特表 2024-520741 Ｓ－ヒドロキシクロロキンを用いた抗リン脂質症候群の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】Ｓ－ヒドロキシクロロキンを用いた抗リン脂質症候群の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4706 20060101AFI20240517BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240517BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 15/06 20060101ALI20240517BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4706

A61P37/02

A61K9/16

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/14

A61K9/08

A61K9/10

A61P15/06

A61P7/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574870

(86)(22)【出願日】2022-06-01

(85)【翻訳文提出日】2024-01-29

(86)【国際出願番号】 US2022031806

(87)【国際公開番号】W WO2022256426

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】63/197,033

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523455079

【氏名又は名称】ジェノベート バイオテクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ジェン

(72)【発明者】

【氏名】チュウ，チアチェン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA22

4C076AA30

4C076AA31

4C076AA36

4C076AA53

4C076BB01

4C076CC07

4C076CC44

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC28

4C086GA13

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA23

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA54

4C086ZA81

4C086ZB07

(57)【要約】

Ｓ－（＋）－ヒドロキシクロロキンおよび薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物を患者に投与することによって、抗リン脂質症候群を処置する方法。医薬組成物は、（Ｒ）－（－）－ヒドロキシクロロキンを実質的に含まない。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）の処置方法であって、
ＡＰＳに罹患している対象を特定すること、及び
（Ｓ）－（＋）－ヒドロキシクロロキンおよび薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物の有効量を前記対象に投与し、それによってＡＰＳを処置すること
を含み、前記医薬組成物が（Ｒ）－（－）－ヒドロキシクロロキンを実質的に含まない方法。

【請求項2】

前記Ｓ－ヒドロキシクロロキンが薬学的に許容される塩の形態である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記薬学的に許容される塩が、塩酸塩、硫酸塩、又はリン酸塩である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記対象に投与されるＳ－ヒドロキシクロロキンの用量が１日あたり１００ｍｇ～８００ｍｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記用量が１日あたり１５０ｍｇ～５００ｍｇである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記医薬組成物が、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、又はシロップ剤の形態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＡＰＳが、原発性ＡＰＳ、二次性ＡＰＳ、又は劇症型ＡＰＳである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＡＰＳが血栓性ＡＰＳ又は産科ＡＰＳである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

背景
抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）は、血栓症及び流産に関連する自己免疫疾患であり、肺及び脳内で生命を脅かす血栓を引き起こし得る。ＡＰＳは、５０歳未満の人の脳卒中の主な原因である。妊娠中の女性では、自然流産及び死産をもたらすことがよくある。

【0002】

報告によると、ＡＰＳは人口の０.３～１％に罹患する。ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗ ３９，１－１４（２０２０）を参照されたい。現在、治癒しない。長期抗凝固薬であるワルファリンは、血栓のリスクを減らすためのＡＰＳ関連血栓症の標準処置である。しかし、出血性合併症のリスクが高くなる。Ｒａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ １１２，１６８７－９５（２００８）を参照されたい。

【0003】

ＡＰＳに関する追加の参考文献については、Ａｇａｒら，Ｂｌｏｏｄ １１６，１３３６－４３（２０１０）；Ｒａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ １１５，２２９２－９９（２０１０）；Ｒａｎｄら，Ｌｕｐｕｓ １７，９２２－３０（２００８）；及びＣｏｎｔｉら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３２，５０９－１６（２００３）を参照されたい。

【0004】

抗マラリア化合物であるヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）は、傷害誘発性血栓症の動物モデルにおいて血栓症の広がりを低減させ、抗リン脂質（「ａＰＬ」）抗体誘発性の血小板活性化を逆転させる役割を果たすことが示唆された。Ｒａｎｄら（２００８）を参照されたい。その有効性と安全性は、大規模な臨床試験ではまだ決定されていない。

【0005】

ＨＣＱは、２つの光学異性体、すなわち、（Ｒ）－（－）－異性体（「Ｒ－ＨＣＱ」）及び（Ｓ）－（＋）異性体（「Ｓ－ＨＣＱ」）を有する。Ｒ－ＨＣＱとＳ－ＨＣＱを５０:５０で含有するラセミ混合物が上述の全ての研究で使用された。

