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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-24
(54)【発明の名称】アデノ随伴ウイルス産生を制御する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240517BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240517BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20240517BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20240517BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240517BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240517BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/35
C12N15/53
C12N5/10
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023576084
(86)(22)【出願日】2022-06-10
(85)【翻訳文提出日】2024-01-30
(86)【国際出願番号】 US2022033071
(87)【国際公開番号】W WO2022261475
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】63/209,735
(32)【優先日】2021-06-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/350,849
(32)【優先日】2022-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518138077
【氏名又は名称】スパーク セラピューティクス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＰＡＲＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ヤズチュオール， ムスタファ
(72)【発明者】
【氏名】オズデミル， アーメット ユヌス
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
(57)【要約】
本開示の主題は、細胞培養物中の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生を制御するための組成物および方法に関する。特に、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生の制御をもたらすＡＡＶ Ｒｅｐおよびヘルパータンパク質の発現の可逆的翻訳後制御によって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質媒介細胞傷害性を克服する戦略に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の産生を制御する方法であって、方法が、ａ）細胞に、
ａ．目的の遺伝子を含むｒＡＡＶ、ならびに
ｂ．融合タンパク質をコードする核酸であって、融合タンパク質が、ＡＡＶタンパク質、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む、核酸
を導入することと、
ｂ）細胞を、ｒＡＡＶベクター粒子を産生するのに好適な条件下で培養することと、
ｃ）細胞を分解リガンドと接触させることであって、分解リガンドが、分解ドメインに結合して、ＡＡＶタンパク質の発現を制御し、それによってｒＡＡＶベクター粒子の産生を制御する、細胞を分解リガンドと接触させることと
を含む、方法。
【請求項2】
核酸が、融合タンパク質をコードし、融合タンパク質が、ＡＡＶタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＡＡＶタンパク質が、Ｃａｐである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＡＡＶタンパク質が、ヘルパータンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
ヘルパータンパク質が、Ｅ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＡＡＶタンパク質が、Ｒｅｐである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
リガンド依存性分解ドメインが、ＦＫＢＰに由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
分解リガンド依存性分解ドメインが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
分解リガンド依存性分解ドメインが、オーキシン誘導性分解ドメインである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
分解リガンドが、小分子リガンドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
小分子が、Ｓｈｉｅｌｄ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
小分子が、トリメトプリム（ＴＭＰ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
小分子が、オーキシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
細胞が、Ｅ１ａ発現細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
Ｅ１ａ発現細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
Ｒｅｐタンパク質が、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０タンパク質である、請求項６から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
分解リガンド依存性分解ドメインが、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端に融合されている、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
分解リガンド依存性分解ドメインが、Ｒｅｐタンパク質のＮ末端に融合されている、請求項６から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
リンカーが、柔軟なリンカーである、請求項２に記載の方法。
【請求項20】
リンカーが、剛直なリンカーである、請求項２に記載の方法。
【請求項21】
細胞に、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸を導入することを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、少なくとも１つのプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、同じプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、別個のプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
ｒｅｐ、ｃａｐ、またはヘルパー遺伝子が、制御エレメントのコントロール下にある、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記制御エレメントが、プロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記制御エレメントが、Ｔｅｔ応答結合エレメントを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
細胞が、真核細胞である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
真核細胞が、動物細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
動物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
哺乳動物細胞が、ＨＥＫ細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
ｒＡＡＶ産生細胞であって、細胞が、ＡＡＶタンパク質および分解リガンド依存性分解ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む、ｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項34】
核酸が、ＡＡＶタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項３３に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項35】
ＡＡＶタンパク質が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびヘルパータンパク質からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項36】
ＡＡＶタンパク質が、Ｃａｐである、請求項３５に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項37】
ＡＡＶタンパク質が、ヘルパータンパク質である、請求項３５に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項38】
ＡＡＶタンパク質が、Ｒｅｐである、請求項３５に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項39】
分解リガンドが、小分子リガンドである、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項40】
分解リガンド依存性分解ドメインが、ＦＫＢＰに由来する、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項41】
分解リガンド依存性分解ドメインが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）である、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項42】
分解リガンド依存性分解ドメインが、オーキシン誘導性分解ドメインである、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項43】
小分子が、Ｓｈｉｅｌｄ１である、請求項４０に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項44】
小分子が、トリメトプリム（ＴＭＰ）である、請求項４１に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項45】
小分子が、オーキシンである、請求項４２に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項46】
細胞が、真核細胞である、請求項３３から４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項47】
真核細胞が、動物細胞である、請求項４６に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項48】
動物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４７に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項49】
哺乳動物細胞が、ＨＥＫ細胞である、請求項４８に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項50】
哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項４８に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項51】
細胞が、Ｅ１ａ発現細胞である、請求項３３から４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項52】
Ｅ１ａ発現細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項５１に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項53】
リガンド依存性分解ドメインが、リンカーを介してＲｅｐタンパク質のＣ末端に融合されている、請求項３８から４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項54】
細胞が哺乳動物細胞であり、リガンド依存性分解ドメインが、リンカーを介してＲｅｐタンパク質のＮ末端に融合されている、請求項３８から４５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項55】
細胞が哺乳動物細胞であり、リンカーが柔軟なリンカーである、請求項３４に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項56】
細胞が哺乳動物細胞であり、リンカーが剛直なリンカーである、請求項３４に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項57】
細胞に、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸を導入することをさらに含む、請求項４８から５６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項58】
細胞が哺乳動物細胞であり、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、少なくとも１つのプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項５７に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項59】
細胞が哺乳動物細胞であり、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、同じプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項５７に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項60】
細胞が哺乳動物細胞であり、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、別個のプラスミドを使用して細胞中に導入される、請求項５７に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項61】
細胞が哺乳動物細胞であり、ｒｅｐ、ｃａｐ、またはヘルパー遺伝子が、制御エレメントのコントロール下にある、請求項４８から６０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項62】
前記制御エレメントが、プロモーターである、請求項６１に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項63】
前記制御エレメントが、Ｔｅｔ応答結合エレメントを含む、請求項６１に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項64】
２つ以上の異なるＡＡＶタンパク質が、独立して、分解リガンド依存性分解ドメインに融合されている、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法または請求項３３から６３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ産生細胞。
【請求項65】
各異なるＡＡＶタンパク質が、独立して、異なる分解リガンド依存性分解ドメインに融合されている、請求項６４に記載の方法またはｒＡＡＶ産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年６月９日に出願された米国仮出願第６３／３５０，８４９号、および２０２１年６月１１日に出願された米国仮出願第６３／２０９，７３５号の優先権を主張するものであり、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に援用され、これらに対して優先権が主張される。
本出願は、２０２２年６月９日に出願された米国仮出願第６３／３５０，８４９号、および２０２１年６月１１日に出願された米国仮出願第６３／２０９，７３５号の優先権を主張するものであり、これらの両方は、その全体が参照により本明細書に援用され、これらに対して優先権が主張される。
【0002】
１．発明の分野
本開示の主題は、細胞培養物中の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生の制御のための組成物および方法に関する。特に、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生の制御をもたらすＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現の可逆的翻訳後制御によって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質媒介細胞傷害性を克服する戦略に関する。
本開示の主題は、細胞培養物中の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生の制御のための組成物および方法に関する。特に、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生の制御をもたらすＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現の可逆的翻訳後制御によって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質媒介細胞傷害性を克服する戦略に関する。
【背景技術】
【0003】
２．背景
細胞培養物中でｒＡＡＶを産生するために使用されるさまざまなＡＡＶ産生システムがある。これらには、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、Ｈｅｌａ産生細胞株、ＢＨＫ２１ベースのプラットフォーム、およびバキュロウイルスベースの産生システムのプラスミド一過性トランスフェクションが含まれる。これらのシステムの各々には、長所および短所がある。例えば、アデノウイルスＥ１ａタンパク質のｒＡＡＶの産生を開始することにおける重要性を考慮すると、Ｅ１ａ発現細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞は、それらが宿主細胞ゲノムにＥ１ａ遺伝子を別途導入する必要性を排除するため、ｒＡＡＶを産生するために魅力的である。Ｅ１ａ発現細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞はまた、増殖の容易さおよび懸濁液中の増殖の適応性も提供することができる。しかしながら、安定かつ継代可能なｒＡＡＶ産生Ｅ１ａ発現細胞株を作り出すための取り組みは、Ｅ１ａ誘導性のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の蓄積によって引き起こされる細胞傷害性によって阻まれてきた。上述した点から、Ｒｅｐタンパク質の蓄積が制御され、Ｒｅｐ媒介細胞傷害性を回避でき、制御されたｒＡＡＶ産生をもたらす、新しいｒＡＡＶ産生戦略が当該技術分野において必要とされている。
