特表 2024-520492 ＮＲ４Ａ３欠損免疫細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】ＮＲ４Ａ３欠損免疫細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240517BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240517BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

C12N15/09 100

C12N15/113 Z ZNA

C12N5/10

A61P35/00

A61P35/02

A61P37/04

A61K35/15

A61K39/395 T

A61K38/19

A61K38/20

A61K38/21

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573114

(86)(22)【出願日】2022-05-27

(85)【翻訳文提出日】2024-01-19

(86)【国際出願番号】 US2022031356

(87)【国際公開番号】W WO2022251644

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】63/194,745

(32)【優先日】2021-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/365,024

(32)【優先日】2022-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522421853

【氏名又は名称】ライエル・イミュノファーマ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＬＹＥＬＬ ＩＭＭＵＮＯＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ラム，ヴィオラ

(72)【発明者】

【氏名】リン，レイチェル クリスティーナ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084BA44

4C084CA18

4C084DA14

4C084DA24

4C084DA25

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB09

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4C084ZB27

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB65

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

本開示は、免疫細胞の持続的エフェクター機能を促進する方法であって、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように細胞を修飾することを含む、方法を提供する。また、修飾された細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾された免疫細胞が提供される。ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減することは、アポトーシス耐性及びさらに免疫チェックポイント耐性である疲弊／機能不全耐性細胞をもたらし、さらに腫瘍微小環境における抗腫瘍機能の維持をもたらす。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３（「ＮＲ４Ａ３」）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び結合分子を発現し、かつＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する修飾された免疫細胞の集団を含む細胞組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項2】

前記修飾された免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照細胞組成物（例えば、前記細胞がより低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞組成物）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記修飾された免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記リンパ球は、Ｔ細胞である、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記結合分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴＣＲを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記結合分子は、ＣＡＲを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記修飾された免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記修飾された免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記修飾された免疫細胞は、前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するように遺伝子編集ツールによって修飾されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記遺伝子編集ツールは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記修飾された免疫細胞の集団は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して前記対象における前記免疫細胞の１つ以上の向上した特性を示す、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記修飾された免疫細胞の前記向上した特性は、（ｉ）前記免疫細胞の向上した増殖、（ｉｉ）前記免疫細胞の向上した細胞傷害性、（ｉｉｉ）向上した持続性、（ｉｖ）前記免疫細胞の向上したサイトカイン発現、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記修飾された免疫細胞は、向上したサイトカイン発現を示す、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

ＩＬ－２の発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＩＦＮ－γの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－γの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

ＴＮＦ－αの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記修飾された免疫細胞は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して低減した疲弊または機能不全を示す、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記修飾された免疫細胞は、逐次刺激後に増加した細胞傷害性を示す、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記修飾された免疫細胞は、慢性刺激後に増加した細胞傷害性を示す、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

前記修飾された免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記結合分子は、Ｒ１２、Ｒ１１、２Ａ２、またはそれらの任意の組み合わせに由来するｓｃＦｖを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記結合分子は、配列番号１７を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２１を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記投与することは、参照腫瘍体積（例えば、前記投与前の前記対象における腫瘍体積及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して、前記対象における腫瘍体積を低減する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記腫瘍体積は、前記参照腫瘍体積（例えば、前記投与前の前記対象における前記腫瘍体積及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して前記投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記投与することは、参照腫瘍重量（例えば、前記投与前の前記対象における腫瘍重量及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して、前記対象における腫瘍重量を低減する、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記腫瘍重量は、前記参照腫瘍重量（例えば、前記投与前の前記対象における前記腫瘍重量及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して前記投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記投与することは、参照生存期間（例えば、前記投与前の前記対象における生存期間及び／または前記投与を受けなかった対象における生存期間）と比較して前記対象における生存期間を増加させる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記参照生存期間と比較して、前記生存期間は、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、または少なくとも約１年増加する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記投与することは、前記免疫細胞の疲弊または機能不全を低減または防止する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化器癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

追加の治療剤を前記対象に投与することを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記追加の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項39】

前記追加の治療剤及び前記細胞組成物は、同時に投与される、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記追加の治療剤及び前記細胞組成物は、逐次投与される、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞組成物は、非経口、筋肉内、皮下、眼内、静脈内、腹腔内、皮内、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、心室内、髄腔内、大槽内、嚢内、腫瘍内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、請求項１０～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３「（ＮＲ４Ａ３」）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する細胞を生成する方法であって、前記細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、前記遺伝子編集ツールは、前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、前記遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、前記方法。

【請求項44】

抗原刺激に応答する免疫細胞によってサイトカインの生成を増加させる方法であって、前記免疫細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、前記遺伝子編集ツールは、前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、前記遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、前記方法。

【請求項45】

前記サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記修飾後、前記抗原刺激に応答する前記サイトカインの前記生成は、前記遺伝子編集ツールで修飾されなかった対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

持続的抗原刺激に応答する免疫細胞のエフェクター機能を増加させる方法であって、前記免疫細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、前記遺伝子編集ツールは、前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、前記遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、前記方法。

【請求項48】

前記免疫細胞は、参照免疫細胞と比較して、抗原刺激アッセイの少なくとも１つの、少なくとも２つの、または少なくとも３つの追加のラウンドの間、エフェクター機能を保持する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記エフェクター機能は、（ｉ）標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷すること（ｉｉ）さらなる抗原刺激後にサイトカインを生成すること、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の能力を含む、請求項４７または４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項61】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項63】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項４２～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

細胞を含む組成物であって、前記細胞は、請求項４３に記載の方法によって調製されている、前記組成物。

【請求項72】

低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞を含む組成物であって、前記細胞は、前記ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されており、前記ｇＲＮＡは、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、前記組成物。

【請求項73】

前記ｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項74】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項75】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項76】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項77】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項78】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項79】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項80】

前記ｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項81】

前記ｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項82】

前記ｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項83】

前記ｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項84】

前記ｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項85】

前記ｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項86】

前記ｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項87】

前記ｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項88】

前記ｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項89】

前記ｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項90】

前記ｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項91】

前記ｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項92】

前記ｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項93】

前記ｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、請求項７２に記載の組成物。

【請求項94】

前記細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞を含む、請求項７１～９３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項95】

前記細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞を含む、請求項７１～９３のいずれか１項に記載の細胞組成物。

【請求項96】

請求項７１～９５のいずれか１項に記載の細胞組成物を含む薬学的組成物。

【請求項97】

（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、及び請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法に従って腫瘍を処置するための指示書を含むキット。

【請求項98】

（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、及び細胞の集団を含む組成物を調製するための指示書を含むキットであって、前記細胞は、請求項４３に記載の方法に従って調製される、前記キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年５月２８日に出願された米国仮出願番号６３／１９４，７４５；及び２０２２年５月１９日に出願された６３／３６５，０２４の優先権の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表に対する言及
本出願で提出された電子的に提出された配列表（名称：４３８５＿０７５ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：９７，２０１バイト；及び作成日：２０２２年５月２７日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／または低減したレベルのＮＲ４Ａ３タンパク質発現を有するように修飾された免疫細胞の投与を伴う細胞ベース（例えば、Ｔ細胞）のがん免疫療法に関する。

【背景技術】

【0004】

がん免疫療法は、Ｔ細胞（感染及び罹患細胞の免疫系の主要な殺傷体）に腫瘍細胞を攻撃させ、殺傷させることに依存する。しかしながら、免疫療法に対する重要な障害となる障壁がある：Ｔ細胞の殺傷する能力が衰える恐れがあり、この現象はしばしば疲弊と称される。免疫チェックポイント阻害、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及びＴ細胞受容体－操作（ＴＣＲ）Ｔ細胞療法は、患者から単離された機能的に活性なＴ細胞を利用する処置であり、有効となるように高機能なＴ細胞を必要とする。これらのＴ細胞は、標的がん細胞上の特定の抗原を認識するために操作され、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させられる。

【0005】

持続的ウイルス感染またはがんの進行性成長など、免疫系が長い期間活性であることを強いられる場合、エフェクターＴ細胞は疲弊し得る。疲弊したＴ細胞の１つの特質は、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４のような免疫チェックポイントタンパク質の増加した発現であり、これは、それらのＴ細胞の休止を引き起こし得る（すなわち、非機能的となる）。免疫チェックポイント阻害剤は、これらのチェックポイントタンパク質を遮断し、そのようにして、腫瘍に対する免疫応答を増加させ得る。いくつかの研究は、疲弊したＴ細胞におけるチェックポイントタンパク質の活性を阻止することが、その目的を達成しないことを示唆している。これは、いわゆるｈｏｔ ｔｕｍｏｒ（高レベルの免疫細胞を含み、よって、免疫療法に応答する理想的な候補であるべきもの）がしばしば、疲弊したＴ細胞から主に構成される集団を保有するので重要である。その上、腫瘍微小環境は、老化及び疲弊した細胞表現型を誘導し得る。そのため、これらの疲弊した状態を好転させる及び／または防止するためのストラテジーを考案することは、免疫治療有効性を改善するために重要である。

【発明の概要】

【0006】

いくつかの態様において、本開示は、腫瘍の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３（「ＮＲ４Ａ３」）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び結合分子（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）を発現し、かつＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する修飾された免疫細胞の集団を含む細胞組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照細胞組成物（例えば、細胞がより低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞組成物）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。一態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルは、約９０％～約９９％低減される。一態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルは、検出のレベル未満まで低減される。

【0007】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞である。

【0008】

いくつかの態様において、結合分子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴＣＲを含む。いくつかの態様において、結合分子は、ＣＡＲを含む。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞を含む。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞を含む。

【0009】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するために遺伝子編集ツールによって修飾されている。一態様において、細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子をノックアウトするために修飾されている。別の態様において、細胞は、機能的ＮＲ４Ａ３タンパク質発現が無効化されるようにＮＲ４Ａ３遺伝子を変異させるために修飾される。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲである。

【0010】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞の集団は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して対象における免疫細胞の１つ以上の向上した特性を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞の向上した特性は、（ｉ）免疫細胞の向上した増殖、（ｉｉ）免疫細胞の向上した細胞傷害性、（ｉｉｉ）向上した持続性、（ｉｖ）免疫細胞の向上したサイトカイン発現、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0011】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、向上したサイトカイン発現を示す。いくつかの態様において、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、ＩＬ－２の発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様において、ＩＦＮ－γの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－γの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する。いくつかの態様において、ＴＮＦ－αの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍増加する。

【0012】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して低減した疲弊または機能不全を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、逐次刺激後に増加した細胞傷害性を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、慢性刺激で増加した細胞傷害性を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する。

【0013】

いくつかの態様において、結合分子は、Ｒ１２、Ｒ１１、２Ａ２、またはそれらの任意の組み合わせに由来するｓｃＦｖを含む。いくつかの態様において、結合分子は、配列番号１７を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２１を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、投与することは、参照腫瘍体積（例えば、投与前の対象における腫瘍体積及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して、対象における腫瘍体積を低減する。いくつかの態様において、腫瘍体積は、参照腫瘍体積（例えば、投与前の対象における腫瘍体積及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。いくつかの態様において、投与することは、参照腫瘍重量（例えば、投与前の対象における腫瘍重量及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して、対象における腫瘍重量を低減する。いくつかの態様において、腫瘍重量は、参照腫瘍重量（例えば、投与前の対象における腫瘍重量及び／または投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減する。

【0014】

いくつかの態様において、投与することは、参照生存期間（例えば、投与前の対象における生存期間及び／または投与を受けなかった対象における生存期間）と比較して対象における生存期間を増加させる。いくつかの態様において、参照生存期間と比較して、生存期間は、少なくとも約１週、少なくとも約２週、少なくとも約３週、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約７ヶ月、少なくとも約８ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１０ヶ月、少なくとも約１１ヶ月、または少なくとも約１年増加する。

【0015】

いくつかの態様において、投与することは、免疫細胞の疲弊または機能不全を低減または防止する。いくつかの態様において、免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する。いくつかの態様において、腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化器癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する。

【0016】

いくつかの態様において、方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様において、追加の治療剤は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、追加の治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、追加の治療剤及び細胞組成物は、同時に投与される。いくつかの態様において、追加の治療剤及び細胞組成物は、逐次投与される。

【0017】

いくつかの態様において、細胞組成物は、非経口、筋肉内、皮下、眼内、静脈内、腹腔内、皮内、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、心室内、髄腔内、大槽内、嚢内、腫瘍内、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。

【0018】

上記方法のいずれかのため、いくつかの態様において、遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む。

【0019】

いくつかの態様において、本開示は、低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３「（ＮＲ４Ａ３」）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する細胞を生成する方法であって、細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、方法を提供する。

【0020】

いくつかの態様において、本開示はまた、抗原刺激に応答する免疫細胞によってサイトカインの生成を増加させる方法であって、免疫細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、修飾後、抗原刺激に応答するサイトカインの生成は、遺伝子編集ツールで修飾されなかった対応する免疫細胞と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。

【0021】

いくつかの態様において、本出願は、持続的抗原刺激に応答する免疫細胞のエフェクター機能を増加させる方法であって、免疫細胞を遺伝子編集ツールで修飾することを含み、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減し、遺伝子編集ツールは、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、免疫細胞は、参照免疫細胞と比較して、抗原刺激アッセイの少なくとも１つの、少なくとも２つの、または少なくとも３つの追加のラウンドの間、エフェクター機能を保持する。いくつかの態様において、エフェクター機能は、（ｉ）標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷すること（ｉｉ）さらなる抗原刺激後にサイトカインを生成すること、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方の能力を含む。

【0022】

いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0023】

いくつかの態様において、本開示は、細胞を含む組成物であって、細胞は、請求項４３に記載の方法によって調製されている、組成物を提供する。いくつかの態様において、本明細書では、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞を含む組成物であって、細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されており、ｇＲＮＡは、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる、組成物が提供される。

【0024】

いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0025】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の方法によって調製された細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞である。

【0026】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の細胞を含む薬学的組成物を提供する。

【0027】

いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、及び本明細書に記載の方法に従って腫瘍を処置するための指示書を含むキットを提供する。

【0028】

いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、及び本明細書に記載の方法に従って細胞組成物を調製するための指示書を含むキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】Ａ及びＢは、５つの独立したドナーにおける２時間のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄ刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞生成の７日目のＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ ＫＯ」）及び対照非編集ＣＤ４^＋（図１Ａ）及びＣＤ８^＋（図１Ｂ）抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮＲ４Ａ３発現の割合を示している（刺激、黒色の丸）。非刺激細胞（白色の丸、Ｄｙｎａｂｅａｄｓなし）を陰性対照として使用した。刺激条件の対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図2】ＣＡＲ Ｔ細胞生成の７日目の５つのドナーからのＮＲ４Ａ１編集（「ＮＲ４Ａ１ ＫＯ」）、ＮＲ４Ａ２編集（「ＮＲ４Ａ２ ＫＯ」）、ＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ ＫＯ」）、及び対照非編集ＣＤ４^＋（白色の丸）及びＣＤ８^＋（黒色の丸）抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現の割合を示している。

【図3】逐次刺激アッセイにおける５つの独立したドナーにおけるＮＲ４Ａ編集によるＨ１９７５－ＮＬＲ ＮＳＣＬＣ細胞または対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（「ｘ」記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞（四角）の連続的な抗ＲＯＲ１溶解を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。Ｈ１９７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解を総ＮＬＲ強度を測定することによって定量した。各ラウンドの刺激のための再播種後の開始強度に対してＮＬＲ強度を正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ。

【図4A】図３に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（「ｘ」記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図4B】図３に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（「ｘ」記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌インターロイキン－２（ＩＬ－２）を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図4C】図３に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（「ｘ」記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌腫瘍－壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図5A】図３に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイ中の各再播種後のＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ（「ｘ」記号）、及びモック非形質導入（四角）Ｔ細胞からのＣＤ４^＋（上側）及びＣＤ８^＋（下側）Ｔ細胞上の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ発現を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。Ｄ０は、アッセイの開始時のＣＡＲ発現の頻度を示している。

【図5B】図３に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集及び対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞からの突出ＣＤ３^＋抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞数の倍率変化を示している。突出細胞数は、次の刺激への細胞の２５％の移行を含むように計算した。倍率変化は、（刺激からの突出細胞数／先行刺激からの突出細胞数）として計算した。図５Ｂにおいて、刺激１、刺激２、及び刺激３の各々におけるバーは、以下に対応する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角；第１のバー）；（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星；第２のバー）；（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸；第３のバー）；及び（ｉｖ）対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号；第４のバー）。グラフの各々は、独立したドナーを表す。

【図6】図３における第２の刺激に対応するＨ１９７５逐次刺激アッセイからのＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ ＫＯ」）及び対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞からのＲＯＲ１ ＣＡＲ^＋ＣＤ４^＋（上側）及びＣＤ８^＋（下側）Ｔ細胞上の阻害性受容体（ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ３９、及びＰＤ－１）の発現を示している。対応のあるｔ検定を統計的分析のために使用した。＊＊ｐ＜０．００５。ｎ＝５つの独立したドナー。

【図7A】Ｈ１９７５慢性刺激アッセイにおける７日間のＲＯＲ１抗原刺激後の５つの独立したドナーにおけるＡ５４９（上の列）またはＨ１９７５（下の列）腫瘍細胞と共培養されたＮＲ４Ａ編集及び対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞から生成された分泌インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を示している。７日目に設定された新たな共培養から２４時間後に上清を収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフの各々は、独立したドナーを表す。グラフの各々において、バーは以下に対応する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角；第１のバー）；（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星；第２のバー）；（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸；第３のバー）；及び（ｉｖ）対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号；第４のバー）。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7B】Ｈ１９７５慢性刺激アッセイにおける７日間のＲＯＲ１抗原刺激後の５つの独立したドナーにおけるＡ５４９（上の列）またはＨ１９７５（下の列）腫瘍細胞と共培養されたＮＲ４Ａ編集及び対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞から生成された分泌インターロイキン－２（ＩＬ－２）を示している。７日目に設定された新たな共培養から２４時間後に上清を収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフの各々は、独立したドナーを表す。グラフの各々において、バーは以下に対応する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角；第１のバー）；（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星；第２のバー）；（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸；第３のバー）；及び（ｉｖ）対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号；第４のバー）。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図7C】Ｈ１９７５慢性刺激アッセイにおける７日間のＲＯＲ１抗原刺激後の５つの独立したドナーにおけるＡ５４９（上の列）またはＨ１９７５（下の列）腫瘍細胞と共培養されたＮＲ４Ａ編集及び対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞から生成された分泌腫瘍－壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）を示している。７日目に設定された新たな共培養から２４時間後に上清を収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフの各々は、独立したドナーを表す。グラフの各々において、バーは以下に対応する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角；第１のバー）；（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星；第２のバー）；（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸；第３のバー）；及び（ｉｖ）対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号；第４のバー）。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。対応のないｔ検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図8A】図７に対応するＨ１９７５慢性刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集及び対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞からのＣＤ４^＋（上側）及びＣＤ８^＋（下側）Ｔ細胞上のＲＯＲ１ ＣＡＲ発現を示している。示されるＮＲ４Ａ編集細胞には、ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、及びＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）が含まれる。

【図8B】図７に対応する７日間のＨ１９７５慢性刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集及び対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞からのＣＤ３^＋抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ^＋Ｔ細胞数の倍率変化を示している。倍率変化は、（現行Ｅ：Ｔ再設定からの細胞数／先行Ｅ：Ｔ再設定細胞数）として計算した。グラフの各々は、独立したドナーを表す。図８Ｂにおいて、２日目、４日目、及び７日目の各々について示されるバーは以下に対応する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角；第１のバー）；（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星；第２のバー）；（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸；第３のバー）；及び（ｉｖ）対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号；第４のバー）。カラムは、５つの独立したドナーからのデータを示している。

【図9】図７に対応するＨ１９７５慢性刺激アッセイの７日目のＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ ＫＯ」）及び対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ細胞からの抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ^＋ＣＤ４^＋（上側）及びＣＤ８^＋（下側）Ｔ細胞上の阻害性受容体（ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＤ３９、及びＰＤ－１）の発現を示している。ｎ＝５つの独立したドナー。

【図10A】ＮＲ４Ａ３編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の改善されたｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示している。腫瘍体積を示している。平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ^３に到達したときに、マウス当たり０．６×１０^６個（上側パネル、低用量）または２×１０^６個（下側パネル、高用量）のいずれかのＣＡＲ^＋Ｔ細胞でＮＲ４Ａ編集または対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに静脈内処置した。１群当たりｎ＝５匹のマウス。エラーバーは、平均＋／－ＳＥＭを表す。生存曲線統計は、ログ・ランク（Ｍａｎｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊ｐ＜０．０００１。示される異なる群には、（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）、（ｉｖ）対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞（四角）が含まれる。

【図10B】ＮＲ４Ａ３編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の改善されたｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示している。皮下側腹部Ｈ１９７５異種移植片腫瘍が移植されたＮＳＧマウスの生存を示している。平均腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ^３に到達したときに、マウス当たり０．６×１０^６個（上側パネル、低用量）または２×１０^６個（下側パネル、高用量）のいずれかのＣＡＲ^＋Ｔ細胞でＮＲ４Ａ編集または対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに静脈内処置した。１群当たりｎ＝５匹のマウス。エラーバーは、平均＋／－ＳＥＭを表す。生存曲線統計は、ログ・ランク（Ｍａｎｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって計算した。＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊ｐ＜０．０００１。示される異なる群には、（ｉ）ＮＲ４Ａ１ノックアウト（三角）、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２ノックアウト（星）、（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３ノックアウト（丸）、（ｉｖ）対照非編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ｘ記号）、及びモック非形質導入Ｔ細胞（四角）が含まれる。

【図11A】ＮＲ４Ａファミリーの以下の複数のメンバーの低減したレベルを有するように修飾された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＡ５４９－ＮＬＲ及びＨ１９７５－ＮＬＲ細胞の連続的溶解をそれぞれ示している：（１）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２の両方（「ＮＲ４Ａ１＋２ＤＫＯ」）（中空丸）、（２）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３の両方（「ＮＲ４Ａ１＋３ＤＫＯ」）（三角）、（３）ＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３の両方（「ＮＲ４Ａ２＋３ＤＫＯ」）（星）、及び（４）ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３（「ＮＲ４Ａ ＴＫＯ」）（アスタリスク）。ＮＲ４Ａ３のみ低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（中実丸）も比較目的のために示されている。モック（ＲＯＲ１ ＣＡＲまたはＮＲ４Ａ編集を伴わない非形質導入Ｔ細胞）（四角）は、対照として示されている。Ｈ１９７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解を総ＮＬＲ強度を測定することによって定量した。各ラウンドの刺激のための再播種後の開始強度に対してＮＬＲ強度を正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ。

【図11B】ＮＲ４Ａファミリーの以下の複数のメンバーの低減したレベルを有するように修飾された抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によるＡ５４９－ＮＬＲ及びＨ１９７５－ＮＬＲ細胞の連続的溶解をそれぞれ示している：（１）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２の両方（「ＮＲ４Ａ１＋２ＤＫＯ」）（中空丸）、（２）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３の両方（「ＮＲ４Ａ１＋３ＤＫＯ」）（三角）、（３）ＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３の両方（「ＮＲ４Ａ２＋３ＤＫＯ」）（星）、及び（４）ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３（「ＮＲ４Ａ ＴＫＯ」）（アスタリスク）。ＮＲ４Ａ３のみ低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（中実丸）も比較目的のために示されている。モック（ＲＯＲ１ ＣＡＲまたはＮＲ４Ａ編集を伴わない非形質導入Ｔ細胞）（四角）は、対照として示されている。Ｈ１９７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解を総ＮＬＲ強度を測定することによって定量した。各ラウンドの刺激のための再播種後の開始強度に対してＮＬＲ強度を正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ。

