▶ エービーエス グローバル インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】家畜におけるインビトロ育種システム及び方法
(51)【国際特許分類】
A01K 67/02 20060101AFI20240517BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20240517BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20240517BHJP
【ＦＩ】
A01K67/02 ZNA
C12N5/07
C12N5/0735
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023573142
(86)(22)【出願日】2022-05-26
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 US2022031210
(87)【国際公開番号】W WO2022251549
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】63/194,667
(32)【優先日】2021-05-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500368329
【氏名又は名称】エービーエス グローバル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ビートン， ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】クリッシャー， レベッカ リン
(72)【発明者】
【氏名】リー， チャン ヒュン
(72)【発明者】
【氏名】ラージプート， サンディープ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BA21
4B065BC01
4B065CA41
(57)【要約】
本教示は、インビトロで家畜を育種する方法を提供する。複数の胚盤胞から胚性幹細胞を作製し、胚性幹細胞を遺伝子型決定して、交配に最適な胚を選択して子孫を作製し、胚性幹細胞を始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）に誘導するための工程が提供される。雄ＰＧＣＬＣは、更に精原幹細胞様細胞に、次いで、精子細胞様細胞に誘導される。雌ＰＧＣＬＣは、卵母細胞に誘導され、次いで成熟される。次いで、得られた配偶子を、互いに、又は望ましい遺伝子を有する動物由来の異性配偶子と混合して、次世代の胚を作製することができ、次いでこのプロセスによって再び実行することができる。このインビトロ育種方法を使用して、家畜における遺伝的進歩の速度を増加させることができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
家畜を育種する方法であって、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭の家畜親を選択することと、
Ｂ）前記少なくとも１頭の家畜親から複数の配偶子を得ることと、
Ｃ）前記複数の配偶子を使用して少なくとも１つの胚を作製することと、
Ｄ）前記少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の株を作製することと、
Ｅ）前記少なくとも１つの胚を遺伝子型決定することと、
Ｆ）育種のための少なくとも１つの胚性幹細胞株を選択することと、
Ｇ）少なくとも１つの選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることと、
Ｈ）前記配偶子又は配偶子様細胞を異性配偶子又は配偶子様細胞と組み合わせて、少なくとも１つの次世代胚を産生することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記少なくとも１つの胚を遺伝子型決定することが、前記少なくとも１つの胚から作製された前記胚性幹細胞を遺伝子型決定すること、又は前記少なくとも１つの胚の生検を遺伝子型決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
配偶子又は配偶子様細胞を前記組み合わせることが、インビトロ受精によるもの、又は細胞質内精子注射によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
異性親の前記配偶子が、高い遺伝的メリットを有する成体動物由来であるか、又は前記配偶子様細胞が、工程Ｄ若しくはＧで産生された異性遺伝子型胚性幹細胞株由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
Ｉ）前記少なくとも１つの次世代胚から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
工程Ｃ又は工程Ｉからの前記胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記親が、ウシ親又はブタ親である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
胚性幹細胞の株を前記作製することが、胚、それに由来する胚盤胞、又はそれらの一部に、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＷＮＴシグナル伝達阻害剤が、存在する場合、ｉｗｒ－１、ｉｗｒ－１－ｅｎｄｏ、ｉｗｐ－２、Ｂｏｘ５、ｉＣＲＴ３、スクレロスチン、ｄｋｋ２、ｄｋｋ１、ＬＦ３、ＣＣＴ０３６４７７、ＦＨ５３５、カルダモニン、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ニクロサミド、ＸＡＶ－９３９、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４、ＣＰ２１Ｒ７、ＮＣＢ－０８４６、ＰＮＵ－７４６５４、サリノマイシン、ＫＹ０２１ １１、ＷＩＫＩ４、ＰＲＩ－７２４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、２，４－ジアミノ－キナゾリン、Ａｎｔ １．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４０、アピキュラレン、バフィロマイシン、ＥＴＣ－１５９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＩＷＲ、ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ１ １５－５８４、ピルビニウム、ケルセチン、シゾカオールＤ、ＢＣ２０５９、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記ＧＳＫ３阻害剤が、存在する場合、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、Ａ １０７０７２２、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣＳ ２００２、３Ｆ８、ＴＤＺＤ ８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＢＩＯ－アセトキシム、インジルビン－３’－オキシム、ＴＷＳ １１９、ＴＣＳ ２１３１１、ＳＢ ２１６７６３、ＢＩＯ、炭酸リチウム、ケンパウロン、アルスターパウロン、及びＣＨＩＲ ９８０１４からなる群から選択され、
前記タンキラーゼ阻害剤が、存在する場合、ＸＡＶ９３９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＴＣ－Ｅ ５００１、及びＷＩＫＩ４からなる群から選択され、
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、存在する場合、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であり、
前記アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、存在する場合、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞が、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、又はＳＵＮ １１６０２で更に処理される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞に、ビタミンＣ、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記選択された幹細胞株の各々からの細胞を前駆細胞に誘導することであって、前記細胞に、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）シグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記前駆細胞が、中胚葉様細胞であり、前記誘導することが、前記細胞に、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、及び血清代替品を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記前駆細胞が、形成細胞様細胞であり、前記誘導することが、前記細胞に、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記前駆細胞を始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）に誘導することであって、前記細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、誘導することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記前駆細胞をＰＧＣＬＣに前記誘導することが、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及びＢＭＰ４を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞に、血清代替品を投与することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記胚性幹細胞を精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）に誘導することであって、前記細胞に、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の誘導剤、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）シグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
胚性幹細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記胚性幹細胞を精子細胞に誘導することであって、前記細胞に、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨの誘導剤、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、又はそれらの組み合わせを投与することによる、誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記胚性幹細胞を卵母細胞に誘導することであって、前記胚性幹細胞を再構成された卵巣内に配置することと、
前記再構成された卵巣内の前記細胞に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、
前記再構成された卵巣内の前記細胞に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、
前記再構成された卵巣内の前記細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、による、誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記幹細胞を配偶子又は配偶子様細胞に前記誘導することが、前記幹細胞を卵母細胞に誘導することであって、前記細胞に、ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、ＳＵＢ１、又はそれらの組み合わせを発現させることによる、誘導することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
ウシを育種する方法であって、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のウシ親を選択することと、
Ｂ）前記少なくとも１頭のウシ親から複数の配偶子を得ることと、
Ｃ）前記複数の配偶子から少なくとも１つの胚を作製することと、
Ｄ）前記少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の１つ以上の株を作製することであって、前記作製することが、
ｉ）胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部に、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達の誘導剤を投与することを含む、作製することと、
Ｅ）前記胚性幹細胞の１つ以上の株を遺伝子型決定することと、
Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、
Ｇ）各選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることであって、前記誘導することが、
ｉ）アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記幹細胞を前駆細胞に誘導することと、
ｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記前駆細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、
ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有する前記ＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、
ａ）ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、
ｂ）インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、又はＢＰＥを投与することによる、前記ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、
ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有する前記ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、
ａ）前記細胞を再構成された卵巣内に配置することと、
ｂ）前記再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、
ｃ）前記再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、
ｄ）前記再構成された卵巣に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含む、誘導することと、を含む、分化させることと、
Ｈ）前記配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、
Ｉ）前記複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、
Ｊ）前記次世代胚性幹細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含む、方法。
【請求項25】
工程Ｄ）が、ＦＧＦ２及びＩＷＲ１を含む培地中で、前記胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部をインキュベートすることを含み、工程Ｇ）が、
ｉ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、前記幹細胞を形成細胞に誘導すること、又は血清代替品、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、前記幹細胞を中胚葉様細胞に誘導することと、
ｉｉ）ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、前記形成細胞又は中胚葉様細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、
ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、
ａ）ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、前記ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、
ｂ）血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、前記ＳＳＣＬを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、
ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、
ａ）前記ＸＸ ＰＧＣＬＳと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、
ｂ）前記再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、
ｃ）前記２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を誘導することと、
ｄ）前記ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、を含む、誘導することと、を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
工程Ｄ又は工程Ｉで作製された前記胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
ブタを育種する方法であって、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のブタ親を選択することと、
Ｂ）前記少なくとも１頭のブタ親から複数の配偶子を得ることと、
Ｃ）前記複数の配偶子から少なくとも１つの胚を作製することと、
Ｄ）前記少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の１つ以上の株を作製することであって、前記作製することが、
ｉ）胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部を複数の胚から単離することと、
ｉｉ）前記胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部に、ＧＳＫ３阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、ビタミンＣ、アクチビンＡシグナル伝達誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達誘導剤、ＦＧＦシグナル伝達誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含む、作製することと、
Ｅ）前記胚性幹細胞の１つ以上の株の各々を遺伝子型決定することと、
Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、
Ｇ）各選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子様細胞に分化させることであって、前記誘導することが、
ｉ）前記細胞に、アクチビンａシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記幹細胞を前駆細胞に誘導することと、
ｉｉ）前記細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記前駆細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、
ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有する前記ＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、
ａ）前記細胞に、ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前記ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、
ｂ）前記細胞に、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、及びＢＰＥを投与することによる、前記ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、
ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有する前記ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、
ａ）前記細胞を再構成された卵巣内に配置することと、
ｂ）前記再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、
ｃ）前記再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、
ｄ）前記細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含む、誘導することと、を含む、分化させることと、
Ｈ）前記配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、
Ｉ）前記複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、
Ｊ）次世代胚性細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含む、方法。
【請求項28】
工程Ｄ）が、前記胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部に、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＰＤ０３２５９０１を投与することを含み、工程Ｇ）が、
ｉ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、前記幹細胞を形成細胞に誘導すること、又は血清代替品、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中でインキュベートすることによる、前記幹細胞を中胚葉様細胞に誘導することと、
ｉｉ）前記細胞に、ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、前記形成細胞又は中胚葉様細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、
ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞に誘導することであって、
ａ）前記細胞に、ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、前記ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、
ｂ）前記細胞に、血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、前記ＳＳＣＬを精子細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、
ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、
ａ）前記ＸＸ ＰＧＣＬＣと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、
ｂ）前記再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、
ｃ）前記２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を誘導することと、
ｄ）前記ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、
ｅ）前記卵母細胞をＭＩＩ卵母細胞に成熟させることと、を含む、誘導することと、を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
工程Ｄ又は工程Ｉで作製された前記胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
インビトロでのウシ始原生殖細胞様細胞を生成する方法であって、ウシ胚性幹細胞に、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、アクチビンａシグナル伝達の誘導剤、及びＷＮＴシグナル伝達の誘導剤を投与して、ウシ形成細胞を誘導すること、又はウシ胚性幹細胞に、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、及び血清代替品を投与して、ウシ中胚葉様細胞を誘導することと、
前記ウシ形成細胞又は前記ウシ中胚葉様細胞に、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、及びＢＭＰシグナル伝達の誘導剤を投与して、始原生殖細胞様細胞を誘導することと、を含む、方法。
【請求項31】
ウシ形成細胞を誘導することを含み、前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＧＳＫ３を阻害することによってＷＮＴを誘導する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ウシ形成細胞を誘導することを含み、前記アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであり、前記ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤が、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、又はＦＧＦ－Ｐであり、前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５である、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
ウシ中胚葉様細胞を誘導することを含み、前記アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであり、前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５である、請求項３０に記載の方法。
【請求項34】
前記ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤が、ＬＩＦであり、前記ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤が、ＳＣＦであり、前記ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤が、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン及びｋｍ１１０７３、４’－ヒドロキシカルコン、又はＳＶＡＫ－１２である、請求項３０に記載の方法。
【請求項35】
ウシ胚性幹細胞からウシ始原生殖細胞様細胞（ｂＰＧＣＬＣ）を誘導する方法であって、Ａ）前記細胞に、
ｉ）ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与して、ウシ形成細胞を形成するか、又は
ｉｉ）アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、及び血清代替品を投与して、ウシ中胚葉様細胞を形成することと、
Ｂ）前記細胞に、ｒＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰ４、及び血清代替品を投与して、ｂＰＧＣＬＣを産生することと、を含む、方法。
【請求項36】
ブタ胚性幹細胞を誘導する方法であって、胚、胚盤胞、又はそれらの一部を提供することと、
前記胚、胚盤胞、又はそれらの一部に、ＦＧＦシグナル伝達誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達誘導剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びアクチビンＡシグナル伝達誘導剤を投与することと、を含む、方法。
【請求項37】
前記ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤が、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、又はＦＧＦ－Ｐであり、前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であり、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であり、前記アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンである、請求項３６に記載の方法。
【請求項37】
前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＧＳＫ３を阻害することによってＷＮＴを誘導する、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤が、ｂＦＧＦであり、前記ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤が、ＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１であり、前記アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、アクチビンＡである、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
実験室で成長した肉を培養する方法であって、請求項１の工程Ｄからの胚性幹細胞を、筋肉細胞、脂肪細胞、臓器細胞、又はそれらの組み合わせに誘導することと、
前記筋肉細胞、脂肪細胞、臓器細胞、又はそれらの組み合わせを三次元構造上で培養することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２８日に出願された米国仮出願第６３／１９４，６６７号の利益及びそれに対する優先権を主張する。６３／１９４，６６７は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２８日に出願された米国仮出願第６３／１９４，６６７号の利益及びそれに対する優先権を主張する。６３／１９４，６６７は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の組み込み
配列表は、３３，９５７バイトのサイズであるＲＢ－２９－２０２１－ＷＯ１－ＳＥＱＬＳＴ．ｘｍｌという名称のファイルを含め、２０２２年５月２３日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表は、３３，９５７バイトのサイズであるＲＢ－２９－２０２１－ＷＯ１－ＳＥＱＬＳＴ．ｘｍｌという名称のファイルを含め、２０２２年５月２３日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
分野
本発明の分野は、家畜の胚性幹細胞の誘導及び分化である。
本発明の分野は、家畜の胚性幹細胞の誘導及び分化である。
【背景技術】
【0004】
背景
世界人口が増加するにつれて、食料生産量も増加させる必要がある。しかしながら、最近の推定では、世界の温室効果ガス排出量の約１５％を世界の家畜生産が占めている（Ｃａｐｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｄｙ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，９８，ｓｋｚ２９１）。環境への影響を最小限に抑えながら食料生産量を増やす方法の１つは、遺伝的進歩、すなわち動物の性能の遺伝的予測に基づいて動物生殖質の効率を高めることによるものである。例えば、乳製品生産量は、２００７年～２０１７年で、ウシの数がほぼ２５％と減少しているのにもかかわらず、ほぼ２５％と同じ量増加した。すなわち、２００７年に存在していた乳牛の７５％が、２０１７年に２００７年よりも２５％多い牛乳を生産した（Ｃａｐｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｄｙ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，９８，ｓｋｚ２９１）。この効率の向上は、牛乳生産のはるかに大きな増加にもかかわらず、温室効果ガスの増加はわずか１％であった。（酪農乳業が全体として２０５０年までに二酸化炭素排出量ネットゼロを約束しているため、温室効果ガス排出量は、まもなく減少し始めるだろう。）遺伝子改善は、豚肉生産量の増加も促進しており、豚肉生産量は、１９５９年の１２１億ポンドの豚肉から２００９年には２２８億ポンドの豚肉へと増加した。同じ期間に、豚肉生産のための土地利用は７８％減少し、水使用量は４１％減少し、豚肉生産のカーボンフットプリントは３５％減少した。
いくつかの概要は、乳製品生殖質における遺伝的進歩の増加は、インビトロ育種によって促進され得ると仮定している。最も顕著には、Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１９，１００，８８５－８９５を参照されたい。従来の育種では、胚がインビトロで作製されてから６ヶ月間（ブタ）又は９ヶ月間（ウシ）にわたって胚を妊娠させ、その後、動物が性的成熟に達するまで更に７ヶ月間（ブタ）又は１年間（ウシ）待つ必要がある。本発明の方法は、より短い期間で増加した遺伝的進歩を可能にする生殖生物学的技術を使用して、生成時間を短縮することを探究する。
世界人口が増加するにつれて、食料生産量も増加させる必要がある。しかしながら、最近の推定では、世界の温室効果ガス排出量の約１５％を世界の家畜生産が占めている（Ｃａｐｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｄｙ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，９８，ｓｋｚ２９１）。環境への影響を最小限に抑えながら食料生産量を増やす方法の１つは、遺伝的進歩、すなわち動物の性能の遺伝的予測に基づいて動物生殖質の効率を高めることによるものである。例えば、乳製品生産量は、２００７年～２０１７年で、ウシの数がほぼ２５％と減少しているのにもかかわらず、ほぼ２５％と同じ量増加した。すなわち、２００７年に存在していた乳牛の７５％が、２０１７年に２００７年よりも２５％多い牛乳を生産した（Ｃａｐｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｄｙ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，９８，ｓｋｚ２９１）。この効率の向上は、牛乳生産のはるかに大きな増加にもかかわらず、温室効果ガスの増加はわずか１％であった。（酪農乳業が全体として２０５０年までに二酸化炭素排出量ネットゼロを約束しているため、温室効果ガス排出量は、まもなく減少し始めるだろう。）遺伝子改善は、豚肉生産量の増加も促進しており、豚肉生産量は、１９５９年の１２１億ポンドの豚肉から２００９年には２２８億ポンドの豚肉へと増加した。同じ期間に、豚肉生産のための土地利用は７８％減少し、水使用量は４１％減少し、豚肉生産のカーボンフットプリントは３５％減少した。
いくつかの概要は、乳製品生殖質における遺伝的進歩の増加は、インビトロ育種によって促進され得ると仮定している。最も顕著には、Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１９，１００，８８５－８９５を参照されたい。従来の育種では、胚がインビトロで作製されてから６ヶ月間（ブタ）又は９ヶ月間（ウシ）にわたって胚を妊娠させ、その後、動物が性的成熟に達するまで更に７ヶ月間（ブタ）又は１年間（ウシ）待つ必要がある。本発明の方法は、より短い期間で増加した遺伝的進歩を可能にする生殖生物学的技術を使用して、生成時間を短縮することを探究する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｃａｐｐｅｒ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｄｙ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，９８，ｓｋｚ２９１
【非特許文献2】Ｇｏｓｚｃｚｙｎｓｋｉ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１９，１００，８８５－８９５
