特表 2024-520691 ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）を標的とするＲＮＡガイドを含む遺伝子編集システム及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）を標的とするＲＮＡガイドを含む遺伝子編集システム及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240517BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240517BHJP

   A61K 38/44 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240517BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/113 Z

A61K38/44

A61K35/76

A61K35/12

A61K9/51

A61K31/7088

A61P13/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574534

(86)(22)【出願日】2022-06-03

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 US2022032144

(87)【国際公開番号】W WO2022256642

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】63/197,073

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/225,046

(32)【優先日】2021-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/292,889

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/300,727

(32)【優先日】2022-01-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518015608

【氏名又は名称】アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ウェッセルズ，クイントン ノーマン

(72)【発明者】

【氏名】ハスウェル，ジェフリー レイモンド

(72)【発明者】

【氏名】ディトマソ，ティア マリー

(72)【発明者】

【氏名】ジャキモ，ノア マイケル

(72)【発明者】

【氏名】セングプタ，セジュティ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA65

4C076CC17

4C076FF70

4C084AA02

4C084DC23

4C084NA14

4C084ZA81

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA81

4C087AA01

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA81

(57)【要約】

ＨＡＯ１遺伝子の遺伝子編集における使用のための、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドを含む遺伝子編集システム及び／又は組成物が、本明細書で提供される。また、編集をＨＡＯ１遺伝子に導入するために、かつ／又は原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）の治療のために遺伝子編集システムを使用する方法、及び遺伝子編集システムを特徴付けるためのプロセスも、本明細書で提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子の遺伝子編集のための遺伝子編集システムであって、
（ｉ）Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド又は前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸であって、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、配列番号９２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号９２２に対して１つ以上の変異を含む、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド又は第１の核酸、
（ｉｉ）ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸であって、前記ＲＮＡガイドが、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列に特異的なスペーサー配列を含み、前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、前記ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、前記５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、前記標的配列に対して５’に位置する、ＲＮＡガイド又は第２の核酸を含む、遺伝子編集システム。

【請求項2】

前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドにおける前記１つ以上の変異が、配列番号９２２のＤ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及び／又はＳ１０４６位にある、請求項１に記載の遺伝子編集システム。

【請求項3】

前記１つ以上の変異が、アミノ酸置換であり、前記アミノ酸置換が、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、Ｓ１０４６Ｇ、又はそれらの組み合わせである、請求項１又は２に記載の遺伝子編集システム。

【請求項4】

前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、
（ｉ）Ｄ５８１、Ｄ９１１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異であって、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｄ９１１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換である、変異、
（ｉｉ）Ｄ５８１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異であって、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換である、変異、
（ｉｉｉ）Ｄ５８１、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、及びＳ１０４６位の変異であって、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換である、変異、
（ｉｖ）Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異であって、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換である、変異、又は
（ｖ）Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異であって、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換である、変異を含む、請求項３に記載の遺伝子編集遺伝子編集システム。

【請求項5】

前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、配列番号９２３、９２４、９２５、９２６、又は９２７のアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、配列番号９２４又は９２７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子編集システム。

【請求項6】

前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項7】

前記第１の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項６に記載の遺伝子編集システム。

【請求項8】

前記第１の核酸が、ウイルスベクター内に含まれており、前記ウイルスベクターが、任意選択で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項７に記載の遺伝子編集システム。

【請求項9】

前記標的配列が、前記ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内にある、請求項１～８のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項10】

前記標的配列が、
（ｉ）５’－ＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＡＴ－３’（配列番号１０２５）、
（ｉｉ）５’－ＧＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧ－３’（配列番号１０２６）、
（ｉｉｉ）５’－ＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡ－３’（配列番号１０４６）、
（ｉｖ）５’－ＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧ－３’（配列番号１０４７）、又は
（ｖ）５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣ－３（配列番号１０５２）を含む、請求項９に記載の遺伝子編集システム。

【請求項11】

前記スペーサー配列が、
（ｉ）５’－ＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号１０９３、
（ｉｉ）５’－ＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号１０９４）、
（ｉｉｉ）５’－ＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号１０９５）、
（ｉｖ）５’－ＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号１０９６）、又は
（ｖ）５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３（配列番号１０９７）を含む、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記スペーサー配列が、２０～３０ヌクレオチド長であり、任意選択で、前記スペーサーが、２０ヌクレオチド長である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項13】

前記ＲＮＡガイドが、前記スペーサーと、ダイレクトリピート配列と、を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項14】

前記ダイレクトリピート配列が、２３～３６ヌクレオチド長である、請求項１３に記載の遺伝子編集システム。

【請求項15】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片と少なくとも９０％同一である、請求項１４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項16】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片である、請求項１５に記載の遺伝子編集システム。

【請求項17】

前記ダイレクトリピート配列が、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）である、請求項１６に記載の遺伝子編集システム。

【請求項18】

前記ＲＮＡガイドが、
（ｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号９６７）、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号９６８）、
（ｉｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号９８８）、
（ｉｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号９８９）、又は
（ｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３’（配列番号９９４）
のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子編集システム。

【請求項19】

前記システムが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項20】

前記ＲＮＡガイドをコードする前記核酸が、ウイルスベクター内に位置する、請求項１９に記載の遺伝子編集システム。

【請求項21】

前記ウイルスベクターが、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸、及び前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸の両方を含む、請求項７～２０のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項22】

前記システムが、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、第１のベクター内に位置し、前記システムが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含み、前記第２の核酸が、第２のベクター内に位置し、任意選択で、前記第１のベクター及び／又は前記第２のベクターが、ウイルスベクターである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項23】

前記第１のベクター及び前記第２のベクターが、同じベクターである、請求項２２に記載の遺伝子編集システム。

【請求項24】

前記システムが、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、前記１つ以上のＬＮＰが、（ｉ）、（ｉｉ）、又は両方を包含する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項25】

前記システムが、前記ＬＮＰを含み、前記ＬＮＰが、（ｉ）を包含し、前記システムが、ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含み、任意選択で、前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項２４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項26】

前記システムが、前記ＬＮＰを含み、前記ＬＮＰが、（ｉｉ）を包含し、前記システムが、ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含み、任意選択で、前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項２４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項27】

ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子の遺伝子編集のための遺伝子編集システムであって、
（ｉ）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第１の核酸であって、任意選択で、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドが、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドである、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は第１の核酸、
（ｉｉ）ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸であって、前記ＲＮＡガイドが、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内の標的配列に特異的なスペーサー配列を含み、前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、前記ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、前記５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、前記標的配列に対して５’に位置する、ＲＮＡガイド又は第２の核酸を含む、遺伝子編集システム。

【請求項28】

前記標的配列が、

【化1】

を含む、請求項２７に記載の遺伝子編集システム。

【請求項29】

前記スペーサー配列が、

【化2】

を含む、請求項２７に記載の遺伝子編集システム。

【請求項30】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項31】

前記第１の核酸が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３０に記載の遺伝子編集システム。

【請求項32】

前記第１の核酸が、ウイルスベクター内に含まれており、前記ウイルスベクターが、任意選択で、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３０に記載の遺伝子編集システム。

【請求項33】

前記スペーサーが、２０～３０ヌクレオチド長であり、任意選択で、前記スペーサーが、２０ヌクレオチド長である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項34】

前記ＲＮＡガイドが、前記スペーサー配列と、ダイレクトリピート配列と、を含む、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項35】

前記ダイレクトリピート配列が、２３～３６ヌクレオチド長である、請求項３４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項36】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片と少なくとも９０％同一である、請求項３５に記載の遺伝子編集システム。

【請求項37】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片である、請求項３６に記載の遺伝子編集システム。

【請求項38】

前記ダイレクトリピート配列が、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）である、請求項３７に記載の遺伝子編集システム。

【請求項39】

前記ＲＮＡガイドが、
（ｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号９６７）、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号９６８）、
（ｉｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号９８８）、
（ｉｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号９８９）、又は
（ｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３’（配列番号９９４）のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項40】

前記システムが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含む、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項41】

前記ＲＮＡガイドをコードする前記核酸が、ウイルスベクター内に位置する、請求項４０に記載の遺伝子編集システム。

【請求項42】

前記ウイルスベクターが、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸、及び前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸の両方を含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項43】

前記システムが、前記Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含み、前記第１の核酸が、第１のベクター内に位置し、前記システムが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含み、前記第２の核酸が、第２のベクター内に位置する、請求項２７～４２のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項44】

前記システムが、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み、前記１つ以上のＬＮＰが、（ｉ）、（ｉｉ）、又は両方を包含する、請求項２７～４３のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。

【請求項45】

前記システムが、前記ＬＮＰを含み、前記ＬＮＰが、（ｉ）を包含し、前記システムが、ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが、前記ＲＮＡガイドをコードする前記第２の核酸を含み、任意選択で、前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項４４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項46】

前記システムが、前記ＬＮＰを含み、前記ＬＮＰが、（ｉｉ）を包含し、前記システムが、ウイルスベクターを含み、前記ウイルスベクターが、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含み、任意選択で、前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項４４に記載の遺伝子編集システム。

【請求項47】

請求項１～４６のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムを含む、薬学的組成物。

【請求項48】

請求項１～４６のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムの要素（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、キット。

【請求項49】

細胞におけるヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を編集するための方法であって、前記方法が、宿主細胞を、請求項１～４６のいずれか一項に記載の、前記ＨＡＯ１遺伝子を編集するための遺伝子編集システムと接触させて、前記宿主細胞における前記ＨＡＯ１遺伝子を遺伝的に編集することを含む、方法。

【請求項50】

前記宿主細胞が、インビトロで培養される、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

接触させるステップが、前記宿主細胞を含む対象に、前記ＨＡＯ１遺伝子を編集するための前記システムを投与することによって実行される、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

破壊されたヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を含む細胞であって、任意選択で、前記細胞が、宿主細胞を、請求項１～４６のいずれか一項に記載の遺伝子編集システムと接触させて、前記宿主細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を遺伝的に編集し、それによって、前記ＨＡＯ１遺伝子を破壊することによって産生される、細胞。

【請求項53】

対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するための方法であって、それを必要としている対象に、請求項１～４６のいずれか一項に記載の、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を編集するための遺伝子編集システム、又は請求項５２に記載の細胞を投与することを含む、方法。

【請求項54】

前記対象が、前記ＰＨを有するヒト患者であり、前記ＰＨが、任意選択で、ＰＨ１、ＰＨ２、又はＰＨ３である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＰＨが、ＰＨ１である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

（ｉ）ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子における標的配列に特異的であるスペーサー配列であって、前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、前記ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、前記５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、前記標的配列に対して５’に位置する、スペーサー配列と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、ＲＮＡガイド。

【請求項57】

前記スペーサーが、２０～３０ヌクレオチド長、任意選択で、２０ヌクレオチド長である、請求項５６に記載のＲＮＡガイド。

【請求項58】

前記ダイレクトリピート配列が、２３～３６ヌクレオチド長、任意選択で、２３ヌクレオチド長である、請求項５６又は５７に記載のＲＮＡガイド。

【請求項59】

前記標的配列が、前記ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内にある、請求項５６～５８のいずれか一項に記載のＲＮＡガイド。

【請求項60】

前記標的配列が、

【化3】

を含む、請求項５９に記載のＲＮＡガイド。

【請求項61】

前記スペーサー配列が、

【化4】

を含む、請求項６０に記載のＲＮＡガイド。

【請求項62】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片と少なくとも９０％同一である、請求項５６～６１のいずれか一項に記載のＲＮＡガイド。

【請求項63】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片である、請求項６２に記載のＲＮＡガイド。

【請求項64】

前記ダイレクトリピート配列が、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）である、請求項６３に記載のＲＮＡガイド。

【請求項65】

（ｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号９６７）、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号９６８）、
（ｉｉｉ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号９８８）、
（ｉｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号９８９）、又は
（ｖ）５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３’（配列番号９９４）のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載のＲＮＡガイド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０２１年６月４日に出願された米国特許仮出願第６３／１９７，０７３号、２０２１年７月２３日に出願された米国特許仮出願第６３／２２５，０４６号、２０２１年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６３／２９２，８８９号、及び２０２２年１月１９日に出願された米国特許仮出願第６３／３００，７２７号の優先権を主張し、それらのそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年０６月３日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名称は、１１６９２８－００４０－０００４ＷＯ００＿ＳＥＱ．ｔｘｔであり、サイズは３６７，３５４バイトである。

【背景技術】

【0003】

クラスター化された規則的間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、合わせてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして既知であり、古細菌及び細菌における適応免疫システムであり、この適応免疫システムは、特定の種を外来性遺伝要素から防御する。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子の遺伝子編集のためのシステムの開発に少なくとも部分的に基づく。システムは、Ｃａｓ１２ｉ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド）と、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼポリペプチドによるＨＡＯ１遺伝子内の遺伝子部位での切断を媒介するＲＮＡガイドと、を含む。本明細書に報告されるように、本明細書に開示される遺伝子編集システムは、高い編集効率及び精度でのＨＡＯ１遺伝子の編集に成功した。

【0005】

理論によって拘束されることなく、本明細書に開示される遺伝子編集システムは、以下の有利な特徴のうちの１つ以上を更に示し得る。ＳｐＣａｓ９及びＣａｓ１２ａと比較して、Ｃａｓ１２ｉエフェクターは、より小さく（１０３３～１０９３ａａ）、これは、それらの短い成熟ｃｒＲＮＡ（４０～４３ｎｔ）とともに、送達及び合成コストの点で好ましい。Ｃａｓ１２ｉ切断は、Ｃａｓ９切断によって誘導される小さい欠失及び＋１挿入と比較して、より大きい欠失をもたらす。また、Ｃａｓ１２ｉ ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９のものと異なる。したがって、Ｃａｓ９と比較して、目的の遺伝子部位のより大きい異なる部分が、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド及びＲＮＡガイドで破壊され得る。タグメンテーションベースのタグ挿入部位シーケンシング（ＴＴＩＳＳ）の不偏手法を使用して、Ｃａｓ１２ｉ２と比較して、より高い数の固有の挿入事象でのより多くの潜在的なオフターゲット部位が、ＳｐＣａｓ９について特定された。ＷＯ／２０２１／２０２８００を参照されたい。したがって、Ｃａｓ１２ｉ、例えば、Ｃａｓ１２ｉ２は、Ｃａｓ９よりも特異的であり得る。

【0006】

したがって、ＨＡＯ１遺伝子を編集するための遺伝子編集システム、このような遺伝子編集システムを含む薬学的組成物又はキット、遺伝子改変細胞を産生するために遺伝子編集システムを使用する方法、及びこのように産生され得られる細胞が、本明細書で提供される。また、対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するための、本明細書に開示される遺伝子編集システム、このような遺伝子編集システムを含む薬学的組成物及びキット、並びに／又はこのように産生される遺伝子改変細胞の使用が、本明細書で提供される。

【0007】

いくつかの態様において、本開示は、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子の遺伝子編集のためのシステムであって、（ｉ）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第１の核酸と、（ｉｉ）ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする第２の核酸と、を含む、システムを特徴とする。ＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列に特異的なスペーサー配列を含み、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭは、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフは、標的配列に対して５’に位置する。

【0008】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドであることができる。他の実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドであることができる。

【0009】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドであり、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号９２２に対して１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドにおける１つ以上の変異は、配列番号９２２のＤ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及び／又はＳ１０４６位にある。いくつかの例において、１つ以上の変異は、アミノ酸置換であり、アミノ酸置換は、任意選択で、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、Ｓ１０４６Ｇ、又はそれらの組み合わせである。

【0010】

一例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｄ９１１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異を含む（例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｄ９１１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換）。別の例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異を含む（例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換）。更に別の例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、及びＳ１０４６位の変異を含む（例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換）。更に別の例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異を含む（例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換）。別の例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異（例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換）を含む。

【0011】

本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかにおける使用のための例示的なＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２３～９２７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。一例において、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかにおける使用のための例示的なＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２４のアミノ酸配列を含む。別の例において、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかにおける使用のための例示的なＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２７のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド）をコードする第１の核酸を含み得る。いくつかの事例において、第１の核酸は、第１のベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター又はＡＡＶベクター）内に位置する。いくつかの事例において、第１の核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。いくつかの事例において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド）をコードする核酸は、コドン最適化されている。

【0013】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内にあり得る。いくつかの例において、標的配列は、５’－ＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＡＴ－３’（配列番号１０２５）、５’－ＧＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧ－３’（配列番号１０２６）、５’－ＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡ－３’（配列番号１０４６）、５’－ＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧ－３’（配列番号１０４７）、又は５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣ－３’（配列番号１０５２）を含む。具体的な例において、標的配列は、配列番号１０４７のヌクレオチド配列であることができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、２０～３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例において、スペーサー配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの例において、スペーサー配列は、５’－ＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号１０９３）、５’－ＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号１０９４）、５’－ＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号１０９５）、５’－ＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号１０９６）、又は５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３（配列番号１０９７）を含む。具体的な例において、スペーサー配列は、配列番号１０９６を含み得る。

【0015】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、スペーサーと、ダイレクトリピート配列と、を含む。いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、２３～３６ヌクレオチド長である。一例において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片と少なくとも９０％同一である。いくつかの具体的な例において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片である。非限定的な例として、ダイレクトリピート配列は、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）である。

【0016】

具体的な例において、ＲＮＡガイドは、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号９６７）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号９６８）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号９８８）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号９８９）、又は５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３’（配列番号９９４）のヌクレオチド配列を含み得る。具体的な例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９８９を含み得る。

【0017】

いくつかの実施形態において、システムは、ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡガイドをコードする核酸は、ウイルスベクター内に位置し得る。いくつかの例において、ウイルスベクターは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸、及びＲＮＡガイドをコードする第２の核酸の両方を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムのうちのいずれかは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸であって、第１の核酸が、第１のベクター内に位置する、第１の核酸と、ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸であって、第２の核酸が、第２のベクター上に位置する、第２の核酸と、を含み得る。いくつかの例において、第１のベクター及び／又は第２のベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの具体的な例において、第１のベクター及び第２のベクターは、同じベクターである。他の例において、第１のベクター及び第２のベクターは、異なるベクターである。

