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特表2024-520636ｍＲＮＡキャッピング効率の定量的評価のためのアッセイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡキャッピング効率の定量的評価のためのアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6816 20180101AFI20240517BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6816 Z ZNA
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023574351
(86)(22)【出願日】2022-06-03
(85)【翻訳文提出日】2024-01-15
(86)【国際出願番号】 US2022032068
(87)【国際公開番号】W WO2022256597
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】63/197,106
(32)【優先日】2021-06-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517316797
【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】フランク・デローザ
(72)【発明者】
【氏名】シャオポー・グゥー
(72)【発明者】
【氏名】アニュシャ・ディアス
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ53
4B063QR14
4B063QR32
4B063QS40
4B063QX04
(57)【要約】
本発明は、複数のｍＲＮＡ転写物を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応混合物からのサンプル中のキャッピング効率を定量する方法であって、ｍＲＮＡ転写物を、ｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域中のヌクレオチドの配列に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列との間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ）消化を用いてｍＲＮＡ転写物の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを放出させる工程を特徴とする、方法に関する。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のキャッピング効率を定量する方法であって：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルは、キャップ有りまたは無しのヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；
（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、該オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の（ｉ）第２～第５のヌクレオチド、（ｉｉ）第３～第６のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをＲＮａｓｅ Ｈと接触させて、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の（ｉ）最初の５個のヌクレオチド、（ｉｉ）最初の６個のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）最初の７個のヌクレオチドをそれぞれ放出させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程
を含み、
工程（ａ）～（ｃ）は、同じアッセイ容器内で互いに連続して進行する、方法。
【請求項2】
工程（ｂ）～（ｄ）は、自動化システムによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
分析は、キャップのメチル化状態をさらに決定することができる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
キャップは、転写後に酵素により付加されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
キャップは、共転写によりｍＲＮＡに付加されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
オリゴヌクレオチドは、以下の式：５’－［Ｒ］ｎ［Ｄ］４［Ｒ］１－３’
（式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、ｎは１０～２０である）
で表され、オリゴヌクレオチドは、約４０％～約６０％のＧＣ含量を有し、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、約５０℃～約６０℃の融解温度を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
ＲＮＡヌクレオチドの各々は、２’－Ｏ－メチルリボースを含む、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
工程（ａ）で提供されたｍＲＮＡサンプル中において、１００ｐｍｏｌ以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡのインプットを必要とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
１００μｌ以下の総アッセイ体積を必要とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｂ）～（ｃ）は、９０分またはそれ未満で実施する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｄ）における分析は、工程（ｃ）で放出されたｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを分離し、キャップの有無を決定するＨＰＬＣを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
ＨＰＬＣは、ＵＨＰＬＣである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
工程（ｄ）における分析は、Ｃａｐ １構造を含む、工程（ｃ）において放出されたｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを同定するための質量分析（ＭＳ）をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
工程（ｄ）における分析は、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
ＭＳまたはＬＣ－ＭＳによる工程（ｄ）におけるサンプルの分析は、２００～６０００ｍ／ｚのスキャン範囲にわたる分析を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
工程（ａ）で提供されるｍＲＮＡサンプルは、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物の第２の部分を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
工程（ａ）で提供されるｍＲＮＡサンプルは、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の第３の部分を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して少なくとも９０％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物の第２の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して１０％以下である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の第３の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して１０％以下である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
さらなる処理は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡ転写物の精製および／または封入を含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
治療用ｍＲＮＡを製造する方法であって：（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物を用いて治療用ｍＲＮＡを合成する工程；
（ｉｉ）請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物からのｍＲＮＡサンプルを分析する工程；および
（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ中にＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分が少なくとも９０％である場合、ｍＲＮＡをさらに処理する工程
を含む、方法。
【請求項23】
さらなる処理は、工程（ｉ）において合成された治療用ｍＲＮＡの精製を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
さらなる処理は、工程（ｉ）において合成された治療用ｍＲＮＡを製剤化することを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
製剤化は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子中に封入することを含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，１０６号の利益を主張し、その優先権を主張するものであり、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年６月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１９７，１０６号の利益を主張し、その優先権を主張するものであり、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表の参照による組み入れ
本明細書は、配列表（ＭＲＴ－２２４１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇという名前のテキストファイルとして電子的に提出）を参照する。このテキストファイルは２０２２年６月１日に作成され、サイズは１３，５１５バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書は、配列表（ＭＲＴ－２２４１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇという名前のテキストファイルとして電子的に提出）を参照する。このテキストファイルは２０２２年６月１日に作成され、サイズは１３，５１５バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0003】
メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）療法は、種々の疾患の治療のためのますます重要なアプローチとなっている。ｍＲＮＡ療法は、ｍＲＮＡを患者に効率的に送達し、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を患者の体内で効率的に産生することを必要とする。
【0004】
治療で使用されるｍＲＮＡは、一般的にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって産生される。５’キャップ構造がメチル化されたｍＲＮＡのみがｉｎ ｖｉｖｏで効率的に翻訳されるが、ＩＶＴによってキャッピングされたｍＲＮＡを生成する機構は不完全である。したがって、キャッピング効率の正確な特徴付けは、治療用途のｍＲＮＡの品質を決定するために特に重要である。
【0005】
ＩＶＴプロセスは、共転写により付加されるキャップアナログを含み得る。あるいは、５’キャップ構造は、ＩＶＴ反応が完了した後、転写後に酵素により付加することもできる。
【0006】
共転写キャッピングの間、抗逆キャップアナログ（ＡＲＣＡ）がＩＶＴ反応混合物中に含まれる。得られたｍＲＮＡ転写物は、メチル化されたＣａｐ ０構造を含み、これはＣａｐ １構造を形成するためにさらにメチル化される必要がある。Ｃａｐ １構造は典型的には、キャッピングされたｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで効率的に翻訳するために必要である。ＩＶＴ反応混合物に２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを含めることにより、メチル化を行うことができる。共転写キャッピングに供されるＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列の最初のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ ０またはＣａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物、および／またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物を含み得る。５’キャップ構造を有さないｍＲＮＡ転写物、ならびにそれぞれＣａｐ ０およびＣａｐ １構造を有するｍＲＮＡ転写物を図１に示す。ＡＲＣＡキャップアナログが使用されている場合、Ｃａｐ ０およびＣａｐ １構造は、リボース環の２’または３’ＯＨ基のいずれかにおけるｍ７Ｇのメチル化をさらに含んでいてもよい。
【0007】
酵素による転写後キャッピングは、３つの合成工程を含む。第１の工程において、グアニルトランスフェラーゼがＧＴＰを基質として使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡの５’末端にグアニン（Ｃａｐ Ｇ）を付加する。第２の工程において、グアニンメチルトランスフェラーゼがメチル基を付加し、Ｃａｐ ０構造を形成する。第３の工程では、２‘－Ｏ－メチルトランスフェラーゼが第２のメチル基を付加し、Ｃａｐ １構造を形成する。このプロセスを図２に示す。酵素による転写後キャッピングに供されるＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列の最初のヌクレオチドの５’末端に複数の異なるキャップ構造のいずれかを含むｍＲＮＡ転写物、および／またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物を含み得る。
【0008】
キャッピング効率を決定する方法は当技術分野で知られている。例えば、１つの方法は、ＧがｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の最初のヌクレオチドであるＩＶＴ反応混合物中に［α－３２Ｐ］ＧＴＰの含有を伴う。ＲＮａｓｅ Ｔ２消化後、キャッピングされていないｍＲＮＡはｐ３Ｇ［３２Ｐ］を放出し、例えばｍ７Ｇｐ３Ｇ［３２Ｐ］のようなキャッピングされたｍＲＮＡに対する存在量を陰イオン交換クロマトグラフィーのような分析法で測定することができる。しかしながら、サンプルの放射性標識には、多くの下流アプリケーションにおいてＩＶＴ反応混合物中のｍＲＮＡサンプルの使用が禁止されているため、放射性標識法は典型的には、別個の対照反応として並行して実行される。このような同時実行されるが別個であるサンプルは、処理する必要があるサンプル数を増加させるだけでなく、オペレーター内のエラーおよび反応条件の微小な変動により本質的に変動しやすい。
【0009】
キャッピング効率を測定する放射性標識を使用しない方法も知られている。そのような方法の１つは、特許文献１に記載されている。これは、ｍＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用することを含む。このプローブは、基質が合成されたｍＲＮＡ分子のプールからＲＮａｓｅ Ｈで切断された５’末端を濃縮するために使用できるように、基質への結合を可能にするタグを含む。しかし、濃縮工程に必要な試薬（例えば、磁気ビーズ）がアッセイのコストを増加させる。濃縮はまた、収率の本質的な減少を伴い、アッセイのサンプル効率を低下させる。
【0010】
したがって、ＩＶＴ反応混合物からｍＲＮＡサンプル中のキャッピング効率を定量する、コスト効率、サンプル効率、および時間効率のよい方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第２０１７／０９８４６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって合成されたｍＲＮＡ転写物のキャッピング効率を正確および定量的に決定するための改善された方法を提供する。特に、本発明は、ｍＲＮＡ調製サンプルを前処理することなく、ｍＲＮＡ調製サンプルから（例えば、ＩＶＴ反応混合物から）直接ｍＲＮＡ転写物のキャッピング効率を定量するための改善された方法に関する。とりわけ、本明細書で提供されるｍＲＮＡキャッピング効率法は、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーション反応、ヌクレアーゼ切断、ならびにＭＳおよびＬＣ－ＭＳ（質量分析／液体クロマトグラフィー－質量分析）定量を、単一の反応容器内のワンステップアッセイで組み合わせる。この改善された方法は、ｍＲＮＡのキャッピング効率を評価するための信頼性が高く、迅速および効率的な定量的アプローチである。本発明は、ｍＲＮＡ製造中の品質管理、および最終治療製品中の活性医薬成分（ＡＰＩ）としてのｍＲＮＡの特性評価に特に有用である。単一の反応容器を用いるワンステップの簡便性により、キャッピング効率の定量を自動化することも可能である。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、部分的には、ｍＲＮＡ転写物の最初の５、６、または７個の５’ヌクレオチドの高効率および正確な酵素による放出に基づいている。これは、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物の第２～第５のヌクレオチド、第３～第６のヌクレオチド、または第４～第７のヌクレオチドとの間にそれぞれｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドを使用して達成され、ｍＲＮＡの最初の５、６、または７個の５’ヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物の残りの部分から放出されるようにヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ）活性を誘導する。これは、オリゴヌクレオチドと第２～第５のヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し、ｍＲＮＡの最初の５’ヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物の残りの部分から放出されるようにヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ）活性を誘導するためのオリゴヌクレオチド上での使用を示す図３に示されている。ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列中の最初の５、６、または７個の５’ヌクレオチドのみを分析することにより、本発明は、ＩＶＴにより合成されたｍＲＮＡ転写物がＣａｐ１構造（例えば、不完全にメチル化されたＣａｐ０構造とは対照的に）を含むかどうかを決定するための高感度の方法を提供する。
【0014】
