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▶ サンガモ セラピューティクス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】ジンクフィンガーヌクレアーゼを標的としたＣＩＩＴＡ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20240517BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C12N5/10 ZNA
C12N9/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572959
(86)(22)【出願日】2022-05-24
(85)【翻訳文提出日】2024-01-18
(86)【国際出願番号】 US2022030727
(87)【国際公開番号】W WO2022251217
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】63/202,029
(32)【優先日】2021-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523443180
【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，レイ
(72)【発明者】
【氏名】レイク，アンドレアス
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
(57)【要約】
本明細書では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ、それをコードするポリヌクレオチド、及びジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を調節する方法を開示する。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって改変された細胞、ならびに疾患を治療するためのこれらの細胞の使用も提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＺＦＮは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含み、前記ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間、または配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記ＺＦＮが、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間で前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ＺＦＮが、配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間で前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）及び／またはＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）またはＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する、請求項１または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含む、請求項１、２、４または５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む、請求項１、２、４または６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）、配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及びで配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む、請求項１、２、４～６、１０及び１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む、請求項１、３、７及び８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む、請求項１、３、７及び９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む、請求項１、３、７～９、１３及び１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５４を含む、請求項１、３または７～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５６を含む、請求項１、３または７～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５４を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５６を含む、請求項１、３、７～９、１６または１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３５の位置４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４７９、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２５、５２７、５３７、５３８及び５５９に１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項21】
前記１つ以上の突然変異が、位置４７９、４８６、４９６、４９９及び／または５２５にある、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項22】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３６（ＦｏｋＥＬＤ）を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項23】
前記１つ以上の突然変異が、位置４９０、５３７及び／または５３８にある、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項24】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３７（ＦｏｋＫＫＲ）を含む、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項25】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、ＤＮＡ切断前に二量体を形成する、請求項１９～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項26】
前記ＦｏｋＩ二量体が、ヘテロ二量体を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項27】
前記ＦｏｋＩヘテロ二量体が、ＦｏｋＩＥＬＤ二量体及びＦｏｋＩＫＫＲ二量体を含む、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項28】
前記ＺＦＮが、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項１、２、４、５、１０及び１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項29】
前記ＺＦＮが、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項１、２、４、６、１１及び１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項30】
配列番号３９に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド［ＳＴＶ２２０－ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸ－ＣＩＩＴＡ－Ｂ－７６８６７－２Ａ－８２８６２プラスミドの完全ヌクレオチド配列］
【請求項31】
前記ＺＦＮが、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５４（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＳＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む。請求項１、３、７、８、１３及び１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項32】
前記ＺＦＮが、配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５６（ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＴＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項１、３、７、８、１４または１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項33】
配列番号４０、配列番号５３、配列番号５５、または配列番号５７と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性である配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項34】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含む、請求項１、３、７及び８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含み、前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む、請求項１、３、７及び９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項36】
ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であって、前記ＺＦＮは、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含み、前記ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間、または配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、前記ＺＦＮ。
【請求項37】
前記ＺＦＮが、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間で前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、請求項３６に記載のＺＦＮ。
【請求項38】
前記ＺＦＮが、配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間で前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、請求項３６に記載のＺＦＮ。
【請求項39】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）及び／またはＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する、請求項３６または３７に記載のＺＦＮ。
【請求項40】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合する、請求項３９記載のＺＦＮ。
【請求項41】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する、請求項３９記載のＺＦＮ。
【請求項42】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）またはＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する、請求項３６または３８に記載のＺＦＮ。
【請求項43】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合する、請求項４２記載のＺＦＮ。
【請求項44】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する、請求項４２記載のＺＦＮ。
【請求項45】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含む、請求項３６、３７、３９及び４０のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項46】
前記ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む、請求項３６、３７、３９及び４０のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項47】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ対であって、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）、配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及びで配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む、前記ＺＦＮ対を含む、請求項３６、３７、３９～４１、４５及び４６のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項48】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む、請求項３６、３８、４２及び４３のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項49】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む、請求項３６、３８、４２及び４４のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項50】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ対であって、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む、前記ＺＦＮ対を含む、請求項３６、３８、４２～４４、４８及び４９のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項51】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５４を含む、請求項３６、３８または４２～４４のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項52】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５６を含む、請求項３６、３８または４２～４４のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項53】
前記ＺＦＮ対が、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５４を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５６を含む、請求項３６、３８または４２～４４または５１～５２のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項54】
前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項３６～５３までのいずれか１項記載のＺＦＮ。
【請求項55】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３５の位置４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４７９、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２５、５２７、５３７、５３８及び５５９に１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項５４に記載のＺＦＮ。
【請求項56】
前記１つ以上の突然変異が、位置４７９、４８６、４９６、４９９及び／または５２５にある、請求項５５に記載のＺＦＮ。
【請求項57】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３６（ＦｏｋＥＬＤ）を含む、請求項５６記載のＺＦＮ。
【請求項58】
前記１つ以上の突然変異が、位置４９０、５３７及び／または５３８にある、請求項５５に記載のＺＦＮ。
【請求項59】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、配列番号３７（ＦｏｋＫＫＲ）を含む、請求項５８記載のＺＦＮ。
【請求項60】
前記ＦｏｋＩ切断ドメインが、ＤＮＡ切断前に二量体を形成する、請求項３６～５９のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項61】
前記ＦｏｋＩ二量体が、ヘテロ二量体を含む、請求項６０に記載のＺＦＮ。
【請求項62】
前記ＦｏｋＩヘテロ二量体が、ＦｏｋＥＬＤ二量体及びＦｏｋＫＫＲ二量体を含む、請求項６１に記載のＺＦＮ。
【請求項63】
前記ＺＦＮが、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項３６、３７、３８、４０、４５及び４７のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項64】
前記ＺＦＮが、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項３６、３７、３９、４０、４６及び４７のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項65】
前記ＺＦＮが、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５４（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＳＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項３６、３８、４２、４３、４８及び５３のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項66】
前記ＺＦＮが、配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５６（ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＴＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、請求項３６、３８、４２、４３、４９及び５３のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項67】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含む、請求項３６、３８、４２及び４３のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項68】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含み、前記切断ドメインが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む、請求項３６、３８、４２及び４４のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項69】
第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、第１の切断ドメイン、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び第２の切断ドメインを含むＺＦＮ対を含み、前記第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３，配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、前記第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含み、前記第１及び前記第２の切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含み、前記第１のＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含み、前記第２のＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５位置の４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む、請求項３６、３８、４２～４４、４８及び４９のいずれか１項に記載のＺＦＮ。
【請求項70】
第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含む、ＺＦＮ対であって、前記第１のＺＦＮは、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含み、前記第２のＺＦＮは、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、前記ＺＦＮ対。
【請求項71】
第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含む、ＺＦＮ対であって、前記第１のＺＦＮは、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含み、前記第２のＺＦＮは、配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、前記ＺＦＮ対。
【請求項72】
第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むＺＦＮ対であって、前記第１のＺＦＮは、配列番号５４に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含み、前記第２のＺＦＮは、配列番号５６と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む、前記ＺＦＮ対。
【請求項73】
請求項１～３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ＺＦＮ。
【請求項74】
請求項３６～６０のいずれか１項に記載のＺＦＮまたは請求項７０～７２のいずれか１項に記載のＺＦＮ対をコードするポリヌクレオチド。
【請求項75】
請求項１～３５及び７４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３６～６９及び７３のいずれか１項に記載のＺＦＮまたは請求項７０～７２のいずれか１項に記載のＺＦＮ対を含む、単離された細胞。
【請求項76】
前記単離された細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、線維芽細胞、心筋細胞、膵島細胞、または血球を含む、請求項７５に記載の単離された細胞。
【請求項77】
同種異系である、請求項７５４または７６に記載の単離された細胞。
【請求項78】
自己由来である、請求項７５または７６に記載の単離された細胞。
【請求項79】
Ｔ細胞を調製する方法であって、単離されたＴ細胞を、請求項１～３５及び７４に記載のポリヌクレオチド、請求項３６～６９及び７３記載のＺＦＮ、または請求項７０～７２のいずれか１項に記載のＺＦＮ対と接触させることを含む、前記方法。
【請求項80】
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体細胞、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、請求項７５～７８のいずれか１項に記載の単離された細胞を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項82】
前記単離された細胞が、同種異系または自己由来である、請求項８１記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／２０２，０２９号の出願日の利益を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／２０２，０２９号の出願日の利益を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表への参照電子提出
本願で提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルへの電子的に提出された配列表の内容（名称：４３４１＿０２３ＰＣ０１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：１１６，９１３バイト；作成日：２０２２年５月１８日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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【0003】
本開示は、細胞におけるＣＩＩＴＡ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を調節することができるジンクフィンガーヌクレアーゼ、ならびにジンクフィンガーヌクレアーゼによって調製され、疾患を治療する細胞に関する。
【背景技術】
【0004】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように設計することができ、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼは、複雑なゲノム内の固有の配列を標的とすることができる。内因性のＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを正確に変更することができる。
【0005】
ＺＦＮは、トリヌクレオチドＤＮＡ配列を認識するＤＮＡ結合ドメインとして機能し、より長いＤＮＡ配列を認識できるようにタンパク質を直列に連結して、配列認識特異性を生成する。融合ＦｏｋＩは二量体として機能するので、ＺＦＮは近接するヌクレオチド配列を認識するために対で設計される。これにより、２つのＺＦＮが同時にＤＮＡの反対側の鎖に結合する場合にのみＤＳＢが生成されることが保証され、それにより、配列認識特異性は、とりわけ、整列したＤＮＡ結合ドメインの長さによって決定される。このことは、オフターゲット効果を制限するものの、ジンクフィンガーモチーフの配列が、隣接するジンクフィンガーの特異性に影響を及ぼすという欠点を伴い、その設計及び選択を難しくしている。初期の研究は、ウイルスベクター由来のＤＮＡ断片を介したＺＦＮ発現カセットの細胞への送達に依拠していた。その後、標的細胞への導入を可能にするために、電気穿孔を介したｍＲＮＡ送達を利用する研究が進められた。このアプローチは、一過性であるが高レベルの細胞内の発現カセットを提供し、ＤＮＡと比較してｍＲＮＡの半減期が短かくなるために、オフターゲット部位での挿入／突然変異の発生のリスクが低くなる。
【0006】
ＺＦＮは、細胞での遺伝子の発現を調節するために使用することができる。したがって、細胞療法のために細胞での遺伝子発現を正確に調節することができるＺＦＮが求められている。
【発明の概要】
【0007】
いくつかの態様では、本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとを含み、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間、または配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８及び２９の間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。
【0008】
いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）及び／またはＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧに結合する（配列番号９）。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧに結合する（配列番号１５）。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）またはＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧに結合する（配列番号３８）。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する。
【0009】
いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、第１のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）、配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）であり、第２のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及びで配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６である。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４を含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５６を含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、第１のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５４を含み、第２のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５６を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６であり、第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５である。
