特表 2024-520693 ＶＥＧＦとＡｎｇ２に結合する二重特異性結合分子およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦとＡｎｇ２に結合する二重特異性結合分子およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/22 20060101AFI20240517BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C07K16/22 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P27/02

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574547

(86)(22)【出願日】2022-06-02

(85)【翻訳文提出日】2024-01-26

(86)【国際出願番号】 CN2022096848

(87)【国際公開番号】W WO2022253314

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】202110623779.2

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】リー イーミン

(72)【発明者】

【氏名】フー スーイー

(72)【発明者】

【氏名】チン ホア

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA41

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA21

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、それぞれ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）とアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に対する抗体、同時に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）とアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に対する二重特異性結合分子（例えば、抗体）、およびそれらの製造方法、ならびに前記抗体または分子を含む医薬組成物およびそれらの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗Ａｎｇ２のＶＨＨ抗体であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含み、ここで、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１６に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号１７もしくは配列番号２０に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に示される配列を含むかまたはそれからなる、ＶＨＨ抗体。

【請求項2】

前記ＶＨＨは、
（１）配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸からなり、あるいは、
（２）配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＶＨＨ抗体。

【請求項3】

ＶＥＧＦ ＡおよびＡｎｇ２に結合する二重特異性結合分子であって、ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合する第１の標的結合領域と、Ａｎｇ２に特異的に結合する第２の標的結合領域とを含み、ここで、第２の標的結合領域は、請求項１または２に記載のＶＨＨ抗体であり、
任意に、第１の標的結合領域は、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合するＶＨＨ、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合する抗体の抗原結合断片、例えばｓｃＦｖ、例えば、前記抗体は完全ヒト抗体またはヒト化抗体であり、あるいは、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ Ｒ）またはその細胞外ドメイン、またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質、例えば、その細胞外ドメインとＦｃとの融合タンパク質から選択される、二重特異性結合分子。

【請求項4】

二重特異性抗体である、請求項３に記載の二重特異性結合分子。

【請求項5】

二価、三価または四価である、請求項３または４に記載の二重特異性結合分子。

【請求項6】

以下の構造：
抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬ－リンカー－抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または
抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨ－リンカー－抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、を有する、請求項４または５に記載の二重特異性結合分子。

【請求項7】

抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、ＬＣＤＲ１は、配列番号３１に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３２に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号３３に示される配列を含むかまたはそれからなり、かつ／または、
抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、ＨＣＤＲ１は、配列番号３５に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号３６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３７に示される配列を含むかまたはそれからなる、請求項６に記載の二重特異性結合分子。

【請求項8】

抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号３４に示されるアミノ酸からなり、あるいは、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含み、
抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号３０に示されるアミノ酸からなり、あるいは、前記軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項６または７に記載の二重特異性結合分子。

【請求項9】

（１）前記結合分子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２８に示されるアミノ酸からなり、あるいは、
（２）前記二重特異性結合分子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項10】

以下の構造：
第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ－リンカー－第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨを有し、
ここで、第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨおよび第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、同じであるか、または異なる、請求項４または５に記載の二重特異性結合分子。

【請求項11】

第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨまたは第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示される配列を含むかまたはそれからなり、
あるいは、
ＨＣＤＲ１は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号７もしくは配列番号１０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる、請求項１０に記載の二重特異性結合分子。

【請求項12】

第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨまたは第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸からなり、あるいは、前記ＶＨＨは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の二重特異性結合分子。

【請求項13】

（１）前記結合分子は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２に示されるアミノ酸からなり、あるいは、
（２）前記二重特異性結合分子は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項14】

以下の鎖：
ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、の１本または２本を含む、請求項３に記載の二重特異性結合分子。

【請求項15】

前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ヒト由来のＶＥＧＦＲの細胞外ドメインであり、好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＶＥＧＦＲ１第２の抗体様ドメインおよびＶＥＧＦＲ２第３の抗体様ドメインを含み、より好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ１第２の抗体様ドメインおよびヒトＶＥＧＦＲ２第３の抗体様ドメインを含む、請求項１４に記載の二重特異性結合分子。

【請求項16】

前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６に示されるアミノ酸からなる、請求項１４または１５に記載の二重特異性結合分子。

【請求項17】

前記Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するＦｃであり、好ましくは、前記Ｆｃは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２７に示されるアミノ酸からなる、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項18】

前記ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃは、ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメインとＦｃとの融合タンパク質、例えば、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはその誘導体であり、例えば配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２５に示されるアミノ酸からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項19】

（１）前記結合分子は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２４に示されるアミノ酸からなり、あるいは、
（２）前記二重特異性結合分子は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項20】

前記リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３～１９のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子。

【請求項21】

抗ＶＥＧＦ ＡのＶＨＨ抗体であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含み、ここで、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示される配列を含むかまたはそれからなり、
あるいは、
ＨＣＤＲ１は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号７もしくは配列番号１０に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる、ＶＨＨ抗体。

【請求項22】

（１）配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸からなり、あるいは、
（２）配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のＶＨＨ抗体。

【請求項23】

請求項１、２、２１および２２のいずれか一項に記載のＶＨＨ抗体、または請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子もしくは前記結合分子の鎖をコードする、核酸分子。

【請求項24】

請求項２３に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、好ましくは、前記発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である、発現ベクター。

【請求項25】

請求項２３に記載の核酸分子または請求項２４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は原核のものまたは真核のもの、例えば大腸菌細胞などの細菌、例えばTG1、または２９３細胞、例えば２９３ＦもしくはＥｘｐｉ－２９３細胞である、宿主細胞。

【請求項26】

請求項１、２、２１および２２のいずれか一項に記載のＶＨＨ抗体、または請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を製造するための方法であって、前記方法は、前記VHH抗体または二重特異性結合分子もしくはその鎖の発現に適した条件下で、請求項２５に記載の宿主細胞を培養すること、および任意に前記宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記ＶＨＨまたは二重特異性結合分子を回収することを含む、方法。

【請求項27】

請求項１、２、２１および２２のいずれか一項に記載のＶＨＨ抗体、または請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を含む、免疫複合体。

【請求項28】

請求項１、２、２１および２２のいずれか一項に記載のＶＨＨ抗体、または請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、および任意に１つまたは複数の他の治療剤、および任意に薬用補助材料を含む、医薬組成物または製剤。

【請求項29】

対象における眼疾患を予防または治療するための方法であって、有効量の請求項１、２、２１および２２のいずれか一項に記載のＶＨＨ抗体、または請求項３～２０のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子、請求項２７に記載の免疫複合体、または請求項２８に記載の医薬組成物もしくは製剤を対象に投与することを含む、方法。

【請求項30】

前記眼疾患は、血管新生に関連する眼疾患、例えば、角膜血管新生に関連する眼疾患から選ばれる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記患者は、（例えばレベルが上昇したもの、例えば核酸やタンパク質レベルの）ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ Ａ、および／またはＡｎｇ２を有する、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

前記方法は、患者に１種または複数種の療法、例えば、治療方式および／または他の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、それぞれ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）とアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に対する抗体、同時に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ－Ａ）とアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）に対する二重特異性結合分子（例えば、抗体）、およびそれらの製造方法、ならびに前記抗体または分子を含む医薬組成物およびそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

血管新生は、固形腫瘍、眼内血管新生に関連する疾患、関節リウマチおよび乾癬を含む様々な疾患の病因に関与する。

【0003】

ＶＥＧＦは、有効かつ遍在する血管成長因子である。ＶＥＧＦファミリーメンバーには、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、および内分泌腺由来ＶＥＧＦ（ＥＧ－ＶＥＧＦ）が含まれる。ＶＥＧＦの活性型は、他のＶＥＧＦファミリーメンバーとともにホモ二量体またはヘテロ二量体として合成される。ＶＥＧＦ－Ａは、選択的スプライシングによって生成される６つのアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６で存在する。これらのアイソフォームは、主にその生物学的利用可能性によって異なり、ＶＥＧＦ１６５は主なアイソフォームである。ＶＥＧＦは、正常な血管新生と疾患に関連する血管新生の重要な調節因子であると考えられている。

【0004】

ＶＥＧＦファミリーに加えて、ヒトアンジオポエチンも血管の発達と出生後の血管新生に関与していると考えられている。ヒトアンジオポエチンには、天然に存在するアゴニストであるアンジオポエチン－１（ＡＮＧ－１）と天然に存在するアンタゴニストであるアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）が含まれる。ＡＮＧ－１の役割は、成人において保存されており、成人において広範かつ構成的に発現されると考えられている。対照的に、ＡＮＧ－２の発現は主に血管リモデリングの部位に限定されており、ＡＮＧ－１の構成的安定化または成熟化機能を遮断し、これにより、血管が発芽シグナルに対してより応答性を有し得る可塑性状態に戻り、その可塑性状態を維持することを可能にすると考えられている。

【0005】

近年、ＶＥＧＦ－ＡおよびＡＮＧ－２を標的とするいくつかの二重特異性抗体がすでに開発されている（例えば、ＷＯ２０１２１３１０７８およびＷＯ２０１４００９４６５）。しかしながら、既存の二重特異性抗体は、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ２に対する遮断性が比較的弱く、かつ分子量が大きすぎるため、単回投与時のモル濃度が低くなる。特に、眼疾患に対しては、通常、より低分子量の抗体を硝子体内投与する方法が用いられ、かつより少ない投与頻度が必要とされる。したがって、特に眼疾患に適用され、ＶＥＧＦ－ＡおよびＡＮＧ－２を標的とする新しい二重特異性結合分子が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ＶＥＧＦ－ＡまたはＡＮＧ－２を標的とする新しいＶＨＨ抗体、および同時にＶＥＧＦ－ＡとＡＮＧ２に対する二重特異性結合分子を開発する。特に、本発明の二重特異性結合分子は、既知の抗体と比較して、より低い分子量を有し、同じ質量濃度においてより高いモル濃度を有し、かつ比較的強力なＶＥＧＦ ＡおよびＡｎｇ２遮断活性有し、ＶＥＧＦＡ誘導性初代細胞増殖を完全に遮断することができる。したがって、本発明の分子は、臨床的により強力な遮断活性を有し、かつ単回投与時の抗体モル濃度をより高くし、単回投与の薬効をより長期間維持し、眼内投与（例えば、硝子体腔内注射）の頻度を低減することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】二重特異性結合分子の構造を示す。

【図2】ＥＬＩＳＡで測定された抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨ抗体がＶＥＧＦ ＡのＶＥＧＦＲ２への結合を遮断し得ることを示す。

【図3】ＥＬＩＳＡ法で測定されたヒト化抗ａｎｔｉ－Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体がＡｎｇ２のＴｉｅ２への結合を遮断する作用を示す。

【図4】ＥＬＩＳＡ法で測定された、抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体（Ａ）およびヒト化抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体（Ｂ）が、Ａｎｇ２－Ｆｃによって誘導される２９３－Ｔｉｅ２細胞のリン酸化を抑制する作用を示す。

【図5】ＨＥＫ２９３－ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ法で抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨがＶＥＧＦＡによるＫＤＲ受容体の活性化を遮断する作用を検出することを示す。

【図6】ＣＣＫ－８で測定された、抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨ抗体が、ＶＥＧＦ Ａによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存および増殖を阻害する作用を示す。

【図7】ＨＥＫ２９３－ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ法でＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－０１２がＶＥＧＦによるＫＤＲ受容体の活性化を遮断する作用を検出することを示す。