特に、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ１構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の（ｉ）第２～第５のヌクレオチド、（ｉｉ）第３～第６のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）第４～第７のヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、（ｉ）ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチド、（ｉｉ）最初の６個のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）最初の７個のヌクレオチドをそれぞれ放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ１構造を含むｍＲＮＡ転写物の最初の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）は、同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。本発明の方法は、ｍＲＮＡキャッピング効率を評価するための、信頼性が高く、迅速および効率的な定量的アプローチである。本発明は、ｍＲＮＡ製造中の品質管理、および最終治療製品中の活性医薬成分（ＡＰＩ）としてのｍＲＮＡの特性評価に特に有用である。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ１構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）は同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0016】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ１構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第３～第６ヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の６個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）は同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0017】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルは、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第４～第７のヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをＲＮａｓｅ Ｈと接触させて、ｍＲＮＡの最初の７個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）は、同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態において、工程（ｂ）～（ｄ）は、自動化システムによって実行される。
【0019】
いくつかの実施形態において、分析は、キャップのメチル化状態をさらに決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明による方法は、異なるメチル化状態を含むキャップ構造の相対的存在量を決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、本発明による方法は、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明による方法は、Ｃａｐ ０でキャッピングされたｍＲＮＡ転写物の部分を決定するために使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明による方法は、リボース環の２’または３’ＯＨ基のいずれかにおけるｍ７Ｇのメチル化をさらに含むＣａｐ ０またはＣａｐ Ｇ構造を含んでいるｍＲＮＡ転写物の部分を決定するために使用することができる。
【0020】
いくつかの実施形態において、キャップは転写後に酵素により付加されている。いくつかの実施形態において、キャップは、共転写によりｍＲＮＡに付加されている。
【0021】
工程（ｂ）で使用するのに適したオリゴヌクレオチドは、典型的には約１０～２５（例えば、１４～２１）ヌクレオチド長である。それは、１つまたはそれ以上のＲＮＡヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のＲＮＡヌクレオチド）によって片側または両側に隣接するＤＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、好適なオリゴヌクレオチドは、１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、好適なオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上のＲＮＡヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のＲＮＡヌクレオチド）によって片側または両側に隣接する４つのＤＮＡヌクレオチドを含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、好適なオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、以下の式：５’－［Ｒ］ｎ［Ｄ］４［Ｒ］１－３’
（式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、ｎは１０～２０である）で表され、オリゴヌクレオチドは、約４０％～約６０％のＧＣ含量を有し、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、約５０℃～約６０℃の融解温度を有する。いくつかの実施形態において、融解温度は５２℃～５８℃である。いくつかの実施形態において、ｎは１１～１５である。特定の実施形態において、ＲＮＡヌクレオチドの各々は、２’－Ｏ－メチルリボースを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下の式：５’－［Ｒ］１１［Ｄ］４［Ｒ］１－３’で表され、式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドである。
（式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、ｎは１０～２０である）で表され、オリゴヌクレオチドは、約４０％～約６０％のＧＣ含量を有し、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、約５０℃～約６０℃の融解温度を有する。いくつかの実施形態において、融解温度は５２℃～５８℃である。いくつかの実施形態において、ｎは１１～１５である。特定の実施形態において、ＲＮＡヌクレオチドの各々は、２’－Ｏ－メチルリボースを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下の式：５’－［Ｒ］１１［Ｄ］４［Ｒ］１－３’で表され、式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドである。
【0023】
本発明での使用に特に適していることが見出された例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＣｍＧｍＡｍＵｍＣＴＧＴＣｍＣ－３’［配列番号１］を有し、式中、ｍＵは２’－Ｏ－メチルリボースを有するウリジンを表し；ｍＣは２’－Ｏ－メチルリボースを有するシチジンを表し；ｍＡは２’－Ｏ－メチルリボースを有するアデニンを表し；ｍＧは２’－Ｏ－メチルリボースを有するグアニジンを表し；Ｔはデオキシチミジンを表し；Ｇはデオキシグアニジンを表し、Ｃはデオキシシチジンを表す。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用できる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。配列番号２の５’ＵＴＲを含むＲＮＡ転写物と接触させると、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチドとの間にｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが形成される。ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ Ｈと接触させると、最初の５個の５’ヌクレオチド（および存在する場合には、キャップヌクレオチド）がｍＲＮＡ転写物から放出される。
【化1】
【0024】
いくつかの実施形態において、本方法は、本方法の工程（ａ）で提供されたｍＲＮＡサンプル中において、１００ｐｍｏｌ以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡのインプットを必要とする。
【0025】
いくつかの実施形態において、本方法は、１００μｌ以下の総アッセイ容量を必要とする。
【0026】
いくつかの実施形態において、本方法の工程（ｂ）～（ｃ）は、９０分またはそれ未満で実施される。
【0027】
いくつかの実施形態において、精製工程は、本方法の工程（ａ）～（ｄ）に必要とされない。
【0028】
いくつかの実施形態において、本方法の工程（ｄ）は、ＨＰＬＣ、場合によりＵＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態において、本方法の工程（ｄ）は、質量分析を含む。いくつかの実施形態において、本方法の工程（ｄ）は、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を含む。
【0029】
いくつかの実施形態において、工程（ａ）で提供されるサンプルは、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物の第２の部分を含む。いくつかの実施形態において、工程（ａ）で提供されるサンプルは、ギャップＧ構造を含むｍＲＮＡ転写物の第３の部分を含む。いくつかの実施形態において、工程（ａ）で提供されるサンプルは、キャップ構造を含まないｍＲＮＡ転写物の第４の部分を含む。
【0030】
いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して少なくとも９０％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物の第２の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して１０％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の第３の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して１０％以下である。いくつかの実施形態において、キャップ構造を含まないｍＲＮＡ転写物の第４の部分は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物に対して１０％以下である。いくつかの実施形態において、さらなる処理は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡ転写物の精製および／または封入を含む。いくつかの実施形態において、さらなる処理は、治療用組成物を製造するためのｍＲＮＡ転写物の使用を含む。
【0031】
いくつかの実施形態において、本発明は、治療用ｍＲＮＡを製造する方法であって、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物を使用して治療用ｍＲＮＡを合成すること；（ｉｉ）本発明によるｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法を使用して、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルを分析すること；および（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ中のＣａｐ１構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分が少なくとも９０％である場合、ｍＲＮＡをさらに処理することを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、さらなる処理は、工程（ｉ）で合成された治療用ｍＲＮＡの精製を含む。加えて、または代替として、さらなる処理は、工程（ｉ）で合成された治療用ｍＲＮＡを製剤化することを含み得る。製剤化は、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することを含み得る。
【0032】
とりわけ、本発明は、本明細書に記載の本発明方法を実施するための組成物およびキットをさらに提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＲＮＡのキャッピング効率を定量するためのキットであって、（１）キャッピング効率が定量されるサンプル中のｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域の配列に相補的な適切なオリゴヌクレオチド、（２）ＤＮＡとＲＮＡとの間のアニーリングのための１つまたはそれ以上の試薬、（３）ＲＮＡｓｅ Ｈ、（４）分析を行うための１つまたはそれ以上の試薬（例えば、クロマトグラフィーカラム）、および（５）１つまたはそれ以上の対照サンプルの１つまたはそれ以上を含み、キットを提供する。
【0033】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成することが可能であり、対照サンプルの各々は、（ｉ）５’キャップ構造を含む５個のヌクレオチドの配列、および（ｉｉ）キャップ構造を欠くか、または（ｉ）とは異なるキャップ構造を含む５個のヌクレオチドの配列を、基準を提供するために定義された比率で含む。例えば、対照サンプルは、（ｉ）５’Ｃａｐ １構造を含む５個のヌクレオチドの配列、および（ｉｉ）キャップ構造を欠く５個のヌクレオチドの配列を９：１の比率で含み得る。対照サンプルは、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の第３～第６のヌクレオチド、または第４～第７のヌクレオチドとの間で、それぞれｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成できるオリゴヌクレオチドに対して適宜適合され、すなわち、それぞれ６個または７個のヌクレオチドの配列を含む。
【0034】
いくつかの実施形態において、（５）による１つまたはそれ以上の対照サンプルは、本発明の方法の工程（ｄ）による分析の一部として較正工程で使用される。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の対照サンプルは、本発明の方法の工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルの分析と並行して実行される。いくつかの実施形態において、対照サンプルは、本方法の工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルと１つまたはそれ以上の対照サンプルとを同時に測定するために、本方法の工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルに１つまたはそれ以上の対照サンプルを添加できるように、例えば重水素化または放射性標識などの修飾が施される。
【0035】
いくつかの実施形態において、（５）による対照サンプルは、適宜５、６、または７個のヌクレオチドの配列を含み、そのうちの６０～１００％がＣａｐ１構造を含み、例えば７０～９８％がＣａｐ １、または８０～９５％がＣａｐ １、または９０％がＣａｐ １を含む。いくつかの実施形態において、（５）による対照サンプルは、適宜５、６、または７個のヌクレオチドの配列を含み、そのうちの１～３０％がＣａｐ Ｇ構造を含み、例えば２～２０％がＣａｐ Ｇ、または３～１５％がＣａｐ Ｇ、または１０％がＣａｐ Ｇを含む。いくつかの実施形態において、（５）による対照サンプルは、適宜、５、６、または７個のヌクレオチドの配列を含み、そのうちの１～３０％がＣａｐ ０構造を含み、例えば２～２０％がＣａｐ ０、または３～１５％がＣａｐ ０、または１０％がＣａｐ ０を含む。いくつかの実施形態では、（５）による対照サンプルは、適宜、５、６、または７個のヌクレオチドの配列を含み、そのうちの１～３０％はキャップ構造を含まず、例えば２～２０％はキャップ構造を欠き、または３～１５％はキャップ構造を欠き、または１０％はキャップ構造を欠く。
【0036】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＲＮＡ調製サンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡ調製サンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチド、第３～第６のヌクレオチド、または第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｂ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、（ｉ）ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチド、（ｉｉ）最初の６個のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）最初の７個のヌクレオチドをそれぞれ放出させる工程；および（ｃ）サンプル中の放出されたヌクレオチドを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の相対量を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）が、同じ反応容器中で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0037】
いくつかの実施形態において、本発明は、Ｃａｐ １構造を含む精製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも８０％含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９０％含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９５％含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を９５％超含む。
【0038】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施態様を示しながら、例示のためにのみ与えられており、限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更および修正は、詳細な説明から当技術分野の当業者には明らかになるであろう。
【0039】
図面は説明のためのものであり、決して限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】５’キャップ構造を有さないｍＲＮＡ転写物（Ａ）、Ｃａｐ ０を有するｍＲＮＡ転写物（Ｂ）、およびＣａｐ １構造を有するｍＲＮＡ転写物（Ｃ）を模式的に示す。Ｃａｐ ０およびＣａｐ １構造は、リボース環の２’または３’ＯＨ基のいずれかにおけるｍ７Ｇのメチル化をさらに含んでいてもよい（図示せず）。
【図2】酵素によるキャッピングプロセスを概略的に示す。
【図3】ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物の残りの部分から放出されるようにＲＮＡｓｅ Ｈ活性を誘導するために、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するためにオリゴヌクレオチドがどのように使用されるかを概略的に示す。オリゴヌクレオチドの点線はＤＮＡヌクレオチドを表し；実線はＲＮＡヌクレオチドを表す。
【0041】
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書を通して規定される。
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を最初に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書を通して規定される。
【0042】
約：本出願で使用される場合、用語「約」および「およそ」は等価物として使用される。本出願で使用される「約」／「およそ」を伴う、または伴わない数値は、関連技術分野における当業者によって理解されるあらゆる通常の変動をカバーすることを意味する。典型的には、用語「およそ」または「約」は、記載された基準値の１０％以内（例えば、５％以内）、より典型的には１％以内の値の範囲を指す。
【0043】
親和性：当技術分野で知られているように、「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーに結合する（例えば、非共有結合的に会合する）稠度、および／またはそのパートナーから解離する速度もしくは頻度の尺度である。当技術分野で知られているように、親和性を決定するために、様々な技術のいずれかを利用することができる。多くの実施形態において、親和性は特異的結合の尺度を表す。
【0044】