【0010】
いくつかの態様では、切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４７９、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２５、５２７、５３７、５３８及び５５９に１つ以上の突然変異をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上の突然変異は、位置４７９、４８６、４９６、４９９及び／または５２５にある。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３６（ＦｏｋＥＬＤ）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の突然変異は、位置４９０、５３７及び／または５３８にある。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３７（ＦｏｋＫＫＲ）を含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、ＤＮＡ切断前に二量体を形成する。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ二量体は、ヘテロ二量体を含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩヘテロ二量体は、ＦｏｋＩＥＬＤ二量体及びＦｏｋＩＫＫＲ二量体を含む。
【0011】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＺＦＮをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号６と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＺＦＮをコードする。
【0012】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号３９と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％配列同一性である配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0013】
いくつかの態様では、本開示は、ＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを提供し、本ＺＦＮは、配列番号７と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、ＺＦＮをコードするポリヌクレオチドを提供し、本ＺＦＮは、配列番号８と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0014】
いくつかの態様では、本開示は、配列番号４０、配列番号５３、配列番号５５、または配列番号５７と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性である配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0015】
いくつかの態様では、本開示は、６個のジンクフィンガーを含むポリヌクレオチドを提供し、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］及びＦｏｋＩ切断ドメインを含むＦ６を含み、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含む。
【0016】
いくつかの態様では、本開示は、５個のジンクフィンガーを含むポリヌクレオチドを提供し、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］及びＦｏｋＩ切断ドメインを含むＦ５を含み、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む。
【0017】
いくつかの態様では、本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を提供し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、切断ドメインとを含み、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８と２９との間、または配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸２８及び２９の間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号１に対応するアミノ酸４６１と４６２との間でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）及び／またはＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合する。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合する。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）またはＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧに結合する（配列番号３８）。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合する。
【0018】
いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）を含む。いくつかの態様では、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６を含む。
【0019】
いくつかの態様では、本開示は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ対を含むＺＦＮを提供し、第１のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー４（Ｆ４）、配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むフィンガー５（Ｆ５）であり、第２のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５及びで配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６である。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮ対は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み、第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６であり、第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５である。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５４を含む。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５６を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮは、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ対を含み、第１のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５４を含み、第２のＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５６を含む。
【0020】
いくつかの態様では、ＺＦＮは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む切断ドメインを含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４１８、４３２、４４１、４４８、４７６、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８及び５５９に１つ以上の突然変異をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上の突然変異は、位置４８６、４９６及び／または４９９にある。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３６（ＦｏｋＥＬＤ）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の突然変異は、位置４９０、５３７及び／または５３８にある。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３７（ＦｏｋＫＫＲ）を含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ切断ドメインは、ＤＮＡ切断前に二量体を形成する。いくつかの態様では、ＦｏｋＩ二量体は、ヘテロ二量体を含む。いくつかの態様では、ＦｏｋＩヘテロ二量体は、ＦｏｋＥＬＤ二量体及びＦｏｋＫＫＲ二量体を含む。
【0021】
いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号７に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮは、配列番号８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの態様では、ＺＦＮは、６個のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］及びＦｏｋＩ切断ドメインを含むＦ６を含み、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含む。
【0023】
いくつかの態様では、ＺＦＮは、５個のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合ドメインを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］及びＦｏｋＩ切断ドメインを含むＦ５を含み、ＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む。
【0024】
いくつかの態様では、本開示は、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むＺＦＮ対を提供し、第１のＺＦＮは、配列番号５に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＮは、配列番号６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0025】
いくつかの態様では、本開示は、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むＺＦＮ対を提供し、第１のＺＦＮは、配列番号７に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＮは、配列番号８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＺＦＮは、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含み、第１のＺＦＮは、配列番号５４４４に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＮは、配列番号５６に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0026】
いくつかの態様では、本開示は、第１のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、第１の切断ドメイン、第２のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び第２の切断ドメインを含むＺＦＮ対を提供し、第１のＤＮＡ結合ドメインは、６個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３，配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、ならびに配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含み、第２のＤＮＡ結合ドメインは、５個のジンクフィンガーを含み、これは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含み、第１及び第２の切断ドメインはＦｏｋＩ切断ドメインを含み、第１のＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５の位置５２５でＫ～Ｓ突然変異をさらに含み、第２のＦｏｋＩ切断ドメインは、配列番号３５位置の４７９でＩ～Ｔ突然変異をさらに含む。
【0027】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによりコードされるＺＦＮを提供する。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるＺＦＮまたは本明細書に開示されるＺＦＮ対をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0028】
いくつかの態様では、本開示は、ポリヌクレオチド、ＺＦＮまたはＺＦＮ対を含む単離された細胞を提供する。
【0029】
いくつかの態様では、単離された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、線維芽細胞、心筋細胞、膵島細胞、または血球を含む。いくつかの態様では、細胞は同種異系である。いくつかの態様では、細胞は自己由来である。
【0030】
いくつかの態様では、本開示は、Ｔ細胞を製造する方法を提供し、本方法は、単離されたＴ細胞を、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ＺＦＮまたはＺＦＮ対と接触させることを含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体細胞、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、本開示は、細胞療法を必要とする対象を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される単離細胞を投与することを含む。いくつかの態様では、投与された単離された細胞は、同種異系または自己由来である。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】ＣＩＩＴＡ遺伝子の位置、転写産物、タンパク質配列、及びＺＦＮ切断部位を示す。
【図2A】９つの種からのＣＩＩＴＡの全長タンパク質配列アラインメントを示す。
【図2B】ＺＦＮ対７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）のＣＩＩＴＡ遺伝子中の切断部位を示す。
【図2C】ＺＦＮ対８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）のＣＩＩＴＡ遺伝子中の切断部位を示す。
【図3】ＺＦＮ対７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）及び８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）の設計情報、アーキテクチャ、及びＤＮＡ結合配列の概略図を示す。それぞれのＤＮＡ結合部位は、太字で示されている。
【図4】ＣＩＩＴＡ ＺＦＮトランスフェクトされたＴ細胞におけるＭＨＣクラスＩＩレベルの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を示す。上パネルにＺＦＮ７６８６７－２Ａ－８２８６２を示す。下パネルにＺＦＮ８７２５４－２Ａ－８４２２１を示す。モック及びＴＲＡＣ ＺＦＮ対照サンプルと比較した、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ処理サンプルにおけるＭＨＣクラスＩＩシグナルの濃度依存的減少が観察された。
【図5A】ＺＦＮ対８７２７８－２Ａ－８７２３２からのｍＲＮＡの生成のためのポリヌクレオチド構築物の概略図を示す。
【図5B】ＺＦＮ対８７２７８－２Ａ－８７２３２についてのヒトＣＩＩＴＡ遺伝子のエクソン１１中のＤＮＡ結合部位（部位Ｇ）を示す。それぞれのＤＮＡ結合部位は、太字で示されている。
【図6】ＣＤ４＋／ＣＤ１２７Ｌｏｗ／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の活性化及び免疫表現型決定についての実験計画を示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
Ｉ．概要
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）に関し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含む。
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）に関し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含む。
【0033】
ＩＩ．定義
本説明が、より容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載されている。
本説明が、より容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して記載されている。
【0034】
「ａ」または「ａｎ」エンティティという用語は、そのエンティティの１つ以上を指しており、例えば「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解されることに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【0035】
さらに、本明細書で使用される場合の「及び／または」は、２つの特定の特徴または成分のそれぞれが、他方のものの有無にかかわらずに特定して開示されているものとして解釈される。したがって、本明細書の「Ａ及び／またはＢ」などの語句において使用する場合の「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」などの語句において使用する場合の「及び／または」という用語は、以下の各態様、すなわち、Ａ、Ｂ及びＣ、Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）及びＣ（単独）を包含することを意図している。
【0036】
本明細書において態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語で記載されている場合にはいずれも、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「実質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」により記載される他の類似の態様も提供されるものと理解される。
【0037】
本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に適用される用語「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、述べられた基準値、及び述べられた基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内の範囲の値を指す。「ほぼ」または「約」という用語が本明細書において特定の値に適用されている場合、「ほぼ」または「約」という用語を含まない値も本明細書に開示されている。
【0038】
本明細書に記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、特に指定のしない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、必要に応じて、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。
【0039】
本明細書で使用される場合、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」及び「μΜ」と同義で使用される。
【0040】
他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的辞書とともにスキルのうちの１つを提供している。
【0041】
単位、接頭辞及び記号は、そのＳｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）の合意形態に示されている。数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものとする。特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で左から右に記述される。アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方位において左から右に記載されている。本明細書中で提供される見出し語は、本開示の様々な態様の限定ではなく、本明細書全体を参照して解釈することができる。したがって、下記で定義される用語は、本明細書の全体を参照することによってより完全に定義される。
【0042】
「約」という用語は、本明細書において、およそ、大まかに、約、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併用して使用されるとき、それは、説明される数値を超える、及びそれ未満の境界を伸展させることによって、その範囲を修飾する。一般的に、「約」という用語は、例えば、１０％、上下（より高いまたはより低い）の変動で、明記される値を超える、及びそれ未満の数値を修飾するために使用することができる。
【0043】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫系の細胞を指す。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）から選択される。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は、交換可能であり、胸腺によって産生または処理されるあらゆるリンパ球を指す。Ｔ細胞の非限定的なクラスには、エフェクターＴ細胞及びＴｈ細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞など）が挙げられる。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔｈ１細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔｈ２細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔｃ１７細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔｈ１７細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）である。いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」とは、多能性細胞、例えば、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または造血性幹細胞）もしくは誘導多能性幹細胞、または免疫細胞への分化が可能な前駆細胞も指す。
【0044】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。本明細書で使用される「メモリー」Ｔ細胞という用語は、その同族抗原（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）に以前に遭遇して応答したＴ細胞、または、例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）で刺激されたＴ細胞を指す。二次暴露時に「メモリー様」表現型を有する免疫細胞は、そのようなメモリーＴ細胞は、一次曝露中よりも速く強い免疫応答を取り込むために再生することができる。いくつかの態様では、メモリーＴ細胞は、中心メモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞）、組織滞留メモリーＴ細胞（ＴＲＭ細胞）、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0045】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「幹細胞様メモリーＴ細胞」、「Ｔメモリー幹細胞」または「ＴＳＣＭ細胞」という用語は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現し、かつ幹細胞様自己複製能力及び多能性を有してメモリー及びエフェクターサブセットの全スペクトルを再構成する能力を備えたメモリーＴ細胞を指す。
【0046】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、中央メモリーＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「中央メモリーＴ細胞」または「ＴＣＭ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを発現するメモリーＴ細胞を指す。中央メモリーＴ細胞は、一般にリンパ節内及び末梢循環内に見られる。
【0047】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「エフェクターメモリーＴ細胞」または「ＴＥＭ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌの発現を欠くメモリーＴ細胞を指す。エフェクターメモリーＴ細胞は、リンパ節ホーミング受容体（例えば、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌ）を欠いているため、これらの細胞は通常、末梢循環及び非リンパ系組織に見られる。
【0048】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、組織常在型メモリーＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「組織常在型メモリーＴ細胞」または「ＴＲＭ細胞」という用語は、循環せず、皮膚、肺、及び胃腸管などの周辺組織に常在したままであるメモリーＴ細胞を指す。特定の態様において、組織常在型メモリーＴ細胞はまた、エフェクターメモリーＴ細胞でもある。
【0049】
いくつかの態様では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「ナイーブＴ細胞」または「ＴＮ細胞」という用語は、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、及びＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＤ９５を発現しないＴ細胞を指す。ＴＮ細胞は、Ｔ細胞系列における最も未分化の細胞を表す。ＴＮ－細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用は、活性化ＴＥＦＦ細胞へのＴＮ細胞の分化と免疫応答を誘導する。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞である。
【0050】
本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、脊椎動物における外来の薬剤に対する生物学的応答を指し、この応答は薬剤及びそれらによって引き起こされる疾患に対して生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）と、これらの細胞または肝臓のいずれかによって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン及び相補体を含む）との作用によって媒介され、脊椎動物の体の病原体、癌細胞もしくは他の異常細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織に感染した侵入病原体、細胞または組織を選択的に標的化する、結合する、ダメージを与える、破壊する及び／または脊椎動物の体から除去させる。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化または阻害、またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は、交換可能であり、胸腺によって産生または処理されるあらゆるリンパ球を指す。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。
【0051】
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同義に使用され得、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはそのリン酸エステル類似体、例えば、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかのホスホロチオエート及びチオエステルを指す。一本鎖核酸配列とは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ及びＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、及び特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、特定の三次形態に限定されない。したがって、この用語には、とりわけ、線状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイル状ＤＮＡ及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従って、配列を本明細書に記載することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ及び半合成ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載の１つ以上の核酸を含む。本明細書に記載される場合、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、単一タンパク質（例えば、ＺＦＮ）をコードする単一ヌクレオチド配列（「モノシストロン性」）を含み得る。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、多シストロン性である（すなわち、２つ以上のシストロンを含む）。特定の態様では、多シストロン性ポリヌクレオチドのシストロンのそれぞれは、本明細書に開示されるタンパク質（例えば、ＺＦＮ）をコードすることができる。いくつかの態様では、各シストロンは、互いに独立して翻訳することができる。