【0019】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムのうちのいずれかは、１つ以上の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含み得、１つ以上のＬＮＰは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド若しくはＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸、ＲＮＡガイド若しくはＲＮＡガイドをコードする第２の核酸、又は両方を包含する。

【0020】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド又はＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸を包含するＬＮＰと、ＲＮＡガイドをコードする第２の核酸を含むウイルスベクターと、を含み得る。いくつかの例において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。他の実施形態において、本明細書に記載されるシステムは、ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする第２の核酸を包含するＬＮＰと、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする第１の核酸を含むウイルスベクターと、を含み得る。いくつかの例において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。

【0021】

いくつかの態様において、本開示はまた、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかを含む薬学的組成物、又は遺伝子編集システムの構成要素を含むキットを提供する。

【0022】

他の態様において、本開示はまた、細胞におけるヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を編集するための方法であって、方法が、宿主細胞を、本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかと接触させて、宿主細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を遺伝的に編集することを含む、方法を特徴とする。いくつかの例において、宿主細胞は、インビトロで培養される。他の例において、接触させるステップは、宿主細胞を含む対象に、ＨＡＯ１遺伝子を編集するためのシステムを投与することによって実行される。

【0023】

また、破壊されたヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を含む細胞であって、細胞が、宿主細胞を、本明細書に開示されるシステムと接触させて、宿主細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を遺伝的に編集することによって産生され得る、細胞が、本開示の範囲内である。

【0024】

更に、他の態様において、本開示は、対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するための方法を提供する。方法は、それを必要としている対象に、本明細書に開示される、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子を編集するためのシステムのうちのいずれか、又は本明細書に開示される改変細胞のうちのいずれかを投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、対象は、ＰＨを有するヒト患者であり得る。いくつかの例において、ＰＨは、ＰＨ１、ＰＨ２、又はＰＨ３である。具体的な例において、ＰＨは、ＰＨ１である。

【0025】

また、（ｉ）ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子における標的配列に特異的である、本明細書に開示されるスペーサー配列であって、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、標的配列に対して５’に位置する、スペーサー配列と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、ＲＮＡガイドが、本明細書で提供される。

【0026】

いくつかの実施形態において、スペーサーは、２０～３０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例において、スペーサーは、２０ヌクレオチド長である。

【0027】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、２３～３６ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、２３ヌクレオチド長である。

【0028】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内にあり得る。いくつかの例において、標的配列は、５’－ＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＡＴＡＴＧＡＣＴＡＴ－３’（配列番号１０２５）、５’－ＧＧＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧ－３’（配列番号１０２６）、５’－ＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡ－３’（配列番号１０４６）、５’－ＣＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧ－３’（配列番号１０４７）、又は５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣ－３’（配列番号１０５２）を含む。具体的な例において、標的配列は、配列番号１０４７を含み得る。

【0029】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、５’－ＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号１０９３）、５’－ＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号１０９４）、５’－ＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号１０９５）、５’－ＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号１０９６）、又は５’－ＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３（配列番号１０９７）として記載され得る。具体的な例において、スペーサー配列は、配列番号１０９６を含み得る。

【0030】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片と少なくとも９０％同一であり得る。いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つ、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片である。非限定的な例として、ダイレクトリピート配列は、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１０）である。

【0031】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＧＵＣＵＡＵＡＵＡＵＧＡＣＵＡＵ－３’（配列番号９６７）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＧＧＡＡＧＵＡＣＵＧＡＵＵＵＡＧＣＡＵＧ－３’（配列番号９６８）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＵＡＧＡＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＡＵＣＣＡＡ－３’（配列番号９８８）、５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＵＣＣＵＵＧＧＡＵＡＣＡＧ－３’（配列番号９８９）、又は５’－ＡＧＡＡＡＵＣＣＧＵＣＵＵＵＣＡＵＵＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＣ－３’（配列番号９９４）のヌクレオチド配列を含み得る。具体的な例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９８９を含み得る。

【0032】

また、対象におけるＰＨの治療における使用のための、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれか、このような遺伝子編集システムを含む薬学的組成物若しくはキット、又は遺伝子編集システムによって生成される遺伝子改変細胞、及び対象におけるＰＨの治療のための医薬品を製造するための、本明細書に開示される遺伝子編集システム、このような遺伝子編集システムを含む薬学的組成物若しくはキット、又は遺伝子編集システムによって生成される遺伝子改変細胞の使用が、本明細書で提供される。

【0033】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、以下の説明に示される。本発明の他の特徴又は利点は、いくつかの実施形態の以下の図面及び詳細な説明から明らかになり、また、添付の特許請求の範囲から明らかになる。

【0034】

以下の図面は、本明細書の一部分をなし、本開示のある態様を更に実証するために含まれており、これらの態様は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明とともに図面を参照することによってより良好に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を編集する、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド及びｃｒＲＮＡで調製されたＲＮＰの能力を示すグラフである。より濃い灰色のバーは、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の両方の配列と完全な相同性を有する標的配列を表す。

【図2】ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を編集する、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド及びｃｒＲＮＡで調製されたＲＮＰの能力を示すグラフである。

【図3】初代肝細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を編集する、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド及びｃｒＲＮＡで調製されたＲＮＰの能力を示すグラフである。

【図4】Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド及びＨＡＯ１標的ｃｒＲＮＡでの、初代ヒト肝細胞におけるＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを示すグラフである。

【図5A】ＨｅｐＧ２細胞において、ＨＡＯ１標的ｃｒＲＮＡ、及び配列番号９２４又は配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドによって誘導された％インデルを示すグラフである。

【図5B】ＨｅｐＧ２細胞において、配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２及びＥ１Ｔ３（配列番号９６８）のＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドによって誘導されたインデルのサイズ（左）及び開始位置（右）を示す。

【図6】配列番号１０９１及び配列番号１０９２の化学修飾ＨＡＯ１標的ｃｒＲＮＡ、並びに配列番号１０８９又は配列番号１０９０のバリアントＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡによって誘導された％インデルを示すグラフである。

【図7A】配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２、並びにＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドＥ２Ｔ５（配列番号９８９）、Ｅ１Ｔ２（配列番号９６７）、Ｅ１Ｔ３（配列番号９６８）、及びＥ２Ｔ１０（配列番号９９４）についてのタグメンテーションベースのタグ挿入部位シーケンシング（ＴＴＩＳＳ）リードを示すプロットを示す。黒色のくさび形及び中央の数字は、オンターゲットＴＴＩＳＳリードの割合を表す。それぞれの灰色のくさび形は、ＴＴＩＳＳによって特定された固有のオフターゲット部位を表す。それぞれの灰色のくさび形のサイズは、所与のオフターゲットへのＴＴＩＳＳリードマッピングの割合を表す。

【図7B】配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２、並びにＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドＥ２Ｔ５（配列番号９８９）、Ｅ１Ｔ２（配列番号９６７）、及びＥ１Ｔ３（配列番号９６８）についてのＴＴＩＳＳリードの２つのレプリケートを示すプロットを示す。黒色のくさび形及び中央の数字は、オンターゲットＴＴＩＳＳリードの割合を表す。それぞれの灰色のくさび形は、ＴＴＩＳＳによって特定された固有のオフターゲット部位を表す。それぞれの灰色のくさび形のサイズは、所与のオフターゲットへのＴＴＩＳＳリードマッピングの割合を表す。

【図8】配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２及びＲＮＡガイドＥ２Ｔ５（配列番号９８９）での、初代ヒト肝細胞のエレクトロポレーション後のＨＡＯ１タンパク質のノックダウンを示すウェスタンブロットである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本開示は、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子（別名、グリコレートオキシダーゼ遺伝子）の遺伝子編集のためのシステムであって、（ｉ）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第１の核酸と、（ｉｉ）ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする第２の核酸であって、ＲＮＡガイドが、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列に特異的なスペーサー配列を含み、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、標的配列に対して５’に位置する、ＲＮＡガイド又は第２の核酸と、を含む、システムに関する。また、このようなシステムを含む薬学的組成物又はキット、及びそれらの使用が、本開示で提供される。細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を編集するための方法、破壊されたＨＡＯ１遺伝子を含むこのように産生される細胞、対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療する方法、及び（ｉ）ＨＡＯ１遺伝子における標的配列に特異的であるスペーサーであって、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフを含み、５’－ＴＴＮ－３’のモチーフが、標的配列に対して５’に位置する、スペーサーと、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、ＲＮＡガイド、並びにそれらの使用が、本明細書に更に開示される。

【0037】

本明細書に開示される遺伝子編集システムにおける使用のためのＣａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド、例えば、本明細書に開示されるもののように野生型Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又はそのバリアントであり得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号９２２に対して１つ以上の変異を含む。他の例において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドであり得、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドもまた本明細書に開示される。

【0038】

定義
本開示は、特定の実施形態に関してかつある図を参照して説明されるが、本開示は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書の以下に記載される用語は、概して、別途指示されない限り、それらの一般的な意味で理解される。

【0039】

本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、生物学的活性を指す。いくつかの実施形態において、活性は、酵素的活性、例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの触媒能力を含む。例えば、活性は、ヌクレアーゼ活性を含むことができる。

【0040】

本明細書で使用される場合、「ＨＡＯ１」という用語は、「ヒドロキシ酸オキシダーゼ」としても既知の「グリコレートオキシダーゼ１」を指す。ＨＡＯ１は、主に肝臓及び膵臓において発現されるペルオキシソームタンパク質であり、その活性は、グリコレート及び２－ヒドロキシ脂肪酸の酸化を含む。本明細書に記載される配列番号９２８は、ＨＡＯ１遺伝子配列の例を提供する。

【0041】

本明細書で使用される場合、（Ｃａｓ１２ｉとも本明細書で称される）「Ｃａｓ１２ｉポリペプチド」という用語は、ＲＮＡガイドによって指定される標的核酸上の標的配列に結合するポリペプチドであって、野生型Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと少なくともある程度のアミノ酸配列相同性を有する、ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、米国特許第１０，８０８，２４５号の配列番号１～５及び１１～１８のうちのいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含み、この文献は、本明細書で参照される主題のためにかつその目的で参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、本出願の配列番号８、２、１１、及び９のうちのいずれか１つと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドは、ＷＯ／２０２１／２０２８００に記載されているＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドであり、その関連する開示は、本明細書で参照される主題のためにかつその目的で参照により組み込まれる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、標的核酸を（例えば、ニック又は二本鎖切断として）切断する。

【0042】

本明細書で使用される場合、「に隣接する」という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列が、別のヌクレオチド又はアミノ酸配列に密接に近接することを指す。いくつかの実施形態において、２つの配列を分離するヌクレオチドがない場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列に隣接する（すなわち、直接隣接する）。いくつかの実施形態において、少ない数のヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド）が、２つの配列を分離する場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、最大２個のヌクレオチド、最大５個のヌクレオチド、最大８個のヌクレオチド、最大１０個のヌクレオチド、最大１２個のヌクレオチド、又は最大１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、２～５個のヌクレオチド、４～６個のヌクレオチド、４～８個のヌクレオチド、４～１０個のヌクレオチド、６～８個のヌクレオチド、６～１０個のヌクレオチド、６～１２個のヌクレオチド、８～１０個のヌクレオチド、８～１２個のヌクレオチド、１０～１２個のヌクレオチド、１０～１５個のヌクレオチド、又は１２～１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、２つ以上の分子の群化を指す。いくつかの実施形態において、複合体は、互いに相互作用する（例えば、結合、接触、接着した）ポリペプチド及び核酸分子を含む。例えば、「複合体」という用語は、ＲＮＡガイド及びポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド）の群化を指すことができる。代替として、「複合体」という用語は、ＲＮＡガイド、ポリペプチド、及び標的配列の相補的領域の群化を指すことができる。別の例において、「複合体」という用語は、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドの群化を指すことができる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」という用語は、標的配列（例えば、ＨＡＯ１標的配列）に隣接するＤＮＡ配列であって、ＲＮＡガイド（例えば、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド）と、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む複合体が、標的配列に結合する、ＤＮＡ配列を指す。二本鎖ＤＮＡ分子において、ＰＡＭモチーフを含有する鎖は、「ＰＡＭ鎖」と称され、相補的鎖は、「非ＰＡＭ鎖」と称される。ＲＮＡガイドは、本明細書に開示される標的配列と相補的である非ＰＡＭ鎖における部位に結合する。

【0045】

いくつかの実施形態において、ＰＡＭ鎖は、コード（例えば、センス）鎖である。他の実施形態において、ＰＡＭ鎖は、非コード（例えば、アンチセンス鎖）である。ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して非ＰＡＭ鎖に結合するため、非ＰＡＭ鎖は、標的鎖としても既知であり、ＰＡＭ鎖は、非標的鎖としても既知である。

【0046】

本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、（ＰＡＭ鎖上の）ＰＡＭモチーフに隣接するＤＮＡ断片を指す。標的配列の相補的領域は、非ＰＡＭ鎖上にある。標的配列は、ＰＡＭモチーフに直接隣接し得る。代替として、標的配列及びＰＡＭは、小さい配列セグメント（例えば、最大５個のヌクレオチド、例えば、最大４、３、２、又は１個のヌクレオチド）によって分離され得る。標的配列は、当該技術分野で既知である、ＰＡＭモチーフを認識するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに依存して、ＰＡＭモチーフの３’末端又はＰＡＭモチーフの５’末端に位置し得る。例えば、標的配列は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるものなどのＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド）について、ＰＡＭモチーフの３’末端に位置する。いくつかの実施形態において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子配列内の配列であり、この配列は、配列番号９２８に記載の配列を含むが、これに限定されない。

【0047】

本明細書で使用される場合、「に隣接する」という用語は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列が、別のヌクレオチド又はアミノ酸配列に密接に近接することを指す。いくつかの実施形態において、２つの配列を分離するヌクレオチドがない場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列に隣接する（すなわち、直接隣接する）。いくつかの実施形態において、少ない数のヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のヌクレオチド）が、２つの配列を分離する場合、ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、最大２個のヌクレオチド、最大５個のヌクレオチド、最大８個のヌクレオチド、最大１０個のヌクレオチド、最大１２個のヌクレオチド、又は最大１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。いくつかの実施形態において、２つの配列が、２～５個のヌクレオチド、４～６個のヌクレオチド、４～８個のヌクレオチド、４～１０個のヌクレオチド、６～８個のヌクレオチド、６～１０個のヌクレオチド、６～１２個のヌクレオチド、８～１０個のヌクレオチド、８～１２個のヌクレオチド、１０～１２個のヌクレオチド、１０～１５個のヌクレオチド、又は１２～１５個のヌクレオチドによって分離されている場合、第１の配列は、第２の配列に隣接する。

【0048】

本明細書で使用される場合、「スペーサー」又は「スペーサー配列」という用語は、標的配列（ＤＮＡ配列）のＲＮＡ均等物である、ＲＮＡガイド内の一部分である。スペーサーは、（ＰＡＭ鎖における）標的配列と相補的な部位での塩基対形成を介して、非ＰＡＭ鎖に結合することが可能である配列を含有する。このようなスペーサーはまた、標的配列に特異的であることが既知である。いくつかの事例において、スペーサーは、ＲＮＡ－ＤＮＡ配列差を除いて、標的配列と少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）同一であり得る。いくつかの事例において、スペーサーは、ＲＮＡ－ＤＮＡ配列差を除いて、標的配列と１００％同一であり得る。

【0049】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイド」又は「ＲＮＡガイド配列」という用語は、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド）が、標的配列（例えば、ＨＡＯ１遺伝子の配列）を標的とすることを容易にするいずれものＲＮＡ分子又は修飾ＲＮＡ分子を指す。例えば、ＲＮＡガイドは、特定の核酸配列（標的配列、例えば、ＨＡＯ１遺伝子での標的配列）と相補的であるように設計された分子であることができる。ＲＮＡガイドは、スペーサー配列と、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列と、を含み得る。いくつかの事例において、ＲＮＡガイドは、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを、例えば、ＲＮＡガイド内に含有されたＤＮＡ結合配列内に含む修飾ＲＮＡ分子であって、標的配列と相補的な配列に結合する、修飾ＲＮＡ分子であることができる。いくつかの例において、ＤＮＡ結合配列は、ＤＮＡ配列又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列を含有し得る。また、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、プレｃｒＲＮＡ、及び成熟ｃｒＲＮＡという用語は、ＲＮＡガイドを指すために本明細書で使用される。

【0050】

本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、第１のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡガイドのスペーサー配列）及び第２のポリヌクレオチド（例えば、標的配列の相補的配列）が、塩基対形成を介して二本鎖複合体を形成して、第１のポリヌクレオチドと複合体を形成するエフェクターポリペプチドが、第２のポリヌクレオチドに作用する（例えば、切断する）ことを可能にすることができるように、第１のポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチドとあるレベルの相補性を有することを指す。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと実質的に相補的であり得、すなわち、第２のポリヌクレオチドと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の相補性を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと完全に相補的であり、すなわち、第２のポリヌクレオチドと１００％の相補性を有する。

【0051】

２つの核酸又は２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」（別名、配列同一性）は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３におけるように修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、１２のワード長で実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行され得る。ギャップが２つの配列間に存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように使用され得る。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。

【0052】

本明細書で使用される場合、「編集」という用語は、１つ以上の修飾が、標的核酸、例えば、ＨＡＯ１遺伝子内の標的核酸内に導入されることを指す。編集は、１つ以上の置換、１つ以上の挿入、１つ以上の欠失、又はそれらの組み合わせであることができる。本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、参照配列に対して、１つ以上のヌクレオチドが、異なる１つ以上のヌクレオチドで置換されていることを指す。本明細書で使用される場合、「挿入」という用語は、参照配列に対して、核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの増加を指す。本明細書で使用される場合、「欠失」という用語は、参照配列に対して、核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの損失を指す。

【0053】

欠失を含む配列をどのように作製するかについての特定のプロセスは示唆されない。例えば、欠失を含む配列は、個々のヌクレオチドから直接合成され得る。他の実施形態において、欠失は、参照配列を提供することと、次いで、それを改変することとによって行われる。核酸配列は、生物のゲノム内にあることができる。核酸配列は、細胞内にあることができる。核酸配列は、ＤＮＡ配列であることができる。欠失は、フレームシフト変異又は非フレームシフト変異であることができる。本明細書に記載される欠失とは、最大数キロ塩基までの欠失を指す。

