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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】レンチウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20240517BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20240517BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C12N15/49
C12N5/10
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575790
(86)(22)【出願日】2022-06-08
(85)【翻訳文提出日】2024-02-02
(86)【国際出願番号】 GB2022051437
(87)【国際公開番号】W WO2022258967
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】2108176.5
(32)【優先日】2021-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2207077.5
(32)【優先日】2022-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517006588
【氏名又は名称】タッチライト・アイピー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ムーア，サラ
(72)【発明者】
【氏名】アディ，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】バレイラ・ゴンザレス，マリア
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、レンチウイルス粒子の生産における使用に好適である新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。注目すべきことに、本発明は、導入遺伝子を含むベクター（多くの場合、「ペイロード」ベクターと呼ばれる）の新しい配置に関し、この配置は、この配置を欠く閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターと比較した場合、感染性レンチウイルス粒子のより大きな収率、注目すべきことに導入遺伝子を有するレンチウイルス粒子のより大きな収率を準備することを可能にする。さらに、本発明者らは、ベクター入力量および構築物比の最適化を通して、閉鎖型直鎖状ＤＮＡによるレンチウイルス生産における改善を発展させた。本発明は、場合により生産ベクターの改善および／または方法の最適化と共に、構築物を使用して感染性レンチウイルス粒子を生成する方法にさらに関する。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって、以下の５’～３’の順序で、配列：（ａ）ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列；
（ｂ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
（ｃ）３’自己不活性化（ＳＩＮ）配列；
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナル配列；および
（ｅ）スペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項2】
前記スペーサー配列が、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項3】
前記プロモーターおよび導入遺伝子が、５’および３’ＬＴＲ配列によって両側から挟まれている、請求項１または２に記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項4】
１つまたは複数のさらなるスペーサー配列、好ましくは前記ハイブリッド５’ＬＴＲ配列の５’に位置する５’スペーサー配列をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項5】
前記５’スペーサー配列が、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項6】
前記ハイブリッド５’ＬＴＲが、異種のプロモーターにより置換されるＵ３領域のすべてまたは部分を有する、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項7】
前記ポリ（Ａ）シグナル配列が、追加のヘルパー配列を含み、場合により、前記ヘルパー配列が、１つまたは複数の上流配列エレメント（ＵＳＥ）である、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項8】
前記ポリ（Ａ）シグナルが、強いポリ（Ａ）シグナルである、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項9】
前記ポリ（Ａ）シグナルが、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列、ウサギβ－グロビンポリ（Ａ）（ｒｂＧｌｏｂ）もしくはウシ成長ホルモンポリ（Ａ）（ｂＧＨｐＡ）または前記配列と少なくとも９０％の相同性を有する配列から選択される、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項10】
前記３’ＳＩＮ ＬＴＲが、野生型ＬＴＲと比較して１つまたは複数の欠失、場合によりＵ３領域における欠失を含有する、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項11】
前記３’ＳＩＮ ＬＴＲが、野生型３’ＬＴＲと比較して、転写開始部位についての－１４９～－９のヌクレオチドの１３３ヌクレオチドＵ３欠失を含有する、請求項１０に記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター。
【請求項12】
前記移行ベクターが、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターである場合、レンチウイルス粒子の感染タイターを改善するための方法であって、前記請求項のいずれかに記載の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを、パッケージング細胞または生産性細胞へ導入するステップを含む方法。
【請求項13】
前記パッケージング細胞へ、レンチウイルス粒子の製造に必要とされるウイルスエレメントをコードする１つまたは複数の生産ベクターを導入するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記１つまたは複数の生産ベクターが、以下のもの：（ｅ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；および／または
（ｆ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；および／または
（ｇ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｈ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記生産ベクターのうちの１つまたは複数が、場合によりスペーサー配列を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターが：（ａ）ｉ． レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
ｉｉ． レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；
ｉｉｉ． エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
ｉｖ． レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセットと、
（ｂ）前記発現カセットの３’に位置するスペーサー配列と
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記エンベロープ遺伝子が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＧＡＧ遺伝子およびＰＯＬ遺伝子が、単一の生産ベクターに含まれる、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記パッケージング細胞が、ＨＥＫ２９３細胞またはそのバリアントもしくは派生物である、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記ベクターが、トランスフェクション、場合により化学トランスフェクションにより前記パッケージング細胞または生産性細胞へ導入される、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
トランスフェクション剤が、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはリポフェクタミンのうちのいずれか１つから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
閉鎖型直鎖状移行ベクター、ＧＡＧ－ＰＯＬコード生産ベクター、ＲＥＶコード生産ベクターおよびＥＮＶコード生産ベクターが、４：１：２：１の構築物モル比において前記パッケージング細胞へ供給される、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
（ａ）レンチウイルス粒子の生産に適合された少なくとも１つの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターをトランスフェクトされたパッケージング細胞または生産性細胞において前記レンチウイルス粒子の生産を誘導するステップ；および／または（ｂ）トランスフェクトされた前記パッケージング細胞または生産性細胞を培養するステップ；ならびに
（ｃ）培養培地から、生産された組換えレンチウイルス粒子を回収／単離するステップ
をさらに含む、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、レンチウイルス粒子の生産における使用に好適である新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。注目すべきことに、本発明は、導入遺伝子を含むベクター（多くの場合、「ペイロード」ベクターと称される）の新しい配置に関し、この配置は、この配置を欠く閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターと比較した場合、感染性レンチウイルス粒子のより大きな収率、注目すべきことに導入遺伝子を有するレンチウイルス粒子のより大きな収率を準備することを可能にする。さらに、本発明者らは、ベクター入力量および構築物比の最適化を通して、閉鎖型直鎖状ＤＮＡによるレンチウイルス生産における改善を発展させた。本発明は、場合により、本明細書において説明される生産ベクターの改善および／または方法の最適化と共に、構築物を使用して感染性レンチウイルス粒子を生成する方法にさらに関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルスベクターは、真核細胞の改変のための効率的な手段を提供し、それらの使用は、研究および臨床遺伝子療法適用の両方について、学術的な研究所および産業分野の両方において今や広がっている。ウイルスベクターのスペクトルは非常に広く、アデノウイルスなどのＤＮＡウイルスから、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスまでに及ぶ。レンチウイルスは、レトロウイルス科のウイルスの１つの属であり、調節遺伝子ｔａｔおよびｒｅｖと共に、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質コード遺伝子をコードする正－センス一本鎖ＲＮＡゲノムによって特徴付けられる。感染性レンチウイルスビリオンは、宿主細胞膜との直接的融合、または受容体媒介性エンドサイトーシスを通して宿主細胞に入り、進入に際してレンチウイルスコアは放出され、レンチウイルスゲノムの逆転写が起こる。生ずる二本鎖プロウイルスＤＮＡは次に、感染した宿主細胞のゲノムへ組み込まれ、そこでそれは宿主の細胞機構に依存して、感染性粒子のアセンブルに必要なウイルスタンパク質の転写および翻訳を開始および完了する。
【0003】
このフレームワークに基づき、かつレンチウイルスの非常に効率的な組込み能力を利用して、レンチウイルス粒子（ＬＶＰ）は、哺乳動物細胞における遺伝子移行のための効率的な媒体として開発されてきた。レンチウイルス粒子の大多数は、最も広範に研究されているレンチウイルスであるＨＩＶ－１に由来するが、他のレンチウイルス、例えばＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス、ならびにネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルスおよびヤギ関節炎－脳炎ウイルスを含む非霊長類レンチウイルスもまた、遺伝子移行媒体として開発されている。
【0004】
ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性についての安全性の懸念を克服するために、数世代の複製欠損レンチウイルス粒子系が開発されている。原理的には、これは、（１）不要なレンチウイルスビルレンス／付属遺伝子の除去を通して「最小レンチウイルスゲノム」を生成すること；（２）レンチウイルス生成に必須のレンチウイルス遺伝子／配列を分離して適切な構築物／カセットにして、複製能のあるレンチウイルスを生成する可能性を最小限にすることによって達成されている。ごく最近開発された第３世代レンチウイルス（ＬＶ）系は、４つの別々のベクターからなり：２つのパッケージングベクターはｒｅｖおよびｇａｇ－ｐｏｌをコードし、ここで（ｉ）ｒｅｖはウイルスゲノムの核外移行のためのタンパク質発現をコードし、（ｉｉ）ｇａｇおよびｐｏｌは、それぞれ、ウイルスカプシド構造タンパク質、ならびに酵素である逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼをコードし；（ｉｉｉ）エンベロープベクターは、細胞進入を媒介するエンベロープ糖タンパク質の発現の原因であるｅｎｖをコードし；（ｉｖ）移行ベクターは異種の強いプロモーターによって駆動される導入遺伝子をコードする。第３世代四重トランスフェクション生産系は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＤｕｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１９９８）において説明される。さらなる進展は、自己不活性化（ＳＩＮ）構築物の開発であり、ここでは、移行ベクターは、３’ＬＴＲのＵ３領域内の同種のプロモーター／エンハンサー配列が欠失されているＳＩＮレンチウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）配置を含有し、レンチウイルス粒子挿入部位に隣接する遺伝子の不要な活性化の危険性を低減し、かつレンチウイルス粒子動員のリスクを減少する。
【0005】
ＳＩＮレンチウイルス粒子の安全性プロファイルの改善は、分裂細胞および非分裂細胞の両方に安定して形質導入するそれらの能力と組んで、臨床研究における遺伝子療法ベクターとしてのレンチウイルス粒子の使用の急激な成長を促進した。しかしながら、臨床試験は、大量の高タイターの感染性レンチウイルス粒子を必要とし、高効率で費用効果が高くかつ大規模に実現可能な生産方法を要求する。
【0006】
レンチウイルス粒子合成は、２つの主要なカテゴリーである、安定なレンチウイルス粒子生産および一過性のレンチウイルス粒子生産に細分され得る。前者の方法は、機能的なレンチウイルス粒子を生産するために必要なヘルパー機能を有する安定なレンチウイルス粒子生産性細胞株への、単一の導入遺伝子をコードする移行ベクターのトランスフェクションを含む。しかしながら、高タイターのレンチウイルス粒子生産が可能な安定な生産性細胞株を開発することにおける困難は、一過性のレンチウイルス粒子生産が好まれてきたことを意味する。現在の一過性のレンチウイルス粒子生産方法は、レンチウイルスエレメント（ｒｅｖ、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖ）をコードする複数のＤＮＡベクターおよび移行ベクターによる許容性パッケージング細胞株の同時トランスフェクションに基づく。典型的に、ＤＮＡベクターは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態で存在し、好ましいパッケージング細胞は、ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３）またはその派生物（例えばＨＥＫ２９３Ｔ）である。
【0007】
一過性のレンチウイルス粒子生産に必要とされる大量の高品質ＤＮＡの製造は、製造プロセスにおける主要な支障であり、遺伝子療法のためのレンチウイルス粒子の広範な臨床的使用における顕著な障害である。さらに、ｐＤＮＡプラットホームにおけるレンチウイルス粒子の生物生産に関連するいくつかの欠点がある。ＧＭＰ ｐＤＮＡ製造は費用がかかり、複雑であり、ＤＮＡ生成物は、最終的に、哺乳動物細胞におけるウイルス生産に不必要である細菌繁殖エレメントで汚染され得る。さらに、真核細胞発現カセットは、時折、細菌において毒性効果または問題のある効果を生産する遺伝子配列を含有する場合があり、これはそれらの増幅を制限する。例えば、一部の治療関連遺伝子は、配列毒性または複雑性のために細菌において繁殖することが困難である（Ｆｅｌｄｍａｎら（２０１４）Ｔｈｅ Ｎａｖ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｅｎｃｈ ｓｅｒｉｅｓ：ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｘ．、１：６～１１；ＭｃＭａｈｏｎら（２０１５）ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃ Ａｃｃｅｓｓ、２７：３２０～３１）。
【0008】
Ｗ０２０１０／０８６６２６、Ｗ０２０１２／０１７２１０、ＷＯ２０１６／１３２１２９およびＷＯ２０１８／０３３７３０（その全体を参照により本明細書に組み込まれる）において説明される合成インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）増幅は、ＧＭＰ閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを２週間で数グラムスケールまで生産することが可能である。生ずる閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子は最小であり、ユーザーが規定した目的の配列のみを含有し、抗生物質耐性遺伝子または複製起点を伴わない。さらに、レンチウイルス粒子生産のための閉鎖型ＤＮＡベクターを生産するための酵素ＤＮＡ増幅プラットホームの使用は、以前は細菌繁殖系と不適合性であった複雑なＤＮＡ配列のレンチウイルス粒子パッケージングを可能にし得る。それゆえ、それらの好ましい安全性プロファイル、およびラージスケール製造のしやすさにより、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、レンチウイルス粒子生産における使用のための、ｐＤＮＡの有望な代替物である。
【0009】
Ｋａｒｄａら（２０１９）は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、第２世代レンチウイルス粒子プラットホームにおいて、インビトロでｐＤＮＡ由来レンチウイルス粒子に匹敵する導入遺伝子発現を伴ってレンチウイルス粒子を生産するために使用され得ること、およびタイターを適合させたベクターはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で同様の導入遺伝子発現を有することを実証した。しかしながら、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを使用して生産したレンチウイルス粒子の感染タイターは、ｐＤＮＡ由来ＬＶよりも低いことが観察された。第２世代レンチウイルス生産は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔ遺伝子をコードする単一のパッケージングプラスミド、ＶＳＶｇをコードするエンベローププラスミド、ならびに５’野生型ＬＴＲからの導入遺伝子発現がＴａｔ依存性である移行ベクターの使用を含む。この技術を、改変されたＬＴＲが使用され（５’および３’の両方）かつＴａｔに対する依存性が除去されている第３世代レンチウイルス粒子プラットホームへ移行する場合、本出願人らは、感染性収率がさらに減少することを発見した。実際に、感染性粒子の生成のためのトランスフェクトされた細胞において、十分に豊富なトランスフェクトされたＤＮＡ（図１Ｂ）およびウイルスゲノムＲＮＡの両方が存在するように見えたが（図１）、これは、導入遺伝子を有する感染性レンチウイルス粒子の十分な収率をもたらさなかった（図２）。したがって、感染性粒子の収率は、他のＤＮＡベクター形式により達成される収率に匹敵しなかった。これに取り組むために、実験は、最初に、トランスフェクションにおいて使用されるベクターＤＮＡの量を低減するために行われた。これは、全粒子タイターを増加させる効果を有した（図２Ｂ）。次に、研究は、減少されたＤＮＡ入力を使用して構築物比を最適化するために行われた。これらの研究は、全粒子タイターをさらに増加させたが、感染性粒子の収率の減少を救済しなかった（図３）。したがって、理論に束縛されるものではないが、本発明者らにより、効果は閉鎖型直鎖状ＤＮＡそれ自体の性質に関連すると仮定される。したがって、本発明者らは、レンチウイルス粒子生産のために使用され、Ｋａｒｄａら（２０１９）において説明される「標準の」閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターよりもかなり高い感染タイターをもたらし、ｐＤＮＡ由来の感染タイターに匹敵する感染タイターをもたらし得る新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを開発した。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、レンチウイルス粒子の生産における使用に好適である新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。新規ベクターはある配置を有し、この配置は、この配置を欠く閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターと比較して、感染性レンチウイルス粒子のより大きな収率を準備することを可能にする。本発明は、本明細書において説明される構築物を使用して、感染性レンチウイルス粒子を生成する方法にさらに関する。
【0011】
本発明は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ形式の新規レンチウイルス移行ベクターを提供する。そのようなものは、ＲＮＡ分子としてのレンチウイルス粒子内に含むための目的の導入遺伝子を含有する。
【0012】
本発明は：
レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって、以下の５’～３’の順序で、配列：
（ａ）ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列；
（ｂ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
（ｃ）３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列；
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナル配列；および
（ｅ）スペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を提供する。
レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって、以下の５’～３’の順序で、配列：
（ａ）ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列；
