特表 2024-520827 イネの光合成効率を高めるための遺伝子の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】イネの光合成効率を高めるための遺伝子の使用

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/46 20180101AFI20240517BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20240517BHJP

【ＦＩ】

A01H6/46 ZNA

C12N15/29

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575998

(86)(22)【出願日】2022-04-15

(85)【翻訳文提出日】2023-12-08

(86)【国際出願番号】 CN2022087090

(87)【国際公開番号】W WO2022257601

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】202110635526.7

(32)【優先日】2021-06-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520465253

【氏名又は名称】浙江師範大学

【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８８ Ｙｉｎｇｂｉｎ Ｒｏａｄ， Ｗｕｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｊｉｎｈｕａ， Ｚｅｊｉａｎｇ ３２１００４ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100205936

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 海龍

(74)【代理人】

【識別番号】100132805

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 貴之

(72)【発明者】

【氏名】陳 析豊

(72)【発明者】

【氏名】許 以霊

(72)【発明者】

【氏名】陸 ▲てつ▼暁

(72)【発明者】

【氏名】馬 季栄

(72)【発明者】

【氏名】馬 伯軍

(57)【要約】

本発明は、イネの光合成効率を高める遺伝子およびその利用方法に関するものであり、作物の遺伝育種の分野に属する。本発明は、イネの光合成効率を改善するための遺伝子の使用、すなわちイネにおいてＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子を過剰発現させることによってイネの葉の光合成効率を高めて収量を増加させることを開示しており、高収量イネ育種における潜在的な応用価値を有する。Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子塩基配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すものである。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

イネにおいてＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子を過剰発現させることによりイネの葉の光合成効率を増加させ、ここで、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すものである、イネの光合成効率を高めるための遺伝子の使用。

【請求項2】

Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターでイネを形質転換し、遺伝子組み換えイネを取得することにより、イネの葉の光合成効率を高め、ここで、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示すものである、イネの葉の光合成を高めるための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イネの光合成効率を高める遺伝子およびその使用方法に関するものであり、作物の遺伝育種の分野に属する。

【背景技術】

【0002】

米は重要な食用作物であり、高収量育種は中国の食料安全保障と持続可能な農業の発展を確実にする効果的な保証となる。イネの出穂後、機能葉（止葉、上から２番目の葉、上から３番目の葉）における光合成化合物の蓄積効率と、光効率の高い期間の持続性が穀物の収量に決定的な役割を果たす。研究によると、米粒の登熟に必要な栄養素の６０％から８０％は、出穂後の機能葉の光合成によって得られる。光合成は、可視光の照射下で葉緑体のクロロフィル（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）を利用して二酸化炭素と水を有機物に変換する。研究では、クロロフィル含有量が特定の範囲内で光合成速度と正の相関があることが示されている（Ｓａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ，１９９８）。葉の老化時には、クロロフィルの分解により光合成速度が低下するが、葉が比較的高いクロロフィル含量を長期間維持できれば、より多くの光エネルギーを吸収し、それによって生物量の合成が促進される可能性がある（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１６）。例えば、イネＳＮＵ－ＳＧ１の自然変異は、クロロフィル含有量、光合成速度、光変換効率を大幅に増加させることができ、登熟期の乾物収量を増加させてイネの収量を増加させることができる（Ｆｕ ｅｔ ａｌ，２００８； ２０１１）。イネの濃い緑色のＧｃ変異体の葉のクロロフィルｂ含有量と光合成速度は、生育期間を通じて大幅に増加し、植物のバイオマスと穀粒収量がそれぞれ１７％と１６％増加させた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００８）。イネＯｓＮＡＰの遺伝子はＮＡＣ転写活性化因子をコードしており、ＯｓＮＡＰはクロロフィル分解、老化、栄養素輸送の制御に関連する遺伝子を直接標的にし、葉の老化を正に制御する。ＯｓＮＡＰ遺伝子の発現を抑制する遺伝子組換えイネ葉のクロロフィル含有量が相対的に増加し、老化が遅延し、穀粒収量が６．３～１０．３％増加する。植物の光合成効率の高い新規遺伝子を徹底的に探索し、作物における光エネルギーの効率的な利用を促進することが、イネの収量を増やす有効な手段の一つであることがわかる。