【0052】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、多シストロン性である（すなわち、２つ以上のシストロンを含む）。特定の態様では、多シストロン性ポリヌクレオチドのシストロンのそれぞれは、本明細書に開示されるタンパク質（例えば、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮ）をコードすることができる。いくつかの態様では、シストロンのそれぞれは、互いに独立して翻訳することができる。
【0053】
本明細書で使用される場合、「コード領域」、「コード配列」、または「翻訳可能な配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの部分である。「ストップコドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、通常はアミノ酸に翻訳されないが、コード化領域の一部とみなすことができ、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等は、コード化領域の一部ではない。コード化領域の境界は、典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。
【0054】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、同義に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【0055】
本明細書で使用される「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えばＺＦＮを産生するプロセスを指す。それらは、限定されないが、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。発現は「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、さらに、転写後修飾を有する核酸、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシング、または翻訳後修飾を有するポリペプチド、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断を含む。
【0056】
本明細書で使用される「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間の全体的なモノマー保持を指す。「同一」という用語は、さらなる限定番号を有さず、例えば、ポリヌクレオチドＡがポリヌクレオチドＢと同一であるとは、ポリヌクレオチド配列が１００％同一（１００％配列同一性）であることを示唆している。２つの配列を、例えば、「７０％同一」と記載することは、それらを、例えば、「７０％配列同一性」を有するものとして記載することに等しい。
【0057】
２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一性パーセントを計算するために、例えば、２つの配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のためにギャップを第１及び第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の一方または両方に導入し得、比較目的で非同一性配列を無視し得る）ことにより実施することができる。特定の態様では、比較の目的で整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。次に、対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸、またはポリヌクレオチドの場合は、塩基が比較される。
【0058】
第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチドによって占有される場合には、分子は、その位置にて同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【0059】
異なる配列（例えば、ポリヌクレオチド配列）を整列するために使用され得る適切なソフトウェアプログラムは、様々なソースから利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの適切なプログラムはｂｌ２ｓｅｑであり、これは米国国立生物工学情報センターＢＬＡＳＴのウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の適切なプログラムは、例えば、生物情報学プログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａの欧州生物情報学研究所（ＥＢＩ）から入手可能である。
【0060】
配列アラインメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ ＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥなどの、当技術分野で知られている方法を使用して実施することができる。
【0061】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの標的配列内の異なる領域は、それぞれ独自の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は最も近い１０分の１に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３及び８０．１４は８０．１に四捨五入されており、一方で８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８及び８０．１９は８０．２に四捨五入されている。また、長さの値は常に整数であることに留意されたい。
【0062】
特定の態様では、同一性パーセント（ＩＤ％）または第２のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する第１のアミノ酸配列（または核酸配列）の同一性パーセント（ＩＤ％）は、ＩＤ％＝１００ｘ（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによって整列された）第１及び第２の配列のアラインメントにおいて同一のマッチとして数えられたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは第２の配列中の総残基数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高い。
【0063】
当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成が、排他的に一次配列データによって駆動される二進配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アライメントは、配列データを、構造的データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異の位置）または系統発生学的データなどの異種ソースからのデータと統合することによって生成することができることも理解されるであろう。異種データを統合して多重配列アライメントを生成する適切なプログラムは、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代替的には、例えば、ＥＢＩから入手可能であるＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。また、配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントが、自動的または手動で作成できることも理解されるであろう。
【0064】
本明細書で使用される「連結された」という用語は、第２のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のそれぞれに共有結合または非共有結合された第１のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列と直接結合または併設してもよく、あるいは代替的に介在配列が、第１の配列を第２の配列に共有結合してもよい。「連結された」の用語は、第１のポリヌクレオチド配列の、５’末端または３’末端の第２のポリヌクレオチド配列への融合を意味するだけでなく、第２のポリヌクレオチド配列（または第１のポリヌクレオチド配列のそれぞれ）中の任意の２つのヌクレオチドに全ての第１のポリヌクレオチド配列（または第２のポリヌクレオチド配列）を挿入することも含む。第１のポリヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって第２のポリヌクレオチド配列に連結され得る。リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドであり得る。
【0065】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、概して、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、Ｋｄの低下と相関性がある。「非特異的結合」とは、目的の任意の分子（例えば、操作されたヌクレアーゼ）と非依存性オンターゲット配列である高分子（例えば、ＤＮＡ）との間に生じる共有結合を指す。
【0066】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、かつ／またはそれは、異なるタンパク質またはタンパク質の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、及びタンパク質結合活性を有する。
【0067】
「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。そのようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質内のドメインまたはポリヌクレオチドであり得る。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、他の態様において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）である。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合分子は、所与の配列のすべてのヌクレオチドに結合する。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合分子は、所与の配列の１つ以外のすべてのヌクレオチドに結合する。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合分子は、所与の配列の２つ以外のすべてのヌクレオチドに結合する。
【0068】
「ＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）とは、それぞれ、例えば、１つ以上のジンクフィンガーを介して、またはジンクフィンガータンパク質における１つ以上のＲＶＤとの相互作用によってＤＮＡを配列特異的に結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」と略記される。
【0069】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」または「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」とは、１つ以上のジンクフィンガーによって配列特異的様式でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインであり、これは、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、この構造は、亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしば「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」と略記される。「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」という用語には、１つのＺＦＮならびに標的遺伝子の切断のために二量体化する１組のＺＦＮ（当該組の構成要素は「左及び右」または「第１及び第２の」もしくは「対」と称される）が含まれる。いくつかの態様では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、所与の配列のすべてのヌクレオチドに結合する。いくつかの態様では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、所与の配列の１つ以外のすべてのヌクレオチドに結合する。いくつかの態様では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、所与の配列の２つ以外のすべてのヌクレオチドに結合する。
【0070】
ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を変更する）ことによって、または、ＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「反復可変二残基」または「ＲＶＤ」領域）を操作することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたジンクフィンガータンパク質は、非天然タンパク質である。ジンクフィンガータンパク質を操作する方法の非限定的な例は、設計及び選択である。設計されたタンパク質は、本質的に合理的な基準から設計／組成が生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計についての合理的基準には、置換規則、ならびに既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、及び同第６，５３４，２６１号を参照されたく、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９号、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、及びＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【0071】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は天然には見られず、その産生は主に、経験的なプロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的な設計、またはハイブリッド選択から生じる。例えば、ＵＳ５，７８９，５３８、ＵＳ５，９２５，５２３、ＵＳ６，００７，９８８、ＵＳ６，０１３，４５３、ＵＳ６，２００，７５９、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７及びＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【0072】
「組み換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組み換えによる捕捉を含むがこれらに限定されない２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的において、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、相同指向の修復機構による細胞の二本鎖切断の修復中に起こるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を用いて「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た分子）を鋳型修復し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすため「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。任意の特定の理論によって束縛されることを望むことなく、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に生じるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、及び／または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」、及び／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、多くの場合、標的分子の配列の変化をもたらす。
【0073】
本開示の特定の態様において、本明細書に記載の１つ以上の標的ヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）中の二本鎖切断（ＤＳＢ）を所定の部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）に生じさせる。ＤＳＢは、本明細書に記載される構築物（例えば、ドナー）の組み込み、または機能的遺伝子発現のノックダウンを媒介する。任意に、構築物は切断領域のヌクレオチド配列に相同性を有する。発現構築物を物理的に組み込み得るか、または別法として、発現カセットを相同組換えによる破断の修復のためのテンプレートとして使用し、その結果、発現カセット中にあるようなヌクレオチド配列の全部または一部が細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチンにおける第１の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、発現カセットに存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用が、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味において、配列の置換）を表し、かつあるポリヌクレオチドの別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的置換は必ずしも必要としないことが理解され得る。
【0074】
本明細書に記載の方法及び組成物（例えば、ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼを使用して作成した細胞等）のうちのいずれかにおいて、さらなる操作されたヌクレアーゼを、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用することができる。
【0075】
細胞クロマチンにおける目的とする領域内の配列の標的組換え及び／または置換及び／または改変のための方法のいくつかの態様では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって変更される。切断領域に対する配列相同性が存在する場合、そのような相同組換えは、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって促進される。
【0076】
本明細書に記載の方法及び組成物（例えば、ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼを使用して作成した細胞等）のいずれかにおいて、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的とする領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それによって相同組換えを促進して目的とする領域内の非同一配列を挿入する。したがって、ある特定の実施形態では、目的の領域の配列と相同であるドナー配列の部分は、置換されたゲノム配列に対して約８０～９９％の配列同一性（またはその間の任意の整数）を示す。他の実施形態では、ドナーとゲノム配列との間の相同性は９９％より高く、例えば１つのヌクレオチドのみが、連続する１００塩基対を超えるドナーとゲノム配列の間で異なる場合である。ある場合において、新しい配列が目的とする領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的とする領域に存在しない配列を含み得る。これらの事例において、非相同配列は、概して、５０～１，０００個の塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または目的とする領域内の配列と相同もしくは同一である１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列と非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【0077】
本明細書に記載の方法のいずれかは、目的とする遺伝子（複数可）の発現を妨害するドナー配列の標的組み込みによる、または標的配列（複数可）の切断、続いて、目的の遺伝子（複数可）の発現を妨げるエラーが生じやすいＮＨＥＪ媒介性修復を介する、細胞における１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【0078】
さらに、本明細書に記載の標的組み込みの方法を用いて、１つ以上の外因性配列を組み込むこともできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。
【0079】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【0080】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。「導入遺伝子」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２～１００，０００，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値）、好ましくは約１００～１００，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２０００～２０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の値）、さらにより好ましくは、５～１５ｋｂ（またはそれらの間の任意の値）であり得る。
【0081】
「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、その核型を特徴とし、これは、この細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合である。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【0082】
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミド、ミニサーク及び特定のウイルスゲノムが挙げられる。本明細書に記載の肝特異的構築物は、エピソーム的に維持されていても、あるいは安定して細胞内に組み込まれていてもよい。
【0083】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在する」かは、細胞の特定の発達段階及び環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能バージョンまたは正常に機能する内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。
【0084】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される分子等の小分子であり得るか、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上述の分子の任意の修飾された誘導体、もしくは上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等の巨大分子であり得る。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【0085】
外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質及び陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、及びウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。外因性分子を植物細胞に導入するための方法には、当業者に既知であり、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介形質転換、脂質媒介導入（すなわち、中性脂質及び陽イオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子衝突（例えば、「遺伝子銃」を使用）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、及びウイルスベクター媒介導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を含み得る。
【0087】
本明細書で使用される場合、「外因性核酸の産物」という用語は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）及び翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【0088】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に結合した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）、切断ドメインに作動可能に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）間の融合、及び融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0089】
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達に起因し得、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、及びポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドを送達するための方法が本開示の他の箇所に提示されている。
【0090】
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような調節配列がコード配列及び／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず）を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【0091】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集等のプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。
【0092】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム突然変異）を使用して発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載されるＺＦＰ系を含まない細胞と比較した、遺伝子の発現の何らかの低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【0093】
「目的とする領域」は、例えば、遺伝子、または遺伝子内の非コード配列もしくは遺伝子に隣接した非コード配列等の細胞クロマチンの任意の領域であり、その中で外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的ＤＮＡ切断及び／または標的組換えの目的のためであり得る。目的とする領域は、例えば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的とする領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的とする領域は、単一のヌクレオチド対と同程度に小さいか、または最大２，０００ヌクレオチド対長であり得るか、または任意の整数値のヌクレオチド対長であり得る。
【0094】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、日常的なアッセイにおいて必ずしも測定されないが、好ましくは容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、及び強化された細胞増殖及び／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープ標識は、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーを含む。「発現標識」は、目的とする遺伝子の発現を監視するために所望の遺伝子配列に作動的に連結され得るレポーターをコードする配列を含む。
【0095】
「真核」細胞には、幹細胞（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）及び多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ））を含む（真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0096】