【発明の概要】
【0006】
概要
本願発明者らは、ウシ及びブタなどの家畜をインビトロで育種する方法を開発した。いくつかの実施形態では、本教示は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭の家畜親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭の家畜親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子を使用して少なくとも１つの胚を作製することと、Ｄ）少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の株を作製することと、Ｅ）少なくとも１つの胚を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための少なくとも１つの胚性幹細胞株を選択することと、Ｇ）少なくとも１つの選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を異性配偶子又は配偶子様細胞と組み合わせて、少なくとも１つの次世代胚を産生することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、家畜を育種する方法を提供する。いくつかの構成では、少なくとも胚を遺伝子型決定することが、少なくとも１つの胚から作製された胚性幹細胞を遺伝子型決定すること、又は少なくとも１つの胚の生検を遺伝子型決定することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、配偶子又は配偶子様細胞を組み合わせることは、インビトロ受精によるもの、又は細胞質内精子注射によるものであり得る。様々な構成では、異性親の配偶子は、高い遺伝的メリットを有する成体動物由来であってもよく、又は配偶子様細胞は、本教示の方法で産生された異性遺伝子型胚性幹細胞株由来である。
本願発明者らは、ウシ及びブタなどの家畜をインビトロで育種する方法を開発した。いくつかの実施形態では、本教示は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭の家畜親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭の家畜親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子を使用して少なくとも１つの胚を作製することと、Ｄ）少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の株を作製することと、Ｅ）少なくとも１つの胚を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための少なくとも１つの胚性幹細胞株を選択することと、Ｇ）少なくとも１つの選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を異性配偶子又は配偶子様細胞と組み合わせて、少なくとも１つの次世代胚を産生することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、家畜を育種する方法を提供する。いくつかの構成では、少なくとも胚を遺伝子型決定することが、少なくとも１つの胚から作製された胚性幹細胞を遺伝子型決定すること、又は少なくとも１つの胚の生検を遺伝子型決定することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、配偶子又は配偶子様細胞を組み合わせることは、インビトロ受精によるもの、又は細胞質内精子注射によるものであり得る。様々な構成では、異性親の配偶子は、高い遺伝的メリットを有する成体動物由来であってもよく、又は配偶子様細胞は、本教示の方法で産生された異性遺伝子型胚性幹細胞株由来である。
【0007】
様々な構成では、本教示の方法は、Ｉ）少なくとも１つの次世代胚から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、本方法は、本教示の方法に従って家畜を育種する間に産生される胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、親は、ウシ親又はブタ親であり得る。
【0008】
様々な構成では、胚性幹細胞の株を作製することは、胚、それに由来する胚盤胞、又はそれらの一部に、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤は、存在する場合、ｉｗｒ－１、ｉｗｒ－１－ｅｎｄｏ、ｉｗｐ－２、Ｂｏｘ５、ｉＣＲＴ３、スクレロスチン、ｄｋｋ２、ｄｋｋ１、ＬＦ３、ＣＣＴ０３６４７７、ＦＨ５３５、カルダモニン、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ニクロサミド、ＸＡＶ－９３９、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４、ＣＰ２１Ｒ７、ＮＣＢ－０８４６、ＰＮＵ－７４６５４、サリノマイシン、ＫＹ０２１ １１、ＷＩＫＩ４、ＰＲＩ－７２４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、２，４－ジアミノ－キナゾリン、Ａｎｔ １．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４０、アピキュラレン、バフィロマイシン、ＥＴＣ－１５９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＩＷＲ、ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ１ １５－５８４、ピルビニウム、ケルセチン、シゾカオールＤ、ＢＣ２０５９、又はそれらの組み合わせであってもよく、ＧＳＫ３阻害剤は、存在する場合、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、Ａ １０７０７２２、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣＳ ２００２、３Ｆ８、ＴＤＺＤ ８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＢＩＯ－アセトキシム、インジルビン－３’－オキシム、ＴＷＳ １１９、ＴＣＳ ２１３１１、ＳＢ ２１６７６３、ＢＩＯ、炭酸リチウム、ケンパウロン、アルスターパウロン、又はＣＨＩＲ ９８０１４であってもよく、タンキラーゼ阻害剤は、存在する場合、ＸＡＶ９３９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＴＣ－Ｅ ５００１、又はＷＩＫＩ４であってもよく、ＲＯＣＫ阻害剤は、存在する場合、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であってもよく、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、存在する場合、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよい。様々な構成では、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤は、存在する場合、ｉｗｒ－１、ｉｗｒ－１－ｅｎｄｏ、ｉｗｐ－２、Ｂｏｘ５、ｉＣＲＴ３、スクレロスチン、ｄｋｋ２、ｄｋｋ１、ＬＦ３、ＣＣＴ０３６４７７、ＦＨ５３５、カルダモニン、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ニクロサミド、ＸＡＶ－９３９、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４、ＣＰ２１Ｒ７、ＮＣＢ－０８４６、ＰＮＵ－７４６５４、サリノマイシン、ＫＹ０２１ １１、ＷＩＫＩ４、ＰＲＩ－７２４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、２，４－ジアミノ－キナゾリン、Ａｎｔ １．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４０、アピキュラレン、バフィロマイシン、ＥＴＣ－１５９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＩＷＲ、ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ１ １５－５８４、ピルビニウム、ケルセチン、シゾカオールＤ、ＢＣ２０５９、又はそれらの組み合わせであってもよい。様々な構成では、ＧＳＫ３阻害剤は、存在する場合、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、Ａ １０７０７２２、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣＳ ２００２、３Ｆ８、ＴＤＺＤ ８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＢＩＯ－アセトキシム、インジルビン－３’－オキシム、ＴＷＳ １１９、ＴＣＳ ２１３１１、ＳＢ ２１６７６３、ＢＩＯ、炭酸リチウム、ケンパウロン、アルスターパウロン、又はＣＨＩＲ ９８０１４であってもよい。様々な構成では、タンキラーゼ阻害剤は、存在する場合、ＸＡＶ９３９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＴＣ－Ｅ ５００１、又はＷＩＫＩ４であってもよく、ＲＯＣＫ阻害剤は、存在する場合、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であってもよく、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、存在する場合、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンである。様々な構成では、細胞は、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、又はＳＵＮ １１６０２で更に処理され得る。様々な構成では、本方法は、ビタミンＣ、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを細胞に投与することを更に含み得る。
【0009】
様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、選択された幹細胞株の各々からの細胞に、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）シグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、細胞を前駆細胞に誘導することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、前駆細胞は、中胚葉様細胞であってもよく、誘導することは、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、及び血清代替品を含む培地中で細胞を培養することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、前駆細胞は、形成細胞様細胞であってもよく、培養することは、ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を含む培地中で細胞を培養することを含み得る。様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、前駆細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、細胞を始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）に誘導することを更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、前駆細胞をＰＧＣＬＣに誘導することは、細胞に、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及びＢＭＰ４を投与することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、誘導することは、血清代替品を投与することを更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。
【0010】
様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞に、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の誘導剤、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）シグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、細胞を精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）に誘導することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、胚性幹細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨの誘導剤、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、又はそれらの組み合わせを投与することによる、胚性幹細胞を精子細胞に誘導することを含み得る。様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞を再構成された卵巣内に配置することと、再構成された卵巣内の細胞に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、再構成された卵巣内の細胞に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、再構成された卵巣内の細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、による、胚性幹細胞を卵母細胞に誘導することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、幹細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、幹細胞に、ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、ＳＵＢ１、又はそれらの組み合わせを発現させることによる、細胞を卵母細胞に誘導することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。
【0011】
様々な実施形態では、本教示のウシを育種する方法は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のウシ親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭のウシ親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子から少なくとも１つの胚を作製することと、Ｄ）少なくとも１つの胚から胚性幹細胞の１つ以上の株を作製することであって、作製することが、ｉ）胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部に、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤及びＦＧＦシグナル伝達の誘導剤を投与することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、作製することと、Ｅ）胚性幹細胞の１つ以上の株を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、Ｇ）配偶子又は配偶子様細胞に分化させるために、各選択された株から幹細胞を誘導することであって、誘導することが、ｉ）アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、幹細胞を前駆細胞に誘導することと、ｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前駆細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、ｂ）インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、又はＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）細胞を再構成された卵巣内に配置することと、ｂ）再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、ｃ）再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、ｄ）再構成された卵巣に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、Ｉ）複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性幹細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、工程Ｄ）は、ＦＧＦ２及びＩＷＲ１を含む培地中で、胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部をインキュベートすることを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよく、工程Ｇ）は、ｉ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、幹細胞を形成細胞に誘導すること、又は血清代替品、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、幹細胞を中胚葉様細胞に誘導することと、ｉｉ）細胞をＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、形成細胞又は中胚葉様細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、ｂ）血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬを精子細胞様細胞に誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）ＸＸ ＰＧＣＬＳと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、ｂ）再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、ｃ）２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を誘導することと、ｄ）ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、本方法は、工程Ｄ又は工程Ｉで作製された胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。
【0012】
様々な実施形態では、本教示によるブタを育種する方法は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のブタ親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭のブタ親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子から少なくとも１つの胚を作製することと、Ｄ）少なくとも１つの胚のから胚性幹細胞の１つ以上の株を作製することであって、作製することが、ｉ）胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部を複数の胚から単離することと、ｉｉ）胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部を、ＧＳＫ３阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、ビタミンＣ、アクチビンＡシグナル伝達誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達誘導剤、ＦＧＦシグナル伝達誘導剤、又はそれらの組み合わせを補充した培地中でインキュベートすることと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、作製することと、Ｅ）胚性幹細胞の１つ以上の株の各々を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、Ｇ）各選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることであって、誘導することが、ｉ）細胞に、アクチビンａシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、幹細胞を前駆細胞に誘導することと、ｉｉ）細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、前駆細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）細胞に、ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、ｂ）細胞に、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）細胞を再構成された卵巣内に配置することと、ｂ）再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、ｃ）再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、ｄ）細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含む、誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、分化させることと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、Ｉ）複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。いくつかの構成では、工程Ｄ）は、胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部に、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、及びＰＤ０３２５９０１を投与することを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよく、工程Ｇ）は、ｉ）細胞にアクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、幹細胞を形成細胞に誘導すること、又は細胞に、血清代替品、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与することによる、幹細胞を中胚葉様細胞に誘導することと、ｉｉ）ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、形成細胞又は中胚葉様細胞をＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、ｂ）血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬを精子細胞に誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）ＸＸ ＰＧＣＬＣと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、ｂ）再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、ｃ）２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を誘導することと、ｄ）ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、ｅ）卵母細胞をＭＩＩ卵母細胞に成熟させることと、を含む、誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。様々な構成では、本方法は、工程Ｄ又は工程Ｉで作製された胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つから動物を産生することを更に含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい。
【0013】
様々な実施形態では、本教示は、ウシ胚性幹細胞に、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、アクチビンａシグナル伝達の誘導剤、及びＷＮＴシグナル伝達の誘導剤を投与して、ウシ形成細胞を誘導すること、又はウシ胚性幹細胞に、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、及び血清代替品を投与して、ウシ中胚葉様細胞を誘導することと、ウシ形成細胞又はウシ中胚葉様細胞に、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、及びＢＭＰシグナル伝達の誘導剤を投与して、始原生殖細胞様細胞を誘導することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、インビトロでのウシ始原生殖細胞様細胞を生成する方法を提供する。いくつかの構成では、ウシ形成細胞が作製され、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＧＳＫ３を阻害することによってＷＮＴを誘導し得る。様々な構成では、ウシ形成細胞が作製され、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよく、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、又はＦＧＦ－Ｐであってもよく、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であってもよい。様々な構成では、ウシ中胚葉様細胞が作製され、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよく、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であってもよい。いくつかの構成では、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤は、ＬＩＦであってもよく、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤は、ＳＣＦであってもよく、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン及びｋｍ１１０７３、４’－ヒドロキシカルコン、又はＳＶＡＫ－１２であってもよい。
【0014】
様々な実施形態では、本教示は、細胞に、ｉ）ｂＦＧＦ、アクチビンＡ、及びＣＨＩＲ９９０２１を投与して、ウシ形成細胞を形成するか、又はｉｉ）アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１、及び血清代替品を投与して、ウシ中胚葉様細胞を形成することと、Ｂ）細胞に、ｒＬＩＦ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰ４、及び血清代替品を投与して、ｂＰＧＣＬＣを産生することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、ウシ胚性幹細胞からウシ始原生殖細胞様細胞（ｂＰＧＣＬＣ）を誘導する方法を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態では、本教示は、胚、胚盤胞、又はそれらの一部を提供することと、胚、胚盤胞、又はそれらの一部に、ＦＧＦシグナル伝達誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達誘導剤、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、及びアクチビンＡシグナル伝達誘導剤を投与することと、を含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなっていてもよい、ブタ胚性幹細胞を誘導する方法を提供する。いくつかの構成では、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、又はＦＧＦ－Ｐであってもよく、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であってもよく、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であってもよく、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよい。様々な構成では、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、又はＦＧＦ－Ｐであってもよい。様々な構成では、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であってもよい。様々な構成では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２又はＰＤ０３２５９０１であってもよい。様々な構成では、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよい。様々な構成では、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＧＳＫ３を阻害することによってＷＮＴを誘導し得る。様々な構成では、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦであってもよく、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であってもよく、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１であってもよく、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤が、アクチビンＡであってもよい。
【0016】
様々な実施形態では、本教示は、本教示の胚性幹細胞を、筋肉細胞、脂肪細胞、臓器細胞、又はそれらの組み合わせに誘導することと、筋肉細胞、脂肪細胞、臓器細胞、又はそれらの組み合わせを三次元構造上で培養することと、を含み得る、実験室で成長した肉を培養する方法を提供する。
【0017】
本教示は、家畜を育種する方法であって、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭の家畜親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭の家畜親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子を使用して複数の胚を作製することと、Ｄ）複数の胚のうちの２つ以上から胚性幹細胞の株を作製することと、Ｅ）複数の胚のうちの２つ以上を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための少なくとも１つの胚性幹細胞株を選択することと、Ｇ）少なくとも１つの選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子又は配偶子様細胞に分化させることと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を異性配偶子又は配偶子様細胞と組み合わせて、複数の次世代胚を産生することと、を含み得る、家畜を育種する方法を提供する。
【0018】
いくつかの構成では、複数の胚のうちの２つ以上を遺伝子型決定することは、複数の胚のうちの２つ以上から作製された胚性幹細胞を遺伝子型決定することを含み得る。様々な構成では、複数の胚のうちの２つ以上を遺伝子型決定することは、複数の胚のうちの２つ以上の生検を遺伝子型決定することを含み得る。様々な構成では、配偶子又は配偶子様細胞を組み合わせることは、インビトロ受精によるものであり得る。様々な構成では、配偶子又は配偶子様細胞を組み合わせることは、細胞質内精子注射によるものであり得る。様々な構成では、異性親の配偶子は、高い遺伝的メリットを有する成体動物由来であってもよい。いくつかの構成では、異性親の配偶子は、高い遺伝的メリットを有する性的成熟動物由来であってもよい。様々な構成では、異性親の配偶子様細胞は、異性幹細胞株から産生された配偶子様細胞であってもよい。様々な構成では、異性親の配偶子様細胞は、工程Ｄで産生された異性遺伝子型胚性幹細胞株由来であってもよい。様々な構成では、異性親の配偶子様細胞は、工程Ｇで産生された異性遺伝子型胚性幹細胞株由来であってもよい。
【0019】
様々な構成では、本教示の方法は、Ｉ）複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性幹細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を更に含み得る。様々な構成では、本教示の方法は、工程（Ｃ）からの胚性幹細胞株のうちの１つからの胚性幹細胞を使用して核移植を行うことを更に含み得る。様々な構成では、本教示の方法は、工程（Ｉ）からの胚性幹細胞株のうちの１つからの胚性幹細胞を使用して核移植を行うことを更に含み得る。様々な構成では、親は、ウシ親である。様々な構成では、親は、ブタ親である。
【0020】
様々な構成では、胚性幹細胞の株を作製することは、ｉ）複数の胚からの胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することと、ｉｉ）ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を補充した培地中でＩＣＭをインキュベートすることと、を含み得る。いくつかの構成では、ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ｉｗｒ－１、ｉｗｒ－１－ｅｎｄｏ、ｉｗｐ－２、Ｂｏｘ５、ｉＣＲＴ３、スクレロスチン、ｄｋｋ２、ｄｋｋ１、ＬＦ３、ＣＣＴ０３６４７７、ＦＨ５３５、カルダモニン、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ニクロサミド、ＸＡＶ－９３９、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４、ＣＰ２１Ｒ７、ＮＣＢ－０８４６、ＰＮＵ－７４６５４、サリノマイシン、ＫＹ０２１ １１、ＷＩＫＩ４、ＰＲＩ－７２４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、２，４－ジアミノ－キナゾリン、Ａｎｔ １．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４０、アピキュラレン、バフィロマイシン、ＥＴＣ－１５９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＩＷＲ、ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ１ １５－５８４、ピルビニウム、ケルセチン、シゾカオールＤ、ＢＣ２０５９、又はそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの構成では、ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ｉｗｒ－１又はｉｗｒ－１－ｅｎｄｏであってもよい。様々な構成では、ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ｉｗｒ－１であってもよく、細胞は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、又はＳＵＮ １１６０２で更に処理され得る。
【0021】
様々な構成では、胚性幹細胞の株を作製することは、ｉ）複数の胚からの胚から内部細胞塊（ＩＣＭ）を単離することと、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、又はそれらの組み合わせを補充した培地中でＩＣＭをインキュベートすることと、を含み得る。いくつかの構成では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＲ－Ａ ０１４４１８、Ａ １０７０７２２、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣＳ ２００２、３Ｆ８、ＴＤＺＤ ８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＢＩＯ－アセトキシム、インジルビン－３’－オキシム、ＴＷＳ １１９、ＴＣＳ ２１３１１、ＳＢ ２１６７６３、ＢＩＯ、炭酸リチウム、ケンパウロン、アルスターパウロン、又はＣＨＩＲ ９８０１４であってもよい。様々な構成では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であってもよい。様々な構成では、タンキラーゼ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＴＣ－Ｅ ５００１、又はＷＩＫＩ４であってもよい。様々な構成では、タンキラーゼ阻害剤は、ＸＡＶ９３９であってもよい。様々な構成では、本方法は、ビタミンＣ、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを細胞に投与することを更に含み得る。
