特表 2024-520831 新規なＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】新規なＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240517BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240517BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240517BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240517BHJP

   C12P 13/06 20060101ALI20240517BHJP

   C12P 13/12 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12N15/09 Z ZNA

C12N15/31

C12P1/04 Z

C12P13/06 D

C12P13/12 B

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023576022

(86)(22)【出願日】2021-09-06

(85)【翻訳文提出日】2023-12-08

(86)【国際出願番号】 KR2021011995

(87)【国際公開番号】W WO2022260215

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】10-2021-0075859

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】シム、ヒ－ジン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ヘ ミン

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ジン－グン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ジン ナム

(72)【発明者】

【氏名】チョン、フィ－ミン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE08

4B064AE14

4B064CA02

4B064CA19

4B064DA20

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA17

(57)【要約】

本出願は、新規なＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＭｄｔＨ変異体。

【請求項2】

前記他のアミノ酸は、イソロイシンである、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項3】

前記１２５番目の位置に対応するアミノ酸は、バリンである、請求項２に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項4】

前記変異体は、Ｏ－ホスホセリン排出活性を有する、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項5】

前記変異体は、前記配列番号１のアミノ酸配列において６０番目の位置に対応するアミノ酸がグルタミンまたはアルギニンである、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項6】

前記変異体は、前記配列番号１のアミノ酸配列において１８０番目の位置に対応するアミノ酸がフェニルアラニンまたはロイシンである、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項7】

前記変異体は、前記配列番号１のアミノ酸配列において３９８番目の位置に対応するアミノ酸がロイシンまたはプロリンである、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項8】

前記変異体は、前記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と８０％以上及び１００％未満の配列同一性を有する、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項9】

前記変異体は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドからなる、請求項１に記載のＭｄｔＨ変異体。

【請求項10】

請求項１に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項11】

配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えエシェリキア属微生物。

【請求項12】

前記組換え微生物は、さらにホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＳｅｒＢ）の活性が内在的活性に比べて弱化された、請求項１１に記載の微生物。

【請求項13】

配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ－ホスホセリンの生産方法。

【請求項14】

ａ）配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養してＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を生産する段階と；
ｂ）Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｌｉｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物及びａ）段階で生産されたＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階と；を含む、システインまたはその誘導体の生産方法。

【請求項15】

配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＭｄｔＨ変異体のＯＰＳ、システインまたはシステインの誘導体生産への使用。

【請求項16】

配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＭｄｔＨ変異体の、ＯＰＳを微生物から排出するための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、ＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びシステインの誘導体の生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－システインは、あらゆる生物体の硫黄代謝において重要なアミノ酸であり、毛髪のケラチンなど、生体内タンパク質、グルタチオン、ビオチン、メチオニン及びその他の硫黄を含有した代謝産物の合成に使用されるだけでなく、コエンザイムＡ生合成の前駆物質として使用される。

【0003】

微生物を用いてＬ－システインを生産する方法として１）微生物を用いてＤ，Ｌ－ＡＴＣ（Ｄ，Ｌ－２－ａｍｉｎｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を生物学的に転換する方法、２）大腸菌を利用したＬ－システインを生産する直接発酵方法（欧州登録特許ＥＰ０８８５９６２Ｂ；Ｗａｄａ Ｍ ａｎｄＴａｋａｇｉ Ｈ、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７３：４８－５４，２００６）、３）微生物を利用してＯ－ホスホセリン（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ、以下「ＯＰＳ」）を発酵生産した後、Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ、以下「ＯＰＳＳ」）の触媒の作用下に硫化物と反応させてＬ－システインに転換させる方法（欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１）が公知となっている。

【0004】

ただし、Ｌ－システインの需要増加により効果的なＬ－アミノ酸の生産方法に関する研究が依然として必要である。特に、前記３）方法で高収率のシステインを生産するためには、前駆体であるＯＰＳを過量生産しなければならない必要性が存在した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】欧州登録特許ＥＰ０８８５９６２Ｂ

【特許文献2】欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１

【特許文献3】米国公開特許ＵＳ ２０１２－０１９００８１

【特許文献4】米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２

【特許文献5】米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２

【特許文献6】米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２

【特許文献7】米国登録特許ＵＳ ９１２７３２４

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｗａｄａ Ｍ ａｎｄＴａｋａｇｉ Ｈ、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７３：４８－５４，２００６

【非特許文献2】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４

【非特許文献3】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７

【非特許文献4】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３

【非特許文献5】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４）

【非特許文献6】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）

【非特許文献7】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４

【非特許文献8】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／。］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３

