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特表2024-520521ゲノム編集ツールの細胞質送達

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】ゲノム編集ツールの細胞質送達

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20240517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/09 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573291

(86)(22)【出願日】2022-05-19

(85)【翻訳文提出日】2024-01-29

(86)【国際出願番号】 NL2022050271

(87)【国際公開番号】W WO2022250531

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】2028321

(32)【優先日】2021-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521271727

【氏名又は名称】サプリームテクノロジーズ，ベー．フェー．

【氏名又は名称原語表記】ＳＡＰＲＥＭＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳＢ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｌａａｎ９，ＢｕｉｌｄｉｎｇＡ１２－１，３７２１ＭＡＢｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】ポステル，ルーベン

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】メルツェヒ，マティアスフリードリッヒ

(72)【発明者】

【氏名】ザマジムコ

(57)【要約】

本発明の第１の態様は、細胞内への核酸のインビトロ送達におけるサポニンの使用に関する。典型的には、核酸は例えば少なくとも５．５ｋｂｐという比較的大きいサイズを有するプラスミドＤＮＡである。本発明の第２の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸をインビトロの細胞内に送達するための方法に関する。典型的には、核酸は例えば少なくとも５．５ｋｂｐという比較的大きいサイズを有するプラスミドＤＮＡである。本発明の第３の態様は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸をインビトロの細胞内に送達するためのパーツキットに関する。加えて、本発明は細胞内への核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子にも関し、ナノ粒子はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸、ポリリジンペプチド、および任意にサポニンを含むかまたはそれらからなる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内への核酸のインビトロ送達におけるサポニンの使用であって、ここで、前記サポニンはビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、前記核酸は５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む、細胞内への核酸のインビトロ送達におけるサポニンの使用。

【請求項2】

前記サポニンは、式（Ｉ）に従い、

【化1】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、前記キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、前記サポニンに存在し、
好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンのＲ^１はキシロース残基であり、および／または、前記サポニンは厳密に２つのアセチル基を持ち、
より好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記アセチル基は、前記サポニンの対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、
あるいは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記Ｒ^２残基の１つはキシロース残基であり、前記Ｒ^２残基の１つはアセチル基であり、前記Ｒ^２残基の１つはＨであり、好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記キシロース残基は、対応するキノボース残基のＣ３位置における酸素原子に結合され、前記アセチル基は前記サポニンの対応するキノボース残基のＣ４位置における酸素原子に結合され、
あるいは、より好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンのＲ^１はキシロース残基であり、式（Ｉ）に従う前記サポニンの２つのＲ^２基はアセチル基であり、これらは対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、前記第３のＲ^２基はＨである、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記サポニンは、式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１であり、

【化2】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
あるいは、前記サポニンは式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１である、

【化3】

請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記核酸はプラスミドＤＮＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項5】

前記核酸はナノ粒子の一部を形成し、このナノ粒子はさらにナノ粒子形成化合物を含み、好ましくは、前記ナノ粒子形成化合物はポリリジンペプチドを含むかまたはそれからなり、好ましくは、前記ポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくは前記ポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子形成化合物および前記核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記核酸が、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする前記核酸の第１の部分を含み、ここで、前記核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む前記核酸の第２の部分を含み、好ましくは、前記核酸はＣａｓをコードするプラスミドＤＮＡであり、より好ましくは、前記核酸は少なくとも前記Ｃａｓを発現するためのプラスミドＤＮＡであり、さらにはより好ましくは、前記核酸は、前記Ｃａｓを発現するため、かつ前記ｇＲＮＡを発現するためのプラスミドＤＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項8】

前記核酸、好ましくは前記プラスミドＤＮＡ、より好ましくは前記ＣａｓをコードするプラスミドＤＮＡは、少なくとも６ｋｂｐ、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐよりも多くを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項9】

前記Ｃａｓをコードする核酸は、Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓをコードする、請求項７～８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項10】

前記細胞は、真核細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項11】

インビトロの細胞内に５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸を送達するための方法であって、
（ｉ）前記核酸を提供するステップと、
（ｉｉ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるサポニンを提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記サポニンの存在下において前記核酸と前記細胞をインキュベーションするステップと、を含む方法。

【請求項12】

前記サポニンは、式（Ｉ）に従い、

【化4】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、前記キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、前記サポニンに存在する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸は、プラスミドＤＮＡである、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記核酸は、ナノ粒子の一部を形成し、このナノ粒子はさらにナノ粒子形成化合物を含み、好ましくは、前記ナノ粒子は前記ナノ粒子形成化合物のポリリジンペプチドを含み、好ましくは前記ポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくは前記ポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子形成化合物および前記核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

サポニン濃度は、前記方法のステップ（ｉｉ）において１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬである、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記サポニンは、式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１であり、

【化5】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
あるいは、前記サポニンが式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１である、

【化6】

請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記核酸は、少なくともＣａｓをコードする第１の部分を含む前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸であり、前記核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするか、あるいはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである第２の部分を含み、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする前記核酸はプラスミドＤＮＡの一部として提供され、好ましくは、ここで、少なくとも、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトの前記Ｃａｓ部分をコードする前記核酸の前記部分はプラスミドＤＮＡの一部として提供され、より好ましくは、前記プラスミドＤＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトの前記Ｃａｓおよび前記ｇＲＮＡを発現するためである、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸、好ましくは前記プラスミドＤＮＡは、少なくとも６ｋｂｐ、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐよりも多くを含む、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

【請求項21】

インビトロの細胞内に５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸を送達するためのパーツキットであって、
（ａ）第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、第２のプラスミドＤＮＡを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択される少なくとも１つのサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、を含むか、またはそれらからなる第１の組み合わせ、
ここで、前記使用は、少なくとも、前記ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび前記第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意に前記サポニンの調製を含み、
前記第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
（ａ）第３のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第２の容器、
（ｃ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択される少なくとも１つのサポニンを含む第３の容器、
（ｄ）使用説明書、を含むかまたはそれらからなる第２の組み合わせ、
ここで、前記使用は、少なくとも、前記ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび前記第３のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意に前記サポニンの調製を含み、
前記第３のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
（ａ）前記第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択される少なくとも１つのサポニンのサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、を含むかまたはそれらからなる第３の組み合わせ、
ここで、前記使用は、少なくとも、前記ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび前記第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意に前記サポニンの調製を含み、
前記第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
好ましくは、前記第１のプラスミドＤＮＡはＣａｓ９をコードし、前記第２のプラスミドＤＮＡはｇＲＮＡをコードし、および／または前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドはｇＲＮＡのＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、または、前記第３のプラスミドＤＮＡはＣａｓ９をコードしかつｇＲＮＡをコードする、を含むパーツキット。

【請求項22】

細胞内への核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子は、
（ｉ）５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む前記核酸、
（ｉｉ）ポリリジンペプチド、および
（ｉｉｉ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるサポニン、を含むかまたはそれらからなる、組成物。

【請求項23】

前記サポニンは、式（Ｉ）に従い、

【化7】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、前記キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、前記サポニンに存在し、
好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンのＲ^１はキシロース残基であり、および／または、前記サポニンは厳密に２つのアセチル基を持ち、
あるいは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記アセチル基は、前記サポニンの対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、
より好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記Ｒ^２残基の１つはキシロース残基であり、前記Ｒ^２残基の１つはアセチル基であり、前記Ｒ^２残基の１つはＨであり、
さらにはより好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンの前記キシロース残基は対応するキノボース残基のＣ３位置における酸素原子に結合され、前記アセチル基は前記サポニンの対応するキノボース残基のＣ４位置における酸素原子に結合され、
最も好ましくは、式（Ｉ）に従う前記サポニンのＲ^１はキシロース残基であり、式（Ｉ）に従う前記サポニンの２つのＲ^２基はアセチル基であり、これらは対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、第３のＲ^２基はＨである、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記サポニンは、式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１であり、

【化8】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
または、前記サポニンは式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１である、

【化9】

請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記ポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくは前記ポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項26】

前記ナノ粒子は、前記ポリリジンペプチドおよび前記核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項27】

前記核酸は、プラスミドＤＮＡの一部である、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項28】

前記核酸は、少なくとも、Ｃａｓをコードする前記核酸の第１の部分を含み、前記核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするか、あるいはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである前記核酸の第２の部分を含む、請求項２２～２７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項29】

前記核酸、好ましくは前記プラスミドＤＮＡは、少なくとも６ｋｂｐ、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐよりも多くを含む、請求項２２～２８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項30】

前記核酸の前記Ｃａｓをコードする第１の部分は、Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓをコードする、請求項２２～２９のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の第１の態様は、細胞内への比較的大きい核酸のインビトロ送達におけるサポニンの使用に関し、核酸は５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む。本発明の第２の態様は、サポニンの存在下においてインビトロの細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードするかかる核酸を送達するための方法に関する。本発明の第３の態様は、サポニンの存在下において、インビトロの細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸を送達するためのパーツキットに関する。加えて、本発明は、細胞内への核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子にも関し、ナノ粒子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸、ポリリジンペプチド、および任意にサポニンを含むかまたはそれらからなる。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）－Ｃａｓ９技術－多くの場合に「遺伝子のはさみ」と呼ばれる－は、ここ数年に遺伝子技術の分野に革命を起こしたツールである。その単純な、安価な、かつ迅速な操作によって、ゲノムからＤＮＡ配列またはさらには遺伝子を精確に切り出すかまたは挿入することが可能である（ゲノム編集）。これらの特性は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を、他の既に存在する遺伝子編集ツールに優る遺伝子治療のための有益なかつ有望な技術にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の真正の目的は、バクテリオファージに対する細菌ストレプトコッカス・ピオゲネスの抗ウイルス防御メカニズムである。

【0003】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は３つの構成要素からなる。Ｃａｓ９は鎖切断を誘導する細菌の酵素である（二本鎖切断の場合にはヌクレアーゼ、一本鎖切断の場合にはニッカーゼ）。ヌクレアーゼがその酵素活性の場所を認識するために、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成し、これは精確な切断のために必要な情報をＣａｓ９酵素に与える。

【0004】

バクテリオファージ感染の間に、ｃｒＲＮＡは、ファージ配列の配列と、それによって、二本鎖切断を誘導および感染を防止するための情報とを所有するかまたは得る。ｔｒａｃｒＲＮＡの目的は、ｃｒＲＮＡを安定化し、一緒になってＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を形成することであり、その標的に対するｃｒＲＮＡ配列のアニーリング後に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼはファージ配列を切り得る。細胞の修復メカニズムがその後に変異に至り、遺伝子不活性化（ノックアウト）をもたらす。

【0005】

この発見された防御メカニズムは、人工ｃｒＲＮＡを設計することによって選択された遺伝子を標的化するというアイディアが生じたときに、ゲノム編集の革命を動き出させた。遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づくノックアウトまたは挿入（「ノックイン」）が可能であり、その単純な、迅速な、かつ費用対効果の良い応用可能性によって他のゲノム編集技術からそれ自体を区別した。

【0006】

サイトゾル内へのｇＲＮＡと一緒のＣａｓ９ヌクレアーゼの導入は、酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの形態で可能である。しかしながら、トランスフェクション効率は不良であり、Ｃａｓ９をコードする（プラスミド）ＤＮＡを導入することによるインビトロのＣａｓ９ヌクレアーゼの使用は、大きいプラスミドＤＮＡなどの比較的大きいＤＮＡコンストラクトの低いトランスフェクション効率を原因として阻止される。よって、通常は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ／蛋白質それ自体が市販の試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）Ｃａｓ９トランスフェクション試薬）の助けによって送達されている。なぜなら、このやり方では、より効率的な移入およびより少ないオフターゲット効果が示され、細胞内に蛋白質をインビトロ送達することによって、不良なＤＮＡトランスフェクション効率が防止されるからである。

【0007】

本発明者らの知る限り、これまで、比較的大きい、すなわちＣａｓ９ＤＮＡプラスミド、すなわちＣａｓ９をコードし、かつ少なくとも５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）のサイズを有するプラスミドＤＮＡのようなＤＮＡコンストラクトを、単純なかつ効率的なやり方で送達することができるインビトロの非ウイルス系のトランスフェクションエンハンサーは存在しない。さらに、プラスミドＤＮＡなどのＤＮＡを送達し得る普遍的なトランスフェクションエンハンサーは、細胞内へのインビトロＣａｓ９ＤＮＡ送達の分野の業者にとって利用可能ではない。

【発明の概要】

【0008】

本発明者らは、驚くべきことに、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９核酸コンストラクトのような比較的大きいプラスミドの効率的なインビトロ送達が、植物の防御分子、すなわちサポニンを細胞のトランスフェクションの間に適用することによって確立され得ることを明らかにしている。特定の群のトリテルペノイドサポニン（ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニン）、例えばＳＯ１８６１およびＧＥ１７４１は、オリゴリジンに基づくナノプレックスのトランスフェクション効率をかなりの度合いで増大させることができる（サーマ（Sama）ら，２０１７年、サーマ（Sama）ら，２０１８年）。今や、本発明によって、本発明者らは、（ｉ）核酸およびポリリジンを含むペプチドに基づくナノ粒子のサポニンに基づくトランスフェクション（本発明者らによってサポフェクションという造語で呼ばれる）の実現可能性、（ｉｉ）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびミニサークルＤＮＡなどの核酸の普遍的な複合体化、ならびに（ｉｉｉ）サポニンの非毒性の濃度、すなわち１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬの使用は、サポニンを、大きいプラスミドＤＮＡのトランスフェクションの分野において適用されるＤＮＡを含む組成物の好適な構成成分にするということを確立した。

【0009】

本発明の第１の態様は、ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンである、特に式（Ｉ）に従うサポニンの、細胞内への核酸のインビトロ送達における使用に関する：

【0010】

【化1】

【0011】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、サポニンに存在し、
核酸は、少なくとも５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含み、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、さらに任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0012】

本発明者らは、先に、カーネーションファミリーからの植物二次代謝物が、比較的小さいサイズのプラスミドＤＮＡ（＜５ｋｂｐ）、ミニサークルＤＮＡ（～３ｋｂｐ）、およびｍＲＮＡ（＜１ｋｂｐ）の細胞内送達を増大させるということを先に明らかにした。トリテルペンサポニンを用いるＤＮＡトランスフェクション技術は、サポニンがトランスフェクションプロセスを改善するためのツールとして用いられているということを示唆するサポフェクションという造語で呼ばれた。サポニン以外の普通に使用されるトランスフェクション試薬の短所は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトなどの比較的大きいプラスミドが標的細胞内にトランスフェクションされなければならないときの、それらの低い効率である。本発明者らは、今や、ジプソフィラ・エレガンスＭ．ビーブおよびサポナリア・オフィシナリスＬ．からの植物二次代謝物が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトなどの大きい核酸コンストラクト（例えば、サイズ＞８，０００ｂｐを有するプラスミドＤＮＡ）の細胞内送達を改善するということを示す。本発明者らは、驚くべきことに、ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるこれらのサポニン化合物、例えばＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１が、真核細胞内への複合体化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトの有効な送達に寄与するということを確立した。

【0013】

トリテルペンサポニンは、かなりの数の植物によって合成される植物由来二次代謝物である。本発明者らは、先に、キャラクタリゼーションされたトリテルペンサポニン、例えばサポナリア・オフィシナリスＬ．からのＳＯ１８６１、ジプソフィラ・エレガンスＭ．ビーブからのＧＥ１７４１、およびアグロステンマ・ギタゴＬ．からのＡＧ１８５６が、（小さいサイズの）プラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、およびｍＲＮＡを含有するオリゴリジンに基づくナノプレックスのトランスフェクション効率を、かなりの度合いで増大させるということを明らかにした（クロシャール（Clochard）ら，２０２０年、サーマ（Sama）ら，２０１８年ａ、サーマ（Sama）ら，２０１７年）。これらのトランスフェクションの単純な実現可能性は、トリテルペンサポニンをトランスフェクションの分野における新規のかつ有望なプレーヤーにする。