【0003】

Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の配列はイネデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｄａｔａ．ｃｎ／ｇｅｎｅ／）で公開されているが、この遺伝子の機能は報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明が解決しようとする技術的課題は、イネの光合成効率をいかに効果的に向上させるかである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記の技術的課題を解決するために、本発明は、イネの光合成を効果的に向上させることができる遺伝子およびその使用方法、すなわち、イネにおいてＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子を過剰発現させることにより、イネの葉の光合成効率を効果的に増加させることができる。この遺伝子のヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １に示す。

【0006】

本発明はまた、イネの葉の光合成を改善する方法、すなわち、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターをイネ（日本晴）に形質転換して、遺伝子組換えイネを取得し、それによってイネの葉の光合成効率を高める方法を提供する。

【0007】

本発明は、イネｃＤＮＡからＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ： １）をＰＣＲ増幅し、同遺伝子の過剰発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム媒介形質転換法を用いて野生型イネ品種日本晴に遺伝形質転換し、二つの過剰発現株ＯＥ１およびＯＥ２が同定され、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、これら二つの株におけるＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の発現レベルが野生型対照日本晴の発現レベルよりも有意に高いことを証明した（図１）。これら二つの過剰発現系統の葉のクロロフィル含量（図２）と光合成効率（図３）は、野生型対照日本晴よりも有意に高く、イネのＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の発現レベルを増加させると、光合成が効果的に改善できることが示され、それによって収量が増加し、高収量イネの育種に潜在的な応用価値を有する。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子が光合成効率を促進する効果を有することを初めて開示した。

【図面の簡単な説明】

【0009】

以下の図１～３において、ＷＴは野生型対照日本晴であり、ＯＥ１およびＯＥ２はそれぞれＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の二つの過剰発現株である。＊＊は、ｔ検定における非常に有意差（Ｐ＜０．０１）を示す。

【図1】イネＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の発現量解析を示す。

【図2】イネＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現系統とその野生型対照の葉の光合成色素含有量を示す。

【図3】イネＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現系統とその野生型対照の葉の光合成効率を示す。

【図4】Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターの図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図面を参照しながら、本発明の具体的な実施形態について、さらに詳細に説明する。

【0011】

（ステップ１． イネの全ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成）
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を製品説明書に従って使用して、野生型イネ品種日本晴の葉から全ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ^ＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （ＴａＫａＲａ）を製品説明書に従って使用してｃＤＮＡに逆転写する。

【0012】

（ステップ２． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子のＰＣＲ増幅）
上流および下流のＰＣＲプライマーを合成する。
Ｆ１： ５’－ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｃｃＡＴＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴ－３’；
Ｒ１： ５’－ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃＣＴＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＣＣ－３’。
このうち、大文字の配列はＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の特異的な配列であり、これを増幅することで遺伝子の全長コード領域配列を得ることができ、小文字の配列は、Ｇａｔｅｗａｙ技術を使用して構築されたエントリー ベクターのアダプター配列である。

【0013】

ステップ１で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ）を用いてＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子をＰＣＲ増幅する。反応系の構成は製品の説明書に従って操作される。具体的には、次のとおりである。１０μｌ ５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ、 ４μｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、２μｌ上流および下流Ｆ１およびＲ１プライマー（各１０μＭ）、１μｌ テンプレートｃＤＮＡ（＜２００ｎｇ）、０．５μｌ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、そして、ｄｄＨ_２Ｏを加えて５０μｌにする。

