特表 2024-520558 Ｇタンパク質ゲート－Ｋ＋チャネルを介した桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）における光感受性の増強

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】Ｇタンパク質ゲート－Ｋ＋チャネルを介した桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）における光感受性の増強

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240517BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240517BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/864 100Z

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/86 Z

C12N15/113 Z

C12N7/01

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/545

A61K48/00

A61K9/127

A61K47/36

A61K9/14

A61K9/51

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573592

(86)(22)【出願日】2022-05-25

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 EP2022064349

(87)【国際公開番号】W WO2022248634

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】21305686.4

(32)【優先日】2021-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523449573

【氏名又は名称】スパーリングヴィジョン

(71)【出願人】

【識別番号】523446619

【氏名又は名称】ルール－ウニヴェルジテート ボーフム

(71)【出願人】

【識別番号】514282002

【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）

(71)【出願人】

【識別番号】513015441

【氏名又は名称】サントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック － セーエヌエールエス

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ － ＣＮＲＳ

【住所又は居所原語表記】３，ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ，Ｆ－７５０１６ Ｐａｒｉｓ １６，Ｆｒａｎｃｅ

(71)【出願人】

【識別番号】507416908

【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ダルカラ，ドゥニ

(72)【発明者】

【氏名】ヘルリツェ，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ミュッヒャー，ブリクス

(72)【発明者】

【氏名】カブ，ハナン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA12

4C076AA31

4C076AA65

4C076AA95

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4C076CC10

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4C084AA13

4C084MA17

4C084MA24

4C084MA38

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4C084MA58

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4C084NA05

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4C084ZA33

4C087AA01

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4C087BB57

4C087BB65

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA24

4C087MA38

4C087MA41

4C087MA58

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA33

(57)【要約】

本発明は、変性した錐体に発現する錐体オプシンによってリクルートされるＧタンパク質によって活性化される、Ｇタンパク質ゲート－Ｋ＋チャネル（ＧＩＲＫ）、特にＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓによって媒介される、進行期の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）における変性した錐体の光感受性を増加させる新しい遺伝子治療アプローチに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。

【請求項2】

前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ＳＶ４０ウイルスベクターから選択されるウイルスである、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

前記ベクターは、ＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ９ウイルスであり、前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、請求項１または２に記載のベクター。

【請求項4】

Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする前記ヌクレオチド配列は、錐体特異的プロモーターの制御下にある、請求項１～３のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項5】

前記錐体特異的プロモーターは、ｐＲ１．７もしくはその機能的変異体、または最小Ｍ－オプシンプロモーター、特にｐＭＮＴＣ発現カセットにて、またはＧＲＫプロモーターもしくはその切断型である、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号３を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項7】

前記ベクターは、以下を含む組換えＡＡＶ９ベクターである、請求項１～６のいずれか１項に記載のベクター：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドはアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号５）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にあるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする、前記ヌクレオチド配列。

【請求項8】

前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）、またはＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１２）を含むか、またはこれらからなる、請求項１～７のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項9】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に定義されるベクターを含む、薬学的に許容される担体。

【請求項11】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項１０に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項12】

前記ベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の薬学的に許容される担体：
ａ）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＳＶ４０ウイルスベクターからなる群より選択される；または
ｂ）は、前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ９ウイルスであり、前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む；または
ｃ）は、以下を含む組換えＡＡＶ９ベクターである：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にある前記哺乳類の錐体オプシンをコードする、前記ヌクレオチド配列。

【請求項13】

前記担体は、固体－脂質ナノ粒子、キトサンナノ粒子、リポソーム、リポプレックスおよびカチオン性ポリマーからなる群から選択される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項14】

前記哺乳類の錐体オプシンは、短波長錐体オプシン（ＳＷＯ）である、請求項１～９のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項１０～１３のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項15】

請求項１～９および１４のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１０～１４のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、医薬組成物。

【請求項16】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療に使用するための、請求項１～９および１４のいずれか１項に記載のベクター、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体、または請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記ベクター、前記薬学的に許容される担体または前記医薬組成物は、窩の距離に網膜下注射によって投与される、請求項１７に記載の使用のためのベクター、薬学的に許容される担体または医薬組成物。

【請求項19】

前記ベクター、前記薬学的に許容される担体または前記医薬組成物は、ａ）網膜動脈の上側枝または下側枝に隣接する領域に；ｂ）前記窩の中心から視蓋直径２～３の距離に；かつｃ）側頭網膜動脈および側頭網膜静脈の枝によって画定される幾何学的形状に局在する位置に、網膜下注射によって投与される、請求項１７または１８のいずれか１項に記載の使用のためのベクター、薬学的に許容される担体または医薬組成物。

【請求項20】

前記ベクター、前記薬学的に許容される担体または前記医薬組成物は、硝子体内注射によって投与される、請求項１７に記載の使用のためのベクター、薬学的に許容される担体または医薬組成物。

【請求項21】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療に使用するための、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする配列を含む、核酸。

【請求項22】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療に使用するための、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸を含む、錐体前駆細胞。

【請求項23】

前記錐体前駆細胞は、治療される前記ＲＣＤの対象から得られる、請求項２２に記載の使用のための錐体前駆細胞。

【請求項24】

前記錐体前駆細胞は、治療される前記ＲＣＤの対象の体細胞から得られた分化誘導多能性幹細胞によって得られる、請求項２２または２３に記載の使用のための錐体前駆細胞。

【請求項25】

前記錐体前駆細胞は、網膜下腔注射によって投与される、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の使用のための錐体前駆細胞。

【請求項26】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓまたはその機能的誘導体をコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞を調製する方法であって、前記方法は、請求項１～９および１４のいずれか１項に記載のウイルスベクター、または請求項１０～１４のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体を錐体前駆細胞に感染させることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔本発明の技術分野〕
本発明は、変性した錐体に発現する錐体オプシンによってリクルートされるＧタンパク質によって活性化される、Ｇタンパク質ゲート－Ｋ＋チャネル（ＧＩＲＫ）、特にＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓによって媒介される、進行期の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）における変性した錐体の光感受性を増加させる新しい遺伝子治療アプローチに関する。

【0002】

以下の記述において、角括弧（［ ］）内の参考文献は、文末の参考文献リストを参照されたい。

【0003】

〔技術状況〕
網膜は、シナプスによって相互接続された３層のニューロンを構成する眼の光感受性組織である。網膜の主要ニューロンは光を感知する光受容体（ＰＲ）であり、夜間視力の桿体（Ｒｏｄ）および昼間視力の錐体（Ｃｏｎｅ）の２種類がある。錐体を介する視力は主に窩によって支えられており、私たちの日常的な視覚作業にとって最も価値のある高い明瞭度の中心視力を担っている（Ｓｉｎｈａら，２０１７）［１］。光受容体において、フォトンの捕獲を膜の過分極につながる細胞内シグナル伝達に結びつける光感受性Ｇタンパク質共役受容体は、オプシンと呼ばれている（ＹａｕおよびＨａｒｄｉｅ，２００９）［２］。霊長類の網膜には、桿体に見出される１種類の桿体オプシン、および３色の視覚を担う３種類の錐体オプシンが存在する。これらのオプシンの構造的特性および光伝達カスケードは類似している。

【0004】

光伝達カスケードは、正常な網膜の光受容体外片に集中するいくつかのタンパク質から構成されている（図１Ａ）。光受容体の役割は、この光伝達カスケードを介して光を感知し、電気信号を誘導することであり、この電気信号は処理された後、下流のニューロンに向かって伝達される（ＥｂｒｅｙおよびＫｏｕｔａｌｏｓ，２００１）［３］。

【0005】

フォトンの吸収は、２つの部分から構成されるオプシンを活性化する：タンパク質部分、およびレチナール（ビタミンＡの誘導体）である光吸収部分。後者は、１１－シス－レチナール（暗順応状態）から全－トランス－レチナール構成（明順応状態）に異性化する。その結果、オプシンはＧタンパク質トランスデューシンを触媒的に活性化する。トランスデューシンのα－サブユニットは、ＧＤＰがＧＴＰに置き換わることによって活性化される。その後、α－サブユニットは、βγ－サブユニットから解離し、その２つの抑制性γサブユニットと結合することによって、膜に結合したホスホジエステラーゼ６（ＰＤＥ）を活性化する。活性化されたＰＤＥは、ｃＧＭＰをＧＭＰに加水分解する。ｃＧＭＰが減少すると、ヌクレオチドゲートチャネル（ＣＮＧ）がクローニングされ、カチオンの侵入が停止するため、ＰＲが過分極し、光受容体によるグルタミン酸塩の放出が減少する（Ｌａｒｈａｍｍａｒら，２００９）［４］。

【0006】

別のフォトンに反応するために、この光伝達カスケードは、以下の２つのメカニズムによって不活性化される：（ｉ）トランスデューシンは結合したＧＴＰを加水分解することによってそれ自身を不活性化し、（ｉｉ）ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ）は制御タンパク質アレスチンと相互作用するオプシンをリン酸化し、オプシンの不活性化をもたらす。レチナールはその後、網膜色素上皮（ＲＰＥ）およびミュラーグリア細胞によって再利用される。このカスケードの各々のタンパク質は、光信号を電気信号に変換し、２次ニューロンおよび３次ニューロンに伝達する上で重要な役割を果たしている（前田ら、２００３）［５］。

【0007】

遺伝性網膜変性は、ほとんどが光受容体またはＲＰＥ細胞の突然変異によるもので、桿体の変性に続き、錐体外分節の変性が起こり、最終的には失明に至る（Ｂｕｃｈら，２００４）［６］。その中でも、桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）は、遺伝的原因が非常に不均一である最大のカテゴリーを代表する。桿体光受容体または網膜色素上皮に発現する６０以上の異なる遺伝子が関与している（Ｗｒｉｇｈｔら，２０１０）［７］。ＲＣＤに関連する最初の遺伝子はロドプシン遺伝子ＲＨＯであり、ＲＣＤ常染色体優性遺伝症例の２５％を占める。その他にも、ｃＧＭＰ－ＰＤＥサブユニット遺伝子および環状ＧＭＰゲートチャネルタンパク質αサブユニット遺伝子など、多くの原因遺伝子が同定されている。多くの原因遺伝子が存在するが、結果として生じるＲＣＤの表現型は異なる変異でも同じである（Ｆｅｒｒａｒｉら，２０１１）［８］。一般的なＲＣＤの表現型は、桿体変性が進行し、夜盲を引き起こし、その後、末梢の錐体変性が進行し、「トンネル視」を引き起こし、残った窩の錐体のみによって調節され、最終的には疾患の末期には完全な失明に至るという特徴がある。通常、ＲＣＤと診断された患者はすでに夜盲を示すが、これは桿体が変性していることを意味する。しかし、錐体は疾患の後期まで残存しており、特に高い明瞭度を担う窩領域では、早期にはトンネル視に至る（Ｌｉら，１９９５）［９］。疾患の後期では、これらの錐体は外分節構造を失い、錐体ソーマおよびペディクルが完全に失われる前に完全な失明に至る（Ｌｉら，１９９５）［９］。

【0008】

光に敏感な錐体細胞体を呈するこれらの患者の視力を維持するために、１つの革新的な戦略は網膜遺伝子治療であり、これは広義には治療効果を媒介するために治療遺伝子を網膜細胞に導入することを指す（Ｂｅｎｎｅｔ，２０１７）［１０］。遺伝子治療の最初の臨床試験の成功は、劣性突然変異を持つ遺伝子を機能的なｃＤＮＡコピーで置換する遺伝子置換に焦点を当てたものであったが、網膜変性の大部分には使用できないため、この戦略には限界がある（Ｂｅｎｎｅｔ，２０１７）［１０］。例えば、ＲＣＤでは、突然変異が非常に多様であるために、各々の特定の変異に適用することが困難である。さらに、優性突然変異はこのアプローチを用いて治療することができない。さらに、５０％の症例では、原因変異が解明されていないか、または最も頻度の高い変異を持つ桿体光受容体が、すでに失われている（Ｄａｌｋａｒａら，２０１５）［１１］。このような理由から、変異遺伝子を知らなくても多くの患者を治療できるように、桿体消失以外にも適用できる変異独立遺伝子治療が開発されなければならない。