【0014】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドロームリピート）－Ｃａｓ９技術は、染色体ＤＮＡ上の遺伝子の精確な欠失およびゲノム上へのＤＮＡ配列の挿入を許す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は３つの構成要素からなる。Ｃａｓ９は鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼである。ｔｒａｃｅｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、Ｃａｓ９－ヌクレアーゼを所望の切断部位に導く。比較的大きいＣａｓ９ＤＮＡプラスミドコンストラクト（プラスミドＤＮＡサイズは７，０００ｂｐまたはより大きい）の送達にとって好適である非ウイルス系のトランスフェクション試薬の数は、限定されているかまたは実在さえもしない。

【0015】

本発明者らは、今や、ＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１が、真核細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＤＮＡプラスミドコンストラクトを包含する大きい核酸の送達のための強力な促進因子かつツールであるということを示した。加えて、本発明者らは、トランスフェクションがＧＥ１７４１などのサポニンの存在下であったときには、大きいプラスミドＤＮＡ（７，０００ｂｐよりも大きいサイズ）の一部としてトランスフェクションされたＧＦＰドナー配列によって、効率的なノックアウト実験が首尾良く確立されたということをも明らかにした。

【0016】

本発明の第２の態様は、インビトロの細胞内に、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸を送達する方法に関し、以下のステップを含む：
（ｉ）核酸を提供することおよび式（Ｉ）に従うサポニンを提供すること、

【0017】

【化2】

【0018】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、サポニンに存在する；ならびに
（ｉｉ）サポニンの存在下において核酸と細胞をインキュベーションすること、
ここで、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、Ｃａｓをコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするかまたはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである核酸の第２の部分を含む。

【0019】

大きいプラスミドＤＮＡのＣＭＶ－ＣＡＳ９－２Ａ－ＧＦＰ（８．２ｋｂｐ）（シグマアルドリッチ、タウフキルヘン、独国）の複合体化のために、ポリリジン（Ｋ_１６）に基づくナノプレックスが製剤された（図１）。異なる質量比で製剤されたＰ（ペプチド）Ｄ（Ｃａｓ９－ＧＦＰプラスミド）ナノプレックスの平均サイズおよびＰＤＩ（多分散指数）が、マルバーンナノゼータサイザー（マルバーン・インストゥルメンツＬｔｄ．、英国）を用いて測定された。より高い質量比では、より低いサイズの傾向が観察され得た。ＰＤＩは一定の単分散分布を示した、ｎ≧３。本発明者らは、当分野において公知のアガロースに基づくゲル電気泳動およびＱｕａｎｔ－ＩＴ－ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを適用することによって、ナノプレックスの複合体化効率をもまた決定した（サーマ（Sama）ら，２０１７年、図３）。ゲル保持アッセイおよび定量的な複合体化効率を適用することによって、ＰＤナノプレックス製剤のＤＮＡ保持ポテンシャルは、ＤＮＡ複合体化効率の定性的な尺度としての用をなした。ナノプレックス製剤はＤＮＡを保持してゲル上の移動をさせない。定量的な複合体化アッセイは、プラスミドＤＮＡおよびポリリジンペプチドを含む全ての製剤について効率的な複合体化を示した。

【0020】

生物物理学的キャラクタリゼーションが、大きいプラスミドＤＮＡおよびポリリジンペプチドのナノプレックスが形成されたということを確立した後に、細胞実験、トランスフェクションが行なわれた。ペプチド／ＤＮＡ（Ｎ／Ｐ）比を原因として、本発明者らによって実施された試験は、１６：１またはより高い質量比のペプチド対プラスミドＤＮＡ質量比では細胞に対するナノプレックスの毒性の効果を明らかにし、加えて、本発明者らによって実施されたさらなる試験は、２：１またはより低いペプチド対プラスミドＤＮＡ質量比では非効率的な核酸送達を明らかにした。いかなる理論による拘束も望まなければ、後者の効果は最も蓋然的にはＤＮＡの不十分な複合体化を原因とする。よって、本発明者らは、４：１比および８：１比で製剤されたＰＤナノプレックスによって実施された例によって、本発明の利益を実証する。ＪＩＭＴ－１細胞（ＤＳＭＺ、ｎｏ．ＡＣＣ５８９）およびＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞（ＤＳＭＺ、ｎｏ．ＡＣＣ１４８）が、トランスフェクションされるべきである細胞が考えられるときに非毒性の濃度で、ＧＥ１７４１同時適用またはＳＯ１８６１同時適用あり、およびなしで、比較的大きいＣａｓ９－ＧＦＰプラスミドを含有するナノプレックスによってトランスフェクションされた。全てのトランスフェクション条件のトランスフェクション効率が、蛍光強度の観点から負の対照（例えば、サポニンの不在下においてナノ粒子と接触させられた細胞）と比較して、フローサイトメトリーを用いて４８時間のインキュベーション時間後に測定された。ＧＥ１７４１に基づくトランスフェクションおよびＳＯ１８６１に基づくトランスフェクションの効率は、ナノ粒子のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（商標）に基づくトランスフェクションの効率ともまた比較された。トランスフェクションは普通に公知のかつ当分野において適用されるプロトコールに従って行なわれた（クロシャール（Clochard）ら，２０２０年、サーマ（Sama）ら，２０１８年ａ、サーマ（Sama）ら，２０１７年、サーマ（Sama）ら，２０１８年ｂ）。トランスフェクション効率はＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞において４．１のペプチド／ＤＮＡ比から８：１比までは増大しなかったので、４：１の比がＪＩＭＴ－１細胞によるさらなる試験および例に用いられた。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞およびＪＩＭＴ－１細胞におけるＧＥ１７４１によって媒介されるＰＤトランスフェクションおよびＳＯ１８６１によって媒介されるＰＤトランスフェクションのトランスフェクション効率が評価された。細胞が、Ｃａｓ９－ＧＦＰＤＮＡを含有するＰＤナノプレックスによって、ＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１あり、およびなしでトランスフェクションされた（サポニンの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった）。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞およびＪＩＭＴ－１細胞において、トランスフェクション（transection）効率は３０％および４０％の間で変動した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は参照としての用をなした、ｎ≧３。ＧＥ１７４１不使用のトランスフェクションまたはＳＯ１８６１不使用のトランスフェクションと比較して有意な違いが明らかであった。Ｕ検定、ｐ≦０．０５。

【0021】

ＳＯ１８６１と比較して、ＧＥ１７４１はわずかにより良好なトランスフェクション調節特性を見せた。さらなるノックアウト実験では、ＧＥ１７４１およびＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が試験された。ゲノムＤＮＡ上へのＧＦＰの遺伝子を含有する直鎖ドナー配列（ＬＤＳ）の組み込みが、Ｏｒｉｇｅｎｅ（ヘルフォルト、独国）からの以下の３つのキットを用いて評価された：Ｓｌｃ１９ａ３－ＫＮ２．０（ＣＡＴ＃ＫＮ５１５９１１）、Ｓｌｃ２５ａ２４－ＫＮ２．０（ＣＡＴ＃ＫＮ５１５９７０）、およびＳｌｃ２６ａ４－ＫＮ２．０（ＣＡＴ＃ＫＮ５１６００６）。これらのキットは、全ての３つが、相同性によって媒介されないＣＲＩＳＰＲによるマウス遺伝子ノックアウトキットであった。キットは、Ｃａｓ９および標的特異的なｓｇＲＮＡをコードするオールインワンプラスミドを含有した。Ｓｌｃ２６ａ４キットは１２番染色体の溶質輸送体ファミリー２６メンバー４を標的化した。Ｓｌｃ２６ａ４座位を標的化することによるｉｎｄｅｌ効率は、既にＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞において示され得た（リュ（Ryu）ら，２０１８年）。そして、直鎖ドナーキット（Ｓｌｃ１９ａ３、Ｓｌｃ２５ａ２４）については、２つの異なるｓｇＲＮＡ配列が試験された。実施例の項において、図９はＧＥ１７４１の存在下におけるトランスフェクション効率を実証している。ＧＦＰによって媒介される蛍光は、サポニンの存在の影響下における染色体ＤＮＡ上への直鎖ドナー配列の効率的な送達および組み込みを示す。それゆえに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞における異なる溶質輸送体遺伝子（Ｓｌｃ）のノックアウトについて、異なる標的（ノックアウトされる遺伝子）および異なる組み込み技術の効率を比較するために、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞が異なるキットによってトランスフェクションされた（図８および図１０参照）。トランスフェクション効率の有意な増大が、ＧＥ１７４１不使用のトランスフェクションと比較してＧＥ１７４１によって処置された細胞について観察された。Ｕ検定、ｐ≦０．０５（ｎ≧３）。

【0022】

それゆえに、これらの例は、驚くべきことに、ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニン、特に、ジプソフィラ・エレガンスＭ．ビーブからのサポニンＧＥ１７４１およびサポナリア・オフィシナリスＬ．からのＳＯ１８６１が、単純なかつ効率的なやり方で、真核細胞内への、６．５ｋｂｐまたはより大きい、最高で８．２ｋｂｐ以上のサイズを有する比較的大きいＤＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクト（例えばプラスミドＤＮＡ）の効率的な送達にとって好適であるということを確立した。

【0023】

本発明の第３の態様は、インビトロの細胞内に、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトなどをコードする５．５ｋｂｐよりも多く、好ましくは８ｋｂｐよりも多くを含む核酸を送達するためのパーツキットに関し、以下を含む：
以下を含むかまたはそれらからなる第１の組み合わせ：
（ａ）例えばＣａｓ９をコードする第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、例えばｇＲＮＡをコードする第２のプラスミドＤＮＡを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）少なくとも１つのビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第２の組み合わせ：
（ａ）例えばＣａｓ９をコードし、かつｇＲＮＡをコードする第３のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第２の容器、
（ｃ）少なくとも１つのビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つを含む第３の容器、
（ｄ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第３のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
第３のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第３の組み合わせ：
（ａ）例えばＣａｓ９をコードする第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド、例えばｇＲＮＡのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）少なくとも１つのビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する。

【0024】

本発明は、細胞内への例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む組成物にもまた関し、ここで、ナノ粒子は以下を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸、
（ｉｉ）ポリリジンペプチド、および
（ｉｉｉ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるサポニン、
場合によっては、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0025】

好ましい組成物は、本発明の細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む組成物であり、さらに式（Ｉ）に従うサポニンを含む：

【0026】

【化3】

【0027】

【0028】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。好ましくは、サポニンはＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１、より好ましくはＧＥ１７４１である。好ましくは、ポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる。好ましくは、核酸はプラスミドＤＮＡの一部として提供される。好ましくは、コードされるＣａｓは、Ｃａｓ９（配列番号１）、または少なくとも９０％の配列同一性をＣａｓ９に対して有するＣａｓである。

【0029】

本発明が具体的な実施形態について記載されるが、本発明はそれにではなく請求項によってのみ限定される。本明細書に記載される本発明の実施形態は、別様に指定されない限り、組み合わせおよび共同で機能し得る。

【0030】

定義
用語の第１、第２、第３、および同類は、本明細書および請求項において、必ずしも配列的または時間的順序を記載するためではなく、例えば類似の要素、組成物、組成物の構成成分、または別個の方法ステップを区別するために用いられる。用語は適当な状況下では交換可能であり、本発明の実施形態は、別様に指定されない限り、本明細書に記載または例示される以外の配列で機能し得る。

【0031】

本明細書に記載される本発明の実施形態は、別様に指定されない限り、組み合わせおよび共同で機能し得る。

【0032】

さらにその上、種々の実施形態は、「好ましい」または「例えば（e.g.）」もしくは「例えば（for example）」または「特に」および同類として言及されるが、本発明の範囲を限定するとしてではなく、むしろ、本発明が実装され得る例示的な様式で解釈されるべきである。

【0033】

請求項において用いられる用語「含む」は、その後に挙げられている例えば要素あるいは組成物、方法、使用、パーツキットの方法ステップまたは構成成分に制限されると解釈されるべきではない。それは他の要素あるいは方法ステップまたはある種の組成物中の構成成分を排除しない。それは、言及される申し立てられた特徴、物、（方法）ステップ、または構成要素の存在を指定すると解釈されることを必要とするが、１つ以上の他の特徴、物、ステップ、もしくは構成要素、またはそれらの群の存在または追加を妨げない。それゆえに、表現「ステップＡおよびＢを含む方法」の範囲はステップＡおよびＢのみからなる方法に限定されるべきではなく、むしろ、本発明については、方法の列挙されているのみのステップがＡおよびＢであり、さらに、請求項はそれらの方法ステップの均等物を包含すると解釈されるべきである。それゆえに、表現「構成要素ＡおよびＢを含む組成物」の範囲は構成要素ＡおよびＢのみからなる組成物に限定されるべきではなく、むしろ、本発明については、組成物の列挙されているのみの構成要素がＡおよびＢであり、さらに、請求項はそれらの構成要素の均等物を包含すると解釈されるべきである。

【0034】

加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素または構成要素の言及は、文脈が要素または構成要素のただ１つのみがあるということを明瞭に要求しない限り、要素または構成要素の１つよりも多くが存在するという可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、それゆえに、通常は「少なくとも１つ」を意味する。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】異なる質量比で製剤されたＰＤナノプレックスの平均サイズおよびＰＤＩを提示する表。ペプチド／ＤＮＡ（ＰＤ）ナノプレックスが、低い粒子サイズおよび好ましくは単分散サイズ分布を有する最適な製剤を評価するために異なる質量比で製剤された。より高い質量比では、より低いサイズの傾向が観察された。ＰＤＩは一定の単分散分布を示した。ｎ≧３。

【図2A】ＤＮＡを装填した（Ｄ）オリゴリジンに基づく（Ｐ）ナノプレックスのサイズ分布。Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ａ）、ＧＦＰＤＮＡ（Ｂ）、またはＧＦＰ－Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ｃ）を装填したＰＤナノプレックス（ペプチド質量：ＤＮＡ質量について４：１質量比）は、１２０ｎｍ前後に主要なサイズ分布を示した。凝集した粒子の割合は低かった（１，０００～１０，０００ｎｍのサイズ範囲に小さいピーク）。

【図2B】ＤＮＡを装填した（Ｄ）オリゴリジンに基づく（Ｐ）ナノプレックスのサイズ分布。Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ａ）、ＧＦＰＤＮＡ（Ｂ）、またはＧＦＰ－Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ｃ）を装填したＰＤナノプレックス（ペプチド質量：ＤＮＡ質量について４：１質量比）は、１２０ｎｍ前後に主要なサイズ分布を示した。凝集した粒子の割合は低かった（１，０００～１０，０００ｎｍのサイズ範囲に小さいピーク）。

【図2C】ＤＮＡを装填した（Ｄ）オリゴリジンに基づく（Ｐ）ナノプレックスのサイズ分布。Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ａ）、ＧＦＰＤＮＡ（Ｂ）、またはＧＦＰ－Ｃａｓ９ＤＮＡ（Ｃ）を装填したＰＤナノプレックス（ペプチド質量：ＤＮＡ質量について４：１質量比）は、１２０ｎｍ前後に主要なサイズ分布を示した。凝集した粒子の割合は低かった（１，０００～１０，０００ｎｍのサイズ範囲に小さいピーク）。