【0014】

ＰＣＲ増幅プログラムは、９５℃で５分間の前変性、９８℃で１０秒間の変性、６５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の伸長、３０サイクル繰り返し、そして、７２℃で５分間の伸長である。反応終了後、ＰＣＲ産物を２μｌ採取し、１％アガロースゲル電気泳動により検出する。

【0015】

（ステップ３． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターの構築（図４））
（１）ＡｘｙＰｒｅｐ ＰＣＲ クリンナップキット（Ａｘｙｇｅｎ）を使用して、ステップ２で得られたＰＣＲ産物を精製する。製品の説明書に従って、精製された目的断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を取得する。

【0016】

（２）ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙ^ＴＭ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^ＴＭ ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘキットを使用して、精製された目的断片をエントリー ベクター上に構築する。反応系は次のとおりである： １μｌ精製ＰＣＲ産物（５０～８０ｎｇ／μｌ）、１μｌエントリー ベクター プラスミド ｐＤＯＮＲ／Ｚｅｏ（１００－１５０ｎｇ／μｌ）、０．５μｌ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ^ＴＭ ＩＩ酵素； ２５℃で１時間インキュベートした後、従来のヒートショック法を用いて大腸菌ＤＨ５αを１時間かけて形質転換する。

【0017】

（３）複数のクローンコロニーを採取し、３７℃、２２０ｒｐｍのシェーカーで一晩培養する。菌液のＰＣＲ検証には２×Ｔａｑ ＰＣＲプレミックス試薬（Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用する。ＰＣＲ増幅用のプライマーの配列は次のとおりである。
Ｆ２： ５’－ＡＴＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴ－３’；
Ｒ２： ５’－ＣＴＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＣＣ－３’。

【0018】

ＰＣＲ反応系は菌液１μｌ、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘＩＩ １０μｌ、Ｆ２＋Ｒ２プライマー（各１０μＭ） １μｌ、ｄｄＨ_２Ｏ加えて２０μｌとする。ＰＣＲ増幅プログラムは、９４℃で５分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長の３５サイクル、そして７２℃で５分間の伸長である。反応後、反応生成物を５μｌ採取し、１％アガロースゲル電気泳動により検出し、陽性クローンを同定する。

【0019】

（４）陽性クローン液については、Ｒａｐｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ （Ｔｉａｎｇｅｎ）を用いてプラスミドを抽出し、目的断片を含むエントリー ベクター プラスミドを取得する。このプラスミド（１００～１５０ｎｇ／μｌを１μｌ取り、ｐＣＡＭＢＩＡ２３００－Ａｃｔｉｎ最終ベクター プラスミド（約１００～１５０ｎｇ／μｌ）１μｌおよびＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ酵素０．５μｌを加え、２５℃で１時間インキュベートした後、従来のヒートショック法を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。

【0020】

（５）複数のクローンコロニーを採取し、３７℃、２２０ｒｐｍのシェーカーで一晩培養する。菌液のＰＣＲ検証には２×Ｔａｑ ＰＣＲプレミックス試薬（Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用する。陽性クローンの同定方法は上記（３）と同様である。

【0021】

（６）陽性クローン（即ち、ＰＣＲによって目的断片を増幅できるコロニー）の場合、Ｒａｐｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ （Ｔｉａｎｇｅｎ）を使用してプラスミドを抽出し、それをバイオテクノロジー会社に送って配列を測定する。プライマーＦ３： ５’－ＣＣＣＴＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＴＣＧ－３’およびＲ３： ５’－ＴＡＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＡＴＡＴＣＴＣＡ－３’を使用して双方向シーケンシングを実行し、挿入された断片の配列を特定し、最終的にＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の過剰発現ベクターを取得する（図４）。すなわち、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0022】

（ステップ４． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターによるイネの遺伝子形質転換）
ステップ３で構築したＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現ベクターを使用して、西村らの方法（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ、２００６）を使用して野生型イネ品種日本晴を形質転換し、遺伝子組換えイネ植物を取得する。