（ｂ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
（ｃ）３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列；
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナル配列；および
（ｅ）スペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を提供する。
【0013】
追加の配列、例えば追加のスペーサー配列は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内に含まれ得る。
ベクターにおいて、プロモーターおよび導入遺伝子は、任意の追加の配列と共に、５’および３’ＬＴＲ配列によって効果的に両側から挟まれる。
ベクターにおいて、プロモーターおよび導入遺伝子は、任意の追加の配列と共に、５’および３’ＬＴＲ配列によって効果的に両側から挟まれる。
【0014】
したがって、本発明は：
レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって：
（ａ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；および
（ｂ）プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟むハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）および３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲをコードする配列；および
（ｃ）３’ＳＩＮ ＬＴＲの３’に位置するポリ（Ａ）シグナルをコードする配列；および
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に位置するスペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を提供する。
レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって：
（ａ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；および
（ｂ）プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟むハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）および３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲをコードする配列；および
（ｃ）３’ＳＩＮ ＬＴＲの３’に位置するポリ（Ａ）シグナルをコードする配列；および
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に位置するスペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を提供する。
【0015】
それゆえ、本発明の任意の説明による新規配置は、レンチウイルス粒子への導入遺伝子の包含を改善するための、３’ＳＩＮ ＬＴＲ配列の３’に存在する、レンチウイルス移行ベクター内の配列を含む。
【0016】
さらに、本発明の任意の説明による閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。
【0017】
任意の態様における本明細書において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内に含まれるＬＴＲ配列は、両方とも野生型ＬＴＲ配列から改変される。５’ＬＴＲはハイブリッド配列であり、前記５’ＬＴＲは、場合によりＵ３領域のすべてまたは部分を異種のプロモーターにより置換することによって改変される。また、３’ＬＴＲは、生産されるＬＶＰが自己不活性化性（ＳＩＮ）であるように改変される。これは通常、３’ＬＴＲのＵ３領域のすべてまたは部分の欠失を含む。ＬＴＲのそのような改変は、（１）ウイルスゲノムの転写のためのウイルス遺伝子ｔａｔについての要求を除去し、これによって、生産中の組換え事象を通した複製能力を有するレトロウイルス（ＲＣＲ）の出現の可能性を低減すること、および（２）ＬＴＲエンハンサー活性を通した挿入性突然変異誘発のリスクを除去することによって、ＬＶＰの安全性を改善するために行われる。ＬＴＲ配列の改変は、第２世代（野生型ＬＴＲ）と第３世代（改変ＬＴＲ）レンチウイルス移行ベクターとの間の相違を表す。
【0018】
さらに、本明細書中の任意の態様において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列（またはポリＡシグナル配列）は、強いポリ（Ａ）シグナルについての配列であり得る。強いポリ（Ａ）シグナルは、効率的な転写の停止を提供するシグナルである。当業者は、適切なポリ（Ａ）シグナル、例えばサルウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリ（Ａ）配列、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）（ｂＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビン（ｒｂＧｌｏｂ）またはそれらとの少なくとも９０％の相同性を有する配列を認識する。
【0019】
さらに、本明細書における任意の態様において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列（またはポリＡシグナル配列）は、追加のヘルパー配列を含んでもよく、場合により、前記ヘルパー配列は、１つまたは複数の上流配列エレメント（ＵＳＥ）である。ＵＳＥは、ポリ（Ａ）シグナルの効率を向上させるように作用し得る。
【0020】
さらに、本明細書中の任意の態様において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内の３’ＳＩＮ ＬＴＲをコードする配列（または３’ＳＩＮ ＬＴＲ配列）は、野生型ＬＴＲと比較して欠失を含有する。場合により、前記欠失は、全体としてまたは部分として、３’ＬＴＲのＵ３領域内に存在する。場合により、３’ＳＩＮ ＬＴＲは、野生型３’ＬＴＲと比較して、転写開始部位についての－１４９～－９のヌクレオチド位置において１３３ヌクレオチドＵ３欠失を含有する。３’ＬＴＲ配列は、必要とされる欠失または挿入によってさらに改変され得る。好ましい実施形態において、改変された５’および３’ＬＴＲは、ＨＩＶ－１に由来する。代替のＬＴＲが用いられる場合、同じ効果に達するために、同様の欠失および挿入が当業者によって行われ得る。
【0021】
さらに、本明細書中の任意の態様において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、感染性レンチウイルス粒子の生産において有益であり得る他のエレメントについての他の配列を含み得る。これらの他のエレメントは本明細書において説明され：ＷＰＲＥ、Ｐｓｉ、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＥＮＶ、ＲＥＶまたは他の任意のパッケージングエレメントのうちの任意の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
【0022】
さらに、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、１つまたは複数のさらなるスペーサー配列をさらに含み得る。追加のスペーサー配列は好ましくは５’スペーサー配列であり、例えば、それは５’ＬＴＲについての配列の５’に位置付けられる。さらなるスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターが２つ以上のスペーサー配列を含む場合、スペーサー配列は、同じまたは異なるヌクレオチド配列であってもよく、同じまたは異なる長さであってもよい。
【0023】
本明細書中の任意の態様において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターは、生産中に粒子へ挿入されるＲＮＡレンチウイルス「ゲノム」についての鋳型を提供する。したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内の配列（例えば導入遺伝子）の一部は、粒子へパッケージングされる関連ＲＮＡ配列についての鋳型である。したがって、ＤＮＡベクターは、ＲＮＡ配列についての関連コードを提供する。この点における「をコードする」という言及は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの配列が一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）をコードすることを意味すると理解される。したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、レンチウイルス粒子への包含のための正しい一本鎖ＲＮＡを生産するためのすべての教示を含む。したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、導入遺伝子についての配列、ならびに作動可能に連結されたプロモーター、ＲＮＡ内の５’ＬＴＲおよび３’ＳＩＮ ＬＴＲを含む。
【0024】
有効に、５’ＬＴＲおよび３’ＳＩＮ ＬＴＲは、レンチウイルスＲＮＡの「フランキング末端」を形成し、したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内のこれらの２つのエレメント間の配列は、パッケージングのためのレンチウイルスｓｓＲＮＡを形成する。従来型ＬＶベクターにおいて、ｓｓＲＮＡは、その後逆転写されて、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）生成物を与え、これはその後、トランスフェクトされた細胞の核へ入る。したがって、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、この場合、逆転写されたＤＮＡ内にプロモーターおよび導入遺伝子についての同じ配列を含む。しかしながら、より新しいバリアントは、ＬＶ粒子のｓｓＲＮＡがトランスフェクトされた細胞においてｍＲＮＡとして使用されることを可能にする。
【0025】
５’ＬＴＲと３’ＳＩＮ ＬＴＲとの間に位置しない（またはこれらによって両側から挟まれていない）閉鎖型直鎖状移行ベクター内に含まれる他の配列は、ＬＶ粒子へ挿入されるｓｓＲＮＡに含まれないことが当業者により理解される。したがって、閉鎖型直鎖状移行ベクターからのポリＡシグナル配列およびスペーサー配列は生産性細胞において転写されるが、ＲＮＡはその後、効率的にプロセスされて、ＬＴＲによって両側から挟まれた、パッケージングのための最終ＲＮＡ分子を形成する。
【0026】
したがって、閉鎖型直鎖状移行ベクターに関して、これは：５’ＬＴＲ、３’ＳＩＮ ＬＴＲ、導入遺伝子（ペイロードとも呼ばれる）、プロモーター、ポリＡシグナル配列；スペーサー配列および任意の追加の配列のうちの１つまたは複数などの配列を含有すると説明され得るか、または、製造が閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの配列の、ＲＮＡ分子への転写を含むので、それはあるいは、そのような配列をコードすると説明され得る。
【0027】
本明細書において説明される閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、ペイロード配列または導入遺伝子を含むレンチウイルス移行ベクターである。しかしながら、本発明者らは、これらの改変は生産ベクターにも適用してもよく、これらのベクターはレンチウイルス粒子の生産に必要とされることを決定した。
【0028】
したがって、１つまたは複数の生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターとしてフォーマットされるならば、上記に説明される改変は、１つまたは複数の生産ベクターにも適用してもよい。それゆえ、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ生産ベクターは、１つまたは複数のスペーサー配列を含み得る。前記スペーサー配列は、遺伝子／停止配列／発現カセットの３’および／または前記配列の５’に存在してもよい。
【0029】
したがって、本発明は：
レンチウイルス生産ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって：
（ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセットと、
（ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列と
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を含む。
レンチウイルス生産ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって：
（ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセットと、
（ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列と
を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
を含む。
【0030】
好ましくは、エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である。
本明細書において使用される場合、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターと同じくらい最小限であってもよく、またはそれは、停止配列などの追加の配列を含んでもよい。本明細書において使用される場合、停止配列は、ポリＡシグナル配列を含むか、または３’ＳＩＮ ＬＴＲを使用してもよい。
本明細書において使用される場合、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターと同じくらい最小限であってもよく、またはそれは、停止配列などの追加の配列を含んでもよい。本明細書において使用される場合、停止配列は、ポリＡシグナル配列を含むか、または３’ＳＩＮ ＬＴＲを使用してもよい。
【0031】
スペーサー配列は、したがって、発現カセットの３’および／または５’に存在してもよい。
さらに、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターが２つ以上のスペーサー配列を含む場合、スペーサー配列は、同じまたは異なるヌクレオチド配列であってもよく、同じまたは異なる長さであってもよい。
さらに、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターが２つ以上のスペーサー配列を含む場合、スペーサー配列は、同じまたは異なるヌクレオチド配列であってもよく、同じまたは異なる長さであってもよい。
【0032】
ＧＡＧ／ＰＯＬまたはＲＥＶをコードする発現カセットを含むレンチウイルス生産ベクターは、発現カセットの３’にスペーサー配列を含むことが好ましい場合がある。ＧＡＧ／ＰＯＬまたはＲＥＶをコードする発現カセットを含むレンチウイルス生産ベクターとしての使用のための閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、発現カセットの３’にスペーサー配列を含むことが好ましい場合がある。
【0033】
場合により、本発明は、本明細書において説明される少なくとも１つのレンチウイルス移行ベクターおよび本明細書において説明される少なくとも１つのレンチウイルス生産ベクターを含むレンチウイルス粒子の生産における使用に好適な１組の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。場合により、このセットの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、本明細書において説明される少なくとも３つのレンチウイルス生産ベクターと共に、本明細書において説明されるレンチウイルス移行ベクターを含む。３つのレンチウイルス生産ベクターは、別々にＧＡＧ／ＰＯＬ、ＥＮＶおよびＲＥＶをコードし得る。ベクターのいずれかまたはすべては、本明細書において定義される３’スペーサー配列を含み得る。
【0034】
本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのうちの１つまたは複数は、レンチウイルス粒子の生産を改善するために使用され得る。少なくとも閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターは、感染タイターを改善するために使用され得る。
【0035】
したがって、移行（ペイロード）ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターである場合にレンチウイルス粒子の感染タイターを改善する方法であって、パッケージング細胞または生産性細胞へ、本明細書中の任意の態様において説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター（「閉鎖型直鎖状移行ベクター」とも称される）を導入するステップを含む方法が提供される。
【0036】
本明細書において説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターに加えて、レンチウイルス粒子を生産する方法は、１つまたは複数の生産ベクターをパッケージング細胞へ導入するステップをさらに含み得る。１つまたは複数の生産ベクターは、レンチウイルス粒子の製造に必要とされるウイルスエレメントをコードする。１つまたは複数の生産ベクターは、以下のもの：
（ａ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；および／または
（ｂ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；および／または
（ｃ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｄ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数をコードする。
（ａ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；および／または
（ｂ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；および／または
（ｃ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｄ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数をコードする。
【0037】
好ましくは、エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である。ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質は、ある範囲の種および細胞タイプにわたる広い指向性を可能にする。
【0038】
ＧＡＧ遺伝子およびＰＯＬ遺伝子は、単一の生産ベクターにコードされるかまたは含まれ得る。
さらに、上記の（ａ）～（ｄ）として列挙される遺伝子のうちのいずれか１つまたは複数は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター上で代わりに供給され得るので、その遺伝子は、別々の生産ベクター上において必要とされないか、または生産性細胞において既に存在していてもよい。
さらに、上記の（ａ）～（ｄ）として列挙される遺伝子のうちのいずれか１つまたは複数は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター上で代わりに供給され得るので、その遺伝子は、別々の生産ベクター上において必要とされないか、または生産性細胞において既に存在していてもよい。
【0039】
さらに、生産ベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターもしくは環状ＤＮＡベクターまたはそれらの混合物などの任意の好適な形式であってもよい。
生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡである場合、それらは少なくとも１つのスペーサー配列を含むことが好ましい。スペーサー配列は、好ましくは、ベクター内の遺伝子または発現カセットの３’に含まれ得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。あるいはまたは加えて、スペーサー配列は、遺伝子または発現カセットの５’に存在し得る。
生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡである場合、それらは少なくとも１つのスペーサー配列を含むことが好ましい。スペーサー配列は、好ましくは、ベクター内の遺伝子または発現カセットの３’に含まれ得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのスペーサー配列は、任意の適切な長さのヌクレオチド配列であってもよい。スペーサー配列とは、一般的に、特定の配列を有しても、有さなくてもよい非コードＤＮＡの配列であると理解される。スペーサー配列は、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。場合により、スペーサー配列は、本明細書において開示される長さの、任意の範囲のヌクレオチドであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。あるいはまたは加えて、スペーサー配列は、遺伝子または発現カセットの５’に存在し得る。
【0040】
さらに、パッケージング細胞は、許容細胞である。場合により、パッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはそのバリアントもしくは派生物である。
さらに、生産性細胞が使用される場合、生産性細胞は、レンチウイルス粒子生産に必要とされる付属のパッケージング機能を発現する安定な細胞株である。
さらに、生産性細胞が使用される場合、生産性細胞は、レンチウイルス粒子生産に必要とされる付属のパッケージング機能を発現する安定な細胞株である。
【0041】
さらに、閉鎖型直鎖状移行ベクターおよび／または生産ベクターは、任意の好適な手段、例えばトランスフェクション、場合により化学トランスフェクションによりパッケージング細胞または生産性細胞へ導入され得る。閉鎖型直鎖状移行ベクターおよび／または生産ベクターが、化学トランスフェクションによりパッケージング細胞または生産性細胞へ導入される場合、トランスフェクション剤は、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはリポフェクタミンのうちのいずれか１つから選択され得る。
【0042】
さらに、本発明の方法により調製されたパッケージング細胞または生産性細胞からレンチウイルス粒子を生産および回収するための方法が提供される。この方法は：
（ａ）レンチウイルス粒子の生産に適合された少なくとも１つの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターをトランスフェクトされたパッケージング細胞においてレンチウイルス粒子の生産を誘導するステップ；および／または
（ｂ）トランスフェクトされたパッケージング細胞または生産性細胞を培養するステップ；ならびに
（ｃ）培養培地から、生産された組換えレンチウイルス粒子を回収／単離するステップ
を含む。
（ａ）レンチウイルス粒子の生産に適合された少なくとも１つの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターをトランスフェクトされたパッケージング細胞においてレンチウイルス粒子の生産を誘導するステップ；および／または
（ｂ）トランスフェクトされたパッケージング細胞または生産性細胞を培養するステップ；ならびに
（ｃ）培養培地から、生産された組換えレンチウイルス粒子を回収／単離するステップ
を含む。
【0043】
また、前記方法は、本明細書中のいずれかの箇所で説明される１つまたは複数の閉鎖型直鎖状生産ベクターの使用を含み得る。したがって、前記方法は、１つまたは複数の閉鎖型直鎖状ＤＮＡ生産ベクターであって：
（ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセットと、
（ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列と
を含む前記ベクターの使用をさらに含み得る。
（ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／または
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセットと、
（ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列と
を含む前記ベクターの使用をさらに含み得る。
【0044】
好ましくは、エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）遺伝子である。
前記発現カセットは、以前に説明される通りである。
前記発現カセットは、以前に説明される通りである。
【0045】
さらに、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターを使用して、レンチウイルス粒子を生産する方法または感染性レンチウイルスタイターを改善する方法は、細胞のトランスフェクションに使用されるＤＮＡの全量を変更することによって、注目すべきことに細胞のトランスフェクションに使用されるＤＮＡの全量を低減することによって最適化され得る。この低減は、他のＤＮＡベクタータイプ、例えばプラスミドと比較した場合達成される。好ましくは、トランスフェクトされる全ＤＮＡは、１μｇ／ｍｌ未満、０．９μｇ／ｍｌ未満、０．８μｇ／ｍｌ未満または０．７５μｇ／ｍｌ未満である。最適には、トランスフェクトされるＤＮＡの全量は、０．７μｇ／ｍｌまたはそれ未満、例えば０６．μｇ／ｍｌまたは０．５μｇ／ｍｌである。
【0046】
加えてまたはあるいは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターを使用して、レンチウイルス粒子を生産する方法または感染性レンチウイルスタイターを改善する方法は、様々なＤＮＡ構築物間の比を変更することによって最適化され得る。したがって、構築物比は、感染性レンチウイルス粒子の生産の向上が達成されるように変更され得る。
【0047】
パッケージング細胞が４つのＤＮＡ構築物（閉鎖型直鎖状移行ベクター、ＧＡＧ／ＰＯＬベクター、ＲＥＶベクターおよびＥＮＶ（またはＶＳＶｇ）ベクター）をトランスフェクトされる場合、任意の適切な構築物モル比が使用され得る。しかしながら、最適化された感染タイターを得るために、構築物モル比は好ましくは、（移行：ＧＡＧ／ＰＯＬ：ＲＥＶ：ＥＮＶ ＤＮＡ構築物として記載される）４：１：２：１、３：１：３：２、３：１：３：１．５または３：１：２：１である。構築物比は、これらの比の間に入る任意の好適な比、例えば３：１：２．５：１などであってもよい。好ましくは、構築物比は、４：１：２：１である。
【0048】
また、本発明の第１の態様による閉鎖型直鎖状移行ベクターをトランスフェクトされた細胞が提供される。前記細胞は、本明細書においてさらに定義されるパッケージング細胞または生産性細胞であってもよい。さらに、また、細胞は、本明細書において説明される１つまたは複数の生産ベクターをトランスフェクトされ得る。
【0049】
さらなる実施形態は、以下および特許請求の範囲において説明される。さらなる利点は、以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1A】図１Ａは、標準のＥＦ１α－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ移行ベクターおよびレンチウイルス生産ベクターによるトランスフェクションの７２時間後のパッケージング細胞における遺伝子発現を示す。細胞から抽出されたＲＮＡを、プローブＬＴＲ－ＰおよびｅＧＦＰを使用するＲＴ－ｑＰＣＲにかけ、それぞれ、全長ゲノムＲＮＡ転写物および移行ベクターに由来する全ＲＮＡ転写物を定量した。ポリ（Ａ）シグナル配列およびスペーサーを伴わない、標準の閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））ベクターからの移行ベクター遺伝子発現は、対応するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と同様であり、低い感染タイターは、不十分な移行ベクターＲＮＡの結果ではないことを実証した。
【図1B】図１Ｂは、ｑＰＣＲによって測定された細胞当たりのＤＮＡベクターコピーを示し、ｐＤＮＡと比較したｄｂＤＮＡベクターコピーの過剰を実証する。細胞に、１μｇ／ｍｌの全ＤＮＡをトランスフェクトした。２：１：１：１の構築物質量比をｐＤＮＡに使用し、モル当量をｄｂＤＮＡに使用した。測定は、トランスフェクションの７２時間後に行った。ベクターの各々についてのデータを示し、プラスミド対閉鎖型直鎖状ＤＮＡのレベルの比較を示す。
【図2A】図２Ａは、ポリ（Ａ）配列およびスペーサーを伴わない、標準のＥＦ１α－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ移行ベクターを使用する生産からのタイターを示す。これは構築物対タイターのプロットである。全ウイルス粒子タイター（ｐ２４）は、対応するｐＤＮＡトランスフェクションと比較して、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））トランスフェクションについて５分の１であった。しかしながら、ｄｂＤＮＡ（商標）トランスフェクションについての感染性ウイルスタイターは、検出限界（ＬＯＤ）未満であり、この場合、感染性ウイルス粒子はほとんど生産されないことを実証した。記号解説：ＶＰ／ｍＬは、１ミリリットル当たりのウイルス粒子であり、ＴＵ／ｍＬは１ミリリットル当たりの形質導入ユニットである（感染タイター）。
【図3】感染タイターを改善するために条件を最適化することを試みる一方で、標準のＥＦ１α－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ移行ベクターを使用する生産からのタイターを示す（タイター対構築物のプロット）。１μｇ／ｍｌのプラスミド構築物を、２：１：１：１（ｅＧＦＰ：Ｇａｇｐｏｌ：Ｒｅｖ：ＶＳＶｇ）の質量比においてトランスフェクトし、０．５μｇ／ｍＬの閉鎖型直鎖状ｄｂＤＮＡ（商標）を、モル当量（Ｍｏｌ）または示される比を使用してトランスフェクトした。ｄｂＤＮＡ（商標）トランスフェクションについての条件を最適化することは、全粒子タイター（ｐ２４）の完全な救済をもたらしたが、感染タイターは、プラスミドと比較して標準の閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクターについて１００分の１のままであった。
【図4A】図４Ａと図４Ｂ（タイター 対 構築物のプロット）に示された結果は、移行ベクターの比を増加することが感染タイターを救済しないことを示す（感染タイター図４Ａ）。ゲノムタイターアッセイの結果（図４Ｂ）は、粒子へのウイルスゲノムのパッケージングはｐＤＮＡと比較して閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターについて非効率的であること、および移行ベクターの量を増加することはこの状況を改善しないことを示唆する。
【図4B】同上。
【図5】図５は、実施例において使用される様々な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターアーキテクチャを示す。ＬＶ－ｅＧＦＰは、３’ＳＩＮ ＬＴＲの３’に酵素ＡｖｒＩＩについての制限酵素認識配列を含む。ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡは、３’ＳＩＮ ＬＴＲについての配列の３’にＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル配列を含む。ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＦＴＳは、３’ＳＩＮ ＬＴＲについての配列の３’にＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル配列およびＦ領域停止配列を含む。ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１は、３’ＳＩＮ ＬＴＲについての配列の３’にＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル配列および１ｋｂランダムスペーサー（ＲＳ）を含む。また、ＲＳＶ１－ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１は、１ｋｂ ５’ランダムスペーサー（ＲＳ）スペーサーを含む。他のエレメントは、５’ＬＴＲ、ＥＦ１αプロモーター、ｅＧＦＰ導入遺伝子、ランダムスペーサー（ＲＳ）およびＷＰＲＥエレメントについての配列である。
【図6A】図６（Ａ～Ｃ）は、図５において示される様々な移行ベクターの全タイター（６Ａ）、感染タイター（６Ｂ）およびゲノムタイター（６Ｃ）に対する効果を示す。プロットは、構築物対タイターである。この場合、ＬＶ－ｅＧＦＰを、ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡと比較した。加えて、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターのみに関して、ＬＶ－ｅＧＦＰを、ＡｖｒＩＩ制限酵素を使用して最初に消化して、３’ＳＩＮ ＬＴＲの下流の配列を切断し、推定のリードスルー（ｒｅａｄ－ｔｈｏｕｇｈ）干渉を軽減した。ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列の付加は、プラスミドおよび閉鎖型直鎖状ＤＮＡ生産の両方について、感染タイターおよびゲノムタイターを改善した。
【図6B】同上。
【図6C】同上。
【図7A】図７（Ａ～Ｃ）は、図５において示される様々な構築物の全タイター（７Ａ）、感染タイター（７Ｂ）およびゲノムタイター（７Ｃ）に対する効果を示す。プロットは、構築物対タイターである。ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列の下流のＦ領域停止配列または１ｋｂランダムスペーサー配列の付加は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡに関して感染タイターおよびゲノムタイターをさらに増大させる。
【図7B】同上。
【図7C】同上。
【図8A】図８（Ａ～Ｂ）は、ｐＤＮＡと比較した場合の感染タイターに関する閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターについてのトランスフェクション条件のさらなる最適化を実証し、これは、プラスミドよりも２分の１低いだけの感染タイターをもたらした。図８Ａは、プラスミド対照と比較した、感染タイターに対する、減少する全入力閉鎖型直鎖状ＤＮＡの効果を示し、０．７μｇ／ｍＬにおけるピークタイターを実証する。図８Ｂは、ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１ｋｂおよび最適化条件を使用する生産についての粒子タイターおよび感染タイターを示す。
【図8B】同上。
【図9A】図９（Ａ～Ｄ）は、実施例において使用される（Ａ）ｐｒｏＴＬｘ移行ベクター、（Ｂ）ｐｒｏＴＬｘ Ｇａｇ－Ｐｏｌ生産ベクター、（Ｃ）ｐｒｏＴＬｘ Ｒｅｖ生産ベクターおよび（Ｄ）ｐｒｏＴＬｘ ＶＳＶｇ生産ベクターについてのプラスミドマップを示す。（Ａ）ｐｒｏＴＬｘ－Ｋ ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１は、３’ＳＩＮ ＬＴＲについての配列の３’にＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル配列、およびＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル配列についての配列の３’に１ｋｂランダムスペーサー（ＲＳ）を含む。他のエレメントは、５’改変ＬＴＲ、ランダムスペーサー（ＲＳ）、ＨＩＶ－１ Ｐｓｉ、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ｃＰＰＴ、ＥＦ１αプロモーター、ｅＧＦＰ導入遺伝子、ＷＰＲＥ、５’ＴｅｌＲＬ（プロテロメラーゼ認識部位）、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）プロモーター、ＫａｎＲ遺伝子、およびｐＵＣ ｏｒｉについての配列を含む。（Ｂ）ｐｒｏＴＬｘ Ｇａｇ－Ｐｏｌ生産ベクターは、ＧａｇおよびＰｏｌ遺伝子を含む。他のエレメントは、ランダムスペーサー（ＲＳ）、ｃＰＰＴ、ＲＲＥ、ベータ－グロビンポリ（Ａ）シグナル配列、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）プロモーター、ＫａｎＲ遺伝子、ならびにｐＵＣ ｏｒｉおよび５’ＴｅｌＲＬ（プロテロメラーゼ認識部位）についての配列を含む。（Ｃ）ｐｒｏＴＬｘ Ｒｅｖ生産ベクターは、Ｒｅｖ遺伝子を含む。他のエレメントは、３’ＴｅｌＲＬ（プロテロメラーゼ認識部位）、ランダムスペーサー（ＲＳ）、ＲＳＶプロモーター、ＨＩＶ ＬＴＲポリ（Ａ）シグナル配列、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）プロモーター、ＫａｎＲ遺伝子、およびｐＵＣ ｏｒｉについての配列を含む。（Ｄ）ｐｒｏＴＬｘ ＶＳＶｇ生産ベクターは、ＶＳＶｇエンベロープタンパク質遺伝子を含む。他のエレメントは、３’ＴｅｌＲＬ（プロテロメラーゼ認識部位）、ランダムスペーサー（ＲＳ）、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター、ベータ－グロビンイントロン、ベータ－グロビンポリ（Ａ）シグナル配列、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）プロモーター、ＫａｎＲ遺伝子、ならびにｐＵＣ ｏｒｉについての配列を含む。
【図9B】同上。
【図9C】同上。
【図9D】同上。
【図10A】図１０（Ａ～Ｃ）は、ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１移行ベクターを使用した感染タイターに関してトランスフェクション条件のさらなる最適化を実証する。図１０Ａは、直鎖状閉鎖末端ＤＮＡ ＬＶ－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１およびＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１を比較する感染タイターを示し、３’ＲＳ１による１．８倍の改善を実証する。図１０Ｂは、０．７μｇ／ｍｌのＤＮＡおよび示されるモル構築物比を使用して生産されたＬＶの感染タイターを示す。１μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを２：１：１：１（ｅＧＦＰ：ＧａｇＰｏｌ：Ｒｅｖ：ＶＳＶｇ）の質量比において使用して生産されたＬＶを、対照として使用した。図１０Ｃは、プラスミドと比較して、低いＤＮＡ入力におけるＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１を使用した感染タイターを示す。閉鎖型直鎖状ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを、それぞれ、４：１：２：１のモル比および２：１：１：１の質量比においてトランスフェクトした。
【図10B】同上。
【図10C】同上。
【図11A】図１１（Ａ～Ｂ）は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ由来ＬＶの救済をもたらす、生産構築物における３’ＲＳ１ｋｂの評価を示す。図１１Ａは、０．７μｇ／ｍＬのｄｂＤＮＡを４：１：２：１のモル構築物比において使用して生産したＬＶの感染タイターを示す。ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１移行ベクターを、私たちの標準の付属構築物（Ｓｔｄ）と組み合わせて使用し、各生産構築物が、独立してかつすべての他の構築物と組み合わせて試験されるように、各構築物を、３’ＲＳ１エレメントを含有する当量の構築物について反復的に交換した。図１１Ｂは、ＣＡＲ１９ｈ２８ｚ移行ベクター、ＧａｇＰｏｌ－ＲＳ１、Ｒｅｖ－ＲＳ１およびＶＳＶｇ（０．７μｇ／ｍＬのｄｂＤＮＡを４：１：２：１のモル比において）を使用して生産されたＬＶの感染タイターを示す。誤差バーは、反復間の標準偏差を表す。
【図11B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0051】
本発明は、レンチウイルス粒子の生産における使用に好適である新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。最も注目すべきことに、これは、そのような構築物を欠く閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターよりも高いレンチウイルス感染性粒子タイターを生産するために好適である。
【0052】
レンチウイルス粒子およびそれらの生産
レンチウイルス粒子（ＬＶＰ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に基づく十分に研究されたベクター系である。ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＭ）、ならびに非霊長類レンチウイルス、例えばネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む他のレンチウイルス系もまた、遺伝子移行系として開発されている。レンチウイルス粒子の生産に有用なレンチウイルス成分は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：８７１～８７５およびＤｕｌｌら（１９９８）Ａ ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１１）：８４６３～８４７１、ならびに表１を参照されたい。
レンチウイルス粒子（ＬＶＰ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）に基づく十分に研究されたベクター系である。ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＭ）、ならびに非霊長類レンチウイルス、例えばネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む他のレンチウイルス系もまた、遺伝子移行系として開発されている。レンチウイルス粒子の生産に有用なレンチウイルス成分は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）Ｍｕｌｔｉｐｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｃｈｉｅｖｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：８７１～８７５およびＤｕｌｌら（１９９８）Ａ ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２（１１）：８４６３～８４７１、ならびに表１を参照されたい。
【0053】
【表1】
【0054】
ヒトにおけるＨＩＶ－１の病原性の性質のための安全性の懸念によってガイドされ、様々な世代のレンチウイルス系がレンチウイルス粒子の生産のために開発されている。レンチウイルス粒子生産に使用され得るレンチウイルス系の要約については、Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ａｎｄ Ｍｅｒｔｅｎ、２０１０、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）、４７４～４８６；およびＭｅｒｔｅｎ、ＨｅｂｂｅｎおよびＢｏｖｏｌｅｎｔａ、２０１６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３、１６０１７；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．１７を参照されたい。臨床および研究開発目的における使用のための最も広く使用されているレンチウイルス系は：
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質
２）エンベロープタンパク質（通常、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））
３）ビリオンタンパク質（Ｒｅｖ）タンパク質の発現のＨＩＶレギュレーター；ならびに
４）導入遺伝子または他のコード配列を含有する移行ベクター
を発現する第３世代の４ベクター系である。
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質
２）エンベロープタンパク質（通常、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））
３）ビリオンタンパク質（Ｒｅｖ）タンパク質の発現のＨＩＶレギュレーター；ならびに
４）導入遺伝子または他のコード配列を含有する移行ベクター
を発現する第３世代の４ベクター系である。
【0055】
典型的に、上記に説明される４つのＤＮＡベクターは、プラスミドの形態で存在する。伝統的に、接着性細胞培養物として、パッケージング細胞、例えば、ヒト胚性腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３）に、４つのプラスミドの各々をトランスフェクトする。一過的にトランスフェクトされた細胞は、目的の遺伝子を有するレンチウイルス粒子を生産することができる。
【0056】
しかしながら、懸濁培養は商業的なスケールアップがより容易であるので、懸濁培養についての関心が増加するにつれ、ＨＥＫ２９３Ｆがより広く使用されるようになっている。
【0057】
本発明は、任意の適切な方法によるレンチウイルス粒子の生産における使用に好適である新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。
閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
本発明者らは、「閉鎖型直鎖状移行ベクター」とも称される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを開発し、これは、それがレンチウイルス粒子の感染タイターの生産において現存の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターよりも優れた性能を有することを可能にするある特定の特性を有する。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、任意のタイプの「閉鎖型」末端を有する任意の適切な形態をとってもよい。また、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子と称され得る。
閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター
本発明者らは、「閉鎖型直鎖状移行ベクター」とも称される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを開発し、これは、それがレンチウイルス粒子の感染タイターの生産において現存の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターよりも優れた性能を有することを可能にするある特定の特性を有する。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、任意のタイプの「閉鎖型」末端を有する任意の適切な形態をとってもよい。また、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子と称され得る。
【0058】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡとは、一般的に、共有結合閉鎖しているかまたは各末端においてキャップを付けられた二本鎖ＤＮＡであると理解される。ＤＮＡの二本鎖セクションまたは二重鎖部分は、それゆえ相補的である。変性された場合、閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、一本鎖環を形成し得る。ＤＮＡは、志向によって、十字型、ヘアピンまたはヘアピンループを含む任意の好適な構造によって各末端において閉鎖されていてもよい。閉鎖型直鎖状ＤＮＡの末端は、非相補的配列からなり、したがって、そのＤＮＡを十字型、ヘアピンまたはヘアピンループの一本鎖配置になるように強要し得る。あるいは、この配列は、末端がヘアピンを形成するように、相補的であってもよい。