【非特許文献9】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２

【非特許文献10】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）

【非特許文献11】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５

【非特許文献12】Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９

【非特許文献13】Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８

【非特許文献14】Ａｈｍｅｄ Ｚａｈｏｏｒ，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ ３，２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ

【非特許文献15】Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｖ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｊｕｎ；９（３）：２６８－７４

【非特許文献16】Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５ Ｎｏｖ；７ １（ ｌ ｌ）：７ １３９－４４．

【非特許文献17】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０，Ｖｏｌ． ２． １－１６

【非特許文献18】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２

【非特許文献19】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３

【非特許文献20】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ． １（１） １９８６

【非特許文献21】Ｍｉｎｏ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ、５５１：１３３－１３８，２００３

【非特許文献22】Ｂｕｍｓ Ｋ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、１２７：１１６０２－１１６０３，２００５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明者らは、高収率のシステインを生産するために、その前駆体であるＯＰＳを過量生産しようと鋭意努力した結果、新規なＭｄｔＨ変異体がＯＰＳ生産能を向上させることを確認することにより、本出願を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＭｄｔＨ変異体を提供することにある。

【0009】

本出願のもう一つの目的は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。

【0010】

本出願の他の一つの目的は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。

【0011】

本出願の他の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えエシェリキア属微生物を提供することにある。

【0012】

本出願の他の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ－ホスホセリンの生産方法を提供することにある。

【0013】

本出願の他の一つの目的は、ａ）配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養してＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を生産する段階と；ｂ）Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｌｉｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物及びａ）段階で生産されたＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階と；を含む、システインまたはその誘導体の生産方法を提供することにある。

【発明の効果】

【0014】

本出願の新規なＯＰＳ排出活性を有する変異型ポリペプチドを用いてＯＰＳ生産能を有する微生物を培養する場合、既存の非変形または変異体タンパク質を利用した場合に比べて高収率のＯＰＳ生産が可能である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本出願の範疇に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。

【0016】

本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換された、ＭｄｔＨ変異体である。

【0017】

一つの具現例として、前記他のアミノ酸は、イソロイシンであってもよい。

【0018】

本出願の変異体は、前記親配列である配列番号１で記載されたアミノ酸配列を基準として１２５番目の位置に対応するアミノ酸であるバリンがイソロイシンで置換され、前記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上または１００％未満の相同性または同一性を有する変異体であってもよい。例えば、本出願の変異体は、前記配列番号１で記載されたアミノ酸配列において配列番号１のアミノ酸配列を基準として１２５番目の位置に対応するアミノ酸はイソロイシンであり、前記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．７％以上または１００％未満の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を有するか、含むことができ、または前記アミノ酸配列からなるか、必須に構成されてもよい。また、そのような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。

【0019】

例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然に起こり得る突然変異、サイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。

【0020】

前記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。そのようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。通常、保存的置換はタンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさない。

【0021】

本出願において、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、特定のタンパク質の親配列において一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記親配列と配列は相異するが、前記特定のタンパク質の機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるタンパク質を指す。変異体は、数個のアミノ酸の置換、欠失または付加により識別される配列（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と異なる。このような変異体は、一般に、前記特定のタンパク質のアミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形されたタンパク質の特性を評価して識別することができる。即ち、変異体の能力は、原タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に比べて増加したり、変わらなかったり、または減少する。また、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）のような一つ以上の部分が除去された変異体を含むことができる。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体を含むことができる。前記用語「変異体」は、変異型、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現ではｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ｍｕｔａｎｔ，ｍｕｔｅｉｎ，ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ，ｖａｒｉａｎｔなど）が用いられ、変異された意味で用いられる用語であれば、これに制限されない。本出願の目的上、前記変異体は、天然の野生型または非変形タンパク質に比べて変異されたタンパク質の活性が増加したものであってもよいが、これに制限されない。

【0022】

また、変異体は、ポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、変異体のＮ末端には、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダー）配列がコンジュゲートすることができる。また、前記変異体は、確認、精製、または合成できるように他の配列またはリンカーとコンジュゲートすることができる。

【0023】

本出願において、「親配列（ｐａｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を導入して変異型ポリペプチドとなる基準配列を意味する。即ち、親配列は、開始配列（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として置換、挿入及び／又は欠失などの変異を導入する対象であってもよい。前記親配列は、天然型（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）あるいは野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）であってもよく、または前記天然型または野生型に一つ以上の置換、挿入または欠失が発生した変異体（ｖａｒｉａｎｔ）であるか、または人為的に合成された配列であってもよい。

【0024】

本出願において、用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準的な配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用することができる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全部または一部と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。

【0025】

任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／。］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。

【0026】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。

【0027】

本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。

【0028】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１と整列（ａｌｉｇｎ）させ、これに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）に比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。

