャフォールド１００上に播種され、本明細書で提供される方法を使用して培養されて成熟ＲＰＥ細胞を生成する。したがって、いくつかの例では、ＲＰＥ細胞１０６は、いくつかの段階（またはいくつかの例）の多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、または成熟ＲＰＣＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）である。
【0121】
したがって、本明細書では、少なくとも２つの層を有するスキャフォールドが提供される。第１の層は、少なくとも約０．２５：３～３：０．２５（例えば１：１）のＤＬ－ラクチド／グリコリド比、少なくとも約１５０ｎｍ（例えば、約１５０～約６５０ｎｍの直径、例えば４５０ｎｍの直径）の繊維径、および少なくとも約０．２ミクロンの直径（例えば直径約０．２～２ミクロン、例えば１ミクロンの直径）の平均孔径を有するＰＬＧＡから構成される。第１の層は、少なくとも約５ミクロン（例えば約５ミクロン～約４０ミクロン、例えば２０ミクロン）の高さを有することができる。第２の層は、ＰＣＬループから構成され、ループの繊維は、少なくとも５ミクロンの直径（例えば、約５～約３００ミクロンの直径）を有する。いくつかの例では、ＰＣＬループは、少なくとも約１０細胞あたり１、少なくとも約２５細胞あたり１、少なくとも約５０細胞あたり１、少なくとも約７５細胞あたり１、または少なくとも約１００細胞あたり１、例えば約１０～１００細胞あたり１、５０～１００細胞あたり１の密度で存在する。いくつかの例では、ＰＣＬループは閉じている（例えば、ＰＣＬ繊維の両端はスキャフォールドの第１層と接触しているか、または一端はスキャフォールドの第１の層と接触しており、ＰＣＬ繊維の他端は同じＰＣＬ繊維の少なくとも１つの他の領域と接触しており、例えば「ｐ」または「ｂ」様構造を形成している）。いくつかの例では、ＰＣＬループは開いている（例えば、ＰＣＬ繊維の一端は、第１の層１０２と接触しておらず、いくつかの例では、フック状構造、例えば「ｊ」様構造を形成する）。いくつかの例では、いくつかのＰＣＬループは開いており、いくつかのＰＣＬループは閉じている。
【0122】
第２の層は、例えば電界紡糸または電気化学エッチングを使用して、第１の層に付着される（または堆積される）（例えば、ＰＣＬループがＰＬＧＡに付着される）。１つの例では、電界紡糸は、少なくとも約５ｋＶ（例えば、少なくとも約１０ｋＶ、少なくとも約２０ｋＶ、少なくとも約２５ｋＶ、少なくとも約３０ｋＶ、少なくとも約４０ｋＶ、または少なくとも約５０ｋＶ、例えば約５～約５０ｋＶ、約５～約４０ｋＶ、約１０～約３０ｋＶ、約２０～約３０ｋＶ、例えば１０ｋＶ、２０ｋＶ、２５ｋＶ、３０ｋＶまた４０ｋＶ、例えば２５ｋｖ）の電界電圧、少なくとも約１０ｋＰａ（例えば、少なくとも約５０ｋＰａ、少なくとも約１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、少なくとも約３００ｋＰａ、少なくとも約３５０ｋＰａ、または少なくとも約４００ｋＰａ、例えば約１０ｋＰａ～約４００ｋＰａ、約１００ｋＰａ～約４００ｋＰａ、約１５０ｋＰａ～約３００ｋＰａ、約２００ｋＰａ～約３００ｋＰａ、または約１００ｋＰａ～約２００ｋＰａ、例えば１０ｋＰａ、２５ｋＰａ、５０ｋＰａ、７５ｋＰａ、１００ｋＰａ、２００ｋＰａ、３００ｋＰａ、または４００ｋＰａ、例えば３００ｋＰａ）のガス噴出圧力、少なくとも約１０ｍｍ（例えば、少なくとも約２０ｍｍ、少なくとも約３０ｍｍ、または少なくとも約４０ｍｍ、例えば約１０ｍｍ～約４０ｍｍ、約１０ｍｍ～約３０ｍｍ、約２０ｍｍ～約３０ｍｍ、例えば１０ｍｍ、２０ｍｍ、２７ｍｍ、３０ｍｍ、３５ｍｍ、または４０ｍｍ、例えば２７ｍｍ）のノズルとＰＬＧＡとの間の作業距離、および少なくとも２分間の電界紡糸時間（例えば、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分、少なくとも６分、少なくとも７分、少なくとも８分、少なくとも９分、少なくとも１０分、例えば約２分～約１０分、約２分～約８分、約４分～約６分、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０分、例えば５分）を使用することを含む。
【0123】
いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、組換え細胞接着タンパク質などの細胞接着タンパク質のコーティングをさらに含む。細胞接着タンパク質のコーティングは、第１および第２の層を含むスキャフォールドの表面全体を覆う。使用することができる例示的な細胞接着タンパク質には、ビトロネクチン、ラミニン、およびフィブロネクチンのうちの１またはそれより多くが含まれる。いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば約２０～９５ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば４５．５ｎｇ／ｍｌの細胞接着タンパク質、例えば４５．５ｎｇ／ｍｌのビトロネクチン、４５．５ｎｇ／ｍｌのラミニン、または４５．５ｎｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコーティングされる。
【0124】
いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＣＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）、およびＰＲＰ細胞のうちの１またはそれより多くなどの細胞で播種する前に滅菌される。いくつかの実施形態では、ガンマ線照射を利用してスキャフォールドを滅菌する。他の実施形態では、電子ビーム（ｅｂｅａｍ）を使用してスキャフォールドを滅菌する。いくつかの例では、酸素プラズマ放出を使用してスキャフォールドを滅菌する。例示的な方法は、例えば、Ｂｒｕｙａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ａ，ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．ＴＥＡ．２０１８．０１３０（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０，２０１８）およびＰｒｏｆｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３３（７）１０１５－１０２３（２０１５））に開示されている。
【0125】
いくつかの例では、スキャフォールド（例えば、図１９Ａの１００）に、例えばエクスビボで細胞を播種する。したがって、いくつかの例では、スキャフォールドは、ＲＰＥ細胞、ＰＲＰ細胞、またはＲＰＥ細胞とＰＲＰ細胞の両方をさらに含む。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞は、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞である。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞はスキャフォールド上で成熟するため、いくつかの例では、スキャフォールドは、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、または成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）をさらに含む。いくつかの例では、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞または成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）は、スキャフォールドの両方の層と接触している細胞の単層である。ＰＲＰ細胞は、ＲＰＥ細胞の上、例えばＲＰＥ単層の上に播種することができる。例えば、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞または成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）は、細胞をスキャフォールドに添加し、ＲＰＥ－ＭＭ培地などの適切な培養培地の存在下で細胞を培養することによって、スキャフォールド上に播種することができる。いくつかの例では、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞または成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑、中心および／または末梢ヒトＲＰＥ細胞）を、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間または少なくとも６週間、例えば７～３１日間、１０～３０日間、１４～２１日間、７～４５日間、例えば１、２、３、４、５または６週間、スキャフォールド上で成長させる。その後、（例えば、成熟ＲＰＥ細胞などの細胞が単層を形成した後）、ＰＲＰ細胞を添加し、ＲＰＥ－ＭＭ培地などの適切な培養培地の存在下で培養する。いくつかの例では、ＰＲＰ細胞をＲＥＰ細胞上で少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、または少なくとも３週間、例えば５～３１日間、１０～３０日間、７～１４日間、１４～２１日間、例えば１週間、２週間、または３週間増殖させる。したがって、いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞（例えば少なくとも２００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも３００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも４００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または少なくとも５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、例えば１００，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、２５０，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または２５０，０００～３５０，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞をさらに含む。いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞（例えば、少なくとも２００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも３００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも５００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または少なくとも６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、例えば、１００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、２００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または３００～４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞）をさらに含む。いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞（例えば、少なくとも２００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも３００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも４００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または少なくとも５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、例えば１００，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、２５０，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または２５０，０００～３５０，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞など）および少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞（例えば、少なくとも２００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも３００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも５００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または少なくとも６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、例えば、１００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、２００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または３００～４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞）をさらに含む。
【0126】
スキャフォールド（例えば、図１９Ａまたは図１９Ｂの１００）は、１またはそれを超える医薬品を含むことができる。いくつかの実施形態では、スキャフォールドは、１またはそれを超える医薬品の持続放出を提供する。いくつかの実施形態では、医薬品は、ＲＰＥ細胞の脱分化（または上皮間葉転換）を阻害するか、またはＲＰＥ細胞の下のドルーゼン沈着物の形成を阻害するか、またはＲＰＥ細胞の活性酸素種を抑制する分子である。いくつかの非限定的な例では、ＲＰＥ細胞脱分化の阻害剤は、Ｌ，７４５，８７０（３－（［４－（４－クロロフェニル）ピペラジン－１－イル］メチル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン）またはドーパミン受容体阻害剤である。医薬品は、メトホルミン、Ｎｏｘ４阻害剤、活性酸素阻害剤アミノカプロン酸、リルゾールまたはＮＫ－κβ阻害剤であり得る。特定の非限定的な例では、医薬品はＬ，７４５，８７０である。別の具体的な非限定的な例では、医薬品はメトホルミンである。さらなる非限定的な例では、医薬品はＮｏｘ４阻害剤（例えば、ＶＡＳ２８７０、ＧＫＴ １３７８３１またはＧＬＸ７０１３１１４）である。さらなる非限定的な例では、医薬品は活性酸素種阻害剤（例えば、ＧＫＴ １３７８３１またはＧＬＸ７０１３１１４またはＮ－アセチルシステイン）である。
【0127】
いくつかの例では、スキャフォールド上のＲＰＥ細胞は、ヒト黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞などの黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞であり、本明細書に提供される方法によって生成される。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞は、ａ）多能性幹細胞を網膜誘導培地中で培養して、細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させること；ｂ）ＲＰＥ前駆細胞を網膜分化培地中で培養して、ＲＰＥ前駆細胞を拘束ＲＰＥ細胞にさらに分化させること；ｃ）拘束ＲＰＥ細胞を網膜培地中で培養して未成熟ＲＰＥ細胞を形成すること；ならびにｄ）未成熟ＲＰＥ細胞をレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で培養し、それによりヒトＲＰＥ細胞を産生することによって生成される。いくつかの例では、幹細胞は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。したがって、いくつかの例では、細胞がスキャフォールドの両方の層と接触するように、スキャフォールドに多能性幹細胞を播種し、多能性幹細胞を上記の培地の存在下でスキャフォールド上で成熟ＲＰＥに成熟させる。いくつかの例では、ＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、またはリアロゾールジヒドロクロリドである。いくつかの例では、カノニカルＷｎｔ阻害剤は、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、またはＴＣ－Ｅ ５００１である。いくつかの例では、ＲＰＥ成熟培地は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィディコリンなどの少なくとも１つの一次繊毛インデューサーを含む。
【0128】
本明細書で提供されるスキャフォールドを含む非生分解性多孔質ポリカーボネート膜も提供される。
【0129】
本明細書で提供される１またはそれを超えるスキャフォールドを含むキットも提供される。そのようなキットは、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチンのうちの１またはそれより多くをさらに含むことができる。いくつかの例では、キットは、スナップウェル培養システム、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）Ｏリング、またはその両方をさらに含む。いくつかの例では、キットは、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜成熟培地、および／または網膜培地などの培養培地をさらに含む。いくつかの例では、キットは、非生分解性多孔質ポリカーボネート膜をさらに含む。いくつかの例では、キットは、ＲＰＥ細胞、ＰＲＰ細胞、またはその両方、例えば黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞、例えばヒト黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞をさらに含み、本明細書に提供される方法によって生成される。いくつかの例では、キットは、ｉＰＳＣ、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、および／または未成熟ＲＰＥ細胞などの多能性幹細胞をさらに含む。
【0130】
開示されるスキャフォールドを使用して、例えば、それを必要とする対象、例えばヒトなどの哺乳動物を処置する方法も提供される。そのような方法は、本明細書に提供されるスキャフォールドを対象の網膜に移植することを含み得る。いくつかの例では、対象は、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を有する。いくつかの例では、網膜変性疾患は、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性黄斑変性、ベスト病、遅発性網膜変性、ベアトラックジストロフィー、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである。いくつかの例では、網膜損傷は、レーザー、炎症性、感染性、放射線、新生血管または外傷性傷害によって引き起こされる。
【0131】
例えば、本明細書で提供される方法で使用するための、本明細書で提供される１またはそれを超えるスキャフォールドを含む医薬組成物も提供される。
【0132】
ＲＰＥ細胞、ＰＲＰ細胞、またはその両方を播種したスキャフォールドを作製する方法も提供される。そのような播種されたスキャフォールドは、本明細書で提供される処置方法で使用することができる。この方法は、本明細書に提供されるスキャフォールド上にＲＰＥ細胞（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）を培養することを含み得る。いくつかの例では、黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞は、ａ）多能性幹細胞を網膜誘導培地中で培養して、細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させること；ｂ）ＲＰＥ前駆細胞を網膜分化培地中で培養して、ＲＰＥ前駆細胞を拘束ＲＰＥ細胞にさらに分化させること；ｃ）拘束ＲＰＥ細胞を網膜培地中で培養して未成熟ＲＰＥ細胞を形成すること；ならびにｄ）未成熟ＲＰＥ細胞をレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストおよび／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤を含むＲＰＥ成熟培地中で培養し、それにより黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞を産生することを含む方法によって生成される。いくつかの例では、そのような培養は、多能性幹細胞がスキャフォールド上に播種され、次いで培養されてスキャフォールド上に成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）を形成するように、スキャフォールド自体で行われる。他の例では、培養を別々に行い、続いて、得られた成熟ＲＰＥ細胞（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）をスキャフォールド上に播種する。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞は、スキャフォールドの両方の層と接触する単層などのＲＰＥ細胞の単層の形成を可能にする期間培養される（例えば、図１９Ｂを参照）。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞は、網膜成熟培地中でスキャフォールドの存在下で培養される。いくつかの例では、ＲＰＥ細胞（または多能性幹細胞（ｉＰＳＣなど）ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、および／または未成熟ＲＰＥ細胞）をスキャフォールド上で少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも５週間、例えば約１、２、３、４、または５週間培養する。この方法は、続いてＲＰＥ細胞の上でＰＲＰ細胞を培養することをさらに含むことができる（例えば、図１９Ｂを参照）。ＰＲＰ細胞は単層を形成する必要はなく、いくつかの例では、集密度は約４０％未満、例えば約５～４０％集密度、約２０～４０％集密度または約３０～４０％集密度である。いくつかの例では、ＰＲＰ細胞は、網膜成熟培地中でスキャフォールドおよびＲＰＥ細胞の存在下で培養される。いくつかの例では、ＰＲＰ細胞は、スキャフォールドおよびＲＰＥ細胞上で、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、例えば約１、２、３、または４週間培養される。いくつかの例では、得られたスキャフォールドは、少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞（例えば少なくとも２００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも３００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも４００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または少なくとも５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、例えば１００，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、２５０，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または２５０，０００～３５０，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞を含む。いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞（例えば、少なくとも２００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも３００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも５００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または少なくとも６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、例えば、１００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、２００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または３００～４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞）を含む。いくつかの例では、スキャフォールドは、少なくとも１００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞（例えば、少なくとも２００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも３００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、少なくとも４００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または少なくとも５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、例えば１００，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、２５０，０００～５００，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞、または２５０，０００～３５０，０００細胞／ｃｍ２のＲＰＥ細胞など）および少なくとも１００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞（例えば、少なくとも２００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも３００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、少なくとも５００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または少なくとも６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、例えば、１００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、２００～６００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞、または３００～４００万細胞／ｃｍ２のＰＲＰ細胞）を含む。いくつかの例では、多能性幹細胞からのＲＰＥ細胞の成熟は、ＴＥＥＲ＞４００オーム．ｃｍ２および光受容体マーカー（例えば、リカバリン、アレスチン、ＮＲＬ、オプシン）の存在によって確認される。
【0133】
多能性幹細胞
１．胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、高いインビトロ分化能力を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで、成長していない細胞のフィーダー層上で内側の塊細胞を培養することによって単離することができる。再プレーティングされた細胞は、増殖し続け、ＥＳ細胞の新しいコロニーを産生し得、これを除去し、解離し、再び再プレーティングし、成長させ得る。この未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するプロセスを複数回繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を作製することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、その多能性を維持しながら増殖する可能性を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞および細胞分化を制御する遺伝子の研究において有用である。遺伝子操作および選択と組み合わせたＥＳ細胞の多能性は、トランスジェニック、キメラおよびノックアウトマウスの作製を介してインビボでの遺伝子分析研究に使用することができる。
１．胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、高いインビトロ分化能力を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで、成長していない細胞のフィーダー層上で内側の塊細胞を培養することによって単離することができる。再プレーティングされた細胞は、増殖し続け、ＥＳ細胞の新しいコロニーを産生し得、これを除去し、解離し、再び再プレーティングし、成長させ得る。この未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するプロセスを複数回繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を作製することができる（米国特許第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、その多能性を維持しながら増殖する可能性を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞および細胞分化を制御する遺伝子の研究において有用である。遺伝子操作および選択と組み合わせたＥＳ細胞の多能性は、トランスジェニック、キメラおよびノックアウトマウスの作製を介してインビボでの遺伝子分析研究に使用することができる。
【0134】
マウスＥＳ細胞の作製方法は公知である。１つの方法では、マウスの１２９系統からの着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して、栄養外胚葉を除去し、内部細胞塊を、化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で、ウシ胎仔血清を含有する培地中で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎仔血清の存在下でマウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を作製する。一部の方法では、サイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に添加することにより、フィーダー層の非存在下でマウスＥＳ細胞を増殖させることができる（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。他の方法では、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下、無血清培地中で成長させることができる。
【0135】
ヒトＥＳ細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、病理発生、またはクロマチンの再プログラミングおよび胚性細胞を産生するためのその後の再プログラミングされたクロマチンの原形質膜への組み込みによって産生される接合体または胚盤胞期哺乳動物胚から、以前に記載された方法によって産生することができるか、または由来することができる。１つの方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解し、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上で培養される内部細胞塊から除去する。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の塊を化学的または機械的に解離し、再プレーティングし、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、解離し、再プレーティングする（米国特許第６，８３３，２６９号）。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下で線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって、血清なしで増殖させることができる。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、フィーダー細胞層なしで、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する「馴化」培地の存在下で、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することによって増殖させることができる。ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。いくつかの実施形態では、ヒトＥＳ細胞は、ヒト胚の破壊を必要としなかった。これらには、樹立されたＥＳ細胞株の使用が含まれる。