【0059】
末端がプロテロメラーゼ酵素の標的配列の一部によって形成されることが好ましい場合がある。プロテロメラーゼ標的配列は、ＤＮＡ鋳型におけるその存在がプロテロメラーゼの酵素活性を可能にする任意のＤＮＡ配列であり、プロテロメラーゼはＤＮＡの二本鎖セクションを切断し、それらを再ライゲートし、共有結合閉鎖末端を残す。一般的に、プロテロメラーゼ標的配列は、任意の完全なパリンドローム配列、すなわち、２倍の回転性対称または完全な逆反復を有する任意の二本鎖ＤＮＡ配列を含む。閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、１つまたは両方の末端においてプロテロメラーゼ標的配列の一部を有し得る。プロテロメラーゼ標的配列は、各末端において同じ同族プロテロメラーゼについての配列であってもよく、または各末端について異なるプロテロメラーゼについての同族配列であってもよい。様々なプロテロメラーゼ酵素の作用を介して構築された閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、Ｗ０２０１０／０８６６２６、Ｗ０２０１２／０１７２１０、ＷＯ２０１６／１３２１２９およびＷＯ２０１８／０３３７３０において本出願人らによって以前に開示されており、当該出願のすべては、参照により組み込まれる。インビトロＤＮＡ増幅および後続のプロテロメラーゼ酵素による切断を使用して構築された閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡがインビトロの、細胞を含有しない環境において生産され、商業的生産のためにスケールアップされ得る利点を有する。これらの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、Ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡまたはｄｂＤＮＡ（商標）として公知である。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、本出願人らの以前の方法を使用して、少なくとも１つのプロテロメラーゼ標的配列を有するＤＮＡ鋳型のポリメラーゼベースの増幅に基づく、インビトロの、細胞を含有しない様式、および閉鎖型直鎖状ＤＮＡを生産するためのプロテロメラーゼによる増幅されたＤＮＡのプロセッシングにおいて製造される。
【0060】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、必須のプロテロメラーゼ標的配列を有するプラスミドの、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターへの変換によって構築され得るが、これは効率的な生産方法ではない。
【0061】
他の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、ＰＣＲ産物のキャッピング、および「ＭＩＤＧＥ（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」ベクターを含む様々なインビトロ策によって構築されてきた。ＭＩＤＧＥは、細菌細胞からのプラスミドの単離後の原核生物性および真核生物性骨格両方の消化、および続いて、末端補充のための、必要とされるＤＮＡ配列のヘアピン配列へのライゲーションによって生成される。そのような方法によって製造される構造は、本発明のＤＮＡベクターにも好適であり得る。
【0062】
プロテロメラーゼの作用に基づいて、細胞培養物においてインビボ様式で生産されるＤＮＡ「ミニストリング（ｍｉｎｉｓｔｒｉｎｇ）」もまた、本発明における使用に好適であり得る閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターである。
【0063】
好適であり得る他の型の閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、十字型構造により末端において閉鎖されたＤＮＡを含み、これもまた、細胞培養物においてまたはインビトロで酵素的に製造され得る。
【0064】
細胞を含まない系は生成物の純度を確実にするので、閉鎖型直鎖状ＤＮＡは、細胞を含まない系において製造されることが好ましい場合がある；代替として、細胞による方法によって製造された閉鎖型直鎖状ＤＮＡの厳格な精製は、監督当局によって必要とされる。
【0065】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、それらの所望の機能および構造に必要な配列（すなわち、それらが送達する配列、および二本鎖直鎖状セクションの末端における閉鎖された末端、例えば、十字型、ヘアピンまたはヘアピンループをコードする配列）のみを含む最小ベクターであるように設計され得る。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターから除外され得る不必要なまたは外来性の配列（例えば、細菌配列）は、細菌の複製起源、細菌選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み得る。そのような配列を含まないことは、外来性遺伝子材料を含有しない「最小」ベクターの創出を可能にする。ベクターの性能に影響を及ぼすか、または不必要な副作用を引き起こし得る遺伝子材料（すなわち、抗生物質耐性遺伝子）が導入されないので、これは、細胞が治療目的のために使用される予定である場合好ましい場合がある。
【0066】
本出願人らは、「第２世代」レンチウイルスベクターの製造において閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを以前に使用した。そのような閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、一般に使用されるｐＤＮＡベクターと比較した場合、任意のさらなる改変を含まなかった。上記に説明されるそのような非改変閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターは、レンチウイルスベクターの生産に、特に実施例１において実証される通り第３世代レンチウイルス法には非効率的な移行ベクターである。したがって、本発明者らは、本明細書において「閉鎖型直鎖状移行ベクター」と称される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを開発し、これは、それがレンチウイルス粒子の感染タイターの生産において現存の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターよりも優れた性能を有することを可能にする設計された特性を有する。
【0067】
一態様において、本発明は、レンチウイルス移行ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターであって、以下の５’～３’の順序：
（ａ）ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列；
（ｂ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
（ｃ）３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列；
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナル配列；および
（ｅ）スペーサー配列
において配列を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。
（ａ）ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列；
（ｂ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
（ｃ）３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲ配列；
（ｄ）ポリ（Ａ）シグナル配列；および
（ｅ）スペーサー配列
において配列を含む閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。
【0068】
追加の配列、例えば追加のスペーサー配列は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター内に含まれ得る。
ベクターにおいて、プロモーターおよび導入遺伝子は、粒子への包含のための任意の追加の配列と共に、５’および３’ＬＴＲ配列によって有効に両側から挟まれる。本明細書において使用される場合、「ｆｌａｎｋｅｄ（両側から挟まれた、両側に位置する）」または「ｆｌａｎｋｉｎｇ（フランキング、両側から挟む、両側に位置する）」は、５’ＬＴＲおよび３’ＳＩＮ ＬＴＲがプロモーターおよび導入遺伝子の真隣に存在しなければならないことを意味しないが、その代わりに、ＲＮＡ分子の両末端がＬＶ粒子へパッケージングされることをもたらすことを意味する。ＬＶ粒子へのパッケージングのための一本鎖ＲＮＡの「フランキング」末端からのＬＴＲ配列が当業者により理解される。レトロウイルスにおいて、ＬＴＲによって両側から挟まれた配列は、ＲＮＡ中間体へ部分的に転写され、続いて逆転写されて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）になり、最終的に全ＬＴＲを伴うｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）になる。その後、ＬＴＲは、ＬＴＲ特異的インテグラーゼを介して、宿主染色体の別の領域へのＤＮＡの組込みを媒介する。
ベクターにおいて、プロモーターおよび導入遺伝子は、粒子への包含のための任意の追加の配列と共に、５’および３’ＬＴＲ配列によって有効に両側から挟まれる。本明細書において使用される場合、「ｆｌａｎｋｅｄ（両側から挟まれた、両側に位置する）」または「ｆｌａｎｋｉｎｇ（フランキング、両側から挟む、両側に位置する）」は、５’ＬＴＲおよび３’ＳＩＮ ＬＴＲがプロモーターおよび導入遺伝子の真隣に存在しなければならないことを意味しないが、その代わりに、ＲＮＡ分子の両末端がＬＶ粒子へパッケージングされることをもたらすことを意味する。ＬＶ粒子へのパッケージングのための一本鎖ＲＮＡの「フランキング」末端からのＬＴＲ配列が当業者により理解される。レトロウイルスにおいて、ＬＴＲによって両側から挟まれた配列は、ＲＮＡ中間体へ部分的に転写され、続いて逆転写されて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）になり、最終的に全ＬＴＲを伴うｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）になる。その後、ＬＴＲは、ＬＴＲ特異的インテグラーゼを介して、宿主染色体の別の領域へのＤＮＡの組込みを媒介する。
【0069】
一態様において、したがって、本発明は：
ａ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
ｂ）プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む、ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）をコードする配列および３’ＳＩＮ ＬＴＲをコードする配列；
ｃ）３’ＬＴＲの３’に位置するポリ（Ａ）シグナルをコードする配列；および
ｄ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に位置するスペーサー配列
を含む、本明細書において「閉鎖型直鎖状移行ベクター」と称される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。
ａ）導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；
ｂ）プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む、ハイブリッド５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）をコードする配列および３’ＳＩＮ ＬＴＲをコードする配列；
ｃ）３’ＬＴＲの３’に位置するポリ（Ａ）シグナルをコードする配列；および
ｄ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に位置するスペーサー配列
を含む、本明細書において「閉鎖型直鎖状移行ベクター」と称される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに関する。
【0070】
この閉鎖型直鎖状移行ベクターは、感染性レンチウイルス粒子の製造のための移行ベクター（レンチウイルスベクター）としての使用に好適である。
特に、特性（ｃ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列および（ｄ）スペーサー配列は、レンチウイルス粒子の感染タイターの生産を向上させる特徴を有する新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを提供する。そのような感染性粒子は、導入遺伝子を含有する。これらの特性は、以下により詳細に説明される。
特に、特性（ｃ）ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列および（ｄ）スペーサー配列は、レンチウイルス粒子の感染タイターの生産を向上させる特徴を有する新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを提供する。そのような感染性粒子は、導入遺伝子を含有する。これらの特性は、以下により詳細に説明される。
【0071】
以前に説明される通り、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ移行ベクター中の配列は、ＲＮＡ分子内のエレメントをコードする配列として説明され得るか、またはそれらのエレメントそれ自体についての配列として説明され得る。また、閉鎖型直鎖状ＤＮＡは二重鎖であるので、関連配列エレメントおよびその相補配列の両方がベクター内に存在することが理解される。
【0072】
ポリ（Ａ）シグナル配列
ポリアデニル化プロセスは、一般的に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成に必要とされ、ここではＲＮＡ切断が、ＲＮＡの新しく形成される３’末端上のポリアデノシンモノホスフェート（アデニン塩基）の合成とカップリングされる。ポリアデニル化のための配列エレメントは、ＲＮＡ配列中のポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）シグナル）を含む。ｍＲＮＡにおいて、ポリアデノシンモノホスフェートの付加された範囲は、ポリアデニル化尾部（ポリ（Ａ）尾部）と呼ばれる。ポリ（Ａ）尾部は、翻訳効率の増加に寄与し得る。
ポリアデニル化プロセスは、一般的に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成に必要とされ、ここではＲＮＡ切断が、ＲＮＡの新しく形成される３’末端上のポリアデノシンモノホスフェート（アデニン塩基）の合成とカップリングされる。ポリアデニル化のための配列エレメントは、ＲＮＡ配列中のポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）シグナル）を含む。ｍＲＮＡにおいて、ポリアデノシンモノホスフェートの付加された範囲は、ポリアデニル化尾部（ポリ（Ａ）尾部）と呼ばれる。ポリ（Ａ）尾部は、翻訳効率の増加に寄与し得る。
【0073】
本発明者らは、レンチウイルス移行ベクターとしての使用のための閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子中の３’ＬＴＲをコードする配列の３’に、ポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルをコードする配列（または「ポリ（Ａ）シグナル配列」）を含むことは、ゲノムタイターおよび感染性ウイルスタイターの両方を増加させることを発見した（実施例１および図６を参照されたい）。ポリ（Ａ）シグナル配列は、真核生物タンパク質コード遺伝子の３’において見出され得る。一般的に、中心配列モチーフＡＡＵＡＡＡまたはＡＵＵＡＡＡは、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）シグナルの重要エレメントであり、この中心配列は、プレメッセンジャーＲＮＡの３’末端切断およびポリアデニル化の両方のために、ならびに下流の転写停止を促進するためにフランキング補助エレメントを必要とし得る。いくつかのポリ（Ａ）シグナルは当該技術分野において公知であり、任意の適切な配列が使用され得る。ＲＮＡ中のポリ（Ａ）シグナルは、配列ＡＡＵＡＡＡを含んでもよく、ＧＵリッチである少なくとも１つの配列および／またはＵリッチである少なくとも１つの配列を含む。
【0074】
好ましくは、ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列は、強いポリ（Ａ）シグナルをコードする。したがって、強いポリ（Ａ）シグナル配列は、好ましい。いくつかの強いポリ（Ａ）シグナルは、当該技術分野において公知であり、これらは、効率的な転写の停止を提供するものとして定義され得る。転写停止は、転写複合体および新生ＲＮＡが両方とも、鋳型ＤＮＡから放出されるプロセスである。当業者は、ポリ（Ａ）シグナルが効率的な停止を提供するかどうかを、ルーチン法を使用して決定することができる。好ましい実施形態において、強いポリ（Ａ）シグナルをコードする配列は、ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）配列もしくはそれとの少なくとも９０％の相同性を有する配列、ウサギβ－グロビン（ｒｂＧｌｏｂ）ポリ（Ａ）配列もしくはそれとの少なくとも９０％の相同性を有する配列、またはウシ成長ホルモンポリ（Ａ）（ｂＧＨｐＡ）もしくはそれとの少なくとも９０％の相同性を有する配列から選択される。そのようなものは、「強い」ポリ（Ａ）シグナルと説明され得る。
【0075】
ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列は、上流配列エレメント（ＵＳＥ）をさらに含み得る。ＵＳＥは当該技術分野において周知であり、ポリアデニル化シグナルの有効性を改善すると考えられる。
【0076】
スペーサー配列
３’スペーサー配列
本発明者らは、上記に説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター中のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に、スペーサー配列を含むことは、ゲノムタイターおよび感染性ウイルスタイターの両方をさらに増加させることを発見した（実施例１および図７を参照されたい）。新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター中のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列（ポリ（Ａ）シグナル配列）の３’のスペーサー配列は、下流スペーサー配列または３’スペーサー配列とも称され得る。興味深いことに、プラスミドベースのレンチウイルス移行ベクターへの同じスペーサー配列の組込みは、ウイルスタイターに影響を及ぼさず（実施例１および図７を参照されたい）、したがって、この効果は、閉鎖型直鎖状ベクターそれ自体の形式に依存性であると考えられる。スペーサー配列は、任意の好適な長さおよび任意の好適な配列であってもよい。好ましくは、新規閉鎖型直鎖状移行ベクターのスペーサー配列は、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さであり得る。スペーサーは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００もしくは少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。スペーサーは、ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列を、直鎖状ＤＮＡ分子の閉鎖された末端から分離する。末端がプロテロメラーゼ配列の一部により閉鎖される場合、スペーサー配列の３’末端は、プロテロメラーゼ配列のその部分の５’末端に隣接し得る。末端がヘアピンにより閉鎖される場合、同じ概念を適用することができ、ヘアピンおよびスペーサーについての配列は隣接し得る。スペーサー配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。これは最終レンチウイルスベクター（感染性レンチウイルス粒子）に存在しないので、レンチウイルスベクターゲノムの収容力を、スペーサー配列の長さを決定することにおいて考慮する必要はない。
３’スペーサー配列
本発明者らは、上記に説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター中のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列の３’に、スペーサー配列を含むことは、ゲノムタイターおよび感染性ウイルスタイターの両方をさらに増加させることを発見した（実施例１および図７を参照されたい）。新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター中のポリ（Ａ）シグナルをコードする配列（ポリ（Ａ）シグナル配列）の３’のスペーサー配列は、下流スペーサー配列または３’スペーサー配列とも称され得る。興味深いことに、プラスミドベースのレンチウイルス移行ベクターへの同じスペーサー配列の組込みは、ウイルスタイターに影響を及ぼさず（実施例１および図７を参照されたい）、したがって、この効果は、閉鎖型直鎖状ベクターそれ自体の形式に依存性であると考えられる。スペーサー配列は、任意の好適な長さおよび任意の好適な配列であってもよい。好ましくは、新規閉鎖型直鎖状移行ベクターのスペーサー配列は、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さであり得る。スペーサーは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００もしくは少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。スペーサーは、ポリ（Ａ）シグナルをコードする配列を、直鎖状ＤＮＡ分子の閉鎖された末端から分離する。末端がプロテロメラーゼ配列の一部により閉鎖される場合、スペーサー配列の３’末端は、プロテロメラーゼ配列のその部分の５’末端に隣接し得る。末端がヘアピンにより閉鎖される場合、同じ概念を適用することができ、ヘアピンおよびスペーサーについての配列は隣接し得る。スペーサー配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。これは最終レンチウイルスベクター（感染性レンチウイルス粒子）に存在しないので、レンチウイルスベクターゲノムの収容力を、スペーサー配列の長さを決定することにおいて考慮する必要はない。
【0077】
スペーサー配列は二重鎖ＤＮＡで存在するので、スペーサー配列は塩基対の長さの点で決定され得る。スペーサー配列は場合により、非コードＤＮＡであり、例えば、それは、タンパク質またはＲＮＡ生成物をコードしない。スペーサーの配列は、ランダムであり得る。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、移行ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形態で存在する場合、スペーサー配列が効率的なＲＮＡプロセッシングを促進すると仮定する。本発明者らは、これは閉鎖型直鎖状ＤＮＡのアーキテクチャのための特定の必要条件であること、およびプラスミドＤＮＡにおけるスペーサー配列の付加は感染タイターに差を生じなかったことに言及した（実施例１および図７を参照されたい）。
【0078】
５’スペーサー配列