【0029】

このような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）などを用いることができるが、これに制限されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

【0030】

本出願において、用語「ＭｄｔＨ」は、化学要求的勾配に反応して細胞膜を横切って小さい溶質の移動を容易にする膜輸送タンパク質のスーパーファミリーである主要促進剤スーパーファミリー（Ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ＭＦＳ）トランスポーターの一種であり、過量のＯＰＳが存在する条件の下で生育阻害が解除された大腸菌からＯＰＳ排出の活性を示すタンパク質として知られている。本出願において前記ＭｄｔＨは、Ｏ－ホスホセリン（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ，ＯＰＳ）の細胞外へ排出できる活性を有する膜タンパク質を意味する。前記ＭｄｔＨは、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。一例として、前記ＭｄｔＨは、ｍｄｔＨ遺伝子によりコードされるＯＰＳ排出活性を有するポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。

【0031】

本出願の変異体は、野生型ポリペプチドに比べてＯＰＳ排出能を増加させる活性を有することができる。

【0032】

本出願において、用語「Ｏ－ホスホセリン（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ、以下「ＯＰＳ」）」は、セリンのリン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ）エステルであり、種々のタンパク質の構成要素である。前記ＯＰＳはＬ－システインの前駆体であり、ＯＰＳスルフヒドリラーゼ（ＯＰＳ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）の触媒の作用下に硫化物と反応してシステインに転換され得るが、これに制限されない（米国公開特許ＵＳ ２０１２－０１９００８１）。

【0033】

本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において６０番目、１８０番目及び３９８番目の位置に対応するアミノ酸中、いずれか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸でさらに置換されたものであってもよい。一例として、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、さらに６０番、１８０番及び３９８番目の位置に対応するアミノ酸中、１個以上、２個以上または３個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたものであってもよいが、これに制限されない。

【0034】

具体的には、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からｉ）１２５番目の位置に対応するアミノ酸残基であるバリンがバリン以外の他のアミノ酸残基で置換されたり、これに対し、さらにｉｉ）６０番目の位置に対応するアミノ酸残基であるグルタミン、ｉｉｉ）１８０番目に対応する位置のアミノ酸残基であるフェニルアラニン、及び／又はｉｖ）３９８番目の位置に対応するアミノ酸残基であるロイシンがそれぞれ他のアミノ酸残基で置換された、ＯＰＳ排出活性を示す変異型ポリペプチドであってもよい。

【0035】

前記配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からｉ）１２５番目の位置に対応するアミノ酸残基であるバリン以外のアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む、ｉｉ）６０番目の位置に対応するアミノ酸残基であるグルタミン以外のアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、バリン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む、ｉｉｉ）１８０番目の位置に対応するアミノ酸残基であるフェニルアラニン以外のアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、プロリン、バリン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む、及び／又はｉｖ）３９８番目の位置に対応するアミノ酸残基であるロイシン以外のアミノ酸は、グリシン、アラニン、イソロイシン、セリン、プロリン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0036】

より具体的には、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からｉ）１２５番目の位置に対応するアミノ酸残基であるバリンがイソロイシンで置換されたり、これに対し、さらにｉｉ）６０番目の位置に対応するアミノ酸残基がグルタミンまたはアルギニンであり、ｉｉｉ）１８０番目の位置に対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンまたはロイシンであり、ｉｖ）３９８番目の位置に対応するアミノ酸残基がロイシンまたはプロリンであってもよい。

【0037】

さらに具体的には、本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端からｉ）１２５番目の位置に対応するアミノ酸残基であるバリンがイソロイシンで置換されたり、これに対し、さらにｉｉ）６０番目の位置に対応するアミノ酸であるグルタミンがアルギニンで置換、ｉｉｉ）１８０番目の位置に対応するアミノ酸であるフェニルアラニンがロイシンで置換及び／又はｉｖ）３９８番目の位置に対応するアミノ酸であるロイシンがプロリンで置換されたものであってもよい。

【0038】

一つの具現例として、本出願の変異体は、配列番号２または配列番号３から選択されるいずれか一つ以上のアミノ酸配列と９９％以上の配列の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異体であってもよい。

【0039】

また、本出願の変異体は、配列番号２または配列番号３から選択されるいずれか一つ以上のアミノ酸配列を有するか、含むか、からなるか、前記アミノ酸配列で必須的に成る（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよいが、これに制限されない。

【0040】

本出願の他の一態様は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドである。
前記変異体は、前述の通りである。

【0041】

本出願において、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

【0042】

本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３で記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことができる。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号５の核酸塩基配列を有するか、または含むことができる。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号５の核酸塩基配列からなるか、必須に構成されてもよい。