【0054】

本明細書で使用される場合、「上流」及び「下流」という用語は、核酸分子における単一の核酸（例えば、ＤＮＡ）配列内の相対的な位置を指す。「上流」及び「下流」は、それぞれ、ＲＮＡ転写が発生する５’から３’方向に関する。第１の配列の３’末端が、第２の配列の５’末端前に発生するときに、第１の配列は、第２の配列の上流にある。第１の配列の５’末端が、第２の配列の３’末端後に発生するときに、第１の配列は、第２の配列の下流にある。いくつかの実施形態において、５’－ＮＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＮ－３’配列は、本明細書に記載されるインデルの上流にあり、Ｃａｓ１２ｉ誘導性インデルは、５’－ＮＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＮ－３’配列の下流にある。

【0055】

Ｉ．遺伝子編集システム
いくつかの態様において、本開示は、ＨＡＯ１遺伝子を標的とするＲＮＡガイドを含む遺伝子編集システムを提供する。このような遺伝子編集システムは、ＨＡＯ１標的遺伝子を編集するために使用され得、例えば、ＨＡＯ１遺伝子を破壊するために使用され得る。

【0056】

（ＨＡＯ１、グリコレートオキシダーゼ［ＧＯＸ又はＧＯ］としても既知である）ヒドロキシ酸オキシダーゼ１は、グリコレートをグリオキシレートに変換する。ＰＨ１を患う個体におけるＨＡＯ１の阻害が、グリオキシレートの形成を遮断し、過剰なグリコレートが尿を介して排泄されることが提案されてきた。ＰＨ１をＨＡＯ１の阻害によって治療するという考えは、ＨＡＯ１の異常なスプライスバリアントを有する一部の個体が、グリコール酸尿症について無症状であり、それによって、明らかな腎臓病態がなく、尿中グリコール酸排泄の増加があったということで更に支持される。したがって、ＨＡＯ１発現の阻害は、グリオキシレートの産生を遮断し、次いで、その代謝物であるオキサレートの産生を遮断する。したがって、ＨＡＯ１遺伝子を標的とする、本明細書に開示される遺伝子編集システムは、治療を必要としている対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するために使用され得る。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート構成要素と、スペーサー構成要素と、から構成されている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態において、スペーサー構成要素は、ＨＡＯ１標的配列に特異的であり、ＨＡＯ１標的配列は、本明細書に記載される５’－ＮＴＴＮ－３’又は５’－ＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列に隣接する。二本鎖標的の場合、ＲＮＡガイドは、標的の第１の鎖（すなわち、非ＰＡＭ鎖）に結合し、本明細書に記載されるＰＡＭ配列は、第２の相補的鎖（すなわち、ＰＡＭ鎖）内に存在する。

【0058】

いくつかの実施形態において、本開示は、複合体を含む組成物であって、複合体が、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドを含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む複合体を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、約１：１のモル比で互いに結合する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む複合体は、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む複合体は、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列の相補的領域に、約１：１のモル比で結合する。いくつかの実施形態において、複合体は、ＨＡＯ１標的配列及び／又は相補的配列を切断することができる酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ活性を含む。ＲＮＡガイド、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、及びＨＡＯ１標的配列の相補的領域は、単独又は一緒のいずれでも自然発生しない。いくつかの実施形態において、複合体におけるＲＮＡガイドは、本明細書に記載されるダイレクトリピート及び／又はスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの配列は、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0059】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される本開示は、本明細書に記載されるＲＮＡガイド、及び／又は本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、同じ組成物内に一緒に含まれている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、別個の組成物内に含まれている。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、本明細書に記載されるダイレクトリピート及び／又はスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの配列は、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0060】

本明細書に開示される遺伝子編集システムの使用は、他の既知のヌクレアーゼシステムのものよりも利点を有する。Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、他のヌクレアーゼよりも小さい。例えば、Ｃａｓ１２ｉ２は、１，０５４アミノ酸長であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、１，３６８アミノ酸長であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）は、１，１２８アミノ酸長であり、ＦｎＣｐｆ１は、１，３００アミノ酸長であり、ＡｓＣｐｆ１は、１，３０７アミノ酸長であり、ＬｂＣｐｆ１は、１，２４６アミノ酸長である。トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要としないＣａｓ１２ｉ ＲＮＡガイドはまた、Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドよりも小さい。より小さいＣａｓ１２ｉポリペプチド及びＲＮＡガイドサイズは、送達に有益である。Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを含む組成物はまた、ＳｐＣａｓ９ポリペプチドを含む組成物と比較して、オフターゲット活性の減少を実証する。ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２５２５７を参照されたく、これは、その全体が参照により組み込まれる。更に、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを含む組成物によって誘導されるインデルは、ＳｐＣａｓ９ポリペプチドを含む組成物によって誘導されるインデルと異なる。例えば、ＳｐＣａｓ９ポリペプチドは、主に、１ヌクレオチド長の挿入及び欠失を誘導する。しかしながら、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、より大きい欠失を誘導し、これは、ＨＡＯ１などの遺伝子のより大きい部分を破壊することにおいて有益であることができる。

【0061】

また、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）遺伝子の遺伝子編集のためのシステムであって、（ｉ）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド）又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第１の核酸（例えば、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２２と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、配列番号９２２に対して１つ以上の変異を含み得る）と、（ｉｉ）ＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする第２の核酸であって、ＲＮＡガイドが、ＨＡＯ１遺伝子内（例えば、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内）の標的配列に特異的なスペーサー配列を含み、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭが、５’－ＴＴＮ－３’（５’－ＮＴＴＮ－３’）のモチーフを含み、５’－ＴＴＮ－３’（５’－ＮＴＴＮ－３’）のモチーフが、標的配列に対して５’に位置する、ＲＮＡガイド又は第２の核酸と、を含む、システムが、本明細書で提供される。

【0062】

Ａ．ＲＮＡガイド
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子編集システムは、ＨＡＯ１遺伝子、例えば、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２を標的とするＲＮＡガイドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子編集システムは、ＨＡＯ１を標的とする２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又は９つ以上）のＲＮＡガイドを含み得る。

【0063】

ＲＮＡガイドは、本明細書に記載される遺伝子編集システム内に含有されたＣａｓ１２ｉポリペプチドを、ＨＡＯ１標的配列に向けることができる。２つ以上のＲＮＡガイドは、本明細書に記載される２つ以上の別個のＣａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、同じ又は異なる配列を有するＣａｓ１２ｉポリペプチド）を、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又は９つ以上）のＨＡＯ１標的配列に向けることができる。

【0064】

特定の種類のＲＮＡガイドの以下の例を読む当業者には、いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１標的特異的であることが理解されよう。すなわち、いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、（例えば、細胞内の）１つ以上のＨＡＯ１標的配列に特異的に結合し、非標的配列（例えば、同じ細胞内の非特異的ＤＮＡ又はランダム配列）に結合しない。

【0065】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、スペーサー配列を含み、続いて、ダイレクトリピート配列を含み、これは、５’から３’方向の配列を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、第１のダイレクトリピート配列を含み、続いて、スペーサー配列及び第２のダイレクトリピート配列を含み、これは、５’から３’方向の配列を指す。いくつかの実施形態において、このようなＲＮＡガイドの第１のダイレクトリピート及び第２のダイレクトリピートは同一である。いくつかの実施形態において、このようなＲＮＡガイドの第１のダイレクトリピート及び第２のダイレクトリピートは異なる。

【0066】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列及びダイレクトリピート配列（複数可）は、同じＲＮＡ分子内に存在する。いくつかの実施形態において、スペーサー及びダイレクトリピート配列は、互いに直接結合している。いくつかの実施形態において、短いリンカーが、スペーサーとダイレクトリピート配列との間に存在し、例えば、１、２、又は３ヌクレオチド長のＲＮＡリンカーである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列及びダイレクトリピート配列（複数可）は、別個の分子内に存在し、別個の分子は、塩基対形成相互作用によって互いに連結されている。

【0067】

ＲＮＡガイドの例示的なダイレクトリピート及びスペーサー構成要素に関する追加の情報は、以下で提供される。

【0068】

（ｉ）．ダイレクトリピート
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドのダイレクトリピート配列は、１２～１００、１３～７５、１４～５０、又は１５～４０個のヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のヌクレオチド）の長さを有する。

【0069】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表１の配列又は表１の配列の一部分である。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６を含むことができる。

【0070】

ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４を含むことができる。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１０に記載される。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１０に記載の配列の一部分を含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表１の配列又は表１の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの４～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの５～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの６～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの７～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの８～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの９～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの１０～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの１１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの１２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの１３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、又は８のうちのいずれか１つの１４～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の１～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の２～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の３～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。

【0072】

ダイレクトリピート配列は、配列番号９の４～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の５～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の６～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の７～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の８～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の９～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の１０～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９の１１～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。

【0073】

ダイレクトリピート配列は、配列番号９の１２～ヌクレオチド３４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１０に記載の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性を有する。

【0074】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドと、配列番号１０のダイレクトリピート及び２０個のヌクレオチドのスペーサー長を含むＲＮＡガイドと、を含む組成物は、インデルをＨＡＯ１標的配列内に導入することが可能である。例えば、実施例１を参照されたく、実施例１において、ＲＮＡガイド及び配列番号９２４のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、ＲＮＰによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達された後に、インデルは、４４個のＨＡＯ１標的配列において測定された。実施例２を参照されたく、実施例２において、ＲＮＡガイド及び配列番号９２４のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、ＲＮＰによってＨｅｐＧ２細胞に送達された後に、インデルは、１１個のＨＡＯ１標的配列において測定された。実施例３を参照されたく、実施例３において、ＲＮＡガイド及び配列番号９２４のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドが、ＲＮＰによって初代肝細胞に送達された後に、インデルは、５個のＨＡＯ１標的配列において測定された。

【0075】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９０％同一である（表１を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号１～１０のうちのいずれか１つの逆相補的配列である。

【0076】

【表1】

【0077】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表２の配列又は表２の配列の一部分である。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６を含むことができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６を含むことができる。

【0078】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表２の配列又は表２の配列の一部分と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの４～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの５～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの６～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの７～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの８～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの９～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１０～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９５％の同一性を有することができる。

【0079】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表２の配列又は表２の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの４～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの５～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの６～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの７～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの８～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの９～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１０～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１１～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１２～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの１３～ヌクレオチド３６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。

【0080】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、又は９５３のうちのいずれか１つの逆相補的配列である。

【0081】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５４又は配列番号９５４の一部分と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５４又は配列番号９５４の一部分と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５４又は配列番号９５４の一部分と少なくとも１００％同一である。

【0082】

【表2】

【0083】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表３の配列又は表３の配列の一部分である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表３の配列又は表３の配列の一部分と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表３の配列又は表３の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５９～９６１のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５９～９６１のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９５９～９６１のうちのいずれか１つの逆相補的配列である。

【0084】

【表3】

【0085】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表４の配列又は表４の配列の一部分である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表４の配列又は表４の配列の一部分と少なくとも９５％の同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、表４の配列又は表４の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９６２～９６４のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９６２～９６４のうちのいずれか１つの逆相補的配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号９６２～９６４のうちのいずれか１つの逆相補的配列である。

【0086】

【表4】

【0087】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるダイレクトリピート配列は、ウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるダイレクトリピート配列は、チミン（Ｔ）を含む。いくつかの実施形態において、表１～４によるダイレクトリピート配列は、チミンを、表１～４にウラシルとして示される１つ以上の場所に含む配列を含む。

【0088】

（ｉｉ）．スペーサー配列
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＤＮＡ標的又はスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドのスペーサー配列は、１２～１００、１３～７５、１４～５０、又は１５～３０個のヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチド）の長さを有し、非ＰＡＭ鎖配列と相補的である。いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、特定のＤＮＡ鎖、例えば、ゲノム遺伝子座の特定のＤＮＡ鎖と相補的であるように設計されている。

【0089】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドスペーサー配列は、標的配列の相補的鎖と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、参照核酸配列、例えば、標的配列の相補的鎖と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列（例えば、スペーサー配列）を含む。２つのこのような核酸間のパーセント同一性は、２つの最適にアラインメントされた核酸配列の検査によって手動で決定されてもよく、又はソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用して、標準パラメータを使用することによって決定されてもよい。

【0090】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、スペーサー配列を含み、スペーサー配列は、１２～１００、１３～７５、１４～５０、又は１５～３０個のヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチド）の長さを有し、標的配列と相補的である非ＰＡＭ鎖上の領域と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、配列、例えば、ＲＮＡ配列を含み、ＲＮＡ配列は、最大５０の長さであり、標的配列と相補的である非ＰＡＭ鎖上の領域と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。

【0091】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、表５の配列又は表５の配列の一部分である。配列番号４６６～９２０の指示は、配列番号４６６～９２０の列挙と均等であると考えられるべきであり、介在番号のそれぞれ、すなわち、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、及び９２０が、列挙内に存在すると理解されるべきである。

【0092】

スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１６を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１７を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１８を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１９を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２０を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２１を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２２を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２３を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２４を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２５を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２６を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２７を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２８を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２９を含むことができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含むことができる。

【0093】

いくつかの実施形態において、スペーサー配列は、表５の配列又は表５の配列の一部分と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１７を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１８を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１９を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２０を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２１を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２２を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２３を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２４を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。

【0094】

スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２５を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２６を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２７を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２８を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２９を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。スペーサー配列は、配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含む配列と少なくとも９０％の同一性を有することができる。

【0095】

【表5-1】

【0096】

【表5-2】

【0097】

【表5-3】

【0098】

【表5-4】

【0099】

【表5-5】

【0100】

【表5-6】

【0101】

【表5-7】

【0102】

【表5-8】

【0103】

【表5-9】

【0104】

【表5-10】

【0105】

【表5-11】

【0106】

【表5-12】

【0107】

【表5-13】

【0108】

【表5-14】

【0109】

【表5-15】

【0110】

【表5-16】

【0111】

【表5-17】

【0112】

【表5-18】

【0113】

【表5-19】

【0114】

【表5-20】

【0115】

【表5-21】

【0116】

【表5-22】

【0117】

【表5-23】

【0118】

【表5-24】

【0119】

【表5-25】

【0120】

【表5-26】

【0121】

【表5-27】

【0122】

【表5-28】

【0123】

【表5-29】

【0124】

【表5-30】

【0125】

本開示は、本明細書の開示と一致する、上記で列挙されるダイレクトリピート及びスペーサーの全ての組み合わせを含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるスペーサー配列は、ウラシル（Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるスペーサー配列は、チミン（Ｔ）を含む。いくつかの実施形態において、表５によるスペーサー配列は、チミンを、表５にウラシルとして示される１つ以上の場所に含む配列を含む。

【0127】

（ｉｉｉ）．例示的なＲＮＡガイド
本開示は、本明細書に記載される（例えば、上記の表５に記載される）ダイレクトリピート及びスペーサーのあらゆる組み合わせを含むＲＮＡガイドを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの配列は、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される例示的なＲＮＡガイドは、配列番号１０９３～１０９７のうちのいずれか１つのスペーサー配列を含み得る。一例において、ＲＮＡガイドは、配列番号１０９６のスペーサーを含み得る。

【0129】

本明細書に開示される例示的なＲＮＡガイドのうちのいずれかは、配列番号１～１０のうちのいずれか１つのダイレクト配列、又は少なくとも２３ヌクレオチド長であるその断片を含み得る。一例において、ダイレクト配列は、配列番号１０を含み得る。

【0130】

具体的な例において、本明細書で提供されるＲＮＡガイドは、配列番号９６７、９６８、９８８、９８９、又は９９４のヌクレオチド配列を含み得る。一例において、本明細書で提供されるＲＮＡガイドは、配列番号９８９のヌクレオチド配列を含む。

【0131】

（ｉｖ）．修飾
ＲＮＡガイドは、参照配列、特に、親ポリリボヌクレオチドに対して１つ以上の共有結合修飾を含み得、これらの共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。

【0132】

例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）、及びそれらのいずれかの組み合わせへのいずれもの修飾を含むことができる。本明細書で提供される例示的な修飾のうちのいくつかは、以下に詳細に記載される。

【0133】

ＲＮＡガイドは、いずれもの有用な修飾、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）への修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置換（ｒｅｐｌａｃｅ）又は置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）され得る。ある実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はそれらのハイブリッド）への修飾であり得る。追加の修飾は、本明細書に記載される。

【0134】

いくつかの実施形態において、修飾は、化学又は細胞誘導性修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎによって、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からの“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ＲＮＡ ｇｕｉｄｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”に記載されている。

【0135】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が、配列における様々な位置に存在し得る。ヌクレオチド類似体又は他の修飾（複数可）は、配列の機能が実質的に減少しないように、配列のいずれかの位置（複数可）に位置し得ることが、当業者には理解されよう。配列は、（全体のヌクレオチド含有量に対して、又は１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、若しくはＣのうちのいずれか１つ以上に対して）約１％～約１００％の修飾ヌクレオチドを含んでもよく、又はいずれかの介在百分率（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

【0136】

いくつかの実施形態において、（例えば、２’位又は４’位の）糖修飾、又は配列の１つ以上のリボヌクレオチドにおける糖の置換、及び骨格修飾は、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。配列の具体的な例としては、修飾骨格を含む配列、又は非自然ヌクレオシド間結合、例えば、ホスホジエステル結合の修飾若しくは置換を含むヌクレオシド間修飾を含む配列が挙げられるが、これらに限定されない。修飾骨格を有する配列は、とりわけ、リン原子を骨格において有しないものを含む。本出願の目的で、かつ当該技術分野でしばしば言及されるように、リン原子をヌクレオシド間骨格において有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、配列は、リボヌクレオチドを含み、リボヌクレオチドは、リン原子をそのヌクレオシド間骨格において有する。