本発明者らは、上記に説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子中の５’長鎖末端反復配列（５’ＬＴＲ）の５’に、スペーサー配列を含むことは、感染性ウイルスタイターをさらに改善することを発見した（実施例２および図７Ｂを参照されたい）。新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子中の５’ＬＴＲの５’のスペーサー配列は、上流スペーサー配列と称され得る。スペーサー配列は、任意の好適な長さおよび任意の好適な配列であってもよい。好ましくは、下流スペーサーの配列は、上流スペーサーの配列と同一ではない。好ましくは、下流スペーサーの配列は、上流スペーサーの配列とは異なり得る。好ましくは、新規閉鎖型直鎖状移行ベクターのスペーサー配列は、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さであり得る。スペーサーは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００もしくは少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。好ましくは、スペーサーは、少なくとも１ｋｂの長さである。スペーサーは、５’ＬＴＲを、直鎖状ＤＮＡ分子の閉鎖された末端から分離する。末端がプロテロメラーゼ配列の一部により閉鎖される場合、上流スペーサー配列の５’末端は、プロテロメラーゼ配列のその部分の３’末端に隣接し得る。末端がヘアピンにより閉鎖される場合、同じ概念を適用することができ、ヘアピンおよびスペーサーについての配列は隣接し得る。上流スペーサー配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。これは最終レンチウイルスベクター（感染性レンチウイルス粒子）に存在しないので、レンチウイルスベクターゲノムの収容力を、上流スペーサー配列の長さを決定することにおいて考慮する必要はない。
本発明者らは、上記に説明される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子中の５’長鎖末端反復配列（５’ＬＴＲ）の５’に、スペーサー配列を含むことは、感染性ウイルスタイターをさらに改善することを発見した（実施例２および図７Ｂを参照されたい）。新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡ分子中の５’ＬＴＲの５’のスペーサー配列は、上流スペーサー配列と称され得る。スペーサー配列は、任意の好適な長さおよび任意の好適な配列であってもよい。好ましくは、下流スペーサーの配列は、上流スペーサーの配列と同一ではない。好ましくは、下流スペーサーの配列は、上流スペーサーの配列とは異なり得る。好ましくは、新規閉鎖型直鎖状移行ベクターのスペーサー配列は、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さであり得る。スペーサーは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００もしくは少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。好ましくは、スペーサーは、少なくとも１ｋｂの長さである。スペーサーは、５’ＬＴＲを、直鎖状ＤＮＡ分子の閉鎖された末端から分離する。末端がプロテロメラーゼ配列の一部により閉鎖される場合、上流スペーサー配列の５’末端は、プロテロメラーゼ配列のその部分の３’末端に隣接し得る。末端がヘアピンにより閉鎖される場合、同じ概念を適用することができ、ヘアピンおよびスペーサーについての配列は隣接し得る。上流スペーサー配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。これは最終レンチウイルスベクター（感染性レンチウイルス粒子）に存在しないので、レンチウイルスベクターゲノムの収容力を、上流スペーサー配列の長さを決定することにおいて考慮する必要はない。
【0079】
上流スペーサー配列は二重鎖ＤＮＡで存在するので、上流スペーサー配列は塩基対の長さの点で決定され得る。上流スペーサー配列は場合により、非コードＤＮＡであり、例えば、それは、タンパク質またはＲＮＡ生成物をコードしない。上流スペーサーの配列は、ランダムであり得る。また、配列は、任意の下流のスペーサー配列とは異なり得る。
【0080】
導入遺伝子
本発明の任意の態様の閉鎖型直鎖状移行ベクターは、目的の生成物をコードする配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含むか、からなるか、またはから本質的になる発現カセットを含み得る。目的の生成物をコードする配列は、導入遺伝子と称され得る。導入遺伝子は、ＲＮＡ生成物、例えば、阻害性ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡもしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、またはタンパク質生成物（メッセンジャーＲＮＡを介して）をコードし得る。本発明の任意の態様の閉鎖型直鎖状移行ベクターは好ましくは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーを含む。１つまたは複数のプロモーターまたはエンハンサーが、必要に応じて使用され得る。任意の好適なプロモーターまたはエンハンサーが使用され得る。これらは、レンチウイルスベクターが構築され、それが標的化するよう所望される細胞に適用されたときの導入遺伝子の発現のためである。
本発明の任意の態様の閉鎖型直鎖状移行ベクターは、目的の生成物をコードする配列に作動可能に連結された真核生物プロモーターを含むか、からなるか、またはから本質的になる発現カセットを含み得る。目的の生成物をコードする配列は、導入遺伝子と称され得る。導入遺伝子は、ＲＮＡ生成物、例えば、阻害性ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡもしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、またはタンパク質生成物（メッセンジャーＲＮＡを介して）をコードし得る。本発明の任意の態様の閉鎖型直鎖状移行ベクターは好ましくは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーを含む。１つまたは複数のプロモーターまたはエンハンサーが、必要に応じて使用され得る。任意の好適なプロモーターまたはエンハンサーが使用され得る。これらは、レンチウイルスベクターが構築され、それが標的化するよう所望される細胞に適用されたときの導入遺伝子の発現のためである。
【0081】
選択される導入遺伝子は、レンチウイルスベクターのために意図される特定の使用に依存する。導入遺伝子の例示的な、非限定的な例は、治療用ＲＮＡをコードする導入遺伝子（例えば、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする導入遺伝子）、疾患を有する対象において欠損または非存在であるタンパク質をコードする遺伝子療法導入遺伝子、およびＤＮＡワクチン接種に使用されるワクチン導入遺伝子（すなわち、発現がタンパク質に対するレシピエント生物のワクチン接種を誘導する前記タンパク質をコードする）を含む。
【0082】
「プロモーター」とは、ポリヌクレオチドの転写を開始および調節するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補助因子、制御性タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補助因子、制御性タンパク質などによって抑制される）、および構成的プロモーターを含み得る。「プロモーター」または「エンハンサー」という用語は、全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。この用語は、二方向性プロモーターを含む。
【0083】
例において、ＥＦ１α（伸長因子１－アルファ）は、プロモーターとして使用される。これは構成的プロモーターであり、それゆえ、レンチウイルスベクターが送達された場合の標的細胞における導入遺伝子の発現での使用に望ましい場合がある。改変されたＥＦ１αプロモーター、例えば、ヒトＥＦ１αコアプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型長鎖末端反復配列のＲセグメントおよびＵ５配列の部分（Ｒ－Ｕ５’）とを含む混成プロモーターであるｈＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーターもまた使用され得る。ＥＦ１αプロモーターは強い活性を呈し、インビボで導入遺伝子の長期持続発現を産生する。Ｒ－Ｕ５’は、コアプロモーターにカップリングされており、ＲＮＡの安定性を向上させる。本発明における使用に好適な代替のプロモーターは：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびポリユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターまたはそれらの転写活性断片を含むが、これらに限定されない。また、プロモーターは、レンチウイルスベクターがインビボで投与された場合に細胞特異的発現を許容するように選択され得る。例えば、黒色腫細胞を標的化することは、チロシナーゼプロモーターまたはエンハンサー断片を含むことによって達成されている。当業者は、本発明における使用に好適な細胞特異的プロモーターを選択することができる。
【0084】
「作動可能に連結された」とは、そのように説明される成分がそれらの通常の機能を行うように構成される、エレメントの配置を指す。したがって、核酸配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にその配列の発現に影響を及ぼすことが可能である。プロモーターは、それが配列の発現を方向付けるように機能する限り、その配列と連続している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが、転写される介在する配列が、プロモーター配列と核酸配列との間に存在してもよく、プロモーター配列はそれでもコード配列に「作動可能に連結されている」と考えられ得る。したがって、「作動可能に連結された」という用語は、インビボにおける転写複合体によるプロモーターエレメントの認識に際して導入遺伝子の転写の開始を可能にする、プロモーターエレメントおよび導入遺伝子の任意の間隔または向きを包含すると意図される。
【0085】
特定の実施形態において、マルチシストロン性発現カセットは、閉鎖型直鎖状移行ベクターにおいて使用され得る。マルチシストロン性発現カセットは、単一の発現カセット中の単一のプロモーターに作動可能に連結された多数の遺伝子を含み、単一の転写物からの多数の遺伝子の翻訳を可能にする。マルチシストロン性発現カセットは、選択可能な薬剤またはマーカー遺伝子が同時発現されることを可能にし、管理可能な構築物サイズを許容し、所望の遺伝子生成物の定常的な生産を可能にし、有害な臨床事象が起こり得る場合のための安全装置としての条件付き細胞傷害性遺伝子を含む機会を提供するので、それらは望ましい場合がある。機能的マルチシストロン性発現カセットを設計および生産する方法は、当該技術分野において周知であり、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、自己切断２Ａペプチドおよび／または二方向性プロモーターの使用を含む。例えば、Ｓｈａｉｍａｒｄａｎｏｖａら（２０１９）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１１（１１）：５８０、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ１１１１０５８０およびＧｏｌｄｉｎｇ， Ｍ． ＆ Ｍａｎｎ， Ｍ．（２０１１）Ａ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｅｘｔｒａｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８：８１７～８２６、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．２６を参照されたい。
【0086】
ＬＴＲ配列
本発明の任意の実施形態において、閉鎖型直鎖状移行ベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲをコードする配列を含む。あるいは、ベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列および３’ＬＴＲ配列を含む。したがって、順序は：５’ＬＴＲ；導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；３’ＬＴＲである。追加の配列は、ＬＴＲ間に含まれ得る。追加の配列は、ベクター内の、ＬＴＲによって両側から挟まれた配列の外側に存在してもよい。
本発明の任意の実施形態において、閉鎖型直鎖状移行ベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）および３’ＬＴＲをコードする配列を含む。あるいは、ベクターは、プロモーターおよび導入遺伝子を両側から挟む５’長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列および３’ＬＴＲ配列を含む。したがって、順序は：５’ＬＴＲ；導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター；３’ＬＴＲである。追加の配列は、ＬＴＲ間に含まれ得る。追加の配列は、ベクター内の、ＬＴＲによって両側から挟まれた配列の外側に存在してもよい。
【0087】
ＬＴＲは、宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組込みを促進する、ウイルスに由来するエレメントである。野生型ＬＴＲは、独特な３’（Ｕ３）領域、反復（Ｒ）領域、および独特な５’（Ｕ５）領域を含むので、野生型５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの両方はＵ３－Ｒ－Ｕ５構造を有する。第３世代レンチウイルス粒子プラットホームにおいて、ＬＴＲをコードする配列は、レンチウイルスベースのベクターが研究および臨床設定における使用のためにより安全であるようにするために、野生型レンチウイルスＬＴＲと比較して改変されている。
【0088】
本発明において使用されるＬＴＲ配列は、任意のレンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスとは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１～３型）を含むレトロウイルスの属である。レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））ならびに非霊長類レンチウイルス（例えば、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ピューマレンチウイルス、ライオンレンチウイルスおよびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ））に由来し得るが、ＨＩＶベースのベクターは、現在の使用におけるレンチウイルスベクターの大多数を構成する。それゆえ、ＬＴＲは、任意のレンチウイルスに由来し得るが、好ましくはＨＩＶ－１に由来する。
【0089】
本発明の任意の態様において、５’ＬＴＲは、ハイブリッドＬＴＲである（また、改変された５’ＬＴＲとも称され得る）。ハイブリッドＬＴＲとは、野生型ＬＴＲの一部が除去されており、異種の配列が挿入されていることを示す。ハイブリッド５’ＬＴＲは、Ｔａｔ独立性転写を許容し得る。Ｔａｔへの依存を低減または除去するために、Ｕ３領域のすべてまたは部分は欠失され得る。発現を維持するために、Ｕ３領域の機能は、異種のプロモーターを使用して置換され得る。そのようなプロモーターは、別のウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであってもよい。
【0090】
ハイブリッド５’ＬＴＲについての任意の好適な配列は、本発明において使用することができ、いくつかは当該技術分野において公知である。ハイブリッド５’ＬＴＲは、野生型ウイルスＬＴＲではない。
【0091】
好ましい実施形態において、５’ＬＴＲをコードする配列は、部分的に欠失され、異種のエンハンサーまたはプロモーターエレメントに融合されて、導入遺伝子のＴａｔ独立性発現を可能にする。したがって、５’ＬＴＲ配列は、したがって、部分的に欠失され、異種のエンハンサーまたはプロモーターエレメントに融合される。
【0092】
好ましい実施形態において、３’ＬＴＲをコードする配列は、３’自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲについての配列である。あるいは、ベクターは、３’ＳＩＮ ＬＴＲ配列を含む。３’ＳＩＮ ＬＴＲは、野生型レンチウイルス３’ＬＴＲと比較して１つまたは複数の欠失を有し、改変された３’ＬＴＲと称され得る。１つまたは複数の欠失は、１ラウンドの逆転写後に５’ＬＴＲへ移行される。この欠失は、それが宿主細胞へ組み込まれた後の全長ウイルスの転写を廃止する。１つまたは複数の欠失は、ＴＡＴＡボックスならびに転写因子Ｓｐ１およびＮＦ－κＢについての結合部位を含むプロモーターまたはエンハンサーエレメントの部分的なまたは完全な欠失を含み得る。３’ＳＩＮ ＬＴＲは当該技術分野において周知であり、当業者は適切な構築物を特定することが可能である。好ましい実施形態において、３’ＳＩＮ ＬＴＲは、３’ＬＴＲのＵ３領域内の、野生型レンチウイルス３’ＬＴＲの転写開始部位についての－１４９～－９のヌクレオチド位置において１３３ヌクレオチド欠失を含む。ＳＩＮ ３’ＬＴＲは、野生型ウイルスＬＴＲではない。
【0093】
３’ＬＴＲにおける欠失についてさらに付け加えると、３’ＳＩＮ ＬＴＲは、特定の機能を与える異種の配列を含み得る。したがって、また、３’ＬＴＲは、ハイブリッドＬＴＲとして説明され得る。任意の異種の配列エレメントは、３’ＬＴＲに挿入され得る。例えば、異種の調節エレメントは、挿入され得る。ハイブリッドＳＩＮ ３’ＬＴＲをコードする任意の好適な配列は、本発明において使用することができ、いくつかは当該技術分野において公知である。ハイブリッドＳＩＮ ３’ＬＴＲは、野生型ウイルスＬＴＲではない。
【0094】
さらに、３’ＳＩＮ ＬＴＲは、Ｕ３領域の欠失の代わりにＵＳＥエレメントを含み得る。好ましくは、ＵＳＥエレメントは、ＳＶ４０に由来する。
本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに含まれる配列は、好ましくは、ＨＩＶ－１に由来するＬＴＲをコードする配列であるが、同様の効果を有するように他の好適なＬＴＲに同様の改変が適用され得ることが明らかである。
本発明の閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターに含まれる配列は、好ましくは、ＨＩＶ－１に由来するＬＴＲをコードする配列であるが、同様の効果を有するように他の好適なＬＴＲに同様の改変が適用され得ることが明らかである。
【0095】
他のエレメントをコードする配列を含むこと
閉鎖型直鎖状移行ベクターは、表１に要約される、さらなるエレメントをコードする配列、または追加のエレメントについての配列を含み得る。そのようなエレメントは、通常５’ＬＴＲの３’に位置し得るＲＮＡパッケージングシグナルＰｓｉ（ψ）、通常Ｐｓｉの３’に位置し得るＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および通常ＲＲＥの３’に位置し得る中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を含み得る。さらなる追加の機能的配列、例えば、プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、コードされるか、または含まれてもよく、またはＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｐｏｓｔ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）もまた本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターに有利に含まれて、インビボでの導入遺伝子のより安定な発現を得ることができる。ＷＰＲＥは、ウイルスベクターからの導入遺伝子発現を増加し得るが、作用の正確な機構は公知ではない。ＷＰＲＥは、ポリアデニル化シグナルに近接して導入遺伝子の下流に置かれた場合、最も有効である。ＷＰＲＥは、他のウイルスからの他の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）について置換され得る。ＷＰＲＥは、レンチウイルス３’ＬＴＲからの転写中のリードスルーを低減すると考えられ、本実施例において使用される。元々試験された閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター（改変前）におけるその存在を考慮すると、閉鎖型直鎖状レンチウイルス移行ベクターの性能が本明細書において説明される改変を行うことによって改善され得ることは、本発明者らにとって驚きであった。
閉鎖型直鎖状移行ベクターは、表１に要約される、さらなるエレメントをコードする配列、または追加のエレメントについての配列を含み得る。そのようなエレメントは、通常５’ＬＴＲの３’に位置し得るＲＮＡパッケージングシグナルＰｓｉ（ψ）、通常Ｐｓｉの３’に位置し得るＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および通常ＲＲＥの３’に位置し得る中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）を含み得る。さらなる追加の機能的配列、例えば、プライマー結合部位（ＰＢＳ）は、コードされるか、または含まれてもよく、またはＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｐｏｓｔ－Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）もまた本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターに有利に含まれて、インビボでの導入遺伝子のより安定な発現を得ることができる。ＷＰＲＥは、ウイルスベクターからの導入遺伝子発現を増加し得るが、作用の正確な機構は公知ではない。ＷＰＲＥは、ポリアデニル化シグナルに近接して導入遺伝子の下流に置かれた場合、最も有効である。ＷＰＲＥは、他のウイルスからの他の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）について置換され得る。ＷＰＲＥは、レンチウイルス３’ＬＴＲからの転写中のリードスルーを低減すると考えられ、本実施例において使用される。元々試験された閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター（改変前）におけるその存在を考慮すると、閉鎖型直鎖状レンチウイルス移行ベクターの性能が本明細書において説明される改変を行うことによって改善され得ることは、本発明者らにとって驚きであった。
【0096】
レンチウイルスベクターを製造する方法
本発明の第２の態様において、レンチウイルスベクターとしても説明される感染性レンチウイルス粒子（ＬＶＰ）を生産する方法が、本明細書において提供される。
本発明の第２の態様において、レンチウイルスベクターとしても説明される感染性レンチウイルス粒子（ＬＶＰ）を生産する方法が、本明細書において提供される。
【0097】
実施形態において、本明細書において説明される方法は、パッケージング細胞に、上記に説明される閉鎖型直鎖状移行ベクター、および１つまたは複数の生産ベクターをトランスフェクトするステップを含む。
【0098】
実施形態において、本明細書において説明される方法は、生産細胞に、上記に説明される閉鎖型直鎖状移行ベクターをトランスフェクトするステップを含む。
生産ベクター
本明細書において使用される場合、「生産ベクター」または「生産構築物」という用語は、レンチウイルス粒子を生産し、最終的な感染性レンチウイルス粒子中に目的の遺伝子（または導入遺伝子）を「パッケージ」するために必要な成分をコードする配列を含有するベクターを指す。また、これらは、「パッケージングエレメント」（特に、ＧＡＧ、ＰＯＬまたはＲＥＶエレメント）とも称され得る。生産ベクターは発現カセットを含み、これはベクターの別個の成分を指し、トランスフェクトされるパッケージング細胞へ送達され、最終的にこの細胞によって発現される１つまたは複数の遺伝子および調節配列を含む。１つまたは複数の生産ベクターは、各々が１つまたは複数の発現カセットを含み、パッケージング細胞へトランスフェクトされ得る。当該技術分野において、これらは、「付属構築物」または「ヘルパー構築物」とも呼ばれ得る。
生産ベクター