【図12】Ａ～Ｃは、Ａ５４９標的細胞を使用した逐次刺激アッセイ（図１１Ａを参照されたい）中にＮＲ４Ａファミリーの複数のメンバーの低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によって生成されたＩＦＮ－γ（図１２Ａ）、ＩＬ－２（図１２Ｂ）、及びＴＮＦ－α（図１２Ｃ）レベルを示している。ＮＲ４Ａ編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照群は、図１１Ａ及び１１Ｂに記載のものと同じである。上清を各再播種（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、刺激４、及び刺激５）から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。

【図13】Ａ～Ｃは、Ｈ１９７５標的細胞を使用した逐次刺激アッセイ（図１１Ｂを参照されたい）中にＮＲ４Ａファミリーの複数のメンバーの低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞によって生成されたＩＦＮ－γ（図１３Ａ）、ＩＬ－２（図１３Ｂ）、及びＴＮＦ－α（図１３Ｃ）レベルを示している。ＮＲ４Ａ編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞及び対照群は、図１１Ａ及び１１Ｂに記載のものと同じである。上清を各再播種（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、刺激４、及び刺激５）から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。

【図14】逐次刺激アッセイにおける３つの独立したドナーにおけるＮＲ４Ａ－編集（ＫＯ）、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞及びモック非形質導入Ｔ細胞によるＮＹ－ＥＳＯ－１＋Ａ３７５－ＮＬＲ黒色腫細胞の連続的溶解を示している。Ａ３７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解を総ＮＬＲ数を測定することによって定量した。各ラウンドの刺激のための再播種後の開始数に対してＮＬＲ数を正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ。各グラフは、３つの独立したドナーからのデータを示している。

【図15A】図１４に対応するＡ３７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を示している。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフは、３つの独立したドナーからのデータを示している。図１５Ａ～１５Ｃの各々において、刺激の各々（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、及び刺激４）について、１番目のバー（左から）は、ＮＲ４Ａ１編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ１ ＫＯ；三角）であり、２番目のバーは、ＮＲ４Ａ２－編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ２ ＫＯ；アスタリスク）であり；３番目のバーは、ＮＲ４Ａ３編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ３ ＫＯ；中実丸）であり；４番目のバーは、非編集対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（対照；ｘ記号）であり；５番目のバーは、非形質導入Ｔ細胞（モック；四角）である。

【図15B】図１４に対応するＡ３７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌インターロイキン－２（ＩＬ－２）示している。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフは、３つの独立したドナーからのデータを示している。図１５Ａ～１５Ｃの各々において、刺激の各々（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、及び刺激４）について、１番目のバー（左から）は、ＮＲ４Ａ１編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ１ ＫＯ；三角）であり、２番目のバーは、ＮＲ４Ａ２－編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ２ ＫＯ；アスタリスク）であり；３番目のバーは、ＮＲ４Ａ３編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ３ ＫＯ；中実丸）であり；４番目のバーは、非編集対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（対照；ｘ記号）であり；５番目のバーは、非形質導入Ｔ細胞（モック；四角）である。

【図15C】図１４に対応するＡ３７５逐次刺激アッセイ中のＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞、及びモック非形質導入Ｔ細胞から生成された分泌腫瘍－壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）を示している。上清を各再播種から２４時間後に収集し、サイトカインをＭＳＤによって定量した。グラフは、３つの独立したドナーからのデータを示している。図１５Ａ～１５Ｃの各々において、刺激の各々（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、及び刺激４）について、１番目のバー（左から）は、ＮＲ４Ａ１編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ１ ＫＯ；三角）であり、２番目のバーは、ＮＲ４Ａ２－編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ２ ＫＯ；アスタリスク）であり；３番目のバーは、ＮＲ４Ａ３編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ３ ＫＯ；中実丸）であり；４番目のバーは、非編集対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（対照；ｘ記号）であり；５番目のバーは、非形質導入Ｔ細胞（モック；四角）である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本開示は、疾患の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現し、かつＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する修飾された免疫細胞の集団を含む組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルの低減は、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集技術を使用することによって達成され得る。本開示から明らかになるように及び本明細書で実証されるように、いくつかの態様において、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する修飾された免疫細胞はまた、低減したレベルのＮＲ４Ａファミリーの他のメンバーを発現し得る。したがって、いくつかの態様において、本開示のために有用な修飾された免疫細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有する。いくつかの態様において、本開示のために有用な修飾された免疫細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する。いくつかの態様において、本開示のために有用な修飾された免疫細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する。

【0031】

ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質発現のレベルの低減は（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）、１つ以上の持続的エフェクター機能をもたらし得る。持続的エフェクター機能の１つの態様は、向上したＴ細胞活性化（例えば、向上した増殖、向上した細胞傷害性、向上したサイトカイン発現）。ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減することは（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）、疲弊／機能不全耐性細胞をもたらし得る。さらに、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減することは（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）、ＴＭＥ環境において抗腫瘍機能の維持をもたらし得る。

【0032】

本開示はまた、例えば、低減したレベルの核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質を発現する修飾された免疫細胞を生成するための方法、修飾された免疫細胞を使用するための方法、薬学的組成物、またはキットを提供する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、そのような方法、薬学的組成物、またはキットのために有用な修飾された免疫細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を有するようにさらに修飾されている。

【0033】

本開示がより詳細に記載される前に、本開示は、記載される特定の組成物またはプロセス工程に限定されないが、そのようなものは当然ながら変わり得ることが理解されるべきである。本開示を読むことで当業者に明らかになるように、本明細書において記載及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの態様のいずれかの特徴から容易に分離されまたはそれと組み合わされ得る個別の成分及び特徴を有する。任意の記述された方法は、記述された事象の順序でまたは論理的に可能性のある任意の他の順序で行われ得る。

【0034】

本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、本開示の態様は、本明細書の全体を参照することによって定義され得る。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を記載する目的のためのものにすぎず、限定することは意図されていないことも理解されたい。

【0035】

Ｉ．用語
本開示がより容易に理解され得るために、所定の用語が最初に定義される。本出願で使用する場合、別段明示的に本明細書で提供される場合を除き、以下の用語の各々は、以下に示される意味を有するものとする。追加の定義が本出願を通して示されている。

【0036】

本開示を通して、「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体の１つ以上を指す；例えば、「免疫細胞」は、１つ以上の免疫細胞を表すことが理解される。このように、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で同義に使用され得る。

【0037】

さらに、「及び／または」は、本明細書で使用する場合、他方を伴うかまたは伴わない、２つの特定の特性または成分の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。よって、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。

【0038】

態様が「含む」という言葉を用いて本明細書に記載されている場合はいつでも、「からなる」及び／または「本質的になる」の観点から記載される別の類似する態様も提供されることが理解される。

【0039】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。

【0040】

単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）の認められた形態で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特記なき限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書において提供する見出しは、本明細書全体を参照することにより得ることができる本開示の様々な態様を限定するものではない。したがって、以下で直ちに定義される用語は、その全体が本明細書への参照によってより十分に定義される。

【0041】

本明細書で使用される略語は、本開示を通して定義される。本開示の様々な態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載されている。

【0042】

「約」または「本質的に含む」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成物の許容誤差範囲内にある値または組成物を指し、これは、部分的には、値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」または「本質的に含む」は、当該技術分野における実践ごとに１標準偏差以内または１標準偏差を超えることを意味し得る。あるいは、「約」または「本質的に含む」は、最大１０％の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、最大１桁または最大５倍の値を意味し得る。特定の値または組成物が本出願及び特許請求の範囲で提供される場合、別段記述されない限り、「約」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成物の許容誤差範囲内にあると想定されるべきである。

【0043】

本明細書で使用する場合、「およそ」という用語は、対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値と同様の値を指す。いくつかの態様において、「およそ」という用語は、別途記述されない限り、または別途文脈から明らかでない限り、記述された参照値のいずれの方向に（それを超えるまたは未満）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内の値の範囲を指す（かかる数がとり得る値の１００％を超える場合を除く）。

【0044】

本明細書に記載されるように、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、別段示されない限り、記述された範囲内の任意の整数、ならびに適切な場合には、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）の値を含むことを理解されたい。

【0045】

本明細書で使用する場合、「投与すること」は、当業者に知られている様々な方法及び送達システムのいずれかを使用する、治療剤または治療剤を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載の治療剤のための様々な投与経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または、例えば注射もしくは注入による他の非経口投与経路が含まれる。「非経口投与」という語句は、本明細書で使用する場合、通常は注射による、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、気管内、肺内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、心室内、硝子体内、硬膜外、及び胸骨内の注射及び注入、ならびにｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される治療剤は、局部投与経路、表皮投与経路、または粘膜投与経路などの非経口的でない経路によって、例えば、鼻腔内投与、経口投与、膣内投与、直腸投与、舌下投与、または局部投与することができる。また、投与は、例えば１回、複数回、及び／または１以上の長い期間にわたって行うことができる。

【0046】

本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはハプテンなどの任意の天然または合成の免疫原性物質を意味する。本明細書で使用する場合、「同族抗原」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が認識することにより、免疫細胞の活性化を誘導する（例えば、サイトカイン生成などのエフェクター機能を誘導する、及び／または細胞の増殖のための細胞内シグナルを誘発する）、抗原を意味する。

【0047】

ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表される。特記なき限り、核酸は、５’から３’配向で左から右に記述される。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されるそれらの一般的に知られている１文字の記号によって本明細書で表される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

【0048】

配列Ｔ及びＵは、配列がＤＮＡであるか、またはＲＮＡであるかに応じて交換可能であることを理解されたい。例えば、ｇＲＮＡスペーサー配列は、本開示ではＤＮＡ（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）として提示される一方で、ｇＲＮＡキメラフレームは、ＲＮＡ（Ａ／Ｕ／Ｃ／Ｇ）として提示される。

【0049】

アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号によってまたはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号によって本明細書で表される。特記なき限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの配向で左から右に記述される。

【0050】

「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に連結したアミノ酸残基を含む鎖を意味し、鎖の長さに上限はない。タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基は、限定されないが、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合形成などの修飾を含み得る。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドを含み得る。特記なき限り、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は同義に使用され得る。

【0051】

「核酸分子」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、ｃＤＮＡであり得る。

【0052】

本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、分子の一次構造を指す。よって、その用語には、三本鎖、二本鎖及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。それにはまた、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化、及び／またはキャッピングによって修飾された形態、及び修飾されていない形態が含まれる。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、スプライシングされたまたはスプライシングされていないにかかわらず、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡが挙げられるポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－配糖体である任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびにＤＮＡ及びＲＮＡにおいて見出されるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含有することを条件とする他の配列特異的合成核酸ポリマーを含む。特記なき限り、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、及び「ｍＲＮＡ」という用語は、同義に使用され得る。

【0053】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。それには、コード領域（リーダー及びトレーラー）の前及び後の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）が含まれ得る。

【0054】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用する場合、連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種には「プラスミド」があり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターの場合、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自己複製が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。その上、所定のベクターは、それらが機能可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。通常、組換えＤＮＡ技術における利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるため、本明細書において「プラスミド」及び「ベクター」は同義に使用され得る。しかしながら、均等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも含まれる。

【0055】

「がん」とは、体内の異常細胞の成長がコントロールされないことを特徴とする様々な疾患の広範な群を意味する。制御不能な細胞分裂及び成長は、隣接組織に侵入する悪性腫瘍の形成をもたらし、また、リンパ系または血流を介して身体の遠位部分に転移し得る。本明細書で使用する「がん」は、原発性癌、転移癌、及び再発癌を意味する。

【0056】

本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、外来作用物質に対する脊椎動物における生物学的応答であり、これらの作用物質及びそれらに起因する疾患から生物を保護する応答を意味する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）ならびにこれらの細胞または肝臓のいずれかによって生成される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）であって、侵入する病原体、病原体に感染した細胞または組織、がん細胞または他の異常な細胞、あるいは自己免疫または病理学的炎症の場合、正常なヒトの細胞または組織の選択的標的化、結合、損傷、破壊、脊椎動物の体内から排除をもたらすものの作用によって媒介される。免疫反応には、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞などのエフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞の活性化もしくは阻害、またはＴ_ｒｅｇ細胞の阻害が含まれる。本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は同義であり、胸腺によって生成または処理されるあらゆるリンパ球を意味する。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。

【0057】

本明細書で使用する場合、「抗腫瘍免疫応答」という用語は、腫瘍抗原に対する免疫応答を意味する。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体のアゴニスト活性の向上及び／または抑制性受容体のアンタゴニスト活性の向上に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の上昇は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカインの放出、細胞溶解活性（標的細胞で直接的に、またはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムを検出することを介して間接的に決定される）、及び増殖の変化を測定するアッセイにおけるＥＣ_５０または最大活性レベルの倍率増加によって反映され得る。いくつかの態様において、免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％向上し得る。いくつかの態様において、免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、またはそれを超えて向上し得る。

【0058】

「対象」には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ならびにマウス、ラット、及びモルモットなどの齧歯動物などの脊椎動物が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で同義に使用される。

【0059】

「治療有効量」または「治療有効投薬量」という用語は、所望の生物学的、治療的、及び／または予防的結果を提供する薬剤（例えば、本明細書に開示される修飾された免疫細胞）の量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因のうちの１以上の低減、回復、緩和、減弱、遅延、及び／または軽減、または生物学的システムの任意の他の所望の変化であり得る。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、及び／または腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍成長を抑圧する）か、または他の望ましくない細胞増殖を防止または遅延させるために十分な量を含む。いくつかの態様において、有効量は、腫瘍発症を遅延させるために十分な量である。いくつかの態様において、有効量は、腫瘍再発を防止または遅延させるために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。有効量の組成物は、例えば、（ｉ）がん細胞の数を低減し、（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小し、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤を阻害し、遅らせ、ある程度減速させ、停止させ得、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度減速させ、停止させ得、（ｖ）腫瘍成長を阻害し、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を防止もしくは遅延させ、及び／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。

【0060】

いくつかの態様において、「治療有効量」は、進行固形腫瘍などのがんの著しい減少またはがんの進行の緩徐化（退縮）をもたらすことが臨床的に証明されている、本明細書における修飾された細胞の量である。疾患退縮を促進する治療剤の能力は、熟練した医師に知られている様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象で、ヒトにおける効能を予測する動物モデル系で、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで薬剤の活性をアッセイすることで評価することができる。

【0061】

本明細書で使用する場合、「標準治療」という用語は、特定の種類の疾患に適切な処置として医療専門家に認められており、医療従事者によって広く使用されている処置を意味する。この用語は、次の用語：「ベストプラクティス」、「標準的医療」、及び「標準療法」のいずれとも同義に使用され得る。

【0062】

例として、「抗がん剤」は、対象におけるがん退縮を促進し、またはさらなる腫瘍成長を防止する。いくつかの態様において、治療有効量の薬物は、がんを排除する点までがん退縮を促進する。

【0063】

「がんの退縮を促進する」とは、有効量の薬物を単独で、または抗新生物剤と組み合わせて投与することにより、腫瘍の成長またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度増大及び期間延長、または疾患の罹患による機能障害もしくは能力障害の防止をもたらすことを意味する。

【0064】

処置に関する「有効な」及び「有効性」という用語には、薬理学的有効性及び生理的安全性の両方が含まれる。薬理学的有効性とは、患者のがんの退行を促進する薬物の能力を意味する。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、細胞、器官、及び／または生物のレベルでの毒性または他の有害な生理学的効果（有害作用）のレベルを意味する。

【0065】

本明細書で使用する場合、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減させる、阻害する、干渉する、または調節する分子を意味する。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を制御する。ＣＴＬＡ－４ならびにそのリガンドのＣＤ８０及びＣＤ８６、ならびにＰＤ－１とそのリガンドのＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２など、多数のチェックポイントタンパク質が公知である。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １２（４）：２５２－６４（２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激性相互作用または阻害性相互作用の原因である。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容性、ならびに生理学的免疫応答の期間及び程度を制御し、維持する。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含むか、または抗体に由来する。

【0066】

本明細書で使用する場合、「酸化ストレス」という用語は、過剰な酸化剤及び／または抗酸化剤レベルの低下を特徴とする状態を意味する。細胞酸化剤は、限定するものではないが、酸素のラジカル（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び／またはペルオキシラジカル）；例えば、過酸化水素及び一重項酸素などの反応性非活性酸素種；炭素ラジカル；窒素ラジカル；硫黄ラジカル；ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、酸化ストレスの状態は、例えば、細胞損傷、細胞の機能不全、及び／または細胞死をもたらし得る。

【0067】

本明細書で使用する場合、「修飾された細胞」という用語は、細胞の表現型（すなわち、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベル）が、修飾されていない細胞（すなわち、参照細胞）とは異なるように、天然に存在しない操作を受けた細胞、例えば、Ｔ細胞を指す。本開示から明らかになるように、本明細書で開示される修飾された細胞は、参照細胞（例えば、修飾されていない対応する細胞）と比較して低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、修飾された細胞は、正常なレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現し得る。いくつかの態様において、本開示の修飾された細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を発現し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の修飾された細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現し得る。いくつかの態様において、修飾された細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する。本明細書で使用する場合、「対応する細胞」という用語は、修飾された細胞と同じ免疫細胞分類に属する細胞を指す。例えば、修飾された細胞がＴ細胞である場合、対応する細胞は、Ｔ細胞であろう。特記なき限り、「低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する（を発現する）修飾された細胞」（そのバリアントを含む）は、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質ならびに（ｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質；（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質；（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質；または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を有するように修飾された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む。

【0068】

本明細書で使用する場合、「内因性発現」または「内因性発現レベル」または「内因性レベル」（またはそのバリアント）という用語は、天然に存在する遺伝子及び／またはタンパク質発現（例えば、量、動態など）を指す（例えば、遺伝子及び／またはタンパク質が、天然に存在しない操作によって直接的に操作されていない）。本開示から明らかになるように、いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞（例えば、ＮＲ４Ａ３がノックダウンされたＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞）は、内因性レベルのＮＲ４Ａ３遺伝子またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現しないが、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子が、（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、例えば、天然に存在しない操作によって）ノックダウンされていないので、修飾された細胞は、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質を内因的に発現する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する修飾された細胞は、低減したレベルの（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方も発現するようにさらに修飾され得る。

【0069】

いくつかの態様において、修飾された細胞は、外来または外因性の核酸を細胞に導入することによって生成される。いくつかの態様において、外来または外因性核酸は、本明細書に開示される遺伝子編集ツールをコードし得る。核酸は、例えば、電気穿孔（例えば、Ｈｅｉｓｅｒ Ｗ．Ｃ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ商標 ２０００；１３０：１１７－１３４を参照されたい）、化学（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｗ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．１９８０ Ｍａｙ；６（３）：３３３－４７、Ｃｈｅｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８７ Ａｕｇｕｓｔ；７（８）：２７４５－２７５２を参照されたい）、組換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えば、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ Ｗ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８０ Ａｐｒｉｌ；７７（４）：２１６３－７を参照されたい）、または精製されたＤＮＡの細胞核への直接的な微量注入（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ Ｍ．Ｒ．Ｃｅｌｌ．１９８０ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２２（２ Ｐｔ ２）：４７９－８８を参照されたい）のような、当該技術分野で公知の方法によって細胞に導入することができる。

【0070】

「修飾された細胞」または「細胞」は、それらの細胞の集団、すなわち、複数のそれらの細胞に同等に適用可能であることを理解されたい。

【0071】

本明細書で使用する場合、「上昇した濃度」または「上昇したベル」という用語及びその文法的類型は、適切な対照（例えば、健康な組織または細胞）と比較して正常を超えるレベルの物質（例えば、反応性酸素種；ＲＯＳ）を指す。

【0072】

本明細書で使用する場合、「反応性酸素種」及び「ＲＯＳ」という用語は、酸素を含む高反応性化学物質で、他の分子と容易に反応し、損傷を生じる可能性のある修飾をもたらすものを意味する。反応性酸素種としては、例えば、酸素イオン、無機及び有機のフリーラジカル及び過酸化物、例えば過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、脂質ヒドロペルオキシダーゼ、及び一重項酸素が挙げられる。これらは通常きわめて小さい分子であり、不対原子価殻電子が存在するため反応性が高い。ほぼすべてのがんが、上昇した濃度の反応性酸素種に関連している。Ｌｉｏｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ ４４（５）：１－３１（２０１０）。

【0073】

「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原が細胞外ドメインに結合すると特殊な機能を果たすよう細胞に指示する、細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を意味する。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語は各々、本明細書では「キメラ抗原受容体」という用語と同義に使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原と結合し、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを伝達するその両方の能力によって他の抗原結合剤とは区別される。

【0074】

キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原、典型的には悪性腫瘍の表面発現抗原を認識し、それと特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインは、例えば、約０．１ｐＭ～約１０μＭ、例えば、約０．１ｐＭ～約１μＭまたは約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの親和性定数または相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する場合、抗原に特異的に結合する。相互作用の親和性を決定するための方法は、当該技術分野において知られている。本開示のＣＡＲにおいて使用するために好適な抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、その多種多様のポリペプチドが当該技術分野において知られている。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ＩｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化版、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）ならびに「ラクダ化」抗体可変ドメインが使用に好適である。いくつかの態様において、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶアルファＶベータを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に好適である。

【0075】

本明細書に開示されるキメラ抗原受容体は、抗原が抗原特異的細胞外ドメインに結合すると細胞内シグナルを細胞（ＣＡＲを発現するもの）に与える細胞内ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が発現されるＴ細胞のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化の原因である。

【0076】

「細胞内ドメイン」という用語は、ＣＡＲのうち、抗原が細胞外ドメインに結合するとエフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすようＴ細胞に指示する部分を意味する。好適な細胞内ドメインの非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、８２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えばＣＤ３ゼータ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ－１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の同様の分子及び断片が挙げられる。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩのような、活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用してもよい。通常は細胞内ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられ得る場合において、かかる切断部分は、依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切断部分を含むことが意図される。典型的に、抗原特異的細胞外ドメインは、膜貫通ドメインにより、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結している。膜貫通ドメインは、細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに接続し、したがってＴ細胞表面におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体は、１以上の共刺激ドメイン及び／または１以上のスペーサーをさらに含んでもよい。共刺激ドメインは、サイトカイン生成、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性をｉｎ ｖｉｖｏで向上させる共刺激性タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。

【0077】

「ペプチドヒンジ」または「スペーサー」は、抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに接続させる。膜貫通ドメインは共刺激ドメインに融合しており、任意選択で、共刺激ドメインは第２の共刺激ドメインに融合しており、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合している。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に、またタンデムＣＡＲの場合は複数のｓｃＦｖ間にスペーサードメインを含めると、抗原結合ドメイン（複数可）の柔軟性、ひいてはＣＡＲ機能に影響が及び得る。好適な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは当該技術分野において公知である。

