特表 2024-520524 短鎖相補的核酸、短鎖相補的核酸を含む組成物、および抗ウイルス剤としての使用のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】短鎖相補的核酸、短鎖相補的核酸を含む組成物、および抗ウイルス剤としての使用のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240517BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K48/00

A61P31/22

A61P43/00 111

A61K31/7105

A61K31/711

A61K31/7115

A61K9/14

A61K47/34

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573329

(86)(22)【出願日】2022-05-27

(85)【翻訳文提出日】2024-01-24

(86)【国際出願番号】 US2022031327

(87)【国際公開番号】W WO2022251622

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】63/194,326

(32)【優先日】2021-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511105953

【氏名又は名称】ハワード ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100117606

【弁理士】

【氏名又は名称】安部 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100136423

【弁理士】

【氏名又は名称】大井 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100154449

【弁理士】

【氏名又は名称】谷 征史

(72)【発明者】

【氏名】タン， チーイ

(72)【発明者】

【氏名】チュー， ホア

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076AA95

4C076CC35

4C076EE23

4C076EE25

4C076FF70

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB33

4C084ZC41

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB33

4C086ZC41

(57)【要約】

本開示は、短鎖相補的ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）、短鎖相補的ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）を含む組成物、とそのような短鎖相補的ＲＮＡを抗ウイルス剤として使用する方法を提供する。本開示は、より具体的な実施形態において、１本鎖であって、約２０～３０ヌクレオチド（ｎｔ）長の、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の主要な即時型（ＭＩＥ）遺伝子等の必須ウイルス遺伝子のイントロンに対して相補的であるｓｃＲＮＡを提供する。また、本明細書では、医薬的に許容される担体系をさらに備える医薬組成物を提供し、この担体系は、エンドソームのｐＨに反応してｓｃＲＮＡを放出するカチオン性ポリマーを備える。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１本鎖核酸分子であって、
１つ以上のポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトを含むウイルスｍＲＮＡのイントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列を備え、
前記核酸分子は、前記ポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトのうち１つ以上を含むイントロン配列の領域にハイブリダイズすることができる、１本鎖核酸分子。

【請求項2】

前記ウイルスｍＲＮＡは、ＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子由来である、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記イントロン配列は、前記ＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子の４番目のイントロンである、請求項２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記核酸分子は、ＨＣＭＶ感染細胞に導入されると、ＨＣＭＶ ＩＥ２のスプライシングと発現を阻害することができる、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、１０～１００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、１０～５０ヌクレオチド長である、請求項５に記載の核酸分子。

【請求項7】

前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ－３’を有する、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項8】

前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ－３’と９０％以上の配列同一性を持つ配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を備える組成物であって、
前記組成物は、送達ビヒクルをさらに備える、組成物。

【請求項10】

前記送達ビヒクルは、ポリマーを備える、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ポリマーは、カチオン性ポリマーを備える、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記送達ビヒクルは、送達粒子である、請求項１０または１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記送達粒子は、前記核酸分子と少なくとも１つのポリマーとを備えるコア構造を有し、
前記送達粒子は、前記コア構造を包む少なくとも１つのラッピング層をさらに備える、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記コア構造は、前記核酸分子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、とポリスペルミンイミダゾール４，５－イミン（ＰＳＩ）とを備える、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記少なくとも１つのラッピング層は、親水性ポリマーを備える、請求項１３または１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記送達粒子は、標的化部分を備える、請求項１２に記載の組成物。

【請求項18】

前記標的化部分は、前記送達粒子をＨＣＭＶ感染細胞に標的化する、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記標的化部分は、ＣＸ３ＣＬ１またはその変異体もしくは誘導体である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記核酸分子は、修飾塩基、塩基類似体、と脱塩基部位のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項21】

前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸。

【請求項22】

前記核酸分子は、短い相補的ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）である、請求項２１に記載の核酸。

【請求項23】

前記核酸分子は、異種分子に結合している、請求項１～８および２０～２２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項24】

ヘルペスウイルス感染症、好ましくはＨＣＭＶ感染症を治療するための方法であって、
請求項１～８および２０～２２のいずれか１項に記載の核酸分子を、それを必要とする被験体に投与することを備える、方法。

【請求項25】

ヘルペスウイルス感染症、好ましくはＨＣＭＶ感染症を治療するための方法であって、
請求項９～１９のいずれか１項に記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを備える、方法。

【請求項26】

転写スイッチングを阻害する方法であって、
請求項１～８および２０～２２のいずれか１項に記載の核酸をウイルスｍＲＮＡと接触させることを備える、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（連邦政府の支援による研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）による助成金番号ＳＣ１１１２７８５によって、その一部が支援されたものである。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

【0002】

(配列表)
本出願は、配列表を含み、その内容を参照によって援用する。

【0003】

本開示は、概して、ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）（これに限定されない）等の短鎖相補的核酸、短鎖相補的核酸を含む組成物、およびｓｃＲＮＡを含む短鎖相補的核酸を抗ウイルス剤として使用する方法に関する。

【0004】

また、本開示は、より具体的な実施形態において、１本鎖であり、約２０～３０ヌクレオチド（ｎｔ）長を有する、必須ウイルス遺伝子（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の主要即時型（ＭＩＥ）遺伝子等）のイントロンに相補的である、ｓｃＲＮＡを含む短鎖相補的核酸を提供する。

【0005】

また、本明細書において、ｓｃＲＮＡを含むこのような短鎖相補的核酸を含む医薬組成物を提供する。これらの医薬組成物は、さらに、薬学的に許容される送達システムを含む。より具体的な実施形態において、このような送達システムは、エンドソームｐＨに反応してｓｃＲＮＡを放出するカチオン性ポリマーを含む。

【背景技術】

【0006】

ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染は、新生児の先天性疾患の主要な感染原因である。先天性ＨＣＭＶ感染は、永続的な神経障害および神経認知障害を引き起こすため、世界的に重大な健康問題となっている。Ｋｉｒｂｙ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ－ａ ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｂｌｅｍ、”Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１６、 １６（８）：９００－１）、Ｂｏｅｃｋｈ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎ、ｐａｒａｄｉｇｍ、ａｎｄ ｐｕｚｚｌｅ、”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１１、１２１（５）：１６７３－８０）、Ｃａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ） ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｗａｒｅｎｅｓｓ、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２００９、４６ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｓ６－１０）、Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｆｅｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、”Ｃｌｉｎ． Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．、２００９、３６（３）：６３９－５３）、および、Ｂｒｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｐａｒａｄｏｘ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｏｆ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ、”Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５、２０４（３）：２６３－７１）を参照。一般的に、ＨＣＭＶは、多くの人に感染し、免疫不全者にとっては高い罹患率と死亡率の原因となっている。Ｓｗｅｅｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、”ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、１９９９、２３（４）：４５７－８２）、Ｌａｎｄｏｌｆｏ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００３、９８（３）：２６９－９７）、および、Ｍｏｃａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ、”２００６、５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．）、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照。現在、利用できるワクチンはない。

【0007】

ＨＣＭＶ感染の一般的な治療法には、ウイルスのＤＮＡ複製をターゲットとする２’－デオキシグアノシン（およびその誘導体）の合成非環式類似体と、ＣＭＶターミナーゼ複合体を標的とする低分子量化合物とを含む。Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（“Ｌｅｔｅｒｍｏｖｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、”Ｅｘｐｅｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ．、２０１７、６［２］；２３５－４１）、Ｃｈｅｍａｌｙ ｅｔ ａｌ．（“Ｌｅｔｅｒｍｏｖｉｒ ｆｏｒ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２０１４、３７０（１９）：１７８１－９）、およびＰｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｅｔｅｒｍｏｖｉｒ ａｎｄ ｍａｒｉｂａｖｉｒ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、”Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．、２０１９、１６３：９１－１０５）を参照。しかし、これらの治療法では薬剤耐性が現れることが多く、また、さらに、これらの治療法には、胎児のＨＣＭＶ曝露に適するものがない。Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｒｉｒｕｓ ＵＬ９７ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ ａｎｄ ｍａｒｉｂａｖｉｒ、”Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．、２００８、１８（４）：２３３－４６）、Ｐａｓｓ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、”Ｊ．Ｉｎｆｅｃｃｔ．Ｄｉｓ．、２００７、１９５（６）：７６７－９）、およびＣｈｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｌｅｔｅｒｍｏｖｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ａ ｌｕｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｇａｃｉｃｌｏｖｉｒ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、”Ａｍ．Ｊ．Ｒｒａｎｓｐｌａｎｔ．、２０１８、１８（１）：３０６０－４）を参照。したがって、新たな特異的ＨＣＭＶ複製阻害剤、特に、先天性のＣＭＶ感染に使用できるものが緊急に必要となっている。

【0008】

許容宿主細胞におけるＣＭＶの複製は、明確な一連のプロセスであって、以下を含む（時系列に）。つまり、細胞への侵入、即時型（ＩＥ）の遺伝子発現、初期（Ｅ）の遺伝子発現、ＤＮＡ複製、後期（Ｌ）の遺伝子発現、ウイルスの産生を含む。Ｍｏｃａｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｒｉｒｕｓｅｓ、”２００６、５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．）、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）を参照。ＭＩＥ遺伝子は、感染の初期段階で最も多く発現するウイルス遺伝子であり、いくつかの核リン酸化タンパク質となる。中でも、即時型タンパク質１（ＩＥ１、また、ＩＥ７２として知られている）および即時型タンパク質２（ＩＥ２、また、ＩＥ８６として知られている）が最も多い。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（“Ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｅａｒｌｙ Ｍ１１２／１１３ ｐｒｉｔａｉｎｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＩＥ３ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００５、７９（１）：２５７－６３、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（“Ｉｍｍｉｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｆｅｎｓｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、”ｉｎ “Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｒｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、”Ｈｅｔｈｅｒｓｅｔｔ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．：Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００５）、Ｈａｇｅｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ７２Ｋ ＩＥ１ ａｎｄ ８０Ｋ ａｎｄ ｈｓｐ７０ ｐｒｏｍｏｔｏｅｒｓ ｖｉａ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｊ．Ｇｅｎ．ＶＩｒｏｌ．、１９９２、７３：２３８５－９３）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（”Ａ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ（ＩＥ） ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＥ２、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９１、６５（２）：８９７－９０３、Ｓｃｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＩＥ２ ８６－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｉａ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９５、６９（１０）：６５３３－４０）、Ａｗｓｔｈｉ ｅｔ ａｌ．（”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ １ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４、７８（１５）：８１９１－２００、Ｓａｎｄａｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．（”Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ９１ ａｎｄ １０２ ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎｓ、“Ａｒｇｈ．Ｖｉｒｏｌ．、２０００、１４５（６）：１２５７－６６）、Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．（”Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＩＥ１ ａｎｄＩＥ２ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔ ＰＭＬ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｉｅｓ ａｔ ｖｅｒｙ ｅａｒｌｙ ｔｉｍｅｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｅｍｉｓｓｉｖｅ ｃｅｌｌｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７１（６）：４５９９－６１３）、Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｌｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｅｄ ｃｅｌｌｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７１（２）：１２４６－５５）、Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（”Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｌｙ ｇｅｎｅ、“Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６、３８（５－６）：３４３－９）、およびＳｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｌｙ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８４、４９（１）：１９０－９を参照。

【0009】

ＩＥ１とＩＥ２は、その両方の発現が、同じプロモーター（ＭＩＥＰ）の制御下で起こる。ＭＩＥ遺伝子は、それぞれ、５つのエクソンと４つのイントロンから構成されており、ＩＥ１とＩＥ２とで最初の３つのエクソンを共有しているが、最後のエクソン（ＩＥ１ではエクソン４、ＩＥ２ではエクソン５）に関しては異なっている。１番目のエクソンは、いかなるアミノ酸もコードしておらず、開始配列に関係する。Ｓｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｌｙ ｇｅｉｎｅ、”Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６、３９（５－６）：３４３－９）、およびＳｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（“Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｉｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８２、４９（１）：１９０－９を参照。１番目のイントロン（イントロンＡ）は、ＮＦ１およびＣＴＣＦとの相互作用によってＭＩＥ遺伝子の調節に関与していると信じられている。Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（“Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎｔｅａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｆｉｖｅ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ、”ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８６、５（６）：１３６７－７１）、およびＭａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（“ＣＴＣＦ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｉｎｔｒｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｉｍｍｅｄｉａｅ－Ｅａｒｌｙ（ＭＩＥ） Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｒｉｒｕｓ（ＨＣＭＶ） Ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＭＩＥ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＨＣＭＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２０１４、ｄｏｉ：ＪＶＩ．００８４５－１４）を参照。