【図8】二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２がＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存および増殖を阻害する作用を検出することを示す。

【図9】ＥＬＩＳＡ法で測定された、二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２がヒトＡｎｇ２のＴｉｅ２への結合を遮断することを示す。

【図10】フローサイトメトリーアッセイで測定された、二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２がＡｎｇ２－ＦｃのＴｉｅ２への結合を遮断することを示す。

【図11】フローサイトメトリーアッセイで測定された、本発明の二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－０１２がインビトロでｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導される２９３－Ｔｉｅ２リン酸化を効果的に抑制することを示す。

【図12】本発明の二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－０１２がＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の透過性を低下させる、すなわち、ＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞漏出を抑制することを示す。

【図13】レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおけるグレード４（図Ａ）およびグレード３以上（図Ｂ）のレーザースポットの比率の統計を示す。

【図14】レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける網膜厚さの統計を示す。

【図15】レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルにおける漏出面積の統計を示す。

【図16】レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルの眼底組織のＨ＆Ｅ染色図（Ａ）および病変面積統計（Ｂ）を示す。

【図17】レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルの眼底組織のＣＤ３１染色図（Ａ）および陽性細胞統計（Ｂ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

定義
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。

【0009】

本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数形が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。

【0010】

用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0011】

本明細書で使用されるように、用語「および／または」は選択可能なオプションのうちのうちのいずれか１つ、または選択可能なオプションのうちの２項または複数項またはすべてを意味する。

【0012】

本明細書で使用されるように、用語「含有する」または「含む」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある具体的な配列を「含む」抗体可変領域が言及される場合、この具体的な配列からなる抗体可変領域を包含することも意図する。

【0013】

本明細書で使用される用語「ＶＥＧＦ」とは、血管成長因子を指す。ＶＥＧＦファミリーメンバーには、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、および内分泌腺由来ＶＥＧＦ（ＥＧ－ＶＥＧＦ）が含まれる。ＶＥＧＦの活性型は、他のＶＥＧＦファミリーメンバーとともにホモ二量体またはヘテロ二量体として合成される。ＶＥＧＦ－Ａは、選択的スプライシングによって生成される６つのアイソフォーム、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６で存在する。これらのアイソフォームは、主にその生物学的利用可能性によって異なり、ＶＥＧＦ１６５は主なアイソフォームである。いくつかの実施形態において、本発明のＶＥＧＦ Ａは、ヒト由来のＶＥＧＦ Ａ、例えばヒト由来のＶＥＧＦ１６５を指す。一実施形態において、本発明のＶＥＧＦＡのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｐ１５６９２（ｕｎｉｐｒｏｔデータベース）のアミノ酸配列である。

【0014】

本明細書で使用されるように、用語「ＡＮＧ２」は、ヒトアンジオポエチン－２（ＡＮＧ－２）（代替的にＡＮＧＰＴ２またはＡＮＧ２と略称される）、例えば、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ、Ｐ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７（１９９７）５５～６０、およびＣｈｅｕｎｇ、Ａ．Ｈ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４８（１９９８）３８９～９１に記載されているものを指す。Ａｎｇ１とＡｎｇ２は、血管内皮で選択的に発現されるチロシンキナーゼのファミリーであるＴｉｅのリガンドとして発見される。現在、４つの確定のアンジオポエチンファミリーのメンバーが存在する。アンジオポエチン－３および－４（ＡＮＧ３およびＡＮＧ４）は、マウスおよびヒトにおける同じ遺伝子座の広範に多様な対応物を表し得る。Ａｎｇ１およびＡｎｇ２は、最初に組織培養実験においてそれぞれアゴニストおよびアンタゴニストとして同定された（ＡＮＧ１については、Ｄａｖｉｓ、Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ８７（１９９６）１１６１－６９を参照；ＡＮＧ２については、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ、Ｐ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７（１９９７）５５～６０を参照）。すべての既知のアンジオポエチンは主にＴｉｅ２に結合する。いくつかの実施形態において、本発明のＡＮＧ２は、ヒト由来のＡｎｇ２を指す。いくつかの実施形態において、ヒトＡｎｇ２は、アクセッション番号０１５１２３（ｕｎｉｐｒｏｔデータベース）のアミノ酸配列を含む。

【0015】

用語「多重特異性結合分子」とは、少なくとも二重特異性の多重特異性結合分子、例えば二重特異性結合分子を指し、すなわち、前記分子は、少なくとも第１の標的結合領域および第２の標的結合領域を含み、ここで、前記第１の標的結合領域は１つの標的または抗原に結合し、かつ前記第２の標的結合領域は別の抗原または標的に結合する。したがって、本発明による分子は、少なくとも２つの異なる抗原または標的に対する特異性を含む。本発明による分子は、複数の標的結合領域／結合部位を含む多重特異性分子、例えば、三重特異性結合分子も包含する。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、二重特異性抗体である。

【0016】

本明細書で使用される用語「リンカー」とは、二重特異性結合分子の異なる部分に直接連結可能な任意の分子を指す。異なる分子部分の間で共有結合を確立するリンカーの実例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含むが、これらに限定されないペプチドリンカーおよび非タンパク質ポリマーが含まれる。いくつかの実施形態において、リンカーはペプチドリンカーであり、ここで、結合分子の第１の部分のアミノ酸配列を結合分子の第２の部分に連結するアミノ酸配列を指す。例えば、ペプチドリンカーは、結合分子の第１の標的結合領域を第２の標的結合領域に連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、抗体の一部を抗体の別の部分に連結すること、例えば、軽鎖可変領域を重鎖可変領域に連結することもできる。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、所望の活性を妨害せずに、それらが互いに対してコンフォメーションを維持するように、２つの実体を連結するのに十分な長さを有する。

【0017】

ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒというアミノ酸残基を主に含んでもよいが、主に含まなくてもよい。有用なリンカーには、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＧＳ）ｎＧを含むグリシン－セリンポリマーが含まれ、ここで、ｎは少なくとも１（かつ好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０）の整数である。有用なリンカーには、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマーおよび他のフレキシブルリンカーがさらに含まれる。有用なリンカーには、グリシンモノマー重合、例えば（Ｇ）ｎも含まれ、ここで、ｎは少なくとも４（かつ例えば４～２０、例えば４、５、６、７、８、９、１０およびそれ以上）の整数である。好ましくは、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎ＝１、２、３または４である。

【0018】

本発明による用語「価」は、抗体分子、例えば結合分子における特定の数の結合部位の存在を意味する。したがって、用語二価、三価、四価は、それぞれ、結合分子内に２つ、３つ、または４つの結合部位（標的結合領域）が存在することを意味する。本発明による二重特異性結合分子は少なくとも二価であり、多価、例えば二価、三価、四価または六価であってもよい。

【0019】

本明細書で使用される用語「標的結合領域」とは、多重特異性結合分子、例えば二重特異性結合分子の特定の標的または抗原に結合する任意の部分を指す。標的結合領域は、例えば、抗体または免疫グロブリン自体、または抗体断片であり得る。このような標的結合領域は、ＢｓＡＢの残りの部分から独立した三次構造を有してもしなくてもよく、別個の実体としてその標的に結合してもしなくてもよい。標的結合領域はまた、受容体もしくはリガンド、またはリガンドに結合できる受容体のドメインであってもよい。

【0020】

用語「抗体断片」は、完全な抗体の一部を含む。好ましい実施形態において、抗体断片は抗原結合断片である。

【0021】

「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体またはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。

【0022】

単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）とも呼ばれる「ＶＨＨ」とは、重鎖可変領域の３つのＨＣＤＲのみを含む、重鎖抗体可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のみから構成される遺伝子工学抗体を指す。ＶＨＨは抗原の特異性および高親和性を有するのは３つのＨＣＤＲのみに依存するが、通常の抗体は６つのＣＤＲを必要とする。結晶構造は、ＶＨＨが従来の抗体ＶＨ免疫グロブリンの折り畳みと同様に、２つのβシートから足場を構成することが示された。

【0023】

用語「標的」とは、結合分子が結合する対象を指す。標的は、抗原であってもよいし、リガンドまたは受容体であってもよい。

【0024】

用語「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生または特異性免疫細胞の活性化に関係し、あるいは両方に関係する可能性がある。当業者であれば、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む大分子は、いずれも抗原として利用できると理解される。また、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導されてもよい。本明細書で使用されるように、用語「エピトープ」とは、抗原（例えば、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を指す。

【0025】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインにおいて、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖および軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ－末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種またはその組み合わせにより決定することができ、前記割り当てシステムは、例えば、抗体の３次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２７３、９２７～９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブのｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。

【0026】

例えば、異なるＣＤＲの決定方案によって、それぞれのＣＤＲの残基は、以下のとおりである。

【表1】

【0027】

ＣＤＲは、参照ＣＤＲの配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することで決定されてもよい。

【0028】

特に断りのない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」は、前記いずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列を含む。

【0029】

特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

【0030】

一実施形態において、本発明のＶＨＨにおけるＣＤＲは、以下の規則に従っている：ここで、ＨＣＤＲ１はＡｂＭに従って決定され、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３はＫａｂａｔに従って決定される。

【0031】

異なる割り当てシステムによって得られた同一抗体の可変領域のＣＤＲの境界は、差異があり得ると注意すべきである。即ち、異なる割り当てシステムで定義された同一抗体の可変領域のＣＤＲ配列には、違いがある。従って、本発明で定義された具体的なＣＤＲ配列により抗体が限定される場合、前記抗体の範囲には、可変領域配列が前記具体的なＣＤＲ配列を含むが、異なる方案（例えば、異なる割り当てシステムのルールまたは組合せ）が使用されるので、かかるＣＤＲ境界が本発明に定義された具体的なＣＤＲ境界と異なるような抗体も含まれる。

【0032】

異なる特異性を有する（即ち、異なる抗原の異なる結合部位を対象とする）抗体は、（同一の割り当てシステムにおいて）異なるＣＤＲを有する。しかし、ＣＤＲが抗体間で異なるにもかかわらず、ＣＤＲにおいては、抗原との結合に直接関与するアミノ酸位置の数が限られている。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＣｏｎｔａｃｔおよびＮｏｒｔｈ方法のうちの少なくとも２つにより、最小重複領域を決定して抗原結合用の「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であってもよい。当業者に知られているように、抗体の構造とタンパク質の折り畳みによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を決定することができる。従って、本発明は、本明細書で提供されるいずれのＣＤＲの変異体についても考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は変わらないように保持するが、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は、保存的なアミノ酸残基で置換されてもよい。

【0033】

用語「Ｆｃ領域」は、本明細書において免疫グロブリン重鎖のＣＨ２とＣＨ３の定常領域を定義するためであり、当該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。天然または野生型のＦｃ領域は、免疫細胞表面の異なるＦｃ受容体と結合することができ、これによりＣＤＣ／ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を引き起こすことができる。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域と結合ドメイン（例えば、抗体可変領域）との連合を必要とする。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、そのＣＤＣ／ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を強化するために変異される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、そのＣＤＣ／ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクター機能を低下または欠失させるために変異される。

【0034】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼすべての可変ドメインの少なくとも１つ、一般的に２つを含み、ここで、すべてまたはほぼすべてのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体に由来する部分に対応し、かつすべてまたはほぼすべてのＦＲは、ヒト抗体に由来する部分に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含む。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化が行われた抗体を指す。「ヒト抗体」または「全ヒト化抗体」または「完全ヒト抗体」は、交換して使用されてもよく、ヒトまたはヒト細胞から生成され、または非ヒト由来のものから由来し、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についての当該定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。