【0078】

本明細書で使用する場合、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、「μｇ」及び「μΜ」とそれぞれ同義に使用される。

【0079】

本明細書で使用する場合、「遺伝子編集」という用語は、細胞のゲノムに存在する遺伝情報を変化させるプロセスを意味する。この遺伝子編集は、ゲノムＤＮＡを操作し、遺伝情報の修飾をもたらすことによって行われ得る。いくつかの態様において、かかる遺伝子編集は、編集されたＤＮＡの発現に影響を及ぼし得る。いくつかの態様において、そのような遺伝子編集は、編集されていないＤＮＡの発現に影響を及ぼさない。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞の遺伝子編集は、本明細書に記載される遺伝子編集ツールを使用して行うことができる。遺伝子編集ツールの非限定的な例としては、ＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0080】

本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を保有する酵素を指す。所望の認識部位へのニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤は、本明細書に開示される方法及び組成物において使用され得る。ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するまたはネイティブのヌクレアーゼ剤が使用され得る。あるいは、修飾されたまたは操作されたヌクレアーゼ剤が用いられ得る。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、所望の認識部位でニックまたは二本鎖切断を特異的に認識し、誘導するためにそのネイティブ形態から操作されたヌクレアーゼを含む。よって、操作されたヌクレアーゼ剤は、ネイティブの天然に存在するヌクレアーゼ剤に由来し得、またはそれは、人工的に生成または合成され得る。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤におけるわずか１つのアミノ酸または核酸切断剤におけるわずか１つのヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、操作されたヌクレアーゼは、認識部位におけるニックまたは二本鎖切断を誘導し、その認識部位は、ネイティブ（操作も修飾もされていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されるであろう配列ではなかったものである。認識部位または他のＤＮＡにおけるニックまたは二本鎖切断を生成することは、本明細書で認識部位または他のＤＮＡを「切ること」または「切断すること」と称され得る。

【0081】

「コード配列」または「コード核酸」は、本明細書で使用する場合、タンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＡＲ、もしくはＴＣＲ、またはポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を指導することが可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む制御性要素に作動可能に連結された開始及び終結シグナルをさらに含み得る。コード配列は、コドン最適化され得る。

【0082】

「相補性」または「相補的」は、本明細書で使用する場合、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログの間のワトソン・クリック（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を指す。「相補性」は、２つの核酸配列間で共有された特性であって、それらが互いに逆平行にアライメントされた場合、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的となるものを指す。

【0083】

本明細書に記載の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に記載される。

【0084】

ＩＩ．修飾された免疫細胞
固形腫瘍のための細胞免疫療法の成功は、腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の疲弊により制限されてきた。腫瘍抗原への持続的曝露は、Ｔ細胞疲弊をもたらし、これは、細胞傷害性及びサイトカイン生成の進行性喪失、ならびに阻害性マーカー、例えば、ＰＤ－１の増加した発現によって特性化される（Ｗｈｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，４８６－４９９（２０１５））。また、疲弊したＴＩＬは、転写因子、特にＮＲ４Ａファミリーを上方制御し、代替的に使用する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５６７，５３０－５３４（２０１９））。

【0085】

本開示は、修飾された免疫細胞、すなわち、例えば、遺伝子編集によって修飾された細胞であって、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現し、結果として、向上した機能、例えば、持続的エフェクター機能及び／または低減した疲弊を示す、細胞（例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３を発現するが、内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２を発現しないＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３を発現するが、内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２を発現しない抗ＲＯＲ１－ＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３を発現するが、内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２を発現しないＴＣＲを発現する免疫細胞）を提供する。いくつかの態様において、そのような修飾された免疫細胞は、低減したレベルのＮＲ４Ａファミリーの他のメンバーも発現するようにさらに修飾されている。例えば、本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する修飾された免疫細胞はまた、低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現するように修飾されている。いくつかの態様において、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する修飾された免疫細胞はまた、低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を発現するように修飾されている。いくつかの態様において、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する修飾された免疫細胞はまた、低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を発現するように修飾されている。

【0086】

ＩＩ．Ａ．ＮＲ４Ａ３
通常ＮＲ４Ａ３と略され、ＭＩＮＯＲ、ＣＳＭＦ、ＮＯＲ１、ＣＨＮ、マイトジェン誘導核オーファン受容体、ニューロン由来オーファン受容体、核ホルモン受容体ＮＯＲ－１、「ＥＷＳに融合された骨外性粘液型軟骨肉腫（Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ，Ｅｘｔｒａｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｙｘｏｉｄ，Ｆｕｓｅｄ ｔｏ ＥＷＳ）」及びＴＥＣとしても知られている核受容体サブファミリー４群Ａメンバー３は、ヒトにおいてＮＲ４Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。オーファン核受容体のＮＲ４Ａファミリーには、ＮＲ４Ａ１（Ｎｕｒ７７）、ＮＲ４Ａ２（Ｎｕｒｒ１）、及びＮＲ４Ａ３（Ｎｏｒ－１）が含まれる。それらは、リガンド非依存的様式で転写因子として働く。それらの機能は大抵、多様な細胞外シグナルによるそれらの発現の急速で一過性の誘導によってコントロールされ、よって、最初期遺伝子とみなされる。ＮＲ４Ａは、アポトーシス、生存、増殖、血管新生、炎症、ＤＮＡ修復、及び脂肪酸代謝を含む様々な細胞機能に関与する。

【0087】

ＮＲ４Ａ３遺伝子は、染色体９（塩基９９，８２１，８８５～９９，８６６，８９３；４５，０３９塩基；プラス鎖配向；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００９．１２）に位置する。ＮＲ４Ａ３は、細胞及び応答要素（標的）特異的様式でプロモーター領域における制御性要素に結合する転写活性化因子ある。ＮＲ４Ａ３は、単量体としてＮＲ４Ａ１応答要素（ＮＢＲＥ）５’－ＡＡＡＡＧＧＴＣＡ－３’部位に結合し、ホモ二量体として（類似性による）それらの制御された標的遺伝子のプロモーターにおけるＮｕｒ応答要素（ＮｕｒＲＥ）部位に結合することによって遺伝子発現を誘導し、多くの異なる細胞タイプの増殖、生存、及び分化の制御において役割を果たす。

【0088】

ＮＲ４Ａ３タンパク質は、選択的スプライシングによって生成された３つのアイソフォームを有する。配列が以下の表１に示されている。

【表1-1】

【表1-2】

【0089】

ＩＩ．Ｂ．ＮＲ４Ａ２
低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質に加えて、いくつかの態様において、本明細書に記載の修飾された細胞は、低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有するようにさらに修飾され得る。当該技術分野で知られている任意の好適な方法は、本明細書に記載の修飾された細胞におけるＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを低減するために使用され得る。例えば、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルは、本明細書に記載の遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）のいずれかを使用して低減され得る。

【0090】

通常ＮＲ４Ａ２と略され、ＮＯＴ、ＲＮＲ１、ＨＺＦ－３、ＮＵＲＲ１、ＴＩＮＵＲとしても知られている核受容体サブファミリー４群Ａメンバー２は、ヒトにおいてＮＲ４Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＮＲ４Ａ２遺伝子は、染色体２（塩基１５６，３２４，４３２～１５６，３３２，７２４、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０００００２．１２）に位置する。特記なき限り、「ＮＲ４Ａ２遺伝子」という用語は、ＮＲ４Ａ２タンパク質（またはそのバリアント）をコードする任意の核酸配列を指すために本明細書で使用される。

【0091】

ＮＲ４Ａ２タンパク質は、選択的スプライシングによって生成された２つのアイソフォームを有する。配列が以下の表２に示されている。特記なき限り及び本明細書でさらに記載されるように、いくつかの態様において、本明細書に記載の免疫細胞は、低減したレベルの任意の既知のＮＲ４Ａ２タンパク質（その任意のアイソフォーム及びバリアントを含む）を有するようにさらに修飾されている。ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを低減する好適な方法は、本開示において他の箇所に記載されており、また、当該技術分野で知られている。

【表2】

【0092】

ＩＩ．Ｃ．ＮＲ４Ａ１
低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質に加えて、いくつかの態様において、本明細書に記載の修飾された細胞は、低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有するようにさらに修飾され得る。当該技術分野で知られている任意の好適な方法は、本明細書に記載の修飾された細胞におけるＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルを低減するために使用され得る。例えば、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルは、本明細書に記載の遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）のいずれかを使用して低減され得る。

【0093】

通常ＮＲ４Ａ１と略され、ＨＭＲ、Ｎ１０、ＴＲ３、ＮＰ１０、ＧＦＲＰ１、ＮＡＫ－１、ＮＧＦＩＢ、及びＮＵＲ７７としても知られている核受容体サブファミリー４群Ａメンバー１は、ヒトにおいてＮＲ４Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＮＲ４Ａ１遺伝子は、染色体１２（塩基５２０２２８３２～５２０５９５０７；ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００１２．１２）に位置する。特記なき限り、「ＮＲ４Ａ１遺伝子」という用語は、ＮＲ４Ａ１タンパク質（またはそのバリアント）をコードする任意の核酸配列を指すために本明細書で使用される。

【0094】

ＮＲ４Ａ１タンパク質は、選択的スプライシングによって生成された３つのアイソフォームを有する。配列が以下の表３に示されている。

【表3】

【0095】

いくつかの態様において、本開示のために有用な細胞組成物は、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／または低減したレベルのＮＲ４Ａ３タンパク質及びＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現し、かつ（ｉ）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する修飾された免疫細胞の集団を含む。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、（ｉ）ＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現する；（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する；及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有する。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、（ｉ）ＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現する；（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する；及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、（ｉ）ＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現する；（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する；（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有する；及び（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する。本明細書で使用する場合、「ＮＲ４Ａ３遺伝子」という用語は、任意の転写産物、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指す。本明細書で使用する場合、「ＮＲ４Ａ３タンパク質」という用語は、上記で開示されるアイソフォームアルファ、アイソフォームベータ、またはアイソフォーム３、ならびにそのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用する場合、ＮＲ４Ａ３タンパク質という用語はまた、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質の少なくとも１つの機能を有する本明細書に開示されるアイソフォームのいずれかの任意の断片またはバリアントを包含する。

【0096】

本明細書で使用する場合、「低減したレベル」という用語（またはその類型）は、物理的レベルの低減（例えば、ゲノムからの編集によるより少ない遺伝子配列、またはタンパク質発現の減少によるより少ないタンパク質）及び機能の低減の両方を指す。例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルの低減は、終止コドンまたはフレームシフトを導入する変異の導入による、転写を改変するであろうエピジェネティック修飾による、またはＮＲ４Ａ３発現を制御するプロモーター遺伝子もしくは別の遺伝子の変異もしくは他の変化による、遺伝子機能の低下を指し得る。いくつかの態様において、修飾された細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルの低減は、参照細胞と比較して、機能的ＮＲ４Ａ３タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質をコードすることが可能なゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の減少を指す。同様に、ＮＲ４Ａ３タンパク質の低減は、機能の（部分的または完全な）喪失を引き起こす変化（例えば、変異または翻訳後修飾）、または、例えば、他の細胞シグナル伝達パートナーとのその相互作用を改変するＮＲ４Ａ３の機能的部位に結合する分子の活性を含むがこれらに限定されない、機能的ＮＲ４Ａ３タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現をもたらす変化を指し得る。

【0097】

ＮＲ４Ａ３遺伝子レベル（例えば、遺伝子全体もしくはその一部の存在／非存在、または遺伝子機能）は、当該技術分野で知られている様々な方法によって測定され得る。ＮＲ４Ａ３タンパク質レベル（例えば、ＮＲ４Ａ３タンパク質もしくはその断片の存在／非存在、または定量もしくはタンパク質機能）は、当該技術分野で知られている様々な方法によって測定され得る。

【0098】

いくつかの態様において、免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベル及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。いくつかの態様において、免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲを発現する細胞またはＴＣＲを発現する細胞の集団）におけるタンパク質におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現は、修飾後に完全に阻害される。

【0099】

いくつかの態様において、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子を発現するように修飾されていない対応する細胞の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0100】

いくつかの態様において、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0101】

いくつかの態様において、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及びＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及びＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0102】

同様に、いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞）はまた、参照免疫細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減したＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルを有する。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞）はまた、参照免疫細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減したＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを有する。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞）はまた、（ｉ）参照免疫細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減したＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベル；及び（ｉｉ）参照免疫細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）の集団と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減したＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを有する。

【0103】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞）は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する細胞の集団）は、リンパ球を含む。本明細書で使用する場合、「修飾された免疫細胞」には、最初に修飾された免疫細胞の子孫細胞が含まれ、子孫細胞はまた、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）発現する。

【0104】

いくつかの態様において、免疫細胞の集団は、純粋集団である。いくつかの態様において、純粋集団は、同じ免疫細胞タイプに属する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％の細胞を含む（例えば、免疫細胞の９９％はリンパ球である）。いくつかの態様において、免疫細胞の集団は、１、２、３、４、または５個の異なる細胞タイプを含み、例えば、２つの細胞タイプを含む免疫細胞の集団は、リンパ球及び樹状細胞を含み得るであろう。

【0105】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞の集団は、リンパ球を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞の集団は、リンパ球を含み、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の態様において、リンパ球は、Ｔ細胞である。いくつかの特定の態様において、リンパ球は、ＮＫ細胞である。

【0106】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＡＲを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲ（ＣＡＲ Ｔ細胞）を発現するように調製され得る修飾されたＴ細胞は、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、単一ＣＡＲ Ｔ細胞、ゲノム編集されたＣＡＲ Ｔ細胞、二重ＣＡＲ Ｔ細胞、またはタンデムＣＡＲ Ｔ細胞である。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞はＮＫ細胞である。いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、ＣＡＲを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲ ＮＫ細胞は、単一ＣＡＲ ＮＫ細胞、二重ＣＡＲ ＮＫ細胞、またはタンデムＣＡＲ ＮＫＴ細胞である。いくつかの態様において、本開示の修飾された細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方は、ＣＡＲを含む。そのようなＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＡＲ ＮＫ細胞の例は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４４１９５（ＷＯ２０２００２８４００Ａ１として公開された）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で提供される。

【0107】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、任意の免疫細胞タイプであり得る。いくつかの態様において、細胞は、任意の養子細胞移植（ＡＣＴ）療法（養子細胞療法としても知られている）のための修飾された免疫細胞である。ＡＣＴ療法は、自家療法または同種療法であり得る。いくつかの態様において、ＡＣＴ療法は、限定するものではないが、ＣＡＲ Ｔ療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、ＮＫ細胞療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0108】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、ＴＩＬ療法のためのＴＩＬである。がんを処置するための養子細胞移入療法としてのＴＩＬの使用は、黒色腫のＴＩＬ養子細胞療法を使用し、２０年以上にわたって研究されてきた。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｕｌｙ ２０１１）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（１３）：４５５０－７（Ｊｕｌｙ ２０１１）。養子Ｔ細胞移入療法では、手術によって切除した腫瘍を小さな断片に切り分けたもの、または腫瘍断片から単離した単細胞懸濁液から、ＴＩＬをｅｘ ｖｉｖｏで増殖させる。個々の培養物を複数確立し、別々に増殖させ、特異的腫瘍認識についてアッセイする。ＴＩＬは数週間にわたって増殖させる。次いで、最も良好な腫瘍反応性を示した特定のＴＩＬ株を、通常２週間にわたって抗ＣＤ３活性化を使用する「高速増殖プロトコール」（ＲＥＰ）でさらに増殖させる。培養物中で成長したＴＩＬは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現が（単独でまたはＮＲ４Ａファミリーの他のメンバー、例えば、ＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ２と組み合わせて）低減されるように、ｅｘ ｖｉｖｏプロセス中に任意の時間で修飾され得る。ＲＥＰ後の最終的なＴＩＬを患者に注入し戻す。このプロセスは、養子移入されたＴＩＬが腫瘍部位に十分に接近して包囲できるようにするために、内因性リンパ球を枯渇させる予備的な化学療法レジメンを含む場合もある。

【0109】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴ細胞受容体を含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、腫瘍抗原に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞、例えば、リンパ球は、Ｔ細胞受容体、例えば、操作されたＴＣＲを有するＴ細胞である。本明細書で使用する場合、「操作されたＴＣＲ」または「操作されたＴ細胞受容体」という用語は、選択される、クローニングされる、及び／または後にＴ細胞集団に導入される主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド標的抗原に所望の親和性で特異的に結合するように操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を意味する。

【0110】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞上で発現し得るＣＡＲまたはＴＣＲは、腫瘍細胞、例えば、悪性Ｂ細胞、悪性Ｔ細胞、または悪性血漿細胞上で発現した１つ以上の抗原に特異的に結合する（すなわち、それを標的とする）。

【0111】

いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ変異体タンパク質を含む）、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原に特異的に結合する（すなわち、それを標的とする）。

【0112】

いくつかの態様において、本開示の修飾された細胞は、抗原を標的とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し得る。Ｔ細胞受容体は、α鎖及びβ鎖という２つの異なる膜貫通ポリペプチド鎖から構成されたヘテロ二量体であり、これらの鎖は各々、鎖をＴ細胞表面膜内に固定する定常領域と、ＭＨＣが提示する抗原を認識し結合する可変領域からなる。ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γε及びＣＤ３δεの２つのヘテロ二量体、ならびに１つのホモ二量体ＣＤ３ζを形成する６つのポリペプチドに関連しており、これらが一緒になってＣＤ３複合体を形成している。Ｔ細胞受容体操作Ｔ細胞療法は、これらの複合体を保持するＴ細胞の修飾を利用して、特定の腫瘍細胞によって発現される抗原を特異的に標的とする。

【0113】

いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、共通の腫瘍関連抗原（共通ＴＡＡ）及びユニークな腫瘍関連抗原（ユニークＴＡＡ）、または腫瘍特異的抗原という主要なタイプを標的とし得る。前者には、限定するものではないが、がん精巣（ＣＴ）抗原、過剰発現抗原、及び分化抗原が含まれ得、後者には、限定するものではないが、新生抗原及びオンコウイルス抗原が含まれ得る。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質及びＨＰＶ Ｅ７タンパク質は、オンコウイルス抗原の分類に属する。

【0114】

いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、ＣＴ抗原、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９．２３、ＭＡＧＥ－Ａ１０、及びＭＡＧＥ－Ａ１２を含むがこれらに限定されない黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）を標的とし得る。いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、黒色腫及び正常なメラノサイトに主に見出される糖タンパク質（ｇｐ１００）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ－１）、及び／またはチロシナーゼを標的とし得る。いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、すなわち、ほとんどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、ほとんどすべての種類の固形腫瘍、及び数種の決定組織、例えば心臓組織で高発現する過剰発現抗原の１種を標的とし得る。いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、メソテリンを標的とし得、メソテリンは、中皮腫で高発現するが、気管を含む数種の組織の中皮細胞にも存在する別の種類の過剰発現抗原である。

【0115】

いくつかの態様において、修飾されたＴＣＲ操作細胞は、個々の腫瘍に特異的なランダムな体細胞変異によって形成され得る任意の新生抗原を標的とし得る。いくつかの態様において、ＴＣＲは、ＡＦＰ、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ変異体タンパク質を含む）、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるがん抗原に特異的に結合する（すなわち、それを標的とする）。

【0116】

いくつかの態様において、本開示の修飾された免疫細胞、例えば、ＣＡＲ ＴもしくはＮＫ細胞またはＴＣＲ操作されたＴ細胞は、上で開示される腫瘍抗原のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを標的とし得る。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者のおよそ５７％及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌患者の４２％で過剰発現しており（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ２０１７）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞にとって非常に魅力的な標的を意味する。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１陽性（ＲＯＲ１^＋）固形腫瘍は、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で安全に標的化され得る（Ｓｐｅｃｈｔ ２０２０）が、固形悪性腫瘍を有する患者では、ＣＡＲ Ｔ細胞が注入後に疲弊または機能不全を示すので、有効性は一部制限されている。また、固形腫瘍は、ＣＡＲ Ｔ細胞等の免疫療法の抗腫瘍活性を制限する免疫抑制バリアを有する（Ｎｅｗｉｃｋ ２０１６，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ２０１８，Ｍａｒｔｉｎｅｚ ２０１９）。いかなる１つの理論によって縛られることを望むものではなく、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現する細胞は、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されており、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する。また、本明細書において記載及び実証されるように、いくつかの態様において、抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現し、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するそのような細胞は、低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を発現するようにさらに修飾されている。いくつかの態様において、そのような細胞（すなわち、抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現し、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する）は、低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を発現するようにさらに修飾されている。いくつかの態様において、そのような細胞（すなわち、抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現し、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する）は、低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を発現するようにさらに修飾されている。これらの修飾された細胞は、疲弊に対してより耐性であり、当該技術分野で利用可能な他の抗ＲＯＲ１細胞と比較して改善されたエフェクター機能を示す。

【0117】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞は、ＲＯＲ１結合キメラ抗原受容体を含む。例示的な抗ＲＯＲ１ ＣＡＲは、Ｈｕｄｅｃｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの態様において、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲを含む本開示のＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているように（例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．の３１５５頁、第１段落全体）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）生成される。いくつかの態様において、本開示の抗ＲＯＲ１ ＣＡＲには、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．ａｔ ｐａｒａｇｒａｐｈ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｐａｇｅｓ ３１５４－５５；Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ４（２０１２）：３４９－６１；及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（２０１１）：ｅ２１０１８（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載の２Ａ２、Ｒ１１、及びＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬ配列を含む抗体またはその断片が含まれる。

【0118】

いくつかの態様において、本開示の抗原結合ドメインは、抗ＲＯＲ１抗体、例えば、Ｒ１２、抗体と交差競合することが可能である。Ｒ１２抗体配列が表２に示されている。いくつかの態様では、本開示のために有用な抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体の同じエピトープに結合する。当業者に明らかになるように、当該技術分野で知られている任意の抗ＲＯＲ１抗体が本開示で使用され得る。そのような抗体の非限定的な例には、Ｈｕｄｅｃｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４；Ｂａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ ４（２０１２）：３４９－６１；及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（２０１１）：ｅ２１０１８；ＵＳ９，３１６，６４６ Ｂ２；及びＵＳ９，７５８，５８６Ｂ２（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の２Ａ２及びＲ１１抗体が含まれる。

【表4】

【0119】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞のＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメインは、Ｒ１２抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合ドメイン、例えば、Ｒ１２ ｓｃＦｖは、Ｒ１２抗体のＶＨ及びＶＬを含む。

【0120】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞のキメラ結合タンパク質（例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲ）の細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するものを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば、２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＢ７－Ｈ３に由来するものをさらに含む。いくつかの態様において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

【0121】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるに修飾された免疫細胞のキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の膜貫通ドメインには、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ１９の少なくとも膜貫通領域（複数可）が含まれ得る。

【0122】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞のキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、共刺激ドメイン、例えば、本明細書に記載の共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合が欠如したＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む。