【0010】

ＨＣＭＶは、大型ＤＮＡウイルスの１科であるヘルペスウイルス科に属する。ヘルペスウイルスは、２００もの異なる遺伝子をコードしている可能性がある。必須遺伝子の中には、その発現が、転写後のＲＮＡスプライシングに依存しているものがある。例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）遺伝子のＭＩＥ遺伝子は５つのエクソンと４つのイントロンを有し、ＩＥとＩＥ２を産生するためにスプライシングされる必要がある（ＩＥとＩＥ２はウイルスの感染と複製に必須である）。

【0011】

ＲＮＡスプライシングには、イントロンＲＮＡの細胞因子との相互作用が必要である。転写レベルでのＭＩＥ遺伝子の発現調整については、広い範囲にわたって研究がなされている。Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７１（２）：１２４６－５５）、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．（“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、“Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４、８５：３５４１－５３）、Ａｋｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｓｐｌｉｃｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、８４：１１１７－２２）、Ｓｏｕｒｖｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（“Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎｔｏ ｐａｒｅｎｔａｌ ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮＤ１０ ｉｎ ｌｉｖｅ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ、“Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００７、８１（１８）：１０１２３－３６）、およびＳｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．（“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｌａｔｅｎｃｙ、ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｙｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、”Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、２０１０、１７９９（３－４）：２８６－９５）を参照。しかし、ＨＣＭＶ遺伝子のスプライシング制御の詳細は、いまだ不明である。

【0012】

ポリピリミジントラクト（Ｐｙ）結合タンパク質（ＰＴＢ）は、ＭＩＥ遺伝子のスプライシングに干渉すること（Ｃｏｓｍｅ ｅｔ ａｌ．（“Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｊｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００９、８３（７）：２８３９－５０を参照）、また、ＨＣＭＶ感染によって、ＰＴＢの時間的な変化が起こること（Ｇａｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２０１０、９１：１５４７－５９を参照）から、本願発明者らは、１つ以上のＰｙを含むイントロンに対して相補的な小さい核酸（ＲＮＡ等）をウイルス複製（ＨＣＭＶ複製等）を阻害する抗ウイルス剤として使用できる抗ウイルス機構に想到した。

【発明の概要】

【0013】

ＨＣＭＶの主要な即時型（ＭＩＥ）遺伝子は、ウイルスの複製に必須であり、ＭＩＥ遺伝子がコードする産物の中で最も数が多いものには、ＩＥ１とＩＥ２とが含まれる。ＩＥ１とＩＥ２遺伝子は、どちらも、最初の３つのエクソンと最初の２つのイントロンと同様に、ＭＩＥプロモーター（ＭＩＥＰ）を共有している。ＩＥ１は、ＣＭＶ感染後（または、ＭＩＥ遺伝子のトランスフェクション後）に、ＩＥ２よりも早い時点で発現する。本願発明者らは、イントロン４（エクソン４とエクソン５の間）に、ＩＥ１からＩＥ２への転写スイッチングを担う２つのポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトを同定した。本願発明者らは、さらに、ＩＥ２のスプライシングと発現には、１番目のＰｙが重要であり、２番目のＰｙが必須であることを発見した。

【0014】

より具体的には、本願発明者らは、（１）２番目のＰｙは、ＩＥ２の４番目のイントロンがスプライシング因子（例えば、Ｕ２ＡＦ６５）と結合するために必須であること、（２）第１のＰｙが、Ｕ２ＡＦ６５とイントロンの結合を強化することを発見した。本願発明者らは、さらに、２番目のＰｙを変異させたＨＣＭＶ ＢＡＣｍｉｄを用いて、２番目のＰｙを欠損によって、ウイルスの産出が完全に抑制されることを発見した（一方、１番目のＰｙを変異させたＨＣＭＶは、欠陥表現型とともに複製された）。

【0015】

これらの発見に鑑みて、本願発明者らは、抗ウイルス剤として、１つ以上のＰｙを含むイントロンＲＮＡに相補的である短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）に想到した。このような分子は、その阻害作用がウイルスに特異的であるため（イントロン配列に相補的であるが、宿主細胞配列には相補的でないため）、抗ウイルス剤として利点がある。

【0016】

本開示は、さらに、相乗的な抗ウイルス組成物および方法を提供するために、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）を短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と組み合わせて提供する。

【0017】

本開示は、さらに、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および組成物を効率的に送達するための送達システムを提供する。

【0018】

本開示の非限定的な実施形態には、以下が含まれる。

【0019】

［１］１本鎖核酸分子であって、１つ以上のポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトを含むウイルスｍＲＮＡのイントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列を備え、前記核酸分子は、前記ポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトのうち１つ以上を含むイントロン配列の領域にハイブリダイズすることができる、１本鎖核酸分子。

【0020】

［２］前記ウイルスｍＲＮＡは、ＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子由来である、［１］に記載の核酸分子。

【0021】

［３］前記イントロン配列は、前記ＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子の４番目のイントロンである、［２］に記載の核酸分子。

【0022】

［４］前記核酸分子は、ＨＣＭＶ感染細胞に導入されると、ＨＣＭＶ ＩＥ２のスプライシングと発現を阻害することができる、［３］に記載の核酸分子。

【0023】

［５］前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、１０～１００ヌクレオチド長である、［１］に記載の核酸分子。

【0024】

［６］前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、１０～５０ヌクレオチド長である、［５］に記載の核酸分子。

【0025】

［７］前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ－３’を有する、［１］に記載の核酸分子。

【0026】

［８］前記イントロン配列の全部または一部に対して相補的な配列は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ‐３’と９０％以上の配列同一性を持つ配列を有する、［１］に記載の核酸分子。

【0027】

［９］［１］～［８］のいずれか１つに記載の核酸分子を備える組成物であって、
前記組成物は、送達ビヒクルをさらに備える、組成物。

【0028】

［１０］前記送達ビヒクルは、ポリマーを備える、［９］に記載の組成物。

【0029】

［１１］前記ポリマーは、カチオン性ポリマーを備える、［１０］に記載の組成物。

【0030】

［１２］前記送達ビヒクルは、送達粒子である、［１０］または［１１］に記載の組成物。

【0031】

［１３］前記送達粒子は、前記核酸分子と少なくとも１つのポリマーとを備えるコア構造を有し、前記送達粒子は、前記コア構造を包む少なくとも１つのラッピング層をさらに備える、［１２］に記載の組成物。

【0032】

［１４］前記コア構造は、前記核酸分子、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、とポリスペルミンイミダゾール４，５－イミン（ＰＳＩ）とを備える、［１３］に記載の組成物。

【0033】

［１５］前記少なくとも１つのラッピング層は、親水性ポリマーを備える、［１３］または１４に記載の組成物。

【0034】

［１６］前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、［１５］に記載の組成物。

【0035】

［１７］前記送達粒子は、標的化部分を備える、［１２］に記載の組成物。

【0036】

［１８］前記標的化部分は、前記送達粒子をＨＣＭＶ感染細胞に標的化する、［１７］に記載の組成物。

【0037】

［１９］前記標的化部分は、ＣＸ３ＣＬ１またはその変異体もしくは誘導体である、［１８］に記載の組成物。

【0038】

［２０］前記核酸分子は、修飾塩基、塩基類似体、と脱塩基部位のうちの少なくとも１つを含む、［１］～［８］のいずれか１つに記載の核酸。

【0039】

［２１］前記核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの両方を含む、［１］～［８］のいずれか１つに記載の核酸。

【0040】

［２２］前記核酸分子は、短い相補的ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）である、［２１］に記載の核酸。

【0041】

［２３］前記核酸分子は、異種分子に結合している、［１］～［８］および［２０］～［２２］のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0042】

［２４］ヘルペスウイルス感染症、好ましくはＨＣＭＶ感染症を治療するための方法であって、［１］～［８］および［２０］～［２２］のいずれか１つに記載の核酸分子を、それを必要とする被験体に投与することを備える、方法。

【0043】

［２５］ヘルペスウイルス感染症、好ましくはＨＣＭＶ感染症を治療するための方法であって、［９］～［１９］のいずれか１つに記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを備える、方法。

【0044】

［２６］転写スイッチングを阻害する方法であって、［１］～［８］および［２０］～［２２］のいずれか１つに記載の核酸を、ウイルスｍＲＮＡと接触させることを備える、方法。

【0045】

（参照による援用）
本明細書において引用される全ての特許、刊行物、および特許出願は、各個々の特許、刊行物、または特許出願が、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用されると具体的かつ個々に示されているように、参照により本明細書に援用される。

【0046】

本発明の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、より良く理解できるだろう。各図面は、比例して表示したものではなく、また縮尺されているわけでもない。指標の位置は、おおよそのものである。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１Ａ～１Ｄは、エクソン５のスプライシンのためのポリピリミジントラクト（Ｐｙ）の同定を確認した実験の結果を示す。図１Ａは、エクソン４とエクソン５の間のＭＩＥ ＲＮＡ配列を示す。強調表示したａａｕａａａ配列は、ＩＥ１のポリＡシグナルであり、２つの予測されるＰｙ配列には下線を引いている（Ａ－ｕｃｕｃｃｃとＢ－ｕｃｕｕｃｕｕ）。図１Ｂは、ＩＥ１／ＩＥ２産生を判定するためのウエスタンブロットアッセイの結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢで２４時間トランスフェクトし、全細胞溶解液を集めてＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、抗ＩＥｌ／２抗体（ＭＡＢ８１０）を用いてＩＥ１／ＩＥ２産生を調べた。関連するバンドは、図示するように、ＩＥｌ、ＳＵＭＯ－ＩＥ１、ＩＥ２、またはＳＵＭＯ－ＩＥ２を示す。図１Ｃは、ＩＥ１／ＩＥ２発現を判定するためのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢで２０時間トランスフェクトし、全ＲＮＡを単離した。１μｇの全ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲに用いて、ＩＥ１／ＩＥ２発現を調べた。グラフのデータは、３つの独立した実験からの平均±標準偏差を表している。図１Ｄは、ＩＥ２とＩＥ２の発現と局在とを判定する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果を示している。ｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢをＭＲＣ－５細胞に２０時間トランスフェクトし、次いで細胞を固定して透過処理し、ＩＥ１（緑で示す）、ＩＥ２（赤で示す）、およびＤＡＰＩ（青で示す）を着色した。

【図2】図２Ａ～２Ｂは、ポリピリミジントラクト（Ｐｙ）とスプライシング因子の相互作用を確認した実験の結果を示す。図２Ａは、ＰｙＡとＰｙＢ（ｗｔ）、変異したＰｙＡ（ｄＰｙＡ）、変異したＰｙＢ（ｄＰｙＢ）、または変異体の両方（ｄＰｙＡＢ）を含むＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブと結合しているＵ２ＡＦ６５の分析をするために用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ：ＥＭＳＡ）の結果を示す。遊離プローブと結合プローブの位置を画像の左側に示す。図２Ｂは、ｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた、Ｕ２ＡＦ６５、ＰＴＢ、または制御ＩｇＧに特異的な抗体を用いたトランスフェクション後２４時間のＲＮＡクロマチン免疫沈降（ＲＮＡ ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す。定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、図示した領域に特異的なプライマーを用いてＣｈＩＰ効率を定量した。棒グラフは、３回の独立したＰＣＲから得られた各ＣｈＩＰのインプットに対する平均パーセント±標準偏差を表している。

【図3】図３Ａ～３Ｂは、ＩＥ１／ＩＥ２のスプライシングアッセイの実験結果を示す。図３Ａは、ＩＥ２ ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの予測サイズと、ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマー（ｐＳｈｏｒｔおよびｐＩＥ２）を示す図である。図３Ｂは、ＩＥ１／ＩＥ２スプライシングアッセイの結果を示す図である。このＩＥ１／ＩＥ２スプライシングアッセイでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢで２０時間トランスフェクトし、全ＲＮＡを単離した。１μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼとともにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号＃１２５７４０１８）を用いて、製造業者の実施要項に従ってＲＴ－ＰＣＲを行った。制御には以下を含む。（１）プラスミドＤＮＡの混入の可能性を排除するため、全ＲＮＡをＰＣＲの鋳型として直接使用した。（２）ＤＮＡベクター中のＤＮＡのサイズを示すため、プラスミドＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。

【図4】図４Ａ～４Ｄは、ウイルスの複製でのＰｙの重要性を確認した実験の結果を示す。図４Ａは、ＩＥ１およびＩＥ２の産生を調べるための免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果を示している。図示するように、ＭＲＣ－５細胞を、ＢＡＣｍｉｄでトランスフェクトした後２０時間で固定し、ＩＥ１（ＦＩＴＣ）とＩＥ２（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）の産生を調べるためにＩＦＡアッセイを行った。図４Ｂは野生型、ＨＣＭＶｄＰｙＡ、および復帰型のウイルスのウイルス増殖曲線を示す。ウイルスの増殖は、感染多重度（ＭＯＩ）０．１の感染のよって、ＭＲＣ－５細胞のプラークアッセイを用いて判定した。各実験を３回行った。ウイルスの増殖は、プラーク形成を分析することにより算出した。増殖曲線に示した感染性ウイルス粒子数は、３回の実験の平均値である。エラーバー付きのデータは平均±標準偏差を示す。図４Ｃは、０．５のＭＯＩでＭＲＣ－５細胞に感染させた後、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体によるウイルスタンパク質産生を調べるためのウエスタンブロットアッセイの結果を示す。図４Ｄは、ＩＥ１およびＩＥ２を検出するための免疫染色の結果を示す。ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ－５）を、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体で、ＭＯＩ０．５で異なる時間感染させて、１２時間および２４時間で固定し、ＩＥ１（ＦＩＴＣ）とＩＥ２（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）に対する抗体を用いて引き続き免疫染色を行った。ＩＥ１およびＩＥ２陽性細胞は、蛍光顕微鏡でカウントした。エラーバー付きのデータは平均±標準偏差を示す。この結果によって、ＰｙＡがウイルス感染システムでのＩＥ２産生に重要であることが確認された。