【図3A】定量的な複合体化効率を包含する一連のナノプレックス製剤についてのゲル保持アッセイ。ＰＤナノプレックス製剤のＤＮＡ保持ポテンシャルは、ＤＮＡ複合体化効率の定性的な尺度としての用をなした。製剤されたナノプレックスはアガロースゲルポケットにアプライされ、その後に電圧が印加された。良く複合体化したナノプレックスは低い臭化エチジウム染色を示し、ゲル上の移動を示さない。遊離の移動するＤＮＡと比較して（図３Ａおよび図３Ｂの左レーン、０：１）、ナノプレックス製剤のいずれも、左から右に第２～第８レーンのいずれかにおいてそれらのポケットから出なかった。ＰＤのシグナル（ＧＦＰ－ＤＮＡ；図３Ａおよび図３Ｂの最後の３つのレーン、左からレーン６～８）はより弱く見え、より小さいＤＮＡのより良好な複合体化を指示した。定量的な複合体化アッセイは全ての製剤について効率的な複合体化を示した。ＧＦＰを装填したナノプレックスは最も良く複合体化され、より大きいサイズのプラスミド（Ｃａｓ９－ＧＦＰ－ＤＮＡ。図３Ｂ、左からレーン２～５）はわずかにより少なく複合体化され、ＰＤ（Ｃａｓ９ＤＮＡ）プラスミド（図３Ａ、左からレーン２～５）についての複合体化効率は、約それらの他の２つの複合体化効率の間であった。

【図3B】定量的な複合体化効率を包含する一連のナノプレックス製剤についてのゲル保持アッセイ。ＰＤナノプレックス製剤のＤＮＡ保持ポテンシャルは、ＤＮＡ複合体化効率の定性的な尺度としての用をなした。製剤されたナノプレックスはアガロースゲルポケットにアプライされ、その後に電圧が印加された。良く複合体化したナノプレックスは低い臭化エチジウム染色を示し、ゲル上の移動を示さない。遊離の移動するＤＮＡと比較して（図３Ａおよび図３Ｂの左レーン、０：１）、ナノプレックス製剤のいずれも、左から右に第２～第８レーンのいずれかにおいてそれらのポケットから出なかった。ＰＤのシグナル（ＧＦＰ－ＤＮＡ；図３Ａおよび図３Ｂの最後の３つのレーン、左からレーン６～８）はより弱く見え、より小さいＤＮＡのより良好な複合体化を指示した。定量的な複合体化アッセイは全ての製剤について効率的な複合体化を示した。ＧＦＰを装填したナノプレックスは最も良く複合体化され、より大きいサイズのプラスミド（Ｃａｓ９－ＧＦＰ－ＤＮＡ。図３Ｂ、左からレーン２～５）はわずかにより少なく複合体化され、ＰＤ（Ｃａｓ９ＤＮＡ）プラスミド（図３Ａ、左からレーン２～５）についての複合体化効率は、約それらの他の２つの複合体化効率の間であった。

【図4A】Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞（図４Ａ）およびＪＩＭＴ－１細胞（図４Ｂ）におけるサポニンによって媒介されるＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞（Ａ）およびＪＩＭＴ－１細胞（Ｂ）が、ＧＦＰ－ＤＮＡ（すなわち、ＧＦＰＤＮＡを含むプラスミド）を担持するＰＤナノプレックスによってまたはＣａｓ９－ＧＦＰ－ＤＮＡを担持するＰＤナノプレックスによって、最も高い非毒性のサポニン同時投与（２μｇ／ｍｌでのＧＥ１７４１同時投与、または２μｇ／ｍｌでのＳＯ１８６１同時投与）あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクションは７０％前後の高い効率に到達し、全ての細胞のおよそ４０％がＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション後にＧＦＰを発現した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなし、有効なＧＦＰ－ＤＮＡ送達のみを示した。ＧＦＰ－Ｃａｓ９－ＤＮＡは低い量でのみ送達された、Ｎ≧３。＊：サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い、Ｕ検定。

【図4B】Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞（図４Ａ）およびＪＩＭＴ－１細胞（図４Ｂ）におけるサポニンによって媒介されるＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞（Ａ）およびＪＩＭＴ－１細胞（Ｂ）が、ＧＦＰ－ＤＮＡ（すなわち、ＧＦＰＤＮＡを含むプラスミド）を担持するＰＤナノプレックスによってまたはＣａｓ９－ＧＦＰ－ＤＮＡを担持するＰＤナノプレックスによって、最も高い非毒性のサポニン同時投与（２μｇ／ｍｌでのＧＥ１７４１同時投与、または２μｇ／ｍｌでのＳＯ１８６１同時投与）あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクションは７０％前後の高い効率に到達し、全ての細胞のおよそ４０％がＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション後にＧＦＰを発現した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなし、有効なＧＦＰ－ＤＮＡ送達のみを示した。ＧＦＰ－Ｃａｓ９－ＤＮＡは低い量でのみ送達された、Ｎ≧３。＊：サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い、Ｕ検定。

【図5A】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図5B】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図5C】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図5D】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図5E】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図5F】ＰＤ（Ｃａｓ９－ＧＦＰ）トランスフェクション±サポニン投与の間のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のコンフルエンス測定。コンフルエンスの視覚的なモニタリングが、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＣａｓ９－ＧＦＰトランスフェクション（図５Ａ、Ｅ、Ｆ）およびＧＦＰ－ＤＮＡトランスフェクション（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）の間に実施された。インキュベーション時間の間のコンフルエンスの提示はＣｙｔｏｓｍａｒｔのアルゴリズムによって提供された。無処置の負の対照と比較して、明確な毒性の効果は観察され得なかった（図５Ａ、Ｂ）。サポニンＧＥ１７４１は、経時的なコンフルエンシー評価の間に不在であったか（図５Ａ、Ｃ、Ｅ）または存在した（図５Ａ、Ｄ、Ｆ）。図５Ｂ～Ｆは、９５時間のインキュベーション時間後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞コンフルエンシーを示す。

【図6A】ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（共トランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ＤＮＡプラスミドおよびｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションによって、４：０．５：０：５の比で、５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェルおよびウェルあたり４，０００ｎｇのポリリジンＫ_１６ペプチドによってトランスフェクションされた。ＦＩＴＣ－Ｈメジアンの減少が、サポニンＧＥ１７４１ありのおよびなしのトランスフェクションで観察された。サポニン同時投与では、ＦＩＴＣ－Ｈは１０％減少し（図６Ｄ）、負の対照と比較して「蛍光性」と考えられない細胞の量は７．５％増大した（図６Ｅ）、ｎ≧３。図６Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図６Ｂ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｄ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）についてのメジアンのＦＩＴＣ－Ｈの値。図６Ｅ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）における非蛍光性の細胞の量。

【図6B】ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（共トランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ＤＮＡプラスミドおよびｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションによって、４：０．５：０：５の比で、５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェルおよびウェルあたり４，０００ｎｇのポリリジンＫ_１６ペプチドによってトランスフェクションされた。ＦＩＴＣ－Ｈメジアンの減少が、サポニンＧＥ１７４１ありのおよびなしのトランスフェクションで観察された。サポニン同時投与では、ＦＩＴＣ－Ｈは１０％減少し（図６Ｄ）、負の対照と比較して「蛍光性」と考えられない細胞の量は７．５％増大した（図６Ｅ）、ｎ≧３。図６Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図６Ｂ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｄ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）についてのメジアンのＦＩＴＣ－Ｈの値。図６Ｅ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）における非蛍光性の細胞の量。

【図6C】ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（共トランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ＤＮＡプラスミドおよびｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションによって、４：０．５：０：５の比で、５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェルおよびウェルあたり４，０００ｎｇのポリリジンＫ_１６ペプチドによってトランスフェクションされた。ＦＩＴＣ－Ｈメジアンの減少が、サポニンＧＥ１７４１ありのおよびなしのトランスフェクションで観察された。サポニン同時投与では、ＦＩＴＣ－Ｈは１０％減少し（図６Ｄ）、負の対照と比較して「蛍光性」と考えられない細胞の量は７．５％増大した（図６Ｅ）、ｎ≧３。図６Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図６Ｂ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｄ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）についてのメジアンのＦＩＴＣ－Ｈの値。図６Ｅ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）における非蛍光性の細胞の量。

【図6D】ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（共トランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ＤＮＡプラスミドおよびｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションによって、４：０．５：０：５の比で、５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェルおよびウェルあたり４，０００ｎｇのポリリジンＫ_１６ペプチドによってトランスフェクションされた。ＦＩＴＣ－Ｈメジアンの減少が、サポニンＧＥ１７４１ありのおよびなしのトランスフェクションで観察された。サポニン同時投与では、ＦＩＴＣ－Ｈは１０％減少し（図６Ｄ）、負の対照と比較して「蛍光性」と考えられない細胞の量は７．５％増大した（図６Ｅ）、ｎ≧３。図６Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図６Ｂ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｄ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）についてのメジアンのＦＩＴＣ－Ｈの値。図６Ｅ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）における非蛍光性の細胞の量。

【図6E】ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（共トランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ＤＮＡプラスミドおよびｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションによって、４：０．５：０：５の比で、５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェルおよびウェルあたり４，０００ｎｇのポリリジンＫ_１６ペプチドによってトランスフェクションされた。ＦＩＴＣ－Ｈメジアンの減少が、サポニンＧＥ１７４１ありのおよびなしのトランスフェクションで観察された。サポニン同時投与では、ＦＩＴＣ－Ｈは１０％減少し（図６Ｄ）、負の対照と比較して「蛍光性」と考えられない細胞の量は７．５％増大した（図６Ｅ）、ｎ≧３。図６Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図６Ｂ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ、ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図６Ｄ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）についてのメジアンのＦＩＴＣ－Ｈの値。図６Ｅ：図６Ａ～Ｃの試験サンプルおよび対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００ＤＤ（Ｃａｓ９－ＤＮＡ）における非蛍光性の細胞の量。

【図7A】ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（オールインワントランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドによる「オールインワン」トランスフェクションによって、４：１の比でトランスフェクションされた。５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェル。ＦＩＴＣ－Ｈは観察され得なかった（図７Ｄ）。しかしながら、蛍光性と考えられる細胞の量は８：１のＰＤ質量比で１１％上昇した（図７Ｅ）。ｎ≧３。図７Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図７Ｂ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｃ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｄ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１のメジアンＦＩＴＣ－Ｈの値。図７Ｅ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１の非蛍光性の細胞の量。

【図7B】ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（オールインワントランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドによる「オールインワン」トランスフェクションによって、４：１の比でトランスフェクションされた。５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェル。ＦＩＴＣ－Ｈは観察され得なかった（図７Ｄ）。しかしながら、蛍光性と考えられる細胞の量は８：１のＰＤ質量比で１１％上昇した（図７Ｅ）。ｎ≧３。図７Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図７Ｂ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｃ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｄ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１のメジアンＦＩＴＣ－Ｈの値。図７Ｅ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１の非蛍光性の細胞の量。

【図7C】ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（オールインワントランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドによる「オールインワン」トランスフェクションによって、４：１の比でトランスフェクションされた。５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェル。ＦＩＴＣ－Ｈは観察され得なかった（図７Ｄ）。しかしながら、蛍光性と考えられる細胞の量は８：１のＰＤ質量比で１１％上昇した（図７Ｅ）。ｎ≧３。図７Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図７Ｂ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｃ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｄ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１のメジアンＦＩＴＣ－Ｈの値。図７Ｅ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１の非蛍光性の細胞の量。

【図7D】ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（オールインワントランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドによる「オールインワン」トランスフェクションによって、４：１の比でトランスフェクションされた。５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェル。ＦＩＴＣ－Ｈは観察され得なかった（図７Ｄ）。しかしながら、蛍光性と考えられる細胞の量は８：１のＰＤ質量比で１１％上昇した（図７Ｅ）。ｎ≧３。図７Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図７Ｂ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｃ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｄ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１のメジアンＦＩＴＣ－Ｈの値。図７Ｅ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１の非蛍光性の細胞の量。

【図7E】ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ）ナノプレックス±サポニン投与（オールインワントランスフェクション）による、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞のＧＦＰノックアウト。ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡプラスミドによる「オールインワン」トランスフェクションによって、４：１の比でトランスフェクションされた。５００ｎｇの各ＤＮＡ／ウェル。ＦＩＴＣ－Ｈは観察され得なかった（図７Ｄ）。しかしながら、蛍光性と考えられる細胞の量は８：１のＰＤ質量比で１１％上昇した（図７Ｅ）。ｎ≧３。図７Ａ：負の対照によるＦＡＣＳ結果。図７Ｂ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｃ：ＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、４：１＋ＧＥ１７４１によるＦＡＣＳ結果。図７Ｄ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１のメジアンＦＩＴＣ－Ｈの値。図７Ｅ：図７Ａ～Ｃの試験サンプルならびにＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１およびＰＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（ＧＦＰ）－ＤＮＡ、８：１＋ＧＥ１７４１の非蛍光性の細胞の量。

【図8】ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に基づく遺伝子ノックアウトおよびレポーター遺伝子ノックイン（ＯｒｉＧｅｎｅ）。ＧＦＰをコードしかつピューロマイシンをコードする直鎖ドナー配列（ＬＤＳ）と一緒に（ＥＦ１ａ（すなわちＥＦ１アルファプロモーター）、ＧＦＰ配列、Ｐ２Ａ配列（すなわち２Ａ自己切断ペプチド）、およびピューロマイシン（「Ｐｕｒｏ」）配列を含む「直鎖ドナー」）、Ｃａｓ９配列およびｇＲＮＡ配列を有するオールインワンＤＮＡプラスミドのプラスミドＤＮＡ（上側左）の共トランスフェクションを実施することによって、遺伝子ノックアウトおよびノックイン実験が行なわれる。溶質輸送体（Ｓｌｃ）の遺伝子がｇＲＮＡ標的として選択された（「標的配列」）。Ｃａｓ９によって誘導される鎖切断（Ｓｌｃノックアウト）の後に、ＬＤＳは非相同組み換えによって順向きでまたは逆向きで組み込まれる（ＧＦＰ－ピューロマイシンノックイン）。改変された細胞クローンの選択は、挿入されたピューロマイシン耐性遺伝子によって達成される。

【図9A】サポニンによって媒介されるＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＬＤＳＤＮＡ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ａ：Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、ＰＤＤナノプレックス（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳ。ペプチドおよびＤＮＡの質量が考えられるときに４：１および８：１質量比）によって、ＧＥ１７４１同時投与あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＥ１７４１の適用は、４：１および８：１質量比についてそれぞれ２０％および３０％のトランスフェクション効率に至った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなした。Ｂ～Ｄ：サポニンによって媒介されるＧＦＰ遺伝子ノックイン後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞の明確な蛍光強度増大。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定が行なわれた。図９Ｂ：負の対照。図９Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）。図９Ｄ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）＋ＧＥ１７４１。

【図9B】サポニンによって媒介されるＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＬＤＳＤＮＡ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ａ：Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、ＰＤＤナノプレックス（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳ。ペプチドおよびＤＮＡの質量が考えられるときに４：１および８：１質量比）によって、ＧＥ１７４１同時投与あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＥ１７４１の適用は、４：１および８：１質量比についてそれぞれ２０％および３０％のトランスフェクション効率に至った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなした。Ｂ～Ｄ：サポニンによって媒介されるＧＦＰ遺伝子ノックイン後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞の明確な蛍光強度増大。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定が行なわれた。図９Ｂ：負の対照。図９Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）。図９Ｄ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）＋ＧＥ１７４１。

【図9C】サポニンによって媒介されるＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＬＤＳＤＮＡ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ａ：Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、ＰＤＤナノプレックス（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳ。ペプチドおよびＤＮＡの質量が考えられるときに４：１および８：１質量比）によって、ＧＥ１７４１同時投与あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＥ１７４１の適用は、４：１および８：１質量比についてそれぞれ２０％および３０％のトランスフェクション効率に至った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなした。Ｂ～Ｄ：サポニンによって媒介されるＧＦＰ遺伝子ノックイン後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞の明確な蛍光強度増大。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定が行なわれた。図９Ｂ：負の対照。図９Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）。図９Ｄ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）＋ＧＥ１７４１。