【0123】

いくつかの態様において、免疫細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するように遺伝子編集ツールによって修飾される。ＮＲ４Ａ３遺伝子の低減した発現は、例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子全体を編集することによって、ＮＲ４Ａ３遺伝子の一部分を編集することによって、ＮＲ４Ａ３遺伝子の発現をコントロールする制御性領域を編集することによって行われ得る。したがって、ＣＡＲを発現する細胞またはＴＣＲを発現する細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するために、細胞における遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低減するための当該技術分野で知られている任意の方法が使用され得る。例えば、いくつかの態様において、ＣＡＲを発現する細胞またはＴＣＲを発現する細胞のＮＲ４Ａ３遺伝子、及びそのコードされるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現は、細胞をＮＲ４Ａ３遺伝子、及びそのコードされるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを低減することが可能な遺伝子編集ツールと接触させることによって低減され得る。遺伝子編集ツールの非限定的な例が以下に示される。いくつかの特定の態様において、遺伝子編集ツールは、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の態様において、遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲである。ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現及び／またはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現も低減される場合、いくつかの態様において、そのような遺伝子編集ツールがまた使用され得る（例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１遺伝子を特異的に標的とする）。

【0124】

いくつかの態様において、免疫細胞（例えば、本明細書に開示される方法によって生成された、すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）の集団は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して対象における免疫細胞の１つ以上の向上したまたは改善した特性を示す。いくつかの態様において、本明細書に開示される免疫細胞の１つ以上の特性を改善することは、腫瘍の処置を補助し得る（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍重量を低減する）。本開示で改善され得る１つ以上の特性には、がんを処置する際に有用であり得る本明細書に開示される免疫細胞の任意の特性が含まれる。例えば、いくつかの態様において、免疫細胞（例えば、本明細書に開示される方法によって生成された、すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現するＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）の集団は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較してより高いエフェクター活性を示し得る。

【0125】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞の向上した特性は、参照細胞に対して
（ｉ）免疫細胞の増加した増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、
（ｉｉ）免疫細胞の増加した細胞傷害性、
（ｉｉｉ）免疫細胞の増加したサイトカイン発現、または
（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ
を含む。

【0126】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して疲弊耐性及び／または機能不全耐性がある。

【0127】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、アポトーシス耐性がある。すなわち、それらは、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して低減したアポトーシスを示し、またはアポトーシスを示さない。

【0128】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、免疫チェックポイント耐性がある。すなわち、それらは、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して低減した免疫チェックポイント活性を示し、または免疫チェックポイント活性を示さない。

【0129】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して向上したＴ細胞活性化を示す。いくつかの態様において、そのような向上したＴ細胞活性化は、例えば、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して向上した増殖、向上した細胞傷害性、向上したサイトカイン発現、またはそれらの任意の組み合わせを示す修飾された免疫細胞によって明らかになり得る。

【0130】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する。

【0131】

本開示はまた、本明細書に開示される修飾された免疫細胞集団及び薬学的許容可能な担体を含む薬学的組成物を提供する。

【0132】

ＩＩＩ．処置方法
本明細書では、腫瘍（またはがん）の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、本開示の細胞組成物、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはそのコードされるタンパク質、すなわち、ＮＲ４Ａ３タンパク質及びＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現し、かつ（ｉ）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を有する細胞、または本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。

【0133】

いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベルは、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子を発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＮＲ４Ａ３タンパク質の両方の発現レベルは、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを低減する方法が本開示において他の箇所で提供される。

【0134】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物を投与することは、参照腫瘍体積と比較して対象における腫瘍体積を低減する。いくつかの態様において、参照腫瘍体積は、修飾された細胞の投与前の対象における腫瘍体積である。いくつかの態様において、参照腫瘍体積は、投与を受けなかった対応する対象における腫瘍体積である。いくつかの態様において、対象における腫瘍体積は、参照腫瘍体積と比較して投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。

【0135】

いくつかの態様において、腫瘍を処置することは、対象における腫瘍重量を低減することを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞は、対象に投与された場合に対象における腫瘍重量を低減し得る。いくつかの態様において、腫瘍重量は、参照腫瘍重量と比較して投与後に少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。いくつかの態様において、参照腫瘍重量は、修飾された細胞の投与前の対象における腫瘍重量である。いくつかの態様において、参照腫瘍重量は、投与を受けなかった対応する対象における腫瘍重量である。

【0136】

いくつかの態様において、例えば、腫瘍に罹患している対象に本開示の細胞組成物を投与することは、対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴＩＬ（例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋）の数及び／または割合を増加させ得る。いくつかの態様において、腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴＩＬの数及び／または割合は、参照（例えば、修飾された細胞を摂取しなかった対象または修飾された細胞の投与前の同じ対象における対応する値）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。

【0137】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物を投与することは、対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおける制御性Ｔ細胞の数及び／または割合を低減し得る。いくつかの態様において、腫瘍及び／またはＴＭＥにおける制御性Ｔ細胞の数及び／または割合は、参照（例えば、修飾された細胞の投与を受けなかった対象における対応する数及び／または割合）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

【0138】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物を投与することは、対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおける骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数及び／または割合を減少させ得る。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、単球性ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、Ｍ－ＭＤＳＣ及びＰＭＮ－ＭＤＳＣの両方を含む。いくつかの態様において、腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＭＤＳＣの数及び／または割合は、参照（例えば、修飾された細胞の投与を受けなかった対応する対象における値）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

【0139】

上記に加えて、本開示の細胞組成物を投与することは、腫瘍の処置のために貢献する他の効果を有し得る。そのような効果は、以下にさらに記載される。

【0140】

本明細書に記載されるように、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及びＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現し、（ｉ）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を有する）は、様々なタイプのがん、例えば、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、消化器癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する腫瘍を処置するために使用され得る。がん適応症の包括的及び非限定的リストは、本出願の適応症セクションで提供される。

【0141】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、他の治療剤（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と組み合わせて使用され得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される腫瘍を処置する方法は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて本開示の細胞組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、免疫経路の複数の要素が標的とされ得るように１つ以上の抗がん剤と組み合わせて使用され得る。いくつかの態様において、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路によるシグナル伝達を遮断する）。本方法において使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。組み合わせ処置の包括的及び非限定的なリストは、本出願の組み合わせ処置セクションで詳細に開示される。

【0142】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、追加の治療剤の投与の前または後に対象に投与される。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、追加の治療剤と同時に対象に投与される。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物及び追加の治療剤は、薬学的に許容可能な担体中で単一の組成物として同時に投与され得る。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物及び追加の治療剤は、別々の組成物として同時に投与される。

【0143】

いくつかの態様において、本開示で処置され得る対象は、ラットまたはマウスなどの非ヒト動物である。いくつかの態様において、処置され得る対象はヒトである。

【0144】

いくつかの態様において、例えば、本明細書に開示される方法において、腫瘍を処置することは、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を向上させることを含む。本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞の活性化を向上させること」という用語は、Ｔ細胞記憶の保持を促進するために活性化中の細胞シグナル伝達を改変することを指す。

【0145】

したがって、いくつかの態様において、本開示は、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減することによってＴ細胞の活性化を向上させる方法に関する。細胞の活性化状態は、当該技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、細胞の１つ以上の機能的特性（例えば、増殖、細胞傷害性、サイトカイン生成）を分析することによってまたは細胞の表現型発現を分析することによって決定され得る。いくつかの態様において、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を向上させることは、細胞における以下の改善した特性：（ｉ）向上した増殖、（ｉｉ）向上した細胞傷害性、（ｉｉｉ）向上したサイトカイン発現、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの１つ以上をもたらし得る。

【0146】

いくつかの態様において、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を向上させることは、細胞の向上した増殖をもたらす。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の増殖）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００倍増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖は、約２倍～約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、免疫細胞のＴ増殖は、約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍、約２０倍～約３００倍増加する。いくつかの態様において、向上した増殖は、例えば、対象における修飾されたＴ細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現する）の数の増加をもたらし得る。いくつかの態様において、修飾されたＴ細胞の数は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の数）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。

【0147】

いくつかの態様において、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を向上させることは、細胞の向上した細胞傷害性をもたらす。本明細書で使用する場合、「細胞傷害性」という用語は、本開示の細胞組成物（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）が腫瘍細胞を攻撃し、その損傷を誘導する能力を指す。本開示の細胞組成物（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）は、当該技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、細胞傷害性分子（例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシン）の放出を介してまたはＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することによって、腫瘍細胞を攻撃し、その損傷を誘導し得る。いくつかの態様において、Ｔ細胞の細胞傷害性は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の細胞傷害性）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、または少なくとも約３００％またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様において、Ｔ細胞の細胞傷害性（または殺傷活性）は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００倍増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の細胞傷害性は、約２倍～約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の細胞傷害性は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の細胞傷害性）と比較して約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍、約２０倍～約３００倍、またはそれを超えて増加する。

【0148】

いくつかの態様において、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を向上させることは、細胞における向上したサイトカイン発現をもたらす。いくつかの態様において、サイトカイン発現は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞におけるサイトカイン発現）と比較して少なくとも約少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様において、Ｔ細胞におけるサイトカイン発現は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００倍増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞におけるサイトカイン発現は、約２倍～約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００倍またはそれ以上増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞のサイトカイン発現は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞のサイトカイン発現）と比較して約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍、約２０倍～約３００倍、またはそれを超えて増加する。本明細書で使用する場合、「サイトカイン」という用語は、がんの処置において有用であり得る任意のサイトカインを指す。そのようなサイトカインの非限定的な例には、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0149】

いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び／または細胞傷害性（または殺傷活性）及び／またはサイトカイン発現は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００倍増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び／または細胞傷害性（または殺傷活性）及び／またはサイトカイン発現は、約２倍～約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び／または細胞傷害性（または殺傷活性）及び／またはサイトカイン発現は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖及び／または細胞傷害性（または殺傷活性）及び／またはサイトカイン発現）と比較して約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍、約２０倍～約３００倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、免疫細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、免疫細胞の細胞傷害性、または免疫細胞のサイトカイン発現は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する免疫細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0150】

いくつかの態様において、本開示による修飾された免疫細胞は、参照細胞に対して増加したサイトカイン発現を示す。いくつかの態様において、サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0151】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞におけるＩＬ－２の発現レベルは、参照免疫細胞におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、またはそれを超えて増加する。

【0152】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞におけるＩＦＮ－γの発現レベルは、参照免疫細胞におけるＩＦＮ－γの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、またはそれを超えて増加する。

【0153】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞におけるＴＮＦ－αの発現レベルは、参照免疫細胞におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、またはそれを超えて増加する。

【0154】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を、単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、抗原、例えば、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）で刺激、例えば、逐次刺激及び／または慢性刺激された場合、増加した量のＩＬ－２を生成する。いくつかの態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞において生成されるＩＬ－２の量は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0155】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を、単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、抗原、例えば、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）で刺激、例えば、逐次刺激及び／または慢性刺激された場合、増加した量のＩＦＮ－γを生成する。いくつかの態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞において生成されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0156】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を、単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、抗原、例えば、同族抗原（例えば、腫瘍抗原）で刺激、例えば、逐次刺激及び／または慢性刺激された場合、増加した量のＴＮＦ－αを生成する。いくつかの態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞において生成されるＴＮＦ－αの量は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0157】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して増加した細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞における細胞増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）及び／または細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0158】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３活性遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して増加した持続性及び／または生存を示す。いくつかの態様において、Ｔ細胞の持続性は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または約１００倍増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の持続性は、約２倍～約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、Ｔ細胞の持続性は、参照（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応するＴ細胞の持続性）と比較して約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍、約２０倍～約３００倍、またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞における持続性及び／または生存は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0159】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して増加した抗腫瘍活性を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞における抗腫瘍活性は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0160】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、低減したＮＲ４Ａ３遺伝子レベル及び／または低減したＮＲ４Ａ３タンパク質発現レベルを有するように修飾されていない免疫細胞）と比較して低減した疲弊または機能不全を示す。いくつかの態様において、修飾された免疫細胞における疲弊または機能不全は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

【0161】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞は、他の治療剤（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と組み合わせて使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される腫瘍を処置する方法は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて本開示の修飾された細胞を対象に投与することを含む。そのような薬剤は、例えば、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害性薬剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科手技、放射線手技、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を、単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、ケア処置（例えば、手術、放射線、及び化学療法）の標準と組み合わせて使用され得る。本明細書に記載の方法はまた、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することが意図された療法として使用され得る。

【0162】

いくつかの態様において、本開示の修飾された細胞は、免疫経路の複数の要素を標的とすることができるように、１以上の抗がん剤と組み合わせて使用され得る。そのような組み合わせの非限定的なものとしては、腫瘍抗原提示を向上させる療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）；例えば、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路の阻害、及び／またはＴ_ｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄系由来サプレッサー細胞）の枯渇もしくは遮断によって、負の免疫制御を阻害する療法；例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０もしくはＧＩＴＲ経路を刺激する及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストにより、正の免疫制御を刺激する療法；抗腫瘍Ｔ細胞の発生頻度を全身的に増大させる療法；例えば、ＣＤ２５のアンタゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用して、もしくはｅｘ ｖｉｖｏの抗ＣＤ２５ビーズによる枯渇により、腫瘍中のＴ_ｒｅｇなどのＴ_ｒｅｇを枯渇させるもしくは阻害する療法；腫瘍中のサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を及ぼす療法；腫瘍細胞の免疫原性を向上させる療法（例えば、アントラサイクリン）；遺伝子修飾された細胞、例えば、キメラ抗原受容体によって修飾された細胞（ＣＡＲ－Ｔ療法）を含む、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入；インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、もしくは一酸化窒素合成酵素などの代謝酵素を阻害する療法；Ｔ細胞のアネルギーもしくは疲弊を好転させる／防止する療法；自然免疫活性化及び／または腫瘍部位の炎症を誘発する療法；免疫刺激サイトカインの投与；免疫抑制サイトカインの遮断；またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0163】

いくつかの態様において、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路によるシグナル伝達を遮断する）。本方法において使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。そのような免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例には、以下のものが含まれる：抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）；ＭＫ－３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＴＳＲ－０４２、ＲＥＧＮ２８１０、ＪＳ００１、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０、及びそれらの組み合わせ）；抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＲＧ７４４６；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５９、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、ＬＹ３３０００５４、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、及びそれらの組み合わせ）；ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、トレメリムマブ（チシリムマブ；ＣＰ－６７５，２０６）、ＡＧＥＮ－１８８４、ＡＴＯＲ－１０１５、及びそれらの組み合わせ）。

【0164】

いくつかの態様において、抗がん剤は、免疫チェックポイント活性化因子を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介してシグナル伝達を促進する）。いくつかの態様において、免疫チェックポイント活性化因子は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、ＴＩＭ３アゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。

【0165】

いくつかの態様において、本明細書に開示される修飾された細胞は、追加の治療剤の投与前または投与後に対象に投与される。いくつかの態様において、修飾された細胞は、追加の治療剤と同時に対象に投与される。いくつかの態様において、修飾された細胞及び追加の治療剤は、薬学的に許容可能な担体中で単一の組成物として同時に投与され得る。いくつかの態様において、修飾された細胞及び追加の治療剤は、別々の組成物として同時に投与される。いくつかの態様において、追加の治療剤及び修飾された免疫細胞は、逐次投与される。

【0166】

ＩＶ．修飾された免疫細胞を作製する方法
本開示は、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有する細胞を生成または調製する方法であって、例えば、遺伝子編集ツールで細胞を修飾することを含み、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減する、方法を提供する。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の低減した発現は、細胞の疲弊を低減または阻害する。いくつかの態様において、修飾された細胞は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方も有するようにさらに修飾され得る。したがって、本開示はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞の疲弊を低減または阻害する方法であって、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するために細胞を修飾することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。また、本開示は、免疫細胞における持続的エフェクター機能を促進する方法であって、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）を発現するように細胞を修飾することを含む、方法を提供する。

【0167】

遺伝子編集、例えば、塩基編集は、当該技術分野で知られている任意の編集ツールを使用して行われ得る。例えば、いくつかの態様において、修飾された細胞（例えば、免疫細胞）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの技術を使用して修飾され得る。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／または発現はまた、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを使用して修飾され得る。すべてのこれらの技術は、以下で詳細により多く論述される。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するために使用される方法は、１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、２つ、３つ、またはそれを超えるツール）を使用することを含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するために使用される方法は、ＮＲ４Ａ３ ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に対して作用する少なくとも１つの方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）及びＮＲ４Ａ３タンパク質に対して作用する少なくとも１つの方法（例えば、細胞シグナル伝達パートナーに結合する阻害または翻訳後修飾）を含む。

【0168】

いくつかの態様において、例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子レベルを低減または無効化するために遺伝子編集ツールを使用することによって、本明細書に開示されるように修飾された細胞（例えば、免疫細胞）は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するようにさらに修飾され得る。いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子編集方法に従って修飾され、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞は、改善された抗がん特性を有し得る。

【0169】

ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減する方法、例えば、遺伝子編集は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する細胞との関連で提供されるが、当業者は、本明細書に開示される方法が、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減することが所望である場合、任意の細胞のために使用され得ることを認識する。例えば、いくつかの態様において、本明細書に開示されるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減する方法は、免疫細胞に適用され得る。いくつかの態様において、免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラル（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの態様において、ＴＩＬは、ＣＤ８^＋ＴＩＬである。いくつかの態様において、ＴＩＬは、ＣＤ４^＋ＴＩＬである。よって、本開示は、本明細書に開示されるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための方法に従って調製された修飾された細胞（例えば、親細胞が、例えば、上で開示される任意の細胞である修飾された免疫細胞）を含む細胞組成物であって、修飾された細胞は、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）に対してＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の低減された発現を示す、細胞組成物を提供する。いくつかの態様において、これらの修飾された細胞は、薬学的組成物を調製するために使用され得る。

【0170】

いくつかの態様において、細胞を修飾することは、細胞を、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを低減することが可能な遺伝子編集ツールと接触させることを含む。いくつかの態様において、遺伝子編集ツール（またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減することが可能な任意の他のツール）と、修飾される細胞との接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはそれらの組み合わせで行われ得る。いくつかの態様において、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、遺伝子療法）で行われる。いくつかの態様において、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。いくつかの態様において、接触は、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。いくつかの態様において、細胞は、自己細胞である。いくつかの態様において、細胞は、異種細胞である。いくつかの態様において、遺伝子編集ツール（またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減することが可能な任意の他のツール）の接触は、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを、参照細胞（例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていない対応する細胞）におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルと比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0171】

いくつかの態様において、遺伝子編集ツールと細胞の接触は、様々な送達経路を含む。通常、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するための本明細書に開示される遺伝子編集ツールのため、遺伝子編集ツールは、細胞に進入し、対象となる遺伝子に結合することができなければならない。いくつかの態様において、対象となる分子を細胞に送達する当該技術分野で公知の任意の送達ビヒクルを使用することができる。全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４７，３５５号Ｂ２を参照されたい。使用することのできるベクターに関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供する。

【0172】

いくつかの態様において、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３タンパク質をコードする遺伝子全体を除去し得る。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ３タンパク質をコードするゲノムの一部分（例えば、１つ以上のエクソン）を除去する。いくつかの態様において、遺伝子編集ツール、例えば、塩基編集体は、インデルを生成することなく特定のヌクレオチドを修飾する。本明細書で使用する場合、「インデル」という用語は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異をもたらし得る核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。塩基編集体の非限定的な例は、２０１７年５月４日に公開された米国公開番号２０１７／０１２１６９３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0173】

いくつかの態様において、修飾された免疫細胞を調製する方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように細胞を修飾することをさらに含む。いくつかの態様において、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように細胞を修飾することは、細胞をＣＡＲをコードする核酸配列と接触させることを含む。いくつかの態様において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、ベクター（例えば、発現ベクター）から発現される。

【0174】

いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子編集ツールは、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列を含むベクターから発現される。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列と、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸配列とは、別々のベクター上にある。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールをコードする核酸配列及びＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸配列は、同じベクター上にある。

【0175】

Ｖ．Ａ．遺伝子編集ツール
本開示の細胞を修飾するには、１以上の遺伝子編集ツールを使用することができる。遺伝子編集ツールの非限定的な例を下記に開示する。

【0176】

Ｖ．Ａ．１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
いくつかの態様において、本開示で使用することのできる遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。そのようなシステムは、例えば、いくつかの例において、発現されるべき所望の細胞タイプ（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞）のためにコドン最適化されたＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸分子を用い得る。本明細書にさらに記載されるように、いくつかの態様において、そのようなシステムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含み得る。

【0177】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（例えば、合成ガイドＲＮＡ）（ｇＲＮＡ）と複合体化することによってゲノム部位に標的とされたＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用する。これは、ＮＧＧモチーフの３ヌクレオチド上流の二本鎖切断をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの独自の能力は、単一のＣａｓ９タンパク質を２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のｇＲＮＡ）と共発現させることによって複数の異なるゲノム遺伝子座を同時に標的とする能力である。そのようなシステムは、２つの別個の分子を含むガイドＲＮＡを用いることもできる。いくつかの態様において、２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「スキャフォールド」）分子とを含む。

【0178】

ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲティングセグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成する一続きのヌクレオチドの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一続きのヌクレオチドを含む。したがって、ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドに相補的であり、これとハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡに対応するｔｒａｃｒＲＮＡがあるといえる。ｃｒＲＮＡはさらに、一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントをもたらす。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列（例えば、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡ）とハイブリダイズする配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。したがって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは（対応するペアとして）ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。細胞内での修飾のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列及び／または長さは、ＲＮＡ分子が使用される種（例えば、ヒト）に特異的であるように設計され得る。

【0179】

３つの要素（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡ）をコードする天然に存在する遺伝子は、典型的には、オペロン（複数可）として構築される。天然に存在するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つの直列反復配列（ＤＲ）が隣接する２１～７２ヌクレオチド長のターゲティングセグメントを含む（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたい）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、対応するｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９タンパク質に結合する。

【0180】

あるいは、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムはさらに、コドン最適化されたＣａｓ９と共に機能する融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物（すなわち、単一の転写物）を用いることができる。この１つのＲＮＡはしばしば、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと称される。ｇＲＮＡの中で、ｃｒＲＮＡ部分は所与の認識部位の「標的配列」と識別され、ｔｒａｃｒＲＮＡは多くの場合「スキャフォールド」と称される。簡潔に述べると、標的配列を含む短いＤＮＡ断片が、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（いくつかの態様ではおおよそ２０ヌクレオチド）、ある形態のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（スキャフォールド）、ならびに細胞内で活性な好適なプロモーター、及び真核細胞内での適切なプロセシングに必要な要素を含む。これらのシステムの多くは、アニールして二本鎖ＤＮＡを形成し、次いでｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングされる特別な相補的オリゴに依存する。

【0181】

次いで、ｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットが細胞に導入される。例えば、Ｍａｌｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８２３－６；Ｊｉｎｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｈｗａｎｇ Ｗ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２２７－９；Ｊｉａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２３３－９；及びＣｏｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８１９－２３（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、及びＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。

【0182】

いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。例えば、いくつかの態様において、本開示のために有用な細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む核酸分子を導入することによって（例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質を有するように）修飾され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む核酸分子は、細胞に逐次導入され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む核酸分子は、細胞に同時に導入され得る。例えば、いくつかの態様において、同時投与は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む核酸分子を同時ではあるが、別々の組成物として導入することを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡを含む核酸分子との複合体の形態で（すなわち、単一の組成物として）提供され得る。