【0043】

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号５の核酸塩基配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するか、含むか、または配列番号４または配列番号５の核酸塩基配列と相同性または同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるか、または必須に構成されてもよいが、これに制限されない。このとき、前記相同性または同一性を有する配列において、配列番号１の１２５番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、イソロイシンをコードするコドンのうちの一つであってもよい。

【0044】

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造することができるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができる配列であれば、制限なく含まれる。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的に２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。

【0045】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、配列全体に相補的な単離された核酸断片を含み得る。

【0046】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節することができる。

【0047】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上）。

【0048】

本出願のもう一つの態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターである。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これらに制限されない。

【0049】

前記ポリヌクレオチドは、前述の通りである。

【0050】

本出願のベクターは、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含み得る。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合することができる。

【0051】

本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＳＫ系、ｐＳＫＨ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＣＬ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＳＫ、ｐＳＫＨ１３０、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0052】

一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーを使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。

【0053】

本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含み得る。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現するのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含み得る。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。

【0054】

また、前記において、用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。

【0055】

本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、エシェリキア属微生物である。

【0056】

本出願の菌株は、本出願の変異型ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／又は本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含むことができる。

【0057】

前記変異体、ポリヌクレオチド及びベクターは、前述の通りである。

【0058】

本出願において、用語「微生物（または、菌株）」とは、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、または内在的遺伝子の活性が強化されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、所望のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。

【0059】

本出願の菌株は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む菌株；本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを発現するように変形された菌株；本出願の変異体、または本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これらに制限されない。

【0060】

本出願の菌株は、ＯＰＳ排出能を有する菌株であってもよい。

【0061】

本出願の菌株は、天然にＭｄｔＨまたはＯＰＳ排出能を有している微生物、またはＭｄｔＨまたはＯＰＳ排出能がない親株に本出願の変異体またはそれをコードするポリヌクレオチド（または前記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されるか、及び／又はＯＰＳ排出能が与えられた微生物であってもよいが、これに制限されない。

【0062】

一例として、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の変異体を含めてＯＰＳを排出できる微生物をすべて含むことができる。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物またはＯＰＳを排出する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりＭｄｔＨ変異体が発現され、ＯＰＳ排出能が増加した組換え菌株であってもよい。前記ＯＰＳ排出能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物またはＭｄｔＨ非変形微生物（即ち、野生型ＭｄｔＨ（配列番号１）を発現する微生物または変異型（配列番号２または配列番号３）タンパク質を発現しない微生物）に比べてＯＰＳ排出能が増加した微生物であってもよいが、これらに制限されるものではない。その例として、前記ＯＰＳ排出能の増加有無を比較する対象菌株である、ＭｄｔＨ非変形微生物は、内在的ホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｓｅｒＢ）の活性を弱化させた菌株であるＣＡ０７－００１２（ＫＣＣＭ １１１２１Ｐ、欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１または米国公開公報第２０１２－０１９００８１号）であってもよいが、これに制限されない。

【0063】

一例として、前記ＯＰＳ排出能の増加によりＯＰＳ生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物のＯＰＳ生産能に比べて約１％以上、具体的には、約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約７．５％以上、約１０％以上、約１２．５％以上、約１５％以上、約１７．５％以上、約２０％以上、約２２．５％以上、約２５％以上、約２７．５％以上、約３０％以上、約３２．５％以上、約３５％以上、約３７．５％以上、約４０％以上、約４２．５％以上、約４５％以上、約４７．５％以上、約５０％以上、約５２．５％以上、約５５％以上、約５７．５％以上、約６０％以上、約６２．５％以上、約６５％以上、約６７．５％以上、約７０％以上、約７２．５％以上、約７５％以上、約７７．５％以上、約８０％以上、約８２．５％以上、約９０％以上、約９２．５％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約１００％以上、約１０２．５％以上、約１０５％以上、約１０７．５％以上、約１１０％以上、約１１２．５％以上、約１１５％以上、約１１７．５％以上、約１２０％以上、約１２２．５％以上、約１２５％以上、約１２７．５％以上、約１３０％以上、約１３２．５％以上、約１３５％以上、または約１３７％以上（上限値に特別な制限はなく、例えば、約３００％以下、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４０％以下、または約３０％以下であってもよい）が増加されたものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。他の例において、前記ＯＰＳ排出能の増加によりＯＰＳ生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物に比べて、ＯＰＳ生産能が約１．０１倍以上、約１．０２５倍以上、約１．０５倍以上、約１．０７５倍以上、約１．１０倍以上、約１．１２５倍以上、約１．１５倍以上、約１．１７５倍以上、約１．２０倍以上、約１．２２５倍以上、約１．２５倍以上、約１．２７５倍以上、約１．３０倍以上、約１．３２５倍以上、約１．３５倍以上、約１．３７５倍以上、約１．５０倍以上、約１．５２５倍以上、約１．５５倍以上、約１．６０倍以上、約１．６２５倍以上、約１．６５倍以上、約１．６７５倍以上、約１．７０倍以上、約１．７２５倍以上、約１．７５倍以上、約１．７７５倍以上、約１．８倍以上、約１．８２５倍以上、約１．８５倍以上、約１．８７５倍以上、約１．９０倍以上、約１．９２５倍以上、約１．９５倍以上、約１．９７５倍以上、約２．０倍以上、約２．０２５倍以上、約２．０５倍以上、約２．０７５倍以上、約２．１０倍以上、約２．１２５倍以上、約２．１５倍以上、約２．１７５倍以上、約２．２０倍以上、約２．２２５倍以上、約２．２５倍以上、約２．２７５倍以上、約２．３０倍以上、約２．３２５倍以上、約２．３５倍以上、または約２．３７倍以上（上限値に特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、または約２倍以下であってもよい）が増加されたものであってもよいが、これに制限されない。前記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに制限されない。