【0009】

この目標を考慮して、先行研究では、双極細胞におけるチャネルロドプシンまたは錐体ＰＲにおけるハロロドプシンのような微生物オプシンの異所性発現を用いて、膜電位を調節し、それぞれ脱分極または過分極を誘導した（Ｂｕｓｓｋａｍｐら，２０１２；ＤａｌｋａｒａおよびＳａｈｅｌ，２０１４；Ｓｃｈｏｌｌら，２０１６）［１２－１４］。したがって、ＲＣＤにおいて、オプトジェネティクスは、失明網膜の視力を回復させる治療戦略として用いることができる（ＢａｋｅｒおよびＦｌａｎｎｅｒｙ，２００８）［１５］。考慮すべきパラメータは多い：（ｉ）脳に最も解釈しやすい信号を送る網膜回路を最大限に活用するための細胞ターゲットの選択（ｉｉ）これらの標的細胞で自然に近い電気生理学的反応を得るための適切な光遺伝学的ツールの選択。第２のポイントに関して、微生物オプシンの比較的弱い能力は、主に以下に限られる：原核生物由来のオプシンを使用することによる潜在的な免疫原性、ハロロドプシン（ＢａｋｅｒおよびＦｌａｎｎｅｒｙ，２００８）の症例のように、単細胞微生物由来の直接光ゲートチャネルおよびポンプによるシグナル増幅がないために必要とされる高強度［１５］、（Ｃｅｈａｊｉｃ－Ｋａｐｅｔａｎｏｖｉｃら，２０１５；Ｇａｕｂら，２０１５；Ｖａｎ ＧｅｌｄｅｒおよびＫａｕｒ，２０１５；ｖａｎ Ｗｙｋら，２０１５）［１６－１９］。ロドプシンまたは錐体オプシンとは異なり、微生物オプシンは健常網膜に存在する光伝達カスケードなどのＧタンパク質共役カスケードを活性化することができない。微生物オプシンの限界を超える可能性のある方法の一つは、全てＧタンパク質共役受容体である動物オプシンを利用することである。しかし、この分野での研究は、今のところ全て網膜内ニューロンに焦点を当てている（Ｂｅｒｒｙら，２０１９；Ｃｅｈａｊｉｃ－Ｋａｐｅｔａｎｏｖｉｃら，２０１５；Ｄｅ Ｓｉｌｖａら，２０１７；Ｇａｕｂら，２０１５；Ｌｉｎら，２００８；ｖａｎ Ｗｙｋら，２０１５）［２０、１６、２１、１７、２２、１９］。

【0010】

以前の研究では、２つの動物の錐体オプシンの光活性化が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ヒト腎臓細胞および神経細胞におけるＧ_ｉ／ｏシグナル伝達経路を刺激できることが示されている（Ｍａｓｓｅｃｋら，２０１４）［２３］。この経路は、ニューロン活動の高速減衰および内在性イオンチャネルの阻害に関与している。しかし、動物の錐体オプシンは、任意の所定の細胞で共発現すると、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネル（ＧＩＲＫ）を直接調節できることも示されている（Ｂｅｒｒｙら，２０１９；Ｍａｓｓｅｃｋら，２０１４）［２０，２３］。ＧＩＲＫチャネルは、２つのサブユニットから構成されている。サブユニットには、ＧＩＲＫ１～４の４種類が存在する。ＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ３はホモ４量体を形成することができず、機能するためにはＧＩＲＫ２と結合する必要がある（ＭａｒｋおよびＨｅｒｌｉｔｚｅ，２０００）［２４］。逆に、ＧＩＲＫ２単独ではホモ四量体を形成することができる。単一の点変異体ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓは、機能的なホモメリックチャネルを形成することが示唆された（Ｃｈａｎら，１９９６）［３１］。ＧＩＲＫチャネルは、静止膜電位では主に閉じている。Ｇ_ｉ／ｏタンパク質のβγサブユニットによって活性化された後、カリウムイオンが細胞から流出し、それと共に、ニューロンを過分極させる（図１Ｂ）。したがって、脊椎動物の錐体オプシンＳＷＯ（短波長オプシンの意）およびＬＷＯ（長波長オプシンの意）を用いて、不安回路（anxiety circuitry）においてｉｎ ｖｉｖｏで特定の波長のＧ_ｉ／ｏを繰り返し活性化することが可能であり、錐体オプシンとＧＩＲＫとの組み合わせは、低光強度において微生物オプシンよりも効率的であることが証明されている（Ｍａｓｓｅｃｋら，２０１４）［２３］。

【0011】

〔本発明の説明〕
そこで本発明者らは、この錐体オプシンに基づくシステムを視力回復の場で実施することが可能かどうかを調査し、臨床候補の選択に備えて患者の網膜を調査した。そこで、光感受性錐体再活性化戦略を開発するために、まず、変性中の錐体における光伝達カスケード要素の発現を２つのＲＣＤマウスモデルで調べた。２つのＲＣＤマウスモデルでリン酸化伝達カスケードを探索した後、残存する錐体オプシンの活性化によってリクルートされるＧ_ｉ／ｏタンパク質を介して作用する標的分子アプローチが初めて提案された。これにより、ＰＤＥおよびトランスデューシンの発現に依存しない新たな「短い光伝達カスケード」が構築された。

【0012】

まず、疾患の進行を通じて変性した錐体における内因性光伝達カスケードの状態を調べた。両モデルマウスにおいて、外分節変性後の錐体細胞体への移行は、オプシンおよびアレスチンのみであった。したがって、錐体オプシンシグナル伝達に基づく錐体の再活性化が実現可能であり得、それによって高感度視力の回復が可能になるという仮説が立てられた。ｒｄ１０マウスモデルでは、内因性の錐体オプシンが錐体細胞体のレベルで依然として発現していることが判明した（図３）。これは、トランスデューシンおよびホスホジエステラーゼが存在しない場合でも、ＧＩＲＫ２チャネルなどのＧＩＲＫチャネルにその活性を結び付けることができる可能性を示唆している（図１Ｂ）。この構成では、ＧＩＲＫチャネルの開口により、休眠錐体の静止膜電位によるカリウムイオンの流出が可能になる（Ｂｕｓｓｋａｍｐ，２０１０）［２５］。ＧＩＲＫチャネルを介したＫ^＋の流出は、ＲＣＤの２つのマウスモデルで見られたように、光に反応して錐体を過分極させる。

【0013】

次に、錐体オプシンによってリクルートされたＧタンパク質によって活性化されるＧＩＲＫ２チャネルが、変性した錐体で発現された。さらに、錐体細胞体に残存するオプシンは依然として機能的であり、変性した錐体において光反応を誘導するのに十分であるため、全ての錐体にＧＩＲＫ２を挿入すると、色覚を維持する各々のオプシンのスペクトル特性に従った光反応が得られる。この結果は、錐体外片の変性中および変性後のＲＣＤ網膜の錐体において、光感受性が亢進していることを示唆している。この結果から、脊椎動物の光感受性タンパク質とＧＩＲＫチャネル、特に内因性Ｇタンパク質によって活性化されるＧＩＲＫ２チャネルを組み合わせることで、網膜電図および作用によって示されるように、２つのモデルマウスの視覚機能を改善できることが示された。これは、光に鈍感な哺乳類のイオンチャネルが内在性オプシンと結びついた初めての例であり、完全な外分節変性が起こる前であっても光感受性を高めることができる、視力回復の新たな道を提供するものである。この新しいシステムは、変性した錐体に発現する内在性オプシンを利用するため、色覚の回復／維持も初めて可能になる。

【0014】

ＲＣＤマウスモデルと同様に、錐体オプシンおよび錐体アレスチンは、ＲＰヒト患者の錐体細胞体に残存する（図１２）。この結果は、短いＧＩＲＫ２／オプシン光伝達カスケードを用いて、ＲＣＤヒト患者の窩領域における錐体機能を再活性化することが可能であることを示している。光刺激によって残存する錐体オプシンが活性化されると、疾患の中期または進行期であっても、短い光伝達カスケードが発動され、ＲＣＤ患者の視力回復につながる。

【0015】

この新しいアプローチは、ヒト患者において、低い光強度のみを必要とする高い視力および色覚を、維持および／または回復する可能性を有する。

【0016】

微生物オプシンの明確な利点は、その頑健性およびミリ秒スケールの動態である（Ｐａｃｋｅｒら，２０１３）［２６］。他のオプシンを用いたシステムでは、別の光刺激に反応するためには、カスケードを不活性化して光感受性を回復しなければならないことを考慮すべきである。これがない場合には、錐体はＧＩＲＫ２チャネル活性化の後に、過分極したままとなり、動体視力に適合した動画速度でシナプス伝達を調節する能力が制限される可能性がある。今回のアプローチでは、両方のＲＣＤモデルにおいて、疾患の非常に後期でも依然として維持されているアレスチンのために、錐体の脱分極が可能になった。このことは、反復光刺激時の網膜の反応を示すフリッカーＥＲＧのトレース、ならびに治療マウスの視覚性運動反射の改善によっても顕著であった。

【0017】

最後に、ＧＩＲＫ２を組み込むことによって、完全な外分節欠損の前であっても、錐体における既存の光反応が増強されるという事実は、疾患の中期でこの遺伝子治療を実施できる可能性を提供する。マウスの網膜変性はヒトよりもはるかに速いため、マウスにおける数日の治療の有効性はヒトにおける数年に相当する。それにもかかわらず、内因性の光反応が消失しても、ＧＩＲＫ２を発現している網膜は、依然として光に反応することができ、残存する錐体数に対応する反応振幅を生成する。このことは、たとえ治療開始時に検出可能な光知覚がなくても、窩に錐体が残存する患者は、この治療から利益を得られることを示唆している（図１０）。したがって、この方法は錐体細胞が残存する限り使用することができる。実際、処理した錐体の光刺激に対する反応の減少が記録されたが、これは錐体数の減少と一致しており、網膜下注入のために全ての錐体を導入しなかったという事実は、有益な効果をさらに制限した。より良好な水平展開を示すＡＡＶベクターは、ブレブを超えて形質導入された錐体数を増加させるために使用することができる（Ｋｈａｂｏｕら，２０１８；国際特許出願ＷＯ２０１８１３４１６８）［２７，２８］。治療の窓を拡大するために、神経栄養因子を本発明のアプローチと並行して実施することができる。実際、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）などの神経栄養因子のＡＡＶ媒介分泌は、錐体細胞死を遅延させることが示されており、ＧＩＲＫ２媒介感作と組み合わせることができる（Ｂｙｒｎｅら，２０１５）［２９］。

【0018】

現在、ＧＩＲＫ１チャネルの変異型であるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓは、短いＧＩＲＫ／オプシン光伝達カスケードの文脈において、ＧＩＲＫ２よりもかなり多くのイオン流出を誘導することが見出されている。この結果は、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓを錐体に組み込むことで、ＲＣＤのＧＩＲＫ２遺伝子治療よりも改善された遺伝子治療を提供することを示唆している。

【0019】

したがって、本発明の目的は、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含むベクターである。

【0020】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列は、ｐＲ１．７もしくはその機能的変異体などの錐体特異的プロモーター、または最小Ｍ－オプシンプロモーター、特にｐＭＮＴＣ発現カセットにて、またはＧＲＫプロモーターもしくはその切断型（Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ、特にＧＲＫ１）の制御下にあってもよい。