【0183】

いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。したがって、いくつかの態様において、本開示のために有用な細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む第２の核酸分子をコードする第１の核酸分子を導入することによって修飾され得る（例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質を有するように）。いくつかの態様において、第１及び第２の核酸分子は、細胞に逐次導入され得る。いくつかの態様において、第１及び第２の核酸分子は、細胞に同時に導入され得る。例えば、いくつかの態様において、第１及び第２の核酸分子は、同時ではあるが、別々の組成物として細胞に導入され得る。いくつかの態様において、第１及び第２の核酸分子は、単一のポリヌクレオチドの一部であり得、細胞は、単一のポリヌクレオチドを含むように修飾される。

【0184】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡであり得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、またはそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。

【0185】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第３の核酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様において、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、ＩＩ型Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９は、ヒトコドン最適化Ｃａｓである。

【0186】

いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両鎖を切断することなく標的核酸配列内に一本鎖切断（すなわち「ニック」）を作ることができる「ニッカーゼ」である。例えばＣａｓ９は、反対のＤＮＡ鎖の切断を担う２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン）を含む。これらのドメインのいずれかに変異があるとニッカーゼが生じ得る。ニッカーゼを生じる変異の例は、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１及びＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１に見出すことができ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。

【0187】

いくつかの態様において、ｄｓＤＮＡの各鎖の標的部位に特異的な２つの別個のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸または同じ核酸上の別個の領域上のオーバーハンギング配列に相補的なオーバーハンギング配列を作ることができる。ｄｓＤＮＡの両鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと核酸を接触させることによって作られるオーバーハンギング末端は、５’または３’のいずれのオーバーハンギング末端であってもよい。例えば、第１のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第１の鎖に一本鎖切断を作り、第２のニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を作ることにより、オーバーハンギング配列を作ることができる。一本鎖切断を作る各ニッカーゼの標的部位は、作られるオーバーハンギング末端配列が、異なる核酸分子上のオーバーハンギング末端配列に相補的となるように選択することができる。２つの異なる核酸分子の相補的なオーバーハンギング末端は、本明細書に開示される方法によってアニールすることができる。いくつかの態様において、第１の鎖上のニッカーゼの標的部位は、第２の鎖上のニッカーゼの標的部位とは異なる。

【0188】

いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子、及びそのコードされるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現は、細胞を例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）と接触させることによって低減される。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ１遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ２遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ３遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。

【0189】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、複数のＮＲ４Ａ遺伝子を標的とする。例えば、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ１遺伝子及びＮＲ４Ａ２遺伝子の両方を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）内因性レベルＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ１遺伝子及びＮＲ４Ａ３遺伝子の両方を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子の両方を標的とすることが可能である。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲは、ＮＲ４Ａ１遺伝子、ＮＲ４Ａ２遺伝子、及びＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲと接触した後、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）は、（ｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、及び（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。

【0190】

いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲを使用する遺伝子編集は、ＮＲ４Ａ３遺伝子レベルを、参照細胞（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用する遺伝子編集に供されなかった対応する細胞）において観察されるＮＲ４Ａ３遺伝子レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子レベルは、当該技術分野で知られている任意の技術、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定され得る。

【0191】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をコードする核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。他の態様において、本明細書に開示されるｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をコードするＲＮＡまたはＤＮＡは、それぞれ合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡである。いくつかの態様において、合成ＲＮＡまたはＤＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、所定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドにおけるすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンまたはシュードウリジンで置き換えられ得る）。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、天然核酸塩基のみ、すなわち、合成ＤＮＡの場合はＡ、Ｃ、Ｔ及びＵ、または合成ＲＮＡもしくは合成ＤＮＡの場合はＡ、Ｃ、Ｔ、及びＵを含む。

【0192】

通常、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集方法は、例えば、免疫細胞をｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで
（ｉ）Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸；及び、
（ｉｉ）少なくとも１つのＮＲ４Ａ３遺伝子ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはそのｇＲＮＡをコードする核酸
と接触させることを含み、ｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子（例えば、イントロン及び／またはエクソン配列）における配列を標的とし、細胞をＣａｓ９及び少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させることは、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現の低減をもたらす。

【0193】

いくつかの態様において、細胞（例えば、免疫細胞）のＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルを低減するために使用され得るｇＲＮＡは、表Ｂ及びＣに提供されるｇＲＮＡのいずれかを含む。例えば、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０、５２～５７、５８、６１、６５、６７、６８、７０、７１、７５、７６、８２、８３、８６、９４、及び９６に示される配列のうちの任意の１つ以上を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲ
ＮＡは、配列番号６９に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲ
ＮＡは、配列番号８９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８９に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列から本質的になる。

【0194】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、遺伝子編集方法は、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方のレベルを低減することをさらに含み得る。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に示される配列から本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に示される配列を含む。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に示される配列からなる。いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に示される配列から本質的になる。

【0195】

本明細書で使用する場合、「接触させること」（例えば、細胞、例えば、免疫細胞を少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓ９と接触させること）という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内で少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９を一緒にインキュベートすること（例えば、ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓタンパク質、またはｇＲＮＡ（複数可）及び／またはＣａｓ９タンパク質（複数可）をコードする核酸（複数可）を培養中の細胞に添加すること）または細胞をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触させることを含むことが意図される。

【0196】

ＮＲ４Ａ３遺伝子標的配列を本明細書に開示される少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９（またはそれらをコードする少なくとも１つの核酸）と接触させる工程は、任意の好適な様式で行われ得る。例えば、細胞、例えば、免疫細胞は、細胞培養条件で処置され得る。本明細書に開示される少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（またはそれらをコードする少なくとも１つ核酸）と接触させられる細胞はまた、別の薬剤、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターと同時にまたは後に接触させられ得ることが理解される。いくつかの態様において、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触した後、方法は、細胞を対象に導入することをさらに含み、それにより疾患または病態、例えば、がんの症状を処置または改善する。

【0197】

ｅｘ ｖｉｖｏ方法の場合、細胞には、自己細胞、すなわち、細胞（複数可）における標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子）を改変することを必要とする対象から取得された免疫細胞（複数可）が含まれ得る（すなわち、ドナー及びレシピエントは、同じ個体である）。自己細胞は、細胞の任意の免疫に基づく拒絶を回避する利点を有し得る。あるいは、細胞は、異種であり、例えば、ドナーから取得され得る。典型的には、細胞がドナーに由来する場合、それらは、免疫抑制の必要性を減弱または除去するためにレシピエントと十分に免疫学的に適合性があるドナーからのものであり、すなわち、移植拒絶応答に供されない。いくつかの態様において、細胞は、異種源、すなわち、レシピエント、またはレシピエントの種と十分に免疫学的に適合性があるように遺伝子的に操作された非ヒト哺乳動物から取得される。免疫学的適合性を決定するための方法は、当該技術分野で知られており、ＨＬＡ及びＡＢＯ決定基についてのドナー－レシピエント適合性を評価するための組織タイピングを含む。例えば、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｈ ａｎｄ Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ １９９４）を参照されたい。

【0198】

いくつかの態様において、本開示は、修飾された免疫細胞を生成する方法であって、細胞、例えば、免疫細胞（Ｔ細胞など）におけるＮＲ４Ａ３遺伝子配列を、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子配列をＣａｓ９タンパク質（またはそのようなＣａｓ９タンパク質をコードする核酸）及びＮＲ４Ａ３遺伝子におけるモチーフ（例えば、ｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質を標的遺伝子に誘導し、標的モチーフとハイブリダイズするモチーフであり、ＮＲ４Ａ３遺伝子は、部分的または全体的に切断され、切断の効率は、約１０％～約１００％である）を標的とする１つのｇＲＮＡと接触させることによってｅｘ ｖｉｖｏで改変することを含む、方法を提供する。そのようなｇＲＮＡの非限定的な例は、本明細書で提供される（例えば、表Ａ、Ｃ、及びＤを参照されたい）。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本明細書に記載の修飾された免疫細胞を生成する方法は、細胞をＣａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸分子及びＮＲ４Ａ遺伝子ファミリーの１つ以上のメンバーを標的とするｇＲＮＡを含む第２の核酸分子と接触させることによってＮＲ４Ａ遺伝子配列を改変することを含む。いくつかの態様において、第１の及び核酸分子は、細胞と逐次接触させられる。いくつかの態様において、第１の及び核酸分子は、細胞と同時に接触させられる。例えば、いくつかの態様において、細胞は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１の核酸分子及びｇＲＮＡを含む第２の核酸分子を含む単一のポリヌクレオチドと接触させられる。

【0199】

いくつかの態様において、細胞は、上述した改変工程の前、後、またはそれと同時にＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸（例えば、ベクター）で修飾（例えば、トランスフェクション）されている。

【0200】

いくつかの態様において、切断の効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。

【0201】

本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、使用されるＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９に応じて、様々な長さのｇＲＮＡスペーサー配列を使用し得る。異なる種からのＣａｓ９は、機能的リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するためにそれらの対応するｇＲＮＡと対合されなければならない。すなわち、異なる細菌種から操作されたキメラｇＲＮＡフレームは、スペーサー配列及びキメラフレーム配列における差に起因して異なる長さを有し得る。

【0202】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、少なくとも１８ヌクレオチド（例えば、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド）長であり得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９に結合するにおけるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡスペーサー配列の長さは、２０ヌクレオチドであるのに対し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９に結合するｇＲＮＡにおけるＳ．ａｕｒｅｕｓ ｇＲＮＡスペーサー配列の長さは、２１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドを含み得る。特定の態様において、ｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン３のサブ配列に対応する１８～２２個の連続ヌクレオチド（例えば、２０個）からなるスペーサー配列を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン４のサブ配列に対応する１８～２２個の連続ヌクレオチド（例えば、２０個）からなるスペーサー配列を含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン３またはエクソン４のサブ配列に対応する１８～２２個の連続ヌクレオチド（例えば、２０個）からなるスペーサー配列を含む。

【0203】

ＮＲ４Ａ３遺伝子上で結合するｇＲＮＡスペーサー配列とＤＮＡ鎖との間の完全マッチが好ましいが、ＮＲ４Ａ３遺伝子レベルの低減またはＮＲ４Ａ３遺伝子機能の低下を依然としてもたらす限り、ｇＲＮＡスペーサー配列とＮＲ４Ａ３標的配列との間のミスマッチも許容される。標的ＮＲ４Ａ３配列と完全に相補的なｇＲＮＡ上の８～１２個の連続ヌクレオチドの「シード」配列は、ＮＲ４Ａ３遺伝子上の標的配列の適切な認識のために好ましい。ｇＲＮＡスペーサー配列の残りは、１つ以上のミスマッチを含み得る。

【0204】

通常、ｇＲＮＡ活性は、ミスマッチの数に逆相関する。好ましくは、本開示のｇＲＮＡスペーサー配列は、７個未満のミスマッチを含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、対応するＮＲ４Ａ３遺伝子標的配列と７個のミスマッチ、６個のミスマッチ、５個のミスマッチ、４個のミスマッチ、３個のミスマッチ、より好ましくは２個のミスマッチ、またはそれ未満を含み、さらにより好ましくはミスマッチを含まない。ｇＲＮＡにおけるヌクレオチドの数が少ないほど、認容されるミスマッチの数が少ない。結合親和性は、マッチするｇＲＮＡ－ＤＮＡの組み合わせの合計に依存すると考えられる。

【0205】

本開示のｇＲＮＡスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集システムのオフターゲット効果を最小化するために選択され得る。したがって、いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも２つのミスマッチを含有するように選択される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、細胞におけるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合、少なくとも１つのミスマッチを含有するように選択される。当業者は、多様な技術が、オフターゲット効果を最小化するための好適なｇＲＮＡスペーサー配列を選択するために使用され得ることを理解する（例えば、バイオインフォマティクス分析）。

【0206】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号３１～４２のスペーサー配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0207】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー配列は、配列番号３１～４２のいずれか１つのＤＮＡ配列と比較して少なくとも１、２、３、４または５個のヌクレオチドミスマッチを含むスペーサー配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0208】

いくつかの態様において、編集有効性は、複数の位置を標的とすることによって増加し得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン１から上流の位置を標的とする１つのｇＲＮＡを使用することを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン１から上流の位置を標的とする２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のｇＲＮＡを使用することを含む。また、いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン４から下流の位置を標的とする１つのｇＲＮＡを使用することを含む。いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、ＮＲ４Ａ３遺伝子のエクソン４から下流の位置を標的とする２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のｇＲＮＡを使用することを含む。

【0209】

いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の同じ鎖上の配列に相補的であり、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の反対の鎖上の配列に相補的であり、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の反対の鎖上の配列に相補的ではなく、及び／またはハイブリダイズしない。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子の重複標的モチーフに相補的であり、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様において、２つのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子のオフセット標的モチーフに相補的であり、及び／またはハイブリダイズする。

【0210】

通常、本開示のｇＲＮＡは、標的配列への、対応するＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質の結合、及び後のＮＲ４Ａ３遺伝子の切除（全体または部分的）を可能とする限り、その配列または化学的修飾の任意のバリアントを含み得る。

【0211】

本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、多数の細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与する。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓなどを含む多数の種の細菌によって生成される。したがって、本開示のために有用なＣａｓ９タンパク質は、当該技術分野で知られている任意の好適な細菌に由来し得る。そのような細菌の非限定的な例には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａが含まれる。本明細書に開示される方法は、当該技術分野で知られている任意のＣａｓ９を用いて実施され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、向上した酵素活性を有する変異Ｃａｓ９またはＣａｓ９部位を含む融合タンパク質である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質である。

【0212】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は通常、細菌において発現するので、Ｃａｓ９組換えタンパク質を設計及び調製する場合に真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）における最適な発現のためにそれらの核酸配列を修飾することが有利であり得る。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ９をコードする核酸は、真核細胞における発現のために、例えば、それを必要とするヒト対象の細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0213】

いくつかの態様において、本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ９タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの例では、置換及び／または修飾は、タンパク質分解を防止または低減し、及び／または細胞におけるポリペプチドの半減期を延長させ得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、ウレア、チオウレア、カルバメート、スルホニルウレアなど）を含み得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、代替的アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、異種部位（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含めるための修飾を含み得る。

【0214】

本明細書に開示される方法は通常、Ｃａｓ９タンパク質を使用して実施されるが、いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓｌ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、またはＣａｓ８であり得ることが想定される。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種からのＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの特定の態様において、本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質もしくはその機能的部分、またはそのようなＣａｓ９もしくはその機能的部分をコードする核酸である。使用され得る他のＣａｓヌクレアーゼの非限定的な例は、当該技術分野で知られており、例えば、ＵＳ９，９７０，００１Ｂ２；ＵＳ１０，２２１，３９８Ｂ２；及びＵＳ２０２０／０１９０４８７Ａ１（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、Ｉ型Ｃａｓタンパク質を含む。Ｉ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びそのバリアントが含まれる。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、及びそのバリアントが含まれる。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。非限定的な例には、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、及びそのバリアントが含まれる。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＶ型Ｃａｓタンパク質を含む。そのようなＣａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃｓｆ１が含まれる。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、Ｖ型Ｃａｓタンパク質を含む。非限定的な例には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃａｓ１４、Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、及びそのバリアントが含まれる。いくつかの態様において、本開示のために有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。ＶＩ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、及びそのバリアントが含まれる。

【0215】

いくつかの場合では、本開示のために有用なＣａｓタンパク質は、上記Ｃａｓタンパク質のオルソログまたはホモログを含む。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書で「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも称される）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書で「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも称される）という用語は、当該技術分野でよく知られている。さらなるガイダンスにより、タンパク質の「ホモログ」は、本明細書で使用する場合、それがホモログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する同じ種のタンパク質である。ホモログタンパク質は、構造的に関連し得るがその必要はなく、または部分的にのみ構造的に関連する。タンパク質の「オルソログ」は、本明細書で使用する場合、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を発揮する異なる種のタンパク質である。オルソログタンパク質は、構造的に関連し得るがその必要はなく、または部分的にのみ構造的に関連する。

【0216】

本明細書で使用する場合、「機能的部分」は、少なくとも１つのｇＲＮＡと複合体化し、標的配列を切断し、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の低減した発現をもたらすその能力を保持するペプチド、例えば、Ｃａｓ９の一部分を指す。いくつかの態様において、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの態様において、機能的ドメインは、非共有結合性複合体を形成する。いくつかの態様において、機能的ドメインは、融合複合体（例えば、融合タンパク質）を形成する。いくつかの態様において、機能的ドメインは、（例えば、１つ以上のスペーサーまたはリンカーを介して）化学的に連結される。いくつかの態様において、機能的ドメインは、コンジュゲートされる。

【0217】

本開示は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９と接触させる様々な方法を企図することが理解されるべきである。いくつかの態様において、外因性Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、細胞浸透性ポリペプチドまたは細胞浸透性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用する場合、「細胞浸透性ポリペプチド」及び「細胞浸透性ペプチド」は、細胞への分子の取り込みを容易化するポリペプチドまたはペプチドをそれぞれ指す。細胞浸透性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。

【0218】

いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、荷電タンパク質、例えば、正電荷、負電荷または全体的に中性の電荷を保有するタンパク質にコンジュゲートまたは融合され得る。そのような連結は、共有結合性であり得る。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９が細胞に浸透する能力を有意に増加させるために超正荷電ペプチドに融合され得る。Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（８）：７４７－５２（２０１０）を参照されたい。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に、細胞へのその侵入を容易化するために融合され得る。例示的なＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが含まれるがこれらに限定されない。よって、いくつかの特定の態様において、本明細書に開示される方法は、細胞浸透性ペプチドに融合されたＣａｓタンパク質、ＰＴＤに融合されたＣａｓタンパク質、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓタンパク質、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓタンパク質、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓタンパク質、またはそれらの組み合わせを含むＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質を使用して実施され得る。

【0219】

いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、標的ポリヌクレオチド配列、すなわち、ＮＲ４Ａ３遺伝子を含有する細胞、例えば、本明細書に開示される免疫細胞、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞に、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸の形態で導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成され得る。好適な技術には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。いくつかの態様において、核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの態様において、核酸は、本明細書に記載される修飾されたＤＮＡを含む。いくつかの態様において、核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの態様において、核酸は、本明細書に記載される修飾されたｍＲＮＡ（例えば、合成の修飾されたｍＲＮＡ）を含む。

【0220】

本明細書に開示される方法において使用されるＣａｓ９をコードするｇＲＮＡ配列及び／または核配列は、例えば、それらの安定性を向上させために（例えば、それを必要とする対象への投与後のそれらの血漿半減期を増加させるために）化学的に修飾され得る。本明細書に開示されるｇＲＮＡ及び／または例えば、Ｃａｓ９をコードする核配列に対する可能性のある化学的修飾は、本明細書において以下で詳細に論述される。

【0221】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡ全体が、化学的に修飾される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサーのみが、化学的に修飾される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡスペーサー及びｇＲＮＡフレーム配列は、化学的に修飾される。特定の化学的修飾の非限定的な例は、以下に詳細に開示される。

【0222】

したがって、本明細書に開示される方法のいくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）及び１つ以上のｇＲＮＡは、それをコードする１つ以上の送達ベクターからの発現を介して標的細胞に提供される。いくつかの態様において、標的細胞においてｇＲＮＡ（複数可）及びＣａｓ９を導入するための上記ベクター（複数可）は、ウイルスベクターである。いくつかの態様において、標的細胞においてｇＲＮＡ（複数可）及びＣａｓ９を導入するための上記ベクター（複数可）は、非ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター（ＬＶ）、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはそれらの組み合わせである。ＡＡＶベクター（複数可）は、ＡＡＶＩ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含むいくつかのカプシドタイプの１つ以上に基づき得る。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶＤＪ－８、ＡＡＶ２ＤＪ９、またはそれらの組み合わせである。

【0223】

上で開示される方法に加えて、本開示は、本開示の方法を実施するための組成物をさらに提供する。したがって、本開示は、少なくとも１つの上記ｇＲＮＡをコードする核酸を提供する。

【0224】

また、組成物及び／または少なくとも１つのＣａｓ９が提供される。いくつかの態様において、Ｃａｓ９をコードする核酸は、（ｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣａｓ９、（ｉｉ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９、（ｉｉｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＣａｓ９またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９に由来する変異体Ｃａｓ９（変異体タンパク質はＣａｓ９活性を保持する）、（ｉｖ）Ｃａｓ９部位を含む融合タンパク質、または（ｖ）それらの組み合わせをコードする。

【0225】

いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、本明細書に開示されるもの）は、本開示の細胞を修飾するために使用され得る。

【0226】

Ｖ．Ａ．２．ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を編集する（例えば、低減または阻害する）ために使用することのできる遺伝子編集ツールは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのヌクレアーゼ剤である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムの特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに、ネイティブ型もしくは操作型の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能性部分を融合することによって作られる。

【0227】

ユニークなモジュラー型ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的に任意のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作し、したがって、所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３－１４８を参照されたい。これらはすべて、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0228】

好適なＴＡＬヌクレアーゼ、及び好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製する方法の非限定的な例は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５号Ａ１、同第２０１１／０２６９２３４号Ａ１、同第２０１１／０１４５９４０号Ａ１、同第２００３／０２３２４１０号Ａ１、同第２００５／０２０８４８９号Ａ１、同第２００５／００２６１５７号Ａ１、同第２００５／００６４４７４号Ａ１、同第２００６／０１８８９８７号Ａ１、及び同第２００６／００６３２３１号Ａ１（各々参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0229】

様々な態様において、例えば、対象となるゲノム遺伝子座にある標的核酸配列またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで標的核酸配列は、ターゲティングベクターによって修飾しようとする配列またはその近くにある。本明細書に提供される様々な方法及び組成物で使用するのに好適なＴＡＬヌクレアーゼとしては、本明細書に記載されるターゲティングベクターによって修飾しようとする標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが挙げられる。

【0230】

いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮの各単量体は、１２～２５個のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐサブサイトに結合する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。いくつかの態様において、独立したヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐ～約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、標的配列において二本鎖切断を行う。

【0231】

いくつかの態様において、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、５ｂｐまたは６ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、二本鎖切断を行う。

【0232】

Ｖ．Ａ．３．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムなどのヌクレアーゼ剤を含む。ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインという２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列（例えば、ＮＲ４Ａ３）に結合することにより、酵素ドメインの活性を配列の近傍に指向し、したがって、標的配列近傍の内因性標的遺伝子の修飾を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望の配列に結合するように操作することができる。本明細書に開示されるように、いくつかの態様において、ジンクフィンガードメインは、ＮＲ４Ａ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合する。したがって、切断または組換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座（例えば、表１に挙げた標的遺伝子中の標的遺伝子座）を同定した後、１以上のジンクフィンガー結合ドメインを、標的遺伝子座内の１以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質を細胞で発現させると、標的遺伝子座の修飾がもたらされる。

【0233】

いくつかの態様において、ジンクフィンガー結合ドメインは、１以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｒｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。典型的には、１つのジンクフィンガードメインは約３０アミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１つのヌクレオチドが重複してもよい４ヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作される配列（例えば、標的配列）の長さが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーの数を決定する。例えば、重複するサブサイトにフィンガーモチーフが結合しないＺＦＰでは、６ヌクレオチド標的配列には２フィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチド標的配列には３フィンガー結合ドメインが結合する、などということである。標的部位における個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、サブサイト）は、隣接している必要はなく、複数フィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さ及び性質に応じて、１つまたは数個のヌクレオチドによって分離していてもよい。いくつかの態様において、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３～６個の個々のジンクフィンガーリピートを含み、各々が９～１８個の塩基対を認識し得る。