【0035】

本明細書で使用されるように、用語「抗」、「結合」または「特異的に結合」は、結合作用が標的または抗原に対して選択的であり、かつ好ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できることを意味する。結合部位の特定の標的または抗原との結合能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当分野における既知の通常の結合測定法、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）やバイオレイヤー干渉測定法やＭＳＤ測定法や表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）で測定することができる。

【0036】

用語「有効量」とは、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組み合わせの１回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。

【0037】

「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片または組成物または組み合わせのいずれの毒性または有害作用も治療による有益な作用に及ばないという量でもある。未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメータを少なくとも約４０％、さらに好ましくは、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは１００％抑制するか、または改善する。

【0038】

「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

【0039】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」と「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞とは全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫を含む。

【0040】

本明細書で使用される用語「標識」は、試薬（例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体）に直接的または間接的に結合または融合され、かつ、その結合または融合の対象試薬による検出を促進する化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であるか、または、酵素触媒によって標識される場合に、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変に触媒作用を及ぼすことができる。当該用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（即ち、物理的連結）することによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含もうとする。いくつかの実施形態において、標識はｈＦｃまたはビオチンである。

【0041】

「個体」または「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ、およびげっ歯類動物（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。

【0042】

「単離された」抗体または分子とは、その存在する自然環境の成分と単離されている抗体である。いくつかの実施形態において、抗体または分子は、純度が９５％または９９％を超えるように精製され、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。

【0043】

以下のように、配列間の配列同一性を算出する。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセンテージを決定するために、前記配列を最適比較のためにアラインメントを行う（例えば、最適アラインメントのために第１と第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方もしくは両方にギャップを導入してもよく、あるいは比較のために、非相同配列を捨ててもよい）。一好ましい実施形態では、比較のために、アラインメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応の位置での同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、前記分子はこの位置において同一である。

【0044】

数学アルゴリズムにより、２つの配列間の配列比較および同一性パーセンテージの計算を実現することができる。一好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに統合されたＮｅｅｄｌｅｍａおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列若しくはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定される。別の好ましい実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて取得可能）により、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定する。特に好ましいパラメータセット（および特に断りのない限り使用すべき１つのパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を採用する。また、ＰＡＭ１２０加重余り表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を利用して、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に統合されたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１－１７）により、２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージを決定してもよい。追加的にまたは選択的に、本明細書に記載の核酸配列とタンパク質配列を「問い合わせ配列」として利用してパブリックデータベースに対して検索を実行することにより、例えば、他のファミリーメンバーの配列または関連配列を同定することができる。

【0045】

本明細書に記載の「眼疾患」は、血管新生に関連する眼の疾患（例えば、眼内で起こる疾患）、例えば角膜血管新生に関連する眼疾患を包含する。

【0046】

用語「薬用補助材料」は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、賦形剤、ベクターや安定化剤などを指す。

【0047】

用語「医薬組成物」とは、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、前記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。

【0048】

本明細書に使用される場合、「治療」とは、存在している症状、病症、病状または疾患の進行もしくは重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。

【0049】

本明細書に使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。

【0050】

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それに連結された別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造である担体、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合された担体を含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかる担体は本明細書において、「発現担体」と呼ばれる。

【0051】

「対象／患者／個体試料」は、患者または対象から得た細胞または流体の集まりを指す。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたかつ／または保存された器官や組織試料や生検試料や穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、涙液、硝子体液、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）や間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意段階に由来する細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、組織試料は、眼組織、例えば硝子体である。いくつかの実施形態において、試料は涙液または硝子体液である。組織試料は、自然界において天然に組織と混ぜ合わせない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含んでもよい。

【0052】

Ｉ．抗ＶＥＧＦ ＡのＶＨＨ抗体
本発明は、ＶＥＧＦ Ａに対するＶＨＨ抗体に関する。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含み、ここで、
ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示される配列を含むかまたはそれからなり、
あるいは、
ＨＣＤＲ１は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号７もしくは配列番号１０に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0053】

いくつかの実施形態において、前記ＶＨＨは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸からなる。

【0054】

いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0056】

ＩＩ．抗Ａｎｇ２のＶＨＨ抗体
本発明は、Ａｎｇ２に対するＶＨＨ抗体に関する。いくつかの実施形態において、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含み、ここで
ＨＣＤＲ１は、配列番号１６に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ２は、配列番号１７もしくは配列番号２０に示される配列を含むかまたはそれからなり、
ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0057】

いくつかの実施形態において、前記ＶＨＨは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸からなる。

【0058】

いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0060】

ＩＩＩ．抗ＶＥＧＦ Ａ×ＡＮＧ２の二重特異性結合分子
本発明の一態様において、本発明は、ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合する第１の標的結合領域と、Ａｎｇ２に特異的に結合する第２の標的結合領域とを含むＶＥＧＦ ＡおよびＡｎｇ２に結合する二重特異性結合分子に関し、ここで、第２の標的結合領域は、抗Ａｎｇ２のＶＨＨ、例えば、本発明の上述の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨである。

【0061】

いくつかの実施形態において、第１の標的結合領域は、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合するＶＨＨ、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合する抗体の抗原結合断片、例えばｓｃＦｖ、例えば、前記抗体は完全ヒト抗体またはヒト化抗体であり、あるいは、
ＶＥＧＦ Ａに特異的に結合するＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ Ｒ）またはその細胞外ドメイン、またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質、例えば、細胞外ドメインとＦｃとの融合タンパク質から選択される。

【0062】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、１つもしくは２つもしくは３つもしくは４つの第１の標的結合領域または第２の標的結合領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、２つ、３つ、もしくは４つの標的結合領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、二価、三価、または四価である。いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、二重特異性抗体である。

【0063】

本発明の一態様において、本発明の二重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体は、以下の構造：
抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬ－リンカー－抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または
抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨ－リンカー－抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、を有し、
ここで、抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１７もしくは配列番号２０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0064】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子の構造は、図１Ａまたは図１Ｂに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は１本の鎖からなる。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は二価である。

【0065】

いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ここで、ＬＣＤＲ１は、配列番号３１に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＬＣＤＲ２は、配列番号３２に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＬＣＤＲ３は、配列番号３３に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0066】

いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、ＨＣＤＲ１は、配列番号３５に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号３６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３７に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0067】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号３４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号３４に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0068】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号３０に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、またはＬＣＤＲ３には存在しない。

【0069】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0070】

いくつかの実施形態において、前記リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間のリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで例えば、ｎ＝４である。いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ可変領域と抗Ａｎｇ２ ＶＨＨとの間のリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、ここで例えば、ｎ＝２または３、例えば３である。

【0071】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ Ａ×ＡＮＧ２二重特異性結合分子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２８に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記二重特異性結合分子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、抗ＶＥＧＦ抗体可変領域および抗Ａｎｇ２ ＶＨＨのＣＤＲには存在しない。

【0072】

本発明の別の態様において、本発明の二重特異性結合分子、例えば二重特異性抗体は、以下の構造：
第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ－リンカー－第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨを有し、
ここで、抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１７もしくは配列番号２０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0073】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子の構造は、図１Ｃに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は１本の鎖からなる。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は三価である。いくつかの実施形態において、第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨおよび第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、同じであるか、または異なる。

【0074】

いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、ＨＣＤＲ１は、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号２に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号３に示される配列を含むかまたはそれからなり、
あるいは、
ＨＣＤＲ１は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号７もしくは配列番号１０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0075】

いくつかの実施形態において、前記抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号４、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0076】

いくつかの実施形態において、抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ここで、ＨＣＤＲ１は、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号７もしくは配列番号１０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記抗ＶＥＧＦ ＶＨＨは、配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号９もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号9もしくは配列番号１１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0078】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0079】

いくつかの実施形態において、前記リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、第１の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨと第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨとの間のリンカー、または第２の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨと抗Ａｎｇ２ ＶＨＨとの間のリンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、例えば、ｎ＝２である。

【0080】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ Ａ×ＡＮＧ２二重特異性結合分子は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記二重特異性結合分子は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、抗ＶＥＧＦ ＶＨＨおよび抗Ａｎｇ２ ＶＨＨのＣＤＲには存在しない。

【0081】

本発明の別の態様において、本発明の二重特異性結合分子は、以下の鎖：
ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃ－リンカー－抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、の１本または２本を含み、
ここで、抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１６に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ２は、配列番号１７もしくは配列番号２０に示される配列を含むかまたはそれからなり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１８に示される配列を含むかまたはそれからなる。

【0082】

いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子の構造は、図１Ｄに示されるとおりである。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は２本の鎖からなる。いくつかの実施形態において、上記二重特異性結合分子は四価である。

【0083】

いくつかの実施形態において、前記抗Ａｎｇ２ ＶＨＨは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記VHHは、配列番号１９もしくは配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、またはＨＣＤＲ３には存在しない。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ヒト由来のＶＥＧＦＲの細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ＶＥＧＦＲ１第２の抗体様ドメイン（例えば、ＦＬＴ１ ｄｏｍａｉｎ ２）およびＶＥＧＦＲ２第３の抗体様ドメイン（例えば、ＫＤＲ ｄｏｍａｉｎ ３）を含む。いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ１第２の抗体様ドメインおよびヒトＶＥＧＦＲ２第３の抗体様ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインは配列番号２６に示されるドメインと同様（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有する）のＶＥＧＦに対する結合親和性を保持する。

【0085】

いくつかの実施形態において、前記Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するＦｃ、例えば、野生型Ｆｃ、または当分野で公知のＦｃ変異体である。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃは、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２７に示されるアミノ酸からなる。

【0086】

いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃは、ＶＥＧＦＲ細胞外ドメインとＦｃとの融合タンパク質、例えば、アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）またはその誘導体である。

【0087】

いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２５に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記ＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃは配列番号２５に示されるドメインと同様（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有する）のＶＥＧＦに対する結合親和性を保持する。

【0088】

いくつかの実施形態において、前記リンカーは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、例えば、ｎ＝３である。

【0089】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ Ａ×ＡＮＧ２の二重特異性結合分子の１本の鎖は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むか、または前記配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号２４に示されるアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、前記二重特異性結合分子は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数(好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個以下)の変異、例えば置換、欠失または付加、好ましくは置換、例えば保存的置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記変異は、抗Ａｎｇ２ ＶＨＨのＣＤＲには存在しない。いくつかの実施形態において、前記変異を有するＶＥＧＦ Ｒ細胞外ドメイン－Ｆｃは配列番号２５に示されるドメインと同様（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を有する）のＶＥＧＦに対する結合親和性を保持する。

【0090】

本発明の一実施形態において、本明細書に記載の抗体または結合分子は、１つまたは複数のアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸変異は、アミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変異はアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である。

【0091】

好ましい実施形態において、本発明に記載のアミノ酸変異は、ＣＤＲ外の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。いくつかの実施形態において、本発明に記載されるアミノ酸変異は、Ｆｃ領域などの抗体重鎖定常領域に生じ、好ましい実施形態において、前記Ｆｃ領域上のアミノ酸変異により、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ作用を弱めるかまたは欠失させる。

【0092】

いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、１つのアミノ酸が同種の別のアミノ酸によって置換され、例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換され、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換され、または１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。

【0093】

一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸変異を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成して、抗体の１つまたは複数の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合および／または抗体依存性細胞毒性を変化させることができる。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置においてアミノ酸変異（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３やＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。

