特表 2024-520478 変異型ヒトＮＡｘタンパク質およびスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】変異型ヒトＮＡｘタンパク質およびスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240517BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240517BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240517BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573036

(86)(22)【出願日】2022-05-27

(85)【翻訳文提出日】2024-01-15

(86)【国際出願番号】 US2022031302

(87)【国際公開番号】W WO2022256251

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】63/195,039

(32)【優先日】2021-05-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】513004906

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・コペンハーゲン

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＰＥＮＨＡＧＥＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ノーランド， キャメロン エル．

(72)【発明者】

【氏名】パヤンデ， ジャン メヘル－ディーン

(72)【発明者】

【氏名】プレス， ステファン アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】チュア， ハン チョウ

(72)【発明者】

【氏名】クションサク， マルク

【テーマコード（参考）】

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ13

4B063QR59

4B063QR80

4B063QS38

4B063QX04

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒトＮａ_Ｘの活性を調節する分子を同定するために使用され得る変異型ヒトＮａ_Ｘを使用する変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（「Ｎａ_Ｘ」）タンパク質およびスクリーニング方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、潜在的Ｎａ_Ｘモジュレーターの存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施することを含む。本開示はまた、ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターとして作用する分子およびそのような分子を検出するための関連キットに関する。
【選択図】図１９Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質（Ｎａ_Ｘ）モジュレーターを同定する方法であって、
ａ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｂ）潜在的Ｎａ_Ｘモジュレーターの存在下で前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および
ｃ）前記潜在的モジュレーターの存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が前記潜在的モジュレーターの非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合に、前記潜在的モジュレーターをヒトＮａ_Ｘモジュレーターとして同定する工程
を含む、方法。

【請求項2】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換された前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、またはこれらからなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換された前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換された前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質（Ｎａ_Ｘ）モジュレーターを同定する方法であって、
ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｂ）潜在的モジュレーターの存在下で、前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および
ｃ）前記潜在的モジュレーターの存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が前記潜在的モジュレーターの非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合に、前記潜在的モジュレーターをヒトＮａ_Ｘモジュレーターとして同定する工程
を含む、方法。

【請求項9】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも２つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも３つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項16】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項17】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項18】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記イオンチャネルアッセイが、前記変異型ヒトＮａ_Ｘの同定されたモジュレーターの存在下で実施される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘの同定されたモジュレーターが、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、キニジン、フレカイニド、テトラカインまたはリドカインの１つ以上である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記潜在的モジュレーターが、ペプチドまたは大環状分子または抗体である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記潜在的モジュレーターが小分子である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に対する、パート（ｃ）で同定された潜在的モジュレーターの結合親和性を決定することをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記潜在的モジュレーターが、前記変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に、１０μＭ以下、１０μＭ～５０ｎＭ、１０μＭ～５００ｎＭ、１μＭ以下、１μＭ～５０ｎＭ、または１００ｎＭ以下のＥＣ５０またはＩＣ５０で結合する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記イオンチャネルアッセイが、パッチクランプもしくは自動パッチクランプアッセイ、イオンフラックスアッセイ、またはイオンもしくは電圧感受性色素アッセイである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

パート（ｃ）で同定された前記潜在的モジュレーターが、前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下させる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

パート（ｃ）で同定された前記潜在的モジュレーターが、前記アッセイにおいて、１０ｎＭ～５００μＭ、５０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～５０μＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～５０μＭ、１～５００μＭ、１～５０μＭ、１０～５００μＭまたは５０～２５０μＭの最大半値濃度で前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を低下させる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

パート（ｃ）で同定された前記潜在的モジュレーターが、前記アッセイにおいて前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を増加させる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

ペプチド、大環状分子、小分子または抗体であってもよい、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法によって同定されるヒトＮａ_Ｘのモジュレーター。

【請求項32】

変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質であって、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されている、変異型ヒトＮａＸイオンチャネル（ＮａＸ）タンパク質。

【請求項33】

請求項３２に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘであって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換された前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの前記少なくとも一部が、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１１３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、またはこれらからなる、変異型ヒトＮａＸ。

【請求項34】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換された前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない、請求項３２または３３に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項35】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換された前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項36】

前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分によって置換されている、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項37】

前記ヒトＮａ_Ｘの前記ＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分によって置換されている、請求項３６に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項38】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０の１つのアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項39】

２つ、３つ、または４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質。

【請求項40】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項41】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項42】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項43】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項44】

請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘであって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも２つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、変異型ヒトＮａＸ。

【請求項45】

請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘであって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも３つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、変異型ヒトＮａＸ。

【請求項46】

請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘであって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、変異型ヒトＮａＸ。

【請求項47】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項48】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項３９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項49】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項４８に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項50】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む、請求項４９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項51】

前記ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む、請求項４９に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘ。

【請求項52】

ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、
ａ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｂ）前記試験分子の存在下で前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程；および
ｃ）前記試験分子の存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、前記試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、
ｄ）パート（ｃ）により、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために前記試験分子を選択する工程を含む、方法。

【請求項53】

ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、
ａ）前記試験分子が前記ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、
ｂ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｃ）前記試験分子の存在下で前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程；および
ｄ）前記試験分子の存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、前記試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、
ｅ）パート（ｄ）により、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために前記試験分子を選択する工程
を含む、方法。

【請求項54】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換された前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、またはこれらからなる、請求項５２または５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換された前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない、請求項５２、５３または５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換された前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、
ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｂ）前記試験分子の存在下で前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程；および
ｃ）前記試験分子の存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、前記試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、
ｄ）パート（ｃ）により、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために前記試験分子を選択する工程
を含む、方法。

【請求項61】

ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する方法であって、
ａ）前記試験分子が前記ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、
ｂ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、
ｃ）前記試験分子の存在下で前記変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および
ｄ）前記試験分子の存在下での前記アッセイにおける前記変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、前記試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、
ｅ）パート（ｄ）により、前記試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために前記試験分子を選択する工程
を含む、方法。

【請求項62】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項63】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項64】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの全ての上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項65】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、前記４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項66】

請求項６０または６１に記載の方法であって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも２つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、方法。

【請求項67】

請求項６０または６１に記載の方法であって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも３つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、方法。

【請求項68】

請求項６０または６１に記載の方法であって、前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む、方法。

【請求項69】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項70】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項６０または６１に記載の方法。

【請求項71】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記変異型ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ヒトＮａ_Ｘが、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む、請求項７１に記載の方法。

【請求項74】

ペプチド、大環状分子、小分子または抗体であってもよい、請求項５２～７３のいずれか一項に記載の方法によって同定される分子。

【請求項75】

請求項３２～５１のいずれか一項に記載のキメラまたは変異型ヒトＮａ_Ｘと、請求項３１に記載のモジュレーターまたは請求項５２、５３、６０もしくは６１に記載の試験分子と、を含む、分子複合体。

【請求項76】

ヒトＮａ_Ｘの活性をアッセイするための、またはヒトＮａ_Ｘモジュレーターおよび／もしくはヒトＮａ_Ｘに結合する分子を同定するためのキットであって、請求項３２～５１のいずれか一項に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘを含み、さらに、イオンチャネルアッセイを実施するための１つ以上の試薬、変異型ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターおよび使用説明書のうちの少なくとも１つを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０２１年５月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／１９５，０３９号に対する優先権を主張する。

【0002】

本開示は、ヒトＮａ_Ｘの活性を調節する分子を同定するために使用され得る変異型ヒトＮａ_Ｘを使用する変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（「Ｎａ_Ｘ」）タンパク質およびスクリーニング方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、潜在的なＮａ_Ｘモジュレーターの存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施することを含む。本開示はまた、ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターとして作用する分子およびそのような分子を検出するための関連キットに関する。

【背景技術】

【0003】

プロトタイプの電位依存性ナトリウム（Ｎａ_Ｖ）チャネルは、活動電位を開始および伝播することによって電気シグナル伝達において重要な役割を果たす。密接に関連する９つの哺乳動物チャネルサブタイプ、Ｎａ_Ｖ１．１－Ｎａ_Ｖ１．９は、神経系機能、筋収縮およびホルモン分泌を含む重要な生理学的過程に寄与する様々な組織で発現している。１０番目のＮａ_Ｖチャネル様遺伝子であるＳＣＮ７ＡＡは、ほぼ３０年前にクローニングされたが、非定型の配列特徴およびこのＮａ_Ｖ２．１タンパク質から電位活性化ナトリウム（Ｎａ^＋）電流を記録し得ないことから、これは異なる生理学的役割を有する可能性がないという推測が高まり、Ｎａ_Ｘと命名された。

【0004】

標準的なＮａ_Ｖチャネルとは対照的に、Ｎａ_Ｘは、細胞外のＮａ^＋濃度によって活性化されるＮａ^＋チャネルとして機能することが提案されている。複数の証拠により、Ｎａ_ＸがＮａ^＋恒常性に寄与し得ることが示唆されている^１、２。Ｎａ_Ｘは、血液組成のモニタリングを専門とする脳領域での発現に限定されていることを示す^５。Ｎａ_Ｘノックアウトマウスは、脱水にもかかわらず塩分を摂取し、血中Ｎａ^＋レベルの上昇によって引き起こされる高血圧に抵抗性である^５、６。ヒトでは、Ｎａ_Ｘに対する自己免疫は、口渇知覚および食欲の障害を伴う慢性高ナトリウム血症を引き起こす^７。末梢では、Ｎａ_Ｘは、上皮Ｎａ^＋チャネル（ＥＮａＣ）の上流のＮａ^＋恒常性を調節し、アトピー性皮膚炎および肥厚性瘢痕を処置するための標的として示唆されている^８。

【0005】

Ｎａ_Ｘは、Ｎａ_Ｖ１．７チャネル^１６と最も高い配列同一性（約５５％）を共有するが、Ｎａ_Ｖチャネルファミリーの最も分岐するメンバーである。従来のＮａ_Ｖチャネルでは、電圧センサドメイン（ＶＳＤ）は、Ｓ４セグメントに沿って保存された４～８個のゲート電荷残基を含み、膜脱分極時に外向きに移動し、チャネルゲート（ＶＳＤ１～ＶＳＤ３）を開くかまたは急速不活性化（ＶＳＤ４）を開始する。このパラダイムとは対照的に、Ｎａ_Ｘは電圧非感受性であり、Ｓ４ゲート電荷残基の数が少ないことが報告されている。したがって、Ｎａ_Ｘ中の電圧センサ様ドメイン（ＶＳＬＤ）の機能および配座状態は不明であり、ＶＳＬＤがどのようにチャネルゲート制御に寄与するかも不明である。さらに、Ｎａ_Ｖと比較してＮａ_Ｘにおいて分岐しているＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーセグメントは、Ｎａ_Ｖチャネルにおける迅速な不活性化に必要であることが知られている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、ヒトＮａ_Ｘの活性を調節する分子を同定するために使用され得る変異型ヒトＮａ_Ｘを使用する変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（「Ｎａ_Ｘ」）タンパク質およびスクリーニング方法、およびこのような方法により同定される分子、およびこの方法を実施するためのキットに関する。変異型ヒトＮａ_Ｘタンパク質および関連する方法は、例えば、Ｎａ_Ｘ活性を調節するだけでなく、Ｎａ_Ｖタンパク質に結合し、または調節することが知られている試験分子を試験して、標的タンパク質に対する選択性を試験するためにも使用され得る。変異型Ｎａｘを使用する本明細書に記載のアッセイにおいて同定されたモジュレーターは、ヒトＮａｘのモジュレーター／候補モジュレーターとして有用であり得る。本発明者らは、驚くべきことに、イオンチャネルの開口した伝導状態を模倣することによってヒトＮａｘに関連するイオンチャネル測定を可能にする変異型Ｎａｘタンパク質を見出した。理論に束縛されるものではないが、変異型Ｎａｘは、例えば、イオンチャネルタンパク質のリン酸化および／または通常はＮａｘイオンチャネルを開口することを可能にする他の関連する生理学的または構造的変化を模倣することによって、Ｎａｘイオンチャネルの開口した導電状態を模倣し得る。本開示は、例えば、以下の実施形態のいずれか１つまたは組み合わせを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、本明細書の開示は、ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質（Ｎａ_Ｘ）モジュレーターを同定する方法であって、ａ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分と置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、ｂ）潜在的Ｎａ_Ｘモジュレーターの存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、およびｃ）潜在的モジュレーターの存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が潜在的モジュレーターの非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合に、潜在的モジュレーターをヒトＮａ_Ｘモジュレーターとして同定する工程を含む、方法に関する。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、これらからなる。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。例えば、いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されているいくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。

【0008】

本発明は、ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質（Ｎａ_Ｘ）モジュレーターを同定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）潜在的モジュレーターの存在下で、変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および（ｃ）潜在的モジュレーターの存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が潜在的モジュレーターの非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合に、潜在的モジュレーターをヒトＮａ_Ｘモジュレーターとして同定する工程を含む、方法をも包含する。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含むいくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも２つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のうちの少なくとも３つの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。

【0009】

上記の方法のいずれにおいても、イオンチャネルアッセイはまた、変異型ヒトＮａ_Ｘの同定されたモジュレーター、例えば、本明細書において同定されたモジュレーターまたは本明細書における方法の実施において別途同定されたモジュレーターの存在下でも実施され得る。いくつかのそのような場合では、変異型ヒトＮａ_Ｘの同定されたモジュレーターは、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、キニジン、フレカイニド、テトラカインまたはリドカインの１以上である。

【0010】

上記の方法のいずれにおいても、潜在的モジュレーターは、ペプチドまたは大環状分子または抗体であり得る。例えば、いくつかの例では、潜在的モジュレーターは小分子である。いくつかの例では、小分子は、例えば、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、キニジン、フレカイニド、テトラカイン、またはリドカインの誘導体であり得る。

【0011】

上記の方法のいずれもまた、パート（ｃ）で同定された潜在的モジュレーターの、変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に対する結合親和性を決定することをさらに含み得る。いくつかの例では、潜在的モジュレーターは、変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に、１０μＭ以下、１０μＭ～５０ｎＭ、１０μＭ～５００ｎＭ、１μＭ以下、１μＭ～５０ｎＭ、または１００ｎＭ以下のＥＣ５０またはＩＣ５０で結合する。いくつかの例では、ＥＣ５０またはＩＣ５０をＥＬＩＳＡアッセイで決定し得る。

【0012】

上記の方法のいずれにおいても、イオンチャネルアッセイは、パッチクランプもしくは自動パッチクランプアッセイ、イオンフラックスアッセイ、またはイオンもしくは電圧感受性色素アッセイであり得る。上記の方法のいずれにおいても、パート（ｃ）で同定された潜在的モジュレーターは、アッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下させ得る。いくつかの例では、パート（ｃ）で同定された潜在的モジュレーターは、アッセイにおいて、１０ｎＭ～５００μＭ、５０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～５０μＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～５０μＭ、１～５００μＭ、１～５０μＭ、１０～５００μＭまたは５０～２５０μＭの最大半値濃度で変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を低下させる。他の例では、パート（ｃ）で同定された潜在的モジュレーターは、アッセイにおいて変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を増加させる。

【0013】

本開示はまた、本明細書に記載の方法によって同定されるヒトＮａ_Ｘのモジュレーターに関し、このモジュレーターは、場合によりペプチド、大環状分子、小分子または抗体であり得る。

【0014】

本開示はまた、変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質を包含し、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されている。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、これらからなる。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。例えば、いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。

【0015】

本開示は、２つ、３つ、または４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む、変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質をさらに含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含むいくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。

【0016】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分と置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｃ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｄ）パート（ｃ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0017】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）試験分子がヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、（ｂ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分と置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｃ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および（ｄ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｅ）パート（ｄ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0018】

上記の２つのさらなる方法において、いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩ Ｓ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含むか、これらからなる。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まず、かつ／またはＳ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている。いくつかのこのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。

【0019】

本開示は、また、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｃ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｄ）パート（ｃ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法を含む。

【0020】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）試験分子がヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、（ｂ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｃ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｄ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、（ｅ）パート（ｄ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0021】

上記の２つの方法のいずれにおいても、いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。

【0022】

本開示はまた、上記の方法によって同定される分子を含み、これは場合により、ペプチド、大環状分子、小分子または抗体であり得る。

【0023】

本開示はまた、本明細書に記載のキメラまたは変異型ヒトＮａ_Ｘタンパク質と、該タンパク質のモジュレーターまたは該タンパク質の潜在的モジュレーターとを含む分子複合体を含む。

【0024】

本開示はまた、ヒトＮａ_Ｘの活性をアッセイするため、またはヒトＮａ_Ｘモジュレーターおよび／もしくはヒトＮａ_Ｘに結合する分子を同定するためのキットであって、本明細書に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘを含み、さらに、イオンチャネルアッセイを実施するための１つ以上の試薬、変異型ヒト_Ｘのモジュレーターおよび使用説明書を含む、キットを含む。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】図１Ａ～図１Ｈは、ヒトＮａ_Ｘおよびβ３－Ｎａ_Ｘチャネル複合体の全体構造の特徴付けを示す。図１Ａは、ヒトＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖ１．７を発現するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図1B】図１Ｂは、示される化合物の細胞外適用に応答した、Ｎａ_Ｘを発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図1C】図１Ｃは、Ｎａ_Ｘを発現し、Ｎａ_ＶまたはＣａ_Ｖチャネル補助サブユニット、Ｎａ^＋／Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼサブユニットおよびシナプス関連タンパク質９７（ＳＡＰ９７）を共発現し、示された細胞外Ｎａ^＋濃度の存在下での卵母細胞からの代表的な電流を示す。図１Ａ～図１Ｃの電圧プロトコルは以下の通りである。Ｎａ_Ｘ：０ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで、＋８０～－１００ｍＶの間の工程；Ｎａ_Ｖ１．７：－１００ｍＶのＨＰから５ｍＶ刻みで－８０ｍＶ～＋６５ｍＶの間の脱分極工程。

【図1D】図１Ｄは、図１Ａ～図１Ｃのように行われた独立した実験データの概要を示す。

【図1E】図１Ｅは、ヒトＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖ１．７を発現するマウスＮｅｕｒｏ－２細胞からの、細胞外Ｎａ^＋濃度（ＨＰ＝－６０ｍＶ）の変化、または電圧：－１００ｍＶのＨＰから１０ｍＶ刻みで、－６０から＋６０ｍＶの間の脱分極工程に応答した、代表的な電流を示す。

【図1F】図１Ｆは、図１Ｅと同様に行われた独立した実験のデータ概要を示す。

【図1G】図１Ｇは、示されたタンパク質について、Ｎｅｕｒｏ－２細胞から抽出されたタンパク質の全溶解物および表面画分を、プローブ探査したウエスタンブロットを示す。

【図1H】図１Ｈは、β３－Ｎａ_Ｘチャネル複合体の側面図および細胞外図を示す。おおよその膜境界を示す。ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩＶは、それぞれ緑色、青色、橙色および桃色に着色され、β３サブユニットは灰色の表面表示である。

【図2A】図２Ａ～Ｅは、Ｎａ_Ｘ細孔モジュールの構造が非導電状態を明らかにすることを示す。図２Ａは、Ｎａ_Ｘ細孔容積が灰色表面として示されており、ＤＩＩおよびＤＩＶがカートゥーン描写で示されていることを示す（明らかにするためにＤＩおよびＤＩＩＩは省略されている）。