本明細書において使用される場合、「生産ベクター」または「生産構築物」という用語は、レンチウイルス粒子を生産し、最終的な感染性レンチウイルス粒子中に目的の遺伝子（または導入遺伝子）を「パッケージ」するために必要な成分をコードする配列を含有するベクターを指す。また、これらは、「パッケージングエレメント」（特に、ＧＡＧ、ＰＯＬまたはＲＥＶエレメント）とも称され得る。生産ベクターは発現カセットを含み、これはベクターの別個の成分を指し、トランスフェクトされるパッケージング細胞へ送達され、最終的にこの細胞によって発現される１つまたは複数の遺伝子および調節配列を含む。１つまたは複数の生産ベクターは、各々が１つまたは複数の発現カセットを含み、パッケージング細胞へトランスフェクトされ得る。当該技術分野において、これらは、「付属構築物」または「ヘルパー構築物」とも呼ばれ得る。
【0099】
ビリオンタンパク質（ＲＥＶ）遺伝子の発現のレンチウイルスレギュレーターは、スプライスされていないか、または部分的にスプライスされた転写物内のＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）に結合するＲＮＡ結合タンパク質をコードして、核から細胞質へのそれらの輸送を促進する。
【0100】
エンベロープ（ＥＮＶ）遺伝子は、宿主細胞に進入するために、生産されたレンチウイルス粒子に必須であるエンベロープタンパク質をコードする。レンチウイルス粒子は、改変されたエンベロープタンパク質、異なるウイルスに由来するエンベロープタンパク質、またはキメラエンベロープタンパク質を含む偽型化ベクターであってもよく、ＣＤ４を欠く宿主細胞の形質導入を可能にする。ある範囲の様々なエンベロープタンパク質は、エンベロープ偽型化レンチウイルス粒子の生産に使用され得る。したがって、例えば、ＥＮＶ遺伝子は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）タンパク質をコードしてもよく、このタンパク質は、ＬＤＬ－受容体ファミリーメンバーに結合し、レンチウイルス粒子が、様々なヒト細胞を含む、多くの別個の宿主種の広範囲の細胞種に感染することを可能にする。好ましくは、ＥＮＶ遺伝子は、ＶＳＶ－Ｇをコードする。非ヒトレトロウイルス、例えば、エコトロピックなレトロウイルスであるマウス白血病ウイルス（ＭＵＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内因性ＲＤ１１４レトロウイルス、モロニーＭＵＬＶ ４０７０Ａ、モロニーＭＵＬＶ株１０Ａ１のエンベロープタンパク質、ならびに狂犬病ウイルス糖タンパク質、および麻疹ウイルスヘマグルチニンおよび融合糖タンパク質を含む、代替のエンベロープタンパク質は、当業者によって選択され得る。
【0101】
ＧＡＧ遺伝子は、スプライスされていないｍＲＮＡから翻訳されるポリタンパク質をコードし、ポリタンパク質はその後、ウイルスプロテアーゼ（ＰＲ）によって切断されてマトリックスタンパク質、カプシドおよびヌクレオカプシドタンパク質になる。レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子は、酵素タンパク質逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードする。
【0102】
各機能（または成分）は、任意の好適なレンチウイルスに由来し得る。しかしながら、好ましい実施形態において、ＧＡＧ－ＰＯＬおよびＲＥＶは、ＨＩＶウイルスに、特にＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２に由来する。
【0103】
現在のところ、任意の供給源からの、細胞に供給されるベクターの最適数は、全部で４であると、当該技術分野において考えられる。この最適数は、ウイルス繁殖のリスクを最小限にするために必要であるように見える。しかしながら、将来的には、４つを超えるか、または４つ未満のベクターを使用してレンチウイルス粒子を生産することが可能であり得る。例えば、２、３、５または６つのベクターを使用する。
【0104】
好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、閉鎖型直鎖状移行ベクターおよび少なくとも１つの生産ベクターをトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞が、レンチウイルス粒子を生産するために必要なすべての成分を含有するように、各生産ベクターは：
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）；
２）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質；
３）エンベロープタンパク質（好ましくは水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））；または
４）ビリオンタンパク質（Ｒｅｖ）タンパク質の発現のＨＩＶレギュレーター
のうちの１つまたは複数をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む。
１）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）；
２）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）タンパク質；
３）エンベロープタンパク質（好ましくは水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ））；または
４）ビリオンタンパク質（Ｒｅｖ）タンパク質の発現のＨＩＶレギュレーター
のうちの１つまたは複数をコードする少なくとも１つの発現カセットを含む。
【0105】
生産ベクターは、２つ以上の発現カセットを含み得る。ＧＡＧ遺伝子およびＰＯＬ遺伝子は、単一の生産ベクター上に含まれ得る。それゆえ、ＧＡＧおよびＰＯＬは、同じプロモーター配列を共有し得る。
【0106】
「生産ベクター」はときには、当該技術分野において「パッケージングベクター」と称されることに留意すべきである。
生産ベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター、または環状ＤＮＡベクター、例えば、プラスミドもしくはミニサークルの形態において細胞に提供され得る。使用されるＤＮＡベクターのすべてが閉鎖型直鎖状ＤＮＡであることが好ましい場合があるか、またはベクターアーキテクチャの混合物が使用され得る。
生産ベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター、または環状ＤＮＡベクター、例えば、プラスミドもしくはミニサークルの形態において細胞に提供され得る。使用されるＤＮＡベクターのすべてが閉鎖型直鎖状ＤＮＡであることが好ましい場合があるか、またはベクターアーキテクチャの混合物が使用され得る。
【0107】
閉鎖型直鎖状生産ベクター
生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの形態で存在する場合、それは、上記に説明される通り、任意の種類の「閉鎖された」末端を伴う、任意の適切な形態をとり得る。生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの形態で存在する場合、それは、閉鎖型直鎖状生産ベクターと称され得る。
生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの形態で存在する場合、それは、上記に説明される通り、任意の種類の「閉鎖された」末端を伴う、任意の適切な形態をとり得る。生産ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの形態で存在する場合、それは、閉鎖型直鎖状生産ベクターと称され得る。
【0108】
本発明者らは、閉鎖型直鎖状生産ベクター中の発現カセットの３’のスペーサー配列の包含は、感染タイターの改善を提供することを発見した（実施例３および４、ならびに図１０Ａおよび１２Ａを参照されたい）。
【0109】
したがって、本発明は、生産ベクターとしての使用に好適な閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクター（閉鎖型直鎖状生産ベクター）であって：
ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；および／もしくは
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／もしくは
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセット；ならびに／または
ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状生産ベクターにさらに関する。
ａ）（ｉ）レンチウイルス群特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子；
（ｉｉ）レンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子；および／もしくは
（ｉｉｉ）エンベロープ遺伝子（ＥＮＶ）；および／もしくは
（ｉｖ）レンチウイルス調節遺伝子（ＲＥＶ）
のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの発現カセット；ならびに／または
ｂ）発現カセットの３’に位置するスペーサー配列
を含む閉鎖型直鎖状生産ベクターにさらに関する。
【0110】
発現カセットは、トランスフェクトされた細胞によって発現される少なくとも１つの遺伝子および調節配列（例えばプロモーター）ならびに停止エレメントからなる、ベクターＤＮＡの別個の成分である。停止エレメントは、ポリＡ配列または実際にＬＴＲもしくは改変されたＬＴＲを含む、任意の適切なエレメントであってもよい。
【0111】
閉鎖型直鎖状生産ベクター中の発現カセットの３’のスペーサー配列は、任意の好適な長さおよび任意の好適な配列であってもよい。好ましくは、閉鎖型直鎖状生産ベクターのスペーサー配列は、少なくとも２５０ヌクレオチドの長さであり得る。スペーサーは、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００もしくは少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１２００、少なくとも１３００、少なくとも１４００または少なくとも１５００ヌクレオチドの長さであってもよい。スペーサーは、少なくとも２５０、少なくとも５００または最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド（１ｋｂ）の長さであることが好ましい場合がある。スペーサーは、発現カセットを、直鎖状ＤＮＡ分子の閉鎖された末端から分離する。末端がプロテロメラーゼ配列の一部により閉鎖される場合、スペーサー配列の３’末端は、プロテロメラーゼ配列のその部分の５’末端に隣接し得る。末端がヘアピンにより閉鎖される場合、同じ概念を適用することができ、ヘアピンおよびスペーサーについての配列は隣接し得る。スペーサー配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。これは最終レンチウイルスベクター（感染性レンチウイルス粒子）に存在しないので、レンチウイルスベクターゲノムの収容力を、スペーサー配列の長さを決定することにおいて考慮する必要はない。
【0112】
スペーサー配列は二重鎖ＤＮＡで存在するので、スペーサー配列は塩基対の長さの点で決定され得る。スペーサー配列は場合により、非コードＤＮＡであり、例えば、それは、タンパク質またはＲＮＡ生成物をコードしない。スペーサーの配列は、ランダムであり得る。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、移行ベクターが閉鎖型直鎖状ＤＮＡの形態で存在する場合、スペーサー配列が効率的なＲＮＡプロセッシングを促進すると仮定する。２つのスペーサー配列が存在する場合、それらは異なる配列であることが好ましい場合がある。
【0113】
使用される１つまたは複数の生産ベクターは、同じベクターアーキテクチャを有し得るか、またはベクターアーキテクチャの混合物が使用され得る。換言すると、３’スペーサー配列を伴うかもしくは伴わない閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの形態の生産ベクター、または環状ＤＮＡベクター、例えばプラスミドもしくはミニサークルの任意の組合せが使用され得る。
【0114】
本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターは、上記に説明されるパッケージングエレメントおよび／または表１に概略されるエレメントのうちの任意の１つまたは複数をさらに含み得ることが当業者により理解され得る。これらのパッケージングエレメントは、マルチシストロン性発現カセットの部分として、または別々の発現カセットとして閉鎖型直鎖状移行ベクターに存在し得る。例えば、ＧＡＧ遺伝子をコードする発現カセットは、閉鎖型直鎖状移行ベクターに含まれ得る。
【0115】
パッケージング細胞
本明細書において使用される場合、「パッケージング細胞」という用語は、レンチウイルス粒子の生産における使用のための細胞を指す。好ましくは、パッケージング細胞は、哺乳動物細胞である。
本明細書において使用される場合、「パッケージング細胞」という用語は、レンチウイルス粒子の生産における使用のための細胞を指す。好ましくは、パッケージング細胞は、哺乳動物細胞である。
【0116】
レンチウイルス粒子の生産のための哺乳動物細胞は、当該技術分野において公知である。パッケージング細胞の代表的な例は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞およびその派生物またはバリアントを含む。例えば、一部の実施形態において、２９３バリアントは、血清非含有条件下において懸濁液中で増殖するそれらの能力のために選択される場合があり、この能力は理想的に、トランスフェクションについて非常に許容性である。そのようなバリアントの一例は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。あるいは、２９３バリアント、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、接着性細胞培養物中で増殖するそれらの能力のために選択され得る。パッケージング細胞としての使用のための他の細胞種として、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＫＢ細胞、ＣＫＴ１細胞、ＮＩＨ／ｓＴ３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはレンチウイルス生活環を支持する任意の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0117】
パッケージング細胞は、構成的であっても、誘導性であってもよい。
パッケージング細胞は、使用される特定の細胞について選択される血清非含有培地中で培養され、レンチウイルス粒子の生産を許容し得る。血清非含有培地は、治療適用に好適なレンチウイルス粒子の生産を可能にする。血清非含有培地についての概略のために、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓの９章（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ）：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；編Ｆｒｅｓｈｅｎ， ＲＩ、２０００、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｐｓ、ｐｐ．８９～１０４および１０５～１２０を参照されたい。一般的に、血清非含有培地は、培養物中の各々の細胞株の増殖を向上させるように操作され、以下のもの：選択された分泌細胞性タンパク質、拡散性栄養素、アミノ酸、有機および／または無機塩、ビタミン、微量金属、糖および脂質ならびにおそらく他の化合物、例えば増殖促進物質（例えばサイトカイン）のいずれかの包含の可能性を有する。そのような培地は市販されており、当業者は、哺乳動物宿主細胞について適切な培地を選択することができる。培地は、添加物、例えば、懸濁培養物中で剪断力を制御するために使用される非イオン性界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２４０４０－０３２）、抗凝集剤（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号００１００５７ＡＥ）およびＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンの代替物、例えばＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、例えばＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０－０３８）を補充してもよい。本発明において使用される培地および添加物は、有利にＧＭＰ適合である。例えば、懸濁液中で２９３Ｆ細胞を増殖させるために使用され得る市販の血清非含有培地の非限定的な例は、Ｇｉｂｃｏ ＬＶ－ＭＡＸ生産培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５８３４０１）である。
パッケージング細胞は、使用される特定の細胞について選択される血清非含有培地中で培養され、レンチウイルス粒子の生産を許容し得る。血清非含有培地は、治療適用に好適なレンチウイルス粒子の生産を可能にする。血清非含有培地についての概略のために、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓの９章（Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ）：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；編Ｆｒｅｓｈｅｎ， ＲＩ、２０００、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｐｓ、ｐｐ．８９～１０４および１０５～１２０を参照されたい。一般的に、血清非含有培地は、培養物中の各々の細胞株の増殖を向上させるように操作され、以下のもの：選択された分泌細胞性タンパク質、拡散性栄養素、アミノ酸、有機および／または無機塩、ビタミン、微量金属、糖および脂質ならびにおそらく他の化合物、例えば増殖促進物質（例えばサイトカイン）のいずれかの包含の可能性を有する。そのような培地は市販されており、当業者は、哺乳動物宿主細胞について適切な培地を選択することができる。培地は、添加物、例えば、懸濁培養物中で剪断力を制御するために使用される非イオン性界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２４０４０－０３２）、抗凝集剤（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号００１００５７ＡＥ）およびＬ－グルタミンまたはＬ－グルタミンの代替物、例えばＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、例えばＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０－０３８）を補充してもよい。本発明において使用される培地および添加物は、有利にＧＭＰ適合である。例えば、懸濁液中で２９３Ｆ細胞を増殖させるために使用され得る市販の血清非含有培地の非限定的な例は、Ｇｉｂｃｏ ＬＶ－ＭＡＸ生産培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５８３４０１）である。
【0118】
あるいは、パッケージング細胞は、当該技術分野において周知の方法を使用して接着系において培養される場合があり、例えば、Ｍｅｒｔｅｎら（２０１１）Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２２（３）：３４３～３５６． ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．０６０を参照されたい。
【0119】
生産性細胞
本明細書において使用される場合、「生産性細胞」という用語は、レンチウイルス粒子の生産における使用のための細胞を指す。生産性細胞は、単に閉鎖型直鎖状移行ベクターが一過性トランスフェクションにより導入されるように、感染性レンチウイルス粒子を生産するために必要とされるパッケージング機能のすべてまたは部分が細胞ゲノムに挿入されている安定な細胞株である。そのような生産性細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６８６，２７９号、Ｏｒｙら（１９９６）Ａ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ／ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ． ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９３：１１４００～１１４０６およびＳａｎｂｅｒら（２０１５）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ、５：９０２１を参照されたい。
本明細書において使用される場合、「生産性細胞」という用語は、レンチウイルス粒子の生産における使用のための細胞を指す。生産性細胞は、単に閉鎖型直鎖状移行ベクターが一過性トランスフェクションにより導入されるように、感染性レンチウイルス粒子を生産するために必要とされるパッケージング機能のすべてまたは部分が細胞ゲノムに挿入されている安定な細胞株である。そのような生産性細胞は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６８６，２７９号、Ｏｒｙら（１９９６）Ａ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ／ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ． ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９３：１１４００～１１４０６およびＳａｎｂｅｒら（２０１５）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ、５：９０２１を参照されたい。
【0120】
生産性細胞は、構成的であっても、誘導性であってもよく、当該技術分野において周知である（Ｆａｒｓｏｎら（２００１）Ａ ｎｅｗ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔａｂｌｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１２（８）：９８１～９７．ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４０１７５０１９５９３５．およびＭｅｒｔｅｎ， Ｏ． Ｗ．、Ｈｅｂｂｅｎ， Ｍ． ＆ Ｂｏｖｏｌｅｎｔａ， Ｃ．（２０１６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． ３：１６０１７）。
【0121】
ハイブリッドの安定な細胞株もまた開発されており、この細胞株では、一部のパッケージング機能は細胞ゲノムに組み込まれており、一方でその他はパッケージングベクターの一過性トランスフェクションを通して提供される。したがって、これらの生産体の組合せを使用してもよく、生産ベクターの一部は細胞ゲノムへ組み込まれ、その他は一過性トランスフェクションによって提供される。当業者は、感染性レンチウイルス粒子を製造するためにいくつかの異なる方法および試薬が使用され得ることを理解し得る。
【0122】
したがって、本発明の新規閉鎖型直鎖状移行ベクターを使用してレンチウイルスベクターを生産する多数の策が存在することが当業者により理解され得る。全体として、閉鎖型直鎖状移行ベクターが導入されるパッケージング細胞または生産性細胞は、機能的レンチウイルス粒子を生産するために必要なパッケージング機能のすべてを有するべきであり、これらのパッケージング機能は、一過性トランスフェクションを通して細胞へ導入され、細胞ゲノムへ安定的に組み込まれ得るか、またはこれらの２つの組合せであり得る。
【0123】
トランスフェクション
本発明の方法において、血清非含有条件下において懸濁液中で増殖するパッケージング細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、レンチウイルス粒子の生産のために適合された１つまたは複数のベクターをトランスフェクトする。好ましくは、トランスフェクションは、一過性トランスフェクションである。