【0136】
ＥＳ細胞はまた、既に記載された方法によるアカゲザルおよびマーモセットを含む他の生物、ならびに樹立されたマウスおよびヒト細胞株に由来し得る。例えば、樹立されたヒトＥＳ細胞株としては、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ－４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞株には、マウス系統１２９胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞株が含まれ、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層のないＬＩＦの存在下で成長させることができる。
【0137】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚性抗原ＳＳＥＡ－１、段階特異的胚性抗原ＳＳＥＡ－３、段階特異的胚性抗原ＳＳＥＡ－４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、腫瘍拒絶抗原１－８１（ＴＲＡ－１－８１）、ＳＯＸ２またはＲＥＸ１を含むタンパク質マーカーによって検出され得る。
【0138】
ａ．体細胞核移植
多能性幹細胞は、体細胞核移植の方法によって調製することができる。体細胞核移植は、紡錘体を含まない卵母細胞へのドナー核の移植を含む。１つの方法では、電気融合によって、霊長類の皮膚線維芽細胞からのドナー線維芽細胞核を、紡錘体を含まない成熟中期ＩＩ霊長類卵母細胞の細胞質に導入する。融合した卵母細胞をイオノマイシンへの曝露によって活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を産生する。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞型に分化する。胚は、これらのＥＳ細胞の産生において破壊されない。
多能性幹細胞は、体細胞核移植の方法によって調製することができる。体細胞核移植は、紡錘体を含まない卵母細胞へのドナー核の移植を含む。１つの方法では、電気融合によって、霊長類の皮膚線維芽細胞からのドナー線維芽細胞核を、紡錘体を含まない成熟中期ＩＩ霊長類卵母細胞の細胞質に導入する。融合した卵母細胞をイオノマイシンへの曝露によって活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を産生する。胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロおよびインビボの両方で複数の細胞型に分化する。胚は、これらのＥＳ細胞の産生において破壊されない。
【0139】
２．誘導多能性幹細胞
多能性の誘導は、多能性に関連する転写因子の導入による体細胞の再プログラミングによって、マウス細胞を使用して２００６年に（Ｙａｍａｎａｋａら）、およびヒト細胞を使用して２００７年に最初に達成された。多能性幹細胞は、未分化状態で維持することができ、ほぼあらゆる細胞型に分化することができる。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に伴う倫理的および実施上の問題のほとんどを回避し、ｉＰＳＣ由来の自己移植片を有する患者は、移植片拒絶を防止するために生涯にわたる免疫抑制処置を必要としない場合がある。
多能性の誘導は、多能性に関連する転写因子の導入による体細胞の再プログラミングによって、マウス細胞を使用して２００６年に（Ｙａｍａｎａｋａら）、およびヒト細胞を使用して２００７年に最初に達成された。多能性幹細胞は、未分化状態で維持することができ、ほぼあらゆる細胞型に分化することができる。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に伴う倫理的および実施上の問題のほとんどを回避し、ｉＰＳＣ由来の自己移植片を有する患者は、移植片拒絶を防止するために生涯にわたる免疫抑制処置を必要としない場合がある。
【0140】
生殖細胞を除いて、任意の細胞をｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、または胃細胞であり得る。細胞は、多分化能細胞、例えば、限定されないが、造血幹細胞、例えば、限定されないが、ＣＤ３４＋細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、再プログラミングのための体細胞の供給源として使用され得る（米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度または細胞が回収される動物の年齢に制限はない；未分化前駆細胞（体性幹細胞を含む）および最終的に分化した成熟細胞でさえも、本明細書中に開示される方法における体細胞の供給源として使用され得る。一実施形態では、体細胞は、それ自体がヒトＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞である。ＲＰＥ細胞は、成体または胎児のＲＰＥ細胞であり得る。ｉＰＳＣは、ヒトＥＳ細胞を特定の細胞型に分化させ、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１を含むヒトＥＳ細胞マーカーを発現することが知られている条件下で成長させることができる。
【0141】
体細胞および多能性幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、当業者に公知の方法を使用して誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生するように再プログラムすることができる。当業者は、誘導多能性幹細胞を容易に産生することができ、例えば、米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号、米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号；米国特許出願公開第２０１２０２７６６３６号；米国特許第８，０５８，０６５号；米国特許第８，１２９，１８７号；米国特許第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００７／０６９６６６ Ａ１および米国特許第８，２６８，６２０号を参照のこと（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一般に、核再プログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を産生するために使用される。いくつかの実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つまたは少なくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４が利用される。
【0142】
細胞は、一般に、体細胞からｉＰＳＣを誘導することができる１またはそれを超える因子である核再プログラミング物質、またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）で処理される。核再プログラミング物質は、一般に、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２またはこれらの分子をコードする核酸を含む。ｐ５３の機能的阻害剤、Ｌ－ｍｙｃまたはＬ－ｍｙｃをコードする核酸、およびＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂまたはＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸を、追加の核再プログラム物質として利用することができる。Ｎａｎｏｇは、核再プログラミングにも利用することができる。米国特許出願公開第２０１２０１９６３６０号に開示されるように、ｉＰＳＣの産生のための例示的な再プログラミング因子としては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘｌ５、Ｓｏｘｌ７またはＳｏｘｌ８で置き換えることができ；Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置き換え可能である；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰ ＶＩ ６ Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；または（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換えることができる）が挙げられる。１つの非限定的な例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ－Ｍｙｃが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２が利用され、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６８２，８２８号を参照されたい。これらの因子には、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２が含まれるが、これらに限定されない。他の例では、因子としては、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの非限定的な例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２が利用される。他の非限定的な例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＳａｌ ４が利用される。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ－Ｍｙｃのような因子は、再プログラミング効率を高めることができ、いくつかの異なる発現ベクターから発現させることができる。例えば、ＥＢＶエレメントに基づく系などの組み込みベクターを使用することができる（米国特許第８，５４６，１４０号）。さらなる態様では、再プログラミングタンパク質は、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入され得る。再プログラミングは、細胞を、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ－３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）受容体阻害剤またはシグナル伝達阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ－κＢ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む１またはそれを超えるシグナル伝達受容体と接触させることをさらに含み得る。これらの調節因子には、小分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセット、またはタンパク質因子が含まれ得る。実質的に任意のｉＰＳ細胞または細胞株が使用され得ることが予想される。
【0143】
これらの核再プログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０６９６６６号に列挙されているＮＣＢＩアクセッション番号を参照して入手可能である。１またはそれを超える再プログラミング物質、またはこれらの再プログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は公知であり、例えば、米国特許出願第２０１２／０１９６３６０号および米国特許第８，０７１，３６９号に開示されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0144】
一旦誘導されると、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地中で培養され得る。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許公開公報第２００３／０２１１６０３号に記載されているように、多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術と共に使用され得る。マウス細胞の場合、通常の培地に白血病抑制因子（ＬＩＦ）を分化抑制因子として添加して培養する。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。ｉＰＳＣの培養および維持のための他の方法を使用してもよい。
【0145】
特定の実施形態では、規定されていない条件を使用することができる。例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終結させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胚性線維芽細胞の共存下で培養される。あるいは、多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地またはＥ８（商標）培地などの規定されたフィーダー非依存性培養系を使用して、本質的に未分化状態で培養および維持され得る。
【0146】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、外因性遺伝子を発現する、内因性遺伝子の発現を増加させる、遺伝子のコピー数を増加させる、遺伝子変異を修正する、または変異体遺伝子の発現をサイレンシングするなどのために改変することができる。いくつかの特定の非限定的な例では、内因性遺伝子の変異または欠失が修正される。この遺伝子は、例えば、レチノイドイソメラーゼ（ＲＰＥ６５）、ベストロフィン（ＢＥＳＴ）１、ＭＥＲチロシンキナーゼ癌原遺伝子（ＭＥＲＴＫ）、ＲＡＢエスコートタンパク質（ＲＥＰ１）、細胞性レチナールデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、プレ－ｍＲＮＡプロセシング因子（ＰＰＲＦ）、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、補体成分３ａ受容体（Ｃ３ａＲ）１、補体成分５受容体（Ｃ５ａＲ１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、補体因子Ｉ（ＣＦＩ）、補体因子２Ｂ（Ｃ２Ｂ）、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー４（ＡＢＣＡ４）、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー１（ＡＢＣＡ１）、膜型フリズルド関連タンパク質（ＭＦＲＰ）、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質５（Ｃ１ｑＴＮＦ５）、精子形成関連タンパク質７（ＳＰＡＴＡ７）、セントロソームタンパク質、２９０ ｋｄ（ＣＥＰ２９０）、ミオシンＶＩＩＡ（ＭＹＯ７Ａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ１（ＦＬＴ－１）、Ｕｓｈｅｒ症候群、Ｉ型（ＵＳＨ１Ａ）、チロシナーゼ、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）、コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型、アルファ－１（ＣＯＬ１８Ａ１）、ＴＴＲＡセリンペプチダーゼ（ＨＴＲＡ）１、ＡＲＭＳ２、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）３、上皮成長因子（ＥＧＦ）含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質（ＥＦＥＭＰ）１、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、転写因子ＥＣ（ＴＦＥＣ）、オルソデンチクル、ショウジョウバエ、ホモログ、２（ＯＴＸ２）、ジンクフィンガータンパク質５０３（ＺＮＦ５０３またはＮＬＺ２）をコードし得る。１つの非限定的な例では、遺伝子はＲＰＥ６５である。別の非限定的な例では、遺伝子はＢＥＳＴ１である。さらなる非限定的な例では、遺伝子はＭＥＴＲＫをコードする。ｉＰＳＣにおいて遺伝子編集を行うための方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｏｃｋｅｎｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ、「Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｅｅｔｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ」、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １８：５７３－５８６，２０１６に開示されている。そこに開示されている方法のいずれも有用である。この方法は、目的の導入遺伝子を終結させるアデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの使用を含むことができる。この方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、レンチウイルス媒介補正、アデノ随伴ウイルス媒介補正、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＦプライム編集の使用を含み得る。
【0147】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、プロモーターに作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーおよび第１のマーカーをコードする核酸配列を含むように、外因性核酸を発現するように改変することができる。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、２０１３年１月１日に入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号２２１７３に開示されている。この配列は、マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６の７番染色体の位置５２８６９７１～５２９１６９１（逆の配向）に整列している。４７２１塩基対の配列は、ＲＰＥ細胞における発現に十分である（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭｕｒｉｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０３：８３８－８４７，２００７を参照のこと）。この構築物は、ＲＰＥ細胞で発現される。他のエンハンサーを利用することができる。他のＲＰＥ特異的エンハンサーとしては、Ｄ－ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＲＰＥ６５、ＶＭＤ２、ＭＥＲＴＫ、ＭＹＲＩＰおよびＲＡＢ２７Ａが挙げられる。適切なプロモーターとしては、限定されないが、チロシナーゼプロモーターを含むＲＰＥ細胞で発現される任意のプロモーターが挙げられる。構築物はまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーターなどの他のエレメントを含むことができる。一般に、構築物で細胞をトランスフェクトすることが有利である。安定なトランスフェクションに適したベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびセンダイウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【0148】
プラスミドは、調節された高コピー数を達成することができ、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用に適合する。いくつかの例では、プラスミドは、大量のＤＮＡを産生および精製することができるように、大腸菌における維持および発酵に適している。プラスミドは安全であり、ヒト患者および動物における使用に適し得る。高コピー数プラスミドは、細菌発酵中に比較的容易に選択され、安定に維持され得る。選択マーカーおよび他のコード配列などのエレメントをプラスミドに含めることができる。いくつかの実施形態において、マーカーをコードするプラスミドには、下記のものが含まれる。（１）高コピー数複製起点、（２）選択マーカー、例えば限定されないが、カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および（４）様々な核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位；ならびに（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列。タンパク質をコードする核酸を誘導するための当技術分野で公知の多数のプラスミドベクター、例えば米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；米国特許第６，４１６，９９８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているベクターがある。
【0149】
ウイルス遺伝子送達システムは、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達システムは、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。
【0150】
いくつかの実施形態では、細胞は、マーカーをコードする核酸分子でトランスフェクトされる。マーカーには、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼまたはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼまたはｎａｎｏｌｕｃ）、または他のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、または内部タンパク質を含む；合成されるかまたは細胞によって取り込まれるかのいずれか）；核酸（例えばｍＲＮＡまたは酵素的に活性な核酸分子）または多糖であり得る。目的の細胞型のマーカーに特異的な抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能な任意のそのような細胞構成要素の決定基が含まれる。マーカーはまた、遺伝子産物の機能に依存する生化学的もしくは酵素アッセイまたは生物学的応答によって同定することができる。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結することができる。さらに、幹細胞からＲＰＥへの分化、またはＲＰＥの機能、または生理学、または病理に影響を及ぼし得る遺伝子など、他の遺伝子を含めることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＴＦＥＣ、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２、ＶＭＤ２、ＣＦＴＲ、ＲＰＥ６５、ＭＦＲＰ、ＣＴＲＰ５、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ２Ｂ、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＢ、ｍＴＯＲ、ＦＯＸＯ、ＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１－６、ＨＴＲＰ１、ＡＢＣＡ４、ＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦＡ、ＣＦＩ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＡＰＰ、ＣＤ４６、ＢＡＣＥ１、ＥＬＯＬＶ４、ＡＤＡＭ １０、ＣＤ５５、ＣＤ５９、およびＡＲＭＳ２のうちの１またはそれより多くをコードする核酸が含まれる。
【0151】
ａ．ＭＨＣハプロタイプ一致
主要組織適合複合体は、同種器官移植の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要なクラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、およびＣ）および３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱ）が存在する。ＨＬＡ遺伝子座は高度に多型性であり、６番染色体上の４Ｍｂにわたって分布している。この領域は自己免疫疾患および感染性疾患に関連し、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響を及ぼし得るので、この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ決定する能力は臨床的に重要である。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞の内側からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞の外側からＴリンパ球に抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答を誘因し、その拒絶をもたらす。したがって、対象は、拒絶を防止するために免疫抑制剤で処置することができる。ＨＬＡ一致幹細胞株は、免疫拒絶のリスクを克服し得る。
主要組織適合複合体は、同種器官移植の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要なクラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、およびＣ）および３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、およびＤＱ）が存在する。ＨＬＡ遺伝子座は高度に多型性であり、６番染色体上の４Ｍｂにわたって分布している。この領域は自己免疫疾患および感染性疾患に関連し、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響を及ぼし得るので、この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ決定する能力は臨床的に重要である。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞の内側からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞の外側からＴリンパ球に抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答を誘因し、その拒絶をもたらす。したがって、対象は、拒絶を防止するために免疫抑制剤で処置することができる。ＨＬＡ一致幹細胞株は、免疫拒絶のリスクを克服し得る。
【0152】
移植におけるＨＬＡの重要性のために、ＨＬＡ遺伝子座は、通常、好ましいドナー・レシピエント対を同定するために血清学およびＰＣＲによって分類される。ＨＬＡクラスＩ抗原およびＨＬＡクラスＩＩ抗原の血清学的検出は、精製Ｔリンパ球または精製Ｂリンパ球を用いた補体媒介リンパ球傷害試験を用いて達成することができる。この手順は、主にＨＬＡ－Ａおよび－Ｂ遺伝子座を一致させるために使用される。分子ベースの組織分類は、多くの場合、血清学的試験よりも正確であり得る。ＰＣＲ産物を一連のオリゴヌクレオチドプローブに対して試験するＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法などの低分解能分子法を使用してＨＬＡ抗原を同定することができ、現在、これらの方法はクラスＩＩ－ＨＬＡ分類に使用される最も一般的な方法である。ＰＣＲ増幅のために対立遺伝子特異的プライマーを利用するＳＳＰ（配列特異的プライマー）法などの高分解能技術は、特異的ＭＨＣ対立遺伝子を同定することができる。
【0153】
ドナー細胞がＨＬＡホモ接合性である場合、すなわち、各抗原提示タンパク質について同一の対立遺伝子を含有する場合、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ適合性は有意に増加する。ほとんどの個体はＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子についてヘテロ接合性であるが、特定の個体はこれらの遺伝子についてホモ接合性である。これらのホモ接合個体はスーパードナーとして働くことができ、それらの細胞から生成された移植片は、そのハプロタイプについてホモ接合またはヘテロ接合のいずれかであるすべての個体に移植することができる。さらに、ホモ接合のドナー細胞が集団において高頻度に見出されるハプロタイプを有する場合、これらの細胞は、多数の個体に対する移植療法において適用を有し得る。
【0154】
したがって、ｉＰＳＣは、処置される対象、または患者と同じもしくは実質的に同じＨＬＡ型を有する別の対象のＣＤ３４＋細胞などの細胞から産生され得る。ある場合において、ドナーの主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－ＤＲの３つの主要な遺伝子座）は、レシピエントの主要なＨＬＡと同一である。場合によっては、体細胞ドナーはスーパードナーであり得る。したがって、ＭＨＣホモ接合性スーパードナーに由来するｉＰＳＣを使用して、ＲＰＥ細胞を作製することができる。したがって、スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである対象に移植され得る。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂなどの２つのＨＬＡ対立遺伝子においてホモ接合性であり得る。このように、スーパードナーから産生されたｉＰＳＣを本明細書中に開示される方法において使用して、多数の潜在的レシピエントに潜在的に「一致」し得るＲＰＥ細胞を作製することができる。
【0155】
ｂ．エピソームベクター
特定の態様では、再プログラミング因子は、１またはそれを超える外因性エピソーム遺伝要素に含まれる発現カセットから発現される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０００３７５７号明細書を参照）。したがって、ｉＰＳＣは、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターエレメントなどの外因性遺伝要素を本質的に含まなくてもよい。これらのｉＰＳＣは、ｉＰＳＣを外因性ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないようにするためにエピソーム的に複製することができるベクターである染色体外複製ベクター（すなわち、エピソームベクター）の使用によって調製される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５４６，１４０号を参照；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドなどのいくつかのＤＮＡウイルスは、哺乳動物細胞において染色体外的またはエピソーム的に複製する。これらのエピソームプラスミドは、本質的に、組込みベクターに関連するこれらのすべての欠点がない（Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。例えば、上で規定したリンパ球指向性ヘルペスウイルス系またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、染色体外で複製し、体細胞への再プログラミング遺伝子の送達を助け得る。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ－１、またはそれらの改変体もしくは機能的等価物である。エピソームベクターの１つの利点は、外因性エレメントが細胞に導入された後に時間とともに失われ、これらのエレメントを本質的に含まない自立型ｉＰＳＣをもたらすことである。