【0094】

一部の実施形態において、ジスルフィド結合変異を含むｓｃＦｖを生成するなど、ジスルフィド結合を生成するために抗体の可変領域を変異させることが必要な場合がある。

【0095】

一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体または結合分子は、当分野における既知で容易に得られる他の非タンパク質部分が含まれるようにさらに修飾することができる。前記誘導作用に適した部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な実例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキサン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物を含む。

【0096】

ＩＶ．本発明のＶＨＨ抗体または二重特異性結合分子の特性
いくつかの実施形態において、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体は、例えば高親和性でＡｎｇ２、例えばヒトＡｎｇ２に特異的に結合することができる。

【0097】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦＡ ＶＨＨ抗体は、例えば高親和性でＶＥＧＦ Ａ、例えばヒトＶＥＧＦ Ａに特異的に結合することができる。

【0098】

いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性結合分子は、例えば高親和性でＡｎｇ２およびＶＥＧＦＡ、例えばヒトＡｎｇ２およびヒトＶＥＧＦＡに特異的に結合することができる。

【0099】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ａｎｇ２抗体または抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子は、以下の特性：
（ｉ）抗Ａｎｇ２抗体または二重特異性結合分子は、Ａｎｇ２によって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対して阻害効果を有すること、
（ｉｉ）抗Ａｎｇ２抗体または二重特異性結合分子は、Ａｎｇ２とＴｉｅ２の間の結合に対して遮断効果を有すること、
（ｉｉｉ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子は、例えばＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒによって検出される、ＶＥＧＦＡ活性化関連受容体シグナル伝達経路に対して遮断効果を有すること、
（ｉｖ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子は、ＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲとの間の結合に対して遮断効果を有すること、
（ｖ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子は、ＶＥＧＦＡによって誘導される細胞（例えば初代細胞、例えば血管内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣ）の生存および増殖に対して阻害効果を有すること、
（ｖｉ）二重特異性結合分子は、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣ）の漏出に対して阻害効果を有すること、および
（ｖｉｉ）二重特異性結合分子は、インビボまたはインビトロにおいて血管新生に対して阻害効果を有し、例えば眼底または網膜脈絡膜血管新生を阻害し、例えば新生血管によって引き起こされる漏出を阻害し、例えば血管完全性を保護すること、の１つまたは複数を有する。

【0100】

Ｖ．本発明の核酸およびそれを含む宿主細胞
一態様では、本発明は、上記のいずれかのＶＨＨまたは二重特異性結合分子、あるいはそれらのいずれかの鎖をコードする核酸を提供する。一実施形態において、前記核酸を含む担体を提供する。一実施形態において、担体は発現担体、例えば、真核発現担体である。担体は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ベクターは例えばｐｃＤＮＡ３．１である。一実施形態において、前記核酸または前記担体を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ－Ｓ）または２９３細胞（例えば、２９３ＦやＨＥＫ２９３細胞））、あるいは抗体またはその断片の製造に適用される他の細胞から選択される。別の実施形態において、前記宿主細胞は原核細胞であり、例えば、大腸菌細胞、例えばＴＧ１である。

【0101】

例えば、本発明の核酸は、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸、または配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。

【0102】

一実施形態において、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。ＶＨＨまたは二重特異性結合分子をコードするベクターをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、本明細書に記載される原核または真核細胞を含む。例えば、ＶＨＨは細菌中で生成され得る。発現後、ＶＨＨは培養上清中に存在し、さらに精製することができる。

【0103】

一実施形態において、宿主細胞は、原核のもの、例えば細菌、例えば大腸菌細胞、例えばＴＧ１である。

【0104】

一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗体若しくはその断片の製造に適用される他の細胞から選択される。例えば、糸状菌または酵母のような真核微生物は、抗体をコードするベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が既に「ヒト化」された真菌と酵母菌株により、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を生成する。グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも由来する。脊椎動物の細胞を宿主として用いてもよい。例えば、懸濁成長に適するように改変された哺乳動物細胞株を使用することができる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の実例は、ＳＶ４０で転換されたザル腎ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３、２９３Ｆまたは２９３Ｔ）などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含み、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＥｘｐｉＣＨＯなど、およびＹ０、ＮＳ０とＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。当分野では、抗体の生成に適する哺乳動物宿主細胞株が知られている。

【0105】

ＶＩ．本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子の生成および精製
一実施形態において、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を製造する方法を提供し、ここで、前記方法は、上述したように、ＶＨＨまたは二重特異性結合分子またはその鎖の発現に適した条件において、前記ＶＨＨまたは二重特異性結合分子（例えば、いずれか１本のポリペプチド鎖、および／または複数本のポリペプチド鎖）をコードする核酸または前記核酸の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、任意に、前記宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記ＶＨＨまたは二重特異性結合分子を回収することとを含む。

【0106】

組換えにより本発明の分子を生成するために、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子（例えば、上記に記載の分子、例えば、いずれか１本のポリペプチド鎖、および／または複数本のポリペプチド鎖）をコードする核酸を単離し、それを１つまたは複数のベクターに挿入し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現に用いる。このような核酸は、通常のプロトコルを使用して単離および配列決定することが容易である。

【0107】

本明細書に記載されるように製造されたＶＨＨまたは二重特異性結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の従来技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの要因にも依存し、かつこれらは当業者にとって自明である。本発明の抗体分子の純度は、様々な周知の分析方法のいずれか１つにより決定することができ、前記周知の分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。

【0108】

ＶＩＩ．測定法
当分野で既知の様々な測定法により、本明細書に提供されるＶＨＨまたは二重特異性結合分子を同定し、スクリーニングし、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性を特徴付けることができる。一態様では、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子は、例えば、バイオレイヤー干渉技術、ＥＬＩＳＡなどの既知の方法によって、それらの標的（例えば、抗原）結合活性について試験される。当分野で既知の方法によりＶＥＧＦ Ａおよび／またはＡｎｇ２への結合を測定することができ、本明細書には例示的な方法が開示されている。いくつかの実施形態において、放射免疫測定（ＲＩＡ）またはバイオレイヤー干渉測定法またはＭＳＤ測定法または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）またはフローサイトメトリーにより測定される。

【0109】

本発明は、生物学的活性を有するＶＨＨまたは二重特異性結合分子を同定するための測定法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば
（ｉ）抗Ａｎｇ２抗体または二重特異性結合分子のＡｎｇ２によって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対する阻害効果、
（ｉｉ）抗Ａｎｇ２抗体または二重特異性結合分子のＡｎｇ２とＴｉｅ２の間の結合に対する遮断効果、
（ｉｉｉ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子の、例えばＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒによって検出される、ＶＥＧＦＡ活性化関連受容体シグナル伝達経路に対する遮断効果、
（ｉｖ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子のＶＥＧＦＡとＶＥＧＦＲとの間の結合に対する遮断効果、
（ｖ）抗ＶＥＧＦＡ抗体または二重特異性結合分子の、ＶＥＧＦＡによって誘導される細胞（例えば初代細胞、例えば血管内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣ）の生存および増殖に対する阻害効果、
（ｖｉ）二重特異性結合分子の血管内皮細胞（例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣ）の漏出に対する阻害効果、
（ｖｉｉ）二重特異性結合分子は、インビボまたはインビトロにおいて血管新生に対する阻害効果、例えば眼底または網膜脈絡膜血管新生の阻害、例えば新生血管によって引き起こされる漏出の阻害、例えば血管完全性の保護、から選択される。

【0110】

上記のインビトロ測定法のいずれかで使用される細胞は初代細胞または細胞株であり、Ａｎｇ２受容体（例えば、Ｔｉｅ２）またはＶＥＧＦＲ（例えば、ＶＥＧＦＲ２、すなわちＫＤＲ）を天然に発現または過剰発現する細胞、例えばＴｉｅ２またはＫＤＲを過剰発現する２９３細胞、例えばＨＥＫ２９３もしくはＥｘｐｉ２９３、あるいは、血管内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣを含む。

【0111】

いくつかの実施形態において、測定は、ビオチンまたはｈＦｃなどのマーカーを使用して行うことができる。

【0112】

なお、本発明の抗体と他の活性剤の組み合わせを使用して、任意の上記の測定法を実現できる。

【0113】

ＶＩＩＩ．免疫複合体および医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の任意のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を含む免疫複合体を提供する。好ましくは、前記免疫複合体は、１つまたは複数の他の治療剤またはマーカーを含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の任意のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を含む組成物または薬物または製剤を提供し、好ましくは、組成物は医薬組成物である。一実施形態において、前記組成物は、薬用補助材料をさらに含む。一実施形態において、組成物、例えば医薬組成物は、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子、および１つまたは複数の他の治療剤の組み合わせたを含む。

【0115】

本発明はまた、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を含む組成物（医薬組成物を含む）または薬物または製剤を含む。これらの組成物または薬物または製剤はまた、適切な薬用補助材料、例えば、当分野での既知の薬用ベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤を含んでもよい。

【0116】

本明細書で使用されるように、「薬用ベクター」は、生理学的に適合する溶剤、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤などのいずれかまたは全てを含む。

【0117】

薬用補助材料の使用およびその使用については、『Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ』、第八版、Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ、Ｐ．Ｊ．ＳｅｓｋｅｙおよびＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈｉｃａｇｏも参照される。

【0118】

本発明の組成物または薬物または製剤は、様々な形態で存在することができる。これらの形態は、例えば、液体、半固体および固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射液または点眼液）、分散剤または懸濁剤、リポソーム剤および坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療的使用によって決定する。例えば、本発明の組成物または薬物または製剤は、点眼液であってもよい。

【0119】

所望の純度を有する本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を１種または複数種の任意の薬用補助材料と混合することにより、本明細書に記載のＶＨＨまたは二重特異性結合分子の薬物または製剤を製造することができ、好ましくは、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で製造する。

【0120】

本発明の組成物または薬物または製剤は、１種以上の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、治療される特定の適応症に必要なものであり、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する活性成分である。例えば、他の治療剤も提供することが望ましい。

【0121】

持続放出製剤を製造することができる。持続放出製剤の適切な実例は、抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、上記マトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセル形態のような成形品である。

【0122】

本発明は薬物組合せまたは薬物組合せ製品をさらに提供し、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子、および１つまたは複数の他の治療剤を含む。本発明は、前記薬物組合せを含む薬物キットのセットをさらに提供し、例えば、前記薬物キットのセットは同じパッケージ内に、
－本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を含む医薬組成物を含有する第１の容器、および
－他の治療剤を含む医薬組成物を含有する第２容器、を含む。

【0123】

ＩＸ．使用と方法
本発明の一態様は、対象における眼疾患を予防または治療するための方法であって、有効量の本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または本発明の二重特異性結合分子、またはそれらを含む組成物、薬物もしくは製剤を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0124】

いくつかの実施形態において、前記患者は、（例えば、核酸やタンパク質レベルなどのレベルが上昇した）ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦＡ、および／またはＡｎｇ２を有する。

【0125】

いくつかの実施形態において、前記眼疾患は、血管新生に関連する眼疾患、例えば、角膜血管新生に関連する眼疾患を含むが、これらに限定されない。

【0126】

いくつかの実施形態において、前記眼疾患の治療は、核酸またはタンパク質レベルが抑制されたＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦＡ、および／またはＡｎｇ２から利益を受ける。

【0127】

他の態様において、本発明は、本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または本発明の二重特異性結合分子、またはそれらを含む組成物の薬物の生産または製造における使用を提供し、前記薬物は、本明細書に記載の使用に用いられ、例えば、本明細書にかかる関連疾患または病症の予防または治療に用いられる。