【図9D】サポニンによって媒介されるＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＬＤＳＤＮＡ）トランスフェクションのトランスフェクション効率。Ａ：Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞が、ＰＤＤナノプレックス（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳ。ペプチドおよびＤＮＡの質量が考えられるときに４：１および８：１質量比）によって、ＧＥ１７４１同時投与あり、およびなしでトランスフェクションされた。ＧＥ１７４１の適用は、４：１および８：１質量比についてそれぞれ２０％および３０％のトランスフェクション効率に至った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は正の対照としての用をなした。Ｂ～Ｄ：サポニンによって媒介されるＧＦＰ遺伝子ノックイン後のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞の明確な蛍光強度増大。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定が行なわれた。図９Ｂ：負の対照。図９Ｃ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）。図９Ｄ：ＰＤＤ（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）－ＤＮＡ、Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）、４：１）＋ＧＥ１７４１。

【図10】図１０（１～３）．レポーター遺伝子ノックイン技術－相同組み換え対非相同組み換え。図１０は相同組み換えを適用するノックイン技術を提示し、環状ドナー鋳型ＤＮＡをＤＮＡベクター、ここではｐＵＣの一部として用いる。比較のために、図８は非相同組み換えを適用するノックイン技術を提示し、対象の核酸をノックインするために直鎖ドナー鋳型ＤＮＡのＬＤＳを用いる。相同組み換えキット（１＋２）は、図８に提示される通り、環状ＤＮＡドナー配列（２：相同な腕部および機能カセットを含有する環状ドナー鋳型ＤＮＡ）とＣａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡ（１：ｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅベクターにクローニングされた標的配列）とからなる。ここでは、ドナー配列は相同修復によって組み込まれる（３：１のｐＣａｓ－ＧｕｉｄｅプラスミドＤＮＡ＋２の環状ドナー鋳型ＤＮＡを担持するプラスミドＤＮＡとしての用をなすｐＵＣベクターの共トランスフェクションは、ドナー配列（ＧＦＰ－Ｐｕｒｏ（ピューロマイシン））のゲノム組み込みをもたらし、ノックインされた遺伝子を有する編集された染色体を提供する。標的遺伝子はノックアウトされ、ＧＦＰはネイティブな遺伝子プロモーター下にあり、ピューロマイシン遺伝子（Ｐｕｒｏ）はこの例ではＰＧＫプロモーター下にある。環状ドナー鋳型ＤＮＡ（２）は直鎖ドナー配列（例えば、図８上側右参照）よりも分解性でないが、遺伝子組み込み効率がＧＦＰ蛍光の程度を測定することによって評価されるときに明らかな通り、組み込みプロセスはより複雑なプロセスであるように見える。

【図11A】Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞における異なる溶質輸送体（Ｓｌｃ）のノックアウト－相同組み換え対非相同組み換え。異なる標的および異なる組み込み技術についての効率を、サポニンＧＥ１７４１の不在または存在の影響下において、Ｋ_１６ペプチドを含むナノプレックスにおいて比較するために、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞がＮＨＲキットを用いておよびＨＲキットを用いてトランスフェクションされた。全てのＮＨＲノックインキット（Ｓｌｃ２６ａ４、Ｓｌｃ１９ａ３、およびＳｌｃ２５ａ２４）はトランスフェクション効率の有意な増大を示したが、ＧＦＰ発現はＨＲノックインキットでは観察され得なかった。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定。（Ａ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡならびにピューロマイシンおよび緑色蛍光蛋白質をコードするＬＤＳＤＮＡ（Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）の共トランスフェクション。（Ｂ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（Ｓｌｃ）をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡならびにＤＮＡベクターとして提供されたピューロマイシンおよび緑色蛍光蛋白質をコードするドナー鋳型ＤＮＡ（Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＤＳ）の共トランスフェクション。

【図11B】Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞における異なる溶質輸送体（Ｓｌｃ）のノックアウト－相同組み換え対非相同組み換え。異なる標的および異なる組み込み技術についての効率を、サポニンＧＥ１７４１の不在または存在の影響下において、Ｋ_１６ペプチドを含むナノプレックスにおいて比較するために、Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞がＮＨＲキットを用いておよびＨＲキットを用いてトランスフェクションされた。全てのＮＨＲノックインキット（Ｓｌｃ２６ａ４、Ｓｌｃ１９ａ３、およびＳｌｃ２５ａ２４）はトランスフェクション効率の有意な増大を示したが、ＧＦＰ発現はＨＲノックインキットでは観察され得なかった。ｎ≧３。＊サポニン不使用のトランスフェクション（ヌクレアーゼのみ）と比較して有意な違い。Ｕ検定。（Ａ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（Ｓｌｃ２６ａ４）をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡならびにピューロマイシンおよび緑色蛍光蛋白質をコードするＬＤＳＤＮＡ（Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＬＤＳ）の共トランスフェクション。（Ｂ）Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ（Ｓｌｃ）をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡならびにＤＮＡベクターとして提供されたピューロマイシンおよび緑色蛍光蛋白質をコードするドナー鋳型ＤＮＡ（Ｐｕｒｏ－ＧＦＰ－ＤＳ）の共トランスフェクション。

【図12A】ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳのノックイン後のピューロマイシン選択。溶質輸送体Ｓｌｃ２６ａ４のノックアウトおよびＧＦＰ－ピューロマイシンドナー配列の組み込みの後に、細胞は、ピューロマイシン選択が始められるまで７継代に渡って培養された。異なる濃度のピューロマイシンが適用され、細胞生存率が観察された（Ａ、Ｂ）。１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬは、ピューロマイシン耐性を原因とするいくつもの生残細胞集団を有するコンフルエンスの減少を示した。（Ｂ）緑色蛍光は、提示された細胞培養プレートのウェルにおける白色化によって明らかである。横列Ａ～Ｃのプレートウェルは左から右に１～４と付番されている。ウェルＣ３～４は空であった。

【図12B】ＧＦＰ－ピューロマイシンＬＤＳのノックイン後のピューロマイシン選択。溶質輸送体Ｓｌｃ２６ａ４のノックアウトおよびＧＦＰ－ピューロマイシンドナー配列の組み込みの後に、細胞は、ピューロマイシン選択が始められるまで７継代に渡って培養された。異なる濃度のピューロマイシンが適用され、細胞生存率が観察された（Ａ、Ｂ）。１μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬは、ピューロマイシン耐性を原因とするいくつもの生残細胞集団を有するコンフルエンスの減少を示した。（Ｂ）緑色蛍光は、提示された細胞培養プレートのウェルにおける白色化によって明らかである。横列Ａ～Ｃのプレートウェルは左から右に１～４と付番されている。ウェルＣ３～４は空であった。

【図13】Ｃａｓ９によって媒介されるＳｌｃ２６ａ４ノックアウト－ＧＦＰノックイン細胞の単離後のＦＩＴＣ－Ｈ分析。成長したＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞クローンはトリプシン処理され、フローサイトメトリーにアプライされた。細胞は蛍光（ＦＩＴＣ－Ｈ）の観点から分析された。無処置のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞およびＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞がそれぞれ負のおよび正の対照として用いられた。２つの型の細胞クローンが観察された。いくつかのクローンは蛍光を示さず、安定なＧＦＰ発現を指示しなかったが、他のクローンは２つの細胞集団を示した。

【発明を実施するための形態】

【0036】

【0037】

細胞内への例えば５．５ｋｂｐまたはより大きいサイズを有するプラスミドＤＮＡなどの比較的大きい核酸のインビトロ送達のための改善された方法を提供することが、本発明の第１のゴールである。

【0038】

好ましくは少なくともＣａｓをコードする比較的大きい核酸（すなわち、少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する核酸）を有する標的細胞をインビトロで提供するための方法を提供することが、本発明の目的であり、この方法は、例えば核酸を含む組成物を調製するための方法ステップが関係するときにおよび／または相対的なトランスフェクション効率が関係するときに、本発明に従うトランスフェクションが当分野において普通に適用されるトランスフェクション方法と比較されるときに、より面倒でない製造要件および改善された核酸トランスフェクション効力を伴う。標的細胞内への核酸のインビトロ送達（トランスフェクション）の目的のために選択された核酸とキットの構成要素を組み合わせることに応用可能な、キットなどのツールを提供することもまた本発明の目的である。かかる核酸は、典型的には５，０００ｂｐよりも大きく、さらには８，０００～９，０００ｂｐほども大きく、またはより大きい。

【0039】

上の目的の少なくとも１つは、好ましくは少なくとも本発明のＣａｓをコードする比較的大きい核酸（すなわち、少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する核酸）を有する標的細胞を提供するためのインビトロ方法を提供することによって達成される。少なくとも、さらなる目的は、サポニンＧＥ１７４１および／またはサポニンＳＯ１８６１などのトランスフェクション効力増強試薬を含む本発明のキットを提供することによって達成される。

【0040】

本発明は具体的な実施形態について記載されるが、本発明はそれにではなく請求項のみによって限定される。本発明は複数の実施形態の観点から記載されているが、それらの代替、改変、順列、および均等物は本明細書を読むことによって当業者には明らかになるであろうということが企図される。本発明は例示されている実施形態に決して限定されない。添付の請求項によって定められる範囲から逸脱することなしに、変更がなされ得る。

【0041】

本発明の第１の態様は、細胞内への、比較的大きい、すなわち少なくとも５．５ｋｂｐまたは少なくとも８ｋｂｐのようなより大きいサイズを有する核酸のインビトロ送達における、ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンの使用に関する。

【0042】

本明細書において用いられる用語「サポニン」は、その当分野において確立された正式の意味を有し、本明細書においては、アグリコンコアまたはサポゲニンと呼称される新油性骨格構造に共有結合的に取り付けられた１つ以上の親水性糖鎖を含む両親媒性グリコシドの群を言う。サポニンは天然に存在し得るかまたは合成（すなわち天然に存在しない）であり得る。本明細書において用いられる用語「サポニン」は、天然に存在するサポニン、ならびに化学的および／またはバイオテクノロジー的合成経路によってデノボ合成されたサポニンを包含すると解釈されるべきである。ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンは、トリテルペン、すなわち五環式Ｃ３０テルペンアグリコンコアを有し、これは１２，１３－デヒドロオレアナン型であり、それに取り付けられた２つの糖鎖を有する（すなわちビスデスモシド型である）。

【0043】

本発明の特に有利な態様は、細胞内への、比較的大きい、すなわち少なくとも５．５ｋｂｐまたは少なくとも８ｋｂｐのようなより大きいサイズを有する核酸のインビトロ送達におけるサポニンの使用に関し、ここで、サポニンは式（Ｉ）に従う：

【0044】

【化4】

【0045】

【0046】

典型的には、本発明の使用は、核酸が、少なくとも６ｋｂｐ、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐ、もしくはさらには少なくとも９ｋｂｐよりも多く、または１０ｋｂｐ以上を含み、好ましくは、プラスミドＤＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードするプラスミドＤＮＡであるということを特徴とする。

【0047】

有利には、本発明の使用は以下を特徴とする：核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含み、好ましくは、核酸はＣａｓをコードするプラスミドＤＮＡであり、より好ましくは、核酸は少なくともＣａｓを発現するためのプラスミドＤＮＡであり、さらにはより好ましくは、核酸はＣａｓを発現するためのかつｇＲＮＡを発現するためのプラスミドＤＮＡである。

【0048】

ゆえに、本発明の特定の態様は、細胞内への核酸のインビトロ送達における式（Ｉ）に従うサポニンの使用に関する：

【0049】

【化5】

【0050】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、サポニンに存在し、
ここで、核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0051】

典型的には、本発明の使用は、細胞が真核細胞であるということを特徴とする。

【0052】

本発明に従う使用は、好ましくは、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１がキシロース残基であり、および／またはサポニンが厳密に２つのアセチル基を持つということを特徴とする。

【0053】

以下を特徴とする本発明に従う使用が好ましい：式（Ｉ）に従うサポニンのアセチル基は、サポニンの対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合される。

【0054】

以下を特徴とする本発明に従う使用もまた好ましい：式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^２残基の１つはキシロース残基であり、Ｒ^２残基の１つはアセチル基であり、Ｒ^２残基の１つはＨである。

【0055】

いくつかの実施形態に従うと、本発明に従う使用は以下を特徴とする：式（Ｉ）に従うサポニンのキシロース残基は対応するキノボース残基のＣ３位置における酸素原子に結合され、ここで、アセチル基はサポニンの対応するキノボース残基のＣ４位置における酸素原子に結合される。

【0056】

以下を特徴とする本発明に従う使用が好ましい：式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１はキシロース残基であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンの２つのＲ^２基はアセチル基であり、これらは対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、ここで、第３のＲ^２基はＨである。

【0057】

以下を特徴とする本発明に従う使用が特に好ましい：
サポニンが式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１であるということ：

【0058】

【化6】

【0059】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
または、サポニンが式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１であるということ：

【0060】

【化7】

【0061】

本発明の使用は有利には以下を特徴とし得る：核酸はナノ粒子の一部を形成し、このナノ粒子はさらにナノ粒子形成化合物を含み、好ましくは、ナノ粒子形成化合物はポリリジンペプチドを含むかまたはそれらからなり、好ましくは、ポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくは、ポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる。具体的な実施形態において、使用は以下を特徴とし得る：ナノ粒子はナノ粒子形成化合物および核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む。

【0062】

サポニンＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、好ましくはＧＥ１７４１を、ポリリジンペプチドとナノプレックス化されているプラスミドＤＮＡと組み合わせることによって（サポニンに基づく「サポフェクション」技術。ナノプレックス化した構造、すなわちナノプレックスに関する。ポリリジンペプチド、好ましくはＫ_１６ペプチド、好ましくはプラスミドＤＮＡの形態の核酸、およびサポニン、好ましくはＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、より好ましくはＧＥ１７４１からなる）、本発明者らは、驚くべきことに、例えば哺乳類細胞（例えばＪＩＭＴ－１癌細胞）およびネズミ癌細胞（Ｎｅｕｒｏ－２Ａ）において、ここでは例えばＣａｓ９蛋白質をコードしかつペプチドに基づく（ポリリジンＫ_１６ペプチド）ナノプレックスに組み込まれた、ＤＮＡプラスミドの形態の比較的大きい核酸（＞６，５００ｂｐ、例えば７．０ｋｂｐ～８．３ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡ）をインビトロの細胞内に有効に送達することができた。ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１などのサポニンは、プラスミドＤＮＡおよびポリリジンペプチドからなる予め形成されたナノプレックスと混合され、それによって、プラスミドＤＮＡおよびポリリジンペプチド、例えばＫ_１６ペプチドからなるナノプレックスを含みかつＧＥ１７４１などのサポニンを含む組成物を提供する。かかる混合物は、核酸によってトランスフェクションされられるべきである標的細胞と接触させられる。代替的には、サポニンを含有する第１の組成物およびナノプレックスを含有する第２の組成物が両方とも、第１の組成物および第２の組成物の先行する混合なしに、細胞と接触させられる。ここでは、例えば、第１の組成物および第２の組成物は細胞培養培地に追加され、これにおいて、核酸によるトランスフェクションのために選択された細胞が培養される。例えば、Ｃａｓ９切断部位に挿入されるピューロマイシンのドナーＤＮＡ配列と組み合わせられるかまたは組み合わせられないかどちらかの例えば緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のドナー配列などの二本鎖ＤＮＡドナー配列の共トランスフェクションは、効率的なドナー配列由来遺伝子発現を示した。本発明のトランスフェクション方法によって達成され、ナノプレックス構造を含む組成物の一部として、または本発明に従うＤＮＡプラスミドによるトランスフェクションのために選択された細胞に別個に追加されたＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１などのサポニンの存在下における比較的大きいＤＮＡプラスミドおよびポリリジンのナノプレックスの使用によって達成されたトランスフェクション効率は、現行のゴールドスタンダードのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（商標）によって得られ得るよりも高かった。例えば、実施例の項、図４～７、９、１１、および１２の参照がなされる。前述の通り、本発明に従うと、サポニンが、混合物が細胞と接触をさせられる前のポリリジンおよび核酸から組成されるナノ粒子と予め混合されるか、または細胞が、例えばナノ粒子およびサポニンを細胞培養培地に追加することによってナノ粒子およびサポニンを別個に細胞に同時追加することによってトランスフェクションされるかどちらかである。