「作動可能な連結」及び「作動可能に連結した」（または「作動的に連結した」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並列に関して同義に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、これらの構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置される。一例として、プロモーター等の転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写制御因子の存在または不在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合にコード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、概して、シスでコード配列と動作可能に結合されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していない場合でも、コード配列に動作可能に結合される転写調節配列である。
【0097】
タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸と同一の機能を保持する強化された機能を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多い残基、少ない残基、もしくは対応する天然分子と同一の数の残基を有し得、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸またはタンパク質の機能を決定するための方法（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力、酵素活性アッセイ）は、当該技術分野でよく知られている。
【0098】
ポリブクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」「発現カセット」及び「遺伝子導入ベクター」は、目的とする遺伝子の発現を指向することができ、かつ遺伝子配列を標的細胞に導入し得る任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニング、及び発現ベヒクル、ならびに組み込みベクターを包含する。
【0099】
「対象」及び「患者」という用語は、同義に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス及び他の動物などの実験動物を指す。したがって、本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳類の患者または対象を意味する。本発明の対象には、障害を有するものが含まれる。
【0100】
本明細書で使用される「治療する」及び「治療」という用語は、症状の重症度及び／または頻度の低下、症状及び／または基礎的原因の排除、症状及び／またはその基礎的原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または改善を指す。がん、単原性疾患及び移植片対宿主病は、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して処置され得る条件の非限定的な例である。
【0101】
「標的部位」または「標的配列」は、結合するのに十分な条件が存在する場合、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。「意図された」または「オンターゲット」配列は、結合分子が結合されることを意図する配列であり、「意図されない」または「オフターゲット」配列は、意図された標的ではない結合分子によって結合された任意の配列を含む。
【0102】
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有する酵素を指す。所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示する方法及び組成物において使用することができる。天然またはネイティブのヌクレアーゼ剤を、そのヌクレアーゼ剤が所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、使用することができる。あるいは、改変された、または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位においてニックまたは二本鎖の切断を特異的に認識及び誘導するように、その天然形態から操作（改変または誘導）されたヌクレアーゼを含む。したがって、改変されたヌクレアーゼ剤は、ネイティブの天然ヌクレアーゼ剤であるか、または人工的に作成もしくは合成することができる。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤中のわずか１個のアミノ酸または核酸切断剤中のわずか１個のヌクレオチドとすることができる。いくつかの態様では、操作されたヌクレアーゼは、認識部位にニックまたは二本鎖の切断を引き起こし、認識部位は、ネイティブの（操作されていない、または改変されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。認識部位または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖の切断を生じさせることは、本明細書では、認識部位または他のＤＮＡを「切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」することを指し得る。
【0103】
本明細書に使用される「相補体」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間の、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対を指す。「相補的な」とは、２つの核酸配列の間で共有される特性を指し、それらが互いに逆平行に整列した場合、各位置のヌクレオチド塩基は相補的となる。
【0104】
ＩＩＩ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含む。ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、ＣＩＩＴＡ遺伝子を発現しないか、または発現が低下した細胞を生成することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは他のＺＦＮと対を形成して、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の部位を切断することができる。
本開示は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）に関し、ＺＦＮは、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、及び切断ドメインを含む。ＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、ＣＩＩＴＡ遺伝子を発現しないか、または発現が低下した細胞を生成することができる。いくつかの態様では、ＺＦＮは他のＺＦＮと対を形成して、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の部位を切断することができる。
【0105】
非ＤＮＡ結合性タンパク質であるＣＩＩＴＡ（ＩＩ型トランス活性化因子）として知られるタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ発現のマスター制御因子の働きをする。他のエンハンセオソームメンバーとは対照的に、ＣＩＩＴＡは、組織特異的発現を示し、ＩＦＮ－γによってアップレギュレーションされ、ＭＨＣクラスＩＩ発現のダウンレギュレーションを引き起こし得るいくつかの細菌及びウイルスによって阻害されることが示されている（これは、細菌の免疫監視を回避するための試みの一部であると考えられる（ＬｅｉｂｕｎｄＧｕｔ－Ｌａｎｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（２００４））Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ３４：１５１３－１５２５を参照））。ＣＩＩＴＡタンパク質は、核内に位置し、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現に対するマスターレギュレーターとして作用する。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、いくつかの種類の免疫細胞の表面に見られ、外来侵入物に対する体の免疫応答に重要な役割を果たす。したがって、理論に縛られることを望むものではないが、ＣＩＩＴＡ遺伝子機能のノックダウンまたはノックアウトは、宿主による拒絶を最小限に抑えることによって、同種異系細胞療法の有効性を向上させることができる。
【0106】
ヒトでは、ＣＩＩＴＡタンパク質は、染色体１６上に位置するＣＩＩＴＡ遺伝子（ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００００１６．１０のヌクレオチド１０，８６６，２０８～１０，９４１，５６２）によりコードされる。ＣＩＩＴＡ遺伝子は、１６番染色体の短腕上の５９１９１ｂｐに及び、２０個のエクソンを包含する（図１）。ＣＩＩＴＡ遺伝子の同義語及びそのコードされたタンパク質は公知であり、「Ｃ２ＴＡ」、「ＮＬＲＡ」、「ＭＨＣ２ＴＡ」、「ＣＩＩＴＡＩＶ」、「ＭＨＣＩＩ型トランス活性化因子」、「ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチリピート及び酸ドメイン含有」、「ＮＬＲファミリー、酸ドメイン含有」、「クラスＩＩ、主要適合組織複合体、トランス活性化因子」、「ＭＨＣＩＩ型トランス活性化因子タイプＩＩＩ」、「ＭＨＣＩＩ型トランス活性化因子タイプＩ」、「ＥＣ２．７．１１．１」及び「ＥＣ２．３．１」が挙げられる。ＣＩＩＴＡ遺伝子は、選択的スプライシング由来の４つのアイソフォームを有し得る。アイソフォーム１は、第１表に示される、正準配列と見なされる１１３０アミノ酸タンパク質をコードする。
【表1】
【0107】
いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の１つ以上の部位を標的とすることができる。いくつかの態様では、ＣＩＩＴＡ遺伝子においてＤＮＡ配列を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼは、アミノ酸２６とアミノ酸３２との間であり、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸２８及び２９である。いくつかの態様では、ＣＩＩＴＡ遺伝子においてＤＮＡ配列を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼは、アミノ酸４５７とアミノ酸４６５との間であり、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸４６１及び４６２である。
【0108】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮは、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0109】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮは、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0110】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮ対は、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のＺＦＮ、及び、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＺＦＮを含む。
【0111】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮは、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５４（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＳＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0112】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮは、配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）、または、配列番号５６（ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＴＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0113】
いくつかの態様では、本開示のＺＦＮ対は、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のＺＦＮ、及び、
【0114】
配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＺＦＮを含む。いくつかの態様では、本開示のＺＦＮ対は、配列番号５４（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＳＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のＺＦＮ、及び、配列番号５６（ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＴＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のＺＦＮを含む。いくつかの態様では、第１のＺＦＮ及び前記第２のＺＦＮは連結している。いくつかの態様では、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとの間の結合はペプチドリンカーである。いくつかの態様では、第１のＺＦＮと第２のＺＦＮとの間の結合は切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0115】
ＩＩＩＡ．ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン
ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン、及びそれをコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載される。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、５個以上のジンクフィンガーを含む。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。
ＣＩＩＴＡ遺伝子中のＤＮＡ配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメイン、及びそれをコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載される。いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、５個以上のジンクフィンガーを含む。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。
【0116】
いくつかの態様では、ジンクフィンガーは、アミノ酸２６とアミノ酸３０との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸２８及びアミノ酸２９のＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、アミノ酸４５７とアミノ酸４６５との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸４６１及びアミノ酸４６２のＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。
【0117】
いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合することができる。いくつかの態様では、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合するＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むか、またはこれからなるジンクフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるジンクフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むか、またはこれからなるジンクフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるジンクフィンガー４（Ｆ４）、及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるジンクフィンガー５（Ｆ５）の５個のジンクフィンガーを有する。
【0118】
いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合することができる。いくつかの態様では、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合するＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むか、またはこれからなるＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むか、またはこれからなるＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むか、またはこれからなるＦ５、及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むか、またはこれからなるＦ６の６個のジンクフィンガーを含む。
【0119】
いくつかの態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＡＴＴＧＣＴ及び／またはＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合することができる。いくつかの態様では、ＡＴＴＧＣＴ及び／またはＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合するＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６の６個のジンクフィンガーを有する。
【0120】
いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合し得る。いくつかの態様では、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合するＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５の５個のジンクフィンガーを有する。
【0121】
いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、ＣＩＩＴＡ遺伝子内のＤＮＡ配列を切断する。いくつかの態様では、ジンクフィンガー対は、アミノ酸２６とアミノ酸３０との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸２８とアミノ酸２９でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むか、またはこれからなるフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むか、またはこれからなるフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー４（Ｆ４）、及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー５（Ｆ５）を含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むか、またはこれからなるＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むか、またはこれからなるＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むか、またはこれからなるＦ５、及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むか、またはこれからなるＦ６を含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【0122】
いくつかの態様では、ジンクフィンガー対は、アミノ酸４５７とアミノ酸４６５との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸４６１とアミノ酸４６２でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断する。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【0123】
ＺＦＮの非限定的な例を表２に示す。
【表2】
【0124】
操作方法には、合理的設計及び様々な種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計には、例えば、三重項（または四重項）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、各三重項または四重項ヌクレオチド配列は、特定の三重項または四重項配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【0125】
ファージディスプレイ及び２ハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、及び同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【0126】
いくつかの態様では、ジンクフィンガードメイン及び／またはマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結することができる。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含むことができる。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【0127】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であり得る。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列として、Ｉ－ＳｃｅＩ，Ｉ－ＣｅｕＩ，ＰＩ－ＰｓｐＩ，ＰＩ－Ｓｃｅ，Ｉ－ＳｃｅＩＶ，Ｉ－ＣｓｍＩ，Ｉ－ＰａｎＩ，Ｉ－ＳｃｅＩＩ，Ｉ－ＰｐｏＩ，Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ，Ｉ－ＣｒｅＩ，Ｉ－ＴｅｖＩ，Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどが知られている。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ１０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許公開第２００７０１１７１２８号を参照されたい。
【0128】
ＩＩＩＢ．切断ドメイン
さらに、ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼ切断ドメインに融合させてＺＦＮを作成しており、これは、その操作されたＺＦＰＤＮＡ結合ドメインを介してその目的とする核酸標的を認識し、かつヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３（３）：１１５６－１１６０を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断（ヌクレアーゼ）ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）をさらに含む。近年では、そのようなヌクレアーゼは、様々な生物におけるゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、及び国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
さらに、ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼ切断ドメインに融合させてＺＦＮを作成しており、これは、その操作されたＺＦＰＤＮＡ結合ドメインを介してその目的とする核酸標的を認識し、かつヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位付近でのＤＮＡの切断を引き起こすことができる機能的実体である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９３（３）：１１５６－１１６０を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断（ヌクレアーゼ）ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメイン）をさらに含む。近年では、そのようなヌクレアーゼは、様々な生物におけるゲノム改変に使用されている。例えば、米国特許公開第２００３０２３２４１０号、同第２００５０２０８４８９号、同第２００５００２６１５７号、同第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号、同第２００６００６３２３１号、及び国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号を参照されたい。
【0129】
いくつかの態様において、遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば、操作されたヌクレアーゼを用いて達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の操作に基づいている。例えば、適合されたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３３（２０）：ｅ１７８；Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－４５８。さらに、ＺＦＰの操作も記載されている。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９７９，５３９号、同第６，９３３，１１３号、同第７，１６３，８２４号、及び同第７，０１３，２１９号を参照されたい。
【0130】
加えて、これら及び他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン、及びジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を用いてともに連結され得る。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。米国特許８，７７２，４５３号も参照されたい。
【0131】
いくつかの態様では、切断ドメインは、切断活性についての二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその機能的断片に由来し得る。いくつかの態様では、切断ドメイン二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体（例えば、同じまたは異なるエンドヌクレアーゼに由来するもの、または差次的に改変されたエンドヌクレアーゼ）であり得る。
【0132】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（例えば、認識部位で）、かつ結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９個目のヌクレオチド及び他方の鎖上のその認識部位から１３個目のヌクレオチドでＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。いくつかの態様では、融合タンパク質（例えば、本明細書に開示のＺＦＮ）は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン（操作され得るか否かに関わらず）を含む。
【0133】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合を使用した細胞配列の標的化された二本鎖切断及び／または標的化された置換のために、それぞれＦｏｋＩ切断ドメイン（例えば、モノマー）を含む２つの融合タンパク質を使用して、（例えば、ホモまたはヘテロ二量体の形成によって）触媒活性の切断ドメインを再構成することができる。いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋＩ切断ダイマーとを含む単一のポリペプチド分子を使用することもできる。本明細書では、ジンクフィンガーＦｏｋＩ融合を使用した、標的化された切断及び標的化された配列変更のためのパラメータが提供される。
【0134】
いくつかの態様では、切断ドメインは、切断活性を保持するか、または機能切断ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【0135】
例示のＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０を参照されたい。
【0136】
いくつかの態様では、切断ドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ由来の切断ドメインを含む。全長ＦｏｋＩタンパク質配列を表３に示す。
【表3】
【0137】
いくつかの態様では、ＦｏｋＩに由来する切断ドメインは、野生型ＦｏｋＩタンパク質とは異なる１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、切断ドメインは、表４中の配列を含む。
【表4】
【0138】