【図2B】図２Ｂは、活性化ゲートに並ぶ側鎖を有するＳ６－ヘリックスを棒状と半透明の表面で表した図である。四面図は、ＤＩＩＩおよびＤＩＶがオレンジ色および桃色に着色され、ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー由来のＩＦＩモチーフ（緑色、破線の枠内）がスティックおよび半透明表面表示で示されている、より広い視点を提供する。

【図2C】図２Ｃは、側方開窓および結合脂質を強調する細孔モジュールをスライスした直交図を示す。Ｓ６ゲートを横切るホスファチジルエタノールアミンは紫色の棒で示されている。側面図では、明確にするために前景の脂質を除去している。

【図2D】図２Ｄの図は、中央のパネルＣと同様であるが、モデル化された脂質の周りに青色メッシュ表示で示される低温ＥＭマップを有する。

【図2E】図２Ｅは、本明細書の表４に示すキメラ構築物１～７を含む、ヒトＮａ_Ｘ、ヒトＮａ_Ｖ１．７、または二重および単一ドメインが交換されたＮａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘキメラを発現するアフリカツメガエル由来の代表的な電流を示す。０ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで＋８０～－１００ｍＶの間の工程。

【図3A】図３Ａ～図３Ｆは、標的化された細孔湿潤Ｓ６変異を有するヒトＮａ_Ｘの特徴付けを示す。図３Ａは、Ｓ６ゲートに並ぶ標的疎水性側鎖の位置および拡大図を示す。

【図3B】図３Ｂは、表示電圧プロトコル下で_Ｘ－ＱＴＴ構築物を発現するアフリカツメガエル卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図3C】図３Ｃは、示されるＮａ_Ｘ構築物を発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図3D】図３Ｄは、Ｎａ_Ｘ－ＥＥＥ構築物を発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。図３Ｃ～図３Ｄの電圧プロトコルは、図２Ｅの上記の通りであった。

【図3E】図３Ｅは、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴ構築物を発現し、示されたＮａ_Ｖ補助サブユニットを共発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。上記の電圧プロトコル。

【図3F】図３Ｆは、図２Ｂ～図２Ｅで実施された独立した実験データの概要を示す。

【図4A】図４Ａ～図４Ｃは、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタの構造および特徴付けを示す。図４Ａは、Ｎａ_ＸＤＥＮＡモチーフ残基側鎖を棒で示す。

【図4B】図４Ｂの上段のパネルは、Ｎａ_Ｘ側鎖を示し、Ｎａ_Ｖチャネルの選択性フィルタの周りに相互作用ネットワークを形成する類似の残基を棒で示す（Ｎａ_Ｖ１．７，ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）。図４Ｂの下段のパネルは、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタおよびＮａ_Ｖ１．７選択性フィルタ（図４Ｂの上段のパネルと同様）の同じ図を示すが、静電的表面平滑化として示す。中央キャビティおよび活性化ゲートは、明確にするために除外されている。

【図4C】図４Ｃは、Ｎａ_ＸおよびＮａ_Ｖ１．７（灰色、ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）構造と棒として示されている選択側鎖とを比較したＤＩ－ＤＩＶ界面の重ね合わせ拡大図を示す。

【図4D】図４Ｄは、Ｃ末端にＧＦＰ－Ｆｌａｇタグを有するヒトＮａ_Ｘ－－ＱＴＴを発現するＨＥＫ２９３細胞からの、生理的（図４Ｄ左側のパネル）またはＮＭＤＧ^＋のみの細胞外溶液（図４Ｄの中央パネル）中の代表的な電流を示す。０ｍＶのＨＰから２０ｍＶの増分で＋８０から－１００ｍＶの間の工程。図４Ｄの右側のパネルは、独立した実験からのＩ－Ｖ曲線データの要約を示す。図４Ｅの左側のパネルは、細胞外溶液中に示された一価陽イオンを有するヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴを発現するＨＥＫ２９３細胞からの代表的な電流を示す。－８０ｍＶから＋８０ｍＶまでの電圧ランプを印加した。

【図4E】図４Ｅの右側パネルは、独立した実験から測定された逆転電位および透過率比の要約を示す。

【図5A】図５Ａ～Ｃは、ヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴチャネルの薬理作用を示す。図５Ａの左側のパネルおよび中央パネルは、細胞外溶液中に示された量のＣａＣｌ_２を含むか、または含まない、示された細胞外一価陽イオンを有するヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴを発現するＨＥＫ２９３細胞からの代表的なＩ－Ｖ電流を示す。－８０ｍＶから＋８０ｍＶまでの電圧ランプを印加した。図５Ａの右側のパネルは、８０ｍＶにおける示された濃度のＣａ^２＋による外向きＮａ^＋のブロックの割合を示す。

【図5B】図５Ｂは、０～＋８０ｍＶまで段階的に進めたときの、示された２価および３価の陽イオン（単位はｍＭ）を含むか、または含まない標準細胞外溶液中におけるヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴを発現するアフリカツメガエルの卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図5C】図５Ｃは、０～＋８０ｍＶ（左側のパネル）または０～－１００ｍＶ（右側のパネル）に段階的に進めた場合の、示された遮断薬を含むか、または含まない標準細胞外溶液中における、ヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴを発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。図５Ｃの中央パネルは、独立した実験から測定された電流の要約を示す。

【図6A】図６Ａ～図６Ｅは、非定型Ｎａ_Ｘ電圧センサ様ドメインの構造を示す。図６Ａは、ＶＳＬＤ１のゲート電荷（青）、ＨＣＳ（緑）、およびＥＮＣ／ＩＮＣ（赤）の側鎖を棒で示す。挿入図は、Ｎａ_Ｘ中のユニークなプロリンを強調しており、比較のためにＮａ_Ｖ１．７ＶＳＤ１（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）を重ね合わせている。

【図6B】図６Ｂは、図６Ａと同様にレンダリングされたＶＳＬＤ２を示す。挿入図は、Ｈｉｓ５７９－Ｓ４相互作用（図６Ｂの上部パネル）およびＳ４－Ｓ５リンカーの置換（図６Ｂの底部パネル）を強調しており、比較のためにＮａ_Ｖ１．７ＤＩＩ（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）を重ね合わせている。

【図6C】図６Ｃは、図６Ａと同様にレンダリングされたＶＳＬＤ３を示す。挿入図は、Ｓ３ヘリックスのＰｈｅ１０１１を強調している。

【図6D】図６Ｄは、図６Ａと同様にレンダリングされたＶＳＬＤ４を示す。挿入図は、Ｎａ_ＸおよびＮａ_Ｖ１．７ＶＳＤ４（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）の間のＳ４／Ｓ４－Ｓ５リンカー領域の比較を示し、ゲート電荷残基のＣαは青色の球として示されている。

【図6E】図６Ｅは、－１００ｍＶのＨＰから５ｍＶ刻みで－８０～＋６５ｍＶの間の脱分極工程に応答した、Ｎａ_Ｖ１．７および様々なＮａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘ－ＶＳＬＤを発現するアフリカツメガエルの卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図7A】図７Ａ～図７Ｆは、種々の発現系におけるヒトＮａ_Ｘの機能的評価を示す。図７Ａは、示された構築物を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したタンパク質の全溶解物および表面画分のウエスタンブロットを示す。

【図7B】図７Ｂは、示された電圧プロトコルで、ヒトＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖ１．７（Ｃ末端ＧＦＰおよびＦｌａｇタグを有する）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの代表的な電流を示す。

【図7C】図７Ｃは、示された構築物を発現するアフリカツメガエル卵母細胞から抽出されたタンパク質の全溶解物および表面画分のウエスタンブロットを示す。

【図7D】図７Ｄは、示された電圧プロトコルで、ヒトＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖ１．７を発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。

【図7E】図７Ｅは、示された構築物を発現するマウスＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞から抽出されたタンパク質の全溶解物および表面画分のウエスタンブロットを示す。

【図7F】図７Ｆは、示された細胞外Ｎａ＋濃度（ＨＰ＝－６０ｍＶ）下で、ヒトＮａ_Ｘ（＊、Ｃ末端ＧＦＰおよびＦｌａｇタグを有する）を発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞からの代表的な電流を示す。個々の細胞のシール抵抗（Ｒｍ）が提供される。

【図8A】図８Ａ～図８Ｄは、アフリカツメガエルの卵母細胞におけるヒトＮａ_Ｘの機能的評価を示す。図８Ａ（左側のパネル）および図８Ｂ（左側のパネル）は、細胞外溶液中に存在する示された薬理学的モジュレーターを有するヒトＮａ_Ｘを発現するアフリカツメガエルの卵母細胞からの代表的な電流を示す。図８Ａの右側のパネルは、０ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで、＋８０ｍＶ～－１００ｍＶの間の脱分極工程によるＩ－Ｖプロットを示す。

【図8B】図８Ｂの左側のパネルは、－１００ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで、－１００～＋１００ｍＶの間の脱分極工程によるＩ－Ｖプロットを示す。

【図8C】図８Ｃ（左側のパネル）および図８Ｄ（左側のパネル）は、示されたタンパク質が共発現されたヒトＮａ_Ｘを発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。図８Ｃの右側のパネルは、０ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで＋８０ｍＶ～－１００ｍＶの間の工程を有するＩ－Ｖプロットを示す。

【図8D】図８Ｄは、－１００ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで、－１００～＋１００ｍＶの間の脱分極工程を有するＩ－Ｖプロットを示す。

【図9】図９は、Ｎａ_ＸチャネルおよびＮａ_Ｖチャネルの多重配列アラインメントを示す。Ｎａ_Ｘドメイン境界を参照のために示す。Ｎａ_Ｘゲーティング電荷をアスタリスクで示し、選択性フィルタ残基を四角で囲む。Ｎａ_ＸＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーＩＦＩモチーフを３つの連続したアスタリスクで示す。

【図10A】図１０Ａ～図１０Ｃは、β３－Ｎａ_Ｘチャネルサンプルの精製を示す。図１０Ａは、β３－Ｎａ_Ｘ発現、精製および再構成スキームを示す。

【図10B】図１０Ｂは、脂質ナノディスク（ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１）中のβ３－Ｎａ_Ｘサンプルのサイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。図１０Ｃは、サイズ排除クロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図11A】図１１Ａ～図１１Ｌは、低温ＥＭデータ処理ワークフローを示す。図１１Ａは、β３－Ｎａ_Ｘ－ナノディスクサンプルの代表的な低温ＥＭ顕微鏡写真を示す。

【図11B】図１１Ｂは、代表的な２Ｄクラス平均を示す。

【図11C】図１１Ｃは、最終的な再構成における割り当てられた粒子配向の全体的な分布を示すヒートマップを示す。

【図11D】図１１Ｄは、２つのハーフデータセット間のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）に基づくグローバル分解能推定値を示す。

【図11E】図１１Ｅは、ウィンドウ化されたＦＳＣによって推定された、局所分解能によって色付けされた最終的な３Ｄ再構成の等表面レンダリングを示す。

【図11F】図１１Ｆは、ＤＩの膜貫通領域上に示される低温ＥＭマップを示す。

【図11G】図１１Ｇは、β３－Ｎａ_Ｘ界面活性剤（ＧＤＮ）サンプルの代表的な低温ＥＭ顕微鏡写真を示す。

【図11H】図１１Ｈは、代表的な２Ｄクラス平均を示す。

【図11I】図１１Ｉは、最終的な再構成における割り当てられた粒子配向の全体的な分布を示すヒートマップを示す。

【図11J】図１１Ｊは、２つのハーフデータセット間のフーリエシェル相関（ＦＳＣ）に基づくグローバル分解能推定値を示す。

【図11K】図１１Ｋは、ウィンドウ化されたＦＳＣによって推定された、局所解像度によって色付けされた最終的な３Ｄ再構成の等表面レンダリングを示す。

【図11L】図１１Ｌは、ＤＩの膜貫通領域上に示される低温ＥＭマップを示す。

【図12A】図１２Ａ～図１２Ｂは、低温ＥＭデータ処理ワークフローを示す。図１２Ａは、β３－ＮａＸ－ナノディスクサンプルの低温ＥＭデータ処理ワークフローの概略図を示す。

【図12B】図１２Ｂは、β３－Ｎａ_Ｘ界面活性剤サンプルの低温ＥＭデータ処理ワークフローの概略図を示す。

【図13A】図１３Ａ～図１３Ｆは、全体的なＮａ_Ｘ構造、β３相互作用、およびＮａ_Ｖチャネルとの比較を示す。図１３Ａは、β３－Ｎａ_Ｘ－ナノディスク複合体の低温ＥＭの再構築を示す。Ｎａ_ＸのＮＴＤ（Ｎ末端ドメイン）は細胞の内側にあり、β３サブユニットＥＣＤ（細胞外ドメイン）は細胞の外側にある。おおよその膜境界を示す。

【図13B】図１３Ｂは、β３－Ｎａ_Ｘ複合体の側面図を示す。挿入図は、Ｎａ_Ｘとのβ３相互作用を強調している。

【図13C-13E】図１３Ｃ～図１３Ｅは、様々な観点から、ヒトＮａ_Ｖ１．２（ＰＤＢ６Ｊ８Ｅ）、Ｎａ_Ｖ１．４（ＰＤＢ６ＡＧＦ）、Ｎａ_Ｖ１．５（ＰＤＢ６ＵＺ０）およびＮａ_Ｖ１．７（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）構造を、アライメントしたβ３－Ｎａ_Ｘの拡大図を示す。

【図13F】図１３Ｆは、Ｎａ_ＸのＤＩＶＷ１４８４側鎖およびＮａ_Ｖ１．７が重ね合わせられた中央キャビティの拡大図を示す（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）。Ｎａ_Ｖ１．７のＤＩＶ Ｐｈｅを棒表示で示す。

【図14A】図１４Ａ～図１４Ｆは、Ｎａ_ＸのＤＩＩＩ－ＤＩリンカー、ＤＩＩＩキメラチャネルおよび脂質結合細孔構造を示す。図１４Ａは、β３－Ｎａ_Ｘ－ナノディスク構造からのＤＩＩＩおよびＤＩＶの側面図および細胞内図を示し、ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーのＩＦＩモチーフを球で示し、Ｎａ_Ｖ１．７の等価領域（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）を比較のために示す。

【図14B】図１４Ｂは、ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー領域とＩＦＩ／ＩＦＭモチーフとの多重配列アラインメントを示す。

【図14C】図１４Ｃは、０ｍＶのＨＰからの２０ｍＶ刻みでの＋８０ｍＶ～－１００ｍＶの間の電圧段階、または－１００ｍＶのＨＰからの２０ｍＶの刻みでの－１００ｍＶ～＋１２０ｍＶの間の脱分極工程を有する、野生型またはＩＦＩ＞ＱＱＱ変異型ヒトＮａ_Ｘを発現する卵母細胞からの代表的な電流を示す。Ｉ－Ｖプロットを図１４Ｃの右側のパネルに示す。

【図14D】図１４Ｄは、０ｍＶのＨＰから２０ｍＶ刻みで、＋８０ｍＶ～－１００ｍＶの間の電圧工程に応答した、様々なＤＩＩＩＩヒトＮａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘチャネルキメラを発現する卵母細胞からの概略電流および代表電流を示す。図１４Ｄ、右側のパネル、様々なＤＩＩＩＮａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘキメラの＋８０ｍＶ（上段のパネル）および－１００ｍＶ（下段のパネル）での最大電流振幅。

【図14E】図１４Ｅは、ゲートライニング側鎖を有するβ３－Ｎａ_Ｘ－ナノディスクＳ６－ゲート構造の側面図を棒で示し、半透明表面表示および割り当てられたホスファチジルエタノールアミンを棒で示す。

【図14F】図１４Ｆは、β３－Ｎａ_Ｘナノディスクおよびβ３－Ｎａ_Ｘ界面活性剤ベースの構造を細孔内に割り当てられた脂質と比較した細孔の上面図を棒表示で示す。低温－ＥＭマップを、β３－ＮａＸ－ＧＤＮ構造のメッシュ表現でモデル化脂質の周りに示す。

【図15A】図１５Ａ～図１５Ｃは、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタおよびＮａ_Ｖ１．７選択性フィルタの構造および比較を示す。図１５Ａは、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタおよびＮａ_Ｖ１．７（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）選択性フィルタの等価図を示す。Ｎａ_Ｖ１．７中で結合したテトロドトキシンを選択された相互作用と共に示す。

【図15B】図１５Ｂは、１１５ｍＭの細胞外Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋またはＣｓ＋の存在下で野生型または変異型ヒトＮａ_Ｖ１．７およびＮａ_Ｘチャネル構築物を発現するアフリカツメガエルの卵母細胞からの代表的な電流を示す。－１００ｍＶのＨＰからの－５０ｍＶ～＋５０ｍＶの間の工程（１０ｍＶ工程）を示す。

【図15C】図１５Ｃは、塩化物（Ｃｌ－）イオン（メタンスルホネートで置換、ＭＳ－）の存在下（左）または非存在下（右）における－８０ｍＶから＋８０ｍＶへの電圧勾配に応答した、ヒトＮａ_Ｘ－ＱＴＴを発現する（Ｃ末端ＧＦＰ－Ｆｌａｇタグを含有する）ＨＥＫ２９３細胞からの代表的な電流を示す。

【図16A】図１６Ａ～図１６Ｅは、Ｎａ_Ｘ電圧センサ様ドメインの構造および比較を示す。図１６Ａは、Ｎａ_Ｖ１．７ＶＳＤ４（ＰＤＢ６Ｊ８Ｊ）およびＮａ_ＸＶＳＬＤ４の等価図を示し、ゲーティング電荷側鎖を棒で示し、Ｒ３～Ｒ５を参照用のために標識している。

【図16B】図１６Ｂは、野生型Ｎａ_Ｖ１．７および様々な変異体チャネルの活性化および定常状態不活性化の電圧依存性を示す。活性化、電流は、－１００ｍＶのＨＰから５ｍＶの刻みで、－８０から＋６５ｍＶの間の脱分極工程後に得られた。不活性化では、－１００ｍＶのＨＰからの一連の調整パルス（－１２０から－１０ｍＶの間、５ｍＶ刻み、５００ｍｓ）の後、０または－２０ｍＶ（２５ｍｓ）での試験パルス中に電流が得られた。正規化された活性化曲線および不活性化曲線を電流トレースの右側に示す。

【図16C】図１６Ｃは、Ｎａ_ＸＶＳＤＬ３およびＫＣＮＱ１ＶＳＤ（ＰＤＢ６ＵＺＺ）を重ね合わせ、Ｎａ_ＸゲーティングチャージおよびＨＣＳを棒で示す。Ｎａ_ＸＳ３Ｆ１１０１およびＫＣＮＱ１由来の対応するＳ３セリンを表面表示で示す。この位置は、全てのヒトＮａ_Ｖチャネルにおいてセリンとしても保存されていることに留意されたい。

【図16D】図１６Ｄは、Ｎａ_ＸＶＳＤＬ４の図を示し、ヒトＮａ_ＶチャネルＶＳＤ４配列と比較した場合に独特であるプロリン側鎖を強調している。

【図16E】図１６Ｅは、野生型Ｎａ_Ｖ１．５およびトリプルプロリンＶＳＤ４変異体チャネルの活性化および定常状態不活性化の電圧依存性を示す。活性化、電流は、－１００ｍＶのＨＰから５ｍＶの刻みで、－８０から＋４０ｍＶの間の脱分極工程後に得られた。不活性化では、－１００ｍＶのＨＰからの一連の調整パルス（－１２０から－１０ｍＶの間、５ｍＶ刻み、５００ｍｓ）の後、０または－２０ｍＶ（２５ｍｓ）での試験パルス中に電流が得られた。正規化された活性化曲線および不活性化曲線を電流トレースの右側に示す。