【0063】

本発明の方法を適用することによって、および本発明に従う使用によって、本発明者らは、約７ｋｂｐまたはさらには８．２ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡのトランスフェクションが考えられるときに、少なくとも１５％のインビトロのトランスフェクション効力を達成した。好ましくは、トランスフェクション効率は少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。実際に、本発明の方法を適用することによって、および本発明に従う使用によって、少なくとも３０％のトランスフェクション効率が得られた（図１１をもまた参照）。典型的には、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００の助けによってプラスミドＤＮＡをトランスフェクションすることによって得られ得るトランスフェクション効率よりも例えば少なくとも３倍高いかかる高い効率は、トランスフェクションの間のサポニンの存在の影響下において、少なくとも配列番号１に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ９、配列番号２に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａ、または配列番号３に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ１３ａ、好ましくはＣａｓ９などのＣａｓ酵素をコードするプラスミドＤＮＡなどの少なくとも７ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクションすることによって達成可能である。典型的には、プラスミドＤＮＡはｇＲＮＡをもまたコードする。典型的には、かかるプラスミドＤＮＡは少なくとも８ｋｂｐのサイズを有し、トランスフェクションの間のサポニンの存在を原因として、本発明の方法を適用することによっておよび本発明に従う使用によって、依然としてインビボで効率的にトランスフェクションされる。代替的にかつ対等に、以下の本発明に従う使用が好ましい：核酸はＣａｓ９などのＣａｓをコードし、ここで、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードする第２の核酸（ｇＲＮＡをコードする第２のプラスミドＤＮＡ）としてまたはｇＲＮＡのＲＮＡ配列として提供される。

【0064】

典型的には、本発明の使用は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ９、配列番号２に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａ、または配列番号３に従うアミノ酸配列を有するＣａｓ１３ａをコードする、好ましくは前記Ｃａｓ９をコードする核酸を包含する。加えて、Ｃａｓをコードする核酸が以下をコードするということを特徴とする本発明に従う使用もまた好ましい：Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓ。

【0065】

ある実施形態は本発明の使用であり、ここで、核酸、好ましくはプラスミドＤＮＡは、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）、または少なくとも９０％の配列同一性をこのＣａｓ９に対して有するＣａｓをコードする核酸の第１の部分を含み、核酸は、任意に以下のいずれか１つ以上を含む：ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含みかつトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む非コードガイドＲＮＡである核酸の第２の部分、コードされるガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはツーピースＲＮＡであり、ｔｒａｃｒＲＮＡは核酸の第１の部分によってコードされるＣａｓの結合部位を含む。代替的には、ある実施形態は、以下の本発明の使用である：Ｃａｓ９などのＣａｓは第１のプラスミドＤＮＡなどの第１の核酸によってコードされ、ｇＲＮＡは第２のプラスミドＤＮＡなどの第２の核酸によってコードされる。Ｃａｓをコードする核酸およびｇＲＮＡをコードする核酸が両方とも単一のプラスミドＤＮＡなどの単一の核酸によって包含される本発明に従う使用が好ましい。

【0066】

対象の蛋白質をコードする（安定にトランスフェクションされた）ノックインされた遺伝子を有する細胞を提供する目的のためには、以下の本発明の使用が好ましい：核酸のインビトロ送達に、細胞のゲノムにノックインするために選択された遺伝子をコードするＤＮＡドナー鋳型であるさらなる核酸と一緒に、Ｃａｓ９などのＣａｓをコードしかつｇＲＮＡをコードする核酸を含む単一のプラスミドＤＮＡの送達、または２つの別個のプラスミドＤＮＡの送達が関わり、第１のものはＣａｓをコードし、第２のものはｇＲＮＡをコードする。ドナー鋳型ＤＮＡは、直鎖ドナー配列または環状ドナー鋳型ＤＮＡどちらか、例えばＤＮＡベクターである。本発明者らは、安定なトランスフェクションおよびノックインされた細胞の形成は、環状ドナー鋳型ＤＮＡの適用と比較して、直鎖ＤＮＡドナー配列が方法の使用のために適用されるときにより効率的であるということを確立した。よって、以下の使用が好ましい：細胞内への核酸のインビトロ送達が、直鎖ドナー配列の送達を含む細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトのインビトロ送達に関する。

【0067】

以下を特徴とする本発明に従う使用が好ましい：インビトロ送達される核酸によってコードされるＣａｓは、Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）であるか、あるいは、前記核酸は、少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をこれらのＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、およびＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓを、またはこれらのＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、およびＣａｓ１３ａのいずれか１つのエンドヌクレアーゼ活性に類似のＣａｓ様のエンドヌクレアーゼ活性を有し、かつＣａｓ９が考えられるときにはｔｒａｃｒＲＮＡに結合する能力があり、かつ少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をこれらのＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、およびＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するエンドヌクレアーゼをコードする。

【0068】

本発明者らは、ポリリジン（１０～２０個のリジン残基、典型的には１６個のリジン残基）が、少なくとも５．５ｋｂｐ、例えば少なくとも７ｋｂｐ、またはさらには少なくとも８ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡなどの核酸とのナノ粒子（ナノプレックス）を効率的に形成するということを確立した。本発明者らは、かかるナノ粒子が、ポリリジンペプチドおよび核酸の間の質量比が１６：１未満、例えば３：１から１５：１であるときに、細胞のトランスフェクションの間の１～５マイクログラム／ｍＬのＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１などのサポニンの存在下において、細胞内に特に効率的にトランスフェクションされるということを確立した。本発明者らは、効率的な核酸トランスフェクションのためには、ナノ粒子におけるポリリジンペプチドおよび核酸の間の質量比は２：１よりも高く、例えば３：１～１５：１であるべきであるということをもまた確立した。本発明の使用では、細胞内へのインビトロ送達のために選択された核酸はナノプレックス（ナノ粒子）の一部として提供されるということが好ましく、ここで、ナノプレックスは、典型的には少なくとも５．５ｋｂｐ、例えば少なくとも６．０ｋｂｐ、例えば６～９ｋｂｐのサイズを有する好ましくはプラスミドＤＮＡの形態の核酸と、ポリリジンペプチド、例えばＫ_１２ペプチド～Ｋ_２０ペプチド（１２から２０個のリジン残基のいずれか１つからなるポリリジンペプチド）、好ましくはＫ_１６ペプチドとからなる。かかる核酸による細胞のトランスフェクションの間に、サポニンもまた細胞に追加されるか、またはサポニンは最初にナノ粒子と予め混合され、それから細胞に追加される。以下の本発明の使用は任意である：細胞内へのインビトロ送達のために選択された核酸がナノプレックス（ナノ粒子）の一部として提供され、ここで、ナノプレックスは、典型的には少なくとも５．５ｋｂｐ、例えば少なくとも６．０ｋｂｐ、例えば６～９ｋｂｐのサイズを有する好ましくはプラスミドＤＮＡの形態の核酸、サポニン、例えばＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、好ましくはＧＥ１７４１、およびポリリジンペプチド、例えばＫ_１２ペプチド～Ｋ_２０ペプチド（１２から２０個のリジン残基のいずれか１つからなるポリリジンペプチド）、好ましくはＫ_１６ペプチドからなる。典型的には、本発明の使用において、ナノ粒子は、ポリリジンペプチドなどのナノ粒子形成化合物および核酸を、３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む。なぜなら、２：１の質量比ではトランスフェクションは非効率的であるからであり、なぜなら、１６：１の質量比ではナノ粒子（ナノプレックス）は細胞にとって毒性があるからである。

【0069】

本発明の第２の態様は、以下のステップを含む、インビトロの細胞内に５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸を送達するための方法に関する：
（ｉ）核酸を提供すること、および
（ｉｉ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるサポニンを提供すること、および
（ｉｉｉ）サポニンの存在下において核酸と細胞をインキュベーションすること。

【0070】

本発明の第２の態様の好ましい実施形態においては、サポニンが式（Ｉ）に従う方法が提供される：

【0071】

【化8】

【0072】

【0073】

特定の実施形態において、本発明の第２の態様は、以下のステップを含む、インビトロの細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸を送達するための方法に関し得る：
（ｉ）核酸を提供することおよび式（Ｉ）に従うサポニンを提供すること、

【0074】

【化9】

【0075】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基が、サポニンに存在する、ならびに
（ｉｉ）サポニンの存在下において核酸と細胞をインキュベーションすること、
ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、Ｃａｓをコードする核酸の第１の部分を含み、ここで、核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするかまたはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである核酸の第２の部分を含む。

【0076】

有利には、核酸がプラスミドＤＮＡであるということを特徴とする方法が提供される。

【0077】

以下を特徴とする本発明に従う方法が好ましい：核酸はナノ粒子の一部を形成し、このナノ粒子はさらにナノ粒子形成化合物を含む。

【0078】

以下を特徴とする本発明に従う方法が特に好ましい：ナノ粒子はナノ粒子形成化合物のポリリジンペプチドを含み、ここで、好ましくはポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくはポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる。例えば、好ましいポリリジンペプチドはＫ_１６ペプチドともまた言われる。

【0079】

本発明の方法または使用が以下を特徴とするということは本発明の一部である：ナノ粒子は、ナノ粒子形成化合物、例えばペプチド、例えばポリリジンおよび核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む。典型的には、ナノ粒子形成化合物はポリリジンペプチド、例えばＫ_１６ペプチドである。以下の方法が好ましい：核酸がプラスミドＤＮＡであり、少なくともＣａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）をコードしかつ任意にｇＲＮＡをもまたコードし、ここで、ナノ粒子は、プラスミドＤＮＡに加えて少なくとも１つのポリリジンペプチド、好ましくはポリリジンＫ_１６ペプチド（１６個のリジン残基からなるポリリジンペプチド）を含む。代替的には、ポリリジンペプチドは、８～２５個のリジン残基、好ましくは１０～２０、より好ましくは１２～１８個からなるペプチドである。プラスミドＤＮＡ、Ｋ_１６ペプチドを包含するナノ粒子が調製および適用され、ＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択されるサポニンの存在下において細胞と接触させられ、好ましくはサポニンがＧＥ１７４１であるときには、高いインビトロトランスフェクション効率が本発明の方法によって得られる。典型的には、インビトロの選択された標的細胞内へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションの間のサポニン濃度は、１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ、好ましくは２～４μｇ／ｍＬである。本発明者らは、サポニンが１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬのサポニン濃度でナノプレックスと一緒に細胞に適用されるときに、サポニンが、ナノプレックスがＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１などのサポニンの存在下において接触させられる細胞に対する毒性の活性を見せないということを確立した。細胞は、典型的には、ナノプレックスを含む組成物およびサポニン、好ましくはＧＥ１７４１を含む別個の組成物と接触させられる。それゆえに、典型的には、ナノ粒子は、ポリリジンペプチドおよび核酸、例えば、少なくとも以下をコードするプラスミドＤＮＡを含む：Ｃａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）、または少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは９０～９９．５％の配列同一性、例えば９２％、９３％、９４％、９５％、または９５～９９％をこのＣａｓ９に対して有するＣａｓ。

【0080】

サポニン濃度が方法のステップ（ｉｉ）において１μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬであるということを特徴とする本発明に従う方法が好ましい。典型的には、細胞のトランスフェクションの間のサポニンの濃度は、１．５～４．５μｇ／ｍＬ、例えば２、２．５、３、３．５、もしくは４μｇ／ｍＬ、またはそれらの間のいずれかの濃度である。かかるサポニン濃度は、本発明の使用および方法に従うと、核酸のトランスフェクションのために選択される細胞に対して毒性を課さない。サポニンが好ましくはＧＥ１７４１またはＳＯ１８４１であり、より好ましくはサポニンがＧＥ１７４１であるかかるサポニン濃度は、核酸、好ましくは少なくともＣａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）をコードするプラスミドＤＮＡの効率的なトランスフェクションにとって好適である。代替的には、コードされるＣａｓはＣａｓ１２ａ（配列番号２）またはＣａｓ１３ａ（配列番号３）である。

【0081】

本発明者らは、細胞が、少なくとも５．５ｋｂｐのサイズ、例えば６．５ｋｂｐ～８．５ｋｂｐ、例えば７ｋｂｐ～８．３ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡを含み、かつＫ_１６ペプチドなどのポリリジンペプチドを含むナノプレックスと、サポニンＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１の存在下においてインビトロで接触させられたときに、比較的高いトランスフェクション効力が得られたということを確立した。ＧＥ１７４１が好ましい。なぜなら、ＧＥ１７４１の適用によって、ＳＯ１８６１と比較して、ずっと改善されたトランスフェクション効率が達成可能であったからである。このときには、効率は、製造者の推奨に従って「ゴールドスタンダード」Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００を適用するトランスフェクションによって得られる結果と比較された。よって、本発明の方法におけるおよび本発明に従う使用のためのＧＥ１７４１の適用は特に好ましい。ナノプレックスは、５．５ｋｂｐまたはより大きい、例えば５．５～９．５ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡなどの核酸とＫ_１６ペプチドなどのポリリジンペプチドとを混合することによって、最初に調製され、核酸およびポリリジンのかかるナノプレックスが得られた後に、これらのナノプレックスは、核酸およびポリリジンペプチドからなるナノプレックスがサポニンの存在下において細胞に適用される前に、任意に、最初に、ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１などのサポニンとさらに混合される。代替的には、ナノ粒子およびサポニンは細胞培養物に別個に追加され、その結果、細胞は例えば細胞培養培地中のサポニンの存在下においてトランスフェクションされる。

【0082】

ある実施形態は、以下を特徴とする本発明に従う方法である：
サポニンが式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１であるということ：

【0083】

【化10】

【0084】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
または、サポニンが式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１であるということ：

【0085】

【化11】

【0086】

サポニンがＧＥ１７４１である本発明の方法または本発明に従う使用が好ましい。効率的なトランスフェクションが、標的細胞のトランスフェクションの間にＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１と組み合わせるナノプレックスによって達成されるので、本明細書に記載される実施形態に従う類似の分子構造を有するサポニンもまた、本発明の使用に従ってまたは本発明の方法に従って核酸トランスフェクション効率を改善することにとって好適である。

【0087】

典型的には、本発明の方法においてまたは本発明の使用に従って、サポニンは、１～５μｇ／ｍｌの標的細胞のトランスフェクションの間の濃度で適用される。なぜなら、本発明のナノプレックス（ナノ粒子）に含まれる核酸のトランスフェクション効率に対するサポニンの存在の正の影響が考えられるときに、かかる濃度では、サポニンは細胞に対して非毒性でありながら、トランスフェクション効力は依然として最適であるからである。好ましくは、ナノプレックスはポリリジンペプチドＫ_１６を含む。当然のことながら、細胞毒性がポリリジンペプチドの代替的な長さの影響下において誘導されない限り、かつトランスフェクション効率が、トランスフェクション効率が少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％であるＫ_１６とは異なる長さを有するポリリジンペプチドを適用することによって阻止されない限り、より短いおよびより長いポリリジンペプチドは等しく好適である。典型的には、少なくとも５．５ｋｂｐ、例えば５．５～１０ｋｂｐまたは６．５～９．０ｋｂｐのサイズのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションすることにとって、トランスフェクション効率が考えられるときに、Ｋ_１６ペプチドの適用は高度に有益である。本発明の方法において適用されるかまたは本発明に従う使用のために適用されるナノプレックスでは、よって、Ｋ_１６ペプチドの存在が好ましいが、より短いまたはより長い長さを有するポリリジンペプチド、例えばＫ_１０～Ｋ_２０もまた好適である。