特定の態様では、再プログラミング因子は、１またはそれを超える外因性エピソーム遺伝要素に含まれる発現カセットから発現される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０００３７５７号明細書を参照）。したがって、ｉＰＳＣは、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターエレメントなどの外因性遺伝要素を本質的に含まなくてもよい。これらのｉＰＳＣは、ｉＰＳＣを外因性ベクターまたはウイルス要素を本質的に含まないようにするためにエピソーム的に複製することができるベクターである染色体外複製ベクター（すなわち、エピソームベクター）の使用によって調製される（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，５４６，１４０号を参照；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドなどのいくつかのＤＮＡウイルスは、哺乳動物細胞において染色体外的またはエピソーム的に複製する。これらのエピソームプラスミドは、本質的に、組込みベクターに関連するこれらのすべての欠点がない（Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。例えば、上で規定したリンパ球指向性ヘルペスウイルス系またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、染色体外で複製し、体細胞への再プログラミング遺伝子の送達を助け得る。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ－１、またはそれらの改変体もしくは機能的等価物である。エピソームベクターの１つの利点は、外因性エレメントが細胞に導入された後に時間とともに失われ、これらのエレメントを本質的に含まない自立型ｉＰＳＣをもたらすことである。
【0156】
他の染色体外ベクターとしては、他のリンパ球指向性ヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられる。リンパ球指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）で複製し、その天然のライフサイクルの一部にわたりプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は「リンパ球指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ球指向性ヘルペスウイルスとしては、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。エピソームベースのベクターのさらなる供給源、例えば酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０またはＢＰＶが企図される。
【0157】
ＲＰＥ細胞の産生方法
黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞を産生するための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から産生され得る。いくつかの例では、例えば、スキャフォールドにＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞を播種し、本明細書に提供される培養工程を行うことによって、本明細書に提供されるスキャフォールド上に黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生する。
黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞を産生するための方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から産生され得る。いくつかの例では、例えば、スキャフォールドにＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞を播種し、本明細書に提供される培養工程を行うことによって、本明細書に提供されるスキャフォールド上に黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生する。
【0158】
ＲＰＥ細胞は、それらの色素沈着、上皮形態および頂端－基底極性に基づいて特徴付けることができる。分化したＲＰＥ細胞は、それらの形態および色素の初期外観によって視覚的に認識することができる。ヒトでは、「黄斑」ＲＰＥ細胞は、約１５０μｍ２＋３３μｍ２の面積および花弁状の頂端突起を有し、これらは約０．５～約４μｍの長さ、約０．１～約１μｍの幅、および約０．２～約２μｍのうねりの幅を有する。中心ＲＰＥ細胞は、約１９９μｍ２＋４０μｍ２の面積を有し、花弁状および指状の頂端突起が混在している。「末梢」ＲＰＥ細胞は、約２３９μｍ２＋３３μｍ２の面積と、約０．１～約１μｍの長さおよび約０．１～約１μｍの幅を有する指状の頂端突起とを有する。これらのタイプのＲＰＥ細胞を産生する方法が開示される。
【0159】
さらに、すべての分化したＲＰＥ細胞は、単層を横切る経上皮抵抗／ＴＥＲおよび経上皮電位／ＴＥＰ（ＴＥＲ＞１００オーム＊ｃｍ２；ＴＥＰ＞２ｍＶ）を有し、流体およびＣＯ２を頂端側から基底側に輸送し、サイトカインの極性のある分泌を調節する。ＲＰＥ細胞は、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリーおよび酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの方法論の使用による検出のためのマーカーとして役立ち得るいくつかのタンパク質を発現する。例えば、ＲＰＥ特異的マーカーとしては、細胞性レチナールデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ－１）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）、ベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）およびｃ－ｍｅｒ癌原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）が挙げられ得る。ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ－４、ｎａｎｏｇまたはＲｅｘ－２を（いかなる検出可能なレベルでも）発現しない。具体的には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって評価した場合、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣよりもＲＰＥ細胞において約１/１００～１/１０００である。ＲＰＥ細胞マーカーは、例えば、公的に入手可能な配列データ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））を使用する標準的な増幅方法で配列特異的プライマーを使用する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析、またはドットブロットハイブリダイゼーション分析によってｍＲＮＡレベルで検出され得る。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出される組織特異的マーカーの発現は、そのレベルが、対照細胞（例えば、未分化多能性幹細胞または他の無関係な細胞型）の少なくともまたは約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍または９倍、より具体的には１０倍超、２０倍超、３０倍超、４０倍超、５０倍超またはそれよりも高い場合、陽性であるとみなされる。
【0160】
ｉＰＳＣおよびＥＳＣから黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞を産生するための例示的な方法を以下に開示する。培地中で使用され得る阻害剤の説明は、このセクションの最後に開示される。阻害剤のクラスを参照する場合、任意の特異的阻害剤を使用することができることに留意されたい。
【0161】
１．多能性幹細胞を培養してＲＰＥ前駆細胞を産生する
開示される方法は、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞（ＰＳＣ）を網膜誘導培地中で培養して、細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させることを含む。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号２０１４／１２１０７７は、ｉＰＳＣから産生された胚様体（ＥＢ）を培養方法において利用してＲＰＥ細胞を産生することができる方法を開示している。例えば、ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の添加によってｉＰＳＣから胚様体を産生し、２つのＷＮＴ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する。
開示される方法は、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣなどの多能性幹細胞（ＰＳＣ）を網膜誘導培地中で培養して、細胞のＲＰＥ前駆細胞への分化を開始させることを含む。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号２０１４／１２１０７７は、ｉＰＳＣから産生された胚様体（ＥＢ）を培養方法において利用してＲＰＥ細胞を産生することができる方法を開示している。例えば、ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の添加によってｉＰＳＣから胚様体を産生し、２つのＷＮＴ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する。
【0162】
いくつかの実施形態では、ヒトｉＰＳＣなどのＰＳＣの本質的に単一の細胞懸濁物を本方法で利用することができる。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、細胞凝集を防ぐためにプレコンフルエントまで培養される。特定の態様では、ＰＳＣは、ＴＲＹＰＳＩＮ（商標）またはＴＲＹＰＬＥ（商標）などによって例示される細胞解離酵素とのインキュベーションによって解離される。ＰＳＣは、ピペッティングによって本質的に単一の細胞懸濁物に解離することもできる。さらに、ブレビスタチン（例えば、約２．５μＭ）を培地に添加して、細胞が培養容器に接着していない間に単一細胞に解離した後のＰＳＣ生存を増加させることができる。あるいは、ブレビスタチンの代わりにＲＯＣＫ阻害剤を使用して、単一細胞に解離した後のＰＳＣ生存を増加させることができる。
【0163】
ＲＰＥ細胞を単一細胞ＰＳＣから効率的に分化させるために、入力密度の正確なカウントは、ＲＰＥ分化効率を増加させることができる。したがって、播種前にＰＳＣの単一細胞懸濁物を計数することができる。例えば、ＰＳＣの単一細胞懸濁物は、血球計または自動細胞計数器、例えばＶＩＣＥＬＬ（登録商標）またはＴＣ２０によって計数することができる。細胞は、少なくとも１０，０００細胞／ｍＬ、例えば少なくとも２０，０００細胞／ｍＬ、少なくとも５０，０００細胞／ｍＬ、少なくとも７５，０００細胞／ｍＬ、少なくとも１００，０００細胞／ｍＬ、少なくとも１５０，０００細胞／ｍＬ、または少なくとも２００，０００細胞／ｍＬ、例えば約１０，０００～約５００，０００細胞／ｍＬ、約５０，０００～約２００，０００細胞／ｍＬ、または約７５，０００～約１５０，０００細胞／ｍＬの細胞密度に希釈され得る。非限定的な例では、ＰＳＣの単一細胞懸濁物を、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの完全に規定された培養培地で約１００，０００細胞／ｍＬの密度に希釈する。
【0164】
他の実施形態では、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、約１，０００～約７５，０００細胞／ｃｍ２、例えば約５，０００～約４０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種される。他の実施形態では、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、少なくとも１，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも２，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも５，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも１０，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも２０，０００細胞／ｃｍ２、または少なくとも５０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種され、６ウェルプレートでは、細胞は、ウェルあたり約５０，０００～約４００，０００細胞の細胞密度で播種され得る。例示的な方法では、細胞は、ウェルあたり約１００，０００、約１５０，００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００または約３５０，０００細胞、例えばウェルあたり約２００，００細胞の細胞密度で播種される。
【0165】
ＰＳＣの単一細胞懸濁物が既知の細胞密度で得られると、細胞は一般に、適切な培養容器、例えば組織培養プレート、例えばフラスコ、６ウェル、２４ウェルまたは９６ウェルプレートに播種される。細胞を培養するために使用される培養容器は、特に限定されないが、その中で幹細胞を培養することができる限り、フラスコ、組織培養用フラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養用皿、マルチ皿、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラーボトルを含むことができる。細胞は、培養の必要性に応じて、少なくともまたは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはその中の導き出せる任意の範囲の体積で培養され得る。特定の実施形態では、培養容器はバイオリアクターであってもよく、バイオリアクターは、細胞を増殖させることができるように生物学的に活性な環境を支持するエクスビボの任意のデバイスまたはシステムを指してもよい。バイオリアクターは、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、または導き出せる任意の範囲の体積を有することができる
【0166】
ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、一般に、細胞生存率を維持しながら細胞接着を促進するために、１またはそれを超える細胞接着タンパク質を含むマトリックスでコーティングされた培養プレート上で培養される。例えば、例示的な細胞接着タンパク質としては、多能性細胞成長のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングするために使用され得るビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンなどの少なくとも１つの細胞接着タンパク質を含むマトリックス上で培養される。ラミニン、ビトロネクチンおよび／またはフィブロネクチンの組み合わせも有用である。他の実施形態では、ＰＳＣは、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンでコーティングされた培養プレート上で増殖される。いくつかの実施形態では、細胞接着タンパク質はヒトタンパク質である。
【0167】
細胞外マトリックスを利用することができる。「細胞外マトリックス」という用語は、当技術分野で認識されている。その構成要素には、以下のタンパク質：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンカリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、アンジュリン、エピリグリン、およびカリニンのうちの１またはそれより多くが含まれる。
【0168】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は、天然起源のものであり得、ヒトまたは動物組織から精製され得るか、あるいはＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作された組換えタンパク質または性質において合成のものであり得る。ＥＣＭタンパク質は、天然または操作された全タンパク質またはペプチド断片の形態であり得る。細胞培養のためのマトリックスに有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、マトリックス組成物は、フィブロネクチンまたは組換えフィブロネクチンの合成的に生成されたペプチド断片を含む。いくつかの実施形態では、マトリックス組成物はゼノフリーである。例えば、ヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリックスでは、ヒト起源のマトリックス構成要素が使用され得、任意の非ヒト動物の構成要素が除外され得る。
【0169】
いくつかの態様では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬである。他の実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである。
【0170】
ａ．培養条件
ＲＰＥ細胞またはＰＳＣなどの細胞は、ＲＰＥ前駆細胞などの各特定の細胞集団の増殖を支持するのに必要な栄養素と共に培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含有し得る。例示的な増殖培地は、幹細胞増殖を増強するために非必須アミノ酸およびビタミンなどの様々な栄養素を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含有する。最小必須培地の例には、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地およびＦ１２培地が含まれるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地には、ウマ、仔ウシまたはウシ胎仔血清などの添加剤を補充してもよい。あるいは、培地は無血清であり得る。他の場合では、増殖培地は、本明細書では培養中に幹細胞などの未分化細胞を増殖および維持するように最適化された無血清製剤と呼ばれる「ノックアウト血清代替物」を含有し得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００２／００７６７４７号に開示されている。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、完全に規定されたフィーダーフリー培地中で培養される。
ＲＰＥ細胞またはＰＳＣなどの細胞は、ＲＰＥ前駆細胞などの各特定の細胞集団の増殖を支持するのに必要な栄養素と共に培養することができる。一般に、細胞は、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するための緩衝液を含む増殖培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含有し得る。例示的な増殖培地は、幹細胞増殖を増強するために非必須アミノ酸およびビタミンなどの様々な栄養素を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含有する。最小必須培地の例には、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地およびＦ１２培地が含まれるが、これらに限定されない。さらに、最小必須培地には、ウマ、仔ウシまたはウシ胎仔血清などの添加剤を補充してもよい。あるいは、培地は無血清であり得る。他の場合では、増殖培地は、本明細書では培養中に幹細胞などの未分化細胞を増殖および維持するように最適化された無血清製剤と呼ばれる「ノックアウト血清代替物」を含有し得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００２／００７６７４７号に開示されている。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、完全に規定されたフィーダーフリー培地中で培養される。
【0171】
したがって、単一細胞ＰＳＣは、一般に、播種後に完全に規定された培養培地中で培養される。特定の態様では、播種後約１８～２４時間で、培地を吸引し、Ｅ８（商標）培地などの新鮮な培地を培養物に添加する。特定の態様では、単一細胞ＰＳＣは、播種後約１、２または３日間、完全に規定された培養培地中で培養される。いくつかの非限定的な例では、単一細胞ＰＳＣは、分化プロセスを進める前に、完全に規定された培養培地中で約２日間培養される。
【0172】
いくつかの実施形態では、培地は血清の代替物を含有し得る。血清の代替物には、アルブミン（例えば、脂質リッチなアルブミン、アルブミン置換物、例えば、組換えアルブミン、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール、またはそれらの等価物を適切に含有する材料が含まれ得る。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示された方法により調製することができる。あるいは、より簡便にするために、任意の市販の材料を使用することができる。市販の材料としては、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、化学的に規定された濃縮脂質（Ｇｉｂｃｏ）、およびＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。培地は無血清であり得る。
【0173】
その他の培養条件は適宜定めることができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃、例えば、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、特にこれらに限定されない。一実施形態では、細胞は３７℃で培養される。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、例えば約２～５％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。酸素圧力は、少なくとも、最大、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。
【0174】
２．分化培地および段階的培養
ａ．網膜誘導培地
ＥＳ細胞またはｉＰＳＣなどのＰＳＣが培養プレートに接着した後、細胞を網膜誘導培地中で培養して、ＲＰＥ前駆細胞への分化プロセスを開始することができる。網膜誘導培地（ＲＩＭ）は、ＷＮＴ経路阻害剤を含み、網膜系統細胞へのＰＳＣの分化をもたらし得る。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。
ａ．網膜誘導培地
ＥＳ細胞またはｉＰＳＣなどのＰＳＣが培養プレートに接着した後、細胞を網膜誘導培地中で培養して、ＲＰＥ前駆細胞への分化プロセスを開始することができる。網膜誘導培地（ＲＩＭ）は、ＷＮＴ経路阻害剤を含み、網膜系統細胞へのＰＳＣの分化をもたらし得る。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。
【0175】
ＲＩＭは、約１：１の比でＤＭＥＭおよびＦ１２を含むことができる。例示的な方法では、ＷＮＴ経路阻害剤がＲＩＭに含まれ（ＣＫＩ－７など）、ＢＭＰ経路阻害剤が含まれ（ＬＤＮ１９３１８９など）、ＴＧＦβ経路阻害剤が含まれる（ＳＢ４３１５４２など）。例えば、ＲＩＭは、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、例えば約１０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．１μＭ～約５μＭ、例えば約０．５μＭのＣＫＩ－７、および約０．５μＭ～約１０μＭ、例えば約１μＭのＳＢ４３１５４２を含む。さらに、ＲＩＭは、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物、例えば約１％～約５％、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、アスコルビン酸およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ１は、動物を含まないＩＧＦ１（ＡＦ－ＩＧＦ１）であり、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１ｎｇ／ｍＬの濃度でＲＩＭに含まれる。培地を毎日吸引し、新鮮なＲＩＭと交換することができる。細胞は一般に、ＲＰＥ前駆細胞を産生するために、ＲＩＭ中で約１～約５日間、例えば約１、２、３、４または５日間、例えば約２日間培養される。
【0176】
ｂ．網膜分化培地
得られたＲＰＥ前駆細胞は、その後、拘束ＲＰＥ細胞へのさらなる分化のために網膜分化培地（ＲＤＭ）中で培養することができる。ＲＤＭには、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤が含まれる。ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＩＧＦ１を含むことができる。
得られたＲＰＥ前駆細胞は、その後、拘束ＲＰＥ細胞へのさらなる分化のために網膜分化培地（ＲＤＭ）中で培養することができる。ＲＤＭには、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤が含まれる。ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＩＧＦ１を含むことができる。
【0177】
一実施形態では、ＲＤＭは、ＣＫＩ－７などのＷＮＴ経路阻害剤、ＬＤＮ１９３１８９などのＢＭＰ経路阻害剤、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ経路阻害剤、およびＰＤ０３２５９０などのＭＥＫ阻害剤を含む。あるいは、ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびｂＦＧＦ阻害剤を含むことができる。一般に、Ｗｎｔ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較してＲＤＭではより高く、例えば約９～約１１倍高く、例えば約１０倍高い。例示的な方法では、ＲＤＭは、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ、例えば約１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭ～約１０μＭ、例えば約５μＭのＣＫＩ－７、約１μＭ～約５０μＭ、例えば約１０μＭのＳＢ４３１５４２、および約０．１μＭ～約１０μＭ、例えば約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、または９μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。
【0178】
一般に、ＲＤＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（例えば、約１％～約５％、例えば約１．５％）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、アスコルビン酸およびＩＧＦ１（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。特定の方法では、前日からの培地を吸引した後、細胞に新鮮なＲＤＭを毎日与える。一般に、細胞をＲＤＭ中で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６日間、例えば約７日間培養して、拘束ＲＰＥ細胞を誘導する。
【0179】
ｃ．網膜培地
得られた拘束ＲＰＥ細胞は、その後、網膜培地（ＲＭ）中で培養することによってさらに分化して未成熟ＲＰＥ細胞を形成する。網膜培地はアクチビンＡを含み、ニコチンアミドをさらに含むことができる。ＲＭは、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、および約１ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約１０ｍＭのニコチンアミドを含むことができる。あるいは、ＲＭは、他のＴＧＦ－β経路アクチベーター、例えばＧＤＦ１および／またはＷＮＴ経路アクチベーター、例えばＷＡＹ－３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）または２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジンを含むことができる。いくつかの例では、ＲＭはＷＮＴ３ａをさらに含む。
得られた拘束ＲＰＥ細胞は、その後、網膜培地（ＲＭ）中で培養することによってさらに分化して未成熟ＲＰＥ細胞を形成する。網膜培地はアクチビンＡを含み、ニコチンアミドをさらに含むことができる。ＲＭは、約５０～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、および約１ｍＭ～約５０ｍＭ、例えば約１０ｍＭのニコチンアミドを含むことができる。あるいは、ＲＭは、他のＴＧＦ－β経路アクチベーター、例えばＧＤＦ１および／またはＷＮＴ経路アクチベーター、例えばＷＡＹ－３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）または２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジル－アミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジンを含むことができる。いくつかの例では、ＲＭはＷＮＴ３ａをさらに含む。
【0180】
ＲＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、約１％～約５％、例えば約１．５％のｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含み得る。培地は室温ＲＭで毎日交換することができる。細胞は一般に、未成熟ＲＰＥ細胞を誘導または産生するために、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７日間、例えば約１０日間、ＲＭ中で培養される。
【0181】
ｄ．ＲＰＥ成熟培地
未成熟ＲＰＥ細胞のさらなる分化のために、細胞を続いてＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ－ＭＭ）中で培養して、黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞を形成する。ＲＰＥ成熟培地は、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、例えば約２５０μｇ／ｍＬのタウリン、約１０μｇ／Ｌ～約３０μｇ／Ｌ、例えば約２０μｇ／Ｌのヒドロコルチゾンおよび約０．００１μｇ／Ｌ～約０．１μｇ／Ｌ、例えば約０．０１３μｇ／Ｌのトリヨードチロニンを含むことができる。いくつかの例では、ＲＰＥ－ＭＭは、ＭＥＭアルファ、Ｎ－２サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎仔血清（例えば、約０．５％～約１０％、例えば約１％～約５％）を含む。
未成熟ＲＰＥ細胞のさらなる分化のために、細胞を続いてＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ－ＭＭ）中で培養して、黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞を形成する。ＲＰＥ成熟培地は、約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、例えば約２５０μｇ／ｍＬのタウリン、約１０μｇ／Ｌ～約３０μｇ／Ｌ、例えば約２０μｇ／Ｌのヒドロコルチゾンおよび約０．００１μｇ／Ｌ～約０．１μｇ／Ｌ、例えば約０．０１３μｇ／Ｌのトリヨードチロニンを含むことができる。いくつかの例では、ＲＰＥ－ＭＭは、ＭＥＭアルファ、Ｎ－２サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、およびウシ胎仔血清（例えば、約０．５％～約１０％、例えば約１％～約５％）を含む。