【図5】図５Ａ～５Ｃは、ＩＥ２のスプライシング、発現、およびイントロン４とスプライシング因子との相互作用におけるＰｙＡの重要性を確認した実験の結果を示す。図５Ａは、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体に０．１のＭＯＩで１６時間感染させたＭＲＣ－５細胞を用いて行ったＩＥ２スプライシングアッセイの結果を示す。図５Ｂは、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体で１のＭＯＩで１６時間感染させたＭＲＣ－５細胞でのイントロン４と遺伝子スプライシング因子（ＰＴＢおよびＵ２ＡＦ６５）との相互作用を判定するためのＲＮＡ ＣｈＩＰアッセイの結果を示している。図５Ｃは、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体に０．５のＭＯＩでＭＲＣ－５細胞に感染させた後、異なる時間におけるＩＥ１／ＩＥ２ ｍＲＮＡレベルを判定するためのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示している。

【図6】図６Ａ～６Ｆは、ＩＥ２遺伝子の発現に対する短鎖相補的ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）の作用を判定した実験の結果を示す。図６Ａは、ｓｓＲＮＡプローブと相補的ｓｃＲＮＡＰｙの配列を示す。図６Ｂは、ｓｓＲＮＡプローブをｓｃＲＮＡＰｙとともにインキュベーションした結果を示しており、これらは２本鎖ＲＮＡを形成したことを示している（ｓｓＲＮＡやｓｃＲＮＡＰｙよりもサイズが大きいことによって示される）。図６Ｃは、ｓｃＲＮＡＰｙの非存在下または存在下でのＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブに結合しているＵ２ＡＦ６５を判定するために用いたＥＭＳＡアッセイの結果を示す。図６Ｄは、ＩＥ２遺伝子のスプライシングに対するｓｃＲＮＡＰｙ干渉のモデルを示す。ｓｃＲＮＡＰｙはＰｙを含むイントロンを有するｄｓＲＮＡを形成し、Ｕ２ＡＦ６５とＰｙとの相互作用をブロックする。図６Ｅは、ＩＥ２産生を判定するために用いたウエスタンブロットアッセイの結果を示している。Ｐｙに相補的なｓｃＲＮＡ（ｓｃＲＮＡＰｙ、ＲＮＡ配列は図６Ａに示す）、またはＰｙの上流に相補的なｓｃＲＮＡ（ｓｃＲＮＡｕｐＰｙ：ｇａｇ ｕａｇ ｇａｕ ｕａｃ ａｇａ ｇｕａ ｕａａ ｃａｕ ａｇａ ｇｕａ ｕａａ ｕａｕ ａｇａ ｇｕａ ｕａｃ ａａｕ ａｇ）、またはスクランブルＲＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子から作製）とｐＳＶＨのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのコトランスフェクションを２４時間行い、全細胞溶解液を使用して、抗ＩＥ２抗体を用いたＩＥ２産生を調べた。チューブリンをローディングベクターとして使用した。図６Ｆは、ＩＥ２ ｍＲＮＡレベルを調べるためのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲの結果を示している。ｓｃＲＮＡＰｙ、またはｃＲＮＡｕｐＰｙ、またはスクランブルＲＮＡとｐＳＶＨをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、全ＲＮＡを単離した。１μｇの全ＲＮＡをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲに用いて、ＩＥ２ ｍＲＮＡレベルを調べた。棒グラフは、３つの独立した実験の平均±標準偏差を表している。

【図7】図７Ａ～７Ｄは、２９３Ｔ細胞においてリポフェクタミン２０００でトランスフェクトしたプラスミド由来のＩＥ１／２タンパク質におけるｓｉＲＮＡおよびｓｃＲＮＡのサイレンシング効率を判定するために用いたウエスタンブロットアッセイの結果を示している。図７Ａは、ｓｉＲＮＡ ＩＥ２およびｓｉＲＮＡ ＩＥ１／２をＰＳＶＨプラスミドとともにトランスフェクトした実験の結果を示す。図７Ｂは、ｓｃＲＮＡ ＩＥ２とプラスミドを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした実験の結果を示す。図７Ｃは、ＩＥ１／２タンパク質のサイレンシングのためにｓｉＲＮＡとｓｃＲＮＡを組み合わせて使用した実験の結果を示す。図７Ａは、ポリプレックスおよびポリワプレックスに配合したプラスミドを用いて、ｓｉＲＮＡとｓｃＲＮＡの組み合わせのサイレンシング効果を測定した実験の結果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0048】

ウイルスの複製に必須のＨＣＭＶ主要即時型（ＭＩＥ）遺伝子は、ＩＥ１遺伝子産物とＩＥ２遺伝子産物をコードする。ＩＥ１遺伝子とＩＥ２遺伝子は、ＭＩＥプロモーター（ＭＩＥＰ）と、最初の３つのエクソン、および最初の２つのイントロンを共有している。上述したように、本願発明者らは、ＩＥ１からＩＥ２への転写スイッチングを担う、イントロン４内（エクソン４とエクソン５の間）の２つのポリピリミジン（Ｐｙ）トラクトを同定した。本願発明者らは、ＩＥ２のスプライシングと発現には、１番目のＰｙが重要で、２番目のＰｙが必須であることを発見した。

【0049】

これらの発見に鑑みて、本願発明者らは、１つ以上のＰｙを含むイントロンＲＮＡに相補的で、イントロン配列に結合し、それによって遺伝子スプライシングを阻害する短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）に想到した。核酸は好ましくは１本鎖であるか、または、相補的結合を効果的にするために少なくとも１本鎖領域を含む。従って、このメカニズムは、例えば、ヘルペスウイルスやアデノウイルス等の様々なＤＮＡウイルスの阻害に応用可能である。

【0050】

本開示は、特定の実施形態において、ＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子のイントロン４における２つのＰｙをカバーするイントロンＲＮＡの全部または一部と相補的な短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）を提供する。

【0051】

本開示は、また、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）を短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と組み合わせる、または、これと組み合わせて使用する組成物および方法を提供する。この組み合わせにより、相乗的な抗ウイルス組成物および方法を提供してもよい。

【0052】

本開示は、さらに、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および組成物を効率的に送達するための送達システムを提供する。

【0053】

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないと理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって明確に指定されない限り、複数である場合を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及には、１つ以上のポリヌクレオチドを含み、「ベクター」への言及には、１つ以上のベクターを含む。

【0054】

また、特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のその他の方法および材料は、本発明において有用であり得るが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。

【0055】

本明細書の教示に鑑み、当業者であれば、例えば、以下の標準的な教本によって教示されているように、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えポリヌクレオチドの従来技術を適用することができる。Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ９７８－０３２３４７９７８３）、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２０１７、１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄｅｍｏｓ Ｍｅｄｉｃａｌ、ＩＳＢＮ９７８－１６２０７００９７６）、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６、９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ９７８－０８１５３４５０５３）、Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、２０１６、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｄａｖｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＩＳＢＮ９７８－０８０３６４４６６３）、Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１４、Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－１－９３６１１３－８１－１）、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１６、７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ＩＳＢＮ９７８－１１１８８７３６５６）、Ｃ．Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、２０１４、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＩＳＢＮ９７８－０１２４１０４９０７）、Ｈ．Ｈｅｄｒｉｃｈ（Ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｏｕｓｅ、２０１２、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０１２３８２００８２）、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１３、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－１９３６１１３０１９）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０１９９６３４２４８）、Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＳＮ１０６４－３７４５）、Ｒｉｏ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０８７９６９８９１１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓｅｒｉｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２０１２、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－１６０５５００５６０）、およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０１３、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０１２３８２２３９０）を参照。

【0056】

「リンカー領域配列」、「リンカー配列」、および「リンカーポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、第１の核酸配列（例えば、５’－リンカーヌクレオチド配列－第１の核酸配列－３’）に共有結合した１つ以上のヌクレオチドの配列のことを意味する。いくつかの実施形態において、リンカーヌクレオチド配列は、２つの別々の核酸配列を結合して単一のポリヌクレオチドを形成する（例えば、５’－第１の核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－第２の核酸配列－３’）。リンカー配列のその他の例としては、５’－第１核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－３’や５’－リンカーヌクレオチド配列－第１核酸配列－リンカーヌクレオチド配列－３’があるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーヌクレオチド配列は、水素結合形成による相互作用によって二次構造を作ることのない、対になっていない核酸塩基の１本鎖ヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態において、リンカーエレメントヌクレオチド配列は、約１００以下、約９０以下、約８０以下、約７０以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２０以下、約１５以下、約１４以下、約１３以下、約１２以下、約１１以下、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、または約２以下の塩基長を有する。

【0057】

「野生型」、「自然に生じる」、および「非変性型」という用語は、本明細書において、自然界に存在する典型的な（または最も一般的な）形態、外観、表現型、または系統を意味するために使用する。例えば、細胞、生物、ポリヌクレオチド、タンパク質、巨大分子複合体、遺伝子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはゲノムの典型的な形態は、それらが自然界の供給源に存在し、そこから単離することができる。野生型の形態、外観、表現型、または系統は、意図的な変形を行う前の元の親として機能する。従って、変異型、変種、操作型、組換え型、修飾型は、野生型ではない。

【0058】

ポリペプチドに言及する場合、「単離された」とは、示された分子が、その分子が自然界で見出される生物全体から分離した個別のものであること、または、同じ型のその他の生物学的の巨大分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、自然界で通常それに関連する配列の全部または一部が欠けている核酸分子、または自然界に存在する配列であるが、それに関連する異種配列を有する配列、または染色体から切り離された分子である。

【0059】

本明細書で使用する「精製された」という用語は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、さらに好ましくは、少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％の同一分子が存在することを意味する。

【0060】

「操作した」、「遺伝子操作した」、「遺伝子改変した」、「組み換えの」、「修飾した」、「非自然発生の」、および「非天然の」という用語は、生物または細胞のゲノムの意図的な人為的操作を示す。これらの用語は、本明細書で定義するゲノム編集や、また、遺伝子の発現や不活性化を変化させる技術、酵素工学、定向進化、知識型設計、ランダム変異誘発法、遺伝子シャフリング、コードン最適化等を含むゲノム改変の方法を包含する。遺伝子工学の方法は、当技術分野で公知である。

【0061】

「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）」、「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｕｎｄ）」、「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」、「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、および「分子結合（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｄ）」は、本明細書において互換的に使われ、原子間の電子対の共有を伴う化学結合のことを指す。共有結合の例としては、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合があげられるが、これらに限定されない。

【0062】

「非共有結合（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）」、「非共有結合した（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「非共有結合した（ｎｏｎ－ｃｏｎｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｕｎｄ」「非共有結合した（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」、「非共有相互作用（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）」、「非共有結合した（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」は、本明細書において互換的に使われ、一対の電子の共有を伴わないあらゆる比較的弱い化学結合のことを指す。複数の非共有結合は、巨大分子の構造を安定化し、分子間の特異的な相互作用を仲介する。非共有結合の例としては、水素結合、イオン性相互作用（例えば、Ｎａ^＋Ｃｌ^―）、ファンデルワールス相互作用、疎水性結合等があげられるが、これらに限定されるものではない。