本発明の方法において、血清非含有条件下において懸濁液中で増殖するパッケージング細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、レンチウイルス粒子の生産のために適合された１つまたは複数のベクターをトランスフェクトする。好ましくは、トランスフェクションは、一過性トランスフェクションである。
【0124】
レンチウイルス粒子の生産に必要な様々な機能は、任意の数のベクターによりパッケージング細胞へ提供され得る。特に、これらの機能は、少なくとも１、２、３または４つのベクターにより提供され得る。本発明の特定の実施形態において、レンチウイルス粒子の生産に必要な様々な機能は、レンチウイルス粒子を生産するために適合された４つのベクターのトランスフェクション、特に一過性トランスフェクションによってパッケージング細胞へ提供され、ここで、１つのベクターはエンベロープタンパク質（Ｅｎｖベクター）をコードし、１つのベクターはレンチウイルスＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードし（Ｇａｇ－Ｐｏｌベクター）、１つのベクターはレンチウイルスＲｅｖタンパク質をコードし（Ｒｅｖベクター）、１つのベクターは、レンチウイルス５’ハイブリッドＬＴＲおよび３’ＳＩＮ ＬＴＲをコードする配列間に導入遺伝子発現カセットを含む本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターである。
【0125】
あるいは、本ベクターの閉鎖型直鎖状移行ベクターは、感染性レンチウイルス粒子を生産するために必要とされるパッケージング機能の相補的な組のすべてまたは部分を保有する安定な生産性細胞へ一過的にトランスフェクトされ得る。
【0126】
当該技術分野において公知の様々な技術は、核酸分子をパッケージング細胞または生産性細胞へ導入するために用いられ得る。そのような技術は、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、リポソーム媒介性トランスフェクションなどの、化合物を使用する、化学物質により促進されるトランスフェクション；エレクトロポレーション法、微粒子銃またはマイクロインジェクションなどの非化学物質法；および目的の核酸分子を含有するウイルスによる感染（「形質導入」と呼ばれることがある）を含む。
【0127】
しかしながら、本発明の好ましい実施形態により、一過性トランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｎｅ）（ＰＥＩ）を使用して行われる。ＰＥＩは合成水溶性ポリマーであり、トランスフェクション試薬として広く使用されている。ＰＥＩは、多くの細胞株において高い遺伝子移行活性を有する一方で、低い細胞毒性を呈し、費用効果が高く、それゆえ産業スケールの生産適用に適合性である。ＰＥＩは、広範な分子量、および効率的な遺伝子移行活性に重要である物理化学パラメーターである多分散性を有する直鎖状および分岐状ポリマーの両方として入手可能である（Ｇｏｄｂｅｙ Ｗ． Ｔ．ら、Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、６０、１４９１６０（１９９９））。特定の実施形態において、本発明において使用されるＰＥＩは、２０～２５ｋＤの直鎖状ＰＥＩである。例えば、特定の実施形態において、本発明において使用されるＰＥＩは、ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）（ＰｏｌｙＰｌｕｓから入手可能）である。ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）トランスフェクション試薬は、動物起源の成分を含まない直鎖状ＰＥＩ誘導体であり、非常に有効かつ再現性のある遺伝子送達を提供する。他のＰＥＩ、または細胞をトランスフェクトするための、構造がそれと類似するカチオン性ポリマーは、米国特許第６，０１３，２４０号および欧州特許第０７７０１４０号において開示される。
【0128】
当業者は、トランスフェクション法を、実行される特定の細胞培養物へ適合することができる。
パッケージング細胞は、１つまたは複数の生産ベクターと共に、本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターをトランスフェクトされ得る。生産ベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（本明細書において説明される３’スペーサー配列を伴うかもしくは伴わない）または環状ＤＮＡ、例えばプラスミドもしくはミニサークルを含む任意の適切な形態において存在してもよい。生産ベクターは、パッケージングエレメントＧＡＧ、ＰＯＬ、ＲＥＶおよび／またはＥＮＶのうちの１つまたは複数をコードし得る。ＧＡＧおよびＰＯＬが単一の生産ベクター上にコードされることが好ましい場合がある。
パッケージング細胞は、１つまたは複数の生産ベクターと共に、本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターをトランスフェクトされ得る。生産ベクターは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（本明細書において説明される３’スペーサー配列を伴うかもしくは伴わない）または環状ＤＮＡ、例えばプラスミドもしくはミニサークルを含む任意の適切な形態において存在してもよい。生産ベクターは、パッケージングエレメントＧＡＧ、ＰＯＬ、ＲＥＶおよび／またはＥＮＶのうちの１つまたは複数をコードし得る。ＧＡＧおよびＰＯＬが単一の生産ベクター上にコードされることが好ましい場合がある。
【0129】
パッケージング細胞は、任意の適切なモル構築物比を使用して、閉鎖型直鎖状移行ベクターおよび１つまたは複数の生産ベクターをトランスフェクトされ得る。例えば、パッケージング細胞が４つのＤＮＡ構築物（閉鎖型直鎖状移行ベクター、ＧａｇＰｏｌベクター、ＲｅｖベクターおよびＥＮＶベクター（好ましくはＶＳＶｇベクター））をトランスフェクトされる場合、任意の適切な構築物質量比が使用され得る。移行：ＧａｇＰｏｌ：Ｒｅｖ：ＶＳＶｇ ＤＮＡ構築物の構築物質量比は、４：１：２：１、３：１：２：１、３：１：３：１．５または３：１：３：２であり得る。
【0130】
誘導
誘導系がレンチウイルス粒子の生産に使用される本発明の実施形態において、本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターを含有するパッケージング細胞または生産性細胞は、レンチウイルス粒子の生産を開始するように誘導され得る。誘導系、例えば、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を通して遺伝子転写を誘発する、培養培地中のテトラサイクリン／ドキシサイクリン抗生物質の、それぞれ添加または除去に基づくＴｅｔ－ｏｎおよびＴｅｔ－ｏｆｆ系は、当該技術分野において周知である。代替の誘導系は、Ｔｅｔ－ｏｎ／クミン酸塩誘導系およびエクジソン誘導系を含むが、これらに限定されない。
誘導系がレンチウイルス粒子の生産に使用される本発明の実施形態において、本発明の閉鎖型直鎖状移行ベクターを含有するパッケージング細胞または生産性細胞は、レンチウイルス粒子の生産を開始するように誘導され得る。誘導系、例えば、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を通して遺伝子転写を誘発する、培養培地中のテトラサイクリン／ドキシサイクリン抗生物質の、それぞれ添加または除去に基づくＴｅｔ－ｏｎおよびＴｅｔ－ｏｆｆ系は、当該技術分野において周知である。代替の誘導系は、Ｔｅｔ－ｏｎ／クミン酸塩誘導系およびエクジソン誘導系を含むが、これらに限定されない。
【0131】
本発明の代替の実施形態において、構成系は、レンチウイルス粒子の生産のために使用され得る。
培養
トランスフェクション後、例えば、ＤＮＡおよびＰＥＩの混合物を細胞培養物へ添加した後、この細胞培養物を、トランスフェクション後３６～７２時間からなり得るある時間の間、特に４８時間後まで増殖させる。
培養
トランスフェクション後、例えば、ＤＮＡおよびＰＥＩの混合物を細胞培養物へ添加した後、この細胞培養物を、トランスフェクション後３６～７２時間からなり得るある時間の間、特に４８時間後まで増殖させる。
【0132】
トランスフェクトされたパッケージング細胞または生産性細胞を培養するための方法は、当該技術分野において公知であり、細胞の増殖および細胞のゲノムへの構築物の組込みを促進する、様々な細胞培養培地、適切な気体濃度／交換および温度管理の使用を含む。
【0133】
特定の実施形態において、パッケージング細胞または生産性細胞を培養するために使用される培地は、前記細胞をトランスフェクトするために使用される培地と同じである。例えば、ＰＥＩおよびベクターの混合物のトランスフェクションの場合、混合物は、Ｇｉｂｃｏ ＬＶ－ＭＡＸ生産培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５８３４０１）中で行ってもよく、また、細胞は、トランスフェクション後、前記Ｇｉｂｃｏ ＬＶ－ＭＡＸ生産培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３５８３４０１）中で増殖させてもよい。
【0134】
培養は、いくつかの培養デバイス、例えば懸濁液中での細胞の培養に適合されたバイオリアクター中で行われ得る。バイオリアクターは、単回使用（使い捨て）バイオリアクターであっても、再利用可能バイオリアクターであってもよい。バイオリアクターは、例えば、培養容器またはバッグおよびタンクリアクターから選択され得る。非限定的な代表的なバイオリアクターとして、Ａｍｂｒ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ａｍｂｒ２５０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ｉＣＥＬＬｉｓ固定床バイオリアクター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｃａｌｅ－Ｘ ｈｙｄｒｏ（Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ）、ＨｙＰｅｒｆｏｒｍａ単回使用バイオリアクター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。
【0135】
回収
レンチウイルス粒子は、その後、当該技術分野において周知の標準技術を使用する１つまたは複数の回収ステップにより、回収（または収集）され得る。
レンチウイルス粒子は、その後、当該技術分野において周知の標準技術を使用する１つまたは複数の回収ステップにより、回収（または収集）され得る。
【0136】
全粒子感染タイターおよびゲノムタイターは、非限定的に以下の実施例において実証される方法を含む、当該技術分野において公知の標準法によって決定され得る。
したがって、本発明は、レンチウイルス粒子の生産に好適な新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを提供する。本発明は、構築物を使用して感染性レンチウイルス粒子を生成する方法にさらに関する。
したがって、本発明は、レンチウイルス粒子の生産に好適な新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターを提供する。本発明は、構築物を使用して感染性レンチウイルス粒子を生成する方法にさらに関する。
【0137】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例について説明される。
実施例
材料および方法 プラスミド／閉鎖型直鎖状ＤＮＡクローニングおよび製造
標準のＤＮＡレンチウイルス構築物のためのすべての配列（ｅＧＦＰ導入遺伝子、ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＧ）を、広く使用されるレンチウイルス第３世代生産系から選択して、公に入手可能な供給源Ａｄｄｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）から取得した。それらの配列を新規に合成し、ＴｏｕｃｈｌｉｇｈｔのｐｒｏＴＬｘ骨格にクローニングした（図９Ａ～Ｄ）。生ずるプラスミド（ｐＤＮＡ）を鋳型として使用して、ＴｏｕｃｈｌｉｇｈｔのｄｂＤＮＡ製造プロセス（ＷＯ２０１０／０８６６２６）を通して、対応する閉鎖型直鎖状ＤＮＡバージョンを生成した。製造した様々な閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構築物を、図４に示す。
実施例
材料および方法 プラスミド／閉鎖型直鎖状ＤＮＡクローニングおよび製造
標準のＤＮＡレンチウイルス構築物のためのすべての配列（ｅＧＦＰ導入遺伝子、ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＧ）を、広く使用されるレンチウイルス第３世代生産系から選択して、公に入手可能な供給源Ａｄｄｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）から取得した。それらの配列を新規に合成し、ＴｏｕｃｈｌｉｇｈｔのｐｒｏＴＬｘ骨格にクローニングした（図９Ａ～Ｄ）。生ずるプラスミド（ｐＤＮＡ）を鋳型として使用して、ＴｏｕｃｈｌｉｇｈｔのｄｂＤＮＡ製造プロセス（ＷＯ２０１０／０８６６２６）を通して、対応する閉鎖型直鎖状ＤＮＡバージョンを生成した。製造した様々な閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構築物を、図４に示す。
【0138】
また、本明細書において説明される新しいエレメントを含むための、標準のｅＧＦＰ導入遺伝子へのすべての改変は、Ｔｏｕｃｈｌｉｇｈｔ（Ｈａｍｐｔｏｎ、英国）において新規に合成され、ｐＤＮＡおよび閉鎖型直鎖状ＤＮＡ製造のための同じ手技を受けた。
【0139】
ＣＡＲ－Ｔ遺伝子は、Ｓａｄｅｌａｉｎ研究所（Ｅｙｑｕｅｍ， Ｊ．ら Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ＣＡＲ ｔｏ ｔｈｅ ＴＲＡＣ ｌｏｃｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｕｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ５４３、（２０１７））によって説明される１９２８ｚ配列に基づいて設計された。
【0140】
レンチウイルス生産：細胞培養、トランスフェクションおよび回収
すべてのレンチウイルス生産のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏウイルス生産細胞、Ａ３５３４７）を、製造業者の推奨に従って、ベントキャップを伴うエルレンマイヤーフラスコにおいて５０～１００ｍＬ体積のＬＶ－ＭＡＸ生産培地（Ａ３５８３４０１）を使用して、プラットホーム振盪インキュベーター中で３７℃、８％ＣＯ２および１２５ｒｐｍにて培養した。
すべてのレンチウイルス生産のために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏウイルス生産細胞、Ａ３５３４７）を、製造業者の推奨に従って、ベントキャップを伴うエルレンマイヤーフラスコにおいて５０～１００ｍＬ体積のＬＶ－ＭＡＸ生産培地（Ａ３５８３４０１）を使用して、プラットホーム振盪インキュベーター中で３７℃、８％ＣＯ２および１２５ｒｐｍにて培養した。
【0141】
トランスフェクション前日に、５０ｍＬの培養物を細胞１×１０６個／ｍＬの濃度において確立した。トランスフェクションの日に、４つのレンチウイルス生産構築物－ｅＧＦＰ移行ベクター、ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶｇ－を含有する全部で０．５～１μｇ／ｍＬのＤＮＡを、ＰＥＩＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）をトランスフェクション試薬として使用して、懸濁細胞についての製造業者の推奨に従ってトランスフェクトした。
【0142】
トランスフェクション４８時間／７２時間後に、５０ｍＬの培養物の１３００ｒｐｍで５分間の遠心分離後、上清を濾過すること（０．４５μｍ）によって回収を行った。上清を続いて一定分量に分け、後の分析のために－８０℃において保存した。細胞ペレットを再懸濁し、５０ｍＬ ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８５３７）により洗浄し、その後それを細胞密度（トリパンブルー）、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用する細胞のｅＧＦＰ発現の解析、および後の遺伝子発現解析のための細胞ペレットの－８０℃保存のために使用した。
【0143】
ＤＮＡ送達および遺伝子発現解析
パッケージング細胞ペレットから、Ｑｉａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）からの、それぞれ、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＴｉｓｓｕｅおよびＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して、推奨されるプロトコールに従って、全ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。ＤＮＡ送達のために、抽出された全ＤＮＡを、その後、別々の反応において、十分な参照材料を使用するコピー数標準曲線を伴う、レンチウイルス標的配列に対するカスタムＴａｑＭａｎプライマー／プローブセット（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるシングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ｑＰＣＲ解析；およびトランスフェクション中の細胞当たりの送達されるＤＮＡベクターコピーの数を評価するための、野生型ＨＥＫ２９３ＦゲノムＤＮＡ標準曲線を伴う、ＲＮＡｓｅＰ ＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析した。遺伝子発現解析のために、１μｇのＲＮＡを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｃＤＮＡを合成した。その後、ｃＤＮＡを、生成される転写物の正規化された数を評価するための十分な参照材料を使用するコピー数標準曲線を伴う、レンチウイルス標的配列および遺伝子発現ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ／１８ＳいずれかのＶＩＣ色素内因性対照（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対するカスタムＦＡＭ色素ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセット（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）を使用するデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）ｑＰＣＲ解析によって解析した。これらのアッセイの前に、ＩＤＴのＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔオンラインツール（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ）を使用して、標的当たりいくつかのＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを設計し、その後試験して最も優れた性能のものを選択し、その配列を以下の表に示す。ｅＧＦＰについて、私たちは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの確証されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ＦＡＭ）（４３３１１８２、アッセイＩＤ Ｍｒ０４０９７２２９＿ｍｒ）を使用した。
パッケージング細胞ペレットから、Ｑｉａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）からの、それぞれ、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＴｉｓｓｕｅおよびＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキットを使用して、推奨されるプロトコールに従って、全ＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。ＤＮＡ送達のために、抽出された全ＤＮＡを、その後、別々の反応において、十分な参照材料を使用するコピー数標準曲線を伴う、レンチウイルス標的配列に対するカスタムＴａｑＭａｎプライマー／プローブセット（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ ｑＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるシングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）ｑＰＣＲ解析；およびトランスフェクション中の細胞当たりの送達されるＤＮＡベクターコピーの数を評価するための、野生型ＨＥＫ２９３ＦゲノムＤＮＡ標準曲線を伴う、ＲＮＡｓｅＰ ＴａｑＭａｎコピー数参照アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析した。遺伝子発現解析のために、１μｇのＲＮＡを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｃＤＮＡを合成した。その後、ｃＤＮＡを、生成される転写物の正規化された数を評価するための十分な参照材料を使用するコピー数標準曲線を伴う、レンチウイルス標的配列および遺伝子発現ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ／１８ＳいずれかのＶＩＣ色素内因性対照（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対するカスタムＦＡＭ色素ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセット（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）を使用するデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）ｑＰＣＲ解析によって解析した。これらのアッセイの前に、ＩＤＴのＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔオンラインツール（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ）を使用して、標的当たりいくつかのＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを設計し、その後試験して最も優れた性能のものを選択し、その配列を以下の表に示す。ｅＧＦＰについて、私たちは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの確証されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ＦＡＭ）（４３３１１８２、アッセイＩＤ Ｍｒ０４０９７２２９＿ｍｒ）を使用した。
【0144】
【表2】
【0145】
レンチウイルス試料解析：全タイター、感染タイターおよびゲノムタイター
希釈されたレンチウイルス上清からの全タイター（１ｍＬ当たりのレンチウイルス粒子、ＬＰ／ｍＬ）を評価するために、レンチウイルス関連ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＶＰＫ－１０７－５）を製造業者によって提供される使用説明書に従って使用した。
希釈されたレンチウイルス上清からの全タイター（１ｍＬ当たりのレンチウイルス粒子、ＬＰ／ｍＬ）を評価するために、レンチウイルス関連ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＶＰＫ－１０７－５）を製造業者によって提供される使用説明書に従って使用した。
【0146】