【0022】
様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、選択された幹細胞株の各々からの細胞を胚盤葉上層様細胞（ＥｐｉＬＣ）に誘導することを含み得る。様々な構成では、細胞をＥｐｉＬＣに誘導することは、細胞に、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）シグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを細胞に投与することを含み得る。いくつかの構成では、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡ、アラントラクトン、ＢＭＰ４、ノーダル、スタウプリミド、ＳＢ－４３１５４２、Ａ０１、アラントラクトン、ＧＤＦ８、又はコノフィリンであってもよい。いくつかの構成では、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤は、アクチビンＡであってもよい。様々な構成では、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２、スクラルファート、及びＦＧＦ－Ｐであってもよい。いくつかの構成では、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ｂＦＧＦであってもよい。様々な構成では、インスリンシグナル伝達の誘導剤は、インスリン、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、硫酸亜鉛硫酸亜鉛－７水、ｂｐＶ、ＢＭＯＶ、バナジルロシグリタゾン、バナジルトレハロース、バナジルメトホルミン、バナジルケルセチン、デメチルアステリキノンＢ１、及びＢＲＤ ７５５２であってもよい。様々な構成では、インスリンシグナル伝達の誘導剤は、インスリンを含有する媒体添加剤であってもよい。いくつかの構成では、媒体添加剤は、血清代替品であってもよい。
【0023】
様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞を始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）に誘導することを含み得る。いくつかの構成では、誘導することは、細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。いくつかの構成では、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン及びｋｍ１１０７３、４’－ヒドロキシカルコン、又はＳＶＡＫ－１２であってもよい。いくつかの構成では、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、又はそれらの組み合わせであってもよい。様々な構成では、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤は、ＬＩＦであってもよい。様々な構成では、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤は、ＳＣＦであってもよい。様々な構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＥＰＲ、又はＨＢ－ＥＧＦであってもよい。いくつかの構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦであってもよい。様々な構成では、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤は、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ、ＷｎｔアゴニストＩＩ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、又はＦｏｘｙ ５であってもよい。
【0024】
いくつかの構成では、誘導することは、細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを含む。いくつかの構成では、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン及びｋｍ１１０７３、４’－ヒドロキシカルコン、又はＳＶＡＫ－１２であってもよい。いくつかの構成では、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、又はそれらの組み合わせであってもよい。様々な構成では、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤は、ＬＩＦであってもよい。様々な構成では、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤は、ＳＣＦであってもよい。様々な構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＥＰＲ、又はＨＢ－ＥＧＦであってもよい。いくつかの構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦであってもよい。
【0025】
いくつかの構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞を精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）に誘導することを含み得る。いくつかの構成では、誘導することは、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達の誘導剤、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）シグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを細胞に投与することを含み得る。いくつかの構成では、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤は、レチノイン酸、レチノイン酸ｐ－ヒドロキシアニリド、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＢＭＰ４、ＴＴＮＰＢ、メトプレン酸、ＥＣ２３、１－メチル－２－オキシインドール、アダパレン、ＣＤ４３７、ＡＣ２６１０６６、ＣＤ１５３０、Ｃｈ ５５、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＡＣ ５５６４９、ＢＭＳ ９６１、ＢＭＳ ７５３、ＣＤ ２３１４、フェンレチニド、アダパレン、ＥＣ １９、又はＳＲ １０７８であってもよい。いくつかの構成では、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤は、レチノイン酸であってもよい。様々な構成では、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤は、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、ＸＩＢ４０３５、ＢＴ１３、ＢＴ１８、又はＢＴ４４であってもよい。いくつかの構成では、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤は、ＧＤＮＦであってもよい。様々な構成では、テストステロンシグナル伝達の誘導剤は、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、オキシメトロン、オキサンドロロン、エチルエストレノール、スタノゾロール、ダナゾール、メタンドロステノロン、ノルエタンドロロン、ＧＤＮＦ、ジヒドロテストステロン、又はイカリインであってもよい。
【0026】
様々な構成では、胚性幹細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞を精子細胞に誘導することを含み得る。様々な構成では、細胞を誘導することは、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、又はそれらの組み合わせを投与することを含み得る。様々な構成では、インスリンシグナル伝達の誘導剤は、インスリン、ｂｐＶ、ＢＭＯＶ、バナジルロシグリタゾン、バナジルトレハロース、バナジルメトホルミン、バナジルケルセチン、デメチルアステリキノンＢ１、及びＢＲＤ ７５５２であってもよい。様々な構成では、インスリンシグナル伝達の誘導剤は、インスリンであってもよい。様々な構成では、テストステロンシグナル伝達の誘導剤は、テストステロン、ＧＤＮＦ、ジヒドロテストステロン、及びイカリインであってもよい。様々な構成では、テストステロンシグナル伝達の誘導剤は、テストステロンであってもよい。様々な構成では、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤は、ＦＳＨ、コリフォリトロピンアルファ、ＦＳＨβ－ＣＴＰ－α、Ｎ２－α ＦＳＨ、妊馬の血清ゴナドトロピン、チアゾリジノン、及びヘキサヒドロキノリンからなる群から選択される。
【0027】
様々な構成では、細胞を配偶子又は配偶子様細胞に誘導することは、胚性幹細胞を卵母細胞に誘導することを含み得る。いくつかの構成では、胚性幹細胞を卵母細胞に誘導することは、胚性幹細胞を再構成された卵巣内に配置することを含み得る。様々な構成では、胚性幹細胞を卵母細胞に誘導することは、細胞にエストロゲン受容体アゴニストを投与することを含み得る。いくつかの構成では、エストロゲン受容体は、ＩＣＩ１８２７８０、フェルチニン、エストロピペート、エストロン－３－サルフェート、Ｓ－エクオール、ＷＡＹ－２０００７０、ＤＹ １３１、ＧＳＫ ４７１６、ＡＢ－１、ＥＲＢ－０４１、ビオカニンＡ、β－エストラジオール、α－エストラジオール、ＰＰＴ、ＤＰＮ、ＦＥＲｂ ０３３、又はＡＣ １８６であってもよい。様々な構成では、エストロゲン受容体アゴニストは、ＩＣＩ１８２７８０であってもよい。様々な構成では、誘導することは、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を細胞に投与することを含み得る。いくつかの構成では、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＧＤＦ９、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン、ｋｍ１１０７３、ＰＤ０７８２４、４’－ヒドロキシカルコン、又はＳＶＡＫ－１２からなる群から選択されてもよい。いくつかの構成では、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤は、ＢＭＰ１５、ＧＤＦ９、又はそれらの組み合わせであってもよい。様々な構成では、細胞を卵母細胞に誘導することは、細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することを含み得る。いくつかの構成では、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤は、ＦＳＨ、コリフォリトロピンアルファ、ＦＳＨβ－ＣＴＰ－α、Ｎ２－α ＦＳＨ、妊馬の血清ゴナドトロピン、チアゾリジノン、又はヘキサヒドロキノリンであってもよい。いくつかの構成では、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤は、ＦＳＨであってもよい。様々な構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＥＰＲ、及びＨＢ－ＥＧＦであってもよい。いくつかの構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦであってもよい。様々な構成では、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤は、ｈＣＧ、絨毛性ゴナドトロピン、コリオゴナドトロピンアルファ、又はコリフォリトロピンアルファであってもよい。いくつかの構成では、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦであってもよい。
【0028】
様々な構成では、誘導することは、細胞に、ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、若しくはＳＵＢ１遺伝子、又はそれらの組み合わせを発現させることを含み得る。いくつかの構成では、細胞に遺伝子を発現させることは、遺伝子を含むベクターを細胞内に一過性にトランスフェクトすることを含み得る。
【0029】
様々な構成では、ＥＳＣを、直接的に誘導された卵母細胞様細胞に誘導する方法は、細胞に、ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、若しくはＳＵＢ１遺伝子、又はそれらの組み合わせを発現させることを含み得る。様々な構成では、細胞に遺伝子を発現させることは、遺伝子を含むベクターを細胞内に一過性にトランスフェクトすることを含み得る。
【0030】
様々な実施形態では、本教示によるウシを育種する方法は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のウシ親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭のウシ親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子から複数の胚を作製することと、Ｄ）複数の胚の各々から胚性幹細胞の株を作製することであって、作製することが、ｉ）任意選択的に複数の胚からの胚からＩＣＭを単離することと、ｉｉ）ｗｎｔシグナル伝達阻害剤を補充した培地中でＩＣＭをインキュベートすることと、を含み得る、作製することと、Ｅ）胚性幹細胞の各々の株を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、Ｇ）配偶子様細胞に分化させるために、各選択された株から幹細胞を誘導することであって、誘導することが、ｉ）アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、幹細胞をＥｐｉＬＣに誘導することと、ｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＥｐｉＬＣをＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、ｂ）インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、又はＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）細胞を再構成された卵巣内に配置することと、ｂ）再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、ｃ）再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、ｄ）再構成された卵巣に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することと、を含む、誘導することと、を含み得る、誘導することと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、Ｉ）複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性幹細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含み得る。いくつかの構成では、工程Ｄ）は、ＦＧＦ２及びＩＷＲ１を含む培地中で、ＩＣＭ、胚、胚盤胞、又はそれらの一部をインキュベートすることを含んでもよく、工程Ｇ）は、ｉ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、幹細胞をＥｐｉＬＣに誘導することと、ｉｉ）ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ、及びＥＧＦを投与することによる、ＥｐｉＬＣをＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、ｂ）血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）ＸＸ ＰＧＣＬＳと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、ｂ）再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、ｃ）２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を誘導することと、ｄ）ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、を含む、誘導することと、を含んでもよい。様々な実施形態では、本方法は、工程Ｄ又は工程Ｉで作製された胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つからの細胞を使用して核移植を行うことを更に含み得る。
【0031】
様々な実施形態では、本教示によるブタを育種する方法は、Ａ）複数の成体動物から少なくとも１頭のブタ親を選択することと、Ｂ）少なくとも１頭のブタ親から複数の配偶子を得ることと、Ｃ）複数の配偶子から複数の胚を作製することと、Ｄ）複数の胚の各々から胚性幹細胞の株を作製することであって、作製することが、ｉ）任意選択的に複数の胚からの胚からＩＣＭを単離することと、ｉｉ）ＩＣＭ、胚、それから成熟した胚盤胞、又はそれらの一部を、ＧＳＫ３阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、ビタミンＣ、アクチビンＡシグナル伝達誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達誘導剤、又はそれらの組み合わせを補充した培地中でインキュベートすることと、を含む、作製することと、Ｅ）胚性幹細胞の各々の株を遺伝子型決定することと、Ｆ）育種のための幹細胞株の組み合わせを選択することと、Ｇ）各選択された株から幹細胞を誘導して、配偶子様細胞に分化させることであって、誘導することが、ｉ）細胞に、アクチビンａシグナル伝達の誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、幹細胞をＥｐｉＬＣに誘導することと、ｉｉ）細胞に、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＥｐｉＬＣをＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することであって、ａ）細胞に、ＲＡシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに誘導することと、ｂ）細胞に、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ遺伝子型を有するＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）細胞を再構成された卵巣内に配置することと、ｂ）再構成された卵巣に、エストロゲン受容体アゴニストを投与することと、ｃ）再構成された卵巣に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を投与することと、ｄ）細胞に、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、及びゴナドトロピンシグナル伝達の誘導剤を投与することと、を含む、誘導することと、を含む、分化させることと、Ｈ）配偶子又は配偶子様細胞を用いてインビトロ受精を行って、複数の次世代胚を形成することと、Ｉ）複数の次世代胚の各々から胚性幹細胞株を作製して、次世代胚性幹細胞株を作製することと、Ｊ）次世代胚性幹細胞株に対して工程Ｅ～Ｈを繰り返すことと、を含み得る。いくつかの構成では、工程Ｄ）は、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＨ－４－０２３、ＸＡＶ９３９、ビタミンＣ、アクチビンＡ、及びＬＩＦを含む培地中でＩＣＭをインキュベートすることを含んでもよく、工程Ｇ）は、ｉ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、及び血清代替品を投与することによる、幹細胞をＥｐｉＬＣに誘導することと、ｉｉ）ＢＭＰ４、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＢＭＰ８ｂ、及びＥＧＦを投与することによる、ＥｐｉＬＣをＰＧＣＬＣに誘導することと、ｉｉｉ）ＸＹ ＰＧＣＬＣを精子細胞に誘導することであって、ａ）ＲＡ、ＧＤＮＦ、及びテストステロンを投与することによる、ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬに誘導することと、ｂ）血清代替品、テストステロン、及びＢＰＥを投与することによる、ＳＳＣＬを精子細胞に誘導することと、を含む、誘導することと、ｉｖ）ＸＸ ＰＧＣＬＣを卵母細胞に誘導することであって、ａ）ＸＸ ＰＧＣＬＣと雌ウシ性腺体細胞及びＲＡとを混合して、再構成された卵巣を形成することと、ｂ）再構成された卵巣にＩＣＩ１８２７８０を投与して、二次卵胞様構造（２ＦＬ）を誘導することと、ｃ）２ＦＬに、ＦＳＨ、ＢＭＰ１５、及びＧＤＦ９を投与して、ＣＯＣを誘導することと、ｄ）ＣＯＣに、ＦＳＨ、ＥＧＦ、及びｈＣＧを投与して、卵母細胞を形成することと、ｅ）卵母細胞をＭＩＩ卵母細胞に成熟させることと、を含む、誘導することと、を含んでもよい。様々な構成では、本方法は、工程Ｄ又は工程Ｉで作製された胚性幹細胞株のうちの少なくとも１つからの細胞を使用して核移植を行うことを更に含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】ＭＥＦ１フィーダー細胞上で成長するウシ胚性幹細胞を示す。
【図2】フィーダーを含まない、ビトロネクチンコーティングされたプレート上で成長するウシ胚性幹細胞を示す。
【図3】本教示のウシ胚性幹細胞が胚様体を形成することを示す。
【図4】本教示のウシ胚性幹細胞が、ニューロン細胞（外胚葉細胞）、中胚葉細胞、及び内胚葉細胞の３つ全ての主要な細胞型に分化することを示す。
【図5】中間細胞型を介した、フィーダーを含まないウシ胚性幹細胞から始原生殖細胞様細胞への誘導を示す。
【図6】誘導されたウシ始原生殖細胞様細胞の形態を示す。
【図7】ＣＦ１マウスフィーダー細胞上で成長するブタ胚性幹細胞を示す。
【図8】フィーダーを含まない、ビトロネクチン又はフィブロネクチンコーティングされたプレート上で成長するブタ胚性幹細胞を示す。
【図9】本教示のブタ胚性幹細胞が胚葉体を形成することを示す。
【図10】本教示のブタ胚性幹細胞が自発的に中胚葉細胞に分化することを示す。
【図11】本教示のブタ胚性幹細胞が自発的に内胚葉細胞に分化することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0033】
詳細な説明
本明細書に記載の方法は、親を選択する工程と、ＩＶＦを介して交配を行って、複数の胚を形成する工程と、これらの胚から胚性幹細胞（ＥＳＣ）株を作製する工程と、細胞株を遺伝子型決定する工程と、次世代のために親を選択する工程と、選択された胚性幹細胞株から配偶子を導出する工程と、これらの配偶子を用いてＩＶＦ又は細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）を行って、複数の胚を形成する工程と、次いで、これらの胚からＥＳＣを産生して、プロセスを再び開始する工程と、を含む、育種する方法を含む。本明細書に開示する方法は、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギなどの様々な哺乳動物家畜種に対する育種する方法の適用を含む。特に、ウシ及びブタが望ましい。これらの方法は、自然に子孫を妊娠させ、それらを遺伝子型決定し、その後、交配する前に動物が性的に成熟するのを待つよりも時間はかからない。胚性幹細胞株を作製してから遺伝子型を取得する方がリスクは低いが、胚を生検して遺伝子型を決定し、選択した胚のみから胚性幹細胞株を作製することが可能である。このプロセス中に作製された高い遺伝的メリットを有する胚性幹細胞株を使用して、標準的な核移植プロトコルを使用して（乳、肉、又は配偶子の）産生のための動物を作製することができる。
本明細書に記載の方法は、親を選択する工程と、ＩＶＦを介して交配を行って、複数の胚を形成する工程と、これらの胚から胚性幹細胞（ＥＳＣ）株を作製する工程と、細胞株を遺伝子型決定する工程と、次世代のために親を選択する工程と、選択された胚性幹細胞株から配偶子を導出する工程と、これらの配偶子を用いてＩＶＦ又は細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）を行って、複数の胚を形成する工程と、次いで、これらの胚からＥＳＣを産生して、プロセスを再び開始する工程と、を含む、育種する方法を含む。本明細書に開示する方法は、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヤギなどの様々な哺乳動物家畜種に対する育種する方法の適用を含む。特に、ウシ及びブタが望ましい。これらの方法は、自然に子孫を妊娠させ、それらを遺伝子型決定し、その後、交配する前に動物が性的に成熟するのを待つよりも時間はかからない。胚性幹細胞株を作製してから遺伝子型を取得する方がリスクは低いが、胚を生検して遺伝子型を決定し、選択した胚のみから胚性幹細胞株を作製することが可能である。このプロセス中に作製された高い遺伝的メリットを有する胚性幹細胞株を使用して、標準的な核移植プロトコルを使用して（乳、肉、又は配偶子の）産生のための動物を作製することができる。
【0034】
また、ウシ胚性幹細胞に由来する第１の始原生殖細胞様細胞を本明細書に開示する。
【0035】
動物の選択
ウシ
ウシ産業は、様々な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を含むゲノム情報（しばしば業界では遺伝学と称される）を使用して、特定の遺伝子座で同様の遺伝学を有する動物を用いた過去の結果に基づいて、特定の動物の値を予測する。
ウシ
ウシ産業は、様々な小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の遺伝子型を含むゲノム情報（しばしば業界では遺伝学と称される）を使用して、特定の遺伝子座で同様の遺伝学を有する動物を用いた過去の結果に基づいて、特定の動物の値を予測する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「遺伝子座」又は複数の「遺伝子座」は、染色体上の特定の遺伝子又はマーカーの物理的な部位又は位置を指す。遺伝子座はまた、「Ａ」遺伝子座、「Ｂ」遺伝子座、又はヘテロ接合性「Ａ／Ｂ」遺伝子座のいずれかとして特徴付けられ得る。「Ａ」又は「Ｂ」のいずれかの遺伝子座としての遺伝子座の識別は、多型自体、又はＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標），Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発されたコンテキスト的に周囲の配列に基づいて、上（ＴＯＰ）及び下（ＢＯＴ）の指定に従って決定される。「Ａ」又は「Ｂ」としての多形性部位の指定を決定するための方法は、例えば、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｉｌｌｕｍｉｎａ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅ＿ｔｏｐｂｏｔ．ｐｄｆ．でインターネット上で入手可能な「ＴＯＰ／ＢＯＴ」Ｓｔｒａｎｄ ａｎｄ 「Ａ／Ｂ」Ａｌｌｅｌｅ」と題されたＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）のＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅによって提供されるように、当該技術分野で既知である。ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰデータベースは、２００５年にＴＯＰ／ＢＯＴ命名法を採用し、その指定は、当業者によく知られている。配列比較によって、ｄｂＳＮＰ識別子、ソース、染色体位置、遺伝子、転写産物、遺伝子への系統又は定量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）、及び相互作用を含むがこれらに限定されない、各遺伝子座に関する広範な情報は、当業者に利用可能である。予測伝達能力（ＰＴＡ）は、例えば、生産（乳及び乳成分）、健康／適合性、並びに種類の広範なカテゴリにおいて、様々な形質について計算することができる。乳牛は、乳、脂肪、及びタンパク質収率、生産的寿命の長さ、並びに体細胞スコア（乳房炎の指標）の形質について評価される。評価手順は、評価された動物の親戚からの情報と、ウシの場合には動物自体からの情報を組み合わせる。加えて、多数の種類又はコンフォメーション形質が定期的に評価される。形質は、典型的には、それらの相対的な経済的重みに基づいて指標に組み合わされる。例えば、ＣＤＣＢと併せてＵＳＤＡ ＡＩＰＬによって計算されたネットメリットインデックス（ＮＭ＄）は、今日の乳業生産者に関連する収入及び費用に基づいて生涯利益を概算し、ドルでの価値で表される。ＮＭ＄に含まれる形質としては、タンパク質（ポンド）、脂肪（ポンド）、生産寿命、体細胞スコア、乳器混合、足／脚混合、身体サイズ混合、及び娘の妊娠率が含まれる。Ｈｏｌｓｔｅｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＵＳＡ（ＨＡＵ）は、Ｔｏｔａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｄｅｘ（ＴＰＩ（登録商標）、ＨＡＵ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を計算する。これには、タンパク質、脂肪、種類、乳器混合、足及び脚の混合、娘の妊娠率、生産寿命、体細胞スコア、娘の分娩の容易さ、娘の死産、並びに乳製品の形態の形質が含まれる。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｅｒｓｅｙ Ｃａｔｔｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによって使用されるＪＥＲＳＥＹ ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ ＩＮＤＥＸ（商標）（ＪＰＩ（商標），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｅｒｓｅｙ Ｃａｔｔｌｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓｂｕｒｇ，Ｏｈｉｏ）は、タンパク質、脂肪、機能的形質指数、生産寿命、体細胞スコア、及び娘の妊娠率といった形質で構成される。この機能的形質指数は、全ての種類の形質についての雄ウシ／雌ウシのＰＴＡに基づく。ＪＰＩ（商標）は、品種を改善するという利益のために定期的に更新される。Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇは、概算育種値（例えば、ＮＭ＄、ＣＭ＄）を年に３回発行している。これらの刊行物は、「Ｓｉｒｅ Ｓｕｍｍａｒｉｅｓ」と称される。その中に開示された予測値は、２０２１年１２月のＳｉｒｅ Ｓｕｍｍａｒｙ時点のものである。ウシの育種家の中には、カスタム指数を使用するものもいる。形質パラメータは、基礎となる遺伝学及び決定された各形質の遺伝性と相関している。１２のＰＴＡ形質間の遺伝学及び表現型の相関関係は、ＶａｎＲａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８でも提供されている。遺伝子型と表現型との間のこれらの相関関係は、経時的に追跡されており、パーセントとして表されるネットメリット信頼性（ＮＭ＿Ｒｅｌ）及び乳信頼性（Ｍｉｌｋ＿Ｒｅｌ）などの信頼性スコアの計算を可能にする。
【0037】
Ｈｏｌｓｔｅｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＵＳＡ（ＨＡＵ）は、Ｔｏｔａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｄｅｘ（ＴＰＩ（登録商標）、ＨＡＵ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を計算する。これには、タンパク質、脂肪、種類、乳器混合、足及び脚の混合、娘の妊娠率、生産寿命、体細胞スコア、娘の分娩の容易さ、娘の死産、並びに乳製品の形態の形質が含まれる。ネットメリットスコアと同様に、ＴＰＩ（登録商標）は、２０１０年のベースライン平均動物との比較に基づいて計算されるが、Ｈｏｌｓｔｅｉｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＵＳＡは、ベースライン動物を更新する計画を発表していない。したがって、本明細書で使用される場合、ＴＰＩ（登録商標）スコアは、２０１０年のベースライン動物を使用して計算される。しかしながら、新しいベースライン年が採用される場合、当業者は、当該技術分野で既知の方法を使用して、２０１０年のベースライン集団（ｗｗｗ．ｈｏｌｓｔｅｉｎｕｓａ．ｃｏｍでインターネットで入手可能）に基づいて、任意の将来のベースライン動物についてのＴＰＩ（登録商標）値を計算又は変換することができるであろう。ＴＰＩ（登録商標）（ＨＡＵ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）には、生産量、種類、並びに重要な線形及び混合の形質が組み込まれている。ＴＰＩ（登録商標）は、タンパク質及び脂肪に対して報酬を受け取る乳製品に焦点を当てており、種類により重点を置く必要がある。
【0038】
個々の育種家及び遺伝学の企業も、育種の決定を補助するために使用可能な独自の指数及び他のカスタム計算を作成する。
【0039】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｎｇｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎなどの肉牛協会は、動物の死体の予測値を表す牛肉値（＄Ｂ）などの値指数を含む同様のレポートを公開している。
【0040】
形質指数を使用して、次世代の親を選択することができる。当業者は、選択及び形質指数を使用して、次世代への親となる動物を選択することができる。親が選択されると、雄配偶子が収集される（射精又は上皮精液を収集する方法）は、当該技術分野で既知である。雌配偶子もまた、当該技術分野で認識された方法、最も頻繁には、経膣採卵によって収集される。
【0041】
ＳＮＰ遺伝子型に基づくいくつかの他の予測形質は、本明細書に開示される胚性幹細胞株について記載されている。本明細書で使用される場合、娘の妊娠率（ＤＰＲ）は、各２１日間（発情周期）の間に実際に妊娠する、非妊娠牛、又は妊娠可能な雌牛の割合の遺伝子的尺度である。ＤＰＲは、群管理目的で計算された妊娠率と似ているが、必ずしも同じではない。より大きなＰＴＡ ＤＰＲを有する種雄ウシの娘は、所与の発情周期の間に受胎する可能性が高く、ＰＴＡ ＤＰＲの各ｌ％の増加は、開放された４日間の遺伝的減少に関連する。
【0042】
本明細書で使用される場合、ウシ生存率（ＬＩＶ）は、品種の平均に対する死亡又は安楽死で終わらない授乳の確率値を表す。授乳中に死ぬウシは価値がなく、農家は、死体を処分するために費用を支払わなければならないため、この形質は重要である。その形質は、何らかの理由で群から淘汰されたウシを含むＰＬに似ている。ＬＩＶ値は、約－５～＋５の範囲であり、品種平均と比較して、雄ウシの娘の５％以上が生き残る。同様に、雌ウシ生存性（ＨＬＩＶ）は、平均的な管理状件下で出生から２日後から１８ヶ月齢までの動物の雌の子孫の予測生存性の割合を表す。数値が高いほど好ましく、その形質は、品種平均と比較して表される。例えば、ＨＬＩＶ値が１のホルスタイン雄ウシは、品種平均と比較して、その娘の１％以上が１８ヶ月齢まで生存すると予想される。
【0043】
本明細書で使用される場合、雌ウシ受胎率（ＨＣＲ）は、各サービスで妊娠した受精雌ウシの割合であり、割合の偏差として示される。
【0044】
本明細書で使用される場合、ウシ受胎率（ＣＣＲ）は、各サービスで妊娠した受精ウシの割合であり、割合の偏差として示される。
【0045】
本明細書で使用される場合、予測伝達能力乳（ＭＩＬＫ又はＰＴＡ ＭＩＬＫ）は、平均からの子孫の乳収量の予測差である、ポンドで測定される乳収量の形質である。ＭＩＬＫは、個々の種雄ウシの平均的な娘について、授乳毎に予想される乳の追加のポンド数として示される。より高い数値が好ましい。
【0046】
残留飼料摂取量（ＲＦＩ）は、サイズ、生産量、及び体重の変化を考慮した後の、動物の実際の飼料摂取量と予測飼料摂取量の間の差として定義される。この形質は、授乳当たりのポンド数で表され、より少ない数が、より良いと考えられる。飼料節約量（ＦＳＡＶ）は、体重及び残留飼料摂取量に基づいて、授乳中に節約された食物のポンド数で表される。
【0047】