【図17A】図１７Ａ～図１７Ｂは、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタおよびＳ６ゲート領域の構造および比較を示す。図１７Ａは、低温ＥＭマップ（メッシュ）の一部および球としてモデル化されたＮａ＋イオンと共に示されるＮａ_Ｘ中の推定イオン結合部位（ＤＥＥモチーフ）を有する選択性フィルタの拡大図を示す。比較のために、Ｎａ_Ｖ１．２（ＰＤＢ６Ｊ８Ｅ）およびＮａ_ＶＰａＳ（ＰＤＢ６ＮＴ４）のＤＥＥモチーフ結合部位に割り当てられたＮａ＋イオンを示す。

【図17B】図１７Ｂは、Ｔｙｒ１４９１（Ｓ６）および結合したホスファチジルエタノールアミンを示し、Ｎａ_Ｖ１．４（非導電性の不活性化状態にあると仮定される；ＰＤＢ６ＡＧＦ）および薬物結合Ｎａ_Ｖ１．５（非導電性の薬物遮断状態にあると仮定される；ＰＤＢ６ＵＺ０）と比較したＮａ_ＸＳ６ゲートの細胞内図を示す。割り当てられた脂質、界面活性剤および薬物分子（ＰＥ、ＧＤＮまたはフレカイニド）は、それぞれ棒表示として示されている。

【図18】図１８は、構築物１～２５を発現するアフリカツメガエルの卵母細胞の電流振幅を示す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；１元配置ＡＮＯＶＡ、Ｎａ_Ｘに対するＤｕｎｎｅｔｔ検定。）

【図19A】図１９Ａ～図１９Ｂは、Ｎａ_Ｘチャネルの構造を示す。図１９Ａでは、ＤＩＩＩ＋ＤＩＩＩ－ＩＶリンカー（９２０～１２３７）が示されている。

【図19B】図１９Ｂには、Ｓ６ゲート領域が示されている。

【図20】図２０は、Ｎａ_ＸチャネルＳ６セグメント（部分）およびＮａ_Ｖチャネルの多重配列アラインメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0026】

Ｉ．定義
別段定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。本開示に従って利用される場合、以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：

【0027】

本願において、「または」の使用は、別段述べられない限り、「および／または」を意味する。多数項従属請求項の文脈では、「または」の使用は、１つよりも多くの先行する独立請求項または従属請求項のいずれかのみを指す。また、「要素」または「構成成分」などの用語は、特に明記しない限り、１つの単位を含む要素および構成成分と、１つよりも多くのサブユニットを含む要素および構成成分の両方を包含する。

【0028】

本明細書で用いられる場合の「～から本質的になる」という移行用語は、特許請求されたプロセスの工程に言及する場合、そのプロセスが、プロセスの基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えるであろう特定の工程を超える追加の工程を含まないことを意味する。本明細書で用いられる場合の「～から本質的になる」という移行用語は、組成物または製品、例えばキットに言及する場合、その基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えるであろう指定された成分を超えて追加の成分を含まないことを意味する。

【0029】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。

【0030】

本明細書に記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、または整数範囲は、別途指示がない限り、列挙された範囲内のあらゆる整数、および適切な場合には、それらの分数（整数の１０分の１および１００分の１など）の値を含むと理解されるべきである。

【0031】

単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（ＳＩ）で受け入れられている形式で示されている。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって有し得る本開示の種々の態様の限定ではない。したがって、以下に定義される用語は、明細書全体を参照することによってさらに詳細に定義される。

【0032】

本明細書に記載される全てのタンパク質は、「哺乳動物Ｎａ_Ｖ」などの語句のように、特に明記されない限り、ヒトタンパク質である。「哺乳動物」タンパク質としては、ヒトタンパク質ならびに他の哺乳動物種由来の同等のタンパク質が挙げられる。

【0033】

本明細書に記載される「Ｎａ_Ｖ」タンパク質または「Ｎａｖ」もしくは「ＮａＶ」タンパク質は、電位依存性ナトリウムチャネルタンパク質ファミリーのメンバーである。ヒトおよび他の哺乳動物におけるＮａ_Ｖファミリーメンバーの例としては、Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８およびＮａｖ１．９が挙げられる。ヒトＮａ_Ｖファミリーメンバータンパク質は、４つのドメイン（ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩ、ＤＩＶ）を含み、それぞれが６つの膜貫通アルファヘリックス（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６）を含み、いくつかの例では、ドメイン内の特定のアルファヘリックスの間および４つのドメインの間にループまたはリンカーを有し、合計２４個の膜貫通アルファヘリックスを含む。

【0034】

本明細書に記載される「Ｎａ_Ｘ」イオンチャネルタンパク質または「Ｎａ_Ｘ」もしくは「Ｎａ_Ｘ」タンパク質は、電位依存性ナトリウムチャネルタンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｎａｖ２．１またはｓｃｎ７ａとしても知られている。特に明記しない限り、「Ｎａ_Ｘ」タンパク質は「ヒトＮａ_Ｘ」タンパク質を意味する。ヒトＮａ_Ｘタンパク質は、中枢神経系ならびに皮膚および他の上皮においてもナトリウムセンサとして作用することが報告されている。野生型ヒトＮａ_Ｘのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔデータベース（受け入れ番号Ｑ０１１１８）に提供されており、本明細書では配列番号１として提供される。ヒト_Ｘタンパク質はまた、タンパク質の天然に存在するバリアントを含み、その例は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースの番号Ｑ０１１１８にも見出され得る。ヒトＮａ_Ｖタンパク質と同様に、ヒトＮａ_Ｘは、各々が６つの膜貫通アルファヘリックス（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６）を含む４つのドメイン（ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩ、ＤＩＶ）を含む。

【0035】

本明細書で使用される場合、「変異型ヒトＮａ_Ｘ」は、配列番号１の野生型Ｎａ_Ｘタンパク質と比較して、少なくとも１つの操作されたアミノ酸の置換、挿入または欠失を含むヒトＮａ_Ｘタンパク質を指す。いくつかの例では、「変異型ヒトＮａ_Ｘ」は、野生型ヒトＮａ_Ｘの少なくとも１つの残基が哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖの同等／対応する残基で置換されている少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの例では、野生型ヒトＮａ_Ｘの領域または完全ドメインは、哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖの同等の領域またはドメイン、例えばＤＩＩＩおよび／またはＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーの一部または全部で置換されている。そのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、種々のタンパク質、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のアミノ酸配列セグメントを含むので、本明細書では代替的に「キメラヒトＮａ_Ｘ」または「キメラＮａ_Ｘ」または「キメラ」と呼ぶことがある。

【0036】

本明細書における「キメラ」という用語は、タンパク質に言及する場合、タンパク質が２つ以上の天然タンパク質由来のアミノ酸配列で構成されていることを意味する。例えば、上記のように、本明細書で使用される場合、「キメラヒトＮａ_Ｘ」は、Ｎａ_Ｘタンパク質の少なくとも１つの領域がヒトＮａ_Ｖファミリーメンバータンパク質由来の対応する領域と交換されている変異型ヒト_Ｘの一種を指す。

【0037】

本明細書における「キメラ」という用語は、タンパク質に言及する場合、タンパク質が２つ以上の天然タンパク質由来のアミノ酸配列で構成されていることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「キメラヒトＮａ_Ｘ」は、Ｎａ_Ｘタンパク質の少なくとも１つの領域が、ヒトまたは哺乳動物ＮａＶ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８、またはＮａｖ１．９などの哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖファミリーメンバータンパク質などのＮａ_Ｖファミリーメンバータンパク質由来の対応する領域と交換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを指す。いくつかの例では、交換領域は、完全なドメイン、または１つ以上の個々の膜貫通アルファヘリックスもしくはドメイン内のリンカー領域もしくはループの１つ、またはドメイン内のαヘリックスおよび／もしくはループの一部であり得る。

【0038】

本明細書で使用される場合、「対応する」または「等価な」という用語は、変異体またはキメラヒトＮａ_Ｘの作製においてヒトＮａ_Ｘから欠失した残基または領域を置換するヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質由来の残基または領域を指す場合に互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「対応する」または「等価な」残基または領域が、適切に折り畳まれたときに２つのタンパク質内の同じ位置にある残基または領域である。いくつかの例では、そのような対応するまたは等価な領域またはアミノ酸残基は、２つのタンパク質の配列アラインメントおよび構造情報を使用して同定され得る。

【0039】

本明細書で使用される場合、「モジュレーター」は、ヒトＮａ_Ｘのようなイオンチャネルタンパク質などのタンパク質の挙動を変化させ得る分子を指す。例えば、いくつかの例では、モジュレーターは、タンパク質に結合することによって標的タンパク質の挙動を変化させ得る。本明細書のモジュレーターは、例えば、タンパク質が細胞膜を横切るイオンの流れを調節する程度など、タンパク質の活性を増加または減少させるように作用し得る。ヒトＮａ_Ｘの活性を低下させるモジュレーターは、例えば、ヒトＮａ_Ｘ活性の「阻害剤」である。ヒトＮａ_Ｘの活性を増加させるモジュレーターは、例えば、ヒトＮａ_Ｘ活性の「活性化因子」である。いくつかの実施形態では、モジュレーターは、特定のイオンの存在下または特定の二次分子の存在下などの特定の条件下でのみ、ヒトＮａ_Ｘの活性を調節し得る。

【0040】

本明細書で使用される場合、ヒトＮａ_Ｘの「潜在的モジュレーター」は、ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターとして作用するかどうかを決定するために試験される分子である。

【0041】

本明細書における「イオンチャネルアッセイ」は、電位依存性ナトリウムチャネルなどのイオンチャネルタンパク質の活性を測定するために使用されるアッセイを指す。様々なアッセイおよびアッセイ形式が当技術分野で通常使用されており、その多くはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）分析のための自動化された形式で提供されている。例としては、例えば放射性Ｎａ^＋イオンなどの放射性イオンを使用するイオンフラックスアッセイ、例えば蛍光シグナルがイオン濃度の変化と共に増加または減少する蛍光指示薬分子を使用する蛍光アッセイなどのイオン感受性または電圧感受性色素アッセイ、および様々な種類のパッチクランプアッセイが挙げられる。そのようなアッセイは、様々な条件でイオンチャネルタンパク質を含む膜を横切るイオン電流の変化を直接的または間接的に測定し得る。いくつかの例では、そのようなアッセイを使用して、潜在的なまたは同定されたモジュレーターの存在下または非存在下でイオンチャネルタンパク質の「活性」を評価する。この意味における「活性」という用語は、これらの種々のアッセイが直接的または間接的に、蛍光、放射能、またはイオン電流の変化などの種々のパラメータの測定を通じてタンパク質の活性を測定することを考えると、最も広い意味での活性を意味する。

【0042】

「パッチクランプアッセイ」は、本明細書では最も広い意味で使用され、例えば、種々の溶液条件下でＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖなどのイオンチャネルタンパク質を含有する細胞膜の小さなパッチを横切るイオンの動きの変化を評価するために使用されるアッセイを指す。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２～５０個、２～１５個、２～１０個、２～８個、または６～１４個のアミノ酸のアミノ酸鎖を含む、ペプチド結合によって連結された５０アミノ酸以下の鎖を指す。

【0044】

本明細書で使用される「小分子」という用語は、５０ダルトン～２５００ダルトンの分子量を有する有機分子を指す。

【0045】

本明細書で使用される場合、「大環状化合物」または「大環状分子」という用語は、環状化合物または高分子の高分子環状部分を指す。大環状化合物のサイズは５００ダルトン～７５００ダルトンの範囲である。本明細書のいくつかの例では、大環状化合物は環状ペプチドまたはペプチド誘導体である。

【0046】

本明細書で使用される場合、「結合断片」という用語は、標的タンパク質と直接接触すると予想される、小分子、ペプチド、または抗体などのより大きな分子の一部を指す。結合断片は、高スループットスクリーニングに使用され得る。

【0047】

本開示において、「結合する」または「結合」または「特異的結合」および同様の用語は、例えばＮａ_ＸまたはＮａ_Ｖタンパク質などのタンパク質に「結合する」分子に言及する場合、結合親和性が十分に強く、結合対のメンバー間の相互作用がランダムな分子会合（すなわち、「非特異的結合」）によるものであり得ないことを意味する。したがって、結合は選択的または特異的である。

【0048】

本明細書で使用される場合、「競合アッセイ」という用語は、試験されている分子が共通の標的への参照分子の特異的結合を防止または阻害するアッセイを指す。

【0049】

他の定義は、以下のセクションに適宜含まれる。

【0050】

ＩＩ．変異型ＮＡ_Ｘタンパク質
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質を含む。

【0051】

ヒトＮａ_Ｘは、電位依存性ナトリウムチャネルタンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｎａｖ２．１またはｓｃｎ７ａとしても知られている。タンパク質のゲノムおよびアミノ酸配列に関する情報は、例えば、受け入れ番号Ｑ０１１１８のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに見出し得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列を含むヒトＮａ_Ｘのアミノ酸配列は、配列番号１のものである。ヒトＮａ_Ｘタンパク質は、中枢神経系ならびに皮膚および他の上皮においてもナトリウムセンサとして作用することが報告されている。ヒトＮａ_ＸおよびＮａ_Ｖタンパク質は、各々が６つの膜貫通アルファヘリックス（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５，Ｓ６）を含む４つのドメイン（ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩ、ＤＩＶ）を含む。これらのドメイン内には、以下の表１に記載されるように、それぞれ対応するアミノ酸残基位置を有するさらなる領域がある。例えば、各ドメインはまた、「電位センサドメイン」または「ＶＳＤ」（例えば、ＶＳＤ１、ＶＳＤ２、ＶＳＤ３、ＶＳＤ４）または「電位センサ様ドメイン」または「ＶＳＬＤ」（例えば、ＶＳＬＤ１、ＶＳＬＤ２、ＶＬＳＤ３、ＶＳＬＤ４）は、Ｓ１－Ｓ４ヘリックスおよびそれらの介在リンカーまたはループを含み、これらは、タンパク質の細胞外面または細胞内面に存在し、例えば、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５とＳ６との間の細孔形成選択性フィルタループを含む、アルファヘリックス間の特異的リンカーまたはループ；および４つのドメイン間のリンカーを含む。配列番号１のヒトＮａ_Ｘの特定のヘリックス、リンカー、ループおよび他の領域は以下に示す通りである。

【表1】

【0052】

本開示は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基が野生型哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖの少なくとも１つの対応する残基で置換された変異型ヒトＮａ_Ｘを含む。いくつかの例では、野生型ヒトＮａ_Ｘの領域または完全ドメインは、哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖの同等の領域またはドメイン、例えばＤＩＩＩまたはＤＩＩＩ／ＤＩＶリンカーの一部または全部で置換される。そのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、種々のタンパク質、哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖ由来のアミノ酸配列セグメントを含むので、本明細書では代替的に「キメラヒトＮａ_Ｘ」または「キメラＮａ_Ｘ」または「キメラ」と呼ばれることがある。いくつかの例では、置換された残基または領域は、哺乳動物またはヒトＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８またはＮａｖ１．９に由来する。いくつかの例では、置換された残基または領域は、ヒトＮａ_Ｖに由来し、例えば、ヒトＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、Ｎａｖ１．６、Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８またはＮａｖ１．９に由来し、例えば、ヒトＮａｖ１．７に由来する。

【0053】

いくつかの実施形態では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されている。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。例えば、いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている。いくつかのこのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。（以下の表４および図１８を参照されたい。）

【0054】

他の例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、そのＳ６セグメントの１つ、２つ、３つ、または４つ全てのアミノ酸残基の、極性残基もしくは荷電残基またはグリシン残基もしくはプロリン残基による少なくとも１つの置換を有する。いくつかの場合、置換残基は極性または荷電している。例示的な極性アミノ酸残基としては、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンが挙げられる。例示的な荷電アミノ酸残基としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンおよびアルギニンが挙げられる。これらのアミノ酸置換は、Ｓ６セグメントの１つ、２つ、３つ、または４つ全て（すなわち、膜二重層の半分まで）の細胞内から中膜貫通領域におよび得る。変異を設計するためのＮａ_Ｘ膜貫通セグメントの予測は、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から入手可能な実験構造およびＮａ_Ｖチャネルを用いた標準的な構造ベースのマルチシーケンスアラインメント（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ）に基づいて行い得る。図２０は、ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩおよびＤＩＶのそれぞれのＳ６におけるヒトＮａ_Ｘにおけるアミノ酸置換の潜在的な位置、ならびに他のヒトＮａ_Ｖタンパク質における対応する残基とのそれらのアラインメントを示す。各配列の右側の破線のボックスによって示されるように、アミノ酸置換は、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９もしくはＩ１４９２のいずれか１つで、またはいずれかの方向に７残基までの任意の残基で、例えば残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）で行われ得る。したがって、いくつかの実施形態では、Ｄ１のＳ６、ＤＩＩのＳ６、ＤＩＩＩのＳ６、およびＤＩＶのＳ６の少なくとも１つは、グリシン、プロリン、極性または荷電残基による上記範囲内のアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含む。

【0055】

いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの１つの少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の４つ全てのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、変異型ヒトＮａ_Ｘタンパク質は、イオンチャネルアッセイで活性である。例えば、いくつかの例では、イオンチャネルアッセイは、アフリカツメガエル卵母細胞において変異タンパク質を発現させることを含む。いくつかのそのような場合、０ｍＶの保持電位から＋８０ｍＶまたは－１００ｍＶで誘発された構築物を発現するアフリカツメガエルの卵母細胞の電流の振幅は、ヒトＮａ_Ｘ野生型を発現する卵母細胞からの振幅よりも有意に高い。（いくつかの活性型および不活性型の変異型ヒトＮａ_Ｘタンパク質構築物の例示については図１８を参照されたい（アスタリスクは統計学的有意性を示す。）。

【0057】

ＩＩＩ．変異型ヒトＮＡ_Ｘタンパク質を使用するスクリーニング方法
本開示はまた、特に、例えばイオンチャネルアッセイおよび／または結合アッセイにおいて、変異型ヒトＮａ_Ｘに対する潜在的なモジュレーターをスクリーニングすることを含む、ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターとして作用する分子を同定する方法を包含する。

【0058】

いくつかの実施形態では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されている。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１－Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。例えば、いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている。いくつかのこのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。（以下の表４および図１８を参照されたい。）

【0059】

本発明は、ヒトＮａ_Ｘイオンチャネルタンパク質（Ｎａ_Ｘ）モジュレーターを同定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）潜在的モジュレーターの存在下で、変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および（ｃ）潜在的モジュレーターの存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が潜在的モジュレーターの非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合に、潜在的モジュレーターをヒトＮａ_Ｘモジュレーターとして同定する工程を含む、方法をも包含する。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの１つの少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含むいくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の４つ全てのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。