【0021】

本発明のベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。例えば、哺乳類の錐体オプシンは、短波長錐体オプシン（ＳＷＯ）であり、例えば、ハツカネズミ由来またはヒト錐体オプシン由来である。同じベクター中に存在する場合には、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列、および哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、同じプロモーター、特にｐＲ１．７またはその機能的変異体などの錐体特異的プロモーター、または最小Ｍ－オプシンプロモーター、特にｐＭＮＴＣ発現カセットにて、またはＧＲＫプロモーターまたはその切断型（Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ、特にＧＲＫ１）の制御下にある。

【0022】

本発明の目的において、「ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ」は、Ｐｈｅ１３７のＳｅｒによる置換を含む野生型ヒトＧＩＲＫ１（配列番号１）またはマウスＧＩＲＫ１（配列番号４）の変異型をコードするヌクレオチド配列であって、オプシンとの共発現時に光に反応する能力を保持するヌクレオチド配列を意味する。ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓは、野生型ＧＩＲＫ１とは、Ｐｈｅ_１３７のＳｅｒによる置換のみ（例えば、配列番号２のような）によって、または限定された数の変異（例えば、Ｐｈｅ_１３７のＳｅｒによる置換に加えて、最大でも１、２、３、４、または５個のアミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入）によって異なっていてもよい。例えば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなり、配列番号３のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなり、配列番号５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。

【0023】

【表1】

【0024】

本発明の別の目的は、本発明のベクターを含む薬学的に許容される担体である。

【0025】

本発明の特定の実施形態によれば、薬学的に許容される担体は、上記のようなＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターとを含むことができる。例えば、哺乳類の錐体オプシンは、短波長錐体オプシン（ＳＷＯ）であり、例えば、ハツカネズミ由来またはヒト長波長感受性（ＯＰＮ１ＬＷ）、中波長感受性（ＯＰＮ１ＭＷ）、短波長感受性（ＯＰＮ１ＳＷ）由来である。実施形態によれば、哺乳類の錐体オプシンは、ヒト長波長感受性オプシン１（配列番号６）である。

【0026】

【表2】

【0027】

本発明の特定の実施形態によれば、薬学的に許容される担体は、例えば、固体－脂質ナノ粒子、キトサンナノ粒子、リポソーム、リポプレックスまたはカチオン性ポリマーから選択される。

【0028】

本発明の特定の実施態様によれば、本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ＳＶ４０ウイルスベクターから選択されるウイルスである。本発明の特定の実施態様によれば、本発明は、３０ｎｍに等しいか、または３０ｎｍ未満の大きさである。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、好ましくはＡＡＶ８、または国際特許出願ＷＯ２０１２／１４５６０１に記載されているようなＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８カプシド変異体である。

【0029】

ＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８カプシド変異体は、ＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ９ウイルスであり、挿入ペプチドはアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む。

【0030】

ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列およびポリペプチド配列、ならびにネイティブな逆末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびＶＰ１タンパク質を含むカプシドサブユニットの配列が、当技術分野で知られている。このような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋもしくはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）などの公開データベースで見つけることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＰＤＢ ＡＦ０４３３０３および１ＬＰ３（ＡＡＶ２）、ＡＹ５３０５７９および３ＵＸ１（ＡＡＶ９（単離株ｈｕ．１４））を参照し、これらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示について参照によって本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ９およびＡＡＶ２の野生型ＶＰ１の例示的なアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８および配列番号９に示す。

【0031】

【表3】

【0032】

好ましくは、ＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループにおける挿入ペプチドの挿入部位は、ＡＡＶ２野生型ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８７と５８８との間、ＡＡＶ９野生型ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間である。

【0033】

いくつかの実施形態によれば、挿入ペプチドは、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、または１１アミノ酸の長さを有する。

【0034】

挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）のＮ末端および／またはＣ末端に、１つ以上のスペーサーアミノ酸を含んでいてもよい。好ましくは、スペーサーアミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択され、より好ましくは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙからなる群から選択される。

【0035】

実施形態によれば、挿入ペプチドは、配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）、またはＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１２）を含むか、またはそれらからなり、好ましくは、配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）を含むか、またはそれらからなる。

【0036】

特定の実施形態によれば、ウイルスベクター、特にＡＡＶ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８は、錐体特異的プロモーター、好ましくはｐＲ１．７もしくはその機能的変異体、または最小Ｍ－オプシンプロモーター、特にｐＭＮＴＣ発現カセットの制御下にある目的のポリヌクレオチド（ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列もしくはその機能的変異体、および／また哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列）を含む。前記ＡＡＶにおいて、錐体特異的プロモーター、例えばプロモーターｐＲ１．７、最小Ｍ－オプシンプロモーターまたはｐＭＮＴＣに作動可能に連結される目的のポリヌクレオチドは、好ましくは２つのアデノ随伴ウイルス逆末端反復（ＡＡＶ ＩＴＲ）、好ましくはＡＡＶ２ ＩＴＲによって挟まれる。

【0037】

ｐＲ１．７は、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｊａｎ；２７（１）：７２－８２に記載のヒト赤オプシンプロモーター配列に基づく１．７キロベース合成プロモーターである。本明細書で使用される場合には、「ｐＲ１．７」は、配列番号１３のプロモーターおよびその機能的変異体を示す。ｐＲ７．１プロモーターの「機能的変異体」は、典型的には、ネイティブｐＲ７．１プロモーター（配列番号１３）に対して１つ以上のヌクレオチド変異（ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換など）を有し、これは、目的のポリヌクレオチドの転写を有意に変化させない。本発明の文脈において、前記機能的変異体は、錐体光受容体において、目的のポリヌクレオチドの強力な発現を駆動する能力を保持する。このような能力は、Ｙｅらによって記載されるように試験され得る（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１６；２７（１）：７２－８２）およびＫｈａｂｏｕら（ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１８，３（２）：ｅ９６０２９）。

【0038】

使用され得る錐体特異的プロモーターの別の例は、ＷＯ２０１５１４２９４１に開示されるような最小Ｍ－オプシンプロモーター領域、特にＷＯ２０１５１４２９４１に開示される配列番号５５または配列番号９３である。インスタント配列番号１４は、ＷＯ２０１５１４２９４１の配列番号９３と同一である。

【0039】

一実施形態において、最小Ｍ－オプシンプロモーター領域の制御下に置かれる目的のポリヌクレオチドは、最適化されたエンハンサー、最適化されたプロモーター、最適化された５’ＵＴＲ、最適化されたイントロン、最適化されたコザックおよび最適化されたポリＡ領域（ＷＯ２０１５１４２９４１の配列番号９５）を含むｐＭＮＴＣ発現カセットに挿入される。

【0040】

【表4】

【0041】

プロモーターおよび目的のポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている。本明細書で使用する場合には、用語「作動可能に連結された」は、互いに機能的な関係にあるように物理的に連結された２つ以上の核酸またはアミノ酸配列要素を指す。例えば、プロモーターが、コード配列の転写および／または発現を開始するか、または他の方法で制御／調節することができる場合には、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結され、この場合には、コード配列は、プロモーターの「制御下にある」と理解されるべきである。一般に、２つの核酸配列が作動可能に連結している場合には、それらは同じ配向にあり、通常は同じ読み枠にもある。これらは通常、本質的に連続しているが、これは必要ではないかもしれない。

【0042】

一実施形態によれば、ベクターは、以下を含むＡＡＶ９（ＡＡＶ９－７ｍ８－ｐＲ１．７）またはＡＡＶ２（ＡＡＶ２－７ｍ８－ｐＲ１．７）である：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にある目的のポリヌクレオチド（ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列および／または哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列）。

【0043】

前記ＡＡＶ９－７ｍ８またはＡＡＶ２－７ｍ８において、挿入ペプチドは７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、または１１アミノ酸の長さを有する。好ましくは、挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）のＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上のスペーサーアミノ酸を含む。好ましくは、スペーサーアミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒからなる群から選択され、より好ましくは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙからなる群から選択される。実施形態によれば、挿入ペプチドは、配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）、またはＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１２）を含むか、またはそれらからなり；好ましくは、配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）またはＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）を含むか、またはそれらからなる。

【0044】

本発明のベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて製造される。要するに、この方法は一般に、（ａ）宿主細胞へのＡＡＶベクターの導入、（ｂ）宿主細胞へのＡＡＶヘルパー構築物の導入、ここでヘルパー構築物はＡＡＶベクターから欠落しているウイルス機能を含んでいる、および（ｃ）宿主細胞へのヘルパーウイルスの導入を含む。ＡＡＶベクターのＡＡＶビリオンへの複製およびのパッケージングを達成するためには、ＡＡＶビリオンの複製およびパッケージングのための全ての機能が存在する必要がある。宿主細胞への導入は、標準的なウイルス学的技術を用いて同時または逐次的に行うことができる。最後に、宿主細胞を培養してＡＡＶビリオンを産生させ、イオジキサノールもしくはＣｓＣｌ勾配などの標準的な技術またはその他の精製法を用いて精製する。精製されたＡＡＶビリオンはすぐに使用する準備ができている。

【0045】

本発明の別の目的は、医薬品として使用するための、上記のＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。特に、前記核酸は、桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療に使用するためのものである。換言すれば、本発明の別の目的は、それを必要とする哺乳動物においてＲＣＤを治療する方法であって、該方法は、上記のようなＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を該哺乳動物に投与することを含む。

【0046】

一実施形態において、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなり、ヌクレオチド配列番号３を含むか、またはそれらからなる。

【0047】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＳＶ４０ウイルスベクターからなる群から選択されるベクター中にあってもよい。

【0048】

実施形態によれば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ｐＲ１．７プロモーターまたは前記プロモーターの機能的変異体の制御下にある。

【0049】

一実施形態によれば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２またはＡＶＶ９ウイルスであるベクター中にあり、挿入ペプチドはアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む。

【0050】

好ましくは、ベクターは、以下を含む組換えＡＡＶ２ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にある前記哺乳類の錐体オプシンをコードする、前記ヌクレオチド配列。

【0051】

実施形態によれば、前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号８）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号９）、またはＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）を含むか、またはそれらからなる。

【0052】

一実施形態によれば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、上記のように、哺乳類の錐体オプシンをコードする配列をさらに含む。

【0053】

別の実施形態によれば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、上記のように、哺乳類の錐体オプシンをコードする別の核酸と組み合わせてＲＣＤを治療するのに使用するためのものである。換言すれば、本発明の別の目的は、それを必要とする哺乳動物においてＲＣＤを治療する方法であって、該方法は、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列および哺乳動物の錐体オプシンをコードする別の核酸を含む核酸を哺乳類に投与することを含む。前記方法において、核酸はしたがって別々の形態であり、単一の医薬組成物中に製剤化されてもよいし、別々の医薬組成物中に製剤化されてもよい。

【0054】

一実施形態において、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲ（配列番号１６に記載の配列を有する）、ｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲ（配列番号１７に記載の配列を有する）、またはｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌｔａＡＴＧ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲ（配列番号１８に記載の配列を有する）からの発現カセットを含む。

【0055】

【表5】

【0056】

本発明の別の目的は、本発明のベクターまたは薬学的に許容される担体と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物である。

【0057】

本発明の別の目的は、桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療に使用するための、本発明のベクター、担体または医薬組成物である。

【0058】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）は、網膜色素変性症（ＲＰ）、特に非症候性Ｘ連鎖網膜色素変性症（ＸＬＲＰ）、常染色体劣性ＲＰ、常染色体優性ＲＰなどの異種の疾患群である。ＲＣＤの最も一般的な症候群型は、アッシャー症候群、バルデ－ビードル症候群、レフスム病、バッセン－コルンツヴァイク症候群、バッテン病を含む。

【0059】

治療の対象となるＲＣＤは哺乳動物、特に非ヒトまたはヒト霊長類、好ましくはヒトである。哺乳動物におけるＲＣＤは、疾患の初期、中期または進行期にあり得る。疾患の中期または進行期にあるＲＣＤ対象では、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を用いて対象の錐体を形質導入することは、錐体オプシンおよび錐体アレスチンが患者の錐体細胞体で依然として発現していれば、視力回復を達成するのに十分であろう。錐体細胞体がもはや錐体オプシンを発現していないＲＣＤ対象では、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列および哺乳類の錐体オプシンを用いて対象の錐体を形質導入することが必要であろう。