細胞培養物中でｒＡＡＶを産生するために使用されるさまざまなＡＡＶ産生システムがある。これらには、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、Ｈｅｌａ産生細胞株、ＢＨＫ２１ベースのプラットフォーム、およびバキュロウイルスベースの産生システムのプラスミド一過性トランスフェクションが含まれる。これらのシステムの各々には、長所および短所がある。例えば、アデノウイルスＥ１ａタンパク質のｒＡＡＶの産生を開始することにおける重要性を考慮すると、Ｅ１ａ発現細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞は、それらが宿主細胞ゲノムにＥ１ａ遺伝子を別途導入する必要性を排除するため、ｒＡＡＶを産生するために魅力的である。Ｅ１ａ発現細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞はまた、増殖の容易さおよび懸濁液中の増殖の適応性も提供することができる。しかしながら、安定かつ継代可能なｒＡＡＶ産生Ｅ１ａ発現細胞株を作り出すための取り組みは、Ｅ１ａ誘導性のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の蓄積によって引き起こされる細胞傷害性によって阻まれてきた。上述した点から、Ｒｅｐタンパク質の蓄積が制御され、Ｒｅｐ媒介細胞傷害性を回避でき、制御されたｒＡＡＶ産生をもたらす、新しいｒＡＡＶ産生戦略が当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
３．本発明の概要
ある特定の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の産生を制御する方法を対象とし、本方法は、細胞に、目的の遺伝子を含むｒＡＡＶおよび融合タンパク質をコードする核酸を導入することであって、融合タンパク質が、ＡＡＶタンパク質、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む、導入することと、ｒＡＡＶベクター粒子を産生するのに好適な条件下で、細胞を培養することと、細胞を分解リガンドと接触させることであって、分解リガンドが分解ドメインに結合して、ＡＡＶタンパク質の発現を制御し、それによって、ｒＡＡＶベクター粒子の産生を制御する、接触させることとを含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター粒子の産生を制御する方法を対象とし、本方法は、細胞に、目的の遺伝子を含むｒＡＡＶおよび融合タンパク質をコードする核酸を導入することであって、融合タンパク質が、ＡＡＶタンパク質、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む、導入することと、ｒＡＡＶベクター粒子を産生するのに好適な条件下で、細胞を培養することと、細胞を分解リガンドと接触させることであって、分解リガンドが分解ドメインに結合して、ＡＡＶタンパク質の発現を制御し、それによって、ｒＡＡＶベクター粒子の産生を制御する、接触させることとを含む。
【0005】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、Ｒｅｐタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む。ある特定の実施形態では、リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰに由来する。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＤＨＦＲである。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、オーキシン誘導性分解ドメインである。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、小分子は、Ｓｈｉｅｌｄ１である。ある特定の実施形態では、小分子は、ＴＭＰである。ある特定の実施形態では、小分子は、オーキシンである。ある特定の実施形態では、小分子は、ｄＴａｇ１３である。
【0006】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、Ｃａｐタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む。ある特定の実施形態では、リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰに由来する。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＤＨＦＲである。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、オーキシン誘導性分解ドメインである。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、小分子は、Ｓｈｉｅｌｄ１である。ある特定の実施形態では、小分子は、ＴＭＰである。ある特定の実施形態では、小分子は、オーキシンである。ある特定の実施形態では、小分子は、ｄＴａｇ１３である。
【0007】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、ヘルパータンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ヘルパータンパク質は、Ｅ２である。ある特定の実施形態では、リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰに由来する。分解リガンド依存性分解ドメインは、ＤＨＦＲである。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、オーキシン誘導性分解ドメインである。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、小分子は、Ｓｈｉｅｌｄ１である。ある特定の実施形態では、小分子は、ＴＭＰである。ある特定の実施形態では、小分子は、オーキシンである。ある特定の実施形態では、小分子は、ｄＴａｇ１３である。
【0008】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｅ１ａ発現細胞である。ある特定の実施形態では、Ｅ１ａ発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0009】
ある特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０タンパク質である。
【0010】
ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＡＡＶタンパク質のＣ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＡＡＶタンパク質のＮ末端に融合されている。
【0011】
ある特定の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。
【0012】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、細胞に、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸を導入することを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、少なくとも１つのプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、同じプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、別個のプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ融合タンパク質コード遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子は、制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、プロモーターである。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、Ｔｅｔ応答エレメントである。
【0013】
ある特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。ある特定の実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。ある特定の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ細胞である。
【0014】
ある特定の実施形態では、本開示は、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とし、本細胞は、ＡＡＶタンパク質および分解リガンド依存性分解ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰに由来する。ある特定の実施形態では、リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰに由来する。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＤＨＦＲである。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、オーキシン誘導性分解ドメインである。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、小分子は、Ｓｈｉｅｌｄ１である。ある特定の実施形態では、小分子は、ＴＭＰである。ある特定の実施形態では、小分子は、オーキシンである。ある特定の実施形態では、小分子は、ｄＴａｇ１３である。
【0015】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生細胞は、真核細胞である。ある特定の実施形態では、真核細胞は、動物細胞である。ある特定の実施形態では、動物細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｅ１ａ発現細胞である。ある特定の実施形態では、Ｅ１ａ発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0016】
ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ産生細胞は、リンカーを介してＡＡＶタンパク質のＣ末端に融合されたリガンド依存性分解ドメインを含む。ある特定の実施形態では、リガンド依存性分解ドメインは、リンカーを介してＡＡＶタンパク質のＮ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。ある特定の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。
【0017】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｃａｐタンパク質をコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、少なくとも１つのプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、同じプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸およびＣａｐタンパク質をコードする核酸が、別々のプラスミドを使用して細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ融合タンパク質コード遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子は、制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、プロモーターである。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、Ｔｅｔ応答エレメントである。
【図面の簡単な説明】
【0018】
４．図面の簡単な説明
【図1】本開示の方法およびシステムにおいて利用されるプラスミドコンストラクトの例を表示する図である。
【図3】ｒＡＡＶが、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を別個のプラスミド上に有する哺乳動物細胞のトランスフェクションによって産生され得ることを示す図である。
【図4】Ｒｅｐ－デグロンコンストラクトがＡＡＶ産生に使用され得ることおよびＲｅｐタンパク質の蓄積が、Ｓｈｉｅｌｄ－１分子の添加によって制御され得ることを示す図である。
【図5】Ｒｅｐコンストラクトの発現のＳｈｉｅｌｄ－１媒介翻訳後制御を示す図である。ここでは、コンストラクトがＣ末端デグロン融合を伴うＲｅｐまたはＮ末端デグロン融合を伴うＲｅｐをコードする。
【図6】Ｃ末端デグロン融合を含むか、または含まないＲｅｐタンパク質の発現のＳｈｉｅｌｄ－１媒介翻訳後制御を示す図である。Ｒｅｐは、Ｃａｐと同じコンストラクト上に存在するか、または別個のコンストラクト上に存在する。
【図7】ｒＡＡＶ産生が、Ｃ末端デグロンのＲｅｐへの融合および増加する濃度のＳｈｉｅｌｄ－１の添加によって調節され得ること、およびＲｅｐ発現がＣＭＶプロモーター下にある増加する濃度のＲｅｐ－デグロンプラスミドが、ｒＡＡＶ産生の低減をもたらすことを示す図である。
【図8】Ｃ末端デグロン融合を含むかまたは含まないＲｅｐタンパク質を使用するｒＡＡＶ産生およびＲｅｐとデグロンとの間の剛直なまたは柔軟なリンカーの組込みを示す図である。
【図9】Ｎ末端デグロン融合を含むかまたは含まないＲｅｐタンパク質を使用するｒＡＡＶ産生およびＲｅｐとデグロンとの間の剛直なまたは柔軟なリンカーの組込みを示す図である。
【図10】Ｃ末端デグロンを含むＲｅｐコンストラクトおよびＮ末端デグロンを含むＲｅｐコンストラクトのＳｈｉｅｌｄ－１を用いた制御を示す図である。
【図11】デグロンタグのＲｅｐタンパク質のＮ末端またはＣ末端への付加後のウェスタンブロットにおける可能なサイズ変化を表示する図である。デグロンのＲｅｐタンパク質のＮ末端への付加（Ｎ－デグロン）は、大型Ｒｅｐタンパク質の分子量を変化させたが、小型Ｒｅｐタンパク質の分子量は変化させなかった。小型Ｒｅｐの分子量は、Ｎ末端タンパク質タグによって影響を受けず、なぜなら、小型Ｒｅｐの発現を促進するｐ１９プロモーターが、Ｒｅｐ遺伝子内に位置しているためである。小型Ｒｅｐタンパク質は、大型Ｒｅｐタンパク質と同じＮ末端配列を共有しない。対照的に、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端へのデグロンの付加（Ｃ－デグロン）は、両方のＣ末端が同じであるため、小型Ｒｅｐタンパク質および大型Ｒｅｐタンパク質の両方の分子量を変化させる。Ｓｈｉｅｌｄ１またはＴＭＰなどの小分子の細胞培養物への添加は、タンパク質分解を阻害することができ、バンド強度もそれに応じて変化することになる。ここで示される例は、ＦＫＢＰ由来デグロンである。
【図12A】ＦＫＢＰ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。Ｎ末端ＦＫＢＰデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する図である。
【図12B】ＦＫＢＰ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。Ｃ末端ＦＫＢＰデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する図である。
【図12D】ＦＫＢＰ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。異なる比でトランスフェクトされたＲｅｐおよびＣａｐプラスミドでのＡＡＶ力価を表示する図である。
【図13A】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲ由来デグロン（ｅｃＤＨＦＲデグロン）を有するＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。Ｎ末端ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する図である。
【図13B】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲ由来デグロン（ｅｃＤＨＦＲデグロン）を有するＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。Ｃ末端ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する図である。
【図13C】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＦＲ由来デグロン（ｅｃＤＨＦＲデグロン）を有するＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。図１３Ａおよび１３Ｂからの試料のＡＡＶ力価を表示する図である。
【図14A】オーキシンベースのデグロンおよびｅｃＤＨＦＲデグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を表示する図である。オーキシン誘導性デグロンまたはｅｃＤＨＦＲデグロンでタグ付けされているＲｅｐのウェスタンブロットを表示する図である。
【図15】Ｓｈｉｅｌｄ１およびｄＴａｇ１３の異なる用量のＡＡＶ産生に対する影響を表示する図である。ｄＴＡＧ－１３は、ユビキチン媒介性分解のために、変異ＦＫＢＰ配列を標的とすることができる小分子である。これは、標的化タンパク質配列をＥ３ユビキチンリガーゼのセレブロンに連結させることによって機能することができる。ｄＴＡＧ－１３は、ＦＫＢＰ融合タンパク質およびそれに融合されたタンパク質の分解をもたらすことができる。
【図16A】Ｔｅｔ応答エレメント含有プロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）のコントロールおよびＴｅｔタンパク質と単一ドキシサイクリン濃度への曝露下でのＣ末端デグロンを含むＲｅｐのウェスタンブロットを表示する図である。
【図17A】ＴＲＥ３ＧプロモーターのコントロールおよびＴｅｔタンパク質とある範囲のドキシサイクリン濃度への曝露下でのＣ末端デグロンを含むＲｅｐのウェスタンブロットを表示する図である。
【図18A】Ｔｅｔシステム、特にＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ－デグロンシステムにおけるＲｅｐタンパク質レベルに対するｐ５プロモーターの影響を表示する図である。
【図18B】Ｃ末端デグロンおよびＴＲＥ３Ｇプロモーターを有するＲｅｐコンストラクトのウェスタンブロットを表示する図である。
【図19A】ＦＫＢＰ由来のデグロンモチーフでタグ付けされたＥ２Ａ遺伝子から観察されたＤＢＰタンパク質発現を表示する図である。Ｅ２Ａ－ＤＢＰ－デグロンを発現するプラスミドが、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ＩＴＲ－ＧＯＬ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２を発現する他のプラスミドと共にトランスフェクトされた。７２時間の終了時に、細胞を溶解させ、ＡＡＶ力価レベルを分析した。ＩＴＲ－ＧＯＩプラスミド（ＡＡＶ産生を妨げるために、ヘルパーおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドが省かれた）のみでトランスフェクトされた細胞を、ネガティブコントロール試料として使用した。Ｓｈｉｅｌｄ１分子の添加がないと、ＡＡＶ産生は、ネガティブコントロールから生じたｑＰＣＲ結果のバックグラウンドレベルと同じである（左側の濃い赤色のバー対右側のグレーバー）。Ｓｈｉｅｌｄ１分子を添加すると、力価レベルはおよそ３倍増し、デグロンタグを有するＥ２Ａ－ＤＢＰを使用するＡＡＶ産生の制御を提供する（中央の縞模様のバー）。
【図19B】デグロンタグの付加に起因して、Ｅ２Ａ－ＤＢＰタンパク質のタンパク質サイズにおけるシフトを示すウェスタンブロットの結果を表示する図である。タグ付きタンパク質は、タグなしのＤＢＰタンパク質よりも約１２ｋＤａ大きい。左側の２つの試料はタグなしＤＢＰであり、一方右側の試料は、デグロンを含むＤＢＰの試料である。
【図20A】デグロンモチーフを有するコドン修飾ＲｅｐがＡＡＶ産生に使用され得ることを表示する図である。制御エレメント、特に、ＴＲＥ３Ｇ－Ｔｅｔシステムのコントロール下にある修飾ｒｅｐ遺伝子を示す図である。ここで示されるコンストラクトは、コドン修飾Ｒｅｐコンストラクトによってのみ産生された大型Ｒｅｐタンパク質を有する。小型Ｒｅｐは、同じプラスミド上の別の領域から発現される。小型Ｒｅｐはまた、同じプラスミド上で、ＴＲＥ３Ｇおよびデグロンのコントロール下にある。
【図20B】デグロンモチーフを有するコドン修飾ＲｅｐがＡＡＶ産生に使用され得ることを表示する図である。より高いＡＡＶ力価を有する細胞からの試料は、Ｓｈｉｅｌｄ１およびＤｏｘで処理されたものである。これは、本明細書に開示される方法の文脈において、修飾ｒｅｐ遺伝子を含む複数のＡＡＶ遺伝子上の複数のデグロンドメインおよびＴｅｔプロモーターの誘導特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