アニールまたはハイブリダイゼーション：本明細書で使用される場合、用語「アニール」、「ハイブリダイゼーション」、および文法的な等価物は、ワトソン－クリック塩基対形成または非カノニカルな塩基対形成を介して複合体を形成するのに十分に相補性的であるヌクレオチド配列間の複合体（二重鎖またはハイブリッドとも呼ばれる）の形成を指す。アニーリングまたはハイブリダイズする配列は、安定なハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことは理解されよう。多くの状況において、安定なハイブリッドは、約１０％未満の塩基がミスマッチである場合に形成される。したがって、本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、特定の条件下でその相補体と安定な二重鎖を形成する核酸分子を指し、一般的には約９０％以上の相同性（例えば、約９５％以上、約９８％以上、または約９９％以上の相同性）が存在する。当技術分野の当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズする一方で、相補性が低い配列はハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定および調整する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 １９８９，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪを参照されたい。２つの核酸分子間の相補性は、核酸のすべての塩基が一致する場合、「完全」、「全」または「完全」と言われ、そうでない場合は「部分的」と言われる。
【0045】
Ｃａｐ １：本明細書で使用される場合、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、グアニンキャップのＮ７アミンの少なくとも両方がメチル化され、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列中の第１のヌクレオチドがリボースの２’ＯＨでメチル化されているキャップ構造を含むＲＮＡ転写物を指す。Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらなる修飾を含んでいてもよい。例えば、キャップリボースの２’または３’ＯＨ基はメチル化される場合がある。別の例として、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列中の第２のヌクレオチドの２’ＯＨがメチル化される場合がある。
【0046】
Ｃａｐ ０：本明細書で使用される場合、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、グアニンキャップのＮ７アミンがメチル化されているが、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列中の第１のヌクレオチドがリボースの２’ＯＨでメチル化されていないキャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物を指す。Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらなる修飾を含んでいてもよい。例えば、キャップリボースの２’または３’ＯＨ基がメチル化される場合がある。
【0047】
クロマトグラフィー：本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物を分離するための技術を指す。典型的には、混合物は「移動相」と呼ばれる流体に溶解され、移動相は「固定相」と呼ばれる別の物質を保持する構造体を通過してこれを保持する。カラムクロマトグラフィーは、固定相がチューブ、すなわちカラム内にある分離技術である。
【0048】
対照：本明細書で使用される場合、「対照」という用語は、結果が比較される基準であるという当技術分野で理解されている意味を有する。典型的には、対照は、実験において、変数を分離することによって完全性を増強し、そのような変数について結論を出すために使用される。いくつかの実施形態において、対照は、比較対象を提供するために、試験反応またはアッセイと同時に行われる反応またはアッセイである。ある実験では、「試験」（すなわち、試験される変数）が適用される。第２の実験では、試験される変数である「対照」は適用されない。いくつかの実施形態において、対照は歴史的対照（すなわち、以前に実施された試験もしくはアッセイのもの、または以前に知られている量もしくは結果）である。いくつかの実施形態において、対照は、印刷された記録または他の方法で保存された記録であるか、またはそれらを含む。対照は陽性対照または陰性対照であってもよい。
【0049】
キット：本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、物質を送達するための任意の送達システムを指す。このような送達システムは、様々な診断または治療試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、抗体、酵素など）および／または補助材料（例えば、緩衝剤、アッセイを実施するための説明書など）をある場所から別の場所に保管、輸送、または送達することを可能にするシステムを含み得る。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助材料を含む１つまたはそれ以上の筐体（例えば、箱）を含む。本明細書で使用される場合、「断片化キット」という用語は、各々がキット全成分の一部を含む２つまたはそれ以上の別々の容器を含む送達システムを指す。容器は一緒に、または別々に意図された受領者に送達される。例えば、第１の容器はアッセイに使用する酵素を含み得、第２の容器はオリゴヌクレオチドを含み得る。「断片化キット」という用語は、連邦食品医薬品化粧品法第５２０条（ｅ）で規制されている分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することを意図しているが、これに限定されるものではない。実際、２つまたはそれ以上の別々の容器を含み、各容器がキットの全成分の一部を含む送達システムは、「断片化キット」という用語に含まれる。対照的に、「複合キット」は、単一の容器（例えば、所望の成分をそれぞれ収容する単一の箱）内に全成分を含む送達システムを指す。「キット」という用語は、断片化キットおよび複合化キットの両方を含む。
【0050】
ヌクレオシド：「ヌクレオシド」または「核酸塩基」という用語は、本明細書で使用される場合、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）、ウラシル（「Ｕ」）、チミン（「Ｔ」）、および炭水化物と連結したそれらのアナログ、例えば炭水化物のアノマー炭素（炭水化物の１’－炭素原子）と核酸塩基との間のＮ－グリコシド結合を介するＤ－リボース（ＲＮＡにおいて）または２’－デオキシ－Ｄ－リボース（ＤＮＡにおいて）を指す。核酸塩基がプリン、例えばＡまたはＧの場合、リボース糖は一般的にプリン複素環のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン、例えば、Ｃ、ＴまたはＵの場合、糖は一般的に複素環のＮ１位に結合している。炭水化物は置換されている場合もあるし置換されない場合もある。置換リボース糖には、炭素原子の１つまたはそれ以上、例えば２’－炭素原子が、同一または異なるＣｌ、Ｆ、－－Ｒ、－－ＯＲ、－－ＮＲ２またはハロゲン基の１つまたはそれ以上で置換されたものが含まれるが、これらに限定されず、ここで各Ｒは独立してＨ、Ｃ１－Ｃ６アルキルまたはＣ５－Ｃ１４アリールである。リボースの例としては、リボース、２’－デオキシリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－ハロリボース、２’－フルオロリボース、２’－クロロリボース、および２’－アルキリボース、例えば、２’－Ｏ－メチル、４’－α－アノマーヌクレオチド、１’－α－アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅら、ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，１９：４０６７－７４ ［１９９１］）、２’－４’－および３’－４’－結合および他の「ロック」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾（国際公開第９８／２２４８９号；国際公開第９８／３９３５２号；国際公開第９９／１４２２６号）が挙げられる。
【0051】
ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、モノマー単位として、またはポリヌクレオチドポリマー内の、リン酸化形態（ヌクレオシドのリン酸エステル）のヌクレオシドを意味する。「ヌクレオチド５’－三リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、リボース糖の構造的特徴を特に指摘するために、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と表記されることもある。三リン酸エステル基は、例えば、α－チオ－ヌクレオチド５’－三リン酸のような種々の酸素部分のための硫黄置換を含んでもよい。ヌクレオチドは、モノ－、ジ－またはトリ－リン酸化形態で存在し得る。ヌクレオチドに存在するリボースの炭素原子は、塩基の骨格番号と区別するために大文字（’）で指定される。ポリヌクレオチドおよび核酸化学の総説については、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと。
【0052】
核酸：「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにその組合せなどのヌクレオチドモノマーまたはそのアナログのポリマーを指す。ヌクレオチドは、ゲノム由来、合成由来、または半合成由来のいずれであってもよい。特に断りのない限り、用語は、合成骨格を有する核酸様構造ならびに増幅産物を包含する。当技術分野の当業者には理解されるように、これらのポリマーの長さ（すなわち、含まれるヌクレオチドの数）は、しばしばその意図される機能または用途に依存して、広く変化し得る。ポリヌクレオチドは、直鎖状、分岐直鎖状、または環状分子であり得る。ポリヌクレオチドはまた、Ｈ＋、ＮＨ４
＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ＋、Ｎａ＋などの関連対イオンを有する。ポリヌクレオチドは、全体がデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、全体がリボヌクレオチドで構成されていてもよく、またはそれらのキメラ混合物で構成される場合がある。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間核酸塩基および糖アナログから構成されている場合もある。
【0053】
オリゴヌクレオチド：いくつかの実施形態において、用語「オリゴヌクレオチド」は、約５～約１５０ヌクレオチド、例えば、約１０～約１００ヌクレオチド、約１５～約７５ヌクレオチド、または約１５～約５０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを示すために本明細書で使用される。本発明の文脈において、オリゴヌクレオチドは、典型的には、約１０～２５ヌクレオチド（例えば、１４～２１ヌクレオチド）を含む。本明細書を通して、オリゴヌクレオチドが文字の配列（例えば、４つの塩基文字：Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴから選択され、これらはそれぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、およびチミジンを示す）で表される場合はいつでも、ヌクレオチドは、左から右へ５’から３’の順序で示される。「ポリヌクレオチド配列」は、ポリマーに沿ったヌクレオチドモノマーの配列を指す。他に示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に５’から３’の配向であることは理解されよう。
【0054】
ヌクレオチドアナログ：核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、標準ヌクレオチド塩基で構成されるか、またはヌクレオチドアイソフォームアナログで置換されていてもよく、これにはｉｓｏ－Ｃ塩基およびｉｓｏ－Ｇ塩基が含まれるが、これらに限定されず、これは標準塩基よりも許容性が高いまたは低いハイブリダイゼーションが可能であり、相補的なアイソフォームアナログ塩基と優先的にハイブリダイゼーションする。このようなアイソフォーム塩基の多くは、例えば、Ｂｅｎｎｅｒら、（１９８７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌに記載されている。天然に存在するヌクレオチドモノマーのアナログとしては、例えば、７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザ－８－アザアデニン、７－メチルグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、 １１７：１２０１－１２０９ ［１９９５］）、ニトロインドール、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードウリジン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５－プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第６，１４７，１９９号）、７－デアザグアニン（Ｓｅｅｌａ、米国特許第５，９９０，３０３号）、２－アザプリン（Ｓｅｅｌａ、国際公開第０１／１６１４９号）、２－チオピリミジン、６－チオグアニン、４－チオチミン、４－チオウラシル、０－６－メチルグアニン、Ｎ－６－メチルアデニン、Ｏ－４－メチルチミン、５，６－ジヒドロチミン、５，６－ジヒドロウラシル、４－メチルインドール、ピラゾロ［３，４－Ｄ］ピリミジン、「ＰＰＧ」（Ｍｅｙｅｒ、米国特許第６，１４３，８７７号および第６，１２７，１２１号；Ｇａｌｌ、国際公開第０１／３８５８４号）、およびエテノアデニン（Ｆａｓｍａｎ （１９８９） ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５－３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）が挙げられる。
【0055】
５’末端／３’末端：用語「３’末端（ｅｎｄ）」および「３’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、核酸分子に関して本明細書で使用される場合、末端ペントース糖の３’炭素に結合した遊離ヒドロキシル基を含む核酸の末端を指す。「５’末端（ｅｎｄ）」および「５’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、核酸分子に関して本明細書で使用される場合、末端ペントース糖の５’炭素に結合した遊離ヒドロキシル基またはリン酸基を含む核酸分子の末端を指す。ｍＲＮＡ転写物中のヌクレオチド数に言及する場合、特に断りのない限り、キャップヌクレオチドはカウントしない。例えば、第１の５’ヌクレオチドは、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物において、末端ペントース糖の５’炭素に結合した遊離ヒドロキシル基またはリン酸基を含む最５’末端のヌクレオチド、またはキャッピングされたｍＲＮＡ転写物において、末端ペントース糖の５’炭素に結合したキャップ構造を含む最５’末端のヌクレオチドを指す。
【発明を実施するための形態】
【0056】
本発明は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のキャップ効率を定量する改善された方法を提供する。
【0057】
本方法は、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを酵素により放出することに基づく。放出された最初の５、６、または７個のヌクレオチドは、ｍＲＮＡサンプルをｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の（ｉ）第２～第５のヌクレオチド、（ｉｉ）第３～第６のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）第４～第７のヌクレオチドとの間で、それぞれｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し、サンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させることによって生成される。サンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定する。
【0058】
ヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、効率的に翻訳される。対照的に、Ｃａｐ ＧまたはＣａｐ ０キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物、またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物は、Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物ほど効率的には翻訳されない。ｍＲＮＡのキャッピングが共転写により行われるにせよ、転写後に酵素により行われるにせよ、ｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部はＣａｐ １構造を含まない。したがって、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルにおけるキャッピング効率は、下流での使用に先立って決定されることが重要である。例えば、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルは、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物も含み得る。いくつかの実施形態において、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルは、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の一部も含む。いくつかの実施形態において、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルは、キャップ構造を含まないｍＲＮＡ転写物の一部も含む。
【0059】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物の、異なるキャップ（例えば、Ｃａｐ ０またはＣａｐ Ｇ）を含むｍＲＮＡ転写物に対する相対的存在量を決定する。いくつかの実施形態において、分析は、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物の相対的存在量を決定し得る。いくつかの実施形態において、分析は、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物の相対的存在量を決定し得る。いくつかの実施形態において、分析は、キャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物の相対的存在量を決定し得る。
【0060】
本発明者らは、ｍＲＮＡ転写物の最初の５個の５’ヌクレオチドの酵素による放出が、Ｃａｐ ０またはＣａｐ Ｇを含むｍＲＮＡ転写物に対する、Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物の相対的存在量を決定する上で特に有用であることを見出した。これは、図３に図示されているように、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し、ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物の残りの部分から放出されるようにヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈ）活性を誘導するように、オリゴヌクレオチドを使用して達成される。ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列中の最初の５個の５’ヌクレオチドのみを分析することによって、本発明者らは、ＩＶＴによって合成されたｍＲＮＡ転写物がＣａｐ １構造を（例えば、不完全にメチル化されたＣａｐ ０構造とは対照的に）含むかどうかを決定するための高感度の方法を提供することができた。
【0061】
特定の実施形態において、本発明の方法は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ転写物のメチル化プロファイルを決定する。
【0062】
本発明の方法は、迅速、確実および効率的にキャッピング効率を決定し、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ転写物の大部分がＣａｐ １構造を含み、したがって、例えば、抗原をコードするｍＲＮＡによるワクチン接種などの治療用途、または遺伝子変異の結果としてのタンパク質の機能的な欠損または非存在に起因して、ｍＲＮＡが対象において欠損しているタンパク質をコードするタンパク質欠損の治療用途の文脈において、ｍＲＮＡコード化タンパク質を効率的に発現させるのに適しているかどうかを評価することができる。
【0063】
ｍＲＮＡキャッピング