【0088】

有利には、本発明の方法において、核酸は、少なくともＣａｓをコードする第１の部分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸であり、ここで、核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするかまたはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである第２の部分を含むであろう。以下を特徴とする本発明の使用または本発明に従う方法が特に好ましい：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸はプラスミドＤＮＡの一部として提供され、好ましくは、ここで、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓコンストラクトのＣａｓ部分をコードする核酸の部分はプラスミドＤＮＡの一部として提供され、より好ましくは、ここで、プラスミドＤＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓコンストラクトのＣａｓおよびｇＲＮＡを発現するためである。好ましくは、プラスミドＤＮＡは、Ｃａｓ９（配列番号９）を、または少なくとも９０％の配列同一性をこのＣａｓ９蛋白質に対して有するＣａｓをコードする。典型的には、プラスミドＤＮＡは少なくとも６．０ｋｂｐ、例えば６．５～８．８ｋｂｐのサイズを有する。典型的には、プラスミドＤＮＡがＣａｓ、好ましくはＣａｓ９をコードする核酸を包含し、かつｇＲＮＡをコードする核酸をもまた包含するときに、プラスミドＤＮＡのサイズは７．０ｋｂｐよりも大きく、例えば７．５～９．５ｋｂｐ、または８～８．５ｋｂｐである。Ｃａｓ、例えばＣａｓ９（配列番号１）をコードする核酸およびｇＲＮＡをコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡを適用することが有益である。なぜなら、単一のプラスミドＤＮＡが、ポリリジンペプチド、好ましくはＫ_１６ペプチドとのナノプレックス形成に、およびその後にサポニン（細胞にナノ粒子を追加する前に、または細胞にナノ粒子を含む別個の組成物およびサポニンを含む別個の組成物を同時追加することによってどちらかで）、例えばＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、好ましくはＧＥ１７４１との混合物の形成に関わらなくてはならないのみであるからである。単一のプラスミドＤＮＡのみがペプチドとナノプレックス化（かつ任意に、ナノプレックス化した核酸によるトランスフェクションのために選択された細胞に追加される前にサポニンと予め混合）されなければならないときには、一貫したバッチ間の生産がより便利かつ容易にされる。しかしながら、本発明の方法および使用は、Ｃａｓをコードする第１のプラスミドＤＮＡおよびｇＲＮＡをコードする第２のプラスミドＤＮＡの適用にとってもまた好適かつ応用可能である。実施形態において、本発明の方法および使用は、Ｃａｓ９および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするプラスミドＤＮＡで適用される。

【0089】

プラスミドＤＮＡが６ｋｂｐよりも多く、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐを含むということを特徴とする本発明の使用または方法が好ましい。例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡは典型的には６．５～７．５ｋｂｐであり、Ｃａｓ９－ＧＦＰコンストラクトをコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡは典型的には７．５～８．５ｋｂｐである。ナノプレックスがＫ_１６ペプチドなどのポリリジンペプチドによって調製され、任意にその後にＧＥ１７４１などのサポニンと混合され、これらのナノプレックスが（予め混合された）サポニンの存在下においてトランスフェクションのために選択された細胞と接触させられるときに、かかるプラスミドＤＮＡサイズは効率的にトランスフェクションされ得る。本発明者らは、先に、一般的な意味で、細胞が１６：１の質量比のナノプレックス（ナノプレックス（ナノ粒子）の総重量に基づいて１６部のペプチド、１部の核酸）と接触させられたときに、毒性の効果が明らかになったということを明らかにした。加えて、本発明者らは、先に、一般的な意味で、細胞が２：１の質量比（ペプチド：核酸）のナノプレックスと接触させられたときに、非効率的な核酸送達が明らかになったということを明らかにした。よって、毒性の不在に鑑みてかつ見かけ上の核酸送達効率に鑑みて、ナノプレックスは、ナノプレックス（ナノ粒子）の総重量に基づいてペプチド質量対核酸質量の３：１から１２：１の質量比で製剤される。好ましくは、核酸、例えばトータルのペプチド対トータルのプラスミドＤＮＡの質量比は、ナノプレックスの総重量に基づいて４：１から８：１、例えば４：１、５：１、６：１、７：１、または８：１である。サポニン、例えばＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、好ましくはＧＥ１７４１の影響下において、ポリリジンペプチド、例えばＫ_１４～Ｋ_１８ペプチド、好ましくはＫ_１６ペプチドを含み、かつＣａｓ９（配列番号１）などのＣａｓをコードする核酸を含みかつｇＲＮＡをコードする核酸を含む単一の第１のプラスミドＤＮＡを含むかまたは前記Ｃａｓをコードする第１のプラスミドＤＮＡおよび前記ｇＲＮＡをコードする第２のプラスミドＤＮＡを含むナノプレックス（ナノ粒子）では、トランスフェクション効率は典型的には少なくとも２０％である。

【0090】

Ｃａｓをコードする核酸が以下をコードするということを特徴とする本発明の使用または本発明に従う方法が好ましい：Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓ。好ましくは、Ｃａｓをコードする核酸は、プラスミドＤＮＡ、例えば、６～９ｋｂｐ、典型的には６．５～８．５ｋｂｐのサイズを有するプラスミドＤＮＡの一部である。Ｃａｓ９では、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするが、核酸がＣａｓ１２ａ（配列番号２）またはＣａｓ１３ａ（配列番号３）をコードするときには、ｇＲＮＡをコードする核酸はｃｒＲＮＡのみをコードする。本発明の方法において適用されるかまたは本発明の使用に関わる核酸が、Ｃａｓ９、または少なくとも９０％の配列同一性を配列番号１に従うＣａｓ９に対して有するＣａｓをコードするときには、コードされるｇＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含みかつトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、ここで、ｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはツーピースＲＮＡであり、ここで、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓ９の結合部位を含む。

【0091】

本発明の第３の態様は、以下を含む、インビトロの細胞内に５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸を送達するためのパーツキットに関する：
以下を含むかまたはそれらからなる第１の組み合わせ：
（ａ）第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、第２のプラスミドＤＮＡを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択される少なくとも１つのサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書,
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第２の組み合わせ：
（ａ）第３のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第２の容器、
（ｃ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択される少なくとも１つのサポニンを含む第３の容器、
（ｄ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第３のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第３のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第３の組み合わせ：
（ａ）第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）少なくとも１つのサポニン、ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであり、好ましくは１つのサポニンであり、最も好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１から選択されるサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
好ましくは、ここで、第１のプラスミドＤＮＡはＣａｓ９をコードし、第２のプラスミドＤＮＡはｇＲＮＡをコードし、および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチドはｇＲＮＡのＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、あるいは、ここで、第３のプラスミドＤＮＡはＣａｓ９をコードしかつｇＲＮＡをコードする。

【0092】

代替的には、本発明の第３の態様は、以下を含むインビトロの細胞内にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸を送達するためのパーツキットに関し得る：
以下を含むかまたはそれらからなる第１の組み合わせ：
（ａ）Ｃａｓ９をコードする第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、ｇＲＮＡをコードする第２のプラスミドＤＮＡを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）少なくとも１つのサポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つのサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第２の組み合わせ：
（ａ）Ｃａｓ９をコードしかつｇＲＮＡをコードする第３のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第２の容器、
（ｃ）少なくとも１つのサポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つのサポニンを含む第３の容器、
（ｄ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第３のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第３のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する、
あるいは
以下を含むかまたはそれらからなる第３の組み合わせ：
（ａ）Ｃａｓ９をコードする第１のプラスミドＤＮＡを含む第１の容器、
（ｂ）任意に、ｇＲＮＡのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む第２の容器、
（ｃ）ポリリジンＫ_１６ペプチドを含む第３の容器、
（ｄ）少なくとも１つのサポニン、好ましくはＧＥ１７４１およびＳＯ１８６１の１つのサポニンを含む第４の容器、
（ｅ）使用説明書、
ここで、使用は、少なくとも、ポリリジンＫ_１６ペプチドおよび第１のプラスミドＤＮＡのナノプレックス、ならびに任意にサポニンの調製を含み、
ここで、第１のプラスミドは少なくとも５．５ｋｂｐのサイズを有する。

【0093】

キットは、任意に、以下を含有する少なくとも１つのさらなる容器を含む：第１、第２、または第３の組み合わせの第１、第２、第３、および存在する場合には第４の容器のいずれか１つ以上に含有される構成要素を希釈または溶解するための、ならびに／あるいは少なくともプラスミドＤＮＡおよび１６個のリジン残基からなるポリリジンペプチドを含むナノプレックスの構成要素と、任意に少なくとも１つのサポニン、好ましくはＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１どちらか、より好ましくはＧＥ１７４１とを希釈または溶解するための、希釈剤あるいは溶媒。好ましくは、キットは、唯一のサポニンとしてのＧＥ１７４１を含む容器またはバイアルを含有する。典型的には、プラスミドＤＮＡは、第１または第３の組み合わせで典型的な５．５ｋｂｐ～１０ｋｂｐ、例えば６．５ｋｂｐ～７．５ｋｂｐ、または第２の組み合わせで典型的な７．５ｋｂｐ～８．５ｋｂｐのサイズを有する。プラスミドＤＮＡは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列に従うＣａｓ９をコードするＤＮＡの部分を含む。代替的には、キットは、少なくとも９０％の同一性をＣａｓ９のアミノ酸配列（配列番号１、例えばｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２参照）に対して有するＣａｓをコードするプラスミドＤＮＡを含む。

【0094】

キットの第１のもしくは第２の組み合わせのコードされる非コードガイドＲＮＡまたはキットの第３の組み合わせに含まれるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含み、かつトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、ここで、ガイドＲＮＡはシングルガイドＲＮＡまたはツーピースＲＮＡであり、ここで、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第１または第３のプラスミドＤＮＡによってコードされるＣａｓ９の結合部位を含む。

【0095】

本発明の使用および／または方法および／またはキットは、インビトロのノックインされた遺伝子を有する細胞、好ましくはインビトロの安定にトランスフェクションされたノックイン細胞を得ることにとって特に好適である。好ましくは、標的細胞ゲノムにノックインされるべき蛋白質をコードする核酸は直鎖ドナー配列（ＬＤＳ）の型のＤＮＡであるが、環状ＤＮＡドナー鋳型もまた、本発明の方法を適用することによってまたは本発明の使用に従って、本発明のキットの使用によって標的細胞のゲノムにコードする核酸をノックインするために応用可能である。例えばベクターまたはプラスミドＤＮＡの形態のＬＤＳまたは環状ＤＮＡドナー鋳型は、好ましくはプラスミドＤＮＡの一部としてのＣａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）をコードする核酸と共トランスフェクションされ、このプラスミドＤＮＡは、好ましくはｇＲＮＡをコードする核酸をもまた含むが、共トランスフェクションでは、ｇＲＮＡは、ＲＮＡとしてまたはｇＲＮＡをコードするさらなるプラスミドＤＮＡとしてもまた提供され得る。本発明に従うと、ＣａｓおよびｇＲＮＡをコードする核酸、好ましくは１つまたは２つのプラスミドＤＮＡ、より好ましくは単一のプラスミドＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ポリリジンペプチド、好ましくはＫ_１６ペプチド、および任意にＳＯ１８６１およびＧＥ１７４１から選択されるサポニンを含むかまたはそれらからなる、好ましくは含むナノ粒子（ナノ粒子を形成するナノプレックス化した構成要素）として提供され、好ましくは、サポニンはＧＥ１７４１である。核酸およびポリリジンペプチドを含むナノ粒子が好ましく、これらのナノ粒子は、核酸による標的細胞のトランスフェクションの間にサポニンと混合される。直鎖または環状ＤＮＡドナー鋳型、好ましくはＬＤＳの（安定な）トランスフェクションによるノックインのために選択された細胞は、サポニンおよびナノ粒子およびＤＮＡドナー鋳型と接触させられ、その結果、Ｃａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）をコードする核酸、ｇＲＮＡをコードする核酸、およびＤＮＡドナー鋳型、好ましくはＬＤＳがインビトロの細胞内にトランスフェクションされ、その結果、その後に、ドナーＤＮＡは細胞のゲノムの標的位置にノックインされる。好ましくは、本発明の使用、本発明の方法、本発明のキットの適用、および／またはサポニンとの組み合わせでの本発明のナノ粒子の適用は、標的細胞の効率的なトランスフェクションをもたらし、ここで、「効率的」は少なくとも２０％、例えば少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも３５％のトランスフェクション率を言い、好ましくは、細胞のゲノム上への選択された核酸のノックインは安定なトランスフェクションである。つまり、ノックインされた核酸は細胞の一またはより多くの継代後に細胞のゲノムに留まる。

【0096】

本発明の第４の態様は、細胞内への核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む組成物に関し、ここで、ナノ粒子は以下を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）５．５キロ塩基対（ｋｂｐ）よりも多くを含む核酸、
（ｉｉ）ポリリジンペプチド、および
（ｉｉｉ）ビスデスモシド型のトリテルペノイド１２，１３－デヒドロオレアナン型サポニンであるサポニン。

【0097】

本発明の第４の態様のある具体的な実施形態は、有利には、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む組成物に関し得る。ここで、ナノ粒子は以下を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸、
（ｉｉ）ポリリジンペプチド、
ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、ここで、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0098】

式（Ｉ）に従うサポニンを含む本発明の組成物が好ましい：

【0099】

【化12】

【0100】

【0101】

本発明に従うと、組成物が、５．５ｋｂｐよりも多くを含む選ばれた核酸、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトによるトランスフェクションのために選択される細胞に適用される前に、組成物は最初にサポニンと混合され得る。または、細胞にサポニンを含む第１の組成物を適用することによって、かつ細胞に本発明の組成物を適用することによって、組成物は細胞と接触し、サポニンもまた細胞に追加される。

【0102】

ある実施形態は、サポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１はキシロース残基であり、および／またはサポニンは厳密に２つのアセチル基を持つ。

【0103】

ある実施形態は、サポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのアセチル基はサポニンの対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合される。

【0104】

ある実施形態は、サポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^２残基の１つはキシロース残基であり、Ｒ^２残基の１つはアセチル基であり、Ｒ^２残基の１つはＨである。

【0105】

ある実施形態は、サポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのキシロース残基は対応するキノボース残基のＣ３位置における酸素原子に結合され、アセチル基はサポニンの対応するキノボース残基のＣ４位置における酸素原子に結合する。

【0106】

ある実施形態は、サポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１はキシロース残基であり、式（Ｉ）に従うサポニンの２つのＲ^２基はアセチル基であり、これらは対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、第３のＲ^２基はＨである。

【0107】

ある実施形態はサポニンを含む本発明に従う組成物であり、ここで、サポニンは式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１である：

【0108】

【化13】

【0109】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
または、ここで、サポニンは式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１である、

【0110】

【化14】

【0111】

ポリリジンペプチドが５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくはポリリジンペプチドが１６個のリジン残基からなる本発明に従う組成物が好ましい。

【0112】

典型的には、本発明に従う組成物において、ナノ粒子は、ポリリジンペプチドおよび核酸を３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む。組成物はサポニンを含むか、含まないかのどちらかである。典型的には、本発明の組成物はサポニンを含まず、組成物がコンストラクトによって細胞をトランスフェクションするために適用されるときに、細胞は、ここでは上で概説された実施形態の本発明の組成物およびサポニンと同時インキュベーションされる。

【0113】

核酸がプラスミドＤＮＡの一部である本発明に従う組成物が好ましい。上で説明された通り、ある種の実施形態においては、以下の組成物が好ましい：核酸は少なくともＣａｓをコードする核酸の第１の部分を含み、ここで、核酸は、任意に、ｇＲＮＡをコードするかまたはｇＲＮＡを含むかまたはｇＲＮＡである核酸の第２の部分を含む。