５．詳細な説明
本開示の主題は、細胞培養物中の組換えｒＡＡＶ産生の制御のための組成物および方法に関する。特に、本開示の主題は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現の可逆的翻訳後制御によって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質媒介細胞傷害性を克服するための組成物および方法に関する。
本開示の主題は、細胞培養物中の組換えｒＡＡＶ産生の制御のための組成物および方法に関する。特に、本開示の主題は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現の可逆的翻訳後制御によって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質媒介細胞傷害性を克服するための組成物および方法に関する。
【0020】
一態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶの発現の翻訳後制御のための細胞培養の方法を対象とする。ある特定の実施形態では、細胞培養物中のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質発現の可逆的翻訳後制御は、分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって達成される。ある特定の実施形態では、分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合は、細胞培養物中の分解リガンドの存在または不在に基づくＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の制御された分解を可能にする。ある特定の実施形態では、分解リガンドの存在または不在に基づくＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の制御された分解は、細胞培養物中のｒＡＡＶの発現の翻訳後制御をもたらす。
【0021】
別の態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。例えば、限定されないが、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現が分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって制御される、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。
【0022】
別の態様では、細胞培養物中のＡＡＶ ヘルパータンパク質発現の可逆的翻訳後制御は、分解ドメインのＡＡＶ ヘルパータンパク質への融合によって達成される。ある特定の実施形態では、分解ドメインのＡＡＶ ヘルパータンパク質への融合は、細胞培養物中の分解リガンドの存在または不在に基づくＡＡＶ ヘルパータンパク質の制御された分解を可能にする。ある特定の実施形態では、分解リガンドの存在または不在に基づくＡＡＶ ヘルパータンパク質の制御された分解は、細胞培養物中のｒＡＡＶの発現の翻訳後制御をもたらす。
【0023】
明確にするために、ただし限定するものではないが、本開示の主題の詳細な説明は、以下のセクションに分けられる：
５．１．定義
５．２．分解ドメインを使用してＡＡＶの発現を制御する方法
５．３．ｒＡＡＶ産生細胞
５．１．定義
５．２．分解ドメインを使用してＡＡＶの発現を制御する方法
５．３．ｒＡＡＶ産生細胞
【0024】
５．１．定義
本明細書で使用される用語は、一般に、当技術分野において、本開示の文脈の範囲内、および各用語が使用される特定の文脈において、それらの通常の意味を有する。本開示の組成物および方法ならびにそれらの作製方法および使用方法を説明する際に施術者に追加のガイダンスを提供するために、特定の用語を以下に、または明細書の他の場所で述べる。
本明細書で使用される用語は、一般に、当技術分野において、本開示の文脈の範囲内、および各用語が使用される特定の文脈において、それらの通常の意味を有する。本開示の組成物および方法ならびにそれらの作製方法および使用方法を説明する際に施術者に追加のガイダンスを提供するために、特定の用語を以下に、または明細書の他の場所で述べる。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書で「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と組み合わせて使用されるとき、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
【0026】
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」およびそれらの変化形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語または単語であることを意図する。本開示はまた、明示的に規定されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示された実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も考慮する。
【0027】
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容誤差範囲内であることを意味するが、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの制約に部分的に依存する。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野における慣例に従って、３以内または３を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、およびより好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、およびより好ましくは２倍以内を意味し得る。
【0028】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、染色体に組み込まれたｒｅｐ遺伝子を担持するが、Ｒｅｐタンパク質を発現するためにヘルパーウイルス機能を必要とする。本明細書で使用される「ヘルパーウイルス」または「ヘルパーウイルス機能」または「ＡＡＶ ヘルパー」は、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂ）、Ａｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを指すか、またはヘルペスウイルスおよびポックスウイルスなどの他のウイルスの対応する機能を指し、これらは、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングを支援するために、ヘルパー機能を付与することができる。特定の実施形態では、ハイブリッドウイルスが、Ｅ１／Ｅ３欠失を有するが、ヘルパーウイルス機能を提供するＡｄ Ｅ２Ａ、Ａｄ Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡ、ならびに異種核酸に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含有するアデノウイルスから作製された。他の実施形態では、ハイブリッドウイルスは、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスからのヘルパーウイルス機能と共に、異種核酸に隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
【0029】
本明細書で使用される場合、「ヘルパーウイルス機能（複数可）」という用語は、ｒＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングを可能にする（ＲｅｐおよびＣａｐと併せて）、ヘルパーウイルスゲノムにおいてコードされる機能（複数可）を指す。本明細書で使用される場合、「ヘルパーウイルス機能」は、多数の異なる方法で提供されてもよい。例えば、ヘルパーウイルス機能は、ウイルスによって提供され得るか、または、例えば、必須のヘルパー機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列によって細胞にトランスで提供される。別の例では、１つ以上のウイルスをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクター（例えば、アデノウイルス）タンパク質は、本発明の細胞株にｒＡＡＶベクターゲノムと共にトランスフェクションした後、ｒＡＡＶベクターゲノムの複製およびｒＡＡＶベクター粒子へのパッケージングを可能にするときにヘルパー機能を提供する。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはそれらのハイブリッドウイルスから選択されるウイルスによって提供される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルス機能を提供する１つ以上のウイルス、ベクターまたはプラスミドを含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、Ａｄ Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａタンパク質またはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質およびＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ヘルパータンパク質に融合している。
【0030】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶタンパク質」という用語は、ＡＡＶゲノムに由来し、ＡＡＶ産生に必要とされる任意の野生型または修飾タンパク質を指す。「ＡＡＶタンパク質」は、野生型かまたは修飾されているかにかかわらず、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、またはヘルパータンパク質の任意の形態を含む。野生型ＡＡＶ遺伝子の修飾は、発現されたタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす必要はない。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ融合タンパク質」は、ＡＡＶタンパク質のアミノ酸配列が、別のアミノ酸配列、例えばデグロン配列に、直接的にまたはリンカーを介して融合されているＡＡＶタンパク質を含む融合タンパク質を指す。
【0031】
「ベクター」という用語は、核酸の挿入もしくは組込みによって操作され得る、小さな担体核酸分子、例えばプラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、または他のビヒクルを指す。そのようなベクターは、ポリヌクレオチドを細胞中に導入／移入するために、また細胞中に挿入されたポリヌクレオチドを転写または翻訳するために、遺伝子操作に使用することができる（すなわち、「クローニングベクター」）。「発現ベクター」は、遺伝子または核酸配列を宿主細胞における発現に必要とされる不可欠な制御領域と共に含有する特殊なベクターである。
【0032】
ベクターの核酸配列は、一般に、細胞中の増殖のための少なくとも複製開始点および任意選択で、追加のエレメント、例えば、異種ポリヌクレオチド配列、発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆位末端反復（ＩＴＲ）、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）、ポリアデニル化シグナルを含有する。
【0033】
ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを含む１つ以上の核酸エレメントに由来するか、またはそれに基づく。特定のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【0034】
組換えＡＡＶベクターなどのベクターの修飾語、ならびに組換えポリヌクレオチドおよびポリペプチドなどの配列の修飾語のような「組換え」という用語は、一般に自然界では発生しないやり方で組成物が操作されている（すなわち、遺伝子操作されている）ことを意味する。組換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノム中には通常存在しないクリック酸配列（例えば、異種核酸配列）がＡＡＶゲノム内に挿入されている場合であるだろう。「組換え」という用語は、本明細書では、ＡＡＶベクター、ならびにポリヌクレオチドなどの配列に関連して常に使用されるわけではないが、ポリヌクレオチドを含む組換え形態が、そのような省略にもかかわらず、明示的に含まれている。
【0035】
「組換えＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ」は、野生型ゲノムをＡＡＶゲノムから取り出し、異種核酸と称される非天然核酸配列で置き換える分子方法を使用して、ＡＡＶの野生型（ｗｔまたは野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ））ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶについては、ＡＡＶゲノムの一方または両方の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が、ＡＡＶベクター中に保持される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノムのすべてまたは一部が、ＡＡＶゲノム核酸に関して非天然配列で置き換えられているので、ＡＡＶゲノムから区別される。したがって、非天然配列の組み込みが、ＡＡＶベクターを「組換え」ベクターと定義し、これは、「ｒＡＡＶベクター」と称され得る。
【0036】
ｒＡＡＶ配列は、その後の、エクスビボ、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の感染（形質導入）のために、パッケージ化され得る－本明細書では「粒子」と称される。組換えＡＡＶベクター配列がＡＡＶ粒子にカプシド化またはパッケージ化されている場合、粒子は「ｒＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶ粒子」とも称され得る。そのようなｒＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージ化するタンパク質を含む。ＡＡＶの場合には、それらはカプシドタンパク質と称される。
【0037】
ベクター「ゲノム」は、最終的にパッケージ化またはカプシド化されてウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが組換えベクターをコンストラクトまたは製造するために使用される場合には、ベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に相当しない「プラスミド」の部分を含まない。組換えプラスミドのこの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、これは、プラスミドのクローニングおよび増幅、増殖ならびに組換えウイルス産生に必要なプロセスに重要であるが、それ自体はウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子中にパッケージ化またはカプシド化されない。したがって、ベクター「ゲノム」は、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）によってパッケージ化またはカプシド化される核酸を指す。
【0038】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、核酸、オリゴヌクレオチドのすべての形態を指すように、本明細書では互換的に使用される。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡならびにアンチセンスＤＮＡ、およびスプライシングを受けたもしくはスプライシングを受けていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ならびに阻害性ＤＮＡまたはＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、短もしくは低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短もしくは低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、トランス－スプライシングＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ）が含まれる。核酸には、天然に存在する、合成、および意図的に修飾または改変されたポリヌクレオチド（例えば、バリアント核酸）が含まれる。ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片などの核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【0039】
ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、もしくは三本鎖、線状もしくは環状であり得、任意の長さのものであり得る。ポリヌクレオチドを論議する際に、特定のポリヌクレオチドの配列または構造は、５’から３’方向にむかって配列を提供する慣例に従って、本明細書で記載され得る。
【0040】
「導入遺伝子」は、本明細書において、簡便には、細胞または生物体へ導入されることを意図された、または導入された異種核酸を指す。導入遺伝子は、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードするか、または阻害性ＲＮＡをコードする遺伝子などの任意の異種核酸を含む。
【0041】
異種核酸は、ＡＡＶなどのベクター、「形質導入」または「トランスフェクション」を通して、細胞中に導入／移入され得る。「形質導入する」という用語およびその文法的変形は、ｒＡＡＶベクターなどの分子の細胞または宿主生物への導入を指す。導入された異種核酸もまた、レシピエント細胞または宿主生物中で染色体外に、または一過性でだけ存在してもよい。
【0042】
「形質導入細胞」は、導入遺伝子が導入された細胞である。したがって、「形質導入」細胞（例えば、細胞または組織または組織細胞などの哺乳動物の）は、外因性分子、例えば核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞への組込み後の、細胞における遺伝子変化を意味する。したがって、「形質導入」細胞は、外因性核酸がその中に導入された細胞またはその子孫である。細胞（複数可）は増殖され、導入されたタンパク質が発現され、または核酸が転写される。遺伝子療法用途および方法については、形質導入細胞は、対象の体内にあり得る。
【0043】
「発現調節エレメント」は、一種の制御エレメントであり、作用可能に連結された核酸の発現に影響を与える核酸配列（複数可）を指す。調節エレメントは、プロモーターおよびエンハンサーなどの本明細書に記載されるような発現調節エレメントを含む。ＡＡＶベクターを含むベクター配列は、１つ以上の「発現調節エレメント」を含み得る。典型的には、そのようなエレメントは、適切な異種ポリヌクレオチドの転写および必要に応じて翻訳を容易にするために含まれる（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にするための遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンなど）。そのようなエレメントは、典型的には、シスで作用し、「シス作用性」エレメントと称されるが、トランスで作用してもよい。
【0044】
発現調節は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性などのレベルで引き起こされ得る。典型的には、転写を調節する発現調節エレメントは、転写された核酸の５’末端の近くに並置されている（すなわち「上流」にある）。発現調節エレメントは、転写された配列の３’末端に位置する（すなわち「下流」にある）か、転写物内に（例えば、イントロン内に）位置することができる。
【0045】
機能的に、作用可能に連結された核酸の発現は、エレメント（例えば、プロモーター）によって少なくとも一部は調節可能であり、それにより、エレメントは核酸の転写を調節し、必要に応じて、転写物の翻訳を調節する。発現調節エレメントの具体的な例はプロモーターであり、これは、通常、転写された核酸配列の５’に位置する。プロモーターは、典型的には、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して、作用可能に連結された核酸から発現される量を増加させる。