【0137】

修飾配列骨格は、例えば、ホスホロチオエート；キラルホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート；ホスフィネート；ホスホルアミデート、例えば、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート；チオノホスホルアミデート；チオノアルキルホスホネート；チオノアルキルホスホトリエステル；並びに直鎖状３’－５’結合を有するボラノホスフェート、それらの２’－５’結合類似体、及び隣接する対のヌクレオシドユニットが３’－５’から５’－３’又は２’－５’から５’－２’結合している逆極性を有するものを含み得る。また、様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態が含まれる。いくつかの実施形態において、配列は、負電荷又は正電荷を有し得る。

【0138】

配列内に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書で、ポリヌクレオチド骨格の文脈において、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、互換的に使用される。骨格ホスフェート基は、酸素原子のうちの１つ以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。更に、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載される別のヌクレオシド間結合での未修飾ホスフェート部分の広範な置換を含むことができる。修飾ホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換された非結合酸素の両方を有する。ホスフェートリンカーはまた、窒素（架橋ホスホルアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）での結合酸素の置換によって修飾され得る。

【0139】

αチオ置換されたホスフェート部分は、安定性を、非自然ホスホロチオエート骨格結合を介して、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性を有し、その後、細胞環境においてより長い半減期を有する。

【0140】

具体的な実施形態において、修飾ヌクレオシドは、アルファ－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－プソイドウリジン）を含む。

【0141】

リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本開示により使用され得る他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。

【0142】

いくつかの実施形態において、配列は、１つ以上の細胞傷害性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドを、二官能性修飾などのように配列内に組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシドとしては、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、並びに６－メルカプトプリンが挙げられるが、これらに限定されない。追加の例としては、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。

【0143】

いくつかの実施形態において、配列は、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、いずれかの転写後修飾、例えば、ＲＮＡにおいて特定されている１００個超の異なるヌクレオシド修飾のうちのいずれかであることができる（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）いくつかの実施形態において、第１の単離された核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。

【0144】

配列は、分子の長さ全体に沿って均一に修飾されてもよく又は修飾されなくてもよい。例えば、１つ以上又は全てのタイプのヌクレオチド（例えば、自然発生のヌクレオチド、プリン、若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのうちのいずれか１つ以上若しくは全て）は、配列において又はその所与の所定の配列領域内で均一に修飾されてもよく又は修飾されなくてもよい。いくつかの実施形態において、配列は、プソイドウリジンを含む。いくつかの実施形態において、配列は、イノシンを含み、イノシンは、配列を内在性対ウイルスＲＮＡとして特徴付ける免疫システムを援助し得る。イノシンの組み込みはまた、改善されたＲＮＡ安定性／低減された分解を媒介し得る。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたく、これは、その全体が参照により組み込まれる。

【0145】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドのヌクレオチドのうちの１つ以上は、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの最初の３個のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの最後の４個のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの最初から最後、第２から最後、及び第３から最後のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含み、ＲＮＡガイドの最後のヌクレオチドは、未修飾である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの最初の３個のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含み、ＲＮＡガイドの最初から最後、第２から最後、及び第３から最後のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。

【0146】

本明細書に開示される遺伝子編集システムが、本明細書に開示されるＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ分子を含むときに、このような核酸分子は、適用可能な場合、本明細書に開示される修飾のうちのいずれかを含有し得る。

【0147】

Ｂ．Ｃａｓ１２ｉポリペプチド
いくつかの実施形態において、本開示の組成物又はシステムは、ＷＯ／２０１９／１７８４２７に記載されているＣａｓ１２ｉポリペプチドを含み、その関連する開示は、本明細書で参照される主題のためにかつその目的で参照により組み込まれる。

【0148】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子編集システムは、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド（例えば、配列番号９２２を含み、かつ／又は配列番号９２１によってコードされたポリペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む。

【0149】

本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列、例えば、配列番号９２１と実質的に同一であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、配列番号９２１と最小約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされている。２つのこのような核酸間のパーセント同一性は、２つの最適にアラインメントされた核酸配列の検査によって手動で決定されてもよく、又はソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用して、標準パラメータを使用することによって決定されてもよい。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指示は、核酸分子が、温度及びイオン強度のストリンジェントな条件下（例えば、中度から高度のストリンジェンシーの範囲内）で他方の相補的配列にハイブリダイズするということである。例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｐａｒｔ Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ”（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ２４）を参照されたい。

【0150】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、配列番号９２１と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％以上の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性を有しない核酸配列によってコードされている。

【0151】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２２と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0152】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９２２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0153】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９２２のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが提供される。

【0154】

いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２２に対して、例えば、Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、Ｓ１０４６位の、又はそれらのいずれかの組み合わせにおける１つ以上の変異を含有し得る。いくつかの事例において、１つ以上の変異は、アミノ酸置換、例えば、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、Ｓ１０４６Ｇ、又はそれらの組み合わせである。

【0155】

いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｄ９１１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異を含有する。このようなＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１Ｒ、Ｄ９１１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換（例えば、配列番号９２３）を含有し得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｉ９２６、及びＶ１０３０位の変異を含有する。このようなＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、及びＶ１０３０Ｇのアミノ酸置換（例えば、配列番号９２４）を含有し得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、及びＳ１０４６位の変異を含有し得る。このようなＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換（例えば、配列番号９２５）を含有し得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異を含有し得る。このようなＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換（例えば、配列番号９２６）を含有し得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１、Ｇ６２４、Ｆ６２６、Ｐ８６８、Ｉ９２６、Ｖ１０３０、Ｅ１０３５、及びＳ１０４６位の変異を含有し得る。このようなＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、Ｄ５８１Ｒ、Ｇ６２４Ｒ、Ｆ６２６Ｒ、Ｐ８６８Ｔ、Ｉ９２６Ｒ、Ｖ１０３０Ｇ、Ｅ１０３５Ｒ、及びＳ１０４６Ｇのアミノ酸置換（例えば、配列番号９２７）を含有し得る。

【0156】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、又は配列番号９２７と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、又は配列番号９２７と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドは、ポリペプチドをそのそれぞれの親／参照配列から区別するアミノ酸変化（又はこれらの変化のうちの少なくとも１、２、３つなど）を維持する。

【0157】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、又は配列番号９２７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0158】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、又は配列番号９２７のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドが提供される。

【0159】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ４ポリペプチド（例えば、配列番号９５６を含み、かつ／又は配列番号９５５によってコードされたポリペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む。

【0160】

本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列、例えば、配列番号９５５と実質的に同一であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、配列番号９５５と最小約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされている。２つのこのような核酸間のパーセント同一性は、２つの最適にアラインメントされた核酸配列の検査によって手動で決定されてもよく、又はソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用して、標準パラメータを使用することによって決定されてもよい。２つの核酸配列が実質的に同一であるという１つの指示は、核酸分子が、温度及びイオン強度のストリンジェントな条件下（例えば、中度から高度のストリンジェンシーの範囲内）で他方の相補的配列にハイブリダイズするということである。

【0161】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、配列番号９５５と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％以上の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性を有しない核酸配列によってコードされている。

【0162】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、配列番号９５６と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0163】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９５６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0164】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９５６のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドが提供される。

【0165】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、配列番号９５７又は配列番号９５８の配列を含むポリペプチドを含む。

【0166】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、配列番号９５７又は配列番号９５８と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号９５７又は配列番号９５８と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、それをそのそれぞれの親／参照配列から区別するアミノ酸変化（又はこれらの変化のうちの少なくとも１、２、３つなど）を維持する。

【0167】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９５７又は配列番号９５８のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0168】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ４ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９５７又は配列番号９５８のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドが提供される。

【0169】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ１ポリペプチド（例えば、配列番号９６５を含むポリペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む。

【0170】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ１ポリペプチドは、配列番号９６５と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0171】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９６５のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ１ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0172】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ１ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９６５のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ１ポリペプチドが提供される。

【0173】

いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ３ポリペプチド（例えば、配列番号９６６を含むポリペプチド）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉ４ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣドメインを含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドは、配列番号９６６と少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の参照ポリペプチドと特定の程度のアミノ酸配列同一性を有し、例えば、配列番号９６６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％であるが、１００％でない配列同一性を有するＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、本明細書に記載されるように決定され得る。

【0176】

また、酵素的活性、例えば、ヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ活性を有する本開示のＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドであって、上記のアラインメント方法のうちのいずれかを使用してアラインメントされたときに、配列番号９６６のアミノ酸配列と５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は０個のアミノ酸残基によって異なるアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉ３ポリペプチドが提供される。

【0177】

本明細書に記載される変化は、１つ以上のアミノ酸変化であり得るが、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドへの変化はまた、実質的な性質のものであり得、例えば、アミノ及び／又はカルボキシルの末端伸長としてのポリペプチドの融合であり得る。例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、追加のペプチド、例えば、１つ以上のペプチドを含有し得る。追加のペプチドの例としては、標識のためのエピトープペプチド、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、Ｍｙｃ、及びＦＬＡＧが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉポリペプチドは、検出可能な部分、例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））に融合し得る。

【0178】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、又は６つ以上）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、又は６つ以上）の核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、又は６つ以上）のＮＬＳと、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５、又は６つ以上）のＮＥＳと、を含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉポリペプチドは、自己不活型であることができる。Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０を参照されたく、これは、その全体が参照により組み込まれる。

【0180】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞又は生物における使用のためにコドン最適化され得る。例えば、核酸は、いずれかの非ヒト真核生物のためにコドン最適化され得、非ヒト真核生物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト霊長類を含む。コドン使用表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／において入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの様式で適合され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたく、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、特定の宿主細胞における発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズム、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）が入手可能である。いくつかの例において、本明細書に開示されるＣａｓ１２ｉポリペプチド、例えば、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドをコードする核酸は、コドン最適化され得るｍＲＮＡ分子であることができる。

【0181】

例示的なＣａｓ１２ｉポリペプチド配列及び対応するヌクレオチド配列は、表６に列挙される。

【0182】

【表6-1】

【0183】

【表6-2】

【0184】

【表6-3】

【0185】

【表6-4】

【0186】

【表6-5】

【0187】

【表6-6】

【0188】

【表6-7】

【0189】

【表6-8】

【0190】

【表6-9】

【0191】

【表6-10】

【0192】

【表6-11】

【0193】

【表6-12】

【0194】

【表6-13】

【0195】

【表6-14】

【0196】

【表6-15】

【0197】

【表6-16】

【0198】

【表6-17】

【0199】

【表6-18】

【0200】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子編集システムは、本明細書に開示されるＣａｓ１２ｉポリペプチドを含み得る。他の実施形態において、遺伝子編集システムは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする核酸を含み得る。例えば、遺伝子編集システムは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２）を含み得る。代替として、遺伝子編集システムは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含み得る。いくつかの事例において、ｍＲＮＡ分子は、コドン最適化され得る。

【0201】

ＩＩ．遺伝子編集システム構成要素の調製
本開示は、本明細書に開示される遺伝子編集システムの構成要素、例えば、ＲＮＡガイドの産生方法、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの産生方法、及びＲＮＡガイドとＣａｓ１２ｉポリペプチドとの複合体を形成するための方法を提供する。

【0202】

Ａ．ＲＮＡガイド
いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によって作製される。したがって、例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＲＮＡガイドをコードする鋳型ＤＮＡのインビトロ転写によって、上流プロモーター配列（例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列）を使用して生成される。いくつかの実施形態において、鋳型ＤＮＡは、複数のＲＮＡガイドをコードするか、又はインビトロ転写反応は、複数の異なる鋳型ＤＮＡを含み、これらの鋳型ＤＮＡはそれぞれ、異なるＲＮＡガイドをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、化学合成方法を使用して作製される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＲＮＡガイド配列を、ＲＮＡガイドをコードする配列を含むプラスミドでトランスフェクトされた細胞において発現させることによって作製される。いくつかの実施形態において、プラスミドは、複数の異なるＲＮＡガイドをコードする。いくつかの実施形態において、それぞれが異なるＲＮＡガイドをコードする複数の異なるプラスミドは、細胞内にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＲＮＡガイドをコードしＣａｓ１２ｉポリペプチドもコードするプラスミドから発現される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、ＲＮＡガイドを発現するが、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを発現しないプラスミドから発現される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、販売業者から購入される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、上記のものを使用して合成される。

【0203】

Ｂ．Ｃａｓ１２ｉポリペプチド
いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドは、（ａ）本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドを産生する細菌を培養し、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを単離し、任意選択で、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを精製し、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドとＲＮＡガイドとの複合体を形成することによって調製され得る。Ｃａｓ１２ｉポリペプチドはまた、（ｂ）既知の遺伝子操作技法によって、具体的には、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする遺伝子を細菌から単離し、組換え発現ベクターを構築し、次いで、ベクターを適切な宿主細胞内に移入し、宿主細胞が、組換えタンパク質の発現のためのＲＮＡガイドを発現し、組換えタンパク質が、宿主細胞においてＲＮＡガイドと複合体を形成することによって調製され得る。代替として、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、（ｃ）インビトロカップリング転写－翻訳システム、次いで、ＲＮＡガイドとの複合体形成によって調製され得る。

【0204】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを発現するために使用される。宿主細胞は、特に限定されず、様々な既知の細胞が、好ましく使用され得る。宿主細胞の具体的な例としては、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母（出芽酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及び分裂酵母であるＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵母細胞、及び動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。上記の発現ベクターを宿主細胞内に移入するための方法、すなわち、形質転換方法は、特に限定されず、既知の方法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム方法、リポソーム方法、及びＤＥＡＥデキストラン方法が使用され得る。

【0205】

宿主が発現ベクターで形質転換された後に、宿主細胞は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの産生のために培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）されてもよく、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）されてもよく、又は繁殖させてもよい。Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの発現後に、宿主細胞は、収集され得、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、従来の方法（例えば、濾過、遠心分離、細胞破壊、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）により、培養物などから精製され得る。

【0206】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド発現のための方法は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも５００個のアミノ酸、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも７００個のアミノ酸、少なくとも８００個のアミノ酸、少なくとも９００個のアミノ酸、又は少なくとも１０００個のアミノ酸の翻訳を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質発現のための方法は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸、約８００個のアミノ酸、約９００個のアミノ酸、又は約１０００個のアミノ酸以上の翻訳を含む。

【0207】

様々な方法が、宿主細胞におけるＣａｓ１２ｉポリペプチドの産生のレベルを決定するために使用され得る。このような方法としては、例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに特異的なポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、又は本明細書の他所に記載される標識タグのいずれかを使用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアッセイ及び他のアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。

【0208】

本開示は、細胞におけるＣａｓ１２ｉポリペプチドのインビボ発現の方法であって、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを宿主細胞に提供することであって、ポリリボヌクレオチドが、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする、提供することと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを細胞において発現させることと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを細胞から得ることと、を含む、方法を提供する。

【0209】

本開示は、細胞におけるＣａｓ１２ｉポリペプチドのインビボ発現の方法であって、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを宿主細胞に提供することであって、ポリリボヌクレオチドが、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする、提供することと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを細胞において発現させることと、を含む、方法を更に提供する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡガイドで細胞に送達され、細胞において発現されると、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド及びＲＮＡガイドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチド及びＲＮＡガイドは、単一の組成物内で細胞に送達される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチド及びＲＮＡガイドは、別個の組成物内に含まれている。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、対象、例えば、ヒト患者において存在する。

【0210】

Ｃ．複合体
いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと複合体を形成して、リボ核タンパク質を形成する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドとＣａｓ１２ｉポリペプチドとの複合体形成は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、又は５５℃のうちのいずれか１つよりも低い温度で発生する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、約３７℃で、少なくとも約１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、又は４時間以上のうちのいずれか１つのインキュベーション期間にわたってＣａｓ１２ｉポリペプチドから解離しない。

【0211】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、複合体形成緩衝液中で複合体を形成する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、緩衝液中に貯蔵され、緩衝液は、複合体形成緩衝液で置換されて、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＲＮＡガイドと複合体を形成する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、複合体形成緩衝液中に貯蔵される。

【0212】

いくつかの実施形態において、複合体形成緩衝液は、約７．３～８．６の範囲のｐＨを有する。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．３である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．４である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．５である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．６である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．７である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．８である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約７．９である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．０である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．１である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．２である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．３である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．４である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．５である。一実施形態において、複合体形成緩衝液のｐＨは、約８．６である。

【0213】

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、本明細書に記載される精製前に、宿主細胞において、過剰発現され得、ＲＮＡガイドと複合体を形成し得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドが細胞において発現されるように細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドはまた、リボ核タンパク質複合体が細胞において形成されるように、単一のｍＲＮＡ又はＤＮＡ構築物と同時に、別個に、又は逐次的に細胞内に導入される。

【0214】

ＩＩＩ．遺伝子編集方法
本開示はまた、ＨＡＯ１遺伝子内の標的部位を修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドを細胞内に導入することを含む。ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、リボ核タンパク質複合体として細胞内に導入され得る。ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、核酸ベクター上で導入され得る。Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｍＲＮＡとして導入され得る。ＲＮＡガイドは、細胞内に直接導入され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、細胞／組織／肝臓／人に送達されて、細胞／組織／肝臓／人におけるＨＡＯ１を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、細胞／組織／肝臓／人に送達されて、細胞／組織／肝臓／人におけるオキサレート産生を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、細胞／組織／肝臓／人に送達されて、細胞／組織／肝臓／人におけるシュウ酸カルシウム結晶沈着を補正する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物は、原発性高シュウ酸尿症を有する人に送達される。

【0215】

本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかは、遺伝子操作されたＨＡＯ１遺伝子ために使用され得る。遺伝子編集システムは、ＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチドと、を含み得る。ＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１遺伝子における標的配列に特異的なスペーサー配列、例えば、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１又はエクソン２内の領域に特異的なスペーサー配列を含む。

【0216】

Ａ．標的配列
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡガイドは、５’－ＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列又は５’－ＮＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列に隣接する標的配列と相補的であるように設計されている。

【0217】

いくつかの実施形態において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子又はＨＡＯ１遺伝子の遺伝子座内（例えば、エクソン１又はエクソン２内）にあり、ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介してそれに結合することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、標的配列の１つのコピーのみを有する。いくつかの実施形態において、細胞は、標的配列の２つ以上のコピー、例えば、少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、又は１００個以上のコピーのうちのいずれか１つを有する。