【0006】

ＨＣＱの長期及び高用量の投与は、かすみ目を引き起こし、場合によっては網膜、角膜、又は網膜黄斑を損傷し、眼組織内の蓄積により一部の患者で視力障害をもたらし得る。

【0007】

ＨＣＱは、心毒性があることも知られている。ＨＣＱは、心室間伝導遅延、Ｑ波からＴ波への間隔延長、トルサード・ド・ポワント、心室性不整脈、低カリウム血症、及び低血圧を引き起し得る。米国特許出願第１７／１７６，６７９号を参照されたい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ＡＰＳを安全に有効に処置する方法を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の必要性を満たすために、Ｓ－（＋）－ヒドロキシクロロキン（「Ｓ－ＨＣＱ」）と薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物でＡＰＳを処置する方法が提供される。

【発明の効果】

【0010】

したがって、本発明は、ＡＰＳを処置する方法であって、
（ｉ）ＡＰＳに罹患している対象を特定する工程、並びに（ｉｉ）Ｓ－ＨＣＱ及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物の有効量を対象に投与し、それによってＡＰＳを処置する工程を含む方法に関する。医薬組成物は、（Ｒ）－（－）－ヒドロキシクロロキン（「Ｒ－ＨＣＱ」）を実質的に含まない。

【0011】

本発明の方法は、全てのタイプのＡＰＳ、例えば、一次ＡＰＳ、二次ＡＰＳ、及び壊滅的ＡＰＳの処置に適している。

【0012】

医薬組成物は、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、又はシロップ剤を含む任意の形態で投与される。好ましくは、医薬組成物は、１日あたり１００ｍｇ～８００ｍｇ（例えば、１２０ｍｇ～６００ｍｇ、１５０ｍｇ～５００ｍｇ、及び１８０ｍｇ～４５０ｍｇ）のＳ－ＨＣＱの用量で患者に投与される。

【0013】

Ｓ－ＨＣＱは、化合物自体及びその薬学的に許容される塩を指す。その塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態の詳細を、以下の説明と図面の両方に記載する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び添付の特許請求の範囲からも明らかである。最後に、本明細書で引用される全ての刊行物及び特許文献は、その全体が参照により組み込まれる。

【0015】

以下の説明は添付図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、分子ドッキング研究から得られ、４つの結合部を含むａ－ヘリックス型の構造を有するβ２－糖タンパク質Ｉに結合するＨＣＱ（Ｓ－ＨＣＱ又はＲ－ＨＣＱ）分子を示す写真を含む。

【発明を実施するための形態】

【0017】

詳細な説明
上記で要約したように、高純度のＳ－ＨＣＱと薬学的に許容される賦形剤を含有し、実質的にＲ－ＨＣＱを含まない医薬組成物をＡＰＳ患者に投与することによってＡＰＳを処置する方法が提供される。

【0018】

Ｓ－ＨＣＱの純度は、Ｓ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱのモルパーセンテージの差として定義される鏡像異性体過剰によって測定され、Ｓ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱの合計モルパーセンテージは１００％である。例えば、９９％の鏡像異性体過剰のＳ－ＨＣＱの純度は、Ｓ－ＨＣＱを９９.５モル％、Ｒ－ＨＣＱを０.５モル％含有する。医薬組成物は、９９％以上（例えば、９９.２％以上、９９.５％以上、及び９９.８％以上）の鏡像異性体過剰のＳ－ＨＣＱを含有する場合、Ｒ－ＨＣＱを実質的に含まないとみなされる。

【0019】

このような高い鏡像異性体過剰を有するＳ－ＨＣＱ調製物は、米国特許出願第１７／１７６,６７９号及び米国特許第５,３１４,８９４号に記載されている。

【0020】

医薬組成物中のＳ－ＨＣＱは、遊離塩基又は薬学的に許容される塩のいずれかである。薬学的に許容される塩は、硫酸塩、リン酸塩、及び塩酸塩であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、それは硫酸塩である。

【0021】

医薬組成物は、重量で５重量％～９５重量％、例えば、３０重量％～８０重量％、４０重量％～７０重量％、４０重量％～５５重量％、及び６０重量％～７０重量％の範囲でＳ－ＨＣＱを含有する。

【0022】

医薬組成物は、Ｒ－ＨＣＱを実質的に含まず、例えば、Ｒ－ＨＣＱを２重量％以下（例えば、１％以下及び０.５％以下）含有する。

【0023】

例示的な医薬組成物は、Ｓ－ＨＣＱを５０％～７０％、及び１以上の医薬賦形剤を３０％～５０％含有する。

【0024】

本発明の方法を実施するために、ＡＰＳに罹患している対象は、典型的には、１００ｍｇ～８００ｍｇ（例えば、２００ｍｇ及び４００ｍｇ）のＳ－ＨＣＱの１日用量に対応する医薬組成物の有効量を投与される。