本明細書で使用される場合、予測伝達能力の種類（ＰＴＡＴ又はＴＹＰＥ）は、基礎集団の物理的コンフォメーションからの点数の差として表される。娘の最終スコアは、品種分類器によって収集される。次いで、生スコアをウシの年齢に合わせて調整し、これを使用して、ＰＴＡの種類（ＰＴＡＴ）を導出する。これらのＰＴＡＴは、基礎集団からの点数の差として表される。ＴＹＰＥ値は、時間経過に伴う異なる基礎集団にわたる比較を可能にするために正規化される。より高い数値は、より望ましい物理的コンフォメーションと相関する。
【0048】
本明細書で使用される場合、以前は「乳製品の特徴」として知られていたＳＴＡ乳製品形態（ＤＦ又はＤＦＭ）は、「乳汁分泌」の指標を提供し、乳牛が肉及び脂肪を介して飼料から乳を生産する能力を反映する、骨の鋭さ、角度、平坦度、肋骨の開口度、及び首の長さを指す。
【0049】
乳牛は、当該技術分野で周知である線形記述形質として一般に知られる基準を使用して評価され、記載される。これらの線形記述形質としては、身長（ＳＴＡ）、強度（ＳＴＲ）、体の深さ（ＢＤＥ）、尻の角度（ＲＰＡ）、股関節の位置、坐骨幅、前乳房の高さ（ＦＴＡ）、前乳房の付着（ＦＵＡ）、後乳房の高さ（ＲＵＨ）、後乳房の幅（ＲＵＷ）、懸垂靭帯（ＵＣＬ）、乳房の深さ（ＵＤＰ）、前乳頭の配置（ＦＴＰ）、後乳頭の配置（ＲＴＰ）、乳頭の長さ（ＴＬＧ）、乳房の傾斜（ＵＴ）、後肢（側望）（ＲＬＳ）、後肢（後望）（ＲＬＲ）、肢蹄スコア（ＦＬＳ）、蹄の角度、寛幅（ＴＲＷ）、及びボディコンディションが挙げられる。これらの線形形質基準は、当業者に周知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｈｅ Ｄａｉｒｙ Ｃｏｗ Ｔｏｄａｙ：Ｕ．Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｓｉｎｃｅ １９８０，Ｓ．Ｌ．Ｓｐａｈｒ ａｎｄ Ｇ．Ｗ．Ｏｐｐｅｒｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ９，Ｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｉｔ ａｐｐｒａｉｓａｌを参照されたい。
【0050】
線形記述形質は、形質の種類の伝達パターンを記述するプロセスを簡素化するために、しばしば複合指数に組み合わされる。複合指数としては、肢蹄複合（ＦＬＣ）、乳房複合指数（ＵＤＣ）、身体（ＢＦ）複合指数、身体サイズ複合（ＢＳＣ）指数、乳生産能（ＤＣ）複合指数、及び体重複合（ＢＷＣ）が挙げられる。ＦＬＣ複合は、後肢、側望、蹄の角度といった線形形質の組み合わせである。ＵＤＣには、前乳房の付着、後乳房の高さ、後乳房の幅、乳房の深さ、懸垂靭帯、前乳頭の配置、及び後乳頭の配置といった線形形質が組み込まれている。ＵＤＣは、ＵＤＣと群生活との間の関連が最大化されるように設計される。より大きな値は、より長い群寿命と関連付けられる。乳房複合指数は、強い付着を有する十分に形成された大容量の乳房を記述する。高いＵＤＣを有する育種動物を使用すると、体細胞スコアが低下し、乳汁が問題なく、より多くの乳を保持することができる娘が生じる。ＢＦ指数は、身長、体の深さ、尻の角度、及び坐骨幅の線形形質を組み合わせたものである。ＤＣ複合は、乳製品形態及び強度の線形形質を組み合わせたものである。ＢＳＣは、身長、強度、体の深さ、及び坐骨幅の４つの線形形質から計算される別の複合指数である。ＢＳＣが１．０ＳＴＡ増加する毎に、成熟体重の２４ポンドの予測される増加と相関する。ＢＷＣは、体重を予測するために様々な線形形質から計算される。これらの形質としては、身長、強度、乳製品形態、及び坐骨幅が挙げられる（Ａｕｇｕｓｔ ２０２１ Ｓｉｒｅ Ｓｕｍｍａｒｙのように）。
【0051】
本明細書で使用される場合、「生産寿命」（ＰＬ）は、乳牛が初めて出産した後に群においてどれくらい生存するかの尺度である。これは、分娩日、屠殺又は死亡日、及びＤＨＩ検査のウシの各授乳期における乳の日（乾乳日に基づく）に基づいている。生産寿命（ＰＬ）のＰＴＡは、搾乳ストリングでの寿命の追加月数として表される。ＰＬが大きい雄ウシは、生産寿命が長い娘の種雄ウシになると予想される。ＰＬを計算するために使用されるデータには、実際の寿命、授乳期、及びＰＬと相関する形質からのデータを補完した屠殺データが含まれる。ピーク生産の数ヶ月間最大のＰＬクレジットを割り当て、最初の授乳よりも後の授乳にわずかにより多くの信用を与えることによって、ＰＬはウシの長寿の経済的影響を反映している。ＰＬの遺伝性は０．０８５と低く、その形質は、乳牛の生涯の後半に発現する。したがって、ＰＬは、低い遺伝性と晩年の形質の発現のため、選択によって改善することが困難な形質である。ＰＬを計算するための方法は、当該技術分野において既知である。ＶａｎＲａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６：２７５８－２７６４（１９９３）、ＶａｎＲａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７８：６３１－６３８（１９９５）、Ｗｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８１：２０４０－２０４４（１９９８）を参照されたい。
【0052】
本明細書で使用される場合、「体細胞スコア」（ＳＣＳ）は、体細胞数（ＳＣＣ）から計算される。乳が生産されると、少数の細胞も乳に移される（乳を構成するタンパク質、脂肪、水、ミネラルとともに）。全ての乳には、これらの細胞の一部が含まれているが、非常に多く存在する場合には、乳の品質が影響を受ける。乳加工業者は、農家から購入する牛乳において許容され得る細胞の濃度を制限する。また、乳房への刺激が高いＳＣＳを引き起こす可能性があるため、個々のウシのＳＣＳを知ることは、農家がウシが健康であるかどうかを判断するのに役立ち得る。健康管理はＳＣＳに最も大きな影響を与えるが、一部の人々が耳感染症を引き起こす可能性が高いことを受け継ぐのと同様に、ウシは、より高いＳＣＳを引き起こす形質を受け継ぐ可能性がある。乳又はタンパク質産生のような形質に次いで、ＳＣＳは、低い遺伝性を有する。体細胞スコアＰＴＡは、乳房炎抵抗性の指標として、最初の５回の授乳からの体細胞スコアデータを使用して計算される。最も低いＰＴＡ ＳＣＳを有する雄ウシは、ＳＣＳが最も低く、体細胞数（ＳＣＣ）が最も低く、乳房炎の症例が最も少ない娘の種ウシとなると予想される。本開示は、ｄａｍ親と比較して子孫における低減されたＳＣＳを提供し、これを含む。
【0053】
本明細書で使用される場合、「受胎能力指標」（ＦＩ）は、雌ウシとして妊娠する能力、授乳中のウシとして妊娠する能力、並びに再び周期を開始し、熱を示し、妊娠し、及び妊娠を維持するウシの全体的な能力といったいくつかの生殖要素を１つの全体的な指数に組み合わせる。受胎能力指数は、次の式から導出される。受胎能力指数＝１８％の雌ウシ受胎率（ＨＣＲ）＋１８％のウシ受胎率（ＣＣＲ）＋６４％の娘の妊娠率（ＤＰＲ）。
【0054】
本明細書で使用される場合、「種雄ウシの分娩の容易さ」（ＳＣＥ）は、特定の種雄ウシからの子ウシが多かれ少なかれ容易に生まれる傾向を測定し、雌ウシの最初の子ウシの困難な出産の割合として１～５のスケールで表される（１が「問題なし」として分類される）。ホルスタインの難産率は、約８％である。一般に、８％以下のＳＣＥを有する雄ウシは、「分娩の容易な」雄ウシとみなされる。数が小さい方が好ましい。
【0055】
本明細書で使用される場合、「娘の分娩の容易さ」（ＤＣＥ）は、ＳＣＥと同様に、特定の動物からの子ウシの分娩が多かれ少なかれ容易に生じる傾向の測定値である。数が小さい方が好ましい。
【0056】
本明細書で使用される場合、「サービス種雄ウシの死産」（ＳＳＢ）は、種雄ウシから予想される死産した子ウシの割合を表す。死産の遺伝的基礎は、８％である。
【0057】
本明細書で使用される場合、「早期の最初の分娩」（ＥＦＣ）は、平均とは異なる、雄ウシの子孫が出産すると予想される日数の逆数である。例えば、雄ウシの娘が、平均より２日早く（平均から－２日目に）出産した場合、雄ウシのＥＦＣは、＋２．０であろう。
【0058】
本明細書で使用される場合、「娘の死産」（ＤＳＢ）は、種雄ウシからの子ウシが死産する傾向であり、ホルスタイン品種のみに適用される。以下で考察されるように、ＤＳＢは、特定のハプロタイプに関連し得る。
【0059】
育種家は、子孫の生涯にわたるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ動物の価値の評価のためのメリットの尺度を開発した。様々なメリットの尺度は、動物の子孫がその生涯にわたって提供する追加の純利益を説明するものである。典型的な乳業事業の収入及び費用が推定され、その結果、全体的な純利益の尺度を計算することができる。生涯収益性の３つの異なる値（ネット、フルード、及びチーズ）が利用可能である。数式間の主な違いは、構成要素に重点が置かれていることである。育種時には、生産者は、その地域での乳の支払いに最も近い指数を選択する。ネットメリットは、米国全土の将来の予想平均乳価格に基づく。フルードメリットは、タンパク質の支払いを受けていない生産者のためのものである。フルードメリットの式では、追加のタンパク質を産生するために追加の飼料が必要であるため、タンパク質に負の値が置かれる。追加のタンパク質に対する直接の支払いがなければ、これは負の値になる。チーズメリットは、チーズ工場に直接的に乳を販売する農家に適している場合がある。
【0060】
本明細書で使用される場合、チーズメリット（ＣＭ＄）は、チーズ又は他の乳製品に製造されるように販売される乳に適切な経済的価値を組み込んだ指数である。この式には、ＭＩＬＫ、ＰＴＡＦ、ＰＴＡＰ、及び様々な健康及び種類の形質が組み込まれている。ＣＭ＄の考察は、ｕｓ．ａｌｔａｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ．で入手可能である。
【0061】
本明細書で使用される場合、ハプロタイプは、（連結された）基として一緒に伝達される染色体上の異なる位置における対立遺伝子（ＤＮＡ配列）の組み合わせである。ハプロタイプテストは、受胎能力及び他の形質に影響を与える劣性遺伝子障害の識別を提供するために利用可能である。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｔｈａｔ ａｆｆｅｃｔ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｒａｉｔｓ，”ＵＳＤＡ ＡＩＰ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ３（０９－１３）（２０１８年１２月１日に更新された）を参照されたい。特定のハプロタイプは、本明細書に提供されるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ生殖質において望ましくない。劣性遺伝子ハプロタイプがホモ接合型である場合、受胎能力及び他の重要な形質が有意に影響を受ける。本開示の生殖質は、群を改善し、これらの望ましくないハプロタイプの存在を低減するために使用することができる。
【0062】
劣性遺伝子ハプロタイプ変異には、無角（角の欠如である）、すなわちハプロタイプＨＨＰが含まれる。かつて、これは、望ましくない遺伝学と密接に関連していたため、望ましくない表現型とみなされた。しかしながら、動物福祉は、損傷を防ぐために動物の角を取り除く必要があり、最近の育種の進歩は、形質を、関連する貧弱な生産表現型から分離し、それをより望ましい形質にしている。別の劣性遺伝子ハプロタイプは、赤色コートカラーであり、ホルスタインが白黒であると想定されるために、望ましくないだけであり、赤色コートカラーは、ハプロタイプＨＢＲ、ＨＤＲ、及びＨＨＲによって引き起こされ得る。対照的に、いくつかのハプロタイプは、生存可能なホモ接合性の子孫を産生しないため、望ましくない。ホルスタインウシの場合、ＨＨ０、ＨＨ１、ＨＨ２、ＨＨ３、ＨＨ４、ＨＨ５、及びＨＨ６。ＨＨ０は、胚の死、死産及び他の変形を引き起こすホルスタインウシにおける先天性遺伝性致死性欠損症であるＢｒａｃｈｙｓｐｉｎａ症候群（ＨＨ０）を引き起こす。（例えば、ＴＹ）。ＨＨ１は、ＡＰＡＦ１遺伝子におけるナンセンス変異である。ＨＨ３は、単一アミノ酸置換を引き起こすＳＭＣ２遺伝子中のＳＮＰによって引き起こされる。ＨＨ４は、ＧＡＲＴ遺伝子の遺伝的病変によって引き起こされる。ＨＨ５は、ＴＦＢ１Ｍ遺伝子の遺伝的病変によって引き起こされる。ＨＨ６は、ＳＤＥ２テロメア維持ホモログ遺伝子内のＡＴＧ開始コドンの破壊によって引き起こされる。ＨＨ２に関連する遺伝子欠損は、まだ不明である。
【0063】
ウシは、メンデル様式で遺伝する単遺伝性疾患であるいくつかの遺伝性疾患に苦しんでいる。様々な遺伝子疾患は、当該技術分野において既知である。例えば、各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇａｒｒｉｃｋ ａｎｄ Ｒｕｖｉｎｓｋｙ，“Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃａｔｔｌｅ，”２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＵＫ ２０１５を参照されたく、また、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｃａｔｔｌｅ ｉｎ Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，”ＩＳＢＮ ９７８０９５８３６３４４７ Ｊｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｃａｔｔｌｅ，”Ｃｈａｐｔｅｒ ２１も参照されたい。
【0064】
低カルシウム血症（乳熱）、第四胃変位（ＤＡ）、ケトーシス（ＫＥＴＯ）、乳腺炎（ＭＡＳＴ）、子宮筋層炎（ＭＥＴＲ）、及び胎盤停滞（ＲＥＴＰ）を含む、ホルスタインウシにおいていくつかの他の健康形質が追跡される。ＭＦＥＶは、授乳中のウシが授乳の早い段階で過剰なカルシウムを分泌する障害である。ＤＡは、ウシの第四胃（「真の胃」）に気体を充満させ、ウシの腹部の床部分から内腔の片側に移動させる障害であり、獣医の介入を必要とする状態である。ＫＥＴＯは、一般に、又は特に牛乳を作るために、エネルギー摂取量よりも多くのエネルギーを使用するウシによって引き起こされる疾患である。ＭＡＳＴは、ウシの乳房の炎症であり、細菌によって引き起こされることが多い。ＭＥＴＲは、ウシの子宮の子宮内膜及び筋肉層の両方の炎症である。ＲＥＴＰは、胎児の胎盤のウシ側が、子ウシ側から分離できず、胎児の膜及び他の組織が出生後２４時間排出されない場合である。これらの形質の各々は、品種平均耐性に対する割合の増加で表される。（平均耐性は、発生率を１００％から差し引くことによって計算される。）例えば、雄ウシのＭＦＥＶが＋０．５の場合、雄ウシの娘は、品種平均よりも０．５％高い乳熱に対する抵抗力を持つと予想される。ホルスタイン動物についてゲノム及び遺伝子評価が提供され、各形質の評価は、品種平均を上回る又は下回る耐性点の割合で表される。
【0065】
ブタ
ウシの育種とは対照的に、ブタの選択は、あまり集中的ではない。各育種家は、その育種目標に応じて、独自のカスタム指数を使用する。多くは、「最良線形不偏予測」又はＢＬＵＰ統計モデルに依存している。形質指数を計算するためのほとんどのソフトウェアは、特定の育種家のためにカスタマイズされるが、公的に利用可能なプログラムは、当該技術分野で知られている。ゲノムマーカーをモデルにもたらすＧＢＬＵＰも含む、いくつかの当技術分野で認識されている統計モデルが存在する（Ｓｔｏｃｋ，Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０２０、１１：５６８）。これらのモデルを使用して、概算育種値（ＥＢＶ、Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．による米国出願第２００５／０２２１３２２号で公開される）を予測する。どの動物が、育種プログラムの目標を達成する子孫につながるかを予測するのは、当業者の知識の範囲内である。ウシと同様に、配偶子を収集する方法は、当該技術分野で既知である。
ウシの育種とは対照的に、ブタの選択は、あまり集中的ではない。各育種家は、その育種目標に応じて、独自のカスタム指数を使用する。多くは、「最良線形不偏予測」又はＢＬＵＰ統計モデルに依存している。形質指数を計算するためのほとんどのソフトウェアは、特定の育種家のためにカスタマイズされるが、公的に利用可能なプログラムは、当該技術分野で知られている。ゲノムマーカーをモデルにもたらすＧＢＬＵＰも含む、いくつかの当技術分野で認識されている統計モデルが存在する（Ｓｔｏｃｋ，Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０２０、１１：５６８）。これらのモデルを使用して、概算育種値（ＥＢＶ、Ｆｏｘ ｅｔ ａｌ．による米国出願第２００５／０２２１３２２号で公開される）を予測する。どの動物が、育種プログラムの目標を達成する子孫につながるかを予測するのは、当業者の知識の範囲内である。ウシと同様に、配偶子を収集する方法は、当該技術分野で既知である。
【0066】
胚の作製
多数の胚は、インビトロ受精（ＩＶＦ）又は人工授精（ＡＩ）などの当該技術分野で既知の方法を介して作製される。ＡＩ胚は、当該技術分野で知られている方法（例えば、フラッシング）を使用して収集され、次に胚盤胞段階の胚が収集され、次の工程に進む。ＩＶＦ胚を観察し、適切なときにプロセスの次の工程に送ることができる。
多数の胚は、インビトロ受精（ＩＶＦ）又は人工授精（ＡＩ）などの当該技術分野で既知の方法を介して作製される。ＡＩ胚は、当該技術分野で知られている方法（例えば、フラッシング）を使用して収集され、次に胚盤胞段階の胚が収集され、次の工程に進む。ＩＶＦ胚を観察し、適切なときにプロセスの次の工程に送ることができる。
【0067】
胚性幹細胞の生成
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、例えば、内部細胞塊（ＩＣＭ）を切除し、細胞を解離させ、次いで、それらを基質上に再播種することによって生成することができる。代替的に、又は加えて、全胚、又はそれらから成熟した胚盤胞を基質上に播種して、胚性幹細胞になるようにプレートを置くことができる。透明帯は、酵素消化又はレーザ補助孵化を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって除去することができる。
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、例えば、内部細胞塊（ＩＣＭ）を切除し、細胞を解離させ、次いで、それらを基質上に再播種することによって生成することができる。代替的に、又は加えて、全胚、又はそれらから成熟した胚盤胞を基質上に播種して、胚性幹細胞になるようにプレートを置くことができる。透明帯は、酵素消化又はレーザ補助孵化を含む、当該技術分野で既知の任意の方法によって除去することができる。
【0068】
内部細胞塊の切除
種間で類似している様々な技術を使用して、胚盤胞から内部細胞塊を単離することができる。ＩＣＭ細胞は、顕微鏡手術、酵素消化、免疫手術、又は機械的分離を使用して単離することができる。
種間で類似している様々な技術を使用して、胚盤胞から内部細胞塊を単離することができる。ＩＣＭ細胞は、顕微鏡手術、酵素消化、免疫手術、又は機械的分離を使用して単離することができる。
【0069】
胚盤胞は、ＨＥＰＥＳ－ＴＬ培地などの好適な細胞成長培地中に配置することができ、次いで、顕微鏡手術は、例えば、限定されないが眼科用ハサミを使用して、当該技術分野で知られている任意の技術を介して（例えば、Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，２１，６８７－６９９）、又は倒立顕微鏡（例えば、Ｎｉｋｏｎ製のＴＥ２０００－Ｕ、例えば、Ｂｏｇｌｉｏｔｔｉ，Ｙ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１８，１１５，２０９０－２０９５を参照されたい）に取り付けたマイクロマニピュレーション機器（例えば、Ｎｉｋｏｎ／Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ製のＮＴ８８－Ｖ３高精度マイクロマニピュレータ）に接続したマイクロブレードを使用して、実行することができる。
【0070】
胚盤胞の透明帯は、トロホブラストがマイクロドロップに分散し始めるまで、プロナーゼ、トリプシン、又はそれらの組み合わせなどを介した酵素消化によって除去することができる。次いで、ＩＣＭ細胞を幹細胞培養培地中で洗浄し、２本の細かい針及び引っ張られたマウスマイクロピペットを用いて単離することができる（例えば、Ｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，２００３，６５，４２９－４３４を参照されたい）。
【0071】
あるいは、ＩＣＭは、Ｔｙｒｏｄｅの溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの商業的供給源から入手可能）、又はプロナーゼ溶液中で胚盤胞をインキュベートして、透明帯を除去し、その後、栄養外胚葉（ＴＥ）の抗体及び補体系が媒介する溶解によって、免疫手術技術を使用して単離することができる。胚盤胞を、１０～２０％の抗ブタ血清（ブタ用）又は抗ウシ血清（ウシ用）を補充した幹細胞培養培地中で３０分間～１時間インキュベートすることができる。血清は、ウサギ、ヤギ、又はラットなどの任意の好適な宿主から必要な種に対して上昇させる抗体であり得る。血清を洗い流すことができ、次いで、細胞を、１０～２０％の補体血清を補充した幹細胞培養培地中で３０分間～１時間インキュベートすることができる。様々な供給源からの補体血清は市販されており、供給源としては、モルモット補体が挙げられる。処理した後、ＩＣＭは、次いで、ピペッティングによって溶解トロホブラスト細胞から単離され、幹細胞培養培地中で複数回洗浄することができる（例えば、Ｈｏｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６，６，２５８３８を参照されたい）。機械的分離のために、透明帯を含まない胚盤胞は、自発的孵化プロセス及び人工孵化プロセスの両方によって得られ、次いで３回洗浄することができる。次いで、ＩＣＭは、幹細胞培養培地中で細かく引っ張られたガラス毛細管ピペットを用いて穏やかにピペッティングすることによって、栄養外胚葉から分離することができる（例えば、Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．，２０１４，１５，５１９－５２８を参照されたい）。
【0072】
代替的に、胚性幹細胞培養物は、最初に全胚盤胞を配置することによって確立することができる。透明帯は、プロナーゼ又はＴｙｒｏｄｅの溶液（上記）を介して除去することができ、その後、全胚盤胞を、以下に記載されるように培地中のフィーダー細胞上に配置することができる。培地は、ＴＥ成長ではなくＥＳＣ成長を促進するように配合することができる。したがって、ＥＳＣは成長し、ＴＥの成長は制限される。したがって、時間が経つにつれて、ＴＥ細胞は競合しなくなり、培養物中に存在しなくなる。
【0073】
代替的に、ＩＣＭは、ＴＥのレーザ支援による除去によって単離されてもよく、これは次のように実行され得る。胚盤胞は、ＩＣＭが９時の位置（視野に対して）に配置されている２つの保持ピペットによって固定され得る。適切な張力が確立されると、およそ１０個の赤外線レーザパルス（３００ｍＷ×１ｍｓ、ＺＩＬＯＳ－ＴＫ（商標）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｔｈｏｒｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を発射して、胚盤胞を、２つの不均等な部分に分割することができ、より小さい方は、ＩＣＭからなり、より大きい方は、トロホブラスト細胞のみで構成される。切除されたＩＣＭ細胞は、フィーダー細胞上に、又はタンパク質コーティングされた培養容器内に直接配置することができる。
【0074】
ウシ胚性幹細胞
単離されたら、単離されたＩＣＭ細胞を、ｉ）フィブロネクチン、マトリゲル、若しくはビトロネクチンなどの有機マトリックスでコーティングされたか、ｉｉ）脱細胞化細胞外マトリックス（ＥＣＭ、ブタゼラチン、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンの混合物）でコーティングされたか、又はｉｉｉ）不活性化フィーダー細胞とともに播種された培養皿に配置する。好適な不活性化フィーダー細胞としては、ガンマ線照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はマイトマイシン処理されたＭＥＦなどの有糸分裂不活性化フィーダー細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、ヒト成人卵管上皮細胞、ヒト真皮線維芽細胞、ヒト羊膜間葉系細胞、ヒト羊膜上皮細胞、マウス骨髄間質細胞、マウス羊水球、ＭＥＦ ＳＮＬ株、ヒト羊水球、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト羊水間葉系細胞、脱落膜由来間葉系細胞の細胞周囲基質、又は別の種類の不活性化フィーダー細胞などが挙げられる。不活性化ＭＥＦ細胞は、６ウェルプレートのウェル当たり５７０，０００～６５０，０００個の細胞、１２ウェルプレートのウェル当たり２２８，０００～３５０，０００個の細胞、又は４ウェルプレートのウェル当たり１００，０００～１１８，０００個の細胞でプレーティングすることができる。プレーティングされたＭＥＦは、７日間にわたって良好である。細胞を、成長因子ＦＧＦ２及びＴＧＦβを完全に欠く基礎培地中で培養する。
単離されたら、単離されたＩＣＭ細胞を、ｉ）フィブロネクチン、マトリゲル、若しくはビトロネクチンなどの有機マトリックスでコーティングされたか、ｉｉ）脱細胞化細胞外マトリックス（ＥＣＭ、ブタゼラチン、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンの混合物）でコーティングされたか、又はｉｉｉ）不活性化フィーダー細胞とともに播種された培養皿に配置する。好適な不活性化フィーダー細胞としては、ガンマ線照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はマイトマイシン処理されたＭＥＦなどの有糸分裂不活性化フィーダー細胞、ヒト胎児筋細胞、ヒト胎児線維芽細胞、ヒト成人卵管上皮細胞、ヒト真皮線維芽細胞、ヒト羊膜間葉系細胞、ヒト羊膜上皮細胞、マウス骨髄間質細胞、マウス羊水球、ＭＥＦ ＳＮＬ株、ヒト羊水球、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト羊水間葉系細胞、脱落膜由来間葉系細胞の細胞周囲基質、又は別の種類の不活性化フィーダー細胞などが挙げられる。不活性化ＭＥＦ細胞は、６ウェルプレートのウェル当たり５７０，０００～６５０，０００個の細胞、１２ウェルプレートのウェル当たり２２８，０００～３５０，０００個の細胞、又は４ウェルプレートのウェル当たり１００，０００～１１８，０００個の細胞でプレーティングすることができる。プレーティングされたＭＥＦは、７日間にわたって良好である。細胞を、成長因子ＦＧＦ２及びＴＧＦβを完全に欠く基礎培地中で培養する。
【0075】
好適な培地としては、ＣＴＦＲ培養培地（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，６３７－６４６）、ＥＳ培養培地（Ｗｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６ ６，２８３４３）、改変ＴｅＳＲｌ（例えば、ＴＧＦＰを欠く）、ＴｅＳＲｌ、Ｎ２Ｂ２７、又はＥ６（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１５１６４０９１から入手可能）が挙げられる。実施例２２には、改変Ｎ２Ｂ２７培地が記載される。簡潔に述べると、この培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、神経基礎培地、０．５倍のＢ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１倍のＮ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１倍のＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１倍のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１ｍＭの２－メルカプトエタノールを含有する。培地に、ウィングレス統合シグナル伝達（「ＷＮＴシグナル伝達」）の阻害剤、及びｂＦＧＦ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、又はＳＵＮ １１６０２が補充され得る。様々なシグナル伝達分子及び小分子が、ＷＮＴシグナル伝達を阻害することが当該技術分野で既知であり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）などの供給業者から市販されている。そのような分子としては、ｉｗｒ－１、ｉｗｒ－１－ｅｎｄｏ、ｉｗｐ－２、Ｂｏｘ５、ｉＣＲＴ３、スクレロスチン、ｄｋｋ２、ｄｋｋ１、ＬＦ３、ＣＣＴ０３６４７７、ＦＨ５３５、カルダモニン、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ニクロサミド、ＸＡＶ－９３９、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４、ＣＰ２１Ｒ７、ＮＣＢ－０８４６、ＰＮＵ－７４６５４、サリノマイシン、ＫＹ０２１ １１、ＷＩＫＩ４、ＰＲＩ－７２４、ＫＹＡ１７９７Ｋ、２，４－ジアミノ－キナゾリン、Ａｎｔ １．４Ｂｒ、Ａｎｔ １．４０、アピキュラレン、バフィロマイシン、ＥＴＣ－１５９、Ｇ００７－ＬＫ、Ｇ２４４－ＬＭ、ＩＷＲ、ＮＳＣ６６８０３６、ＰＫＦ１ １５－５８４、ピルビニウム、ケルセチン、シゾカオールＤ、ＢＣ２０５９、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態は、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ及び２．５μＭのＩＷＲを補充したＮ２Ｂ２７培地である。
【0076】
６～７日培養した後、ＩＣＭの発芽後成長物を継代することができる。これは通常、細胞を酵素的に（例えば、プロナーゼ、トリプシン、又は組換えトリプシンで）又は機械的に（上記で考察されているように）解離し、ｉ）培養培地及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、又はｉｉ）培養培地、ＦＢＳ、及び血清代替品のいずれかを用いて、新しく調製されたフィーダー細胞上に再播種することを含む。血清代替品は、当該技術分野で周知であり、一般に、補助アミノ酸、抗酸化剤、並びにインスリン、トランスフェリン、及び脂質豊富なアルブミンなどのタンパク質を含有する。血清代替品は、微量元素も含有してもよい。市販の血清代替品としては、Ｎ２、Ｂ２７、及びＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ、商標はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ似対するものである）が挙げられる。血清代替品の完全な考察は、例えば、公開された出願ＵＳ２００２／００７６７４７に見出すことができる。好適なＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２、ＡＳ１８９２８０２、ファスジル塩酸塩、ＧＳＫ ２６９９６２、ＧＳＫ ４２９２８６、Ｈ １１５２、Ｇｌｙｃｌｙｌ－Ｈ １１５２、ＨＡ １１００、ＯＸＡ ０６、ＲＫＩ １４４７、ＳＢ ７７２０７７Ｂ、ＳＲ ３６７７、ＰＤ－３２５９０１、及びＴＣ－Ｓ ７００１が挙げられる。継代された細胞を、同じ培地及びフィーダー細胞を含有する新しいウェルに播種することができる。確立されたら、培地は、毎日交換することができる。細胞を、４～５日毎に１：１０～１：２０に分割することができる。細胞を、加湿ＣＯ２インキュベータ内で３７℃～３８．５℃で維持することができる。
【0077】
ブタ胚性幹細胞
単離されたＩＣＭ細胞を、ＳＴＯ又はＭＥＦ細胞などの有糸分裂不活性化し、かつ代謝活性のフィーダー細胞上で培養することができる。これらのフィーダー細胞は、ガンマ線照射又はマイトマイシンＣ処理を使用して有糸分裂不活性化することができる。他の例示的なフィーダー細胞は、上記に記載されている。ＩＣＭ細胞を、発芽後成長物が現れるまで、加湿雰囲気中、５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び９０％Ｎ２中、３７．０℃～３８．５℃で培養することができる。（Ｈｏｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６，６，２５８３８、Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，２１，６８７－６９９、Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，２００３，６５，４２９－４３４、Ｍｉｃｈａｌｓｋａ，Ａ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｕｎｉｔ１Ｃ．３における例示的な手順を参照されたい）。ｐＥＳＣ、ｐＥＳＬＣ、又はｐＥＰＳＣＭなどのいくつかの培地をこれらの培養に使用することができるが、これらに限定されない。
単離されたＩＣＭ細胞を、ＳＴＯ又はＭＥＦ細胞などの有糸分裂不活性化し、かつ代謝活性のフィーダー細胞上で培養することができる。これらのフィーダー細胞は、ガンマ線照射又はマイトマイシンＣ処理を使用して有糸分裂不活性化することができる。他の例示的なフィーダー細胞は、上記に記載されている。ＩＣＭ細胞を、発芽後成長物が現れるまで、加湿雰囲気中、５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び９０％Ｎ２中、３７．０℃～３８．５℃で培養することができる。（Ｈｏｕ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１６，６，２５８３８、Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，２１，６８７－６９９、Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，２００３，６５，４２９－４３４、Ｍｉｃｈａｌｓｋａ，Ａ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｕｎｉｔ１Ｃ．３における例示的な手順を参照されたい）。ｐＥＳＣ、ｐＥＳＬＣ、又はｐＥＰＳＣＭなどのいくつかの培地をこれらの培養に使用することができるが、これらに限定されない。
【0078】
ｐＥＳＣは、低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨａｍのＦ－１０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１混合物である。この混合物は、２ｍＭのｌ－グルタミン、１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１％（ｖ／ｖ）のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）、及び２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ）を補充した１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を更に含む（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８，ｅ５２４８１、Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．，２０１４，１５，５１９－５２８、Ｙｕａｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１９，５，１０４）。
【0079】
別の公開されたブタ培地は、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ａｍｒｅｓｃｏ、３１５１Ｂ５５）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、０８５４０）、２０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト線維芽細胞成長因子－塩基性（ｒｈ－ｂＦＧＦ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ０２９１）、４０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト白血病阻止因子（ｒｈ－ＬＩＦ、Ｓｉｇｍａ、Ｌ－５２８３）、ヌクレオシド（０．０３ｍＭのアデノシン、０．０３ｍＭのグアノシン、０．０３ｍＭのシチジン、０．０３ｍＭのウリジン、及び０．０１ｍＭのチミジン、Ｓｉｇｍａ）、並びに１６％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭを含む。（Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，２００３，６５，４２９－４３４）。
【0080】