【0182】
培地は、室温ＲＰＥ－ＭＭで１日おきに交換することができる。ＲＰＥ－ＭＭは、ＲＡＲアンタゴニスト、カノニカルＷｎｔ阻害剤、またはその両方を含み得る。例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、およびリアロゾールジヒドロクロリドが含まれる。いくつかの非限定的な例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９である。例示的なカノニカルＷｎｔ阻害剤には、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、およびＴＣ－Ｅ ５００１が含まれる。いくつかの非限定的な例では、カノニカルＷｎｔ阻害剤はＥｎｄｏ－１－ＩＷＲである。
【0183】
未成熟細胞は、一般に、ＲＰＥ－ＭＭ中で約５～約１０日間、例えば約５日間培養される。次いで、細胞を、例えば細胞解離酵素を用いて解離させ、再播種し、さらなる期間、例えばさらに約５～約５０日間、約５～約４０日間または約５～約３０日間培養することができる。細胞は、ＲＡＲアンタゴニスト、Ｗｎｔ阻害剤またはその両方の存在下でＲＰＥ細胞にさらに分化させるために、例えば、約１５～約２０日間、約１５～約２５日間、または約２０～約２５日間、または約２０～約３０日間、約３０～約４０日間、約３０～約５０日間、または約４０～約５０日間培養することができる。具体的な非限定的な例では、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞、または末梢ＲＰＥ細胞を産生するために、細胞を、ＲＡＲアンタゴニスト、カノニカルＷｎｔ阻害剤、またはその両方の存在下、約１５～約５０日間、例えば約２０～約５０日間、約３０～約５０日間、または約４０～約５０日間、ＲＰＥ－ＭＭ中で培養する。
【0184】
ｉ．黄斑ＲＰＥ細胞の産生
いくつかの実施形態では、本方法は、黄斑ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ－ＭＭは、ＲＡＲアンタゴニストを含むが、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含まない。黄斑ＲＰＥ細胞は、ヒト黄斑ＲＰＥ細胞であり得る。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３およびリアロゾールジヒドロクロリドのうちの１またはそれより多くが含まれる。
いくつかの実施形態では、本方法は、黄斑ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ－ＭＭは、ＲＡＲアンタゴニストを含むが、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含まない。黄斑ＲＰＥ細胞は、ヒト黄斑ＲＰＥ細胞であり得る。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３およびリアロゾールジヒドロクロリドのうちの１またはそれより多くが含まれる。
【0185】
いくつかの非限定的な例では、ＲＰＥ－ＭＭ中のＲＡＲアンタゴニストは、ＡＧＮ １９３１０９である。ＲＰＥ－ＭＭは、約０．０５～約０．４μＭのＡＧＮ １９３１０９、例えば約０．１～約０．２μＭのＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．０５～約０．３μＭ、約０．０５～約０．２μＭ、または約０．０５～約０．１μＭのＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．０５～約０．４μＭ、約０．１～約０．２μＭ、約０．１５～約０．４μＭ、約０．２～約０．４μＭ、約０．２５～約０．４μＭ、約０．３～約０．４μＭ、または約０．３５～約０．４μＭのＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．１μＭ、約０．１５、または約０．２μＭのＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。
【0186】
未成熟ＲＰＥ細胞は、一般に、ＲＡＲアンタゴニストを含有するがカノニカルＷｎｔ阻害剤を含有しないＲＰＥ－ＭＭ中で、約５～約５０日間、例えば約５～約２５日間、例えば約５～約１０日間、例えば約５日間培養される。次いで、細胞を、例えば細胞解離酵素を用いて解離させ、再播種し、ＲＡＲアンタゴニストの存在下で中心ＲＰＥ細胞にさらに分化させるために、さらなる期間、例えばさらなる約５～約５０日間、例えば約５～約４０日間、例えば約５～約３０日間、例えば約１５～約２０日間、約１５～約２５日間、または約２０～約２５日間、約２０～約３０日間、約３０～約４０日間、約４０～約５０日間、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０日間培養することができる。具体的な非限定的な例では、中心ＲＰＥ細胞を産生するために、未成熟ＲＰＥ細胞を、ＲＡＲアンタゴニストを含有するＲＰＥ－ＭＭ中で約１５～約２５日間培養する。
【0187】
特定の非限定的な例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９である。
【0188】
ｉｉ．中心ＲＰＥ細胞の産生
他の実施形態では、本方法は、中心ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ－ＭＭは、ＲＡＲアンタゴニストとカノニカルＷｎｔ阻害剤の両方を含む。中心ＲＰＥ細胞は、ヒト中心ＲＰＥ細胞であり得る。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３およびリアロゾールジヒドロクロリドが含まれる。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なカノニカルＷｎｔ阻害剤には、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、およびＴＣ－Ｅ ５００１が含まれる。
他の実施形態では、本方法は、中心ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ－ＭＭは、ＲＡＲアンタゴニストとカノニカルＷｎｔ阻害剤の両方を含む。中心ＲＰＥ細胞は、ヒト中心ＲＰＥ細胞であり得る。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３およびリアロゾールジヒドロクロリドが含まれる。ＲＰＥ－ＭＭ中に存在し得る例示的なカノニカルＷｎｔ阻害剤には、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、およびＴＣ－Ｅ ５００１が含まれる。
【0189】
いくつかの非限定的な例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９であり、カノニカルＷｎｔ阻害剤はＥＮＤＯ１－１ＷＲである。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約１０ｎＭ～約５０ｎＭのＡＧＮ １９３１０９および約０．０２５～約０．５μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲ、例えば約２５ｎＭ～約５０ｎＭのＡＧＮ １９３１０９および約０．１μＭ～約０．２μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含むことができる。
【0190】
ＲＰＥ－ＭＭは、約１０ｎＭ～約４０ｎＭ、約１０ｎＭ～約３０ｎＭ、約１０ｎＭ～約２０ｎＭ、約２０ｎＭ～約５０ｎＭ、約３０ｎＭ～約５０ｎＭまたは約４０ｎＭ～約５０ｎＭ のＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．０２５～約０．４μＭ、約０．０２５～約０．３μＭ、約０．０２５～約２μＭ、または約０．０２５～約１μＭのＡＮＧ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．０５～約０．５μＭ、約０．１～約０．５μＭ、約０．１５～約０．５μＭ、約０．２～約０．５μＭ、約０．２５～約０．５μＭ、約０．３～約０．５μＭ、約０．３５～約０．５μＭ、約０．４～約０．５μＭ、または約０．４５～約０．５μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含むことができる。
【0191】
ＲＰＥ－ＭＭは、約２５～約４５ｎＭ、約２５～約４０ｎＭ、約２５～約３５ｎＭ、または約２５～約３０ｎＭのＡＧＮ １９３１０９を含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、約０．１～約０．１２５μＭ、約０．１～約０．１５μＭ、または約０．１～約０．１７５μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含むことができる。
【0192】
未成熟ＲＰＥ細胞は、一般に、ＲＡＲアンタゴニストおよびカノニカルＷｎｔ阻害剤を含有するＲＰＥ－ＭＭ中で、約５～約５０日間、例えば約５～約２５日間、例えば約５～約１０日間、例えば約５日間培養される。次いで、細胞を、例えば細胞解離酵素を用いて解離させ、再播種し、ＲＡＲアンタゴニストおよびカノニカルＷｎｔ阻害剤の存在下で中心ＲＰＥ細胞にさらに分化させるために、さらなる期間、例えばさらなる約５～約５０日間、例えば約５～約４０日間、例えば約５～約３０日間、例えば約１５～約２０日間、約１５～約２５日間、または約２０～約２５日間、約２０～約３０日間、約３０～約４０日間、約４０～約５０日間、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０日間培養することができる。具体的な非限定的な例では、中心ＲＰＥ細胞を産生するために、未成熟ＲＰＥ細胞を、ＲＡＲアンタゴニストおよびカノニカルＷｎｔ阻害剤を含有するＲＰＥ－ＭＭ中で約１５～約２５日間培養する。
【0193】
ｉｉｉ．末梢ＲＰＥ細胞の産生
さらなる実施形態では、本方法は、末梢ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ成熟培地は、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含むが、ＲＡＲアンタゴニストは含まない。末梢ＲＰＥ細胞は、ヒト末梢ＲＰＥ細胞であり得る。
さらなる実施形態では、本方法は、末梢ＲＰＥ細胞を産生し、ＲＰＥ成熟培地は、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含むが、ＲＡＲアンタゴニストは含まない。末梢ＲＰＥ細胞は、ヒト末梢ＲＰＥ細胞であり得る。
【0194】
ＲＲＰＥ ＭＭ中に存在し得る例示的なカノニカルＷｎｔ阻害剤には、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、およびＴＣ－Ｅ ５００１が含まれる。非限定的な例では、ＲＲＰＥ ＭＭに存在するカノニカルＷｎｔ阻害剤は、Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲである。
【0195】
いくつかの非限定的な例では、ＲＰＥ－ＭＭは、約０．５～約８μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲ、例えば約１～約４μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含む。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約０．５～約７μＭ、約０．５～約６μＭ、約０．５～約５μＭ、約０．０５～約４μＭ、約０．０５～約３μＭ、約０．０５～約２μＭ、または約０．０５～約１μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含むことができる。ＲＰＥ－ＭＭは、例えば、約１～約２μＭまたは約１～約３μＭのＥｎｄｏ－１－ＩＷＲを含むことができる。
【0196】
未成熟ＲＰＥ細胞は、一般に、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含有するがＲＡＲアンタゴニストを含有しないＲＰＥ－ＭＭ中で、約５～約５０日間、例えば約５～約２５日間、例えば約５～約１０日間、例えば約５日間培養される。次いで、細胞を、例えば細胞解離酵素を用いて解離させ、再播種し、カノニカルＷｎｔ阻害剤の存在下で中心ＲＰＥ細胞にさらに分化させるために、さらなる期間、例えばさらなる約５～約５０日間、例えば約５～約４０日間、例えば約５～約３０日間、例えば約１５～約２０日間、約１５～約２５日間、または約２０～約２５日間、約２０～約３０日間、約３０～約４０日間、約４０～約５０日間、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０日間培養することができる。具体的な非限定的な例では、中心ＲＰＥ細胞を産生するために、未成熟ＲＰＥ細胞を、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含有するＲＰＥ－ＭＭ中で約１５～約２５日間培養する。
【0197】
３．凍結保存
本明細書に開示される方法によって産生された黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、凍結保存することができ、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号２０１２／１４９４８４ Ａ２を参照されたい。細胞は、基材の有無にかかわらず凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲およびそれらの重複範囲である。いくつかの実施形態では、凍結保存細胞の貯蔵（例えば、維持）にはより低い温度が使用される。いくつかの実施形態では、液体窒素（または他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態では、細胞は約６時間を超えて保存される。さらなる実施形態では、細胞は約７２時間保存される。いくつかの実施形態では、細胞は、４８時間～約１週間保存される。さらに他の実施形態では、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７または８週間保存される。さらなる実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別個に、または本明細書に開示される基材のいずれかなどの基材上で凍結保存することができる。
本明細書に開示される方法によって産生された黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、凍結保存することができ、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号２０１２／１４９４８４ Ａ２を参照されたい。細胞は、基材の有無にかかわらず凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、貯蔵温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃の範囲およびそれらの重複範囲である。いくつかの実施形態では、凍結保存細胞の貯蔵（例えば、維持）にはより低い温度が使用される。いくつかの実施形態では、液体窒素（または他の同様の液体冷却剤）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態では、細胞は約６時間を超えて保存される。さらなる実施形態では、細胞は約７２時間保存される。いくつかの実施形態では、細胞は、４８時間～約１週間保存される。さらに他の実施形態では、細胞は、約１、２、３、４、５、６、７または８週間保存される。さらなる実施形態では、細胞は、１、２、３、４、５、６７、８、９、１０、１１または１２ヶ月間保存される。細胞は、より長い時間保存することもできる。細胞は、別個に、または本明細書に開示される基材のいずれかなどの基材上で凍結保存することができる。
【0198】
いくつかの実施形態では、追加の凍結保護剤を使用することができる。例えば、ＤＭ８０、ヒトまたはウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンなどの１またはそれを超える凍結保護剤を含む凍結保存溶液中で細胞を凍結保存することができる。凍結保護剤は、細胞膜にインターカレートし、凍結を生き延びるように細胞の特性を変化させることができる。中心ＲＰＥ細胞、末梢ＲＰＥ細胞および黄斑ＲＰＥ細胞は、単離された集団として凍結保存することができ、または凍結保存前に目的の比率で混合することができる。
【0199】
特定の実施形態では、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％・、約８％、約９％、または約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態では、溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％、または約８％・～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアルブミンを含む。特定の実施形態では、溶液は２．５％ ＤＭＳＯを含む。別の具体的な実施形態では、溶液は１０％ ＤＭＳＯを含む。
【0200】
細胞は、例えば、凍結保存中に約１℃分で冷却され得る。いくつかの実施形態では、凍結保存温度は、約－８０℃～約－１８０℃、または約－１２５℃～約－１４０℃である。いくつかの実施形態では、細胞は、約１℃／分で冷却する前に４℃に冷却される。凍結保存細胞は、使用のために解凍する前に液体窒素の気相に移すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、細胞が約－８０℃に達すると、それらは液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存は、制御された速度の冷凍庫を用いて行うこともできる。凍結保存細胞は、例えば、約２５℃～約４０℃の温度、例えば、約３７℃の温度で解凍され得る。次いで、細胞は、以下に論じるように、スキャフォールド上で成熟させることができる。
【0201】
４．固体支持体上でのＲＰＥ細胞の成熟
ＲＰＥ細胞は、例えばＰＬＧＡおよびＰＣＬループを含有する本明細書に提供されるスキャフォールドなどの固体支持体中または固体支持体上で、成熟のための継続期間にわたってＲＰＥ－ＭＭ（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）中で培養することができる。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、または１０ｃｍプレートなどのウェル（プラスチック非透過性または半透過性表面を有するものなど）で増殖される。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、ＰＬＧＡ層およびＰＬＧＡ層の上面に付着されたＰＣＬループの層からなる生分解性スキャフォールドなどの本明細書に開示されるスキャフォールド上で増殖および成熟される。ＲＰＥ細胞は、スキャフォールド上のＲＰＥ－ＭＭ中で、約２～約１０週間、例えば約３～４週間、約６～８週間、例えば２、３、４、５、６、７、または８週間維持することができる。いくつかの非限定的な例では、ＲＰＥ細胞をスキャフォールド上の培地中で約２～６週間、例えば約５週間培養して、成熟および機能性の黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞の単層を得る。この培養により、スキャフォールド上に極性化した黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞が生じ、これらが一緒になって組織インプラントを形成する。
ＲＰＥ細胞は、例えばＰＬＧＡおよびＰＣＬループを含有する本明細書に提供されるスキャフォールドなどの固体支持体中または固体支持体上で、成熟のための継続期間にわたってＲＰＥ－ＭＭ（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）中で培養することができる。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、または１０ｃｍプレートなどのウェル（プラスチック非透過性または半透過性表面を有するものなど）で増殖される。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、ＰＬＧＡ層およびＰＬＧＡ層の上面に付着されたＰＣＬループの層からなる生分解性スキャフォールドなどの本明細書に開示されるスキャフォールド上で増殖および成熟される。ＲＰＥ細胞は、スキャフォールド上のＲＰＥ－ＭＭ中で、約２～約１０週間、例えば約３～４週間、約６～８週間、例えば２、３、４、５、６、７、または８週間維持することができる。いくつかの非限定的な例では、ＲＰＥ細胞をスキャフォールド上の培地中で約２～６週間、例えば約５週間培養して、成熟および機能性の黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞の単層を得る。この培養により、スキャフォールド上に極性化した黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞が生じ、これらが一緒になって組織インプラントを形成する。
【0202】
いくつかの実施形態では、スキャフォールドは、スキャフォールドからの大部分の乳酸放出がインビトロで起こるように十分な時間培養される。いくつかの実施形態では、乳酸放出の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％超がインビトロで起こる。したがって、いくつかの実施形態では、スキャフォールド上のＲＰＥ－ＭＭ中でＲＰＥを約２～約１０週間、例えば約６～８週間または３～５週間、例えば３、４、５、６、７、または８週間維持することにより、この効果が達成される。いくつかの非限定的な例では、スキャフォールド上の培地中でＲＰＥ細胞を約２～６週間、例えば約３、４または５週間培養することにより、この効果が達成される。
【0203】
スキャフォールド上にＲＰＥ細胞、ＰＲＰ細胞、またはその両方（例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞）を播種する前に、スキャフォールドを滅菌することができる（例えば、ガンマ線照射、電子ビーム（ｅｂｅａｍ）を使用）。
【0204】
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞、未成熟ＲＰＥ細胞を、ＰＬＧＡスキャフォールドの直径１２ｍｍあたり約１２５，０００～約５００，０００細胞、例えば直径１２ｍｍあたり約１５０，０００細胞、直径１２ｍｍあたり約２００，０００細胞、直径１２ｍｍあたり約２５０，０００細胞、直径１２ｍｍあたり約３００，０００細胞、直径１２ｍｍあたり約３５０，０００細胞、直径１２ｍｍあたり約４００，０００細胞、またはスキャフォールド（ＰＬＧＡスキャフォールドなど）の直径１２ｍｍあたり約４５０，０００細胞で、スキャフォールド上に播種する。
【0205】
いくつかの実施形態では、成熟黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞は、スキャフォールド上のＲＰＥ－ＭＭ（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）における継続培養によって、無傷の黄斑、中心または末梢ＲＰＥ組織として挙動する単層に発達する。追加の小分子をＲＰＥ－ＭＭに含めることができる（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）。いくつかの実施形態では、これらの小分子は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィディコリンなどの一次繊毛インデューサーである。ＰＧＥ２は、約２５μＭ～約２５０μＭ、例えば約５０μＭ～約１００μＭの濃度でＲＰＥ－ＭＭに添加することができる。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞の継続的な成熟のために、ＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤を含むＲＰＥ－ＭＭ（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）中で、細胞解離酵素、例えばＴＲＹＰＬＥ（商標）中で未成熟ＲＰＥ細胞を解離させ、特殊なＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）設計などのスキャフォールド上に少なくとも約１～２週間再播種することができる。あるいは、ＲＰＥ－ＭＭ（例えば、カノニカルＷｎｔ阻害剤、ＲＡＲアンタゴニスト、またはその両方を含有するもの）は、ＭＥＫ阻害剤の代わりにｂＦＧＦ阻害剤を含むことができる。分解性スキャフォールド上でＲＰＥ細胞を培養するための適切な方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１４／１２１０７７およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０２０／１０６６２２に教示および記載されており、これらは両方ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔には、この方法の主要な構成要素は、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレート、生体不活性０－リング、および生分解性スキャフォールド、例えば上に開示されるＰＬＧＡスキャフォールドのいずれかである。ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレートは、生分解性スキャフォールドのための構造およびプラットフォームを提供する。頂端側および基底側を作り出す微孔質膜は、スキャフォールドを支持するとともに、細胞の極性化した層の別個の側を単離する。膜を剥離するＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）インサートの能力は、インサートの支持リングをスキャフォールドのためのアンカーとして使用することを可能にする（以下を参照）。次いで、スキャフォールド上の得られた黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞の単層を単離し、組織置換インプラントとして使用することができる。
【0207】
さらに他の実施形態では、スキャフォールド上の得られた成熟黄斑、中心または末梢ＲＰＥ細胞は、約－５０～約－６０ｍＶの静止電位および約５～約１０μｌ ｃｍ－２ｈ－１の流体輸送速度を有する。さらなる実施形態では、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞は、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＬＨＸ２、ＴＦＥＣ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ３、ＣＬＤＮ１０、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＢＥＳＴ１、ＴＩＭＰ３、ＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ３、ＴＴＲ、ＶＥＧＦＡ、ＣＳＰＧ５、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲ、ＳＩＬＶ、ＳＩＬ１、ＭＬＡＮＡ、ＲＡＢ２７Ａ、ＯＣＡ２、ＧＰＲ１４３、ＧＰＮＭＢ、ＭＹＯ６、ＭＹＲＩＰ、ＲＰＥ６５、ＲＢＰ１、ＲＢＰ４、ＲＤＨ５、ＲＤＨ１１、ＲＬＢＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＦＢＬＮ１、ＳＬＣ１６Ａ１、ＫＣＮＶ２、ＫＣＮＪ１３、およびＣＦＴＲを発現し、ｍｉＲ２０４およびｍｉＲ２１１を発現し、約－５０～約－６０ｍＶの静止電位を有し、約５～約１０μｌ ｃｍ－２ｈ－１の流体輸送速度を有する。他の実施形態では、ＲＰＥ細胞は、１００Ω＊ｃｍ２超、例えば２００Ω＊ｃｍ２超の経皮抵抗を有する。さらなる実施形態では、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞または末梢ＲＰＥ細胞は、１００Ω＊ｃｍ２～５００Ω＊ｃｍ２の経皮抵抗、例えば２００Ω＊ｃｍ２～４００Ω＊ｃｍ２の経皮抵抗を有する。
【0208】
１つの非限定的な例では、ａ）ビトロネクチンでコーティングされたＰＬＧＡの第１の層およびそれに付着したＰＣＬループの第２の層を含む本明細書に提供されるスキャフォールドであって、スキャフォールドのＰＬＧＡ部分はメッシュ構造を形成する繊維を含み、スキャフォールドのＰＬＧＡ部分は上面および下面を有し、ＰＬＧＡスキャフォールドは約５～約４０ミクロンの厚さ（例えば、高さ）であり、約１：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比、約１ミクロン未満の平均孔径、および約１５０～約６５０ｎｍの繊維径を有し、ＰＣＬループは約５～約３００ミクロンの直径を有する、スキャフォールドを提供すること；ｂ）多能性幹細胞、ＲＰＥ前駆細胞、拘束ＲＰＥ細胞または未成熟ＲＰＥ細胞をスキャフォールドの直径（ｃｍ）あたり約１００，０００～約５００，０００個の細胞でスキャフォールド上に播種すること；ｃ）スキャフォールド上のｉ個の細胞を、ｉ）ＲＰＥ細胞の極性化およびｉｉ）スキャフォールドのバルク分解に十分な時間、スキャフォールドの上面および下面の両方に培地が存在する状態で、インビトロで組織培養培地中で培養すること；ｄ）先にスキャフォールド上に播種された未成熟ＲＰＥから生成された成熟黄斑、中心または末梢ＲＰＥの層上に、スキャフォールドの直径（ｃｍ）あたり約１，０００，０００～約６，０００，０００個のＰＲＰ細胞でＰＲＰ細胞を播種すること；ｅ）スキャフォールド上の成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を、ＴＥＥＲ＞４００オーム．ｃｍ２および光受容体マーカー（例えば、リカバリン、アレスチン、ＮＲＬ、オプシン）の存在に十分な時間、前記スキャフォールドの上面および下面の両方に培地が存在する組織培養培地中でインビトロで培養すること、を含む方法が提供される。
【0209】
５．末梢、中心および黄斑ＲＰＥ細胞の分化において有用な阻害剤
ＲＰＥ細胞の調製に有用な阻害剤を以下に開示する。これらの阻害剤は、上記のように、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜培地、および／またはＲＰＥ成熟培地に含めることができる。
ＲＰＥ細胞の調製に有用な阻害剤を以下に開示する。これらの阻害剤は、上記のように、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜培地、および／またはＲＰＥ成熟培地に含めることができる。
【0210】
ａ．ＷＮＴ経路阻害剤
ＷＮＴは、細胞間相互作用を調節し、ショウジョウバエのセグメント極性遺伝子ｗｉｎｇｌｅｓｓに関連する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーである。ヒトでは、ＷＮＴファミリーの遺伝子は、３８～４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９－１３５８（１９９７）を参照）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質ベータ－カテニンの安定化を促進する能力のために、ＷＮＴタンパク質は転写アクチベーターとして作用し、アポトーシスを阻害することができる。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、特定のがんに関連することが示されている。
ＷＮＴは、細胞間相互作用を調節し、ショウジョウバエのセグメント極性遺伝子ｗｉｎｇｌｅｓｓに関連する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーである。ヒトでは、ＷＮＴファミリーの遺伝子は、３８～４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９－１３５８（１９９７）を参照）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質ベータ－カテニンの安定化を促進する能力のために、ＷＮＴタンパク質は転写アクチベーターとして作用し、アポトーシスを阻害することができる。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、特定のがんに関連することが示されている。
【0211】