【0046】
別のタイプの制御エレメントには、Ｔｅｔが含まれる。Ｔｅｔ依存的誘導では、標的導入遺伝子からの発現は、誘導性プロモーターに依存する。プロモーターは、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのテトラサイクリン誘導体のレベルによって制御され得る。Ｔｅｔ－Ｏｎプロモーターの活性化は、Ｄｏｘの存在下でプロモーターに結合することができる追加の活性化因子タンパク質の存在に依存する。対照的に、Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステムの場合には、転写は、Ｄｏｘの存在下で不活性である。誘導性システムの他の例としては、Ｃｕｍａｔｅ、アブシジン酸（ＡＢＡ）、ラパマイシン、タモキシフェン誘導性システムが挙げられる。本明細書に開示される分解リガンド依存性分解ドメインもまた、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ、ＣＲＩＳＰＲ、リボスイッチおよび光で切り替え可能な導入遺伝子システムと共に同様に使用され得る。本明細書で使用される「エンハンサー」は、異種核酸に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントの上流に位置するが、機能することもあり、配列の下流もしくは配列内に位置することもできる。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントによって与えられる発現を上回る作用可能に連結された核酸の発現を増加させる。
【0047】
プロモーターなどの本明細書における発現調節エレメントは、典型的には、転写された配列から遠く離れたところに位置付けられる。特定の実施形態では、プロモーターなどの発現調節エレメントは、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの少なくとも約２５ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５～５，０００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約２５０～２，５００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約５００～２，０００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，０００～１，９００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，５００～１，９００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，６００～１，８００ヌクレオチド５’に位置付けられ、ｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，７００～１，８００ヌクレオチド５’に位置付けられ、またはｒｅｐ遺伝子開始コドンの約１，７５０ヌクレオチド５’に位置付けられる。
【0048】
発現調節エレメントには、多くの異なる細胞型におけるポリヌクレオチドの発現を促進することができる、遍在するか無秩序なプロモーター／エンハンサーが含まれる。そのようなエレメントとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列、および種々の哺乳動物細胞型で活性な他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーターならびにホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
発現調節エレメントは、異種ポリヌクレオチドのための天然エレメント（複数可）も含む。天然調節エレメント（例えば、プロモーター）は、異種ポリヌクレオチドの発現が天然の発現を模倣するべきであることが望ましい場合に、使用されてもよい。イントロン、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列などの他の天然調節エレメントも使用されてもよい。
【0050】
「作用可能に連結された」という用語は、核酸配列の発現に必要である調節配列が、核酸配列の発現を引き起こすように、配列に対して適切な位置で配置されることを意味する。この同じ定義は、時には、発現ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターにおける核酸配列および転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、および停止エレメント）の配置に適用される。
【0051】
核酸との作用可能な連結における発現調節エレメントの例では、関係は、調節エレメントが核酸の発現を調整するようなものである。より具体的には、例えば、作用可能に連結された２つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列のうちの少なくとも１つが他の配列に対して生理的影響を及ぼすことができるような関係で、２つのＤＮＡが配置されている（シスまたはトランスで）ことを意味する。
【0052】
本明細書で開示されるように、発現調節エレメントとＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子との間に位置付けられた核酸スペーサー配列は、ｒｅｐ遺伝子の発現を実質的に低減または排除し、それによって、次にはＲｅｐタンパク質の発現を低減または排除し、細胞がアデノウイルスＥ１ａタンパク質も発現しながらでも生存することを可能にする。例えば、ハイブリッドウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスによって提供される、ヘルパーウイルス機能のそのような細胞への添加は、ｒｅｐ遺伝子発現に対するスペーサー核酸の減衰する効果を克服することができ、次には、ｒｅｐ遺伝子の発現を促進し、それによって、Ｒｅｐタンパク質の発現を提供する。
【0053】
ｒＡＡＶベクターのための追加のエレメントとしては、限定されないが、転写停止シグナルまたは終止コドン、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の１つ以上のコピーなどの配列に隣接する５’または３’非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ポリＡ）配列）、またはイントロンが挙げられる。
【0054】
さらなるエレメントとしては、例えば、パッケージングを改善し、夾雑する核酸の存在を低減するために、例えば、充填剤またはスタッファーポリヌクレオチド配列が含まれる。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ、またはわずかにそれ以上であるサイズ範囲を有するＤＮＡのインサートを受入れる。したがって、短い配列の場合、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターパッケージングに許容可能なウイルスゲノム配列のほぼ通常のサイズまたは通常のサイズに長さを調整するために、スタッファーまたは充填剤を含める。さまざまな実施形態では、充填剤／スタッファー核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７ｋｂ未満の核酸配列の場合、充填剤またはスタッファーポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされると（例えば、ベクター中に挿入されると）約３．０～５．５ｋｂ、または約４．０～５．０ｋｂ、または約４．３～４．８ｋｂの全長を有する長さを有する。
【0055】
野生型異種核酸または導入遺伝子がＡＡＶベクター粒子内にパッケージ化されるには大きすぎる場合、異種核酸は、ＡＡＶベクター内のパッケージ化およびＡＡＶベクターによる送達のために、修飾型、断片化、または短縮型の形態で提供されてもよく、それによって、治療用タンパク質または核酸産物などの機能性タンパク質または核酸産物が最終的に提供される。
【0056】
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸は、修飾型もしくは短縮型の形態で提供され、または異種核酸は、別個の複数のＡＡＶベクターによって送達される複数のコンストラクトで提供される。
【0057】
ある特定の態様では、異種核酸は、機能に不要な部分の除去を含み、それによってコードする異種ポリヌクレオチドがＡＡＶベクター内のパッケージングのためにサイズが短縮されている、コードされるタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の機能性を維持する短縮型バリアントとして提供される。
【0058】
ある特定の態様では、異種核酸は、各々がタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の異なる部分をコードする核酸を提供し、それによって、細胞中で組み立てられ、機能するタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の複数の部分を送達する、スプリットＡＡＶベクターで提供される。
【0059】
他の態様では、異種核酸は、オーバーラッピングベクター、トランススプライシングベクターまたはハイブリッドトランススプライシングデュアルベクターの技術を使用して、デュアルＡＡＶベクターによって提供される。ある特定の実施形態では、細胞中で組み合わさり、完全長タンパク質（例えば、治療用タンパク質）がそれから発現される完全な発現カセットを生成する、２つのオーバーラッピングＡＡＶベクターが使用される。
【0060】
「止血関連障害」は、血友病Ａ、阻害性抗体を有する血友病Ａ、血友病Ｂ、阻害性抗体を有する血友病Ｂ、いずれかの凝固因子：ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子の欠乏症、複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠乏症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、またはガンマ－カルボキシラーゼ欠乏症；外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固症、または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワーファリン、または小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰な抗凝固；ならびに血小板障害、例えば、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、および貯蔵プール欠乏症などの出血性疾患を指す。
【0061】
「単離された」という用語は、組成物の修飾語として使用される場合、組成物が、ヒトの手によって作製されるか、またはそれらの天然に存在するｉｎ ｖｉｖｏ環境から完全にもしくは少なくとも一部が分離されていることを意味する。一般に、単離された組成物は、通常、それらが自然界で関連している１つ以上の材料、例えば、１つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。
【0062】
「単離された」という用語は、ヒトの手によって製造された組み合わせ、例えば、ｒＡＡＶ配列、またはＡＡＶベクターゲノムをパッケージ化するか、またはカプシド化するｒＡＡＶ粒子および医薬製剤を除外しない。「単離された」という用語はまた、ハイブリッド／キメラ、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）もしくは誘導体化形態、またはヒトの手によって製造された宿主細胞中で発現される形態などの組成物の代替物理的形態も除外しない。
【0063】
「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０～６０重量％の目的の化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。調製物は、少なくとも７５重量％、または少なくとも８５重量％、または約９０～９９重量％の目的の化合物を含み得る。純度は、目的の化合物に適切な方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【0064】
「～から本質的になる」という語句は、特定のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に言及する場合、所与の配列番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に言及する場合、この語句は、配列自体および配列の基本的および新規な特性に影響を及ぼさない分子修飾を含む。
【0065】
「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」およびその文法的変化は、「整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）」配列の場合に、２つ以上の参照されたエンティティ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が同じであることを意味する。したがって、例として、２つのタンパク質配列が同一である場合、それらは少なくとも参照された領域または部分内に同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、それらは少なくとも参照された領域または部分内に同じ核酸配列を有する。同一性は、配列の定義されたエリア（領域またはドメイン）にわたって存在してもよい。
【0066】
同一性の「エリア」または「領域」とは、同じである２つ以上の参照されたエンティティの一部分を指す。したがって、２つのタンパク質配列または核酸配列が、１つ以上の配列エリアまたは領域にわたって同一である場合、これらは、その領域内において同一性を共有する。「整列された」配列とは、多くの場合、参照配列と比較して欠けているまたは追加の塩基もしくはアミノ酸（ギャップ）の修正を含有する、複数のタンパク質（アミノ酸）または核酸の配列を指す。
【0067】
同一性は、配列の全長にわたってまたは一部に広がることができる。ある特定の実施形態では、パーセント同一性を共有する配列の長さは、２、３、４、５個以上の近接するアミノ酸または核酸であり、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個などの近接する核酸またはアミノ酸である。追加の実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、２１個以上の近接するアミノ酸または核酸であり、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個などの近接するアミノ酸または核酸である。さらなる実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、４１個以上の近接するアミノ酸または核酸であり、例えば、４２、４３、４４、４５、４５、４７、４８、４９、５０個などの近接するアミノ酸または核酸である。さらに他の実施形態では、同一性を共有する配列の長さは、５０個以上の近接するアミノ酸または核酸であり、例えば、５０～５５、５５～６０、６０～６５、６５～７０、７０～７５、７５～８０、８０～８５、８５～９０、９０～９５、９５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～５００、５００～１，０００個などの近接するアミノ酸または核酸である。
【0068】
２つの配列の間の同一性（相同性）または「パーセント同一性」の範囲は、コンピュータプログラムおよび／または数値計算アルゴリズムを使用して確かめることができる。本発明の目的のために、核酸配列の比較は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ｉｎ Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．１を使用して実施される。便宜上、そのプログラムによって指定されたデフォルトパラメータ（ギャップ形成ペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝４）を配列同一性を比較するために本明細書での使用を意図する。あるいは、デフォルトパラメータを伴うギャップありアライメントを使用するアメリカ国立生物工学情報センターによって提供されるＢｌａｓｔｎ２．０プログラム（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／でワールドワイドウェブにおいて見られる；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－４１０）を用いて、核酸配列およびアミノ酸配列の間の同一性と類似性のレベルを決定してもよい。ポリペプチド配列を比較する場合には、典型的には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ５０などのスコアリング行列と組み合わせて使用する。同一性の程度を定量化するのに、ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）ならびにＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも使用されている（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１３２：１８５（２０００）；およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１））。ドロネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）ベースの位相マッピングを使用して、タンパク質構造類似性を定量化するプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：３２０（２００３））。
【0069】
本発明の修飾／バリアントＡＡＶカプシドをコードする核酸および異種核酸が含まれる、核酸分子、発現ベクター（例えば、ＡＡＶベクターゲノム）、プラスミドは、組換えＤＮＡ手法を使用して調製され得る。核酸配列情報を入手できることは、本発明の単離された核酸分子のさまざまな手段による調製を可能にする。例えば、核酸配列は、さまざまな標準クローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞発現、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および化学合成技術を介して作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動などにより決定可能である。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーションまたはコンピュータベースのデータベーススクリーニング技術を使用して単離することができる。そのような技術は、以下に限定されないが、次のようなものが含まれる：（１）プローブを用いて同種のヌクレオチド配列を検出するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリを使用して共有される構造的特徴を有するポリペプチドを検出する抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列のアニーリングを行うことが可能なプライマーを使用したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連する配列の配列データベースのコンピュータによる検索；および（５）サブトラクトされた核酸ライブラリの差異スクリーニング。
【0070】
５．２．分解ドメインを使用してＡＡＶ産生を制御する方法
一態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶの発現の翻訳後制御のための細胞培養の方法を対象とする。ある特定の実施形態では、細胞培養物中のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質発現の可逆的翻訳後制御は、分解ドメイン（「デグロン」）のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって達成される。ある特定の実施形態では、分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合は、分解リガンドまたは他の「阻害剤」、例えば、デグロンに結合して、その分解の速度を改変する小分子リガンドまたはデグロンの分解の速度を改変する光もしくは温度などの阻害剤の存在または不在に基づいて、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の分解の制御を可能にする。ある特定の実施形態では、分解リガンドまたは他の阻害剤の存在または不在に基づくＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の制御された分解は、細胞培養物中のｒＡＡＶの発現の翻訳後制御をもたらす。本明細書で使用される場合、「分解リガンド依存性分解ドメイン」という用語は、分解リガンドに結合するデグロンドメインを指す。本明細書で使用される場合、「分解リガンド」という用語は、分解ドメインに結合するリガンドを指す。