【0023】

（ステップ５． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現遺伝子組換え植物の同定）
ステップ１の方法に従って、ステップ４で得られた形質転換植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の発現レベルは、従来のＲＴ－ｑＰＣＲ法を使用して測定する。

【0024】

Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子特異的プライマーＦ４： ５’－ＡＴＧＣＣＣＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣＴＧＡ－３’およびＲ４： ５’－ＡＴＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＴＴＡＣＣＡＣＣＧ－３’を使用する。イネのアクチン遺伝子を内部参照として使用し、ＰＣＲプライマーはＦ５： ５’－ＴＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣ－３’、Ｒ５： ５’－ＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡ－３’であった（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｉｃｅ，２０１３）。ＴａＫａＲａ社のＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ^ＴＭ ＩＩキットを使用し、反応系は次のとおりである。１０μｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標） ＩＩ、２μｌ ｃＤＮＡテンプレート、１μｌ上流および下流のＦ４およびＲ４プライマー（各１０μＭ）、０．４μｌ ＲＯＸ参照色素、ｄｄＨ_２Ｏを加えて２０μｌにする。ＰＣＲプログラムは、９５℃で３０秒間の前変性、９５℃で５秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリングおよび伸長、４０サイクルである。各サンプルを３回繰り返し、２^{－ΔΔＣＴ}法（Ｌｉｖａｋ ｅｔ ａｌ．，２００１）を使用してデータを処理し、ｔ検定法を使用して有意差を分析する。形質転換イネでは、ＯＥ１系統とＯＥ２系統の２系統でＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の発現量が野生型日本晴に比べてそれぞれ２０倍、１５倍高いことが分かった（図１）。このようにして、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子の過剰発現植物が得られる。

【0025】

（ステップ６． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現植物の葉における光合成色素含有量の測定）
ステップ５で同定したＯｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現株ＯＥ１、ＯＥ２と野生型日本晴を水田に植え、各稲を３０ｃｍ×１５ｃｍの間隔で植えた。イネの分げつ段階で、各品種からランダムに６本を選び、各植物から十分に展開した止葉を取り出し、主葉脈を取り除いて細かく切り、０．１ｇ秤量し、８０％（ｖ／ｗ）３ｍｌアセトンに浸、暗所で２８°Ｃで４８時間抽出する。クロロフィルａ（Ｃｈｌａ）、クロロフィルｂ（Ｃｈｌｂ）およびカロテノイド（Ｃａｒ）の含有量は、Ａｍｏｎ（１９４９）の方法に従って測定する。有意差は、ｔ検定法を使用して分析される。その結果、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子発現株ＯＥ１、ＯＥ２のクロロフィルａ、クロロフィルｂ、カロテノイド含有量は野生型日本晴に比べて高いことが示される（図２）。

【0026】

（ステップ７． Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現植物の葉の光合成効率の測定）
ステップ６の方法に従って植え付ける。イネの分げつ段階で、各品種からンダムに６本を選び、Ｌｉ－６４００（Ｌｉ－ＣＯＲ、米国）光合成メーターを用いて、止葉の光合成効率パラメータ：正味光合成速度、細胞間ＣＯ_２濃度、気孔コンダクタンス、蒸散速度を測定する。測定方法は、機器の一般的な使用説明書に従うものとする。有意差は、ｔ検定法を使用して分析する。その結果、Ｏｓ０７ｇ０１０１４００遺伝子過剰発現株ＯＥ１およびＯＥ２の正味の光合成速度、細胞間ＣＯ_２濃度、気孔コンダクタンスおよび蒸散速度は、野生型日本晴よりも有意に高いことが示される（図３）。
最後に、上に列挙したのは、本発明のいくつかの特定の実施形態にすぎないことにも留意されたい。本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能であることは言うまでもない。当業者が本発明の開示から直接導出または連想できるすべての変更は、本発明の保護範囲内にあるとみなされるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024520827000001.xml

【国際調査報告】