本明細書におけるＷＮＴ阻害剤は、一般にＷＮＴ阻害剤を指す。したがって、ＷＮＴ阻害剤は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１１、およびＷｎｔ１６を含むＷＮＴファミリータンパク質のメンバーの任意の阻害剤を指す。本方法の特定の実施形態は、分化培地中のＷＮＴ阻害剤に関する。当技術分野で既に公知の適切なＷＮＴ阻害剤の例には、Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ－７）、Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－３－（２－メトキシフェニル）－４－オキソチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド（ＩＷＰ４）、２－フェノキシ安息香酸－［（５－メチル－２－フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ ７４６５４）２，４－ジアミノ－キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン（ＸＡＶ９３９）、２，５－ジクロロ－Ｎ－（２－メチル－４－ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ ５３５）、Ｎ－［４－［２－エチル－４－（３－メチルフェニル）－５－チアゾリル］－２－ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ ７１５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、および分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１が含まれる。さらに、ＷＮＴの阻害剤には、ＷＮＴに対する抗体、ＷＮＴのドミナントネガティブ改変体、ならびにＷＮＴの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が含まれ得る。ＷＮＴの阻害はまた、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）を使用して達成することができる。有用な例示的なＷｎｔ阻害剤を表５に列挙する。
【0212】
ｂ．ＢＭＰ経路阻害剤
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する多機能成長因子である。ＢＭＰは、身体を介して構造を調整する、極めて重要な形態形成シグナルの群を構成すると考えられる。生理学におけるＢＭＰシグナルの重要な機能は、病理学的過程における調節不全ＢＭＰシグナル伝達のための多数の役割によって強調される。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する多機能成長因子である。ＢＭＰは、身体を介して構造を調整する、極めて重要な形態形成シグナルの群を構成すると考えられる。生理学におけるＢＭＰシグナルの重要な機能は、病理学的過程における調節不全ＢＭＰシグナル伝達のための多数の役割によって強調される。
【0213】
ＢＭＰ経路阻害剤は、一般にＢＭＰシグナル伝達の阻害剤、またはＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０もしくはＢＭＰ１５に特異的な阻害剤を含み得る。例示的なＢＭＰ阻害剤には、４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ１９３１８９）、６－［４－［２－（１－ピペリジニル）エトキシ］フェニル］－３－（４－ピリジニル）－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、４－［６－［４－（１－メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン（ＤＭＨ１）、４－［６－［４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン（ＤＭＨ－２）、および５－［６－（４－メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン（ＭＬ ３４７）が含まれる。
【0214】
ｃ．ＴＧＦβ経路阻害剤
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化、および他の機能を制御する分泌タンパク質である。それは、免疫、がん、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病および多発性硬化症において役割を果たすサイトカインの一種である。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３と呼ばれる少なくとも３つのアイソフォームに存在する。ＴＧＦ－βファミリーは、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジックおよびＶｇ－１を含む、トランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリーとして知られるタンパク質のスーパーファミリーの一部である。
トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化、および他の機能を制御する分泌タンパク質である。それは、免疫、がん、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病および多発性硬化症において役割を果たすサイトカインの一種である。ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３と呼ばれる少なくとも３つのアイソフォームに存在する。ＴＧＦ－βファミリーは、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジックおよびＶｇ－１を含む、トランスフォーミング成長因子ベータスーパーファミリーとして知られるタンパク質のスーパーファミリーの一部である。
【0215】
ＴＧＦβ経路阻害剤は、一般に、ＴＧＦβシグナル伝達の任意の阻害剤を含み得る。例えば、ＴＧＦβ経路阻害剤は、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２－（５－ベンゾ［ｌ，３］ジオキソール－５－イル－２－イエリ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジンヒドロクロリド水和物（ＳＢ－５０５１２４）、４－（５－ベンゾール［ｌ，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－ｌＨ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（ｌ，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－ｌＨ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（Ａ ８３－０１）、４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４－［４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２－ピリジニル］－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－ベンズアミド（ＧＷ ７８８３８８）、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン（ＬＹ ３６４８４７）、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（Ｒ ２６８７１２）または２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である。
【0216】
ｄ．ＭＥＫ阻害剤
ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１またはＭＥＫ２を阻害する化学物質または薬物である。ＭＥＫ阻害剤は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすために使用することができる。例えば、ＭＥＫ阻害剤には、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－［３－［３－シクロプロピル－５－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６，８－ジメチル－２，４，７－トリオキソピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－１－イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ－［３，４－ジフルオロ－２－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６－メトキシフェニル］－１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン－１－スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）および６－（４－ブロモ－２－クロロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）が含まれる。
ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１またはＭＥＫ２を阻害する化学物質または薬物である。ＭＥＫ阻害剤は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすために使用することができる。例えば、ＭＥＫ阻害剤には、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－［３－［３－シクロプロピル－５－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６，８－ジメチル－２，４，７－トリオキソピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－１－イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ－［３，４－ジフルオロ－２－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６－メトキシフェニル］－１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン－１－スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）および６－（４－ブロモ－２－クロロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）が含まれる。
【0217】
ｅ．ｂＦＧＦ阻害剤
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βとしても知られる）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦは、基底膜および血管の内皮下細胞外マトリックスに存在する。加えて、ｂＦＧＦは、細胞が未分化状態のままであることが必要であるヒトＥＳＣ培養培地の一般的な構成要素である。
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βとしても知られる）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦは、基底膜および血管の内皮下細胞外マトリックスに存在する。加えて、ｂＦＧＦは、細胞が未分化状態のままであることが必要であるヒトＥＳＣ培養培地の一般的な構成要素である。
【0218】
ｂＦＧＦ阻害剤は、一般に、ｂＦＧＦ阻害剤を指す。例えば、ｂＦＧＦ阻害剤には、Ｎ－［２－［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（ｌ，ｌ－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－ｌ－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ ９８０５９）、ｌ－ｔｅｒｔ－ブチル－３－［６－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）、６－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［［４－［２－（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］－８－メチル－ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オンジヒドロクロリド水和物（ＰＤ１６６２８５）、Ｎ－［２－アミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７－イル］－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）－尿素（ＰＤ１６６８６６）およびＭＫ－２２０６が含まれるが、これらに限定されない。
【0219】
ｆ．ＲＡＲアンタゴニスト
ＲＡＲアンタゴニストは、開示される方法において有用である。有用なＲＡＲアンタゴニストを表４に列挙する。例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、およびリアロゾールジヒドロクロリドが含まれる。いくつかの非限定的な例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９である。
ＲＡＲアンタゴニストは、開示される方法において有用である。有用なＲＡＲアンタゴニストを表４に列挙する。例示的なＲＡＲアンタゴニストには、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、およびリアロゾールジヒドロクロリドが含まれる。いくつかの非限定的な例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９である。
【0220】
６．キット
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生するための１またはそれを超える培地および構成要素を含むことができる。試薬系は、適切な場合には、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に構成要素が配置され得、好ましくは適切に等分され得る。キットに１よりも多くの構成要素がある場合、キットはまた、一般に、追加の構成要素が別々に配置され得る第２、第３または他の追加の容器を含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせがバイアルに含まれてもよい。キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供され得る。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生するための１またはそれを超える培地および構成要素を含むことができる。試薬系は、適切な場合には、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み、その中に構成要素が配置され得、好ましくは適切に等分され得る。キットに１よりも多くの構成要素がある場合、キットはまた、一般に、追加の構成要素が別々に配置され得る第２、第３または他の追加の容器を含む。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせがバイアルに含まれてもよい。キットの構成要素は、乾燥粉末（複数可）として提供され得る。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒は、別の容器手段に提供されてもよいことが想定される。
【0221】
いくつかの例では、キットは、ＷＮＴ経路阻害剤、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－β経路阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含むものなどの網膜誘導培地を含む。
【0222】
いくつかの例では、キットは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＩＧＦ１、および追加の阻害剤（例えば、ＭＥＫ阻害剤または線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）を含むものなどの網膜分化培地を含む。
【0223】
いくつかの例では、キットは、アクチビンＡを含むものなどの網膜培地を含み、ニコチンアミドをさらに含むことができる。
【0224】
いくつかの例では、キットはＲＰＥ成熟培地を含み、ＲＰＥ成熟培地はレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニスト（例えば、ＡＧＮ １９３１０９、ＣＥ ２６６５、ＥＲ ５０８１、ＬＥ １３５、ＬＹ ２９５５３０３、ＭＭ １１２５３、およびリアロゾールジヒドロクロリドのうちの１またはそれより多く）および／またはカノニカルＷｎｔ阻害剤（例えば、４－（１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル）－Ｎ－８－キノリニル－ベンズアミド（Ｅｎｄｏ－１－ＩＷＲ）、カルホスチンＣ、カーディオノーゲン１、ＣＣＴ ０３１３７４ヒドロブロミド、ＩＷＰ １２、ＸＡＶ ９３９、ＷＩＫＩ４、ＩＣＧ－００１、Ｗｎｔ－Ｃ５９（Ｃ５９）、ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ、ＫＹ０２１１１、ＬＧＫ－９７４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＦＨ５３５、ｉＣＲＴ １４、ＩＷＰ ４、ＪＷ ６７、ＪＷ ７４、ＫＹＡ １７９７Ｋ、ＮＬＳ－ＳｔＡｘ－ｈ、ＰＮＵ ７４６５４、ＴＡＫ ７１５、ＩＷＰ ２、ＣＫＩ ７ジヒドロクロリド、（Ｒ）－ＣＲ８、Ｄ ４４７６、（Ｒ）－ＤＲＦ０５３ジヒドロクロリド、エピブラスチンＡ、ＩＣ ２６１、ＬＨ ８４６、ＰＦ ４８００５６７ヒドロクロリド、ＰＦ ５００６７３９、ＰＦ ６７０４６２、ＳＲ ３０２９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＭＮ ６４、およびＴＣ－Ｅ ５００１のうちの１またはそれより多く）を含む。１つの例では、ＲＡＲアンタゴニストはＡＧＮ １９３１０９である。１つの例において、カノニカルＷｎｔ阻害剤はＥｎｄｏ－１－ＩＷＲである。１つの例では、ＲＰＥ成熟培地は、ＲＡＲアンタゴニスト（ＡＧＮ １９３１０９など）を含むが、カノニカルＷｎｔ阻害剤を含まない。１つの例では、ＲＰＥ成熟培地は、カノニカルＷｎｔ阻害剤（Ｅｎｄｏ１－ＩＷＲなど）を含むが、ＲＡＲアンタゴニストを含まない。１つの例では、ＲＰＥ成熟培地は、カノニカルＷｎｔ阻害剤（Ｅｎｄｏ１－ＩＷＲなど）およびＲＡＲアンタゴニスト（ＡＧＮ １９３１０９など）の両方を含む。
【0225】
いくつかの例では、キットは、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜培地およびＲＰＥ成熟培地のうちの１、２、３または４種を含む。いくつかの例では、キットは、ＲＰＥ成熟培地ならびに網膜誘導培地、網膜分化培地および網膜培地のうちの１、２または３種を含む。いくつかの例では、そのようなキットは、少なくとも１つの組換え細胞接着タンパク質（例えば、ラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチン）を含むものなどのマトリックスをさらに含むことができる。いくつかの例では、そのようなキットは、本明細書に提供されるものなどのスキャフォールドをさらに含むことができる。キットはまた、典型的には、市販のために厳重に閉じ込められたキット構成要素（複数可）を収容するための容器を含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含んでもよい。いくつかの例では、容器はガラス製である。
【0226】
いくつかの例では、キットは、ＲＰＥ細胞（例えば、成熟黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞）および／またはＰＲＰ細胞を含んでも含まなくてもよい、本明細書に提供されるスキャフォールドを含む。いくつかの例では、キットは、ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞が付着していない本明細書に提供されるスキャフォールドを含み、キットは、（１）多能性幹細胞、（２）ＲＰＥ前駆細胞、（３）拘束ＲＰＥ細胞、（４）未成熟ＲＰＥ細胞、（５）黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞、ならびに（６）ＰＲＰ細胞のうちの１またはそれより多くを別々の容器にさらに含む。そのようなキットは、キットは、網膜誘導培地、網膜分化培地、網膜培地およびＲＰＥ成熟培地のうちの１、２、３または４種をさらに含むことができる。いくつかの例では、そのようなキットは、ＲＰＥ成熟培地ならびに網膜誘導培地、網膜分化培地および網膜培地のうちの１、２または３種を含む。いくつかの例では、そのようなキットは、少なくとも１つの組換え細胞接着タンパク質（例えば、ラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチン）をさらに含む。いくつかの例では、そのようなキットは、スナップウェル培養システム、（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）Ｏリング、および非生分解性多孔質ポリカーボネート膜のうちの１またはそれより多くをさらに含む。
【0227】
キットはまた、印刷または電子形式、例えばデジタル形式などの使用についての指示を含むことができる。指示は、細胞を産生するため、および／または細胞および／または細胞を含むインプラントを対象に導入するためのものであり得る。
【0228】
使用方法
黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、開示される方法を使用してｉＰＳＣに由来し、したがって、眼疾患を有する患者に「個別化医療」を提供するために使用することができる。いくつかの実施形態では、患者から得られた細胞、例えば体細胞もしくはＣＤ３４＋細胞、または臍帯細胞を使用してｉＰＳＣを産生することができ、次いでこれを使用して黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生する。いくつかの実施形態では、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞（または出発ｉＰＳＣ）を、疾患を引き起こす変異を修正するように遺伝子操作し、黄斑ＲＰＥ、中心ＲＰＥおよび／または末梢ＲＰＥに分化させ、組織インプラントを形成するように操作することができる。この組織置換インプラントは、同一対象の内因性変性ＲＰＥを置換するために使用することができる。黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞を組織インプラントに含めることができる。ＲＰＥ細胞のタイプは、対象において処置される疾患に基づいて選択され得る。インプラントは、本明細書に開示されるスキャフォールドを含むことができる。
黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、開示される方法を使用してｉＰＳＣに由来し、したがって、眼疾患を有する患者に「個別化医療」を提供するために使用することができる。いくつかの実施形態では、患者から得られた細胞、例えば体細胞もしくはＣＤ３４＋細胞、または臍帯細胞を使用してｉＰＳＣを産生することができ、次いでこれを使用して黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞を産生する。いくつかの実施形態では、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞（または出発ｉＰＳＣ）を、疾患を引き起こす変異を修正するように遺伝子操作し、黄斑ＲＰＥ、中心ＲＰＥおよび／または末梢ＲＰＥに分化させ、組織インプラントを形成するように操作することができる。この組織置換インプラントは、同一対象の内因性変性ＲＰＥを置換するために使用することができる。黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞を組織インプラントに含めることができる。ＲＰＥ細胞のタイプは、対象において処置される疾患に基づいて選択され得る。インプラントは、本明細書に開示されるスキャフォールドを含むことができる。
【0229】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、健康なドナーから、またはＨＬＡホモ接合性「スーパードナー」もしくは「ユニバーサル」ドナー多能性（ｉＰＳ）細胞から産生することができ、組織インプラントを調製するために使用することができる。ＲＰＥ細胞は、インビボで抗炎症性および免疫抑制性環境を生成するために、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）－ベータ、および／またはレチノイン酸などの特定の因子でインビトロで処理することができる。これらの「スーパードナー」ｉＰＳＣは市販されており、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照されたい（例えば、ｇｌｏｂｅｎｅｗｓｗｉｒｅ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ－ｒｅｌｅａｓｅ／２０１５／０２／０９／７０４３９２／１０１１９１６１／ｅｎ／Ｃｅｌｌｕｌａｒ－Ｄｙｎａｍｉｃｓ－Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ－ｃＧＭＰ－ＨＬＡ－Ｓｕｐｅｒｄｏｎｏｒ－Ｓｔｅｍ－Ｃｅｌｌ－Ｌｉｎｅｓ－ｔｏ－Ｅｎａｂｌｅ－Ｃｅｌｌ－Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｗｉｔｈ－Ｇｅｎｅｔｉｃ－Ｍａｔｃｈｉｎｇ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５，２０１５を参照されたい）。
【0230】
対象は、ヒトまたは獣医学対象であり得る。黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、単一の対象に由来し得るか、またはそれぞれ異なる対象に由来する異なるタイプのＲＰＥなどの黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞のいくつかの集団を使用して、網膜変性などを有する対象の処置のためのインプラントを産生することができる。
【0231】
図１４Ａ～１４Ｄに示すように、本明細書で提供される方法を使用して産生された異なるタイプのＲＰＥ（例えば、Ｐ１黄斑Ｐ２中心および／またはＰ３末梢）を使用して、異なる網膜疾患の処置をカスタマイズすることができる。例えば、黄斑ＲＰＥは、錐体光受容体の機能および活性を支持するために使用することができ、中心ＲＰＥおよび末梢ＲＰＥは、桿体光受容体の活性を支持するために使用することができる。いくつかの例では、黄斑ＲＰＥは、それらに隣接して発生する場合、緻密なｉＰＳＣ由来脈絡膜血管構造を支持するが、中心および末梢ＲＰＥは、比較的緻密性の低いｉＰＳＣ由来脈絡膜血管構造を支持することができる。正しいタイプのｉＰＳＣ由来の光受容体を正しいタイプのＲＰＥおよびｉＰＳＣ由来血管構造と組み合わせることによって、眼の背部の異なる部分を生成することができる（例えば、眼の黄斑全体または中心全体または周辺部全体または遠位周辺部全体）。
【0232】
様々な形態の網膜変性疾患が眼の様々な部分に影響を及ぼす。例えば、コロイデレミア（ＣＨＭ；図１４Ａ）は、初期疾患段階において、中心およびＰ４ ＲＰＥ細胞に広がる末梢ＲＰＥ機能障害を引き起こす。疾患が進行するにつれて、対応する光受容体および脈絡膜血管構造も変性する。同様に、疾患遅発性網膜変性（Ｌ－ＯＲＤ、図１４Ｂ）では、疾患関連損傷が中心および末梢ＲＰＥ細胞で始まり、最終的に疾患後期では、光受容体および脈絡膜血管構造も変性する。ＡＭＤ（図１４Ｃ）では、最初に、ＡＭＤの進行段階において、光受容体および脈絡膜血管構造に広がる黄斑、Ｐ４およびＰ５ ＲＰＥに損傷が見られる。
【0233】
１つの例において、早期段階のＣＨＭは、中心ＲＰＥを使用して処置され、中間段階は、末梢およびＰ４ ｉＰＳＣ－ＲＰＥを使用して処置され得、進行段階は、対応する桿体が濃縮された光受容体を有する中心および末梢ＲＰＥを利用して、錐体が濃縮された光受容体を有するＰ４ ｉＰＳＣ－ＲＰＥについては脈絡膜血管構造の有無にかかわらず処置され得る。
【0234】
１つの例では、Ｌ－ＯＲＤは、疾患の段階に応じて、対応する光受容体および脈絡膜血管構造の有無にかかわらず、中心および末梢ＲＰＥを使用して処置される。
【0235】
１つの例において、黄斑ＲＰＥ（またはＰ４ ＲＰＥ）が、対応する光受容体および脈絡膜血管構造の有無にかかわらず、ＡＭＤを処置するために使用される。
【0236】
いくつかの実施形態では、開示される方法に従って黄斑細胞、中心細胞または末梢細胞を産生すること、および黄斑細胞、中心細胞または末梢細胞を対象の網膜に移植することを含む、それを必要とする対象を処置する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象は、網膜変性疾患、網膜機能障害、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を有する。いくつかの非限定的な例では、網膜変性疾患は、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、後天性黄斑変性、遺伝性黄斑変性、遅発性網膜変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィーである。他の非限定的な例では、網膜損傷は、レーザー、炎症性、感染性、放射線、新生血管または外傷性傷害によって引き起こされる。さらなる非限定的な例では、黄斑中心および／または末梢網膜色素上皮細胞は、眼の網膜下腔、硝子体腔、内側または外側網膜、網膜周辺部または脈絡膜内に導入される。単層および多層網膜インプラントを産生する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ ２０１８／０８９５１５に開示されている。
【0237】
黄斑ＲＰＥおよび遠位末梢ＲＰＥは主に錐体光受容体の機能および活性を支持し、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞は主に桿体光受容体の活性を支持する。同様に、黄斑ＲＰＥは、それらに隣接して発生する場合、緻密なｉＰＳＣ由来脈絡膜血管構造を支持するが、中心および末梢ＲＰＥは、比較的緻密性の低いｉＰＳＣ由来脈絡膜血管構造を支持する。１またはそれを超える特定のタイプのｉＰＳＣ由来光受容体を、本明細書中に開示されるような選択されたタイプのＲＰＥ、および必要に応じて、ｉＰＳＣ由来血管構造と組み合わせることによって、目的の眼の領域における網膜変性を処置するためのインプラントを設計することができる。
【0238】
光に直接感受性である網膜の細胞は、光受容体細胞である。光受容体は、網膜の外側部分の光感受性ニューロンであり、桿体または錐体のいずれかであり得る。光伝達のプロセスにおいて、光受容体細胞は、レンズによって集束された入射光エネルギーを電気信号に変換し、その後、電気信号は視神経を介して脳に送られる。脊椎動物は、錐体と桿体の２種類の光受容体を有する。錐体は、細かい細部、中心視および色覚を検出するように適合され、明るい光で良好に機能する。桿体は、周辺および薄暗い光の視覚を担う。桿体および錐体からの神経信号は、網膜の他のニューロンによって処理される。
【0239】
網膜色素上皮は、血流と網膜との間のバリアとして作用し、視覚機能の維持において光受容体と密接に相互作用する。網膜色素上皮は、網膜に到達する光エネルギーを吸収するメラニンの顆粒が密集した黄斑、中心および末梢ＲＰＥ細胞を含む六角形細胞の単層で構成される。これらのＲＰＥ細胞の機能には、血液から光受容体へのグルコース、レチノール、および脂肪酸などの栄養素の輸送；網膜下腔から血液への水、代謝最終産物およびイオンの輸送；光の吸収および光酸化に対する保護；全トランス型レチノールの１１シス型レチナールへの再異性化；脱落した光受容体膜の食作用；および網膜の構造的完全性のための様々な必須因子の分泌が含まれる。
【0240】
ＲＰＥ細胞の機能不全、損傷および喪失は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および遺伝性黄斑変性（ベスト病など）、ならびに網膜色素変性を含む多くの眼疾患および障害の要因である。他の疾患を以下に考察する。物理的損傷などによる網膜の損傷にも処置が必要である。処置され得る例示的な状態を図１４に示す。