【0025】

Ｓ－ＨＣＱの投与は、Ｒ－ＨＣＱ及びラセミＨＣＱ（すなわち、Ｓ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱの等モル混合物）と比較して、特に心毒性に関する副作用がほとんどない。

【0026】

Ｓ－ＨＣＱに加えて、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含み、これは、結合剤、希釈剤、界面活性剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、及び着色剤を含むが、これらに限定されない、医薬分野で使用される任意の生理学的に不活性な賦形剤であり得る。賦形剤の例については、米国特許出願公開第２００８／０２０６３４号を参照されたい。

【0027】

医薬組成物は、任意の形態、例えば、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、及びシロップ剤で提供される。それは、多くの刊行物に記載されている従来の方法に従って調製することができ、例えば、米国特許出願公開第２０１８／０１９４７１９号を参照されたい。

【0028】

本発明の方法は、原発性ＡＰＳ（血栓性ＡＰＳ及び産科ＡＰＳ）、二次性ＡＰＳ、及び劇症型ＡＰＳに罹患している対象の処置において驚くほど効率的である。

【0029】

原発性ＡＰＳは、併存疾患がない状態で、再発性動脈血栓症及び静脈血栓症、再発性流産、並びに血栓性素因及び妊娠の罹患率に関与する循環ａＰＬ抗体の存在を特徴とする血栓性状態である。二次性ＡＰＳを有する患者では、既存の自己免疫状態がある。ＡＰＳの最も重篤な形態である劇症型ＡＰＳは、ａＰＬ抗体に関連する多系統自己免疫状態であり、小血管閉塞を伴う多臓器不全が同時に発生する場合の血管血栓症又は流産を特徴とする。

【0030】

患者ごとに異なるＡＰＳの症状には、血栓、流産、発疹、慢性頭痛、認知症、発作、動脈血栓症、自己免疫性血小板減少症、常染色体優性遺伝、かすみ目、網膜中心動脈閉塞症、虹彩炎、角膜炎、狼瘡抗凝固剤、網膜剥離、網膜血管炎、強膜炎、静脈血栓症、視力喪失、及び硝子体炎などの兆候が含まれる。

【0031】

理論に縛られることなく、ＨＣＱは、ＡＰＳに関連する血中タンパク質であるβ２－糖タンパク質Ｉ（「β２－ＧＰ１」）と結合することによってＡＰＳを処置すると考えられている。β２－ＧＰ１は、血液凝固を調節できる高濃度、すなわち０.２ｍｇ／ｍＬで血液中を循環する。ＭｃＤｏｎｎｅｌｌらを参照されたい。

【0032】

β２－ＧＰ１は、２つの立体構造、すなわち閉じた環状型と開いた直鎖型で存在する。β２－ＧＰ１がこれら２つの形態の間で立体構造を変化させるきっかけは不明である。その中で、β２－ＧＰ１の９０％は血液中を環状型で移動する。Ａｇａｒら，Ｂｌｏｏｄ １１６，１３３６－４３（２０１０）を参照されたい。β２－ＧＰ１は、その直鎖型では、２つのドメイン、すなわち、Ｎ末端ドメインI（「ＤＩ」）とＣ末端ドメインＶ（「ＤＶ」）を露出する。ＤＩは、抗体、例えば、ａＰＬ抗体を受け取るための主要な領域である。ＤＶは、血液細胞膜への結合に関与している。β２－ＧＰ１が環状型から直鎖型に変化すると、抗体の血液細胞膜への結合が促進され、凝固反応が始まる。これはβ２－ＧＰ１－抗体複合体を形成することによって達成され、ＡＰＳへの重要な病原性経路である。

【0033】

β２－ＧＰ１－抗体複合体は、他のメカニズムの中でも特に、血液細胞上の抗凝固アネキシンＶシールドを破壊することにより、血液凝固作用を発揮することが認識されている。ＭｃＤｏｎｎｅｌｌらを参照されたい。