【0060】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質、例えばヒトＮａ_Ｖタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分と置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｃ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｄ）パート（ｃ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0061】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質、例えばヒトＮａ_Ｖタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）試験分子がヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、（ｂ）ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部がヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分と置換されている変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｃ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、および（ｄ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｅ）パート（ｄ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部が、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖタンパク質（Ｎａ_Ｖ）のＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されている。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_Ｖ由来のＤＩＩＩＳ１～Ｓ６領域の全部または一部を含み、場合により、置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、（ａ）ＤＩＩＩ（残基９２０～１２００）、（ｂ）ＤＩＩＩ電圧センサドメインＩＩＩ（ＶＳＤ３）およびＳ４－Ｓ５リンカー（残基９２０～１０５８）、（ｃ）ＤＩＩＩ ＶＳＤ３、Ｓ４－Ｓ５リンカーおよびＳ５（残基９２０～１０７８）、（ｄ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカー（残基７３３～１２００）、（ｅ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（９２０～１２３７）、（ｆ）ＤＩＩＩおよびＤＩＩ－ＤＩＩＩリンカーおよびＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカー（７３３～１２３７）を含む。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ５を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分によって置換されているヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ６を含まない。いくつかの例では、ヒトまたは哺乳動物Ｎａ_ＶのＤＩＩＩドメインの対応する部分で置換されたヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４および／またはＳ４－Ｓ５リンカーのいずれをも含まない。いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、哺乳動物Ｎａｖ１．１、哺乳動物Ｎａｖ１．２、哺乳動物Ｎａｖ１．３、哺乳動物Ｎａｖ１．４、哺乳動物Ｎａｖ１．５、哺乳動物Ｎａｖ１．６、哺乳動物Ｎａｖ１．７、哺乳動物Ｎａｖ１．８、哺乳動物Ｎａｖ１．９、ヒトＮａｖ１．１、ヒトＮａｖ１．２、ヒトＮａｖ１．３、ヒトＮａｖ１．４、ヒトＮａｖ１．５、ヒトＮａｖ１．６、ヒトＮａｖ１．７、ヒトＮａｖ１．８またはヒトＮａｖ１．９の対応する部分で置換されている。例えば、いくつかの例では、ヒトＮａ_ＸのＤＩＩＩドメインの少なくとも一部は、ヒトＮａｖ１．７の対応する部分で置換されている。いくつかのこのような例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、キメラ構築物２、キメラ構築物３、キメラ構築物７、キメラ構築物９、キメラ構築物１１、キメラ構築物１５もしくはキメラ構築物１９であるか、または配列番号３、４、８、１０、１２、１６もしくは２０のいずれか１つのアミノ酸配列である。（以下の表４および図１８を参照されたい。）

【0063】

本開示は、また、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性を調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｂ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｃ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、場合により、（ｄ）パート（ｃ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法を含む。

【0064】

本開示は、ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節する試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する方法であって、（ａ）試験分子がヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することを決定する工程、（ｂ）ヒトＮａ_Ｘの２つ、３つまたは４つのＳ６アルファヘリックスのそれぞれの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む変異型ヒトＮａ_Ｘを提供する工程、（ｃ）試験分子の存在下で変異型ヒトＮａ_Ｘに対してイオンチャネルアッセイを実施する工程、（ｄ）試験分子の存在下でのアッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性が、試験分子の非存在下での活性よりも高いかまたは低い場合、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターであると決定する工程を含み、（ｅ）パート（ｄ）により、試験分子がヒトＮａ_Ｘモジュレーターでない場合、追加のスクリーニングのために試験分子を選択する工程を含む方法をさらに含む。

【0065】

いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの１つの少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスのうちの２つの上にある少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの３つの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つ全てのＳ６アルファヘリックスの上の少なくとも１つの残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、４つのＳ６アルファヘリックスの少なくとも３つの上のアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による１つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、配列番号１の以下のセグメント：残基３８３～３９７（ドメインＩ（Ｄ１）のＳ６中）、残基７１７～７３１（ＤＩＩのＳ６中）、残基１１８２～１１９６（ＤＩＩＩのＳ６中）および／または残基１４８５～１４９９（ＤＩＶのＳ６中）のそれぞれの中に、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基によるアミノ酸残基の１つまたは２つの置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの２つ以上におけるアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２のうちの３つのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、アミノ酸残基Ｌ３９０、Ｆ７２４およびＩ１１８９の、またはアミノ酸残基Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の、グリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｆ７２４Ｑ、Ｉ１１８９ＴおよびＩ１４９２Ｔを含む。いくつかの例では、ヒトＮａ_Ｘは、野生型ヒトＮａ_Ｘと比較した置換Ｌ３９０Ｅ、Ｉ１１８９ＥおよびＩ１４９２Ｅを含む。いくつかの例では、変異型ヒトＮａ_Ｘは、残基Ｌ３９０、Ｆ７２４、Ｉ１１８９およびＩ１４９２の４つ全てのアミノ酸残基のグリシン、プロリンまたは極性もしくは荷電残基による置換を含む。

【0066】

ヒトイオンチャネルタンパク質の活性を調節することが知られているか、または発見された試験分子がヒトＮａ_Ｘイオンチャネル（Ｎａ_Ｘ）タンパク質の活性も調節するかどうかを決定する特定の方法では、方法を対抗選択として使用し得る。例えば、実験者が、特定のＮａ_Ｖタンパク質のモジュレーターがそのＮａ_Ｖタンパク質および／または関連するＮａ_Ｖタンパク質に特異的であることを確実にしたい場合、実験者は、本明細書の方法を実施して試験分子が変異型ヒトＮａ_Ｘのモジュレーターではないことを確認し得る。

【0067】

上記の方法のいずれにおいても、イオンチャネルアッセイは、例えば、イオンチャネルとしての変異型Ｎａ_Ｘタンパク質の活性を検出するために使用される任意の適切なアッセイであり得る。例としては、自動パッチクランプアッセイ、イオンフラックスアッセイ、およびイオンまたは電圧感受性色素アッセイを含むパッチクランプアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアッセイは、例えば、Ｈ．Ｙｕら，“ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎｉｃａ３７：３４－４３（２０１６）に記載されており、材料は、商業的製造業者から入手可能である。イオンフラックスアッセイでは、例えば、ナトリウム２２（^２２Ｎａ^＋）などの放射性同位体を使用して、ナトリウムイオンまたは他のイオンの細胞流入および流出を追跡し得る。別のタイプのアッセイは、電圧感受性またはイオン感受性色素アッセイである。電圧感受性色素アッセイでは、イオンチャネルタンパク質を含む膜を横切る電圧変化は、例えばビス－（１，３－ジブチルバルビツール酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ_４）またはＦＭＰなどのオキソノール誘導体などの色素を使用し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して測定される。いくつかの例では、ＦＲＥＴ色素は、膜に局在化または結合され得る。イオン感受性色素アッセイは、イオン濃度に応じてシグナルの差を示す色素を使用し得る。一例は、ナトリウム指示薬色素ＳＢＦＩである。他の実施形態では、パッチクランプアッセイをスクリーニング方法に使用し得る。いくつかの実施形態では、自動パッチクランプアッセイを使用し得る。パッチクランプアッセイを実施するための例示的なプラットフォームおよび機器は、いくつかの製造業者によって販売されている。プラットフォームアッセイの例としては、ＩｏｎＷｏｒｋｓ（商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｓｓａｙｓ、ＰａｔｃｈＸｐｒｅｓｓ（商標）およびＩｏｎＦｌｕｘ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）、Ｑｐａｔｃｈ（商標）ＨＴ／ＨＴＸ（Ｓｏｐｈｉｏｎ）、ならびにＰａｔｃｈｌｉｎｅｒ（商標）およびＳｙｎｃｈｒｏＰａｔｃｈ（商標）（Ｎａｎｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられる。

【0068】

上記の方法のいずれにおいても、当該方法において同定された潜在的モジュレーターは、変異型ヒトＮａｘの活性を調節し、例えば、野生型ヒトＮａｘの活性よりも低いか、または高い活性を有する。いくつかの例では、潜在的モジュレーターは、野生型ヒトＮａ_Ｘの活性よりも低い活性を有するなど、変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を低下させる。いくつかの例では、活性は、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低下し得る。いくつかの例では、モジュレーターの存在下での変異型ヒトＮａ_Ｘの活性は、例えば、モジュレーターの非存在下での変異型ヒトＮａｘの活性の１～９０％、１０～９０％、１～１０％、１～２０％、２５～９０％、５０～９０％、２５～７５％、４０～８０％、または５０～７５％であり得る。いくつかの例では、アッセイで同定された潜在的モジュレーターは、１０ｎＭ～５００μＭ、５０ｎＭ～５００μＭ、１０ｎＭ～５０μＭ、１００ｎＭ～５００μＭ、１００ｎＭ～５０μＭ、１～５００μＭ、１～５０μＭ、１０～５００μＭまたは５０～２５０μＭの最大半値濃度でアッセイにおいて変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を低下させる。

【0069】

他の例では、アッセイで同定された潜在的モジュレーターは、例えば野生型ヒトＮａ_Ｘの活性よりも高い活性を有するなど、アッセイにおける変異型ヒトＮａ_Ｘの活性を増加させる。いくつかの例では、活性は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも１００％（すなわち、２倍）、最大１００％、または最大３倍増加し得る。いくつかの例では、モジュレーターの存在下での変異型ヒトＮａ_Ｘの活性は、例えば、モジュレーターの非存在下での変異型ヒトＮａｘの活性よりも１０～１００％、１０～８０％、２０～８０％、２５～１００％、２５～７５％、５０～１００％、２～３倍または１００～２００％高い場合がある。

【0070】

上記の方法のいずれにおいても、イオンチャネルアッセイはまた、変異型ヒトＮａ_Ｘの潜在的モジュレーターおよび同定されたモジュレーターの両方の存在下で行われ得る。例えば、そのような場合、同定されたモジュレーターがタンパク質の活性を変化させるために潜在的モジュレーターと競合するかどうかを決定し得る。いくつかのそのような場合では、変異型ヒトＮａ_Ｘの同定されたモジュレーターは、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、キニジン、フレカイニド、テトラカインまたはリドカインの１以上である。

【0071】

上記の方法のいずれもまた、変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に対するアッセイにおいて、ならびにキメラヒトＮａ_Ｘの場合、置換アミノ酸が由来する哺乳動物またはヒトＮａ_Ｖタンパク質に対する、アッセイにおいて同定された潜在的モジュレーターの結合親和性を決定することをさらに含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、例えば、ビーズ、プレートなどの固体表面などのマトリックス上の脂質で安定化した形態の変異型ヒトＮａ_Ｘタンパク質を使用して、結合親和性を決定し得る。ビーズは、薄片またはチップ、球、ペレットなどの任意の形状を有し得る。いくつかの実施形態では、そのようなビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズ、アビジン被覆ビーズ、または脱グリコシル化アビジン被覆ビーズである。いくつかの実施形態では、そのようなビーズは磁性ビーズである。いくつかの例では、潜在的モジュレーターは、変異型ヒトＮａ_Ｘおよび野生型ヒトＮａ_Ｘのいずれかまたは両方に、１０μＭ以下、１０μＭ～５０ｎＭ、１０μＭ～５００ｎＭ、１μＭ以下、１μＭ～５０ｎＭ、または１００ｎＭ以下のＥＣ５０またはＩＣ５０で結合する。

【0072】

いくつかの実施形態では、例えば、分子の他の生物学的活性を決定するために、上記のスクリーニングで選択された分子に対してさらなる実験を実施し得る。例えば、さらなるアッセイを使用して、分子がヒトまたは哺乳動物のＮａ_Ｖタンパク質などの他のイオンチャネルタンパク質にも結合するかどうかを決定し、結果としてイオンチャネルモジュレーターまたは結合剤としての分子の特異性を決定し得る。例えば、キメラヒトＮａ_Ｘを使用する方法では、さらなるアッセイを実施して、分子が、変異型Ｎａ_Ｘのキメラ部分が由来するＮａ_Ｖタンパク質の活性をも調節するかどうか、または分子がそのＮａ_Ｖタンパク質に結合するかどうかを決定し得る。

【0073】

ＩＶ．スクリーニング方法のための試験分子
上記の方法のいずれにおいても、潜在的モジュレーター（すなわち、試験分子）は、ペプチドまたは大環状分子または抗体であり得る。例えば、いくつかの例では、潜在的モジュレーターは小分子である。

【0074】

本開示はまた、本明細書に記載の方法によって同定されるヒトＮａ_Ｘのモジュレーターに関し、このモジュレーターは、場合によりペプチド、大環状分子、小分子または抗体であり得る。

【0075】

いくつかの実施形態では、試験される潜在的モジュレーター分子はペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１４量体ペプチド、例えば６～１２量体、６～１０量体、６～８量体、８～１２量体、８～１０量体などである。スライド１０を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１４量体である。スライド１５～１６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは６～１０量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは８～１０量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは６～８量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは８量体である。スライド２１～２２を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、３～４０量体、３～２０量体、４～１６量体、４～１４量体、または６～１４量体、例えば３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体、１７量体、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、２４量体、２５量体、２６量体、２７量体、２８量体、２９量体、３０量体、３１量体、３２量体、３３量体、３４量体、３５量体、３６量体、３７量体、３８量体、３９量体、または４０量体である。

【0076】

いくつかの実施形態では、ペプチドは大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１４量体、例えば６～１２量体、６～１０量体、６～８量体、８～１２量体、８～１０量体などの大環状化合物である。スライド１０を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１４量体の大環状化合物である。スライド１５～１６を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１０量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、８～１０量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～８量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、８量体の大環状化合物である。スライド２１～２２を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、３～４０量体、３～２０量体、４～１６量体、４～１４量体、または６～１４量体、例えば、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体、１７量体、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、２４量体、２５量体、２６量体、２７量体、２８量体、２９量体、３０量体、３１量体、３２量体、３３量体、３４量体、３５量体、３６量体、３７量体、３８量体、３９量体、または４０量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、少なくとも１つの親油性側鎖および少なくとも１つの正に帯電した側鎖を有する。

【0077】

いくつかの実施形態では、本明細書のスクリーニングで試験される分子は小分子である。いくつかの実施形態では、試験される分子は抗体であり、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかの完全長抗体だけでなく、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合断片、ナノボディ、一本鎖抗体、二重特異性または多重特異性抗体も含み得る。

【0078】

いくつかの実施形態では、試験される分子は、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片（例えば、抗原結合断片）である。

【0079】

Ｖ．分子複合体
いくつかの実施形態では、本開示は、ペプチド、小分子、抗体、またはペプチド、小分子もしくは抗体の結合断片などの潜在的モジュレーター分子などの分子に結合した本明細書に記載の変異型ヒトＮａ_Ｘを含む分子複合体を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、分子はペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１２量体、６～１０量体、６～８量体、８～１２量体、８～１０量体などの６～１４量体のペプチドである。スライド１０を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１４量体である。スライド１５～１６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～１０量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８～１０量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、６～８量体である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、８量体である。スライド２１～２２を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドは、３～４０量体、３～２０量体、４～１６量体、４～１４量体、または６～１４量体、例えば３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体、１７量体、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、２４量体、２５量体、２６量体、２７量体、２８量体、２９量体、３０量体、３１量体、３２量体、３３量体、３４量体、３５量体、３６量体、３７量体、３８量体、３９量体、または４０量体である。

【0081】

いくつかの実施形態では、ペプチドは大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１４量体、例えば６～１２量体、６～１０量体、６～８量体、８～１２量体、８～１０量体などの大環状化合物である。スライド１０を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１４量体の大環状化合物である。スライド１５～１６を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～１０量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、８～１０量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、６～８量体の大環状化合物である。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、８量体の大環状化合物である。スライド２１～２２を参照されたい。いくつかの実施形態では、大環状化合物は、３～４０量体、３～２０量体、４～１６量体、４～１４量体、または６～１４量体、例えば、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体、１７量体、１８量体、１９量体、２０量体、２１量体、２２量体、２３量体、２４量体、２５量体、２６量体、２７量体、２８量体、２９量体、３０量体、３１量体、３２量体、３３量体、３４量体、３５量体、３６量体、３７量体、３８量体、３９量体、または４０量体の大環状化合物である。

【0082】

いくつかの実施形態では、大環状化合物は、少なくとも１つの親油性側鎖および少なくとも１つの正に帯電した側鎖を有する。

【0083】

いくつかの実施形態では、大環状化合物は、少なくとも１つの親油性側鎖および少なくとも１つの正に帯電した側鎖を有する。いくつかの実施形態では、分子は抗体であり、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれかの完全長抗体だけでなく、Ｆｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖなどの抗体の抗原結合断片、ナノボディ、一本鎖抗体、二重特異性または多重特異性抗体も含み得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、分子は、ペプチドの結合断片、小分子の結合断片、または抗体の結合断片（例えば、抗原結合断片）である。

【0085】

ＶＩＩ．キット
本開示はまた、本明細書のスクリーニング方法に関連する試薬を含むキットを含む。いくつかの例では、キットは、本明細書中に記載の１つ以上の種の変異型ヒトＮａ_Ｘを含む。いくつかの例では、キットは、特定の変異型ヒトＮａ_Ｘの有無にかかわらず、本明細書のスクリーニング方法で使用される試薬を含む。いくつかの例では、キットは２種類以上の変異型ヒトＮａ_Ｘを含む。いくつかの例では、キットはまた、例えば対照として、少なくとも１つの哺乳動物もしくはヒトのＮａ_Ｖおよび／または野生型のヒトＮａ_Ｘを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、本明細書のキットは、イオンチャネルアッセイを実施するための１つ以上の試薬を含み得る。いくつかの例では、キットは、例えば陽性対照として、変異型ヒトＮａ_Ｘの特定のモジュレーターを含み得る。本明細書のキットはまた、変異型ヒトＮａ_Ｘを調節しないと同定された陰性対照を含み得る。分子が変異型タンパク質に結合するかどうかを決定するためにキットが使用される場合、キットは、ビーズなどのマトリックス粒子またはプレートなどの別の種類のマトリックスに結合した変異型ヒトＮａ_Ｘを含み得る。ビーズは、薄片またはチップ、球、ペレットなどの任意の形状を有し得る。いくつかの実施形態では、そのようなビーズは、ストレプトアビジン被覆ビーズ、アビジン被覆ビーズ、または脱グリコシル化アビジン被覆ビーズである。いくつかの実施形態では、そのようなビーズは磁性ビーズである。変異型ヒトＮａ_Ｘは、マトリックスに予め結合していてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、ビオチン－ストレプトアビジンまたは同様の系など、タンパク質のマトリックスへのタンパク質の結合を促進するための試薬が含まれる。

【0087】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のスクリーニング方法に関連する試薬、例えば本明細書の方法に記載のイオンチャネルアッセイを実施するのに必要な試薬の一部または全部を含み得る。いくつかの例では、タンパク質のモジュレーターなどの１つ以上の対照試薬も含まれ得る。

【0088】

いくつかの実施形態では、キットは、ペプチド、小分子、および／または抗体などの試験分子または試験分子のライブラリーを含み得る。いくつかの実施形態では、キット中のペプチドは大環状化合物であり得る。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチド、小分子、または抗体の結合断片である試験分子を含み得る。

【0089】

いくつかの実施形態では、キットは、使用のための指示書をも含み得る。

【0090】

実施例
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。これらの実施例は、本開示を限定することを意図するものではなく、例示することのみを意図しており、上記の一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。

【0091】

実施例１－材料および方法
実施例１．１－実験モデルおよび対象の詳細
細胞株Ｅｘｐｉ２９３Ｆは、懸濁液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖するように形質転換および採用されたヒト胎児腎臓細胞株（雌）であり、タンパク質発現に使用された。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を認証し、マイコプラズマ汚染について試験した。