典型的には、真核生物のｍＲＮＡは、その５’－末端に「キャップ」構造を有し、これは翻訳において重要な役割を果たす。例えば、キャップはｍＲＮＡの代謝において極めて重要な役割を果たしており、核におけるＲＮＡ転写物のプロセシングおよび成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡの安定性、およびｍＲＮＡからタンパク質への効率的な翻訳に程度の差こそあれ必要とされる。５’キャップ構造は、真核細胞のｍＲＮおよび真核ウイルスのｍＲＮＡのタンパク質合成の開始ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡのプロセシングおよび安定性に関与している（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，ＣＥＬＬ，９：６４５－６５３ （１９７６）；Ｆｕｒｕｉｃｈｉら ＮＡＴＵＲＥ，２６６：２３５ （１９７７）；ＦＥＤＥＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＩＳＴＳ ＳＯＣＩＥＴＹ ＬＥＴＴＥＲ ９６：１－１１ （１９７８）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ＰＲＯＧ．ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ ｍｏｌ ｂｉｏｌ，３５：１７３－２０７ （１９８８）を参照のこと）。ｍＲＮＡの翻訳開始に必要な機械の構成要素には、特異的キャップ結合タンパク質が含まれる（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，ＣＥＬＬ，４０：２２３－２４ （１９８５）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ＰＲＯＧ．ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ ｍｏｌ ｂｉｏｌ，３５：１７３－２０７ （１９８８）を参照のこと）。ｍＲＮＡのキャップは翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅによって認識される（Ｇｉｎｇｒａｓら、ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．６８：９１３－９６３ （１９９９）；Ｒｈｏａｄｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２７４：３０３３７－３０４０ （１９９９））。５’キャップ構造はまた、５’－エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供し、その欠失はｍＲＮＡの急速な分解をもたらす（例えば、Ｒｏｓｓ，Ｊ．，ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＭＥＤ．５：１－１４ （１９８８）；Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．ら、ＣＥＬＬ，３２：６８１－６９４ （１９８３）を参照のこと）。多くの真核細胞遺伝子および真核ウイルス遺伝子の一次転写物は、これらの転写物のコード領域内の介在配列（イントロン）を除去するためのプロセシングを必要とするため、キャップの利点は、このようなｐｒｅ－ｍＲＮＡの安定化にも及ぶ。
典型的には、真核生物のｍＲＮＡは、その５’－末端に「キャップ」構造を有し、これは翻訳において重要な役割を果たす。例えば、キャップはｍＲＮＡの代謝において極めて重要な役割を果たしており、核におけるＲＮＡ転写物のプロセシングおよび成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡの安定性、およびｍＲＮＡからタンパク質への効率的な翻訳に程度の差こそあれ必要とされる。５’キャップ構造は、真核細胞のｍＲＮおよび真核ウイルスのｍＲＮＡのタンパク質合成の開始ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡのプロセシングおよび安定性に関与している（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，ＣＥＬＬ，９：６４５－６５３ （１９７６）；Ｆｕｒｕｉｃｈｉら ＮＡＴＵＲＥ，２６６：２３５ （１９７７）；ＦＥＤＥＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＢＩＯＬＯＧＩＳＴＳ ＳＯＣＩＥＴＹ ＬＥＴＴＥＲ ９６：１－１１ （１９７８）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ＰＲＯＧ．ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ ｍｏｌ ｂｉｏｌ，３５：１７３－２０７ （１９８８）を参照のこと）。ｍＲＮＡの翻訳開始に必要な機械の構成要素には、特異的キャップ結合タンパク質が含まれる（例えば、Ｓｈａｔｋｉｎ，Ａ．Ｊ．，ＣＥＬＬ，４０：２２３－２４ （１９８５）；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，ＰＲＯＧ．ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ ｍｏｌ ｂｉｏｌ，３５：１７３－２０７ （１９８８）を参照のこと）。ｍＲＮＡのキャップは翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅによって認識される（Ｇｉｎｇｒａｓら、ＡＮＮ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．６８：９１３－９６３ （１９９９）；Ｒｈｏａｄｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２７４：３０３３７－３０４０ （１９９９））。５’キャップ構造はまた、５’－エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を提供し、その欠失はｍＲＮＡの急速な分解をもたらす（例えば、Ｒｏｓｓ，Ｊ．，ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．ＭＥＤ．５：１－１４ （１９８８）；Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．ら、ＣＥＬＬ，３２：６８１－６９４ （１９８３）を参照のこと）。多くの真核細胞遺伝子および真核ウイルス遺伝子の一次転写物は、これらの転写物のコード領域内の介在配列（イントロン）を除去するためのプロセシングを必要とするため、キャップの利点は、このようなｐｒｅ－ｍＲＮＡの安定化にも及ぶ。
【0064】
キャッピングされたＲＮＡは、ウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽翻訳系などの様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、キャッピングされていない転写物よりも効率的に翻訳されることが報告されている（例えば、Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ，Ｋ．ら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，７４：２７３４－２７３８ （１９７７）；Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＮＡＴＵＲＥ，２７９：６９２ （１９７９）を参照のこと）。この効果はまた、一部にはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に存在し得るエクソリボヌクレアーゼならびに他の要因からのＲＮＡの保護によるものであると考えられている。
【0065】
Ｃａｐ １
天然に存在するキャップ構造は、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの５’－末端に三リン酸橋を介して連結される７－メチルグアノシンを含み、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎをもたらし、ここで、Ｎは任意のヌクレオシドである。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、キャップは酵素により付加される。キャップは核内で付加され、グアニリルトランスフェラーゼという酵素によって触媒される。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写開始直後に起こる。キャップヌクレオシドは他のヌクレオチドとは逆向き、すなわちｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｐである。Ｎ７メチルグアノシンを含み、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドのリボースの２’Ｏメチル化を欠損するキャップ構造はＣａｐ ０として知られている。ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列における第１のヌクレオチドのリボースの２’Ｏメチル化は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｍ、すなわちＣａｐ １をもたらす。この２’Ｏメチル化は、「自己」と「非自己」のＲＮＡを区別するために重要であり、したがってｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めるために重要である（例えば、Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ，４８：４ （２０２０）を参照のこと）。Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物の翻訳効率増加の１つの報告された機構は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドのリボース２’－Ｏメチル化が、翻訳の阻害剤であるＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチドリピートを含むＩＦＮ誘導タンパク質１（ＩＦＮ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ－１））によるｍＲＮＡ転写物の認識を妨げることである（Ａｂｂａｓら、ＰＮＡＳ，１１４：１１ （２０１７），Ｈａｂｊａｎら、ＰＬｏＳ ＰＡＴＨＯＧ，９：１０ （２０１３））。
天然に存在するキャップ構造は、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの５’－末端に三リン酸橋を介して連結される７－メチルグアノシンを含み、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎをもたらし、ここで、Ｎは任意のヌクレオシドである。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、キャップは酵素により付加される。キャップは核内で付加され、グアニリルトランスフェラーゼという酵素によって触媒される。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写開始直後に起こる。キャップヌクレオシドは他のヌクレオチドとは逆向き、すなわちｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｐである。Ｎ７メチルグアノシンを含み、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドのリボースの２’Ｏメチル化を欠損するキャップ構造はＣａｐ ０として知られている。ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列における第１のヌクレオチドのリボースの２’Ｏメチル化は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎｍ、すなわちＣａｐ １をもたらす。この２’Ｏメチル化は、「自己」と「非自己」のＲＮＡを区別するために重要であり、したがってｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めるために重要である（例えば、Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、ＮＵＣ．ａｃｉｄ ｒｅｓ，４８：４ （２０２０）を参照のこと）。Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物の翻訳効率増加の１つの報告された機構は、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドのリボース２’－Ｏメチル化が、翻訳の阻害剤であるＩＦＩＴ１（テトラトリコペプチドリピートを含むＩＦＮ誘導タンパク質１（ＩＦＮ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ－１））によるｍＲＮＡ転写物の認識を妨げることである（Ａｂｂａｓら、ＰＮＡＳ，１１４：１１ （２０１７），Ｈａｂｊａｎら、ＰＬｏＳ ＰＡＴＨＯＧ，９：１０ （２０１３））。
【0066】
キャッピングされたｍＲＮＡの産生
ＲＮＡの転写は、通常、ヌクレオシド三リン酸（通常、プリン、ＡまたはＧ）から始まる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、典型的には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のようなファージＲＮＡポリメラーゼ、ファージポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）ならびにマグネシウム塩を含む緩衝剤を含む。
ＲＮＡの転写は、通常、ヌクレオシド三リン酸（通常、プリン、ＡまたはＧ）から始まる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、典型的には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のようなファージＲＮＡポリメラーゼ、ファージポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰ）ならびにマグネシウム塩を含む緩衝剤を含む。
【0067】
共転写キャッピング
共転写キャッピングは、転写開始剤として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）の形の予め形成されたジヌクレオチドを用いて実施することができる。ＧＴＰ（４：１）に対する過剰なキャップ（例えばｍ７ＧｐｐｐＧ）は、各転写物が５’キャップを持つ機会を増加させる。この比率を変えることで、高い転写収率を達成することと、キャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物の部分を最小限に抑えることのバランスに影響を与えることができる。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、ＩＶＴ ｍＲＮＡのこの種のキャッピング用キットは市販されている。これらのキットでは、典型的には、８０％のキャッピングされたＲＮＡ対２０％のキャッピングされていないＲＮＡが得られるが、転写物の伸長にはＧＴＰが必要であるため、ＧＴＰ濃度が速度制限となり、全ＲＮＡ収量は低くなる。偽対称ジヌクレオチドであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを使用することの欠点は、Ｇまたはｍ７Ｇ部分のいずれかの３’－ＯＨが転写伸長の開始求核剤として機能しやすいことである。言い換えれば、ｍ７ＧとＧの両部位に３’－ＯＨが存在すると、ｍＲＮＡの半分までが不適切な方向にキャップを組み込むことになる。このため、転写反応のイオン条件によって、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（ｐＮ）ｎおよびＧ（５’）ｐｐｐｍ７Ｇ（ｐＮ）ｎの２種類の異性体ＲＮＡがほぼ等しい割合で合成される。異性体の変異はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に悪影響を及ぼし、均質な治療産物には望ましくない。
共転写キャッピングは、転写開始剤として、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）の形の予め形成されたジヌクレオチドを用いて実施することができる。ＧＴＰ（４：１）に対する過剰なキャップ（例えばｍ７ＧｐｐｐＧ）は、各転写物が５’キャップを持つ機会を増加させる。この比率を変えることで、高い転写収率を達成することと、キャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物の部分を最小限に抑えることのバランスに影響を与えることができる。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、ＩＶＴ ｍＲＮＡのこの種のキャッピング用キットは市販されている。これらのキットでは、典型的には、８０％のキャッピングされたＲＮＡ対２０％のキャッピングされていないＲＮＡが得られるが、転写物の伸長にはＧＴＰが必要であるため、ＧＴＰ濃度が速度制限となり、全ＲＮＡ収量は低くなる。偽対称ジヌクレオチドであるｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを使用することの欠点は、Ｇまたはｍ７Ｇ部分のいずれかの３’－ＯＨが転写伸長の開始求核剤として機能しやすいことである。言い換えれば、ｍ７ＧとＧの両部位に３’－ＯＨが存在すると、ｍＲＮＡの半分までが不適切な方向にキャップを組み込むことになる。このため、転写反応のイオン条件によって、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ（ｐＮ）ｎおよびＧ（５’）ｐｐｐｍ７Ｇ（ｐＮ）ｎの２種類の異性体ＲＮＡがほぼ等しい割合で合成される。異性体の変異はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に悪影響を及ぼし、均質な治療産物には望ましくない。
【0068】
この逆キャップ配向を防止するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳実験で使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、一般的に２’または３’ＯＨ基が－ＯＣＨ３で置換された修飾キャップアナログであるＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（「ＡＲＣＡ」）である。リボース環の２’または３’ＯＨ基のいずれかでｍ７Ｇを化学修飾すると、２’ＯＨ基がホスホジエステル結合に関与しないにもかかわらず、キャップは順方向のみに組み込まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ， Ｊら「Ｎｏｖｅｌ ’ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、ＲＮＡ， ９：１１０８－１１２２（２００３））。Ｎ７におけるグアノシンのメチル化、ならびに３’Ｏ－メチル化および５’二リン酸合成の選択的手順は確立されている（Ｋｏｒｅ， Ａ． ａｎｄ Ｐａｒｍａｒ， Ｇ． ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ， ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ， ＡＮＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ， ２５：３３７－３４０，（２００６）およびＫｏｒｅ，Ａ． Ｒ．ら、ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ， ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ， ＡＮＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ２５（３）：３０７－１４，（２００６）。ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、ＡＲＣＡキャップを用いたＩＶＴ ｍＲＮＡのキャッピングキットが市販されている。このようなキットは典型的には、キャップアナログとＧＴＰの比率を４：１にすることを推奨している。キャップアナログとＧＴＰの比率を低下させると、典型的には転写反応の収量は増加するが、キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分は減少する。
【0069】
転写後のキャッピング
ｍＲＮＡは、図２に概略を示す３段階の酵素プロセスで転写後にキャッピングすることもできる。第１の工程において、グアニルトランスフェラーゼは、ＧＴＰを基質として使用し、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの５’末端にグアニンを付加し、Ｃａｐ Ｇ構造を形成する。第２の工程において、Ｎ７メチルトランスフェラーゼはキャップグアニンのＮ７にメチル基を付加し、Ｃａｐ ０構造を形成する。第３の工程において、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、ｍＲＮＡ転写物中のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドのリボースの２’ＯＨにメチル基を付加し、Ｃａｐ １構造を形成する。