【0063】

本明細書で使用する「水素結合」、「水素塩基対合」、および「水素結合した」は、互換的に使われ、標準的な水素結合および非標準的な水素結合のことを指す。この標準的な水素結合および非標準的な水素結合には、「ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）水素結合塩基対」（Ｗ－Ｃ－水素結合塩基対またはＷ－Ｃ水素結合）、「フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）水素結合塩基対」（フーグスティーン水素結合）、および「ウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）水素結合塩基対」（ウォブル水素結合）を含むがこれらに限定されない。逆Ｗ－Ｃ水素結合を含むＷ－Ｃ水素結合とは、プリンーピリミジン塩基対、すなわち、アデニンとチミン、グアニンとシトシン、およびウラシルとアデニンのことを指す。逆フーグスティーン水素結合を含むフーグスティーン水素結合とは、核酸における塩基の一種で、２つの核酸塩基（各鎖に１つずつ）が、主溝の水素結合によって共に保持されている結合である。この非Ｗ－Ｃ水素結合により、３本目の鎖が２本鎖の周囲に巻き付き、３本鎖らせんを形成することができる。逆ウォブル水素結合を含むウォブル水素結合とは、ワトソン－クリック塩基対規則に従っていないＲＮＡ分子における２つのヌクレオチド間の対のことである。ウォブル塩基対の主要なものとしては、グアニンとウラシル、イノシン（ヒポキサンチン）とウラシル、イノシンとアデニン、およびイノシンとシトシンの４つがある。また、イノシンとチミン、イノシンとグアニンの間でもウォブル塩基相互作用が起こることが知られている。イノシン塩基およびデオキシイノシン塩基は、標準的なＤＮＡ塩基およびＲＮＡ塩基と水素結合することができるため、「ユニバーサル・ペアリング塩基」と呼ぶことができる（例えば、図７参照）。また、Ｗａｔｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、３３（１９）：６２５８－６７）を参照。標準的水素結合および非標準的水素結合は、当業者にとって公知である。例えば、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、２００５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０８７９６９７３９６）、Ｒ．Ｆ． Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、１９９９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０８７９６９５６１３）、およびＲ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ（Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ、 Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ）、１９９３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、９７８－０８７９６９４５６２）を参照。また、Ａｐｐｅｎｄｉｘ １：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒｓ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ａｔ Ｌｅａｓｔ Ｔｗｏ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄｓ、Ｉ．Ｔｉｎｏｃｏ）、Ｗ．Ｓａｅｎｇｅｒ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９８８、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＡＧ、ＩＳＢＮ９７８－０－３８７－９０７６１－１）、およびＳ．Ｎｅｉｄｌｅ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２００７、Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ９７８－０１２３６９５０７９１）を参照。

【0064】

「結合する（ｃｏｎｎｅｃｔ）」、「結合した（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、および「結合している（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）」は、本明細書では互換的に使われ、２つの巨大分子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質等）間の共有結合または非共有結合を指す。

【0065】

本明細書で使用する「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、および「オリゴヌクレオチド」の用語は、互換的であり、ヌクレオチドの重合体のことを指す。本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」の用語は、１つの５’末端および１つの３’末端を有し、１つ以上の核酸配列からなり得るヌクレオチドの重合体のことを指す。これらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、それらの類似体、または、それらの組み合わせであってもよく、任意の長さを有していてもよい。ポリヌクレオチドは、任意の機能を果たしてもよく、種々の二次および三次構造を有していてもよい。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、および塩基、糖、および／またはリン酸部分が修飾されたヌクレオチドを包含する。特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対特異性を有する（例えば、ＡのＴとの塩基対の類似体）。ポリヌクレオチドは、１つの修飾ヌクレオチドまたは複数の修飾ヌクレオチドを備えていてもよい。修飾ヌクレオチドの例としては、フッ素化ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体があげられる。ヌクレオチド構造は、ポリマーが組み込まれる前であっても後であっても修飾することができる。重合に続いて、ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分または標的結合成分との抱合によって、さらに修飾されてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分を組み込んでもよい。これら用語は、また、合成、天然および／または非天然に存在するものであって、参照ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と同様の結合特性を有する、修飾された骨格残基または結合を含む核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホールアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ（商標））（Ｅｘｉｑｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）ヌクレオシド、グリコール核酸、架橋核酸、およびモルホリノ構造があげられるが、これらに限定されない。

【0066】

本明細書で使用される「脱塩基の」、「脱塩基部位」、「脱塩基ヌクレオチド」、および「脱プリン部位／脱ピリミジン部位」の用語は、互換的に使用され、プリン塩基またはピリミジン塩基を欠くヌクレオチド配列中の部位のことを指す。特定の実施形態では、脱塩基部位は、リボース部位からなる。その他の実施形態においては、脱塩基部位は、リボース部位からなる。さらなる実施形態においては、脱塩基部位は、１’ヒドロキシル基を有するペントース環等の修飾された骨格からなる。脱塩基部位は、窒素塩基を含まないため、ＤＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡヌクレオチドの相補的窒素塩基と水素塩基対結合を形成することができない。

【0067】

本明細書で使用する「塩基類似体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中の標準プリン塩基または標準ピリミジン塩基との構造的な類似性を有する化合物のことを指す。この塩基類似体は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基と比較して、修飾された糖および／または修飾された核酸塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、この塩基類似体は、２’－デオキシイノシン等のイノシンまたはデオキシイノシン、である。その他の実施形態においては、この塩基類似体は、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチド、または２’－リボヌクレオチドであり、ここで、核酸塩基は、修飾塩基（例えば、キサンチン、ウリジン、オキサニン（オキサノシン）、７－メチルグアノシン、ジヒドロウリジン、５－メチルシチジン、Ｃ３スペーサー、５－メチルｄＣ、５－ヒドロキシブチル－２’－デオキシウリジン、５－ニトロインドール、５－メチルイソ－デオキシシトシン、イソデオキシグアノシン、デオキシウリジン、イソデオキシシチジン、その他のＯ－１プリン類似体、Ｎ－６－ヒドロキシルアミノプリン、ネブラリン、７－デアザヒポキサンチン、その他の７－デアザプリン、および２－メチルプリン等）を含む。いくつかの実施形態においては、塩基類似体は、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルフォリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホルアミデートイノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシン、および２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群より選択され得る。「塩基類似体」の用語は、また、例えば、２’－デオキシリボヌクレオシド、２’－リボヌクレオシド、２’－デオキシリボヌクレオチドまたは２’－リボヌクレオチドを包含し、ここで、核酸塩基は、置換ヒポキサンチンである。例えば、置換ヒポキサンチンは、フッ素または塩素等のハロゲンで置換されていてもよい。いくつかの実施形態において、塩基類似体は、２－クロロイノシン、６－クロロイノシン、８－クロロイノシン、２－フルオロイノシン、６－フルオロイノシン、または８－フルオロイノシン等のフルオロイノシンまたはクロロイノシンであってもよい。その他の実施形態においては、塩基類似体は、デオキシウリジンである。その他の実施形態においては、塩基類似体は、核酸模倣物（例えば、人工核酸およびゼノ核酸（ＸＮＡ）等）である。

【0068】

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリヌクレオチドのリン酸－糖骨格が柔軟な擬似ペプチドポリマーで置換された、核酸の合成ホモログである。核酸塩基は、ポリマーと結合する。ＰＮＡは、ＲＮＡとＤＮＡの相補的な配列に高い親和性と特異性をもってハイブリダイズする能力を持つ。

【0069】

ホスホロチオエート核酸では、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、ポリヌクレオチドホスフエート骨格において、非架橋酸素を硫黄原子に置換する。この修飾により、ヌクレオチド間結合は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性を有するようになる。いくつかの実施形態においては、ホスホロチオエート結合が、エキソヌクレアーゼ分解を阻害するために、ポリヌクレオチド配列の５’末端または３’末端配列で最後の３～５つのヌクレオチド間に導入される。オリゴヌクレオチド全体にホスホロチオエート結合を配置することは、エンドヌクレアーゼによる分解を減少させるのにも役立つ。

【0070】

スレオース核酸（ＴＮＡ）は、人工的な遺伝子ポリマーである。ＴＮＡの骨格構造は、ホスホジエステル結合によって結合したトレオース糖の繰り返しからなる。ＴＮＡポリマーはヌクレアーゼ分解に対して耐性を有する。ＴＮＡは、塩基対水素結合によって２重鎖構造に自己組立てできる。

【0071】

結合反転は、「リバースホスホロアミダイト」の使用によってポリヌクレオチドに導入することができる（例えば、ｗｗｗ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｄｎａｌａｂ／ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／－ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ／ｌｉｎｋａｇｅｓを参照）。ポリヌクレオチドの末端における３’－３’結合は、２つの５’－ＯＨ末端を有するが３’－ＯＨ末端を欠くオリゴヌクレオチドを作製することによって、エキソヌクレアーゼ分解に対してポリヌクレオチドを安定化する。一般的に、このようなポリヌクレオチドは、５’－ＯＨ位置にホスホロアミダイト基を有し、３’－ＯＨ位置にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常は、ＤＭＴ保護基は５’－ＯＨ上にあり、ホスホロアミダイトは３’－ＯＨ上にある。

【0072】

ポリヌクレオチド配列は、特に指示がない限り、本明細書では、従来の５’から３’の方向で表示される。

【0073】

本明細書で使用する「配列同一性」とは、概して、様々な重み付けパラメーターを有するアルゴリズムを使用して、第１のポリヌクレオチドまたは第１のポリペプチドと第２のポリヌクレオチドまたは第２のポリペプチドとを比較するための、ヌクレオチド塩基またはアミノ酸の同一性の割合のことを指す。２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列同一性は、ウェブサイトからインターネットを通じて入手可能な種々の方法およびコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥＲ、Ｌ－ＡＬＩＧＮ等）による配列アラインメントを用いて判定することができる。そのようなウェブサイトには、ＧＥＮＢＡＮＫ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）およびＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．）が含まれるが、これらに限定されない。２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列同一性は、一般的に、種々の方法またはコンピュータープログラムの標準的なデフォルトのパラメーターを使用して計算される。２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の高い配列同一性とは、一般的に、参照ポリペプチドの長さにわたって、約９０％から約１００％の間であり、例えば、約９０％以上であり、好ましくは約９５％以上であり、より好ましくは約９８％以上である。２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の中程度の配列同一性とは、一般的に、参照ポリペプチドの長さにわたって、約８０％から約８５％の間であり、例えば、約８０％以上であり、好ましくは約８５％である。２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の低い配列同一性とは、一般的に、約５０％から７５％の間であり、例えば、参照ポリペプチドの長さにわたって、約５０％であり、好ましくは約６０％であり、より好ましくは約７５％である。

【0074】

例えば、本開示の核酸配列は、参照配列に対して特定の配列同一性を有していてもよい。この配列同一性は、例えば、２５％以上、５０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってもよい。

【0075】

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、または「ハイブリダイズしている（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」とは、水素塩基対形成により、２つの相補的な１本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を結合させて、１つの２本鎖分子（ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ）を形成するプロセスのことである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一般的に、ハイブリダイゼーション温度とハイブリダイゼーションバッファーの塩濃度によって決まる。例えば、高温で低塩濃度の場合、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が得られる。異なるハイブリダイゼーション条件の塩濃度範囲と温度範囲の例は以下の通りである。高ストリンジェンシーとは、約０．０１Ｍ～約０．０５Ｍの塩濃度で、Ｔ_ｍから５℃から１０℃低いハイブリダイゼーション温度であり、中ストリンジェンシーとは、約０．１６Ｍ～約０．３３Ｍの塩濃度で、Ｔ_ｍより２０℃から２９℃低いハイブリダイゼーション温度であり、低ストリンジェンシーとは、約０．３３Ｍ～約０．８２Ｍの塩濃度で、Ｔ_ｍから４０℃から４８℃低いハイブリダイゼーション温度である。２重鎖核酸配列のＴ_ｍは、当該技術分野で公知の標準的な方法で計算される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｃａｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７７、４：１５３９－１５５２）；Ｂｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８５、１０（ｌ）：４５－５２）、およびＷａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８１、９（４）：８７９－８９４）を参照。Ｔ_ｍを推定するアルゴリズム予測ツールも広く普及している。ハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件とは、一般的に、標的配列に相補的なポリヌクレオチドが、標的配列と優先的にハイブリダイズして、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。一般的には、ハイブリダイゼーション条件は、中ストリンジェンシー、好ましくは高ストリンジェンシーである。

【0076】

本明細書で使用される「相補的」とは、核酸配列がその他の核酸配列と水素結合を形成する能力のことを指す（例えば、標準的なワトソン－クリック塩基対形成による）。相補率とは、第２の核酸配列と水素結合を形成できる核酸配列中の残基の割合を示すものである。２つの核酸配列が１００％の相補性を有する場合、２つの配列は完全に相補的であり、すなわち、第１のポリヌクレオチドの連続する残基がすべて、第２のポリヌクレオチド中の同じ数の連続する残基と水素結合する。

【0077】

本明細書で使用される「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質とポリヌクレオチドとの間、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとの間、またはタンパク質とタンパク質との間等）の非共有結合的相互作用のことを指す。このような非共有結合的相互作用とは、「関連する」または「相互に作用する」（例えば、第１の巨大分子が第２の巨大分子と相互作用する場合は、第１の巨大分子が、非共有結合的に第２の巨大分子に結合する）ことを指す。結合相互作用のいくつかの部分は、配列特異的であってもよい（「配列特異的結合」、「配列特異的に結合する」、「部位特異的結合」、および「部位特異的に結合する」は、本明細書において互換的に使用される）。結合相互作用は、解離定数（Ｋｄ）によって特徴づけができる。「結合親和性」とは、結合相互作用の強度のことを指す。高い結合親和性は、低いＫｄと相関がある。