【0128】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または本発明の二重特異性結合分子、またはそれらを含む組成物もしくは薬物もしくは製剤は、病症および／または病症に関連する症状の発作を遅延することができる。

【0129】

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または本発明の二重特異性結合分子、またはそれらを含む組成物もしくは薬物もしくは製剤は、さらに１種または複数種の他の療法、例えば、治療方式および／または他の治療剤と組み合わせて投与され、本明細書に記載の使用に用いられ、例えば、本明細書にかかる関連疾患または病症の予防または治療に用いられることができる。

【0130】

本発明の抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ、または本発明の二重特異性結合分子、またはそれらを含む組成物もしくは薬物もしくは製剤の投与経路は、既知の方法、例えば、局所投与、例えば眼内投与、眼表面投与に従う。いくつかの実施形態において、投与は注射または滴下による。

【0131】

Ｘ．診断と検出のための方法と組成物
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体も、生体試料におけるＡｎｇ２の存在の検出に用いることができる。一部の実施形態において、本発明で提供される抗ＶＥＧＦＡ ＶＨＨ抗体は、生体試料におけるＶＥＧＦＡの存在を検出するために用いることができる。一部の実施形態において、本明細書で提供される抗二重特異性結合分子は、生体試料におけるＡｎｇ２および／またはＶＥＧＦＡの存在を検出するために使用することができた。

【0132】

用語「検出」が本明細書に使用される場合、定量的または定性的検出を含み、例示的な検出方法としては、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子複合磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定法、ＰＣＲ－技術（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられる。一部の実施形態において、生体試料は、体液または眼組織、例えば硝子体液である。

【0133】

一部の実施形態において、前記方法は、Ａｎｇ２またはＶＥＧＦＡへの結合が許容される条件で、生体試料を本明細書に記載のＶＨＨまたは二重特異性結合分子と接触するとともに、当該ＶＨＨまたは二重特異性結合分子とＡｎｇ２またはＶＥＧＦＡの間に複合物が形成されたか否かを検出することを含む。複合物の形成は、Ａｎｇ２またはＶＥＧＦＡの存在を示す。当該方法は、インビトロまたはインビボ方法であってもよい。一実施形態において、本発明の抗体は、本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子による治療に適する対象の選択に用いられ、例えば、ここで、Ａｎｇ２またはＶＥＧＦＡは前記対象を選択するためのバイオマーカーである。

【0134】

一部の実施形態において、標識されたＶＨＨまたは二重特異性結合分子が提供される。標識は、直接検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識および放射性標識）、および例えば、酵素触媒反応または分子間の相互作用により間接的に検出される部分、例えば、酵素もしくはリガンドを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記標識は、例えば、ビオチンまたはｈＦｃなどのマーカーである。

【0135】

本明細書に記載のいくつかの実施形態において、試料が本発明のＶＨＨまたは二重特異性結合分子による治療前に得られる。いくつかの実施形態において、試料は、他の療法を使用する前に得られる。いくつかの実施形態において、試料は、他の療法による治療中または他の療法による治療後に得られる。

【0136】

いくつかの実施形態において、治療前に、例えば、治療開始前または治療間隔後のある治療前にＡｎｇ２および／またはＶＥＧＦ Ａを検出する。

【0137】

いくつかの実施形態において、本発明の疾患を治療する方法が提供され、前記方法は、Ａｎｇ２および／またはＶＥＧＦ Ａの存在について対象（例えば、試料）（例えば、対象試料）を検査することにより、Ａｎｇ２および／またはＶＥＧＦ Ａ値を確定し、Ａｎｇ２および／またはＶＥＧＦ Ａ値を対照値（例えば、正常個体における値）と比較し、Ａｎｇ２および／またはＶＥＧＦ Ａ値が対照値より大きい場合、対象に治療有効量の、場合によって１種または複数種の他の療法と組み合わせる本発明に記載のＶＨＨまたは二重特異性結合分子を投与することにより、前記疾患を治療することを含む。

【0138】

本発明にかかる上記と他の態様および実施形態は、図面（図面の簡単な説明がその後に続く）と以下の発明の詳細な説明において記載され、以下の実施例に例示されている。上記および本願にわたって説明された特徴のいずれかまたはすべては、本発明の各実施形態において組み合わせることができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。

【実施例】

【0139】

実施例１．ファージ免疫ライブラリーの調製
アルパカの免疫または合成ライブラリーの構築
１．１ 健康な成体アルパカ（Ｃｈｅｎｇｄｕ ＮＢＢＩＯＬＡＢ社）を２頭選択し、組換えタンパク質抗原ＶＥＧＦＡまたはＡｎｇ２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）０．５ｍｇとフロイントアジュバントを１：１の比率で均一に混合し、背中の複数箇所に皮下注射する方式でアルパクを４回免疫化し、免疫間隔を２週間とした。

【0140】

１．２ アルパカ末梢血５０ｍｌを採取し、リンパ球を分離し、生細胞２．５×１０^７個あたり１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬を加え、クロロホルム／イソプロピルアルコール沈殿法により全ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮＡを鋳型として取り、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社）を用いて逆転写を行った。ｃＤＮＡを鋳型として１回目のＰＣＲ反応を行い、フォワードプライマーＡｌｐ－ＶｈＬとリバースプライマーＡｌｐ－２ｂ／２ｃＲを用いて１回目のＰＣＲ産物を得た。１回目のＰＣＲ産物を鋳型として２回目のＰＣＲ反応を行い、フォワードプライマーＡｌｐ－ＶｈＦおよびリバースプライマーＡｌｐ－ＪＨＲ－ＳａｌＩを使用して２回目のＰＣＲ産物を得た。ｐＣ３－ＨＦベクターと２回目のＰＣＲ産物をそれぞれＳａｃＩとＳａｌＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて二重消化し、酵素消化産物をＴ４リガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に加えて反応させ、ＴＧ１コンピテント細胞を電気形質転換して、ＶＨＨ抗体ライブラリーを構築し、菌液を－８０℃で凍結保存した。復活した菌液を１００ｍｌのＹＴ－ＡＧ培地（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に接種し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加えて感染させ、２×ＹＴ－ＡＫ培地（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に菌体を再懸濁し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。培養上清を回収し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿法を用いて組換えファージを調製した。

【0141】

１．３ 組換えファージを、ビオチン標識抗原ＶＥＧＦＡ（ＡＣＲＯ社）またはＡｎｇ２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を使用する３回のパニング実験を行った。５０μｌのＭ２８０磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ社）および適量のビオチン標識抗原を各チューブに加え、室温で３０分間インキュベートした後、１×１０^１２ｃｆｕの組換えファージを加え、室温で１時間インキュベートした。得られた混合物を１ｍｌのＰＢＳＴに加え、各洗浄時間は５分間で１０回洗浄した。最後に、ｐＨ２．５グリシン緩衝液０．５ｍｌを加えて抗原結合した組換えファージを溶出し、ＴＧ１に感染させて一晩培養し、組換えファージを調製して次回のパニング実験に供し、陽性ＶＨＨのＴＧ１細菌クローンを同定した。

【0142】

１．４ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡにより結合活性およびクローニング配列決定を検出した。
ＶＥＧＦ Ａを予め取り、Ａｎｇ２抗原（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）は、ＰＢＳ緩衝液で０．５μｇ／ｍｌに希釈して９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、冷蔵庫で４℃で一晩置いた。抗原コーティングプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤を３００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間静置ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、８０μｌのブロッキング剤＋上記１．３で同定した陽性ＶＨＨのＴＧ１菌の発現上清２０μｌを加え、室温で１時間振盪した。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ブロッキング剤で希釈したＡｎｔｉ－Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体（Ｓｉｇｍａ社）１００μｌ／ウェルを加え、室温で４０分間振盪した。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢ発色液を１００μｌ／ウェルに添加し、光を避けて５～１５分間発色させた。１００μｌ／ウェルの停止液をさらに加えた。マイクロプレートリーダーで読み取り、ＯＤ４５０ｎｍ吸光度を測定し、読み取り値が０．５より大きい細菌クローンを選択して配列決定のためにジーンウイズに送り、各対応するＶＨＨ配列を含むＴＧ１菌クローンを選択してグリセロールを加え、冷蔵庫で－８０℃に凍結した。

【0143】

実施例２．原核生物抗体の生産および精製、ならびにヒト化
本発明は、分子生物学技術を利用して抗ＶＥＧＦＡまたはＡｎｇ２陽性ファージ内の抗体配列を得、上記で得られた陽性ＶＨＨを含むＴＧ１モノクローナル発現および精製を利用してＶＨＨ抗体タンパク質を得た。

【0144】

実施例１で同定したＶＨＨ発現プラスミドを含むＴＧ１菌を８００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００値が０．５～０．６になるまで培養した。菌液に１ｍＭのＩＰＴＧを加えて発現を誘導し、２８℃、２００ｒｐｍで一晩培養し、培養上清を収集し、遠心分離後に１５ｍｌ ＰＢ＋１ｍｇ／ｍｌポリミキシンを加えて細菌を再懸濁し、再度遠心分離し、０．２２μｍフィルタ膜で濾過した。細菌溶解物を１ｍｌ Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅプレカラムに流し、ＰＢＳを加えて２回洗浄し、０．５Ｍイミダゾールを加えて標的タンパク質を溶出し、紫外線法を使用してタンパク質濃度を測定した。溶出した目的タンパク質は紫外線法でタンパク質濃度を測定し、複数のチューブに分けて冷蔵庫で－４０度に凍結した。得られた抗体溶液を以降上清と呼ぶ。

【0145】

本発明で得られた２つの抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨ抗体（ＬＡ４２Ｆ８およびＬＡ４６Ｅ１１）と１つの抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体（ＬＡ２４Ｃ１１）のＣＤＲ、およびＶＨＨのアミノ酸配列、ならびに配列番号については、配列表を参照した。

【0146】

次に、上記で得られた免疫ライブラリ抗体ＬＡ４２Ｆ８、ＬＡ４６Ｅ１１、およびＬＡ２４Ｃ１１を、以下のステップのようにしてヒト化した：
1. ＣＤＲループ構造を決定し、
2. ヒト生殖系列配列データベースに重鎖の各Ｖ／Ｊ領域に最も近い相同配列を見つけ、
3. 重鎖軽鎖と最もマッチングするヒト生殖細胞系列および最低量の復帰変異をスクリーニングし、
4. キメラ抗体のＣＤＲ領域をヒトの骨格領域に構築し、
5. 配列と構造特徴を使用して、骨格領域においてＣＤＲを維持する機能を果たすアミノ酸位置を決定し、
6. 重要であると決定された配列位置で復帰変異を行い（入力アミノ酸タイプに戻す）、
7. リスク部位のアミノ酸を最適化した。

【0147】

本発明で得られた３つのヒト化抗体によりそれぞれ得られたヒト化ＶＨＨ抗体ＬＡ４２Ｆ８．５、ＬＡ４６Ｅ１１．８、ＬＡ２４Ｃ１１．１０のＣＤＲ、および重鎖可変領域のアミノ酸配列については、添付の配列表を参照した。

【0148】

上記のＬＡ４２Ｆ８、ＬＡ４６Ｅ１１、ＬＡ２４Ｃ１１およびヒト化抗体ＬＡ４２Ｆ８．５、ＬＡ４６Ｅ１１．８、ＬＡ２４Ｃ１１．１０は真核細胞での発現のために以下のように調製した：