【0218】

いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子は、哺乳類遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子は、ヒト遺伝子である。例えば、いくつかの実施形態において、標的配列は、配列番号９２８の配列（又はその逆相補的配列）内にある。いくつかの実施形態において、標的配列は、配列番号９２８に記載のＨＡＯ１遺伝子のエクソン内、例えば、配列番号９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、又は９３５の配列（又はその逆相補的配列）内にある。配列番号９２８のＨＡＯ１遺伝子のエクソン領域内の標的配列は、表５に記載される。いくつかの実施形態において、標的配列は、配列番号９２８（又はその逆相補的配列）に記載のＨＡＯ１遺伝子のイントロン内にある。いくつかの実施形態において、標的配列は、配列番号９２８（又はその逆相補的配列）に記載のＨＡＯ１遺伝子配列のバリアント（例えば、多型バリアント）内にある。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子配列は、配列番号９２８（又はその逆相補的配列）に記載の配列の相同配列である。例えば、いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子配列は、非ヒトＨＡＯ１配列である。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子配列は、配列番号１０２４（又はその逆相補的配列）に記載のコード配列である。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１遺伝子配列は、配列番号１０２４（又はその逆相補的配列）に記載のコード配列の相同配列である。

【0219】

いくつかの実施形態において、標的配列は、５’－ＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列又は５’－ＮＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列に隣接し、配列において、Ｎは、いずれかのヌクレオチドである。５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、標的配列に直接隣接してもよく、又は、例えば、標的配列の少ない数（例えば、１、２、３、４、又は５個）のヌクレオチド内にあってもよい。いくつかの実施形態において、５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、５’－ＮＴＴＹ－３’、５’－ＮＴＴＣ－３’、５’－ＮＴＴＴ－３’、５’－ＮＴＴＡ－３’、５’－ＮＴＴＢ－３’、５’－ＮＴＴＧ－３’、５’－ＣＴＴＹ－３’、５’－ＤＴＴＲ－３’、５’－ＣＴＴＲ－３’、５’－ＤＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＮ－３’、又は５’－ＧＴＴＮ－３’であり、配列において、Ｙは、Ｃ又はＴであり、Ｂは、Ａを除くいずれかのヌクレオチドであり、Ｄは、Ｃ又はＧを除くいずれかのヌクレオチドであり、Ｒは、Ａ又はＧである。いくつかの実施形態において、５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’である。ＰＡＭ配列は、標的配列に対して５’であり得る。

【0220】

５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、標的配列に直接隣接してもよく、又は、例えば、標的配列の少ない数（例えば、１、２、３、４、又は５個）のヌクレオチド内にあってもよい。いくつかの実施形態において、５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、５’－ＮＴＴＹ－３’、５’－ＮＴＴＣ－３’、５’－ＮＴＴＴ－３’、５’－ＮＴＴＡ－３’、５’－ＮＴＴＢ－３’、５’－ＮＴＴＧ－３’、５’－ＣＴＴＹ－３’、５’－ＤＴＴＲ－３’、５’－ＣＴＴＲ－３’、５’－ＤＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＮ－３’、又は５’－ＧＴＴＮ－３’であり、配列において、Ｙは、Ｃ又はＴであり、Ｂは、Ａを除くいずれかのヌクレオチドであり、Ｄは、Ｃを除くいずれかのヌクレオチドであり、Ｒは、Ａ又はＧである。いくつかの実施形態において、５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、二本鎖標的核酸の第１の鎖（すなわち、非ＰＡＭ鎖）に結合するように設計されており、５’－ＮＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列は、第２の相補的鎖（すなわち、ＰＡＭ鎖）内に存在する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、５’－ＮＡＡＮ－３’配列に隣接するＰＡＭ鎖上の標的配列と相補的である非ＰＡＭ鎖上の領域に結合する。

【0221】

いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞内に存在する。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核内に存在する。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞に内在性である。いくつかの実施形態において、標的配列は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的配列は、染色体ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的配列は、タンパク質コード遺伝子若しくはその機能領域、例えば、コード領域、又は調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’若しくは３’非翻訳領域などである。

【0222】

いくつかの実施形態において、標的配列は、標的配列の容易にアクセス可能な領域内に存在する。いくつかの実施形態において、標的配列は、標的遺伝子のエクソン内にある。いくつかの実施形態において、標的配列は、標的遺伝子のエクソン－イントロン接合部にわたる。いくつかの実施形態において、標的配列は、遺伝子の非コード領域、例えば、調節領域内に存在する。

【0223】

Ｂ．遺伝子編集
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、酵素的活性（例えば、ヌクレアーゼ活性）を有する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、細胞において１つ以上のＤＮＡ二本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、細胞において１つ以上のＤＮＡ一本鎖切断を誘導する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、細胞において１つ以上のＤＮＡニックを誘導する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ切断及び／又はＤＮＡニックは、１つ以上のインデル（例えば、１つ以上の欠失）の形成をもたらす。

【0224】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示するＲＮＡガイドは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと複合体を形成し、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを、５’－ＮＴＴＮ－３’配列に隣接する標的配列に向ける。いくつかの実施形態において、複合体は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列に隣接する欠失（例えば、ヌクレオチド欠失又はＤＮＡ欠失）を誘導する。いくつかの実施形態において、複合体は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列に隣接する欠失を誘導する。いくつかの実施形態において、複合体は、Ｔ／Ｃリッチ配列に隣接する欠失を誘導する。

【0225】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流にある。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流にある。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流にある。

【0226】

いくつかの実施形態において、欠失は、ＨＡＯ１遺伝子の発現を改変する。いくつかの実施形態において、欠失は、ＨＡＯ１遺伝子の機能を改変する。いくつかの実施形態において、欠失は、ＨＡＯ１遺伝子を不活性化する。いくつかの実施形態において、欠失は、フレームシフト欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、非フレームシフト欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、細胞毒性又は細胞死（例えば、アポトーシス）をもたらす。

【0227】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。

【0228】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。

【0229】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。

【0230】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始する。

【0231】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。

【0232】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始する。

【0233】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0234】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0235】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0236】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0237】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0238】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0239】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0240】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0241】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0242】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0243】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0244】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１５個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0245】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0246】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0247】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１０個のヌクレオチド内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で終了する。

【0248】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0249】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0250】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約５～約１０個のヌクレオチド（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0251】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0252】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約３０個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0253】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0254】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２０～約２５個のヌクレオチド（例えば、約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）内で終了する。

【0255】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0256】

いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。いくつかの実施形態において、欠失は、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約１０～約１５個のヌクレオチド（例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）内で開始し、Ｔ／Ｃリッチ配列の下流の約２５～約３０個のヌクレオチド（例えば、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、又は３３個のヌクレオチド）内で終了する。

【0257】

いくつかの実施形態において、欠失は、最大約４０ヌクレオチド長（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５個のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、欠失は、約４ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド長（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５個のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、欠失は、約４ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド長（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、欠失は、約１０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド長（例えば、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８個のヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、欠失は、約１０ヌクレオチド～約１５ヌクレオチド長（例えば、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個のヌクレオチド）である。

【0258】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、ＨＡＯ１遺伝子における本明細書に記載される欠失を含む細胞を操作するために使用される。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されるＣａｓ１２ｉ酵素と、本明細書に記載されるダイレクトリピート及びスペーサーを含むＲＮＡガイドと、を含む複合体を使用して実施される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドの配列は、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）を有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0259】

いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドは、プラスミドにおいてコードされている。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡガイドは、合成又は精製ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、プラスミドにおいてコードされている。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＲＮＡによってコードされており、ＲＮＡは、合成又は精製のものである。

【0260】

Ｃ．送達
本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかの構成要素は、製剤化され得、例えば、担体及び／又はポリマー担体などの担体、例えば、リポソームを含み得、既知の方法によって、細胞（例えば、原核生物、真核生物、植物、哺乳類など）に送達され得る。このような方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）、エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、ｆｕｇｅｎｅ、ダイレクトソニックローディング、セルスクイージング、光トランスフェクション、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、エクソーム媒介性移入、脂質ナノ粒子媒介性移入、及びそれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0261】

いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の核酸（例えば、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、ＲＮＡガイド、ドナーＤＮＡなどをコードする核酸）、１つ以上のそれらの転写物、及び／又は予め形成されたＲＮＡガイド／Ｃａｓ１２ｉポリペプチド複合体を細胞に送達することであって、細胞において、三元複合体が形成される、送達することを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、単一の組成物内で一緒に送達される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、別個の組成物内で送達される。いくつかの実施形態において、別個の組成物内で送達されるＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、同じ送達技術を使用して送達される。いくつかの実施形態において、別個の組成物内で送達されるＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするＲＮＡは、異なる送達技術を使用して送達される。例示的な細胞内送達方法としては、ウイルス、例えば、ＡＡＶ、又はウイルス様薬剤；化学ベースのトランスフェクション方法、例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、脂質ナノ粒子、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン）を使用するもの；非化学的方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、光トランスフェクション、インパレフェクション、プロトプラスト融合、細菌コンジュゲーション、プラスミド又はトランスポゾンの送達；粒子ベースの方法、例えば、遺伝子銃、マグネクトフェクション又は磁気アシストトランスフェクション、粒子銃の使用；及びハイブリッド方法、例えば、ヌクレオフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ＲＮＡガイド、又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及びＲＮＡガイドを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、配列番号９２１若しくは配列番号９５５に記載のヌクレオチド配列の転写物、又はそのバリアントである。いくつかの実施形態において、本出願は、このような方法によって産生される細胞、及びこのような細胞を含むか又はそれから産生される生物（例えば、動物、植物、又は真菌）を更に提供する。

【0262】

Ｄ．遺伝子改変細胞
本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれもが、様々な細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞培養又は２つ以上の細胞型の共培養におけるものである。いくつかの実施形態において、細胞は、エクスビボである。いくつかの実施形態において、細胞は、生存生物から得られ、細胞培養において維持される。いくつかの実施形態において、細胞は、単細胞生物である。

【0263】

いくつかの実施形態において、細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞であるか又は細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、古細菌細胞であるか又は古細菌細胞に由来する。

【0264】

いくつかの実施形態において、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞であるか又は植物細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、真菌細胞であるか又は真菌細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、動物細胞であるか又は動物細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、無脊椎動物細胞であるか又は無脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞であるか又は脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞であるか又は哺乳類細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ゼブラフィッシュ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、げっ歯類細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、合成的に作製され、しばしば、人工細胞と称される。

【0265】

いくつかの実施形態において、細胞は、細胞株に由来する。組織培養のための多種多様な細胞株が、当該技術分野で既知である。細胞株の例としては、２９３Ｔ、ＭＦ７、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられるが、これらに限定されない。細胞株は、当業者に既知の様々な供給源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、細胞は、不死又は不死化細胞である。

【0266】

いくつかの実施形態において、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞、例えば、全能性幹細胞（例えば、万能）、多能性幹細胞、複能性幹細胞、寡能性幹細胞、又は単能性幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるか又はｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、分化細胞である。例えば、いくつかの実施形態において、分化細胞は、肝臓細胞（例えば、肝細胞）、胆管細胞（ｂｉｌｉａｒｙ ｃｅｌｌ）（例えば、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｙｔｅ））、星状細胞、クッパー細胞、肝類洞壁内皮細胞、筋肉細胞（例えば、筋細胞）、脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ）（例えば、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ））、骨細胞（ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ）（例えば、骨芽細胞、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、破骨細胞）、血液細胞（例えば、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、赤血球、又は血小板）、神経細胞（例えば、ニューロン）、上皮細胞、免疫細胞（例えば、リンパ球、好中球、単球、又はマクロファージ）、線維芽細胞、又は性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、最終分化細胞である。例えば、いくつかの実施形態において、最終分化細胞は、ニューロン細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、表皮細胞、又は腸細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞又はマウス細胞である。いくつかの実施形態において、マウス細胞は、野生型マウス、免疫抑制マウス、又は疾患特異的マウスモデルに由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、生存組織、臓器、又は生物内の細胞である。

【0267】

また、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかを使用して産生される遺伝子改変細胞のうちのいずれもが、本開示の範囲内である。このような改変細胞は、破壊されたＨＡＯ１遺伝子を含み得る。

【0268】

本明細書に開示される組成物、ベクター、核酸、ＲＮＡガイド、及び細胞は、療法において使用され得る。本明細書に開示される組成物、ベクター、核酸、ＲＮＡガイド、及び細胞は、対象における疾患又は状態を治療する方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、である当該技術分野で既知のいずれかの好適な送達又は投与方法が、本明細書に開示される組成物、ベクター、核酸、ＲＮＡガイド、及び細胞を送達するために使用され得る。このような方法は、標的配列を、本明細書に開示される組成物、ベクター、核酸、又はＲＮＡガイドと接触させることを含み得る。このような方法は、本明細書に開示されるＨＡＯ１配列を編集する方法を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＲＮＡガイドを使用して操作された細胞は、エクスビボ遺伝子療法のために使用される。

【0269】

ＩＶ．治療用途
本明細書に開示される遺伝子編集システム又はこのような遺伝子編集システムを使用して生成される改変細胞のうちのいずれかは、ＨＡＯ１遺伝子に関連する疾患、例えば、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＰＨは、ＰＨ１、ＰＨ２、又はＰＨ３である。具体的な例において、標的疾患は、ＰＨ１である。

【0270】

本明細書に開示される遺伝子編集システム、このような遺伝子編集システムを含む薬学的組成物又はキット、及びＲＮＡガイドのうちのいずれかは、対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療するために使用され得る。ＰＨは、幼児から高齢者までの全ての年齢の対象をもたらす希少遺伝性障害である。ＰＨは、３つのサブタイプを含み、３つのサブタイプは、３つの異なるタンパク質の発現を改変する遺伝的欠陥に関係する。ＰＨ１は、アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ又はＡＧＴ／ＡＧＴ１に関係する。ＰＨ２は、グリオキシレート／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ又はＧＲ／ＨＰＲに関係し、ＰＨ３は、４－ヒドロキシ－２－オキソグルタル酸アルドラーゼ又はＨＯＧＡに関係する。

【0271】

ＰＨ１では、過剰なオキサレートはまた、カルシウムと組み合わせて、腎臓及び他の臓器内でシュウ酸カルシウムを形成し得る。シュウ酸カルシウムの沈着は、シュウ酸カルシウムの広範な堆積（腎石灰化症）又は腎臓及び膀胱結石の形成（尿路結石症）を生じさせ、腎臓損傷を引き起こすことがある。ＰＨ１における一般的な腎臓合併症としては、尿内の血液（血尿）、尿路感染症、腎臓損傷、及び末期腎疾患（ＥＳＲＤ）が挙げられる。時間が経つにつれて、ＰＨ１を患う患者の腎臓は機能しなくなり始め、オキサレートのレベルが血中で上昇する場合がある。全身の組織中のオキサレートの沈着、例えば、全身性シュウ酸症は、高い血中オキサレートレベルに起因して起こる場合があり、骨、皮膚、及び眼における合併症につながる場合がある。ＰＨ１を患う患者は、通常、若年齢で腎不全を患い、腎透析又は二重腎臓／肝臓臓器移植が唯一の治療選択肢となる。

【0272】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的疾患（例えば、ＰＨ、例えば、ＰＨ１）を治療するための方法であって、治療を必要としている対象（例えば、ヒト患者）に、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかを投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。遺伝子編集システムは、遺伝子編集が必要とされる特定の組織又は特定の細胞型に送達され得る。遺伝子編集システムは、ＬＮＰを含み得、ＬＮＰは、構成要素のうちの１つ以上、構成要素のうちの１つ以上をコードする１つ以上のベクター（例えば、ウイルスベクター）、又はそれらの組み合わせを包含する。遺伝子編集システムの構成要素は、製剤化されて、薬学的組成物を形成し得、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体を更に含み得る。

【0273】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子編集システムのうちのいずれかを使用して産生される改変細胞は、治療を必要としている対象（例えば、ヒト患者）に投与され得る。改変細胞は、本明細書に記載される置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。いくつかの例において、改変細胞は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、逆転写酵素ポリペプチド、及び編集鋳型ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド及びＲＴドナーＲＮＡ）によって改変された細胞株を含み得る。いくつかの事例において、改変細胞は、異質性集団であり得、異質性集団は、異なるタイプの遺伝子編集を有する細胞を含む。代替として、改変細胞は、実質的に均質な細胞集団（例えば、全集団における細胞の少なくとも８０％）を含み得、実質的に均質な細胞集団は、ＨＡＯ１遺伝子における１つの特定の遺伝子編集を含む。いくつかの例において、細胞は、好適な培地中に懸濁し得る。

【0274】

いくつかの実施形態において、遺伝子編集システム又はその構成要素を含む組成物が、本明細書で提供される。このような組成物は、薬学的組成物であることができる。有用である薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、病巣内、頬側、眼、静脈内、臓器内、又は別の投与経路に好適な製剤内で調製、包装、又は販売され得る。本開示の薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、又は複数の単一単位用量として調製、包装、又は販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、対象に投与される薬学的組成物（例えば、遺伝子編集システム又はその構成要素）の別々の量、又はこのような投与量の好都合な分数、例えば、このような投与量の２分の１若しくは３分の１などである。

【0275】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される遺伝子編集システム又はその構成要素を含む薬学的組成物は、それを必要としている対象、例えば、ＨＡＯ１遺伝子に関連する肝臓疾患を患う対象に投与され得る。いくつかの事例において、遺伝子編集システム又はその構成要素は、特定の細胞又は組織（例えば、肝臓細胞）に送達され得、遺伝子編集システムは、このような細胞におけるＨＡＯ１遺伝子を遺伝的に改変するように機能し得る。

【0276】

非経口投与に好適な薬学的組成物の製剤は、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水又は滅菌等張生理食塩水と組み合わされた活性剤（例えば、遺伝子編集システム若しくはその構成要素、又は改変細胞）を含み得る。このような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に好適な形態で調製、包装、又は販売され得る。いくつかの注射可能製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤を収容するアンプル又は複数用量容器内で調製、包装、又は販売され得る。非経口投与のためのいくつかの製剤としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、及び埋め込み型持続放出又は生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの製剤としては、１つ以上の追加の成分を更に含み得、１つ以上の追加の成分は、懸濁剤、安定化剤、又は分散剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0277】