【0078】

本明細書で使用する「調節配列」、「調節エレメント」、および「制御エレメント」という用語は互換的であり、発現するポリヌクレオチド標的の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非翻訳配列）であるポリヌクレオチド配列のことを指す。調節配列は、例えば、転写のタイミング、転写量または転写レベル、ＲＮＡ処理またはＲＮＡの安定性、および／または関連する構造的なヌクレオチド配列の翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、活性化物質結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、転写開始部位、リプレッサー結合配列、ステムル―プ構造、翻訳開始配列、内部リボソ―ム進入部位（ＩＲＥＳ）、翻訳リーダー配列、転写終結配列（例えば、ポリアデニル化シグナルやポリＵ配列）、翻訳終結配列、プライマー結合部位等を含んでもよい。

【0079】

調節エレメントには、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現、誘導性発現、および抑制性発現を指示するもの、ならびに特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上のＰＯＬ ＩＩＩプロモーター、１つ以上のＰＯＬ ＩＩプロモーター、１つ以上のＰＯＬ Ｉプロモーター、または、それらの組み合わせを含む。ＰＯＬ ＩＩＩプロモーターの例としては、Ｕ６プロモーターおよびＨＩプロモーターがあげられるが、これらに限定されない。ＰＯＬ ＩＩプロモーターの例としては、レトロウイルスのラス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（ＲＳＶエンハンサーを有していてもよい）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶエンハンサーを有していてもよい。例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ、１９８５、４１：５２１―５３０）を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクタ―ゼプロモーター、β―アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦｌαプロモーターがあげられるが、これらに限定されない。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベル等の要因に依存し得ることが、当業者には理解される。ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載の核酸配列によりコードされる転写産物、融合タンパク質または融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。

【0080】

本明細書で使用する「遺伝子」とは、エクソンおよび関連する調節配列からなるポリヌクレオチド配列のことを指す。遺伝子は、イントロンおよび／または非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含んでいてもよい。

【0081】

本明細書で使用される「操作可能に結合した」という用語は、互いに機能的関係にあるポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のことを指す。例えば、調節配列（例えば、プロモーターやエンハンサー）は、調節配列がポリヌクレオチドの転写を調節するか、または調節に寄与する場合、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに「操作可能に結合され」ている。操作可能に結合した調節エレメントは、一般的に、コード配列と連続している。しかしながら、エンハンサーは、プロモーターから数キロベース以上離れていても機能することができる。従って、いくつかの調節エレメントは、ポリヌクレオチド配列と操作可能に結合していてよく、ポリヌクレオチド配列とは連続していなくてもよい。同様に、翻訳調節エレメントは、ポリヌクレオチドからのタンパク質発現の調節に寄与する。

【0082】

本明細書で使用する「発現」とは、ＤＮＡ鋳型からのポリヌクレオチドの転写のことを指し、この転写の結果、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその他のＲＮＡ転写物（例えば、構造ＲＮＡまたはスキャフォールドＲＮＡ等の非コードＲＮＡ）が生じる。この用語は、さらに、転写したｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスのことを指す。転写産物およびコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称してもよい。発現は、ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。

【0083】

「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ポリペプチドに転写されたり（ＤＮＡの場合）、翻訳されたり（ｍＲＮＡの場合）する核酸分子である。コード配列の境界は、５’末端の開始コードンと３’末端の翻訳停止コードンによって決定する。転写終結配列は、コード配列の３’末端に位置してもよい。

【0084】

本明細書で使用する「調節する」という用語は、機能の量、程度、または大きさの変化のことを指す。従って、遺伝子発現の「調節」には、遺伝子活性化と遺伝子抑制の両方が含まれる。調節は、標的遺伝子の発現によって直接的または間接的に影響を受ける任意の特性を決定することによってアッセイすることができる。このような特性には、例えば、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベル、タンパク質活性、産物のレベル、遺伝子の発現、またはレポーター遺伝子の活性レベルの変化が含まれる。

【0085】

本明細書で使用する「ベクター」および「プラスミド」は、遺伝物質を細胞に導入するためのポリヌクレオチド送達ビヒクルを指す。ベクターは直鎖状であってもよいし、環状であってもよい。ベクターは、適当な宿主細胞においてベクターの複製を引き起こすことができる複製配列（例えば、複製起点）を含むことができる。適当な宿主の形質転換を行うと、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製して機能するか、または、宿主ゲノムに統合され得る。ベクターの設計は、特に、ベクターの使用目的および宿主細胞に依存し、特定の使用目的および特定の宿主細胞に対する本発明のベクターの設計は、当該技術分野の技術レベルの範囲内である。主要なベクターの種類には、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体の４つがある。一般的に、ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、および／または選択可能なマーカーを含んでいる。発現ベクターは、一般的に、発現カセットからなる。「組換えウイルス」とは、例えば、異種核酸構築物をウイルスゲノムまたはその一部に付加または挿入することにより、遺伝的に改変されたウイルスを意味する。

【0086】

本明細書で使用する「発現カセット」とは、組換え法を使用して、または合成手段によって生成され、宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの発現を容易にするために、選択されたポリヌクレオチドに操作可能に結合された調節配列を含むポリヌクレオチド構築物のこと指す。例えば、制御配列は、宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの転写、または宿主細胞における選択されたポリヌクレオチドの転写と翻訳を促進することができる。発現カセットは、例えば、宿主細胞のゲノム中に統合する、または発現ベクターを形成するためにベクター中に存在することができる。

【0087】

本明細書で使用される「間」という用語は、所定の範囲内の末端値を包含する（例えば、「約１ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長の間）には、１ヌクレオチド長と５０ヌクレオチド長が含まれる）。

【0088】

本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、ペプチド模倣体、グリシン、およびＤまたはＬ光学異性体を含む、天然および合成（非天然）のアミノ酸のことを指す。

【0089】

本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的であり、アミノ酸のポリマーのことを指す。ポリペプチドは、どのような長さであってもよい。ポリペプチドは、分枝状でも直鎖状でもよく、非アミノ酸で中断されていてもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよい。この用語は、また、例えば、アセチル化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ＰＧ化、ビオチン化、架橋結合、および／またはコンジュゲーション（例えば、標識成分や標識リガンドとの結合）によって修飾されたアミノ酸ポリマーのことを指す。本明細書中では、ポリペプチドの配列は、特に指示がない限り、従来のＮ末端からＣ末端への方向で表示する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、分子生物学の分野における常用技術を用いて作製することができる。さらに、本質的にいかなるポリペプチドまたはポリヌクレオチドも商業的供給源から入手可能である。

【0090】

本明細書で使用される「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」という用語は、天然には同時に存在しない２つ以上のタンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質フラグメントを単一のタンパク質中で結合させることによって作製される単一のタンパク質のことを指す。

【0091】

本明細書で使用される「部分」とは、分子の一部を指し得る。部分は、官能基であり得る、または、（例えば、共通の構造的態様を共有する）複数の官能基を有する分子の一部のことをいうこともある。この「部分」という用語と「官能基」という用語は、一般的に、互換的に使用されるが、「官能基」は、より具体的には、ある共通の化学的挙動を有する分子の一部を指すことができる。「部分」は、構造的な説明として使用されることが多い。いくつかの実施形態において、５’末端、３’末端、または、５’末端および３’末端は、１つ以上の部分を含み得る。

【0092】

本明細書で使用される「修飾タンパク質」、「変異タンパク質」、「タンパク質変種」、および「操作タンパク質」は、一般的には、非天然の配列からなるように修飾されたタンパク質のことを指す（すなわち、修飾タンパク質は、非修飾タンパク質と比較すると、独自の配列を有する）。

【0093】

「被験者」、「個体」または「患者」は、本明細書において互換的に使用され、ヒト、および、アカゲザル、チンパンジー、および、その他のサルや類人猿種等の非ヒト霊長類を含む霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ等の家畜、イヌ、ネコ等の家畜哺乳類、ウサギ、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、ニワトリ、七面鳥、その他のガリン科の鳥、アヒル、およびガンを含む家禽類、野鳥、狩猟鳥類等の鳥類を含む脊索動物門の任意のメンバーのことを指す。脊索動物門の任意の動物とは、上記のものに限定されない。この用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。従って、この用語は、成体、幼体、および新生個体、また、雄および雌を含む。

【0094】

組成物または薬剤の「有効量」または「治療上の有効量」という用語は、所望の反応を得るのに十分な組成物または薬剤の量のことを指す。好ましくは、有効量は、１つ以上の有害な副作用を予防、回避、または排除する。必要とされる正確な処置量は、被験体の種、年齢、および一般的な状態、治療される状態の重症度、使用される特定の治療法、投与様式等に応じて、被験体ごとに異なる。個々の症例における適切な「有効」量は、日常的な実験を用いて当業者が決定してもよい。

【0095】

特定の疾患の「治療」または「治療すること」には、（１）疾患を予防すること、例えば、疾患の素因を有している可能性があるが、まだ疾患の症状を経験していなかったり、示していなかったりする被験体において、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を防止すること、または、疾患がより低い強度で発生するようにすること、（２）疾患を阻害すること、例えば、発症速度を低下させること、疾患の進行を阻止すること、または、疾患状態を逆転させること、および／または（３）疾患の症状を緩和すること、例えば、被験体によって経験される症状の数を減少させること、が含まれる。

【0096】

本明細書で使用する「形質転換」とは、挿入の方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことを指す。例えば、形質転換は、直接的な取り込み、トランスフェクション、感染等によるものであり得る。核酸とポリヌクレオチドは、例えば、ウイルスベクター、ヌクレオフェクション、遺伝子銃、ソノポレーション、細胞圧搾、リポフェクション、または化学物質（例えば、細胞透過性ペプチド）を用いて細胞に導入することができる。

【0097】

本明細書中で使用される「ヘルペスウイルス」は、ヘルペスウイルス科のメンバーを指し、従って、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、及びにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）等のウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
短鎖相補的核酸

【0098】

本明細書に記載されるように、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、設計および合成が可能で、ヘルペスウイルスおよび／またはアデノウイルスの複製等のＤＮＡウイルス複製を阻害するものである。いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、１つ以上のＰｙを含むヘルペスウイルスの即時型遺伝子内のイントロンＲＮＡに相補的であり得る。特定の実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、１つ以上のＰｙを含むＨＣＭＶの即時型遺伝子のイントロンＲＮＡに相補的であってもよい。

【0099】

特定の実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、ＩＥ１からＩＥ２への転写スイッチングを担う２つのＰｙトラクトを含むＨＣＭＶ ＭＩＥ遺伝子のイントロン４（エクソン４とエクソン５の間）の全部または一部に相補的であってもよい。

【0100】

いくつかの実施形態において、イントロンＲＮＡに相補的なｓｃＲＮＡは、一方または両方のＰｙをカバーすることができる。

【0101】

実施形態において、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、スプライシング因子のイントロンとの相互作用に干渉してもよく、好ましくは、それによって必須遺伝子の発現を抑制してもよい。そのような実施形態のうちいくつかにおいて、スプライシング因子は、Ｕ２ＡＦ６５および／またはＵ２ＡＦ３５である。そのような実施形態のうちいくつかにおいて、イントロンは、ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子のイントロン４である。

【0102】

いくつかの実施形態において、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ－３’からなるか、その断片もしくは部分からなるか、または、その誘導体の修飾体からなる。

【0103】

いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの混合物であり、例えば、１つ以上の脱塩基部位、塩基類似体、および／または修飾塩基を含んでもいてもよいし、含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸配列は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸配列は、ＲＮＡのみを含む。さらに、本明細書で提供するｓｉＲＮＡは、いくつかの実施形態において、ＤＮＡ塩基を含んでいてもよい。

【0104】

特定の態様および実施形態において、本明細書における核酸分子（短鎖相補的核酸およびｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されない）は、１つ以上の修飾（または化学修飾）を含んでいてもよい。このような修飾は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド糖、ヌクレオチド塩基、ヌクレオチドリン酸基、および／またはリン酸骨格において存在し得る。

【0105】

特定の実施形態において、本明細書に開示される修飾は、核酸分子（短鎖相補的核酸、ｓｃＲＮＡ、および／またはｓｉＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏの安定性、特に、血清中の安定性を高めるため、および／または、分子の生物学的利用能を高めるために使用されてもよい。修飾の非限定的な例としては、インターヌクレオチドまたはインターヌクレオシド結合、核酸分子の任意の位置および鎖におけるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシリボヌクレオチド、好ましくは、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルから選択される２’－位に修飾を有する核酸（例えば、リボ核酸）、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５－Ｃ－メチルヌクレオチド、ビオチン基、および、末端グリセリルおよび／または逆デオキシ塩基性残基の組込み、蛍光分子等の立体障害分子があげられ、限定されない。その他の修飾ヌクレオチドには、例えば、３’－デオキシアデノシン、３’－アジド－３’デオキシチミジン、２’，３’－ジデオキシイノシン、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジン、２’，３’－ジデヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジン、および、３’－アジド－３’－デオキシチミジン、２’，３’－ジデオキシ－３’－チアシチジンおよび２’，３’－ジデオヒドロ－２’，３’－ジデオキシチミジンのモノリン酸ヌクレオチドを含んでもよい。