ｍＲＮＡは、図２に概略を示す３段階の酵素プロセスで転写後にキャッピングすることもできる。第１の工程において、グアニルトランスフェラーゼは、ＧＴＰを基質として使用し、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドの５’末端にグアニンを付加し、Ｃａｐ Ｇ構造を形成する。第２の工程において、Ｎ７メチルトランスフェラーゼはキャップグアニンのＮ７にメチル基を付加し、Ｃａｐ ０構造を形成する。第３の工程において、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼは、ｍＲＮＡ転写物中のヌクレオチド配列の第１のヌクレオチドのリボースの２’ＯＨにメチル基を付加し、Ｃａｐ １構造を形成する。
【0070】
ｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルが、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分が、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）が同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルが、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分が、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の５個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）が同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0071】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルが、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分が、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第３～第６のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の６個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）が、同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0072】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量する方法であって、以下の工程：（ａ）ｍＲＮＡサンプルを提供する工程であって、ｍＲＮＡサンプルが、ヌクレオチドの配列を含む複数のｍＲＮＡ転写物を含み、ｍＲＮＡ転写物の第１の部分が、ヌクレオチドの配列の第１のヌクレオチドの５’末端にＣａｐ １構造を含む、工程；（ｂ）ｍＲＮＡサンプルを、ｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させて、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ ：ＤＮＡハイブリッドを形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られたサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させて、ｍＲＮＡの最初の７個の５’ヌクレオチドを放出させる工程；および（ｄ）工程（ｃ）で得られたサンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の第１の部分を決定する工程を含み、工程（ａ）～（ｃ）が、同じ反応容器内で互いに連続して進行する、方法を提供する。
【0073】
本発明による方法の１つの利点は、ＩＶＴ反応混合物からのｍＲＮＡサンプルの必要量が少ないことである。これは、一部には工程（ａ）～（ｄ）に追加の工程が必要ないことによる。例えば、本発明の方法では、工程（ａ）～（ｃ）のいずれかの後に精製工程を実施する必要がなく、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に介在工程無しに直接的に進行する。同様に、本発明の方法は、工程（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの後に消化のさらなる工程を実施する必要がなく、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に介在工程無しに直接的に進行する。同様に、本発明の方法は、工程（ｃ）の後にｍＲＮＡ転写物の放出された最初の５、６、または７個の５’ヌクレオチドを濃縮する工程を適宜実施する必要がなく、工程（ｄ）は工程（ｃ）の後に介在工程無しに直接的に進行する。
【0074】
ｍＲＮＡのインプット量
精製、消化、または濃縮の追加の工程がないため、本明細書に開示される方法は高いサンプル効率を有する。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において３０～１１０ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡ、例えば３０～１００ｐｍｏｌ、３０～９０ｐｍｏｌ、３０～８０ｐｍｏｌ、３０～７０ｐｍｏｌ、３０～６０ｐｍｏｌまたは３０～５０ｐｍｏｌのＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とする。例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において１００ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とする。実施例１において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において５５ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とすることが示される。他の利点の中でも、開示される方法により必要とされるインプットｍＲＮＡの量が少ないため、治療用組成物の製剤化における使用など、下流での使用のためにＩＶＴ反応混合物中に残存するｍＲＮＡの量が増加する。
精製、消化、または濃縮の追加の工程がないため、本明細書に開示される方法は高いサンプル効率を有する。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において３０～１１０ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡ、例えば３０～１００ｐｍｏｌ、３０～９０ｐｍｏｌ、３０～８０ｐｍｏｌ、３０～７０ｐｍｏｌ、３０～６０ｐｍｏｌまたは３０～５０ｐｍｏｌのＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とする。例えば、いくつかの実施形態において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において１００ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とする。実施例１において、本方法は、提供されるｍＲＮＡサンプル中において５５ｐｍｏｌ以下のＩＶＴ ｍＲＮＡのインプットを必要とすることが示される。他の利点の中でも、開示される方法により必要とされるインプットｍＲＮＡの量が少ないため、治療用組成物の製剤化における使用など、下流での使用のためにＩＶＴ反応混合物中に残存するｍＲＮＡの量が増加する。
【0075】
アッセイ体積
本発明による方法のさらなる利点は、本方法が必要とする総アッセイ体積が少ないことである。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、５０～１２０μｌ以下、例えば５０～１１０μｌ、５０～１００μｌ、５０～９０μｌ、５０～８０μｌ、５０～７０μｌまたは５０～６０μｌの総アッセイ体積を必要とする。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は１００μｌ以下の総アッセイ体積を必要とする。実施例１では、５２μｌの体積がうまく機能することが見出されている。より少ない反応体積を使用することには、コスト削減、スケールアップの容易さ、および自動化システムへのプロセスの移行の容易さなど、多くの利点がある。
本発明による方法のさらなる利点は、本方法が必要とする総アッセイ体積が少ないことである。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、５０～１２０μｌ以下、例えば５０～１１０μｌ、５０～１００μｌ、５０～９０μｌ、５０～８０μｌ、５０～７０μｌまたは５０～６０μｌの総アッセイ体積を必要とする。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は１００μｌ以下の総アッセイ体積を必要とする。実施例１では、５２μｌの体積がうまく機能することが見出されている。より少ない反応体積を使用することには、コスト削減、スケールアップの容易さ、および自動化システムへのプロセスの移行の容易さなど、多くの利点がある。
【0076】
オリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の（ｉ）第２～第５のヌクレオチド、（ｉｉ）第３～第６のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。特定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、図３に模式的に示されるように、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し得る。したがって、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのＤＮＡ塩基対を含む。
本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の（ｉ）第２～第５のヌクレオチド、（ｉｉ）第３～第６のヌクレオチド、または（ｉｉｉ）第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。特定の実施形態において、本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドは、図３に模式的に示されるように、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し得る。したがって、オリゴヌクレオチドは、少なくとも４つのＤＮＡ塩基対を含む。
【0077】
本発明の方法において使用するオリゴヌクレオチドは、オフターゲット部位とｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成しないように設計されている。オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングによって、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）の切断は確実に１つの部位、すなわち、最初の５個の５’ヌクレオチド、最初の６個の５’ヌクレオチド、または最初の７個の５’オリゴヌクレオチドを適宜放出するように向けられる。例えば、１回のＲＮａｓｅ Ｈ消化工程で最初の５個の５’ヌクレオチドのみを放出させると、高分解能分析、特にキャップヌクレオチドのメチル化状態を決定するのに適した低分子量ｍＲＮＡ配列のサンプルが得られる。
【0078】
本明細書に開示される方法は、ｍＲＮＡ転写物の５’末端で起こる１回の切断イベントを必要とするため、ｍＲＮＡ転写物の残りの部分はインタクトのままであり、ｍＲＮＡ転写物の他の側面、例えば３’テールの長さなどの長さに関する追加情報を収集するために使用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、開示されるキャッピング効率法に使用されるｍＲＮＡサンプルは、ｍＲＮＡ転写物の他の側面、例えば、転写物の長さまたは３’テールの長さを分析するための他の方法において使用し得る。
【0079】
オリゴヌクレオチドの非特異的なアニーリングは、放出されたｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの混合物をより複雑にし、その結果、分析段階での分解能が失われる。したがって、この分解能の損失を最小化するために、例えば、精製工程を使用して望ましくない放出ｍＲＮＡ転写物ヌクレオチドを除去する、または例えば最初の消化工程を使用してｍＲＮＡ転写物を短くすることによってｍＲＮＡ転写物を単純化してオリゴヌクレオチドのオフターゲットハイブリダイゼーションを低減する、などの余分な工程が必要となる。対照的に、本発明は、最初の単純化消化工程、精製工程、および／または新しい反応容器への移送を必要とすることなく、高分解能を達成する。
【0080】
いくつかの実施形態において、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、５’－［Ｒ］ｎ［Ｄ］４［Ｒ］１－３’の構造を有し、式中、各ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、各ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、添え字の数字は各ヌクレオチドの数を表す。ｎは、適切な融解温度（Ｔｍ）およびＧＣ含量（ＧＣ％）を有するオリゴヌクレオチドを提供するように調整し得る。例えば、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡ転写物との間で形成されるｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドには、約５０℃～約６０℃、より典型的には５２℃～５８℃のＴｍが特に望ましい。典型的には、約４０％～約６０％のＧＣ含量が適切である。ｎは１０～２０であり得る。より典型的には、ｎは１１～１５である。
【0081】
本発明者らは、構造：５’－［Ｒ］１１［Ｄ］４［Ｒ］１－３’を有するオリゴヌクレオチドが特に有用であることを見出し、式中、ＲはＲＮＡヌクレオチドであり、ＤはＤＮＡヌクレオチドであり、そして添え字の数字はそれぞれの数を表す。
【0082】
メチル化ＲＮＡヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡとより安定な二重鎖を形成することができる。さらに、メチル化ＲＮＡヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、その後の分析工程中、サンプル中のｍＲＮＡ断片と容易に区別することができる。したがって、典型的な実施形態において、本発明の方法において使用するためのオリゴヌクレオチドのＲＮＡヌクレオチドの各々は、メチル化されており、例えば、各ＲＮＡヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボースを含んでいてもよい。
【0083】
本発明の技術分野の当業者は、異なる５’ＵＴＲ配列が異なるオリゴヌクレオチド配列の使用を必要とすることを理解するであろうし、したがって、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列のそれぞれ第２～第５のヌクレオチド、第３～第６のヌクレオチド、または第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド（キャップヌクレオチドをカウントしない）が形成されるように、５’ＵＴＲまたはｍＲＮＡ転写物への結合のために特異的に適合した任意のヌクレオチド配列を使用することができる。
【0084】
例えば、いくつかの実施形態において、例示的な５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号２］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＡＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ ［配列番号３］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＡＧＡＡＵＡＡＡＣＵＡＧＵＡＵＵＣＵＵＣＵＧＧＵＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣ ［配列番号４］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ ［配列番号５］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＡＧＡＡＡＧＣＵＵＡＣＣ ［配列番号６］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ ［配列番号７］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＡＧＧＧＵＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＡＣＧＧＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＡＵＣＧＧＡＧＧＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ ［配列番号８］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む： ＧＧＧＵＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＡＣＧＧＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＡＵＣＧＧＡＧＧＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ ［配列番号９］。
ＧＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ［配列番号２］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＡＧＡＣＡＧＡＵＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＧＣＵＧＵＵＵＵＧＡＣＣＵＣＣＡＵＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＧＡＵＣＣＡＧＣＣＵＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＧＧＡＡＣＧＣＧＧＡＵＵＣＣＣＣＧＵＧＣＣＡＡＧＡＧＵＧＡＣＵＣＡＣＣＧＵＣＣＵＵＧＡＣＡＣＧ ［配列番号３］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＡＧＡＡＵＡＡＡＣＵＡＧＵＡＵＵＣＵＵＣＵＧＧＵＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣ ［配列番号４］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ ［配列番号５］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＡＧＡＡＡＧＣＵＵＡＣＣ ［配列番号６］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ ［配列番号７］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む：ＡＧＧＧＵＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＡＣＧＧＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＡＵＣＧＧＡＧＧＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ ［配列番号８］。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、以下の配列を含む： ＧＧＧＵＣＡＡＧＡＵＵＡＧＡＧＡＡＣＧＧＵＣＧＵＡＧＣＡＵＵＡＵＣＧＧＡＧＧＵＵＣＵＧＣＣＡＣＣ ［配列番号９］。
【0085】
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１および配列番号１４２２から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号２５～３０および配列番号３１９～３８２から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１～１５１から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、国際公開第２０１４／１６４２５３号の配列番号４２７６～４２８２から選択される配列を含む。
【0086】
例示的オリゴヌクレオチド
本発明の方法において使用するのに適した例示的なオリゴヌクレオチドには、以下が挙げられる：