【0064】

本出願において、用語「非変形微生物」とは、微生物に自然に生じ得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、自然的または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非変形微生物は、本明細書に記載のＭｄｔＨ変異体が導入されないか、または導入される前の菌株を意味する。前記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。

【0065】

本出願のまた他の一例として、本出願の微生物は、ＯＰＳを生産できれば、その種類に特に制限されず、原核細胞または真核細胞がいずれも可能であるが、具体的には原核細胞であってもよい。前記原核細胞は、一例として、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物菌株を含むことができ、具体的にはエシェリキア属微生物、より具体的には大腸菌、即ち、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよいが、これに制限されない。

【0066】

特に、本出願のエシェリキア属微生物の場合、Ｌ－セリン（Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ）の生合成経路の酵素であるＳｅｒＡ、ＳｅｒＣ及びＳｅｒＢを通じて、ＯＰＳ及びＬ－セリンを生産することができる（Ａｈｍｅｄ Ｚａｈｏｏｒ，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ ３，２０１２ Ｏｃｔｏｂｅｒ；Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｖ Ｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｊｕｎ；９（３）：２６８－７４；Ｐｅｔｅｒｓ－Ｗｅｎｄｉｓｃｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００５ Ｎｏｖ；７ １（ ｌ ｌ）：７ １３９－４４．）。ホスホセリンホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）のＳｅｒＢは、ＯＰＳをＬ－セリンに変換させる活性を有するため、前記ＳｅｒＢ活性が弱化されるように変異された微生物は、ＯＰＳを蓄積する特徴を有し、ＯＰＳの生産に有用である。一例として、本出願の微生物は、本出願の変異体導入以外に、さらにＳｅｒＢの活性が内在的活性に比べて弱化された組換え微生物であってもよい。

【0067】

本出願のＳｅｒＢは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ． ＡＡＣ７７３４１．１で記載されるアミノ酸配列を有するか、または含むタンパク質、またはＡＡＣ７７３４１．１で記載されるアミノ酸配列からなるか、必須で構成されるタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。また、本出願のＳｅｒＢは、ＯＰＳのＬ－セリンへの変換活性を示す限り、ＡＡＣ７７３４１．１で記載されるアミノ酸配列と相同性または同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上のアミノ酸配列を有するか、含むことができる。さらに、本出願のＳｅｒＢは、ＡＡＣ７７３４１．１で記載されるアミノ酸配列と相同性または同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上のアミノ酸配列からなるか、必須で構成されるものであってもよいが、これに制限されない。

【0068】

また、本出願のＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチドは、ＮＣＢＩ ＮＰ＿４１５５８３．４で記載される塩基配列を有するか、含むことができる。本出願のＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチドは、ＮＰ＿４１５５８３．４の塩基配列と相同性または同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上、そして１００％未満の塩基配列を有するか、含むことができる。さらに、本出願のＳｅｒＢをコードするポリヌクレオチドは、ＮＰ＿４１５５８３．４の塩基配列と相同性または同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上、そして１００％未満の塩基配列で行われるか、必須で構成されてもよいが、これに制限されない。

【0069】

本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。

【0070】

前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。

【0071】

前記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野においてよく知られた多様な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０，Ｖｏｌ． ２． １－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。

【0072】

具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域の変形；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に修飾；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに、特に制限されるものではない。

【0073】

より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに制限されない。前記ベクターは、前述の通りである。

【0074】

前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはそれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、より強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含み得る。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに制限されない。