【0234】

ジンクフィンガー結合ドメインは、最適な配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法としては、合理的設計及び様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。

【0235】

ジンクフィンガードメインが結合する標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って行うことができる。当業者には、ヌクレオチド配列の単純な目視検査を標的ＤＮＡ配列の選択に使用してもよいことが明らかであろう。したがって、本明細書に記載される方法では、任意の手段を標的ＤＮＡ配列の選択に使用することができる。標的部位は通常少なくとも９ヌクレオチド長を有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインが結合する。しかしながら、例えば、４フィンガー結合ドメインの１２ヌクレオチド標的部位への結合、５フィンガー結合ドメインの１５ヌクレオチド標的部位への結合、または６フィンガー結合ドメインの１８ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかであるように、より大きな結合ドメイン（例えば、７フィンガー、８フィンガー、９フィンガー及びそれ以上）の、より長い標的部位への結合も可能である。

【0236】

ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。酵素ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照されたい）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１以上を切断ドメイン源として使用することができる。
本明細書に記載されるＺＦＰの酵素ドメインとして使用するのに好適な例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位で）配列特異的に結合し、かつ結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９個目のヌクレオチド、かつ他方の鎖上のその認識部位から１３個目のヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、いくつかの態様において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素の酵素ドメイン、及び１以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

【0237】

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用して標的化された二本鎖ＤＮＡ切断を行うには、各々がＦｏｋＩ酵素ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある切断ドメインを再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む１つのポリペプチド分子を使用してもよい。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。

【0238】

Ｖ．Ａ．３．メガヌクレアーゼ
いくつかの態様において、細胞におけるＮＲ４Ａ３発現を制御するために使用することのできる遺伝子編集ツールは、メガヌクレアーゼシステムなどのヌクレアーゼ剤を含む。メガヌクレアーゼは、保存的配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、このファミリーは「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ－ＹＩＧ」、「Ｈ－Ｎ－Ｈ」、及び「Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス」の各ファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。

【0239】

ＨＥアーゼは、認識部位が長く、ＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することが注目に値する。メガヌクレアーゼのドメイン、構造、及び機能は公知である。例えば、Ｇｕｈａｎ ａｎｄ Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ ａｎｄ Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９－９５、及びＭｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照されたい。

【0240】

いくつかの例では、天然に存在するバリアント、及び／または操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／または認識部位特異性を修飾する方法、ならびに活性のスクリーニングは公知である。例えば、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５１０５９８９、ＷＯ２００３０７８６１９、ＷＯ２００６０９７８５４、ＷＯ２００６０９７８５３、ＷＯ２００６０９７７８４、及びＷＯ２００４０３１３４６を参照されたい。これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0241】

本明細書では、限定するものではないが、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｅｃＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらの任意の活性バリアントもしくは断片を含め、任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。

【0242】

いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の１つの完全にマッチする標的配列を認識する。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ホーミングヌクレアーゼは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様において、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0243】

Ｖ．Ａ．４．制限エンドヌクレアーゼ
いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼを含め、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ剤が含まれる。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、通常、ヌクレアーゼ結合部位からの様々な位置で切断し、これは、切断部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。ＩＩ型システムでは、制限活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、通常、切断は結合部位内またはその近くの特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム認識部位を認識し、認識部位の外側を切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で二度配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称の認識部位を認識し、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で一方の側で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えばＲＥＢＡＳＥデータベース（ウェブページはｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８－２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５－１２、及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）において、さらに記載及び分類されている。

【0244】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、当該技術分野で公知の任意の手段によって細胞に導入することができる。いくつかの態様において、特定の遺伝子編集ツールをコードするポリペプチドを細胞に直接導入してもよい。あるいは、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入してもよい。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するとき、遺伝子編集ツールは、細胞内で一過性に、条件的に、または構成的に発現させてもよい。したがって、遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結していてもよい。あるいは、遺伝子編集ツールは、遺伝子編集ツールをコードする、または遺伝子編集ツールを含むｍＲＮＡとして、細胞に導入される。

【0245】

ヌクレアーゼ剤（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）の活性バリアント及び断片も提供される。そのような活性バリアントは、ネイティブヌクレアーゼ剤と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含み得、活性バリアントは、所望の認識部位で切断する能力を保持し、これによりニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれかは、ネイティブエンドヌクレアーゼ配列から修飾され、ネイティブヌクレアーゼ剤によって認識されなかった認識部位を認識し、その位置でニックまたは二本鎖切断を誘導するように設計され得る。よって、いくつかの態様において、操作されたヌクレアーゼは、対応するネイティブヌクレアーゼ剤の認識部位とは異なる認識部位でニックまたは二本鎖切断を誘導するための特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のためのアッセイは知られており、通常、認識部位を含有するＤＮＡ基質に対するエンドヌクレアーゼの全体的活性及び特異性を測定する。

【0246】

ヌクレアーゼ剤がヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を介して細胞に提供される場合、そのようなヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、対象となる細胞におけるより高い使用頻度を有するコドンに置き換えるように修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、対象となる所与の細胞におけるより高い使用頻度を有するコドンに置き換えるように修飾され得る。

【0247】

Ｖ．Ａ．５．干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
いくつかの態様において、細胞におけるＮＲ４Ａ３の発現を低減させるために使用することのできる遺伝子編集ツールは、ＲＮＡ干渉分子（「ＲＮＡｉ」）を含む。本明細書で使用する場合、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子サイレンシング経路による標的ｍＲＮＡの分解によって内因性標的遺伝子産物の発現減少を媒介するＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））である。ＲＮＡｉ剤の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」ともいう）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0248】

いくつかの態様において、本開示において有用な遺伝子編集ツールは、１以上のｍｉＲＮＡを含む。「ｍｉＲＮＡ」とは、約２１～２５ヌクレオチド長の天然に存在する小さな非コードＲＮＡ分子を意味する。いくつかの態様において、本開示において有用なｍｉＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制、ｍＲＮＡの切断、及び／または脱アデニル化によって、内因性標的遺伝子産物（すなわち、ＮＲ４Ａ３タンパク質）の発現を下方制御する（例えば、減少させる）ことができる。

【0249】

いくつかの態様において、本開示で使用することのできる遺伝子編集ツールは、１以上のｓｈＲＮＡを含む。「ｓｈＲＮＡ」（または「低分子ヘアピンＲＮＡ」分子）とは、二本鎖領域及びループ領域を一端に含みヘアピンループを形成するＲＮＡ配列を意味し、これを使用して、遺伝子発現を低減させる及び／またはサイレンシングすることができる。二本鎖領域は通常、ステムの各側で約１９ヌクレオチド～約２９ヌクレオチド長であり、ループ領域は通常、約３～約１０ヌクレオチド長である（３’末端または５’末端の一本鎖オーバーハンギングヌクレオチドは任意選択による）。ｓｈＲＮＡをプラスミドまたは非複製的組換えウイルスベクターにクローニングして細胞内に導入すると、ｓｈＲＮＡコード配列をゲノムに組み込むことができる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内因性標的遺伝子（すなわち、ＮＲ４Ａ３）翻訳及び発現の安定かつ一貫した抑制をもたらし得る。

【0250】

いくつかの態様において、本明細書に開示される遺伝子編集ツールは、１以上のｓｉＲＮＡを含む。「ｓｉＲＮＡ」とは、通常約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多タンパク質複合体と会合し、その間に「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。次いで、活性化されたＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が配列相同性のためにＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡ（すなわち、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡ）を切断して、特異的な遺伝子サイレンシングが生じる。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、２塩基のオーバーハングをその３’末端に有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入して標的ｍＲＮＡ配列（すなわち、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡ）を分解させることができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれるＦｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：１９，１９９８ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，２０２，８４６号、及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。

【0251】

Ｖ．Ａ．６．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
いくつかの態様において、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減するために使用され得る遺伝子編集ツールには、アンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用する場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」とは、標的核酸と、特に標的核酸上の連続配列とハイブリダイズすることにより、標的遺伝子（すなわち、ＮＲ４Ａ３）の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。

【0252】

いくつかの態様において、本開示において有用なＡＳＯは一本鎖である。本開示の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の度合いがオリゴヌクレオチドの全長にわたっておよそ５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができると理解される。いくつかの態様において、本開示において有用なＡＳＯは、２’糖修飾ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを１以上含み得る。ＡＳＯに行うことのできる追加の修飾（例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子発現を阻害または低減させるために使用することのできるもの）は、例えば、米国公開第２０１９／０２７５１４８号Ａ１に提示されている。

【0253】

いくつかの態様において、ＡＳＯがヌクレアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨ１などのＲＮアーゼＨを動員することができる場合、ＡＳＯは、ＮＲ４Ａ３転写物（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレアーゼによる分解を介して、ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減させることができる。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を加水分解する遍在性酵素である。したがって、いくつかの態様において、標的配列（例えば、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡ）に結合すると、ＡＳＯは、ＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡの分解を誘導し得、それにより、ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減する。

【0254】

本明細書に開示されるように、遺伝子編集ツールの上記の例は限定を意図するものではなく、当該技術分野で利用可能な任意の遺伝子編集ツールを使用して、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を低減または阻害することができる。また、本明細書に記載されるように、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方のレベルも低減される場合、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子を特異的に標的とする上述した遺伝子編集ツールのいずれかも使用され得る。

【0255】

ＩＶ．Ａ．７．リプレッサー
いくつかの態様において、（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低減するために）本開示で使用され得る遺伝子編集ツールは、リプレッサーを含む。本明細書で使用する場合、「リプレッサー」という用語は、転写を活性化することなく以下のＮＲ４Ａ応答要素：（ｉ）ＮＧＦＩ－Ｂ応答要素（ＮＢＲＥ）、（ｉｉ）Ｎｕｒ－応答要素（ＮｕｒＲＥ）、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方に結合することが可能な任意の薬剤を指す。したがって、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥに結合することによって、本明細書に記載のリプレッサーは、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）における１つ以上のＮＲ４Ａファミリーメンバーのレベルを抑制する（または低減または阻害する）ことが可能である。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、細胞がリプレッサーと接触した場合、細胞におけるＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、細胞がリプレッサーと接触した場合、細胞におけるＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、細胞がリプレッサーと接触した場合、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質及び（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルを低減する。いくつかの態様において、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへのリプレッサーの結合は、以下の各々のレベルを低減する：（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質。ＮＲ４Ａファミリーのすべてのメンバー（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３）のレベルを低減することが可能なリプレッサーは、「ＮＲ４Ａスーパーリプレッサー」としても知られている。例えば、ＷＯ２０２０２３７０４０Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0256】

少なくとも上の開示から明らかなように、本開示のために有用であるリプレッサーは、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥ応答要素に結合することが可能なＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの態様において、そのようなリプレッサーは、追加のドメインを含む。そのような追加のドメインの非限定的な例には、ＮＲ４Ａリガンド結合ドメイン、ＦＬＡＧドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＮＣＯＲドメイン、Ｔ２Ａドメイン、自己切断ドメイン、核局在化シグナル、二量体化ドメイン（例えば、ｄｉＺＩＰ二量体化ドメイン）、転写リプレッサードメイン、クロマチン圧縮ドメイン、エピトープタグ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。そのような追加のドメインに関する追加の開示は、例えば、ＷＯ２０２０２３７０４０Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られ得る。いくつかの態様において、追加のドメインは、転写活性化ドメインを含まない。

【0257】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルを低減する際に、細胞は、本明細書に記載のＮＲ４Ａリプレッサータンパク質と接触させられ得る。いくつかの態様において、細胞は、ＮＲ４Ａリプレッサーをコードする核酸配列と接触させられる。

【0258】

Ｖ．Ｂ．疲弊／機能不全を低減する方法
本開示は、細胞の疲弊または機能不全を低減、改善、または阻害する方法であって、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１ならびにＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有しながら、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように細胞を修飾することを含む、方法を提供する。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、そのような細胞（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有するように修飾されている）は、低減したレベルの（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を有するようにさらに修飾され得る。

【0259】

腫瘍細胞が宿主免疫応答を回避し得る様々な様式のうちの１つは、腫瘍特異的免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を引き起こすことによる。本明細書で使用する場合、「疲弊」、またはより具体的には、「Ｔ細胞疲弊」という用語は、Ｔ細胞機能の喪失を指し、これは、感染症または疾患（例えば、がん）の結果として生じ得る。Ｔ細胞疲弊は、本開示では「Ｔ細胞機能不全」または「Ｔ細胞アネルギー」と同義に使用され得る。いくつかの態様において、Ｔ細胞疲弊は、様々な免疫チェックポイント阻害性分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３）の増加した発現、アポトーシス、及び低減したエフェクター機能（例えば、サイトカイン生成及び細胞傷害性分子、例えば、パーフォリン及びグランザイムの発現）に関連する。したがって、「Ｔ細胞疲弊を低減する」、「Ｔ細胞疲弊を改善する」、「Ｔ細胞疲弊を阻害する」などの用語は、以下のうちの１つ以上によって特性化されるＴ細胞の回復した機能性の状態を指す：（ｉ）１つ以上の免疫チェックポイント阻害性分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３）の低下した発現、（ｉｉ）記憶マーカー（例えば、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＣＲ７）の増加した記憶形成及び／または維持、（ｉｉｉ）アポトーシスの防止、（ｉｖ）増加したサイトカイン生成（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦ－α）、（ｖ）向上した殺傷能力、（ｖｉ）少ない表面抗原を有する腫瘍標的の増加した認識、（ｖｉｉ）抗原に応答する向上した増殖、及び（ｖｉｉｉ）それらの任意の組み合わせ。

【0260】

いくつかの態様において、例えば、本明細書に開示される方法において、細胞を修飾することは、疲弊に対する抵抗性または耐性を有するように免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を修飾することを含む。したがって、いくつかの態様において、本開示は、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルを（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減することによって免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）における疲弊を低減する方法に関する。いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞においてすでに生じた機能不全を好転させること（すなわち、疲弊したＴ細胞をより疲弊していないようにすること）を含む。いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、新たに活性化した免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が疲弊することを防止することを含む。本開示から明らかなように、いくつかの態様において、免疫細胞は、例えば、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように先に、同時に、または後に修飾される。

【0261】

いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞における疲弊を好転させること及び防止することの両方を含む。

【0262】

免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、当該技術分野で知られている様々な方法によって決定され得る。いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、アポトーシスに対する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の耐性を評価することによって測定され得る。したがって、いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び（ｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を発現する）は、アポトーシスに対する増加した耐性を示す。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物におけるアポトーシスに対する耐性は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、より低いレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞のアポトーシス）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、アポトーシスに対する増加した耐性は、Ｔ細胞の長期持続性または生存を促進し得る。そのため、いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して向上した持続性または生存を示す。

【0263】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物における持続性または生存は、少なくとも約２倍～約１００倍増加する。所定の態様において、本開示の細胞組成物における持続性または生存は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0264】

いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、免疫チェックポイント分子に対する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の耐性を評価することによって測定され得る。いくつかの態様において、免疫チェックポイント分子に対する耐性は、本開示の細胞組成物において、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞における耐性）と比較して少なくとも１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0265】

いかなる１つの理論によっても縛られることなく、いくつかの態様において、免疫チェックポイント分子に対する増加した耐性は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞上の１つ以上の免疫チェックポイント分子の減少した発現による。したがって、いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して低減したレベルの１つ以上の免疫チェックポイント分子を発現する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント分子の発現レベルは、本開示の細胞組成物において参照細胞と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低減される。免疫チェックポイント分子の例は、当該技術分野で知られており、それには、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＤ２００Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。

【0266】

いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が、刺激、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にサイトカインを生成する能力を評価することによって測定され得る。したがって、いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて発現する）は、参照（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞におけるサイトカイン生成）と比較して増加したサイトカイン生成を示す。

【0267】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物におけるサイトカイン生成は、少なくとも約２倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物におけるサイトカイン生成は、参照（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞におけるサイトカイン生成）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。サイトカインの非限定的な例には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0268】

いくつかの態様において、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が繰り返しの腫瘍負荷後に腫瘍細胞を殺傷する能力を評価することによって測定され得る。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、２回の腫瘍負荷後に参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して増加した腫瘍細胞殺傷を示す。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、３回の腫瘍負荷後に参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して増加した腫瘍細胞殺傷を示す。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、４回の腫瘍負荷後に参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して増加した腫瘍細胞殺傷を示す。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物は、５回の腫瘍負荷後に参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して増加した腫瘍細胞殺傷を示す。いくつかの態様において、腫瘍細胞を殺傷することは、腫瘍細胞の派生を防止することを含む。

【0269】

いくつかの態様において、腫瘍負荷の各々の後、本開示の細胞組成物の腫瘍細胞を殺傷する能力は、約２倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様において、腫瘍細胞を殺傷する能力は、参照（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞における腫瘍細胞殺傷）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0270】

Ｖ．Ｃ．腫瘍微小環境において抗腫瘍機能を維持する方法
腫瘍形成（すなわち、腫瘍の生成または形成）は、３つの段階：開始、進行、及び転移からなる複雑で動的なプロセスである。これらの段階の各々は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって緊密に制御される。Ｗａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８（５）：７６１－７７３（２０１７）を参照されたい。本明細書で使用する場合、「腫瘍微小環境」または「ＴＭＥ」という用語は、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックスを含む、腫瘍の周りの環境を指す。以下にさらに記載されるように、腫瘍は、細胞外シグナルを放出すること、腫瘍血管新生を促進すること、及び末梢免疫寛容を誘導することによって微小環境に影響を及ぼし得るのに対し、微小環境における免疫細胞は、腫瘍細胞の成長及び進化に影響を及ぼし得る。

【0271】

腫瘍細胞は通常、腫瘍微小環境への不十分な血液供給をもたらす極めて高いスピードで成長する。Ｇｏｕｉｒａｎｄ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ８：１１７（２０１８）を参照されたい。これは、腫瘍微小環境を低酸素にし、反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加した生成をもたらす。低酸素及びＲＯＳは、免疫細胞機能に悪影響を及ぼし得、それにより、対象における抗腫瘍免疫応答を阻害する。

【0272】

いくつかの態様において、例えば、本明細書に開示される方法において、細胞を修飾することは、腫瘍微小環境に見られるもの等の低酸素環境において免疫細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の抗腫瘍機能の向上をもたらす。本明細書で使用する場合、「抗腫瘍機能」という用語は、免疫細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）が、腫瘍細胞の根絶及び／またはコントロールをもたらす免疫応答を搭載する能力を指す。抗腫瘍機能の非限定的な例は、サイトカイン生成、増殖、低減した疲弊、長期生存、細胞傷害性（例えば、腫瘍細胞を殺傷する能力）、またはそれらの組み合わせを含む。

【0273】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて有する修飾された細胞を含む）の抗腫瘍機能は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して低酸素環境において向上する（すなわち、増加する）。

【0274】

腫瘍細胞の急速増殖はまた、腫瘍微小環境内の様々な栄養素（例えば、グルコース）の枯渇をもたらし得る。Ｇｏｕｉｒａｎｄ（上掲）を参照されたい。本明細書で論述されるように、栄養素、例えば、グルコースは、正常な免疫細胞機能及び発達のために必須である。いくつかの態様において、本開示の細胞組成物の抗腫瘍機能は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して低い栄養素環境において向上する（すなわち、増加する）。

【0275】

本明細書に記載されるように、腫瘍細胞が宿主免疫応答を抑制するメカニズムの１つは、腫瘍微小環境に様々な免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインを放出することによる。腫瘍微小環境内のそのような代謝産物及び／またはサイトカインの蓄積は、免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の正常な機能を阻害し得る。そのような免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインの非限定的な例には、インドールアミン－２－３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、アルギナーゼ、誘導性酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）－Ａ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、ＶＥＧＦ、反応性酸素種（ＲＯＳ）、アデノシン、アルギナーゼ、プロスタグランジンＥ２、及びそれらの組み合わせが含まれる。

【0276】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて有する修飾された細胞を含む）の抗腫瘍機能は、免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインの存在下で少なくとも約２倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様において、抗腫瘍機能は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

【0277】

腫瘍微小環境が抗腫瘍免疫応答を阻害し得る別のメカニズムは、免疫抑制性細胞、例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞を介する。

【0278】

本明細書で使用する場合、「骨髄系由来サプレッサー細胞」または「ＭＤＳＣ」という用語は、骨髄起源、未成熟状態、及びＴ細胞応答を強力に抑制する能力によって定義される、不均一な免疫細胞集団を意味する。ＭＤＳＣは、骨髄において生成され、腫瘍保有宿主において、末梢リンパ器官及び腫瘍に移行して腫瘍微小環境の形成に寄与する。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、単球と形態学的に及び表現型的に同様である単球性ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、好中球と形態学的に及び表現型的に同様である多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、Ｍ－ＭＤＳＣ及びＰＭＮ－ＭＤＳＣの両方を含む。腫瘍微小環境内に存在するＭＤＳＣは通常、不十分な食作用活性、反応性酸素種（ＲＯＳ）、酸化窒素（ＮＯ）、及び大抵は抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－β）の継続的生成を示す。

【0279】

本明細書で使用する場合、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔ_ｒｅｇ細胞」という用語は、他のＴ細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の増殖及び／または機能を抑制する能力を有するＴ細胞の特定の集団を指す。いくつかの態様において、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞である。いくつかの態様において、制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３^＋である。制御性Ｔ細胞は、様々な接触依存性及び非依存性メカニズムを介してそれらの免疫抑制活性を発揮し得る。そのようなメカニズムの非限定的な例には、（ｉ）抑制性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、及びＩＬ－３５）の生成；（ｉｉ）免疫チェックポイント及び阻害性受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、アルギナーゼ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＣＯＳ、ＴＩＧＩＴ、ＩＤＯ）の発現；（ｉｉｉ）直接的細胞傷害性（パーフォリン／グランザイム媒介またはＦａｓＬ媒介）；（ｉｖ）エフェクターＴ細胞活性の代謝破壊（例えば、ＩＬ－２消費）；（ｖ）Ｔ細胞疲弊を促進し得る寛容原性樹状細胞の誘導；（ｖｉ）アデノシン生成、及び（ｖｉｉ）それらの任意の組み合わせが含まれる。

【0280】

いくつかの態様において、本開示の細胞組成物（すなわち、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて有する修飾された細胞を含む）の抗腫瘍機能は、参照細胞（例えば、対応する細胞、例えば、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されていないＴ細胞などの免疫細胞）と比較して抑制性細胞の存在下で向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様において、抑制性細胞は、ＭＤＳＣである。いくつかの態様において、抑制性細胞は、Ｔ_ｒｅｇ細胞である。いくつかの態様において、抑制性細胞は、ＭＤＳＣ及びＴ_ｒｅｇ細胞の両方を含む。