【0114】

プラスミドＤＮＡが６ｋｂｐよりも多く、好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも８ｋｂｐを含む本発明の組成物が特に好ましい。

【0115】

核酸のＣａｓをコードする第１の部分が以下をコードする本発明に従う組成物が好ましい：Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓ。

【0116】

本発明の第５の態様は、細胞内への核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子に関し、ナノ粒子は以下を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸、
（ｉｉ）ポリリジンペプチド、および
（ｉｉｉ）式（Ｉ）に従うサポニン、

【0117】

【化15】

【0118】

式中、
Ｒ^１はキシロース残基、アラビノース残基、またはグルコース残基であり、そのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキシロース残基に結合され、
Ｒ^２は、同じ分子上の他のＲ^２残基から独立して、Ｈ、アセチル残基、またはそのＣ１原子によって式（Ｉ）の対応するキノボース残基に結合されたキシロース残基であり、ただし、キノボース残基に結合された少なくとも２つのアセチル残基または少なくとも１つのアセチル残基およびキシロース残基がサポニンに存在し、
ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、ここで、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0119】

本発明の実施形態は本発明に従うナノ粒子であり、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１はキシロース残基であり、および／またはサポニンは厳密に２つのアセチル基を持つ。

【0120】

以下の本発明に従うナノ粒子が好適である：式（Ｉ）に従うサポニンのアセチル基が、サポニンの対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合される。

【0121】

以下の本発明に従うナノ粒子もまた好適である：式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^２残基の１つはキシロース残基であり、Ｒ^２残基の１つはアセチル基であり、Ｒ^２残基の１つはＨである。

【0122】

ある種の実施形態において、本発明に従うナノ粒子は式（Ｉ）のサポニンを含み、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのキシロース残基は対応するキノボース残基のＣ３位置における酸素原子に結合され、アセチル基はサポニンの対応するキノボース残基のＣ４位置における酸素原子に結合される。

【0123】

ある種の実施形態において、本発明に従うナノ粒子は式（Ｉ）のサポニンを含み、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンのＲ^１はキシロース残基であり、ここで、式（Ｉ）に従うサポニンの２つのＲ^２基はアセチル基であり、これらは対応するキノボース残基のＣ３位置およびＣ４位置における酸素原子に結合され、第３のＲ^２基はＨである。

【0124】

以下の本発明に従うナノ粒子が好ましい：
サポニンが式（ＩＩ）に従うＧＥ１７４１である：

【0125】

【化16】

【0126】

式中、Ｒ^１はキシロースである、
または、サポニンが式（ＩＩＩ）に従うＳＯ１８６１である：

【0127】

【化17】

【0128】

好ましくは、ナノ粒子はＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１、より好ましくはＧＥ１７４１を含む。

【0129】

好ましくは、本発明に従うナノ粒子では、ポリリジンペプチドは５～２５個のリジン残基からなり、より好ましくはポリリジンペプチドは１６個のリジン残基からなる。

【0130】

典型的には、本発明に従うナノ粒子では、ナノ粒子は、核酸およびポリリジンペプチドを３：１から１５：１の範囲の、好ましくは３：１から９：１の範囲の質量比で含む。好ましくは、範囲は４：１～８：１から選択される。

【0131】

核酸がプラスミドＤＮＡの一部である本発明に従うナノ粒子が好ましい。プラスミドＤＮＡは、好ましくは、Ｃａｓ、好ましくはＣａｓ９（配列番号１）をコードする核酸の第１の部分と、ｇＲＮＡをコードする核酸の第２の部分とを含む。

【0132】

典型的には、本発明に従うナノ粒子では、プラスミドＤＮＡは、５．５ｋｂｐよりも多く、好ましくは少なくとも６ｋｂｐ、より好ましくは少なくとも７ｋｂｐ、最も好ましくは少なくとも７．５ｋｂｐを含む。プラスミドＤＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸は、少なくとも、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）をコードする核酸の第１の部分を含み、ここで、核酸は、任意に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするかまたはｇＲＮＡであるかまたはｇＲＮＡを含む核酸の第２の部分を含む。

【0133】

本発明に従うナノ粒子では、核酸のＣａｓをコードする第１の部分は以下をコードするということが好ましい：Ｃａｓ９（配列番号１）、Ｃａｓ１２ａ（配列番号２）、Ｃａｓ１３ａ（配列番号３）、または少なくとも９０％のアミノ酸残基同一性をストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１のＣａｓ９、フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）のＣａｓ１２ａ、およびレプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）のＣａｓ１３ａのいずれか１つに対して有するＣａｓ。より好ましいのは、ＣａｓはＣａｓ９である。

【0134】

細胞内内へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓコンストラクトをコードする核酸のインビトロ送達にとって好適なナノ粒子を含む本発明の組成物、または本発明のナノ粒子は、サポニンの存在下において核酸によって細胞をトランスフェクションするための本発明に従う方法における適用にとって特に好適である。本発明の使用には、典型的には本発明のかかる組成物または本発明のかかるナノ粒子が関わり、ここでサポニンはトランスフェクションされるべきである細胞に同時投与されるか、またはサポニンは組成物の一部またはナノ粒子の一部である。

【0135】

本発明はさらに次の例によって例示される。これらは決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。いくつかのパーツまたは化合物の改変および代替的な実装が可能であり、添付の請求項に定められる保護の範囲に包含される。

【実施例】

【0136】

ナノプレックスキャラクタリゼーション
本発明者らは、比較的大きいプラスミドＤＮＡ（８，２１６ｂｐ）からオリゴリジンに基づくナノプレックス（ナノ粒子）への非自明な複合体化を行なうことを成し遂げた。かかる複合体化は、先には、４～５ｋｂｐの範囲のプラスミドでのみ達成されていた（サーマ（Sama）ら，２０１７年）。Ｋ_１６ペプチドおよびＤＮＡプラスミドからなるナノプレックス、いわゆる「ＰＤナノプレックス」を異なる質量比で製剤し（図１、図２）、ＤＮＡ複合体化を定性的に（ゲル保持アッセイ）および定量的に（蛍光強度測定）決定した（図３）。プラスミドＤＮＡはＣａｓ９をコードした。Ｃａｓ９アミノ酸配列はここでは下の配列のリストにおいて配列番号１として提供される。Ｃａｓ９配列はストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１からのＣａｓ９であり、配列はｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２から検索され、ここでは、それは＞ｓｐ｜Ｑ９９ＺＷ２｜ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１として挙げられた。

【0137】

サイズおよびサイズ分布
Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＧＦＰＤＮＡを装填したＰＤナノプレックスを、異なる質量比で複合体化した。サイズおよびＰＤＩ（多分散指数）は、安定性およびトランスフェクション効率の観点から最適な製剤のための質量比の初期評価を提供する（図１）。適用されるペプチドの質量および適用される核酸の質量の間の質量比が考えられるときに、サイズ値は、より高い質量比ではより小さい粒子への傾向を示した。ＰＤＩは全ての製剤について単分散粒子の懸濁を指示した。これは、４：１質量比（ペプチド：核酸）製剤について示される例示的なサイズ分布評価によって確認された（図２）。

【0138】

ゲル保持
いかなる理論による拘束も望まなければ、ゲル電気泳動において、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲセーフＤＮＡゲル染色剤のような色素は、インターカレーション後の蛍光によって二本鎖核酸を可視にするという目的を有する。ＤＮＡがナノプレックス内にコンパクトに組み込まれる場合には、核酸は電圧を印加した後にアノードに向かって流れない。正荷電のオリゴペプチドの負電荷の相殺が達成されるので、ナノプレックス内のＤＮＡはゲルポケットに留まる。

【0139】

よって、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－ＧＦＰ、および比較のＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミドを異なる質量比で複合体化し、ゲルポケットに移入した。電気泳動を完了した後には、大きいプラスミド（Ｃａｓ９約７ｋｂｐ、Ｃａｓ９－ＧＦＰ約８ｋｂｐ）でさえも、ＤＮＡ複合体化が可能であり、達成されるということが観察された（図３）。

【0140】

複合体化を定量または複合体化効率を決定するために、蛍光に基づく定量アッセイをナノプレックス製剤後に実施した。ＤＮＡに対する結合後に蛍光性の色素（Ｑｕａｎｔ－ＩＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）、サーモフィッシャー）を用いて、遊離のＤＮＡの量を計算し－複合体化したＤＮＡは色素によってアクセスし得ない－それによって、複合体化効率を計算した。

【0141】

実験は、ペプチド（ポリリジンＫ_１６ペプチド）の量を増大させると、わずかに増大した効率が観察され、これは全ての質量比について一般的に効率的であった（８４～９８％）ということを明らかにした。加えて、より大きいプラスミドサイズでは、より効率的でない複合体化が観察された（図３）。

【0142】

本発明者らは、先に、一般的な意味で、細胞が１６：１質量比のナノプレックスと接触させられたときには、毒性の効果が明らかになったということを明らかにした。加えて、本発明者らは、先に、一般的な意味で、Ｎ／Ｐ比を原因として、細胞が２：１質量比のナノプレックスと接触させられたときには、非効率的な核酸送達が明らかになったということを明らかにした。よって、毒性および核酸送達効率を、４：１および８：１比で製剤されたＰＤナノプレックスで評価した。

【0143】

細胞トランスフェクション
Ｃａｓ９－ＧＦＰ－ＤＮＡ移入
ＪＩＭＴ－１細胞（ヒト乳癌）およびＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞（ネズミ神経芽腫）を、Ｃａｓ９－ＧＦＰプラスミドを含有するナノプレックスによって、サポニンＧＥ１７４１同時適用またはサポニンＳＯ１８６１同時適用あり、およびなしで（つまり、サポニンは、サポニンの存在下においてトランスフェクションされるべきである核酸を含むナノ粒子の追加と一緒に、細胞培養物に追加される）、サポニンが考えられるときに非毒性の濃度でトランスフェクションした。ナノ粒子中のペプチドおよび核酸（プラスミドＤＮＡ）についての質量比は、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を考えて、かつ先述の以前に評価された毒性および以前に行なわれた効率研究を考えて選択した。全てのトランスフェクション条件のトランスフェクション効率を、４８時間のインキュベーション時間後に、フローサイトメトリーによって、負の対照との比較によって、蛍光強度の観点から測定した（図４）。比較として、サポニンに基づくトランスフェクションの効率を、市販のトランスフェクションエンハンサーＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（商標）と比較した。商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）は非ウイルス系のトランスフェクションの分野におけるゴールドスタンダードとして見られている。トランスフェクション効率の決定はＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子によって可能であった。これは、核酸と細胞を接触させる間のサポニンの存在または不在下において、Ｃａｓ９－ＧＦＰ融合蛋白質遺伝子として共トランスフェクションされた。Ｃａｓ９－ＧＦＰを含むＤＮＡプラスミドの首尾良いトランスフェクション、よって、首尾良くトランスフェクションされた細胞内におけるＣａｓ９－ＤＮＡの細胞内転写によるＣａｓ９蛋白質の間接的送達は、共トランスフェクションされたＧＦＰＤＮＡによって引き起こされる緑色蛍光として示されるであろう。

【0144】

Ｎｅｕｒｏ－２Ａ細胞のトランスフェクションプロセス（播種、トランスフェクション、インキュベーション）の過程において、細胞は生細胞撮像装置（Ｃｙｔｏｓｍａｒｔ－Ｏｍｎｉ）によって詳しく撮像し、コンフルエンスについて分析した。視覚的画像を処理したクラウドに基づくアルゴリズムによって、Ｃｙｔｏｓｍａｒｔはコンフルエンスの観点から生存率の有益な尺度を提供した。この同時の実験では、サポニン同時適用ありのおよびなしのトランスフェクションについて有意な毒性効果は観察されなかった（図５）。

【0145】

実施された試験は、サポニンが細胞トランスフェクションの間に存在したときには、大きいＤＮＡプラスミド（少なくとも７ｋｂｐのサイズを有する）が細胞株内に効率的にトランスフェクションされ得たという驚くべき知見を提供した。そして、５ｋｂｐよりも小さいサイズを有する比較的小さいＧＦＰプラスミドと比較して、トランスフェクションされるより少数の量の核酸分子を考慮するときには、実施された試験の結果はより多くのインパクトを獲得する。核酸の適用される量は５００ｎｇ／ウェルに留まるが、トランスフェクションされたＤＮＡプラスミドのサイズ、よってプラスミドの分子質量は有意に変化するので、効率は呈示されるものよりもいっそう高い。

【0146】

Ｃａｓ９－ＤＮＡ移入
ＧＦＰによって駆動される蛍光によってＣａｓ９－ＤＮＡの首尾良い送達を確立した後に、本発明者らは次にＣａｓ９－トランスフェクションの機能性を試験した。よって、ＧＦＰを発現するＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞が取得された。試験の狙いは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトによるＧＦＰ遺伝子のノックアウトを示し、視覚化することであった。よって、Ｃａｓ９－ＤＮＡ（すなわちプラスミドＤＮＡ）を、ｇＲＮＡＤＮＡプラスミド（ＰＤＤ）と共トランスフェクションするか、またはＣａｓ９およびｇＲＮＡ（ＰＤ）をコードしかつＣａｓ９およびガイドＲＮＡ両方を発現する１つのプラスミドＤＮＡ（「オールインワンプラスミド」）によって送達するかどちらかをした（図８、図９）。細胞のトランスフェクションの間のＧＥ１７４１同時適用の効果を、蛍光強度の減少によって検討した（ＦＩＴＣ－ＨおよびＦＳＣに関する４分割上のドットプロットのＦＩＴＣ－Ｈメジアンおよび分離）。両方の実験は蛍光の縮減を明らかにした（それぞれ全ての細胞の１０％および１１％は蛍光性と考えられなかった）（図６、図７）。全ての細胞の３０％がＣａｓ９－ＤＮＡによって首尾良くトランスフェクションされたということを考慮すると、結果はいくらかの程度まで効率的なかつ有意な遺伝子ノックアウトを示した。遺伝子ノックアウト効率を改善するために、ｇＲＮＡにとって最も効率的な標的配列を選択するために、いくつもの異なるｇＲＮＡ配列を試験した。初期におよびさらに適用されたｇＲＮＡ配列は、効率情報を有するデータベースから得られた。多くのＧＦＰ配列が利用可能であるので、最適なｇＲＮＡ配列の選択のためには、トランスフェクションされた細胞株のＧＦＰ遺伝子配列は公知でなければならない。さらに、遺伝子ノックアウトは、最小限の変化が検出され得る高感度のアッセイを要求する。プロモーターによって駆動される高度に蛍光性の細胞内では、単一の遺伝子ノックアウトは場合によっては同定され得なかった。