ブタ拡大潜在幹細胞培地（ｐＥＰＳＣＭ）は、５００ｍｌのＮ２Ｂ２７基礎培地：０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤及びＷＮＴアゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号４４２３）、０．３μＭのＷＨ－４－０２３（ＳＲＣ阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５４１３）、２．５μＭのＸＡＶ９３９（タンキラーゼ阻害剤、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）又は２．０μＭのＩＷＲ－１（ｗｎｔ阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、６５．０μｇ／ｍｌのビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０．０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＣＩ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、２０．０ｎｇ／ｍｌのアクチビン（ＳＣＩ）及び０．３％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）＋１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，２１，６８７－６９９）。
【0081】
改変Ｎ２Ｂ２７培地は、実施例２２に記載されており、ブタ胚性幹細胞の調製にも好適である。
【0082】
ブタ胚性幹細胞の調製及び維持に好適な培地は、ＧＳＫ３阻害剤、タンキラーゼ阻害剤、又はそれらの組み合わせを含み得る。当業者は、有効量の異なるＧＳＫ３阻害剤、例えば、限定されないが、市販の阻害剤ＡＲ－Ａ ０１４４１８、Ａ １０７０７２２、ＳＢ ４１５２８６、ＴＣＳ ２００２、３Ｆ８、ＴＤＺＤ ８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＢＩＯ－アセトキシム、インジルビン－３’－オキシム、ＴＷＳ １１９、ＴＣＳ ２１３１１、ＳＢ ２１６７６３、ＢＩＯ、炭酸リチウム、ケンパウロン、アルスターパウロン、及びＣＨＩＲ ９８０１４を認識するだろう。（これらの小分子は全て、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入して入手することができる）。更に、代替のタンキラーゼ阻害剤としては、ＡＺ ６１０２、ＪＷ ５５、ＴＣ－Ｅ ５００１、及びＷＩＫＩ４が挙げられ得る。好適な培地はまた、ＲＯＣＫ阻害剤及び／又はｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤を含んでもよい。好ましい実施形態は、実施例２２に記載されるＮ２Ｂ２７培地であり、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、及び１μＭのＰＤ０３２５９０１が補充されている。ＰＤ０３２５９０１は、６日後に抜き取ることができる。
【0083】
培養培地は、１～２日毎に交換することができる。一般に、細胞は、培養の５～８日後にコロニーを形成する。次に、胚由来コロニー形成細胞を、引っ張られたガラスピペットを使用して機械的に単離し、幹細胞培養培地中の新鮮なフィーダー細胞上に再播種することができる。代替的に、細胞を、トリプシン化プロセスを使用して除去することができる。細胞は、一般に、３～４日後に十分に画定されたコロニーを形成し、引っ張られたガラスピペット法又は５～７日毎のトリプシン化を介して定期的に継代され得る。細胞を、毎日培地を交換しつつ、加湿雰囲気中、５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び９０％Ｎ２中、３７～３８．５℃で培養することができる。
【0084】
幹細胞を、アルカリホスファターゼアッセイ、ＥＳＣ特異的ｍＲＮＡ及びタンパク質ベースのマーカー分析、並びに／又は胚様体形成、自発的分化、及び奇形腫形成アッセイを使用して検証することができる（例示的な方法については、Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８，ｅ５２４８１、Ｊｕｎｇ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．，２０１４，１５，５１９－５２８、Ｙｕａｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１９，５，１０４を参照されたい）。
【0085】
確立されたＥＳＣはまた、プライミングされたＥＳＣと比較して、ナイーブ（真のＥＳＣ）としてその状況を決定するために評価されてもよく、又はナイーブＥＳＣにおけるｍＲＮＡ（ＭＨＣ Ｉ抗原、ＸＩＳＴ）及びタンパク質（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）ベースのマーカーの低い発現、若しくは発現しないことに基づいてプライミングされてもよい（Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２０１９，３３，９３５０－９３６１を参照されたい）。
【0086】
ＥＳＣの遺伝子型決定
各幹細胞株のアリコートを、遺伝子型決定に使用するために採取することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子検査が同じ胚由来の細胞の一部に対して行われている間に、胚を培養してもよい。検査結果が陽性である場合、培養された胚は、子孫の産生のためにレシピエントに移すことができる。代替的に、これらの陽性胚からの細胞を、核移植プロセス、又は当該技術分野で既知の任意の他のプロセスで使用して、遺伝的に優れた動物を産生し得る。様々な実施形態では、胚性細胞又は胚性幹細胞の拡張し、凍結させるための方法が開示される。拡張した細胞の一部分に対して、遺伝子検査を行ってもよい。検査結果が好ましい場合、同じ胚からの残りの細胞を解凍し、これを使用して子孫を産生してもよい。別の実施形態では、生検試料は、受精後約３～７日間培養された胚から得られてもよい。胚生検の一般的な方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｐｏｌｉｓｓｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，２０１０，９３，７８３－７８８及びＬｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００１，５６，１３８３－１３９２に開示されている。生検された細胞を個別に培養して、細胞を約２～１０日間、又は更に長く拡張させてもよい。生検試料からの拡張した細胞は、残りの胚が培養される間、全ゲノム解析（ＷＧＡ）又は遺伝子型決定などの遺伝子検査を受けてもよい。多重置換増幅（ＭＤＡ）は、ＷＧＡ技術の一種であり、これを使用して、分析のために生検からのＤＮＡの量を増加させ得る（例えば、Ｌａｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３，１０１，２４－２９を参照されたい）。
各幹細胞株のアリコートを、遺伝子型決定に使用するために採取することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子検査が同じ胚由来の細胞の一部に対して行われている間に、胚を培養してもよい。検査結果が陽性である場合、培養された胚は、子孫の産生のためにレシピエントに移すことができる。代替的に、これらの陽性胚からの細胞を、核移植プロセス、又は当該技術分野で既知の任意の他のプロセスで使用して、遺伝的に優れた動物を産生し得る。様々な実施形態では、胚性細胞又は胚性幹細胞の拡張し、凍結させるための方法が開示される。拡張した細胞の一部分に対して、遺伝子検査を行ってもよい。検査結果が好ましい場合、同じ胚からの残りの細胞を解凍し、これを使用して子孫を産生してもよい。別の実施形態では、生検試料は、受精後約３～７日間培養された胚から得られてもよい。胚生検の一般的な方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｐｏｌｉｓｓｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，２０１０，９３，７８３－７８８及びＬｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００１，５６，１３８３－１３９２に開示されている。生検された細胞を個別に培養して、細胞を約２～１０日間、又は更に長く拡張させてもよい。生検試料からの拡張した細胞は、残りの胚が培養される間、全ゲノム解析（ＷＧＡ）又は遺伝子型決定などの遺伝子検査を受けてもよい。多重置換増幅（ＭＤＡ）は、ＷＧＡ技術の一種であり、これを使用して、分析のために生検からのＤＮＡの量を増加させ得る（例えば、Ｌａｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３，１０１，２４－２９を参照されたい）。
【0087】
ウシ遺伝子型決定
当該技術分野で既知のウシ動物又はウシ細胞を遺伝子型決定するいくつかの方法がある。最も一般的なのは、５０ｋのウシＳＮＰチップである。ＥＳＣの遺伝子型は、ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０ ｖ３ ＢｅａｄＣｈｉｐマイクロアレイキット（ＢｅａｄＣｈｉｐ）を使用して、製造業者の指示に従って、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＴＳ ＢｅａｄＣｈｉｐ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）マイクロアレイシステムを使用して決定することができる。ＢｅａｄＣｈｉｐは、中央値３７．４ｋｂの間隔で、主要なウシ品種の種類のゲノム全体に均一に分布する５３，７１４の非常に有益なＳＮＰプローブを含んでいる。ＳＮＰプローブは、１８の一般的な牛肉及び乳製品品種で検証されている。ＢｅａｄＣｈｉｐは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標），Ｉｎｃ．、ＵＳＤＡ－ＡＲＳ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａの共同成果物である。２２，０００を超えるＳＮＰプローブは、経済的に重要な肉牛及び乳牛のプールされた集団に見出される新規のＳＮＰ遺伝子座を標的とする。ＢｅａｄＣｈｉｐは周知であり、当業者によって広く使用されている。ＧＥＮＥＳＥＥＫ（登録商標）ＧＥＮＯＭＩＣ ＰＲＯＦＩＬＥＲ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙアレイ（ＧＧＰ ＨＤ１５０Ｋ；１３９３７６ ＳＮＰ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）、ＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｂｏｖｉｎｅ ５０ｋチップ（４７８４３ ＳＮＰ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）、及びＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｂｏｖｉｎｅ １００ｋチップ（１００，０００ ＳＮＰ）を含むが、これらに限定されない、他の好適な遺伝子型決定チップ及び技術を使用することができる。
当該技術分野で既知のウシ動物又はウシ細胞を遺伝子型決定するいくつかの方法がある。最も一般的なのは、５０ｋのウシＳＮＰチップである。ＥＳＣの遺伝子型は、ＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０ ｖ３ ＢｅａｄＣｈｉｐマイクロアレイキット（ＢｅａｄＣｈｉｐ）を使用して、製造業者の指示に従って、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＴＳ ＢｅａｄＣｈｉｐ（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）マイクロアレイシステムを使用して決定することができる。ＢｅａｄＣｈｉｐは、中央値３７．４ｋｂの間隔で、主要なウシ品種の種類のゲノム全体に均一に分布する５３，７１４の非常に有益なＳＮＰプローブを含んでいる。ＳＮＰプローブは、１８の一般的な牛肉及び乳製品品種で検証されている。ＢｅａｄＣｈｉｐは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標），Ｉｎｃ．、ＵＳＤＡ－ＡＲＳ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａの共同成果物である。２２，０００を超えるＳＮＰプローブは、経済的に重要な肉牛及び乳牛のプールされた集団に見出される新規のＳＮＰ遺伝子座を標的とする。ＢｅａｄＣｈｉｐは周知であり、当業者によって広く使用されている。ＧＥＮＥＳＥＥＫ（登録商標）ＧＥＮＯＭＩＣ ＰＲＯＦＩＬＥＲ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙアレイ（ＧＧＰ ＨＤ１５０Ｋ；１３９３７６ ＳＮＰ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）、ＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｂｏｖｉｎｅ ５０ｋチップ（４７８４３ ＳＮＰ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）、及びＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｂｏｖｉｎｅ １００ｋチップ（１００，０００ ＳＮＰ）を含むが、これらに限定されない、他の好適な遺伝子型決定チップ及び技術を使用することができる。
【0088】
ウシ参照ゲノム（Ｂｏｖｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２６）：５２２－５２８）、Ｂｔａｕ（ｆｔｐ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／で入手可能）、及びＢｏｖｉｎｅ ＨａｐＭａｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍデータセット（Ｂｏｖｉｎｅ ＨａｐＭａｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２６）：５２８－３２ （２００９）ｂｏｖｉｎｅｈａｐｍａｐ．ｏｒｇでインターネットで入手可能）を含む、多種多様な公的に利用可能なリソースが当該技術分野で既知である。分析ツール及び配列データは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｎｉｏｎ’ｓ Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｔ Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ Ｎｏ．６１３６８９）及びＵＳＤＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅによって支援されているＢｏｖｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢＧＤ）によって維持される。ＢＧＤは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉにホストされている。
【0089】
ブタ遺伝子型決定
ウシ遺伝子型決定と同様に、当該技術分野で既知のブタ遺伝子型決定のいくつかの方法が存在する。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）は、およそ６４，０００のＳＮＰを含有するＰｏｒｃｉｎｅＳＮＰ６０ｖ２ ＢｅａｄＣｈｉｐを販売している。異なる育種家の目標及び指数を提供するために、このチップは、追加の２５，０００のユーザが供給するＳＮＰプローブのためのスペースも提供する。このチップは、様々な政府機関及び学術機関の研究者で構成されるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＳＮＰ Ｃｈｉｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍと共同で設計された。このチップは、上記で考察したように、マーカー支援ブタ選択を可能にするように設計される。それぞれ約８０，０００及び５１，０００のＳＮＰを含有する、ＧＥＮＥＳＥＥＫ（登録商標）ＧＥＮＯＭＩＣ ＰＲＯＦＩＬＥＲ（商標）（ＧＧＰ Ｐｏｒｃｉｎｅ ８０Ｋ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）及びＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｐｏｒｃｉｎｅ ５０ｋチップ（Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）を含むが、これらに限定されない、他の好適な遺伝子型決定チップ及び技術を使用することができる。他の遺伝子型決定チップ及び技術は、市販されており、当該技術分野で既知である。
ウシ遺伝子型決定と同様に、当該技術分野で既知のブタ遺伝子型決定のいくつかの方法が存在する。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）は、およそ６４，０００のＳＮＰを含有するＰｏｒｃｉｎｅＳＮＰ６０ｖ２ ＢｅａｄＣｈｉｐを販売している。異なる育種家の目標及び指数を提供するために、このチップは、追加の２５，０００のユーザが供給するＳＮＰプローブのためのスペースも提供する。このチップは、様々な政府機関及び学術機関の研究者で構成されるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＳＮＰ Ｃｈｉｐ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍと共同で設計された。このチップは、上記で考察したように、マーカー支援ブタ選択を可能にするように設計される。それぞれ約８０，０００及び５１，０００のＳＮＰを含有する、ＧＥＮＥＳＥＥＫ（登録商標）ＧＥＮＯＭＩＣ ＰＲＯＦＩＬＥＲ（商標）（ＧＧＰ Ｐｏｒｃｉｎｅ ８０Ｋ；Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）及びＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｐｏｒｃｉｎｅ ５０ｋチップ（Ｎｅｏｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ ＮＥ）を含むが、これらに限定されない、他の好適な遺伝子型決定チップ及び技術を使用することができる。他の遺伝子型決定チップ及び技術は、市販されており、当該技術分野で既知である。
【0090】
遺伝子型決定されたら、最も望ましい形質を有するＥＳＣ株は、ブタ及びウシの両方の育種のための選択工程と同様に選択される。特に望ましいＥＳＣ株を使用して、例えば、Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，６３６，１５５－１７７に記載されているような核移植方法を使用して動物を生成することができる。Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．に対して２０００年１月４日に登録された米国特許第６，０１１，１９７号も参照されたい。
【0091】
代替的に、又は加えて、ＥＳＣ株は、以下で考察されるインビトロ配偶子生成のために選択され得る。
【0092】
配偶子生成
胚性幹細胞株は、多能性であり、配偶子を含む多くの異なる細胞型を形成するように誘導することができる。配偶子生成中に産生される配偶子の種類は、細胞の遺伝子型に依存する。ＸＹを保有するＥＳＣ株を誘導して精子又は精子細胞様細胞を作製することができ、ＸＸを保有するＥＳＣ株を誘導して卵母細胞又は卵母細胞様細胞を作製することができる。
胚性幹細胞株は、多能性であり、配偶子を含む多くの異なる細胞型を形成するように誘導することができる。配偶子生成中に産生される配偶子の種類は、細胞の遺伝子型に依存する。ＸＹを保有するＥＳＣ株を誘導して精子又は精子細胞様細胞を作製することができ、ＸＸを保有するＥＳＣ株を誘導して卵母細胞又は卵母細胞様細胞を作製することができる。
【0093】
始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）へのＥＳＣ分化
これまで、始原生殖細胞様細胞は、中間細胞型を介して胚性幹細胞から誘導されてきた。これらの前駆細胞は、胚盤葉上層様細胞、形成細胞様細胞、中胚葉様細胞、又は胚外内胚葉（Ｘｅｎ）細胞などの様々な種類の多能性細胞である。始原生殖細胞様細胞に分化することができる任意の多能性細胞型を、前駆細胞として使用することができる。
これまで、始原生殖細胞様細胞は、中間細胞型を介して胚性幹細胞から誘導されてきた。これらの前駆細胞は、胚盤葉上層様細胞、形成細胞様細胞、中胚葉様細胞、又は胚外内胚葉（Ｘｅｎ）細胞などの様々な種類の多能性細胞である。始原生殖細胞様細胞に分化することができる任意の多能性細胞型を、前駆細胞として使用することができる。
【0094】
また、胚性幹細胞から直接ＰＧＣＬＣを作製することも企図されている。
【0095】
ウシ
胚性幹細胞は、（トリプシン中などで）酵素的に解離され、細胞外マトリックス又は基底ラミナ分子でプレコーティングされた皿上でフィーダーを含まないように培養することができる。好適な分子としては、コラーゲンＩＶ、ポリ－Ｌ－オルニチン、及びラミニン、ゼラチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンが挙げられる。例えば、ＰＢＳ中の１６．７μｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１２ウェルプレート内に配置し、３７℃～３８．５℃でインキュベートすることができる（Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ，１４６，５１９－５３２、Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０２０，１１７，２４１９５－２４２０４中の他の例示的な手順を参照されたい）。
胚性幹細胞は、（トリプシン中などで）酵素的に解離され、細胞外マトリックス又は基底ラミナ分子でプレコーティングされた皿上でフィーダーを含まないように培養することができる。好適な分子としては、コラーゲンＩＶ、ポリ－Ｌ－オルニチン、及びラミニン、ゼラチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンが挙げられる。例えば、ＰＢＳ中の１６．７μｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１２ウェルプレート内に配置し、３７℃～３８．５℃でインキュベートすることができる（Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ，１４６，５１９－５３２、Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０２０，１１７，２４１９５－２４２０４中の他の例示的な手順を参照されたい）。
【0096】
次いで、これらの培養ＥＳＣを、胚盤葉上層様細胞（ＥｐｉＬＣ）、形成様細胞、又は中胚葉様細胞などの前駆細胞に誘導することができる。ＥｐｉＬＣを作製するための例示的な方法は、アクチビンシグナル伝達誘導剤、ｂＦＧＦシグナル伝達誘導剤、インスリンシグナル伝達誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地中でＥＳＣを培養することである。各々の種類のシグナル伝達の誘導剤は、当該技術分野で既知であり、以下で考察する。代替的に、又は加えて、培養ｂＥＳＣを、ｂＦＧＦシグナル伝達誘導剤、アクチビンＡシグナル伝達誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達誘導剤／ＧＳＫ３阻害剤、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地中でウシ形成様細胞に誘導することができる。代替的に、又は加えて、ｂＥＳＣを、アクチビンＡシグナル伝達誘導剤及びｗｎｔシグナル伝達誘導剤／ＧＳＫ３阻害剤を含む無血清培地中で中胚葉様細胞に誘導することができる。更に、無血清培地は、血清代替品を含み得る。例示的な無血清培地としては、実施例２２及び実施例３３にそれぞれ詳細に記載されているＮ２Ｂ２７培地及びＧＫ１５培地が挙げられる。ウシ形成細胞及びウシ中胚葉様細胞の両方を、フィブロネクチンコーティングされたプレート上で、フィーダーを含まない状態で誘導することができる。例示的なアクチビンシグナル伝達誘導剤としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ノーダル、アラントラクトン、スタウプリミド（［９Ｓ－（９α，１０β，１１β，１３α）］－Ｎ－（２，３，１０，１１，１２，１３－ヘキサヒドロ－１０－メトキシ－９－メチル－１，３－ジオキソ－９，１３－エポキシ－１Ｈ，９Ｈ－ジイインドロ［１，２，３－ｇｈ：３’，２’，１’－ｌｍ］ピロロ［３，４－ｊ］［１，７］ベンゾジアゾニン－１１－イル）－Ｎ－メチルベンザミド）、ＳＢ－４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンザミド）、Ａ０１（［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］スルホニル］－１－ピペラジニル］［４－（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）フェニル］メタノン）、アラントラクトン、ＧＤＦ８、及びコノフィリン（ジメチル（２Ｒ，６Ｒ，１１Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，２３Ｓ，２４Ｓ，２５Ｓ，３６Ｒ，３９Ｒ，４０Ｒ）－１４，２５－ジエチル－２４，３３－ジヒドロキシ－３１，３２－ジメトキシ－１２，２２－ジオキサ－１，９，１８，２９－テトラザドデカシクロ［２３．１３．１．１６，９．０２，２３．０３，２１．０５，１９．０６，１７．０１１，１３．０２８，３６．０３０，３５．０３６，３９．０１４，４０］テトラコンタ－３，５（１９），１６，２０，２７，３０，３２，３４－オクタエン－１６，２７－ジカルボキシレート）が挙げられる。ｂＦＧＦシグナル伝達の例示的な誘導因子としては、ｂＦＧＦ、ＳＵＮ １１６０２（４－［［４－［［２－［（４－アミノ－２，３，５，６－テトラメチルフェニル）アミノ］アセチル］メチルアミノ］－１－ピペリジニル］メチル］ベンズアミド）、スクラルファート（ＣＡＳ５４１８２－５８－０）、及びＦＧＦ－Ｐ（Ｃａｓｅｙ－Ｓａｗｉｃｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓ ２０１４，１０６，７０４－１２に公開されるペプチド模倣物）が挙げられる。例示的なインスリンシグナル伝達の誘導剤としては、インスリン、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、硫酸亜鉛硫酸亜鉛－７水、ｂｐＶ（ＣＡＳ４２４９４－７３－５）、ＢＭＯＶ（ＣＡＳ３８２１３－６９－３）、バナジルロシグリタゾン、バナジルトレハロース、バナジルメトホルミン、バナジルケルセチン（バナジル分子は全て、Ｊｉａｎｇ，Ｐ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，１８０，８４１－８５１に公開されている）、デメチルアステリキノンＢ１（２－［２－（１，１－ジメチル－２－プロペニル）－１Ｈ－インドール－３－イル］－３，６－ジヒドロキシ－５－［７－（３－メチル－２－ブテニル）－１Ｈ－インドール－３－イル］－２，５－シクロヘキサジエン－１，４－ジオン）、及びＢＲＤ７５５２（メチル［２，３－Ｏ－ビス（ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－カルバモイル）］－４－Ｏ－（４－エトキシカルボニル－フェニルカルバモイル）－α－Ｄ－グルコピラノシド）が挙げられる。他のインスリンシグナル伝達の誘導剤は、血清代替品などのインスリンを含有する培地添加剤を含むことができる。
【0097】
前駆細胞からＰＧＣＬＣを誘導するいくつかの方法が存在する。ＥｐｉＬＣの浮遊培養物は、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレートのウェル中、インスリンシグナル伝達の活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地中で、プレーティングすることができる。例示的な無血清培地としては、市販のＤＭＥＭ、ＭＥＭａｌｐｈａ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＨａｍのＦ－１０、ＨａｍのＦ－１２、ＲＰＭＩ １６４０、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、及びＧＭＥＭが挙げられる。無血清培地Ｎ２Ｂ２７及びＧＫ１５培地は、それぞれ実施例２２及び実施例３３に記載されている。インスリンシグナル伝達の例示的な誘導剤を上記に列挙する。例示的なＢＭＰシグナル伝達の誘導剤としては、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ７、ＴＧＦβ、ｓｂ４（２－［［（４－ブロモフェニル）メチル］チオ］ベンゾオキサゾール）、トリアムシノロン、イソリキリチゲニン、及び４’－ヒドロキシカルコン（Ｖｒｉｊｅｎｓ，Ｋ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，２０１３，８，ｅ５９０４５）、Ｃ１＝Ｃ（ＣＣ（Ｃ）Ｃ）Ｏ＝ＮＣ１Ｃ（＝Ｏ）Ｎｃ１：ｃ：ｃ（Ｃｌ）：ｃ（Ｆ）：ｃ：ｃ：１、Ｃ（ＯＣ１＝ＣＣ（ＣＣ）＝ＣＣ＝Ｃ１）（＝Ｏ）Ｎｃ１：ｃ：ｃ（Ｎ（Ｏ）＝Ｏ）：ｃ（Ｆ）：ｃ：ｃ：１、Ｃ１Ｃ＝ＳＣ（Ｃ（ＯＣＣ（＝Ｏ）Ｎｃ２：ｃ：ｃ：ｃ（ＯＣ（Ｆ）Ｆ）：ｃ：ｃ：２）＝Ｏ）Ｃ＝１Ｃ（これらのフッ素化化合物は、Ｇｅｎｔｈｅ，Ｊ．Ｒ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１７ Ｓｅｐ １５；１２（９）：２４３６－２４４７に記載される）、ｋｍ１１０７３（ＷＯ２０１９０４２８８９）、ＰＤ０７８２４、ＳＶＡＫ－１２（Ｋａｔｏ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１１，３４９，９７－１０６）、Ｃ１＝Ｃ（Ｃ（Ｆ）（Ｆ）Ｆ）Ｃ（Ｃｌ）＝ＣＣ＝Ｃ１Ｓ（Ｏ）（Ｏ）Ｎ１ＣＣＮ（Ｃ（＝Ｏ）Ｃ２＝ＣＣ＝Ｃ（Ｎ３Ｃ（Ｃ）＝ＣＣ＝Ｎ３）Ｃ＝Ｃ２）ＣＣ１、又は１－エチル－６－フルオロ－４－オキソ－７－［４－（３－フェニルプロパノイル）－１－ピペラジニル］－１，４－ジヒドロ－３－キノリンカルボン酸が挙げられ得る。ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤は、ＬＩＦであってもよい。ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤は、ＳＣＦであってもよい。ＥＧＦシグナル伝達の例示的な誘導剤としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＥＰＲ、及びＨＢ－ＥＧＦが挙げられる。例示的なＷＮＴシグナル伝達の誘導剤としては、ＷＮＴ２ｂ、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ－４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ－９ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６ｂ、ノリン、ＷｎｔアゴニストＩ（２－アミノ－４－（３，４－（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ）－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジン、ＣＡＳ ８５３２２０－５２－７）、ＷｎｔアゴニストＩＩ（５－（フラン－２－イル）－Ｎ－（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）－１，２－オキサゾール－３－カルボキサミド）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＰ ９２２０５６、ＢＭＬ ２８４、ＷＡＹ ３１６６０６塩酸塩、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １、ＣＨＩＲ ９８０１４、及びＦｏｘｙ ５が挙げられる。
【0098】
代替的に、前駆細胞の浮遊培養は、インスリンシグナル伝達の活性化因子、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む無血清培地中で誘導することができる。（例示的な誘導剤及び培地は、上記で考察される。）
【0099】
細胞を、３７℃～３８．５℃、５％ＣＯ２で維持することができる（Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｅｌｌ，１４６，５１９－５３２）。
【0100】
代替的に、前駆細胞を、基礎培養培地中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に播種することができる。基礎培地は、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、少なくとも１つのインスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを更に含み得る。例示的な基礎培地としては、１００倍のＮ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）及び５０倍のＢ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）及びＤＭＦ／１２培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）（１：１）が挙げられ、Ｎ２Ｂ２７培地と呼ばれる。例示的なシグナル誘導剤については、上記に記載されている。
【0101】
代替的に、ウシ形成細胞及び／又はウシ中胚葉様細胞は、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、及びＢＭＰシグナル伝達の誘導剤が補充されたＧＫ１５基礎培地を使用して、フィーダーを含まない培養物中で誘導することができる。（例示的なシグナル伝達誘導剤は、上記で考察される。）更に、ＧＫ１５培地は、インスリンシグナル伝達の誘導剤を含む血清代替品を含有し得る。（実施例３３には、ＧＫ１５培地が記載される。）
【0102】
最後の代替物では、ＥＳＣは、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１４、ＳＴＥＬＬＡ、ＳＯＸ１７、及び／又はＳＯＸ２などの内因性転写因子のＣＲＩＳＰＲ媒介性多重活性化を使用して、ＧＤＦ９、ＶＡＳＡ、ＤＡＺＬ、ＮＡＮＯＳ２、及びＮＡＮＯＳ３の発現を誘導することによって、ＰＧＣＬＣに分化され得る。これらのマーカーは、ＰＧＣ分化において役割を果たすことが知られている（Ｗａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６、Ｗａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１９，２０，１４９４－１５０５、Ｉｄｅｔａ，Ａ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２４９８３、Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０２０，１１７，２４１９５－２４２０４）。いくつかの実施形態では、内因性転写因子のＣＲＩＳＰＲ媒介性活性化因子は、標準的な方法に従って動物から育種させることができる。代替的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介性活性化因子は、それらが得られた動物中に存在しないように、培養細胞中で一過性にトランスフェクトされ得る。
【0103】
未分化ＥＳＣを除去するために、得られるＰＧＣＬＣ培養物を、Ｓｄａ／ＧＭ２－グリカン（Ｋｌｉｓｃｈ，Ｋ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１１，１４２，６６７－６７４）、α－ＳＳＥＡ－１（Ｆｏｘ Ｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９８１，８３，３９１－３９８）、αＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４（Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８２，３０，６９７－７０５）、ＥＭＡ－１（Ｈａｈｎｅｌ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｅｄｄｙ，Ｅ．Ｍ．，Ｇａｍｅｔｅ Ｒｅｓ．，１９８６，１５，１２３５－１２４４）、ＴＧ－１（Ｄｏｎｏｖａｎ ＰＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１９８７，８，３５９－３６７）、ｃ－ｋｉｔ（Ｄｅ Ｍｉｇｕｅｌ，Ｍ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１０４５８－１０４６３）、又はＴＮＡＰ（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５，１２１，１４８７－１４８９）を含むＰＧＣ特異的細胞表面マーカーを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選別することができる。
【0104】
機能的及び遺伝的同一性は、インビボでウシＰＧＣと比較してトランスクリプトームシグネチャーを分析することによって検証することができ、ＰＧＣの純度は、アルカリホスファターゼ（ＡＰａｓｅ）染色によって決定することができる。