【0034】

細胞タンパク質であるアネキシンＶは、血液細胞膜のリン脂質に結合することによって血栓の形成を阻害し、抗体がリン脂質を攻撃するのを遮断するシールドを形成する。ＡＰＳ患者では、アネキシンＶシールドはβ２－ＧＰ１を介した抗体によって破壊される。

【0035】

ＨＣＱは、β２－ＧＰ１がその立体構造を直鎖状に変化するのを防ぐことにより、上記の病原性経路を破壊すると考えられている。

【0036】

これ以上詳しく説明しないが、当業者なら、本明細書の開示に基づいて、本開示を最大限に活用できると考えられる。

【0037】

したがって、以下の具体例は、単に説明的なものとして解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を制限するものではない。

【0038】

実施例
実施例１:β２－糖タンパク質Ｉ上でのＳ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱの分子ドッキング
Ｓ－ＨＣＱ及びＲ－ＨＣＱとβ２－ＧＰ１の結合安定性を評価するために、生体高分子構造データの世界規模のオープンアクセスアーカイブであるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ：１ＡＶ１）から構造を取得して、分子ドッキングをシミュレーションした。ＢＩＯＶＩＡ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、タンパク質構造とアミノ酸配列のアライメントと編集を行った。スイスバイオインフォマティクス研究所（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）が提供するドッキングサービスであるＳｗｉｓｓＤｏｃｋにより、β２－ＧＰ１の疎水性領域を予測するためにコンピューター解析を行った。ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａｍ（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）のソフトウェアを使用して、分子構造を可視化し、解析した。

【0039】

分子ドッキングは、ＨＣＱがβ２－ＧＰ１に結合し、その立体構造変化を阻害する方法を理解するのに役立つ。Ｓ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱに対して、β２－ＧＰ１との分子ドッキングシミュレーションを別々に行った。抗体に結合すると、β２－ＧＰ１は、閉じた形態（環状）から開いた形態（直鎖状）に立体構造変化を起こす。後者は、β２－ＧＰ１抗体複合体の形成を促進し、血栓症を引き起こす。したがって、ＨＣＱの結合がβ２－ＧＰ１の立体構造変化を妨げることできるかどうかを知ることが非常に重要である。

【0040】

分子ドッキングの結果を図１に示す。図示されているように、β２－ＧＰ１は、５つのドメインと４つの結合部（図では１、２、３、及び４として示されている）を有する擬連続性の両親媒性ａ－ヘリックスを含有する。隣接する２つのａ－ヘリックスドメインは結合部で連結されている。４つの結合部は、共に又は別々に、ａ－ヘリックスの移動を可能にし、それによりβ２－ＧＰ１立体配置を環状型と直鎖型の間で変化させる。

【0041】

分子ドッキングにより、ＨＣＱ分子が４つの結合部（１、２、３及び４）のいずれか１つに結合できることが示された。なかでも、結合部３への結合は、立体構造変化を阻害するために有効である。結合の強さは、分子ドッキング研究で計算された親和性エネルギーによって測定される。親和性エネルギーが高いほど、結合が強いことを示す。

【0042】

Ｓ－ＨＣＱは、非常に高い値の１２.６ｋｃａｌ／ｍｏｌの親和性エネルギーで結合部３に結合する。β２－ＧＰ１のａ－ヘリックスの結合部３を固定することにより、Ｓ－ＨＣＱは、ＡＰＳ病原性経路に必要である抗体がβ２－ＧＰ１と結合して複合体を形成するのに必要とされる環状型から直鎖型への立体構造変化を阻害する。そのため、Ｓ－ＨＣＱはこの経路を遮断し、それによってＡＰＳを有効に処置する。

【0043】

対照的に、Ｒ－ＨＣＱは、わずか１０.５ｋｃａｌ／ｍｏｌの親和性エネルギーで結合部３に結合し、このエネルギーレベルは、β２－ＧＰ１のａ－ヘリックスの立体構造変化を防止するためにあまり有効ではない。さらに、β２－ＧＰ１のａ－ヘリックス上でのＲ－ＨＣＱの結合角度（ａｎｇｅｌ）がＳ－ＨＣＱのそれと異なるため、Ｒ－ＨＣＱは立体配置変化を抑制するためにあまり有効ではなくなる。

【0044】

実施例２:ＨＣＱによるβ２－ＧＰ１－抗体形成の阻害
インビトロ研究で、Ｓ－ＨＣＱ及びＲ－ＨＣＱを試験し、単球性白血病患者由来のヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１を用いてａＰＬ抗体とβ２－ＧＰ１の結合を低下させるその有効性を示した。