【0060】

したがって、ＲＣＤの治療は、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ導入遺伝子、またはＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類の錐体オプシン導入遺伝子を有する錐体の形質導入を達成するように、本発明のベクター、担体または医薬組成物を哺乳動物に投与することによって実施され得る。

【0061】

換言すれば、本発明の別の目的は、それを必要とする哺乳動物においてＲＣＤを治療する方法であって、該方法は、本発明の医薬組成物のベクターまたは担体の有効量を該哺乳動物に投与することを含む。

【0062】

従って、第１の実施形態において、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、前記ベクターを含む担体、またはベクターもしくは担体を含む医薬組成物は、錐体細胞が内因性錐体オプシンを依然として発現しているＲＣＤ哺乳類対象における桿体－錐体ジストロフィーの治療に使用するためのものである。一実施形態によれば、ベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。別の実施形態によれば、ベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含まない。一実施形態によれば、担体は、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む。別の実施形態によれば、担体は、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含まない。

【0063】

第２の実施形態において、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、前記ベクターを含む担体、またはベクターもしくは担体を包む医薬組成物は、錐体細胞がもはや内因性錐体オプシンを発現しないＲＣＤの哺乳類対象における桿体－錐体ジストロフィーの治療に使用するためのものである。この実施形態によれば、ベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、または担体は、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を包むベクターをさらに含む。

【0064】

ＲＣＤの治療は、哺乳類の錐体前駆細胞を、本発明のベクター、担体または医薬組成物で形質導入し、形質導入された哺乳類の錐体前駆細胞をＲＣＤ哺乳動物の網膜、特に窩領域に投与することによっても実施され得る。

【0065】

換言すれば、本発明の別の目的は、それを必要とする哺乳動物においてＲＣＤを治療する方法であって、該方法は、本発明の医薬組成物のベクターまたは担体で形質導入された有効量の哺乳類の錐体前駆細胞を該哺乳動物に投与することを含む。

【0066】

本発明はまた、ＲＣＤを治療する方法において使用するための、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸、またはＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類の錐体オプシンをコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞に関する。従って、それを必要とする哺乳動物においてＲＣＤを治療する方法であって、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸、またはＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類の錐体オプシンをコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞を哺乳動物に投与することを含む方法も提供される。本明細書において、用語「異種核酸」は、自然環境には存在しない遺伝子、ポリヌクレオチドまたは核酸配列を指す。

【0067】

錐体前駆細胞は、錐体細胞への分化が約束された、完全には分化されていない、非分裂細胞である。

【0068】

一実施形態では、錐体前駆細胞は、ドナー（例えば、死体眼ドナー）の網膜、または治療対象ＲＣＤの網膜から得られ、好ましくは治療対象ＲＣＤから得られる。別の実施形態では、錐体前駆細胞は、幹細胞、特に胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、成体幹細胞または胎児幹細胞から得られる。別の実施形態では、錐体前駆細胞は分化した胚性幹細胞から得られる。一実施形態によれば、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞である。別の実施形態によれば、方法自体または関連する行為がヒト胚の破壊を含まないという但し書き付きで、ヒト胚性幹細胞が使用され得る。好ましくは、錐体前駆細胞は、幹細胞の分化、好ましくは成体幹細胞または人工多能性幹細胞の分化から、より好ましくは、治療されるＲＣＤ対象の体細胞、例えば線維芽細胞から得られた人工多能性幹細胞の分化から得られる。

【0069】

胚性幹細胞は、未分化状態を維持することもできるし、外胚葉、内胚葉、中胚葉の３つの胚葉層全てに由来する系統に沿って成熟するように誘導することもできる。国際特許出願ＷＯ２０１８０５５１３１に記載されているように、主要な発生シグナル伝達経路を操作することによって、胚性幹細胞を錐体光受容体へと再プログラムすることができる。例えば、アクチビンＡおよび血清に加えて、結節経路およびｗｎｔ経路のアンタゴニストが用いられ得る（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋら，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５ Ｍａｒ；８（３）：２８８－９６）、あるいはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害が実施され得る（Ｏｓａｋａｄａ Ｆら，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００；４（６）：８１１－２４）。錐体前駆細胞は、当業者に公知の任意のプロトコールを用いて胚性幹細胞から得ることができる（Ｏｓａｋａｄａ Ｆら Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；２６（２）：２１５－２４；Ａｍｉｒｐｏｕｒ Ｎら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２ Ｊａｎ；２１（ｌ）：４２－５３；Ｎａｋａｎｏ Ｔら Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ｊｕｎ １４；１０（６）：７７１－８５；Ｚｈｕ Ｙら Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ．２５ ２０１３；８（ｌ）：ｅ５４５５２；Ｙａｎａｉ Ａら Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｏｃｔ；１９（１０）：７５５－６４；Ｋｕｗａｈａｒａ Ａら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５ Ｆｅｂ １９；６：６２８６；Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ＣＢら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ａｕｇ；３３（８）：２４１６－３０；Ｓｉｎｇｈ Ｋら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１５ Ｄｅｃ ｌ；２４（２３）：２７７８－９５）。

【0070】

好ましくは、錐体前駆細胞はｉＰＳ細胞または成体幹細胞から得られ、より好ましくはｉＰＳ細胞から得られる。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、リプログラミングとして知られるプロセスによって非多能性細胞、典型的には成人の体細胞から誘導され、細胞を多能性にするためにいくつかの特定の遺伝子（例えば、ヒト細胞ではＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ－ＭＹＣ）の導入のみが必要である。ｉＰＳ細胞を使用する利点の一つは、胚細胞の使用を完全に避けることができることであり、それゆえ倫理的な問題が生じることもない。光受容体前駆細胞は、当業者に公知の分化方法を用いてｉＰＳ細胞から得ることができる。

【0071】

特に、光受容体前駆細胞は、Ｇａｒｉｔａ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，２０１９，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０，４５２４に開示されるような方法によって、ヒトｉＰＳ細胞から得ることができる。ヒトｉＰＳは、ｉＰＳ培地（例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地、ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でコンフルエンスまで増殖させる。８０％コンフルエントした後、培地をプロネオ培地（例えば、１％Ｎ２サプリメント（１００Ｘ）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６（商標）培地；ＧＩＢＣＯ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替えた。培地は２－３日ごとに交換した。分化の４週間後、神経網膜様構造が培養物から成長し、機械的に単離された。ＲＰＥを生じる色素部分は注意深く除去した。成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に２％ Ｂ－２７（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）、無血清、１％ ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００Ｘ）；ＧＩＢＣＯ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にて３次元培養を続けたところ、網膜オルガノイドが形成された。この時点で１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加すると、網膜オルガノイドの増殖が促進され、ＲＰＥ系譜の代わりに網膜ニューロンにコミットした。網膜前駆細胞の光受容体へのコミットメントを促進するため、ガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１０μＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を用いて、分化４２日目から１週間、Ｎｏｔｃｈシグナルを特異的にブロックした。浮遊オルガノイドを６ウェルプレートで培養し（１ウェルあたり１０個のオルガノイド）、培地を２日ごとに交換した。

【0072】

光受容体前駆細胞はまた、当業者に公知の任意の他のプロトコールを用いてヒトｉＰＳ細胞から得ることもできる（Ｌａｍｂａ，Ｏｓａｋａｄａおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ（Ｌａｍｂａら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００６ Ａｕｇ ２２；１０３（３４）：１２７６９－７４；Ｌａｍｂａら Ｐｌｏｓ ｏｎｅ．２０１０ Ｊａｎ ２０；５（ｌ）：ｅ８７６３；Ｏｓａｋａｄａら Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（６）：８１１－２４；Ｍｅｙｅｒ ＪＳら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９ Ｓｅｐ ２９；１０６（３９）：１６６９８－７０３；Ｍｅｙｅｒ ＪＳら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１１ Ａｕｇ；２９（８）：１２０６－１８；Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ＣＢら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ａｐｒ；３０（４）：６７３－８６；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅ Ｃら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１３ Ｆｅｂ ；３１（２）：４０８－１４；Ｓｒｉｄｈａｒ Ａら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＴｒａｎｓＩ Ｍｅｄ．２０１３；２（４）：２５５－６４；Ｔｕｃｋｅｒ ＢＡら Ｅｌｉｆｅ．２０１３ Ａｕｇ ２７，２：ｅ００８２４；Ｔｕｃｋｅｒ ＢＡら Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ＴｒａｎｓＩ Ｍｅｄ．２０１３ Ｊａｎ；２（１）：１６－２４；ｅｉｃｈｍａｎ Ｓら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１４ Ｊｕｎ １０；１１１（２３）：８５１８－２３；Ｚｈｏｎｇ Ｘら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｉｎ．２０１４ Ｊｕｎ １０；５：４０４７；Ｗａｎｇ Ｘら Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１５ Ｊｕｎ；５３：４０－９）。

【0073】

錐体前駆体は、ｉ）ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸、またはｉｉ）ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸および哺乳類の錐体オプシンを含む。錐体前駆細胞が、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、またはその機能的誘導体、および哺乳類錐体オプシンをコードする異種核酸を含む場合には、錐体前駆細胞は、ｉ）ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類錐体オプシンの両方をコードする異種核酸、またはｉｉ）ＧＩＲＫ１をコードする異種核酸、および哺乳類錐体オプシンをコードする別の異種核酸のいずれかを含む。

【0074】

前記錐体前駆細胞は、当業者に公知の任意の方法によって、前記異種核酸（単数または複数）、または前記核酸（単数または複数）を含む発現カセットもしくはベクターを前記錐体前駆細胞に導入することによって調製され得る。一実施形態によれば、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓｆをコードする異種核酸、またはＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類の錐体オプシンをコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞は、上記のようなウイルスベクター、特にＡＡＶベクター、好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ２－７ｍ８またはＡＡＶ９－７ｍ８を用いて錐体前駆細胞を感染させることによって調製される。

【0075】

別の態様では、したがって本発明はさらに、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸、またはＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓおよび哺乳類の錐体オプシンをコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞を調製する方法であって、前記方法は、本発明によるウイルスベクターまたは担体を用いて錐体前駆細胞を感染させること、および感染した錐体前駆細胞を回収することを含む方法を指す。

【0076】

ベクター、担体、または医薬組成物、または錐体前駆細胞は、特に硝子体内投与または網膜下投与または脈絡膜上投与によって、当業者に公知の任意の適切な経路で投与され得る。

【0077】

実施形態において、ウイルスベクター、担体または医薬組成物は、１０^７～１０^１５ｖｇ／眼の間、好ましくは１０^１１～１０^１５ｖｇ／眼の間、さらにより好ましくは１０^１１および１０^１３ｖｇ／眼を含む用量で注射される。

【0078】

実施形態において、ウイルスベクター、担体または医薬組成物は、硝子体内注射によって投与される。

【0079】

一実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２もしくはＡＡＶ９、またはＡＡＶ２－７ｍ８もしくはＡＡＶ９－７ｍ８などのそれらの改変バージョンであり、前記ベクターは硝子体内注射によって投与される。

【0080】

実施形態において、ウイルスベクター、担体または医薬組成物は、網膜下注射によって投与される。

【0081】

窩は、霊長類の網膜中央部にある直径約０．５ｍｍ以下の小さな領域で、錐体光受容細胞のみを含み、網膜全体で錐体の密度が最も高い。窩は高い明瞭度色覚を提供することによって霊長類の視覚知覚を支配している。錐体の密度が最も高いのは窩の中心（窩の中心から０．３ｍｍ以下）であり、桿体光受容体は存在しない。錐体の密度は窩から離れるにつれて最大１００倍まで減少する。

【0082】

網膜色素変性症のような遺伝性網膜疾患の治療を目的とした遺伝子治療では、窩洞の錐体細胞が主要な標的である。通常、治療タンパク質をコードするウイルスベクターは、「網膜下」、すなわち光受容体と網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞との間の網膜下腔に注入され、錐体への遺伝子導入が行われる。