。下線を引いたヌクレオチドはＤＮＡである。残りのヌクレオチドはＲＮＡである。典型的な実施形態において、ＲＮＡヌクレオチドはメチル化されており、例えば、２’－Ｏ－メチルリボースを含み得る。
本発明の方法において使用するのに適した例示的なオリゴヌクレオチドには、以下が挙げられる：
【化2】
【0087】
本発明での使用に特に適していることが見出された例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ ｍＵｍＣｍＣｍＡｍＧｍＧｍＣｍＧｍＡｍＵｍＣＴＧＴＣｍＣ－３’［配列番号１］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化3】
【0088】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＡｍＵＴＴＣＣｍＣ－３’［配列番号１９］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化4】
【0089】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＵｍＵｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＵｍＡｍＵＴＴＣＣｍＣ－３’［配列番号２０］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化5】
【0090】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣＴＡＧＴｍＵ－３’［配列番号２１］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化6】
【0091】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＧｍＧｍＡｍＣｍＣｍＡｍＧｍＡｍＡｍＧｍＡｍＡｍＵｍＡｍＣＴＡＧＴｍＵ－３’［配列番号２３］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化7】
【0092】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＧｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧＡＣＣＣｍＵ－３’［配列番号２４］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化8】
【0093】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＵｍＣｍＵｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＧＡＣＣＣｍＵ－３’［配列番号２５］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化9】
【0094】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＣｍＧｍＵｍＵｍＣｍＵｍＣｍＵｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵＧＡＣＣｍＣ－３’［配列番号２６］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化10】
【0095】
本発明で使用するための別の例示的なオリゴヌクレオチドは、配列：５’－ｍＣｍＵｍＣｍＵｍＡｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵＧＡＣＣｍＣ－３’［配列番号２７］を有する。このオリゴヌクレオチドは、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡと共に使用することができる：
５’ＵＴＲ中のオリゴヌクレオチド結合部位を太字で示す。
【化11】
【0096】
オリゴヌクレオチド配列において、ｍＵは２’－Ｏ－メチルリボースを有するウリジンを表し；ｍＣは２’－Ｏ－メチルリボースを有するシチジンを表し；ｍＡは２’－Ｏ－メチルリボースを有するアデニンを表し；ｍＧは２’－Ｏ－メチルリボースを有するグアニジンを表し；Ａはデオキシアデニンを表し；Ｔはデオキシチミジンを表し；Ｇはデオキシグアニジンを表し；そしてＣはデオキシシチジンを表す。
【0097】
ヌクレアーゼ
本発明にしたがって、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド基質中のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ鎖の切断を触媒することができるヌクレアーゼを、ｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ分子の非翻訳領域からの第１のヌクレオチドの切断のために使用することができ；このようなヌクレアーゼは非配列特異的である。いくつかの実施形態では、１つのキャッピング効率定量において複数のヌクレアーゼが使用される。
本発明にしたがって、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド基質中のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ鎖の切断を触媒することができるヌクレアーゼを、ｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡ分子の非翻訳領域からの第１のヌクレオチドの切断のために使用することができ；このようなヌクレアーゼは非配列特異的である。いくつかの実施形態では、１つのキャッピング効率定量において複数のヌクレアーゼが使用される。
【0098】
いくつかの実施形態において、好適なヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＨまたはＲＮａｓｅ Ｈ様酵素活性を有する任意の酵素である。いくつかの実施形態において、好適なヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ Ｓ１またはＲＮａｓｅ Ｓ１様酵素活性を有する任意の酵素である。他の実施形態において、好適なヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、ヌクレアーゼＰ１、ホスホジエステル、ＲＮａｓｅ ＡおよびＲＮａｓｅ Ｔ１から選択される。いくつかの実施形態では、複数のヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＳ１ヌクレアーゼが使用される。
【0099】
一実施形態では、ヌクレアーゼはＲＮａｓｅ Ｈである。
【0100】
ＲＮａｓｅ Ｈ
ＲＮａｓｅ Ｈは、２つの異なる系統学的サブタイプ、タイプ１およびタイプ２に分けられるユビキタス酵素ファミリーを形成し、そのいずれかを本発明の特定の実施形態において使用し得る。ＲＮａｓｅ Ｈは、相補的ＤＮＡ一本鎖にハイブリダイズした一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡに結合した後、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解するという共通の能力によって統一されている。ＲＮａｓｅ ＨはＤＮＡの複製および組み換え、ならびに修復に関与しているが、その生理学的役割は完全には解明されていない。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、この酵素は二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡとも結合するが、その親和性はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するよりも低い。この酵素はユビキタスであるため、文献にはいくつかのＲＮａｓｅ Ｈの配列が知られており、それぞれのアミノ酸配列は多少異なっている。米国特許第５，２６８，２８９号は耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈを開示しており、米国特許第５，５００，３７０号も同様である。米国特許第６，３７６，６６１号は、ヒトＲＮａｓｅ Ｈならびにその組成物および用途を開示している。米国特許第６，００１，６５２号はヒト２型ＲＮａｓｅ Ｈを開示している。米国特許第６，０７１，７３４号はＨＢＶポリメラーゼ由来のＲＮａｓｅ Ｈを開示している。これらのＲＮａｓｅ Ｈはすべて、本発明の１つまたはそれ以上の実施形態で使用することができる。
ＲＮａｓｅ Ｈは、２つの異なる系統学的サブタイプ、タイプ１およびタイプ２に分けられるユビキタス酵素ファミリーを形成し、そのいずれかを本発明の特定の実施形態において使用し得る。ＲＮａｓｅ Ｈは、相補的ＤＮＡ一本鎖にハイブリダイズした一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡに結合した後、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解するという共通の能力によって統一されている。ＲＮａｓｅ ＨはＤＮＡの複製および組み換え、ならびに修復に関与しているが、その生理学的役割は完全には解明されていない。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、この酵素は二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡとも結合するが、その親和性はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するよりも低い。この酵素はユビキタスであるため、文献にはいくつかのＲＮａｓｅ Ｈの配列が知られており、それぞれのアミノ酸配列は多少異なっている。米国特許第５，２６８，２８９号は耐熱性ＲＮａｓｅ Ｈを開示しており、米国特許第５，５００，３７０号も同様である。米国特許第６，３７６，６６１号は、ヒトＲＮａｓｅ Ｈならびにその組成物および用途を開示している。米国特許第６，００１，６５２号はヒト２型ＲＮａｓｅ Ｈを開示している。米国特許第６，０７１，７３４号はＨＢＶポリメラーゼ由来のＲＮａｓｅ Ｈを開示している。これらのＲＮａｓｅ Ｈはすべて、本発明の１つまたはそれ以上の実施形態で使用することができる。
【0101】
アッセイ実行時間
本発明による方法のもう１つの利点は、反応工程が完了までにかかる時間が短いことである。したがって、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡサンプルをオリゴヌクレオチドと接触させる工程、およびサンプルをヌクレアーゼ（例えばＲ、Ｎａｓｅ Ｈ）と接触させてｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを放出させる工程の完了は、９０分未満で完了する。いくつかの実施形態では、工程は、４０～１００分、４５～９０分、５０～８０分、５５～７０分、または６０～７０分で実施される。
本発明による方法のもう１つの利点は、反応工程が完了までにかかる時間が短いことである。したがって、いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡサンプルをオリゴヌクレオチドと接触させる工程、およびサンプルをヌクレアーゼ（例えばＲ、Ｎａｓｅ Ｈ）と接触させてｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを放出させる工程の完了は、９０分未満で完了する。いくつかの実施形態では、工程は、４０～１００分、４５～９０分、５０～８０分、５５～７０分、または６０～７０分で実施される。
【0102】
実施例１に例示されるように、ｍＲＮＡサンプルをオリゴヌクレオチドと接触させる工程、およびサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させてｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを放出させる工程は、６０分で実施される。したがって、本発明の特定の実施形態において、ｍＲＮＡサンプルをオリゴヌクレオチドと接触させ、次いでそのサンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させる工程は、完了するのに６０分以下、または６５分以下を必要とする。
【0103】
自動化
本発明による方法の１つの利点は、ｍＲＮＡサンプルをｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させる工程、サンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させる工程、およびサンプルを分析してＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定する工程を、自動化システム上で実施できることである。自動化により、本明細書に開示される方法の時間効率をさらに向上させることができる。自動化はまた、本明細書に開示されるキャッピング効率を決定するための方法のスケールアップにも利点を有する。いくつかの実施形態において、自動化は、自動液体処理システムの使用を含む。特定の実施形態において、自動液体処理システムは、一度に約１００サンプルを処理する。例えば、特定の実施形態において、自動液体処理システムは、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）との使用に適合される。市販の液体処理システムとしては、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＶＡＮＴＡＧＥ １．３、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＮＩＭＢＵＳ９６またはＭｉｃｒｏｌａｂ Ｐｒｅｐ（すべてＨａｍｉｌｔｏｎ）が挙げられる。同様のシステムはＴｅｃａｎからも入手可能である（例えば、Ｔｅｃａｎ ＦｌｕｅｎｔまたはＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ液体処理プラットフォーム）。その他の自動液体処理器は当業者には公知である。
本発明による方法の１つの利点は、ｍＲＮＡサンプルをｍＲＮＡ転写物に相補的なオリゴヌクレオチドと接触させる工程、サンプルをヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）と接触させる工程、およびサンプルを分析してＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定する工程を、自動化システム上で実施できることである。自動化により、本明細書に開示される方法の時間効率をさらに向上させることができる。自動化はまた、本明細書に開示されるキャッピング効率を決定するための方法のスケールアップにも利点を有する。いくつかの実施形態において、自動化は、自動液体処理システムの使用を含む。特定の実施形態において、自動液体処理システムは、一度に約１００サンプルを処理する。例えば、特定の実施形態において、自動液体処理システムは、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）との使用に適合される。市販の液体処理システムとしては、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＶＡＮＴＡＧＥ １．３、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＮＩＭＢＵＳ９６またはＭｉｃｒｏｌａｂ Ｐｒｅｐ（すべてＨａｍｉｌｔｏｎ）が挙げられる。同様のシステムはＴｅｃａｎからも入手可能である（例えば、Ｔｅｃａｎ ＦｌｕｅｎｔまたはＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ液体処理プラットフォーム）。その他の自動液体処理器は当業者には公知である。
【0104】
クロマトグラフィー分離
ヌクレアーゼ処理した（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ処理した）サンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定する。典型的な実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーを利用して、Ｃａｐ１を含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを、Ｃａｐ ０および／またはＣａｐ Ｇを含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチド、および／またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチドから分離する。
ヌクレアーゼ処理した（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ処理した）サンプルを分析して、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定する。典型的な実施形態において、本発明は、クロマトグラフィーを利用して、Ｃａｐ１を含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを、Ｃａｐ ０および／またはＣａｐ Ｇを含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチド、および／またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドに対応するヌクレオチドから分離する。
【0105】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを含むｍＲＮＡサンプルは、薄層クロマトグラフィー（「ＴＬＣ」）に供することができる。
【0106】
特定の実施形態では、工程（ｄ）による分析は、工程（ｃ）で得られたサンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析することを含む。本明細書で使用される用語「ＨＰＬＣ」は、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）にも関する。
【0107】
具体的な実施形態において、本発明による方法は、工程（ｄ）で実施される分析のためにＵＨＰＬＣを使用する。ＵＨＰＬＣは通常、２μｍより小さい粒子（例えば、１．７μｍ）を充填したカラムを使用する。ＵＨＰＬＣシステムは通常、６０００ｐｓｉより高い圧力（例えば、最大１５０００ｐｓｉ）を採用し、その結果、高速化のために高い流速が得られる。小さな粒径との組合せにより、ＵＨＰＬＣは従来のＨＰＬＣシステムに比べて優れた分離能および感度を提供する（例えば、Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｅ．「Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＬＣ）：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＳＣＩＥＮＣＥ ＲＥＤＥＦＩＮＥＤ（２００５）を参照）。
【0108】
ＨＰＬＣは、使用されるカラムに応じて、サンプル分離の異なる方法を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、適切なクロマトグラフィーカラムは、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、逆相ＨＰＬＣカラム、疎水性相互作用カラム、サイズ排除カラム、またはその組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において、逆相ＨＰＬＣカラム、例えば逆相ＵＨＰＬＣカラムが使用される。特定の実施形態において、工程（ｄ）による分析は、工程（ｃ）で得られたサンプルをＣ１８逆相ＵＨＰＬＣカラムで分析することを含む。本発明者らは、Ｃ１８ ２．１×１００ｍｍカラムが特に有用であることを見出した。いくつかの実施形態において、サンプルを加熱する（例えば、約５０℃まで）か、またはサンプルを加熱したクロマトグラフィーカラムにアプライすることが望ましい場合がある。
【0109】
当技術分野の当業者には公知のように、イオン交換体（例えば、陰イオン交換体および／または陽イオン交換体）は、マトリックスならびに付着した荷電基に関して、様々な材料をベースとしていてもよい。例えば、以下のマトリックス：アガロースベースのマトリックス（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＣＬ－６Ｂ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、セルロースベースのマトリクス（例えば、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ（登録商標））、デキストランベースのマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標））、シリカベースのマトリックスおよび合成ポリマーベースのマトリックスを使用することができ、言及した材料は多かれ少なかれ架橋される場合がある。
【0110】