【0045】

ＴＨＰ－１は、β２－ＧＰ１を高発現するヒト末梢血単球であり、患者のＡＰＳの増加に関連する。ＨＣＱで処置する前に、ＴＨＰ－１細胞を３．７％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングし、マウスａＰＬ抗体（Ａ５００－００６Ａ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｔｅｘａｓ）とインキュベートした。細胞免疫蛍光染色を用いて、β２－ＧＰ１の発現を測定した。

【0046】

ドットブロットアッセイのために、以下のように、別々の試料を調製した：ＴＨＰ－１全可溶化液をフッ化ポリビニリデン膜にロードし、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングし、マウス抗β２－ＧＰ１ Ａ５００－００６Ａ及びＳ－ＨＣＱ、Ｒ－ＨＣＱ、又はラセミＨＣＱと各々１０ｍｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。対照試料を、ＨＣＱを添加しないことを除いて、上記と同じ手順に従って得た。

【0047】

続いて、Ｓ－ＨＣＱ又はＲ－ＨＣＱがβ２－ＧＰ１－抗体複合体のＴＨＰ－１膜への結合を阻害するどうかかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。このようにして処理したＴＨＰ－１細胞を、８０％のＲＰＭＩ－１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ，ｐＨ７．４５）中２０％の抗β２－ＧＰ１免疫グロブリンＧ（「ＩｇＧ」）（０．２ｍｇ／ｍＬ）、及びＳ－ＨＣＱを含有する培地で密度３．６×１０^５細胞／ｍＬの密度に再懸濁した。異なるＳ－ＨＣＱ濃度、すなわち、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、又は５μｇ／ｍＬを有する培地から３つの試料を各々調製した。対照試料を、Ｓ－ＨＣＱを添加しないことを除いて、上記と同じ手順に従って得た。光学吸光度を４５０ｎｍで測定した。

【0048】

上記の全てのアッセイを３連で行った。報告された結果を平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。全ての統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（バージョン８．０ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の商標のソフトウェアを使用して実行した。２つの群間の比較には、スチューデント検定を用いた。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。

【0049】

細胞免疫蛍光染色を用いて、本研究のＴＨＰ－１細胞は、β２－ＧＰ１を高レベルで発現することが見出され、このことは核の青色の点を有する丸い単一細胞形態として示されるＴＨＰ－１細胞に緑色の丸い点が重なることにより確認された。

【0050】

ドットブロット分析により、Ｓ－ＨＣＱは、β２－ＧＰ１と抗体の結合を９７％（±２％、ｐ＜０．０５）という驚くべきレベルで阻害することが示された。比較として、Ｒ－ＨＣＱは、β２－ＧＰ１と抗体の結合をわずか２３％（±１７％）阻害し、ラセミＨＣＱは結合を８０％（±４％）阻害した。

【0051】

ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｓ－ＨＣＱがβ２－ＧＰ１と抗体の結合を用量依存的に阻害する、すなわち、１μｇ／ｍＬのＳ－ＨＣＱで２５％、２．５μｇ／ｍＬのＳ－ＨＣＱで６０％、及び５μｇ／ｍＬのＳ－ＨＣＱで９０％の阻害率（ｐ＜０．０５）で阻害することが実証された。

【0052】

Ｓ－ＨＣＱは、β２－ＧＰ１と抗体の結合を有効に阻害し、Ｒ－ＨＣＱ及びラセミＨＣＱよりも驚くほど有効であることが見出された。

【0053】

実施例３:ＨＣＱによる細胞膜上でのアネキシンＡ５抗凝固シールドの修復
上記で指摘したように、内因性タンパク質であるアネキシンＡ５は、血液細胞表面でシールドを形成し、血液凝固を抑制するため、ＡＰＳのリスクを低下させる。この実施例で、Ｓ－ＨＣＱは、ａＰＬ抗体によって破壊されたアネキシンＡ５抗凝固シールドを顕著に修復した。