【0083】

網膜下への導入は、注入された眼の網膜下腔内に液体が充満したポケットを意味する「ブレブ（ｂｌｅｂ）」の形成をもたらす。この方法では、遺伝子導入は、注入された液体の局所的なブレブに接触する細胞に限定される。網膜剥離、特に窩剥離は、網膜下への注入中に起き、網膜変性のある眼では懸念される。

【0084】

有利には、ベクターがＡＡＶ９－７ｍ８ベクター（特に、ＡＡＶ９－７ｍ８－ｐＲ１．７ベクター）である場合には、ベクター（または前記ベクターを含む医薬組成物の担体）は、遠位網膜下注射によって、または窩の周辺部に投与することができ、次いで、窩領域に到達するように側方に広がる。一実施形態によれば、ブレブは、窩領域を剥離することなく、窩の中心から０．５ミリメートル以上離れて形成される。一実施形態において、前記ＡＡＶ９－７ｍ８ウイルスベクターは溶液中に製剤化され、５０～１００μＬの溶液が２０～３０秒で連続的に注入される。実施形態において、前記ＡＡＶ９－７ｍ８ウイルスベクターは、１×１０^１０～１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ（ウイルスゲノム／ｍＬ）、好ましくは０．５×１０^１１～５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１×１０^１１ｖｇ／ｍＬの濃度で溶液中に製剤化される。好ましくは、錐体前駆細胞は眼内注射によって、好ましくは網膜下腔注射によって、より好ましくは神経網膜とその上のＰＥとの間の注射によって投与される。投与する錐体前駆細胞の量は、当業者によく知られた標準的な手順によって決定され得る。適切な用量を決定するために、患者の生理学的データ（例えば、年齢、体格、および体重）、ならびに治療される疾患の種類および重症度を考慮しなければならない。錐体前駆細胞は、単回投与でも複数回投与でもよい。特に、各々の単位用量は、１μΙあたり１００，０００個から３００，０００個までの錐体前駆細胞、好ましくは１μΙあたり２００，０００個から３００，０００個までの錐体前駆細胞を含むことができる。

【0085】

〔図の簡単な説明〕
〔図１〕図１は、光伝達カスケード（Ａ）通常の光伝達カスケード（Ｂ）動物オプシンおよびＧＩＲＫ２チャネルを用いた短い光伝達カスケードを表す。ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ。CNG：環状ヌクレオチドゲートチャネル。ｃＧＭＰ：環状グアノシン一リン酸。

【0086】

〔図２〕図２は、プラスミド（Ａ）ＣＭＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰおよび（Ｂ）ＣＭＶ－ＳＷＯ－ｍＣｈｅｒｒｙを表す。

【0087】

〔図３〕図３は、免疫組織化学を用いてｒｄ１０マウスの光伝達カスケードに残存したものを表す。（Ａ－Ｄ）（Ａ）オプシン、（Ｂ）トランスデューシン、（Ｃ）ＰＤＥおよび（Ｄ）錐体アレスチンで染色した対照ＷＴマウスの網膜断面。（Ｅ－Ｈ）（Ｅ）オプシン、（Ｆ）トランスデューシン、（Ｇ）ＰＤＥおよび（Ｈ）錐体アレスチンで染色したＰ１４のｒｄ１０マウスの網膜断面。（Ｉ－Ｌ）（Ｉ）オプシン、（Ｊ）トランスデューシン、（Ｋ）ＰＤＥおよび（Ｌ）錐体アレスチンで染色したＰ１５０のｒｄ１０マウスの網膜断面。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【0088】

〔図４〕図４は予備データを表す。（Ａ）注入１週間後のｒｄ１０マウスにおけるＧＩＲＫ２－ＧＦＰ発現の眼底（^＊注入部位）（Ｂ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注入したＰ３３のｒｄ１０マウスにおける光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝１２）。Ｐ＝０．０００２。（Ｃ）Ｐ３３での代表的なフリッカーＥＲＧ。（Ｄ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝８）。

【0089】

〔図５〕図５は、ＧＩＲＫ２を介した視覚を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび／またはＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したＰ４１のｒｄ１０マウスの光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝１２）。Ｐ_{ＳＷＯ＋ＧＩＲＫ２}＝０．０３８１およびＰ_{ＧＩＲＫ２}＝０．００２１。（Ｂ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび／またはＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝７）。（Ｃ）Ｐ４１での代表的なフリッカーＥＲＧ。

【0090】

〔図６〕図６は、長期の有効性を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスの光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｂ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｃ）野生型マウスおよび非注射ｒｄ１０マウスの経時的な錐体数（ｎ＝６）。Ｐ値_{（Ｐ５０－Ｐ３６５）}＝０．００２２。（Ｄ）ｒｄ１０マウスのＥＲＧ振幅と錐体数との間の線形回帰相関（ｎ＝６）。Ｐ値_非注射＝０，０４８２。Ｐ値_{ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ}＝０．０００７。Ｐ値_ＰＢＳ＝０．０１０４。

【0091】

〔図７〕図７は、免疫組織化学を用いて、ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおいて光伝達カスケードに残存したものを表す。（Ａ－Ｄ）（Ａ）オプシン、（Ｂ）トランスデューシン、（Ｃ）ＰＤＥおよび（Ｄ）錐体アレスチンで染色した対照ＷＴマウスの網膜断面。（Ｅ－Ｈ）（Ｅ）オプシン、（Ｆ）トランスデューシン、（Ｇ）ＰＤＥおよび（Ｈ）錐体アレスチンで染色したＰ１４のｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの網膜断面。（Ｉ－Ｌ）（Ｉ）オプシン、（Ｊ）トランスデューシン、（Ｋ）ＰＤＥおよび（Ｌ）錐体アレスチンで染色したＰ１５０でのｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの網膜断面。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【0092】

〔図８〕図８は、アプローチの普遍性を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおける光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｂ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｃ）野生型マウスおよび非注射ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの経時的な錐体数（ｎ＝６）。Ｐ値_{（Ｐ５０－Ｐ３６５）}＝０．００２２。（Ｄ）ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスのＥＲＧ振幅と錐体数との線形回帰相関（ｎ＝５）。Ｐ値_非注射＝０．０３１３。Ｐ値_{ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ}＝０．０１４６。Ｐ値_ＰＢＳ＝０．０４９７。

【0093】

〔図９〕図９は、２つのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるマウスＧＩＲＫ２の有効性を表す：ＣＭＶ－ＳＷＯ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＭＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ。

【0094】

〔図１０〕図１０は、対象となる患者集団について、正常なボランティアおよび網膜色素変性症患者の表現型分類を表す。上段（Ａ）は、網膜の錐体優位領域の適応制御光学画像とともに、健常者の眼底および眼球後部のＯＣＴ画像を示す。中段（Ｂ）は進行したＲＣＤ患者の円グラフ分布を示す。下段は異なる患者のＯＣＴ画像およびＡＯＳＬＯ画像を表す。網膜色素変性症患者（７７歳、男性）のＡＯＳＬＯ共焦点（上）およびＡＯＳＬＯ分割検出（下）のｉｎ ｖｉｖｏ網膜画像。獲得野は、休止状態の錐体と推定される領域（すなわち、形態学的に無傷－ＯＣＴで見えるＩＳ／ＯＳ線、ＡＯＳＬＯ分割検出で見える明瞭な内分節モザイク、およびＡＯＳＬＯ共焦点で無傷の内分節および外分節を示す明瞭な錐体モザイク－ただし患者の視力によって機能は低下している；黄色のバー）と、損傷または欠落した錐体（ＯＣＴにおいて欠落したＩＳ／ＯＳライン、ＡＯＳＬＯ分割検出および共焦点においてそれぞれぼやけた内分節および錐体のモザイクによって示される；赤色のバー）。黄色の矢印は、変性していると思われる錐体を示し、共焦点ではＯＳが存在しないが、分割検出ではＩＳが存在する。スケールバー、２００μｍ。

【0095】

〔図１１〕図１１は、正常およびＲＰヒト網膜における錐体光伝達カスケードタンパク質を標識した免疫組織化学を表す。（Ａ）８６歳の対照ヒト網膜の網膜断面（２０倍）。（Ｂ）網膜色素変性症（ＲＰ）に罹患し、夜盲と周辺視力低下とを有する７５歳の老齢のヒトの網膜断面（４０倍）。（Ａ－Ｂ）Ｏｐｎ１ｍｗ（明）および核染色ＤＡＰＩ（暗）で染色。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【0096】

〔図１２〕図１２は、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＯｐｎ４Ｌの活性化によって惹起されるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ電流の特性を示す。Ａ）青色光（４７１ｎｍ、横軸に１０秒から２０秒までの露光）で活性化する場合には、ｍＯｐｎ４Ｌは強いＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ媒介電流を誘導し、それは石灰光（５６０ｎｍ、横軸に２０秒から６０秒までの露光）で刺激すると終了し、Ｂ）ＨＥＫ２９３膜を通るイオンのフラックスおよびＣ）容量あたりの電流密度に統計的に有意な差が生じる。

【0097】

〔図１３〕図１３は、青色光（４７１ｎｍ、横軸に１０秒から２０秒までの露光）で活性化され、石灰光（５６０ｎｍ、横軸に２０秒から６０秒までの露光）で刺激すると終了する場合の、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＯｐｎ４Ｌの活性化によって誘発されるＧＩＲＫ１またはＧＩＲＫ２電流の特性を示す。

【0098】

〔図１４〕図１４：Ａ１）ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、Ｂ１）ｈＧＩＲＫ２、またはＣ１）切断されたｒＧＩＲＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞の容量あたりの電流密度を示す。ｍＯｐｎ４の活性化によって誘発される電流反応を、ｃ末端ｅＧＦＰ融合構築物および遺伝子導入されていない細胞との比較で示す。個々の細胞の電流密度は、個々のデータポイントによって示されている。条件間の有意差を^＊印で示す（全てのペアでの複合的な比較手順を有するランク上の分散のクラスカル－ワリスワンウェイ分析（ダンの方法）Ｐ＜０．０５）。条件間の有意差を^＊印で示す（マン－ホイットニーランクサム検定；Ｐ＝０．００２）。青色光で活性化する場合には、ｍＯｐｎ４はＧＩＲＫ媒介電流を誘導し、石灰光で刺激すると、Ａ２）ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、Ｂ２）ｈＧＩＲＫ２、およびＣ２）切断されたｒＧＩＲＫ２ Ｔ構造物の例示的なトレースで見られるように終了する。

【0099】

〔図１５〕図１５Ａ）ｍＯｐｎ４と、ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ－ｅＧＦＰ、またはｈＧＩＲＫ２のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激は、全細胞パッチクランプ記録において確実に観察可能な電流を生じるが、ｍＯｐｎ４活性化後のｈＧＩＲＫ２－ｅＧＦＰ、ｒＧＩＲＫ２、またはｒＧＩＲＫ２－ｅＧＦＰの電流は、観察可能である可能性が低い。Ｂ）異なるＧＩＲＫ構築物（上）またはそれらのｅＧＦＰタグ付きバージョン（下）を発現するＨＥＫ２９３細胞の容量あたりの電流密度。個々の細胞の電流密度は、個々のデータポイントによって示されている。条件間の有意差を^＊印で示す（全てのペアでの複合的な比較手順を有するランク上の分散のクラスカル－ワリスワンウェイ分析（ダンの方法）Ｐ＜０．０５）。

【0100】

〔図１６〕図１６は、ビヒクル注射したｒｄ１０マウスまたはナイーブ（非注射）ｒｄ１０マウスと比較した、５Ｅ７ｖｇ／眼または５Ｅ８ｖｇ／眼でＡＡＶ８－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ１Ｆ１３７ＳをＰ１５で両側網膜下注射した後のｒｄ１０マウスの視力を表す。