【0241】
本明細書に開示される方法によって産生された黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞の医薬組成物。これらの組成物は、少なくとも約１×１０３個のＲＰＥ細胞、約１×１０４個のＲＰＥ細胞、約１×１０５個のＲＰＥ細胞、約１×１０６個のＲＰＥ細胞、約１×１０７個のＲＰＥ細胞、約１×１０８個のＲＰＥ細胞または約１×１０９個のＲＰＥ細胞を含み得る。特定の実施形態では、組成物は、本明細書に開示される方法によって産生された分化ＲＰＥ細胞を含む、（非ＲＰＥ細胞に関して）実質的に精製された調製物である。組成物は、眼の網膜下腔、硝子体腔、内側または外側網膜、網膜周辺部、脈絡膜内、または脈絡膜上の位置など、それを必要とする対象の眼への送達のために製剤化することができる。
【0242】
ポリマー担体および／または細胞外マトリックスなどのスキャフォールドと、本明細書に開示される方法によって産生される治療有効量の黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および末梢ＲＰＥ細胞とを含む組成物も提供される。例えば、細胞は、細胞の単層として提供される。組成物はまた、複数の層を含むことができ、光受容体および／または血管細胞を含むことができる。生理学的に許容され得る、インビボ適用での使用に適した分解性または非生分解性スキャフォールドなどのスキャフォールドも含めることができる。例えば、生理学的に許容され得る材料には、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、架橋または非架橋アルギネート、親水コロイド、フォーム、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、フリースおよび生体接着剤などの吸収性および／または非吸収性の固体材料が含まれるが、これらに限定されない。スキャフォールドはＰＬＧＡスキャフォールドであり得る。これらのスキャフォールドは、それを必要とする対象の眼に送達され得る。
【0243】
開示される黄斑、中心および末梢ＲＰＥ、ならびに黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥを含む組織置換インプラントは、網膜変性疾患、網膜または網膜色素上皮機能不全、網膜分解、網膜または網膜色素上皮損傷、例えば光、レーザー、炎症性、感染性、放射線、血管新生または外傷性傷害によって引き起こされる損傷を処置するのに有用である。開示される黄斑ＲＰＥ、中心ＲＰＥおよび／または末梢ＲＰＥ、ならびにこれらの細胞を含む組織置換インプラントは、網膜色素上皮の喪失を処置するためにも有用である。この方法は、黄斑ＲＰＥ、中心ＲＰＥおよび／もしくは末梢ＲＰＥ、または組織配置インプラントを対象の眼に局所投与することを含む。治療有効量のＲＰＥ細胞を含む医薬組成物は、眼の網膜下腔、硝子体腔、内側または外側網膜、網膜周辺部または脈絡膜内に導入することができる。ＲＰＥ細胞は、インプラント上に含めることもできる。
【0244】
いくつかの実施形態では、網膜変性疾患は、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、緑内障、糖尿病性網膜症、レーバー先天性黒内障、遅発性網膜変性、遺伝性黄斑変性または後天性網膜変性、ベスト病、ソルスビー眼底ジストロフィー、網膜剥離、脳回転状萎縮、バッテン病、ベアトラックジストロフィー、外傷性眼傷害またはコロイデレミア、パターンジストロフィーである。さらなる状態としては、網膜剥離、パターンジストロフィー、およびＲＰＥの他のジストロフィーが挙げられる。特定の非限定的な例では、対象は加齢性黄斑変性症を有する。特定の実施形態では、網膜変性を特徴とする状態を処置または予防する方法が提供され、開示されるＲＰＥ細胞またはこれらのＲＰＥ細胞を含む組織置換インプラントを、それを必要とする対象に投与することを含む。インプラントに含まれるＲＰＥのタイプは、処置される障害に基づいて選択することができる。
【0245】
これらの方法は、これらの状態のうちの１またはそれより多くを有する対象を選択することと、組織置換インプラントを投与して状態を処置するおよび／または状態の症状を改善することとを含むことができる。インプラントは、必要に応じて光受容体および／または血管細胞などの他の網膜細胞と組み合わせて、黄斑ＲＰＥ、中心ＲＰＥおよび／または末梢ＲＰＥを含むことができる。
【0246】
様々な形態の網膜変性疾患が眼の様々な部分に影響を及ぼす。例えば、コロイデレミア（ＣＨＭ）は、初期疾患段階において、中心および遠位末梢ＲＰＥ細胞に広がる末梢ＲＰＥ機能障害を引き起こす。この疾患が進行するにつれて、対応する光受容体および脈絡膜血管構造も変性する。ＣＨＭの処置に使用されるインプラントには、中心ＲＰＥ細胞、および必要に応じて遠位末梢ＲＰＥ細胞、ならびに必要に応じて光受容体および血管細胞が含まれる。同様に、疾患遅発性網膜変性（Ｌ－ＯＲＤ）では、疾患関連損傷が中心および末梢ＲＰＥ細胞で始まり、最終的に疾患後期では、光受容体および脈絡膜血管構造も変性する。したがって、早期処置のために、有用なインプラントには、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞が含まれる。後期疾患段階では、これらの同じインプラントを使用することができ、またはインプラントは光受容体および／または血管細胞も含むことができる。ＡＭＤでは、最初に、ＡＭＤの進行段階で光受容体および脈絡膜血管構造に広がる黄斑ＲＰＥ、遠位末梢ＲＰＥおよび鋸状縁ＲＰＥに損傷が見られる。したがって、早期処置のために、有用なインプラントは、黄斑ＲＰＥ、ならびに必要に応じて遠位末梢および鋸状縁ＲＰＥ細胞を含むことができる。後の疾患段階では、これらの同じインプラントを使用することができ、またはインプラントは、関連する光受容体および／または黄斑および末梢特異的血管細胞を含むことができる。
【0247】
これらの方法は、これらの状態の１またはそれより多くを有する対象を選択し、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／もしくは末梢ＲＰＥ細胞、またはＲＰＥ細胞を含む組織置換インプラントを投与して、状態を処置し、および／または状態の症状を改善することを含むことができる。開示されるＲＰＥ細胞は、光受容体および／または血管細胞などの他の網膜細胞と一緒に移植（同時移植）することもできる。
【0248】
開示された方法は、異なる疾患およびそれらの疾患の異なる段階のためのカスタマイズされた細胞治療の開発を可能にする。例えば、ＣＨＭの初期段階では、中心ＲＰＥを含むインプラントを処置に使用することができ、中間段階では、末梢ＲＰＥおよび遠位末梢ＲＰＥを含むインプラントを処置に使用することができる。進行段階では、インプラントは、対応する桿体に富む光受容体を有する中心および末梢ＲＰＥを含むことができる。あるいは、脈絡膜血管構造の有無にかかわらず、錐体に富む光受容体を有する遠位末梢ＲＰＥのためにインプラントを産生することができる。いくつかの実施形態では、インプラントは、対応する光受容体および脈絡膜血管構造の有無にかかわらず、中心または末梢ＲＰＥを用いて産生することができる。細胞の選択は、疾患段階に基づいて行うことができる。
【0249】
他の実施形態では、ＡＭＤの処置のために、対応する光受容体および脈絡膜血管構造の有無にかかわらず、黄斑ＲＰＥまたは遠位末梢ＲＰＥを含むインプラントを作製することができる。次いで、これらのインプラントを処置に使用することができる。ＡＭＤの初期段階では、黄斑ＲＰＥ細胞および／または他のタイプのＲＰＥ細胞のみを置換すれば十分であり得る（図１４を参照）。理論に拘束されるものではないが、移植された黄斑ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞のさらなる喪失および／またはブルッフ膜の変性の予防を媒介し得る。ＡＭＤの進行段階では、患者はＲＰＥ細胞と光受容体細胞の両方の喪失を経験し得る。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、光受容体細胞を含む組成物を移植することをさらに含むことができる。スキャフォールドおよびＲＰＥ細胞を移植する方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２１７７９６８およびＰＣＴ公開番号２０１６／００７８５２に開示されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【0250】
いくつかの実施形態では、必要に応じて組織置換インプラント内の、黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞は、処置される対象由来であり、したがって自己由来である。他の実施形態では、必要に応じて組織置換インプラントに含まれる黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ一致ドナーまたはユニバーサルドナーから産生される。別の実施形態では、必要に応じて組織置換インプラント内の、黄斑、中心および／または末梢ＲＰＥ細胞は、同種異系である。
【0251】
組織置換インプラントなどのＲＰＥ細胞は、対象の眼内の様々な標的部位に導入することができる。いくつかの実施形態では、組織置換インプラントは、移植などによって、哺乳動物における（光受容体外節と脈絡膜との間の）ＲＰＥの解剖学的位置である眼の網膜下腔に導入される。例示的な方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１８／０８９５２１に開示されている。いくつかの実施形態では、組織置換インプラントは、外側網膜、網膜周辺部、黄斑、または黄斑周囲領域、または脈絡膜内に導入される。さらに、細胞の遊走能および／または正のパラクリン作用に依存して、硝子体腔、内側または外側網膜、網膜周辺部および脈絡膜内などの追加の眼区画への導入を考慮することができる。
【0252】
移植される組織置換インプラントのサイズは、一般に、特定の患者に存在する網膜病理領域のサイズの臨床評価を、特定のサイズのインプラントを送達する外科的実現可能性によって課される制約と比較することによって決定され得る。例えば、中心網膜（例えば、加齢性黄斑変性）を含む変性では、解剖学的中心窩に近似する直径約１．０～２．５ｍｍ（例えば、直径約１．５ｍｍ）の円形インプラントがしばしば適切である。場合によっては、より大きなインプラントが適切であり得、これは、中心窩を中心とするまたは中心窩外領域に配置された約６．０ｍｍ（垂直）×７．５ｍｍ（水平）の卵形領域である側頭血管アーケード（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｒｃａｄｅ）（組織学的黄斑、臨床後極）の間にある後部網膜の領域に最大限対応する。いくつかの例では、同様に、約０．５ｍｍほどのより小さい寸法のポリマースキャフォールドを、外接する病理の領域に配置するように形成することが適切であり得る。さらに、患者に合わせて不規則な形状のインプラントを特注すること、例えば、残存する高い視力の領域を避けながら病理の領域を覆うことが興味深い場合がある。
【0253】
組織置換インプラントは、当技術分野で公知の様々な技術によって導入することができる。移植を行うための方法は、例えば、米国特許第５，９６２，０２７号、米国特許第６，０４５，７９１号、および米国特許第５，９４１，２５０号；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ Ｆｅｂ．２４，２０００；２６８（３）：８４２－６；およびＯｐｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９１；２２（２）：１０２－８）に開示されている。角膜移植を行うための方法は、例えば、米国特許第５，７５５，７８５号；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ａｕｇｕｓｔ １９９２；３（４）：４７３－８１；Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇ Ｌａｓｅｒｓ Ａｐｒｉｌ １９９８；２９（４）：３０５－８；およびＯｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ａｐｒｉｌ ２０００；１０７（４）：７１９－２４に記載されている。いくつかの実施形態では、移植は、経毛様体扁平部硝子体切除術（ｐａｒｓ ｐａｎａ ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ ｓｕｒｇｅｒｙ）を介して行われ、その後、小さな網膜開口部を通して網膜下腔に組織置換インプラントを送達する。あるいは、組織置換インプラントは、経強膜、経脈絡膜、または脈絡膜上アプローチを介して網膜下腔に送達することができる。さらに、毛様体に近接した前部網膜周辺部への直接経強膜挿入を行うことができる。
【0254】
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、炎症細胞の応答をダウンレギュレーションすることによって、または炎症細胞のアポトーシスを誘導することによって、免疫応答を低下させる免疫抑制剤を投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、網膜ニューロンの生存を促進する、および／または変性を減少させる、治療有効量の神経保護剤を投与することを含む。さらに他の実施形態では、本方法は、望ましくない血管新生を阻害するために、例えばＡＭＤ患者の中心窩の下の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）成長に対抗するために、治療有効量の薬剤を投与することを含み得る。例示的な治療剤は、例えば、ＶＥＧＦの活性形態の受容体部位に結合し、ＶＥＧＦとその受容体との相互作用を防止することによって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を低下させることができる。ＳＴＡＴ３、ＮＦ－ｋＢ、ＨＩＦ－１αなどのＶＥＧＦ分泌をもたらす経路を阻害することによってＶＥＧＦの発現を抑制する治療有効量。他の薬物は、補体経路、オートファジー、またはＮＦ－ｋＢ経路を標的とすることによってＲＰＥ細胞の萎縮を防ぐことができる。ＡＭＤのために有用な処置には、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））およびアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））などの新しい血管の成長を停止させることを目的とした薬物療法；光線力学的治療；光凝固；低視力リハビリテーションが含まれる。
【0255】
さらなる実施形態では、本方法は、治療有効量の毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を対象に投与することを含み、これは、例えば、光受容体細胞などのニューロンの発達または機能を促進するために使用することができる。他の例示的な非限定的な実施形態は、治療有効量のトロンボスポンジン１、抗炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）－ｌｒａ、ＩＬ－６、Ｆａｓリガンドまたは腫瘍成長因子（ＴＧＦ）－β、神経栄養性／神経保護成長因子、例えば、限定されないが、グリア細胞株由来成長因子、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、－４／５、－６およびビタミンＥを対象に投与することを含む。そのような薬剤は、単独でまたは組み合わせて提供されてもよい。
【0256】
個別化医療適用が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、網膜変性疾患、網膜または網膜色素上皮機能不全、網膜分解、網膜損傷、または網膜色素上皮の喪失を有する対象を処置する方法が開示される。この方法は、対象について、黄斑ＲＰＥ細胞、末梢ＲＰＥ細胞および／または中心ＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞のどの集団が影響を受けるかを決定すること、それらの細胞を産生すること、次いで、これらの黄斑ＲＰＥ細胞、末梢ＲＰＥ細胞および／または中心ＲＰＥ細胞を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、開示された組織置換インプラントを対象の眼に局所投与することを含む。組織置換インプラントは、対象の疾患過程に応じて、黄斑ＲＰＥ細胞、中心ＲＰＥ細胞および／または末梢ＲＰＥ細胞を含むことができる。組織置換は、必要に応じて、桿体および／または錐体および／または血管細胞などの光受容体を含むことができる。特定の非限定的な例では、対象は、ＣＨＭ、ＡＭＤ、Ｌ－ＯＲＤまたはＲＤを有する。
【0257】
本開示は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【0258】
実施例１
材料および方法
組織ドナー情報：９人の健常ドナーからの１７個の眼球を得た。網膜変性の病歴がない場合、眼を研究のために考慮した。眼球を摘出し、直ちに貯蔵し、氷冷ＰＢＳ １×または湿氷中ＲＰＭＩで輸送した。ドナーの死亡から２４時間以内に、眼球を受け取り、解剖し、４％ ＰＦＡ中で保存した。
材料および方法
組織ドナー情報：９人の健常ドナーからの１７個の眼球を得た。網膜変性の病歴がない場合、眼を研究のために考慮した。眼球を摘出し、直ちに貯蔵し、氷冷ＰＢＳ １×または湿氷中ＲＰＭＩで輸送した。ドナーの死亡から２４時間以内に、眼球を受け取り、解剖し、４％ ＰＦＡ中で保存した。
【0259】
染色およびイメージング：ＲＰＥ単層を、１％ウシアルブミン血清（ＢＳＡ）、０．５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘを含有するＰＢＳ緩衝液中、ＲＴで１時間インキュベートして、透過化および非特異的部位の遮断を可能にした。その後、細胞境界を室温で一晩、抗ＺＯ１（カタログ番号３３９１００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗汎カドヘリン抗体（カタログ番号ａｂ６５２９、Ａｂｃａｍ）の１：２００希釈で染色した。二次抗体抗マウス－６４７（カタログ番号Ａ－２１２３５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗ウサギ－６３３（カタログ番号Ａ－２１０７１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１：５００希釈で暗所において室温で１時間添加した。両方の二次抗体フルオロフォアは、シグナル対ノイズ比を増加させるために、遠赤色波長において同様の発光スペクトルを有するように選択された。実際、それらの生理学的活性および網膜における酸素の存在の上昇のために、ＲＰＥは、極めて自己蛍光性であるリポフスチンなどの多くの老廃物を蓄積する。波長の選択はまた、リポフスチン自己蛍光の広い帯域幅を回避することを目的とする。シグナル対ノイズ比をさらに増加させるために、ファロイジン－ｉＦｌｕｏｒ ６４７（カタログ番号ａｂ１７６７５９、Ａｂｃａｍ）を、１：２５０希釈の二次抗体と共に添加した。それにもかかわらず、シグナル対ノイズ比は、ＲＰＥ境界の大部分を区別することができるほど十分に高くなかった。染色後、リポフスチン自己蛍光消光剤であるＴＲＵＥＢＬＡＣＫ（登録商標）（カタログ番号２３００７、Ｂｉｏｔｉｕｍ）を用いた。ＴＲＵＥＢＬＡＣＫ（登録商標）をエタノール７０％中で１：２０希釈し、ＲＰＥを上に向けて最大２分間サンプルに適用した。フラットマウントのすべての花弁をさらに切断して、組織をより良好に平らにした。最後に、サンプルを５０×７５ ｍｍガラススライド（カタログ番号５０７５、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に載せた。均一に平らであることを確実にするためにサンプルの上に一晩重りを置いた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１広視野スキャナ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して、ＲＰＥ単層をイメージングした。最大２５０，０００～２７５，０００枚のタイルおよび１２０μｍのｚスタックを、各サンプルを含むように設定した。最終ファイルがＣＺＩ圧縮で１０ＧＢの最大寸法を有するように、スタックをオンラインで単一のスライスに圧縮した。
【0260】
ｉＰＳＣ－ＲＰＥ分化：スクリーニングおよびその後の表現型の特徴付けに使用された、ＴＪＰ１－ｍＥＧＦＰと呼ばれるｉＰＳＣ株は、広く使用されている親株ＷＴＣ－１１に由来し、タイトジャンクションタンパク質１遺伝子（ＴＪＰ１；または密着結合１、ＺＯ１）は、一方の対立遺伝子のＮ末端エクソンが単量体の増強された緑色蛍光タンパク質（ｍＥＧＦＰ）配列挿入を有するようにＣＲＩＳＰＲ改変された。得られたＴＪＰ１タンパク質は、ｍＥＧＦＰにコンジュゲートされ、細胞境界のライブでの可視化を可能にする。タグ付けの明らかな有害作用を排除するために、多数のゲノムおよび細胞検証を行った。アッセイおよびその結果は、Ａｌｌｅｎ研究所のウェブサイト（ａｌｌｅｎｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｃｅｌｌ－ｃａｔａｌｏｇ．ｈｔｍｌ）で入手可能である。ｉＰＳＣ株を、開発されたプロトコル（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１（４７５），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｔ５５８０，２０１９）を使用してＲＰＥに分化させた。幹細胞からのＲＰＥ分化は、神経外胚葉段階でのＴＧＦおよびＷＮＴ経路の活性化によって誘導することができる（Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，５（４），３９６－４０８，２００９；Ｌａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０３（３４），１２７６９－１２７７４，２００６；Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，５６（２），１００２－１０１３，２０１５；Ｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｆａｔｅ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－６０７６１－６９１－７＿９，２０１０）。分化の効率および再現性をさらに改善する三相性分化プロトコルを開発した（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．，２０１９）。第１に、二重ＳＭＡＤ阻害はニューロンの運命を促進し、ＦＧＦ経路活性化はＲＰＥへの眼領域の分化を阻害するので、二重ＳＭＡＤ阻害をＦＧＦ阻害と組み合わせてｉＰＳＣからの神経外胚葉細胞の形成を誘導した（Ｂｈａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８（７）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００２７５７，２０１２；Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２７５－２８０，２００９；Ｆｕｈｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９３，６１－８４，２０１０；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０６（３９），１６６９８－１６７０３，２００９）。第２に、ＴＧＦ－βおよびＷＮＴ経路を活性化して、神経外胚葉細胞のＲＰＥ運命への拘束を促進した（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，４（１２），ｅ８１５２２００９；Ｆｕｈｒｍａｎｎ，Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，４（２），６０－６７，２０１０；Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，５（４），３９６－４０８，２００９）を参照。第３に、拘束ＲＰＥをプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）での処理によって成熟させて、一次繊毛の刺激によってカノニカルＷＮＴ経路を能動的に抑制した（Ｍａｙ－Ｓｉｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２２（１），１８９－２０５，２０１８）。
【0261】
分化のために、ｉＰＳＣをビトロネクチン（カタログ番号Ａ１７００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）被覆６ウェルプレートに播種した。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｅ８、カタログ番号Ａ１５１７００１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２日後、細胞を、１０ｎＭのＬＤＮ（カタログ番号０４－００７４ Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、０．５μＭのＣＫ１－７ジヒドロクロリド（カタログ番号Ｃ０７４２、Ｓｉｇｍａ）、１μＭのＳＢ４３１５４２水和物（カタログ番号Ｓ４３１７、Ｓｉｇｍａ）および１ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１（カタログ番号ＡＦＬ２９１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した基礎分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（カタログ番号１１３３００３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２サプリメント（カタログ番号Ａ１３７０７０１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ２７（カタログ番号１７５０４０４４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＫＳＲ（カタログ番号１２６１８０１３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２００μＭアスコルビン酸（カタログ番号Ａ４５４４、Ｓｉｇｍａ））で構成される神経外胚葉誘導培地（ＮＥＩＭ）で２日間処理した。次に、神経外胚葉細胞をＲＰＥ誘導培地（ＲＰＥＩＭ、１００ｎＭのＬＤＮ（カタログ番号０４－００７４ Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、５μＭのＣＫ１－７ジヒドロクロリド（カタログ番号Ｃ０７４２、Ｓｉｇｍａ）、１０μＭのＳＢ ４３１５４２水和物（カタログ番号Ｓ４３１７、Ｓｉｇｍａ）および１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１（カタログ番号ＡＦＬ２９１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭのＰＤ ０３２５９０１（カタログ番号ＰＺ０６１２Ｓｉｇｍａ）を含む基礎分化培地）中で１０日間培養した。細胞をＲＰＥ拘束培地（ＲＰＥＣＭ、１０ｍＭのニコチンアミド（カタログ番号Ｎ０６３６ Ｓｉｇｍａ）、１５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（カタログ番号３３８－ＡＣ／ＣＦ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する基礎分化培地）中で１０日間培養した。拘束ＲＰＥをＲＰＥ増殖培地中で５日間維持し、次いで再播種してニューロン形成を除去した（ＲＰＥＧＭ、ＭＥＭ＋ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（カタログ番号３２５６１０３７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％ ＦＢＳ（カタログ番号ＳＨ３００７１．０３、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、タウリン（カタログ番号Ｔ－０６２５、Ｓｉｇｍａ）、チロニン（カタログ番号Ｔ－５５１６、Ｓｉｇｍａ）、ヒドロコルチゾン（カタログ番号Ｈ－０３９６－１０、Ｓｉｇｍａ））。その後、未成熟ＲＰＥをＲＰＥＧＭ中で１５日間培養し、次いで、抗ＣＤ２４（カタログ番号６５５１５４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ５６（カタログ番号３４０７２３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を使用してネガティブ選択によって濃縮した。最後に、未成熟ＲＰＥ細胞をビトロネクチン被覆トランスウェル（カタログ番号３４６０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、ＲＰＥ成熟培地（５０μＭのＰＧＥ２を含有するＲＰＥＧＭであるＲＰＥＭＭ（カタログ番号２２９６／１０、Ｔｏｃｒｉｓ））中で６週間培養して、完全に成熟したｉＰＳＣ由来ＲＰＥを得た。黄斑（Ｐ１）および末梢（Ｐ４）ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を作製するために、成熟細胞が使用される準備ができるまで（図１）、ＡＧＮ １９３１０９およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１をそれぞれＤ２１由来のＲＰＥＧＭに添加した（拘束ＲＰＥ細胞）。
【0262】
化合物ライブラリーのスクリーニングおよびイメージング：様々な発生経路または細胞骨格ストレッサーを標的とする１１５の薬物を選択して、化合物の新しい発生ライブラリーを形成した。薬物は、様々なシグナル伝達経路の活性化剤または阻害剤であり、シグナル伝達カスケードの異なるレベルのタンパク質を標的とする。各薬物について、初期濃度を選択し、各薬物の濃度を調整した。アッセイは、ｉＰＳＣ由来の拘束ＲＰＥに対して行った。すべての薬物について、毒性が検出された場合は濃度を下げ、対照と比較して細胞形態に明らかな効果がなかった場合は濃度を上げた。試験した化合物のリストを表１に見出すことができる。３つの異なる濃度の範囲（３倍、１倍、０．３倍）を使用して、３８４ウェルプレート（カタログ番号６０５７３００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でハイコンテントスクリーニングを実施した。すべての薬物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、カタログ番号Ｄ２６５０、Ｓｉｇｍａ）中で再構成し、各薬物４０μｌを３８４ウェルマスタープレート中に三連で等分した。次いで、最終的な所望の作業濃度を得るためにＲＰＥＧＭによる連続希釈を行い、最終プレートを－８０℃で保存した。ＲＰＥＧＭ中で５日後、拘束ＲＰＥを約５０細胞／ｍｍ２（５００細胞／ウェル）の濃度で３８４ウェルプレートに再播種し、１０μＭ ｒｏｃｋ阻害剤（カタログ番号１２５４、Ｔｏｃｒｉｓ）とともに２４時間接着および適応させた。毎日、最終濃度の化合物の１つのプレートを解凍し、細胞に新鮮な薬物を添加するために使用した。この処理手順は、化合物の凍結／解凍サイクルの最小数を可能にし、培養細胞への非常に小さい体積の薬物の直接の添加と比較して精度を促進し、培養細胞がマルチチャネルピペットで薬物を移送することによってインキュベーター外で費やす時間を最小にする。３８４ウェルプレートにおける細胞播種から１５および３０日の２つの時点をイメージングのために選択した。Ｙｏｋｏｇａｗａ Ｃｅｌｌ Ｖｏｙａｇｅｒ（ＣＶ７０００）高スループットスピニングディスク共焦点を２０倍空気液浸対物レンズと共に使用した。各ウェルを９視野に含め、単層の不均一性を考慮してｚスタックを設定し、画像をオンザフライで単一スライスに投影した。ライブイメージングを第１の時点で実施し、４％ ＰＦＡで固定した細胞を第２の時点についてイメージングした。細胞はその寿命を通してＴＪＰ１－ｍＥＧＦＰタンパク質を発現するので、染色は必要ではなかった。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0263】
畳み込みネットワークを使用したセグメント化：畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）アルゴリズムを使用して、免疫蛍光によって標識されたサンプルの画像からＲＰＥ細胞境界を認識した。アルゴリズムは、セグメント化されたＲＰＥ境界のバイナリマスクを生成する；この出力は、アルゴリズムが学習する「正しい答え」を提供するために手動で補正された。訓練されると、ＣＮＮアルゴリズムには、蛍光標識されたＲＰＥ細胞の画像が供給され、生成されたバイナリマスク画像は、細胞形状分析（図３）のためのＲＥＳｈＡＰＥソフトウェアの入力となった。