【0054】

ＴＨＰ－１細胞を、最初に、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び５０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン抗生物質を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で維持した。次に、それらを９６ウェル培養プレートに８×１０^４細胞／ウェルの密度で播種し、コンフルエンスにさせた。続いて、ＴＨＰ－１細胞を０．５μｇ／ｍＬのＨＣＱの存在下で抗β２－ＧＰ１ ＩｇＧで処理した。ＩｇＧ処理ＴＨＰ－１細胞をＨＢＳ－ＣａＣｌ_２溶液ですすぎ、遊離アネキシンＶを除去し、細胞表面に付着したアネキシンＶのみを残した後に、細胞表面上のアネキシンＶのレベルを光学吸光度によって測定した。

【0055】

３つの試料を、３つのＨＣＱ（すなわち、Ｓ－ＨＣＱ、Ｒ－ＨＣＱ、及びラセミＨＣＱ）溶液の１つで各々調製した。比較試料を、ＨＣＱを添加しないことを除いて、上記と同じ手順に従って得た。β２－ＧＰ１－抗体を含有する患者血清を対照試料として使用した。

【0056】

細胞免疫蛍光染色により、免疫蛍光画像において緑色の点としてアネキシンＶの高発現レベルを確認した。加えて、ＴＨＰ－１におけるアネキシンＶの発現をウェスタンブロットによって確認した。

【0057】

Ｓ－ＨＣＱ処理ＴＨＰ－１細胞は、Ｒ－ＨＣＱ処理ＴＨＰ－１細胞で見られる相対レベル２．５４及びラセミＨＣＱ処理ＴＨＰ－１細胞で見られる相対レベル３．０９と比較して、相対レベル３．４５でアネキシンＶを有していた。比較試料は、アネキシンＶの相対レベルがわずか１であることを示した。

【0058】

上記の結果は、Ｓ－ＨＣＱがＡＰＳの処置においてＲ－ＨＣＱ及びラセミＨＣＱよりも驚くほど有望であることを示している。

【0059】

実施例４:ＨＣＱによる生体内血栓形成の減少
血栓症の抑制に対するＨＣＱの治療効果を、ＡＰＳ関連血栓症動物モデルによって評価した。

【0060】

抗β２－糖タンパク質Ｉの単離
６人のＡＰＳ患者（すなわち、患者１～６）の血清および血漿を、本研究に参加するために選択した。ＡＰＳ確認のために、抗カルジオリピン（ａＣＬ）、抗β２ＧＰＩ、及びループス抗凝固（ＬＡ）活性を測定した。ＡＰＳ由来の抗β２ＧＰＩ試料を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＧｒａｖｉＴｒａｐ（商標）（Ｃｙｔｉｖａ（商標），Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて血清試料の精製によって得た。各試料中の抗β２ＧＰＩ抗体の濃度を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｍｈｅｒｓｔ，Ｎｅｗ Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）によりβ２ＧＰＩへの結合を用いて試験した。

【0061】

インビトロ内皮細胞活性化を、上記で得た抗β２ＧＰＩ抗体によって誘導した。内皮細胞（すなわち、ＨＵＶＥＣ）を播種し、ＡＰＳ由来の抗β２ＧＰＩ抗体とインキュベートした。陽性対照として、一部のＨＵＶＥＣをリポ多糖（ＬＰＳ、３ｍｇ／ｍＬ）で処理した。Ｅ－セレクチン、細胞間接着、及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）の表面発現が検出され、β２ＧＰＩ ＩｇＧの量と正の相関があることが見出された。

【0062】

ＡＰＳ関連血栓症マウスモデル
８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（ＢｉｏＬａｓｃｏ，Ｔａｉｗａｎから購入）を本研究で使用した。全ての手順は、台北医科大学の施設動物管理委員会によって承認された。

【0063】

内皮損傷モデルを用いてマウスにおいて静脈血栓症を誘発した。７．５％ ＦｅＣｌ_３（陽性対照）、生理食塩水（陰性対照）、又はＡＰＳ由来抗β２ＧＰ１抗体（患者２由来）を１００、２００、又は３００ＡＵ（試験群）の投与量でマウスに静脈内（ＩＶ）注射した。注射後７２時間の時点で麻酔をかけた。右大腿静脈を露出し、１５００ｇ／ｍｍ^２の圧力でつまみ、血栓の形成を誘発した。

【0064】

抗β２ＧＰ１抗体は、３つの濃度、すなわち、１００、２００、及び３００ＡＵの全てで有効に血栓を誘発することが決定された。そのため、以下の全ての研究では、抗β２ＧＰ１抗体をマウスに１００ＡＵで注射した。