【0101】

〔図１７〕図１７は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【0102】

〔図１８〕図１８は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【0103】

〔図１９〕図１９は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌｔａＡＴＧ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【0104】

〔実施例〕
〔実施例１：材料および方法〕
〔１．動物〕
これらの実験には、Ｃ５７ＢＬ／６ｊ^{ｒｄ１０／ｒｄ１０}（ｒｄ１０）マウスが用いられた。このマウスは桿体ＰＤＥ遺伝子に変異があり、光伝達カスケードの機能不全および桿体－錐体ジストロフィーを引き起こす。２番目のモデルは、ｈｕＲｈｏＰ３４７Ｓ^＋／－マウスである。このマウスのホモ接合体ストランドには、マウスロドプシン（ｍＲｈｏ）遺伝子のＫＯと、変異（Ｐ３４７Ｓ）を有するヒトロドプシン（ｈｕＲｈｏ）のＫＩとが存在する（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ－Ｗａｒｄら、２０１１）［３０］。ホモ接合体の雄をＣ５７ＢＬ／６ｊ（野生型）の雌と交配させ、ヘテロ接合体マウスを得た。これらのマウスはｒｄ１０マウスと同様の表現型を有するが、変性率は低い。

【0105】

〔２．ＡＡＶ注射〕
まず、マウスは０．９％ＮａＣｌで希釈した０．２ｍｌ／２０ｇのケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ ５００，Ｖｉｂｒａｃ Ｆｒａｎｃｅ）およびキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ ２％，Ｒｏｍｐｕｎ）の腹腔内注射で麻酔された。８％ネオシネフリン（Ｎｅｏｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ Ｆａｕｒｅ １０％，Ｅｕｒｏｐｈｔａ）および４２％Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ ０．５％，Ｔｈｅａ）を０．９％ＮａＣｌで希釈したもので眼を拡張した。

【0106】

総量１μｌのベクター溶液を網膜下に注入した。注入後、眼軟膏であるフラデキサムを塗布した。注入したウイルスベクターのリストを以下に示す：

【0107】

【表6】

【0108】

〔３．眼底検査〕
網膜下注射の１週間後、マウスはイソフルオラン吸入によって麻酔された。眼を拡張し、Ｌｕｂｒｉｔｈａｌ ｅｙｅ ｇｅｌ（ＶｅｔＸＸ）で保護した。生きた麻酔されたマウスでＧＦＰまたはｔｄＴｏｍａｔｏの発現をモニターするために、特定のフィルターを装着した眼底カメラ（Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ；Ｐｈｏｅｎｉｘ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を用いて眼底撮影を行った。

【0109】

〔４．網膜電図（ＥＲＧ）記録〕
網膜機能を評価するために、網膜電図記録（ＥＲＧ）を記録した（ｅｓｐｉｏｎ Ｅ２ ＥＲＧ ｓｙｓｔｅｍ；Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ）。ウイルスベクターの注射後、異なる時点でいくつかの試験を行った。マウスは、０．９％ＮａＣｌで希釈した０．２ｍｌ／２０ｇのケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ ５００，Ｖｉｂｒａｃ Ｆｒａｎｃｅ）およびキシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ ２％，Ｒｏｍｐｕｎ）の腹腔内注射で麻酔された。その後、マウスを３７℃の加温パッド上に置いた。０．９％ＮａＣｌで希釈したネオサイヘフリン（Ｎｅｏｓｙｎｅｐｈｒｉｎｅ Ｆａｕｒｅ １０％，Ｅｕｒｏｐｈｔａ）およびＭｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ ０．５％，Ｔｈｅａ）で眼を拡張した。各々の眼の角膜表面上に電極を貼る前に、ルブリタール・アイジェルで眼を保護した。基準電極は額の皮下に、アース電極は背中の皮下に挿入した。

【0110】

ＥＲＧ記録は、２つの条件下で行った：（ｉ）錐体主導の光反応を反映する光視性条件－２０ｃｄｓ／ｍで５分間の順応の後、光強度を増加させながら（０．１／１／１０／５０ｃｄｓ／ｍ）６０秒間、６ｍｓの光フラッシュを１秒ごとに照射した－、ならびに（ｉｉ）錐体機能を反映する速い周波数の光刺激であるフリッカー条件（１０Ｈｚ、１ｃｄ ｓ／ｍで７０回のフラッシュ）。

【0111】

グラフおよび統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて行った。

【0112】

〔５．視覚性運動試験〕
視力は、動くバーの前に置かれたマウスの頭を回す動きを得点化する視覚性運動試験を用いて測定された。視覚性運動室を形成するために、試験は正方形に配置された４台のコンピューターモニターからなるコンピューターベースの機械を用いて行われた。視覚性運動刺激の生成には、黒および白の縞が交互に動くことからなるコンピュータープログラムが指定された。空間周波数は０．０３ｃｙｃ／ｄｅｇから０．６ｃｙｃ／ｄｅｇまでの範囲である。このプログラムにより、縞の幅とバーの移動方向とを調節することができた。

【0113】

〔６．免疫組織化学および共焦点の撮影〕
動物はＣＯ_２の吸入によって犠牲にし、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ中にて室温で１時間固定した。眼球は免疫組織化学用のアイカップとして、または細胞計数用の平板マウントとして解剖した。その後、アイカップをＰＢＳ－ショ糖１０％のグラジエントで１時間、さらにＰＢＳ－ショ糖３０％で一晩凍結保護した。アイカップをＯＣＴに包埋し、厚さ１２μｍのクライオスタット切片（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を切り出し、スライドガラス上に固定した。切片をＰＢＳ中で洗浄し（３×５分）、異なる抗体（下表参照）とＤＡＰＩ（１：２０００）とで染色した。最後に、切片をＰＢＳで洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｖａｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で固定し、レーザー共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１）を用いた撮影のためにカバースリップした。フラットマウント網膜染色について、組織を凍結保護しなかった以外は、プロトコールは同じである。画像はＦＩＪＩソフトウェアを用いて解析した。

【0114】

【表7】

【0115】

〔７．細胞数〕
ｒｄ１０およびｈｕＲｈｏＰ３４７Ｓ^＋／－マウスのフラットマウント網膜を、マウス錐体アレスチン－ｍＣＡＲ（１：１００００）およびＤＡＰＩ（１：２０００）に対する抗体を用いて染色した。二重染色した細胞を異なる年齢で計算した。各々の年齢で５匹（ｎ＝１０）の動物の網膜を使用し、背腹側と鼻側頭側とに方向付けた。外核層（ＯＮＬ）全体の厚さをカバーするように連続光学切片を得た。全ての網膜の４つの領域の各々において、２１１．９７μｍ×２１１．９７μｍの走査領域を２つずつ作成した。錐体細胞の計算は、ＯＮＬの厚さ全体をカバーする画像（ｚスタック）の再構成によって、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して手動で行った。各々の網膜の平均密度値を計算し、異なる年齢における１ｍｍ^２あたりの錐体細胞数を求めた。

【0116】

〔８．マウスＧＩＲＫ２の有効性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験〕
ＨＥＫ細胞を２つのプラスミドで遺伝子導入した：ＣＭＶ－ＳＷＯ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＭＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ（図２）。ＨＥＫ２９３細胞は遺伝子導入後、暗室条件で培養され、記録された。細胞は、２５倍の水浸対物レンズ（ＸＬＰｌａｎＮ－２５×－Ｗ－ＭＰ／ＮＡ１．０５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた顕微鏡の記録チャンバーに入れ、１ｍＭ９－シス－レチナールを加えて濃縮した酸素添加（９５％ Ｏ２／５％ＣＯ２）したエームス培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３６℃に保った。高い細胞外カリウム濃度を得るため、外部溶液にＫＧｌｕｃｏｎａｔｅを添加し、細胞カリウム逆転電位を－４０ｍＶとした。

【0117】

全細胞記録では、Ａｘｏｎ Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ アンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＧＩＲＫ媒介Ｋ^＋電流は、－８０ｍＶでの電位固定配置で、ホウケイ酸塩ガラスピペット（ＢＦ１００－５０－１０，Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用い、５ＭΩに引き、１１５ｍＭＫグルコン酸塩、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および４ｍＭ ＡＴＰ－Ｎａ２（ｐＨ７．２）で満たし、記録した。

【0118】

実験中、ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐ．）を用い、透過型赤外光を用いて細胞を可視化させた。電気生理学的実験では、単色光源（Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ Ｖ、ＴＩＬＬ ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使用して、４００ｎｍの光フラッシュで細胞を刺激した。

【0119】

〔９．患者眼底撮影〕
適応制御光学走査型レーザー検眼鏡検査（ＡＯＳＬＯ）（Ｒｏｏｒｄａら Ｏｐｔ Ｅｘｐ ２００２）を用いて、細胞分解能で錐体光受容体のモザイクを画像化した。使用したＡＯＳＬＯ装置（ＭＡＯＲＩ、ＰＳＩ、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、光軸に沿って散乱された光（共焦点モード）から内分節および外分節の両方（ＩＳ、ＯＳ）と、軸外に散乱された多重散乱光（分割検出モード）から内分節と、を有する無傷の錐体を、２度の視野にわたって同時に撮影することができる。これにより、各々の錐体についてＩＳ対ＩＳ＋ＯＳの差分撮影を行い、錐体の存在および健全性を評価することができる。

【0120】

〔実施例２：結果〕
〔１．変性した錐体における光伝達カスケードの変化〕
光伝達カスケードは、まずｒｄ１０マウスモデルにおいて、網膜変性中の異なる時点において、免疫組織化学を用いてその構成要素を調べることによって分析した。錐体オプシンと直接相互作用する光伝達カスケードのうち、錐体オプシン、トランスデューシング、ホスホジエステラーゼ、および錐体アレスチンタンパク質に対する免疫蛍光染色が行われた。

【0121】

図３は、錐体オプシンおよびアレスチンのみが、依然として疾患の後期においても発現し、錐体細胞体の周囲に局在していることを示している。

【0122】

〔２．錐体オプシンおよびＧＩＲＫ２を介した視力回復〕
免疫組織化学、およびニューロンにおいて発現した錐体オプシンに関するこれまでの知見に基づいて、まず、ｔｄＴｏｍａｔｏと融合したマウス短波長錐体オプシン（ＳＷＯ）と、ＧＦＰと融合したラットの切断されたＧＩＲＫ２とを、等モル比で混合した２つのＡＡＶベクターを用いて送達することで、光に対する錐体細胞の反応が増強される理由を調べた。そこで、２つのＡＡＶをｐ１５で変性したｒｄ１０マウス網膜に網膜下注射した（図４Ａ）。この結果、処理した眼の光刺激性ＥＲＧ振幅は対照と比較して有意に増加した（図４Ｂ）。フリッカーＥＲＧは、ＧＩＲＫ２を発現するこれらの錐体細胞において回復メカニズムが依然として活性であり、速い刺激に追従できることを確認した（図４Ｃ）。ＧＩＲＫ２で処理したｒｄ１０動物は、対照と比較して視覚性運動反射の改善も示した（図４Ｄ）。

【0123】

次に、変性した錐体に依然として存在する内因性の錐体オプシンが機能的であり、このマウスモデルにおいてＧＩＲＫ２チャネルを活性化するのに十分であるかどうかが研究された。このために、ＧＩＲＫ２をＧＦＰと融合してコードする単一のＡＡＶ８ベクターを投与した。この結果、処理した眼では、光視性ＥＲＧ振幅および視覚性運動反射が、対照と比較して同様に増加し、ＧＩＲＫ２単独で錐体オプシンが関与するＧタンパク質共役シグナルを介して光感受性を増加させるのに十分であることが確認された（図５Ａ－Ｂ）。フリッカーＥＲＧもまた、このアプローチにより強固に増幅された（図５Ｃ）。