【0264】
ＲＥＳｈＡＰＥを使用した形態計測分析：ＣＮＮアルゴリズムによって生成されたバイナリセグメント化を、細胞形状分析のためにＲＥＳｈＡＰＥに移した。ＲＥＳｈＡＰＥ（網膜上皮形状および色素評価器（Ｒｅｔｉｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ Ｓｈａｐｅ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ））は、画像解析用のＦｉｊｉプラグインである。成功裏にセグメント化された視野内のすべての細胞について、ＲＥＳｈＡＰＥは、２５を超える異なる形状測定基準の定量化を提供する。生データは、統計分析を可能にするためにスプレッドシートに保存した。さらに、ソフトウェアは、分析された測定基準ごとにセグメント化された細胞の画像を作成し、すべての細胞は生の値に従って色分けされる（図４）。色分けされた画像は、分析された細胞の位置を表示する。形状測定基準をソフトウェアで分析して、面積および周囲などの細胞寸法の測定値、長径および短径の長さなどの伸長の測定値、ならびに六角形性（ｈｅｘａｇｏｎａｌｉｔｙ）スコアおよび近傍数などの細胞規則性の測定値を得た。分析は、ピクセルからμｍへの変換が提供される限り、ピクセル単位またはμｍで行った。データおよびグラフの分析は、Ｒソフトウェア（「Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１８）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＵＲＬ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／」）を使用して行った。Ｒパッケージ「ｐｌｙｒ」および「ｇｇｐｌｏｔ２」は、それぞれデータの取り扱いおよびプロットに使用されている（Ｗｉｃｋｈａｍ，２００９，２０１１）。事後ペアワイズ多重比較のための方法であるダネット検定を使用して、いくつかの処置群を対照群と比較することによって統計分析を計算した。９５％のファミリーごとの信頼水準を使用した。「ＤｅｓｃＴｏｏｌｓ」は、ダネット検定を行うために使用されたＲパッケージである（Ｓｉｇｎｏｒｅｌｌ，ＤｅｓｃＴｏｏｌｓ：Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ［Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ＤｅｓｃＴｏｏｌｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．９９．３１］、ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ＤｅｓｃＴｏｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ，２０１９から２０１９年１０月２５日に検索）。正常性の仮定を、シャピロ－ウィルク検定を用いて試験した。正常性の試験はサンプルサイズに感受性であるため、各群のデータの偏りのないサブセットに対して試験を行った。さらに、各群の全データセットに対する正常性を評価するために分位数－分位数（Ｑ－Ｑ）プロットを描いた。分散の均一性は、「残差対適合プロット」に残差をプロットすることによって試験した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定を行う前に群間分散を評価した。Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定および一元配置ＡＮＯＶＡは、Ｒパッケージ「ｄｐｌｙｒ」（Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ｄｐｌｙｒ：Ａ Ｇｒａｍｍａｒ ｏｆ Ｄａｔａ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｄｐｌｙｒ，２０１９から取得）を用いて行ったが、Ｑ－Ｑプロットは、Ｒパッケージ「ｇｇｐｕｂｒ」（Ｋａｓｓａｍｂａｒａ，ｇｇｐｕｂｒ：「ｇｇｐｌｏｔ２」Ｂａｓｅｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｙ Ｐｌｏｔｓ．ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｇｇｐｕｂｒ，２０２０から取得）を用いて描いた。データはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示すので、範囲はデータの９０％を指定する。ＲＥＳｈＡＰＥ形態計測分析のために、単一細胞測定値を技術的複製とみなし、一方、薬物スクリーニングの各眼または各ウェルを生物学的複製とみなした。
【0265】
ヒト眼集団の定量化：いくつかの形状測定基準パラメータにより、ヒトＲＰＥフラットマウントにわたって異なるＲＰＥ集団の存在が明らかになった（図５）。これらのＲＰＥ集団を分離するために特注のソフトウェアを開発した。このソフトウェアは、ＲＥＳｈＡＰＥによって生成されたスプレッドシートからすべての細胞のｘ－ｙ座標を取得し、色分けされた画像を再構成する。ＲＰＥ集団は、色分けされた画像上で直接切り取られ、選択された細胞の情報が検索され、新しいスプレッドシートに保存される。ＲＰＥ集団はリング状に配置されているので、それらを単離するために円形選択ツールを使用した。円形領域は色分けされた細胞の勾配に従って切り取られたにもかかわらず、各リングの測定値の変動は０．６ｍｍ未満である。
【0266】
実施例２
成体ヒトＲＰＥの完全な形態計測マップ
成体ヒトＲＰＥ細胞の形態計測を分析するために、９人の非ＡＭＤ患者から１７個の死体眼を得た。眼を湿った氷上でアイバンクから輸送し、患者の死亡の２４時間以内に処理した。眼の硝子体内に１７００ ｍＯｓｍのマンニトール溶液を注射して、ＲＰＥからの網膜剥離を誘導し、その後、ＲＰＥ／脈絡膜複合体を切開し、平らな組織としてマウントした。ＲＰＥ細胞境界を抗ＺＯ１抗体および汎カドヘリン抗体で免疫標識し、それぞれタイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションを認識した。ＲＰＥ細胞では、アクチンフィラメントが細胞境界に沿ってタイトジャンクションを接続する多角形の環を形成するので、フルオロフォア結合ファロイジンも細胞境界染色を増強するために使用された。全ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントをイメージングし、特注のソフトウェアＲＥＳｈＡＰＥを用いて細胞形状を分析した。上皮全体の色分けされた画像は、分析されたあらゆる測定基準についての細胞形状の定量化を視覚的に表示する。眼全体ではなく、より小規模で以前に報告されたように（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．，２０１６）、特定の形状測定基準についてＲＰＥ全体にわたって明確な不均一性が観察された。例えば、細胞は、上皮の周辺部に位置する細胞と比較して、黄斑ＲＰＥに対応するより小さな面積で観察された（図５～６）。ＲＰＥ細胞面積は、偏心して徐々に増加する。興味深いことに、眼の中心から１４～１７ｍｍに含まれる領域に小さなＲＰＥ細胞のリングが観察された。リングの内側の末梢ＲＰＥと小さいＲＰＥの末梢リングとの間の細胞面積の変化は急激であり、小さいＲＰＥのリングとリングの外側の末梢ＲＰＥとの間の移行も急激である。小さなＲＰＥのリングの外側では、細胞面積が劇的に増加する。しかしながら、すべてのＲＰＥ細胞は、非常に細長く不規則に見えるまさしく周辺部の細胞を除いて、上皮全体にわたって同様に規則的な形状であるように見える。図２は、ヒト黄斑および末梢ＲＰＥ細胞の違いを示す。
成体ヒトＲＰＥの完全な形態計測マップ
成体ヒトＲＰＥ細胞の形態計測を分析するために、９人の非ＡＭＤ患者から１７個の死体眼を得た。眼を湿った氷上でアイバンクから輸送し、患者の死亡の２４時間以内に処理した。眼の硝子体内に１７００ ｍＯｓｍのマンニトール溶液を注射して、ＲＰＥからの網膜剥離を誘導し、その後、ＲＰＥ／脈絡膜複合体を切開し、平らな組織としてマウントした。ＲＰＥ細胞境界を抗ＺＯ１抗体および汎カドヘリン抗体で免疫標識し、それぞれタイトジャンクションおよびアドヘレンスジャンクションを認識した。ＲＰＥ細胞では、アクチンフィラメントが細胞境界に沿ってタイトジャンクションを接続する多角形の環を形成するので、フルオロフォア結合ファロイジンも細胞境界染色を増強するために使用された。全ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントをイメージングし、特注のソフトウェアＲＥＳｈＡＰＥを用いて細胞形状を分析した。上皮全体の色分けされた画像は、分析されたあらゆる測定基準についての細胞形状の定量化を視覚的に表示する。眼全体ではなく、より小規模で以前に報告されたように（Ｂｈａｔｉａ ｅｔ ａｌ．，ｏｐ．ｃｉｔ．，２０１６）、特定の形状測定基準についてＲＰＥ全体にわたって明確な不均一性が観察された。例えば、細胞は、上皮の周辺部に位置する細胞と比較して、黄斑ＲＰＥに対応するより小さな面積で観察された（図５～６）。ＲＰＥ細胞面積は、偏心して徐々に増加する。興味深いことに、眼の中心から１４～１７ｍｍに含まれる領域に小さなＲＰＥ細胞のリングが観察された。リングの内側の末梢ＲＰＥと小さいＲＰＥの末梢リングとの間の細胞面積の変化は急激であり、小さいＲＰＥのリングとリングの外側の末梢ＲＰＥとの間の移行も急激である。小さなＲＰＥのリングの外側では、細胞面積が劇的に増加する。しかしながら、すべてのＲＰＥ細胞は、非常に細長く不規則に見えるまさしく周辺部の細胞を除いて、上皮全体にわたって同様に規則的な形状であるように見える。図２は、ヒト黄斑および末梢ＲＰＥ細胞の違いを示す。
【0267】
実施例３
黄斑細胞とＲＰＥ細胞との比較
５つの異なるＲＰＥ集団をそれらの細胞面積に従って区別した（図６）。フラットマウントの画像を、視神経と黄斑との間のほぼ中間にある眼の中央付近を中心とする同心円状のリングと、黄斑の周りのリングとに分けた。中心から周辺部に向かって、ＲＰＥ集団を、Ｐ１、黄斑ＲＰＥ、上皮のまさに縁のＲＰＥであるＰ５と命名した。Ｐ１は黄斑であり、Ｐ２は中心であり、Ｐ３は末梢であり；Ｐ４は遠位末梢であり；Ｐ５は鋸状縁ＲＰＥである。円形領域が色分けされた細胞の勾配に従って手動で切り取られたにもかかわらず、平均の周りの広がりは０．６ｍｍ未満であることに留意されたい。したがって、成人の眼のＲＰＥ集団は非常に正確な位置を有する。さらに、ＲＰＥの中心集団および末梢集団（Ｐ２およびＰ３）にはわずかな非対称性がある。中心（Ｐ２）集団は常に側頭側にさらに延び、一方、末梢（Ｐ３）集団は鼻側にさらに延びる。その結果、細胞面積の色分けされた画像では、側頭側の色勾配は鼻側よりも顕著ではなく、側頭側ではＲＰＥ細胞面積がより小さいままである傾向があることを示唆している。
黄斑細胞とＲＰＥ細胞との比較
５つの異なるＲＰＥ集団をそれらの細胞面積に従って区別した（図６）。フラットマウントの画像を、視神経と黄斑との間のほぼ中間にある眼の中央付近を中心とする同心円状のリングと、黄斑の周りのリングとに分けた。中心から周辺部に向かって、ＲＰＥ集団を、Ｐ１、黄斑ＲＰＥ、上皮のまさに縁のＲＰＥであるＰ５と命名した。Ｐ１は黄斑であり、Ｐ２は中心であり、Ｐ３は末梢であり；Ｐ４は遠位末梢であり；Ｐ５は鋸状縁ＲＰＥである。円形領域が色分けされた細胞の勾配に従って手動で切り取られたにもかかわらず、平均の周りの広がりは０．６ｍｍ未満であることに留意されたい。したがって、成人の眼のＲＰＥ集団は非常に正確な位置を有する。さらに、ＲＰＥの中心集団および末梢集団（Ｐ２およびＰ３）にはわずかな非対称性がある。中心（Ｐ２）集団は常に側頭側にさらに延び、一方、末梢（Ｐ３）集団は鼻側にさらに延びる。その結果、細胞面積の色分けされた画像では、側頭側の色勾配は鼻側よりも顕著ではなく、側頭側ではＲＰＥ細胞面積がより小さいままである傾向があることを示唆している。
【0268】
平均ＲＰＥ細胞サイズは、眼の中心から１１．２±０．６ｍｍ～１４．３±０．５ｍｍで集団Ｐ３（末梢）まで偏心して増加する。このＲＰＥ集団は、２３８．６±３７．８μｍ２の平均細胞面積を有し、これは集団Ｐ１における黄斑ＲＰＥ細胞面積（黄斑、１４９．６±３３．４μｍ２）よりもほぼ６７％大きい。Ｐ３（末梢）の周囲（１４．６±０．６ｍｍ～１７．２±０．４ｍｍ）では、集団Ｐ４のＲＰＥ細胞サイズはかなり減少する（１８１．８±３９．５μｍ２）。解剖の変動性のために、この種の定量化は常に、Ｐ４集団において、より大きな面積寸法に向かって測定値を偏らせるＰ３（末梢）およびＰ５集団の一部を含む。したがって、色分けされた画像（図６）から理解され得るように、Ｐ４集団は、黄斑細胞（Ｐ１）と非常に類似した平均面積を有し得る。全体として、これは、周辺部に黄斑型のＲＰＥが存在することを示している。
【0269】
１７．６±０．４ｍｍから２１．１±０．５ｍｍまでのフラットマウントのまさしく周辺部では、ＲＰＥ集団Ｐ５の平均面積は、眼の残りの部分（３３６．８±４９．６μｍ２）と比較してかなり大きくなり、変動性である。目視検査により、最初の数ミリメートルでは、Ｐ５領域は末梢集団（Ｐ３）に匹敵する面積を有する細胞を含むが、より偏心した細胞面積ははるかに大きくなる。ほとんどの末梢ＲＰＥ細胞は、光感受性網膜が毛様体の非光感受性領域に移行する鋸状縁の領域に属する可能性が高い。
【0270】
実施例４
ｉＰＳＣ－ＲＰＥおよび成体ヒトＲＰＥの形態計測の比較
次に、Ｐ１（黄斑）およびＰ３（末梢）の形態学的ＲＰＥ不均一性をインビトロで再現した。非黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ２～Ｐ５）の中で、桿体光受容体の純粋な集団を支持する可能性が最も高いので、末梢（Ｐ３）を選択した。局所網膜変性における位置の重要性にもかかわらず、幹細胞由来ＲＰＥを任意の特定のヒトＲＰＥ集団に結び付ける報告は文献にない。変性に対する異なる感受性を再現するインビトロＲＰＥ集団を生成することは、ＡＭＤなどの疾患を研究するためのより良いシステムを提供するであろう。遠位末梢（Ｐ４）細胞は、後期ＡＭＤおよび外傷性傷害において損傷を受け得る。鋸状縁（Ｐ５）ＲＰＥ細胞は外傷性傷害において損傷を受け得る
ｉＰＳＣ－ＲＰＥおよび成体ヒトＲＰＥの形態計測の比較
次に、Ｐ１（黄斑）およびＰ３（末梢）の形態学的ＲＰＥ不均一性をインビトロで再現した。非黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ２～Ｐ５）の中で、桿体光受容体の純粋な集団を支持する可能性が最も高いので、末梢（Ｐ３）を選択した。局所網膜変性における位置の重要性にもかかわらず、幹細胞由来ＲＰＥを任意の特定のヒトＲＰＥ集団に結び付ける報告は文献にない。変性に対する異なる感受性を再現するインビトロＲＰＥ集団を生成することは、ＡＭＤなどの疾患を研究するためのより良いシステムを提供するであろう。遠位末梢（Ｐ４）細胞は、後期ＡＭＤおよび外傷性傷害において損傷を受け得る。鋸状縁（Ｐ５）ＲＰＥ細胞は外傷性傷害において損傷を受け得る
【0271】
エクスビボ培養で生成された完全に成熟したｉＰＳＣ由来ＲＰＥ（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）の形態計測を、成人健常ドナーからの１７個のフラットマウントで同定されたヒトＲＰＥ集団と比較した。興味深いことに、細胞サイズを比較した場合、インビトロで生成されたｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞は、あらゆるヒトＲＰＥ集団よりも小さい面積を有するようである。最も類似した寸法を有する集団は、Ｐ１と標識された黄斑集団である（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ：１０７．０±６１．７μｍ２対Ｐ１：１４９．６±３３．４μｍ２）（図８）。
【0272】
実施例５
処置されたｉＰＳＣ－ＲＰＥと成体ヒトＲＰＥ形態計測との比較
ＲＥＳｈＡＰＥは、細胞形態を定量するための非常に感受性の高いツールであることが示されたので、また、形態計測分析は、非常に単純かつスケーラブルな技術であるので、形態計測を、ｉＰＳＣに由来する黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ１）および末梢ＲＰＥ集団（Ｐ３）を特定するためのスクリーニングアッセイとして使用した。黄斑ＲＰＥおよび末梢ＲＰＥを濃縮および分離するために、分化中にｉＰＳＣ－ＲＰＥ上の化合物のハイコンテントスクリーニングを行った。１１５の選択された化合物には、細胞骨格の異なる発生経路およびストレス要因の活性化剤および阻害剤が含まれる。拘束ＲＰＥ細胞を３８４ウェルプレートに播種し、細胞形状分析を行う前に３０日間処理した。発生経路が依然として主要な役割を果たすがＲＰＥ運命を変化させないＲＰＥ分化中に早期に介入するために、細胞をＲＰＥ運命に拘束しながら処理した。ＴＪＰ１（ＺＯ１）タンパク質をｍＥＧＦＰにコンジュゲートさせたｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞株を使用した。ハイコンテントイメージングを実施し、ＲＥＳｈＡＰＥを用いて蛍光画像を分析した。互いに３倍に分離した３つの濃度を評価した。各形状測定基準のデータを分析し、プロットした。細胞面積は、ＲＰＥ集団間の明確な区別のために、処理されたｉＰＳＣ－ＲＰＥをヒトＲＰＥと比較するために選択された測定基準であった（図７）。
処置されたｉＰＳＣ－ＲＰＥと成体ヒトＲＰＥ形態計測との比較
ＲＥＳｈＡＰＥは、細胞形態を定量するための非常に感受性の高いツールであることが示されたので、また、形態計測分析は、非常に単純かつスケーラブルな技術であるので、形態計測を、ｉＰＳＣに由来する黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ１）および末梢ＲＰＥ集団（Ｐ３）を特定するためのスクリーニングアッセイとして使用した。黄斑ＲＰＥおよび末梢ＲＰＥを濃縮および分離するために、分化中にｉＰＳＣ－ＲＰＥ上の化合物のハイコンテントスクリーニングを行った。１１５の選択された化合物には、細胞骨格の異なる発生経路およびストレス要因の活性化剤および阻害剤が含まれる。拘束ＲＰＥ細胞を３８４ウェルプレートに播種し、細胞形状分析を行う前に３０日間処理した。発生経路が依然として主要な役割を果たすがＲＰＥ運命を変化させないＲＰＥ分化中に早期に介入するために、細胞をＲＰＥ運命に拘束しながら処理した。ＴＪＰ１（ＺＯ１）タンパク質をｍＥＧＦＰにコンジュゲートさせたｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞株を使用した。ハイコンテントイメージングを実施し、ＲＥＳｈＡＰＥを用いて蛍光画像を分析した。互いに３倍に分離した３つの濃度を評価した。各形状測定基準のデータを分析し、プロットした。細胞面積は、ＲＰＥ集団間の明確な区別のために、処理されたｉＰＳＣ－ＲＰＥをヒトＲＰＥと比較するために選択された測定基準であった（図７）。
【0273】
任意の濃度範囲で細胞サイズ分布のシフトを誘導したすべての薬物を選択し、生画像を毒性によって引き起こされる非特異的効果についてチェックした。残りの薬物を表２に列挙する。
【表2-1】
【表2-2】
【0274】
選択された薬物を、それらが作用する経路およびそれらの役割（活性化剤または阻害剤）に従ってグループ分けした。各群について、１よりも多くの薬物が存在する場合、細胞サイズの最も強いシフトを誘導したものをｉＰＳＣ－ＲＰＥ表現型に対するそれらの効果の特徴付けのために進めた。１１の薬物をｉＰＳＣ－ＲＰＥ表現型分析のために進めた（表３）。
【表3】
【0275】
実施例６
選択された薬物処理の表現型の特徴付け
１１の化合物を、ＲＰＥ細胞サイズにおけるそれらの初期効果に基づくさらなる表現型の特徴付けのために選択した。この特徴付けの目的は、以下の２つであった：１）薬物処理後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ表現型を分析して、薬物が細胞の健康に悪影響を及ぼさなかったことを確認すること；および２）細胞上の黄斑型または末梢型の頂端突起の存在を確認すること。ＲＰＥの頂端突起の構造は、錐体または桿体特異的として説明されてきた：花弁状の頂端突起は、錐体の外節の周りを包むことが観察されているが、指状の構造は、桿体の外節に並置されている（Ｆｉｓｈｅｒ＆Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０６（２），１３１－１４５，１９８２；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ＆Ｗｏｏｄ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８７（１０８９），４６１－４７８，１９７４）。黄斑は錐体に支配され、周辺部は桿体に支配されるので、これらの２つの異なる領域のＲＰＥ細胞は、２つの頂端突起構造のうちの１つで濃縮され得る。ＲＰＥの頂端突起の表現型が、ＲＰＥ形態計測以外の追加の識別因子として役立つであろうと仮定された。
選択された薬物処理の表現型の特徴付け
１１の化合物を、ＲＰＥ細胞サイズにおけるそれらの初期効果に基づくさらなる表現型の特徴付けのために選択した。この特徴付けの目的は、以下の２つであった：１）薬物処理後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ表現型を分析して、薬物が細胞の健康に悪影響を及ぼさなかったことを確認すること；および２）細胞上の黄斑型または末梢型の頂端突起の存在を確認すること。ＲＰＥの頂端突起の構造は、錐体または桿体特異的として説明されてきた：花弁状の頂端突起は、錐体の外節の周りを包むことが観察されているが、指状の構造は、桿体の外節に並置されている（Ｆｉｓｈｅｒ＆Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０６（２），１３１－１４５，１９８２；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ＆Ｗｏｏｄ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８７（１０８９），４６１－４７８，１９７４）。黄斑は錐体に支配され、周辺部は桿体に支配されるので、これらの２つの異なる領域のＲＰＥ細胞は、２つの頂端突起構造のうちの１つで濃縮され得る。ＲＰＥの頂端突起の表現型が、ＲＰＥ形態計測以外の追加の識別因子として役立つであろうと仮定された。
【0276】
異なる技術を使用して、ＲＰＥの形態学的特徴を研究した。経上皮電気抵抗を使用してタイトジャンクション完全性を調べ、明視野イメージングはＲＰＥ色素沈着欠陥を決定するのに有用であり、ヘマトキシリンおよびエオシン染色ならびに透過型電子顕微鏡法はそれぞれ肉眼的および微細な形態学的変化を検査するのに有用であったが、走査型電子顕微鏡法は頂端突起構造の改変を明らかにした。２つの化合物、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲおよびＡＧＮ １９３１０９は、ｉＰＳＣ－ＲＰＥの健康を破壊せず、異なるタイプの頂端突起表現型を明らかにした。
【0277】
Ｄ２１から開始して、ｉＰＳＣ－ＲＰＥを異なる化合物で処理した。Ｄ４０に、未成熟ＲＰＥを分化プロトコルに従ってネガティブ選択によって濃縮し、成熟のためにトランスウェルに播種した。細胞が完全に成熟するまで、ｉＰＳＣ－ＲＰＥを化合物でさらに６週間処理した（図１および図１１）。
【0278】
この時点で、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）をアッセイして、分化の質を確認し、タイトジャンクション完全性に対する薬物の効果を調べた。単位面積あたりの上皮抵抗についての４００Ωｃｍ２の最小閾値を使用して、良好な分化バッチを決定する。ＤＭＳＯ処理ｉＰＳＣ－ＲＰＥは、約１１００Ωｃｍ２の平均ＴＥＲ測定値を示し、この分化バッチの品質を確認した。他の化合物（表３参照）は、上皮バリアの完全性を破壊したが、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲおよびＡＧＮ １９３１０９は、タイトジャンクション完全性を維持しただけでなく、ＴＥＲ抵抗の増加も誘発した（ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲ：約１２００Ωｃｍ２、ＡＧＮ １９３１０９：約１６００Ωｃｍ２）。
【0279】
その後、形状測定基準を分析して、細胞面積に対する薬物の効果を確認した。ＤＭＳＯ処理ｉＰＳＣ－ＲＰＥと比較して、ＡＧＮ １９３１０９は、黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ１）の寸法に匹敵するｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞面積の増加を誘導し（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ面積＝１６１．８±１４９．７μｍ２、Ｐ１＝１４９．６±３３．４μｍ２）、一方、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲは、末梢ＲＰＥ集団Ｐ３の細胞に匹敵する細胞サイズのより大きな増加を誘導した（ｉＰＳＣ－ＲＰＥ面積＝２５１．８±２１８．４μｍ２、Ｐ３＝２３８．６±３７．８μｍ２）。図８～９のグラフおよび色分けされた画像は、異なる群間の比較を示す。
【0280】
明視野イメージングを使用してＲＰＥ色素沈着欠陥を決定したが、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は単層の肉眼的形態学的変化を検査するのに有用であった。トランスウェル膜の切片を切断し、明視野イメージングのためにガラススライドに載せた。色素沈着レベルは、ＤＭＳＯ処理ｉＰＳＣ－ＲＰＥと比較して、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲおよびＡＧＮ １９３１０９処理後に保存された。トランスウェルの別の領域を切片化し、Ｈ＆Ｅで染色した。薬物処理後、細胞は依然として単層として配置され、肉眼的形態学的変化は検出されず、ＲＰＥ細胞の頂端側に色素顆粒が依然として存在した。
【0281】
最後に、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して微細な形態学的変化を検出したが、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）は、頂端突起構造における改変を研究するために不可欠であった。ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲおよびＡＧＮ １９３１０９処理後に微細な細胞内構造の欠陥は同定されなかったが、２つの薬物は頂端突起構造の変化を誘導した。ＤＭＳＯ処理ｉＰＳＣ－ＲＰＥでは、本発明者らは、頂端突起、花弁および指状の両方のタイプを見出した。注目すべきことに、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲ処理時に、すべてのＲＰＥ細胞は、桿体外節とのＲＰＥ相互作用に関連している指状の頂端突起によって固有に濃縮された。一方、ＡＧＮ １９３１０９処理は、錐体外部を支持する花弁状の頂端突起（うねりを有する）を有するＲＰＥ細胞を濃縮した。ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲが末梢ＲＰＥ集団Ｐ３の寸法まで細胞サイズを増加させ、指状の頂端突起を有する細胞を濃縮するという事実は、この化合物が末梢ＲＰＥ表現型を誘導することを証明している。逆に、ＡＧＮ １９３１０９は、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞サイズを黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ１）にシフトさせ、花弁状の頂端突起（うねりを有する）の形成を誘導し、この化合物が黄斑ＲＰＥ表現型を誘導するという証拠が得られる（図１０および図１１）。
【0282】
全体として、これらの結果は、スクリーニングツールとして細胞形状を使用することが、大きい細胞の集団を小さい細胞の集団から分離するだけでなく、形態学的特徴を選択することを示している。理論に拘束されるものではないが、データは、発生経路がＲＰＥ分化中に標的化されたことを示している。
【0283】
要約すると、９人の非ＡＭＤドナーの眼から１７個のＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントを解剖し、ＲＰＥ細胞境界について染色し、イメージングし、フラットマウントあたり平均３００～４００万個の細胞をセグメント化した。本研究で使用した各ヒト眼について、ヒトＲＰＥ全体の完全な形態計測マップを初めて作成した。眼全体にわたるＲＰＥ細胞の不均一性を強調するために、他の形状測定基準の中から細胞面積を選択した。ＲＰＥ細胞の勾配は、黄斑内の小さいＲＰＥ細胞から始まって周辺部に向かって偏心的に移動する、次第に大きくなる領域で特定された。眼の中心から半径１４～１７ｍｍ付近に小さなＲＰＥ細胞の末梢リングが検出された。ＲＰＥ細胞の５つの固有の領域を同定した。
【0284】
より小さいＲＰＥ細胞の末梢リングの発見は、遠位周辺部における黄斑型ＲＰＥ細胞の存在を示す。ＲＰＥ集団Ｐ４は、錐体の末梢縁部が記載されているのと同じ領域に対応し得る。例えば、集団Ｐ３（末梢）の大きなＲＰＥ細胞から集団Ｐ４（遠位末梢）の小さな細胞へ、そして再び集団Ｐ５（鋸状縁）の大きなＲＰＥ細胞への突然の移行がある。さらに、ＲＰＥ集団Ｐ４は、眼の中心から約１４～１７ｍｍ離れた領域、および鋸状縁の移行ゾーン（錐体のゆるいバンドが記載されたのと同じ領域）の前に含まれる幅約１～２ｍｍである。小さいＲＰＥ細胞は黄斑および末梢縁部などの錐体が支配的な領域に存在し、大きいＲＰＥ細胞は桿体が支配的な領域に発生するようである。
【0285】
開示される方法は、インビトロでの領域的ＲＰＥ不均一性の再現を達成する。これを達成するために、培養で生成されたｉＰＳＣ－ＲＰＥの細胞サイズを、各ヒトＲＰＥ集団の平均細胞面積と比較した。比較は、培養で増殖させた完全成熟ＲＰＥが、死体眼サンプルで同定された任意の他のヒトＲＰＥ集団よりも小さい細胞面積を有することを示した。サイズに関して最も近いヒトＲＰＥ集団は、黄斑ＲＰＥ（Ｐ１）であった。細胞を異なるプレートフォーマットで播種し、それに応じて濃度を調整したが、平均細胞面積は実質的に変化しなかったので、播種濃度がより小さな細胞サイズを誘導する可能性は低い。
【0286】
ＲＰＥ細胞サイズを決定するそのようなシグナルを同定するために、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を、それらがＲＰＥ運命に拘束されたばかりの分化段階中に操作した。この操作を、異なる発生経路の１１５の活性化剤および阻害剤ならびにアクチン細胞骨格の調節因子を使用して行った。ＲＰＥ形態計測をすべての薬物について分析し、ヒト黄斑ＲＰＥ集団（Ｐ１）および末梢ＲＰＥ集団Ｐ３に対する参照として比較した。
【0287】
集団Ｐ５は「真の」ＲＰＥ特徴を有さない可能性がある鋸状縁のＲＰＥ細胞を含み、集団Ｐ４（遠位末梢）は細胞サイズが黄斑ＲＰＥに似ているので、末梢集団Ｐ３を周辺部の参照として選択した。
【0288】
化合物を、経路およびそれを活性化または阻害する際のそれらの役割によってグループ化し、各群について細胞サイズの最大のシフトを示した化合物を表現型の特徴付けについて試験した。２つの化合物、ＡＧＮ １９３１０９およびＥＮＤＯ－１－ＩＷＲは、それぞれ黄斑集団（Ｐ１）および末梢集団（Ｐ３）の細胞サイズを再現することができ、それぞれ花弁状および指状の頂端突起を有するＲＰＥ細胞を濃縮することができることが見出された。両方の化合物は、ＴＥＲ、明視野、Ｈ＆ＥおよびＴＥＭによって検証されるように、健康なＲＰＥ表現型に影響を及ぼさなかった。
【0289】