いくつかの態様にでは、本開示に有用なＦｏｋＩタンパク質は、野生型とは異なるアミノ酸、（１つ以上のアミノ酸残基の）挿入及び／または（１つ以上のアミノ酸残基の）欠失を含む。いくつかの態様では、残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２及び／または５２１～５３１（上記の全長の配列に対して番号付けされている）の１つ以上は、これらの残基は、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（（２００７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２５：７７８－７８４）に記載されたその標的部位に結合されたＺＦＮの分子モデルのＤＮＡ骨格に位置しているため、野生型配列とは異なる。いくつかの態様では、位置４１６、４２２、４４７、４４８及び／または５２５の１つ以上の残基は、対応する野生型配列とは異なる。いくつかの態様では、本開示に有用なＦｏｋＩタンパク質は、対応する野生型残基とは異なる１つ以上のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）残基、システイン（Ｃ）残基、アスパラギン酸（Ｄ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、グリシン（Ｇ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、またはトレオニン（Ｔ）残基を含む。いくつかの態様では、位置４１６、４１８、４２２、４４６、４４８、４７６、４７９、４８０、４８１、５２５、５２７及び／または５３１の１つ以上にある野生型残基は、Ｒ４１６Ｅ、Ｒ４１６Ｆ、Ｒ４１６Ｎ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４１８Ｅ、Ｒ４２２Ｈ、Ｎ４７６Ｄ、Ｎ４７６Ｅ、Ｎ４７６Ｇ、Ｎ４７６Ｔ、Ｉ４７９Ｔ、Ｉ４７９Ｑ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｄ、Ｑ４８１Ｅ、Ｑ４８１Ｈ、Ｋ５２５Ａ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ｔ、Ｋ５２５Ｖ、Ｎ５２７Ｄ及び／またはＱ５３１Ｒを含むが、これらに限定されない他の残基のいずれかで置換される。いくつかの態様では、配列番号３５の位置５２５での野生型残基リジン（Ｋ）は、セリン（Ｓ）残基で置き換えられる。いくつかの態様では、配列番号３５の位置４７９での野生型残基イソロイシン（Ｉ）は、トレオニン（Ｔ）残基で置き換えられる。
【0139】
いくつかの態様では、切断ドメインは、例えば、米国特許第７，９１４，７９６、同第８，０３４，５９８号及び同第８，６２３，６１８号、ならびに米国特許出願２０１１０２０１０５５号（これらの開示はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ホモ二量体化を最小限に抑えるかまたは防止する１つ以上の操作された二量体（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩ（全長のＦｏｋＩ配列に対して番号付けされる）の位置４４６，４４７，４７９，４８３，４８４，４８６，４８７，４９０，４９１，４９６，４９８，４９９，５００，５３１，５３４，５３７，及び５３８のアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ドメインの二量体化に影響する標的である。突然変異は、ＦｏｋＩと相同な天然の制限酵素で見られる残基への突然変異を含んでよい。いくつかの態様では、位置４１６、４２２、４４７、４４８及び／または５２５における突然変異は、正に荷電されたアミノ酸を非荷電または負に荷電されたアミノ酸と交換することを含む。いくつかの態様では、操作された切断ドメインは、１つ以上のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８または５２５の突然変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６及び４８６の突然変異を含む。
【0140】
いくつかの態様では、本明細書に記載される組成物は、例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、同第８，０３４，５９８号、同第８，９６１，２８１及び同第８，６２３，６１８号、米国特許公開第２００８０１３１９６２号及び同第２０１２００４０３９８号に記載されるように偏性ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された切断ドメインを含む。したがって、いくつかの態様では、本開示は融合タンパクを提供し、操作された切断ドメインは、位置４１６、４２２、４４７、４４８または５２５（本明細書に示されている野生型ＦｏｋＩに対して相対的に番号付けされている）での１つ以上の突然変異に加えて、位置４８６の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置換され、位置４９９の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置換され、位置４９６の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）残基またはＧｌｕ（Ｅ）残基（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）で置換されるポリペプチドを含む。
【0141】
いくつかの態様では、操作された切断ドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインに由来し、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８または５２５での１つ以上の突然変異に加えて、野生型ＦｏｋＩに対して番号が付されているアミノ酸残基４９０、５３８及び５３７での突然変異を含む。いくつかの態様では、本開示は、融合タンパク質を提供し、操作された切断ドメインは、４１６、４２２、４４７、４４８または５２５での１つ以上の突然変異に加えて、位置４９０の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置換され、位置５３８の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置換され、位置５３７の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基（「ＫＫＫ」または「ＫＫＲ」）（米国特許第８，９６２，２８１号、参照により本明細書に組み込まれる）で置換されるポリペプチドを含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６、同第８，０３４，５９８号、及び同第８，６２３，６１８号を参照されたく、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。いくつかの態様では、操作された切断ドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」及び／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」突然変異を含む（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６－１０７を参照されたい）。
【0142】
いくつかの態様では、操作された切断ドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインに由来し、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８または５２５での１つ以上の突然変異に加えて、野生型ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩ相同体に対して番号が付されているアミノ酸残基４９０及び５３８での突然変異を含む。いくつかの態様では、本開示は、融合タンパク質を提供し、操作された切断ドメインは、位置４１６、４２２、４４７、４４８または５２５での１つ以上の突然変異に加えて、位置４９０の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置換され、位置５３８の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基（「ＫＫ」）で置換されるポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本開示は、融合タンパク質を提供し、操作された切断ドメインは、位置４１６、４２２、４４７、４４８または５２５での１つ以上の突然変異に加えて、位置４８６の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置換され、位置４９９の野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基（米国特許第８，０３４，５９８号、参照により本明細書に組み込まれる）で置換されるポリペプチドを含む。
【0143】
いくつかの態様では、本開示は、融合タンパク質を提供し、操作された切断ドメインは、ＦｏｋＩ触媒ドメイン中の位置３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４０２、４１６、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４７、４４８、４６９、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２５、５２９、５３４、５５９、５６９、５７０、５７１の１つ以上で野生型アミノ酸残基が変異しているポリペプチドを含む。
【0144】
いくつかの態様では、１つ以上の突然変異は、野生型アミノ酸を正に帯電した残基から中性残基または負に帯電した残基に変化させる。いくつかの態様において、記載された変異体を、１つ以上のさらなる突然変異を含むＦｏｋＩドメインで作製することもできる。いくつかの態様では、これらの追加の突然変異は、二量体化ドメイン、例えば、位置４１８、４３２、４４１、４８１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２３、５２７、５３７、５３８及び／または５５９にある。突然変異の非限定的な例には、任意のアミノ酸残基（例えば、Ｋ３９３Ｘ、Ｋ３９４Ｘ、Ｒ３９８Ｘ、Ｒ４１６Ｓ、Ｄ４２１Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｋ４４４Ｘ、Ｓ４７２Ｘ、Ｇ４７３Ｘ、Ｓ４７２、Ｐ４７８Ｘ、Ｇ４８０Ｘ、Ｋ５２５Ｘ及びＡ５３０Ｘ、第１の残基は、野生型を示し、Ｘは、野生型残基の代わりに置換される任意のアミノ酸を指す）との位置３９３、３９４、３９８、４１６、４２１、４２２、４４２、４４４、４７２、４７３、４７８、４８０、５２５または５３０での任意の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩの相同）の野生型残基の突然変異（例えば、置換）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｘは、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＤまたはＮである。他の例示的な突然変異としては、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４４６Ｄ、Ｓ４４６Ｒ、Ｋ４４８Ａ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｎ、Ｑ４８１Ｅ、Ａ５３０Ｅ及び／またはＡ５３０Ｋが挙げられ、アミノ酸残基は、全長のＦｏｋＩ野生型切断ドメイン及びその相同体に対して番号付けされる。いくつかの態様では、組み合わせは、４１６と４２２、位置４１６とＫ４４８Ａでの突然変異、Ｋ４４８ＡとＩ４７９Ｑ、Ｋ４４８ＡとＱ４８１Ａ、及び／またはＫ４４８Ａならびに位置５２５における突然変異を含むことができる。いくつかの態様では、４１６位の野生型残基は、Ｇｌｕ（Ｅ）残基（Ｒ４１６Ｅ）で置き換えられていてもよく、４２２位の野生型残基は、Ｈｉｓ（Ｈ）残基（Ｒ４２２Ｈ）で置き換えられており、５２５位の野生型残基は、Ａｌａ（Ａ）残基で置き換えられている。本明細書に記載される切断ドメインはさらに、４３２、４４１、４８３、４８６、４８７、４９０、４９６、４９９、５２７、５３７、５３８及び／または５５９を含むが、これに限定されない位置において、さらなる突然変異を含むことができる、例えば、二量体化ドメイン変異体（例えば、ＥＬＤ、ＫＫＲ）及び／またはニッカーゼ変異体（触媒ドメインへの突然変異）。
【0145】
いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤタンパク質は、配列番号９［［ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ］］に記載の核酸配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤタンパク質は、配列番号１０［［ＲＰＹＴＬＲＬ］］を含むＦ１、配列番号１１［［ＲＳＡＮＬＴＲ］］を含むＦ２、配列番号１２［［ＲＳＤＡＬＳＴ］］を含むＦ３、配列番号１３［［ＤＲＳＴＲＴＫ］］を含むＦ４、及び配列番号１４［［ＤＲＳＴＲＴＫ］］を含むＦ５の５個のフィンガーを含む。いくつかの態様では、ｃＦｏｋＫＫＲタンパク質は、配列番号１５［［ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ］］に記載の核酸配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｃＦｏｋＫＫＲタンパク質は、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むＦ５、及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むＦ６の６個のフィンガーを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。
【0146】
いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、（１）（ａ）配列番号１０［［ＲＰＹＴＬＲＬ］］を含むＦ１、配列番号１１［［ＲＳＡＮＬＴＲ］］を含むＦ２、配列番号１２［［ＲＳＤＡＬＳＴ］］を含むＦ３、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むＦ４、及び配列番号１４［［ＤＲＳＴＲＴＫ］］を含むＦ５の５個のフィンガーを含む、第１のＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）ｎＦｏｋＥＬＤタンパク質を含む第１の切断ドメインと、を含む第１のＺＦＮ、ならびに（２）（ａ）配列番号１６［［ＲＳＤＶＬＳＡ］］を含むＦ１、配列番号１７［［ＤＲＳＮＲＩＫ］］を含むＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号１９［［ＬＫＱＨＬＴＲ］］を含むＦ４、配列番号２０［［ＱＳＧＮＬＡＲ］］を含むＦ５、及び配列番号２１［［ＱＳＴＰＲＴＴ］］を含むＦ６の６個のフィンガーを含む、第２のＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）ｃＦｏｋＫＫＲタンパク質を含む第２の切断ドメインと、を含む第２のＺＦＮを含む。
【0147】
いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤ（Ｑ４８１Ｅ）タンパク質は、配列番号３８［［ＡＴＴＧＣＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ］］に記載の核酸配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤ（Ｑ４８１）タンパク質は、配列番号２３［［ＲＳＤＨＬＳＲ］］を含むＦ１、配列番号２４［［ＤＳＳＤＲＫＫ］］を含むＦ２、配列番号２５［［ＲＳＤＴＬＳＥ］］を含むＦ３、配列番号２６［［ＱＳＧＤＬＴＲ］］を含むＦ４、及び配列番号２７［［ＱＳＳＤＬＳＲ］］を含むＦ５及び配列番号２８［［ＹＫＷＴＬＲＮ］］を含むＦ６の６個のフィンガーを含む。いくつかの態様では、ｃＦｏｋＫＫＲタンパク質は、配列番号３９［［ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ］］に記載の核酸配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｃＦｏｋＫＫＲタンパク質は、配列番号３０［［ＳＮＱＮＬＴＴ］］を含むＦ１、配列番号３１［［ＤＲＳＨＬＡＲ］］を含むＦ２、配列番号３２［［ＱＳＧＤＬＴＲ］］を含むＦ３、配列番号３３［［ＷＫＨＤＬＴＮ］］を含むＦ４、及び配列番号３４［［ＴＳＧＮＬＴＲ］］を含むＦ５の５個のフィンガーを含む、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。
【0148】
いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤ（Ｋ５２５Ｓ）タンパク質は、配列番号３８［［ＡＴＴＧＣＴＴ及びＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ］］に記載の核酸配列に結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｎＦｏｋＥＬＤ（Ｋ５２５Ｓ）タンパク質は、配列番号２３［［ＲＳＤＨＬＳＲ］］を含むＦ１、配列番号２４［［ＤＳＳＤＲＫＫ］］を含むＦ２、配列番号２５［［ＲＳＤＴＬＳＥ］］を含むＦ３、配列番号２６［［ＱＳＧＤＬＴＲ］］を含むＦ４、及び配列番号２７［［ＱＳＳＤＬＳＲ］］を含むＦ５及び配列番号２８［［ＹＫＷＴＬＲＮ］］を含むＦ６の６個のフィンガーを含む。
【0149】
いくつかの態様では、ｎＦｏｋＫＫＲ（Ｉ４７９Ｔ）タンパク質は、配列番号３９［［ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ］］に記載の核酸配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。いくつかの態様では、ｎＦｏｋＫＫＲ（Ｉ４７９Ｔ）タンパク質は、配列番号３０［［ＳＮＱＮＬＴＴ］］を含むＦ１、配列番号３１［［ＤＲＳＨＬＡＲ］］を含むＦ２、配列番号３２［［ＱＳＧＤＬＴＲ］］を含むＦ３、配列番号３３［［ＷＫＨＤＬＴＮ］］を含むＦ４、及び配列番号３４［［ＴＳＧＮＬＴＲ］］を含むＦ５の５個のフィンガーを含む、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに融合される。
【0150】
いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、（１）（ａ）配列番号２３［［ＲＳＤＨＬＳＲ］］を含むＦ１、配列番号２４［［ＤＳＳＤＲＫＫ］］を含むＦ２、配列番号２５［［ＲＳＤＴＬＳＥ］］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、及び配列番号２７［［ＱＳＳＤＬＳＲ］］を含むＦ５、配列番号２８［［ＹＫＷＴＬＲＮ］］を含むＦ６の６個のフィンガーを含む、第１のＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）ｎＦｏｋＥＬＤタンパク質を含む第１の切断ドメインと、を含む第１のＺＦＮ、ならびに（２）（ａ）配列番号３０［［ＳＮＱＮＬＴＴ］］を含むＦ１、配列番号３１［［ＤＲＳＨＬＡＲ］］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［［ＷＫＨＤＬＴＮ］］を含むＦ４、及び配列番号３４［［ＴＳＧＮＬＴＲ］］を含むＦ５の６個のフィンガーを含む、第２のＤＮＡ結合ドメインと、（ｂ）ｎＦｏｋＫＫＲタンパク質を含む第２の切断ドメインと、を含む第２のＺＦＮを含む。
【0151】
ＤＮＡ結合ドメイン及びＦｏｋＩタンパク質を含むＺＦＮ対の例を表５に示す。
【表5】
【0152】
ＩＶ．ポリヌクレオチド及びベクター
本開示は、また、本開示のＺＦＮをコードするポリヌクレオチド及び／または調節エレメントに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、本開示のＺＦＮをコードする多シストロン性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
本開示は、また、本開示のＺＦＮをコードするポリヌクレオチド及び／または調節エレメントに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、本開示のＺＦＮをコードする多シストロン性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【0153】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、アミノ酸２６とアミノ酸３０との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸２８及びアミノ酸２９のＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる、ジンクフィンガーヌクレアーポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、アミノ酸４５７とアミノ酸４６５との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸４６１及びアミノ酸４６２のＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができる。
【0154】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧに結合が可能なＤＮＡ結合ドメインポリペプチドをコードする（配列番号９）。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧ（配列番号９）に結合するＤＮＡ結合ドメインをコードし、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むか、またはこれからなるフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むか、またはこれからなるフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー４（Ｆ４）、及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー５（Ｆ５）の５個のジンクフィンガーを有する。
【0155】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合が可能なＤＮＡ結合ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＣＴＡＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＣＴＧ（配列番号１５）に結合するＤＮＡ結合ドメインをコードし、これは、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むか、またはこれからなるＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むか、またはこれからなるＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むか、またはこれからなるＦ５、及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むか、またはこれからなるＦ６の６個のジンクフィンガーを含む。
【0156】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＡＴＴＧＣＴ及び／またはＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合が可能なＤＮＡ結合ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＡＴＴＧＣＴ及び／またはＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧ（配列番号３８）に結合するＤＮＡ結合ドメインポリペプチドをコードし、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６の６個のジンクフィンガーを有する。
【0157】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合が可能なＤＮＡ結合ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、ＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴ（配列番号２９）に結合するＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５の５個のジンクフィンガーを有する。
【0158】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ＣＩＩＴＡ遺伝子中でＤＮＡ配列を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、アミノ酸２６とアミノ酸３０との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸２８とアミノ酸２９でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断することができるジンクフィンガー対をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、これは、配列番号１０［ＲＰＹＴＬＲＬ］を含むか、またはこれからなるフィンガー１（Ｆ１）、配列番号１１［ＲＳＡＮＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるフィンガー２（Ｆ２）、配列番号１２［ＲＳＤＡＬＳＴ］を含むか、またはこれからなるフィンガー３（Ｆ３）、配列番号１３［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー４（Ｆ４）、及び配列番号１４［ＤＲＳＴＲＴＫ］を含むか、またはこれからなるフィンガー５（Ｆ５）を含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び、配列番号１６［ＲＳＤＶＬＳＡ］を含むか、またはこれからなるＦ１、配列番号１７［ＤＲＳＮＲＩＫ］を含むか、またはこれからなるＦ２、配列番号１８［ＤＲＳＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ３、配列番号１９［ＬＫＱＨＬＴＲ］を含むか、またはこれからなるＦ４、配列番号２０［ＱＳＧＮＬＡＲ］を含むか、またはこれからなるＦ５、及び配列番号２１［ＱＳＴＰＲＴＴ］を含むか、またはこれからなるＦ６を含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【0159】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、アミノ酸４５７とアミノ酸４６５との間、例えば、配列番号１に対応するアミノ酸４６１とアミノ酸４６２でＣＩＩＴＡ遺伝子を切断するジンクフィンガー対をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド及び／またはポリヌクレオチドを含むベクターは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対をコードし、これは、配列番号２３［ＲＳＤＨＬＳＲ］を含むＦ１、配列番号２４［ＤＳＳＤＲＫＫ］を含むＦ２、配列番号２５［ＲＳＤＴＬＳＥ］を含むＦ３、配列番号２６［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ４、配列番号２７［ＱＳＳＤＬＳＲ］を含むＦ５、及び配列番号２８［ＹＫＷＴＬＲＮ］を含むＦ６を含む第１のジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び、配列番号３０［ＳＮＱＮＬＴＴ］を含むＦ１、配列番号３１［ＤＲＳＨＬＡＲ］を含むＦ２、配列番号３２［ＱＳＧＤＬＴＲ］を含むＦ３、配列番号３３［ＷＫＨＤＬＴＮ］を含むＦ４、及び配列番号３４［ＴＳＧＮＬＴＲ］を含むＦ５を含む第２のジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。
【0160】
いくつかの態様では、ベクターは導入ベクターである。「導入ベクター」という用語は、単離された核酸（例えば、本開示のポリヌクレオチド）を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物を指す。多数のベクターがこの分野で知られており、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、「導入ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの細胞への核酸の導入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物をさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス導入ベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0161】
いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む組換えポリヌクレオチド（例えば、本開示のポリペプチド）を含むベクターを指す。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、多シストロン性発現ベクターである。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系によって供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野で知られている全てのウイルスが含まれる。
【0162】
いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクター、哺乳動物ベクター、または細菌ベクターである。いくつかの態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルス、センダイウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ハイブリッドベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターからなる群から選択される。
【0163】