【0124】

〔３．ＧＩＲＫ２を介した視力回復：長期的有効性〕
光刺激に対する錐体反応をモニターするため、ＧＩＲＫ２投与後および非投与時の異なる時点で光視性ＥＲＧ記録を行った。これらのＥＲＧは２つの条件下で行われた：（ｉ）光強度を増加させながら６０秒間１秒ごとに光フラッシュを照射する明順応化、ならびに（ｉｉ）６０秒間繰り返しフラッシュを照射するフリッカー刺激。データはｐ５０までは週単位で、その後１１週齢までは１０～１３日ごとに収集され、対照の眼および処置された眼の両方でＥＲＧ振幅が徐々に低下することが示された（図６Ａ）。さらに、これらの結果は視覚性運動試験と一致しており、ＧＩＲＫ２を投与した対照の眼および処置された眼の両方で、視覚性運動反射が経時的に低下したことを示す（図６Ｂ）。ｒｄ１０マウスでは錐体数も経時的に減少していることから、この減少は予想されたことであった（図６Ｃ）。ｒｄ１０網膜に残存する錐体光受容体の数を数え、錐体数の減少とＥＲＧ振幅の減少とを関連付けた。実際、光反応の減少は、残存する光受容体の数に比例していた（図６Ｄ）。したがって、ＧＩＲＫ２は、錐体が生きて残存している限り、残存する錐体の光反応を増加させたが、予想通り、錐体細胞の消失を遅らせなかったと結論づけられた。

【0125】

〔４．変異型ロドプシンに起因するＲＣＤモデルにおけるＧＩＲＫ２を介した視力回復〕
変異に依存しない治療法を開発するという目標を念頭に置いて、このアプローチを異なる原因変異を持つ別のマウスモデルで試験した。この目的のために、Ｐ３４７Ｓ変異ヒトロドプシンをノックインしたｍＲｈｏ^－／－ｈｕＲｈｏＰ３４７Ｓ^＋／－と呼ばれるヘテロ接合体マウスモデルで実験が行われた。変異ヒトロドプシンおよびマウスロドプシンの欠失が、この相補的モデルにおける桿体－錐体ジストロフィーにつながった。ここでは、ｒｄ１０マウスモデルで行ったのと同じ一連の実験を繰り返した。まず、異なる時点における錐体オプシンと相互作用する光伝達カスケードタンパク質を分析した（図７）。その結果、以下のことがわかった：（ｉ）変性速度はｒｄ１０と比較して遅かった、ならびに（ｉｉ）ｒｄ１０モデルと同様に、Ｐ１５０ではオプシンおよびアレスチンだけが錐体細胞体に残存していた。

【0126】

次に、ＧＦＰと融合したＧＩＲＫ２をコードする同じＡＡＶベクターをＰ１５でマウスに注射し、様々な時点で光刺激に対する錐体反応をモニターするためにＥＲＧを記録した（図８Ａ）。処理した眼の反応振幅は、Ｐ１００まで対照の眼の反応振幅よりも有意に高かった。さらに、フリッカーＥＲＧ反応もこのマウスモデルで同様に改善した。ｒｄ１０マウスと同様に、このマウスモデルでも視覚性運動反射が改善され、対照条件および処置条件の両方で経時的に減少することを示している（図８Ｂ）。このＲＣＤマウスモデルでは、錐体数も経時的に減少するため、この減少は予想されることである（図８Ｃ）。ＥＲＧ振幅の時間的減少も、このモデルにおける錐体数の減少と相関している（図８Ｄ）。これは、このアプローチでは変性は止められなかったが、ＧＩＲＫ２を介して光感受性を高めることができたという事実と再度一致した。

【0127】

〔５．ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験におけるマウスＧＩＲＫ２の有効性〕
ＧＩＲＫおよびＳＷＯ（短波長オプシン）の両方を発現するＨＥＫ細胞では、光刺激（４００ｎｍ、５秒、全視野）によってＧＩＲＫ電流が活性化された（図９）。ＧＩＲＫチャネルはＧｉ／ｏ経路を介して膜限定的かつ高速に調節され、マウスＧＩＲＫチャネルの発現は膜結合型であった。ＳＷＯによるＧＩＲＫチャネルの光誘導活性化および不活性化の振幅および動態は、５秒間の光パルス中に大きなＧＩＲＫ電流振幅を誘導する。

【0128】

〔実施例３：ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓは、青色光（４７１ｎｍ）で刺激すると、ＧＩＲＫ２よりも強い電流を誘発する〕
マウスＯｐｎ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的に発現するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、４．５ｇ／ｌ Ｄ－グルコース、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシンの添加、５％ＣＯ２下の加湿インキュベーター中、３７℃で維持される。ＨＥＫ２９３細胞は、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元のプロトコールに従って遺伝子導入し、記録前に１８～２４時間インキュベートする。レチナールアルデヒドは最終培地濃度が１μＭになるように添加する。

【0129】

ＧＩＲＫチャネルの記録のために、Ｏｐｎ４Ｌ－ｍＣｈｅｒｒｙを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞でＧＩＲＫ構造物を発現させる。遺伝子導入後、暗室条件下で細胞を培養し、記録する。ＧＩＲＫを介したＫ－電流は、以下に記述するように測定および解析される。外部溶液は、以下の通りである：２０ｍＭ ＮａＣｌ、１２０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．３（ＫＯＨ）。パッチピペット（２－５ＭΩｓ）には内溶液を充填した：１００ｍＭ アスパラギン酸カリウム、４０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＡＴＰ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭ ＧＴＰ、ｐＨ７．３（ＫＯＨ）。細胞は１μＭ ９－ｃｉｓレチナール（Ｓｉｇｍａ）を含む外部溶液中で記録される。実験操作中、細胞は透過型赤色光（５９０ｎｍ）または緑色光フィルター（４８０ｎｍ）を用いて可視化される。ＨＥＫ２９３細胞の全細胞パッチクランプ記録は、ＥＰＣ１０アンプ（ＨＥＫＡ）を用いて行った。電流はデジタル化され、ＥＰＣ１０アンプの２．９ｋＨｚ ４極ベッセルフィルター（フィルター２）と直列に、内蔵の１０－ｋＨｚ ３極ベッセルフィルター（フィルター１）でフィルタリングされる。直列抵抗は７０～９０％の間で部分的に補完される。

【0130】

ＧＩＲＫ電流を分析および比較するために、ＨＥＫ２９３細胞を－６０ｍＶで電圧クランプする。基準電流を決定するために、光照射前に－１００ｍＶから＋５０ｍＶまで５００ｍｓの長電圧ランプを照射する。その後、－６０ｍＶで４７１ｎｍの光パルスを１０秒間照射する。ＧＩＲＫ電流の大きさは、光活性化前後の細胞のコンダクタンスに関連している。

【0131】

異なるＧＩＲＫ電流間のＧタンパク質の調製および脱感作の有効性における可能性のある差異を分析するために、０．１～６０秒の範囲で光パルスを照射し、我々の出版物に記載されているように光の強度を変化させる（Ｅｉｃｋｅｌｂｅｃｋ， Ｄ．ら Ｃｏｍｍｕｎ． Ｂｉｏｌ．２，（２０１９）；Ｓｐｏｉｄａ， Ｋ．ら Ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．２６，１２０６－１２１２（２０１６）；Ｍａｓｓｅｃｋ，Ｏ．ａ．Ｏ．Ａ．ら Ｎｅｕｒｏｎ ８１，１２６３－１２７３（２０１４））。

【0132】

図１２および図１３の比較から明らかなように、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓは、ＨＥＫ細胞における短いＧＩＲＫ／オプシン光伝達カスケードの文脈において、切断されたラットのＧＩＲＫ２よりも有意により多くのイオン流出を誘導し（約１７倍高い）、一方で、野生型ＧＩＲＫ１はイオン流出の誘導に効果がない。この結果は、錐体にＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓを組み込むことで、ＲＣＤのＧＩＲＫ２遺伝子治療よりも改善された遺伝子治療が可能になることを示唆している。

【0133】

図１４および図１５もまた、ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ（ＧＦＰタグの有無にかかわらず）が、ヒトまたはラットのＧＩＲＫ２（ＧＦＰタグの有無にかかわらず）と比較して、有意にイオン流出を誘導することを確認している。

【0134】

〔実施例４：変異型ロドプシンによるＲＣＤモデルにおけるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓの視力回復〕
実施例２．２と同じ実験モデルを用いて、ｒｄ１０マウスの眼におけるヒトＧＩＲＫ１ Ｆ１３７ＳのＡＡＶ媒介発現が、視覚性運動試験によって決定されるＰ３７での視力向上につながることを実証した。結果を図１６に示す。

【0135】

Ｐ１５ ｒｄ１０／ｒｄ１０マウスに、ＡＡＶ８－ＰＲ１．７－ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓを５ｅ８ｖｇ／眼または５ｅ７ｖｇ／眼の用量で網膜下注射した。Ｐ３０およびＰ３７で、視機能を評価するためにＯＫＴ測定を行った。５ｅ８ｖｇ／眼の投与３週間後に、Ｐ３７で有意な視覚機能の改善が観察された。

【0136】

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【図面の簡単な説明】

【0137】

【図1】図１は、光伝達カスケード（Ａ）通常の光伝達カスケード（Ｂ）動物オプシンおよびＧＩＲＫ２チャネルを用いた短い光伝達カスケードを表す。ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ。CNG：環状ヌクレオチドゲートチャネル。ｃＧＭＰ：環状グアノシン一リン酸。

【図2】図２は、プラスミド（Ａ）ＣＭＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰおよび（Ｂ）ＣＭＶ－ＳＷＯ－ｍＣｈｅｒｒｙを表す。

【図3】図３は、免疫組織化学を用いてｒｄ１０マウスの光伝達カスケードに残存したものを表す。（Ａ－Ｄ）（Ａ）オプシン、（Ｂ）トランスデューシン、（Ｃ）ＰＤＥおよび（Ｄ）錐体アレスチンで染色した対照ＷＴマウスの網膜断面。（Ｅ－Ｈ）（Ｅ）オプシン、（Ｆ）トランスデューシン、（Ｇ）ＰＤＥおよび（Ｈ）錐体アレスチンで染色したＰ１４のｒｄ１０マウスの網膜断面。（Ｉ－Ｌ）（Ｉ）オプシン、（Ｊ）トランスデューシン、（Ｋ）ＰＤＥおよび（Ｌ）錐体アレスチンで染色したＰ１５０のｒｄ１０マウスの網膜断面。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【図4】図４は予備データを表す。（Ａ）注入１週間後のｒｄ１０マウスにおけるＧＩＲＫ２－ＧＦＰ発現の眼底（^＊注入部位）（Ｂ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注入したＰ３３のｒｄ１０マウスにおける光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝１２）。Ｐ＝０．０００２。（Ｃ）Ｐ３３での代表的なフリッカーＥＲＧ。（Ｄ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝８）。

【図5】図５は、ＧＩＲＫ２を介した視覚を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび／またはＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したＰ４１のｒｄ１０マウスの光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝１２）。Ｐ_{ＳＷＯ＋ＧＩＲＫ２}＝０．０３８１およびＰ_{ＧＩＲＫ２}＝０．００２１。（Ｂ）ＡＡＶ－ＳＷＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏおよび／またはＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した。対照マウスにはＡＡＶ－ＧＦＰを注射した（ｎ＝７）。（Ｃ）Ｐ４１での代表的なフリッカーＥＲＧ。

【図6】図６は、長期の有効性を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスの光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｂ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｒｄ１０マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｃ）野生型マウスおよび非注射ｒｄ１０マウスの経時的な錐体数（ｎ＝６）。Ｐ値_{（Ｐ５０－Ｐ３６５）}＝０．００２２。（Ｄ）ｒｄ１０マウスのＥＲＧ振幅と錐体数との間の線形回帰相関（ｎ＝６）。Ｐ値_非注射＝０，０４８２。Ｐ値_{ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ}＝０．０００７。Ｐ値_ＰＢＳ＝０．０１０４。