【0075】

公知となった強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに制限されない。

【0076】

前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに制限されない。

【0077】

前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに制限されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、前述の通りである。

【0078】

前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加され得る。

【0079】

前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。

【0080】

前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質の候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。

【0081】

このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加することであってもよいが、これらに制限されるものではない。

【0082】

本出願における用語、ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。

【0083】

前記弱化は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などにより、ポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性程度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。

【0084】

そのようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに制限されるものではなく、当該分野においてよく知られている多様な方法の適用により達成することができる（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。

【0085】

具体的には、本出願のポリペプチド活性の弱化は、
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、前記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、前記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的で結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。

【0086】

例えば、
前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部または全部の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
また、前記２）発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより発現調節領域（または発現調節配列）上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これらに限定されるものではない。

【0087】

また、前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これらに制限されない。

【0088】

また、前記３）及び４）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに制限されない。

【0089】

前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ． １（１） １９８６］を参考することができる。

【0090】

前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。

【0091】

前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。

【0092】

本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質の処理により誘導されてもよいが、これらに制限されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに制限されるものではない。

【0093】

また、前記微生物は、さらにＯＰＳの細胞中への流入及び分解能力を減少させた微生物であってもよい。

【0094】

前記のようなＯＰＳ生産微生物に関する内容は、前記内容以外にも欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１または米国公開公報第２０１２－０１９００８１号などに開示された内容が本出願の参考資料として用いられるが、これに制限されない。

【0095】

本出願の微生物において、変異体、ポリヌクレオチド及びＯＰＳなどは、前記他の様態で記載した通りである。

【0096】

本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養する段階を含む、Ｏ－ホスホセリンの生産方法である。

【0097】

本出願のＯＰＳ生産方法は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドまたは本出願のベクターを含む微生物を培地で培養する段階を含むことができる。

【0098】

本出願において、用語「培養」とは、本出願の微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。

【0099】

本出願において、用語「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

【0100】

前記培地に含まれる炭素源は、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸を含むことができ、これらの物質は、個別的にまたは混合物として使用されてもよいが、これらに制限されるものではない。

【0101】

前記培地に含まれる窒素源として、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液及び大豆粕のような有機窒素源及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源が含まれ、これらの窒素源は、単独または組み合わせて使用されてもよいが、これらに制限されるものではない。

【0102】

前記培地に含まれるリン源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム及び対応するナトリウム含有塩が含まれてもよいが、これらに制限されるものではない。

【0103】

また、前記培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含むことができ、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加されてもよいが、これらに制限されるものではない。

【0104】

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これらに限定されるものではない。

【0105】

本出願の培養において、培養温度は２５℃～４０℃、具体的には３０℃～３５℃を維持することができ、培養期間は、所望の有用物質の生産量が得られるまで続けるが、具体的には１０～１００時間であってもよい。しかし、これらの例示に制限されるものではない。

【0106】

本出願の培養により生産されたＯＰＳは、培地中に分泌することができる。

【0107】

本出願のＯＰＳ生産方法は、本出願の微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養する段階の前に、さらに含むことができる。

【0108】

本出願のＯＰＳ生産方法は、前記培養による培地（培養が行われた培地）または本出願の微生物からＯＰＳを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階の後にさらに含むことができる。

【0109】

前記ＯＰＳを回収する方法は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＯＰＳを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＯＰＳを回収することができる。

【0110】

また、本出願のＯＰＳ生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＯＰＳ生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに制限されるものではない。

【0111】

本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び菌株などは、前記他の様態で記載した通りである。

【0112】

本出願のもう一つの態様は、システインまたはその誘導体の生産方法である。

【0113】

具体的には、前記方法は、ａ）配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養し、Ｏ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を生産する段階と；ｂ）Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｌｉｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）またはそれを発現する微生物及びａ）段階で生産されたＯ－ホスホセリンまたはそれを含む培地を硫化物と反応させる段階と；を含むものであってもよい。

【0114】

本出願において、用語「誘導体」はある化合物の一部を化学的に変化させて得られる類似の化合物として、たいてい化合物のうち水素原子または特定原子団が違う原子または原子団によって置換された化合物を意味する。