ＡＧＮ １９３１０９は、高親和性汎レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストである。レチノイン酸は、食事では入手できないビタミンＡの一形態であるが、レチノールから合成される。したがって、そのレベルは、その合成および分解によって調節される（Ｄｕｅｓｔｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１（３），１６３８－１６４；Ｎａｐｏｌｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１（２９），１３５９２－１３５９７ｊ １９８６）。レチノイン酸は、胚形成、免疫、細胞増殖および分化の促進または阻害などの多くの重要な生物学的プロセスを調節することができる（Ｌｏｔａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，６０５（１），３３－９１，１９８０）。ＲＰＥは、眼のレチノイド代謝において中心的な役割を果たす：ＲＰＥは、ビタミンＡの貯蔵形態であるレチニルエステルのレザバであり、１１－シス－レチナールデヒドを形成するための全トランスレチニルエステルの異性化および酸化がＲＰＥ細胞で起こる（Ｒａｎｄｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（３），５９５－６０，１９９１）。さらに、ＲＰＥは、体内で最も高い濃度のレチノイドを含有する組織の１つであり、ビタミンＡ代謝におけるＲＰＥ細胞の重要性を強調している（Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，１３（９），６７５－６８７，１９７４）。培養ウシＲＰＥ細胞は、シトクロムＰ－４５０モノオキシゲナーゼの活性を介してレチノイン酸を代謝することが示されている。ＲＰＥは、レチノイン酸をより極性の高い代謝産物である４－オキソ－レチノイン酸に変換し、これは細胞から急速に放出され得る（Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６（３），７０８－７１７，１９９５）。この結果は、ＲＰＥが網膜におけるこの生物学的に強力なレチノイドの不活性化において重要であり得ることを示している。
【0290】
初期の眼発生中のＲＰＥおよび網膜からのレチノイン酸の局所的な分解は、将来の黄斑ＲＰＥおよび中心窩の位置を示す可能性がある。理論に拘束されるものではないが、ＡＧＮ １９３１０９は、ＲＰＥ細胞のＲＡＲに拮抗することによってレチノイン酸枯渇を模倣し得る。この仮説を検証するために、レチノイン酸シグナルの基礎レベルを検証することができ、対照およびＡＧＮ １９３１０９処理ＲＰＥ細胞におけるシトクロムの発現および活性を確認することができる。
【0291】
他の市販のレチノイン酸阻害剤を使用して、黄斑ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｐ１）を生成することができる。これらを表４に示す。
【表4】
【0292】
ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲは、カノニカルＷｎｔ経路阻害剤である。Ｗｎｔは、胚発生中の細胞運命決定、細胞遊走、細胞極性、神経パターン形成および器官形成の重要な態様を調節する進化的に保存された経路である。Ｗｎｔ経路は、フリズルド受容体の下流で２つの主な分岐：β－カテニンに依存するカノニカルＷｎｔ経路および非カノニカルＷｎｔ経路に細分することができる。後者は、平面細胞極性（ＰＣＰ）経路およびＷｎｔ／Ｃａ２＋経路にさらに細分することができる。Ｗｎｔ分子は、フリズルド受容体ファミリーに結合する分泌糖タンパク質である。Ｗｎｔシグナル伝達は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達の場合、フリズルド受容体の共受容体、例えば低密度リポタンパク質関連タンパク質５／６（ＬＲＰ５／６）への結合によって開始される。次いで、シグナルは細胞質タンパク質Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）に変換され、このレベルで経路が分岐する（Ｋｏｍｉｙａ＆Ｈａｂａｓ，Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，４（２），６８－７５，２００８）。カノニカルＷｎｔ経路の特徴は、ＬＥＦ／ＴＣＦなどのＤＮＡ結合転写因子との結合を介して標的遺伝子の転写を活性化する、アドヘレンスジャンクション関連タンパク質β－カテニンの核内への蓄積およびトランスロケーションである（Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｃｅｌｌ １２７（３），４６９－４８０．２００６；Ｒｅｙａ＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４３４（７０３５），８４３－８５０，２００５）。Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下では、β－カテニンはβ－カテニン破壊複合体によってリン酸化され、プロテアソームによる分解の標的となる。平面細胞極性は、上皮細胞の組織化および配向を調節することが示されている（Ｍｌｏｄｚｉｋ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ，１８（１１），５６４－５７１，２００２）。この経路は転写とは独立しているようであるが、構造の組織化を達成するためにアクチン細胞骨格の直接的な調節を介して機能する。非カノニカル経路の第２の分岐は、Ｗｎｔ／Ｃａ２＋と命名される。これはβ－カテニン誘導性転写とは無関係であり、ＥＲからのＧタンパク質媒介性細胞内Ｃａ２＋放出を特徴とする（Ｋｏｈｎ＆Ｍｏｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ，３８（３－４），４３９－４４６，２００５；Ｓｌｕｓａｒｓｋｉ＆Ｐｅｌｅｇｒｉ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０７（１），１－１３，２００７）。
【0293】
ＲＰＥ表現型の特徴付けに使用される化合物であるＥＮＤＯ－１－ＩＷＲは、β－カテニン破壊複合体のアキシンタンパク質を安定化することによって作用する。破壊複合体の安定化は、β－カテニン分解、したがってカノニカルＷｎｔ経路阻害を促進する。
【0294】
Ｗｎｔ経路は、ＲＰＥの発生において役割を果たす。第１に、ＢＭＰ阻害に伴うＷｎｔ経路阻害は、前側神経上皮（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）からの眼領域の生成を可能にする。Ｄｋｋ－１およびＮｏｇｇｉｎ内因性発現（それぞれＷｎｔ／β－カテニンおよびＢＭＰ阻害剤）は、眼野の特異化（ｅｙｅ ｆｉｅｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）中にヒト胚性幹細胞においてアップレギュレートされた（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，１０６（３９），１６６９８－１６７０３，２００９）。第２に、ＲＰＥの特定中に、カノニカルＷｎｔが活性化され、β－カテニンが核にトランスロケーションし、ＲＰＥ特異的遺伝子ＭｉｔｆおよびＯｔｘ２のエンハンサー部位に直接結合して、それらの発現を誘導する。β－カテニンが欠失すると、ＲＰＥは、ＭｉｔｆおよびＯｔｘ２がダウンレギュレートされた多層組織に変換し、ＲＰＥの網膜への分化転換をもたらす（Ｗｅｓｔｅｎｓｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３６（１５），２５０５－２５１０，２００９）。
【0295】
本明細書に開示されるデータに基づいて、カノニカルＷｎｔ経路は、ＲＰＥ拘束段階から成熟ＲＰＥ段階までの発生の後期段階でＲＰＥにおいて役割をさらに果たす。この段階の間、ＥＮＤＯ－１－ＩＷＲによるカノニカルＷｎｔ阻害は、ヒト末梢ＲＰＥ集団Ｐ３と一致するようにＲＰＥ細胞サイズを増加させ、指状の頂端突起を有するこれらの細胞を濃縮して網膜の桿体が支配的な領域を支持する。細胞サイズの勾配は、レチノイン酸とＷｎｔ阻害の組み合わせによって達成することができる。
【0296】
スクリーニングに使用される他のＷｎｔ阻害剤は、ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞面積の増加において同様の傾向を示し、末梢ＲＰＥ細胞の生成におけるＷｎｔ阻害の役割をさらに裏付けている（図１２）。この証拠は、他の市販のカノニカルＷｎｔ阻害剤を使用して、末梢ｉＰＳＣ－ＲＰＥ（Ｐ３）を生成することができることを示す。表５は、これらの化合物の例示的なリストを提供する。
【表5-1】
【表5-2】
【0297】
ＲＰＥ成熟期（培養日数の合計であるＤ４０～Ｄ７５）中のカノニカルＷｎｔ阻害は、ＲＰＥ成熟を促進することができる（Ｍａｙ－Ｓｉｍｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２（１），１８９－２０５，２０１８）。処理は、成熟培地での培養開始から１５日後に開始することができる。ここに示されるデータとは対照的に、Ｗｎｔ阻害は、ＲＰＥ運命への細胞拘束中に開始され、ＲＰＥ成熟の終了まで維持される（Ｄ２５～Ｄ７５）。ＲＰＥ拘束の間、発生経路は依然として主要な役割を果たし、ＲＰＥの運命を変えることなく最終的なＲＰＥ表現型に影響を及ぼし得る。
【0298】
したがって、黄斑（Ｐ１）および末梢（Ｐ３）ＲＰＥ細胞のヒトＲＰＥ集団をインビトロで再現した。使用した例示的な非限定的な濃度を表６に列挙する。
【表6】
【表7】
【0299】
この研究は、黄斑およびＲＰＥの発生に関する洞察を提供し、網膜変性の現在のｉＰＳＣベースの疾患モデルを改善し、細胞治療製品または網膜の１またはそれを超える領域を開発するために使用することができる（図１４）。
【0300】
実施例７
二層スキャフォールドの生成
この実施例は、本明細書で「ファジー」または「ＰＬＧＡ／ＰＣＬ」スキャフォールドと呼ばれる二層スキャフォールドを調製するために使用される方法を記載する。そのようなスキャフォールドは、ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を播種するために使用することができる。いくつかの例では、生成されたスキャフォールドは、例えば眼への移植後２０日～６ヶ月で生分解性である。
二層スキャフォールドの生成
この実施例は、本明細書で「ファジー」または「ＰＬＧＡ／ＰＣＬ」スキャフォールドと呼ばれる二層スキャフォールドを調製するために使用される方法を記載する。そのようなスキャフォールドは、ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を播種するために使用することができる。いくつかの例では、生成されたスキャフォールドは、例えば眼への移植後２０日～６ヶ月で生分解性である。
【0301】
二層スキャフォールドは、米国特許第１０，４８０，０３１号に記載されている方法の改変を使用して調製した。手短に言えば、熱溶融電界紡糸ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）スキャフォールドを使用し、これは＞５６Ｃでの熱処理によって生成され、繊維の穏やかな融合を可能にし、細胞を上部で増殖させる。ＰＬＧＡスキャフォールドは、高さが約２０～３０ミクロンであり、１ミクロン未満の平均孔径、１：１のＤＬ－ラクチド／グリコリド比、および１５０～６５０ｎｍの繊維径を有していた。
【0302】
ＰＬＧＡスキャフォールドをベースとして使用して、ＰＬＧＡスキャフォールドの表面にポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ループを付加した。電界紡糸中、ＰＣＬはＰＬＧＡスキャフォールドの表面に永久的に付着するようになる。ＰＣＬループを堆積させるために、電界紡糸プロセス中に噴出する前に、ＰＣＬを１００℃（約７０℃～約１４０℃の範囲を使用することができる）で３０分間溶融し、電界紡糸プロセスでは、電界電圧は２５ｋＶ（約５～約５０ｋＶの範囲を使用することができる）、ガス噴出圧力は３００ｋＰａ、ノズルとＰＬＧＡスキャフォールドとの間の作業距離は２７ｍｍ（約１０ｍｍ～約４０ ｍｍの範囲を使用することができる）であり、電界紡糸時間は５分（約２分～約１０分の範囲を使用することができる）であった。これらのパラメータは、ＰＬＧＡスキャフォールド表面上にスポンジ状メッシュ構造を形成するランダムに堆積したループを生成した。ＰＣＬ直径は、約５ｕｍ～３００ｕｍの範囲であった。ループはランダムなパターンで分布し、ループ形成繊維のランダムな厚さを有していた。ループ密度およびループの数は、複数のＲＰＥ細胞（１０～１０００個の細胞）が単層領域を形成するのに十分なギャップを提供するために実験的に決定することができる。ＰＬＧＡスキャフォールド上に堆積したＰＣＬループは、完全に閉じたまたは開いたループの混合物を含む。
【0303】
ＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを以下のように滅菌した。Ｐｌａｓｍａ Ｅｔｃｈ ＰＥ５０ＸＬデバイスを使用して、スキャフォールド繊維の処理のための酸素プラズマ放出を生成し、スキャフォールドの表面を滅菌した。作業圧力は約１４０ｍｔｏｒｒであり、酸素流量は約７ｃｃ／分であった。サイクルは、３０分間の最大電圧（１２０Ｖ）である。
【0304】
滅菌したＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールド（直径１０ｍｍ、直径約１０ｍｍ～約３０ｍｍであり得る）をＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システムの表面に載せた。このシステムは、ＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドのための構造およびプラットフォームを提供する。システムの微孔質膜は、スキャフォールドを支持するとともに細胞の極性化した層の別個の面を単離する頂端側および基底側を作り出す。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システムインサートが膜を剥離する能力により、インサートの支持リングをスキャフォールドのためのアンカーとして使用することが可能になる。しかしながら、支持リングと膜とを組み合わせた後、支持リングの底部リップと多孔質膜自体との間には小さな空隙が存在する。したがって、生体不活性Ｏリング（硬化シリコーンポリマー）を使用して空隙を充填した。支持リングは、膜の外縁の周りに均一に圧力を加えて、膜に対してスキャフォールドを保持することができる。このシリコーンリングは、細胞培養および培地交換中にスキャフォールドを確実に保持するために、Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）の非生分解性多孔質ポリカーボネート膜上の定位置にＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを保持した。
【0305】
簡単に説明すると、ウェル上部をウェル底部から分離し、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システム膜の内部寸法に一致するようにプレカットしたＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドをＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システム底部の中央に配置して、平らに置いた。Ｏリング（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、１２ｍｍ×１０．２５ｍｍ×１．２ｍｍ、Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｗａｓｈｅｒ ａｎｄ Ｇａｓｋｅｔ Ｃｏｒｐ，ＵＳ）をＰＬＧＡ／ＰＣＬの上部に配置して、スキャフォールドを定位置に保持した（しかし、他のＯリングを使用することもできる）。Ｏリングは、７０％エタノール中で２０分間処理することによって予め滅菌した。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システムの上部をＯリングの上に置き、静かに所定の位置に押し込んだ。
【0306】
図１５に示すように、得られた「ファジー」二層スキャフォールドは、ＰＣＬループのメッシュ状構造を含む。これらのループは、ＲＰＥ細胞（例えば、実施例１～６に記載されるように本明細書中に提供される方法を使用して生成される末梢ＲＰＥ細胞、黄斑ＲＰＥ細胞および／または中心ＲＰＥ細胞など）へのそれらの付着を安定化するためのＰＲＰ細胞のアンカーおよびスキャフォールドとして機能する。天然の生体系では、ＲＰＥ細胞表面への光受容体付着が弱い。ＰＣＬループは、機械的取り扱い段階中（例えば、移植手順中）に、この付着を補強し維持するためのスキャフォールドを形成する。
【0307】
実施例８
二層スキャフォールドへのＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞の付着
この実施例は、実施例７で生成されたＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドにＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を付着させるために使用される方法を記載する。
二層スキャフォールドへのＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞の付着
この実施例は、実施例７で生成されたＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドにＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を付着させるために使用される方法を記載する。
【0308】
簡潔には、ＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を、以下のように実施例７で調製したスキャフォールド上に付着／播種した。中心ＲＰＥ細胞（例えば、開示された方法を使用して生成される）を、スナップウェル培養システム（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｎａｐｗｅｌｌ（商標）システム）で組み立てたビトロネクチン（ＶＴＮ）被覆ＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールド（ＶＴＮ濃度：４５．５ｕｇ／ｍｌ、１２時間、約２０～約９５ｕｇ／ｍｌを使用することができる）に播種した。本明細書で提供される方法を使用して生成された末梢ＲＰＥ細胞および黄斑ＲＰＥ細胞などの他のＲＰＥ細胞を使用することができる。純粋なＲＰＥ細胞、拘束ＲＰＥ細胞および未成熟ＲＰＥ細胞を３５０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、３週間増殖させ、ＲＰＥ－ＭＭ培地（標準的なＲＰＥ増殖培地）を２～３日ごとに交換した。その後、培養準備のできた凍結形態で到着したＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．のｉＰＲＰを用いてＰＲＰ細胞播種を行った。細胞を解凍および洗浄した後、ｉＰＲＰを、培地改変なしのＲＰＥ－ＭＭにおいて３５０万細胞／ｃｍ２（０．５ｍＬ培地体積）でｉＲＰＥの上に播種した。使用前にさらに２週間、３７℃、環境酸素、５％ ＣＯ２で細胞を増殖させた。
【0309】
図１６Ａ～１６Ｂに示すように、開示のＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを使用して細胞を増殖させることができる。より小さい六角形の細胞は、スキャフォールドのすべての表面を覆うＲＰＥ単層である。より小さなパッチで増殖する、より大きく現れる細胞はＰＲＰ細胞である。ほとんどのＰＲＰ「パッチ」は、ＰＣＬループによって形成された「遮蔽」区画に位置する。
【0310】
実施例９
二層スキャフォールドの移植
この実施例は、実施例８で作製したＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を含むＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを ブタの眼に移植するために用いた方法を説明する。簡潔には、播種したＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを以下のようにブタの眼に外科的に移植した。ポビドンヨードによる手術領域の滅菌、側頭眼角切開（temporal canthotomy）、上直筋牽引および瞬膜収縮が、手術露出領域を増加させるために行われる。露出した強膜に対して鼻角膜周囲切開を行い、２５ Ｇバルブトロカールカニューレ（Ａｌｃｏｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）を使用して縁から３．５ｍｍに４つの手術ポート（注入、シャンデリア照明、および２つの作業ポート）を作成する。硝子体切除術および後部硝子体剥離の後、２５Ｇ／３８Ｇカニューレ（ＭｅｄＯｎｅ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を使用して、視覚的線条（レーザー領域）において限局性網膜剥離（ＲＤ）を行い、鋏網膜切開術をＲＤの基部で行う。移植ツールを収容するために、強膜切開（２．３ｍｍ～２．５ｍｍ）が鼻ポートの領域で行われる。ＲＰＥ／ＰＬＧＡスキャフォールドを装填したツールの先端部を網膜切開術を通して網膜下腔に導入し、硝子体切除システム（Ａｌｃｏｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）の粘性流体注入デバイスの助けを借りてｉＲＰＥスキャフォールドを放出させる。眼創傷クランプ（特注）を使用して、第２のＰＲＰ／ＰＧＳスキャフォールドが移植ツールに装填されるまで、強膜切開創を一時的に閉鎖する。次いで、ＰＲＰ／ＰＧＳスキャフォールドを装填したツールの先端部を網膜切開術を通して網膜下腔に導入し、ＲＰＥスキャフォールドの上に堆積させることを目指してＰＲＰスキャフォールドを解放する。眼創傷クランプは、強膜切開創を一時的に封止するために使用される。軟質先端２５Ｇカニューレまたはブラシは、網膜下腔に重ね合わせるように両方のスキャフォールドを操作するために使用される。スキャフォールド位置が依然として変化しないことを確実にするために、術中ＯＣＴで監視しながら、剥離した領域を平らにするために流体空気交換が使用される。必要に応じて、流体－空気交換中にソフトチップまたはブラシカニューレを使用して小さな補正を行うことができる。強膜切開をナイロン８－０で閉じる。
二層スキャフォールドの移植
この実施例は、実施例８で作製したＲＰＥ細胞およびＰＲＰ細胞を含むＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを ブタの眼に移植するために用いた方法を説明する。簡潔には、播種したＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドを以下のようにブタの眼に外科的に移植した。ポビドンヨードによる手術領域の滅菌、側頭眼角切開（temporal canthotomy）、上直筋牽引および瞬膜収縮が、手術露出領域を増加させるために行われる。露出した強膜に対して鼻角膜周囲切開を行い、２５ Ｇバルブトロカールカニューレ（Ａｌｃｏｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）を使用して縁から３．５ｍｍに４つの手術ポート（注入、シャンデリア照明、および２つの作業ポート）を作成する。硝子体切除術および後部硝子体剥離の後、２５Ｇ／３８Ｇカニューレ（ＭｅｄＯｎｅ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を使用して、視覚的線条（レーザー領域）において限局性網膜剥離（ＲＤ）を行い、鋏網膜切開術をＲＤの基部で行う。移植ツールを収容するために、強膜切開（２．３ｍｍ～２．５ｍｍ）が鼻ポートの領域で行われる。ＲＰＥ／ＰＬＧＡスキャフォールドを装填したツールの先端部を網膜切開術を通して網膜下腔に導入し、硝子体切除システム（Ａｌｃｏｎ ｓｕｒｇｉｃａｌ）の粘性流体注入デバイスの助けを借りてｉＲＰＥスキャフォールドを放出させる。眼創傷クランプ（特注）を使用して、第２のＰＲＰ／ＰＧＳスキャフォールドが移植ツールに装填されるまで、強膜切開創を一時的に閉鎖する。次いで、ＰＲＰ／ＰＧＳスキャフォールドを装填したツールの先端部を網膜切開術を通して網膜下腔に導入し、ＲＰＥスキャフォールドの上に堆積させることを目指してＰＲＰスキャフォールドを解放する。眼創傷クランプは、強膜切開創を一時的に封止するために使用される。軟質先端２５Ｇカニューレまたはブラシは、網膜下腔に重ね合わせるように両方のスキャフォールドを操作するために使用される。スキャフォールド位置が依然として変化しないことを確実にするために、術中ＯＣＴで監視しながら、剥離した領域を平らにするために流体空気交換が使用される。必要に応じて、流体－空気交換中にソフトチップまたはブラシカニューレを使用して小さな補正を行うことができる。強膜切開をナイロン８－０で閉じる。
【0311】
図１７Ａは、手術の１ヶ月後のインプラントのデジタルＳＬＯ画像を示す。図１７Ｂに示すように、移植の１ヶ月後、ＯＣＴ Ｂスキャンは、網膜構造のわずかな上昇によって残留スキャフォールドマトリックスが観察されるスキャフォールドの完全な組み込みを示す。炎症反応は認められない。網膜層は、スキャフォールド領域の上部で十分に顕著である。
【0312】
手術の２ヶ月後、網膜は正常な外観を有し、スキャフォールドは見えない。図１８Ａは、インプラントが配置された領域を示す眼組織の切開され固定された断片を示す。網膜は、目に見える炎症または瘢痕化のプロセスがなく、完全に健康である。図１８Ｂに示すように、スキャフォールドが移植された領域では、網膜の積層が明らかであり（青色ドット）、周囲の領域と比較してより健康な網膜を示している。したがって、スキャフォールド領域の網膜の厚さはより規則的であり、はっきりと見える網膜層を有する。これらの層は、スキャフォールドが配置された領域にのみ存在する。これは、スキャフォールドの境界の両側で網膜変性がはっきりと見えるのとは対照的である。スキャフォールド領域におけるいくらかの網膜分離は、サンプル処理によって引き起こされ得る。図１８Ｃは、より高倍率の画像を提供し、ＰＲＰおよび第２のＲＰＥ層を示す。この知見は、開示されたＰＬＧＡ／ＰＣＬスキャフォールドが網膜組織に首尾よく組み込まれ、正常な網膜機能を維持することができることを実証している。
【0313】
実施例１０
ＡＧＮ １９３１０９またはｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１で処理した細胞の追加の特徴付け
ＤＭＳＯ（対象、キャリア）、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１およびＡＧＮ １９３１０９が有害でないことを実証するために、ＤＭＳＯ（図２０Ａ）、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１（図２０Ｃ）またはＡＧＮ １９３１０９（図２０Ｅ）で処理した後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ色素沈着レベルを調べた。ＡＧＮ １９３１０９を０．２．μＭで使用し、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を４ｕＭで使用した。両方の薬物をＤＭＳＯに溶解し、その結果、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％以下であった。ＤＭＳＯ対照の最終濃度は０．１％であった。細胞が成熟するまで、化合物をＲＰＥ成熟培地に添加した。可能性のある異常を検出するために、肉眼的細胞形態も分析した（図２０Ｂ、図２０Ｄ、図２０Ｆ、左画像）。透過型電子顕微鏡を用いて、微細な細胞内構造を変化について調べた（ＴＥＭ、図２０Ｂ、図２０Ｄ、図２０Ｆ、右画像）。これらの薬剤は、色素沈着レベルを変化させず、肉眼的または微細な細胞形態にも影響しなかった。
ＡＧＮ １９３１０９またはｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１で処理した細胞の追加の特徴付け
ＤＭＳＯ（対象、キャリア）、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１およびＡＧＮ １９３１０９が有害でないことを実証するために、ＤＭＳＯ（図２０Ａ）、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１（図２０Ｃ）またはＡＧＮ １９３１０９（図２０Ｅ）で処理した後のｉＰＳＣ－ＲＰＥ色素沈着レベルを調べた。ＡＧＮ １９３１０９を０．２．μＭで使用し、ｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１を４ｕＭで使用した。両方の薬物をＤＭＳＯに溶解し、その結果、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％以下であった。ＤＭＳＯ対照の最終濃度は０．１％であった。細胞が成熟するまで、化合物をＲＰＥ成熟培地に添加した。可能性のある異常を検出するために、肉眼的細胞形態も分析した（図２０Ｂ、図２０Ｄ、図２０Ｆ、左画像）。透過型電子顕微鏡を用いて、微細な細胞内構造を変化について調べた（ＴＥＭ、図２０Ｂ、図２０Ｄ、図２０Ｆ、右画像）。これらの薬剤は、色素沈着レベルを変化させず、肉眼的または微細な細胞形態にも影響しなかった。
【0314】
経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）は、単層の緊密さの尺度である。単層が密であるほど、単層中の細胞はより健康である。４００オーム＊ｃｍ２のカットオフを使用して、低いＴＥＲを有する細胞を除外した。図２１に示すように、ＡＧＮ １９３１０９処理細胞およびｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞の両方とも、この閾値を十分に上回った。ｒｅｓデータはボックスプロットとして表示され、ボックス限界は第１および第３四分位数を表し、中心線は中央値を示し、ひげは第５および第９５パーセンタイルを示す。範囲は、データの９０％を指定する。
【0315】
単一細胞ＲＮＡシーケンシングを行って、化合物が細胞トランスクリプトームを変化させたことを確認した。図２２に示すように、黄斑および中位末梢ｉＰＳＣ－ＲＰＥは、ＤＭＳＯとも互いとも機能的に異なる。
【0316】
バルクＲＮＡシーケンシングを行い、特定の遺伝子の発現レベルを文献から入手可能なデータと比較した（図２３）。データは、黄斑ＲＰＥでより発現される遺伝子の不完全であるが一貫した一致；反対の発現を有する遺伝子のセット；および末梢ＲＰＥ細胞でより発現される遺伝子のほぼ完全な一致を実証している。
【0317】
ｉＰＳＣ－ＲＰＥ細胞を、貪食するために精製ウシ外節（主に桿体光受容体）に提供した。外節を、外節が貪食されたときに蛍光を発する色素で標識した。ＲＰＥ細胞を外節と共に４時間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーで分析して外節摂取を測定するか、または２０時間インキュベーターに戻してから、フローサイトメトリーを行って外節消化を測定した。図２４に示されるように、ｅｎｄｏ－ｉｗｒ－１処理細胞は、より多くの外節を摂取し（末梢細胞）、通常は網膜の周辺部で優勢である桿体外節に対する可能な親和性を示す。一元配置ＡＮＯＶＡは差を示さなかった。
【0318】
酸性ホスファターゼは、黄斑においてより高い発現を有する（Ｂｏｕｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍ．７８：１２５－９，ｄｏｉ：１０．１１３６／ｂｊｏ．７８．２．１２５，１９９４）。この酵素は、光受容体外節の消化において重要な役割を果たす。酸性ホスファターゼ活性を、ＤＭＳＯ、ＡＧＮ １９３１０９またはｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１で処理した細胞において決定した。ＲＰＥ細胞を蒸留水に溶解して酵素を抽出した。次いで、溶解物を、酸性ホスファターゼによって脱リン酸化されると黄色になるホスファターゼ基質であるｐ－ニトロフェニルホスフェートと共にインキュベートした。溶液の色を分光光度計で測定し、酵素活性を推定した。図２５に示すように、ＡＧＮ １９３１０９処理細胞（黄斑ｉＰＳＣ－ＲＰＥ）は、ＤＭＳＯまたはｅｎｄｏ－ＩＷＲ－１処理細胞よりも高い酸性ホスファターゼ活性を有していた。
【0319】
末梢（Ｐ）－ＲＰＥは、黄斑（Ｍ）－ＲＰＥと比較して、より高いミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）を有する。２つのタイプのＲＰＥ細胞（Ｍ－ＲＰＥおよびＰ－ＲＰＥ）における代謝プロセスを、Ｓｅａｈｏｒｓｅ技術を用いて測定した。Ｓｅａｈｏｒｓｅシステムは、それぞれミトコンドリア呼吸および解糖の指標である、生細胞の酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。図２６に示すように、２つの異なる炭素源（プロリンおよびコハク酸）の下で、Ｐ－ＲＰＥは、より高い解糖速度を示したＭ－ＲＰＥと比較して、ＯＸＰＨＯＳを行う能力が高かった。
【0320】
本発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は本発明の例にすぎず、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の範囲内に入るすべてを本発明者らの発明として主張する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A-17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【国際調査報告】