【0092】

実施例１．２－タンパク質の発現および精製
２ｘＳｔｒｅｐＩＩおよび２ｘＦＬＡＧタグをそのＮ末端にタンデムに含む全長ヒト_Ｘおよびタグなし全長ヒトβ３を、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＲＫベクターにそれぞれクローニングした。両構築物をＥｘｐｉ２９３細胞にＰＥＩでトランスフェクトし、ＳＭＭ ２９３Ｔ－Ｉ培地中、５％ ＣＯ_２下、３７℃で４８時間培養した。細胞を８００ｇで１０分間の遠心分離によって回収し、再懸濁し、ｄｏｕｎｃｅ均質化によって緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＡＤＡ ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬのベンゾナーゼおよび１ｘＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル）に溶解した。細胞膜を可溶化するために、グリコジオスゲニン（ＧＤＮ）およびコレステロールヘミスクシネート（ＣＨＳ）をそれぞれ最終濃度２％および０．３％になるようにサンプルに添加し、このサンプルを４℃で２時間穏やかに撹拌した。次いで、不溶性物質を４℃で１時間、１２５，０００ｇでの超遠心分離によって回収した。上清を、緩衝液Ｂ（２５ｍＭ ＡＤＡ ｐＨ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＧＤＮ）中で予備平衡化し、４℃で１時間バッチで結合させた抗ＦＬＡＧ Ｍ ２アガロース樹脂にアプライした。次いで、サンプルをグラビティカラムにアプライし、収集した樹脂を１０ ＣＶ緩衝液Ｂで洗浄した後、５ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した１０ ＣＶで洗浄した。３００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドを補充した５ ＣＶ緩衝液Ｂでタンパク質を溶出した。溶出液を、緩衝液Ｂ中で予備平衡化し、バッチ中で３時間結合させたＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ高容量樹脂に直接アプライし、次いで１０ ＣＶ緩衝液Ｂで洗浄した後、５０ｍＭビオチンを補充した５ ＣＶでサンプルを溶出した。ナノディスクの組み込みのために、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心分離濾過装置（１００ｋＤａ ＭＷＣＯ）を使用してサンプルを１５μＭに濃縮した。界面活性剤（ＧＤＮ）中の構造分析のために、溶出液を代わりに１００μＬに濃縮し、緩衝液Ｂ中で予備平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムにアプライした。

【0093】

実施例１．３－質量分析
サイズ排除クロマトグラフィー後、１０μｇのＮａ_Ｘ含有ピーク画分（それぞれβ１サブユニットまたはβ３サブユニットとの共発現後）を８Ｍグアニジン（１：１ ｖ／ｖ）で変性させ、１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）で１００ｍＭ ＤＴＴの最終濃度まで還元し、９５℃で１０分間インキュベートし、次いで遠心分離した。１０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を溶液に添加し、水を使用してグアニジンを最終濃度２Ｍに希釈した。２μＬのＰＮＧａｓｅＦ（１５０００Ｕ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で脱グリコシル化を行った後、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを６０℃で１０ｍＭ ＤＴＴを用いてさらに還元し（１５分）、続いて室温で２０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。タンパク質を、３７℃で一晩、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８中の０．２μｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）またはキモトリプシンで消化した。消化物をギ酸でクエンチし、上清をＣ１８ ＰｈｙＴｉｐｓ（ＰｈｙＮｅｘｕｓ社）で脱塩し、凍結乾燥し、２％アセトニトリルを含む０．１％ギ酸で再構成し、Ｅｌｉｔｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にインターフェースされたＷａｔｅｒｓ ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社）で逆相ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによってさらに処理することなく分析した。ペプチドをＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（１．７ｍｍ ＢＥＨ－１３０、０．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）にロードし、１μＬ／分の流速で２％～２５％の溶媒Ｂ（０．１％ギ酸、９８％アセトニトリル）の６０分間の勾配で分離した。１．２ｋＶのスプレー電圧で、ペプチドを質量分析計に直接溶出した。完全ＭＳデータを、６０，０００の分解能で３５０～１２５０ｍ／ｚのＦＴで取得した。完全なＭＳスキャンからの最も豊富なイオンを、２－Ｄａの単離ウィンドウを通してＭＳ／ＭＳのために選択した。

【0094】

取得したタンデムＭＳスペクトルを、トリプシンまたはキモトリプシン酵素特異性を用いてＭａｓｃｏｔアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて検索した。検索基準としては、５０ｐｐｍの完全なＭＳ耐性、可変修飾としてメチオニンの酸化（＋１５．９９４９Ｄａ）および静的修飾としてシステインのカルバミドメチル化（＋５７．０２１５Ｄａ）による０．５ＤａのＭＳ／ＭＳ耐性が挙げられた。データは、Ｕｎｉｐｒｏｔ哺乳動物データベースに重ね合わせた逆タンパク質配列を含む社内構築物の特異的配列に対して検索した。ペプチドの帰属を、最初にペプチドレベルで２％の偽陽性率（ＦＤＲ）までフィルタにかけ、続いてタンパク質レベルで２％のＦＤＲまでフィルタにかけた。

【0095】

実施例１．４－脂質ナノディスクへのβ３－ＮａＸの再構成
ナノディスクへの再構成のために、複数の５０μＬサンプルアリコートをそれぞれ、２００倍モル過剰のＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ：ＰＯＰＧ脂質混合物（３：１：１ ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および１％ ＣＨＡＰＳを含有する緩衝液中、１０ｍｇ／ｍＬの超音波処理浴で可溶化した比）を含む２ｍＬチューブにアプライし、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、膜足場タンパク質ＭＳＰ１Ｅ３Ｄ１（Ｓｉｇｍａ社）を４倍モル過剰でサンプルにアプライし、４℃でさらに３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを１．５ｍＬに希釈し、Ｂｉｏ－Ｂｅａｄｓを０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にアプライした。次いで、サンプルを４℃で一晩転転倒動させた後、Ｂｉｏ－Ｂｅａｄを除去した。次いで、サンプルをプールし、緩衝液Ｃ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ）であらかじめ平衡化したカラム中の１ｍＬのＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ樹脂上を通過させ、空のナノディスクを除去した。カラムを５ＣＶ緩衝液Ｃで洗浄した後、５０ｍＭビオチンを含有する５ＣＶでサンプルを溶出した。次いで、サンプルを１００μＬに濃縮し、緩衝液Ｃ中で予備平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ３．２／３００カラムにアプライした。ピーク画分をプールし、３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0096】

実施例１．５－低温ＥＭサンプルの調製およびデータ取得
サンプルを室温で１０分間、最終濃度０．０５％のＥＭグレードのグルタルアルデヒドで架橋した。１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０を添加することによって架橋反応をクエンチした。Ｕｌｔｒａｆｏｉｌ Ｒ２／２（２００メッシュ）低温ＥＭグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ社ＧＭＢＨ）を、Ｓｏｌａｒｕｓプラズマ洗浄機（Ｇａｔａｎ社、カリフォルニア州プレザントン）を用いて５秒間プラズマ洗浄した。２．２５ｍｇ／ｍＬ（ナノディスク）または１．５ｍｇ／ｍＬ（ＧＤＮ）の３マイクロリットルの最終サンプルを低温ＥＭグリッドに適用し、Ｖｉｔｒｉｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して、湿度１００％で８のブロット力設定を使用して２．５秒間ブロットし、液体エタンに浸漬した。次いで、Ｋ２（ナノディスク）またはＫ３（ＧＤＮ）Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器（Ｇａｔａｎ社、カリフォルニア州プレザントン）を使用して、生物量子エネルギーフィルタを用いて３００ｋｅＶで操作されるＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ電子顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、マサチューセッツ州ウォルサム）でグリッドを画像化した。ナノディスクの画像を、２０ｅＶのエネルギースリットを使用して０．８２４Å／ピクセルに相当する１６５，０００×の倍率で記録した。画像スタックは、１０秒間にわたって０．２秒間隔で記録された５０枚の画像を含み、総露光量は約５０ｅ^－／Å^２であった。ＧＤＮサンプルの画像を、２０ｅＶのエネルギースリットを使用して、０．４１９Å／ピクセルに相当する１０５，０００倍の倍率で超解像モードで記録した。画像スタックは、３秒にわたって０．０５秒間隔で記録された６０枚の画像を含み、総露光量は約６４ｅ^－／Å^２であった。全てのデータ収集はｓｅｒｉａｌＥＭ^６７を用いて行った。

【0097】

実施例１．６－低温ＥＭデータ処理
ナノディスクサンプル
低温－ＥＭデータは、ＷＡＲＰ、ＲＥＬＩＯＮ、およびｃｉｓＴＥＭソフトウェアパッケージ^{６８－７１}の組み合わせを使用して処理した。最初のデータセットについては、ＲＥＬＩＯＮのＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２^７２を使用して、フレームの動きに対して１１，６５８個の動画を補正した。得られた画像を、合計累積運動量が２５０未満のもののみを保持するようフィルタリングして、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）パラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ４．１^７３を使用してスペクトルの３０～４．５Åの帯域を使用して適合させた。画像をフィルタリングして、検出された適合分解能が５Åより良好なもののみを含め、さらなる処理のために合計９，９８８枚の良好な画像を得た。ＷＡＲＰ^６８の深層学習ベースのアルゴリズムを使用して、１，６６９，１０７個の粒子を選別した。粒子をｃｉｓＴＥＭで２回の２次元分類に供し、最良の３０クラスを選択し（７６，３９２粒子）、３次元分類のためにＲＥＬＩＯＮにエクスポートした。ナノディスクの外側の全ての密度が消去された、ナノディスク（ＥＭＤ－９０２４）^７４で解決された２０Åのローパスフィルタリング（ＬＰＦ）Ｋ_Ｖ１．２再構成を最初の３次元基準として使用した。次いで、得られた最良の３次元体積を、ｃｉｓＴＥＭ（３５０，９０１粒子）における２次元分類からの粒子のより広範な選択を使用して、２回目の３次元分類の基準として使用した。次いで、最良の３次元体積およびその対応する９１，４３５個の粒子を、マスクなしでの反復的な自動精製および反復的に調整されたマスクおよび２０Åのマスクの外側のＬＰＦによる手動精製のために、ｃｉｓＴＥＭにインポートして戻した（外側重量０．８）。次いで、得られた４．５Åマップを、ｃｉｓＴＥＭの単一ラウンドのみの２次元分類からの粒子スタックを使用して、ｃｉｓＴＥＭのマスクされていない自動精製およびマスクされた手動精製の最終ラウンドにおける参照として使用し、最終３．２Åマップを得た。

【0098】

界面活性剤（ＧＤＮ）サンプル
ＲＥＬＩＯＮ、Ｇａａｕｔｏｍａｔｃｈ［Ｋ．Ｚｈａｎｇ、ＭＲＣ ＬＭＢ（ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｋｚｈａｎｇ／）］、およびｃｉｓＴＥＭソフトウェアパッケージの組み合わせを使用して、低温－ＥＭデータを処理した。１０，８５０個の動画を、ＲＥＬＩＯＮのＭｏｔｉｏｎ Ｃｏｒ２^７２を使用してフレーム移動について補正し、１Å／ピクセルにビニングした。得られた画像を、合計累積運動量が２５０未満のもののみを保持するようフィルタリングして、コントラスト伝達関数（ＣＴＦ）パラメータを、ＣＴＦＦＩＮＤ４．１^７３を使用してスペクトルの３０～４．５Åの帯域を使用して適合させた。画像をフィルタリングして、検出された適合分解能が５Åより良好なもののみを含め、さらなる処理のために合計１０，５６９枚の良好な画像を得た。鋳型としてβ１補助サブユニット（ＥＭＤ－９６１７）と複合体化したＮａ_Ｖ１．４の再構成の１６個の均一な投影を使用して、Ｇａｕｔｏｍａｔｃｈを使用して合計２，７８０，６６３個の粒子を自動的に選別した。粒子をＲＥＬＩＯＮで２５０クラスへの二次元分類の一巡に供し、最良の５５クラスからの１，４２０，４２２個の粒子を含む粒子スタックを抽出し、ｃｉｓＴＥＭにエクスポートした。ナノディスクに溶解したβ３－Ｎａ_Ｘの構造を、マスクなしの自動精製の初期ラウンドにおける初期基準として使用し、続いて反復マスク精製およびマスク外の２０ÅＬＰＦによる数ラウンドの手動精製を行った（外側重量０．８）。手動による精密化の実行は、デフォーカス精密化を含み、０．２のスコア閾値を使用した。マスクされていない自動精密化およびマスクされた手動精密化の反復ラウンドにより、最終的に２．８５Åの分解能で再構成した。

【0099】

実施例１．７－モデル構築および構造解析
β１補助サブユニットと複合体を形成したＮａ_Ｖ１．４の構造（ＰＤＢ ６ＡＧＦ）^２８を鋳型として、Ｐｈｙｒｅ２サーバー^５８を用いてＮａ_Ｘ相同性モデルを作成した。このモデルをβ１と共に、Ｃｏｏｔ^５９での手動再構築のために低温ＥＭマップにドッキングして、β３－Ｎａ_Ｘ複合体の初期モデルを得た。Ｐｈｅｎｉｘ^６０における複数回の実空間精密化およびＣｏｏｔにおける手動再構築に続いて、ＩＳＯＬＤＥ^６２を用いたＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ^６１における分子動力学支援手動精密化を行った。Ｐｈｅｎｉｘで最終的に改良した後、Ｐｈｅｎｉｘ検証パッケージを使用してモデルを検証した。ＰｙＭｏｌ^６３、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ^６４、およびＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸを使用して構造図を作成した。チャネル孔^６５を分析するために、Ｃａｖｅｒ３．０を使用した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ^６６を使用して配列アラインメントを行い、ＥＳＰｒｉｍｐｔ ３．０^６７でレンダリングした。

【0100】

実施例１．８－生化学的および電気生理学的試験のための分子生物学
ヒトＮａ_Ｘ、Ｎａ_Ｘ－ｅＧＦＰ－２×ＦＬＡＧ、Ｎａ_Ｖ１．７、Ｎａ_Ｘ－Ｎａ_Ｖ１．７ドメイン交換キメラ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ１およびＳＡＰ９７（ホモサピエンスに最適化されたコドン）の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ^（＋）ベクターにクローニングし、この試験に使用した。ヒトＮａ_Ｖβ１、Ｎａ_Ｖβ３、Ｃａ_Ｖβ１、Ｃａ_Ｖγ２、Ｃａ_Ｖα２δ１、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＴＰ１Ｇ１およびＳＡＰ９７構築物をｐｃＤＮＡ３．１^（＋）ベクターにクローニングした。Ｎａ_Ｘ、Ｎａ_Ｖ１．５５およびＮａ_Ｖ１．７変異体（Ｎａ_ＸＮ１１４２Ｋ、ＱＴＴ（Ｆ７２４Ｑ／Ｉ１１８９Ｔ／Ｉ１４９２Ｔ）；Ｎａ_Ｖ１．５ Ｓ１６１０Ｐ／Ｓ１６１８Ｐ／Ａ１６４０Ｐ；Ｎａ_Ｖ１．７Ｓ２１１Ｐ、ΔＬ９６６、Ｓ１２６９Ｆ、Ｋ１４０６ＮおよびＡ１５９６Ｐ／Ｓ１６０５Ｐ／Ａ１６２７Ｐ）を、特注設計したプライマー（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ社）、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩＦｕｓｉｏｎＨＳＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた部位特異的変異誘発法を用いて作製し、ＤＮＡ配列はサンガーＤＮＡ配列決定（ＥｕｒｏｆｉｎｓＧｅｎｏｍｉｃｓ社）で確認した。アフリカツメガエル卵母細胞における発現のために、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ制限酵素のいずれかを使用してｃＤＮＡを線状化し、次いでＴ７ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてキャップされたＲＮＡに転写した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＮｅｕｒｏ－２ａ細胞における発現のために、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ社）で精製したプラスミドＤＮＡを使用した。

【0101】

実施例１．９－二電極電位固定電気生理学的試験
卵母細胞を以前に記載したように調製した^６８。健康そうなステージＶ～ＶＩの卵母細胞に、Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０１０注入器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて２．５～４０ｎｇのＲＮＡ（５～４１ ｎＬ）を注入した。１つ以上の構築物を除外する場合、等量のヌクレアーゼフリー水を添加して、種々の構築物の組み合わせにわたって一定のＲＮＡ濃度を維持した。注入された卵母細胞を、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび５０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、２．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭテオフィリン、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ＮａＯＨ；ｐＨ７．４）を補充したＮＤ９６中、１８℃、１４０ｒｐｍで２～５日間維持した。Ｗａｒｎｅｒ ＯＣ－７２５Ｃ Ｏｏｃｙｔｅ Ｃｌａｍｐ増幅器（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．、米国）を使用し、ＮＤ ９６溶液（９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；ＮａＯＨでｐＨ７．４）を用いて一定の灌流下、室温で２電極電位固定測定を行った。イオン選択性実験のために、外部溶液は、塩化物塩として１１５ｍＭの試験陽イオン、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（対応する水酸化物を含むｐＨ７．４）を含んでいた。データ取得は、Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０デジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ社；１０ｋＨｚでサンプリング）およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用して行った。ホウケイ酸ガラスキャピラリー（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）からのマイクロ電極を、Ｐ－１０００ Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎ Ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ Ｐｕｌｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を使用して約０．２～１．０ＭΩの抵抗を有するように調製し、３Ｍ ＫＣｌを充填した。アコニチンおよびベラトリジン（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社）をＤＭＳＯに溶解して５０ｍＭストックを作製し、電気生理学的実験のためにＮＤ９６で３００および１００μＭにさらに希釈した。他のＮａ_Ｖ活性化剤（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ社；図８Ａ～図８Ｄ）を水に溶解してストック溶液を作製した。イオン電流の電圧依存性は、０ｍＶの保持電位から＋８０～－１００ｍＶの範囲の電圧まで、２０ｍＶ刻みで１秒間のステップからなるプロトコルを使用して決定した。

【0102】

実施例１．１０－細胞培養、細胞表面ビオチン化およびウエスタンブロット
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＮｅｕｒｏ－２ａ細胞（ＡＴＣＣ）を、前述のように増殖させ、維持した^６８。およそ８００，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞および２５０，０００個のＮｅｕｒｏ－２ａ細胞を３５ｍｍ細胞培養皿に播種し、約２０時間後にＬｉｐｏＤ２９３ ｖｅｒ．ＩＩ（ｔｅｂｕ－ｂｉｏ）を使用して１μｇのｃＤＮＡによる一過性トランスフェクションを行った。生化学実験のために、Ｎａ_Ｘ－ｅＧＦＰ－２×ＦＬＡＧおよびβ３のｃＤＮＡを１：１の質量比で混合した。等量の空ベクターＤＮＡを添加して、β３をトランスフェクションから除外した場合に総ｃＤＮＡ量を一定に維持した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの２４時間後に生化学実験に使用した。分化を誘導するために、Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を、生化学的実験および電気生理学的実験のために使用する前に、トランスフェクションの２４時間後に血清飢餓状態にした（ＤＭＥＭ中でさらに２４～３０時間培養した）。細胞表面ビオチン化およびウエスタンブロットを、以下のような、わずかな改変のみを伴って、以前に記載されたように行った^６８；１）クエンチ工程は、氷上で穏やかに撹拌しながら３０分間行った。２）アフリカツメガエル卵母細胞を溶解前にトリス緩衝生理食塩水で２回洗浄した。３）卵母細胞の総溶解物画分をＳＤＳサンプル緩衝液で１：５に希釈した後、過剰なタンパク質のためにゲルにロードした。マウス抗Ｎａ^＋／Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼ抗体がＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社からのもの（ｓｃ－２１７１２）であったことを除いて、抗体は^６８に記載されているものを使用した。ブロットは、最小３回の個々の実験の代表である。