【0149】

上記で得られたヒト化抗体配列をｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、抗体配列を含むプラスミドをそれぞれ得た。

【0150】

必要なトランスフェクション体積に応じて、Ｅｘｐｉ－２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を継代し、トランスフェクションの前日に細胞密度を１．５×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。トランスフェクションの当日に細胞密度は約３×１０^６個の細胞／ｍＬであった。最終体積の１／１０のＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１３８３５－０１）をトランスフェクション緩衝液として使用し、適切な前記プラスミドを加えて、均一に混合した。プラスミドに適量のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を加え（２９３Ｆ細胞におけるプラスミドとＰＥＩの比率は１：３）、均一に混合してから室温で１０分間インキュベートすることによって、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物で細胞を再懸濁して、３６．５℃、８％ＣＯ_２において培養した。２４時間後にトランスフェクション体積の２％でフィード培地（ＦＥＥＤ）（Ｓｉｇｍａ）を追加し、３６．５℃、１２０ｒｐｍと８％ＣＯ_２の条件において培養した。６日目に連続培養しまたは細胞活性が６０％以下になると、細胞上清を収集して精製した。精製に使用される重力カラムを０．５Ｍ ＮａＯＨで一晩処理し、ガラス瓶などは蒸留水で洗浄した後に１８０℃で４時間乾燥させて、精製カラムを得た。精製前に、上記の収集した細胞上清を４５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、細胞を廃棄した。次に上清を０．２２μｌのフィルタで濾過した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｈｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ５＊５ｍｌ、ＧＥ、１１－００３４－９５）を１０ｍｌの結合緩衝液（リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化した。濾過後の上清を精製カラムに加えて結合緩衝液１５ｍｌで再平衡化した。溶出緩衝液５ｍｌ（クエン酸＋クエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ３．５）を加えて溶出液を収集し、溶出液１ｍｌあたりＴｒｉｓ－ＨＣｌ ８０μｌを加えた。収集した抗体を限外濾過により濃縮し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換して濃度を検出した。表３、図２、図４Ａ、図５Ａにおける検出のための本発明の抗体を除き、上清について特に言及されていない限り、実施例で使用した抗体はすべてこの発現のために精製された抗体であった。

【0151】

同様に、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照ＢＩ－ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ、ＢＩ８３６８８０、Ｆａｒｉｃｉｍａｂ（配列については配列表を参照）のコーディング核酸をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした後、Ｅｘｐｉ－２９３細胞にトランスフェクトした後、発現および精製して得、方法は実施例２と同じでした。

【0152】

実施例３ バイオレイヤー干渉技術による本発明のキメラ抗体と抗原の結合動力学の測定
バイオレイヤー干渉測定技術（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いてヒトＡｎｇ２と結合する本発明の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐら，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ２７０－８）に従ってＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性を測定した。

【0153】

実験開始より半時間前に、サンプルの数量分に応じて、適切な数量のＡＭＱ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）（サンプル検出用）センサまたはＡＨＱ（Ｐａｌｌ、１５０２０５１）（陽性対照検出用）センサを用意し、ＳＤバッファ（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ポリソルベート２０ ０．０５％）に浸漬した。

【0154】

１００μｌのＳＤバッファー、上記の実施例２で調製したＶＨＨ抗体、および抗原［ヒトＡｎｇ２（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、およびヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ）を含む］を取り、それぞれ９６ウェル黒色ポリスチレンハーフボリュームマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６７５０７６）に加えた。試料の位置に応じてプレートを配置し、センサの位置を決定した。次のように機器パラメータを設定した：ステップＢａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ～１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎを実行し、試料の結合と解離の速度で各ステップの実行時間を決定し、回転数は４００ｒｐｍで、温度は３０℃であった。ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェアを用いてＫ_Ｄ値を分析した。

【0155】

上記測定法に記載の実験において、抗体の親和性は、表１に示された。

【表2】

【表3】

【0156】

実施例４ 抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨ抗体ＥＬＩＳＡ遮断実験
本実施例は、受容体ＫＤＲへのｈＶＥＧＦＡの結合に対する本発明の抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨの遮断効果を検証した。ＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号２１１２５）を１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでマイクロプレートにプレーティングし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、３％ＢＳＡを加えて１．５時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識のＶＥＧＦ Ａ１６５（ＡＣＲＯ カタログ番号ＶＥ５－Ｈ８２１０）を加え、１．５時間インキュベートし、予め抗体（初期濃度１５０μｇ／ｍｌ、３倍連続希釈した）の実施例２で調製したＬＡ４２Ｆ８上清、ＬＡ４６Ｅ１１上清、陰性対照ＩｇＧ、および５０μｌの陽性対照ＢＩ－ａｎｔｉ－ＶＥＧＦをＶＥＧＦＲ－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１００１２－Ｈ０２Ｈ、最終濃度０．２μｇ／ｍｌ）と２０分間インキュベートした後、プレートに加えた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｈｕｍａｎ Ｆｃ ＨＲＰ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ カタログ番号：Ａ８０－１０４Ｐ）（１：１００００）を加え、３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢで５分間発色し、停止後にＯＤ４５０ｎｍを読み取った。

【0157】

本発明により得られた３つの抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ抗体の遮断結果を図２に示した。図２は、候補分子ＬＡ４２Ｆ８およびＬＡ４６Ｅ１１抗体がＶＥＧＦ ＡのＶＥＧＦＲ２への結合を完全に遮断できることを示した。

【0158】

実施例５ 抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体ＥＬＩＳＡ遮断実験
本実施例は、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体の、ｈＡｎｇ２－ｂｉｏｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＢＴ６２３Ｂ／ＣＦ）のＴｉｅ２タンパク質への結合に対する遮断効果を検証した。

【0159】

Ｔｉｅ２－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号：１０７００－Ｈ０３Ｈ）を２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルでマイクロプレートにプレーティングし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、３％ＢＳＡを加えて１．５時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、予め実施例２で調製した精製ＬＡ２４Ｃ１１．１０および陰性対照ＩｇＧ各５０μｌをｈＡｎｇ２－ｂｉｏｔｉｎ（最終濃度０．２μｇ／ｍｌ）と２０分間インキュベートした後、プレートに加えた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、Ａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ（１：２０００）を加え、３５分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢで５分間発色し、停止後にＯＤ４５０ｎｍを読み取った。

【0160】

本発明によって得られた抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体の遮断結果を表３に示し、候補分子ＬＡ２４Ｃ１１は、Ａｎｇ２の受容体Ｔｉｅ２への結合に対する遮断効果を有した。

【表4】

【0161】

実施例４と同様に（Ａｎｇ２－Ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＢＴ６２３Ｂ／ＣＦ）を使用）、Ａｎｇ２およびＴｉｅ２の結合の遮断に対するＬＡ２４Ｃ１１．１０の効果をＥＬＩＳＡ遮断実験によって検出し、その結果を図３に示した。ＬＡ２４Ｃ１１．１０がＡｎｇ２の受容体Ｔｉｅ２への結合に対して遮断効果を有することがわかった。

【0162】

実施例６ 抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体のリン酸化実験
本実施例は、ｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対する本発明の抗Ａｎｇ２
ＶＨＨ抗体の阻害効果を実証した。

【0163】

ｈＡｎｇ２によって誘導されるリン酸化実験
本研究は、抗体および組換えｈＡｎｇ２－Ｆｃタンパク質を、Ｔｉｅ２を過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞２９３－Ｔｉｅ２と共インキュベートし、系内のリン酸化Ｔｉｅ２の含有量を検出して、ｈＡｎｇ２－ｆｃによって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対する異なる抗体の阻害効果を反映した。

【0164】

ヒトＴｉｅ２を過剰発現するＥｘｐｉ－２９３細胞２９３－Ｔｉｅ２細胞は、マルチクローニングサイトＭＣＳにクローニングされたヒトＴｉｅ２遺伝子（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号：ＨＧ１０７００－Ｍ）を有するｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＥｘｐｉ－２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ）にトランスフェクトすることによって生成された。

【0165】

ヒトＴｉｅ２を過剰発現する２９３－Ｔｉｅ２細胞を取り、２×１０^６細胞／ｍｌに希釈し、ウェル当たり１００μｌを９６ウェルプレートに加え、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。

【0166】

Ｅｘｐｉ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ａ１４３５１０２）を使用して実験培地を構成し、その中に試験抗体（実施例２で調製したＬＡ２４Ｃ１１（２４Ｃ１１）およびＬＡ２４Ｃ１１．０（ｈｚ２４Ｃ１１．１０）、ならびに陰性対照ＩｇＧ、および陽性対照Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ（ＣＮ２０２０１０５７３６２５．２にしたがって調製された））を加え、初期濃度は６０μｇ／ｍｌで、順次に１：２で等倍希釈し、ｈＡｎｇ２－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ：１０６９１－Ｈ０２Ｈ）の最終濃度は２．５μｇ／ｍｌであった。

【0167】

細胞をウェルあたり１００μｌの実験培地に再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートし、遠心分離して培地を除去し、１％プロテアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号：７８４４２）およびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号：７８４４２）を含むＮＰ－４０溶解バッファー（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ００１３Ｆ）１００μｌを加え、氷上で３０分間置き、２０００ｇで遠心分離し、タンパク質上清を収集し、冷蔵庫で－８０度に保管した。

【0168】

リン酸化Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＤＹＣ２７２０Ｅ）の説明書に従ってｐＴｉｅ２濃度を検出し、キット内の捕捉抗体を４μｇ／ｍｌの濃度でマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。前のステップで得た凍結解凍したタンパク質上清１００μｌ、および対照ｐＴｉｅ２（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＤＹＣ２７２０Ｅ）を加え、標準曲線の作成に用いて室温で２時間インキュベートした（試料ｐＴｉｅ２の濃度が高すぎて、ＥＬＩＳＡの検出範囲を超える場合、得られた混合物を２～３倍希釈した）。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰが結合される抗ｐＴｙｒ抗体（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＤＹＣ２７２０Ｅ）１００μｌを加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ カタログ番号：ＰＲ１２００）を加えて発色させ、１５分後に１００μｌの停止緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏカタログ番号：Ｃ１０５８）を加えて反応を停止させた。多機能マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３を使用してＯＤ４５０～ＯＤ６２０を測定した。実験結果を図４Ａ（２４Ｃ１１は実施例２で調製したＬＡ２４Ｃ１１原核生物発現精製上清である）および図４Ｂに示した。

【0169】

したがって、本発明の抗Ａｎｇ２ ＶＨＨ抗体ＬＡ２４Ｃ１１およびＬＡ２４Ｃ１１．１０は両方とも、インビトロでｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導される２９３－Ｔｉｅ２細胞のリン酸化を効果的に阻害することができた。

【0170】

実施例７ 抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨ抗体ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ遮断実験
ＶＥＧＦ Ａは、関連する受容体ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）に結合し、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を活性化し、血管内皮細胞の生存、増殖、および遊走などを誘導し、本研究は、ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験系を用い、ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ ＣＳ１８１４０１）を使用し、ＶＥＧＦＡ活性化関連受容体シグナル伝達経路に対する段階希釈した抗体の遮断効果を検出した。