一態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶの発現の翻訳後制御のための細胞培養の方法を対象とする。ある特定の実施形態では、細胞培養物中のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質発現の可逆的翻訳後制御は、分解ドメイン（「デグロン」）のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって達成される。ある特定の実施形態では、分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合は、分解リガンドまたは他の「阻害剤」、例えば、デグロンに結合して、その分解の速度を改変する小分子リガンドまたはデグロンの分解の速度を改変する光もしくは温度などの阻害剤の存在または不在に基づいて、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の分解の制御を可能にする。ある特定の実施形態では、分解リガンドまたは他の阻害剤の存在または不在に基づくＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の制御された分解は、細胞培養物中のｒＡＡＶの発現の翻訳後制御をもたらす。本明細書で使用される場合、「分解リガンド依存性分解ドメイン」という用語は、分解リガンドに結合するデグロンドメインを指す。本明細書で使用される場合、「分解リガンド」という用語は、分解ドメインに結合するリガンドを指す。
【0071】
任意の好適なデグロンは、本開示の方法と関連付けて使用することができる。例えば、限定されないが、デグロンは、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（「ＦＫＢＰ」）と称されるタンパク質をコードするヒト遺伝子から改変されている。ある特定の実施形態では、デグロンは、ＦＫＢＰに由来する。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰデグロンが由来するＦＫＢＰバリアントタンパク質は、Ｆ３６Ｖアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰデグロンが由来するＦＫＢＰバリアントタンパク質は、Ｌ１０６Ｐアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰデグロンが由来するＦＫＢＰバリアントタンパク質は、両方のＦ３６ＶおよびＬ１０６Ｐアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰの改変は、ａ）分解リガンド、例えば、Ｓｈｉｅｌｄ１に対するその特異性を改善するために、結合ポケットをＦＫ５０６を超えて深くし、および／またはｂ）その分解リガンドの不在下でタンパク質をより不安定にする。ｄＴＡＧ－１３は、ユビキチン媒介性分解のために、変異ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ）配列を標的とすることができる小分子である。これは、標的化タンパク質配列をＥ３ユビキチンリガーゼのセレブロンに連結させることによって機能することができる。ｄＴＡＧ－１３は、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ融合タンパク質およびそれに融合されたタンパク質の分解をもたらすことができる。本明細書で使用される場合、ＦＫＢＰ１２ドメインは、「ＦＫＢＰ」と称される。
【0072】
ある特定の実施形態では、デグロンは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ベースのデグロン、オーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）ドメイン、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）ベースのデグロン、スプリットユビキチンベースのデグロンシステム、プロテアーゼベースのデグロンシステム、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）ベースのデグロンシステム、抗体依存性タンパク質デグロンシステム、光感受性デグロン（ｐｓｄ）、リン酸化依存性デグロン、または温度依存性デグロンである。
【0073】
ある特定の実施形態では、デグロンは、分解リガンドもしくは阻害剤の存在または不在によって制御される。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがＦＫＢＰバリアントタンパク質である場合、小分子リガンドはＳｈｉｅｌｄ１である。
【0074】
ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ベースのデグロンである場合、リガンドはトリメトプリム（ＴＭＰ）である。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがオーキシン誘導性デグロン（ＡＩＤ）である場合、リガンドはオーキシンである。ある特定の実施形態では、デグロンがオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）ベースのデグロンである場合、リガンドはアンチザイムである。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがスプリットユビキチンベースのデグロンシステムである場合、リガンドはラパマイシンである。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがプロテアーゼベースのデグロンシステムである場合、阻害剤は、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤またはＴＥＶプロテアーゼ発現でありうる。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）ベースのデグロンシステムである場合、阻害剤はＰＲＯＴＡＣ発現である。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンが抗体依存性タンパク質デグロンシステムである場合、リガンドは、対応する抗体である。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンが光感受性デグロン（ｐｓｄ）である場合、阻害剤は光である。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンがリン酸化依存性デグロンである場合、阻害剤は、対応するキナーゼ活性化因子である。ある特定の実施形態では、例えば、デグロンが温度依存性デグロンである場合、阻害剤は、温度変化である。
【0075】
ある特定の実施形態では、デグロン配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のＣ末端に連結される。ある特定の実施形態では、デグロン配列は、ＡＡＶ－Ｒｅｐタンパク質のＮ末端に連結される。ある特定の実施形態では、デグロンとＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、柔軟なリンカーを通して連結される。ある特定の実施形態では、デグロンとＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、剛直なリンカーを通して連結される。ある特定の非限定的な実施形態では、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する。ある特定の非限定的な実施形態では、剛直なリンカーは、アミノ酸配列：ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＬＥＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡ ＡＡＫＡを有する。
【0076】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ウイルスの産生を制御することを対象とし、本方法は、哺乳動物細胞に、目的の遺伝子および融合タンパク質をコードする核酸を含むｒＡＡＶを導入することであって、融合タンパク質が、Ｒｅｐタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む、導入することと、ｒＡＡＶウイルスを産生するのに好適な条件下で、細胞を培養することと、細胞を分解リガンドと接触させることであって、分解リガンドが分解ドメインに結合して、Ｒｅｐタンパク質の発現を制御し、それによって、ｒＡＡＶの産生を制御する、接触させることとを含む。
【0077】
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｅ１ａ発現細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＰＥＲＣ６細胞である。
【0078】
ある特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、またはＲｅｐ４０タンパク質である。
【0079】
本開示の方法は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を促進させるために、プロモーターを含む好適な制御エレメントの使用を含む。ある特定の実施形態では、好適なプロモーターは、真核生物プロモーター、原核生物プロモーター、またはウイルスプロモーターであり得る。好適なプロモーターには、非誘導性プロモーターおよび非組織特異的プロモーターが含まれる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶ ｐ５プロモーターであり、これは、その天然状態で、ｒｅｐ遺伝子からのＲｅｐタンパク質の発現を促進する。ある特定の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーター／エンハンサーである。追加の好適なプロモーターの非限定的な例には、多くの異なる細胞型におけるポリヌクレオチドの発現を促進することができる、遍在するか無秩序なプロモーターが含まれる。そのようなエレメントとしては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター配列、および種々の哺乳動物細胞型で活性な他のウイルスプロモーター、または合成エレメント（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、細胞質β－アクチンプロモーターならびにホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ヒト伸長因子－１αＥＦ１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＳＦＦＶプロモーター、ｐ１９プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）プロモーターから選択される。ある特定の実施形態では、プロモーターは、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子の近位または遠位に位置してもよい。ある特定の実施形態では、プロモーターを含む制御エレメントは、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子に対してシスまたはトランスであってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸の発現を対象とし、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ９ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ１０ Ｒｅｐタンパク質、またはＡＡＶ１１ Ｒｅｐタンパク質である。本開示の方法は、ＡＡＶを産生するあらゆる細胞型に適用可能であるため、ＡＡＶは、例えば、ヒト、鳥類、ウシ、イヌ、ウマ、霊長類、非霊長類、ヒツジ、またはそれらの任意の誘導体とすることができる。
【0080】
ある特定の実施形態では、本開示の方法によって産生されるｒＡＡＶは、任意のウイルス株または血清型を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、Ｒｈ８、Ｒｈ１０、Ｒｈ７４、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ－２ｉ８、ＬＫ０３、ＲＨＭ４－１、ＤＪ、ＤＪ８、ＮＰ５９、Ａｎｃ－８０およびそれらのバリアントを含むが、これらに限定されない、任意のＡＡＶゲノムに基づくことができ、これらには、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９（６）１０７０－１０７８（２０１１）（特にＡＡＶ９．４７を含むＡＡＶ９バリアントについて記載）、米国特許第７，９０６，１１１号（特にＡＡＶ９（ｈｕ１４）について記載）、米国特許第１０，５３２，１１１号（特にＮＰ５９について記載）、米国特許第ＵＳ１０７３８０８７号（特にＡｎｃ－８０について記載）、ＷＯ２０１２／１４５６０１、ＷＯ２０１３／１５８８７９、ＷＯ２０１５／０１３３１３、ＷＯ２０１８／１５６６５４、ＵＳ２０１３／００５９７３２、米国特許第９，１６９，２９９号（ＬＫ０３についての説明）、同第９，８４０，７１９号（ＲＨＭ４－１についての説明）、同第７，７４９，４９２号、同第７，５８８，７７２号（ＤＪおよびＤＪ８についての説明）、および同第９，５８７，２８２号に記載のＡＡＶカプシドのバリアントが含まれ、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に援用される。したがって、ｒＡＡＶベクターは、特定の血清型、ならびに混合血清型に特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。
【0081】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、天然のＡＡＶゲノムと同様に配置される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、核酸がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のＮ末端またはＣ末端におけるリンカーおよび／またはデグロン配列をコードすることを除いて、天然ＡＡＶゲノムと同様に配置される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、直接的または間接的にタンデム配置に配置されていない。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、共有結合されていない。ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の追加の適切な配置を使用することができ、例えば、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の順序を、それらの天然のＡＡＶゲノム順序に対して逆転させることができ、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方は、ＩＲＥＳ、自己切断タンパク質（例えば、２Ａペプチド）コード配列、または機能を有さないスタッファー領域を含む配列の前または後にあり得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方を細胞ゲノムに組み込むことができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方を、エピソームプラスミドの維持を増加させるＤＮＡ配列を増加させる因子と組み合わせることができる。
【0082】
ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはそれらのハイブリッドウイルスから選択されるウイルスによって提供される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、ヘルパーウイルス機能を提供する１つ以上のウイルス、ベクターまたはプラスミドを含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質およびＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。
【0083】
ヘルパーウイルス機能は、多数の異なる方法で提供され得る。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、ウイルスによって提供され得るか、または、例えば、必須のヘルパー機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列によって細胞にトランスで提供される。
【0084】
ある特定の実施形態では、デグロン配列は、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、またはＡｄ Ｅ４タンパク質のＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、デグロン配列は、Ａｄ Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、またはＡｄ Ｅ４タンパク質のＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、デグロンおよびＡｄ Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、またはＡｄ Ｅ４タンパク質は柔軟なリンカーを通して連結されている。ある特定の実施形態では、デグロンおよびＡｄ Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、またはＡｄ Ｅ４タンパク質は剛直なリンカーを通して連結されている。
【0085】
ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質、例えば、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、および／またはヘルパータンパク質は、独立して、デグロン配列に連結して、２つ以上のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質を生成する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質の各々は、ＡＡＶタンパク質のＣ末端またはＮ末端でデグロンを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質の各々は、異なるデグロン配列を含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質の各々は、同じデグロン配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶタンパク質とそのそれぞれのデグロンとの間の結合は、柔軟なリンカーである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶタンパク質とそのそれぞれのデグロンとの間の結合は、剛直なリンカーである。
【0086】
ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質融合タンパク質は、同じベクター、例えばプラスミド上の配列によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、２つ以上のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質は、例えば、第１のプラスミドが第１のＡＡＶタンパク質－デグロン融合体のコード配列を含み、第２のプラスミドが第２のＡＡＶタンパク質－デグロン融合体のコード配列を含む、別個のベクター上の配列によってコードされ得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質のうちの少なくとも１つの発現は、制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、ＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質のうちの少なくとも２つの発現は、制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、複数のＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質の発現はそれぞれ、異なる制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、ＡＡＶタンパク質－デグロン融合タンパク質のすべての発現は、制御エレメントのコントロール下にある。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、プロモーターである。ある特定の実施形態では、制御エレメントは、Ｔｅｔ応答エレメントである。
【0087】
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、野生型ＡＡＶゲノムに通常は存在しない酸配列、例えば、本明細書では目的の遺伝子または（ＧＯＩ）とも称される異種核酸配列を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、ＧＯＩは、治療用タンパク質をコードする核酸配列または阻害性核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、ＡＡＶなどのベクターの形質導入またはトランスフェクションを通して、細胞中に導入／移入され得る。ある特定の実施形態では、導入されたＧＯＩは、レシピエント細胞または宿主生物中で染色体外に、または一過性でだけ存在してもよい。
【0088】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、修飾型もしくは短縮型の形態で提供されるタンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードするか、またはＧＯＩは、別個の複数のＡＡＶベクターによって送達される複数のコンストラクトで提供される。
【0089】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、機能に不要な部分の除去を含み、それによってＧＯＩがＡＡＶベクター内のパッケージングのためにサイズが短縮されている、コードされるタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の機能性を維持する短縮型バリアントとして提供される。
【0090】
ある特定の態様では、ＧＯＩは、各々がタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の異なる部分をコードする核酸を提供し、それによって、細胞中で組み立てられ、機能するタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の複数の部分を送達する、スプリットＡＡＶベクターで提供される。
【0091】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、オーバーラッピングベクター、トランススプライシングデュアルベクターまたはハイブリッドトランススプライシングベクターの技術を使用して、デュアルＡＡＶベクターによって提供される。ある特定の実施形態では、細胞中で組み合わさり、完全長タンパク質（例えば、治療用タンパク質）がそれから発現される完全な発現カセットを生成する、２つのオーバーラッピングＡＡＶベクターが使用される。
【0092】
５．３．ＡＡＶ産生細胞
別の態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。例えば、限定されないが、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現が分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって制御される、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。
別の態様では、本開示の主題は、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。例えば、限定されないが、本開示は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現が分解ドメインのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質への融合によって制御される、ｒＡＡＶ産生細胞を対象とする。
【0093】
本開示のｒＡＡＶ産生細胞の実施形態は、ｒＡＡＶまたはＡＡＶを産生することができる任意の細胞型またはシステムを含む。さまざまなシステムのいくつかの例が、以前に、例えば、Ｃｏｎｌｏｎ ａｎｄ Ｍａｖｉｌｉｏ、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，８：１８１－１８２（２０１８）に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。本開示の実施形態は、哺乳動物細胞におけるプラスミドの一過性トランスフェクションによるｒＡＡＶの作製、安定な細胞株におけるｒＡＡＶの産生、哺乳動物細胞における単純ヘルペスウイルスによるｒＡＡＶの産生、およびＳｆ９細胞におけるバキュロウイルスによるｒＡＡＶの産生を含む。
【0094】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、真核細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、動物細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、昆虫細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、ヒト細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、またはＥｘｐｉ２９３細胞である。
【0095】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【0096】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、昆虫（Ｓｆ９）細胞である。
【0097】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現しない。
【0098】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、浮遊細胞である。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、接着細胞である。
【0099】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、少なくとも約１×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約５×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍＬ、または少なくとも約２×１０７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、約１×１０６～５×１０６細胞／ｍＬ、約５×１０６～１×１０７細胞／ｍＬ、約１×１０７～２×１０７細胞／ｍＬの細胞密度で培養することができる。
【0100】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、培地または増殖培地中に存在する。
【0101】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、保存に好適な培地中にある。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、０℃以下、－３０℃以下、－８０℃以下、または－１６０℃以下での長期保存に好適な培地中にある。
【0102】
ある特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞を対象とし、本細胞は、Ｒｅｐタンパク質、リンカー、および分解リガンド依存性分解ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、分解リガンド依存性分解ドメインは、ＦＫＢＰバリアントタンパク質である。ある特定の実施形態では、分解リガンドは、小分子リガンドである。ある特定の実施形態では、小分子は、Ｓｈｉｅｌｄ１である。
【0103】
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ産生細胞は、Ｅ１ａ発現細胞である。ある特定の実施形態では、Ｅ１ａ発現細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【0104】
ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞のリガンド依存性分解ドメインは、リンカーを介して、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞のリガンド依存性分解ドメインは、リンカーを介して、Ｒｅｐタンパク質のＮ末端に融合されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、柔軟なリンカーである。ある特定の非限定的な実施形態では、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する。ある特定の実施形態では、リンカーは、剛直なリンカーである。ある特定の非限定的な実施形態では、剛直なリンカーは、アミノ酸配列：ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＬＥＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ ＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡを有する。
【0105】
ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞は、天然のＡＡＶゲノムと同様に配置された、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、核酸がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のＮ末端またはＣ末端におけるリンカーおよび／またはデグロン配列をコードすることを除いて、天然ＡＡＶゲノムと同様に配置される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、直接的または間接的にタンデム配置に配置されていない。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする核酸は、共有結合されていない。ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の追加の適切な配置を使用することができ、例えば、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の順序を、それらの天然のＡＡＶゲノム順序に対して逆転させることができ、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方は、ＩＲＥＳ、自己切断タンパク質（例えば、２Ａペプチド）コード配列、または機能を有さないスタッファー領域を含む配列の前または後にあり得る。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方を細胞ゲノムに組み込むことができる。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード配列の一方または両方を、エピソームプラスミドの維持を増加させるＤＮＡ配列を増加させる因子と組み合わせることができる。
【0106】
ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞は、ヘルパーウイルス機能が可能であるウイルスを含む。ある特定の実施形態ではウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはそれらのハイブリッドウイルスから選択される。ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞は、ヘルパーウイルス機能を提供する１つ以上のウイルス、ベクターまたはプラスミドを含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルス機能は、アデノウイルス（Ａｄ）Ｅ１タンパク質（例えば、Ａｄ Ｅ１ａまたはＡｄ Ｅ１ｂタンパク質）、Ａｄ Ｅ２Ａタンパク質、Ａｄ Ｅ４タンパク質およびＡｄ ＶＡ ＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。
【0107】
ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞は、ＧＯＩを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、ＧＯＩは、治療用タンパク質をコードする核酸配列または阻害性核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、ＡＡＶなどのベクターの形質導入またはトランスフェクションを通して、細胞中に導入／移入され得る。ある特定の実施形態では、導入されたＧＯＩは、レシピエント細胞または宿主生物中で染色体外に、または一過性でだけ存在してもよい。
【0108】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、修飾型もしくは短縮型の形態で提供されるタンパク質（例えば、治療用タンパク質）をコードするか、またはＧＯＩは、別個の複数のＡＡＶベクターによって送達される複数のコンストラクトで提供される。
【0109】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、機能に不要な部分の除去を含み、それによってＧＯＩがＡＡＶベクター内のパッケージングのためにサイズが短縮されている、コードされるタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の機能性を維持する短縮型バリアントとして提供される。
【0110】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、各々がタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の異なる部分をコードする核酸を提供し、それによって、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞中で組み立てられ、機能するタンパク質（例えば、治療用タンパク質）の複数の部分を送達する、スプリットＡＡＶベクターで提供される。
【0111】
ある特定の実施形態では、ＧＯＩは、オーバーラッピングベクター、トランススプライシングベクターまたはハイブリッドトランススプライシングデュアルベクターの技術を使用して、デュアルＡＡＶベクターによって提供される。ある特定の実施形態では、本開示の哺乳動物ｒＡＡＶ産生細胞中で組み合わさり、完全長タンパク質（例えば、治療用タンパク質）がそれから発現される完全な発現カセットを生成する、２つのオーバーラッピングＡＡＶベクターが使用される。
【0112】
本発明に従って有用な遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質）をコードする異種核酸の非限定的な例としては、「止血」または血液凝固障害、例えば、血友病Ａ、阻害性抗体を有する血友病Ａ、血友病Ｂ、凝固因子、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、およびＸ、ＸＩ、Ｖ、ＸＩＩ、ＩＩ、フォン・ヴィレブランド因子の欠乏症、複合ＦＶ／ＦＶＩＩＩ欠乏症、サラセミア、ビタミンＫエポキシドレダクターゼＣ１欠乏症、ガンマ－カルボキシラーゼ欠乏症；貧血、外傷、損傷、血栓症、血小板減少症、脳卒中、凝固症、または播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に関連する出血；ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ワーファリン、小分子抗血栓薬（すなわち、ＦＸａ阻害剤）に関連する過剰な抗凝固；ならびに血小板障害、例えば、ベルナール・スーリエ症候群、グランツマンの血小板無力症、および貯蔵プール欠乏症などの血小板障害が挙げられるが、これらに限定されない疾患または障害の治療で使用し得るものが挙げられる。
【0113】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を与えるか、または中枢神経系に起因する。ある特定の実施形態では、疾患は、神経変性疾患である。ある特定の実施形態では、ＣＮＳまたは神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、遺伝性痙性片麻痺、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ケネディ病、ポリグルタミンリピート病、またはパーキンソン病である。ある特定の実施形態では、ＣＮＳまたは神経変性疾患は、ポリグルタミンリピート病である。ある特定の実施形態では、ポリグルタミンリピート病は、脊髄小脳変性症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはＳＣＡ１７）である。
【0114】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ａ（ＴＧＦａ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）、ＴＧＦｐ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン ＮＴ－３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン－１およびネトリン－２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、およびチロシンヒドロキシラーゼからなる群から選択される遺伝子産物をコードする異種核酸を含む。
【0115】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ１～ＩＬ－１７）、単球化学誘引タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子からなる群から選択される遺伝子産物をコードする異種核酸を含む。
【0116】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータシンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、ＲＰＥ６５、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、ジストロフィンｃＤＮＡ配列からなる群から選択される遺伝子産物をコードする異種核酸を含む。
【0117】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ポリペプチドをコードする異種核酸、タンパク質をコードするか、もしくは目的の転写物に転写される核酸、またはｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される核酸を含む。
【0118】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ポンペ病の治療のためのＧＡＡ（酸性アルファグルコシダーゼ）；ウィルソン病の治療のためのＡＴＰ７Ｂ（銅輸送ＡＴＰａｓｅ２）；ファブリー病の治療のためのアルファガラクトシダーゼ；シトルリン血症１型の治療のためのＡＳＳ１（アルギノコハク酸シンターゼ）；ゴーシェ病１型の治療のためのベータ－グルコセレブロシダーゼ；テイ・サックス病の治療のためのベータ－ヘキソサミニダーゼＡ；Ｃ１阻害剤欠損症Ｉ型およびＩＩ型としても知られる、遺伝性血管性水腫（ＨＡＥ）の治療のためのＳＥＲＰＩＮＧ１（Ｃ１プロテアーゼ阻害剤またはＣ１エステラーゼ阻害剤）；ならび糖原病Ｉ型（ＧＳＤＩ）の治療のためのグルコース－６－ホスファターゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする異種核を含む。
【0119】