【0106】

また、本明細書において提供されるのは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’－メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチルチオエチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロヌクレオチド、２’－アジドヌクレオチド、および２’－Ｏ－メチルヌクレオチドである。化学修飾には、Ｃ２’－Ｃ３’結合が存在しない非ヌクレオチド、非環式類似体であるアンロック核酸、またはＵＮＡが含まれる。

【0107】

化学修飾は、また、核酸の５’部分および／または３’部分の末端修飾を含み、キャッピング部分としても知られている。このような末端修飾は、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、脂質、ペプチド、および糖から選択される。化学修飾は、また、「６員環ヌクレオチド類似体」を含む。六員環ヌクレオチド類似体の例には、ヘキシトールモノマーおよびアルトリトールヌクレオチドモノマ―が含まれる。

【0108】

化学修飾には、通常の天然に存在するヌクレオチドと比較して、逆のキラリティを有する「ミラー」ヌクレオチドも含まれる。ミラーヌクレオチドは、少なくとも１つの糖または塩基修飾および／または骨格修飾をさらに含んでいてもよい。ミラーヌクレオチドは、例えば、Ｌ－ＤＮＡ（Ｌ－デオキシリボアデノシン－３’－リン酸（ミラーｄＡ）、Ｌ－デオキシリボシチジン－３’－リン酸（ミラーｄＣ）、Ｌ－デオキシリボグアノシン－３’－リン酸（ミラーｄＧ）、Ｌ－デオキシリボチミジン－３’－リン酸（ミラーｄＴ））およびＬ－ＲＮＡ（Ｌ－リボウデノシン－３’－リン酸（ミラーｒＡ）、Ｌ－リボシチジン－３’－リン酸（ミラ－ｒＣ）、Ｌ－リボグアノシン－３’－リン酸（ミラーｒＧ）、およびＬ－リボウラシル－３’－リン酸（ミラーｄＵ））を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、修飾リボヌクレオチドは、修飾デオキシリボヌクレオチド、例えば５’ＯＭｅ ＤＮＡ（５－メチルデオキシリボグアノシン－３’－リン酸）、ＰＡＣＥ（デオキシリボアデノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテート）を含む。

【0110】

本明細書に開示される核酸（短鎖相補的核酸、ｓｃＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシルのような未修飾デオキシリボヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチド（プリンおよびピリミジン）を含んでいてもよい。核酸塩基は、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、イノシン、２－アミノアデニン、アデニン並びにグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体、以下のあらゆる「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド等の天然および合成核酸塩基で修飾することができる。「ユニバーサル塩基」は、アデニンとグアニンの２－プロピル誘導体およびその他のアルキル誘導体、５－ハロウラシル並びにシトシン、５－プロピニルウラシル並びにシトシン、６－アゾウラシル、シトシン、並びにチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、およびその他の８－置換アデニン並びにグアニン、５－トリフルオロメチルおよびその他の５－置換ウラシル並びにシトシン、７－メチルグアニン、デアザプリン、プリンとピリミジンのヘテロサイクリック置換類似体、例えば、アミノメトキシフェノキサジン、プリンとピリミジンの誘導体（例えば、１－アルキル誘導体、１－アルケニル誘導体、ヘテロアロマチック誘導体、および、１－アルキニル誘導体）、および、それらの互変異性体、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－ジアザキサンチン、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、５－（１－プロピニル）ウラシル、５－（１－プロピニル）シトシン、および４，４－エタノシトシン等である。適切な塩基のその他の例としては、２－アミノピリジンおよびトリアジン等の非プリニル塩基および非ピリミジニル塩基があげられる。

【0111】

本明細書に開示される核酸（短鎖相補的核酸、ｓｃＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）中の糖部分は、いかなる修飾も有しておらず、２’－ヒドロキシル－ペントフラノシル糖部分を含むことができる。あるいは、２’－デオキシ－ペントフラノシル糖部分、Ｄ－リボース、ヘキソース等の糖部分は修飾することができ、この修飾は、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチルおよび２’－Ｏ－エチルを含む）のようなペントフラノシル糖部分の２’位での修飾である。すなわち、２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｏ－アリール、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロゲン（２’－フルオロ、クロロおよびブロモを含む）、２’－メトキシエトキシ、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－２－メトキシエチル、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、ＣＦ、シアノ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート等が修飾される。

【0112】

いくつかの実施形態において、ペンタフラノシル環は、ペンタフラノシル環のＣ２’－Ｃ３’－結合を欠く非環式誘導体で置換されてもよい。例えば、アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰに通常存在する２’－デオキシリボフラノシル糖の代わりに、２－ヒドロキシエトキシメチル基で置換してもよい。

【0113】

本明細書に開示される核酸（短鎖相補的核酸、ｓｃＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合によって互いに結合されてもよい。ホスホジエステル結合は、任意にその他の結合で置換されてもよい。例えば、ホスホロチオエート、チオホスフエートＤ－リボース体、トリエステル、チオエート、２’－５’架橋骨格、ＰＡＣＥ、３’－（または５’）デオキシ－３’－（または５’）チオホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’－（または５’－）デオキシホスフィネート、ボラノホスフィネート、３’－（または５’－）デオキシ－３’－（または５’－）アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノホスフィネートエステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、および、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステル－リン結合、５’－エトキシホスホジエステル、Ｐ－アルキルオキシホスホトネステル、メチルホスホネート、非リン含有結合等のホスホトリエステル修飾体、例えば、炭酸塩、カルバミン酸塩、シリル、硫黄、スルホン酸、スルホンアミド、ホルマセタル、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノ結合である。

【0114】

本明細書に開示される核酸分子（短鎖相補的核酸、ｓｃＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格を含んでもよい。ＰＮＡ骨格は、ペプチド結合によって結合した反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシンユニットを含む。プリン塩基、ピリミジン塩基、天然塩基、合成塩基等の様々な塩基は、メチレンカルボニル結合によって骨格に結合する。

【0115】

修飾は、末端リン酸基で行うことができる。異なる安定化化学構造の非限定的な例を使用して、例えば、核酸配列の３’－末端を安定化することができる。例えば、（１）［３－３’］－逆デオキシリボース、（２）デオキシリボヌクレオチド、（３）［５’－３’］－３’－デオキシリボヌクレオチド、（４）［５’－３’］－リボヌクレオチド、（５）［５’－３’］－３’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、（６）３’－グリセリル、（７）［３’－５’］－３’－デオキシリボヌクレオチド、（８）［３’－３’］－デオキシリボヌクレオチド、（９）［５’－２’］－デオキシリボヌクレオチド、および（１０）［５－３’］－ジデオキシリボヌクレオチドである。未修飾の骨格化学構造に加えて、本明細書に記載の１つ以上の異なる骨格修飾と組み合わせることができる。

【0116】

本明細書で提供される修飾ヌクレオチドおよび核酸分子は、複合体、例えば、核酸分子に共有結合した複合体を含んでもよい。複合体は、リンカーを介して核酸分子に共有結合してもよい。一実施形態において、複合体分子は、例えば、特定の型の細胞内、または細胞内の特定の細胞内区画内もしくは小胞内等の細胞内への核酸分子の送達を容易にする分子を含んでもよい。複合体は、また、例えば、検出可能な標識、または、第２の分子による結合または検出を容易にする分子を含んでもよい。

【0117】

いくつかの実施形態では、ｓｃＲＮＡのような短鎖相補的核酸は、約５００以下、約４００以下、約３００以下、約２００以下、約１００以下、約９０以下、約８０以下、約７０以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２５以下、約２０以下、約１５以下、約１４以下、約１３以下、約１２以下、約１１以下、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、または、約２以下の塩基長を有する。

【0118】

いくつかの実施形態において、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、目的のイントロン配列に対して相補的な配列に対する特定の配列同一性を有する配列を備える。いくつかの実施形態において、配列は、目的のイントロン配列に対して相補的な配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する。

【0119】

いくつかの実施形態において、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、配列５’－ｃａｃｇｃｃｕｇｕｇａａａｃｃｇｕａｃｕａａｇｕｃｕｃｃｃｇｕｇｕｃｕｕｃｕｕａｕｃａｃｃａｕｃａｇ－３’に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を備える。
補完的短鎖相補的核酸とｓｉＲＮＡの結合

【0120】

ｓｉＲＮＡは、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）と結合させて、混合させて、組合せて、連続的に、または、同時に使用することができる。本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、好ましくは、完全にまたは部分的に相補的な塩基対合（ハイブリダイゼーション）によってイントロンを標的とする。いくつかの実施形態において、本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、核内のＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子のイントロン４のＰｙ含有部分とハイブリダイズする。これに対して、細胞質内の（例えば、ＨＣＭＶのＭＩＥ遺伝子の）ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを使用して、ＲＩＳＣ複合体を形成し、ｍＲＮＡの分解を引き起こすようにしてもよい。ｓｉＲＮＡと本開示の短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）の基礎となるメカニズムは異なるため、本明細書の実施形態では、ウイルス遺伝子の発現および複製に対する相加的または相乗的な阻害効果が得られる可能性がある。

【0121】

本開示のｓｉＲＮＡおよび短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、同時に送達されてもよく、または、異なる時に送達されてもよい。本開示のｓｉＲＮＡおよび短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）は、同じ送達機構または送達ビヒクルを使用して送達されてもよく、または、異なる送達機構または送達ビヒクルを使用して送達されてもよい。
治療薬よび治療組成物の送達

【0122】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸の送達は、当業者に公知の多くの方法によって達成してもよい。いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、細胞内に直接導入することができる。これらの成分を細胞内に導入する非限定的な方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポフェクション、パーティグルガン法、および、マイクロパーティグルガン法が挙げられる。

【0123】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸の送達は、粒子、脂質小胞、または、担体等の送達ビヒクルを使用することによって達成してもよい。核酸分子は、担体もしくは希釈剤、または、ウイルス配列、ウイルス特有リポソーム製剤、リポフェクチン、もしくは、沈殿剤等を含む、細胞内への侵入を補助、促進、または、容易化するよう作用する任意のその他の送達ビヒクルとともに、薬剤（核酸分子等）を直接投与することによって、被験体に送達または投与することができる。

【0124】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸の送達は、また、リポソームへの封入を含むがこれに限定されない当業者に公知の様々な方法によって、イオントフォレーシス、または生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、およびＰＬＧＡマイクロスフェア、生分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア等のその他のビヒクルへの組込み、あるいはタンパク質性ベクターによって達成してもよい。

【0125】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、カチオン性脂質と複合体化して、リポソーム内にパッケージングでき、また、そうでない場合は、標的細胞または標的組織に送達することができる。このような核酸、または核酸複合体は、生体高分子への組込みの有無にかかわらず、直接経皮適用、経皮適用、または注射によって、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで関連組織に局所投与することができる。送達システムには、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム、滞留型リポソーム、またはステルスリポソーム）がある。これらの製剤は、標的組織における薬物の蓄積を増加させる方法を提供する。

【0126】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖状または分枝状のＰＥＩ、）および／または、例えば、ポリエチレンイミン－ポリエチレングリコールＮ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＧＡＬ）、またはポリエチレンイミン－ポリエチレングリコール－トリ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ－ＰＥＧ－ｔｒｉＧＡＬ）誘導体、ガラクト－スＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体化ＰＥＩ、ポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ－ＰＥＩ）等のグラフト型ＰＥＩ等を含むポリエチレンイミン誘導体と配合、または複合することができる。

【0127】

いくつかの実施形態では、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、ナノ粒子を含むがこれらに限定されない送達粒子内において製剤化される。いくつかの実施形態では、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）およびｓｉＲＮＡは、同じナノ粒子内において製剤化される。その他の実施形態では、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）およびｓｉＲＮＡは、異なる、および／または別個の、ナノ粒子（複数可）内において製剤化される。

【0128】

いくつかの実施形態では、粒子（ナノ粒子等）は、１つ以上のカチオン性ポリマーを備える。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリマーは、ポリアミンもしくはポリイミン、またはそれらの誘導体を備えてもよい。

【0129】

いくつかの実施形態において、粒子は、コアと、コアを包含する１つ以上のシェル層とを備えてもよい。いくつかの実施形態において、粒子、または粒子コアは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリスペルミンイミダゾール４、５－イミン（ＰＳＩ）と複合体化された１つ以上の核酸を備えてもよい。いくつかの実施形態において、ネットワークカチオン性ポリマーは、（例えば、１００～４００ｎｍの範囲の）粒子または粒子コアとして使用してもよく、スペルミンイミダゾール４、５－アルデヒドオリゴマ―と分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ－８００）との縮合によって調製される。

【0130】

いくつかの実施形態において、ネットワークカチオン性ポリマーの大きさは、（例えば、このような縮合反応が起こる）溶液のｐＨを変化させることによって、および／または塩濃度を調整することによって、調整することができる。いくつかの実施形態において、約９～１２のｐＨが使用され、および／または約０～３０ｍＭの塩濃度が使用される。いくつかの実施形態において、約９のｐＨが使用される。いくつかの実施形態において、塩は塩化ナトリウムである。