【0147】

Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＤＮＡおよびＬＤＳ移入
鎖切断の直後のゲノムＤＮＡ上への直鎖ドナー配列（ＬＤＳ。直鎖ＤＮＡドナー鋳型ともまた言われる）の組み込みは、対象の遺伝子によってノックインし、それによって細胞を安定にトランスフェクションするための方法である。このやり方で、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術によって、ノックアウトおよびノックインが確立され得る。ＧＦＰのようなレポーター遺伝子およびピューロマイシンのような耐性遺伝子をコードするＬＤＳは、首尾良いＣａｓ９改変の検出、およびそれぞれの首尾良くトランスフェクションされた細胞の単離を促進する。以下を含む第１のキットが本発明者らによって提供される：Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするオールインワンプラスミド（第１のプラスミドＤＮＡ）を含有する第１の容器、ならびにＧＦＰおよびピューロマイシンをコードするＬＤＳ（ＤＮＡドナー鋳型としての用をなす直鎖ドナー配列ＤＮＡ）を含有する第２の容器。オールインワンプラスミドおよびＬＤＳは細胞内への共トランスフェクションのために選択され（図８）、キットは、さらに、第１のプラスミドおよびＬＤＳを標的細胞内にトランスフェクションするための説明書を含む。類似に、以下を含む第２のキットが本発明者らによって提供される：Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするオールインワンプラスミド（第１のプラスミド）を含有し、かつＧＦＰおよびピューロマイシンをコードするＬＤＳを含有する容器。オールインワンプラスミドおよびＬＤＳは細胞内への共トランスフェクションのために選択され（図８）、キットは、さらに、第１のプラスミドおよびＬＤＳを標的細胞内にトランスフェクションするための説明書を含む。第１のキットおよび第２のキットは、さらに、ペプチドおよび第１のプラスミドおよび（任意に）ＬＤＳのナノプレックスを提供するために、第１のプラスミドとの混合のためのおよび任意にＬＤＳとの混合のため、または第１のプラスミドおよびＬＤＳの組み合わせとの混合のための、ポリリジンＫ_１６ペプチドを含有するバイアルを含み得る。代替的には、第１のキットまたは第２のキットは、ペプチドおよび第１のプラスミドおよび（任意に）ＬＤＳのナノプレックスを提供するために、さらにポリリジンＫ_１６ペプチドを含有する第１の容器を含むか、またはさらにポリリジンＫ_１６ペプチドを含有する容器を含む。ＧＦＰによって媒介される蛍光は、核内へのＧＦＰをコードするＬＤＳの送達を証明する。ピューロマイシン選択圧によって選択されたトランスフェクションされた細胞は、Ｃａｓ９によって誘導される鎖切断後のゲノム上への安定なＬＤＳ組み込みの証拠として、複数継代に渡ってＧＦＰ蛍光を発現するであろう。

【0148】

Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡならびにＧＦＰおよびピューロマイシンをコードするＬＤＳによるＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞の共トランスフェクションが、４：１および８：１のポリリジンＫ_１６ペプチド－核酸比でされ、プラスミドＤＮＡおよびＬＤＳが等しく複合体化された（５００ｎｇ／ウェル）。細胞のトランスフェクションを、細胞が培養された細胞培養培地中のＧＥ１７４１あり、およびなしで行なった。サポニンの不在または存在の影響下におけるトランスフェクション効率を、細胞のトランスフェクションの間のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００の存在の影響下におけるトランスフェクションと比較した。全てのトランスフェクションされた細胞の３０％超についての蛍光の発現は、サポニンがトランスフェクションの間に存在したときのＬＤＳの首尾良い送達および帰結としてのＧＦＰの発現を示している。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００は匹敵する結果に到達しなかった（＜１０％）（図９）。

【0149】

ゲノム上へのドナー配列の組み込みは非相同組み換え（「ＮＨＲ」）および相同組み換え（「ＨＲ」）によって行なわれ得る。直鎖ドナー配列は順向きおよび逆向きで組み込まれるが（図８）、相同な組み込み（相同組み換え「ＨＲ」）は相同な腕部によってのみ可能であり、専ら順向きの組み込みをもたらす（図１０）。両方の技術は利点および欠点を呈示し得る。直鎖ドナー配列（ＬＤＳ）ＤＮＡは、ＨＲを適用する組み込みと比較して、ＮＨＲによってより容易に鎖切断部に組み込まれ得る。しかしながら、直鎖化された核酸はＤＮＡｓｅによって比較的素早く分解される。ドナー配列のより複雑な相同な組み込みは、そのベクターの安定性に直面する。溶質輸送体２６ａ４に対する試験されたノックアウトキットの他にも（図９）、２つの他のＬＤＳドナーキット（Ｓｌｃ１９ａ３、Ｓｌｃ２５ａ２４）および２つのＨＲに基づくキットを試験した（Ｓｌｃ４ａ４、Ｓｌｃ１１ａ２）。各キットについて、２つの異なるｇＲＮＡ配列を調べた。結果は、蛍光発現が相同組み換えを用いるトランスフェクションでは検出され得なかったということを示している（図１１）。しかしながら、ＬＤＳによるトランスフェクションは、サポニンがトランスフェクションの間に存在したときに有意な効率増大を示した。Ｓｌｃ２６ａ４標的によるトランスフェクション後に到達された効率レベルが最も高かった。

【0150】

ＧＥ１７４１の存在下におけるＣａｓ９－ｇＲＮＡプラスミドおよびＬＤＳの共トランスフェクションのその後に、ピューロマイシンによって媒介される選択は、トランスフェクションされた細胞の単離を可能にし、ゲノム上へのドナー配列組み込みの同定を促進する。この目的のために、異なるピューロマイシン濃度をＧＥ１７４１の存在下のトランスフェクションされた細胞に適用した。最適なピューロマイシン濃度は、ドナー配列から耐性を受け取った細胞は助命しながら、トランスフェクションされていない／非耐性細胞を最適に殺すはずである。０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンはＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞に対する有意な効果を達成せず、１μｇ／ｍＬは単に不完全な選択を達成したが、２～３μｇ／ｍＬは全てに近い細胞を逓減させ、よってさらなるステップに採用された（図１２）。

【0151】

ピューロマイシン濃度を維持することによって、細胞を成長させた。コンフルエンスに到達したときに、ゲノムＤＮＡを抽出した。設計されたプライマー（Ｓｌｃ２６ａ４の始めのフォワードプライマー、Ｓｌｃ２６ａ４の終わりのリバースプライマー）によって、組み込まれたドナーカセットの存在は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による標的化された組み込みを示すであろう。蛍光はトランスフェクションの５日後に依然として見られ得た。

【0152】

ＧＥ１７４１の存在の影響下における別のノックイントランスフェクションを行ない、陽性の集団を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってソーティングおよび培養した。陽性の集団および新たなＮｅｕｒｏ－２Ａクローンを、コンフルエンスおよび蛍光についてさらにモニタリングした。改変された細胞の単離のための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を、遺伝子改変された細胞の代替的な単離方法として行なった。高度に蛍光性のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞をＦＡＣＳによって選択し、９６ウェルプレート上に単離し、コンフルエンスまで成長させた。コンフルエントなウェルをトリプシン処理し、フローサイトメトリーにアプライした。無処置のＮｅｕｒｏ－２Ａ細胞および無処置のＮｅｕｒｏ－２Ａ－ＧＦＰ細胞は負のおよび正の対照としての用をなした。いくつかの細胞クローン集団は蛍光を示さなかったが、他は２つの異なる集団を明らかにした（図１３）。

【0153】

例および試験の詳細な判定後に、本発明の方法を適用することによってかつ本発明の方法および使用に従ってサポニンとの組み合わせでナノプレックスを用いることによって、またはサポニンありの共トランスフェクションを包含する本発明のナノ粒子もしくは本発明のナノプレックスを含む組成物を適用することによって達成される次の利益が明らかになった。トリテルペノイドサポニン、例えばＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１、好ましくはＧＥ１７４１の同時適用によるＣａｓ９ＤＮＡの増大した送達が明らかである。ポリリジン対核酸の質量比が考えられるときに、まさに十分に低い細胞毒性を示しかつ改善されたかつ効率的な細胞侵入を見せる製剤比および濃度が、本発明者らによって確立される。２：１～１５：１から選択される比が好ましく、４：１～８：１から選択される比が好ましい。細胞に対するプラスミドＤＮＡ（およびサポニン）の適用のタイミングは、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子ノックインを確立することにとって十分に正確であった。例においては、効率的な遺伝子ノックアウトを提供するｇＲＮＡ配列を用いた。高感度のアッセイによって、細胞集団内の単一のノックアウトである細胞が同定され得る。

【0154】

それゆえに、インビトロの細胞内への核酸のトランスフェクションの間のサポニンの存在の影響下におけるＣａｓ９ＤＮＡ（＞８ｋｂｐ）のような大きいコンストラクトの驚くべきことに増大した送達は、本発明者らの知る限りこれまで存在することおよび明らかであることはなかったサポニンの新規の特性を表している。サポニンに基づくインビトロトランスフェクションができる細胞（例えばＮｅｕｒｏ－２Ａ、ＪＩＭＴ－１）は、今や、本発明者らによる本貢献を原因として、それらのサイズにかかわらず、いずれかの核酸によってトランスフェクションされ得る。重要なことに、５ｋｂｐよりも大きい、例えばさらには７～８ｋｂｐよりも大きいプラスミドサイズを有するプラスミドＤＮＡのサポニンに基づくトランスフェクションは、トランスフェクション剤Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ３０００を用いる当分野において現行で用いられる方法の１つと比較されるときに、より高い効率に到達する。例えば５．５ｋｂｐ、またはより高い比較的大きいプラスミドＤＮＡの所望のトランスフェクションが考えられるときに当分野が悩む問題は、例えば、２０２０年１２月にサーモフィッシャーウェブサイトから取られた次の引用文によって例示される：「カチオン性脂質によって媒介されるトランスフェクションにおける類似の取り込み効率にもかかわらず、大きいプラスミドの核送達は小さいプラスミド分子と比較して難しい。この効果は、同等の質量またはモル濃度の異なるサイズのコンストラクトを用いて観察され、プラスミドの核送達が細胞内の通過の速度によって限定され得るということと、小さいプラスミドが細胞の防御の飽和によってではなくむしろ細胞質の素早い通過によって分解を免れるということとを示唆する（ルカクス（Lukacs）ら，２０００年、マクレナキャン（McLenachan）ら，２００７年）」。ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｄｅ／ｄｅ／ｈｏｍｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ／ｇｉｂｃｏ－ｃｅｌｌ－ｃｕｌｔｕｒｅ－ｂａｓｉｃｓ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｂａｓｉｃｓ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ－ｆｏｒ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｄｎａ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌから取った。

【0155】

サポニンがプラスミドＤＮＡなどの大きいコンストラクトのためのトランスフェクションブースターとして適用される本発明の技術は、現行で当分野において見られる見かけ上の阻止されたトランスフェクション効率の解決を提供する。

【0156】

サポニンはトランスフェクションの分野において種々の適用を提供する。実施された試験および提示された例および先に実行された試験は、これがインビトロの環境および実験において適用されるということを証明した。大きいＤＮＡプラスミド（プラスミドＤＮＡ）からポリリジンに基づくナノプレックスへの首尾良い複合体化と、より小さいサイズのプラスミドＤＮＡ（最高で４～５ｋｂｐのプラスミドＤＮＡサイズを有する）、ｍＲＮＡ、およびミニサークルＤＮＡによる先に実施されたナノプレックス製剤とによって、ナノ粒子が核酸によってトランスフェクションされるべきである細胞と接触させられるときにサポニンの存在と組み合わせられたポリリジンＫ_１６ペプチドおよび核酸から組成されるナノ粒子からなるトランスフェクショントライアドは、今や、本発明に従う効率的なかつ非毒性のインビトロ遺伝子送達のための普遍的なツールであることが分かった。

【0157】

ポリリジンＫ_１６ペプチドに基づくナノプレックスによって、驚くべきことに、８．２ｋｂｐほども大きいＤＮＡプラスミドが複合体化され、（１～５マイクログラム／ｍＬ）ＧＥ１７４１またはＳＯ１８６１の存在下においてインビトロの細胞内にトランスフェクションされ得た。行なわれた分析に基づくと、より大きいサイズのポリリジンペプチドもまた安定なナノプレックスを形成し得るということが明らかであった（ゲル保持アッセイ）。これは正荷電のペプチドの量についてフレキシビリティを提供し、これは調整され得る。

【0158】

参照
クロシャール（Clochard），Ｊ．、イェルツ（Jerz），Ｇ．、シュミーダー（Schmieder），Ｐ．、ミトダンク（Mitdank），Ｈ．、トローガー（Troger），Ｍ．、サーマ（Sama），Ｓ．、ウェン（Weng），Ａ．（２０２０年）アグロステンマ・ギタゴＬ．からの新たなアセチル化トリテルペンサポニンは遺伝子送達を効率的に調節し、高い細胞の忍容性を示す（A new acetylated triterpene saponin from Agrostemma githago L. modulates gene delivery efficiently and shows a high cellular tolerance）．インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），第５８９巻，ｐ．１１９８２２．
リュ（Ryu），Ｎ．、キム（Kim），Ｍ．Ａ．、パク（Park），Ｄ．、リ（Lee），Ｂ．、キム（Kim）、Ｙ．Ｒ．、キム（Kim），Ｋ．Ｈ．、ベック（Baek），Ｊ．Ｉ．、キム（Kim），Ｗ．Ｊ．、リ（Lee），Ｋ．Ｙ．、キム（Kim），Ｕ．Ｋ．，（２０１８年）標的化された遺伝子治療のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の有効なＰＥＩによって媒介される送達（Effective PEI－mediated delivery of CRISPR－Cas9 complex for targeted gene therapy）．ナノメディシン（Nanomedicine），第１４巻，ｐ．２０９５－２１０２．
サーマ（Sama），Ｓ．、イェルツ（Jerz），Ｇ．、シュミーダー（Schmieder），Ｐ．、ジョセフ（Joseph），Ｊ．Ｆ．、メルジグ（Melzig），Ｍ．Ｆ．、ウェン（Weng），Ａ．（２０１８年ａ）ジプソフィラ・エレガンスＭ．ビーブからの植物由来トリテルペンは、遺伝子を装填したナノプレックスの非毒性の送達を可能にする（Plant derived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb. enable non－toxic delivery of gene loaded nanoplexes）．ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Journal of Biotechnology），第２８４，ｐ．１３１－１３９．
サーマ（Sama），Ｓ．、Ｇ．イェルツ（Jerz）、Ｐ．シュミーダー（Schmieder）、Ｅ．ヴォイト（Woith）、Ｍ．Ｆ．メルジグ（Melzig）、およびＡ．ウェン（Weng）．２０１７年．「サポフェクトシド－非毒性のかつ有効なＤＮＡおよびＲＮＡ送達を保証する（Sapofectosid －Ensuring non－toxic and effective DNA and RNA delivery）」，インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティクス（International Journal of Pharmaceutics），第５３４巻：ｐ．１９５－２０５．
サーマ（Sama），Ｓ．、Ｅ．ヴォイト（Woith）、Ｗ．ヴァルター（Walther）、Ｇ．イェルツ（Jerz）、Ｗ．チェン（Chen）、Ｓ．ハルト（Hart）、Ｍ．Ｆ．メルジグ（Melzig）、およびＡ．ウェン（Weng）．２０１８年ｂ．「標的化された自殺遺伝子トランスフェクションは、悪性の神経芽腫を有するｎｕ／ｎｕマウスにおける有望な結果を明らかにする（Targeted suicide gene transfections reveal promising results in nu/nu mice with aggressive neuroblastoma）」，ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Journal of Controlled Release），第２７５巻：ｐ．２０８－１６．

【0159】

配列－配列番号

配列番号１
ストレプトコッカス・ピオゲネス血清型Ｍ１からのＣａｓ９；配列はｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２から検索
＞ｓｐ｜Ｑ９９ＺＷ２｜ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９／Ｃｓｎ１
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【0160】

配列番号２
フランシセラ・ツラレンシスｓｕｂｓｐ．ノビシダ（株Ｕ１１２）からのＣａｓ１２ａ；配列はｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ａ０Ｑ７Ｑ２から検索
＞ｓｐ｜Ａ０Ｑ７Ｑ２｜ＣＳ１２Ａ＿ＦＲＡＴＮＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ１２ａ
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【0161】

配列番号３
レプトトリキア・ブッカリス（株ＡＴＣＣ１４２０１／ＤＳＭ１１３５／ＪＣＭ１２９６９／ＮＣＴＣ１０２４９／Ｃ－１０１３－ｂ）からのＣａｓ１３ａ；配列はｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｃ７ＮＢＹ４から検索
＞ｓｐ｜Ｃ７ＮＢＹ４｜ＣＳ１３Ａ＿ＬＥＰＢＤＣＲＩＳＰＲ関連エンドリボヌクレアーゼＣａｓ１３ａ
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【図1】