感染タイター（１ｍＬ当たりの形質導入ユニット、ＴＵ／ｍＬ）を測定するために、接着性ＨＥＫ２９３Ｔ（Ｌｅｎｔｉ－ＸＴＭ ２９３Ｔ、Ｔａｋａｒａ、６３２１８０）を培養し、６ウェルプレート中に前日に播種し、感染の日に、１２μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３４２２０）を伴ってレンチウイルス上清の様々な希釈物に曝露した。プレートを９００×ｇにおいて室温にて３０分間遠心分離し、その後、３７℃および５％ＣＯ２において７２時間インキュベートした。感染の７２時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、細胞のｅＧＦＰ発現をＣｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって解析した。５～２５％のｅＧＦＰ陽性細胞を与える上清希釈物を使用して、以下の式を用いて感染タイター（ＴＵ／ｍＬ）を計算した：ＴＵ／ｍＬ＝（ＦｘＣ／Ｖ）ｘＤ（式中、Ｆ＝ＧＦＰ＋細胞の頻度（％ＧＦＰ＋細胞／１００）、Ｃ＝形質導入のために播種された、１ウェル当たりの細胞数、Ｖ＝接種体積（ｍＬ）（０．１ｍＬ）およびＤ＝レンチウイルス希釈因子）。
【0147】
ＣＡＲ１９ｈＣＤ２８ｚ ＬＶＶの感染タイターを測定するために、感染の日に、２４ウェルプレートの１ウェル当たりＴＨＰ－１細胞５×１０５個を播種した。細胞に、８μｇ／ｍＬのポリブレンを含有する媒体中のＬＶＶ上清の連続希釈物を感染させ、１０００×ｇにおいて室温にて１時間遠心分離した。感染４８時間後、上記の通り、細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートした抗マウスＦ（ａｂ’）２断片ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析して、ＣＡＲ１９ｈ２８ｚ発現を決定した。感染タイターを上記に説明される通りに計算した。
【0148】
レンチウイルス上清のゲノムＲＮＡ抽出および後のｑＲＴ－ＰＣＲによるレンチウイルスゲノムコピー定量を必要とするＴａｋａｒａのＬｅｎｔｉ－Ｘ ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（６３１２３５）を使用して、ゲノムタイター（１ｍＬ当たりのゲノム粒子、ＧＰ／ｍＬ）を計算した。
【0149】
ｑＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現解析
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１３４）を使用して動物細胞についての製造業者のプロトコールに従って、レンチウイルス回収中に収集した細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１７５２０５０）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３７６６００）において、導入遺伝子構築物のｄｂＤＮＡから作成したコピー数標準曲線（１０８～１０２コピー／ウェル）を、回収試料からの希釈したｃＤＮＡと並べて実行した。全長ゲノムＲＮＡ（ＬＴＲ－Ｐセット：オリゴＭＨ５３１－５’ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴ３’（配列番号１４）およびＭＨ５３２－５’ＧＡＧＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣ３’（配列番号１５）、ならびに蛍光プローブＬＲＴ－Ｐ（５’ＦＡＭ－ＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡ－ＢＨＱ ３’（配列番号１３）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または導入遺伝子からの全ＲＮＡのためのＦＡＭ色素プライマー／プローブセット（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ，ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５１３７０、アッセイＩＤ Ｍｒ０４０９７２２９＿ｍｒ）、ならびに真核生物１８Ｓ ｒＲＮＡ内因性対照に対するＶＩＣ色素プライマー／プローブセット（ＶＩＣ／ＭＧＢプローブ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３１９４１３Ｅ）により二本鎖化することによって、Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４４４５５６）を使用してｑＰＣＲランを行った。内因性対照を試料の正規化のために使用し、転写物コピー数をコピー数標準曲線から各試料について計算した。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１３４）を使用して動物細胞についての製造業者のプロトコールに従って、レンチウイルス回収中に収集した細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＲＴ－ＰＣＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１７５２０５０）を使用してｃＤＮＡ合成を行った。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３７６６００）において、導入遺伝子構築物のｄｂＤＮＡから作成したコピー数標準曲線（１０８～１０２コピー／ウェル）を、回収試料からの希釈したｃＤＮＡと並べて実行した。全長ゲノムＲＮＡ（ＬＴＲ－Ｐセット：オリゴＭＨ５３１－５’ＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴ３’（配列番号１４）およびＭＨ５３２－５’ＧＡＧＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣ３’（配列番号１５）、ならびに蛍光プローブＬＲＴ－Ｐ（５’ＦＡＭ－ＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡ－ＢＨＱ ３’（配列番号１３）；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または導入遺伝子からの全ＲＮＡのためのＦＡＭ色素プライマー／プローブセット（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ，ＦＡＭ ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５１３７０、アッセイＩＤ Ｍｒ０４０９７２２９＿ｍｒ）、ならびに真核生物１８Ｓ ｒＲＮＡ内因性対照に対するＶＩＣ色素プライマー／プローブセット（ＶＩＣ／ＭＧＢプローブ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３１９４１３Ｅ）により二本鎖化することによって、Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４４４５５６）を使用してｑＰＣＲランを行った。内因性対照を試料の正規化のために使用し、転写物コピー数をコピー数標準曲線から各試料について計算した。
【実施例1】
【0150】
結果
先行技術の構築物
図１Ａは、標準のＥＦ１α－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ移行ベクターおよびレンチウイルスパッケージング構築物によるトランスフェクションの７２時間後の生産性細胞における遺伝子発現を示す。細胞から抽出したＲＮＡを、プローブＬＴＲ－ＰおよびｅＧＦＰを使用するＲＴ－ｑＰＣＲにかけて、それぞれ、全長ゲノムＲＮＡ転写物および全ＲＮＡ転写物を定量した。閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））構築物からの移行ベクター遺伝子発現は、対応するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）についての遺伝子発現と同様であり、低い感染タイターは、不十分な移行ベクターＲＮＡの結果ではないことを実証した。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの独特な構造は、生産性細胞におけるトランスフェクションおよび発現を変更し、タイターに負の影響を及ぼすと考えられる。ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、トランスフェクションの７２時間後の生産性細胞におけるＤＮＡコピー数および転写物存在量を解析した。これは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、プラスミドと比較して各構築物の細胞当たり、３～４倍多いＤＮＡコピーを含有することを明らかにした（図１Ｂ）。
先行技術の構築物
図１Ａは、標準のＥＦ１α－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥ移行ベクターおよびレンチウイルスパッケージング構築物によるトランスフェクションの７２時間後の生産性細胞における遺伝子発現を示す。細胞から抽出したＲＮＡを、プローブＬＴＲ－ＰおよびｅＧＦＰを使用するＲＴ－ｑＰＣＲにかけて、それぞれ、全長ゲノムＲＮＡ転写物および全ＲＮＡ転写物を定量した。閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））構築物からの移行ベクター遺伝子発現は、対応するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）についての遺伝子発現と同様であり、低い感染タイターは、不十分な移行ベクターＲＮＡの結果ではないことを実証した。閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターの独特な構造は、生産性細胞におけるトランスフェクションおよび発現を変更し、タイターに負の影響を及ぼすと考えられる。ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、トランスフェクションの７２時間後の生産性細胞におけるＤＮＡコピー数および転写物存在量を解析した。これは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、プラスミドと比較して各構築物の細胞当たり、３～４倍多いＤＮＡコピーを含有することを明らかにした（図１Ｂ）。
【0151】
図２は、ポリ（Ａ）配列およびスペーサーを伴わない「標準」移行ベクターを使用する生産からのタイターを示す。全ウイルスタイター（ｐ２４）は、対応するプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）トランスフェクションと比較して、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）トランスフェクションについて５分の１であった。しかしながら、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）トランスフェクションについての感染性ウイルスタイターは、検出限界未満であり、この場合、感染性ウイルス粒子はほとんど生産されないことを実証した。記号解説：ＶＰ／ｍｌは、１ミリリットル当たりのウイルス粒子であり、ＴＵ／ｍｌは１ミリリットル当たりの形質導入ユニット（感染タイター）である。
【0152】
これらの結果に続いて、閉鎖型直鎖状ＤＮＡトランスフェクションについて条件を最適化する試みがなされ、これらの実験からの結果は、図３において見ることができる。閉鎖型直鎖状ＤＮＡトランスフェクションについての条件を最適化することは、全粒子タイター（ｐ２４）の完全な救済をもたらしたが、感染タイターは、プラスミドと比較して閉鎖型直鎖状ＤＮＡについて１００分の１のままであった。
【0153】
導入遺伝子ペイロードの量を増加させることは感染タイターを増加させ得るかどうかを見るために、さらなる最適化の作業が行われた。図４Ａおよび４Ｂにおいて示される結果は、導入遺伝子を増加させることは感染タイターを救済しないことを示す。ゲノムタイターアッセイからの結果（図４Ｂ）は、粒子へのウイルスゲノムのパッケージングはｐＤＮＡと比較して閉鎖型直鎖状ＤＮＡについて非効率的であること、および移行ベクターの量を増加させることはこの状況を改善しないことを示唆する。
【0154】
新規アーキテクチャ
図５において示される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡアーキテクチャを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。図６（Ａ～Ｃ）は、様々な構築物の全粒子タイター、感染タイターおよびゲノムタイターに対する効果を示す。ＡｖｒＩＩ制限酵素消化を使用して３’ＬＴＲの下流を切断することは、タイターを改善せず、リードスルー干渉はないことを示唆する。しかしながら、ＳＶ４０ｐ（Ａ）の付加は、ｐＤＮＡおよび閉鎖型直鎖状ＤＮＡレンチウイルスベクタータイターの両方を改善する。
図５において示される新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡアーキテクチャを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。図６（Ａ～Ｃ）は、様々な構築物の全粒子タイター、感染タイターおよびゲノムタイターに対する効果を示す。ＡｖｒＩＩ制限酵素消化を使用して３’ＬＴＲの下流を切断することは、タイターを改善せず、リードスルー干渉はないことを示唆する。しかしながら、ＳＶ４０ｐ（Ａ）の付加は、ｐＤＮＡおよび閉鎖型直鎖状ＤＮＡレンチウイルスベクタータイターの両方を改善する。
【0155】
図７（Ａ～Ｃ）は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構築物へスペーサーを付加すること（Ｆ領域停止配列（ＦＴＳ）または１ｋｂのスペーサー（ＲＳ１）のいずれか）は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）単独からの感染タイターおよびゲノムタイターの両方をさらに改善するという結果を示す。見られ得るように、この効果は、閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターにおいてのみ見られ、プラスミドでは見られない。また、効果は、スペーサーの配列に依存しないことが明らかである。
【0156】
図８は、ｐＤＮＡと比較した場合の感染タイターに関する閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターについてのルーチントランスフェクション条件のさらなる最適化を示し、これはプラスミドと比較して２分の１だけ低い感染タイターをもたらした。
【実施例2】
【0157】
５’スペーサー配列
新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡアーキテクチャを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。図１０Ａは、３’ＳＶ４０ポリ（Ａ）および３’スペーサー（ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１）に加えて、ＣＭＶ／５’ＬＴＲの上流に１ｋｂのランダムスペーサー配列（ＲＳ１）を付加すると、ＳＶ４０ポリ（Ａ）および３’スペーサー配列からの感染タイターおよびゲノムタイターの両方をさらに改善するという結果を示す。５’スペーサー配列の付加は、感染タイターにおけるさらなる２倍の改善をもたらした。
新規閉鎖型直鎖状ＤＮＡアーキテクチャを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。図１０Ａは、３’ＳＶ４０ポリ（Ａ）および３’スペーサー（ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１）に加えて、ＣＭＶ／５’ＬＴＲの上流に１ｋｂのランダムスペーサー配列（ＲＳ１）を付加すると、ＳＶ４０ポリ（Ａ）および３’スペーサー配列からの感染タイターおよびゲノムタイターの両方をさらに改善するという結果を示す。５’スペーサー配列の付加は、感染タイターにおけるさらなる２倍の改善をもたらした。
【0158】
最適化閉鎖型直鎖状生産ベクター
閉鎖型直鎖状生産ベクターを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。各生産構築物が当量の付属＋３’ＲＳ１ｋｂについて個々にまたは群で交換される生産を行った。図１１Ａは、閉鎖型直鎖状生産ベクターにおいて３’スペーサー配列を含むと、感染タイターを改善するという結果を示す。ＧａｇＰｏｌまたはＶＳＶｇのいずれかへのＲＳ１ｋｂの付加は、感染性を実質的に改善した。ＧａｇＰｏｌ－ＲＳ１ｋｂおよびＲｅｖ－ＲＳ１ｋｂの組合せは、最も高いタイターを産出した。
閉鎖型直鎖状生産ベクターを構築し（上記）、トランスフェクション実験において試験した（上記）。各生産構築物が当量の付属＋３’ＲＳ１ｋｂについて個々にまたは群で交換される生産を行った。図１１Ａは、閉鎖型直鎖状生産ベクターにおいて３’スペーサー配列を含むと、感染タイターを改善するという結果を示す。ＧａｇＰｏｌまたはＶＳＶｇのいずれかへのＲＳ１ｋｂの付加は、感染性を実質的に改善した。ＧａｇＰｏｌ－ＲＳ１ｋｂおよびＲｅｖ－ＲＳ１ｋｂの組合せは、最も高いタイターを産出した。
【実施例3】
【0159】
構築物比の最適化
新規移行ベクターアーキテクチャ（ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１）に関する４つのＤＮＡ構築物ｅＧＦＰペイロード、ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶｇについての構築物比のハイスループット最適化を、０．７μｇ／ｍＬの全入力移行ベクターを使用して行った。移行ベクターおよびＲｅｖが増加されるいくつかの条件は、４：３：３：４の私たちの以前の条件に優る、感染タイターにおける顕著な改善を産出した。特に、３：１：２：１の比を使用して、最大で１．４×１０６ＴＵ／ｍＬのタイターが達成された（図１０Ｂ）。
新規移行ベクターアーキテクチャ（ＬＶ－ＲＳ１－ｅＧＦＰ－ｐＡ－ＲＳ１）に関する４つのＤＮＡ構築物ｅＧＦＰペイロード、ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶｇについての構築物比のハイスループット最適化を、０．７μｇ／ｍＬの全入力移行ベクターを使用して行った。移行ベクターおよびＲｅｖが増加されるいくつかの条件は、４：３：３：４の私たちの以前の条件に優る、感染タイターにおける顕著な改善を産出した。特に、３：１：２：１の比を使用して、最大で１．４×１０６ＴＵ／ｍＬのタイターが達成された（図１０Ｂ）。
【実施例4】
【0160】
ＣＡＲ１９ｈ２８ｚレンチウイルス粒子
下流のＳＶ４０ ＬｐＡおよびフランキングＲＳ１ｋｂを含む、ＣＡＲ１９ｈ２８ｚを発現するレンチウイルス粒子（ＬＶ－ＲＳ１ｋｂ－１９２８ｚ－ＬｐＡ－ＲＳ１ｋｂ）を生成した。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞に、ＬＶ－ＲＳ１ｋｂ－１９２８ｚ－ＬｐＡ－ＲＳ１ｋｂ、ＧａｇＰｏｌ－ＲＳ１ｋｂ、Ｒｅｖ－ＲＳ１ｋｂおよびＶＳＶｇを、ｄｂＤＮＡ（０．７μｇ／ｍＬ ＤＮＡ；１：３ ＤＮＡ：ＰＥＩ）について４：１：２：１のモル比、およびプラスミド（１μｇ／ｍＬ ＤＮＡ；１：２ ＤＮＡ：ＰＥＩ）について２：１：１：１の質量比において同時トランスフェクトし、形質導入したＴＨＰ１細胞のＣＤ１９ ＦＡＣＳによる感染タイター解析のために上清を７２時間後に回収した。図１０Ｂにおいて示される通り、完全に最適化された１揃いの構築物および最適化されたトランスフェクション条件を使用すると、ＬＶＰ ＣＡＲ１９２８ｚについての感染タイターは、プラスミドを出発材料として使用しても、ｄｂＤＮＡを使用しても当量であった。合わせると、これらのデータは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡが、高タイターＬＶの製造のために、プラスミドの代替出発材料として使用され得ることを実証する。
下流のＳＶ４０ ＬｐＡおよびフランキングＲＳ１ｋｂを含む、ＣＡＲ１９ｈ２８ｚを発現するレンチウイルス粒子（ＬＶ－ＲＳ１ｋｂ－１９２８ｚ－ＬｐＡ－ＲＳ１ｋｂ）を生成した。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞に、ＬＶ－ＲＳ１ｋｂ－１９２８ｚ－ＬｐＡ－ＲＳ１ｋｂ、ＧａｇＰｏｌ－ＲＳ１ｋｂ、Ｒｅｖ－ＲＳ１ｋｂおよびＶＳＶｇを、ｄｂＤＮＡ（０．７μｇ／ｍＬ ＤＮＡ；１：３ ＤＮＡ：ＰＥＩ）について４：１：２：１のモル比、およびプラスミド（１μｇ／ｍＬ ＤＮＡ；１：２ ＤＮＡ：ＰＥＩ）について２：１：１：１の質量比において同時トランスフェクトし、形質導入したＴＨＰ１細胞のＣＤ１９ ＦＡＣＳによる感染タイター解析のために上清を７２時間後に回収した。図１０Ｂにおいて示される通り、完全に最適化された１揃いの構築物および最適化されたトランスフェクション条件を使用すると、ＬＶＰ ＣＡＲ１９２８ｚについての感染タイターは、プラスミドを出発材料として使用しても、ｄｂＤＮＡを使用しても当量であった。合わせると、これらのデータは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡが、高タイターＬＶの製造のために、プラスミドの代替出発材料として使用され得ることを実証する。
【実施例5】
【0161】
全ベクター入力および構築物比の最適化は全粒子タイターを救済する
本実施例は、標準の先行技術閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構築物を使用した。しかしながら、また、改善された構築物において有益な効果が実証される（実施例３および４）。
本実施例は、標準の先行技術閉鎖型直鎖状ＤＮＡ構築物を使用した。しかしながら、また、改善された構築物において有益な効果が実証される（実施例３および４）。
【0162】
閉鎖型直鎖状ＤＮＡ発現プロファイルにおいて観察された差は、トランスフェクション条件および構築物比は、産業標準（プラスミド）と同等のタイターを達成するためにさらに最適化される必要があることを示した。構築物比２：１：１：１を使用して、細胞に０．５、０．７５または１．０μｇ／ｍＬの閉鎖型直鎖状ＤＮＡベクターをトランスフェクトすることによって、全ＤＮＡ入力を評価した。試料をトランスフェクションの７２時間後に回収し、トランスフェクション効率および全ｐ２４タイターを解析した。全ＤＮＡが低減されるにつれ、全粒子タイターにおける明確な用量依存的増加が観察された（図２Ｂ、最も低い全入力ＤＮＡを使用して全粒子タイターにおける６倍増加を実証する）。
【0163】
低い感染性粒子タイターは移行ベクターの増加により改善されない
高粒子タイターを産出した条件を特定して、閉鎖型直鎖状由来粒子の感染性をプラスミドと比較した。標準のプラスミド条件（２：１：１：１；１μｇ／ｍＬ）と、プラスミドとモル当量ならびに０．５：１：３：１および０．５：３：３：１の２つの最適化比条件を使用する閉鎖型直鎖状ベクター（０．５μｇ／ｍＬ）との間で、比較研究を行った。これは、最適化閉鎖型直鎖状比条件を使用する全粒子タイターがプラスミドと同等であり、再現性があることを確認したが、しかしながら、感染タイターはおよそ１００分の１であることが分かった（図３）。低い感染タイターは、レンチウイルスゲノムＲＮＡ（ｖｇＲＮＡ）の低い存在量と相関し、粒子は不十分な移行ベクターのために空であり得ることを示唆した。このことは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ由来ＬＶの低い感染性は、低いパッケージング効率に関連するという仮説を支持する。
高粒子タイターを産出した条件を特定して、閉鎖型直鎖状由来粒子の感染性をプラスミドと比較した。標準のプラスミド条件（２：１：１：１；１μｇ／ｍＬ）と、プラスミドとモル当量ならびに０．５：１：３：１および０．５：３：３：１の２つの最適化比条件を使用する閉鎖型直鎖状ベクター（０．５μｇ／ｍＬ）との間で、比較研究を行った。これは、最適化閉鎖型直鎖状比条件を使用する全粒子タイターがプラスミドと同等であり、再現性があることを確認したが、しかしながら、感染タイターはおよそ１００分の１であることが分かった（図３）。低い感染タイターは、レンチウイルスゲノムＲＮＡ（ｖｇＲＮＡ）の低い存在量と相関し、粒子は不十分な移行ベクターのために空であり得ることを示唆した。このことは、閉鎖型直鎖状ＤＮＡ由来ＬＶの低い感染性は、低いパッケージング効率に関連するという仮説を支持する。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【配列表】
【国際調査報告】