【0281】

上記開示は、Ｔ細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）との関連で概ね提供されるが、上記開示はまた、他のタイプの免疫細胞に適用され得ることを当業者は認識する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に開示される方法は、活性化を向上させ、疲弊／機能不全を低減し、または腫瘍の処置のために有用な任意の免疫細胞の抗腫瘍機能を維持するために使用され得る。そのような免疫細胞の非限定的な例には、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラル（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様において、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの態様において、ＴＩＬは、ＣＤ８^＋ＴＩＬである。いくつかの態様において、ＴＩＬは、ＣＤ４^＋ＴＩＬである。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本開示の免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ ＮＫ細胞を含む。

【0282】

ＶＩ．核酸及びベクター
本開示はまた、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツールを含み、及び／または本開示の修飾された細胞において発現し得るキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体（例えば、抗ＲＯＲ１ ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ ＴＣＲ）をコードする１つ以上の核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）を提供する。

【0283】

本明細書に記載されるように、本開示のいくつかの態様は、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の標的配列に特異的に結合することが可能なヌクレオチド配列（すなわち、ＮＲ４Ａ３標的化ポリヌクレオチド）を含むポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）を対象とする。いかなる１つの理論によっても縛られることなく、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の標的配列に結合することによって、本開示のポリヌクレオチドは、細胞（例えば、免疫細胞）におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはコードされるタンパク質のレベルを低減することが可能である。

【0284】

本明細書に記載されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の核酸配列に特異的に結合し得るヌクレオチド配列を含む。そのようなヌクレオチド配列は、本明細書で「結合配列」または「ガイド配列」または「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）とも称される。したがって、「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）という用語は、本明細書で使用する場合、ＮＲ４Ａ３遺伝子を有する核酸配列に特異的に結合し得、それにより、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減する限り、特に限定されない。そのようなｇＲＮＡの非限定的な例は、本開示を通して提供される（例えば、表Ａ～Ｄを参照されたい）。

【0285】

いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、約５～約１００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドのｇＲＮＡは、長さが約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、長さが約１０～約３０ヌクレオチド（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０ヌクレオチド）である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、長さが約２０ヌクレオチドである。本開示のために有用であるｇＲＮＡに関する追加の開示は、本出願において他の箇所で提供される（例えば、セクションＩＶ．Ａ．１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを参照されたい）。

【0286】

いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の核配列（本明細書で「標的配列」とも称される）と相補的または実質的に相補的となるように設計される。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、複数の配列（例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の複数の標的配列；またはＮＲ４Ａ３遺伝子の標的配列及びＮＲ４Ａファミリーの他のメンバー内の標的配列）を結合させるために揺らぎまたは縮重塩基を組み込み得る。いくつかの場合では、ｇＲＮＡは、安定性を増加させるために改変され得る。例えば、非天然ヌクレオチドが、分解に対するＲＮＡ耐性を増加させるために組み込まれ得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡにおける二次構造形成を回避または低減するように改変または設計され得る。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、Ｇ－Ｃ含有量を最適化するように設計され得る。いくつかの態様において、Ｇ－Ｃ含有量は、約４０％～約６０％（例えば、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％）である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチド、例えば、限定されないが、メチル化またはリン酸化されたヌクレオチドを含有し得る。本明細書に記載のポリヌクレオチドの１つ以上の特性を修飾し、それによりそれを改善する追加の方法は、当該技術分野で知られている。本明細書に記載のポリヌクレオチドに付加され得るそのような修飾の非限定的な例には、５’キャップ、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列、安定性コントロール配列、ヘアピン、細胞内局在化配列、検出もしくは標識配列、１つ以上のタンパク質のための結合部位、非天然ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、米国公開番号２０２１０１２３０４６Ａ１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのような修飾に関する追加の開示は、本開示において他の箇所で提供される。

【0287】

本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、遺伝子編集ツールを含む核酸分子及びガイドＲＮＡを含む核酸分子は、別々の核酸分子として（同時にまたは逐次）細胞に導入され得る。いくつかの態様において、遺伝子編集ツール及びガイドＲＮＡは、単一の核酸分子の一部であり得る。例えば、いくつかの態様において、遺伝子編集ツールを含む核酸分子は、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示される合成ガイドＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの態様において、遺伝子編集ツールを含む核酸分子は、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示される合成ガイドＲＮＡ）及びＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む。

【0288】

本明細書で提供される核酸のいずれかは、細胞全体に、細胞ライセートに、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。

【0289】

核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然に単離ＤＮＡに連結されている染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野でよく知られている他のものを含む標準的な技術によって精製された場合、「単離されている」または「実質的に純粋とされている」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。本明細書に記載の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有する場合があり、含有しない場合がある。いくつかの態様において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。本明細書に記載される核酸は、当該技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。

【0290】

いくつかの態様において、本開示は、細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツールを含む単離された核酸分子を含み、及び／または本開示の修飾された細胞において発現し得るキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードするベクターを提供する。

【0291】

本明細書に記載されるように、そのようなベクターは、低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）発現するように細胞（例えば、ＣＡＲを発現する細胞）を修飾するために使用され得、そのような修飾された細胞は、疾患または障害、例えば、がんを処置するために使用され得る。

【0292】

本開示のための好適なベクターには、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターが含まれる。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0293】

本明細書で使用する場合、「ベクター」及び「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞に導入したときに、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製及び翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸構築物を意味する。発現ベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びその誘導体が含まれ得る。

【0294】

本明細書で使用する場合、ウイルスベクターは、限定するものではないが、次のウイルス：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；レンチウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来する核酸配列を含む。当該技術分野でよく知られている他のベクターを容易に用い得る。所定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が対象となる遺伝子で置き換えられた非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスにはレトロウイルスが含まれ、レトロウイルスのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、その後、宿主細胞ＤＮＡにプロウイルスが組込まれる。

【0295】

いくつかの態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する。いくつかの態様において、ベクターは、レンチウイルスに由来する。レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６、及びＷＯ９８１８９３４に開示されており、これらは各々、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

【0296】

他のベクターにはプラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは、当該技術分野で広く記載されており、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製して宿主ゲノム内に組み込まれることがないため、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であることが見出されている。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。商業的供給者から入手可能ないくつかの一般的に使用されているプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。特定のプラスミドの追加の例には、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０；ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０；ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０；及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０（すべてがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）製である）が含まれる。他のプラスミドも当業者には周知である。さらに、プラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去及び／または付加するように、標準的な分子生物学技術を使用してカスタム設計することができる。

【0297】

本開示は、本明細書に開示される核酸を修飾するために当業者に利用可能な任意の核酸修飾、例えば、ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡをコードする核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、少なくとも１つのｇＲＮＡまたは少なくとも１つのｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードする核酸を含むベクター、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸、本明細書に開示される任意のゲノム編集ツールをコードする核酸、ＲＮＡｉをコードする核酸、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を企図する。

【0298】

本明細書で使用する場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。いくつかの態様において、合成の修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）修飾または置換を含む。

【0299】

本出願に開示される核酸（例えば、ｇＲＮＡ及びそのようなｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓ９をコードする核酸）は、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に開示されるヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。いくつかの態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）または化学的合成を使用することによって導入される少なくとも１つのヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ－ＲＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＤＮＡモノマー、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡモノマー、２’－アミノ－ＤＮＡモノマー、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマー、ｃＥｔモノマー、ｃＭＯＥモノマー、５’－Ｍｅ－ＬＮＡモノマー、２’－（３－ヒドロキシ）プロピル－ＲＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＡＮＡモノマー、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、インターカレート核酸（ＩＮＡ）モノマー、及び前記ヌクレオチドアナログの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様において、最適化された核酸分子、例えば、ｇＲＮＡは、少なくとも１つの骨格修飾、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

【0300】

いくつかの態様において、本出願に開示される核酸（例えば、ｇＲＮＡ及びそのようなｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓ９をコードする核酸）は、末端位置で、例えば、５’及び／または３’末端に対して位置１、２、３でＭ（２’－Ｏ－メチル）、ＭＳ（２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート）、またはＭＳＰ（２’－Ｏ－メチ３’チオＰＡＣＥ、ホスホノアセテート）修飾、またはそれらの組み合わせを導入することによって化学的に修飾され得る。例えば、一態様において、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭ修飾を含み得る。いくつかの態様において、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭＳ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭＳ修飾を含み得る。いくつかの態様において、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭＳＰ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭＳＰ修飾を含み得る。

【0301】

いくつかの態様において、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、例えば、ｇＲＮＡにおけるウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジンヌクレオシドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または１００％は、ヌクレオシドで置き換えられている。

【0302】

いくつかの態様において、本出願に開示される核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、ＩＶＴまたは化学的合成によって生成されるヌクレオチド配列を含み、
（ｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのウリジンは、置き換えられており；及び／または、
（ｉｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのアデノシンは、置き換えられており；及び／または、
（ｉｉｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのグアノシンは、置き換えられており；及び／または、
（ｉｖ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのシチジンは、置き換えられている。

【0303】

本開示の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、分子の長さ全体に沿って均一に修飾されている必要はない。異なるヌクレオチド修飾及び／または骨格構造が、核酸における様々な位置で存在し得る。当業者は、ヌクレオチドアナログまたは他の修飾（複数可）が、核酸の機能が実質的に低下しないように、核酸の任意の位置（複数可）に位置し得ることを理解する。修飾はまた、５’または３’末端修飾であり得る。核酸は、最小で１％及び最大で１００％修飾されたヌクレオチド、または任意の介在パーセンテージ、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％修飾されたヌクレオチドを含有し得る。

【0304】

いくつかの態様において、本明細書で提供される核酸は、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ）及び／またはポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）をコードする合成の修飾されたＤＮＡ分子であり、合成の修飾されたＤＮＡ分子は、１つ以上の修飾を含む。

【0305】

本明細書に記載の合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）には、エンド及びエキソヌクレアーゼによる急速分解を防止するための修飾が含まれる。修飾には、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、反転結合等）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合等）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広範なパートナーのレパートリーと塩基対合する塩基、またはコンジュゲーション塩基での置き換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位におけるもの）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む、ヌクレオシド間結合修飾が含まれるがこれらに限定されない。

【0306】

本明細書に記載の方法で有用な合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）組成物の具体的な例には、修飾されたまたは非天然ヌクレオシド間結合を含有する修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）が含まれるがこれらに限定されない。修飾されたヌクレオシド間結合を有する合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）には、とりわけ、ヌクレオシド間結合においてリン原子を有しないものが含まれる。いくつかの態様において、合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、そのヌクレオシド間結合（複数可）においてリン原子を有する。

【0307】

修飾されたヌクレオシド間結合の非限定的な例には、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらのＴ－５’結合アナログ、ならびに逆転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が、３’－５’から５’－３’またはＴ－５’から５’－Ｔに連結されている）が含まれる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。

【0308】

修飾されたヌクレオシド間結合であって、それにリン原子が含まれない、修飾されたヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。

【0309】

本明細書に記載の合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）のいくつかの態様には、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する核酸及びヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ならびに特に米国特許第５，４８９，６７７号の－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして知られている］、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－及び－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－［ネイティブホスホジエステルヌクレオシド間結合は、－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ_２－として表される］、及び米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格（これらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。いくつかの態様において、本明細書で特徴となる核酸配列は、米国特許第５，０３４，５０６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のモルホリノ骨格構造を有する。

【0310】

本明細書に記載の合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）はまた、１つ以上の置換された糖部位を含有し得る。本明細書で特徴となる核酸には、以下のもの：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つが２’位で含まれ得、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な修飾には、Ｏ［（ＣＨ_２）ｎＯ］ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３）］_２（式中、ｎ及びｍは、１～約１０である）が含まれる。いくつかの態様において、合成の修飾されたＲＮＡには、以下のもの：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、レポーター基、インターカレーター、所定の核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の薬物動態特性を改善するための基、または合成の修飾された核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つが２’位で含まれる。いくつかの態様において、修飾には、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または－ＭＯＥとしても知られている２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_２）_２である。

【0311】

他の修飾には、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の修飾はまた、核酸配列上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行われ得る。合成の修飾されたｇＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位などの糖模倣体を有し得る。

【0312】

非限定的な例として、本明細書に記載の合成の修飾されたｇＲＮＡには、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’－アミノ－修飾ヌクレオシド、２’－アルキル－修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドが含まれ得る。

【0313】

いくつかの態様において、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、シュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、及びイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。

【0314】

あるいは、合成の修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個またはそれを超え、最大でヌクレオチドの長さ全体の修飾されたヌクレオシドを含み得る。最小で、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含む合成の修飾されたｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される修飾を有する単一のヌクレオシドを含む。所与の合成の修飾されたｇＲＮＡにおけるすべての位置について、均一に修飾されている必要はなく、実際、前述した修飾のうちの複数が、単一の合成の修飾されたｇＲＮＡにおいてまたは合成の修飾されたｇＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいてでさえも組み込まれ得る。しかしながら、分子における所与のヌクレオシドの各存在は、修飾されることが好ましい（例えば、各シトシンは、修飾されたシトシン、例えば、５ｍＣである）が、絶対に必要であるわけではない。しかしながら、同じヌクレオシドの異なる存在は、所与の合成の修飾されたｇＲＮＡ分子において異なる様式で修飾され得ることも企図される（例えば、一部のシトシンは５ｍＣとして修飾されており、他のものは２’－０－メチルシチジンまたは他のシトシンアナログとして修飾されている）。修飾は、合成の修飾されたｇＲＮＡにおいて複数の修飾されたヌクレオシドの各々について同じである必要はない。さらに、本明細書に記載の態様のいくつかの態様において、合成の修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも２つの異なる修飾されたヌクレオシドを含む。本明細書に記載のいくつかの態様において、少なくとも２つの異なる修飾されたヌクレオシドは、５－メチルシチジン及びシュードウリジンである。合成の修飾されたｇＲＮＡはまた、修飾されたヌクレオシド及び修飾されていないヌクレオシドの両方の混合物を含有し得る。

【0315】

本明細書に開示されるｇＲＮＡ及び他の核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のために使用される核酸、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットは、オリゴヌクレオチド合成機、宿主細胞発現、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）、または当該技術分野で知られている任意の他の方法を使用して化学的合成を使用して生成され得る。全体的または部分的に天然に存在するヌクレオシドを置き換える天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組み合わせ。ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素方法によって行われ得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖におけるヌクレオチド間のホスホジエステル結合の生成を触媒する。

【0316】

遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として作用する標的核酸の酵素的増幅に基づく。対象となる個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究及び他の研究ニーズのため、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さなサンプルから標的核酸の複数のコピーを生成することが必要である。そのような方法は、本明細書に開示されるｇＲＮＡ及び他の核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ＡＳＯ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）の製造において適用され得る。

【0317】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の急速増幅、ならびにゲノムマッピング及びシーケンシングにおいて広い用途を有する。ＤＮＡを合成するための重要な成分は、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端に相補的なプライマー、構築ブロックとしてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長工程を介して進行するので、新しく生成されるＤＮＡ分子は、複製の次のサークルのための鋳型として作用し得、標的ＤＮＡの指数関数的増幅を達成する。ＰＣＲは、変性及びアニーリングのための加熱及び冷却のサイクルを必要とする。基礎的ＰＣＲのバリエーションには、非対称ＰＣＲ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８５，９４３６－９４４０（１９８８））、インバースＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２０（３），６２１－６２３，（１９８８））、及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２６（１），１１２－２２，１２４－５（１９９９））（その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。ＲＴ－ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが所望の標的であり、最初に逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。前述の方法のいずれも、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）の１つ以上の領域の製造において利用され得る。

【0318】

リガーゼによってポリヌクレオチドまたは核酸をアセンブルすることも広く使用されている。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介してポリヌクレオチド鎖の５’末端及び３’末端の分子間ライゲーションを促進する。したがって、ＲＮＡリガーゼは、例えば、ｇＲＮＡスペーサー配列及びｇＲＮＡフレーム配列の３’から５’への分子間ライゲーションによってｇＲＮＡを生成するために使用され得る。

【0319】

対象となる単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために標準的な方法が適用され得る。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化されたヌクレオチド配列を含有する単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーが合成され得る。いくつかの態様において、所望のポリペプチドの一部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、次いでライゲーションされ得る。いくつかの態様において、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的アセンブリのための５’または３’オーバーハングを含有する。

【0320】

本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）は、当該技術分野で知られている化学的合成方法及び潜在的核酸塩基置換を使用して化学的に合成され得る。例えば、国際公開番号ＷＯ２０１４０９３９２４、ＷＯ２０１３０５２５２３；ＷＯ２０１３０３９８５７、ＷＯ２０１２１３５８０５、ＷＯ２０１３１５１６７１；米国公開番号ＵＳ２０１３０１１５２７２；または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号、同第ＵＳ８７１０２００号（これらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0321】

ＶＩＩ．薬学的組成物
本開示は、（ａ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を発現するように修飾されており、かつ（ｉ）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を有する細胞を含む薬学的組成物（例えば、本明細書に記載の細胞のもの等）を提供する。本開示は、（ａ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質及び結合分子を発現するように修飾されており、かつ：（ｉ）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を有する細胞を含む薬学的組成物（例えば、本明細書に記載の細胞のもの等）を提供する。より具体的には、いくつかの態様において、本明細書では、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有し、（ｉｉｉ）内因性レベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有し、及び（ｉｖ）内因性レベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する修飾された細胞（例えば、修飾された免疫細胞）を含む組成物が提供される。いくつかの態様において、本明細書で提供される組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有し、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有し、及び（ｉｖ）内因性レベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する修飾された細胞（例えば、修飾された免疫細胞）を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有し、（ｉｉｉ）低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有し、及び（ｉｖ）低減したレベルのＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有する修飾された細胞（例えば、修飾された免疫細胞）を含む。

【0322】

いくつかの態様において、上述した組成物のいずれかについて、ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルは、本明細書に記載の遺伝子編集ツールのいずれかを使用して低減され得る。例えば、いくつかの態様において、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得る本明細書に記載のｇＲＮＡのいずれかは、ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルを低減する（それにより、コードされるＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低減する）ために使用され得る。

【0323】

したがって、いくつかの態様において、本開示のために有用な組成物は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本開示のために有用な組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの
態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0324】

いくつかの態様において、本開示のために有用な組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号３０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号５９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号６９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号７９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、
ｇＲＮＡは、配列番号８５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号８９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９０に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９１に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９２に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９３に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９４に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９５に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９６に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９７に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９８に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、（ｉ）結合分子（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とし得るｇＲＮＡで修飾されている細胞（例えば、免疫細胞）を含み、ｇＲＮＡは、配列番号９９に示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。

【0325】

いくつかの態様において、上述した組成物のいずれかは、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含む。当業者に明らかになるように、特記なき限り、「組成物」及び「薬学的組成物」という用語は、同義に使用され得る。したがって、薬学的組成物に関する任意の好適な開示は、組成物に同等に適用され得る。同様に、組成物に関する任意の好適な開示は、薬学的組成物に同等に適用され得る。

【0326】

本明細書に記載されるように、本明細書に記載の薬学的組成物のいずれかは、がんを予防及び／または処置するために使用され得る。本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、本明細書に開示される薬学的組成物に存在する修飾された細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞）またはＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＮＫ細胞）などの免疫細胞である。

【0327】

許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノールアルコール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、もしくはデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

【0328】

薬学的組成物は、対象に対するあらゆる投与経路用に配合され得る。投与経路の特定例としては、筋肉内、皮下、眼内、静脈内、腹腔内、皮内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、心室内、髄腔内、大槽内、嚢内、または腫瘍内が挙げられる。皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注射を特徴とする非経口投与も、本明細書では想定される。注射物は、液体の溶液もしくは懸濁液、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液に好適な固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。注射物、溶液、及びエマルジョンはまた、１以上の賦形剤を含む。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、所望の場合、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度向上剤、及び他のかかる薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、及びシクロデキストリンなどを含んでもよい。

【0329】

非経口調製物で使用される薬学的に許容可能な担体には、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、バッファー、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容できる物質が含まれる。水性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース、及び乳酸加リンゲル注射液が含まれる。非水性非経口ビヒクルには、植物由来の不揮発性油、綿実油、コーン油、ゴマ油及びピーナッツ油が含まれる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウムクロリド、及びベンゼトニウムクロリドを含む複数用量容器に包装される非経口調製物に、静菌性または静真菌性の濃度の抗微生物剤を加えてもよい。等張剤は、塩化ナトリウム及びデキストロースを含む。バッファーは、リン酸塩及びクエン酸塩を含む。抗酸化剤は、重硫酸ナトリウムを含む。局所麻酔剤は、塩酸プロカインを含む。懸濁剤及び分散剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンを含む。乳化剤には、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤は、ＥＤＴＡを含む。薬学的担体は、水混和性ビヒクル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も含む。

【0330】

非経口投与用の調製物は、そのまま注射できる無菌溶液、使用直前に溶媒と組み合わされる無菌の乾燥した可溶性製品、例えば凍結乾燥粉末を含み、皮下錠剤、そのまま注射できる無菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わされる無菌の乾燥した不溶性製品、及び無菌エマルジョンを含む。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。

【0331】

静脈内投与される場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤及び可溶化剤（グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール、ならびにこれらの混合物など）を含む溶液が含まれる。

【0332】

本明細書に提供される薬学的組成物は、特定の組織、受容体、または処置される対象の身体の他の領域を標的とするように配合されてもよい。そのような標的化方法の多くが当業者に周知である。本明細書では、そのような標的化方法のすべてが本発明の組成物の使用において想定される。標的化方法の非限定的な例については、例えば、各々が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、及び同第５，７０９，８７４号を参照されたい。

【0333】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される組成物は、滅菌されていてもよい。これは、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成され得る。

【0334】

本開示はまた、例えば、免疫細胞の集団における持続的記憶及び／またはエフェクター機能を促進する、本明細書に記載の１つ以上の方法のための手段を含む細胞組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、免疫細胞の集団における疲弊及び／または機能不全を低減、改善、または阻害するための手段を含む細胞組成物を提供する。いくつかの態様において、手段は、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）修飾することを含む。いくつかの態様において、手段は、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を修飾することを含む。

【0335】

ＶＩＩＩ．キット
本開示はまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツール（例えば、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるｇＲＮＡを含む）、または（ｉｉ）それらの組み合わせ、及び任意に本明細書に開示される方法のいずれかに従って腫瘍を処置するための指示書を含むキットを提供する。また、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツール（例えば、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる）、または（ｉｉ）それらの組み合わせ、及び任意に本明細書に開示される方法に従って細胞組成物を調製するための指示書を含むキットが提供される。

【0336】

本開示はまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。いくつかの態様において、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツール（例えば、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる）、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、ＲＯＲ１ ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を含むベクター、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、及び任意に本明細書に開示される方法のいずれかに従って腫瘍を処置するための指示書を含むキットを提供する。また、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための遺伝子編集ツール（例えば、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になる）、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を含むベクター、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、及び任意に本明細書に開示される方法に従って細胞組成物を調製するための指示書を含むキットが提供される。