【0171】

実験方法については、供給元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書を参照した。

【0172】

３日前に実験培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）に交換したＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ ＨＥＫ２９３細胞を取り、古い培地を吸引除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、１ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ａ６９６４－５００ＭＬ）を使用して細胞が丸くなり脱壁するまで細胞を消化し、５ｍｌの希釈培地で反応を停止し、細胞を遠沈管に吸い取り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を廃棄し、１０ｍｌの希釈培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）を加えて細胞を再懸濁し、均一に混合して計数し、細胞生存率が９０％以上になるべきであった。希釈培地を使用して細胞密度を０．８×１０^６細胞／ｍｌに調整し、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μｌ／ウェルで加えた。

【0173】

濃度が１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ Ａと勾配希釈した被検抗体混合液を調製し、３０分間静置し、細胞を含む９６ウェル白色細胞培養プレートに５０μｌ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで６時間インキュベートした。ここで、被検試料は、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照ＢＩ－ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ、ＬＡ４２Ｆ８、ＬＡ４６Ｅ１１、ＬＡ４２Ｆ８．５、ＬＡ４６Ｅ１１．８であり；Ｂｌａｎｋは、希釈培地のみを含み、ＶＥＧＦ Ａ、抗体を含まず；ＶＥＧＦ Ａ １００ｎｇ／ｍｌは、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡのみを含んだ。

【0174】

６時間インキュベートした９６ウェル白色細胞培養プレートを炭酸ガスインキュベーターから取り出し、室温まで１０～１５分間平衡化した。予め室温に平衡化したＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを取り出し、実験レイアウトに従って９６ウェル白色細胞培養プレートに１００μｌ／ウェルで加え、室温で光を避けて５分間インキュベートした。蛍光読み取りは、多機能マイクロプレートリーダーを使用し、プレート読み取りモードとして化学発光モードを選択し、プレート読み取りタイプとしてエンドポイント法を選択し、波長を全波長に設定し、列ごとに蛍光を収集し、各列の収集時間は１０００ｍｓであった。

【0175】

上記測定法に記載の実験において、検出結果を図５に示し、抗ＶＥＧＦ ＶＨＨ抗体ＬＡ４２Ｆ８、ＬＡ４２Ｆ８．５、ＬＡ４６Ｅ１１、およびＬＡ４６Ｅ１１．８はすべて、ＶＥＧＦ Ａによって誘導されるＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を遮断することができた。

【0176】

実施例８ 抗ＶＥＧＦ Ａ ＶＨＨによるＶＥＧＦ Ａによって誘発されるＨＵＶＥＣ生存増殖の阻害の実験
ＶＥＧＦ Ａは、血管内皮細胞中のＶＥＧＦＲなどに関連する受容体に作用することができ、血管内皮細胞の生存、増殖、遊走を促進し、これによって血管新生を誘導し、本実験は、ＶＥＧＦがヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の生存および増殖を誘導することに基づいて、抗体がＶＥＧＦ Ａによって誘導される初代細胞の生存および増殖に対する阻害効果を検出した。

【0177】

本実施例は、ＣＣＫ－８を用いてＨＵＶＥＣの生存および増殖を測定し、具体的な方法は、細胞ＨＵＶＥＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ カタログ番号：Ｈ－００１－ＣＮ）を１日前に処理し、９６ウェル培養プレートに２０００細胞／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中に入れて２４時間インキュベートしたことであった。

【0178】

細胞が壁に付着した後、最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ Ａおよび勾配希釈した抗体（実施例２で調製したＬＡ４２Ｆ８、初期濃度８０μｇ／ｍｌ、１：３で等倍希釈し、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照ＢＩ８３６８８０、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ Ａのみを含む群（ＶＥＧＦＡ）、ならびにＶＥＧＦ Ａおよび抗体添加なしのＢｌａｎｋ）を含む実験培地を調製し、９６ウェルプレート中の内皮細胞培地を置換し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中に入れて７２時間インキュベートし、ＣＣＫ－８検出液（Ｄｏｊｉｎｄｏ カタログ番号：ＣＫ０４）を１０μｌ／ウェルで加え、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーター中で１２～２４時間インキュベートし、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度ＯＤ４５０－ＯＤ６２０の読み取り値を行った。

【0179】

上記測定法に記載の実験において、検出結果を図６に示し、図から、抗ＶＥＧＦＡ抗体ＬＡ４２Ｆ８が、ＶＥＧＦＡによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存および増殖を完全に阻害できることがわかった。

【0180】

実施例９ 抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性抗体ＨＥＫ２９３－ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ遮断実験
本発明の二重特異性結合分子の鎖ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２（配列は配列表に示す）の鎖をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築し、実施例２に記載のように２９３細胞で発現させ、前記二重特異性結合分子を精製した。

【0181】

本実施例は、ＨＥＫ２９３－ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験により、ＶＥＧＦ Ａに対する抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性抗体の遮断効果を検出した。実験方法については実施例７を参照した。
使用した結合分子または対照は次のとおりであった：
Ｂｌａｎｋ：ＶＥＧＦ Ａなし、抗体なし、
ＶＥＧＦ Ａ：１００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ Ａ、
陰性対照ＩｇＧ：上記のように調製し、
陽性対照Ｆａｒｉｃｉｍａｂ：上記のように調製し、初期濃度は１３．５μｇ／ｍｌ、１：３で勾配希釈し、
陽性対照ＢＩ－８３６８８０：上記のように調製し、初期濃度は１３．５μｇ／ｍｌ、１：３で勾配希釈し、
ＩＥＸ０４－０１２：上記のように調製し、初期濃度は１３．５μｇ／ｍｌ、１：３で勾配希釈した。

【0182】

検出結果を図７に示し、二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－０１２は、ＶＥＧＦによって誘導されるＫＤＲシグナル伝達経路の活性化を阻害し、対照抗体ＢＩ８３６８８０と比較して、より優れた阻害能力を有した。

【0183】

実施例１０ 抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子ＨＵＶＥＣ増殖阻害実験
本研究は、ＨＥＫ２９３－ＫＤＲ ｒｅｐｏｒｔｅｒ実験により、ＶＥＧＦＡによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存および増殖に対する抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子の阻害効果を検出した。

【0184】

実験方法は実施例８と同様であるが、使用した抗体は以下のとおりであった。
図Ａ：初期濃度が２０ｎｇ／ｍｌで、１：３で等倍希釈した上記のように調製したＩＥＸ０４－００８、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照ＦａｒｉｃｉｍａｂおよびＢＩ８３６８８０、ブランクはＢｌａｎｋ（すなわち抗体およびＶＥＧＦ Ａなし）、およびＶＥＧＦ Ａ群（すなわち、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡのみを加えた）、
図Ｂ：初期濃度が８０μｇ／ｍｌで、１：３で等倍希釈した上記のように調製した陰性対照ＩｇＧ、ＢＩ－ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ、ＩＥＸ０４－０１０、ブランクはＢｌａｎｋ（すなわち抗体およびＶＥＧＦ Ａなし）、およびＶＥＧＦ Ａ群（すなわち、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡのみを加えた）、
図Ｃ：初期濃度が２０ｎＭで、１：３で等倍希釈した上記のように調製したＩＥＸ０４-012、陰性対照ＩｇＧ、陽性対照ＦａｒｉｃｉｍａｂおよびＢＩ８３６８８０、ブランクはＢｌａｎｋ（すなわち抗体およびＶＥＧＦ Ａなし）、およびＶＥＧＦ Ａ群（すなわち、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡのみを加えた）。

【0185】

検出結果は図８に示すように、二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０、およびＩＥＸ０４－０１２はすべてＶＥＧＦによって誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の生存および増殖を阻害し、対照抗体ＢＩ８３６８８０およびＦａｒｉｃｉｍａｂと比較して、ＩＥＸ０４－０１２のＩＣ５０がより低く、より優れた阻害能力を有した。

【0186】

実施例１１ 抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性抗体Ａｎｇ２遮断実験
Ａｎｇ２はその天然受容体Ｔｉｅ２に結合することができ、本研究は、ＥＬＩＳＡ法およびＦＡＣＳ法により抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子によるＡｎｇ２とＴｉｅ２間の結合の遮断を検出した。

【0187】

（１）ＥＬＩＳＡ
ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２、ならびに対照抗体ＢＩ－８３６８８０およびＦａｒｉｃｉｍａｂがヒトＡｎｇ２のｈＴｉｅ２への結合を遮断する能力を、ＥＬＩＳＡによって検出した。

【0188】

ｈＴｉｅ２タンパク質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＰＢＳで再懸濁して２μｇ／ｍＬの濃度に溶解し、マイクロプレートに一晩被覆した。５％のＢＳＡで１時間ブロッキングし、ビオチン抗原Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｈＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２タンパク質（Ｒ＆Ｄ）を６００μｇ／ｍｌＭに希釈し、５０μｌ／ウェルであった。上記のように調製した抗体（ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０、ＩＥＸ０４－０１２、ならびに陽性対照抗体ＢＩ８３６８８０、Ｆａｒｉｃｉｍａｂ、および陰性対照ＩｇＧ）を最高濃度３００ｎＭから１：２で等倍希釈し、合計８個または１２個の希釈勾配、５０μｌ／ウェルで、氷上のＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、ビオチン抗原の最終濃度は３００ｎｇ／ｍｌであった。上記で得られた抗原抗体混合液をマイクロプレートにて９０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに１：１００００で希釈したＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μＬ加え、常温で３０分間行い、ＰＢＳを加えて６回洗浄した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ発色液（ｓｏｌａｒｂｉｏ）により１分間発色し、１００μＬ／ウェルの停止液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）により停止させた。

【0189】

マイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルのＯＤ４５０およびＯＤ６２０を読み取った。

【0190】

実験結果は（図９を参照）、ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０、ＩＥＸ０４－０１２および対照抗体ＢＩ８３６８８０がすべて完全な遮断効果を有し、本発明の二重特異性結合分子のＩＣ５０がすべて陽性対照抗体より顕著に小さいことを示した。

【0191】

（２）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）
ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０、ＩＥＸ０４－０１２、ならびに陽性対照抗体ＢＩ－８３６８８０およびＦａｒｉｃｉｍａｂおよび陰性対照ＩｇＧが細胞表面上のＴｉｅ２へのヒトＡｎｇ２－ｈＦｃの結合を遮断する能力はＦＡＣＳによって測定した。

【0192】

抗原ｈＡｎｇ２－Ｆｃタンパク質（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０６９１－Ｈ０２Ｈ）を４μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルであった。上記のように調製した抗体（ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０、ＩＥＸ０４－０１２、ならびに陽性対照抗体ＢＩ－８３６８８０およびＦａｒｉｃｉｍａｂおよび陰性対照ＩｇＧ）を最高濃度の８００ｎＭから始めて２倍勾配希釈し、合計１２個の希釈勾配、５０μｌ／ウェルで、氷上のＰＢＳ中で３０分間インキュベートし、抗原ｈＡｎｇ２－Ｆｃタンパク質の最終濃度は２μｇ／ｍｌ、各抗体の最大最終濃度は４００ｎＭであった上記のように調製した２９３－Ｔｉｅ２細胞を２×１０^５細胞／ウェル、１００μｌ／ウェルに調整した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、抗原抗体混合液に再懸濁した。氷上において３０分間インキュベートし、１００μｌ／ウェルでＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり１：２００で希釈した１００μｌのＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を加え、２０分間氷浴して、１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳを加え、３００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した。１００μｌのＰＢＳで再懸濁して、フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞蛍光シグナル値を検出した。そのＭＦＩに従って、ＧｒａｐｈＰａｄで濃度依存曲線をフィッティングした。結果を図１０に示した。図に示されるように、二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－００８、ＩＥＸ０４－０１０およびＩＥＸ０４－０１２がすべてヒトＡｎｇ２－ｈＦｃのＴｉｅ２への結合を効果的に遮断でき、ＩＣ５０が陽性対照より低かった。