【0103】

実施例１．１１－パッチクランプ電気生理学的試験
パッチクランプ実験の１時間前に、Ｎａ_Ｘ－ｅＧＦＰ－２×ＦＬＡＧを発現する分化したＮｅｕｒｏ－２ａ細胞をガラスカバースリップ上に播種した。細胞を、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）、Ｄｉｇｉｄａｔａ １５５０Ａデジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社；１０ｋＨｚでサンプリング）およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用して、全細胞構成（図１Ｅ～Ｆおよび図７Ｆ）で－６０ｍＶで電圧クランプした。パッチクランプ実験のためのガラスピペットをホウケイ酸ガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；Ｋｗｉｋ－Ｆｉｌ １．５／１．１２；ＯＤ／ＩＤ）から引っ張り、２．０～５．５ＭΩの間の最終抵抗値までファイヤーポリッシングした。細胞外溶液は、１４０または１９０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭグルコース ＮａＯＨでｐＨ７．４）を含有していた。これらの溶液の浸透圧値は、約３０２ｍＯｓｍ／Ｌ（１４０ＮａＣｌの場合）および約３９５ｍＯｓｍ／Ｌ（１９０ＮａＣｌの場合）であった。細胞内溶液は、ＫＯＨを含む１２０ｍＭ Ｋ－グルコネート、２０ｍＭ ＴＥＡ－Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ、１ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３を含んでいた（約２８１ｍＯｓｍ／Ｌ）。

【0104】

Ｎａ_ＸまたはＮａ_Ｘ－ＱＴＴ－ｅＧＦＰ－２×ＦＬＡＧを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ホールセルパッチクランプ実験の１時間前にガラスカバースリップ上に播種した。より生理学的な条件（図４Ｄおよび図７Ｂ）では、細胞外溶液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、およびＮａＯＨおよび１３ｍＭ Ｄ－（＋）－グルコース（ｐＨ７．４）、約３２０ｍＯｓｍ／Ｌを含み、細胞内溶液は、ＣｓＯＨを含み、１４０ｍＭ ＣｓＣｌ、１０ｍＭ ＣｓＦ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ（ｐＨ７．２）、約３０４ｍＯｓｍ／Ｌを含んでいた。Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴが陽イオン透過性であるかどうかを決定するために、本発明者らは最初に全ての細胞外陽イオンをＮＭＤＧ^＋で置換した（図４Ｅ）。細胞外溶液は、１５０ｍＭ ＮＭＤＧおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有していた（Ｄ－（＋）－グルコースを適宜添加して約３２５ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を達成し、塩酸でｐＨを７．４に調整した）。Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴが陰イオン透過性であるかどうかを決定するために、本発明者らは、細胞内溶液および細胞外溶液の両方の全てのＣｌ^－イオンを大きな陰イオンメタンスルホネート（ＭＳ^－）で置換した（図１５Ｃ）。細胞外溶液は、１５０ｍＭ ＮａＭおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有していた（Ｄ－（＋）－グルコースを適宜添加して約３２５ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を達成し、塩酸でｐＨを７．４に調整した）。細胞内溶液は、１３６ｍＭ ＮａＭＳ、１０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ（ＮａＯＨでｐＨ７．２、約３０９ｍＯｓｍ／Ｌ）を含有していた。細胞外ＮＭＤＧ溶液は、１５０ｍＭ ＮＭＤＧおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有していた（Ｄ－（＋）－グルコースを適宜添加して、約３２５ｍＯｓｍ／Ｌのオスモル濃度を達成し、メタンスルホン酸でｐＨを７．４に調整した）。

【0105】

イオン選択性実験（図４Ｅおよび図５Ａ）（ｉ）一価陽イオンを含む場合、細胞外溶液は１５０ｍＭ ＸＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、Ｄ－（＋）－グルコースを適宜添加して約３２５ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を達成し、ＸＯＨでｐＨを７．４に調整した（ＸはＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｌｉ^＋またはＣｓ^＋を示す）。（ｉｉ）Ｃａ^２＋を含む場合、細胞外溶液は１１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、Ｄ－（＋）－グルコースを適宜添加して、約３２５ｍＯｓｍ／Ｌの浸透圧を達成し、Ｃａ（ＯＨ）_２でｐＨを７．４に調整した。（ｉｉｉ）細胞内溶液は、１３６ｍＭ ＮａＣｌを含み、ＮａＯＨ、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ（ｐＨ７．２）を含み、約３０９ｍＯｓｍ／Ｌであった。

【0106】

実施例１．１２－データ分析
データ分析のために、生の電流トレースは、典型的には、５００～８００Ｈｚで８極ベッセルローパスフィルタを使用してフィルタリングされた。電流トレースは、図に表示するために係数５のデータ削減を受けた。データは、細胞の少なくとも２つのバッチからの少なくとも３つの細胞からの平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。Ｎａ^＋細胞内溶液を用いて行ったイオン選択性実験（図４Ｅおよび図５Ａ）では、Ｎａ^＋細胞内溶液を基準として液接合電位（ＬＪＰ）を測定し、記録後に補正した。相対イオン透過率（ＰＮａ／ＰＸ）は、式Ｐ_Ｘ／Ｐ_Ｎａ＝［Ｎａ^＋］_ＩＣｅｘｐ（Ｅ_ｒｅｖＦ／ＲＴ）／［Ｘ^＋］_ＥＣ（Ｘ＝Ｎａ，Ｋ，ＬｉまたはＣｓ）を用いて計算した（式中、Ｆはファラデー定数であり、Ｒはガス定数であり、Ｔ＝２７４Ｋであり、Ｅ_ｒｅｖは－８０～＋８０ｍＶランプ（ＬＪＰに対して補正）から測定した。）。

【0107】

実施例２－ヒトＮａ_Ｘ機能の評価
信頼できるイオン電流は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトＮａ_Ｘを発現させた後、膜電圧の変化に応答して検出されなかった（図１Ａ～図１Ｄ、図７Ａ～図７Ｄ、および図８Ａ～図８Ｄ）。卵母細胞における異なる電位段階プロトコル中のアコニチン、ベラトリジン、ポンピリドトキシン、血液抑制物質－Ｉおよび神経毒－ＩＩなどの古典的なＮａ_Ｖチャネル活性化剤の適用は、いかなる明確なヒトＮａ_Ｘ媒介電流も引き起こさなかった（図１Ｂ、図１Ｄ、図８Ａ～図８Ｂ）。ヒトＮａ_Ｘの表面発現は強固であるにもかかわらず、Ｎａ_Ｖまたは電位依存性カルシウム（Ｃａ_Ｖ）チャネル補助サブユニット（すなわち、β１、β３、α２δ１、γ２）との同時発現も、信頼できる電流を生成し得なかった（図１Ｃ、図１Ｄ、図７Ａ、図７Ｃおよび図８Ｃ～図８Ｄ）。これらの結果は、Ｎａ_Ｘが従来の電圧ゲート付きチャネルとして動作しないという以前の知見を大幅に拡張する^{１４、１５}。

【0108】

細胞外ナトリウム濃度の増加［Ｎａ^＋］_ｅは、マウスＮａ_Ｘを発現するグリアおよび神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏ－２ａ）細胞株において非不活性化Ｎａ^＋電流を活性化することが報告されている。マウスＮａ_Ｘはまた、原形質膜でＮａ^＋／Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼおよびシナプス結合タンパク質９７（ＳＡＰ９７）と相互作用することが示唆されている。表面発現およびＡＴＰ１Ａ１αサブユニットをいくつかの条件下で共免疫沈降させる本発明者らの能力がある（表２）にもかかわらず、２００ｍＭ［Ｎａ^＋］_ｅへの曝露時にＮａ^＋／Ｋ^＋－ＡＴＰアーゼサブユニットおよびＳＡＰ９７と共にヒトＮａ_Ｘを共発現する卵母細胞において信頼できる内向きＮａ^＋電流は検出されなかった（図１Ｃおよび図１Ｄ）。

【表2】

【0109】

ヒトＮａ_ＸをＮｅｕｒｏ－２ａ細胞で発現させた場合、本発明者らは、ホールセルパッチクランプ配置で［Ｎａ^＋］_ｅを１４０から１９０ｍＭに変化させると、小さく点滅する内向き電流を観察した（図１Ｅ～Ｇおよび７Ｅ～Ｆ）。Ｎａ_Ｖ１．７チャネルを発現するＮｅｕｒｏ－２ａ細胞は、浸透圧の変化後に同様のフリッカー挙動を示し、この現象がヒトＮａ_Ｘを発現する細胞に特異的ではないことが示された（図１Ｅ～Ｇ）。非不活性化内向き電流は、シール抵抗が低い場合（＜１ＧΩ）にのみ観察され、この表現型は、模擬およびヒトＮａ_ＸトランスフェクトＮｅｕｒｏ－２ａ細胞の両方で見られた（図７Ｆ）。全体として、本発明者らの知見がヒトおよびマウスＮａ_Ｘチャネルの間の機能的分岐（図９）、または実験プロトコルのわずかな違いを反映するかどうかは不明であるが、本発明者らはヒトＮａ_Ｘを通る信頼できる電流を測定し得なかった。次に、本発明名者らは、ヒトＮａ_Ｘの構造決定がその機能または調節への洞察を提供し得るかどうかを検討した。

【0110】

実施例３－脂質ナノディスク中のβ３－Ｎａ_Ｘ複合体の構造決定
ヒトＮａ_ＸをＨＥＫ２９３細胞中で組換え発現させ、穏やかな界面活性剤であるグリコジオスゲニン中で精製した（図１０Ａ～Ｃ）。Ｎａ_Ｖ１．７チャネルが補助的なβサブユニット^{２３－２５}、β１またはβ３サブユニットと安定な複合体を形成するという報告によって着想を得て、β１またはβ３サブユニットを共発現させ、Ｎａ_Ｘと共精製することを見出した（表２）。より自然な環境を提供するために、β３－Ｎａ_Ｘ複合体を、一般的なリン脂質混合物を使用してナノディスクに再構成した（図１０Ａ～図１０Ｃ）。サンプルのガラス化の前に、Ｎａ^＋濃度を、Ｎａ_Ｘを活性化すると報告されている閾値を超えて２００ｍＭまで上昇させた。得られたヒトβ３－Ｎａ_Ｘ複合体の低温ＥＭ再構築は、３．２Å分解能まで拡張され（図１１Ａ～図１１Ｆ、図１２Ａ、および表３）、再構成された脂質膜環境で決定された真核生物Ｎａ_Ｖチャネルファミリーメンバーの最初の構造を表す。以下の表３の最初の表題行では、β３－_Ｘ－ナノディスクのＥＭＤＢ参照番号はＥＭＤＢ－２５９１９であり、ＰＤＢ参照番号はＰＤＢ７ＴＪ８である。β３－Ｎａ_Ｘ－ＧＤＮのＥＭＤＢ基準はＥＤＭＢ－２５９２０であり、ＰＤＢ基準はＰＤＢ７ＴＪ９である。

【表3】

【0111】

実施例４－β３－Ｎａ_Ｘチャネル複合体の全体構造
β３－Ｎａ_Ｘチャネル複合体は、中心細孔モジュールの周りのドメイン交換組織に配置されたＶＳＬＤを有する四葉クローバに似ており（図１Ｈ）、これはＮａ_Ｖ、Ｃａ_ＶおよびＮＡＬＣＮチャネル間で共有されるアーキテクチャに適合する。Ｎａ_Ｘでは、可溶性細胞内アミノ末端ドメインがＶＳＬＤ１の下にドッキングされ、細胞内ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーが細孔に沿って結合しており、細胞内カルボキシル末端ドメイン（ＣＴＤ）は十分に分解されておらず（図１３Ａ）、利用可能なヒトＮａ_Ｖチャネル構造を連想させる特徴を有する。細胞外側では、Ｎａ_Ｘサブユニットおよびβ３サブユニットから、２つおよび４つのＮ結合型グリカンがそれぞれ、伸長することが見出されている。

【0112】

β３－サブユニットは、その免疫グロブリン－ドメインをＮａ_Ｘ細孔モジュールの精密化された細胞外ループの間にくさび留めし、その単一膜貫通ヘリックスをＶＳＬＤ３に対して配置することによって、広範な相互作用を形成する（図１Ｈおよび１３Ｂ）。現代のβ１またはβ３補助サブユニットはＮａ_Ｘと安定な複合体を形成するようであるが（表２）、その細孔モジュールは、β２またはβ４－サブユニットと共有結合複合体を形成するのに必要なシステイン残基を持たない^{２３，２７}。

【0113】

脂質ナノディスク中で再構成されたヒトＮａ_Ｘの全体構造は、界面活性剤中で決定されたＮａ_Ｖ１．１、Ｎａ_Ｖ１．２、Ｎａ_Ｖ１．４、Ｎａ_Ｖ１．５およびＮａ_Ｖ１．７チャネル構造と非常に類似している^{２３、２８－３１}（図１３Ｃ）。逆に、Ｎａ_Ｘは、Ｎａ_Ｖチャネルゲーティングに頻繁に関与する領域において、ＶＳＬＤ４の約５Åの位置シフト、およびＤＩＩＳ４－Ｓ５リンカーに沿った６Åを超える変位を含む、実質的な逸脱を示す（図１３Ｄおよび１３Ｅ）。_Ｘにおいて観察された構造変化は、その高い配列多様性の結果であり、その明確な機能に寄与すると考えられる（図９）。

【0114】

実施例５－Ｎａ_Ｘ細孔モジュールは非導電状態にある
Ｎａ_Ｘ細孔モジュールは、外側前庭、イオン選択性フィルタ、中央キャビティ、およびＳ６活性化ゲートを含む（図２Ａ）。Ｓ６ゲートは狭く、水和イオンの通過に対する障壁を形成する疎水性側鎖の二重環によって裏打ちされており、非導電状態を明確に定義する（図２Ａ、図２Ｂおよび図１３Ｃ）^{２３，２８－３１}。しかし、本発明者らのＮａ_Ｘ構造は高Ｎａ^＋濃度下で決定されたので、これらの所見は、マウスＮａ_ＸがＮａ＋活性化非不活性化チャネルを形成するという報告と矛盾するように思われる。代わりに、細孔モジュールについて観察された非導電状態は、ヒトＮａ_Ｘに関する本発明者らの生理学的研究からの予測と完全に一致している（図１Ａ～Ｆ、７Ａ～Ｆおよび８Ａ～Ｄ）

【0115】

Ｎａ_Ｘ中央キャビティの体積はＮａ_Ｖチャネルの体積と同様であるが、一般的に細孔遮断薬^{３２，３３}によって標的とされるＤＩＶ－Ｓ６フェニルアラニンはＤＩＶ－Ｔｒｐ１４８４に置き換えられる（図１３Ｆ）。Ｎａ_Ｘにより、細孔モジュールを貫通する４つの側方開窓を明らかにされ、Ｎａ_Ｖチャネルで最初に示唆されるように、疎水性薬物または脂質が中央キャビティに直接入るための膜アクセス経路が同定された（図２Ｃおよび図２Ｄ）^{２８－３０，３４}。したがって、古典的なＮａ_ＶまたはＣａ_Ｖチャネルアンタゴニストが中央キャビティ内のＮａ_Ｘを標的とし得ることが考えられる。

【0116】

実施例６－Ｎａ_Ｘ ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーはＳ６ゲート拡張を制限する
Ｎａ_Ｘの細胞内ＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーは、ヒトＮａ_Ｖチャネルの急速不活性化状態構造によく似た様式で細孔モジュール受容体部位と相互作用する（図２Ｂおよび１４Ａ）。Ｎａ_ＸＩＦＩモチーフは、Ｎａ_ＶチャネルのＳ６ゲート拡張を制限する複合体と類似しており、ＤＩＩＩ－Ｓ４－Ｓ５リンカーとＤＩＶ－Ｓ５およびＳ６との間に結合している（図２Ｂおよび図１４Ａ）。Ｎａ_ＸのＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーは、かなりの配列分岐の部位として長い間認識されてきたが（図１４Ｂ）、Ｎａ_Ｖチャネルにおけるこの重要な機能領域と高い構造相同性を明らかに共有している（図１４Ａ）。それにもかかわらず、Ｎａ_ＸのＩＦＩモチーフを古典的な非活性化Ｎａ_ＶチャネルＱＱＱモチーフに変異させることは、注入された卵母細胞において機能的チャネルを生成するのに不十分であり（図１４Ｃ）、これは、Ｎａ_Ｘチャネルをゲーティングするための明確な要件の存在をさらに強調している。

【0117】

本発明者らは、Ｎａ_ＸおよびＮａ_Ｖ１．７構造モデルを利用して、ヒトＮａ_Ｘの非伝導性状態を担う決定因子を評価するための正確に標的化されたキメラチャネルのパネルを構築した。二重ドメインのＤＩＩ－ＤＩＩＩおよび ＤＩＩＩ－ＤＩＶ Ｎａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘキメラならびに単一ドメインＤＩＩＩ Ｎａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘキメラは、アフリカツメガエル卵母細胞において単独で発現された場合、大きな内向き電流および外向き電流を生じた（図２Ｅ）。最終的に、Ｎａ_Ｖ１．７－ＶＳＤ３および関連するＤＩＩＩ－Ｓ４－Ｓ５リンカーの両方を交換することは、リークチャネル表現型を移入するのに十分な最小領域であった（図１４Ｄ）。これらの領域は、Ｎａ_ＶチャネルのＳ６拡張を制限するＩＦＭモチーフの受容体部位を形成するのに必要であり（図１４Ａ）、Ｎａ_Ｘへのそれらの置換は堅牢なリーク電流を生成するので（図２Ｅおよび図１４Ｄ）、本発明者らは、Ｎａ_ＸのＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーがＳ６透析を制限し、細孔モジュールの非伝導状態を安定化する役割を果たしていることを提案する。

【0118】

実施例７－Ｎａ_Ｘ細孔は膜脂質によって浸潤される
定義により、イオンチャネルの閉鎖状態または不活性化状態は非導電性である。β３－Ｎａ_Ｘ構造では、４つの脂質が側方細孔開窓を貫通して、狭い疎水性Ｓ６ゲートの上方の中央キャビティに入る。これらの著しい密度は、３つのリン脂質および１つのコレステロールとして明確に割り当て得る（図２Ｃおよび２Ｄ）。１つのリン脂質は、細胞内Ｓ６活性化ゲートをまたぎ、シールしている（図２Ｃおよび図１４Ｅ）。

【0119】

脂質ナノディスク環境がβ３－Ｎａ_Ｘ中の膜脂質の堅固な可視化に関与しているかどうかを評価するために、本発明者らは、外因性リン脂質を補充せずに界面活性剤グリコジオスゲニン中に新しいサンプルを調製し、その構造を２．８５Å分解能で決定した（図１１Ｇ～図１１Ｌ、図１２Ｂおよび表３）。本発明者らは、４つの明確に定義された共精製脂質が貫通した同一のＮａ_Ｘ細孔構造を観察した（図１４Ｆ）。したがって、β３－Ｎａ_Ｘ中のイオン伝導経路は、脂質によって浸透および閉塞されているので、この細孔モジュール構造では明らかに非伝導性である（図２Ａ～Ｄおよび１４Ｅ～Ｆ）。Ｎａ_Ｘ内に結合したよく分解された共精製脂質の存在は、その非導電状態の固有の安定性およびＳ６ゲートおよび中央キャビティの疎水性を反映している可能性がある。