【0065】

ＡＰＳ関連血栓症マウスモデルにおけるラセミＨＣＱによる血栓形成の減少
上記の手順に従い、マウス（すなわち、ＨＣＱ処置マウス）に、患者５由来の抗β２ＧＰ１抗体１００ＡＵ及び２０００μｇのラセミＨＣＱ（１０ｍｇ／ｍｌで２００μｌ）を注射した。対照としてのマウス群（ｎ＝４;ＡＰＳ誘発マウス）に、抗β２ＧＰ１抗体を１００ＡＵのみ注射した。７２時間後、各マウスの右大腿静脈を露出させ、１５００ｇ／ｍｍ^２の圧力でつまみ、血栓形成を誘発した。血栓症時間（分単位）を記録した。健常マウス群（ｎ＝２）の血栓症時間は５分であったのに対し、ＡＰＳ誘発マウスの平均血栓症時間は２分であった。対照的に、ＨＣＱ処置マウスの血栓症時間は５分で、健常マウスと同じであった。結果から、抗β２ＧＰ１抗体はＡＰＳ誘発マウスの血栓症を加速する一方で、ラセミＨＣＱは抗β２ＧＰ１抗体の機能を阻害することが示された。

【0066】

５分間ピンチした後、血栓を大腿静脈から除去した。ラセミＨＣＱは、ＨＣＱ処置を行わなかったマウス群と比較して、血栓サイズを有意に低減させた。

【0067】

結果から、Ｓ－ＨＣＱとＲ－ＨＣＱの両方を含むラセミＨＣＱが、ＡＰＳ患者の血栓形成を低減させることにより、ＡＰＳの処置に有用であることが示される。

【0068】

ＡＰＳ関連血栓症マウスモデルにおけるＳ－ＨＣＱによる血栓形成の低減
ＡＰＳ関連血栓症と静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の危険因子は重複しており、主に内皮機能障害（ＥＤ）に関連する。Ｅ－セレクチンおよびＶＣＡＭ－１は、ＡＰＳ関連血栓症の高リスクに関連する。

【0069】

上記のＡＰＳ動物モデルに基づき、血栓症を減少させるために、Ｒ－ＨＣＱ及びＳ－ＨＣＱをマウスに投与した。マウスを６群に分け、それらの各々に（１）対照群としてＩｇＧ、（２）比較群として抗β２ＧＰＩ－抗体１００ＡＵ、（３）処置群３として抗β２ＧＰＩ抗体１００ＡＵとＳ－ＨＣＱ３００μｇの組み合わせ、（４）処置群４として抗β２ＧＰＩ抗体１００ＡＵとＳ－ＨＣＱ２００μｇの組み合わせ、（５）処置群５として抗β２ＧＰＩ抗体１００ＡＵとＲ－ＨＣＱ２００μｇの組み合わせ、又は（６）処置群６として抗β２ＧＰ１抗体１００ＡＵとＲ－ＨＣＱ１００μｇの組み合わせを注射した。

【0070】

ＡＰＳ関連血栓症の２つのバイオマーカーであるＥ－セレクチンとＶＣＡＭ－１の血清発現レベルを測定した。処置群３～６における阻害のパーセンテージを、比較群と比較したＥ－セレクチン及びＶＣＡＭ－１の発現レベルに基づいて計算した。結果については、以下の表１を参照されたい。Ｅ－セレクチン又はＶＣＡＭ－１の発現レベルが低いと、血栓症の阻害は高いことを示す。

【0071】

表１に示すように、３００μｇ又は２００μｇのＳ－ＨＣＱで処置したマウスは、Ｒ－ＨＣＱで処置したマウスと比較して、Ｅ－セレクチンとＶＣＡＭ－１の両方の発現がはるかに低かった。驚くべきことに、２００μｇのＳ－ＨＣＱで処置したマウスは、２００μｇのＲ－ＨＣＱで処置したマウスのわずか２６.５％と比較して、血栓症を５１．４％阻害することが見出された。

【表1】

【0072】

他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書において開示される各特徴は、同一、同等、又は類似の目的を果たす代替の特徴と置き換えてもよい。別段の明示的な記載がない限り、開示される各特徴は、同等又は類似の特徴の一般的なシリーズの一例にすぎない。

【0073】

上記から、当業者なら、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適合させるために様々な変更及び改変を行うことができる。そのため、他の実施形態も以下の特許請求の範囲に含まれる。

【図1】

【国際調査報告】