【0131】

いくつかの実施形態において、コア粒子は、少なくとも１つのラッピング層で包まれている。いくつかの実施形態において、ラッピング層はポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、親水性ポリマーおよび／または水溶性ポリマーである。いくつかの実施形態において、ラッピングポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0132】

いくつかの実施形態において、粒子は、標的化部分を使用して、例えば、特定の細胞または細胞型を含む特定の目的地に特異的に標的化してもよい。いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的細胞の表面上の分子に結合する分子、リガンド、またはタンパク質である。いくつかの実施形態では、粒子は、ＨＣＭＶ感染細胞（またはＨＣＭＶによって感染可能な細胞）に優先的に粒子を標的化する標的化部分を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、標的化部分は、ケモカイン分子である。いくつかの実施形態において、ケモカイン分子は、ＣＸ３ＣＬ１、またはＨＣＭＶ感染細胞の表面に発現するＵＳ２８受容体に結合するその変異体もしくは誘導体である。

【0133】

当業者に公知の様々な技術を用いて、標的化部分を粒子に結合させることができる。

【0134】

いくつかの実施形態において、標的化部分は、リジンに結合して、（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端において、またはＮ末端および／またはＣ末端に向かって）余分なアミノ基を生成してもよい。いくつかの実施形態において、リジンは、ＣＸ３ＣＬ１、またはその変異体もしくは誘導体のような標的化部分のＣ末端に結合される。いくつかの実施形態において、標的化部分は、結合によって、粒子、コア、またはラッピング層に固定化される。いくつかの実施形態において、標的化部分（ＣＸ３ＣＬ１等）は、標的化部分に遊離した、または導入したアミノ基を使用すること等により、ＰＥＧラッピング層に固定化される。

【0135】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、核酸含有コアおよび１つまたは複数のラッピング層を含む粒子等の核酸含有粒子は、細胞（ＨＣＭＶ感染細胞等）によってエンドソ―ム内に取り込まれ、核酸は、エンドソ―ムの低ｐＨ条件下でコア複合体から放出することができる（細胞質基質への進入を得る）。

【0136】

いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、膜破壊剤と複合体化することができる。膜破壊剤および核酸分子はまた、カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子と複合体化してもよい。

【0137】

送達システムは、例えば、水性および非水性ゲル、クリーム、多重エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性および非水性溶液、ローション、エアロゾール、炭化水素塩基および炭化水素粉末を含んでもよく、可溶化剤、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル、およびポリビニルピロリドン）等の賦形剤を含むことができる。

【0138】

本明細書に開示する組成物、方法、およびキットは、本発明の少なくとも１つの核酸分子をコードする核酸配列を核酸分子の発現を可能にする方法で含む発現ベクターを含んでもよい。細胞の環境中に核酸分子または核酸分子を発現可能な１つ以上のベクターを導入する方法は、細胞型およびその環境の構成に依存する。

【0139】

いくつかの実施形態において、短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入した転写ユニットから発現してもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。核酸分子発現ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。核酸分子を発現することができる組換えベクターは、本明細書に記載されるように、送達することができ、標的細胞中で存続できる。あるいは、核酸分子の一過性の発現を提供するウイルスベクターを使用することもできる。このようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。核酸分子発現ベクターの送達は、静脈内投与または筋肉内投与等の全身投与が可能である。

【0140】

発現ベクターは、以下のうちの１つ以上を含んでもよい。すなわち、ａ）転写開始領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ開始領域）、ｂ）転写終結領域（例えば、真核生物ｐｏｌ Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ終結領域）、ｃ）イントロン、およびｄ）核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列のうち１つ以上を含んでもよい。ここで、そのような配列は、核酸分子の発現および／または送達を可能にする様式で、開始領域および終結領域に操作可能に結合される。

【0141】

このような核酸分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターから駆動することができる。

【0142】

本明細書において、投与される核酸の有用な投与量、および特定の投与様式は、当業者に明らかなように、細胞型等の因子に依存して異なり、または、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用の場合、年齢、体重、および治療する特定の動物およびその領域、使用する特定の薬剤（例えば、核酸）および送達の方法、治療的または診断的使用であるか、ならびに製剤の形態が、例えば、懸濁液、エマルジョン、ミセル、またはリポソームであるか等の因子によって変化する。

【0143】

核酸を送達するために脂質を使用する場合、投与する脂質化合物の量は変化し得るものであって、一般的に、投与する核酸の量に依存する。例えば、脂質化合物と核酸の重量比は、好ましくは約１：１～約３０：１であり、約５：１～約１０：１の重量比がより好ましい。

【0144】

核酸分子の好適な投与単位は、１日にレシピエントの体重１キログラム当たり０．００１～０．２５ミリグラムの範囲内、または１日に体重１キログラム当たり０．０１～２０マイクログラムの範囲内、または１日に体重１キログラム当たり０．０１～１０マイクログラムの範囲内、または１日に体重１キログラム当たり０．１０～５マイクログラムの範囲内、または１日に体重１キログラム当たり０．１～２．５マイクログラムの範囲内としてもよい。

【0145】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸は、ＨＣＭＶのようなヘルペスウイルス等のヘルペスウイルスまたはアデノウイルスに感染している、または感染している疑いのある個体を治療するために使用することができる。

【0146】

短鎖相補的核酸（ｓｃＲＮＡ等）および／またはｓｉＲＮＡ等の本開示の核酸の投与は、エアロゾール吸入、注射、経口摂取、輸血、インプランテーション、またはトランスプランテーションを含む任意の都合のよい方法で実施してもよい。本明細書に記載の組成物は、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、結節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内注射もしくはリンパ液内注射、または腹腔内投与によって、患者に投与してもよい。上記の薬剤または組成物は、１回または複数回に分けた服用量で投与することができる。いくつかの実施形態において、有効量を１回の服用量として投与する。その他の実施形態においては、有効量を、一定期間にわたって、２回以上の服用量として投与する。特定の疾患または状態に対するある細胞の型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術の範囲内で行われる。

【0147】

本開示の治療は、例えば、ヌクレオシド類似体、２’－デオキシグアノシンの合成非環式類似体（およびそれらの誘導体）、およびＣＭＶターミナーゼ複合体を標的とする低分子量化合物を含む、その他の抗ヘルペスウイルス治療または抗アデノウイルス治療と同時に、またはその前に、またはその後に提供することができる。
実験

【0148】

本発明の非限定的な実施形態を以下の実施例に示す。使用する数値（例えば、量、濃度、変化率等）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、若干の実験誤差および逸脱に関しては説明されるべきである。

【0149】

特に断らない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い圧力である。これらの実施例は例示のためにのみ与えられ、本願発明者が本発明の様々な実施形態とみなすものの範囲を限定することを意図するものではないと理解されるべきである。各実施例に記載する以下の工程の全てが必要なわけではなく、また各実施例における工程の順序が提示された通りでなければならないわけでもない。
実施例１
ＩＥ１からＩＥ２への転写スイッチングを担うＰｙの同定

【0150】

エクソン４の末端（図１Ａ）には、ＩＥ１遺伝子発現のための停止コードンとポリＡシグナルが存在する。さらに、図１Ａにも示すように、エクソン４とエクソン５の間であって、ＩＥ１のポリＡシグナルの後に、２つのＰｙ配列（ｕｃｕｃｃｃ（Ａ）とｕｃｕｕｃｕｕ（Ｂ））が存在する。ＩＥ１からＩＥ２への切り替えがどのように調節されているのか、特に、ＩＥ１のポリＡシグナルの後のＤＮＡ配列がＩＥ２の遺伝子スプライシングに重要であるかどうかを解明するために、Ｐｙ配列の変異体を作製した。

【0151】

ｐＳＶＨプラスミドを使用して、３つの異なる変異体、ｐＳＶＨｄＰｙＡ（ここでは、ｕｃｕｃｃｃがｕｃａｇｃｃに変異している）、ｐＳＶＨｄＰｙＢ（ここでは、ｕｃｕｕｃｕｕがｕｃａａｇｕｕに変異している）、およびｐＳＶＨｄＰｙＡＢ（ここでは、ＡとＢの両方が変異している）を作成した。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、ウエスタンブロットアッセイ（図１Ｂ）とリアルタイムＲＴ ＰＣＲアッセイ（図１Ｃ）を用いて、ＩＥ１とＩＥ２の産生を、それぞれタンパク質レベルと転写レベルの両方で調べた。その結果、ｐＳＶＨｄＰｙＢとｐＳＶＨｄＰｙＡＢは、ＩＥ１の発現には影響がなかったが、ＩＥ２は、有意なレベルで発現することができなかった。また、ｐＳＶＨｄＰｙＡは、ｐＳＶＨよりもはるかに低いレベルでＩＥ２を発現することが観察された。この結果から、２番目のＰｙ（Ｂ）はＩＥ２を産生する遺伝子のスプライシングに必要であること（その変異体（ｕｃａａｇｕｕ）はＩＥ２を発現しなかったため）、そして１番目のＰｙ（Ａ）はＩＥ２のスプライシングと発現に重要であることが示された。

【0152】

さらに、免疫蛍光アッセイ（１ＦＡ）を行って、トランスフェクトしたＭＲＣ－５細胞からのＩＥ１／２の産生を調べた。ＭＲＣ－５細胞を、ｐＳＶＨｄＰｙＡ（図１Ｄの上段のパネル）、ｐＳＶＨ（図１Ｄの中段のパネル）、またはｐＳＶＨｄＰｙＢ（図１Ｄの下段のパネル）で、２０時間トランスフェクトした。次に、これらの細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、０．２％トリトンＸ－１００で透過処理した。次に、それぞれＩＥ１またはＩＥ２の産生を示すために、これらの細胞を抗ＩＥ１抗体または抗ＩＥ２抗体にインキュベートした。全細胞は、ＤＡＰＩ染色によって可視化した。全ての色を最初のカラムで統合した。

【0153】

図１Ｄに示すように、ＩＥ１の産生は、顕著な影響は受けなかった。これは、トランスフェクションに用いたプラスミドに関係なく細胞内で検出されたことよる。しかし、ｐＳＶＨｄＰｙＢでトランスフェクトした細胞では、ＩＥ２の産生は検出されなかった。
実施例２
ポリピリミジントラクト（Ｐｙ）、はイントロンとスプライシングとの間の相互作用を媒介する

【0154】

ＰｙＡまたはＰｙＢがイントロン４とＵ２ＡＦ６５との間の相互作用を媒介するかどうかを判定するために、ＲＮＡ ＥＭＳＡアッセイを行った。具体的には、Ｕ２ＡＦ６５タンパク質を放射標識されたＲＮＡプローブ（図２Ａ、配列は表１に示す）とともにインキュベートし、以下のレーンで非変性ＰＡＧＥを用いて分解した。すなわち、１）ＰｙｓＡおよびＰｙｓＢを含まないＲＮＡ（ｄＰｙＡＢ）、２）ＰｙＢを含まないＲＮＡ（ｄＰｙＢ）、３）ＰｙＡを含まないＲＮＡ（ｄＰｙＡ）、および４）ＰｙｓＡおよびＰｙｓＢの両方を含むＲＮＡ（ｗｔ）のレーンで分解を行った。結合したプローブをｗｔのプローブ（レーン４）と比較するとわかるように、Ｕ２ＡＦ６５は、ＰｙＢが変異したＲＮＡプローブ（１番目と２番目のレーン）には結合せず、ＰｙＡが変異した場合（３番目のレーン）には結合が非常に弱くなることがわかった。

【表1】

【0155】

さらに、Ｐｙｓがｉｎ ｖｉｖｏでＵ２ＡＦ－イントロン４結合に影響し得るかどうかを判定するために、ＲＮＡ ＣｈＩＰアッセイを行い、スプライシング調節因子（Ｕ２ＡＦ６５およびＰＴＢ）がＰｙと相互作用し得るかどうかを判定した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４つの異なるプラスミド（図２Ｂ）のうち１つで２４時間トランスフェクトし、１％パラホルムアルデヒドで架橋した後、ソニケーターでせん断してＲＮＡを分解した。ＲＮＡ－タンパク質複合体は、制御ＩｇＧ、抗ＰＴＢ、抗Ｕ２ＡＦ６５抗体を用いてプルダウンした。複数回洗浄した後、架橋を９５°ＣのＳＤＳで逆転させた。ＤＮＡは、ＤＮａｓｅ Ｉの消化で除去し、ＲＮＡは、ＲＮＡ ＣｈＩＰキットに付属のカラムで精製した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行い、ＣｈＩＰ後の各サンプル中の特異的ＲＮＡの量を判定し、インプットＲＮＡと比較してＲＮＡの割合を算出した。ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーを表２に示す。