いくつかの態様において、アデノウイルスベクターは、第３世代アデノウイルスベクターである。ＡＤＥＡＳＹ（商標）は、アデノウイルスベクター構築物を作成するための最も一般的な方法である。この系は、２種類のプラスミド、すなわち、シャトル（または導入）ベクター及びアデノウイルスベクターからなる。目的の導入遺伝子をシャトルベクターにクローニングし、検証し、制限酵素ＰｍｅＩを用いて線形化する。次に、この構築物をＡＤＥＡＳＩＥＲ－１細胞に形質変換し、これはＰＡＤＥＡＳＹ（商標）を含むＢＪ５１８３Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。ＰＡＤＥＡＳＹ（商標）は、ウイルス産生に必要なアデノウイルス遺伝子を含む約３３Ｋｂアデノウイルスプラスミドである。シャトルベクター及びアデノウイルスプラスミドは、アデノウイルスプラスミドへの導入遺伝子の相同的組換えを容易にする左右相同性アームの組み合わせを有する。標準的なＢＪ５１８３をスーパーコイルＰＡＤＥＡＳＹ（商標）及びシャトルベクターと同時形質転換することもできるが、この方法では、非組換えアデノウイルスプラスミドのバックグラウンドがより高くなる。次いで、組換えアデノウイルスプラスミドをサイズ及び適切な制限消化パターンについて検証することで、導入遺伝子がアデノウイルスプラスミドに挿入され、他の組換えパターンが起こらなかったことを判定する。検証した後、組換えプラスミドをＰａｃＩで線形化して、ＩＴＲに隣接する線形化ｄｓＤＮＡ構築物を作り出す。２９３または９１１の細胞を線形化構築物でトランスフェクトし、約７～１０日後にウイルスを採取することができる。この方法に加えて、本願が出願された時点の当技術分野において公知のアデノウイルスベクター構築物を作製するための他の方法を使用して、本明細書に開示された方法を実施することができる。
【0164】
他の態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター（例えば、第３または第４世代レンチウイルスベクター）である。「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスには特有であり、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができ、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは全て、レンチウイルスの例である。「レンチウイルスベクター」という用語は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に記載された自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例には、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターの非臨床型も利用可能であり、当業者に知られているであろう。
【0165】
レンチウイルスベクターは、通常、細胞株が３つの別個のプラスミド発現系でトランスフェクトされる一過性のトランスフェクション系で作製される。これらには、導入ベクタープラスミド（ＨＩＶプロウイルスの一部）、パッケージングプラスミドまたは構築物、及び異なるウイルスの異種エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）を有するプラスミドが含まれる。ベクターの３つのプラスミド成分をパッケージング細胞に入れ、これをＨＩＶシェルに挿入する。ベクターのウイルス部分は挿入配列を含むので、ウイルスは細胞系の内部で複製することはできない。現在の第３世代レンチウイルスベクターは、複製能ウイルスの組換えを介した生成を回避するために別個のプラスミドから発現される９つのＨＩＶ－１タンパク質のうち３つ（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ）のみをコードする。第４世代のレンチウイルスベクターでは、レトロウイルスゲノムがさらに減少している（例えば、ＴＡＫＡＲＡ（登録商標）ＬＥＮＴＩ－Ｘ（商標）第４世代のパッケージングシステムを参照）。
【0166】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載のＺＦＮ対７６８６７－２Ａ－８２８６２及び／または８７２５４－２Ａ－８４２２１をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【0167】
いくつかの態様では、本明細書の構築物の複数のタンパク質単位は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で発現され、これにより、複数のタンパク質単位を有する単一のポリペプチドが生成され、少なくとも１つのタンパク質は、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の標的部位に結合するＺＦ ＤＮＡ結合ドメインを含む第１のＺＦＮであり、少なくとも１つのタンパク質は、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の標的部位に結合するＺＦ ＤＮＡ結合ドメインを含む第２のＺＦＮである。いくつかの態様において、本明細書に記載の発現構築物により発現される各タンパク質の間に、高効率切断部位を含むアミノ酸配列またはリンカーが配置される。本明細書で使用する場合、高切断効率とは、翻訳されたタンパク質の５０％超、７０％超、８０％超、または９０％超が切断されると定義される。切断効率は、ウェスタンブロット分析によって測定することができる。
【0168】
高効率切断部位の非限定的な例としては、ブタテッショウウイルス１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ２Ａ（本明細書では、Ｆ２Ａと略記）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、及びトアシグナウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）及びｆｌａｃｈｅｒｉｅウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、高効率切断部位はＰ２Ａである。高効率切断部位は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｈｉｇｈ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａ ２Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ Ｍｉｃｅ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ６（４）：ｅｌ８５５６に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0169】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号５（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＰＹＴＬＲＬＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＲＳＡＮＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＡＬＳＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＫＦＡＤＲＳＴＲＴＫＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0170】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号６（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＡＥＲＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＲＳＤＶＬＳＡＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＫＫＦＡＤＲＳＮＲＩＫＨＴＫＩＨＴＧＳＱＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＤＲＳＨＬＴＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＬＫＱＨＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＱＳＧＮＬＡＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＴＰＲＴＴＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0171】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号５４（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＳＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0172】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号５６（ＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＴＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0173】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５３、５５または５７に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【0174】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３９に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％配列同一性である配列を含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号７（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＥＲＹＶＥＥＮＱＴＲＤＫＨＬＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＨＩＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＨＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＳＳＤＲＫＫＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＲＳＤＴＬＳＥＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＨＰＲＡＰＩＰＫＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＱＳＳＤＬＳＲＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＹＫＷＴＬＲＮＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0176】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドはＺＦＮをコードし、本ＺＦＮは、配列番号８（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＭＧＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫＬＫＹＶＰＨＥＹＩＥＬＩＥＩＡＲＮＳＴＱＤＲＩＬＥＭＫＶＭＥＦＦＭＫＶＹＧＹＲＧＫＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＡＩＹＴＶＧＳＰＩＤＹＧＶＩＶＤＴＫＡＹＳＧＧＹＮＬＰＩＧＱＡＤＥＭＱＲＹＶＫＥＮＱＴＲＮＫＨＩＮＰＮＥＷＷＫＶＹＰＳＳＶＴＥＦＫＦＬＦＶＳＧＨＦＫＧＮＹＫＡＱＬＴＲＬＮＲＫＴＮＣＮＧＡＶＬＳＶＥＥＬＬＩＧＧＥＭＩＫＡＧＴＬＴＬＥＥＶＲＲＫＦＮＮＧＥＩＮＦＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬＲＰＦＱＣＲＩＣＭＲＮＦＳＳＮＱＮＬＴＴＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＤＲＳＨＬＡＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＫＦＡＱＳＧＤＬＴＲＨＴＫＩＨＴＧＥＫＰＦＱＣＲＩＣＭＱＮＦＳＷＫＨＤＬＴＮＨＩＲＴＨＴＧＥＫＰＦＡＣＤＩＣＧＲＫＦＡＴＳＧＮＬＴＲＨＴＫＩＨＬＲＱＫＤ）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0177】
いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４０に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性である配列を含む。
【0178】
いくつかの態様では、ベクターは、配列番号３９または配列番号４０または配列番号５７に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0179】
いくつかの態様では、ベクターは、配列番号３９または配列番号５３または配列番号５７に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0180】
いくつかの態様では、ベクターは、配列番号３９または配列番号５５に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列同一性であるポリヌクレオチド配列を含む。
【0181】
Ｖ．細胞
本開示はまた、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮまたはＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮをコードするポリヌクレオチド構築物を含む、遺伝子改変細胞を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載されるＺＦＮは、構築物を発現するように遺伝子改変された細胞で組換え発現され、細胞は、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列またはベクターを含む。いくつかの態様では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮまたはＺＦＮをコードするポリヌクレオチド構築物により遺伝子操作された細胞であり、細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質の低下したレベルを発現するか、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を示さない。
本開示はまた、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮまたはＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮをコードするポリヌクレオチド構築物を含む、遺伝子改変細胞を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載されるＺＦＮは、構築物を発現するように遺伝子改変された細胞で組換え発現され、細胞は、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列またはベクターを含む。いくつかの態様では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮまたはＺＦＮをコードするポリヌクレオチド構築物により遺伝子操作された細胞であり、細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質の低下したレベルを発現するか、またはＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を示さない。
【0182】
いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子改変細胞は、本開示のタンパク質成分（例えば、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするＺＦＮ）をコードするポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクトされている。「トランスフェクトされた」（または同等の「形質転換された」及び「形質導入された」）という用語は、外因性核酸、例えば、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを、宿主細胞、例えば、Ｔ細胞のゲノムに移入または導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」細胞は、外因性核酸、例えば、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターで、トランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。この細胞は、一次対象細胞及びその子孫を含む。
【0183】
いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本開示のベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターでトランスフェクトされる。いくつかのそのような態様では、細胞は、本開示のタンパク質を安定して発現し得る。
【0184】
いくつかの態様では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、本開示のタンパク質をコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされている。いくつかのそのような態様では、細胞は、本開示のタンパク質を一過的に発現し得る。例えば、ＲＮＡ構築物は、細胞に直接的にトランスフェクトされ得る。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成する方法は、特別に設計されたプライマーを用いたテンプレートのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）に続いてポリＡ付加を含み、３’及び５’非翻訳配列（ＵＴＲ）、５’キャップ、発現させる核酸、及びポリＡ尾部、典型的には５０～２０００塩基長さを含む構築物を産生する。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率よくトランスフェクトすることができる。いくつかの態様では、テンプレートは、本開示のＺＦＮの配列を含む。一態様において、ＲＮＡベクターは、電気穿孔によりＴ細胞に形式導入される。
【0185】
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＺＦＮポリペプチドのコード配列は、別個の発現構築物上に置くことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＺＦＮポリペプチドのコード配列は、単一の発現構築物上に置くことができる。
【0186】
いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、線維芽細胞、心筋細胞、膵島細胞、または血球である。いくつかの態様では、細胞は、同種異系または自己由来である。
【0187】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むいくつかの源から得られ得る。
【0188】
本開示の遺伝子改変された細胞の供給源は、治療される患者（すなわち、自己細胞）のもの、または治療される患者ではないドナー（例えば、同種異系細胞）由来であり得る。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、操作されたＴ細胞である。本明細書におけるＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ８－（すなわち、ＣＤ４単一陽性）Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８＋（すなわち、ＣＤ８単一陽性）Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性）Ｔ細胞であり得る。機能的には、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、またはそれらの混合物であり得る。操作されるＴ細胞は、自己由来または同種異系であり得る。
【0189】
一次Ｔ細胞を含む一次免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び／または腫瘍組織を含むいくつかの組織源から得られ得る。ＰＢＭＣを含む白血球は、周知の技術、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離及び白血球除去により、他の血球から単離することができる。白血球アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞を含む）、単球、顆粒球、及び他の有核白血球細胞を含有する。Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または向流遠心分離溶離により、他の白血球からさらに単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＧＩＴＲ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞等のＴ細胞の特定の下位集団は、陽性または陰性選択技法（例えば、蛍光性または磁性細胞選別）によってさらに単離され得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択または望ましくない細胞の除去のための負の選択に十分な期間にわたって、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離産生物（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）などの様々な市販の抗体共役ビーズのいずれかとインキュベーションによって単離され得る。
【0190】
いくつかの場合では、自己由来Ｔ細胞は、治療後にがん患者から直接得る。特定のがん治療、特に免疫系を損なう治療に続いて、治療後すぐに収集されるＴ細胞の品質は、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖する及び／またはｅｘ ｖｉｖｏで操作した後の移植に対する能力が改善され得ることが観察されている。
【0191】
遺伝子改変の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第５，８５８，３５８号、同第５，８８３，２２３号、同第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、同第６，６９２，９６４号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８０号、同第６，９０５，６８１号、同第６，９０５，８７４号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１４４，５７５号、同第７，１７２，８６９号、同第７，１７５，８４３号、同第７，２３２，５６６号、同第７，５７２，６３１号、及び同第１０，７８６，５３３号に記載の方法を一般に使用して活性化及び増殖され得る。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドに結合した表面との接触によってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで増殖され得る。具体的には、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を用いることができる。
【0192】
細胞培養条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、及び細胞を活性化するように設計された任意の他の薬剤のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、培養条件は、ＩＬ－２、ＩＬ－７及び／またはＩＬ－１５の添加を含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、操作される細胞は、処理後に成熟Ｔ細胞へと分化する多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞及び多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞であり得る。これらの非Ｔ細胞は、同種異系であり得、例えば、ヒト胚性幹細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、または造血幹細胞もしくは前駆細胞であり得る。説明を容易にするために、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞及び多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を、本明細書では「前駆細胞」と総称する。
【0194】
いくつかの態様では、（例えば、本明細書に記載のＺＦＮを用いた内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトにより）移植片対宿主拒絶を低減するように、同種異系細胞を操作する。いくつかの態様では、同種異系細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの態様では、同種異系細胞は、Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞である。
【0195】
ＶＩ．方法
いくつかの態様では、（例えば、本明細書に記載のＺＦＮを用いた内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトにより）移植片対宿主拒絶を低減するように、同種異系細胞を操作する。
いくつかの態様では、（例えば、本明細書に記載のＺＦＮを用いた内因性ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトにより）移植片対宿主拒絶を低減するように、同種異系細胞を操作する。
【0196】
いくつかの態様では、本開示は、Ｔ細胞を調製する方法を提供し、本方法は、Ｔ細胞を単離すること、及び単離されたＴ細胞を本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたは本明細書に開示されるＺＦＮポリペプチドと接触させることを含む。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体細胞、Ｔｒｅｇ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0197】
いくつかの態様では、本開示は、細胞療法を必要とする対象を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載される単離細胞を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、単離された細胞は、同種異系または自己由来である。
【0198】
ＶＩＩ．キット
また、本開示は、（ｉ）本開示のＺＦＮ、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のベクター、またはポリヌクレオチド（複数可）もしくはベクター（複数可）を含む組成物、及び、任意に（ｉｉ）取扱説明書、例えば、本明細書に開示された方法による使用の指示を含む、キットまたは製造品も提供する。
また、本開示は、（ｉ）本開示のＺＦＮ、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、本開示のＺＦＮをコードする１つ以上のベクター、またはポリヌクレオチド（複数可）もしくはベクター（複数可）を含む組成物、及び、任意に（ｉｉ）取扱説明書、例えば、本明細書に開示された方法による使用の指示を含む、キットまたは製造品も提供する。
【0199】
いくつかの態様では、キットまたは製造品は、例えば、本開示のＺＦＮをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、または少なくとも１つの容器にポリヌクレオチド、ベクターを含み、別の１つ以上の容器トランスフェクション試薬を含む組成物を含む。
＊＊＊
＊＊＊
【0200】
本開示を実施の際には、別段に示されていない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法であって、当業者の技術の範囲内である技法を用いることになる。このような技法は、文献で充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （２００７）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
【0201】
下記の実施例は、例示として示されており、限定するために示されているものではない。
【実施例】
【0202】
実施例１．ジンクフィンガーヌクレアーゼの調製
ＺＦＮ設計
「ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ」対（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのカルボキシ末端に融合されたＦｏｋＩ触媒ドメイン）、ならびに「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ」対及び「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ」対（一方または両方のＺＦＮがそのアミノ末端でヌクレアーゼドメインを有する）を含む様々なＺＦＮアーキテクチャが用いられた。例えば、Ｐａｓｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０１９，１０（１）：１１３３－５７を参照されたい。
ＺＦＮ設計
「ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ」対（例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインのカルボキシ末端に融合されたＦｏｋＩ触媒ドメイン）、ならびに「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ」対及び「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ」対（一方または両方のＺＦＮがそのアミノ末端でヌクレアーゼドメインを有する）を含む様々なＺＦＮアーキテクチャが用いられた。例えば、Ｐａｓｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０１９，１０（１）：１１３３－５７を参照されたい。