【0115】

本出願において、用語「システイン誘導体」とは、システインの水素原子または特定の原子団が他の原子または原子団により置換された化合物を意味する。その例として、システインのアミン基（－ＮＨ_２）の窒素原子またはチオール基（－ＳＨ）の硫黄原子に他の原子または原子団が付着した形態であってもよく、その例としてＮＡＣ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ＳＣＭＣ（Ｓ－Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ＢＯＣ－ＣＹＳ（ＭＥ）－ＯＨ、（Ｒ）－Ｓ－（２－Ａｍｉｎｏ－２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－Ｌ－ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、（Ｒ）－２－Ａｍｉｎｏ－３－ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｄ－２－Ａｍｉｎｏ－４－（ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、３－ｓｕｌｆｉｎｏ－Ｌ－ａｌａｎｉｎｅ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｂｏｃ－ｍｅｔｈｙｌ）－ＯＨ、Ｓｅｌｅｎｏ－Ｌ－ｃｙｓｔｉｎｅ、Ｓ－（２－Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｓ－（２－Ｔｈｉｅｎｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｓ－（４－Ｔｏｌｙｌ）－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅなどがあるが、これに制限されない。

【0116】

本出願の方法によりシステインを生産しさえすれば、システイン誘導体への変換は、当業界に広く知られた方法で容易に多様なシステイン誘導体への変換が可能であってもよい。

【0117】

具体的には、前記システイン誘導体の生産方法は、前記ｂ）段階で生成されたシステインをシステイン誘導体に変換させる段階をさらに含むものであってもよい。一例として、システインをアセチル化剤（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）と反応させてＮＡＣ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）を合成するか、またはシステインを塩基性条件でハロ酢酸（ｈａｌｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と反応させることによりＳＣＭＣ（Ｓ－Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）を合成することができるが、これらに制限されない。

【0118】

前記システイン誘導体は、主に、製薬原料として鎮咳剤、咳緩和剤、気管支炎、気管支喘息と咽喉炎などの治療剤として使用され得るが、これらに制限されない。

【0119】

本出願において、用語「Ｏ－ホスホセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ，ＯＰＳＳ）」とは、ＯＰＳにチオール基（ｔｈｉｏｌ，ｇｒｏｕｐ、ＳＨ基）を提供して前記ＯＰＳをシステインに転換する反応を触媒する酵素を意味する。前記酵素は、アエロピルム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｍｍ ｐｅｒｎｉｘ）、マイコバクテリウム・トゥバキュロウシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｇｍａｔｉｃｓ）、トリコモナス・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）（Ｍｉｎｏ Ｋ ａｎｄ Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ、ＦＥＢＳｌｅｔｔｅｒｓ、５５１：１３３－１３８，２００３；Ｂｕｍｓ Ｋ Ｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、１２７：１１６０２－１１６０３，２００５）で初めて明らかになったことであってもよい。また、前記ＯＰＳＳは、野生型ＯＰＳＳタンパク質だけでなく、前記ＯＰＳＳをコードするポリヌクレオチド配列中の一部の配列が欠失、置換または付加された配列であり、野生型ＯＰＳＳタンパク質の生物学的活性と同等またはそれ以上の活性を示す変異体タンパク質も含み、欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１及び米国登録特許ＵＳ ９１２７３２４に開示されたＯＰＳＳタンパク質及びその変異体タンパク質もすべて含むことができる。

【0120】

前記硫化物は、当該技術分野において通常用いる固形だけでなく、ｐＨ、圧力、溶解度の差により液体または気体の形態で提供され、サルファイド（ｓｕｌｆｉｄｅ，Ｓ^２－）、チオサルフェイト（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ，Ｓ_２Ｏ_３ ^２－）などの形態でチオール基（ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＳＨ基）に転換され得る硫化物であれば、制限なく用いることができる。具体的には、チオール基をＯＰＳに提供するＮａ_２Ｓ、ＮａＳＨ、Ｈ_２Ｓ、（ＮＨ_４）_２Ｓ、ＮａＳＨ及びＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３を使用することができるが、これらに制限されない。前記反応は、一つのＯＰＳ反応基に一つのチオール基を提供して一つのシステインまたはシステイン誘導体を製造する反応であり、前記反応時に硫化物の添加量は、ＯＰＳモル濃度の０．１～３倍であってもよく、具体的には１～２倍であってもよいが、これらに制限されるものではない。

【0121】

また、本出願においては、さらに前記反応段階を通じて生産されたシステインを回収する段階を含むことができる。そのとき、当該分野において公知となった適切な反応を用いて反応液から所望のシステインを分離及び精製して収集することができる。

【0122】

本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目の位置に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたＭｄｔＨ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む微生物；それを培養した培地；またはそれらのうちの２以上の組み合わせを含むＯＰＳ生産用組成物である。

【0123】

本出願の組成物は、ＯＰＳ生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、このような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0124】

本出願の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地及びＯＰＳなどは、前記他の様態で記載した通りである。

【0125】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＯＰＳ排出活性を示す変異型ポリペプチドのＯＰＳ、システインまたはシステインの誘導体生産への使用である。