薬学的組成物は、滅菌注射可能水性又は油性懸濁液又は溶液の形態であり得る。この懸濁液又は溶液は、既知の技術により製剤化され得、細胞に加えて、追加の成分、例えば、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤を含み得る。このような滅菌注射可能製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒、例えば、水又は生理食塩水を使用して調製され得る。他の許容される希釈剤及び溶媒としては、リンゲル溶液、等張食塩水、及び固定油、例えば、合成モノ又はジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。有用である他の親投与可能な製剤は、細胞を、包装された形態で、リポソーム調製物内で、又は生分解性ポリマーシステムの構成要素として含み得るものを含む。持続放出又は埋め込みのためのいくつかの組成物は、薬学的に許容されるポリマー又は疎水性材料、例えば、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含み得る。

【0278】

Ｖ．キット及びそれらの使用
本開示はまた、例えば、ＨＡＯ１遺伝子の遺伝子改変のための本明細書に記載される方法を実施するために使用され得るキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態において、キットは、このようなＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択で、ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、本明細書に記載されるベクター内に含まれている。（例えば、リボ核タンパク質としての）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド及びＲＮＡガイドは、キット若しくはシステム内の同じ若しくは他の容器内に包装されてもよく、又は別個のバイアル若しくは他の容器内に包装されてもよく、それらの内容物は、使用前に混合され得る。加えて、キットは、任意選択で、緩衝液、並びに／又はＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドの使用についての説明書を含むことができる。

【0279】

いくつかの実施形態において、キットは、研究目的で有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、キットは、遺伝子機能を研究するのに有用であり得る。

【0280】

本明細書で引用される全ての参照文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0281】

追加の実施形態
追加の実施形態が以下で提供され、追加の実施形態もまた、本開示の範囲内である。

【0282】

実施形態１：ＲＮＡガイドを含む組成物であって、ＲＮＡガイドが、（ｉ）ＨＡＯ１遺伝子内の非ＰＡＭ鎖上の領域（標的配列の相補的配列）と実質的に相補的又は完全に相補的であるスペーサー配列と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含み、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭが、配列５’－ＮＴＴＮ－３’を含む、組成物。

【0283】

実施形態１において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７内にあり得る。いくつかの例において、ＨＡＯ１遺伝子は、配列番号９２８の配列、配列番号９２８の逆相補的配列、配列番号９２８のバリアント、又は配列番号９２８のバリアントの逆相補的配列を含む。

【0284】

実施形態１において、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含み得る。

【0285】

実施形態１の組成物のうちのいずれかにおいて、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含み得る。

【0286】

実施形態１の組成物のうちのいずれかにおいて、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含み得る。

【0287】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、（又はａａ）配列番号１０若しくはその一部分）を含む。

【0288】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列）を含む。

【0289】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（又はｏ）配列番号９５４若しくはその一部分を含む。

【0290】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１の配列、又はその一部分と少なくとも９０％同一である配列）を含む。

【0291】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しく配列番号９６１、又はその一部分）を含む。

【0292】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列）を含む。

【0293】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４若しくはその一部分）を含む。

【0294】

いくつかの例において、スペーサー配列は、配列番号１１～４６５のうちのいずれか１つの配列の相補的配列と実質的に相補的又は完全に相補的である。

【0295】

実施形態１の組成物のうちのいずれかにおいて、ＰＡＭは、配列５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’を含み得る。

【0296】

いくつかの例において、標的配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接する。

【0297】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。

【0298】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0299】

実施形態２：実施形態１の組成物は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを更に含み得、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又はポリリボヌクレオチドは、以下、（ａ）配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、若しくは配列番号９２７の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド、（ｂ）配列番号９５６、配列番号９５７、若しくは配列番号９５８の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ４ポリペプチド、（ｃ）配列番号９６５の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ１ポリペプチド、又は（ｄ）配列番号９６６の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドのうちの１つであることができる。

【0300】

具体的な例において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、（ａ）配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、若しくは配列番号９２７の配列を含むＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド、（ｂ）配列番号９５６、配列番号９５７、若しくは配列番号９５８の配列を含むＣａｓ１２ｉ４ポリペプチド、（ｃ）配列番号９６５の配列を含むＣａｓ１２ｉ１ポリペプチド、又は（ｄ）配列番号９６６の配列を含むＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドである。

【0301】

実施形態２の組成物のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。いくつかの例において、リボ核タンパク質複合体は、標的核酸に結合する。いくつかの例において、組成物は、細胞内に存在する。

【0302】

実施形態２の組成物のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、ベクター、例えば、発現ベクターにおいてコードされ得る。いくつかの例において、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、単一のベクターにおいてコードされている。他の例において、ＲＮＡガイドは、第１のベクターにおいてコードされており、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、第２のベクターにおいてコードされている。

【0303】

実施形態３：１つ以上のベクターを含むベクターシステムであって、１つ以上のベクターが、本明細書に開示されるＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする、ベクターシステム。いくつかの例において、ベクターシステムは、本明細書に開示されるＲＮＡガイドをコードする第１のベクターと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第２のベクターと、を含む。ベクターは、発現ベクターであり得る。

【0304】

実施形態４：ＲＮＡガイドと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと、を含む組成物であって、ＲＮＡガイドが、（ｉ）ＨＡＯ１遺伝子内の非ＰＡＭ鎖上の領域（標的配列の相補的配列）と実質的に相補的又は完全に相補的であるスペーサー配列と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、組成物。

【0305】

いくつかの例において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７内にあり、ＨＡＯ１遺伝子は、配列番号９２８の配列、配列番号９２８の逆相補的配列、配列番号９２８の配列のバリアント、又は配列番号９２８のバリアントの逆相補的配列を含み得る。

【0306】

いくつかの例において、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含む。

【0307】

いくつかの例において、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含む。

【0308】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列）を含む。

【0309】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０若しくはその一部分を含む。

【0310】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0311】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４若しくはその一部分を含む。

【0312】

いくつかの実施形態において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１の配列、又はその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0313】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１、又はその一部分を含む。

【0314】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0315】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４若しくはその一部分を含む。

【0316】

実施形態４の組成物のうちのいずれかにおいて、スペーサー配列は、配列番号１１～４６５のうちのいずれか１つの配列の相補的配列と実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。

【0317】

いくつかの例において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し、ＰＡＭは、配列５’－ＮＴＴＮ－３’を含む。いくつかの例において、ＰＡＭは、配列５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’を含む。

【0318】

いくつかの例において、標的配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接する。いくつかの例において、標的配列は、ＰＡＭ配列の１、２、３、４、又は５個のヌクレオチド内にある。

【0319】

実施形態４の組成物のうちのいずれかにおいて、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、（ａ）配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、若しくは配列番号９２７の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド、（ｂ）配列番号９５６、配列番号９５７、若しくは配列番号９５８の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ４ポリペプチド、（ｃ）配列番号９６５の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ１ポリペプチド、（又は（ｄ）配列番号９６６の配列と少なくとも９０％同一である配列を含むＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドである。

【0320】

いくつかの例において、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、（ａ）配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、若しくは配列番号９２７の配列を含むＣａｓ１２ｉ２ポリペプチド、（ｂ）配列番号９５６、配列番号９５７、若しくは配列番号９５８の配列を含むＣａｓ１２ｉ４ポリペプチド、（ｃ）配列番号９６５の配列を含むＣａｓ１２ｉ１ポリペプチド、又は（ｄ）配列番号９６６の配列を含むＣａｓ１２ｉ３ポリペプチドである。

【0321】

実施形態４の組成物のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、リボ核タンパク質複合体を形成し得る。いくつかの例において、リボ核タンパク質複合体は、標的核酸に結合する。

【0322】

実施形態４の組成物のうちのいずれかにおいて、組成物は、細胞内に存在し得る。

【0323】

実施形態４の組成物のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、ベクター、例えば、発現ベクターにおいてコードされ得る。いくつかの例において、ＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドは、単一のベクターにおいてコードされている。他の例において、ＲＮＡガイドは、第１のベクターにおいてコードされており、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、第２のベクターにおいてコードされている。

【0324】

実施形態５：１つ以上のベクターを含むベクターシステムであって、１つ以上のベクターが、本明細書に開示されるＲＮＡガイド及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードする、ベクターシステム。いくつかの例において、ベクターシステムは、本明細書に開示されるＲＮＡガイドをコードする第１のベクターと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第２のベクターと、を含む。いくつかの例において、ベクターは、発現ベクターである。

【0325】

実施形態６：（ｉ）ＨＡＯ１遺伝子内の非ＰＡＭ鎖上の領域（標的配列の相補的配列）と実質的に相補的又は完全に相補的であるスペーサー配列と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、ＲＮＡガイド。

【0326】

いくつかの例において、標的配列は、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、又はエクソン７内にあり、ＨＡＯ１遺伝子は、配列番号９２８の配列、配列番号９２８の逆相補的配列、配列番号９２８の配列のバリアント、又は配列番号９２８のバリアントの逆相補的配列を含み得る。

【0327】

いくつかの例において、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含む。

【0328】

いくつかの例において、スペーサー配列は、（ａ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１６、（ｂ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１７、（ｃ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１８、（ｄ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド１９、（ｅ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２０、（ｆ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２１、（ｇ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２２、（ｈ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２３、（ｉ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２４、（ｊ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２５、（ｋ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２６、（ｌ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２７、（ｍ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２８、（ｎ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド２９、又は（ｏ）配列番号４６６～９２０のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３０を含む。

【0329】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0330】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０若しくはその一部分を含む。

【0331】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0332】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４若しくはその一部分を含む。

【0333】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１の配列、又はその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0334】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１、又はその一部分を含む。

【0335】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0336】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４若しくはその一部分を含む。

【0337】

実施形態６のＲＮＡガイドのうちのいずれかにおいて、スペーサー配列は、配列番号１１～４６５のうちのいずれか１つの配列の相補的配列と実質的に相補的又は完全に相補的であり得る。

【0338】

実施形態６のＲＮＡガイドのうちのいずれかにおいて、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接し得、ＰＡＭは、配列５’－ＮＴＴＮ－３’を含み、配列において、Ｎは、いずれかのヌクレオチドである。いくつかの例において、ＰＡＭは、配列５’－ＡＴＴＡ－３’、５’－ＡＴＴＴ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＣＴＴＡ－３’、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＧ－３’、又は５’－ＣＴＴＣ－３’を含む。

【0339】

いくつかの例において、標的配列は、ＰＡＭ配列に直接隣接する。他の例において、標的配列は、ＰＡＭ配列の１、２、３、４、又は５個のヌクレオチド内にある。

【0340】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。いくつかの具体的な例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0341】

実施形態７：本明細書に記載されるＲＮＡガイドをコードする核酸。

【0342】

実施形態８：本明細書に記載されるＲＮＡガイドを含むベクター。

【0343】

実施形態９：本明細書に記載される組成物、ＲＮＡガイド、核酸、又はベクターを含む細胞。いくつかの例において、細胞は、真核細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、初代細胞、細胞株、幹細胞、又は肝細胞である。

【0344】

実施形態１０：本明細書に記載される組成物、ＲＮＡガイド、核酸、又はベクターを含むキット。

【0345】

実施形態１１：ＨＡＯ１配列を編集する方法であって、ＨＡＯ１配列を、本明細書に記載される組成物又はＲＮＡガイドと接触させることを含む、方法。いくつかの例において、方法は、インビトロで実施される。他の例において、方法は、エクスビボで実施される。

【0346】

いくつかの例において、ＨＡＯ１配列は、細胞内にある。

【0347】

いくつかの例において、組成物又はＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１配列における欠失を誘導する。いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列に隣接し、配列において、Ｎは、いずれかのヌクレオチドである。いくつかの具体的な例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流にある。いくつかの具体的な例において、欠失は、最大約４０ヌクレオチド長である。いくつかの事例において、欠失は、約４ヌクレオチド～４０ヌクレオチド、約４ヌクレオチド～２５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド、又は約１０ヌクレオチド～１５ヌクレオチド長である。

【0348】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約５個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド、約５個のヌクレオチド～約１０個のヌクレオチド、又は約１０個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始する。

【0349】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド、約５個のヌクレオチド～約１０個のヌクレオチド、又は約１０個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始する。

【0350】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の約２０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、又は約２５個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0351】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド、約２５個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0352】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0353】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド内で終了する。

【0354】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0355】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１０個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0356】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１０個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド内で終了する。

【0357】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約５個のヌクレオチド～約１０個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0358】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0359】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２０個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチド内で終了する。

【0360】

いくつかの例において、欠失は、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約１０個のヌクレオチド～約１５個のヌクレオチド内で開始し、５’－ＮＴＴＮ－３’配列の下流の約２５個のヌクレオチド～約３０個のヌクレオチド内で終了する。

【0361】

いくつかの例において、５’－ＮＴＴＮ－３’配列は、５’－ＣＴＴＴ－３’、５’－ＣＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＴ－３’、５’－ＧＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＴＣ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、又は５’－ＧＴＴＧ－３’である。

【0362】

いくつかの例において、欠失は、ＨＡＯ１配列における変異と重複する。いくつかの事例において、欠失は、ＨＡＯ１配列における挿入と重複する。いくつかの事例において、欠失は、ＨＡＯ１配列又はその一部分のリピート伸長を除去する。いくつかの事例において、欠失は、ＨＡＯ１配列のアレルの一方又は両方を破壊する。

【0363】

本明細書に記載される実施形態１～１０の組成物、ＲＮＡガイド、核酸、ベクター、細胞、キット、又は方法のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイドは、配列番号９６７～１０２３のうちのいずれか１つの配列を含み得る。

【0364】

実施形態１２：対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療する方法であって、ＰＨが、任意選択で、ＰＨ１、ＰＨ２、又はＰＨ３であり、方法が、対象に、本明細書に記載される組成物、ＲＮＡ、又は細胞のうちのいずれかを投与することを含む、方法。

【0365】

本明細書に記載される組成物、ＲＮＡガイド、細胞、キット、又は方法のうちのいずれかにおいて、ＲＮＡガイド、及び／又はＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドは、脂質ナノ粒子内に含まれ得る。いくつかの例において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドは、同じ脂質ナノ粒子内に含まれている。他の例において、ＲＮＡガイド、及びＣａｓ１２ｉポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドは、別個の脂質ナノ粒子内に含まれている。

【0366】

実施形態１３：（ｉ）ＨＡＯ１遺伝子内の標的部位と相補的であるスペーサー配列（標的部位が、非ＰＡＭ鎖上にあり、標的配列と相補的である）と、（ｉｉ）ダイレクトリピート配列と、を含む、ＲＮＡガイドであって、標的配列が、配列番号１０４７、１０２６、若しくは１０２５のうちのいずれか１つ、又はその逆相補的配列である、ＲＮＡガイド。

【0367】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0368】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号１～８のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３４、（ｐ）配列番号９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３４、（ｑ）配列番号９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３４、（ｒ）配列番号９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３４、（ｓ）配列番号９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３４、（ｔ）配列番号９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３４、（ｕ）配列番号９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３４、（ｖ）配列番号９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３４、（ｗ）配列番号９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３４、（ｘ）配列番号９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３４、（ｙ）配列番号９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３４、（ｚ）配列番号９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３４、又は（ａａ）配列番号１０若しくはその一部分を含む。

【0369】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0370】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９３６～９５３のうちのいずれか１つのヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、又は（ｏ）配列番号９５４若しくはその一部分を含む。

【0371】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１の配列、又はその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0372】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９５９のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９５９のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９５９のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９５９のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９５９のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９５９のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９５９のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９５９のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９５９のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９５９のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９５９のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９５９のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９５９のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９５９のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、あるいは（ｏ）配列番号９６０若しくは配列番号９６１、又はその一部分を含む。

【0373】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３の配列と少なくとも９０％同一である配列のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４の配列若しくはその一部分と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0374】

いくつかの例において、ダイレクトリピート配列は、（ａ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１～ヌクレオチド３６、（ｂ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド２～ヌクレオチド３６、（ｃ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド３～ヌクレオチド３６、（ｄ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド４～ヌクレオチド３６、（ｅ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド５～ヌクレオチド３６、（ｆ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド６～ヌクレオチド３６、（ｇ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド７～ヌクレオチド３６、（ｈ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド８～ヌクレオチド３６、（ｉ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド９～ヌクレオチド３６、（ｊ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１０～ヌクレオチド３６、（ｋ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１１～ヌクレオチド３６、（ｌ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１２～ヌクレオチド３６、（ｍ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１３～ヌクレオチド３６、（ｎ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１４～ヌクレオチド３６、（ｏ）配列番号９６２若しくは配列番号９６３のヌクレオチド１５～ヌクレオチド３６、又は（ｐ）配列番号９６４若しくはその一部分を含む。

【0375】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９８９、９６８、又は９６７のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。いくつかの具体的な例において、ＲＮＡガイドは、配列番号９８９、９６８、又は９６７のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0376】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドの最初の３個のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。

【0377】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドの最後の４個のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。

【0378】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドの最初から最後、第２から最後、及び第３から最後のヌクレオチドのそれぞれは、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含み、ＲＮＡガイドの最後のヌクレオチドは、未修飾である。

【0379】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、配列番号１０８２～１０８７のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列を有する。いくつかの具体的な例において、ＲＮＡガイドは、配列番号１０８２～１０８７のうちのいずれか１つの配列を有する。

【0380】

いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、配列番号１０８２～１０８７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、配列番号１０８２～１０８７のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１０８３又は配列番号１０８４と少なくとも９０％の同一性を含むＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０４７のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１０８３又は配列番号１０８４のＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０４７のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１０８５又は配列番号１０８６と少なくとも９０％の同一性を含むＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０２６のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１０８５又は配列番号１０８６のＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０２６のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１０８７又は配列番号２２９３と少なくとも９０％の同一性を含むＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０２５のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。いくつかの実施形態において、配列番号１０８７又は配列番号２２９３のＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、塩基対形成を介して、配列番号１０２５のＨＡＯ１標的配列の相補的領域に結合する。