【0203】
初期設計段階でリン酸接触変化を適用する利点を検討するために、これらのアーキテクチャに準拠したＺＦＮを、フィンガーのうちの３個においてリン酸接触変化ありまたはなしで、ＣＩＩＴＡ遺伝子の標的領域全体にわたる部位に対して設計した。最も活性の高い対のサブセットを選択し、代替のモジュール、リンカー、及びリン酸接触変化の数を使用することにより、さらに２回繰り返し行った。ＺＦＮ ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡを用いたＫ５６２細胞でのＺＦＮのスクリーニングを行った。さらなる改善のために選択された最も活性の高いＺＦＮは、「サイクル１ ＺＦＮリード」と称される。第２の設計サイクルにおいて、特異性を高めるための手段として、サイクル１ ＺＦＮリードを、触媒速度の減少を介して特異性を改善することが示されたＦｏｋＩ変異体を使用して再設計した（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｂｙ ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９，３７（８７）：９４５－５２）。ＺＦＮ ＲＮＡを用いたＴ細胞でのＺＦＮのスクリーニングを行った。これらのＺＦＮは「サイクル２ ＺＦＮ」と称されることになる。
【0204】
ＺＦＮ遺伝子集合体
ＺＦＮ遺伝子は、標準的な分子生物学的手法を用いて必要な成分をコードするＤＮＡセグメントの連結により組み立てた。初期アセンブリを、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列を有する遺伝子発現カセットを含むｐＶＡＸ１ベースのＺＦＮ発現ベクターに行った。
ＺＦＮ遺伝子は、標準的な分子生物学的手法を用いて必要な成分をコードするＤＮＡセグメントの連結により組み立てた。初期アセンブリを、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列を有する遺伝子発現カセットを含むｐＶＡＸ１ベースのＺＦＮ発現ベクターに行った。
【0205】
大規模なＴ細胞研究で試験するために、リードＺＦＮ試薬対のコード配列をＳＴＶ２２０－ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸベクターにサブクローニングし、２つのＺＦＮを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリーキットを用いるＧｉｂｓｏｎクローニング法によってＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチド（Ｔ２Ａ）コード配列に連結した。Ｔ２Ａペプチドは、単一の転写物（Ｓｚｙｍｃｚａｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，２２（５）：５８９～５９４）から約１：１の比率で２つのＺＦＮタンパク質の発現を可能にする。構築物の同一性を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。
【0206】
スクリーニングのためのプラスミド及びｍＲＮＡの調製
Ｋ５６２細胞の活性スクリーニングで使用するために、ＺＦＮコード化プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｋｉｔで調製した。
Ｋ５６２細胞の活性スクリーニングで使用するために、ＺＦＮコード化プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｋｉｔで調製した。
【0207】
ＺＦＮコード化ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ（ＡＭ１３４５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により調製した。ＺＦＮをコードするベクターに応じて、２つの代替的な戦略を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成のためのＤＮＡテンプレートを作成した。ｐＶＡＸ－ＺＦＮベクターから少量のＺＦＮコード化ｍＲＮＡを製造するために、５’Ｔ７プロモーター及び３’ポリＡｓ（ｎ＝６０）含有ＤＮＡテンプレートを使用した。これは、ＤＮＡテンプレートとしてＮ８０ＰＴ（５’－ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧ）（配列番号：４１）及びＲ５Ａ６０（ＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧ ＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧ）（配列番号４２）プライマー及びｐＶＡＸ－ＺＦＮを用いたＰＣＲによって生成した。
【0208】
大規模でのｍＲＮＡの合成のために、２Ａ連結ＺＦＮ対をコードするＳｐｅＩ－線形化ＳＴＶ２２０－ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸベクターを使用した。検証の目的で、このｍＲＮＡバッチを、ＯＣ－１００ ＭａｘＣｙｔｅトランスフェクションを使用してＴ細胞で試験した。
【0209】
スクリーニング－スケールトランスフェクション
３８４ウェルフォーマットにおけるＺＦＮ候補のスクリーニングは、Ａｍａｘａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、ＺＦＮをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡをＫ５６２細胞またはＴ細胞に電気穿孔することにより実施した。９６ウェルフォーマットにおけるＺＦＮ候補の後続のスクリーニングは、ＢＴＸ装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いてＺＦＮをコードするｍＲＮＡをＴ細胞に電気穿孔することにより行った。Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）及びＺＦＮプラスミドまたはｍＲＮＡを含むＳＦ細胞系ヌクレオベクター溶液と予備混合し、Ａｍａｘａ ＨＴヌクレオベクター装置を使用して電気穿孔した。電気穿孔されたＫ５６２細胞を３７℃のインキュベーターに３日間入れた。健康なドナー白血球から精製したＴ細胞を０日目に解凍し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激を用いて活性化させ、３日間培養した。３日目に、細胞を、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）及びＺＦＮ ｍＲＮＡを含むＰ３一次細胞核異方体溶液と予備混合し、Ａｍａｘａ ＨＴ核異方体デバイスを用いて電気穿孔した。電気穿孔したＴ細胞を３０℃のインキュベーターに１６時間入れ、次に７日目まで３７℃のインキュベーターに移した。ＢＴＸ電気穿孔の後、３０℃のインキュベーションステップなしに７日目までＴ細胞を３７℃のインキュベーター内に置いた。インキュベーション後、Ｋ５６２及びＴ細胞を採取し、ゲノム改変のために分析し、いくつかの実験では、ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面発現に対する効果を解析した。目的の部位における修飾レベルは、以下に示すイルミナの次世代シーケンシングプロトコルを使用して決定した。
３８４ウェルフォーマットにおけるＺＦＮ候補のスクリーニングは、Ａｍａｘａ ＨＴ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、ＺＦＮをコードするプラスミドまたはｍＲＮＡをＫ５６２細胞またはＴ細胞に電気穿孔することにより実施した。９６ウェルフォーマットにおけるＺＦＮ候補の後続のスクリーニングは、ＢＴＸ装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いてＺＦＮをコードするｍＲＮＡをＴ細胞に電気穿孔することにより行った。Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）及びＺＦＮプラスミドまたはｍＲＮＡを含むＳＦ細胞系ヌクレオベクター溶液と予備混合し、Ａｍａｘａ ＨＴヌクレオベクター装置を使用して電気穿孔した。電気穿孔されたＫ５６２細胞を３７℃のインキュベーターに３日間入れた。健康なドナー白血球から精製したＴ細胞を０日目に解凍し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激を用いて活性化させ、３日間培養した。３日目に、細胞を、サプリメント（Ｌｏｎｚａ）及びＺＦＮ ｍＲＮＡを含むＰ３一次細胞核異方体溶液と予備混合し、Ａｍａｘａ ＨＴ核異方体デバイスを用いて電気穿孔した。電気穿孔したＴ細胞を３０℃のインキュベーターに１６時間入れ、次に７日目まで３７℃のインキュベーターに移した。ＢＴＸ電気穿孔の後、３０℃のインキュベーションステップなしに７日目までＴ細胞を３７℃のインキュベーター内に置いた。インキュベーション後、Ｋ５６２及びＴ細胞を採取し、ゲノム改変のために分析し、いくつかの実験では、ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面発現に対する効果を解析した。目的の部位における修飾レベルは、以下に示すイルミナの次世代シーケンシングプロトコルを使用して決定した。
【0210】
実施例２．ジンクフィンガーヌクレアーゼの同定
大規模研究のためのＴ細胞培養及びＲＮＡ送達
ＺＦＮリードの大規模な分析では、ｍＲＮＡ送達のためにＭａｘＣｙｔｅ ＧＴ機器を使用した。７日目及び１０日目に細胞の増殖及び生存率を決定した。Ｔ細膨張倍率を、３日目から１０日目まで計算した。段階的なプロトコルを以下に示す。
大規模研究のためのＴ細胞培養及びＲＮＡ送達
ＺＦＮリードの大規模な分析では、ｍＲＮＡ送達のためにＭａｘＣｙｔｅ ＧＴ機器を使用した。７日目及び１０日目に細胞の増殖及び生存率を決定した。Ｔ細膨張倍率を、３日目から１０日目まで計算した。段階的なプロトコルを以下に示す。
【0211】
Ｔ細胞培養培地の調製
培地成分を、室温にした：Ｘ－Ｖｉｖ１５培地、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ必須ビタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びヒトＡＢ血清。培地を、以下の表６に従ってＢＳＣフードで調製した。ヒトＡＢ血清を除く他のすべてのサプリメントを加え、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。次いで、ヒトＡＢを添加した。配合した培地を４℃で貯蔵し、露光から保護するためにアルミニウム箔で包んだ。
培地成分を、室温にした：Ｘ－Ｖｉｖ１５培地、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ＭＥＭ必須ビタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びヒトＡＢ血清。培地を、以下の表６に従ってＢＳＣフードで調製した。ヒトＡＢ血清を除く他のすべてのサプリメントを加え、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌した。次いで、ヒトＡＢを添加した。配合した培地を４℃で貯蔵し、露光から保護するためにアルミニウム箔で包んだ。
【表6】
【0212】
ＣＤ４＋／ＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞の解凍及び活性化－０日目：以下の工程を行った：（１）静的培地を３７℃に予熱した。（２）選択したＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍する前に、解凍後の最初の細胞洗浄のために１５ｍｌまたは５０ｍｌの培地チューブを調製した。１０ｍｌの培地を１ｍｌの細胞体積毎に温める。（３）冷凍されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞のバイアル（複数可）を、バイアルを首のすぐ下まで浸漬し、氷結晶が見えなくなるまで穏やかに撹拌することにより、３７℃の水浴で融解する。（４）細胞懸濁液の全体積（約１ｍＬ）を、事前に引用された温かい媒体を収容する円錐形チューブに滴下する。（５）さらに５００μＬの加温した培地をクライオバイアルに加えて、残りのセルをすすぎ、回収する。（６）細胞を室温で４００×ｇで６～１０分間遠心分離する。（７）上清を除去し、ＩＬ－２含有培地中の細胞を再懸濁し、細胞をカウントし、必要な培地（１ｅ６細胞／ｍｌ）及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの体積を計算する（細胞対ビーズの比：１～３）。（８）ＣＤ３／ＣＤ３８ ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃４０２０３Ｄ）を冷蔵庫から取り出す。１：３の細胞：ビーズ比で細胞の活性化に必要なビーズの体積を取り出す。（９）ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを１回、１Ｘ ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなし）で洗浄し、次いで、培地中でビーズを再懸濁させる。（１０）活性化される細胞の数に応じて、適切な組織培養フラスコを使用する。細胞懸濁液及びビーズ懸濁液をフラスコに移し、培地を所望の体積まで加えて、１ｅ６細胞／ｍｌの最終細胞懸濁液を達成する。（１１）トランスフェクションの日まで３７℃、５％のＣＯ２で、細胞をインキュベーター内で培養するガイダンスは以下の表７を参照のこと。
【表7】
【0213】
大規模なＴ細胞研究のためのＲＮＡ送達
Ｔ細胞のＭａｘＣｙｔｅトランスフェクションのために細胞を解凍した３日後に、以下のプロトコルを使用した：（１）実験開始前に３７℃のインキュベーター中で培地を予熱した。（２）ＺＦＮ ｍＲＮＡ（複数可）を標識された１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（複数可）にアリコートし、氷上に保つ。（３）３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターから０日目の溶媒物からの活性化Ｔ細胞のフラスコを取り出す。（４）上下にピペットを当てて細胞塊をやさしく破壊する。計数のために十分に再懸濁させた細胞を約５００μｌサンプリングする。（５）必要な体積の細胞懸濁液（ＯＣ－１００トランスフェクションあたり３ｅ６細胞）を５０ｍｌの円錐管（複数可）に移す。細胞を室温で６分にわたり４００×ｇで遠心分離することによるペレットにする。上清を、ペレットを妨害することなくできるだけ清浄に吸引する。（６）４５ｍｌのハイクローンＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔バッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＣＡＴ＃ＥＰＢ５）で細胞を洗浄する－効果的な洗浄のために細胞ペレットを確実に分散させる。４００×ｇで６分間遠心分離する。注：血清または媒体タンパク質の存在は、トランスフェクション効率に悪影響を及ぼす可能性がある。（７）遠心分離機からチューブを取り出し、ＢＳＣフードに移し、ペレットに障害を与えることなくできるだけ上清を吸引する。（８）Ｈｙｃｌｏｎｅ ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔バッファー中の細胞を最終濃度３０ｅ６細胞／ｍＬに再懸濁させる。（９）目的のｍＲＮＡを含む指定されたエッペンドルフチューブ（複数可）に１００μｌの細胞（３ｅ６細胞）を加え、混合物を３回穏やかにピペットして混合する。注：細胞をｍＲＮＡと混合し、一度に１つのサンプルずつをトランスフェクトする。（１０）細胞－ｍＲＮＡ混合物をプロセシングアセンブリ（ＰＡ）ＯＣ－１００に移す。（１１）ＰＡを含有する細胞／ｍＲＮＡをＭａｘＣｙｔｅ ＧＴに挿入し、事前プログラミングされたプロトコルをクリックすることにより電気穿孔プロセスを直ちに開始する。（１２）電気穿孔プロセスが完了したら、ＰＡをＢＳＣに移し、細胞をＰＡからＰ２００ピペットを用いて指定されたウェルに移す。（１３）工程（９）～（１２）を可能な限り迅速に実施する。全ての実験アームが電気穿孔されるまで前記ステップ（９）～（１２）を繰り返す。（１４）細胞を入れたプレートを３７℃のインキュベーターに移し、２０分間インキュベートする。（１５）３７℃で２０分間インキュベーションした後、インキュベーターからプレートを取り出し、それらをＢＳＣフードに入れる。細胞を、１００ＩＵ／ｍｌ（ＯＣ－１００について９００μｌ）の新鮮なＩＬ－２を補充した予熱したＴ細胞培地で１０倍に希釈する。細胞を３０℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートする。
Ｔ細胞のＭａｘＣｙｔｅトランスフェクションのために細胞を解凍した３日後に、以下のプロトコルを使用した：（１）実験開始前に３７℃のインキュベーター中で培地を予熱した。（２）ＺＦＮ ｍＲＮＡ（複数可）を標識された１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（複数可）にアリコートし、氷上に保つ。（３）３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターから０日目の溶媒物からの活性化Ｔ細胞のフラスコを取り出す。（４）上下にピペットを当てて細胞塊をやさしく破壊する。計数のために十分に再懸濁させた細胞を約５００μｌサンプリングする。（５）必要な体積の細胞懸濁液（ＯＣ－１００トランスフェクションあたり３ｅ６細胞）を５０ｍｌの円錐管（複数可）に移す。細胞を室温で６分にわたり４００×ｇで遠心分離することによるペレットにする。上清を、ペレットを妨害することなくできるだけ清浄に吸引する。（６）４５ｍｌのハイクローンＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔バッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＣＡＴ＃ＥＰＢ５）で細胞を洗浄する－効果的な洗浄のために細胞ペレットを確実に分散させる。４００×ｇで６分間遠心分離する。注：血清または媒体タンパク質の存在は、トランスフェクション効率に悪影響を及ぼす可能性がある。（７）遠心分離機からチューブを取り出し、ＢＳＣフードに移し、ペレットに障害を与えることなくできるだけ上清を吸引する。（８）Ｈｙｃｌｏｎｅ ＭａｘＣｙｔｅ電気穿孔バッファー中の細胞を最終濃度３０ｅ６細胞／ｍＬに再懸濁させる。（９）目的のｍＲＮＡを含む指定されたエッペンドルフチューブ（複数可）に１００μｌの細胞（３ｅ６細胞）を加え、混合物を３回穏やかにピペットして混合する。注：細胞をｍＲＮＡと混合し、一度に１つのサンプルずつをトランスフェクトする。（１０）細胞－ｍＲＮＡ混合物をプロセシングアセンブリ（ＰＡ）ＯＣ－１００に移す。（１１）ＰＡを含有する細胞／ｍＲＮＡをＭａｘＣｙｔｅ ＧＴに挿入し、事前プログラミングされたプロトコルをクリックすることにより電気穿孔プロセスを直ちに開始する。（１２）電気穿孔プロセスが完了したら、ＰＡをＢＳＣに移し、細胞をＰＡからＰ２００ピペットを用いて指定されたウェルに移す。（１３）工程（９）～（１２）を可能な限り迅速に実施する。全ての実験アームが電気穿孔されるまで前記ステップ（９）～（１２）を繰り返す。（１４）細胞を入れたプレートを３７℃のインキュベーターに移し、２０分間インキュベートする。（１５）３７℃で２０分間インキュベーションした後、インキュベーターからプレートを取り出し、それらをＢＳＣフードに入れる。細胞を、１００ＩＵ／ｍｌ（ＯＣ－１００について９００μｌ）の新鮮なＩＬ－２を補充した予熱したＴ細胞培地で１０倍に希釈する。細胞を３０℃、５％のＣＯ２インキュベーター内で一晩インキュベートする。
【0214】
細胞希釈－４日目、７日目：以下のプロトコルを使用した：（１）インキュベーター中でＴ細胞培地を３７℃まで予熱（２）電気穿孔の約１８時間後、または４日目に、３０℃～３７℃のインキュベーターから５～６時間回復のためにプレート（複数可）を移す。（３）次に、適切なプレートまたはフラスコに入れて１００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ－２を含むＴ細胞培地で細胞を１：４に希釈し、細胞を３７℃でインキュベーターでインキュベートする。（４）７日目に、細胞数を測定し、細胞を新しいＩＬ－２含有培地で５ｅ５細胞／ｍｌに希釈し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで細胞を増殖させ続ける。
【0215】
表現型決定及び遺伝子型決定、ならびに凍結保存のための細胞収集：以下のプロトコルを使用した：（１）１０日目に、細胞フラスコをインキュベーターから取り出す。（２）ＢＳＣフード内で、ピペット操作によりセルを再懸濁させる。細胞数について約１００μｌの細胞懸濁液をサンプリングする。（３）ＦＡＣＳ分析には最小限の１ｅ６細胞を確保し、ＭｉＳｅｑ分析には最小限の１ｅ６細胞を確保する。
【0216】
ＺＦＮ活性の定量化のための次世代シーケンシングアッセイ
ＺＦＮの意図した標的での改変レベルを評価するために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）溶解物（高スループット３８４または９６ウェルのトランスフェクションの場合）またはＱｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔで精製されたゲノムＤＮＡ（大規模なトランスフェクションの場合）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してアンプリコンシーケンシングに供した。
ＺＦＮの意図した標的での改変レベルを評価するために、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）溶解物（高スループット３８４または９６ウェルのトランスフェクションの場合）またはＱｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔで精製されたゲノムＤＮＡ（大規模なトランスフェクションの場合）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してアンプリコンシーケンシングに供した。
【0217】
ヒトＣＩＩＴＡ遺伝子座におけるＺＦＮ標的部位を包含する１３０～２００ｂｐの断片の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。これらのプライマーは、ＰＣＲ増幅の第２ラウンドで使用されるプライマーのためのプライミング配列も含有する。最終的に出荷されたＺＦＮ対のゲノム標的を増幅及び分析するために使用されるプライマー配列については、表８を参照のこと。第１ラウンドのＰＣＲ増幅の産物を、第２ラウンドのＰＣＲ増幅に使用し、これにはサンプル特異的識別子配列（「バーコード」）及びＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑシーケンシングに必要な一定の末端領域を導入するように設計されたプライマーが使用された（Ｐａｓｃｈｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０１９，１０（１）：１１３３－５７）。バーコード化されたアンプリコンをプールし、ＭｉＳｅｑまたはＮｅｘｔＳｅｑプラットフォームを使用してシーケンシングした。
太字は、第２ラウンドのＰＣＴ（ｉ５及びｉ７アダプタープライマーを有する）のプライミングに使用される配列を示し、下線は、ＰＣＲの最初のラウンドの間の遺伝子座特異的プライミングのための配列を示す。
【表8】
【0218】
アンプリコンを生成するためのＤＮＡ単離及びＰＣＲ条件
【0219】
ハイスループットスクリーニングからのゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して調製した。大規模なトランスフェクションからのＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；カタログ番号６９５０９）を使用して調製した。
【0220】
ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ抽出ＤＮＡを使用したＮＧＳ ＰＣＲでは、ＤＮＡの入力レベルは、８０～１２０ｎｇ／μｌでの精製されたｇＤＮＡパネルからのＰＣＲあたり１００ｎｇであった。ＤＮＡに加えて、以下のものを各ＮＧＳ ＰＣＲ反応に加えた：１２．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１μＬの各第１ラウンドＰＣＲプライマー（濃度１０μΜ）、及び２５μＬの総反応体積に対する水。ＮＧＳ ＰＣＲ条件は、９８℃で１分間変性、及び９８℃で１５秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で４０秒間の３５サイクルを経て、７２℃で１０分間伸長した。
【0221】
バーコードＰＣＲは、１μＬのＮＧＳ ＰＣＲ産物、１２．５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１μＬのフォワードバーコードプライマー、１μＬのリバースバーコードプライマー（両方とも１０μΜの濃度）及び水による２５μＬの総反応体積で行った。
【0222】
バーコードＰＣＲ条件は、９８℃で１分間変性、及び９８℃で１５秒間、６５℃で３０秒間及び７２℃で４０秒間の１２サイクルを経て、７２℃で１０分間伸長した。
【0223】
インデル定量化
【0224】
ＰＣＲ増幅された標的アンプリコンを、次世代シークエンシングを用いた対末端シークエンシングによってシークエンシングした。品質フィルタリング、配列データ処理、及びインデル定量化を、（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９，３７（８７）：９４５－５２）に記載のように実施した。インデル定量化のために、背景補正をウィンドウ処理なしで適用した。
【0225】
オフターゲット評価
【0226】
Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９，３７（８７）：９４５－５２に記載のように、オリゴヌクレオチドの二重捕捉分析を使用して、オフターゲット部位の候補を同定した。簡単に言えば、Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）を、１０％ウシ胎児血清及び１倍のペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ｃａｔ．＃３０－００９－Ｃｌ）に５％のＣＯ２を含むＲＰＭＩ１６４０中に維持した。２０万（２ｅ５）の細胞を、ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ９６－ｗｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｅｆｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，ｃａｔ．＃Ｖ４ＳＣ－２０９６）を製造元の命令に従って使用し、２０μｌのトランスフェクション混合物中の２７ｂｐのオリゴ捕獲二重鎖を含有する４つのヌクレオチドオーバーハングの固定用量（１μΜ）を用いて、様々な用量のＣＩＩＴＡ ＺＦＮコード化ｍＲＮＡ（ｎｇ）で電気穿孔した。オリゴヌクレオチド５′－Ｐ－Ｎ＊Ｎ＊Ｎ Ｎ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＡＧＡ Ｃ＊Ｔ＊Ｇ－３′及び５′－Ｐ－Ｎ＊Ｎ＊Ｎ Ｎ ＣＡＧ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＡ ＧＴＣ Ｔ＊Ｔ＊Ｃ－３′（配列中、Ｐは５’リン酸化を表し、アスタリスクはホスホロチオエート結合を示す）をアニーリングすることによってオリゴヌクレオチド捕捉二本鎖を調製した。ＧＦＰ発現ＲＮＡを陰性対照として使用した。電気穿孔細胞を、１０％ウシ胎児血清及び１倍のペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミンを含有する１００μｌの温かいＲＰＭＩ培地中で回収し、１００μｌの予熱培地を有する９６ウェルの組織培養プレートに移した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。ピペット混合後に、トランスフェクトされた細胞の３０％を、２００ｘｇでの１０分間の遠心分離によって収穫し、アンプリコンシーケンシングによるインデル及びオリゴの取り込みの定量化に使用した。細胞をスケールアップするために、残りの細胞を、新鮮な培地４００μｌを有する２４ウェルプレートに移した。これらの細胞を、新鮮な培地を絶え間なく補充しながら更に５日間維持した。細胞を遠心分離により採取し、オリゴ捕捉ライブラリーが構築されるまで、－８０℃でペレットの形態で保存した。
【0227】
トランスフェクション後４８時間のインデル定量のために、標的部位をＰＣＲ増幅させ、上記のプロトコルを使用してアンプリコンシーケンシングに供した。標的部位でのオリゴヌクレオチド－二重組み込みを、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に記載されるカスタムシェルスクリプトを使用して決定した。
【0228】
評価した各ＺＦＮ対について、目標の修飾（＞７５％のインデル）及び＞３％の二重導入のほぼ飽和レベルを示す細胞サンプルを同定した。ゲノムＤＮＡを、製造元の指示に従いＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ （Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，ｃａｔ．＃７４０７４０）を使用して精製した。ＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ．＃Ｑ３２８５４）を使用して定量した。４００ｎｇ（約１２０ｋゲノム）のゲノムＤＮＡを使用して、標準的なオリゴヌクレオチド二重捕捉プロトコルに従って候補オフターゲット遺伝子座を同定した（Ｍｉｌｌｅｒ，２０１９）。
【0229】
スクリーニング規模研究からのＺＦＮ処理されたＴ細胞を７日目に収穫し、大規模研究からのＺＦＮ処理されたＴ細胞を１０日目に収穫した。ゲノムＤＮＡを単離し、上記のようにオンターゲットインデルパーセンテージを測定した。次いで、各ＺＦＮ対について、７５％超の改変を示す最低投与量サンプルを、オリゴヌクレオチド二重捕捉分析により識別された最も高い順位の候補オフターゲット部位で独立したインデルパーセンテージについて分析した。これらの部位で、上記の方法を用いてインデルを測定した。
【0230】
細胞膨張率及び生存率測定
【0231】
細胞数及び生存率の測定を、ＶｉａＳｔａｉｎ ＡＯＰＩ染色溶液によるＮｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２機器（（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ，＃ＣＳ２－０１０６－２５ｍＬ）で実施した。