【0120】

実施例８－標的化細孔湿潤変異はヒトＮａ_Ｘを活性化し得る
Ｓ６ゲートは狭く、疎水性であり、脂質に結合しており、ＩＦＩモチーフ受容体部位を破壊すると、Ｓ６拡張を促進し得るという本発明者らの集合的な観察に基づいて、本発明者らは、Ｓ６ゲート周囲への極性残基の標的化された導入が、細孔水和、結合した脂質の不安定化、およびＮａ_Ｘの開導電状態への移行を促進し得ると推論した（図３Ａ～Ｆ）。したがって、３つのＳ６ゲートライニング位置に極性置換を含む三重変異体Ｎａ_Ｘチャネル構築物（Ｆ７２４Ｑ－Ｉ１１８９Ｔ－Ｉ１４９２Ｔ）、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴは、電位段階プロトコルに応答してアフリカツメガエル卵母細胞において単独で発現させた場合、堅牢なイオン電流を生成した（図３Ａおよび３Ｂ）。対応する単一点変異Ｎａ_Ｘチャネル構築物は堅牢な電流を生成し得ず、非導電性細孔モジュール状態の不安定化を通じてＳ６ゲート拡張を達成するための細孔湿潤閾値が存在することが示された（図３Ｃ）。Ｌ３９０Ｅ－Ｉ１８９Ｅ－Ｉ１４９２Ｅ三重変異型Ｎａ_Ｘチャネル構築物（Ｎａ_Ｘ－ＥＥＥ）も機能を示したが、Ｎａ_Ｘ－－ＱＴＴと比較して電流振幅が非常に低く、電流変動がより大きかった（図３Ｄおよび３Ｆ）。

【0121】

注入された卵母細胞では、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴ電流は、長時間（５秒間）の脱分極試験パルスの間でさえ不活化の徴候なく外向きに整流する（図３Ｂ）。Ｎａ_Ｘはβ１またはβ３サブユニットと安定に相互作用し得るので（図１Ｈおよび表２）、これらの補助サブユニットの機能的効果を評価した。Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴをそれぞれβ１サブユニットまたはβ３サブユニットの存在下で発現させた場合、電流振幅または動態に違いは観察されなかった（図３Ｅおよび３Ｆ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴはまた、Ｃ末端ＧＦＰ－２ｘＦＬＡＧタグを用いて発現させた場合、ホールセルパッチクランプ実験において非不活性化チャネルとして挙動する（下記参照）。重要なことに、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴチャネル構築物は、選択性フィルタおよび他の重要なチャネル領域から著しく除去された、細胞内Ｓ６ゲート（図３Ａ）の周りを標的とする３つの変異のみを含むので、以下、本発明者らは、ヒトＮａ_Ｘチャネルのイオン選択性および薬理学を評価するためのプロキシとしてＮａ_Ｘ－ＱＴＴを特徴付ける。

【0122】

実施例９－Ｎａ_Ｘ選択性フィルタ
Ｎａ_Ｘ（ＤＥＮＡモチーフ）の独特のイオン選択性フィルタは、Ｎａ_Ｖチャネルにおいて古典的なＤＥＫＡモチーフを支持する足場とは根本的に異なる局所構造によって支持されている（図４Ａ～Ｃ）。Ｎａ_Ｖチャネル内の４つの目印となるトリプトファン残基は、３つの保存されたトレオニン側鎖を含むドメイン間相互作用を形成している（図４Ｂ）^{２３，２８－３０，３５，３６}。Ｎａ_Ｘでは、Ｐｒｏ３５５がＤＩトリプトファンを置換し、Ａｌａ３５１およびＩｌｅ１４３２がそれぞれＤＩおよびＤＩＶトレオニンの対照物を置換する（図４Ｂ）。Ｎａ_ＸＰｒｏ３５５およびＩｌｅ１４３２と同等の位置のＮａ_Ｖ１．５における置換は病原性であり、これらの変化が機能的に関連性のある可能性を強調している。その結果、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタは、Ｎａ_Ｖチャネルの選択性フィルタよりも広く、電気陰性度が高い（図４Ｂ）。

【0123】

Ｎａ_ＸのＤＥＮＡモチーフでは、Ａｓｐ３５３（ＤＩ）がＤＩＩ－Ｔｒｐ６８９の骨格に水素結合し、Ｇｌｕ６８８（ＤＩＩ）がイオン透過経路を指し、Ａｓｎ１１４２（ＤＩＩＩ）がＤＩＶ－Ｐｈｅ１４３３カルボニルに結合して、Ｎａ_ＶチャネルのＤＩＶアラニンと比較してＡｌａ１４３４（ＤＩＶ）に約１．５Åの半径方向シフトを課す（図４Ａおよび図４Ｃ）。Ａｌａ１４３４の相対的な変位はＮａ_Ｘ中のＤＩ－Ｐｒｏ３５５によって適応され、これはまた、ＤＩ－Ｔｙｒ３５９が約９０°再配向して、存在しない従来のＤＩトリプトファンによって空いた体積を満たすことを可能にする（図４Ｃ）。この構造的再構築は、外側前庭部のＤＩ－Ｇｌｕ３５６およびＤＩＩ－Ｇｌｕ６９１を２．５～３．５Å置換し、これはカノニカルテトロドトキシン（ＴＴＸ）結合部位を修飾し、Ｎａ_Ｘ選択的阻害剤を発見する可能性を強調し得る（図１５Ａ）。

【0124】

実施例１０－Ｎａ_Ｘは一価陽イオンを区別しない
特徴的なＤＩＩＩ－Ａｓｎ１１４２側鎖は、Ｎａ_ＶチャネルにおけるＮａ^＋－選択性の確立において重要な役割を果たす従来のＤＩＩＩ－リジンと比較して、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタの構造および化学的プロファイルを劇的に変化させる（図４Ａ～Ｃ）。したがって、本発明者らは、単一の突然変異を介してＤＥＮＡモチーフをヒトＮａ_Ｖ１．７チャネルに導入し、注入されたアフリカツメガエル卵母細胞でＮａ^＋およびＬｉ^＋選択性の顕著な喪失を観察したが、異常な動態を有する測定可能なＫ^＋電流が記録された（図１５Ｂ）。相互実験では、標準的なＤＥＫＡモチーフのＮａ_Ｘへの変異導入は測定可能な電流を生じず（図１５Ｂ）、Ｎａ_ＸＤＥＮモチーフを超える分子的特徴がその活性化に寄与することが確認された。

【0125】

本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されるＮａ_Ｘ－ＱＴＴ構築物からの電流を調べ、細胞外溶液中の全ての陽イオンを大きな陽イオンＮ－メチル－Ｄ－グルカミン（ＮＭＤＧ）で置き換えた場合、反転電位が＋５ｍＶから－１００ｍＶ未満にシフトすることを見出し（図４Ｄ）、この構築物が陽イオンチャネルとして挙動し、大きな陽イオンが透過しないことが確認された。全ての細胞外Ｃｌ^－イオンを大きな陰イオンであるメタンスルホン酸で置換しても電流プロファイルは変化せず（図１５Ｃ）、Ｎａ_Ｘが陽イオン選択性チャネルとして挙動することを示し、これは選択性フィルタのサイズおよび電気陰性プロファイルと一致する（図４Ｂ）。予想通り、単純なＮａ^＋細胞内溶液（１５０ｍＭ）を用いたランププロトコル（－８０～＋８０ｍＶ）を使用すると、対称的なＮａＣｌ／ＮａＣｌ条件下で反転電位は０ｍＶに近かった（図４Ｅ）。特に、細胞を異なる細胞外一価陽イオン（１５０ｍＭ）に曝露した場合、反転電位のわずかな変化のみが測定され、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴがＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｓ^＋またはＬｉ^＋イオンを効果的に区別しないことが立証された（図４Ｅ）。

【0126】

実施例１１－Ｎａ_Ｘは細胞外Ｃａ^２＋によって阻害される
本発明者らは、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴから電流を測定し、Ｃａ^２＋が透過しないことを観察した（図５Ａ）。しかし、細胞外Ｃａ^２＋は阻害効果を示し、生理学的に適切な濃度のＣａ^２＋（１ｍＭ）は外向きのＮａ^＋電流の約７０％を阻害した（図５Ａ）。特に、細胞外Ｃａ^２＋の遮断は、従来のＮａ_Ｖチャネルと比較してＮａ_Ｘに対して約１０倍強力であり、選択性フィルタ内の物理化学的区別が確認された（図４Ａおよび図４Ｂ）。二価陽イオンであるＺｎ^２＋およびＣｏ^２＋は１ｍＭでＮａ_Ｘ－ＱＴＴ電流を阻害したが、三価陽イオンＧｄ^３＋による阻害はより強力であり（図５Ｂ）、多価陽イオンによる細孔ブロックがＮａ_Ｘのより広くより電気陰性の選択性フィルタ構造によって実質的に影響されないことを実証している（図４Ｂ）。

【0127】

実施例１２－Ｎａ_Ｘは従来のＮａ_Ｖチャネル遮断薬に対して感受性である
本発明者らは、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴの薬理特性を確立するために一連の古典的Ｎａ_Ｖチャネル遮断薬を試験した。注目すべきことに、Ｎａ_ＸがＴＴＸ抵抗性チャネルであるという以前の報告とは強く対照的に、テトロドトキシンは、１０ｎＭという低い濃度でＮａ_Ｘ－ＱＴＴに対して阻害効果を示した（図５Ｃ）。ＴＴＸブロックの効力は、感受性Ｎａ_ＶチャネルサブタイプのＴＴＸブロックに関与する側鎖の実質的な保存と一致して、ＴＴＸブロックが選択性フィルタで起こることを示唆している（図９および図１５Ａ）。

【0128】

全身麻酔薬リドカインは、おそらくチャネルの中央キャビティ内で結合することによって、低いｍＭ濃度でＮａ_Ｘ－ＱＴＴ電流を遮断するのに有効であった（図５Ｃ）。キニジンおよびロペラミドなどの他の古典的な細孔遮断薬は、高いμＭ濃度でＮａ_Ｘ－ＱＴＴ電流の同等に強力な阻害剤であった（図５Ｃ）。対照的に、フレカイニド、ラノラジンまたはフェニトインについては、３００μＭまでの濃度のＮａ_Ｘ－ＱＴＴ電流に対して強い阻害効果は観察されなかった（図５Ｃ）。

【0129】

実施例１３－Ｎａ_Ｘは非典型的な電圧センサ様ドメインを明らかにする
マウスまたはヒトＮａ_Ｘチャネルが電圧活性化電流を生成する条件はまだ同定されておらず、この明らかな電圧感受性の欠如は謎のままである。逆説的に、Ｓ４ゲーティング電荷の数はヒトＮａ_Ｘではわずかに減少し（図９）^{１４，１５，２２}、そのＶＳＬＤはＮａ_ＶおよびＣａ_ＶチャネルのＶＳＤと全体的に高い構造類似性を共有する（図１３Ｄおよび１３Ｅ）。興味深いことに、Ｎａ_Ｘ中のＶＳＬＤ１、ＶＳＬＤ２およびＶＳＬＤ３は全て活性化立体配座で見出されるが、ＶＳＬＤ４は不活性化されている（図６Ａ～図６Ｄ）。Ｎａ_ＸＶＳＬＤをより詳細に評価することにより、その明らかな欠陥電圧感受性の洞察を提供するはずである。

【0130】

ヒトＮａ_Ｖチャネルと比較して、Ｎａ_Ｘ中のＶＳＬＤ１は、４つの予想されるＳ４ゲート電荷のうちの３つしか含まない（_２０３ＰＴＬＱＴＡＲＴＬＲＩＬＫＩＩＰ_２１８；配列番号８７；図６Ａおよび図９）。Ｋ４は、活性化された立体配座（図６Ａ）と同様に、疎水性構築部位（ＨＣＳ）の下の細胞内負電荷クラスタ（ＩＮＣ）によって配位されている^{３７，３８}。注目すべきことに、Ｒ１でのグルタミン中和は、他のチャネルにおいて電圧感受性を低下させることが知られており^４０、Ｐｒｏ２０３は、Ｎａ_Ｖチャネルにおいてセリンとして保存された位置において、Ｎａ_ＸにおけるＳ４運動に影響を及ぼし得る細胞外Ｓ３－Ｓ４ループ内の放射状屈曲を付与する（図６Ａおよび９）。

【0131】

Ｎａ_ＸＶＳＬＤ２は、５つの予想されるＳ４ゲート電荷（_５９３ＡＬＬＲＬＦＲＭＬＲＩＦＫＬＧＫ _６０８；配列番号８８）を全て含み、その活性化状態は、Ｓ４カルボニル骨格に結合する固有のＳ３Ｈｉｓ５７９側鎖によって安定化されているようである（図６Ｂおよび図９）。さらに、ヒトＮａ_Ｖチャネル構造に対するＤＩＩＳ４－Ｓ５リンカーのサイトゾル（３－７Å）へのラジカルシフトは、ＶＳＬＤ２カップリングを変化させている可能性がある（図６Ｂおよび１３Ｄ）。これは、Ｎａ_ＸＤＩＩ－Ｓ６ヘリックス内の単一残基欠失によって伝播され、これはＰｈｅ７３１を再配置して約１８０°の再配向を受けてＳ４－Ｓ５リンカーを強制的に置換している（図６Ｂおよび図９）。

【0132】

Ｎａ_ＸＶＳＬＤ３は、６つの標準的なＳ４ゲート電荷（_１０２４ ＫＰＬＩＳＭＫＦＬＲＰＬＲＶＬＳＱ _１０４０；配列番号８９）のうちの４つのみを示し、その変化は、その活性化された立体配座を安定化させ、固有の電圧感受性を低下させると予測された（図６Ｃおよび図９）。さらに、Ｐｈｅ１０１１（Ｓ３）は、ＶＳＬＤ３におけるＨＣＳを実質的かつ一義的に拡張し（図６Ｃおよび図９）、これは、Ｓ４ゲーティング電荷移動にさらに影響を与えると予想される。

【0133】

Ｎａ_ＸＶＳＬＤ４は、Ｈ４およびＨ８が生理学的ｐＨで帯電する可能性が低いため^{３７，３９，４４，４５}、４つのＳ４ゲート電荷（_１３４６ ＱＬＩＬＬＳＲＩＩＨＭＬＲＬＧＫＧＰＫＶＦＨ _１３６７；配列番号９０）のみを含む（図６Ｄおよび図９）。比較すると、標準的なＮａ_ＶチャネルにおけるＶＳＤ４および関連するＤＩＶＳ４－Ｓ５リンカーは、高速不活性化機構に密接に連結された８つのＳ４ゲート電荷を保存する。ヒトＮａ_Ｖチャネル構造^{２３，２８，２９，３１，３７}および０ｍＶでの予想とは全く対照的に、Ｎａ_ＸのＶＳＬＤ４は、不活性化されたような状態で存在し、Ｓ４が細胞質側に相対的に約７Å変位していることが示されている（図６Ｄと１６Ａ）。この観察は驚くべきことであるが、Ｎａ_Ｘについてこれまでに記載された不十分な電圧感受性と一致する。

【0134】

実施例１４－発散Ｎａ_Ｘ ＶＳＬＤのプローブ機能
Ｎａ_ＸのＶＳＬＤにおいて同定された構造的特徴は、チャネル機能への非標準的な寄与を示唆する。さらに、関連するヒトチャネルにおける疾患の原因となる変化として報告されているＮａＸ中の位置に、いくつかの顕著な配列特異性が生じる。Ｎａ_ＸＶＳＬＤ１中のＰｒｏ２０３は、チャネル活性化を－１２ｍＶ過分極にすると報告されているＮａ_Ｖ１．７中の病原性Ｓｅｒ２１１Ｐｒｏ突然変異と同等である（図６Ａおよび図１６Ｂ）。構造に基づく配列アラインメントにより、類似のインフレームＤＩＩ－Ｓ６欠失がＮａ_Ｖ１．７（ΔＬｅｕ９６６）において病原性であり、活性化の－１６ｍＶの過分極を生じることが明らかになった（図６Ｂおよび図１６Ｂ）。Ｎａ_ＸＶＳＬＤ３中のＰｈｅ１０１１は、チャネル活性化に強い過分極（－４５ｍＶ）を与えると報告されたＫＣＮＱ１中の病原性Ｓｅｒ２０９Ｐｈｅ変異に対応し（図１６Ｃ）^４３、一方、Ｎａ_Ｖ１．７中の同等のＳｅｒ１２６９Ｐｈｅ置換は約８ｍＶの脱分極シフトをもたらした（図６Ｃおよび図１６Ｂ）。さらに、Ｎａ_ＸのＶＳＬＤ４には３つのプロリンが独特に存在し（図９および図１６Ｄ）、Ｎａ_Ｖ１．５中の対応するＶＳＤ４残基のプロリンに変異させると、ＶＳＬＤ４で観察された不活性化配座と一致して、定常状態不活性化に対する強い脱分極シフト（１５ｍＶ）を付与した（図６Ｄ、図１６Ａおよび図１６Ｅ）。

【0135】

Ｎａ_ＸＶＳＬＤ機能をさらに調査するために、本発明者らは、個々のＶＳＬＤのＮａ_Ｖ１．７への標的化された移入によってキメラ構築物を操作した。注目すべきことに、Ｎａ_Ｖ１．７－Ｎａ_Ｘ－ＶＳＬＤ２チャネルキメラを発現するアフリカツメガエル卵母細胞を注入すると、強い電流が記録され（図６Ｅ）、ＶＳＬＤ２が構成的に活性化されるか、または本質的に電気機械的カップリングが可能であることを示している。対照的に、Ｎａ_Ｘ－ＶＳＬＤ１、ＶＳＬＤ３またはＶＳＬＤ４のホールセールトランスファーにより、Ｎａ_Ｖ１．７キメラチャネルが機能しなくなった（図６Ｅ））。したがって、Ｎａ_ＸがＮａＶ、Ｃａ_ｖおよびＫ_Ｖチャネルと全体的な構造類似性を共有しているにもかかわらず、本発明者らの知見は、累積的な配列適応がチャネルスーパーファミリーにわたって非常に多様な機能的結果をもたらし得ることを示唆している。

【0136】

実施例１５－例示的なＮａ_Ｘ／Ｎａ_Ｖ１．７キメラ構築物
以下の表４に示すように、対応するＮａ_Ｘ配列の代わりにヒトＮａ_Ｖ１．７由来の１つ以上の領域が挿入された一連のキメラヒトＮａ_Ｘタンパク質を構築した。０ｍＶの保持電位から＋８０ｍＶまたは－１００ｍＶで誘発された構築物を発現するアフリカツメガエル卵母細胞の現在の振幅が、ヒトＮａ_Ｘ野生型を発現する卵母細胞からの振幅よりも有意に高い場合（図１８参照）、構築物は機能的であるとみなされる（表４参照）。表４の最初の７つのキメラおよびｈＮａ_Ｘ－ｈＮａ_Ｖ１．７ＤＩＶキメラのデータも実施例６に記載されており、図２Ｅに示す。

【表4】

【0137】

考察
上記の実施例は、Ｎａ_Ｘチャネルに関する洞察を提供するために、構造、機能および薬理学の統合分析を追求している。種々の発現系、補因子および薬理学的活性化因子を包括的に評価を通して、本発明者らは、ヒトＮａ_Ｘが電圧活性化チャネルとして機能しないことを実証した。同様の変化がＮａ_Ｖ１．５およびＮａ_Ｖ１．７チャネルのゲート特性に劇的な影響を及ぼし得るので、Ｎａ_Ｘの電圧感受性の変化の原因となる分子的特徴は、選択性フィルタ、電圧センサ、および細孔モジュール内の単一残基の変化が含まれ得る（図６Ａ～図６Ｅ、図９、図１６Ｂおよび図１６Ｅ）。実際、Ｎａ_Ｘに構造変化を与える多くの位置変化が、Ｎａ_Ｖチャネルにおける疾患ホットスポット位置の根底にあるように思われるが、これらの観察の重要性は不明のままである。