【0193】

実施例１２ 抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子のＡｎｇ２リン酸化阻害実験
本実施例は、ｈＡｎｇ２によって誘導されるリン酸化実験を使用して、ｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対する本発明の二重特異性結合分子の阻害効果を検証した。

【0194】

本研究は、二重特異性結合分子と組換えｈＡｎｇ２－Ｆｃタンパク質を、Ｔｉｅ２を過剰発現するＥｘｐｉ２９３細胞、２９３－Ｔｉｅ２と共インキュベートし、系内のリン酸化Ｔｉｅ２の含有量を検出して、ｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導されるＴｉｅ２リン酸化に対する異なる抗体の阻害効果を反映した。

【0195】

上記のように調製した過剰発現２９３－Ｔｉｅ２細胞を取り、２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌに希釈し、ウェル当たり１００μｌを９６ウェルプレートに加え、４００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。

【0196】

Ｅｘｐｉ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏ カタログ番号Ａ１４３５１０２）を使用して実験培地を調製し、その中にそれぞれ試験抗体（上記のように調製したＩＥＸ０４－０１２、陽性対照ＢＩ－８３６８８０およびＦａｒｉｃｉｍａｂ、陰性対照ＩｇＧ）を加え、最大最終濃度は６０μｇ／ｍｌで、順次に１：２で等倍希釈し、ｈＡｎｇ２－Ｆｃ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号：１０６９１－Ｈ０２Ｈ）の最終濃度は２．５μｇ／ｍｌであった。

【0197】

細胞をウェルあたり１００μｌの実験培地に再懸濁し、３７度で１５分間インキュベートし、遠心分離して培地を除去し、１％プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む１００μｌのＮＰ－４０溶解液を加え、氷上に３０分間置いた。２０００ｇで遠心分離し、タンパク質上清を収集し、冷蔵庫で－８０度に保存し、

【0198】

リン酸化Ｔｉｅ２ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ＤＹＣ２７２０Ｅ）の説明書に従ってｐＴｉｅ２の濃度を検出し、捕捉抗体を４μｇ／ｍｌの濃度でマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩置いた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、５％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。試験試料１００μｌ、および対照ｐＴｉｅ２（Ｒ＆Ｄカタログ番号：ＤＹＣ２７２０Ｅ）を加え、標準曲線の作成に用いて室温で２時間インキュベートした（試料ｐＴｉｅ２の濃度が高すぎて、ＥＬＩＳＡの検出範囲を超える場合、得られた混合物を２～３倍希釈した）。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰが結合される抗ｐＴｙｒ抗体（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：ＤＹＣ２７２０Ｅ）１００μｌを加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＴＭＢを１００μｌ加えて発色し、１５分後に１００μｌの停止緩衝液を加えて反応を停止した。分光光度計を使用して、各ウェルのＯＤ４５０～ＯＤ６２０を測定した。

【0199】

実験結果を図１１に示した。本発明の抗体ＩＥＸ０４－０１２は、インビトロでｈＡｎｇ２－Ｆｃによって誘導される２９３－Ｔｉｅ２リン酸化を効果的に阻害することができ、ＩＣ５０は陽性対照より優れていた。

【0200】

実施例１３ Ａｎｇ２血管内皮細胞漏出に対する抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子の阻害実験
本研究は、ＨＵＶＥＣ－Ｔｉｅ２漏出実験により、血管内皮細胞漏出に対する抗ＶＥＧＦ Ａ／Ａｎｇ２二重特異性結合分子の作用および機能を同定した。

【0201】

ＨＵＶＥＣ細胞をレンチウイルス（Ａｌｌｃｅｌｌｓ カタログ番号：Ｈ－００１－ＣＮ）でトランスフェクトし、Ｔｉｅ２を過剰発現するＨＵＶＥＣ－Ｔｉｅ２細胞を得た。

【0202】

ｍｉｎｉ－ｗｅｌｌ９６ウェルインサートペトリ皿を用いてＥＧＭ－２培地３００μｌを下層にプレーティングし、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で消化してＨＵＶＥＣ－Ｔｉｅ２を得、ＥＧＭ－２培地を用いて１＊１０^７細胞／ｍｌに再懸濁し、１００μｌ／ウェルでペトリ皿の上層にプレーティングした。下室培地（ＥＧＭ－２培地）を２４時間ごとに置換し、２４時間後に下室培地を実験培地に交換し、前記実験培地の組成は次のとおりであった：
Ｂｌａｎｋ：ＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ カタログ番号：ＣＣ－５０３５）、
ＶＥＧＦ Ａ群：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：２９３－ＶＥ）、
ＩｇＧ群（ＶＥＧＦ Ａ＋ＩｇＧ）：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ ＩｇＧ、
Ａｎｇ１群（ＶＥＧＦ Ａ＋Ａｎｇ１）：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：２９３－ＶＥ）＋２００ｎｇ／ｍｌ Ａｎｇ１（Ｒ＆Ｄ カタログ番号：９２３－ＡＮ）、
ＩＥＸ０４－０１２群（ＶＥＧＦ Ａ＋ＩＥＸ０４－０１２）：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ ＩＥＸ０４－０１２、
ＢＩ－８３６８８０群（ＶＥＧＦ Ａ＋ＢＩ－８３６８８０）：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ ＢＩ－８３６８８０、
Ｆａｒｉｃｉｍａｂ群（ＶＥＧＦ Ａ＋Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）：ＥＧＭ－２培地＋２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ＋１０μｇ／ｍｌ Ｆａｒｉｃｉｍａｂ。
上記実験培地を３７℃、５％ＣＯ_２に置いて培養した。

【0203】

２４時間後、１μｌのＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：ＦＤ２０００Ｓ－１Ｇ）（４ｍｇ／ｍｌ）を上室実験培地の各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ_２に置き、３０分間後に下室培地を取り外し、ＰＢＳで希釈し、１：１０で希釈した後、マイクロプレートリーダーで検出し、励起光の波長は４８８ｎｍ、発光波長は５３５ｎｍであった。

【0204】

実験結果は図１２に示すように、本発明の抗体ＩＥＸ０４－０１２がＶＥＧＦによって誘導される血管内皮細胞の透過性を効果的に低下させることができることを示した。

【0205】

実施例１４．レーザー誘発脈絡膜血管新生の薬効試験
本実験は、アカゲザルレーザー誘発脈絡膜血管新生モデルを使用して、本発明の二重特異性結合分子ＩＥＸ０４－０１２の抗血管新生効果を測定した。

【0206】

アカゲザル：種属はアカゲザルであり、グレードは普通グレードであり、体重は、購入時の体重が３．３０～４．２０ｋｇで、モデリング時の体重が３．３５～４．３５ｋｇであり、由来は、Ｓｉｃｈｕａｎ Ｈｅｎｇｓｈｕ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．であり、生産許可証番号はＳＣＸＫ（川）２０１９－０２９であり、実験動物品質合格書番号はＮｏ．００２３３５６であり、

【0207】

本試験はレーザーを用いてアカゲザルの眼底黄斑の中心窩周辺に光凝固術を行って、眼底の脈絡膜血管新生を誘発することにより、ヒト脈絡膜新生血管に類似する動物モデルを作成した。光凝固前と光凝固後２０日後にフルオレセイン眼底血管造影を行い、モデリング状況を判定し、モデリングに成功したアカゲザル２０匹（雌雄各半）を選択してモデル対照群、ＩＥＸ０４－０１２低用量群、ＩＥＸ０４－０１２高用量群、Ｅｙｌｅａ群、Ｆａｒｉｃｉｍａｂ群の５群に分け、各群に４匹のサル、雌雄各半とした。

【0208】

光凝固後２１日目に、各群のサルに表中の投与量に応じてそれそれ投与を行い、ＩＥＸ０４－０１２、Ｅｙｌｅａ（Ｂａｙｅｒ）またはＦａｒｉｃｉｍａｂ（いずれも０．９％塩化ナトリウム注射液に溶解）を両眼硝子体に注射投与し、モデル対照群には同体積の０．９％塩化ナトリウム注射液が投与された。各群の動物は、投与後７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に眼底カラー写真撮影、フルオレセイン眼底血管造影（漏出スポット統計および漏出面積測定）（Ｒｏｂｉｎ Ｊ Ｇｏｏｄｙ、Ｗｅｎｚｈｅｎｇ Ｈｕ、Ａｆｓｈｉｎ Ｓｈａｆｉｅｅら、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０１１ ９２（６）：４６４－７２）、光干渉断層撮影（ＯＣＴ、Ｗａｎｇ Ｑ、Ｌｉｎ Ｘ、 Ｘｉａｎｇ Ｗら、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌａｓｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒａｌ－ｄｏｍａｉｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ． Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、２０１５、９９（１）：１１９－２４）をそれぞれ行い、試験製品による脈絡膜血管新生の阻害を観察した。投与後２９日目に安楽死させた後、両眼を取って免疫組織化学（ＨＥ）染色による組織学的検査を行った。

【表5】

【0209】

結果は図１３～１５に示すように、本発明の二重特異性結合分子は、投与２８日後に、顕著な抗血管新生効果を示し、グレード４の漏出スポット（図１３Ａ）とグレード３～４の漏出スポット（図１３Ｂ）の数の統計は、ＩＥＸ０４－０１２群の処置動物における高漏出スポットの数が対照群および陽性対照群より顕著に少なかったことを示した。ＯＣＴの結果は、ＩＥＸ０４－０１２治療群の動物において、網膜厚が顕著に減少し、網膜浮腫の程度が減少することを提示し、かつその効果が対照より優れたことを示した（図１４）。フルオレセイン眼底血管撮影の結果は、ＩＥＸ０４－０１２治療群における眼底漏出面積が顕著に減少し、かつその効果が陽性対照であるＥｙｌｅａおよびＦａｒｉｃｉｍａｂより優れたことを示し（図１５）、本発明の抗体が新生血管による漏出を顕著に阻害することができることを示した。以上により、本発明の抗体併用抗ＶＥＧＦ阻害剤は、レーザー誘発眼底血管新生に対して明らかな阻害効果を有し、同時に血管の完全性を保護する機能を有することが証明された。

【0210】

アカゲザルに投与２９日後、体重に応じてペントバルビタールナトリウムで麻酔し（約３０ｍｇ／ｋｇを静脈内注射、投与量は動物の健康状態に応じて調整できる）、腹部大動脈または大腿動脈から瀉血させて安楽死させ、大局観察を行い、両側眼を摘出した。

【0211】

一部の動物の両眼を、改良したＤａｖｉｄｓｏｎ’ｓ固定液で固定し、パラフィン包埋して切片にし、レーザーモデリング領域を選択して通常のＨＥ染色、ＣＤ３１ ＩＨＣ染色などの組織病理学的検査を行った。

【0212】

本発明の抗体群は、病理学的切片において、抗ＶＥＧＦ単独治療と比較して、網膜病変領域を顕著に減少させ、網膜浮腫を緩和し、レーザー損傷領域における組織増殖を減少させ、その結果は、より良好な網膜形態学的改善が示され（図１６を参照）、網膜脈絡膜血管新生が阻害され、血管完全性が向上した（図１７）。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】