【0232】
細胞数及び生存率を決定するために、２０μｌの生細胞サンプル及び２０μｌのＡＯＰＩ染色溶液を組み合わせて混合した。次に、２０μｌの染色したサンプルをスライド上のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｃｈａｍｂｅｒに加え、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２機器を用いて分析し、これはサンプルの生／死細胞の数、生／死細胞の濃度、平均直径、及び生存率についての報告を提供する。
【0233】
３日目～１０日目の細胞膨張倍率を、１０日目の各サンプルの細胞の総数を３×１０６、すなわち電気穿孔に使用した細胞の数で割ることによって決定した。
【0234】
ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析
【0235】
ＭＨＣクラスＩＩフローサイトメトリーに使用した染色材料：Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，＃６５－０８６６－１４，ｌｏｔ＃２０９５４２３）、Ｒａｔ Ｉｇ２ａ Ｋａｐｐａ Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅＦｌｕｏｒ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ＃６９－４３２１－８２，Ｌｏｔ＃２０９４３４５、及びＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－ＤＲ，ＤＰ，ＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ＃３６１７１４，Ｌｏｔ＃Ｂ２８９４０９）。染色した細胞を、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．７．１を使用して分析した。
【0236】
染色されるべき９６ディープウェルプレートに、各サンプルについておよそ１００万個の細胞を収集した（アイソタイプ及び染色されていない対照については未改変Ｔ細胞、モックＴ細胞、及びＺＦＮ処理したＴ細胞）。細胞を５００ｘｇで５分間ペレット化し、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ）で２回洗浄した。各サンプルに１００μｌのｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ５０６（ＰＢＳ中で１：１０００に希釈）を加え、４度で３０分間インキュベートし、光から保護した。インキュベーション期間の終わりに、細胞を４００μｌのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、過剰なバイアビリティー色素を除去した。細胞を５００ｘｇで５分間ペレット化し、５０μｌのＭＨＣクラスＩＩｍＡｂ（ＦＡＣＳバッファー中で１：２０に希釈）に再懸濁させた。抗体インキュベーションを、光から保護しながら室温で３０分間行った。抗体インキュベーション後、細胞を５００μｌのＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。ペレットを、捕捉読み取りのために２００μｌのＦＡＣＡバッファーに再懸濁させた。
【0237】
第１サイクルのリード発達からの高活性ＺＦＮ試薬の同定
【0238】
リード発達の初期サイクルでは、初期設計セットからの１８０個のＺＦＮ対を、ＲＮＡトランスフェクションを用いてＫ５６２細胞でスクリーニングした。最も活性の高い対のサブセットを、代替のモジュール、リンカー、及びリン酸接触変化の数を使用することにより、２つの追加段階を介してオンターゲットインデックスを改善するために選択した。これらのＺＦＮを、Ｋ５６２細胞中のプラスミドＤＮＡ、またはＴ細胞中のＲＮＡで試験した。Ｔ細胞内のＺＦＮ ＲＮＡをトランスフェクションすることにより得られた３つの特異部位を標的とする最も活性の高いＺＦＮ対の１５個を含む１つの代表的なスクリーニングデータセットを表９に示す。これらの結果は、滴定挙動の範囲を示し、最も活性な対は、より高い用量で７０％超のインデルレベルを達成した。我々の経験において、高スループットＴ細胞スクリーンに見られる活性レベルは、大規模な研究で達成される改変効率を過小評価する傾向がある。
【表9】
【0239】
サイクル１のリードＺＦＮの特異性評価及び改善
表９に示されている候補対のセットから、サブセットを開発プロセスのサイクル２に進め、これには、詳細度を測定及び改善するために２つの並行したアクティビティが関与する。これらの活性のうちの第１の活性では、オリゴヌクレオチド二重捕捉分析においてＺＦＮ対を使用し、候補オフターゲット部位での活性を評価するための追跡インデル研究を行った。７６８６７：８２８６２対（第９表を参照）に関しては、これらの研究は優れた特異性を示し、オンターゲット捕捉数は、他の任意の遺伝子座での捕捉数を約１０倍も上回った。さらに、２３の最も高くランク付けされた候補オフターゲット遺伝子座でのインデル分析では、８０％超のオンターゲット改変レベルで低い総インデルレベルを得た。右側のＺＦＮ８２８６２の設計特徴は、ＺＦＰ結合親和性を低下させるために、フィンガー１、３、及び５での３つのアルギニン－グルタミン置換を含む（表１５）。この対の高度に特異的な性能を、２Ａバージョンを用いた大規模なＴ細胞研究で確認した（表１０を参照）。
表９に示されている候補対のセットから、サブセットを開発プロセスのサイクル２に進め、これには、詳細度を測定及び改善するために２つの並行したアクティビティが関与する。これらの活性のうちの第１の活性では、オリゴヌクレオチド二重捕捉分析においてＺＦＮ対を使用し、候補オフターゲット部位での活性を評価するための追跡インデル研究を行った。７６８６７：８２８６２対（第９表を参照）に関しては、これらの研究は優れた特異性を示し、オンターゲット捕捉数は、他の任意の遺伝子座での捕捉数を約１０倍も上回った。さらに、２３の最も高くランク付けされた候補オフターゲット遺伝子座でのインデル分析では、８０％超のオンターゲット改変レベルで低い総インデルレベルを得た。右側のＺＦＮ８２８６２の設計特徴は、ＺＦＰ結合親和性を低下させるために、フィンガー１、３、及び５での３つのアルギニン－グルタミン置換を含む（表１５）。この対の高度に特異的な性能を、２Ａバージョンを用いた大規模なＴ細胞研究で確認した（表１０を参照）。
【表10】
【0240】
第２の対（表９の８４２１４：８４２２１対を参照）についても、捕捉及びインデル分析によって良好な性能が得られた。右側のＺＦＮ８４２２１の設計特徴は、ＺＦＰ結合親和性を低下させるために、フィンガー３及び４での２つのアルギニン－グルタミン置換を含む（表１５）。オフターゲット活性をさらに減少させるために、ＦｏｋＩドメインに置換を有するＺＦＮ変異体をアセンブルし、次いで、既知のオフターゲットに対する改善された特異性についてスクリーニングした。この取り組みにより、ＦｏｋＩドメイン内でＱ４８１Ｅ置換を有する、８７２５４で示されるＺＦＮ８４２１４の有意に改善された変異体が同定された（表１５）。８４２１４ＺＦＮを８７２５４で置換すると、バックグラウンド減算されたオフターゲットインデルが劇的に減少した（表１１の列４と５を比較）。その２Ａ構成におけるこの対の特異性は、大規模なＴ細胞研究で確認された（表１１参照）。
【表11】
【0241】
これらの取り組みから得られたＺＦＮ対、７６８６７：８２８６２及び８７２５４：８４２２１は、大規模なＴ細胞研究で、１５％未満の総オフターゲットインデルレベルと、７５％超のオンターゲット改変レベルとを有する高度の切断特異性を示した（表１０及び１１参照）。
【0242】
実施例３．大規模研究
大規模なＴ細胞研究の前に、それぞれのリード対、７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）及び８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）の２つのＺＦＮコード遺伝子を、２Ａ－ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを介して結合させ、得られた融合遺伝子をＳＴＶ２２０－ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸ発現ベクターにサブクローニングした。２Ａペプチドは、単一ＲＮＡ転写物からの両方のＺＦＮタンパク質の効率的な産生を可能にする（Ｓｚｙｍｃｚａｋ、２００４）。次に、得られた構築物から生成されたＲＮＡを、５０、１００、１５０及び２００μｇ／ｍｌの濃度で、ＯＣ－１００ＭａｘＣｙｔｅプロトコルを使用してＴ細胞にトランスフェクトした。１０日目（すなわち、トランスフェクション後７日目）に次世代シーケンスによって測定されたオンターゲットインデル率は、最小用量で高いインデルレベルを示し、約９６％でピークインデルレベルを示した（表１２を参照）。対照として、９０μｇ／ｍｌのＺＦＮ対ｐＳＴ－ＴＲＡＣｍＲ（ＣＤ１９標的）をトランスフェクションに含め、９１．２％の改変率を得た。
大規模なＴ細胞研究の前に、それぞれのリード対、７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）及び８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）の２つのＺＦＮコード遺伝子を、２Ａ－ペプチドをコードするＤＮＡセグメントを介して結合させ、得られた融合遺伝子をＳＴＶ２２０－ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸ発現ベクターにサブクローニングした。２Ａペプチドは、単一ＲＮＡ転写物からの両方のＺＦＮタンパク質の効率的な産生を可能にする（Ｓｚｙｍｃｚａｋ、２００４）。次に、得られた構築物から生成されたＲＮＡを、５０、１００、１５０及び２００μｇ／ｍｌの濃度で、ＯＣ－１００ＭａｘＣｙｔｅプロトコルを使用してＴ細胞にトランスフェクトした。１０日目（すなわち、トランスフェクション後７日目）に次世代シーケンスによって測定されたオンターゲットインデル率は、最小用量で高いインデルレベルを示し、約９６％でピークインデルレベルを示した（表１２を参照）。対照として、９０μｇ／ｍｌのＺＦＮ対ｐＳＴ－ＴＲＡＣｍＲ（ＣＤ１９標的）をトランスフェクションに含め、９１．２％の改変率を得た。
【表12】
【0243】
総オフターゲットインデルレベルの評価
ＺＦＮを標的とするＣＩＩＴＡの重要な性能要件は、それらが高い特異性、特に１５％未満の総オフターゲットインデルレベルを示すことである。このメトリックに対する性能を評価するために、７６８６７－２Ａ－８２８６２及び８７２５４－２Ａ－８４２２１の対についての低用量サンプルを、オリゴヌクレオチドの二重捕捉試験によって決定される最も高くランク付けされた候補オフターゲット部位におけるインデル％について特性決定した。第１０表及び第１１表にまとめたこれらの分析の結果は、活性及び特異性性能を示しており、これは、このプログラムについて定義された許容範囲内である。７６８６７－２Ａ－８２８６２対（部位Ｂ）については、２３の候補オフターゲットを分析して、統計的に有意なイインデルシグナルを示す３つの部位を、バックグラウンド減算レベルでそれぞれ０．２８％、０．５０％、０．６４％で特定した。他の２つの部位は、統計的に有意なインデルレベルを示さなかったが、マニュアルインデル分析に基づいて潜在的なオフターゲット部位と考えられた。８７２５４－２Ａ－８４２２１対（部位Ｇ）については、１つのオフターゲット部位のみが０．２１％の統計的に有意なインデルレベルを示し、それ以外でマニュアル分析においてＺＦＮ誘導性インデルを示す部位はなかった。
ＺＦＮを標的とするＣＩＩＴＡの重要な性能要件は、それらが高い特異性、特に１５％未満の総オフターゲットインデルレベルを示すことである。このメトリックに対する性能を評価するために、７６８６７－２Ａ－８２８６２及び８７２５４－２Ａ－８４２２１の対についての低用量サンプルを、オリゴヌクレオチドの二重捕捉試験によって決定される最も高くランク付けされた候補オフターゲット部位におけるインデル％について特性決定した。第１０表及び第１１表にまとめたこれらの分析の結果は、活性及び特異性性能を示しており、これは、このプログラムについて定義された許容範囲内である。７６８６７－２Ａ－８２８６２対（部位Ｂ）については、２３の候補オフターゲットを分析して、統計的に有意なイインデルシグナルを示す３つの部位を、バックグラウンド減算レベルでそれぞれ０．２８％、０．５０％、０．６４％で特定した。他の２つの部位は、統計的に有意なインデルレベルを示さなかったが、マニュアルインデル分析に基づいて潜在的なオフターゲット部位と考えられた。８７２５４－２Ａ－８４２２１対（部位Ｇ）については、１つのオフターゲット部位のみが０．２１％の統計的に有意なインデルレベルを示し、それ以外でマニュアル分析においてＺＦＮ誘導性インデルを示す部位はなかった。
【0244】
細胞生存率及び細胞膨張の評価
大規模なトランスフェクションにおけるＴ細胞の健康に対するＺＦＮ発現の効果を評価するために、細胞生存率を７日目及び１０日目（トランスフェクションの４日後及び７日後）に決定した。表１３に示すように、モック対照と比較して細胞生存率の大きな損失は観察されなかった。３日目から１０日目までのＴ細胞膨張の測定（表１４）は、モック及びＴＲＡＣ ＺＦＮ対照の膨張において通常よりも大きな変動を示したが、最も高いＣＩＩＴＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡ入力レベルでは膨張の明らかな減少はなかった。
大規模なトランスフェクションにおけるＴ細胞の健康に対するＺＦＮ発現の効果を評価するために、細胞生存率を７日目及び１０日目（トランスフェクションの４日後及び７日後）に決定した。表１３に示すように、モック対照と比較して細胞生存率の大きな損失は観察されなかった。３日目から１０日目までのＴ細胞膨張の測定（表１４）は、モック及びＴＲＡＣ ＺＦＮ対照の膨張において通常よりも大きな変動を示したが、最も高いＣＩＩＴＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡ入力レベルでは膨張の明らかな減少はなかった。
【表13】
【表14】
【0245】
ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析
【0246】
ＣＩＩＴＡ機能のＺＦＮ媒介性ノックアウトは、ＭＨＣクラスＩＩの細胞表面発現を示す細胞の割合を減少させるはずであることから、本発明者らは、採取時、トランフェクションから７日後（［１０日目」）にＴ細胞についてＦＡＣＳ分析を行った。モック及びＴＲＡＣ ＺＦＮ対照サンプルと比較した、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ処理サンプルにおけるＭＨＣクラスＩＩシグナルのＺＦＮ濃度依存的減少が観察された（図２）。ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ対８７５３４－２Ａ－８４２２１（部位Ｇ）においては、ＭＨＣクラスＩＩが７５％超減少し、これはＭＨＣクラスＩＩレベルを５０％減少した、ＺＦＮ対７６８６７－２Ａ－８２８６２（サイトＢ）よりもＭＨＣクラスＩＩレベルの顕著により高い減少を示した。インデルレベルにおいては、両方のＺＦＮ対は、同様の極めて高いレベルをもたらした。
【0247】
ＺＦＮ切断部位でのインデル部位の機能的効果のバイオインフォマティクスベースの考察
【0248】
９種からのＣＩＩＴＡ相同の全長タンパク質配列は図２Ａに示すように整列している。ＺＦＮ対７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）及び８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）の切断部位を有する領域が拡大され、図２Ｂ及び２Ｃにそれぞれ示される。両方のＺＦＮ対は保存領域でＤＮＡを切断し、ＺＦＮによって生成されたインデルが機能的破壊を媒介することを示唆したが、ＦＡＣＳで測定したＭＨＣクラスＩＩタンパク質のノックダウンレベルは、Ｇ部位ではＢ部位よりも高い効率を示した。図２に示されるように、Ｇ部位は、ＮＡＣＨＴドメイン内に位置している。ＮＡＣＨＴドメインは、進化的に保存された予測ヌクレオシド－トリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）ドメインである（Ｋｏｏｎｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０００，２５（５）：２２３）。その名は、ＮＡＩＰ（ＮＬＰファミリーのアポトーシス阻害タンパク質）、ＣＩＩＴＡ（すなわち、Ｃ２ＴＡまたはＭＨＣクラスＩＩ転写活性化剤）、ＨＥＴ－Ｅ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ ａｎｓｅｒｉｎａ由来の不和合性座蛋白質）、及びＴＥＰ１（テロメラーゼ関連タンパク質）を含むいくつかのタンパク質に由来する。ＮＡＣＨＴドメインの重要な機能及びそのヌクレオチド結合ドメインのロスマンフォールドらしさを考慮すると、Ｇ部位で生成されるインフレームインデルによるアミノ酸残基変化は、Ｂ部位で生成されるインフレームインデルによるアミノ酸残基変化よりもＣＩＩＴＡタンパク質機能に対してより有害であり、したがって、より深刻なＭＨＣクラスＩＩ低減を示す可能性がある。
【0249】
ＺＦＮ対７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）及び８７２５４：８４２２１（部位Ｇ）は、それぞれＣＩＩＴＡエクソン２及び１１を標的としている。ゲノム及びタンパク質配列に対するそれらの標的部位を図１に示す。２つのＺＦＮ試薬のための設計情報、アーキテクチャ及びＤＮＡ結合配列を第１５表及び図３に示す。具体的には、以下の表１５は、本開示の６つの例示的に操作されたＺＦＮを列挙している。各ＺＦＮについて、ＺＦＮドメイン内の各ジンクフィンガーのゲノム標的配列（結合配列）及びＤＮＡ結合認識ヘリックス配列（すなわち、Ｆ１～Ｆ６）を単一の列で示す。下記表の「＾」は、指示されたヘリックスの１番目のアミノ酸の上流の４番目のアルギニン（Ｒ）残基がグルタミン（Ｑ）に変化したことを示す。配列に関する配列リスト番号（配列番号：＃）は、その小括弧内に示されている。
【表15】
【0250】
ＺＦＮ対、７６８６７：８２８６２（部位Ｂ）はＣＩＩＴＡエクソン２を標的とし、ＺＦＮ対８７２５４：８４２２１及び８７２７８：８７２３２（部位Ｇ）はＣＩＩＴＡエクソン１１を標的とする。ゲノム及びタンパク質配列に対するそれらの標的部位を図１に示す。２つのＺＦＮ試薬のための設計情報、アーキテクチャ及びＤＮＡ結合配列を第１５表及び図３に示す。
【0251】
【表16】
【0252】
【表17】
【0253】
【表18】
【0254】
【表19】
【0255】
【表20】
【0256】
【表21】
【0257】
【表22】
【0258】
実施例４．ジンクフィンガーヌクレアーゼの編集活性
ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ，８７２７８及び８７２３２の編集活性を評価した。
ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ，８７２７８及び８７２３２の編集活性を評価した。
【0259】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の単離
Ｔｒｅｇ細胞を、ＥＦＳ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の健康なボランティアの血液から得たバフィーコートから新たに単離した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを、採血の翌日に精製した。次に、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ＬｏｗＴｒｅｇ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を使用したカラムフリー免疫磁気陽性選択によって単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）単離したＣＤ２５＋細胞から結合磁性粒子を除去し、ＣＤ１２７発現細胞を免疫磁気陰性選択により枯渇させた。生きたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ＬｏｗＴｒｅｇ細胞を、ＰＩ染色により計数し、下流の用途に使用した。
Ｔｒｅｇ細胞を、ＥＦＳ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）の健康なボランティアの血液から得たバフィーコートから新たに単離した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを、採血の翌日に精製した。次に、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７ＬｏｗＴｒｅｇ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ＲａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓ（商標）を使用したカラムフリー免疫磁気陽性選択によって単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）単離したＣＤ２５＋細胞から結合磁性粒子を除去し、ＣＤ１２７発現細胞を免疫磁気陰性選択により枯渇させた。生きたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ＬｏｗＴｒｅｇ細胞を、ＰＩ染色により計数し、下流の用途に使用した。
【0260】
Ｔｒｅｇ細胞培養
細胞単離後、細胞を、Ｌ－グルタミン（２０ｍＭ）、ゲンタマイシン（７５μｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８で被覆したビーズを補充した細胞培養培地中にプレーティングした。電気穿孔後、細胞を、Ｌ－グルタミン（２０ｍＭ）、ゲンタマイシン（７５μｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び５％血清置換技術を補充した同じ細胞培養培地にプレーティングした。電気穿孔の４日後に、細胞を採取し、計数し、新鮮な完全培地中に再プレーティングした。
細胞単離後、細胞を、Ｌ－グルタミン（２０ｍＭ）、ゲンタマイシン（７５μｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８で被覆したビーズを補充した細胞培養培地中にプレーティングした。電気穿孔後、細胞を、Ｌ－グルタミン（２０ｍＭ）、ゲンタマイシン（７５μｇ／ｍＬ）、ｒｈＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び５％血清置換技術を補充した同じ細胞培養培地にプレーティングした。電気穿孔の４日後に、細胞を採取し、計数し、新鮮な完全培地中に再プレーティングした。
【0261】
ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡ産生
ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ（８７２７８及び８７２３２）をコードするＤＮＡ配列を、ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸプラスミドにクローニングした。ＳｐｅＩを用いたプラスミド線形化後、ｍＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｕｌｔｒａ－Ｋｉｔを使用してｍＲＮＡ転写産物を産生し、続いて塩化リチウム精製により単離した。最後に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してｍＲＮＡの品質を評価した。
ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ（８７２７８及び８７２３２）をコードするＤＮＡ配列を、ｐＶＡＸ－ＧＥＭ２ＵＸプラスミドにクローニングした。ＳｐｅＩを用いたプラスミド線形化後、ｍＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ ｕｌｔｒａ－Ｋｉｔを使用してｍＲＮＡ転写産物を産生し、続いて塩化リチウム精製により単離した。最後に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してｍＲＮＡの品質を評価した。
【0262】
Ｔｒｅｇ細胞電気穿孔
０．５＊１０Ｅ＋０６個の細胞を収集し、２０＊１Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬの細胞濃度で電気穿孔バッファー中に懸濁させた。次いで、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを、示された濃度で再懸濁された細胞と混合した。次に、サンプルを電気穿孔カセットに入れ、製造業者の指示に従って電気穿孔した。電気ショック後、細胞を回収し、記載された培地中にプレーティングした（Ｔｒｅｇ細胞培養の項目を参照）。
０．５＊１０Ｅ＋０６個の細胞を収集し、２０＊１Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬの細胞濃度で電気穿孔バッファー中に懸濁させた。次いで、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを、示された濃度で再懸濁された細胞と混合した。次に、サンプルを電気穿孔カセットに入れ、製造業者の指示に従って電気穿孔した。電気ショック後、細胞を回収し、記載された培地中にプレーティングした（Ｔｒｅｇ細胞培養の項目を参照）。
【0263】
免疫表現型決定
細胞を暗所で４℃で２０分間抗ＭＨＣＩＩ抗体で染色した。２つの洗浄ステップの後に、ＳＹＴＯＸブルーを含むＦＡＣＳバッファー中で細胞を再懸濁し、これを死亡率のマーカーとして使用した。サンプルを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置を使用するフローサイトメトリーによって分析した。
細胞を暗所で４℃で２０分間抗ＭＨＣＩＩ抗体で染色した。２つの洗浄ステップの後に、ＳＹＴＯＸブルーを含むＦＡＣＳバッファー中で細胞を再懸濁し、これを死亡率のマーカーとして使用した。サンプルを、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置を使用するフローサイトメトリーによって分析した。
【0264】
次世代シーケンシングを用いるインデル検出
ＣＩＩＴＡ標的領域は、単一のＰＣＲによりゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。次に、生成されたＰＣＲ産物をバーコード化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシングシステムでのペアエンドディープシーケンシングによって改変レベルを決定した。Ｍｉｓｅｑデータは社内で処理及び分析した。インデル定量のためにゲノムＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーは、以下の表２３に記載されている。
ＣＩＩＴＡ標的領域は、単一のＰＣＲによりゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。次に、生成されたＰＣＲ産物をバーコード化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンシングシステムでのペアエンドディープシーケンシングによって改変レベルを決定した。Ｍｉｓｅｑデータは社内で処理及び分析した。インデル定量のためにゲノムＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーは、以下の表２３に記載されている。
【表23】
【0265】
実験計画
単離したばかりのＣＤ４＋／ＣＤ１２７Ｌｏｗ／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ｄ－３）を使用して活性化させた。０日目、結果セクションに示されるように、ＺＦＮ－ｍＲＮＡを細胞内に電気穿孔した。電気穿孔（ＥＰ）後、５％の血清置換物（ＳＲ）の存在下で細胞を培養した。ＥＰ後４日目に、新鮮な抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを添加することにより細胞を再活性化させた。免疫表現型決定により細胞を分析した際に、ラパマイシンも７日目ＥＰ後まで添加した。ＤＮＡも抽出してＭｉｓｅｑ解析を行った。（図６を参照）。
単離したばかりのＣＤ４＋／ＣＤ１２７Ｌｏｗ／ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ｄ－３）を使用して活性化させた。０日目、結果セクションに示されるように、ＺＦＮ－ｍＲＮＡを細胞内に電気穿孔した。電気穿孔（ＥＰ）後、５％の血清置換物（ＳＲ）の存在下で細胞を培養した。ＥＰ後４日目に、新鮮な抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを添加することにより細胞を再活性化させた。免疫表現型決定により細胞を分析した際に、ラパマイシンも７日目ＥＰ後まで添加した。ＤＮＡも抽出してＭｉｓｅｑ解析を行った。（図６を参照）。
【0266】
Ｔｒｅｇ細胞を、様々な濃度のＣＩＩＴＡ ＺＦＮ ｍＲＮＡ（０、３０、６０、９０及び１２０μｇ／ｍＬ）で電気穿孔した。１週間後、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮの編集効率を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）で評価した。９０μｇ／ｍＬの電気穿孔ｍＲＮＡで最適な編集条件（インデル％）を得た（図７Ａ）。並行して、Ｔｒｅｇ細胞の免疫表現型分析を実施して、細胞表面ＭＨＣＩＩからのノックアウトを監視した。ＭＨＣＩＩ発現はＴｒｅｇ細胞において経時的に変動するため、データは非電気穿孔（ＮｏＥＰ）対照条件にわたって正規化した。編集データと一致して、ＣＩＩＴＡ ＺＦＮ編集は、約９０μｇ／ｍＬのＺＦＮの最適濃度を有する強力なＭＨＣＩＩノックアウトをもたらした（図７Ｂ）。
【0267】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、及び出版物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0268】
理解の明瞭化ために説明図及び例を用いてある程度詳しく開示を提供しているが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく様々な変更及び修正を行うことができることは当業者には明らかである。したがって、前述の説明及び実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【国際調査報告】