イオン交換樹脂は、公知の方法にしたがって調製することができる。典型的には、樹脂を対イオンに結合させる平衡化緩衝剤を、サンプルを樹脂に充填する前にイオン交換樹脂に通すことができる。好都合なことに、平衡化緩衝剤は、充填緩衝剤と同じであり得るが、これは必須ではない。一実施形態において、イオン交換樹脂は、カラムを再使用できるように、サンプルの溶出後に再生緩衝剤で再生することができる。一般的に、再生緩衝剤の塩濃度および／またはｐＨは、実質的にすべての汚染物質および残りのすべてのサンプルがイオン交換樹脂から溶出されるようなものとすることができる。一般的に、再生緩衝剤は、イオン交換樹脂から汚染物質およびヌクレオチドを溶出するために非常に高い塩濃度を有する。
【0111】
いくつかの実施形態において、工程（ｃ）で得られたサンプルは、工程（ｄ）による分析のために陰イオン交換クロマトグラフィーに供される。ヌクレオチドの高分解能分析は、Ａｕｓｓｅｒ， Ｗ．Ａ．ら、「Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ＨＰＬＣ」、ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ， １９：１３６－１３９（１９９５）に記載されているように実施することができる。陰イオン交換樹脂の場合、マトリックスに共有結合している荷電基は、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）、および／または第４級アンモニウム（Ｑ）であり得る。いくつかの実施形態において、使用される陰イオン交換樹脂は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムである。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ、ＤＥＡＥ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ Ｇｉｇａｃａｐ（登録商標）Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル、第４級アンモニア樹脂）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）Ｑ、Ｎｕｖｉａ（商標）Ｑ、またはＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑを使用して実施することができる。他の陰イオン交換体としては、第４級アミノ樹脂または「Ｑ－樹脂」（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）－Ｑ、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、ジエチルアミノエタン樹脂（例えばＤＥＡＥ－Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ（登録商標）、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルＳｅｐｈａｃｅｌ（登録商標））；Ａｍｂｅｒｊｅｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ－６７、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）強塩基性、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）弱塩基性）、コレスチラミン樹脂、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＳＡＸ－１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＡＸ－１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）ＷＣＸ－１０）；ＴＳＫ－ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ－５ＰＷ）；およびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）樹脂が挙げられる。
【0112】
陰イオン交換クロマトグラフィーの典型的な移動相には、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、およびイソプロパノールなどの有機アルコール、または２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む溶液などの極性溶液が含まれる。したがって、特定の実施形態において、移動相は、約０％、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の極性溶液を含む。特定の実施形態において、移動相は、分離の過程の任意の時点で、約１％～約１００％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約２０％～約８０％、約３０％～約７０％、または約４０％～約６０％の極性溶液を含む。
【0113】
一般的に、キャッピングされていないｍＲＮＡは、強陰イオン交換カラムの固定されたプラス電荷に吸着し、所定の流速で移動相を用いてイオン強度を増加させる勾配により、正電荷を有するカラムとのイオン相互作用の強さに比例して、カラムからキャッピングされた種（キャップが正電荷を有する）が溶出される。キャップ構造を欠く、より負に荷電した（より酸性の）ｍＲＮＡヌクレオチドは、負の荷電が低い（酸性度が低い）キャップ種よりも後に溶出する。
【0114】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）による分析は、工程（ｃ）で得られたものを陽イオン交換クロマトグラフィー、例えばスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーに供することを含む。他の陽イオンクロマトグラフィー膜または樹脂、例えば、ＭＵＳＴＡＮＧ（商標）Ｓ膜、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）樹脂、またはＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）樹脂を使用することができる。
【0115】
いくつかの実施形態では、工程（ｄ）による分析は、工程（ｃ）で得られたものを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供することを含む。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、極性または非極性環境に対する所与の分子の吸引力を利用し、核酸に関しては、この傾向は、ヌクレオチドおよびその修飾の疎水性または親水性によって支配される。したがって、核酸は、疎水性マトリックス、典型的には鎖長が炭素数２～１８のアルキルリンカーアームを有する不活性支持体に対するそれらの様々な吸引度に基づいて分画される。固定相は、親水性ポリマー骨格（例えば、架橋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、デキストラン、またはアガロース）に結合した小さい非極性基（ブチル、オクチル、またはフェニル）を含む。いくつかの実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーはフェニルクロマトグラフィーを含む。他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチルクロマトグラフィーまたはオクチルクロマトグラフィーを含む。
【0116】
いくつかの実施形態において、工程（ｄ）による分析は、工程（ｃ）で得られたものを逆相ＨＰＬＣに供することを含む。逆相ＨＰＬＣは、非極性固定相および中極性移動相を含む。いくつかの実施形態において、固定相は、例えばＲＭｅ２ＳｉＣｌで処理されたシリカであり、ここで、ＲはＣ１８Ｈ３７またはＣ８Ｈ１７のような直鎖アルキル基である。そのため、天然でより非極性である分子は保持時間が長くなり、極性分子がより容易に溶出することが可能になる。保持時間は、移動相に極性溶媒を添加すると増加し、より疎水性の溶媒の添加によって減少する。他の変更可能なパラメータとしては移動相の流速および温度も挙げられる。分析物としての特定のＲＮＡ分子の特性は、その保持特性に重要な役割を果たすことがある。一般的に、非極性官能基（例えば、メチル基）をより多く有する分析物は、分子の疎水性が増すため、保持時間が長くなる。本発明の実施形態で使用するために適合され得る、逆相－ＨＰＬＣを使用したＲＮＡ種の高分離のための手順は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第８，３８３，３４０号明細書；Ｇｉｌａｒ，Ｍ．「Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、ＡＮＡＬ． ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９８：１９６－２０６（２００１））。いくつかの実施形態において、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）緩衝剤は、キャップを含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドの分離および特徴付けのためのＵＶ検出に使用される。
【0117】
いくつかの実施形態において、本方法の工程（ｄ）による分析は、本明細書に開示される１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー分離法の組合せを利用する。例えば、本発明の特定の実施形態では、逆相イオンペアクロマトグラフィーを利用することができ、これにより、疎水性および分子と結合した陰イオンの数の両方に基づいて分離が行われる。マトリックスは、シリカベースであり得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、ＡＮＡＬ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１８：１７７－１８４（１９９４））。非多孔性で不活性なポリマー樹脂を、特定の実施形態において使用し得る（例えば、Ｈｕｂｅｒ， Ｃ．Ｇ．「Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｎｏｎｐｏｒｏｕｓ ａｌｋｙｌａｔｅｄ ｓｔｙｒｅｎｅ－ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」、ＡＮＡＬ． ＢＩＯＣＨＥＭ：３５１－３５８（１９９３）を参照のこと）。
【0118】
特定の実施形態において、工程（ｄ）による分析は、質量分析（「ＭＳ」）と組み合わせたクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、特にＵＨＰＬＣ）を含み得る。適切なＬＣ－ＭＳ法は当技術分野で公知である。そのような方法は、典型的には、ＭＳ検出に適合する水性トリエチルアミン－ヘキサフルオロイソプロパノール（ＴＥＡ ＨＦＩＰ）緩衝剤を使用する（Ａｐｆｆｅｌ， Ａ．ら、「Ｎｅｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＨＰＬＣ－ＥＳＩ ＭＳ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ａ， ７７７：３－２１（１９９７））。例えば、最適化されたＴＥＡ－ＨＦＩＰ移動相を、キャップを含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドのＬＣ－ＭＳ分離および特性評価のために使用し得る。特定の実施形態において、水性緩衝剤は、ｐＨ８．３で１００ｍＭ ＨＦＩＰおよび８． ６ｍＭのＴＥＡを含む。具体的な実施形態において、１００ｍＭ ＨＦＩＰ／８．６ｍＭ ＴＥＡ、ｐＨ８．３の水溶液を最大５０％のメタノールと組み合わせて含む移動相が、本発明による方法において使用される。あるいは、トリエチル炭酸水素アンモニウム移動相を、溶出液へのカラム後のアセトニトリル添加を伴うオリゴヌクレオチド分離に使用してもよい。イオンペアリング緩衝剤は、最良のＭＳ検出感度を与えるように選択することができる。特定の実施形態において、工程（ｄ）による分析は、タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせたクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）を含み得る。本発明者らは、超高速液体クロマトグラフィー－四重極飛行時間質量分析（ＵＨＰＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ）が、本発明の工程（ｄ）による分析の特に好適な方法であることを見出した。したがって、特定の実施形態において、本発明による方法は、超高速液体クロマトグラフィー－四重極飛行時間型質量分析（ＵＨＰＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ）を使用して、工程（ｄ）の分析を実施する。
【0119】
いくつかの実施形態において、ＭＳまたはＬＣ－ＭＳによる工程（ｄ）によるサンプルの分析は、２００～６０００ｍ／ｚ、または２５０～５０００ｍ／ｚ、または３００～４０００ｍ／ｚのスキャン範囲にわたる分析を含む。特定の実施形態において、ＭＳまたはＬＣ－ＭＳによる工程（ｄ）によるサンプルの分析は、４００～３２００ｍ／ｚのスキャン範囲にわたる分析を含む。
【0120】
メチル化プロファイル
特定の実施形態において、キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、メチル化プロファイルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、「メチル化プロファイル」は、移動相のカラムへの添加後の一時点においてクロマトグラフィーカラムから溶出する、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドの量に対応する値のセットを指す。上述したように、天然でより非極性であるメチル化キャップおよび最後から２番目のヌクレオチドの保持時間は、より容易に溶出する極性分子に対して増加する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）で放出される最初の５、６、または７個のヌクレオチドの保持時間は、工程（ｄ）で実施されるクロマトグラフィー分析工程の間に使用される移動相への極性溶媒の添加によって増加し得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）で放出される最初の５、６、または７個のヌクレオチドの保持時間は、工程（ｄ）で実施されるクロマトグラフィー分析工程の間に使用される移動相への疎水性溶媒の添加によって減少し得る。
特定の実施形態において、キャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、メチル化プロファイルによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、「メチル化プロファイル」は、移動相のカラムへの添加後の一時点においてクロマトグラフィーカラムから溶出する、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドの量に対応する値のセットを指す。上述したように、天然でより非極性であるメチル化キャップおよび最後から２番目のヌクレオチドの保持時間は、より容易に溶出する極性分子に対して増加する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）で放出される最初の５、６、または７個のヌクレオチドの保持時間は、工程（ｄ）で実施されるクロマトグラフィー分析工程の間に使用される移動相への極性溶媒の添加によって増加し得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）で放出される最初の５、６、または７個のヌクレオチドの保持時間は、工程（ｄ）で実施されるクロマトグラフィー分析工程の間に使用される移動相への疎水性溶媒の添加によって減少し得る。
【0121】
ピーク分析
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法の工程（ｄ）による分析は、クロマトグラム中のそれぞれのピーク面積の自動積分を含む。例えば、データは、クロマトグラム全体の総積分ピーク面積に対する特定種の積分ピーク面積のパーセント比率を指す面積パーセント値として提示される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法の工程（ｄ）による分析は、クロマトグラム中のそれぞれのピーク面積の自動積分を含む。例えば、データは、クロマトグラム全体の総積分ピーク面積に対する特定種の積分ピーク面積のパーセント比率を指す面積パーセント値として提示される。
【0122】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法の工程（ｄ）による分析は、ＨＰＬＣ分析後のクロマトグラム（複数可）におけるそれぞれのピークの比較を含む。特定の実施形態において、本明細書に開示される方法の工程（ｄ）による分析は、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ）後のクロマトグラム（複数可）におけるそれぞれのピークの総イオンカウントの比較を含む。
【0123】
いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドの部分は、他のキャップ構造（例えば、Ｃａｐ ０またはＣａｐ Ｇ）を含む、またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドの部分に対して決定される。
【0124】
特定の実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５個のヌクレオチドの部分は、他のキャップ構造（例えば、Ｃａｐ ０またはＣａｐ Ｇ）を含む、またはキャップ構造を欠くｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５個のヌクレオチドの部分に対して決定される。
【0125】
対照サンプル
いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｄ）による分析は、１つまたはそれ以上の対照サンプルを参照して実施される。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｄ）による分析は、本発明によるｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡのヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドにそれぞれ対応する合成オリゴヌクレオチドを含むキャッピングされていない対照サンプルを参照して実施される。
いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｄ）による分析は、１つまたはそれ以上の対照サンプルを参照して実施される。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法の工程（ｄ）による分析は、本発明によるｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡのヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドにそれぞれ対応する合成オリゴヌクレオチドを含むキャッピングされていない対照サンプルを参照して実施される。
【0126】
他の実施形態において、好適な対照サンプルは、（ｉ）適宜５’キャップ構造を含む、５、６、または７個のヌクレオチドの配列、および（ｉｉ）適宜キャップ構造を欠く、５、６、または７個のヌクレオチドの配列を、参照を提供するために規定された比率（例えば、９：１）で含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡ転写物の最初の５個の５’ヌクレオチドの酵素による放出のために設計されている場合、対照サンプルは、（ｉ）５’Ｃａｐ １構造を含む５個のヌクレオチドの配列、および（ｉｉ）キャップ構造を欠く５個のヌクレオチドの配列を、参照を提供するために規定された比率で含み得る。特定の実施形態において、対照サンプルは、（ｉ）５’Ｃａｐ １構造を含む５個のヌクレオチドの配列、および（ｉｉ）キャップ構造を欠く５個のヌクレオチドの配列を、９：１の比率で含む。
【0127】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の対照サンプルは、本発明の方法の工程（ｄ）による分析の一部として、較正工程において使用される。いくつかの実施形態において、対照サンプルは、対照サンプルの溶出時間および／またはピーク強度を測定することによって機械較正をモニターするために使用される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡのヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドにそれぞれ対応する合成オリゴヌクレオチドを含む対照サンプルを、本発明の方法の工程（ｄ）にしたがって分析し、機械較正をモニターする。