【0105】
ＰＧＣＬＣは、Ｆａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００５，２８５，４９－５６によって記載される方法を使用して体細胞の非存在下で、又は雄若しくは雌の胎児性腺の体細胞の存在下で（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｓａｉｔｏｕ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１３，１５１３－１５２４）、培養物中で維持され得る。
【0106】
ブタ
ブタＥＳＣ（ｐＥＳＣ）は、フィーダー細胞上に維持することができる。分化のために細胞を調製するために、それらを適合させ、基礎ラミニン分子でコーティングされた皿上で、フィーダーを含まない状態で維持することができる。好適な分子としては、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ－オルニチン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）＋ラミニン（１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はゼラチンが挙げられる。細胞を、Ｎ２Ｂ２７などの基礎培地上で維持することができる。Ｎ２Ｂ２７は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ、１７５０２－０４８）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０－０３３）と、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、１７５０４－０４４）、２５μｇ／ｍｌのインスリン及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡが補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ、２１１０３－０４９）との１：１混合物である。基礎培地は、細胞の多能性状態を維持するために、アクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）を更に補充することができる。代替的に、それらは、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１が補充された実施例２２で調製したようなＮ２Ｂ２７培地上で維持することができる。培地は、毎日交換することができる。
ブタＥＳＣ（ｐＥＳＣ）は、フィーダー細胞上に維持することができる。分化のために細胞を調製するために、それらを適合させ、基礎ラミニン分子でコーティングされた皿上で、フィーダーを含まない状態で維持することができる。好適な分子としては、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ－オルニチン（０．０１％、Ｓｉｇｍａ）＋ラミニン（１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はゼラチンが挙げられる。細胞を、Ｎ２Ｂ２７などの基礎培地上で維持することができる。Ｎ２Ｂ２７は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ、１７５０２－０４８）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０－０３３）と、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、１７５０４－０４４）、２５μｇ／ｍｌのインスリン及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡが補充されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ、２１１０３－０４９）との１：１混合物である。基礎培地は、細胞の多能性状態を維持するために、アクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１％ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ）を更に補充することができる。代替的に、それらは、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１が補充された実施例２２で調製したようなＮ２Ｂ２７培地上で維持することができる。培地は、毎日交換することができる。
【0107】
ＰＧＣＬＣ分化のために、ＥＳＣを前駆細胞に誘導することができる。胚細胞を単一細胞に消化し、次いで、無血清培地中で、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせで処理することができる。代替的に、細胞を、アクチビンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせで処理することができる。代替的に、細胞を、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、アクチビンシグナル伝達の誘導剤、ＷＮＴシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせで処理することができる。例示的なシグナル伝達分子を上記に列挙する。例示的な培地は、Ｗａｎｇ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６に記載されるように、１５％のＫＳＲ、ＮＥＡＡ、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びβ－メルカプトエタノールが補充されたＧＭＥＭであり得る。他の例示的な培地としては、上記に記載されるＮ２Ｂ２７及びＧＫ１５培地が挙げられる。
【0108】
代替的に、内因性転写因子、具体的には、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１４、ＳＴＥＬＬＡ、ＳＯＸ１７、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２の組み合わせのＣＲＩＳＰＲ媒介性多重活性化を使用することによって、ＥＳＣをＰＧＣに分化させることができる。これらの因子は、ＰＧＣ分化に役割を果たすことが知られている（例えば、Ｗａｎｇ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６、Ｗａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１９，２０，１４９４－１５０５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介性多重因子は、標準的な方法を使用して動物から育種させることができる。代替的に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性多重因子を、誘導培養細胞内で一過性にトランスフェクトすることができる。
【0109】
未分化ＥＳＣを除去するために、得られたＰＧＣＬＣを、Ｓｄａ／ＧＭ２－グリカン（Ｋｌｉｓｃｈ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１１，１４２，６６７－６７４）、α－ＳＳＥＡ－１（Ｆｏｘ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１９８１，８３，３９１－３９８）、αＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４（Ｓｈｅｖｉｎｓｋｙ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８２，３０，６９７－７０５）、ＥＭＡ－１（Ｈａｈｎｅｌ，Ａ．Ｃ．ａｎｄ Ｅｄｄｙ，Ｅ．Ｍ．，Ｇａｍｅｔｅ Ｒｅｓ．，１９８６，１５，１２３５－１２４４）、ＴＧ－１（Ｄｏｎｏｖａｎ Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１９８７，８，３５９－３６７）、ｃ－ｋｉｔ（Ｄｅ Ｍｉｇｕｅｌ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００２，９９，１０４５８－１０４６３）、又はＴＮＡＰ（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９５，１２１，１４８７－１４８９）を含むＰＧＣ特異的細胞表面マーカーを使用して、ＦＡＣＳによって選別することができる。
【0110】
代替的に、前駆細胞は、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、上皮成長因子（ＥＧＦ）シグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む培養培地中で誘導することができる。例示的な誘導剤は、上記で考察される。６日目に、これらの細胞は、ＰＧＣＬＣになり得る。
【0111】
加えて、ＥＳＣに、ＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、及びＳＯＸ１７などの転写因子を発現させることによって、ＥＳＣを刺激してＰＧＣＬＣになることができる。これらの転写因子は、発現カセットを含むベクターをトランスフェクトして一過性に転写因子を発現させることによって、又は誘導性プロモーター上の転写因子を含むＰＩＧＧＹＢＡＣトランスポゾンを含むベクターをトランスフェクトすることによって、発現することができる。培養培地は、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、ＳＣＦシグナル伝達の誘導剤、ＥＧＦの誘導剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み得る。好適な誘導剤及びＲＯＣＫ阻害剤は、上記で考察される。核への転写因子の取り込みは、デキサメタゾンの添加によって増強され得る。
【0112】
精子生成
精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）の分化を誘導するために、雄遺伝子型のウシ又はブタのＰＧＣＬＣを、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む培地中で解離させ、配置することができる。例示的なレチノイン酸シグナル伝達の誘導剤としては、レチノイン酸、レチノイン酸ｐ－ヒドロキシアニリド、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＢＭＰ４、ＴＴＮＰＢ、メトプレン酸、ＥＣ２３、１－メチル－２－オキシインドール、アダパレン、ＣＤ４３７、ＡＣ２６１０６６、ＣＤ１５３０、Ｃｈ ５５、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＡＣ ５５６４９、ＢＭＳ ９６１、ＢＭＳ ７５３、ＣＤ ２３１４、フェンレチニド、アダパレン、ＥＣ １９、及びＳＲ １０７８が挙げられる。例示的なＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤としては、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、ＸＩＢ４０３５、ＢＴ１３（Ｎ，Ｎ－ジエチル－３－［４－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）ベンゾイル］ピペラジン－１－イル］－４－メトキシベンゼンスルホンアミド）、ＢＴ１８（［４－［５－［（６，７－ジメトキシ－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－２－イル）スルホニル］－２－メトキシフェニル］ピペラジン－１－イル］－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン）、ＢＴ４４、及び
Ｃ１２ＮＣ（Ｃ３＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ４＝ＮＣ５Ｃ＝Ｃ（Ｃ（Ｏ）＝Ｏ）Ｃ＝ＣＣ＝５Ｎ４）Ｃ＝Ｃ３）＝ＮＣ１＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ（＝Ｏ）Ｏ）Ｃ＝２（Ｉｖａｎｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１８，３，１，１０２２－１０３０）が挙げられる。例示的なテストステロンシグナル伝達の誘導剤としては、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、オキシメトロン、オキサンドロロン、エチルエストレノール、スタノゾロール、ダナゾール、メタンドロステノロン、ノルエタンドロロン、ＧＤＮＦ、ジヒドロテストステロン、及びイカリインが挙げられる。培地は、毎日交換することができる（Ｗａｎｇ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６）。
精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）の分化を誘導するために、雄遺伝子型のウシ又はブタのＰＧＣＬＣを、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む培地中で解離させ、配置することができる。例示的なレチノイン酸シグナル伝達の誘導剤としては、レチノイン酸、レチノイン酸ｐ－ヒドロキシアニリド、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＢＭＰ４、ＴＴＮＰＢ、メトプレン酸、ＥＣ２３、１－メチル－２－オキシインドール、アダパレン、ＣＤ４３７、ＡＣ２６１０６６、ＣＤ１５３０、Ｃｈ ５５、ＡＭ ５８０、ＡＭ ８０、ＡＣ ５５６４９、ＢＭＳ ９６１、ＢＭＳ ７５３、ＣＤ ２３１４、フェンレチニド、アダパレン、ＥＣ １９、及びＳＲ １０７８が挙げられる。例示的なＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤としては、ＧＤＮＦ、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、パーセフィン（ＰＳＰＮ）、ＸＩＢ４０３５、ＢＴ１３（Ｎ，Ｎ－ジエチル－３－［４－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）ベンゾイル］ピペラジン－１－イル］－４－メトキシベンゼンスルホンアミド）、ＢＴ１８（［４－［５－［（６，７－ジメトキシ－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－２－イル）スルホニル］－２－メトキシフェニル］ピペラジン－１－イル］－［４－フルオロ－２－（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン）、ＢＴ４４、及び
Ｃ１２ＮＣ（Ｃ３＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ４＝ＮＣ５Ｃ＝Ｃ（Ｃ（Ｏ）＝Ｏ）Ｃ＝ＣＣ＝５Ｎ４）Ｃ＝Ｃ３）＝ＮＣ１＝ＣＣ＝Ｃ（Ｃ（＝Ｏ）Ｏ）Ｃ＝２（Ｉｖａｎｏｖａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１８，３，１，１０２２－１０３０）が挙げられる。例示的なテストステロンシグナル伝達の誘導剤としては、テストステロン、メチルテストステロン、フルオキシメステロン、オキシメトロン、オキサンドロロン、エチルエストレノール、スタノゾロール、ダナゾール、メタンドロステノロン、ノルエタンドロロン、ＧＤＮＦ、ジヒドロテストステロン、及びイカリインが挙げられる。培地は、毎日交換することができる（Ｗａｎｇ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．，２０１６，６，２７２５６）。
【0113】
代替的に、ウシ又はブタのＰＧＣＬＣは、再構成された精巣において分化され得る。ブタ又はウシの胚性精巣体細胞は、例えば、コラゲナーゼを用いて、胚性精巣を単離し、細胞を分散させることによって調製することができる。次いで、細胞をトリプシンで処理することによって解離させることができる。単一細胞懸濁液は、細胞ストレーナーを介して濾過することによって得ることができ、細胞は、遠心分離によって収集することができる。野生型胚から得られた細胞は、磁性ビーズとコンジュゲートされたＰＧＣ特異的マーカー抗体を使用した磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によってＰＧＣを枯渇させることができる。代替的に、体細胞は、生殖細胞特異的遺伝子ノックアウト動物（例えば、ＮＡＮＯＳ２ノックアウト）を含む胚から単離されてもよく、その場合、ＭＡＣＳ選別は省略されてもよい。
【0114】
次いで、これらの細胞を、１：１の比率で同種異系ＰＧＣＬＣと混合し、インスリンシグナル伝達の誘導剤、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤、アクチビンＡシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせが補充されたα－ＭＥＭ中で培養することができる。シグナル誘導剤の例は、上記に記載されている。ＲｅｃＡ及びＳｔｒａ８などの減数分裂特異的マーカー、並びに精原幹細胞（ＳＳＣ）特異的マーカーの発現を監視することができる。細胞は、これらのマーカーが、培養物中の０日目のＰＧＣＬＣと比較して上方制御され、ＰＧＣＬＣからＳＳＣＬＣへの分化を確認するとき、精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）として確認することができる。（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１６，１８，３３０－３４０を参照されたい）。
【0115】
代替的に、ＰＧＣＬＣを基礎培養培地中のフィーダー層上に再播種することができる。例えば、基礎培地は、Ｎ２Ｂ２７であってもよい。基礎培地は、ＢＭＰシグナル伝達の誘導剤、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤、ＧＤＮＦシグナル伝達の誘導剤、ＬＩＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを更に含み得る。次いで、細胞は、精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）状態を確認するために当該技術分野で既知の方法によってアッセイされるように、精原幹細胞特異的マーカーが０日目と比較して上方制御されるまで培養され得る。この誘導の効率は、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子としてＥｉｆ２ｓ３ｙを使用して増強することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｉｆ２ｓ３ｙ発現カセットは、得られる任意の産生動物から育種させることができる。
【0116】
安定なＳＳＣＬＣの維持及び増殖のために、ＳＳＣＬＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍｇ／ｍｌのインスリン、１００ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、６０ｍＭのプトレシン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、６ｍｇ／ｍｌのＤ－（１）－グルコース、３０ｍｇ／ｍｌのピルビン酸、１ｍｌ／ｍｌのＤＬ－乳酸（Ｓｉｇｍａ）、５ｍｇ／ｍｌのウシアルブミンＩｍｍｕｎＯ（ＭＰ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０μＭの２－メルカプトエタノール、最少必須培地（ＭＥＭ）、ビタミン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μＭのアスコルビン酸、１０ｍｇ／ｍｌのＤ－ビオチン、３０ｎｇ／ｍｌのｂ－エストラジオール、６０ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）、及び０．１％のＦＣＳが補充されたＳｔｅｍＰｒｏ－３４無血清培地（ＳＦＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの幹細胞培養培地中で培養することができる。培地は、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ、及び４０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦを更に含み得る（Ａｐｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００８，１３６，５４３－５５７２を参照されたい）。
【0117】
次に、ＳＳＣＬＣを、単倍体精子細胞様細胞（ＳＬＣ）に分化させることができる。ＳＳＣＬＣは、インスリンシグナル伝達の誘導剤、テストステロンシグナル伝達の誘導剤、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤、ウシ下垂体抽出物、又はそれらの組み合わせを含有する最小培地中で培養することができる。インスリンシグナル伝達の誘導剤及びテストステロンシグナル伝達の誘導剤の例は、上記で考察される。例示的なＦＳＨシグナル伝達の誘導剤としては、ＦＳＨ、コリフォリトロピンアルファ、ＦＳＨβ－ＣＴＰ－α、Ｎ２－α ＦＳＨ、妊馬の血清ゴナドトロピン、チアゾリジノン、及びヘキサヒドロキノリンが挙げられる。ウシ脳下垂体抽出物は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、Ｌｏｎｚａ、及び他の生化学製造業者から市販されている。培地は、２日毎に交換することができる。細胞を、ＴＰ１、ＰＲＭ１、アクロシン、及びハプリンなどの単倍体精子マーカーが上方制御されるまで、３７℃～３８．５℃で、５％ＣＯ２中で培養することができる。上方制御は、培養物全体から採取した試料のウェスタンブロットを介して測定することができる。
【0118】
代替的に、ＳＳＣＬＣは、６ウェルプレート中、ＴＰ１、ＰＲＭ１、アクロシン、及びハプリンなどの単倍体精子マーカーが上方制御されるまで、レチノイン酸シグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせを含む、基礎培養培地、例えばＮ２Ｂ２７中で、フィーダー層上に再播種することができる。
【0119】
この誘導の効率は、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子としてＥｉｆ２ｓ３ｙを使用して増強することができる。いくつかの実施形態では、Ｅｉｆ３ｓ３ｙ遺伝子は、産生動物のために株から外へ育種させることができる。
【0120】
この誘導は、精子細胞マーカーを有する丸い単倍体細胞を産生する。精子細胞を使用して、当該技術分野で既知の方法を介して、細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）によって卵母細胞を受精させることができる。精子は、必要に応じて、性腺細胞又は性腺細胞から馴化した培地とともに懸濁液中でＳＳＬＣをインキュベートすることによって産生することができる。
【0121】
卵生成
再構成された卵巣
ＦＡＣＳ選別されたブタ又はウシの雌ＰＧＣＬＣは、インスリンシグナル伝達の誘導剤及びレチノイン酸シグナル伝達の誘導剤が補充された最小培地中で、１：１の比率で同種異系性腺体細胞と混合して、再構成された卵巣を形成することができる。性腺体細胞は、胚性卵巣を単離し、それらをコラゲナーゼで分散させ、続いて細胞をトリプシンで消化することによって調製することができる。単一細胞懸濁液は、細胞ストレーナーを介して濾過することによって得ることができ、細胞は、遠心分離によって収集される。次いで、細胞を、磁性ビーズとコンジュゲートされたＰＧＣ特異的タンパク質マーカー抗体を使用した磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、始原生殖細胞（ＰＧＣ）を枯渇させる。代替的に、このＰＧＣ枯渇工程は、雌生殖細胞特異的ノックアウト（例えば、ＮＡＮＯＳ３ノックアウト動物）を有する胚から単離された卵巣を使用することによって回避することができる。
再構成された卵巣
ＦＡＣＳ選別されたブタ又はウシの雌ＰＧＣＬＣは、インスリンシグナル伝達の誘導剤及びレチノイン酸シグナル伝達の誘導剤が補充された最小培地中で、１：１の比率で同種異系性腺体細胞と混合して、再構成された卵巣を形成することができる。性腺体細胞は、胚性卵巣を単離し、それらをコラゲナーゼで分散させ、続いて細胞をトリプシンで消化することによって調製することができる。単一細胞懸濁液は、細胞ストレーナーを介して濾過することによって得ることができ、細胞は、遠心分離によって収集される。次いで、細胞を、磁性ビーズとコンジュゲートされたＰＧＣ特異的タンパク質マーカー抗体を使用した磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、始原生殖細胞（ＰＧＣ）を枯渇させる。代替的に、このＰＧＣ枯渇工程は、雌生殖細胞特異的ノックアウト（例えば、ＮＡＮＯＳ３ノックアウト動物）を有する胚から単離された卵巣を使用することによって回避することができる。
【0122】
再構成された卵巣を、インビトロ分化（ＩＶＤｉ）培地に浸漬されたコラーゲンコーティングされた膜上に配置することができる。ＩＶＤｉ培地は、ＦＣＳ、アスコルビン酸、グルタミンサプリメント、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２－メルカプトエタノールが補充された最小培地を含み得る。培養の２～７日目に、培養培地を、ＦＣＳ、アスコルビン酸、グルタミンサプリメント、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２－メルカプトエタノールが補充された無血清培地を含むＩＶＤｉ培地に変更することができる。培養の５日目から１０日目まで、エストロゲン受容体アゴニストをＩＶＤｉ培地に添加することができる。例示的なエストロゲン受容体アゴニストとしては、ＩＣＩ１８２７８０、フェルチニン、エストロピペート、エストロン－３－サルフェート、Ｓ－エクオール、ＷＡＹ－２０００７０、ＤＹ １３１、ＧＳＫ ４７１６、ＡＢ－１、ＥＲＢ－０４１、ビオカニンＡ、β－エストラジオール、α－エストラジオール、ＰＰＴ、ＤＰＮ、ＦＥＲｂ ０３３、又はＡＣ １８６が挙げられる。培養の１５～２５日目に、個々の二次卵胞様構造（２ＦＬ）を再構成された卵巣から手動で解離させることができる（以下を参照されたい）。
【0123】
電気的に研がれたタングステン針を、個々の二次卵胞様構造（２ＦＬ）の単離に使用することができる。２ＦＬ間の間質細胞を除去することができる。２ＦＬを、再構築された卵巣（ｒＯｖａｒｉｅｓ）から分離し、コラーゲンコーティングされた膜上に大部分が規則的な間隔で配置することができる。
【0124】
コラーゲン膜上の単一の２ＦＬを、ＩＶＧ培地に浸漬することができる。ＩＶＧ培地は、ＦＣＳ、ポリビニルピロリドンなどの安定化ポリマー、アスコルビン酸、グルタミンサプリメント、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｍ２－メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）シグナル誘導剤、ＴＧＦβシグナル誘導剤、又はそれらの組み合わせなどが補充された最小培地を含み得る。例示的なＦＳＨ及びＢＭＰシグナル誘導剤は、上記で考察される。例示的なＴＧＦβシグナル誘導剤としては、ＧＤＦ９、ＢＭＰ１５（ＧＤＦ９ｂとも呼ばれる）、及び上記で考察した例示的なＢＭＰシグナル誘導剤が挙げられる。培養の１～５日目に、ＴＧＦβシグナル誘導剤を培地から抜き取ることができ、その後、濾胞をコラゲナーゼ中でインキュベートすることができる。血清が補充された最小培地で洗浄した後、卵胞は、ＴＧＦβシグナル誘導剤を含まないＩＶＧ中で培養することができる。培養の７～１４日目に、膜上で成長した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を採取し、ＩＶＭ培地に移すことができる。ＦＣＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンが補充された最小培地に、シグナル伝達分子を補充することができる。シグナル伝達分子は、ＦＳＨシグナル伝達誘導剤、ＥＧＦシグナル伝達誘導剤、ゴナドトロピンシグナル伝達誘導剤、又はそれらの組み合わせであり得る。例示的なＦＳＨ及びＥＧＦシグナル伝達誘導剤は、上記で考察される。例示的なゴナドトロピンシグナル伝達誘導剤としては、ｈＣＧ、絨毛性ゴナドトロピン、コリオゴナドトロピンアルファ、及びコリフォリトロピンアルファが挙げられる。培養１６時間目に、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって卵母細胞から腫れた卵巣細胞を取り除き、第１の極体放出によってＭＩＩ卵母細胞を決定することができる。
【0125】
直接誘導された卵母細胞様細胞
ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、若しくはＳＵＢ１遺伝子、又はそれらの組み合わせの発現を可能にするベクターは、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ）、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、ＶＰＨ－１００１、ＶＰＨ－５０１２、若しくはその他）、又は電気泳動（ＢＴＸ）を使用することによって、ＥＳＣに共トランスフェクションすることができる。好適なベクターとしては、シールド１（ｓｈｉｅｌｄ１）誘導性プロモーターを有するＰｉｇｇｙＢＡＣベースのベクター及び一過性トランスフェクションに好適なベクターが挙げられる。様々な一過性トランスフェクションシステムは、当該技術分野で既知であり、市販されている。２４時間後、ＥＳ細胞を抗生物質とともに培養することができる。２～５日後、ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に再拡散させることができる。（例示的なフィーダー細胞は、上記で考察される。）培養の３～７日目に、単一のコロニーを拾い上げ、フィーダー細胞上に播種する。フィーダー細胞を除去するために、ＥＳ細胞を、フィーダーを含まない条件下で少なくとも３回継代させることができる。
ＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、若しくはＳＵＢ１遺伝子、又はそれらの組み合わせの発現を可能にするベクターは、リポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ）、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ、ＶＰＨ－１００１、ＶＰＨ－５０１２、若しくはその他）、又は電気泳動（ＢＴＸ）を使用することによって、ＥＳＣに共トランスフェクションすることができる。好適なベクターとしては、シールド１（ｓｈｉｅｌｄ１）誘導性プロモーターを有するＰｉｇｇｙＢＡＣベースのベクター及び一過性トランスフェクションに好適なベクターが挙げられる。様々な一過性トランスフェクションシステムは、当該技術分野で既知であり、市販されている。２４時間後、ＥＳ細胞を抗生物質とともに培養することができる。２～５日後、ＥＳ細胞をフィーダー細胞上に再拡散させることができる。（例示的なフィーダー細胞は、上記で考察される。）培養の３～７日目に、単一のコロニーを拾い上げ、フィーダー細胞上に播種する。フィーダー細胞を除去するために、ＥＳ細胞を、フィーダーを含まない条件下で少なくとも３回継代させることができる。
【0126】
体細胞を含まない直接誘導卵母細胞様細胞（ＤＩＯＬ）の長期誘導のために、ＦＣＳ、アスコルビン酸、グルタミンサプリメント、抗生物質、及び２－メルカプトエタノールを補充し得る基礎培地中、５０，０００個のＥＳ細胞を、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレートに移すことができる。培地は、ＳＣＦシグナル伝達誘導剤、ＲＯＣＫ阻害剤、又はそれらの組み合わせを更に含むことができる。（例示的なＳＣＦシグナル伝達誘導剤及びＲＯＣＫ阻害剤は、上記で考察される。）培養２日目に、凝集体を、該当する場合、Ｓｈｉｅｌｄ１を有する補充された基礎培地中、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に配置することができる。細胞を２～４週間培養することができる。体細胞によるＤＩＯＬの誘導のために、５０，０００個のＥＳ細胞及び３０，０００～７５，０００個のＥ１２．５雌性腺体細胞を、Ｓ１０培地中、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレート（誘導が必要な場合は０．５μＭのＳｈｉｅｌｄ１を有する）に移すことができる。培養２日目に、凝集体をＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜上に配置し、２８日間培養する（必要に応じてＳｈｉｅｌｄ１を含む）。
【0127】
ＤＩＯＬのインビトロ成長（ＩＶＧ）培養のために、個々の卵胞は、電気的に研がれたタングステン針を使用して手動で単離することができる。単離されたＤＩＯＬを、ＩＶＧ培地中、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜上で培養することができる。ＩＶＧ培地は、ＦＣＳ、ポリビニルピロリドン、アスコルビン酸、グルタミンサプリメント、抗生物質、２－メルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムが補充された基礎培地を含むことができる。ＩＶＧ培地は、ＦＳＨシグナル伝達の誘導剤と、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤と、を更に含むことができる。培養２日目に、少なくとも１つのＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を培地から抜き取ることができる。卵胞を、コラゲナーゼ中でインキュベートすることができる。卵胞は、ＦＣＳが補充された基礎培地で洗浄することができ、卵胞は、ＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤を含まないＩＶＧ中で７～１１日間培養することができる。
【0128】
インビトロ胚産生
配偶子様細胞から胚を生成するための当該技術分野で既知のいくつかの方法が存在する。ＩＣＳＩの標準的な方法を使用して、本教示に従って作製された所望の遺伝子又は卵母細胞様細胞又はＤＩＯＬを有する動物由来の卵母細胞に本教示の精子細胞を注射することができる。代替的に、又は加えて、本教示の卵母細胞様細胞又はＤＩＯＬを、望ましい遺伝子を有する動物から得られた精子を用いたインビトロ受精に使用することができる。
配偶子様細胞から胚を生成するための当該技術分野で既知のいくつかの方法が存在する。ＩＣＳＩの標準的な方法を使用して、本教示に従って作製された所望の遺伝子又は卵母細胞様細胞又はＤＩＯＬを有する動物由来の卵母細胞に本教示の精子細胞を注射することができる。代替的に、又は加えて、本教示の卵母細胞様細胞又はＤＩＯＬを、望ましい遺伝子を有する動物から得られた精子を用いたインビトロ受精に使用することができる。
【0129】
家畜胚性幹細胞のその他の使用
培養肉（又は実験室で成長した肉）は、幹細胞に由来する食用タンパク質であり、一部の菜食主義者及びビーガンに許容される自然に成長した肉の「残酷さのない」代替品であり得る。一般に、実験室で成長した肉は、幹細胞が、筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、及び／又は軟骨細胞などのヒトによって食用にされる細胞に分化するように、幹細胞を培養することによって生産される。いくつかの実施形態では、分化細胞は、例えば、横紋筋細胞若しくは骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、内皮細胞、血液細胞、膀胱細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞、肺細胞、又はそれらの任意の組み合わせなどの臓器細胞である。代替的に、所望の細胞型は、時には、完全に分化した細胞型を生成するのに有用な成体幹細胞又は前駆細胞などの中間細胞型である。いくつかの実施形態では、インビトロでの幹細胞の成長に好適な成長培地を使用して、単離された幹細胞を培養し得る。好適な培養培地は、Ｃｈａｌｌａｋｅｒｅによる公開出願第ＵＳ２０１１／０３０１２４９Ａ１号で考察される。
培養肉（又は実験室で成長した肉）は、幹細胞に由来する食用タンパク質であり、一部の菜食主義者及びビーガンに許容される自然に成長した肉の「残酷さのない」代替品であり得る。一般に、実験室で成長した肉は、幹細胞が、筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、及び／又は軟骨細胞などのヒトによって食用にされる細胞に分化するように、幹細胞を培養することによって生産される。いくつかの実施形態では、分化細胞は、例えば、横紋筋細胞若しくは骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、脾臓細胞、胸腺細胞、内皮細胞、血液細胞、膀胱細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞、肺細胞、又はそれらの任意の組み合わせなどの臓器細胞である。代替的に、所望の細胞型は、時には、完全に分化した細胞型を生成するのに有用な成体幹細胞又は前駆細胞などの中間細胞型である。いくつかの実施形態では、インビトロでの幹細胞の成長に好適な成長培地を使用して、単離された幹細胞を培養し得る。好適な培養培地は、Ｃｈａｌｌａｋｅｒｅによる公開出願第ＵＳ２０１１／０３０１２４９Ａ１号で考察される。