【0381】

実施形態１４：本明細書に記載される実施形態１３のＲＮＡガイドをコードする核酸。

【0382】

実施形態１５：本明細書に記載される実施形態１４の核酸を含むベクター。

【0383】

実施形態１６：１つ以上のベクターを含むベクターシステムであって、１つ以上のベクターが、（ｉ）本明細書に記載される実施形態１３のＲＮＡガイド、及び（ｉｉ）Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする、ベクターシステム。いくつかの例において、ベクターシステムは、ＲＮＡガイドをコードする第１のベクターと、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドをコードする第２のベクターと、を含む。

【0384】

実施形態１７：本明細書に記載される実施形態１３～１６のＲＮＡガイド、核酸、ベクター、又はベクターシステムを含む細胞。いくつかの例において、細胞は、真核細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、初代細胞、細胞株、幹細胞、又はＴ細胞である。

【0385】

実施形態１８：本明細書に記載される実施形態１３～１６のＲＮＡガイド、核酸、ベクター、又はベクターシステムを含むキット。

【0386】

実施形態１９：ＨＡＯ１配列を編集する方法であって、ＨＡＯ１配列を、本明細書に記載される実施形態１３のＲＮＡガイドと接触させることを含む、方法。いくつかの例において、ＨＡＯ１配列は、細胞内にある。

【0387】

いくつかの例において、ＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１配列におけるインデル（例えば、挿入又は欠失）を誘導する。

【0388】

実施形態２０：対象における原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ）を治療する方法であって、ＰＨが、任意選択で、ＰＨ１、ＰＨ２、又はＰＨ３であり、方法が、対象に、本明細書に記載される実施形態１２のＲＮＡガイドを投与することを含む、方法。

【0389】

一般的な技術
本発明の実施は、別途指示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である、（組換え技法を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞、及びＢ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）などの文献に十分に説明されている。

【0390】

更なる詳細なく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に使用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単に例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分をなんら限定するものではない。本明細書に引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的で又は主題のために参照により組み込まれる。

【実施例】

【0391】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を更に例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、それらの例示的な性質によって、当業者に既知の他の手順、方法、又は技法が代替として使用され得ることが理解されよう。

【0392】

実施例１－ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＡＯ１標的部位のＣａｓ１２ｉ２媒介性編集
この実施例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に導入されるＣａｓ１２ｉ２を使用する、ＨＡＯ１遺伝子のゲノム編集を記載する。

【0393】

Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）を設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における初期ガイドスクリーニングのために、標的配列を、５’－ＮＴＴＮ－３’ＰＡＭ配列のためにＨＡＯ１のコードエクソンをタイリングすることによって設計し、次いで、スペーサー配列を、ＰＡＭ配列の下流の２０ｂｐの標的配列のために設計した。ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイド配列を、表７に示す。図において、「Ｅ＃Ｔ＃」はまた、「エクソン＃標的＃」として表され得る。

【0394】

【表7-1】

【0395】

【表7-2】

【0396】

【表7-3】

【0397】

【表7-4】

【0398】

【表7-5】

【0399】

Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＰ複合体形成反応を、配列番号９２４の精製Ｃａｓ１２ｉ２ポリペプチド（４００μＭ）を、ＨＡＯ１標的ｃｒＲＮＡ（２５０ｍＭのＮａＣｌ中の１ｍＭ）と、１：１（Ｃａｓ１２ｉ２：ｃｒＲＮＡ）の体積比（２．５：１のｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１２ｉ２モル比）で混合することによって行った。複合体形成物を、氷上で３０～６０分間インキュベートした。

【0400】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し計数した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳＦ緩衝液＋サプリメント（ＳＦ細胞株４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）ＸキットＳ、Ｌｏｎｚａ ＃Ｖ４ＸＣ－２０３２）中に、１６，４８０個の細胞／μＬの濃度で再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、３×１０^５個の細胞／反応物で、Ｌｏｎｚａ１６ウェルＮＵＣＬＥＯＣＵＶＥＴＴＥ（登録商標）ストリップ内に分注した。複合体を形成したＣａｓ１２ｉ２ ＲＮＰを、それぞれの反応物に、１０μＭの最終濃度（Ｃａｓ１２ｉ２）で添加し、次いで、トランスフェクションエンハンサーオリゴを、４μＭの最終濃度で添加した。それぞれのエレクトロポレーション反応物の最終体積は、２０μＬであった。非標的ガイドを、陰性対照として使用した。

【0401】

ストリップを、エレクトロポレーションデバイス（プログラムＣＭ－１３０、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標））を使用してエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの直後に、８０μＬの予め加温されたＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを、それぞれのウェルに添加し、ピペットによって穏やかに混合した。それぞれのテクニカルレプリケートプレートについて、１０μＬ（３０，０００個の細胞）の希釈されたヌクレオフェクションされた細胞を、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを収容するウェルを有する予め加温された９６ウェルプレート内に蒔いた。編集プレートを、３日間、３７℃で５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0402】

３日後に、ウェルを、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し、９６ウェルＴＷＩＮ．ＴＥＣ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。培地を軽くはじき、細胞を、２０μＬのＱＵＩＣＫＥＸＴＲＡＣＴ（商標）（ＤＮＡ抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に再懸濁させた。次いで、試料を、ＰＣＲマシンにおいて、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、９８℃で１０分間のサイクルに供した。次いで、試料を、－２０℃で凍結させた。

【0403】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のための試料を、数ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１のラウンド（ＰＣＲ Ｉ）を使用して、標的部位に隣接するゲノム領域を増幅し、ＮＧＳアダプターを添加した。第２のラウンド（ＰＣＲ ＩＩ）を使用して、ＮＧＳインデックスを添加した。次いで、反応物を、プールし、カラム精製によって精製し、蛍光光度計（Ｑｕｂｉｔ）において定量化した。シーケンシングを、１５０サイクルＮＧＳ機器（ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）ｖ２．５）中又は高出力キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実行し、ＮＧＳ機器（ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）５５０、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において実行した。

【0404】

ＮＧＳ分析のために、インデルマッピング関数は、試料のｆａｓｔｑファイル、アンプリコン参照配列、及びフォワードプライマー配列を使用した。それぞれのリードについて、ｋｍｅｒスキャンアルゴリズムを使用して、リードと参照配列との間の編集動作（マッチ、ミスマッチ、挿入、欠失）を計算した。いくつかの試料内に存在する少量のプライマー二量体を除去するために、それぞれのリードの最初の３０ｎｔが参照とマッチすることを必要とし、また、マッピングヌクレオチドの半分超がミスマッチであるリードをフィルタ除去した。これらのフィルタを通過した最大５０，０００個のリードを、分析のために使用し、リードが挿入又は欠失を含有する場合、リードをインデルリードとして計数した。％インデルを、インデル含有リードの数を、分析されたリードの数で除算したものとして計算した（フィルタを通過したリードは、最大５０，０００個であった）。フィルタを通過したリードの最小数についてのＱＣ基準は、１０，０００個であった。

【0405】

図１は、ＲＮＰ送達後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＡＯ１インデルを示す。エラーバーは、１つの生物学的レプリケートにわたる３つのテクニカルレプリケートの平均を表す。送達後に、ＲＮＡガイドのそれぞれで、インデルを、ＨＡＯ１標的部位のそれぞれ内でかつ／又はそれに隣接して検出した。Ｅ１Ｔ２、Ｅ１Ｔ３、Ｅ１Ｔ６、Ｅ１Ｔ７、Ｅ１Ｔ１３、Ｔ１Ｔ１７、Ｅ２Ｔ４、Ｅ２Ｔ５、Ｅ２Ｔ９、Ｅ２Ｔ１０、Ｅ３Ｔ６、Ｅ３Ｔ１９、Ｅ３Ｔ２２、及びＥ３Ｔ２８の送達は、ＮＧＳリードの７０％超においてインデルをもたらした。したがって、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるエクソン１、エクソン２、及びエクソン３内のインデルを誘導した。

【0406】

したがって、この実施例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳類細胞において、ＨＡＯ１が、Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＰによって個々に標的とされ得ることを示す。

【0407】

実施例２－ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＡＯ１標的部位のＣａｓ１２ｉ２媒介性編集
この実施例は、ＲＮＰによってＨｅｐＧ２細胞内に導入されるＣａｓ１２ｉ２を使用する、ＨＡＯ１遺伝子のゲノム編集を記載する。

【0408】

ＲＮＰ複合体形成反応を、実施例１に記載されるように、表７の様々なＲＮＡガイドで実行した。ＨｅｐＧ２細胞を、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し計数した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳＦ緩衝液＋サプリメント（ＳＦ細胞株４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）ＸキットＳ、Ｌｏｎｚａ ＃Ｖ４ＸＣ－２０３２）中に、１３，８８９個の細胞／μＬの濃度で再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、２．５ｅ５個の細胞／反応物で、Ｌｏｎｚａ１６ウェルＮＵＣＬＥＯＣＵＶＥＴＴＥ（登録商標）ストリップ内に分注した。複合体を形成したＣａｓ１２ｉ２ ＲＮＰを、それぞれの反応物に、２０μＭの最終濃度（Ｃａｓ１２ｉ２）で添加し、トランスフェクションエンハンサーオリゴを添加しなかった。それぞれのエレクトロポレーション反応物の最終体積は、２０μＬであった。非標的ガイドを、陰性対照として使用した。

【0409】

ストリップを、エレクトロポレーションデバイス（プログラムＤＪ－１００、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標））を使用してエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの直後に、８０μＬの予め加温されたＥＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを、それぞれのウェルに添加し、ピペットによって穏やかに混合した。それぞれのテクニカルレプリケートプレートについて、１０μＬ（２５，０００個の細胞）の希釈されたヌクレオフェクションされた細胞を、１００μＬのＥＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを収容するウェルを有する予め加温された９６ウェルプレート内に蒔いた。編集プレートを、３日間、３７℃で５％のＣＯ_２でインキュベートした。

【0410】

３日後に、ウェルを、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し、９６ウェルＴＷＩＮ．ＴＥＣ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。培地を軽くはじき、細胞を、２０μＬのＱＵＩＣＫＥＸＴＲＡＣＴ（商標）（ＤＮＡ抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に再懸濁させた。次いで、試料を、ＰＣＲマシンにおいて、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、９８℃で１０分間のサイクルに供した。次いで、試料を、－２０℃で凍結させた。試料を、ＮＧＳによって、実施例１に記載されるように分析した。

【0411】

図２は、ＲＮＰ送達後のＨｅｐＧ２細胞におけるＨＡＯ１インデルを示す。エラーバーは、１つの生物学的レプリケートにわたる３つのテクニカルレプリケートの平均を表す。送達後に、ＲＮＡガイドのそれぞれで、インデルを、ＨＡＯ１標的部位のそれぞれ内でかつ／又はそれに隣接して検出した。したがって、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、ＨｅｐＧ２細胞におけるエクソン１、エクソン２、及びエクソン３内のインデルを誘導した。

【0412】

したがって、この実施例は、ＨｅｐＧ２細胞などの哺乳類細胞において、ＨＡＯ１が、Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＰによって標的とされ得ることを示す。

【0413】

実施例３－初代肝細胞におけるＨＡＯ１標的部位のＣａｓ１２ｉ２媒介性編集
この実施例は、ＲＮＰによって初代肝細胞内に導入されるＣａｓ１２ｉ２を使用する、ＨＡＯ１のゲノム編集を記載する。

【0414】

ＲＮＰ複合体形成反応を、実施例１に記載されるように、表７のＲＮＡガイドで実行した。ヒトドナーからの初代肝細胞を、３７℃の水浴中で液体窒素から非常に迅速に解凍した。細胞を、予め加温された肝細胞回収培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＣＭ７０００）に添加し、１００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、適切な体積の肝細胞プレーティング培地（肝細胞プレーティング補完パック（血清含有）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＣＭ３０００で補完されたウイリアムス培地Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ａ１２１７６０１）中に再懸濁させた。細胞を、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）ディスポーザブル血球計数器（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２２－６００－１００）で、トリパンブルー生存率計数に供した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｐ３緩衝液＋サプリメント（Ｐ３初代細胞４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）Ｘキット、Ｌｏｎｚａ、ＶＸＰ－３０３２）中に、約７，５００個の細胞／μＬの濃度で再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、ｍＲＮＡリードのために、１５０，０００個の細胞／反応物で、１６ウェルＬｏｎｚａ ＮＵＣＬＥＯＣＵＶＥＴＴＥストリップ内に分注するか、又は５００，０００個の細胞／反応物で、単一のＬｏｎｚａ ＮＵＣＬＥＯＣＵＶＥＴＴＥS（登録商標）内に分注した。複合体を形成したＣａｓ１２ｉ２ ＲＮＰを、それぞれの反応物に、２０μＭの最終濃度（Ｃａｓ１２ｉ２）で添加し、次いで、トランスフェクションエンハンサーオリゴを、４μＭの最終濃度で添加した。それぞれのエレクトロポレーション反応物の最終体積は、１６ウェルｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップ形式で２０μＬ、又は単一のｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ形式で１００μＬのいずれかであった。非標的ガイドを、陰性対照として使用した。

【0415】

ストリップを、ＤＳ－１５０プログラムを使用してエレクトロポレーションに供し、単一のｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅを、ＣＡ１３７プログラム（Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標））を使用してエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの直後に、予め加温された肝細胞プレーティング培地を、それぞれのウェルに添加し、ピペットによって非常に穏やかに混合した。それぞれのテクニカルレプリケートプレートについて、希釈されたヌクレオフェクションされた細胞の全ての細胞懸濁液を、肝細胞プレーティング培地を収容するウェルを有する予め温められたコラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート又は２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）内に蒔いた。次いで、細胞を、３７℃のインキュベーター内でインキュベートした。４時間後に細胞が付着した後に、培地を、肝細胞維持培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＣＭ ４０００で補完されたウイリアムス培地Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ａ１２１７６０１）に変更した。２日後に、新しい肝細胞維持培地に交換した。

【0416】

ＲＮＰエレクトロポレーションの４～５日後に、培地を吸引し、細胞を、３７℃のインキュベーター内で、Ｃａ／Ｍｇを含有するＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中に溶解した２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１７１０４０１９）とともに振盪（５００ｒｐｍ）することによって採取した。細胞をプレートから解離させた後に、それらを、９６ウェルＴＷＩＮ．ＴＥＣ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、遠心分離した。培地を軽くはじき、ＮＧＳリードのための細胞ペレットを、２０μＬのＱＵＩＣＫＥＸＴＲＡＣＴ（商標）（ＤＮＡ抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に再懸濁させた。次いで、試料を、ＰＣＲマシンにおいて、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、９８℃で１０分間のサイクルに供し、ＮＧＳによって、実施例１に記載されるように分析した。

【0417】

ｍＲＮＡリードのために、細胞ペレットを、－８０℃で凍結させ、その後、溶解緩衝液中に再懸濁させ、ＤＮＡ／ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で、製造業者の説明書に従って抽出した。試料から抽出されたＤＮＡを、ＮＧＳによって分析した。単離されたＲＮＡを、ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、量及び純度について確認し、その後、このＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡ合成を、５ｘ ｉＳｃｒｉｐｔ逆転写反応ミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、製造業者の推奨に従って行った。鋳型ｃＤＮＡを、その後の分析の線形範囲にあるように適切に希釈した。希釈されたｃＤＮＡを使用して、２０μＬのデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ－ＢｉｏＲａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）反応を、ＨＡＯ１のための標的特異的プライマー及びプローブであるＡＴＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＡＴ（配列番号１０８８）、並びに２ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｎｏ ｄＵＴＰ（ＢｉｏＲａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、製造業者の説明書に従って確立した。反応物を使用して、液滴を、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、製造業者の推奨に従って生成した。プレートを、ＰＸ１ ＰＣＲプレートシーラー（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して密封し、生成された液滴を、Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、製造業者によって推奨された条件を使用してＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ増幅された液滴を、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）においてリードし、取得されたデータを、ＱＸ Ｍａｎａｇｅｒバージョン１．２（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して分析して、適切な標的についてのそれぞれの反応物中に存在するｍＲＮＡの絶対コピー数の存在を決定した。

【0418】

図３に示されるように、試験されたそれぞれのＲＮＡガイドは、ＨＡＯ１標的部位内のかつ／又はそれに隣接するインデルを誘導した。インデルは、非標的対照で誘導されなかった。したがって、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドは、初代肝細胞においてインデルを誘導した。次いで、インデルを、それぞれの標的についてのｍＲＮＡレベルと相関させて、インデルが、ｍＲＮＡノックダウン及びその後のタンパク質ノックダウンをもたらすかを決定した。図４は、未編集の対照細胞と比較して、編集された細胞におけるＨＡＯ１の％ｍＲＮＡノックダウンを示す。ＮＧＳリードのより高い百分率は、ＨＡＯ１ Ｅ２Ｔ４（配列番号９８８）と比較して、ＨＡＯ１ Ｅ２Ｔ５（配列番号９８９）を使用してインデルを含んだが、ＨＡＯ１ Ｅ２Ｔ４は、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのより大きいノックダウンをもたらした。

【0419】

したがって、この実施例は、初代ヒト肝細胞などの哺乳類細胞において、ＨＡＯ１が、Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＰによって標的とされ得ることを示す。

【0420】

実施例４－Ｃａｓ１２ｉ２バリアントでの、ＨｅｐＧ２細胞におけるＨＡＯ１標的部位の編集
この実施例は、一過性トランスフェクションによってＨｅｐＧ２細胞内に導入されるバリアントを使用する、ＨＡＯ１標的についてのインデル評価を記載する。