【0128】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の対照サンプルは、工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルの分析と並行して実行され、参照クロマトグラムを提供する。いくつかの実施形態において、対照サンプルは、工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルと１つまたはそれ以上の対照サンプルを同時に測定するために、工程（ｃ）にしたがって得られたサンプルに１つまたはそれ以上の対照サンプルを添加できるように、例えば重水素化または放射性標識などの修飾が施される。
【0129】
例えば、キャップを含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５個のヌクレオチドとキャップを含まないｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５個のヌクレオチドとの間、ならびに異なるキャップ構造（例えば、Ｃａｐ ０、Ｃａｐ ＧおよびＣａｐ １）の間を容易に区別することができる本発明の方法により達成される高分解能を考慮すると、対照サンプルの使用は厳密には必要ではない。したがって、本発明の特定の実施形態において、本発明の方法の工程（ｃ）で得られたサンプルを分析する工程（ｄ）では、対照サンプルを使用しない。
【0130】
ｍＲＮＡ転写物のさらなる処理
いくつかの実施形態において、本発明の方法は製造プロセスに組み込まれ、工程（ｄ）の結果は、ｍＲＮＡサンプルが採取されたＩＶＴ反応混合物をさらに処理するかどうかを決定するために使用される。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は製造プロセスに組み込まれ、工程（ｄ）の結果は、ｍＲＮＡサンプルが採取されたＩＶＴ反応混合物をさらに処理するかどうかを決定するために使用される。
【0131】
「さらに処理する」とは、反応混合物を所定の製造プロセスにおける次の工程に移すことを意味する。例えば、さらなる処理は、例えばＩＶＴ反応混合物の特定の構成要素を除去するための精製を含むことができる。さらなる処理は、例えば脂質ナノ粒子への封入によるｍＲＮＡ転写物の製剤化も含み得る。例えば、さらなる処理は、治療用組成物の調製におけるＩＶＴ反応混合物の使用を含み得る。
【0132】
具体的な実施形態において、さらなる処理は、３’ポリ（Ａ）テールの付加を含み得る。いくつかの実施形態において、約２００ヌクレオチドの長さの３’ポリ（Ａ）テール（ゲル電気泳動によって決定される）は、ＰｏｌｙＡポリメラーゼと組み合わせてＡＴＰを添加することによって組み込まれる。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、約１００～２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、約５０～３００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ＩＶＴ反応混合物中のｍＲＮＡ転写物は、５’および３’非翻訳領域を含む。
【0133】
いくつかの実施形態において、さらなる処理は、さらなる品質管理工程を含む。例えば、ＩＶＴ反応混合物は、ｍＲＮＡ転写物の他の局面、例えばｍＲＮＡ転写物の長さに関して分析することができるさらなるｍＲＮＡサンプルの供給源として使用することができる。さらなる処理は、ｍＲＮＡサンプルの純度を決定することを含み得る。
【0134】
典型的には、閾値を上回るＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の量を含むと決定されたＩＶＴ反応混合物は、さらに処理するものとする。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも８０％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも８５％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９０％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９１％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９２％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９３％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９４％である。特定の実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９５％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９６％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９７％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９８％である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの少なくとも９９％である。
【0135】
したがって、Ｃａｐ １以外のＣａｐ構造を含むｍＲＮＡ転写物の量を含むと決定されたＩＶＴ反応混合物は、Ｃａｐ １以外のＣａｐ構造が閾値未満に存在する場合にのみ、さらに処理されるものとする。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの２０％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１５％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１０％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの９％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの８％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの７％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの６％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの５％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの４％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの３％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの２％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ ０構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１％以下である。
【0136】
いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの２０％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１５％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１０％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの９％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの８％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの７％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの６％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの５％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの４％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの３％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの２％以下である。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ Ｇ構造を含むｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＶＴ反応混合物のサンプルの１％以下である。
【0137】
一般的に、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物の量を含むと決定されたＩＶＴ反応混合物は、その量が閾値未満である場合にのみ、さらに処理されるものとする。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの２０％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの１５％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの１０％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの９％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの８％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの７％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの６％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの５％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの４％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの３％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの２％以下である。特定の実施形態において、キャッピングされていないｍＲＮＡ転写物は、さらに処理されるＩＴＶ反応混合物のサンプルの１％以下である。
【0138】
Ｃａｐ １を含むｍＲＮＡ転写物を９０％未満含むと決定されたＩＶＴ反応混合物は、さらなる処理を行わないが、ｍＲＮＡサンプルまたはＩＶＴ反応混合物は、例えばＣａｐ １の生成が不十分である原因を決定するためなど、他の目的で使用することができる。
【0139】
キット
本発明はさらに、本発明による発明方法を実施するのに有用な種々の試薬および材料を含むキットを提供する。本明細書に記載される定量的手順は、診断研究室、実験研究室、または商業的研究室によって実施される。本発明は、これらの異なる環境で使用できるキットを提供する。
本発明はさらに、本発明による発明方法を実施するのに有用な種々の試薬および材料を含むキットを提供する。本明細書に記載される定量的手順は、診断研究室、実験研究室、または商業的研究室によって実施される。本発明は、これらの異なる環境で使用できるキットを提供する。
【0140】
ｍＲＮＡキャッピング効率を検出／定量するために、キットは、標的ｍＲＮＡ転写物のｍＲＮＡキャップに特異的に隣接してアニールし、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列のそれぞれ第２～第５のヌクレオチド、第３～第６のヌクレオチド、または第４～第７のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドを含み得る。キットはまた、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列のそれぞれ最初の５、６、または７個のヌクレオチドを産生するためのヌクレアーゼ、すなわちＲＮａｓｅ Ｈを含み得る。キットはさらに、本発明の方法にしたがってキットを使用するための説明書を含み得る。
【0141】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、参照点として使用される対照サンプルをさらに含み得る。例えば、キットに含まれる対照サンプルは、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の少なくとも９０％を含むｍＲＮＡサンプルを含み得る。具体的な実施形態において、キットに含まれる対照サンプルは、適宜、５、６、または７個のリボヌクレオチドを含み、ここで、リボヌクレオチドの少なくとも９０％はＣａｐ １構造を含む。
【0142】
いくつかの実施形態において、酵素操作およびクロマトグラフィー分離によってｍＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡキャッピング効率を定量するための材料および試薬は、キットの中で一緒に組み立てることができる。例えば、このようなキットは、カラム上のキャップ構造を含むｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５、６、または７個のヌクレオチドを分離するための薬剤、クロマトグラフィーカラム、および本発明の方法にしたがってキットを使用するための説明書を含み得る。
【0143】
組成物
本発明はまた、Ｃａｐ １構造を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを含む精製ｍＲＮＡ組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも８０％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも８５％を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９０％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９５％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９６％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９７％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９８％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９９％含む。Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるキャッピング効率アッセイ後に調製される。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子のパーセント比率は、本発明のキャッピング効率アッセイによって決定される。
本発明はまた、Ｃａｐ １構造を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを含む精製ｍＲＮＡ組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも８０％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも８５％を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９０％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９５％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９６％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９７％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９８％含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子を少なくとも９９％含む。Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるキャッピング効率アッセイ後に調製される。いくつかの実施形態において、Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ分子のパーセント比率は、本発明のキャッピング効率アッセイによって決定される。
【0144】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は脂質ナノ粒子中に封入される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために製剤化される。
【実施例1】
【0145】
キャッピング効率の分析
本実施例は、「サンプル１」および「サンプル２」と称する、２つの異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物からのｍＲＮＡサンプルにおけるキャッピング効率を定量する方法を示す。
本実施例は、「サンプル１」および「サンプル２」と称する、２つの異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物からのｍＲＮＡサンプルにおけるキャッピング効率を定量する方法を示す。
【0146】
オリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡ転写物に相補的となるように設計および合成し、図３に図示されているように、オリゴヌクレオチドと、ｍＲＮＡ転写物のヌクレオチド配列の第２～第５のヌクレオチドとの間で、ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成した。ｍＲＮＡ転写物は、以下の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含んでいた：
【化12】
【0147】
オリゴヌクレオチドの配列は、以下：
の通りであり、式中、ｍＵは２’－Ｏ－メチルリボースを有するウリジンを表し；ｍＣは２’－Ｏ－メチルリボースを有するシチジンを表し；ｍＡは２’－Ｏ－メチルリボースを有するアデニンを表し；ｍＧは２’－Ｏ－メチルリボースを有するグアニジンを表し；Ｔはデオキシチミジンを表し；Ｇはデオキシグアニジンを表し、Ｃはデオキシシチジンを表し、下線テキストはＤＮＡヌクレオチドを表す。
【化13】
【0148】
サンプル１およびサンプル２を、以下のように２つの別々の反応で処理した。ｍＲＮＡ転写物を含むｍＲＮＡサンプル５５ｐｍｏｌを、２２μｌの総初期アッセイ体積中でオリゴヌクレオチドと接触させ、７５℃で１０分間、続いて室温で１０分間インキュベートした。その後、ｍＲＮＡサンプルを同じ反応容器内でＲＮａｓｅ Ｈと接触させ、総最終アッセイ体積５２μｌを得た。反応は３７℃で４０分間進行させた。ＲＮａｓｅ ＨはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの領域でｍＲＮＡを切断し、それによってｍＲＮＡ転写物のヌクレオチドの配列の最初の５個の５’ヌクレオチドを放出させた。
【0149】
精製することなく、ＲＮａｓｅ Ｈで切断したｍＲＮＡサンプルを、５０℃に維持したＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ Ｃ１８ ２．１×１００ｍｍカラムを有するＵＨＰＬＣ－ＱＴＯＦシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）に充填し、ｍＲＮＡサンプル中においてＣａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分を決定した。０．５ｍｌ／分の流速を使用して、移動相Ａ（１００ｍＭ ＨＦＩＰ、８．６ｍＭトリメチルアミン、ｐＨ ８．３）から移動相Ｂ（１００％メタノール）への１０分間の１～１６％勾配の後に、５０％移動相Ｂ１．５分間を続けた。溶出液は、１３Ｌ／分の３５０℃乾燥ガスフロー、１０ｐｓｉのネブライザー圧力、および３７５０Ｖのキャピラリー電圧でＱＴＯＦスペクトロメトリにより直接的に分析した。分析は、４００～３２００ｍ／ｚのスキャン範囲にわたって負イオンモードで行った。
【0150】
サンプル１およびサンプル２の得られたクロマトグラムをそれぞれ図４Ｂおよび図４Ｃに示す。図４Ｂに示すように、サンプル１のクロマトグラムによって、４つの識別可能なピークが明らかになった。これらは、示された通り、キャッピングされていないヌクレオチド、ならびにＣａｐ ０、Ｃａｐ Ｇ、およびＣａｐ １を有するヌクレオチドに割り当てられた。Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分は９０％未満であったため、サンプル１はそれ以上処理されなかった。図４Ｃに示すように、サンプル２のクロマトグラムによって、Ｃａｐ １に対応する主要なピークが明らかになった。Ｃａｐ １とキャッピングされていないヌクレオチドの相対量は、関連するクロマトグラフィーのピークを自動積分することによって決定した。Ｃａｐ １構造を含むｍＲＮＡ転写物の部分は９５％であると決定されたため、サンプル２はさらなる処理のために採取した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】