ある特定の実施形態では、異種核酸は、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通制御因子タンパク質）、血液凝固（凝血）因子（第ＸＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、プロテインＣなど）機能獲得血液凝固因子、抗体、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、増殖因子、インスリン様増殖因子１または２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、グリア由来成長因子、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子産物、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、シトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子、薬剤耐性タンパク質、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節特性を有するペプチド、寛容原性または免疫原性ペプチドまたはタンパク質ＴレギトープまたはｈＣＤＲ１、インスリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ－ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（脈絡膜血症）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ－レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノトランスフェラーゼ（回状萎縮症）、レチノシシン１（Ｘ連鎖網膜剥離）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰのＡＲ型：網膜色素変性）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３、４（色覚異常）、ＰＫＤ－１またはＰＫＤ－２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸転移酵素、カテプシンＡ、ＧＭ２－ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化タンパク質、ゲノム編集用の１つ以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはゲノム編集用の修復テンプレートとして使用される１つ以上のドナー配列をコードする。
【0120】
核酸分子、クローニングなどのベクター、発現ベクター（例えば、ベクターゲノム）およびプラスミドは、組換えＤＮＡ技術方法を使用して調製され得る。核酸配列情報を入手できることは、核酸分子のさまざまな手段による調製を可能にする。例えば、ベクターまたはプラスミドを含むＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする異種核酸は、さまざまな標準クローニング、組換えＤＮＡ技術を使用して、細胞発現、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳および化学合成技術を介して作製することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動などにより決定可能である。例えば、核酸は、ハイブリダイゼーションまたはコンピュータベースのデータベーススクリーニング技術を使用して単離することができる。そのような技術は、以下に限定されないが、次のようなものが含まれる：（１）プローブを用いて同種のヌクレオチド配列を検出するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリのハイブリダイゼーション；（２）例えば、発現ライブラリを使用して共有される構造的特徴を有するポリペプチドを検出する抗体スクリーニング；（３）目的の核酸配列のアニーリングを行うことが可能なプライマーを使用したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；（４）関連する配列の配列データベースのコンピュータによる検索；および（５）サブトラクトされた核酸ライブラリの差異スクリーニング。
【実施例】
【0121】
実施例
以下の実施例は、本開示の主題を単に例示するものであり、決して限定と見なされるべきではない。
以下の実施例は、本開示の主題を単に例示するものであり、決して限定と見なされるべきではない。
【0122】
実施例１：Ｒｅｐ－デグロンコンストラクトおよびｒＡＡＶ産生
制御可能なＲｅｐ蓄積およびより高いｒＡＡＶ産生のためのメカニズムの構築のために、さまざまなコントラクトを設計した。Ｒｅｐ導入遺伝子を、不安定化ドメイン（デグロン）でＮ末端もしくはＣ末端においてタグ付けして不安定性を付与し、翻訳されたＲｅｐタンパク質産物を分解のためにプロテアソームのターゲットにした。Ｒｅｐタンパク質分解は、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドの添加によって逆転させることができる。デグロンを、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（「ＦＫＢＰ１２」）をコードするヒト遺伝子から改変させた。タンパク質のＦ３６Ｖ修飾が、そのＳｈｉｅｌｄ１に対する特異性をＦＫ５０６を超えて改善することが、以前に示された（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １９９８）。より不安定なデグロンモチーフを作成するためのその後の取り組みは、Ｌ１０７Ｐ突然変異をもたらした（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２００６）。Ｆ３６ＶおよびＬ１０７Ｐ突然変異を有する、本明細書で「ＦＫＢＰ」と称される、本実施例で使用されたデグロンのアミノ酸配列は、下記の通りであった。
制御可能なＲｅｐ蓄積およびより高いｒＡＡＶ産生のためのメカニズムの構築のために、さまざまなコントラクトを設計した。Ｒｅｐ導入遺伝子を、不安定化ドメイン（デグロン）でＮ末端もしくはＣ末端においてタグ付けして不安定性を付与し、翻訳されたＲｅｐタンパク質産物を分解のためにプロテアソームのターゲットにした。Ｒｅｐタンパク質分解は、Ｓｈｉｅｌｄ１リガンドの添加によって逆転させることができる。デグロンを、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（「ＦＫＢＰ１２」）をコードするヒト遺伝子から改変させた。タンパク質のＦ３６Ｖ修飾が、そのＳｈｉｅｌｄ１に対する特異性をＦＫ５０６を超えて改善することが、以前に示された（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １９９８）。より不安定なデグロンモチーフを作成するためのその後の取り組みは、Ｌ１０７Ｐ突然変異をもたらした（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２００６）。Ｆ３６ＶおよびＬ１０７Ｐ突然変異を有する、本明細書で「ＦＫＢＰ」と称される、本実施例で使用されたデグロンのアミノ酸配列は、下記の通りであった。
【0123】
ｒＡＡＶの産生： ６ウェルプレートで増殖させたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞のトランスフェクションによって、組換えＡＡＶを産生させた。７０～９０％の培養密度の細胞を、ｊｅｔＯＰＴＩＭＵＳ（登録商標）ＤＮＡ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ）トランスフェクション試薬を使用して、３μｇの総ＤＮＡでトランスフェクションした。ＬＫ０３Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドを用いて産生されたポジティブコントロールｒＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法を介して産生された。プラスミドを、１：１：１の比率（１ヘルパー：１ＩＴＲプラスミド：１ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド）で添加した。Ｓｐｌｉｔ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドを用いて産生されたｒＡＡＶプラスミドは、クアドロプルプラスミドトランスフェクション法を用いて産生され、ここでは、ＲｅｐおよびＣａｐプラスミドが互いに等量で使用されたが、特に明記されない限り、ヘルパーおよびＩＴＲプラスミドの半分であった（１ヘルパー：１ＩＴＲプラスミド：０．５Ｒｅｐ：０．５ｃａｐ）。デグロン含有コンストラクトの場合、ｗｔＲｅｐまたはＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドが、ＲｅｐまたはＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドを含有するデグロンで置き換えられた。トランスフェクション後、細胞培養培地を翌日交換した。培地交換後に、小分子Ｓｈｉｅｌｄ－１（Ｔａｋａｒａ）を対応する試料の培地に添加し、細胞をさらに２４～３６時間増殖させて、ＡＡＶ産生を可能にした。粗細胞溶解物抽出物中またはＨＥＫ２９３細胞の培地中のＡＡＶを用いて、標的細胞を形質導入した。
【0124】
粗抽出物中のｒＡＡＶの使用については、細胞をそれらが増殖している細胞培養培地中に再懸濁させ、懸濁液を１．５ｍｌのチューブに移した。洗剤ベースの溶解の代わりに、ドライアイスと３７℃の水浴との間を移動させる４回連続の凍結および融解サイクルによって細胞を溶解させた。各溶解サイクル後に試料をボルテックスして、細胞溶解およびプロモーターウイルス粒子の放出を増強させた。溶解工程の完了時に、試料を、４℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機内で１３，５００×ｇで１０分間遠心分離した。ｒＡＡＶ粒子を含有する上清を、形質導入アッセイで使用するために、新しいチューブに移した。
【0125】
細胞の形質導入： Ｈｕｈ７細胞に、等容量の細胞溶解物またはＡＡＶベクターを含有する細胞培地を形質導入した。簡単に言うと、形質導入の１日前に、Ｈｕｈ７細胞を２４ウェルプレートに播種した。最大で５０ｕｌのＨＥＫ２９３からの未精製のウイルス調製物を、Ｈｕｈ７の培地に添加した。形質導入効率を、生物学的な２反復または３反復で評価した。培地を翌日交換し、試料を、形質導入から４８～７２時間後に、導入遺伝子発現について分析した。ルシフェラーゼ発現の分析については、Ｈｕｈ７細胞を受動的溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で溶解させ、各生物学的試料を分割して、９６ウェル発光アッセイプレートの４つのウェルにプレーティングした。ウミシイタケルシフェラーゼのレベルを、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定し、インジェクターを装備したマイクロプレートルミノメーター（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）で分析した。
【0126】
プラスミドコンストラクトのクローニング： デグロンモチーフを有するコンストラクトのクローニングを、ギブソン・アセンブリー法を使用して行った。簡単に言うと、所望の相同性領域を有する設計されたデグロン－リンカー配列を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからｇＢｌｏｃｋｓ断片として注文した。ＲｅｐのみのプラスミドまたはＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドを含有する骨格とｇｂｌｏｃｋｓとを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ Ｈｉｆｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｅ５５２０）を使用して連結させた。プラスミド精製および配列検証の際に、正しい配列を有するプラスミドをｒＡＡＶ産生実験に使用した。
【0127】
図１および２に示すように、ＲＥＰおよびＣａｐ遺伝子を同じプラスミドまたは別個のプラスミドのいずれかにクローニングした。その目的は、Ｃａｐ発現を変更することなくＲｅｐ発現を制御することであった。Ｒｅｐ配列のＣ末端またはＮ末端にクローニングされたデグロン配列を有するプラスミドを構築した（図１）。２つのタイプのリンカー；剛直なリンカーおよび柔軟なリンカーを試験した。Ｐ４０プロモーターを使用して、Ｃａｐの発現を促進した。Ｒｅｐには、場合によっては、ｐ５プロモーターが使用され、一方ＣＭＶプロモーターは、示されているように、他のもので使用される。
【0128】
図１および２に示すような、導入遺伝子プラスミドのみによる細胞のトランスフェクションは、ネガティブコントロールとして使用された。Ｓｈｉｅｌｄ１を選択されたウェルに添加した（図２）。ｒＡＡＶ産生ＨＥＫ２９３細胞からの培地または細胞溶解物を使用して、Ｈｕｈ７細胞（肝細胞、肝細胞癌）を形質導入した。次いで、Ｈｕｈ７細胞を溶解し、導入遺伝子活性の検出のためにルシフェラーゼ活性を測定した。
【0129】
実施例２：別個のプラスミド上のＲｅｐおよびＣａｐのトランスフェクションによって産生されたｒＡＡＶ
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、ｒＡＡＶが別個のプラスミド上のＲｅｐおよびＣａｐのトランスフェクションによって依然として産生され得るかどうかを判定するために使用した。デグロンを含まないＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、デグロンを含まないＲｅｐのみのプラスミド、およびＣａｐのみのプラスミドを試験した。Ｒｅｐは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあった。Ｃａｐには、ＣＭＶプロモーター（Ｒｅｐの末端が欠けている、ＣＭＶ－Ｃａｐ（＊））およびＰ４０プロモーター（Ｒｅｐの末端が存在するＰ４０－Ｃａｐ）を使用した。図３に示すように、Ｐ４０－Ｃａｐは、標的細胞形質導入によって判定されるように、ｒＡＡＶ産生を助けることができる。しかしながら、ＣＭＶ－ＣａｐはｒＡＡＶ産生を助けることはできない。図３は、ｒＡＡＶが、別個のプラスミド上でのＲｅｐおよびＣａｐのトランスフェクションによって産生され得ることを示す。
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、ｒＡＡＶが別個のプラスミド上のＲｅｐおよびＣａｐのトランスフェクションによって依然として産生され得るかどうかを判定するために使用した。デグロンを含まないＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、デグロンを含まないＲｅｐのみのプラスミド、およびＣａｐのみのプラスミドを試験した。Ｒｅｐは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあった。Ｃａｐには、ＣＭＶプロモーター（Ｒｅｐの末端が欠けている、ＣＭＶ－Ｃａｐ（＊））およびＰ４０プロモーター（Ｒｅｐの末端が存在するＰ４０－Ｃａｐ）を使用した。図３に示すように、Ｐ４０－Ｃａｐは、標的細胞形質導入によって判定されるように、ｒＡＡＶ産生を助けることができる。しかしながら、ＣＭＶ－ＣａｐはｒＡＡＶ産生を助けることはできない。図３は、ｒＡＡＶが、別個のプラスミド上でのＲｅｐおよびＣａｐのトランスフェクションによって産生され得ることを示す。
【0130】
実施例３：Ｓｈｉｅｌｄ１の添加によるｒＡＡＶ産生の制御
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、Ｓｈｉｅｌｄ１の添加が、Ｒｅｐ－デグロンの蓄積に対して翻訳後コントロールを及ぼすことができるかどうかを判定するために使用した。コンストラクトを、Ｃａｐプラスミドを伴ってまたは伴わずにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（図４）。Ｓｈｉｅｌｄ１の添加はｒＡＡＶ産生および標的細胞の形質導入を助けた。図４に示すように、ＲｅｐのみのプラスミドＣ末端デグロンを使用した。形質導入効率は、ｗｔＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドの約１５～２０％であった。
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、Ｓｈｉｅｌｄ１の添加が、Ｒｅｐ－デグロンの蓄積に対して翻訳後コントロールを及ぼすことができるかどうかを判定するために使用した。コンストラクトを、Ｃａｐプラスミドを伴ってまたは伴わずにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（図４）。Ｓｈｉｅｌｄ１の添加はｒＡＡＶ産生および標的細胞の形質導入を助けた。図４に示すように、ＲｅｐのみのプラスミドＣ末端デグロンを使用した。形質導入効率は、ｗｔＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドの約１５～２０％であった。
【0131】
実施例４：さまざまなＲｅｐコンストラクトの制御
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、デグロンの位置（すなわち、Ｃ末端に位置するデグロンまたはＮ末端に位置するデグロン）が、Ｒｅｐ発現の翻訳後制御に影響を与えるかどうかを判定するために使用した。Ｈｕｈ７細胞を、上述のように、ＨＥＫ２９３細胞からの上清で形質導入した。Ｐ４０－Ｃａｐプラスミドを用いて、Ｃａｐの発現を促進させた。図５および１０に示すように、Ｎ末端結合されたデグロンを有するＲｅｐコンストラクトからのｒＡＡＶ産生は、Ｃ末端結合されたデグロンを有するＲｅｐコンストラクトと比較して、あまり厳密に制御されていない発現を示す。
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、デグロンの位置（すなわち、Ｃ末端に位置するデグロンまたはＮ末端に位置するデグロン）が、Ｒｅｐ発現の翻訳後制御に影響を与えるかどうかを判定するために使用した。Ｈｕｈ７細胞を、上述のように、ＨＥＫ２９３細胞からの上清で形質導入した。Ｐ４０－Ｃａｐプラスミドを用いて、Ｃａｐの発現を促進させた。図５および１０に示すように、Ｎ末端結合されたデグロンを有するＲｅｐコンストラクトからのｒＡＡＶ産生は、Ｃ末端結合されたデグロンを有するＲｅｐコンストラクトと比較して、あまり厳密に制御されていない発現を示す。
【0132】
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、Ｒｅｐコード配列のみを有するコンストラクトに対するＲｅｐコード配列とＣａｐコード配列の両方を含むコンストラクトに関連付けて、Ｓｈｉｅｌｄ１のＲｅｐ発現の翻訳後制御に影響を与えるかどうかを判定するために使用した。Ｐ４０－Ｃａｐプラスミドを用いて、「ＣａｐＰプラスミド」が提供される（「＋」と記載される）Ｃａｐ発現を促進させた。図６に示すように、Ｃ末端に結合したデグロンを含むＲｅｐがＣａｐの存在下で発現される場合（単一のＲｅｐ／Ｃａｐコンストラクトのいずれかから発現されるか、またはＣａｐがトランスで発現される）のｒＡＡＶ産生のわずかな増加にもかかわらず、ｒＡＡＶ産生は、Ｃ末端に結合したデグロンを含むＲｅｐがＣａｐおよびＳｈｉｅｌｄ１の両方の存在下で発現される場合に著しく増加される。やはり、Ｃａｐは、単一のＲｅｐ／Ｃａｐコンストラクトから発現され得るか、またはＣａｐはトランスで発現される。
【0133】
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、Ｃ末端に結合したデグロンを含むＲｅｐをコードするプラスミドの増加する量を添加することのｒＡＡＶ産生に対する影響を判定するために使用した。図７に示すように、Ｃ末端に結合したデグロンを含むＲｅｐをコードするプラスミドの増加する量は、全体のｒＡＡＶ産生を低減し、Ｓｈｉｅｌｄ１による区別された制御をあまりもたらさなかった。
【0134】
実施例５：剛直なリンカーまたは柔軟なリンカーによるＲｅｐコンストラクトの制御