【表2】

【0156】

図２Ｂに見られるように、ＰｙＢを変異させると、イントロンＲＮＡは、Ｕ２ＡＦ６５またはＰＴＢに結合する能力を失った。ＰｙＡを変異させた場合、イントロンＲＮＡのＰＴＢまたはＵ２ＡＦとの結合は、野生型よりも有意に弱いものであった。

【0157】

従って、これらの実験から、ＩＥ２遺伝子のスプライシングを促進するために、いずれかのスプライシング因子がイントロン４に結合する場合には、イントロン４中の両方のＰｙが重要であることがわかった。２番目のＰｙ（ＰｙＢ）は、スプライシング因子とイントロンの相互作用に必須であり、１番目のＰｙ（ＰｙＡ）はその相互作用に重要である。

実施例３
ＰｙＡおよびＰｙＢは、ＩＥ２遺伝子のスプライシングに影響する

【0158】

ＰｙＡまたはＰｙＢがＩＥ２遺伝子のスプライシングに重要であるかどうかを判定するために、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子スプライシングアッセイを行った。まず、プラスミド（ｐＳＶＨ、ｐＳＶＨｄＰｙＡ、ｐＳＶＨｄＰｙＢ、またはｐＳＶＨｄＰｙＡＢ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２０時間トランスフェクトして、その後、全ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡをＤＮａｓｅで処理し、混入したプラスミドＤＮＡを除去した。その後、逆転写（ＲＴ）のために、ｍＲＮＡとプレｍＲＮＡの両方を逆転写できるように、オリゴｄＴの代わりにエクソン５（表２）の特異的逆転写プライマー（ｐｌＥ２）を用いてＲＴ－ＰＣＲを行った（図３Ａ）。そうすることによって、エクソン３のフォワードプライマーとエクソン５のリバースプライマー（ｐＩＥ２）を用いて、プレｍＲＮＡ（＊）とｍＲＮＡ（＊＊）の両方のｃＤＮＡを増幅することができた（表２）。（ＤＮａｓｅ処理後の）全ＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。

【0159】

図３Ｂの中ほどのパネルに示すように、ＤＮＡは増幅されることはなく、全ＲＮＡ調製中のプラスミドＤＮＡによる汚染の可能性が除外された。さらに、プラスミドＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ実験では、よりサイズが大きいＤＮＡが増幅された（図３Ｂの右側）。

【0160】

図３Ｂの左側に示すように、ＲＴ－ＰＣＲの結果、ｐＳＶＨおよびｐＳＶＨｄＰｙＡでトランスフェクトしたグループについては、２本のバンドが得られ、これらはそれぞれプレｍＲＮＡ（＊）およびｍＲＮＡ（＊＊）から増幅されたＤＮＡを表している。ｐＳＶＨｄＰｙＢとｐＳＶＨｄＰｙＡＢのグループでは、ｍＲＮＡのバンドは検出できなかった。また、ｐＳＶＨｄＰｙＡでトランスフェクトしたグループのｍＲＮＡバンドは、ｐＳＶＨでトランスフェクトしたグループのものよりもはるかに弱いことがわかる。これらの結果から、ＩＥ２のスプライシングのために、また、豊富なプレｍＲＮＡから効率的にｍＲＮＡを産生するためには、ＰｙＢが必要で、ＰｙＡが重要であることが示された。
実施例４
ＨＣＭＶの複製には、ＰｙＢが必須であり、ＰｙＡが重要である

【0161】

Ｐｙにおける変異をＨＣＭＶ ＢＡＣｍｉｄに導入して、以下のＢＡＣｍｉｄを得た。すなわち、ＨＢ５ｄＰｙＡ、ＨＢ５ｄＰｙＢ、ＨＢ５ｄＰｙＡＢを得た。ＢＡＣｍｉｄがＭＲＣ－５細胞へのトランスフェクション後にＩＥ１／２を発現することができるかどうかを判定するために、トランスフェクション後２０時間でＭＲＣ－５細胞を固定し、ＩＦＡを行ってＩＥ１／２の産生を調べた。

【0162】

図４Ａに示すように、ＢＡＣｍｉｄ ＨＣＭＶｄＰｙＡのみが、ＩＥ１とＩＥ２の両方を産生したが、他の２つのＢＡＣｍｉｄは、ＩＥ１のみを産生し、ＩＥ２は産生しなかった。この結果は、図１に示した結果（プラスミドによるトランスフェクション後のもの）と一致した。さらに、復帰変異体ＢＡＣを作製した（ＨＢ５ｄＰｙＡＲｅｖ、ＨＢ５ｄＰｙＢＲｅｖ、ＨＢ５ｄＰｙＡＢＲｅｖ）。

【0163】

各ＢＡＣｍｉｄをＭＲＣ－５細胞にトランスフェクトし、ウイルス形成を可能にした。ＨＢ５ｄＰｙＡは、感染性ウイルス粒子を形成することができた。しかし、他の２つのＢＡＣｍｉｄ（ＨＢ５ｄＰｙＢおよびＨＢ５ｄＰｙＡＢ）は、感染性ウイルスを生成できなかった。すべての復帰型ＢＡＣｍｉｄｓは、感染性ウイルスを形成することができ、また、野生型と同様に複製した。

【0164】

ＨＣＭＶｄＰｙＡのウイルス複製を野生型ＨＣＭＶ（またはその復帰型）のウイルス複製と比較することによって、ＨＣＭＶｄＰｙＡが複製において欠陥のある表現型を有することがわかった（図４Ｂ）。また、ウエスタンブロットアッセイでも、１番目のＰｙが変異するときに、ウイルスタンパク質の産生が減少することが示された（図４Ｃ）。予想の通り、ＩＥ２タンパク質は、ＨＣＭＶｄＰｙＡにおいて、復帰型ＨＣＭＶに比べてかなり遅れて産生された。従って、１番目のＰｙ配列はＨＣＭＶの複製に重要であり、２番目のＰｙはＨＣＭＶの複製に必要であることがわかった。

【0165】

図１および図４Ａは、トランスフェクション系において、ＰｙＡがＩＥ２の産生に重要であることを示している。これらの結果をウイルス感染系で確認するために、ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ－５）にＨＣＭＶｄＰｙＡ（またはその復帰体）を異なる時間感染させ、感染後１２時間および２４時間で細胞を固定して、免疫染色を行った（ＩＥ１（ＦＩＴＣ）とＩＥ２（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）に対する抗体を使用）。ＩＥ１陽性細胞およびＩＥ２陽性細胞を蛍光顕微鏡下で数えた。

【0166】

感染後１２時間では、ＨＣＭＶｄＰｙＡを感染させた場合では、１００個のＩＥｌ陽性細胞に対して５５個のＩＥ２陽性細胞しか見られなかったが、これに対して、復帰型ウイルス感染においては、１００個のＩＥｌ陽性細胞につき８７個のＩＥ２陽性細胞が見られた（図４Ｄ）。感染後２４時間では、ＩＥ２／ＩＥ１比は、１に近いものであった（ＨＣＭＶｄＰｙＡ感染の７４％に対して、復帰型感染系では９９％）。これらの結果から、ＰｙＡがウイルス感染系においてＩＥ２の産生に重要であることが示された。

【0167】

さらに、ウイルス感染下の状況でＰｙＡが変異している場合に、ＩＥ２遺伝子のスプライシングが影響を受けるかどうかを判定するために、ＭＲＣ－５細胞をＨＣＭＶｄＰｙＡ（またはその復帰体）に０．１のＭＯＩで１６時間感染させた。全ＲＮＡを単離して、ＤＮａｓｅ Ｉで処理した。図５Ａの右側に示すように、全ＲＮＡを鋳型として使用した場合、ＰＣＲは陰性であり、ウイルスＤＮＡ混入の可能性は排除された。図５Ａの左側は、ｍＲＮＡ（１７１ｂｐのバンド）またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ（１．７ｋｂ）から増幅されたＲＴ－ＰＣＲ産物を示している。復帰型感染では、ＨＣＭＶｄＰｙＡ感染よりも、ｍＲＮＡのバンドが有意に強いことから、ＩＥのスプライシングが強いことがわかる。従って、ＰｙＡの変異がＩＥ２遺伝子のスプライシングに悪影響を及ぼしたと判定された。

【0168】

さらに、ＰｙＡがスプライシング因子とＭＩＥのイントロン４との相互作用において役割を果たしているかどうかを判定するために、ＲＮＡ ＣｈＩＰアッセイを行った。ＨＣＭＶｄＰｙＡ（またはその復帰体）に１のＭＯＩで１６時間感染させた後に、ＭＲＣ－５細胞を固定した。抗ＰＴＢ抗体または抗Ｕ２ＡＦ６５抗体を用いて、上記のようにＲＮＡ ＣｈＩＰアッセイを行った。図５Ｂに示すように、ＨＣＭＶｄＰｙＡまたはその復帰体に感染した細胞では、ＰＴＢとＵ２ＡＦ６５の両方がＩＥ２ ＲＮＡのイントロン４と相互に作用した。しかし、ＰｙＡを変異させると相互作用は減少した。このような結果により、ＰｙＡがスプライシング因子とイントロン４との相互作用を増強することが確認された。

【0169】

図４Ｃに示した結果は、ＰｙＡの変異が翻訳レベルでのウイルス遺伝子の発現を減少させることを示している。ＰｙＡがｍＲＮＡレベルでのＩＥ１／ＩＥ２遺伝子発現に影響を及ぼすかどうかを判定するために、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを行って、０．５のＭＯＩで、ＭＲＣ－５細胞をＨＣＭＶｄＰｙＡ（またはその復帰体）に感染させた後、異なる時間におけるＩＥ１／ＩＥ２ ｍＲＮＡレベルを判定した。

【0170】

図５Ｃに見られるように、ＩＥ１のｍＲＮＡレベルは、ＨＣＭＶｄＰｙＡに感染した細胞から同程度のレベルに保たれていたが、ＩＥ２のｍＲＮＡレベルは、ＰｙＡ変異ウイルス感染では、有意に減少していた。従って、これらの結果から、ＰｙＡは、ＨＣＭＶが複製するためには必要ではないが、スプライシング因子とイントロン４との相互作用を強化する（ウイルス遺伝子の発現とウイルス複製を強める）ためには重要であることが示された。
実施例５
イントロンを標的とする短鎖相補的核酸の設計と合成

【0171】

本願発明者らは、このようにして、１つ以上のＰｙを含むイントロンに相補的な小さい核酸（ＲＮＡ等）が、スプライシング因子（Ｕ２ＡＦ６５等）とＰｙとの相互作用を消失させ、それによって遺伝子スプライシングの阻害をもたらすことによって、ウイルスの複製（ＨＣＭＶ複製等）に対する抗ウイルス剤として使用することができる抗ウイルス機構を着想した。

【0172】

ＨＣＭＶでこの効果を実証するために、ＩＥ２遺伝子モデルを用いた。まず、Ｕ２ＡＦ６５と相互作用することが示されたＲＮＡプローブに相補的な小さいＲＮＡ（ｓｃＲＮＡＰｙ）を作製した。図２Ａおよび図６Ａ。このｓｃＲＮＡＰｙとプローブＲＮＡは、１：１のモル比で混合する（室温で３０分間）と、２本鎖ＲＮＡを形成することが示された。１本鎖ＲＮＡバンドおよび１本鎖ＲＮＡバンドを図６Ｂに示す。

【0173】

さらに、ｓｃＲＮＡＰｙの非存在下または存在下でＲＮＡゲルシフトアッセイを行った。図６Ｃに示すように、プローブとＵ２ＡＦ６５との結合は、ｓｃＲＮＡＰｙをプローブＵ２ＡＦ６５反応系に添加した場合に減少しており、プローブ－Ｕ２ＡＦ６５結合の減少はｓｃＲＮＡＰｙの量に関連していた。

【0174】

図６Ｄに示すように、Ｕ２ＡＦ６５とＰｙトラクトの結合に対するｓｃＲＮＡＰｙの干渉がｉｎ ｖｉｖｏで起こり得るかどうか（ＩＥ２遺伝子のスプライシングを抑制するかどうか）を判定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｓｃＲＮＡＰｙ、ｓｃＲＮＡＰｙｕｐ（イントロン４の上流に相補的なｓｃＲＮＡ）、またはスクランブルＲＮＡ（ルシフェラーゼｃＤＮＡから作製した）とともに、ｐＳＶＨで２０時間コトランスフェクトした。その後、ウエスタンブロットアッセイに使用するために全細胞溶解液サンプルを調製し、ＩＥ２タンパク質の産生をチェックした。さらに、全ＲＮＡサンプルをリアルタイムＰＣＲに用いるために調製し、ＩＥ２のｍＲＮＡレベルを調べた。図６Ｅと６Ｆに見られるように、ｓｃＲＮＡＰｙは、タンパク質レベルと転写レベルの両方でＩＥ２の発現を有意に減少させた。この結果は、例えば、ｓｃＲＮＡＰｙは、効果的にＩＥ２遺伝子のスプライシングと発現に干渉することができることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】