【0126】

本出願のもう一つの態様は、本出願のＯＰＳ排出活性を示す変異型ポリペプチドを有するポリペプチドの、ＯＰＳを微生物から排出するための使用である。

【0127】

本出願の使用において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地及びＯＰＳなどは、前記他の様態で記載した通りである。

【0128】

以下、本出願を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0129】

実施例１：ｍｄｔＨライブラリーの製作及びスクリーニング
ＯＰＳ排出活性が増加したＭｄｔＨ変異体を選定するために、ｍｄｔＨ遺伝子変異体プラスミドのライブラリーを製作した。具体的な過程は、下記の通りである。

【0130】

Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｗ３１１０（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＣ＿００７７７９．１）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９及び１０のプライマー対（ｐｒｉｍｅｒ ３及び８）を用いて任意の突然変異誘発ＰＣＲを行った（Ｔａｋａｒａ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｃａｔ ｎｏ． ６３０７０３）。

【0131】

ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。

【0132】

このような過程で製作された突然変異の遺伝子断片をｔｒｃプロモーターがあるｐＣＬ１９２０ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ ＡＢ２３６９３０）に入れるために、まず、ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃを製作した。ｔｒｃプロモーター断片を確保するために、配列番号７及び８のプライマー対（ｐｒｉｍｅｒ １及び２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。

【0133】

ここで使用されたプライマー配列は、下記表１の通りである。

【0134】

【表1】

【0135】

ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断されたｐＣＬ１９２０ベクターにｔｒｃプロモーター断片をインフュージョンクローニングキット（ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてクローニングし、ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃを確保した。確保したベクターｐＣＬ＿ＰｔｒｃベクターをＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶで切断した後、前記ＰＣＲを通じて得られた突然変異の遺伝子断片をインフュージョンクローニングキットを使用してクローニングした。クローニングは、５０℃で６０分間反応させて行われ、これを通じてｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ遺伝子変異体プラスミドライブラリーを製作した。

【0136】

製作されたｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ遺伝子変異体プラスミドライブラリーをＣＡ０７－００１２（ＫＣＣＭ １１１２１Ｐ、欧州公開特許ＥＰ ２４４４４８１または米国公開公報第２０１２－０１９００８１号）に電気穿孔法で形質転換させた。そのうち、変異体を含む菌株２種を選別し、それからプラスミドを得てシークエンシング技法を通じて塩基配列を分析した。

【0137】

塩基配列の分析結果、選別された２種の変異体は、野生型ＭｄｔＨのアミノ酸配列で１２５番目のアミノ酸残基のバリンがイソロイシンで置換された変異体［ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）］、６０番目アミノ酸残基のグルタミンがアルギニンで置換され、１２５番目のアミノ酸残基のバリンがイソロイシンで置換され、１８０番目のアミノ酸残基のフェニルアラニンがロイシンで置換され、３９８番目のアミノ酸残基のロイシンがプロリンで置換された変異体［ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）］であることを確認した。前記変異体ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）が形質転換された菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）をＥ．ｃｏｌｉ ＣＡ０７－０３７９と、前記変異体ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）が形質転換された菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）をＥ．ｃｏｌｉ ＣＡ０７－０３８０と命名した。

【0138】

実施例２：ＭｄｔＨ変異体導入菌株のＯＰＳ生産能の評価
ＭｄｔＨ変異体が導入された菌株のＯＰＳ生産能を下記培地（表２）を用いて評価した。

【0139】

【表2】

【0140】

具体的には、培養は、それぞれの菌株をＬＢ固体培地に塗抹した後、３３℃の培養器で一晩中培養した。ＬＢ固体培地で一晩中培養した菌株を表２の２５ｍＬの力価培地に接種した後、それを３３℃の温度で２００ｒｐｍで培養器で４８時間培養し、ＯＰＳ生産能を評価し、その結果を下記表３に示した。

【0141】

【表3】

【0142】

その結果、ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）が導入された菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）の場合、野生型ｍｄｔＨが導入された菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨに比べて約１８０％の生産能を示した。また、ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）が導入された菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）の場合、菌株ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨに比べて約２３７％の生産能を示した。

【0143】

前記ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｖ１２５Ｉ）はＣＡ０７－０３７９と命名し、ＣＡ０７－００１２／ｐＣＬ＿Ｐｔｒｃ－ｍｄｔＨ（Ｑ６０Ｒ、Ｖ１２５Ｉ、Ｆ１８０Ｌ、Ｌ３９８Ｐ）はＣＡ０７－０３８０と命名した。

【0144】

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

【配列表】

2024520831000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-12-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2024520831000001.app

【国際調査報告】