【0138】

構造誘導型タンパク質工学を使用して、本発明者らは、Ｎａ_ＸとＮａ_Ｖ１．７との間の全相同ドメインまたはサブドメイン（例えば、ＶＳＬＤ）を移動することで、非常に珍しいゲーティング特性を有する非機能性構築物またはチャネルのいずれかが生成されることが見出された（図２Ｅおよび６Ｅ）。これらの結果は、Ｎａ_Ｘゲーティングのカップリングまたはエネルギー論がＮａ_Ｖチャネルから実質的に異なることを示唆しており、これは、これらの密接に関連するチャネル足場間のカップリング界面に負担をかける構造的差異を指し示している可能性が高い。特に、本発明者らの研究は、Ｎａ_Ｘが特定の細胞状況において電圧変調チャネルとして機能し得る可能性を排除しない。ＮＡＬＣＮチャネルまたはＴＭＥＭ１６Ａチャネルについて最近記載されたように、推定上の補助サブユニットまたは補因子の結合がＮａ_Ｘにある程度の電圧感受性を付与し得ることが考えられる。

【0139】

Ｎａ^＋感知に対する差異の再調製
マウスＮａ_Ｘは、細胞外Ｎａ^＋濃度を１５０ｍＭを超えるように増加させると、非不活性化内向き電流を生じることが報告されている。本発明者らは、形質膜上でそれを安定化すると予想される因子（すなわち、ＳＡＰ９７）と同時発現させた場合でさえ、低いシール抵抗を有する定性的に同様の記録しか観察せず、ヒトＮａ_Ｘの異種発現時にＮａ^＋活性化電流を再構成し得なかった（図１Ｄおよび７Ｆ）。マウスおよびヒトのＮａ_Ｘタンパク質との間の配列の相違または細胞状況の相違が、これらの一見矛盾する機能的結果を説明すると考えられる（図９）。

【0140】

β３－Ｎａ_Ｘの本発明者らの低温ＥＭサンプルは、２００ｍＭ ＮａＣｌ中で、Ｎａ^＋依存性ゲーティングに必要な報告された閾値より高く調製された^９－１１。構造分析では明確なＮａ^＋感知遺伝子座または活性化に基づく機構は観察されず、細胞外Ｎａ^＋イオンとして割り当て得る唯一のマップ上の特徴は、Ｎａ_Ｘ選択性フィルタの近くで、Ｎａ_Ｖチャネルにも見られる部位に結合している（図１７Ａ）^{２９，４９}。本発明者らは、Ｎａ_Ｘについて記載されているＮａ^＋感知機構が、Ｎａ^＋／Ｋ^＋ＡＴＰアーゼ、エンドセリン受容体、またはまだ同定されていない系などの外因性タンパク質因子または経路によって寄与されている可能性が最も高いと推測している。Ｎａ_ＸＤＩＩＩ－ＤＩＶリンカーに沿った予測されるリン酸化部位の翻訳後修飾（図１４Ｂ）が、そのポアモジュール受容体部位からＩＦＩモチーフを除去してＳ６拡張およびチャネルゲート制御を促進するのに役立ち得ると考えられる。あるいは、Ｎａ_ＸのＤＩＶおよびＶＳＬＤ４内に見られる通常とは異なるが高度に保存されたヒスチジン残基の存在はまた、潜在的な細胞内二価陽イオンまたはｐＨ感受性活性化または調節機構の推測を高め得る（図６Ｄおよび図９）。

【0141】

Ｎａ_Ｘ仮説：非選択的Ｎａ^＋リークチャネル
構造分析および反復タンパク質工学実験によって導かれて、本発明者らは、疎水性Ｓ６ゲート領域の周りの３つの残基の標的変異させることが、アフリカツメガエル卵母細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されるヒトＮａ_Ｘを介して堅牢なイオン電流を生成するのに十分であることを見出した（図３、図４Ｄ、図４Ｅおよび図５）。おそらく、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴチャネル構築物に３つの極性側鎖を導入することにより、Ｓ６ゲートを水和させ、結合した膜脂質を除去し、細孔拡張およびイオン伝導が可能になる（図２Ｂ～図２Ｄ）。この概念的および技術的ブレークスルーにより、ヒトＮａ_Ｘの基本特性を特徴付けることが初めて可能となった。

【0142】

Ｎａ_Ｖチャネルとは異なり、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴは、細胞外Ｃａ^２＋イオンの非存在下でオーミックリークチャネルとして一価陽イオンを効果的に伝導する（図３、図４Ｄ、図４Ｅ）。Ｃａ^２＋は透過せず、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴを遮断するので、生理学的レベルの細胞外Ｃａ^２＋の存在下では、負の膜電位ではＮａ_Ｘ－ＱＴＴ電流は外向きに整流し、小さな内向きリーク成分のみを有する（図５Ａ）。この独特の電流の表現型は、ＴＴＸ、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋およびＧｄ^３＋による見かけの選択性フィルタブロック、ならびにリドカイン、キニジンおよびロペラミドによる推定細孔ブロックを含む、Ｎａ_Ｖ様チャネルに期待される薬理学的感受性を有する（図５Ｂおよび５Ｃ）。フレカイニド、ラノラジンまたはフェニトインは、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴ電流の強力な阻害をもたらさず（図５Ｃ）、これは、標準的なＮａ_Ｖチャネルに対するヒトＮａ_Ｘの特徴的な薬理学的プロファイルを示し、おそらく、ＤＩＶ－Ｔｒｐ１４８４（図１３Ｆ）のような特有の中央キャビティライニング残基、またはＮａ_Ｘにおける不活性化状態の潜在的欠如を反映している（図３Ｂおよび図４Ｄ）。Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴ電流は非不活性性であり、電圧によって変調されなかったが、細孔を湿潤するＱＴＴ変異はＳ６ゲート領域を標的とするので、野生型ヒトＮａ_Ｘチャネルにおけるこれらの重要な特性を定義するために今後の研究が必要とされる。それにもかかわらず、Ｎａ_Ｘがインビボでリークチャネルとして機能することを先の研究が示唆したことは注目に値する。

【0143】

Ｎａ_Ｘ選択性フィルタ構造の物理的、化学的および静電的プロファイルは、陽イオン選択性チャネルの予想を満たすが（図４Ａおよび図４Ｂ）、Ｎａ_ＶチャネルにおいてＮａ^＋選択性を付与するＤＩＩＩ－リジン側鎖を欠いている（図９）。実際、本発明者らのＮａ_Ｘ－ＱＴＴの電気生理学的特性評価により、試験した一価陽イオン（Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｓ^＋およびＬｉ^＋）間で選択性がないことが明らかになった（図４Ｅ）。したがって、本発明者らは、ヒトＮａ_Ｘが生理学的条件下で細胞外Ｃａ^２＋による調節に感受性のＮａ^＋リークチャネルとして機能すると仮定する（図５Ａ）。特に、Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴのＣａ^２＋遮断は、Ｎａ_Ｖチャネル上のＣａ^２＋遮断よりも約１０倍強力であるが（図５Ａ）、遠縁の関連する非選択的ＮＡＬＣＮＮａ^＋リークチャネルのＣａ^２＋遮断感受性と類似しており、おそらく細胞への過剰な脱分極Ｎａ^＋流入を回避するための共通の制御機構を反映している。

【0144】

細孔結合膜脂質の可視化
界面活性剤または脂質ナノディスク中で決定された本発明者らのＮａ_Ｘチャネル構造の顕著な特徴は、脂質がイオン伝導経路を完全に閉塞し、Ｓ６ゲートを封止する非伝導状態が可視化されたことであった（図２Ｃ、２Ｄおよび１４Ｆ）。Ｓ６ゲートを封鎖するリン脂質は、Ｎａ_Ｖチャネル構造^{２８，２９，３１}のＳ６ゲートに結合したコレステロール様分子を連想させる（図１７Ｂ）。Ｓ６ゲートにおけるこれらの疎水性リガンドの占有は、Ｎａ_Ｖチャネルにおける薬物ブロックに古典的に関与してきた保存されたＤＩＶ－Ｓ６チロシン側鎖の「上」配座と相関しているようである（図９および図１７Ｂ）^{２３，３１－３３}。特に、中央キャビティ内の薬物結合は、Ｓ６ゲート（図１７Ｂ）での脂質様密度の置換と同時に、この保存されたＳ６チロシン^{３０，３１}の「ダウンコンフォメーション」を強制し得る^３１。したがって、本発明者らのＮａ_Ｘ構造は、膜脂質がＳ６ゲートを封止し得、その脂質占有がイオン伝導性、薬物結合および細孔構造を調節し得る新たなパラダイムを支持する。この開発中のモデルは、Ｓ６ゲートがＮａ_Ｖチャネルをしっかりと閉じて完全に閉じなければならないという長年の見解とは強く対照的である^３０。

【0145】

概要および見解
Ｎａ_Ｘチャネルの基本的な生理学的および薬理学的特性は、ほぼ３０年前のそのクローニング以来、不可解なままである。本発明者らは、ヒトＮａ_Ｘが、本発明者らが調べた条件下で、Ｎａ^＋活性化チャネルとしても電圧活性化チャネルとしても独立して機能しないことを見出した。構造誘導型タンパク質工学的取り組みを通して、本発明者らは、従来の異種発現系を使用してヒトＮａ_Ｘチャネル変異体を特徴付けるためのアプローチを発見した。Ｎａ_Ｘ－ＱＴＴチャネル構築物は、Ｃａ^２＋およびＴＴＸによる強力な阻害を含む、特徴的であるがＮａ_Ｖチャネル様の薬理学的プロファイルを示し、Ｎａ_ＸチャネルがインビボでＣａ^２＋調節Ｎａ^＋リークチャネルとして作用し得ることを示唆する非選択的陽イオン伝導性を明らかにした。全体として、この研究は、ＮａＸの生理学および薬理学をさらに調べるための不可欠なツールを提供し、この非定型イオンチャネルの理解を大きく前進させる。

【0146】

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３５ Ｐａｙａｎｄｅｈ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｕｅｒ，Ｔ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．およびＣａｔｔｅｒａｌｌ，Ｗ．Ａ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ４７５，３５３－３５８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０２３８（２０１１）．
３６ Ｐａｙａｎｄｅｈ，Ｊ．，Ｇａｍａｌ Ｅｌ－Ｄｉｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｃｈｅｕｅｒ，Ｔ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．およびＣａｔｔｅｒａｌｌ，Ｗ．Ａ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｔｗｏ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ４８６，１３５－１３９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１０７７（２０１２）．
３７ Ａｈｕｊａ，Ｓ．らＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｎａｖ１．７ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｉｓｏｆｏｒｍ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５０，ａａｃ５４６４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｃ５４６４（２０１５）．
３８ Ｔａｏ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ａ．，Ｌｉｍａｐｉｃｈａｔ，Ｗ．，Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ａ．およびＭａｃＫｉｎｎｏｎ，Ｒ．Ａ ｇａｔｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｅｎｔｅｒ ｉｎ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２８，６７－７３，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８５９５４（２０１０）．
３９ Ｇａｇｎｏｎ，Ｄ．Ｇ．およびＢｅｚａｎｉｌｌａ，Ｆ．Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｒｇｅｄ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ ｉｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｈａｋｅｒ Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１３３，４６７－４８３，ｄｏｉ：１０．１０８５／ｊｇｐ．２００８１００８２（２００９）．
４０ Ｋｏｎｔｉｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｒｏｕｎａｇｈｉ，Ａ．およびＧｏｌｄｉｎ，Ａ．Ｌ．Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇａｔｉｎｇ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｉｎ ａｌｌ ｆｏｕｒ ｄｏｍａｉｎｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１１０，３９１－４０１，ｄｏｉ：１０．１０８５／ｊｇｐ．１１０．４．３９１（１９９７）．
４１ Ｅｓｔａｃｉｏｎ，Ｍ．らＣａｎ ｒｏｂｏｔｓ ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｈｕｍａｎｓ？ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ５８８，１９１５－１９２７，ｄｏｉ：１０．１１１３／ｊｐｈｙｓｉｏｌ．２００９．１８６１１４（２０１０）．
４２ Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｅｓｔａｃｉｏｎ，Ｍ．，Ｄｉｂ－Ｈａｊｊ，Ｓ．Ｄ．およびＷａｘｍａｎ，Ｓ．Ｇ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ Ｓ６ ｈｅｌｉｘ：ｒａｄｉａｌ ｔｕｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ １．７ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇａｔｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２８８，１３７４１－１３７４７，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１３．４６２３６６（２０１３）．
４３ Ｅｌｄｓｔｒｏｍ，Ｊ．らＭｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＬＱＴ１ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｓ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＫＣＮＱ１ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＩＫｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１３５，４３３－４４８，ｄｏｉ：１０．１０８５／ｊｇｐ．２００９１０３５１（２０１０）．
４４ Ｋｕｈｎ，Ｆ．Ｊ．およびＧｒｅｅｆｆ，Ｎ．Ｇ．Ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ Ｓ４ ｉｎ ｄｏｍａｉｎ ４ ｉｓ ｔｉｇｈｔｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｆａｓｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇａｔｉｎｇ ｃｈａｒｇｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１１４，１６７－１８３，ｄｏｉ：１０．１０８５／ｊｇｐ．１１４．２．１６７（１９９９）．
４５ Ａｒｎｏｌｄ，Ｗ．Ｄ．らＤｅｆｅｃｔｉｖｅ ｆａｓｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＮａＶ １．４ ｉｎ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｙａｓｔｈｅｎｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ７７，８４０－８５０，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｎａ．２４３８９（２０１５）．
４６ Ｂｏｓｍａｎｓ，Ｆ．，Ｍａｒｔｉｎ－Ｅａｕｃｌａｉｒｅ，Ｍ．Ｆ．およびＳｗａｒｔｚ，Ｋ．Ｊ．Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ４５６，２０２－２０８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７４７３（２００８）．
４７ Ｂｏｓｍａｎｓ，Ｆ．，Ｐｕｏｐｏｌｏ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎ－Ｅａｕｃｌａｉｒｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｂｅａｎ，Ｂ．Ｐ．およびＳｗａｒｔｚ，Ｋ．Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｏｘｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｖｉｅｗｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ１３８，５９－７２，ｄｏｉ：１０．１０８５／ｊｇｐ．２０１１１０６１４（２０１１）．
４８ Ｘｕ，Ｈ．らＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｎａｖ１．７ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ａ Ｇａｔｉｎｇ－Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｓｐｉｄｅｒ Ｔｏｘｉｎ．Ｃｅｌｌ１７６，７０２－７１５ ｅ７１４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．１２．０１８（２０１９）．
４９ Ｓｈｅｎ，Ｈ．らＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｂｙ ａｎｉｍａｌ ｔｏｘｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３６２，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｕ２５９６（２０１８）．
５０ Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｅ，Ｄ．Ｎ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｕｓｉｎｇ ｒｏｂｕｓｔ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ１５２，３６－５１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｂ．２００５．０７．００７（２００５）．
５１ Ｔｅｇｕｎｏｖ，Ｄ．およびＣｒａｍｅｒ，Ｐ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｄａｔａ ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｗａｒｐ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１６，１１４６－１１５２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９２－０１９－０５８０－ｙ（２０１９）．
５２ Ｚｉｖａｎｏｖ，Ｊ．らＮｅｗ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ＲＥＬＩＯＮ－３．Ｅｌｉｆｅ７，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．４２１６６（２０１８）．
５３ Ｇｒａｎｔ，Ｔ．，Ｒｏｈｏｕ，Ａ．およびＧｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｎ．ｃｉｓＴＥＭ，ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｍａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｅｌｉｆｅ７，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３５３８３（２０１８）．
５４ Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｓ．Ｈ．ＲＥＬＩＯＮ：ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ１８０，５１９－５３０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｂ．２０１２．０９．００６（２０１２）．
５５ Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．Ｑ．らＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２：ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅａｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１４，３３１－３３２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４１９３（２０１７）．
５６ Ｒｏｈｏｕ，Ａ．およびＧｒｉｇｏｒｉｅｆｆ，Ｎ．ＣＴＦＦＩＮＤ４：Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｆｏｃｕｓ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ１９２，２１６－２２１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｓｂ．２０１５．０８．００８（２０１５）．
５７ Ｍａｔｔｈｉｅｓ，Ｄ．らＳｉｎｇｌｅ－ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｖｏｌｔａｇｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｄｉｓｃｓ．Ｅｌｉｆｅ７，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３７５５８（２０１８）．
５８ Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，Ｍｅｚｕｌｉｓ，Ｓ．，Ｙａｔｅｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｗａｓｓ，Ｍ．Ｎ．およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ Ｐｈｙｒｅ２ ｗｅｂ ｐｏｒｔａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ１０，８４５－８５８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．０５３（２０１５）．
５９ Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．およびＣｏｗｔａｎ，Ｋ．Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ６６，４８６－５０１，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９１０００７４９３（２０１０）．
６０ Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｐ．Ｖ．らＲｅａｌ－ｓｐａｃｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｉｎ ＰＨＥＮＩＸ ｆｏｒ ｃｒｙｏ－ＥＭ ａｎｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ７４，５３１－５４４，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ２０５９７９８３１８００６５５１（２０１８）．
６１ Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．らＵＣＳＦ ＣｈｉｍｅｒａＸ：Ｍｅｅｔｉｎｇ ｍｏｄｅｒｎ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ２７，１４－２５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｒｏ．３２３５（２０１８）．
６２ Ｃｒｏｌｌ，Ｔ．Ｉ．ＩＳＯＬＤＥ：ａ ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ ｒｅａｌｉｓｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｌｏｗ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｐｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ７４，５１９－５３０，ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ２０５９７９８３１８００２４２５（２０１８）．
６３ Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖ．ｒ．ｐ．，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．
６４ Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．らＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａ－－ａ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ２５，１６０５－１６１２，ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｃｃ．２００８４（２００４）．
６５ Ｃｈｏｖａｎｃｏｖａ，Ｅ．らＣＡＶＥＲ ３．０：ａ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｄｙｎａｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ８，ｅ１００２７０８，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．１００２７０８（２０１２）．
６６ Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｆ．らＦａｓｔ，ｓｃａｌａｂｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ．Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ７，５３９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｓｂ．２０１１．７５（２０１１）．
６７ Ｒｏｂｅｒｔ，Ｘ．およびＧｏｕｅｔ，Ｐ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｋｅｙ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅｗ ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ ｓｅｒｖｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ４２，Ｗ３２０－３２４，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ３１６（２０１４）．
６８ Ｃｈｕａ，Ｃ．Ｈ．，Ｗｕｌｆ，Ｍ．，Ｗｅｉｄｌｉｎｇ，Ｃ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｌ．Ｐ．およびＰｌｅｓｓ，Ｓ．Ａ．Ｔｈｅ ＮＡＬＣＮ ｃｈａｎｎｅｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ．Ｓｃｉ Ａｄｖ６，ｅａａｚ３１５４（２０２０）．

【0147】

シーケンス表
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列をさらに記載する。

【表5】

【0148】

前述の発明は明確な理解のために例示および実例によって幾分詳細に説明されているが、これらの説明および実例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用される全ての特許および科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6AB】

【図6CD】

【図6E】

【図7-1】

【図7-2】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図9-8】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図11I】

【図11J】

【図11K】

【図11L】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20-1】

【図20-2】

【配列表】

2024520478000001.app

【国際調査報告】