【0130】
分化すると、培養物は、三次元培養物に移行する。細胞を三次元培養物に移行させる方法は、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ，Ｉｎｃ．によってＷＯ／２０１８／２２７０１６で考察されている。培養のための三次元構造は、当該技術分野において公知であり、限定されないが、食用マイクロキャリア、ヒドロゲルチューブ及びヒドロゲルマトリックス、脱細胞化植物材料、植物系中空繊維、セルロース膜、コラーゲンブレンド中空繊維、並びにヒドロコロイド及びタンパク質を含む食用中空繊維が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞を、質感改変特性を有する少なくとも１つの天然タンパク質を含む微細骨格上の浮遊培養において成長させる。種々の組成物の微細骨格を使用して、最終的な食品において所望の質感及び／又は一貫性を生み出すことができる。様々な実施形態では、大豆タンパク質などの質感を変えた植物タンパク質が使用される。微細骨格は、任意選択的に、食品に質感を提供するための少なくとも１つの充填剤又は結合剤材料を含む。いくつかの構成では、微細骨格は、完成食品がもはや微細骨格構造が残っていないように生分解する材料から作られる。例えば、細胞の集合体は、バイオリアクター内の微細骨格に播種される。細胞が微細骨格に付着し、増殖するにつれて、残存する全てが、互いに付着している細胞の塊と、それらが分泌した細胞外マトリックス材料になるまで、微細骨格は徐々に生分解する。したがって、微細骨格（及び更に大きな３Ｄ骨格）を使用して、得られた培養食品の構造を導くことができるが、ヒトによる消費のための食品中に残ることはない。代替的に、微細骨格及び３Ｄ骨格は、消費のために培養食品中に生分解及び／又は残存しない材料を含み得る。例えば、本明細書に記載の特定の材料を使用して、特定の構造、質感、味、又は他の所望の特性を付与するために、骨格を生成することができる。いくつかの実施形態では、細胞を、細胞組織から作製された三次元骨格上で成長させることができる。いくつかの実施形態では、三次元細胞組織は、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び衛星細胞を含む筋細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、脂肪細胞（例えば、含脂肪細胞）を含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、特殊化された細胞（例えば、線維芽細胞）によって分泌される細胞外マトリックスを含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、大動脈内皮細胞及び骨格微血管内皮細胞を含むがこれらに限定されない、内皮細胞によって形成される内皮細胞又は毛細血管内皮を含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、細胞外マトリックスを更に含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、脂肪細胞を更に含み得る。いくつかの実施形態では、三次元多型細胞組織は、毛細血管を更に含み得る。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、本明細書に記載されるように産生され得る。いくつかの構成では、前駆細胞を単一培養で分化させることができ、次いで、複数の細胞を有する三次元多孔質骨格上でインキュベートすることができる。非限定的な例としては、本教示の胚性幹細胞を培養して間葉系幹細胞に分化させ、次いで間葉系幹細胞を筋芽細胞に分化させ、次いで分化した筋芽細胞を三次元多孔質骨格上で培養することが挙げられるが、これらに限定されない。詳細な培養方法及び潜在的な多孔質骨格は、ＴＥＣＨＮＩＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ．に対するＷＯ／２０１９／０１６７９５に記載される。
【0131】
細胞を実験室で成長した肉に分化させるために使用することができる成長因子には、限定されないが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）などが含まれ得る。ＰＤＧＦ及びＩＧＦ１は、有糸分裂促進性、走化性、及び細胞応答の増殖（分化）を刺激することが知られている。成長因子は、以下のうちの１つ以上であり得る。ＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦ ＡＡ、ＰＤＧＦ ＢＢ；ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ｂ－内皮細胞成長因子、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、及びＦＧＦ９；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－Ｐ１、ＴＧＦ ｂｉ．２、ＴＧＦ－ｐ２、ＴＧＦ－ｐ３、ＴＧＦ－ｐ５；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えば、ＢＭＰ １、ＢＭＰ ２、ＢＭＰ ３、ＢＭＰ ４；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、例えば、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）、例えば、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ；インターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＣＳＦ－Ｇ、ＣＳＦ－ＧＭ、ＣＳＦ－Ｍ；神経成長因子（ＮＧＦ）；幹細胞因子；肝細胞成長因子、及び毛様体神経栄養因子。いくつかの実施形態では、成長因子は、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤、インスリンシグナル伝達の誘導剤、又はそれらの組み合わせであり得る。例示的な成長因子としては、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、又はそれらの組み合わせが挙げられる。多孔性骨格上でウシ細胞を分化させるための手順は、ＴＥＣＨＮＩＯＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ．に対するＷＯ／２０１９／０１６７９５に記載される。
【0132】
いくつかの実施形態では、実験室肉は、臓器肉であり得る。例えば、実験室で成長した肝臓を作製するために、胚性幹細胞は、最初に本明細書に記載の内胚葉前駆細胞に分化させることによって、肝細胞に分化させることができる。次いで、前駆内胚葉細胞を、ｂＦＧＦシグナル伝達の誘導剤及びＴＧＦβシグナル伝達の誘導剤で処理することによって肝内胚葉に分化させることができる。次に、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）で処理することによって、肝内胚葉細胞を未成熟の肝細胞様細胞に分化させることができる。次いで、これらの細胞を、肝細胞成長因子、オンコスタチンＭ、及びデキサメタゾンなどのコルチコステロイドで処理することができる。次いで、得られた成熟肝細胞様細胞を、食用骨格を含む懸濁培養物中で成長させることができる。次いで、細胞は、骨格をコロニー化して、実験室で成長した肝臓を作製することができる。（ａｂｃａｍ．ｃｏｍ．のプロトコルから適合させた。）代替的に、肝細胞は、前駆細胞にＨＮＦ１Ａ、ＦＯＸＡ１、及びＨＮＦ４Ａを発現させることによって前駆細胞から誘導され得る（そのような方法は、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ，Ｉｎｃ．によるＷＯ／２０１８／２２７０１６に記載されている。他の好適な培地誘導剤は、Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ，Ｉｎｃ．によるＷＯ／２０１８／２２７０１６で考察されている。
【0133】
様々な実施形態では、実験室で成長した肉は、骨格筋肉であり得る。いくつかの実施形態では、骨格筋細胞は、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤及びＥＧＦシグナル伝達の誘導剤で細胞を処理することによって、胚性幹細胞に由来し得る。いくつかの構成では、ＦＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＦＧＦであってもよく、ＥＧＦシグナル伝達の誘導剤は、ＥＧＦであってもよい。導入の詳細な方法は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ Ｃｏｎｔｒｅ ｌｅｓ Ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓに対するＵＳ１１００１８０３Ｂ２に記載される。いくつかの実施形態では、家畜胚性幹細胞（ウシ又はブタ胚性幹細胞など）は、本教示に従って中胚葉様幹細胞になるように誘導され得る。代替的に、ＴＧＦ－βシグナル伝達誘導剤を投与することによって、胚性幹細胞を誘導して、間葉系幹細胞様細胞などの中胚葉様細胞を形成することができる。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達誘導剤は、ＢＭＰ４であり得る。次いで、細胞は、フィブロネクチン又はビトロネクチンでコーティングされたプレート上でフィーダーを用いずに成長させることができる。トロホブラストを形成した後、細胞は、成長培地を含有する血清又は血清代替品中で成長させ、間葉系幹細胞様細胞に分化させることができる。胚性幹細胞を間葉系幹細胞様細胞に誘導する更なる方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔに対するＵＳ１０２２６４８８Ｂ２で考察されている。次いで、間葉系幹細胞を骨格筋細胞に誘導することができる。次いで、骨格筋細胞を、上記で考察したように三次元培養物に変換することができる。
【実施例】
【0134】
本教示は、任意の特許請求の範囲又は実施形態の範囲を限定することを意図するものではない、実施例に提供される説明を含む。本発明を更に例示するために、以下の非限定的な実施例を提供する。当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態では、多くの変更を行うことができ、それでも本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似又は同様の結果を得ることができることを理解するだろう。
【0135】
実施例１
この実施例は、ウシ群においてＮＭ＄を増加させるための複数の胚の作製を示す。
この実施例は、ウシ群においてＮＭ＄を増加させるための複数の胚の作製を示す。
【0136】
乳牛生産群は、ＮＭ＄の中央値が７００であり、上位１０％の動物は、８５０を超えるＮＭ＄を有する。８５０を超えるＮＭ＄を有する雌ウシは、同期され、成熟卵母細胞が、標準的な経膣採卵によって収集される。精液は、標準的な方法を使用して、８５０を超えるＮＭ＄を有する群れの雄ウシから収集される。雌ウシと雄ウシとの間の様々な異なる交配からの胚は、インビトロ受精によって作製される。
【0137】
実施例２
この実施例は、ブタの群れにおいてブタ生産量を増加させるための複数の胚の作製を例示する。
この実施例は、ブタの群れにおいてブタ生産量を増加させるための複数の胚の作製を例示する。
【0138】
背部脂肪、ロース深さ、及び不妊特性を優先するカスタム指数を使用して、ブタ生産群から上位１０％の動物を選択する。卵母細胞は、標準的な経膣採卵によって雌から収集される。精液は、標準的な方法で雄から収集される。雌と雄との間の様々な異なる交配からの胚は、インビトロ受精によって作製される。
【0139】
実施例３
この実施例は、ウシ胚からの胚性幹細胞株の作製を示す。
この実施例は、ウシ胚からの胚性幹細胞株の作製を示す。
【0140】
内部細胞塊を、実施例１で産生された各胚から切除する。透明帯を通過した胚盤胞段階の胚をＰＢＳ中に配置し、ＴＥ２０００－Ｕ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）に取り付けたＮＴ８８－Ｖ３高精度マイクロマニピュレータ（Ｎｉｋｏｎ）に接続したマイクロブレードを使用して切除した。次いで、細胞を、ＭＥＦフィーダー細胞の単層上の培養プレートからウェルに播種し、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦＧＦ２及び２．５μＭのＩＷＲ１を補充したＣＴＦＲ基本培地中で培養する。細胞を３７℃～３８．５℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。フィーダー層に付着しない細胞は、顕微鏡下で２２ゲージの針を使用してフィーダー層に押し付けられる。培地は、発芽後成長物が現れるまで、毎日交換する。５日後、発芽後成長物を１０μＭのＹ－２７６３２で処理し、トリプシン解離させ、新鮮なフィーダー細胞上で継代させる。
【0141】
実施例４
この実施例は、ブタ胚性幹細胞株の確立を示す。
この実施例は、ブタ胚性幹細胞株の確立を示す。
【0142】
実施例２で作製した胚からの胚盤胞を使用して、ＩＣＭをＣａ２＋－ＴＬ－ＨＥＰＥＳ培地中に配置し、次いで眼科用ハサミを使用して顕微鏡手術を介してＩＣＭを切除することによってＩＣＭを得る。単離されたＩＣＭを、５００ｍｌのＮ２Ｂ２７基礎培地当たり、０．２μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号４４２３）、０．３μＭのＷＨ－４－０２３（ＳＲＣ阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号５４１３）、２．５μＭのＸＡＶ９３９（タンキラーゼ阻害剤、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ３００４）、又は２．０μＭのＩＷＲ－１（ＷＮＴ阻害剤、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号３５３２）、６５．０μｇ／ｍｌのビタミンＣ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４９７５２－１００Ｇ）、１０．０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＣＩ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、２０．０ｎｇ／ｍｌのアクチビン（ＳＣＩ）及び０．３％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０２７０）＋１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を含むｐＥＰＳＣＭ中、ＳＴＯ細胞上で７日間培養した（Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１９，２１，６８７－６９９）。発芽後成長物は、２日後に現れる。発芽後成長物を機械的に単離し、ｐＥＰＳＣＭ中の新鮮なＳＴＯ細胞上に再播種する。細胞は、３日後に十分に画定されたコロニーを形成する。
【0143】
実施例５
この実施例は、次世代のインビトロ育種のためのウシ胚性幹細胞の選択を示す。
この実施例は、次世代のインビトロ育種のためのウシ胚性幹細胞の選択を示す。
【0144】
各幹細胞株のアリコートを採取し、標準的な方法を使用してＤＮＡを抽出する。次いで、ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＢｏｖｉｎｅＳＮＰ５０ ｖ３ ＢｅａｄＣｈｉｐマイクロアレイキットを使用して遺伝子型決定する。次いで、これらのＳＮＰ遺伝子型を分析して、各細胞株の予測ＮＭ＄を計算する。上位１０％のＮＭ＄細胞株は、次世代の作製のための配偶子生成のために選択される。次に、生成された配偶子間、又は配偶子と他の動物との間の交配を計画する。
【0145】
実施例６
この実施例は、次世代のインビトロ育種のためのブタ胚性幹細胞の選択を示す。
この実施例は、次世代のインビトロ育種のためのブタ胚性幹細胞の選択を示す。
【0146】
各幹細胞株のアリコートを採取し、標準的な方法を使用してＤＮＡを抽出する。次いで、ＤＮＡを、製造業者の指示に従ってＰｏｒｃｉｎｅＳＮＰ６０ｖ２ ＢｅａｄＣｈｉｐを使用して遺伝子型決定する。次いで、得られたＳＮＰを、背部脂肪、ロース深さ、及び不妊形質を優先するカスタム指標を使用して分析する。次いで、この指標に従って上位１０％の細胞株を、次世代の細胞株を作製するための配偶子生成のために選択する。
【0147】
実施例７
この実施例は、ウシ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を誘導する方法を示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を誘導する方法を示す。
【0148】
実施例３で生成した細胞株からの胚性幹細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２６０４－０２１）で解離させ、コラーゲンＩＶでプレコーティングした皿に播種して、フィーダーを含まない培養物を作製する。次いで、これらの培養ＥＳＣを、２０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、及び１％のＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）血清代替品（ＫＳＲ）を含むＮ２Ｂ２７培地中、胚盤葉上層様細胞（ＥｐｉＬＣ）に誘導する。これらの細胞を３日間インキュベートする。この培地を毎日交換する。
【0149】
次いで、ＥｐｉＬＣのこの浮遊培養物を、ＧＫ１５培地（ＧＭＥＭ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］１５％のＫＳＲ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ－グルタミンを含む）中、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）のウェルに配置する。ＧＫ１５培地には、５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ８ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が更に補充される。細胞を、３７℃～３８．５℃、５％ＣＯ２で維持する。分化したＰＧＣＬＣを、α－ＳＳＥＡ－１を用いたＦＡＣ選択を介して、未分化ＥｐｉＬＣから分離する。
【0150】
実施例８
この実施例は、ウシ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を誘導する代替方法を示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を誘導する代替方法を示す。
【0151】
実施例３で生成された系統からの胚性幹細胞のＥｐｉＬＣへの分化は、実施例７に記載されるように行われる。
【0152】
次いで、これらの誘導ＥｐｉＬＣを、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１４、及びＴＦＡＰ２Ｃの発現を引き起こすベクターで一過性にトランスフェクトする。これらの細胞を２日間インキュベートする。分化したＰＧＣＬＣを、ｃ－ｋｉｔ表面マーカーを用いたＦＡＣ選択を介して、未分化ＥｐｉＬＣから分離する。
【0153】
実施例９
この実施例は、ブタ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を示す。
この実施例は、ブタ胚性幹細胞からＰＧＣＬＣへの分化を示す。
【0154】
実施例４で生成された細胞株からの胚性幹細胞を、ゼラチンでコーティングされた皿上でのフィーダーを含まない培養に適合させる。次いで、細胞をトリプシンで解離させ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ８ｂ（Ｒ＆Ｄ）、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、及び１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＮ２Ｂ２７培地で処理する。これらの細胞を２日間インキュベートする。分化したＰＧＣＬＣを、ＴＮＡＰ表面マーカーを用いたＦＡＣ選択を介して、未分化ＥｐｉＬＣから分離する。
【0155】
実施例１０
この実施例は、ＥＳＣからＰＧＣＬＣへと分化させる代替方法を示す。
この実施例は、ＥＳＣからＰＧＣＬＣへと分化させる代替方法を示す。
【0156】
実施例４からのブタＥＳＣを、ＮＡＮＯＧ、ＢＬＩＭＰ１、ＴＦＡＰ２Ｃ、及びＳＯＸ１７の転写を誘導するベクターで一過性にトランスフェクトする。細胞を、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０、１％のＢ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１．０倍のグルタミンペニシリン－ストレプトマイシン、１．０倍のＮＥＡＡ、０．１ｍＭの２－メルカプトエタノール及び以下のサイトカイン（５００．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２、１０．０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ、１００．０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０．０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び１０．０μＭのＹ２７６３２）を含む培地中で培養する。未分化細胞を、ＥＭＡ－１細胞表面マーカーを用いたＦＡＣ選択を介して、ＰＧＣＬＣから分離する。
【0157】
実施例１１
この実施例は、ウシ雄ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに分化させる方法を示す。
この実施例は、ウシ雄ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに分化させる方法を示す。
【0158】
実施例７からの雄ＰＧＣＬＣを解離させ、１５％のＦＢＳ、ＮＥＡＡ、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、β－メルカプトエタノール、２μＭのＲＡ、４ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、及び１μＭのテストステロンを含むＤＭＥＭ培地（ＲＧＴ培地と呼ばれる）とともに、１２ウェルプレートのゼラチンコーティングされたウェルにプレーティングする（２×１０５個の細胞／ウェル）。
【0159】
減数分裂特異的マーカーＲｅｃＡ及びＳｔｒａ８、並びに精原幹細胞（ＳＳＣ）特異的マーカーを監視し、培養物中の０日目のＰＧＣＬＣと比較して、ＰＧＣＬＣの精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）への分化を確認する。（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１６，１８，３３０－３４０を参照されたい）。
【0160】
実施例１２
この実施例は、ブタ雄ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに分化させる方法を示す。
この実施例は、ブタ雄ＰＧＣＬＣをＳＳＣＬＣに分化させる方法を示す。
【0161】
ブタ胚性精巣体細胞は、ＮＡＮＯＳ２ノックアウト胚からブタ胚性精巣を単離することによって調製される。次いで、細胞を、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型で、３７℃～３８．５℃で１０分間分散させ、その後、０．２５％のトリプシン／１ｍＭのＥＤＴＡを用い、３７℃～３８．５℃で１０分間解離させる。単一細胞懸濁液は、細胞ストレーナーを介して濾過することによって得られ、細胞を遠心分離によって収集する。
【0162】
次いで、これらの細胞を、実施例９からの雄ＰＧＣＬＣと１：１の比で混合する。次に、この混合物を、１０％のＫＳＲ、各々２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、及びＢＭＰ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、並びに１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたα－ＭＥＭ中で培養する。
【0163】
減数分裂特異的マーカーＲｅｃＡ及びＳｔｒａ８、並びに精原幹細胞（ＳＳＣ）特異的マーカーを監視し、培養物中の０日目のＰＧＣＬＣと比較して、ＰＧＣＬＣの精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）への分化を確認する。（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１６，１８，３３０－３４０を参照されたい）。
【0164】
実施例１３
この実施例は、ＰＧＣＬＣからＳＳＣＬＣへと分化させる代替方法を示す。
この実施例は、ＰＧＣＬＣからＳＳＣＬＣへと分化させる代替方法を示す。
【0165】
ブタＰＧＣＬＣを、１００倍のＮ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）及び５０倍のＢ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）及びＤＭＦ／１２培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）（１：１）中、フィーダー層上に再播種する（６ウェルプレートのウェル当たり３×１０５個の細胞）。このＮＢ２７培地には、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、４０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１２μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１５％のＫＳＲが更に補充されている。
【0166】
減数分裂特異的マーカーＲｅｃＡ及びＳｔｒａ８、並びに精原幹細胞（ＳＳＣ）特異的マーカーを監視し、培養物中の０日目のＰＧＣＬＣと比較して、ＰＧＣＬＣの精原幹細胞様細胞（ＳＳＣＬＣ）への分化を確認する。（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１６，１８，３３０－３４０を参照されたい）。
【0167】
実施例１４
この実施例は、ウシＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に分化させる方法を示す。
この実施例は、ウシＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に分化させる方法を示す。
【0168】
実施例１０からのＳＳＣＬＣを、１０％のＫＳＲ、１０ｍＭのテストステロン（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）、２００ｎｇ／ｍｌのＦＳＨ（Ｓｉｇｍａ）、及び５０ｍｇ／ｍｌのＢＰＥ（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むαＭＥＭ中で培養する。培地を２日毎に交換する。細胞を、３７℃～３８．５℃で、５％ＣＯ２中で培養する。
【0169】
実施例１５
この実施例は、ブタＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に分化させる方法を示す。
この実施例は、ブタＳＳＣＬＣを精子細胞様細胞に分化させる方法を示す。
【0170】
実施例１１からのＳＳＣＬＣを、６ウェルプレート中、２ｎＭのＲＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１５％のＫＳＲが補充されたＮ２Ｂ２７基礎培地中で、フィーダー層上に再播種する。細胞を、３７℃～３８．５℃で、５％ＣＯ２中で培養する。
【0171】
実施例１６
この実施例は、再構成された卵巣におけるＰＧＣＬＣからの卵母細胞の形成を示す。
この実施例は、再構成された卵巣におけるＰＧＣＬＣからの卵母細胞の形成を示す。
【0172】
実施例８からの雌ＰＧＣＬＣ（ウシ）を、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ）中、１μＭのレチノイン酸が補充されたＧＫ１５培養培地中で、ウシ雌性腺体細胞と１：１の比率で再構成する。ウシ雌性腺体細胞は、胚性卵巣を単離し、それらを１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型で、３７℃～３８．５℃で１０分間分散させ、その後、０．２５％のトリプシン／１ｍＭのＥＤＴＡで、３７℃～３８．５℃で１０分間消化することによって調製される。単一細胞懸濁液は、細胞ストレーナーを介して濾過することによって得られ、細胞を遠心分離によって収集する。次いで、これらの細胞を、磁性ビーズとコンジュゲートされたＰＧＣ特異的タンパク質マーカー抗体を使用した磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）によって、内因性始原生殖細胞（ＰＧＣ）を枯渇させる。このＰＧＣ枯渇工程は、雌生殖細胞特異的ノックアウト（例えば、ＮＡＮＯＳ３ノックアウト動物）を有する胚から単離された卵巣を使用することによって回避することができる。次いで、これらの枯渇させたウシ体細胞を、実施例８からの雌ＰＧＣＬＣと混合して、再構成された卵巣を形成する。
【0173】
再構成された卵巣を、αＭＥＭベースのインビトロ分化（ＩＶＤｉ）培地に浸漬されたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ膜（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に配置する。ＩＶＤｉ培地は、２％のＦＣＳ、１５０μＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、１倍のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、及び５５μＭの２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたαＭＥＭを含む。培養４日目に、培養培地を、１０％のＦＣＳ、１５０μＭのアスコルビン酸、１倍のＧｌｕｔａｍａｘ、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、及び５５μＭの２－メルカプトエタノールが補充されたＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４ベースのＩＶＤｉ培地に交換する。培養物の７日目から１０日目まで、５００ｎＭのＩＣＩ１８２７８０を、各培地交換とともにＳｔｅｍＰｒｏ－３４ベースのＩＶＤｉ培地に添加する。培養の約２１日目に、個々の二次卵胞様構造（２ＦＬ）が形成される。
【0174】
電気的に研がれたタングステン針を、個々の二次卵胞様構造（２ＦＬ）の単離に使用することができる。２ＦＬ間の間質細胞を除去することができる。２ＦＬを、再構築された卵巣（ｒＯｖａｒｉｅｓ）から分離し、解離させ、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜上に大部分が規則的な間隔で配置することができる。
【0175】
ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜上の単一２ＦＬを、５％のＦＣＳ、２％のポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ）、１５０μＭのアスコルビン酸、１倍のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭの２－メルカプトエタノール、５５μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、０．１ＩＵ／ｍｌの卵胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ、ＭＳＤ）、１５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ１５及び１５ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたαＭＥＭを含むＩＶＧ－α ＭＥＭ培地に浸漬する。培養の２日目に、ＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を培地から抜き取り、次に、卵胞を０．１％のＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中でインキュベートする。５％のＦＣＳが数回補充されたαＭＥＭで洗浄した後、ＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を含まないＩＶＧ－αＭＥＭ中で卵胞を培養する。培養１１日目に、膜上で成長した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、微細なガラスキャピラリーによって拾い上げる。卵丘－卵母細胞複合体を、ＩＶＭ培地（５％のＦＣＳ、２５μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１ＩＵ／ｍｌのＦＳＨ、４ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、及び１．２ＩＵ／ｍｌの１ｈＣＧ（ゴナドトロピン、ＡＳＫＡ）が補充されたαＭＥＭ）に移した。培養１６時間目に、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理することによって卵母細胞から腫れた卵巣細胞を取り除き、次に顕微鏡下で第１の極体放出によってＭＩＩ卵母細胞を決定する。
【0176】
実施例１７
この実施例は、胚性幹細胞から直接卵母細胞を誘導する方法を示す。
この実施例は、胚性幹細胞から直接卵母細胞を誘導する方法を示す。
【0177】
実施例４からのＥＳＣを、フィーダーを含まない条件下で少なくとも３回継代する。
【0178】
体細胞を含まない直接誘導卵母細胞様細胞（ＤＩＯＬ）の長期誘導のために、５０，０００個のＥＳ細胞を、Ｓ１０培地（ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、低細胞結合性底Ｕ字９６ウェルプレートに移す。Ｓ１０培地には、１０％のＦＣＳ、１５０μＭのアスコルビン酸、１倍のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、及び５５μＭの２－メルカプトエタノール、１５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、並びに１０ｎＭのＹ－２７６３２（Ｗａｋｏ）が補充されている。培養２日目に、凝集体を、Ｓ１０培地中、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜（ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標））上に配置する。ＣＭＶプロモーター上にＦＩＧＬＡ、ＳＯＨＬＨ１、ＬＨＸ８、ＮＯＢＯＸ、ＳＴＡＴ３、ＴＢＰＬ２、ＤＹＮＬＬ１、及びＳＵＢ１コードカセットを含む非組み込みプラスミドを、細胞がそれらを３週間発現することを可能にする間隔で培養細胞内に一過性にトランスフェクトする。
【0179】
ＤＩＯＬのインビトロ成長（ＩＶＧ）培養のために、個々の卵胞は、研がれたタングステン針を使用して手動で単離される。単離されたＤＩＯＬを、ＩＶＧ培地中、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）－ＣＯＬ（登録商標）膜上で培養する。ＩＶＧ培地は、５％のＦＣＳ、２％のポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ）、１５０μＭのアスコルビン酸、１倍のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭの２－メルカプトエタノール、５５μｇ／ｍｌのピルビン酸ナトリウム（Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、０．１ＩＵ／ｍｌの卵胞刺激ホルモン（Ｆｏｌｌｉｓｔｉｍ、ＭＳＤ）、１５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ１５及び１５ｎｇ ｍｌ／のＧＤＦ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が補充されたαＭＥＭを含む。培養の２日目に、ＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を培地から抜き取り、次に、卵胞を０．１％のＩＶ型コラゲナーゼ中でインキュベートする。５％のＦＣＳが数回補充されたαＭＥＭで洗浄した後、ＤＩＯＬが形成されるまで７～１１日間、ＢＭＰ１５及びＧＤＦ９を含まないＩＶＧ－αＭＥＭ中で卵胞を培養する。
【0180】
実施例１８
この実施例は、インビトロで生成されたウシ配偶子を使用したインビトロ受精を示す。