【図7】図７は、免疫組織化学を用いて、ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおいて光伝達カスケードに残存したものを表す。（Ａ－Ｄ）（Ａ）オプシン、（Ｂ）トランスデューシン、（Ｃ）ＰＤＥおよび（Ｄ）錐体アレスチンで染色した対照ＷＴマウスの網膜断面。（Ｅ－Ｈ）（Ｅ）オプシン、（Ｆ）トランスデューシン、（Ｇ）ＰＤＥおよび（Ｈ）錐体アレスチンで染色したＰ１４のｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの網膜断面。（Ｉ－Ｌ）（Ｉ）オプシン、（Ｊ）トランスデューシン、（Ｋ）ＰＤＥおよび（Ｌ）錐体アレスチンで染色したＰ１５０でのｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの網膜断面。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【図8】図８は、アプローチの普遍性を表す。（Ａ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおける光視性ＥＲＧ振幅。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｂ）ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰを注射したｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスにおける視覚性運動試験による視力の測定。対照マウスにはＰＢＳを注射した（ｎ＝６）。（Ｃ）野生型マウスおよび非注射ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスの経時的な錐体数（ｎ＝６）。Ｐ値_{（Ｐ５０－Ｐ３６５）}＝０．００２２。（Ｄ）ｈｕＰ３４７Ｓ^＋／－マウスのＥＲＧ振幅と錐体数との線形回帰相関（ｎ＝５）。Ｐ値_非注射＝０．０３１３。Ｐ値_{ＡＡＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ}＝０．０１４６。Ｐ値_ＰＢＳ＝０．０４９７。

【図9】図９は、２つのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞におけるマウスＧＩＲＫ２の有効性を表す：ＣＭＶ－ＳＷＯ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびＣＭＶ－ＧＩＲＫ２－ＧＦＰ。

【図10】図１０は、対象となる患者集団について、正常なボランティアおよび網膜色素変性症患者の表現型分類を表す。上段（Ａ）は、網膜の錐体優位領域の適応制御光学画像とともに、健常者の眼底および眼球後部のＯＣＴ画像を示す。中段（Ｂ）は進行したＲＣＤ患者の円グラフ分布を示す。下段は異なる患者のＯＣＴ画像およびＡＯＳＬＯ画像を表す。網膜色素変性症患者（７７歳、男性）のＡＯＳＬＯ共焦点（上）およびＡＯＳＬＯ分割検出（下）のｉｎ ｖｉｖｏ網膜画像。獲得野は、休止状態の錐体と推定される領域（すなわち、形態学的に無傷－ＯＣＴで見えるＩＳ／ＯＳ線、ＡＯＳＬＯ分割検出で見える明瞭な内分節モザイク、およびＡＯＳＬＯ共焦点で無傷の内分節および外分節を示す明瞭な錐体モザイク－ただし患者の視力によって機能は低下している；黄色のバー）と、損傷または欠落した錐体（ＯＣＴにおいて欠落したＩＳ／ＯＳライン、ＡＯＳＬＯ分割検出および共焦点においてそれぞれぼやけた内分節および錐体のモザイクによって示される；赤色のバー）。黄色の矢印は、変性していると思われる錐体を示し、共焦点ではＯＳが存在しないが、分割検出ではＩＳが存在する。スケールバー、２００μｍ。

【図11】図１１は、正常およびＲＰヒト網膜における錐体光伝達カスケードタンパク質を標識した免疫組織化学を表す。（Ａ）８６歳の対照ヒト網膜の網膜断面（２０倍）。（Ｂ）網膜色素変性症（ＲＰ）に罹患し、夜盲と周辺視力低下とを有する７５歳の老齢のヒトの網膜断面（４０倍）。（Ａ－Ｂ）Ｏｐｎ１ｍｗ（明）および核染色ＤＡＰＩ（暗）で染色。ＯＮＬ：外側核層。ＩＮＬ：内核層。ＧＣ：神経節細胞。スケールバーは５０μｍである。挿入スケールバーは２５μｍである。

【図12】図１２は、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＯｐｎ４Ｌの活性化によって惹起されるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ電流の特性を示す。Ａ）青色光（４７１ｎｍ、横軸に１０秒から２０秒までの露光）で活性化する場合には、ｍＯｐｎ４Ｌは強いＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ媒介電流を誘導し、それは石灰光（５６０ｎｍ、横軸に２０秒から６０秒までの露光）で刺激すると終了し、Ｂ）ＨＥＫ２９３膜を通るイオンのフラックスおよびＣ）容量あたりの電流密度に統計的に有意な差が生じる。

【図13】図１３は、青色光（４７１ｎｍ、横軸に１０秒から２０秒までの露光）で活性化され、石灰光（５６０ｎｍ、横軸に２０秒から６０秒までの露光）で刺激すると終了する場合の、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＯｐｎ４Ｌの活性化によって誘発されるＧＩＲＫ１またはＧＩＲＫ２電流の特性を示す。

【図14】図１４：Ａ１）ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、Ｂ１）ｈＧＩＲＫ２、またはＣ１）切断されたｒＧＩＲＫ２を発現するＨＥＫ２９３細胞の容量あたりの電流密度を示す。ｍＯｐｎ４の活性化によって誘発される電流反応を、ｃ末端ｅＧＦＰ融合構築物および遺伝子導入されていない細胞との比較で示す。個々の細胞の電流密度は、個々のデータポイントによって示されている。条件間の有意差を^＊印で示す（全てのペアでの複合的な比較手順を有するランク上の分散のクラスカル－ワリスワンウェイ分析（ダンの方法）Ｐ＜０．０５）。条件間の有意差を^＊印で示す（マン－ホイットニーランクサム検定；Ｐ＝０．００２）。青色光で活性化する場合には、ｍＯｐｎ４はＧＩＲＫ媒介電流を誘導し、石灰光で刺激すると、Ａ２）ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、Ｂ２）ｈＧＩＲＫ２、およびＣ２）切断されたｒＧＩＲＫ２ Ｔ構造物の例示的なトレースで見られるように終了する。

【図15】図１５Ａ）ｍＯｐｎ４と、ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ、ｈＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓ－ｅＧＦＰ、またはｈＧＩＲＫ２のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激は、全細胞パッチクランプ記録において確実に観察可能な電流を生じるが、ｍＯｐｎ４活性化後のｈＧＩＲＫ２－ｅＧＦＰ、ｒＧＩＲＫ２、またはｒＧＩＲＫ２－ｅＧＦＰの電流は、観察可能である可能性が低い。Ｂ）異なるＧＩＲＫ構築物（上）またはそれらのｅＧＦＰタグ付きバージョン（下）を発現するＨＥＫ２９３細胞の容量あたりの電流密度。個々の細胞の電流密度は、個々のデータポイントによって示されている。条件間の有意差を^＊印で示す（全てのペアでの複合的な比較手順を有するランク上の分散のクラスカル－ワリスワンウェイ分析（ダンの方法）Ｐ＜０．０５）。

【図16】図１６は、ビヒクル注射したｒｄ１０マウスまたはナイーブ（非注射）ｒｄ１０マウスと比較した、５Ｅ７ｖｇ／眼または５Ｅ８ｖｇ／眼でＡＡＶ８－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ１Ｆ１３７ＳをＰ１５で両側網膜下注射した後のｒｄ１０マウスの視力を表す。

【図17】図１７は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【図18】図１８は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【図19】図１９は、プラスミドｐＡＡＶ２－５’ＩＴＲ－ｐＲ１．７－ｈＧＩＲＫ－Ｆ１３７Ｓ－ＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌｔａＡＴＧ－ＢＧＨｐＡ－ＡＡＶ２－３’ＩＴＲを表す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2024520558000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-01-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。

【請求項2】

前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ＳＶ４０ウイルスベクターから選択されるウイルスである、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

前記ベクターは、ＶＰ１カプシドタンパク質のＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ９ウイルスであり、前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、請求項１または２に記載のベクター。

【請求項4】

Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする前記ヌクレオチド配列は、錐体特異的プロモーターの制御下にある、請求項１に記載のベクター。

【請求項5】

前記錐体特異的プロモーターは、ｐＲ１．７もしくはその機能的変異体、または最小Ｍ－オプシンプロモーター、特にｐＭＮＴＣ発現カセットにて、またはＧＲＫプロモーターもしくはその切断型である、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号３を含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項7】

前記ベクターは、以下を含む組換えＡＡＶ９ベクターである、請求項１に記載のベクター：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドはアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号５）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にあるＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓをコードする、前記ヌクレオチド配列。

【請求項8】

前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１０）、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１１）、またはＧＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１２）を含むか、またはこれらからなる、請求項１に記載のベクター。

【請求項9】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項10】

請求項１に定義されるベクターを含む、薬学的に許容される担体。

【請求項11】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項１０に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項12】

前記ベクターは、哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の薬学的に許容される担体：
ａ）は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、およびＳＶ４０ウイルスベクターからなる群より選択される；または
ｂ）は、前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドを含むＡＡＶ２ウイルスまたはＡＡＶ９ウイルスであり、前記挿入ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む；または
ｃ）は、以下を含む組換えＡＡＶ９ベクターである：
－野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に局在する位置で、野生型ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質に対して前記ＶＰ１カプシドタンパク質の前記ＧＨループに７～１１アミノ酸長の挿入ペプチドが挿入されたＶＰ１カプシドタンパク質であって、前記ペプチドは、アミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号７）を含む、ＶＰ１カプシドタンパク質；および
－ｐＲ１．７プロモーターの制御下にある前記哺乳類の錐体オプシンをコードする、前記ヌクレオチド配列。

【請求項13】

前記担体は、固体－脂質ナノ粒子、キトサンナノ粒子、リポソーム、リポプレックスおよびカチオン性ポリマーからなる群から選択される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項14】

前記哺乳類の錐体オプシンは、短波長錐体オプシン（ＳＷＯ）である、請求項１に記載のベクターまたは請求項１０に記載の薬学的に許容される担体。

【請求項15】

請求項１に記載のベクター、または請求項１０に記載の薬学的に許容される担体を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、医薬組成物。

【請求項16】

哺乳類の錐体オプシンをコードするヌクレオチド配列を含むベクターをさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記医薬組成物は、窩の距離に網膜下注射によって投与される、請求項１７に記載の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための医薬組成物。

【請求項19】

前記医薬組成物は、ａ）網膜動脈の上側枝または下側枝に隣接する領域に；ｂ）前記窩の中心から視蓋直径２～３の距離に；かつｃ）側頭網膜動脈および側頭網膜静脈の枝によって画定される幾何学的形状に局在する位置に、網膜下注射によって投与される、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記医薬組成物は、硝子体内注射によって投与される、請求項１７に記載の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための医薬組成物。

【請求項21】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする配列を含む核酸を含む、医薬組成物。

【請求項22】

桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための、Ｇタンパク質ゲート内向き整流カリウムチャネルのサブユニット１（ＧＩＲＫ１）Ｆ１３７Ｓをコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞を含む、医薬組成物。

【請求項23】

前記錐体前駆細胞は、治療される前記ＲＣＤの対象から得られる、請求項２２に記載の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための錐体前駆細胞を含む医薬組成物。

【請求項24】

前記錐体前駆細胞は、治療される前記ＲＣＤの対象の体細胞から得られた分化誘導多能性幹細胞によって得られる、請求項２２に記載の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための錐体前駆細胞を含む医薬組成物。

【請求項25】

前記錐体前駆細胞は、網膜下腔注射によって投与される、請求項２２に記載の桿体－錐体ジストロフィー（ＲＣＤ）の治療のための錐体前駆細胞を含む医薬組成物。

【請求項26】

ＧＩＲＫ１ Ｆ１３７Ｓまたはその機能的誘導体をコードする異種核酸を含む錐体前駆細胞を調製する方法であって、前記方法は、請求項１に記載のウイルスベクター、または請求項１０に記載の薬学的に許容される担体を錐体前駆細胞に感染させることを含む、方法。

【国際調査報告】