【0421】

配列番号９２４及び配列番号９２７のＣａｓ１２ｉ２バリアントを、ｐｃｄａ３．１骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に個々にクローニングした。ＲＮＡガイドＥ１Ｔ２（配列番号９６７）、Ｅ１Ｔ３（配列番号９６８）、Ｅ２Ｔ４（配列番号９８８）、Ｅ２Ｔ５（配列番号９８９）、Ｅ２Ｔ１０（配列番号９９４）をコードする核酸を、ｐＵＣ１９骨格（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）内にクローニングした。次いで、プラスミドを、マキシプレップし希釈した。

【0422】

ＨｅｐＧ２細胞を、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し計数した。細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳＦ緩衝液＋サプリメント（ＳＦ細胞株４Ｄ－ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）ＸキットＳ、Ｌｏｎｚａ ＃Ｖ４ＸＣ－２０３２）中に再懸濁させた。

【0423】

トランスフェクションの約１６時間前に、ＥＭＥＭ／１０％のＦＢＳ中の２５，０００個のＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェルプレートのそれぞれのウェル内に蒔いた。トランスフェクションの日に、細胞は、７０～９０％コンフルエントであった。トランスフェクトされるそれぞれのウェルについて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）の混合物を、調製し、次いで、室温で５分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）：ＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）混合物を、ヌクレアーゼプラスミドと、ＲＮＡガイドプラスミドと、Ｐ３０００試薬と、を含有する別個の混合物に添加した（溶液２）。陰性対照の場合、ｃｒＲＮＡを、溶液２中に含めなかった。溶液１及び溶液２を、上下にピペットすることによって混合し、次いで、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後に、溶液１及び溶液２混合物を、細胞を収容する９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに滴加した。

【0424】

３日後に、ウェルを、ＴＲＹＰＬＥ（商標）（組換え細胞解離酵素、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して採取し、９６ウェルＴＷＩＮ．ＴＥＣ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。培地を軽くはじき、細胞を、２０μＬのＱＵＩＣＫＥＸＴＲＡＣＴ（商標）（ＤＮＡ抽出緩衝液、Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に再懸濁させた。次いで、試料を、ＰＣＲマシンにおいて、６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、９８℃で１０分間のサイクルに供した。次いで、試料を、－２０℃で凍結させ、ＮＧＳによって、実施例１に記載されるように分析した。

【0425】

図５Ａに示されるように、２つのＣａｓ１２ｉ２バリアントでの同等のインデル活性が、Ｅ１Ｔ２、Ｅ１Ｔ３、Ｅ２Ｔ４、Ｅ２Ｔ５、Ｅ２Ｔ１０について観察された。図５Ｂは、Ｅ１Ｔ３及び配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２についてのインデルサイズ頻度（左）及びＰＡＭに対するインデル開始位置を示す。左に示されるように、欠失は、１個のヌクレオチド～約４０個のヌクレオチドの範囲のサイズであった。欠失の大部分は、約６ヌクレオチド～約２７ヌクレオチド長であった。右に示されるように、標的配列は、０位で開始し、２０位で終了するように表される。インデルは、ＰＡＭ配列の下流の約１０個のヌクレオチド及び約３５個のヌクレオチド内で開始した。インデルの大部分は、標的配列の末端の近くで開始し、例えば、ＰＡＭ配列の下流の約１８個のヌクレオチド～約２５個のヌクレオチドで開始した。

【0426】

したがって、この実施例は、ＨＡＯ１が、複数のＣａｓ１２ｉ２ポリペプチドによって標的とされることが可能であることを示す。

【0427】

実施例５－Ｃａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ構築物を使用する、初代ヒト肝細胞におけるＨＡＯ１の編集
この実施例は、Ｃａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ及び化学修飾ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドの送達を介するＨＡＯ１標的部位についてのインデル評価を記載する。

【0428】

配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２配列及び配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２配列に対応するｍＲＮＡ配列を、Ａｌｄｅｖｅｒｏｎによって１－プソイド－Ｕ修飾ヌクレオチドで、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ ＡＧ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して合成した。表８に示されるＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ配列は、Ｃ末端ＮＬＳを更に含んだ。

【0429】

【表8-1】

【0430】

【表8-2】

【0431】

【表8-3】

【0432】

Ｃａｓ１２ｉ２ ＲＮＡガイドを、表９に指定されるように、３’末端修飾ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基ガイド、又は５’末端及び３’末端修飾ホスホロチオエート化２’Ｏ－メチル塩基ガイドを有するように設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文した。それぞれのバリアントＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡを、ｃｒＲＮＡと、１：１（Ｃａｓ１２ｉ２：ｃｒＲＮＡ）の体積比（１０５０：１のｃｒＲＮＡ：Ｃａｓ１２ｉ２モル比）で混合した。ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを、エレクトロポレーションの直前に混合した。初代ヒト肝細胞を、培養し、実施例３に記載されるようにエレクトロポレーションに供した。

【0433】

【表9】

【0434】

図６は、バリアントＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ、並びに３’末端修飾Ｅ２Ｔ５（配列番号１０９１）、又は５’及び３’末端修飾Ｅ２Ｔ５（配列番号１０９２）によるＨＡＯ１標的部位の編集を示す。ＨＡＯ１標的部位におけるインデルは、配列番号１０８９又は配列番号１０９０のＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ、及び配列番号１０９１又は配列番号１０９２のＲＮＡガイドのいずれかのエレクトロポレーション後に導入された。約５０％のＮＧＳリードは、配列番号１０９０のＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ、及び配列番号１０９１又は配列番号１０９２のＲＮＡガイドのエレクトロポレーション後にインデルを含んだ。統計的に有意により高い％インデルが、配列番号１０８９のバリアントＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡと比較して、配列番号１０９０のバリアントＣａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡを使用して観察された。統計的差は、５’及び３’修飾ＲＮＡガイドＥ２Ｔ５対３’のみの修飾ＲＮＡガイドＥ２Ｔ５を使用して観察されなかった。

【0435】

したがって、この実施例は、哺乳類細胞において、ＨＡＯ１が、Ｃａｓ１２ｉ２ ｍＲＮＡ構築物及び化学修飾ＲＮＡガイドによって標的とされ得ることを示す。

【0436】

実施例６－Ｃａｓ１２ｉ２及びＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドのオフターゲット分析
この実施例は、Ｃａｓ１２ｉ２バリアント及びＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドのオンターゲット対オフターゲット評価を記載する。

【0437】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＣＴ／ＵＳ２１／２５２５７の実施例１６に記載されている方法により、配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２又は配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２をコードするプラスミド、並びにＥ２Ｔ５（配列番号９８９）、Ｅ１Ｔ２（配列番号９６７）、Ｅ１Ｔ３（配列番号９６８）、及びＥ２Ｔ１０（配列番号９９４）をコードするプラスミドでトランスフェクトした。次いで、ＰＣＴ／ＵＳ２１／２５２５７の実施例１６に記載されているタグメンテーションベースのタグ挿入部位シーケンシング（ＴＴＩＳＳ）方法を実施した。

【0438】

図７Ａ及び図７Ｂは、オンターゲット及びオフターゲットＴＴＩＳＳリードを示すプロットを示す。黒色のくさび形及び中央の数字は、オンターゲットＴＴＩＳＳリードの割合を表す。それぞれの灰色のくさび形は、ＴＴＩＳＳによって特定された固有のオフターゲット部位を表す。それぞれの灰色のくさび形のサイズは、所与のオフターゲット部位へのＴＴＩＳＳリードマッピングの割合を表す。図７Ａは、配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２についてのＴＴＩＳＳリードを示し、図７Ｂは、配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２についてのＴＴＩＳＳリードを示す。

【0439】

図７Ａに示されるように、配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２とＥ２Ｔ５との対は、ＴＴＩＳＳリードの１００％がオンターゲットにマッピングされたため、オフターゲット編集の可能性が低いことを実証した。ＴＴＩＳＳリードは、潜在的なオフターゲット部位にマッピングされなかった。また、Ｅ１Ｔ２が、オフターゲット編集の可能性が低いことを示した。Ｅ１Ｔ２については、ＴＴＩＳＳリードの９８％が、オンターゲットにマッピングされ、２つの潜在的なオフターゲット部位が、ＴＴＩＳＳリードの合計２％を表した。Ｅ５Ｔ１０については、ＴＴＩＳＳリードの９５％が、オンターゲットにマッピングされ、２つの潜在的なオフターゲット部位が、ＴＴＩＳＳリードの合計５％を表した。Ｅ２Ｔ１０は、ＴＴＩＳＳ方法を使用して、オフターゲット編集の可能性がより高いことを実証した。Ｅ２Ｔ１０については、ＴＴＩＳＳリードの６５％のみが、オンターゲットにマッピングされ、４つの潜在的なオフターゲット部位が、ＴＴＩＳＳリードの残りの合計３５％を表した。Ｅ２Ｔ１０については、１つの潜在的なオフターゲットが、潜在的なオフターゲットＴＴＩＳＳリードの大部分を表した。

【0440】

図７Ｂに示されるように、配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２とＥ２Ｔ５との対は、ＴＴＩＳＳリードの１００％がオンターゲットにマッピングされたため、オフターゲット編集の可能性が低いことを実証した。ＴＴＩＳＳリードは、潜在的なオフターゲット部位にマッピングされなかった。また、配列番号９２７のバリアントＣａｓ１２ｉ２とＥ１Ｔ２又はＥ１Ｔ３との対が、オフターゲット編集の可能性が低いことを実証した。Ｅ１Ｔ２については、レプリケート１におけるＴＴＩＳＳリードの１００％、及びレプリケート２におけるＴＴＩＳＳリードの９６％が、オンターゲットにマッピングされ、２つの潜在的なオフターゲット部位が、レプリケート２におけるＴＴＩＳＳリードの残りの４％を表した。Ｅ１Ｔ３については、レプリケート１におけるＴＴＩＳＳリードの１００％、及びレプリケート２におけるＴＴＩＳＳリードの９２％が、オンターゲットにマッピングされ、２つの潜在的なオフターゲット部位が、レプリケート２におけるＴＴＩＳＳリードの残りの８％を表した。

【0441】

したがって、この実施例は、Ｃａｓ１２ｉ２と、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドと、を含む組成物が、異なるオフターゲット活性プロファイルを含むことを示す。

【0442】

実施例７－Ｃａｓ１２ｉ２及びＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドでのＨＡＯ１タンパク質ノックダウン
この実施例は、配列番号９２４のバリアントＣａｓ１２ｉ２及びＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドを使用するＨＡＯ１タンパク質のノックダウンを特定するためのウェスタンブロットの使用を記載する。

【0443】

ヒトドナーからの初代肝細胞を、３７℃の水浴中で液体窒素から非常に迅速に解凍した。細胞を、予め加温された肝細胞回収培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＣＭ７０００）に添加し、１００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、適切な体積の肝細胞プレーティング培地（肝細胞プレーティング補完パック（血清含有）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＣＭ３０００で補完されたウイリアムス培地Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１２１７６０１）中に再懸濁させた。細胞を、Ｉｎｕｃｙｔｅディスポーザブル血球計数器（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２２－６００－１００）で、トリパンブルー生存率計数に供した。次いで、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｐ３緩衝液＋サプリメント（Ｌｏｎｚａ、ＶＸＰ－３０３２）中で、約５０００個の細胞／μＬの濃度で再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、５００，０００個の細胞／反応物で、Ｌｏｎｚａエレクトロポレーションキュベット内に分注した

【0444】

ＲＮＰ反応のために、Ｅ２Ｔ５（配列番号９８９）を、ＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドとして使用した。ＲＮＰを、それぞれの反応物に、２０μＭの最終濃度（Ｃａｓ１２ｉ２）で添加し、次いで、トランスフェクションエンハンサーオリゴを、４μＭの最終濃度で添加した。未エレクトロポレーションの細胞、及びカーゴなしでのエレクトロポレーションに供された細胞を、陰性対照として使用した。

【0445】

ストリップを、エレクトロポレーションデバイス（プログラムＣＡ１３７、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を使用してエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの直後に、予め加温された肝細胞プレーティング培地を、それぞれのウェルに添加し、ピペットによって非常に穏やかに混合した。それぞれのテクニカルレプリケートプレートについて、希釈されたヌクレオフェクションされた細胞の５００，０００個の細胞を、肝細胞プレーティング培地を収容するウェルを有する予め加温されたコラーゲンコーティングされた２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内に蒔いた。次いで、細胞を、３７℃でインキュベートした。２４時間後に細胞が付着した後に、培地を、肝細胞維持培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＣＭ ４０００で補完されたウイリアムス培地Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ１２１７６０１）に変更した。新しい肝細胞維持培地に４８時間ごとに交換した。

【0446】

ＲＮＰエレクトロポレーションの１６日後に、培地を吸引し、細胞を、ＰＢＳで穏やかに洗浄した。次いで、細胞を、ＲＩＰＡ Ｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ８９９０１）＋１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ７８４４０）で、３０分間氷上で溶解させ、試料を、５分ごとに混合した。細胞溶解物を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ２３２２７）を介して定量化した。１試料当たり１５μｇの総タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｌｉ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＲａｄ １６１０７４７）及び１００ｍＭのＤＴＴ中で調製し、次いで、９５℃で１０分間加熱した。試料を、４～１５％のＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ ５６７１０８４）上で、２００Ｖで４５分間実行した。試料を、トランスブロットＴｕｒｂｏシステムを使用して、０．２ｕｍのニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ １７０４１５９）に移入した。膜を、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ ＴＢＳ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉ－ｃｏｒ ９２７－６０００１）中で、３０分間室温で遮断した。次いで、ブロットを、遮断緩衝液中の１：１０００の希釈の一次抗ＨＡＯ１抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ ＧＴＸ８１１４４）及び１：２５００の希釈の一次抗ビンキュリン抗体（Ｓｉｇｍａ Ｖ９１３１）中で、４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ２８３６０）で、３回、それぞれ５分間洗浄し、次いで、ＴＢＳＴ中の１：１２５００希釈のＩＲ６８０抗マウス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩ３５５１８）及びＩＲ８００抗ウサギ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＰＩＳＡ５３５５７１）とともに、１時間室温でインキュベートした。次いで、ブロットを、ＴＢＳＴで、３回、それぞれ５分間洗浄し、Ｌｉ－ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸにおいて可視化した。

【0447】

ＨＡＯ１タンパク質のノックダウンは、初代ヒト肝細胞において、ＨＡＯ１遺伝子を標的とするＣａｓ１２ｉ２ ＲＮＰ及びＥ２Ｔ５（図８のレーン１～３）による編集後の７日目に観察された。ＨＡＯ１ノックダウンは、緩衝液のみの対照（レーン４～７）について観察されなかった。

【0448】

したがって、この実施例は、ＨＡＯ１タンパク質レベルが、Ｃａｓ１２ｉ２及びＨＡＯ１標的ＲＮＡガイドでの編集後に減少したことを示す。

【0449】

他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、いずれかの組み合わせで組み合わされ得る。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ、均等な、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置換され得る。したがって、別途明記されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、一般的な一連の均等な又は同様の特徴の一例のみである。

【0450】

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更形態及び修正形態をなして、本発明を様々な使用及び条件に適応させることができる。したがって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲内である。

【0451】

均等物
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書に記載及び例示されているが、当業者は、本明細書に記載される機能を実行するための、かつ／又は本明細書に記載される結果及び／若しくは利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、このような変形形態及び／又は修正形態のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内であると考えられる。更に概して、本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示であることが意図されており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示が使用される特定の１つ以上の用途に依存することが、当業者には容易に理解されよう。当業者は、通例の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか又は確認することができる。したがって、上記の実施形態は、例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載及び特許請求されるものとは別法で実施され得ることが理解されるべきである。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法のいずれもの組み合わせが、このような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。

【0452】

本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書定義、参照により組み込まれる文書における定義、及び／又は定義される用語の通常の意味よりも優先されると理解されるべきである。

【0453】

本明細書に開示される全ての参照文献、特許、及び特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、これは、いくつかの場合において、文書の全体を包含し得る。

【0454】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、明確にそれに反して示されない限り、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0455】

本明細書で明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「及び／又は」という語句は、このように結合した要素、例えば、いくつかの場合、接続的に存在し、他の場合、離接的に存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわち、このように結合した要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」という節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定されるこれらの要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドな用語とともに使用されるときに、一実施形態において、Ａのみ（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態において、Ｂのみ（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、更に別の実施形態において、Ａ及びＢの両方（任意選択で、他の要素を含む）などを指すことができる。

【0456】

本明細書において、及び特許請求の範囲において本願で使用されるとき、「又は」は、上記で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、列挙内の項目を分離するときに、「又は」又は「及び／又は」は、包括的であるとして解釈され、すなわち、いくつかの要素又は要素の列挙のうちの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意選択で、追加の列挙されていない項目を含むと解釈される。明らかに反して指示される用語のみ、例えば、「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの正確に１つ」、又は特許請求の範囲で使用されるときに、「からなる」とは、いくつかの要素又は要素の列挙のうちの正確に１つの要素を含むことを指す。概して、本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、排他性の用語、例えば、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの正確に１つ」が先行するときに、排他的代替（例えば、「一方又は他方であるが、両方ではない」）を指示するとしてのみ解釈される。特許請求の範囲で使用されるときに、「から本質的になる」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有する。

【0457】

本明細書において、及び特許請求の範囲において本願で使用されるとき、語句「少なくとも１つ」は、１つ以上の要素のリストに関して、要素のリスト内の要素のうちの任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙され、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない各要素の少なくとも１つを含むとは限らない。この定義はまた、具体的に特定される要素に関連するかどうかにかかわらず、語句「少なくとも１つ」が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が任意選択で存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は均等に、「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は均等に、「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態において、少なくとも１つのＡ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）ことを指すことができ、別の実施形態において、少なくとも１つのＢ、任意選択で、２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（任意選択で、Ａ以外の要素を含む）ことを指すことができ、更に別の実施形態において、少なくとも１つのＡ、任意選択で、２つ以上のＡを含み、少なくとも１つのＢ、任意選択で、２つ以上のＢを含む（任意選択で、他の要素を含む）ことなどを指すことができる。

【0458】

また、明確に反対が示されない限り、２つ以上のステップ又は行動を含む本明細書に特許請求される任意の方法において、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも方法のステップ又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【配列表】

2024520691000001.app

【国際調査報告】