この実施例は、インビトロで生成されたウシ配偶子を使用したインビトロ受精を示す。
【0181】
次のラウンドのインビトロ育種のための複数の胚を作製するために、実施例１２からの複数の精子細胞様細胞を、ＩＣＳＩの標準的な手順（卵母細胞当たり１つの精子細胞様細胞）を使用して、実施例１４からの複数の卵母細胞に注入する。次に、得られた胚のうち、胚盤胞段階に達する各々を使用して、実施例３に記載されるような細胞株を作製し、インビトロ育種の別のサイクルを開始する。
【0182】
実施例１９
この実施例は、インビトロで作製されたブタ配偶子を使用したインビトロ受精を示す。
この実施例は、インビトロで作製されたブタ配偶子を使用したインビトロ受精を示す。
【0183】
次のラウンドのインビトロ育種のための複数の胚を作製するために、実施例１１からの複数の精子細胞様細胞を、ＩＣＳＩの標準的な手順（卵母細胞当たり１つの精子細胞様細胞）を使用して、実施例１５からの複数の卵母細胞に注入する。次に、得られた胚のうち、胚盤胞段階に達する各々を使用して、実施例４に記載されるような細胞株を作製し、インビトロ育種の別のサイクルを開始する。
【0184】
実施例２０
この実施例は、同じ遺伝子型の動物を作製するための、選択されたウシ胚性幹細胞株の核移植を示す。
この実施例は、同じ遺伝子型の動物を作製するための、選択されたウシ胚性幹細胞株の核移植を示す。
【0185】
実施例５又は実施例１６で作製したＮＭ＄ウシ胚性幹細胞株の上位１％について、核移植を、Ｒｏｓｓ ａｎｄ Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６３６．１５５－７７（２０１０）及びＲｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４１：７４１－７５０（２００６）に公開されるのと同様の方法で行う。Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．に対して２０００年１月４日に登録された米国特許第６，０１１，１９７号も参照されたい。
【0186】
簡潔に述べると、ドナー細胞は、ＨＨ培地中、１０ＩＵ／ｍＬのプロナーゼで５分間処理することによって解離される。卵母細胞は、屠畜場由来の卵巣から、又は超音波誘導卵母細胞吸引によって生きた動物からのいずれかから採取される。卵母細胞をインビトロで成熟させ、脱核する。選択された胚性幹細胞培養物からの単一細胞を、２０μｍ（内径）のガラスピペットを使用して、脱核された卵母細胞の囲卵腔に挿入する。卵母細胞融合物は、方形ＤＣパルス発生器を使用して誘導される。融合した卵母細胞をイオノマイシンを使用して活性化し、標準条件下で培養する。活性化後４８時間で、切断されていない胚を培養物から除去し、活性化後７２時間で、培地に任意選択的に血清を補充し、７日間培養してから回収し、同期したレシピエントに移植する。子ウシは、通常、代理母から生まれ、胚性幹細胞と遺伝的に同一である。ウシ卵母細胞の高い利用可能性及び通常ウシにおいて得られる比較的高い効率レベルは、商業目的及び研究目的の両方でＳＣＮＴを使用することを提供する。
【0187】
実施例２１
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の核移植を示す。
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の核移植を示す。
【0188】
ブタ胚性幹細胞をコンフルエンスになるまで成長させ、細胞周期のＧ１又はＧ２で強制的に停止させる。卵母細胞を得て、調製し、実施例２０に記載されるように核を移植する。
【0189】
実施例２２
この実施例は、家畜胚性幹細胞を誘導するための例示的な培地を示す。
この実施例は、家畜胚性幹細胞を誘導するための例示的な培地を示す。
【0190】
Ｎ２Ｂ２７基礎培地（ＮＢＭ）は、４０ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ １１３２０－０３３）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁された１０ｍＬの１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡストック、５００μＬのＮ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００倍、Ｇｉｂｃｏ １７５０２－０４８）、５０ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ ２１１０３－０４９）、１ｍＬのＢ－２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０倍、Ｇｉｂｃｏ １７５０４－０４４）、１ｍＬのＭＥＭ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１ ｍＬのＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００倍カタログ：Ｇｉｂｃｏ ３５０５０－０６１）、１００Ｕ／ｍｌ ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、１０μＬの２－メルカプトエタノール１Ｍストック（最終濃度０．１ｍＭ、Ｓｉｇｍａ Ｍ６２５０）を混合することによって作製した。混合後、培地を濾過滅菌した。
【0191】
ＮＢＦＲ培地について、この基礎培地には、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－１８Ｂ）及び２．５μＭのＩＷＲ１（ＳＩＧＭＡ Ｉ０１６１）が補充された。
【0192】
実施例２３
この実施例は、ウシ胚性幹細胞を誘導する方法を示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞を誘導する方法を示す。
【0193】
ＭＥＦフィーダー細胞の層を、４ウェルプレート中、ウェル当たり１１８，０００個の細胞でプレーティングし、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、及び１％のＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）が補充されたＤＭＥＭ培地上で培養した。播種の準備ができたら、フィーダー細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで半分の体積の培地で覆った。培地を除去した後、胚盤胞を添加した。
【0194】
胚盤胞全体（透明質帯を除去したもの）を、１０μＭのＹ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（ＥＮＺＯ、ＡＬｘ－２７０－３３３－Ｍ００５、ＲＯＣＫｉ）が補充された培地とともに、フィーダープレートに添加した。プレーティングから２４時間後に、ＭＥＦに付着していない胚を、プレートに付着するまで３２ｇの針を用いて押し下げた。
【0195】
培地をプレーティングから４８時間後に交換し、その後は毎日交換した。プレーティングから６日後に、細胞を、分割することなく（同じサイズウェルで１：１の比率で）、（明らかな細胞の成長がみられない場合であっても）新しいウェルに継代させた（実施例２４を参照されたい）。６日後、細胞を４ウェルプレートから１２ウェルプレートに再度継代させた（明らかな細胞の成長がみられない場合であっても）。次いで、細胞を、成長に応じて、第２の継代の３～５日後に、１２ウェルプレートから６ウェルプレートに継代させた。この継代後、細胞を典型的には３～４日おきに、成長に応じて１：５～１：１０の比率で継代した。４～５継代後にコロニーを形成しなかった細胞株を廃棄した。本願発明者らは、表１に示すように、様々な供給源からの７６のウシ胚性幹細胞株を確立した。
【表1】
【0196】
出発材料は、屠畜場卵巣（インビトロ）から、経膣採卵技術（インビトロ）によって、又はフラッシングされた胚（インビボ）によって得られた卵母細胞又は胚のいずれかであった。
【0197】
実施例２４
この実施例は、実施例２３に確立された細胞株の維持を示す。
この実施例は、実施例２３に確立された細胞株の維持を示す。
【0198】
細胞を、成長に応じて３～５日毎に継代によって維持した。成長培地を除去した。次に、プレートのウェルをＰＢＳで洗浄し、ＴｒｙｐＬＥの６ウェルプレートのウェル当たり５００ｕＬを使用してプレートから分離させ、３７℃インキュベータで２～３分間インキュベートした。５ｍｌのＮＢＦＲ培地（実施例２２を参照）を加え、混合物を１５ｍｌのファルコンチューブに移した。チューブを、室温で４００×ｇで４分間遠心分離した。このスピン中に上記のようにＰＢＳで洗浄することによって新しいフィーダー細胞ウェルを調製した。スピン後、バルク上清をペレットを乱すことなくファルコンから廃棄した。次いで、ペレットを、事前に温めたＮＢＦＲ培地中に再懸濁させ、適切な数の細胞を（必要な分割に応じて）事前に洗浄したウェルに加えた。必要に応じて、最終濃度１０μＭのＲＯＣＫｉを任意選択的に添加して、細胞生存率を増加させた。新鮮な培地（ＲＯＣＫｉを含まない）を２４時間後に添加した。次いで、培地を細胞上で毎日交換した。
【0199】
胚性幹細胞の凍結保存のために、細胞を、上清のスピン及び除去の後、細胞を次いで１μｌのＲＯＣＫｉ及び１００μｌのＤＭＳＯを含有する９００μｌの培地に再懸濁させたことを除き、継代について上に記載したように洗浄した。次に、細胞をゆっくりと凍結し、次に、－８０℃におよそ２４時間移した後、液体窒素中で保存した。
【0200】
凍結保存された細胞を解凍するために、凍結された細胞を３７℃の水浴中で、小さな氷結晶のみが残るまで加熱した。解凍された細胞及び凍結溶液を円錐形のチューブに移し、次に５ｍＬの予熱したＮＢＦＲ培地を滴下した。次いで、細胞を、室温で４００×ｇで４分間遠心分離した。スピンさせながら、新鮮なフィーダー細胞ウェルを洗浄した。スピン後、上清を廃棄した。ペレットを、２ｕｌのＲＯＣＫ阻害剤を含有する２ｍＬの培地中に再懸濁させ、次いで、予め洗浄したウェルに移した。２４時間後、ＲＯＣＫｉを含む培地を除去し、ＲＯＣＫｉを含まない新鮮な培地と交換した。次いで、培地の交換及び継代を上記のように行った。
【0201】
実施例２５
この実施例は、フィーダーを含まない胚性幹細胞培養で使用される培地及び手順を示す。
この実施例は、フィーダーを含まない胚性幹細胞培養で使用される培地及び手順を示す。
【0202】
ＥＳ培地について、Ｎ２Ｂ２７基礎培地には、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－１８Ｂ）、２．５μＭのＩＷＲ１（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、１１２７４４２－８２－３）、２０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号３３８－ＡＣ－０１０）が補充された。
【0203】
ＥＳ継代培地について、ＥＳ培地には、１０μＭのＹ－２７６３２ ＲＯＣＫ阻害剤（ＥＮＺＯ、ＡＬｘ－２７０－３３３－Ｍ００５、ＲＯＣＫｉ）が更に補充された。
【0204】
フィーダーを含まない培養物の場合、コーティングされていない培養皿を細胞外マトリックスタンパク質でコーティングした。ＶＩＴＲＯＮＥＣＴＩＮ ＸＦ（商標）（Ｎｕｃｌｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによって所有される商標、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入、カタログ番号０７１８０）を使用して、製造業者の指示に従って６ウェルプレートをコーティングし、次いで、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で洗浄し、次いで２ｍｌのＥＳ培地を各ウェルに添加した。
【0205】
実施例２６
この実施例は、胚性幹細胞培養物をフィーダー細胞培養物からフィーダーを含まない培養物に変換することを示す。
この実施例は、胚性幹細胞培養物をフィーダー細胞培養物からフィーダーを含まない培養物に変換することを示す。
【0206】
実施例２３で確立されたフィーダー細胞培養上のＥＳＣを、１ｍＬ／ウェルのＤ－ＰＢＳ（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を含まない）で洗浄した。次いで、１ｍＬ／ウェルのＲｅＬｅＳＲ（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を各ウェルに添加し、放出された胚性幹細胞を１分以内に培地とともに除去し、新鮮な容器に移した。次いで、細胞を室温又は３７℃で５～７分間インキュベートした。次いで、１ｍＬ／ウェルのＥＳ培養培地を各ウェルに添加した。次いで、プレートの側面を製造業者の指示に従っておよそ３０～６０秒間タップすることによってコロニーを分離させた。細胞凝集体のサイズをチェックして、プレーティング前にＲｅＬｅＳＲ（商標）製造業者が推奨するサイズ（およそ５０～２００μｍ）であることを確認した。次いで、分離した細胞凝集体を１５ｍＬのチューブに移した。細胞混合物を上下に２～５回ピペッティングして、任意の大きな凝集体を確実に破壊した。次に、細胞凝集体混合物を、ＥＳ継代培地を含有する予めコーティングされたウェル上に、所望の密度（用途に応じて、１：２～１：４の比率／ウェル）でプレーティングした。必要に応じて、継代培地を用いて、体積を適切な体積まで上げた。次いで、プレートを３７℃のインキュベータに入れ、細胞凝集体を均等に分布させるために、何回かの迅速な、短い、前後の、及び左右の動きで移動させ、次いで２４時間所定の位置に放置した。２４時間後、培地をＥＳ培養培地で毎日交換し、培養物を視覚的に評価して成長を監視した。
【0207】
実施例２７
この実施例は、フィーダーを含まないウシ胚性幹細胞培養物の維持を示す。
この実施例は、フィーダーを含まないウシ胚性幹細胞培養物の維持を示す。
【0208】
全ての培養細胞と同様に、胚性幹細胞は、細胞がコンフルエンスに近づくと、継代を必要とする。継代するために、細胞培養培地を除去し、細胞を１ｍＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。洗浄後、細胞を１ｍＬ／ウェルのＲｅＬｅＳＲ（商標）で最長１分間処理し、少量を除いてＲｅＬｅＳＲ（商標）の大部分を除去した。次いで、細胞を室温で５～７分間インキュベートした。次に、１ｍｌ／ウェルのＥＳ継代培地（実施例２５を参照）を各ウェルに添加した。次いで、プレートの側面を製造業者の指示に従っておよそ３０～６０秒間タップすることによってコロニーを分離させた。細胞凝集体のサイズをチェックして、プレーティング前にＲｅＬｅＳＲ（商標）製造業者が推奨するサイズであることを確認した。次いで、分離した細胞凝集体を１５ｍＬのチューブに移した。
【0209】
細胞混合物を上下に２～５回ピペッティングして、任意の大きな凝集体を確実に破壊した。次に、細胞凝集体混合物を、ＥＳ継代培地を含有する予めコーティングされたウェル上に、所望の密度（用途に応じて、１：２～１：４の比率／ウェル）でプレーティングした（実施例２５を参照されたい）。必要に応じて、継代培地を用いて、体積を適切な体積まで上げた。次いで、プレートを加湿したインキュベータ（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）に移し、細胞凝集体を均等に分布させるために、何回かの迅速な、短い、前後の、及び左右の動きで移動させ、次いで細胞を２４時間かけて安定させた。次いで、細胞を、無細胞培養培地を毎日交換しつつ維持し、視覚的に評価して成長を監視した。
【0210】
フィーダーを含まない維持されたウシ胚性幹細胞の凍結保存のために、細胞培養培地を除去し、細胞を１ｍＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した。次いでＤＰＢＳを除去し、１分以内に吸引された各ウェルに１ｍＬのＲｅＬｅＳＲ（商標）を添加して、少量を除いてＲｅＬｅＳＲ（商標）の大部分を除去した。次いで、細胞を室温で５～７分間インキュベートした。次いで、製造業者の指示に従って、プレートを室温で５～７分間インキュベートした。各ウェルに１ｍｌの継代培地を添加した（実施例２５を参照されたい）。次いで、プレートの側面を製造業者の指示に従っておよそ３０～６０秒間タップすることによってコロニーを分離させた。細胞凝集体のサイズをチェックして、プレーティング前にＲｅＬｅＳＲ（商標）製造業者が推奨するサイズであることを確認した。次いで、分離した細胞凝集体を１５ｍＬのチューブに移した。
【0211】
細胞を、１ｍｌの凍結バイアル中、３００μＬの細胞懸濁液、６００μＬのＥＳ継代培地、及び１００μＬのＤＭＳＯを含む凍結保存混合物中で凍結させた。混合物を２～５回ピペッティングして混合し、小さな凝集体へと破壊した。次いで、バイアルをクライオボックスに入れ、－８０℃で一晩インキュベートした。次いで、バイアルを、長期間保存のために液体窒素に移した。
【0212】
実施例２８
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の形態を示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の形態を示す。
【0213】
実施例２４（図１）のように、及び実施例２７（図２）のようなフィーダーを含まない条件下で、フィーダー細胞上で成長した細胞を、４０倍のＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ２倒立顕微鏡で観察した。（写真は、ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂｒソフトウェアを使用して撮影した。）胚性幹細胞は、フィーダー細胞とともに成長したときに、凝集体のスポット内に集まった（図１）。フィーダーを含まない条件下で成長させると、細胞は、コンフルエント構造を形成する（図２）。（スケールバーは１００μｍである。）この形態は、胚性幹細胞について予想される。
【0214】
実施例２９
この実施例は、ウシ胚性幹細胞が、多能性細胞と一致する遺伝子発現プロファイルを有することを示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞が、多能性細胞と一致する遺伝子発現プロファイルを有することを示す。
【0215】
タンパク質発現を分析するために、実施例２３及び実施例２６に記載されるような胚性幹細胞の細胞ペレットを、１倍のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）中、氷上で、４℃で３０分間解凍した。溶解物を高強度超音波処理（３セットの３０秒パルス）に供し、不溶性材料を４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって除去した。上清の総タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して決定された。試料当たり合計３００ｎｇのタンパク質抽出物を、ＣＤＸ２（Ａｂｃａｍ ａｂ７６５４１）、ＧＡＴＡ６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ５８５１Ｔ）、ＯＣＴ＿４（Ａｂｃａｍ ａｂ１８１５５７）、ＮＡＮＯＧ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ５００－Ｐ２３６）、及びＳＯＸ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３５７９Ｔ）マーカーについてのキャピラリーウェスタンブロット（Ｒａｊｐｕｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆ Ｓ Ｓｃｉ．，２０２１，２，３３－４２）を使用して分析した。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮＡＮＯＧの発現の増加が観察された。ＣＤＸ２（栄養外胚葉を指定する）は、最小限の発現を示し、ＧＡＴＡ６（原始内胚葉を指定する）の発現は、ウェスタンブロットで検出することができなかった。この発現プロファイルは、多能性胚性幹細胞について予想される。
【0216】
この発現を、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によって更に検証した。プライマー対を表２に示す。
【表2】
【0217】
ＲＴ－ｑＰＣＲを行って、全てのマーカーのｍＲＮＡ発現を分析した。ＲＮＡを、ウシ線維芽細胞及びウシ胚性幹細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ、１７０８８９１）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、これをＰＯＷＥＲＴＲＡＣＫ（商標）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ Ａ４６０１２）を使用するｑＰＣＲに使用した。全てのキットは、製造業者の指示に従って使用した。
【0218】
抽出物内で、各マーカーについてのｍＲＮＡ発現をＧＡＤＰＨに対して正規化した。次いで、ウシ胚性幹細胞における発現を線維芽細胞における発現と比較し、倍率変化として提示した。５つのＥＳＣラインの平均からの結果を表３に列挙する。
【表3】
【0219】
多能性マーカーＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧの転写は、ウシＥＳＣにおいて顕著に増加する。対照的に、指定マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ６は、線維芽細胞と比べて、転写産物存在量が近い。本明細書に記載されるように作製されたウシ胚性幹細胞は、多能性細胞と一致する方法で多能性マーカーを発現する。
【0220】
実施例３０
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の自発的分化を示す。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の自発的分化を示す。
【0221】
ウシ胚性幹細胞を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｄｈａｍ，ＭＡ、１２５６３０１１）を使用して培養皿から分離させ、ＣＦ－１フィーダー細胞培養培地（１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ）中に再懸濁させ、次いで、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００μウェル培養皿（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｃａｎａｄａ）に播種した。浮遊培養物中で４日後、胚様体が形成された。図３は、４０倍における胚様体の代表的な写真を示す。胚様体をゼラチンコーティングされた皿に移し、観察及びＲＴ－ｑＰＣＲの前に更に２週間培養した。胚性幹細胞は、ニューロン細胞（外胚葉）、中胚葉細胞、及び内胚葉細胞に分化した。代表的な自発的分化細胞を図４に示す。ＲＴ－ｑＰＣＲに使用したプライマー対を表４に列挙する。
【表4】
【0222】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ－ｑＰＣＲは、実施例２９に記載されるように行った。抽出物内で、各マーカーについてのｍＲＮＡ発現をＧＡＤＰＨに対して正規化した。次いで、分化細胞における発現を、未分化ウシ胚性幹細胞における発現と比較し、倍率変化として報告した。ＡＦＰを使用して内胚葉分化を調べ、ＡＣＴＡ２を使用して中胚葉分化を調べ、ＴＵＢＢ３を使用して外胚葉分化を調べた。表５に示すように、これらのマーカーの各々の転写産物存在量は、ｂＥＳＣにおけるそれらの存在量と比べて増加した。
【表5】
【0223】
実施例３１
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の核型正常性を例示する。
この実施例は、ウシ胚性幹細胞の核型正常性を例示する。
【0224】
２つの細胞株（１つは雄遺伝子型を有し、１つは雌遺伝子型を有する）が、核型決定のために選択された。簡潔に述べると、１０継代を受けた株からの細胞を調製し、コルセミドで処理し、洗浄し、採取した。採取した細胞を低張性溶液で処理し、固定し、染色し、分析した。染色体を取り付け、次いでＧバンドを分析した。染色体の数、形態、及びＧバンドは全て正常であった。この実施例は、本教示に従って調製されたウシ胚性幹細胞が、家畜胚性幹細胞における以前の試みよりも動物に表現型が近いことを示す。
【0225】
実施例３２
この実施例は、エリート遺伝子を用いた胚性幹細胞の遺伝子型決定を示す。
この実施例は、エリート遺伝子を用いた胚性幹細胞の遺伝子型決定を示す。
【0226】
本教示の胚性幹細胞からＤＮＡを抽出した。次に、ＤＮＡを、ＮＥＯＧＥＮ（登録商標）ＧＧＰ Ｂｏｖｉｎｅ １００ｋチップを使用した品種登録及び遺伝子型決定のための胚ＤＮＡとしてＣｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ（ＣＤＣＢ）に提出した。ＣＤＣＢは、ＳＮＰの結果から算出された予測伝達能力（ＰＴＡ）を提供した。これらの結果を表６及び表７に報告する。
【表6-1】
【表6-2】
【表7-1】
【表7-2】
【0227】
これらのデータは、本教示の胚性幹細胞が当該技術分野で一般的な方法で遺伝子型決定され得ることを示す。
【0228】
実施例３３
この実施例は、本教示のウシ胚性幹細胞からの始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）の誘導を示す。
この実施例は、本教示のウシ胚性幹細胞からの始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）の誘導を示す。
【0229】
この実施例におけるいくつかの培養方法は、ＧＫ１５培地を使用する。ＧＫ１５培地（ＧＢＭ）は、４０４ｍＬのＧｌａｓｇｏｗの最小必須培地（ＧＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、１１７１００３５）、７５ｍＬのＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ、１０８２８－０１０、商標Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、５ｍｌの２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｍＬの２－メルカプトエタノール、５ｍＬの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、１００倍）、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム、及び５ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ、１００倍）を添加することによって作製した。
【0230】
本願発明者らは、最初に、ウシ胚性幹細胞を前駆細胞、具体的にはウシ形成様細胞又はウシ中胚葉様細胞に誘導した。前駆細胞を調製するために、ＰＢＳ中の１６．７ｕｇ／ｍｌのヒト血漿フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＦＣ０１０）を使用して細胞培養プレートをコーティングし、次いで３７℃で１時間インキュベートした。フィブロネクチン溶液を除去した。１ｍｌ／ウェルのｂＦＣＭ又はｂＭＬＣ培地（以下を参照）をコーティングされたプレートに添加し、次いで５％Ｏ２、５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で１時間インキュベートした。
【0231】
誘導培地は、前駆細胞の各々について異なるものであった。ウシ形成細胞については、１０ｍｌのＮＢＭ（実施例２２を参照）に１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を補充することによってｂＦＣＭを作製した。ウシ中胚葉様細胞誘導については、１０ｍｌのＧＫ１５培地に、最終濃度７０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１になるまで補充した。
【0232】
次いで、フィーダーを含まないウシ胚性幹細胞をＰＢＳで洗浄した。５００μｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で３分間インキュベートした。５００μｌのＮＢＭを添加し、上下にピペッティングした。次いで、細胞懸濁液を１５ｍｌのチューブに移し、３００×ｇ、２０℃で５分間遠心分離した。培地を除去し、細胞ペレットを１ｍｌのＮＢＭ中に再懸濁させた。上の調製したｂＦＣＭ又はｂＭＬＣ培地を含有するプレートに、ウェル当たり１．０～２．０×１０５個の細胞を添加した。細胞を、５％Ｏ２、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で２４～４８時間培養した。
【0233】
ウシＰＧＣＬＣのための培地は、１０００Ｕ／ｍＬのｒＬＩＦ、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、及び５００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４が補充されたＧＢＭであった。２００μｌのこの培地を、上記のようにフィブロネクチンでコーティングした９６ウェル底Ｕ字プレートに添加した。
【0234】
次いで、前駆細胞をＰＢＳで洗浄した。５００μｌの０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを各ウェルに添加し、細胞を３７℃で３分間インキュベートした。５００μｌのＮＢＭを添加し、上下にピペッティングした。次いで、細胞懸濁液を１５ｍｌのチューブに移し、３００×ｇ、２０℃で５分間遠心分離した。次いで、培地を除去した。細胞ペレットを１ｍｌのＧＢＭに再懸濁させた。次いで、ウェル当たり４×１０３個の細胞を、ＰＧＣＬＣ培地を含有する９６ウェル底Ｕ字プレートの各ウェルに添加した。次いで、細胞を、５％Ｏ２、５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で９６時間維持した。新鮮なウシＰＧＣＬＣ培地を一日おきに添加した。
【0235】
実施例３４
この実施例は、実施例３３で誘導されたようなＰＧＣＬＣの特徴付けを示す。
この実施例は、実施例３３で誘導されたようなＰＧＣＬＣの特徴付けを示す。
【0236】
フィーダーを含まない胚性幹細胞、中間細胞、及び誘導ＰＧＣＬＣを全て、４０倍のＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ２倒立顕微鏡で観察した。（図５）。全ての細胞は、予想される形態を有していた。
【0237】
ＲＴ－ＰＣＲプライマーを、多能性遺伝子（ＯＣＴ４、表２を参照）及びＰＧＣ指定遺伝子（ＮＡＮＯＳ３、ＳＯＸ１７、ＴＢＸＴ、及びＴＦＡＰ２Ｃ）のために設計した。本明細書の遺伝子のプライマーを表８に列挙する。
【表8】
【0238】
ＲＴ－ｑＰＣＲを実施例２９と同様に行って、ウシ胚性幹細胞（ｂＥＳＣ）、ウシ形成細胞から誘導されたウシＰＧＣＬＣ、及びウシ中胚葉様細胞から誘導されたウシＰＧＣＬＣにおける遺伝子発現を調べた。抽出物内で、各マーカーについてのｍＲＮＡ発現をＧＡＤＰＨに対して正規化し、次いで、ｂＥＳＣにおける発現と比較した。ｂＥＳＣにおける発現に対する発現を表９に示す。
【表9】
【0239】
多能性マーカーＯＣＴ４の転写産物存在量は変化しないが、ＰＧＣ指定マーカーＮＡＮＯＳ３、ＳＯＸ１７、ＴＢＸＴ、及びＴＦＡＰ２Ｃにおける転写産物存在量は、全て顕著に増加している。
【0240】
更に、誘導ＰＧＣＬ細胞の凝集体は、予想される細胞形態を有していた（図６を参照されたい）。
【0241】
これらのデータは、ウシ胚性幹細胞からのウシ始原生殖細胞様細胞の誘導を示す。
【0242】
実施例３５
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の産生を示す。
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の産生を示す。
【0243】
ブタ胚性幹細胞は、以下の変更を伴いつつ、実施例２３に記載されるようにインビトロ受精したブタ卵母細胞から調製された。細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＰＤ０３２５９０１（ＲＯＣＫ阻害剤）、及び１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが補充されたＮ２Ｂ２７培地（実施例２２を参照）中、ＣＦ１フィーダー細胞上で成長させた。ＰＤ０３２５９０１を６日後に抜き取った。細胞を、４０倍のＮｉｋｏｎ ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ２倒立顕微鏡で観察した。（写真は、ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂｒソフトウェアを使用して撮影した。）図７は、これらの細胞を４０倍の倍率で示す。次いで、細胞を、ＥＳ培地が、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１μＭのＰＤ０３２５９０１（ＲＯＣＫ阻害剤）、及び１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡが補充されたＮ２Ｂ２７培地を含むことを除き、実施例２５に記載されるように無細胞培養するために移した。ＰＤ０３２５９０１を６日後に抜き取った。フィーダーを含まない細胞を図８に４０倍で示す。スケールバーは１００μｍである。胚性幹細胞は、フィーダー細胞とともに成長したときに、凝集体のスポット内に集まる（図７）。フィーダーを含まない条件下で成長させると、細胞は、コンフルエント構造を形成する（図８）。この形態は、胚性幹細胞について予想される。
【0244】
実施例３６
この実施例は、多能性細胞に典型的なブタ胚性幹細胞の挙動を示す。
この実施例は、多能性細胞に典型的なブタ胚性幹細胞の挙動を示す。
【0245】
胚様体の形成及びブタ胚性幹細胞の自発的分化を、実施例３０のウシ胚性幹細胞について記載されるように実施した。ブタ胚性幹細胞は、胚様体（図９）、中胚葉細胞（図１０）、及び内胚葉細胞（図１１）を形成した。これらのデータは、ブタ胚性幹細胞が多能性であることを示す。
【0246】
実施例３７
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の多能性を示す。
この実施例は、ブタ胚性幹細胞の多能性を示す。
【0247】
ＲＮＡ ｐｒｅｐ及びＲＴ－ｑＰＣＲをブタ胚性幹細胞について行い、実施例２９のようにデータを分析する。多能性マーカーのためのプライマーを表１０に列挙する。
【表10】
【0248】
多能性マーカーＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧは、線維芽細胞と比較して上方制御されるが、分化マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ４は上方制御されないことが予想される。
【0249】
実施例３８
この実施例は、培養牛肉の生産のためのウシＥＳＣの使用を示す。
この実施例は、培養牛肉の生産のためのウシＥＳＣの使用を示す。
【0250】
実施例２６で成長したウシ胚性幹細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦでおよそ１６時間処理し、続いて培地交換を行ってもよい。その後、細胞を同じ培地上で成長させ、１０～１５日間毎日交換して、筋細胞の分化を誘導する。次いで、細胞を、多孔質の食用骨格上で三次元培養に移行させる。その後、骨格筋、したがって牛肉に近似した方法で、細胞が骨格上で成長することが予想される。
【0251】
実施例３９
この実施例は、培養豚肉の生産のためのブタＥＳＣの使用を示す。
この実施例は、培養豚肉の生産のためのブタＥＳＣの使用を示す。
【0252】
実施例３５で成長したブタ胚性幹細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦでおよそ１６時間処理し、続いて培地交換を行ってもよい。その後、細胞を同じ培地上で成長させ、１０～１５日間毎日交換して、筋細胞の分化を誘導する。次いで、細胞を、多孔質の食用骨格上で三次元培養に移行させる。その後、骨格筋、したがって豚肉に近似した方法で、細胞が骨格上で成長することが予想される。
【0253】
実施例４０
この実施例は、臓器肉の生産のためのウシＥＳＣの使用を示す。
この実施例は、臓器肉の生産のためのウシＥＳＣの使用を示す。
【0254】
実施例２６で成長したウシ胚性幹細胞は、フィーダーを含まないプレート上で、２日間にわたって毎日培地を交換しつつ、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を用いて処理して、内胚葉様細胞を作製してもよい。次いで、細胞を５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を用いて５日間、毎日培地を交換しつつ処理して、肝内胚葉細胞を誘導する。次いで、これらの細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を用いて５日間、毎日培地交換しつつ処理して、未成熟の肝細胞様細胞を誘導する。次いで、細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ、及び１００ｎＭのデキサメタゾンを用いて１０～１２日間処理する。次いで、細胞を多孔質の食用骨格上での三次元培養に適合させ、コンフルエンスになるまで成長させる。細胞は、この段階で、牛肉肝臓に類似した組織を形成すると予想される。
【0255】
本明細書で引用される任意の参照文献は、各々が参照によってその全体が組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】