【0337】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示される組成物、例えば、（ｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質（単独でまたはＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）の低減された発現を示す細胞、例えば、免疫細胞、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、ベクター）、（ｉｖ）少なくとも１つのｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）、（ｖ）ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする少なくとも１つの核酸（例えば、ベクター）、（ｖｉ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸（例えば、第１のベクター）及びＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸（例えば、第２のベクター）、（ｖｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む単一のベクター、（ｖｉｉ）ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするベクターまたはベクターのセットを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ＮＲ４Ａ３を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰ（例えば、ｓｇＲＮＡＧＣＵＣＧＡＧＵＡＧＣＣＣＵＣＣＡＣＧＡ（配列番号３０）を含むＣａｓ９ ＲＮＰ）を含む。ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とする他のＣａｓ９ ＲＮＰの非限定的な例、ならびにＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするものは、本開示において他の箇所に提供される（例えば、表Ａ、Ｃ及びＤを参照されたい）。いくつかの態様において、キットは、それらの使用のための指示書をさらに含む。

【0338】

本開示は、本明細書に開示される修飾された細胞（例えば、免疫細胞）を含むがんの処置のためのキットであって、細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の低減された発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）示す、キットを提供する。本開示は、本明細書に開示される修飾された細胞（例えば、免疫細胞）を含むがんの処置のためのキットであって、細胞は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の低減された発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）示し、細胞は、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲを発現する、キットを提供する。

【0339】

いくつかの態様において、キットは、本明細書に開示される少なくとも１つのｇＲＮＡ（例えば、配列番号３０及び５２～９９のいずれか１つに示される配列を含む、それからなる、またはそれから本質的になるｇＲＮＡを含む）、本明細書に開示されるｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのベクター、本明細書に開示されるｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのベクターを含む細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、キットは、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをさらに含む。

【0340】

本開示は、少なくとも１つの容器手段であって、その中に上記ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９；ベクター、細胞、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つが配置された、少なくとも１つの容器手段を、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を（単独でまたは低減したレベルのＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質及び／またはＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質と組み合わせて）低減するための指示書と一緒に含むキットまたはパッケージをさらに提供する。

【0341】

いくつかの態様において、キットは、少なくとも１つの上流ｇＲＮＡ及び下流ｇＲＮＡを含む。したがって、一部において、キットは、（ｉ）配列番号３１～３８のいずれか１つのスペーサー配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）配列番号４１～４２のいずれか１つのスペーサー配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

【0342】

特定の態様において、キットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓキメラフレーム、例えば、配列番号３９の配列に作動可能に連結された配列番号３１～３８のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含む。

【0343】

いくつかの態様において、特定の細菌種Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）のためのｇＲＮＡを含む各キットは、そのようなＣａｓ９をさらに含む。

【0344】

いくつかの態様において、キットは、がん抗原を標的とするＣＡＲ及び／またはＴＣＲを発現する１つ以上の細胞、培養物、または細胞の集団を含む。

【実施例】

【0345】

実施例１－ガイドＲＮＡスクリーニング及び修飾されたＴ細胞の生成
ヒトＴ細胞疲弊に打ち勝つ際の各ＮＲ４Ａメンバーの役割を調べるために、ＲＯＲ１－Ｒ１２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞及びＮＹ－ＥＳＯ－１Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞モデルを使用した。ＲＯＲ１ ＣＡＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで形質導入されたヒトＴ細胞における各ＮＲ４Ａファミリーメンバーのタンパク質発現を特異的に低減したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同定した。

【0346】

ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが表Ａに示されている。実施例２～７に記載の実験において、ＮＲ４Ａ１ ｓｇＲＮＡ５及び６を組み合わせて使用し、ＮＲ４Ａ２ ｓｇＲＮＡ１、２、及び３を組み合わせて使用した。

【表5】

【0347】

ＮＲ４Ａ３に特異的な単一のｇＲＮＡを設計し、スクリーニングして、３つの独立した実験（ｖ０、ｖ１、及びｖ２）における最大編集効率及び最大タンパク質低減を有するｇＲＮＡを同定した。すべてのｇＲＮＡスクリーニングについて、単離されたドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、活性化のために１％（ｖ／ｖ）ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と１：１の比で２４時間混合した。活性化したＴ細胞を抗ＲＯＲ１ ＣＡＲをコードするバイシストロン性（ｖ０）またはトリシストロン性レンチウイルスベクター（ｖ２）で２４時間後に形質導入し、または形質導入しないままとした（ｖ１）。次いでＴ細胞を、修飾されたガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ；ｖ０－表Ｂ、ｖ１－表Ｃ及びｖ２－表Ｄ）及びＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ単位を利用してヒトＮＲ４Ａ３を標的とするＣａｓ９ ＲＮＰでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされたＴ細胞を増殖のためにＧ－Ｒｅｘ培養プレートに移してから、ＣｒｙｏＳｔｏｒ培地中で７日目に凍結保存した。１つのドナーを実験ｖ０及びｖ１において使用した一方で、２つの独立したドナーを実験ｖ２において使用した。７日目にフローサイトメトリーによってタンパク質低減の効率を評価するために、３×１０５ ＮＲ４Ａ３編集または対照（ＲＮＰでエレクトロポレーションした）Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において２００μＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｖ０及びｖ１）またはＰＭＡ＋イオノマイシン（ｖ２）で２時間３７Ｃで刺激して最大ＮＲ４Ａ３発現を誘導した。刺激後、細胞を上述したように表面マーカーで染色した。次いで細胞を固定し、製造業者の指示書に従ってＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理し、細胞内染色をカスタム蛍光色素コンジュゲートＮＲ４Ａ３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。

【0348】

ｖ０におけるｇＲＮＡのいずれも、対照非編集細胞と比較してＮＲ４Ａ３タンパク質発現を低減しなかった（表Ｂ）。ＮＧＳによる確認的ゲノム編集効率は実施しなかった。ｖ１において、７つすべてのｇＲＮＡが非編集対照と比較してＮＲ４Ａ３タンパク質発現を低減し、ＮＧＳ編集効率を実施した。２つのガイド（ｇ４及びｇ８）は、最も高いゲノム編集を有していた（総パーセントＴ細胞分散によって測定される場合）。高い編集効率にもかかわらず、ゲノムバリアントのインデル特性化は、ｇ８が高い頻度の望ましくないインフレーム欠失をもたらしたことを明らかにした（表Ｃ）。ｖ２において、上位１４個のｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ３タンパク質発現が非編集対照と比較して低減され、及び／または両方のドナーについてベンチマークｇ４に対して同様／より良好であったＫＯ条件に基づいて選択した（表Ｄ）。選択された条件をＮＧＳ分析によってゲノム編集効率を確認するためにさらに評価した。

【表6】

【表7】

【表8-1】

【表8-2】

【表8-3】

【0349】

以下の実施例においてより詳細に記載されているように、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ３ ｇＲＮＡ ｇ４配列番号３０を使用して編集した）は、最も高い機能的利益を示し、対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して連続的ＲＯＲ１抗原曝露後に有意に長い細胞傷害性、サイトカイン生成、Ｔ細胞持続性、及び改善された表現型を実証した。ＮＲ４Ａ３編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞はまた、最も高い機能的利益を示し、対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較して連続的ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原曝露後に長い細胞傷害性及びサイトカイン生成を実証した。

【0350】

実施例２－低減したＮＲ４Ａ３発現
ＮＲ４Ａタンパク質発現の低減を、フローサイトメトリーによってＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＮＲ４Ａ３ ｓｇＲＮＡ ｇ４、配列番号３０を使用して編集した）において検証した。ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓでの刺激を使用して最大ＮＲ４Ａ発現を誘導した。フローサイトメトリー分析のため、ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、生死色素で１０分間室温（ＲＴ）で染色し、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で５分間室温でブロッキングし、ＣＣＲ７で１５分間３７Ｃで染色し、次いで表面マーカー抗体で１０分間室温で染色した。すべての染色をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ細胞染色緩衝液中で実施した。

【0351】

３×１０^５個のＮＲ４Ａ編集または対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において２００ｕＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で３：１のビーズ対細胞比で２時間３７Ｃで刺激して最大ＮＲ４Ａ３発現を誘導した。刺激後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、細胞を上述したように表面マーカーで染色した。次いで細胞を固定し、製造業者の指示書に従ってＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した。カスタム蛍光色素コンジュゲートＮＲ４Ａ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を染色のために使用した。

【0352】

ＮＲ４Ａ３タンパク質発現は、非編集対照と比較してＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ＣＡＲ Ｔ細胞において有意に低減した（図１Ａ及び１Ｂ）。同様に、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを使用して高い効率のＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質低減が達成された（データは示されていない）。ＲＯＲ１ ＣＡＲ（ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋として特定される）の発現は、試験された５つのドナーにわたって同様であり、ＮＲ４Ａ編集によって影響を受けなかった（図２）。

【0353】

実施例３－逐次刺激における持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成
ＣＡＲ Ｔ細胞が抗原に逐次または慢性的に曝露される２つのｉｎ ｖｉｔｒｏ疲弊アッセイにおいてＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の機能を評価した。

【0354】

逐次刺激アッセイにおいて、ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞をＨ１９７５ ＮＳＣＬＣ ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞株を用いて５回の連続刺激に供した。特に、凍結保存されたＮＲ４Ａ編集または対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、フラット２４ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において三連でＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＨ１９７５－ＮＬＲ腫瘍細胞と１：１のＥ：Ｔ比で直ちに培養した。３日間の共培養後に、ウェルを再懸濁し、培養物の２５％をウェル当たり同じ初期数の新たな腫瘍細胞を有する新たなプレートに移した。これを合計で５回の刺激について繰り返した。細胞傷害性をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてアッセイ中に連続的に測定し、各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に上清を収集してサイトカインレベルを測定した。三連の共培養ウェルからの残りの細胞を、上述したように表現型フロー分析のために組み合わせた。ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈ１９７５腫瘍細胞に対してより高い細胞傷害性を保持し、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して３～５ラウンドの刺激後に標的細胞を溶解する持続的能力を実証した（図３）。

【0355】

持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ ＲＯＲ１を発現する腫瘍細胞で刺激した場合、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してより高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αを生成した（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。サイトカインレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ－Ｐｌｅｘ炎症誘発パネル１ヒトキットまたはカスタムヒトＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－ａサイトカインキットを使用して製造業者の指示書に従って測定した。

【0356】

サイトカイン生成の差は、後のラウンドの刺激後に最も顕著であり、ＮＲ４Ａ３ノックアウトが、長期抗原刺激後に持続した機能的活性及び／または改善されたＣＡＲ Ｔ細胞生存に寄与することを示唆している。実際に、逐次刺激アッセイからのＮＲ４Ａ３編集Ｔ細胞は、いくつかのラウンドの刺激後にＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集Ｔ細胞よりも高い頻度のＲＯＲ１ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を維持した（図５Ａ）。結果的に、これは、刺激ラウンド２～３で総ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞数の増加した持続性に相関する（図５Ｂ）。ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、Ｈ１９７５腫瘍細胞に対する第２の逐次刺激後にＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に少ないＬＡＧ３及びＣＤ３９の発現を有していた（図６）。

【0357】

Ｔ細胞疲弊のｉｎ ｖｉｔｒｏ逐次刺激モデルは、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が、５つの独立したドナーにおいてＲＯＲ１を発現するＨ１９７５腫瘍細胞に対する向上した及び持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成を示すことを明らかにした。後のラウンドの刺激での増加した機能的活性は、少なくとも部分的に、アッセイ全体を通してＮＲ４Ａ３編集Ｔ細胞の増加した持続性によるものである可能性が高い。

【0358】

これらの結果は、第２のＲＯＲ１^＋腫瘍細胞株Ａ５４９を使用して確認され、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が、後の刺激で持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成を実証した（データは示されていない）。Ａ５４９－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）及びＨ１９７５－ＮＬＲ腫瘍細胞株を、アッセイを設定する前にＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で２～３継代培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン処理した。

【0359】

実施例４－慢性刺激における持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成
細胞固有の機能的容量に対するＮＲ４Ａ３ノックアウトの影響をより直接的に測定するために、７日間の慢性刺激アッセイを、ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が疲弊に打ち勝つ能力を調べるために開発した。このアッセイでは、各再設定時点及び機能的アッセイの前にすべての群にわたってＥ：Ｔ比を再正規化して、機能的リードアウトに対するＣＡＲ Ｔ細胞数の差の影響を除去した。

【0360】

凍結保存されたＮＲ４Ａ編集または対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、ＴＣＭにおいて３日間放置し、次いでＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＨ１９７５－ＮＬＲ腫瘍細胞と１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で培養した。生存ＣＡＲ Ｔ細胞を回収し、回収された活性カスパーゼ３^－ＣＤ３^＋ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２＋細胞の数についてフローサイトメトリーによって定量し、合計で７日間、２～３日毎に新たな腫瘍細胞を１：１のＥ：Ｔ比で再播種した。ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、生死色素で１０分間室温（ＲＴ）で染色し、ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で５分間室温でブロッキングし、ＣＣＲ７で１５分間３７Ｃで染色し、次いで表面マーカー抗体で１０分間室温で染色した。ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞をさらに固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキットで製造業者の指示書に従って透過処理し、活性カスパーゼ３で染色した。すべての染色をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ細胞染色緩衝液中で実施した。

【0361】

機能的細胞傷害性及びサイトカイン生成を、慢性刺激を開始した０日目及び慢性刺激の終了時の７日目に評価した。細胞傷害性を、Ａ５４９－ＮＬＲ腫瘍細胞の場合１：１のＥ：Ｔ比及びＨ１９７５－ＮＬＲ腫瘍細胞の場合１：５のＥ：Ｔでフラット９６ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）においてＩｎｃｕｃｙｔｅを使用して７２時間測定した。サイトカインレベルを測定するためにＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイプレートを設定してから２４時間後に上清を収集した。

【0362】

逐次刺激アッセイと同様に、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＨ１９７５腫瘍細胞からの７日間の慢性ＲＯＲ１抗原曝露の後に、より高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αを生成した（図７）。同様の知見は、Ａ５４９腫瘍細胞を使用した７日間の慢性刺激アッセイにおいて観察され、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または対照非編集ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して増加したサイトカイン生成を維持した（データは示されていない）。ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＣＡＲを発現する細胞の割合の小さな増加が、Ｈ１９７５慢性刺激中に他のＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞間で観察され（図８Ａ）、総ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞数は、７日目にほとんどのドナーにおいてわずかに改善された（図８Ｂ）。さらに、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、７日間の慢性ＲＯＲ１抗原曝露後に対照非編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも少ない阻害性マーカー発現を有する傾向にあった（統計的に非有意）（図９）。

【0363】

実施例５－抗腫瘍有効性
最後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイからのＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の表現型及び改善された機能が再現されるかどうかを決定するためにｉｎ ｖｉｖｏ Ｈ１９７５異種移植モデルを使用した。

【0364】

親Ｈ１９７５腫瘍細胞を、６～８週齢のＮＳＧ ＨＬＡ二重ノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）への埋込前にＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）中で３継代培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ酵素でトリプシン処理し、ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と１：１比で混合した。５百万個のＨ１９７５腫瘍細胞を各マウスの側腹部に移植した。腫瘍が８０～１２０ｍｍ^３のサイズに到達したときに、Ｔ細胞を無作為化された腫瘍保有マウスに養子移入した。

【0365】

腫瘍体積及び体重を、腫瘍の＞２０００ｍｍ^３への到達、＞２０％の体重減少、潰瘍、呼吸困難、重度に制限された可動性もしくは直立不能、またはＴ細胞移入から６０日後までのエンドポイントまで週２回測定した。

【0366】

養子移入のためのＴ細胞を調製するために、凍結保存されたＮＲ４Ａ編集または対照ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を解凍し、腫瘍保有マウスに養子移入する前にＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。マウスに１００ｕＬの０．６百万個（低用量）または２百万個（高用量）の活性カスパーゼ３^－ＣＤ３^＋ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋Ｔ細胞を尾静脈を介して静脈内注射した。処置群当たりｎ＝５匹のマウス。

【0367】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの対応のないｔ検定、対応のあるｔ検定、及びログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を統計的分析のために使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【0368】

ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、２つの異なる用量レベルのＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞で強力で改善された抗腫瘍有効性を示した（図１０Ａ）。その上、ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞が養子移入されたマウスは、他のＴ細胞群と比較してＴ細胞注射から６０日後に増加した生存を有していた（図１０Ｂ）。

【0369】

ＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、逐次及び慢性刺激）及びｉｎ ｖｉｖｏ Ｈ１９７５異種移植モデルによって実証されるように、ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の頑強な細胞傷害性及びサイトカイン生成、より良好な維持及び持続性を示し、低減した疲弊傾向にある表現型を示した。そのため、ＲＯＲ１－Ｒ１２ ＣＡＲ Ｔ細胞との関連でＮＲ４Ａ３を編集することは、ＲＯＲ１を発現する固形腫瘍に対する細胞免疫療法を改善し得る。

【0370】

実施例６－逐次刺激における持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成
低減したＮＲ４ＡレベルがＣＡＲ Ｔ細胞機能に対して（特に慢性抗原刺激との関連で）有する効果をさらに評価するために、ＮＲ４Ａファミリーの複数のメンバーの低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例１に提供される方法及びｓｇＲＮＡを使用して生成した。具体的には、以下のＮＲ４Ａファミリーメンバーの低減したレベルを有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成した：（１）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２の両方（ＮＲ４Ａ１＋２二重ノックアウト）、（２）ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３の両方（ＮＲ４Ａ１＋３二重ノックアウト）、（３）ＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３の両方（ＮＲ４Ａ２＋３二重ノックアウト）、及び（４）ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３（ＮＲ４Ａ三重ノックアウト）。非ＮＲ４Ａ編集抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞ならびに低減したレベルのＮＲ４Ａ１単独、ＮＲ４Ａ２単独、及びＮＲ４Ａ３単独を有する抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（実施例１及び２を参照されたい）も比較目的のために使用した。異なる抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を実施例３に記載されているように逐次刺激アッセイにおいて抗原（Ａ５４９－ＮＬＲまたはＨ１９７５－ＮＬＲ細胞のいずれか）で刺激した。細胞傷害性をアッセイ中にＩｎｃｕｃｙｔｅにおいて連続的に測定し、上清をサイトカインレベルを測定するために各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に収集した。

【0371】

図１１Ａ及び１１Ｂに示されているように、繰り返しの抗原刺激の後であっても、異なる抗ＲＯＲ１ ＮＲ４Ａ二重及び三重ノックアウトＣＡＲ Ｔ細胞は、モック抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してＲＯＲ１^＋腫瘍細胞を有効に溶解するそれらの能力を維持することができた。持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４Ａ二重及び三重ＫＯ抗ＲＯＲ１ ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、繰り返しの抗原刺激後に異なるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－α）を生成するそれらの能力を維持した。特に、ＮＲ４Ａ３ ＫＯを含有するＫＯ組み合わせ（ＮＲ４Ａ１／ＮＲ４Ａ３ ＤＫＯ、ＮＲ４Ａ２／ＮＲ４Ａ３ ＤＫＯ及びＴＫＯ）は、最も大きな影響を示し、修飾された細胞の向上した活性におけるＮＲ４Ａ３ ＫＯの重要性を確認する。

【0372】

これらの結果はさらに、免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）においてＮＲ４Ａレベルを低減する治療的利益を、特に慢性抗原刺激との関連で実証する。

【0373】

実施例７－逐次刺激における操作されたＴＣＲ Ｔ細胞の持続した細胞傷害性及びサイトカイン生成
単一のＮＲ４Ａ編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｔ細胞がＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３のいずれかで編集されている）の機能を、ＴＣＲ Ｔ細胞が逐次抗原に曝露されるｉｎ ｖｉｔｒｏ疲弊アッセイにおいて評価した。アッセイを設定する前に、Ａ３７５－ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）腫瘍細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で２～３継代培養した。細胞をアキュターゼ酵素（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理した。

【0374】

逐次刺激アッセイにおいて、対照及びＮＲ４Ａ－編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞をＡ３７５黒色腫ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞株を用いて４回の連続刺激に供した。特に、凍結保存されたＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞を解凍し、フラット９６ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において三連でＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でｃＰａｒｐ^－ＣＤ３^＋ＴＣＲｖβ１３．１^＋ＴＣＲ Ｔ細胞とＡ３７５－ＮＬＲ腫瘍細胞との１：１のＥ：Ｔ比で直ちに培養した。３日または４日間の共培養後に、ウェルを再懸濁し、培養物の２５％をウェル当たり同じ初期数の新たな腫瘍細胞を有する新たなプレートに移した。これを合計で４回の刺激について繰り返した。細胞傷害性をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてアッセイ中に連続的に測定し、各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に上清を収集してサイトカインレベルを測定した。ＲＯＲ１－ＣＡＲ－Ｔ細胞の状況と同様に、ＮＲ４Ａ３ ＫＯ ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞は、Ａ３７５腫瘍細胞に対して最も高い細胞傷害性を保持し、３つの異なるドナーにおける対照と比較して２または３ラウンドの刺激後に標的細胞を溶解するより持続した能力を実証した（図１４）。

【0375】

持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４Ａ３ ＫＯ ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞はまた、測定したほとんどの時点でほとんどのドナーにおいてＡ３７５黒色腫ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞で刺激された場合、非編集対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ Ｔ細胞と比較してより高いＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αを生成した（図１５及び表３～５）。Ｔ細胞を第２のＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞株Ｈ１７０３を使用して順次刺激した場合、同様の結果が観察された（データは示されていない）。サイトカインレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ－Ｐｌｅｘ炎症誘発パネル１ヒトキットまたはカスタムヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αサイトカインキットを使用して製造業者の指示書に従って測定した。サイトカイン生成における差は、後のラウンドの刺激後に最も顕著であった。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【表10-4】

【表10-5】

【表10-6】

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【表11-4】

【表11-5】

【表11-6】

【表11-7】

【0376】

概要及び要約書のセクションではなく、詳細な説明のセクションは、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されることを理解されたい。概要及び要約書のセクションは、発明者（複数可）によって企図される本開示の１つ以上の、しかしすべてではない例示的な態様を示し得、よって、本開示及び添付の特許請求の範囲をどのようにも限定することは意図されていない。

【0377】

本開示は、特定の機能及びその関係性の実施を示す機能構築ブロックを用いて上記に記載されている。これらの機能構築ブロックの境界は、説明の便宜のために本明細書において任意に定義されている。特定の機能及びそれらの関係性が適切に実施される限り、代替的な境界が定義され得る。

【0378】

特定の態様の前述の説明は、本開示の一般的性質を十分に明らかにするので、他者は、当該技術分野の技術の範囲内の知識を適用することによって、様々な用途のためにそのような特定の態様を、過度な実験をせずに、本開示の一般的概念から逸脱することなく、容易に改変及び／または適応し得る。そのため、そのような適応及び修飾は、本明細書で提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示される態様の均等物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書における表現または専門用語は、本明細書の専門用語または表現が、教示及びガイダンスの観点から当業者によって解釈されるように、限定の目的ではなく説明の目的のためのものであることが理解されるべきである。

【0379】

本開示の幅及び範囲は、上述した例示的な態様のいずれかによって限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。

【0380】

本出願全体を通して引用されるすべての引用参考文献（参考文献、米国または外国特許または特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、任意の目的のためにそれらの全体が本明細書に記載されているかのように、それらで引用される参考文献も同様に、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。何らかの矛盾が生じた場合、本明細書に文章で開示される内容が優先する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A-1】

【図5A-2】

【図5B】

【図6】

【図7A-1】

【図7A-2】

【図7B-1】

【図7B-2】

【図7C-1】

【図7C-2】

【図8A-1】

【図8A-2】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【配列表】

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【国際調査報告】