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、ＲｅｐのＣ末端とデグロンとの間のリンカーのタイプの影響を判定するために使用した。２つのタイプのリンカー；剛直なリンカーおよび柔軟なリンカーを試験した。図８は、デグロンを欠くＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；強固に結合されたＣ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；柔軟に結合されたＣ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；およびＲｅｐまたはＣａｐが提供されずデュアルＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドがない対照（発現はＰ５遠位プロモーターによって促進される）についての結果を示す。図９は、デグロンを欠くＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；強固に結合されたＮ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；柔軟に結合されたＮ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；およびＲｅｐまたはＣａｐが提供されずデュアルＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドがない対照（発現はＰ５遠位プロモーターによって促進される）についての結果を示す。図８および９の両方において、柔軟なリンカーの使用は、Ｒｅｐの発現のＳｈｉｅｌｄ１に媒介された翻訳後コントロールと関連し、ｒＡＡＶ産生をもたらす。
実施例１の方法を、具体的に記載されているものは除き、ＲｅｐのＣ末端とデグロンとの間のリンカーのタイプの影響を判定するために使用した。２つのタイプのリンカー；剛直なリンカーおよび柔軟なリンカーを試験した。図８は、デグロンを欠くＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；強固に結合されたＣ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；柔軟に結合されたＣ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；およびＲｅｐまたはＣａｐが提供されずデュアルＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドがない対照（発現はＰ５遠位プロモーターによって促進される）についての結果を示す。図９は、デグロンを欠くＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；強固に結合されたＮ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；柔軟に結合されたＮ末端デグロンを含むＲｅｐ（＋／－Ｓｈｉｅｌｄ１）；およびＲｅｐまたはＣａｐが提供されずデュアルＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドがない対照（発現はＰ５遠位プロモーターによって促進される）についての結果を示す。図８および９の両方において、柔軟なリンカーの使用は、Ｒｅｐの発現のＳｈｉｅｌｄ１に媒介された翻訳後コントロールと関連し、ｒＡＡＶ産生をもたらす。
【0135】
実施例６：Ｒｅｐ発現およびＡＡＶ産生の分析
Ａ．材料および方法
ａ．トランスフェクション
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ２９３培地中に、１．４Ｅ６生細胞／ｍＬに播種した。生細胞が２Ｅ６～３Ｅ６細胞／ｍＬになったときに、トランスフェクションを実施した。ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。ＰＥＩ：ＤＮＡ比は２であり、１００万個の細胞当たり０．６μｇのＤＮＡを使用した。トリプルトランスフェクションを、ＲＨＭ４－１ Ｒｅｐ Ｃａｐ、ヘルパーおよびガウシアルシフェラーゼプラスミドを用いて実施した。スプリットＲｅｐおよびＣａｐプラスミドを、１：４（Ｒｅｐ：Ｃａｐ）の比で使用した。いくつかの場合には、スプリットＲｅｐ ＣａｐプラスミドおよびＴＩＲ１またはＣＭＶ－Ｔｅｔを１：３：１（Ｒｅｐ：Ｃａｐ：ＴＩＲ１またはＣＭＶ－Ｔｅｔ）の比で使用した。１．５ｍＭのＳＡＨＡを、ＤＮＡ－ＰＥＩ複合体の添加後に添加した。いくつかの場合には、翌日に、Ｓｈｉｅｌｄ１またはＴＭＰまたはオーキシンおよび／もしくはドキシサイクリンを添加した。ドキシサイクリン処理試料の場合、Ｄｏｘのさらなる処理を、最初の処理から２４時間後に実施した。細胞を、処理後４、８、２４時間に、またトランスフェクション後４４時間または６８時間または７２時間に採取し、遠心分離し、冷ＰＢＳで洗浄した。これらの細胞ペレットを、－８０度の冷凍庫で保管した。ｑＰＣＲ用に、１ｍＬの細胞を、トランスフェクション後４４時間または６８時間または７２時間に採取した。
Ａ．材料および方法
ａ．トランスフェクション
Ｅｘｐｉ２９３細胞を、トランスフェクションの前日に、Ｅｘｐｉ２９３培地中に、１．４Ｅ６生細胞／ｍＬに播種した。生細胞が２Ｅ６～３Ｅ６細胞／ｍＬになったときに、トランスフェクションを実施した。ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。ＰＥＩ：ＤＮＡ比は２であり、１００万個の細胞当たり０．６μｇのＤＮＡを使用した。トリプルトランスフェクションを、ＲＨＭ４－１ Ｒｅｐ Ｃａｐ、ヘルパーおよびガウシアルシフェラーゼプラスミドを用いて実施した。スプリットＲｅｐおよびＣａｐプラスミドを、１：４（Ｒｅｐ：Ｃａｐ）の比で使用した。いくつかの場合には、スプリットＲｅｐ ＣａｐプラスミドおよびＴＩＲ１またはＣＭＶ－Ｔｅｔを１：３：１（Ｒｅｐ：Ｃａｐ：ＴＩＲ１またはＣＭＶ－Ｔｅｔ）の比で使用した。１．５ｍＭのＳＡＨＡを、ＤＮＡ－ＰＥＩ複合体の添加後に添加した。いくつかの場合には、翌日に、Ｓｈｉｅｌｄ１またはＴＭＰまたはオーキシンおよび／もしくはドキシサイクリンを添加した。ドキシサイクリン処理試料の場合、Ｄｏｘのさらなる処理を、最初の処理から２４時間後に実施した。細胞を、処理後４、８、２４時間に、またトランスフェクション後４４時間または６８時間または７２時間に採取し、遠心分離し、冷ＰＢＳで洗浄した。これらの細胞ペレットを、－８０度の冷凍庫で保管した。ｑＰＣＲ用に、１ｍＬの細胞を、トランスフェクション後４４時間または６８時間または７２時間に採取した。
【0136】
ｂ．ウェスタンブロット
細胞ペレットを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤とＥＤＴＡを含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）で氷上で３０分間溶解させた。溶解物を最大速度で１５分間遠心分離し、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ウェスタンブロットに使用した。タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの１レーン当たり３０μｇのタンパク質を装填した。これらのゲルをＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に移した。膜をブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）で、室温にて３０分間ブロックした。抗ＡＡＶ Ｒｅｐクローン３０３．９（ＡＲＰ、カタログ番号０３－６１０６９）精製マウスモノクローナル抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで５００倍希釈した。膜を、低温室内で、振動させながら、または振動させずに一晩インキュベートした。翌日、膜を、３回１０分間、それぞれ１×ＴＢＳＴバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０二次抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで１０００倍希釈した。膜を、振動させながら、室温で４５分間インキュベートした。次いで、膜を、６回１０分間、それぞれ１×ＴＢＳＴバッファーで洗浄した。膜をＯｄｙｓｓｅｔ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）でスキャンした。抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、ローディングコントロールとして、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで５０００倍希釈した。一次インキュベーションは、振動させながら室温で１時間であった。ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ８００二次抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで１００００倍希釈した。
細胞ペレットを、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤とＥＤＴＡを含むＲＩＰＡバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）で氷上で３０分間溶解させた。溶解物を最大速度で１５分間遠心分離し、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ウェスタンブロットに使用した。タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの１レーン当たり３０μｇのタンパク質を装填した。これらのゲルをＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に移した。膜をブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）で、室温にて３０分間ブロックした。抗ＡＡＶ Ｒｅｐクローン３０３．９（ＡＲＰ、カタログ番号０３－６１０６９）精製マウスモノクローナル抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで５００倍希釈した。膜を、低温室内で、振動させながら、または振動させずに一晩インキュベートした。翌日、膜を、３回１０分間、それぞれ１×ＴＢＳＴバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６８０二次抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで１０００倍希釈した。膜を、振動させながら、室温で４５分間インキュベートした。次いで、膜を、６回１０分間、それぞれ１×ＴＢＳＴバッファーで洗浄した。膜をＯｄｙｓｓｅｔ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）でスキャンした。抗ＧＡＰＤＨウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、ローディングコントロールとして、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで５０００倍希釈した。一次インキュベーションは、振動させながら室温で１時間であった。ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ８００二次抗体を、ブロッキングバッファー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）または抗体希釈剤（Ｌｉ－Ｃｏｒ）のいずれかで１００００倍希釈した。
【0137】
ｃ．ｑＰＣＲ
凍結した採取された細胞を融解し、超音波処理した。３００μＬの超音波処理した細胞を、ベンゾナーゼで、ローテーター／シェイカー上、３７℃のインキュベーターで１時間処理した。次いで、ＤＮａｓｅＩによる処理を１５分間行った。反応を停止試薬（０．２％のＳＤＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ／０．２ＭのＮａＣｌ）で停止させ、９５℃に１０分間加熱して遠心分離した。段階希釈を行って、１００００倍または１０００００倍希釈した。Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを、Ｑｕａｎｔ ＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲ装置を使用し、特異的プライマーおよびプローブを用いて行った。
凍結した採取された細胞を融解し、超音波処理した。３００μＬの超音波処理した細胞を、ベンゾナーゼで、ローテーター／シェイカー上、３７℃のインキュベーターで１時間処理した。次いで、ＤＮａｓｅＩによる処理を１５分間行った。反応を停止試薬（０．２％のＳＤＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ／０．２ＭのＮａＣｌ）で停止させ、９５℃に１０分間加熱して遠心分離した。段階希釈を行って、１００００倍または１０００００倍希釈した。Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを、Ｑｕａｎｔ ＳｔｕｄｉｏリアルタイムＰＣＲ装置を使用し、特異的プライマーおよびプローブを用いて行った。
【0138】
Ｂ．ＦＫＢＰデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質発現およびＡＡＶ産生
本研究において、ＦＫＢＰ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。予備的な事項として、図１１は、デグロンによるタグ付け時のＲｅｐタンパク質の分子量変化を例示している。具体的には、図１１は、デグロンタグのＲｅｐタンパク質のＮ末端またはＣ末端への付加後のウェスタンブロットにおける可能なサイズ変化を表示する。デグロンのＲｅｐタンパク質のＮ末端への付加（Ｎ－デグロン）は、大型Ｒｅｐタンパク質の分子量を変化させたが、小型Ｒｅｐタンパク質の分子量は変化させなかった。小型Ｒｅｐタンパク質の分子量は、Ｎ末端タンパク質タグによって影響を受けず、なぜなら、小型Ｒｅｐの発現を促進するｐ１９プロモーターが、Ｒｅｐ遺伝子内に位置しているためである。小型Ｒｅｐタンパク質は、大型Ｒｅｐタンパク質と同じＮ末端配列を共有しない。対照的に、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端へのデグロンの付加（Ｃ－デグロン）は、両方のＣ末端が同じであるため、小型Ｒｅｐタンパク質および大型Ｒｅｐタンパク質の両方の分子量を変化させる。Ｓｈｉｅｌｄ１またはＴＭＰなどの小分子の細胞培養物への添加は、タンパク質分解を阻害することができ、バンド強度もそれに応じて変化することになる。ここで示される例は、ＦＫＢＰ由来デグロンである。
本研究において、ＦＫＢＰ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。予備的な事項として、図１１は、デグロンによるタグ付け時のＲｅｐタンパク質の分子量変化を例示している。具体的には、図１１は、デグロンタグのＲｅｐタンパク質のＮ末端またはＣ末端への付加後のウェスタンブロットにおける可能なサイズ変化を表示する。デグロンのＲｅｐタンパク質のＮ末端への付加（Ｎ－デグロン）は、大型Ｒｅｐタンパク質の分子量を変化させたが、小型Ｒｅｐタンパク質の分子量は変化させなかった。小型Ｒｅｐタンパク質の分子量は、Ｎ末端タンパク質タグによって影響を受けず、なぜなら、小型Ｒｅｐの発現を促進するｐ１９プロモーターが、Ｒｅｐ遺伝子内に位置しているためである。小型Ｒｅｐタンパク質は、大型Ｒｅｐタンパク質と同じＮ末端配列を共有しない。対照的に、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端へのデグロンの付加（Ｃ－デグロン）は、両方のＣ末端が同じであるため、小型Ｒｅｐタンパク質および大型Ｒｅｐタンパク質の両方の分子量を変化させる。Ｓｈｉｅｌｄ１またはＴＭＰなどの小分子の細胞培養物への添加は、タンパク質分解を阻害することができ、バンド強度もそれに応じて変化することになる。ここで示される例は、ＦＫＢＰ由来デグロンである。
【0139】
この研究では、ＲＨＭ４－１を、上記セクション６Ａで提示された材料および方法に従ってＡＡＶカプシドとして使用した。図１２Ａ～１２Ｄに表示するように、「ＲＨＭ４－１」および「ＲＨＭ４－１ｖ２」は、デグロンを含まないＲｅｐタンパク質およびＲＨＭ４－１ Ｃａｐの両方を発現するプラスミドである。対照的に、「ｐ４０Ｃａｐプラスミド」は、ＲＨＭ４－１カプシドのみを発現し、一方「ｐＡＡＶ２ Ｒｅｐプラスミド」は、ＡＡＶ２からのＲｅｐタンパク質を発現する。これらの研究で使用されたＩＴＲプラスミドは、導入遺伝子としてガウシアルシフェラーゼを有する。
【0140】
図１２Ａは、Ｎ末端ＦＫＢＰデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する。この研究では、Ｎ末端デグロン含有Ｒｅｐ（Ｎ－デグロンＲｅｐ）コンストラクトを発現するプラスミドを、ＡＡＶ産生に使用した。試料を、Ｓｈｉｅｌｄ１の培地への添加後４、８、または２４時間で採取した。小型Ｒｅｐ（Ｒｅｐ５２）の分子量および発現は、図１１で説明したように（試料１～６対試料７～１１）、デグロンの存在または不在によって影響されない。デグロンを有さないＲｅｐを使用して産生された対照試料を、レーン７～１１に装填する。固有のプラスミドデザインのために、大型Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８）発現は、すべての試料において小型Ｒｅｐ発現よりも非常に低い。Ｎ－デグロンＲｅｐ試料からの大型Ｒｅｐ発現は、未処理対照（試料１～３）と比較して、Ｓｈｉｅｌｄ１の添加後に増加する（試料４～６）。大型Ｒｅｐタンパク質の分子量は、Ｎ－デグロンＲｅｐを有する試料についてより大きい（試料１～６対７～１１）が、図１１に説明したように、これらの試料では、小型Ｒｅｐの分子量の変化は観察されない。
【0141】
図１２Ｂは、Ｃ末端ＦＫＢＰデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する。この研究では、Ｃ末端デグロン含有Ｒｅｐコンストラクト（Ｃ－デグロンＲｅｐ）を発現するプラスミドをＡＡＶ産生に使用し、試料を、Ｓｈｉｅｌｄ１による誘導後の異なる時点（４、８、および２４時間）に採取した。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐの発現は、同じ時点で、未処理対照（試料１～３）よりもＳｈｉｅｌｄ１で高い（試料４～６）。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐの分子量は、Ｃ末端ＦＫＢＰデグロンで大きく、デグロンを含有しないＲｅｐタンパク質を含む試料と比較してシフトが観察された（試料１～６対７～１１）。
【0142】
図１２Ｃは、図１２Ａおよび１２Ｂからの試料のＡＡＶ力価を表示する。ＡＡＶ力価は、Ｓｈｉｅｌｄ１分子のＡＡＶ産生に使用された培地への添加時に増加する。この研究では、細胞を、Ｒｅｐ－デグロン含有プラスミドと共にＡＡ産生に必要な他のプラスミドでトランスフェクトした。Ｓｈｉｅｌｄ１分子の添加は、未処理対照と比較して、Ｎ末端およびＣ末端デグロンコンストラクトについてＡＡＶ力価を増加させる。
【0143】
図１２Ｄは、異なる比でトランスフェクトされたＲｅｐおよびＣａｐプラスミドで観察されたＡＡＶ力価を表示する。この研究では、デグロンタグ付きＲｅｐタンパク質は、ＲｅｐプラスミドおよびＣａｐプラスミドの異なる比率でトランスフェクトされた細胞において制御される。結果で例示されるように、ＡＡＶ産生は、図の下部に列挙されるように、ＨＥＫ２９３細胞に異なる比でトランスフェクトされた別個のプラスミドとして提供されるデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質を介して制御され得る。力価は、デグロンを含まないＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドを使用する対照トランスフェクションからの力価に対して正規化された。５００ｎＭのＳｈｉｅｌｄ１を、試料に添加して、Ｒｅｐ分解を阻害した。
【0144】
Ｃ．ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質発現およびＡＡＶ産生
本研究において、ｅｃＤＨＦＲ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。ｅｃＤＨＦＲ由来デグロンは、以下のアミノ酸配列を有する：
ｅｃＤＨＦＲ由来デグロンは、以下のＤＮＡ配列を有する：
この研究では、ＲＨＭ４－１を、上記セクション６Ａで提示された材料および方法に従ってＡＡＶカプシドとして使用した。
本研究において、ｅｃＤＨＦＲ由来デグロンを含むＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。ｅｃＤＨＦＲ由来デグロンは、以下のアミノ酸配列を有する：
【0145】
図１３Ａは、Ｎ末端ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する。この研究では、Ｎ末端ｅｃデグロン含有Ｒｅｐ（Ｎ－ｅｃデグロンＲｅｐ）コンストラクトをＡＡＶ産生に使用し、Ｃａｐ遺伝子を別個のプラスミドとして提供する。小型Ｒｅｐ発現は、図１１に説明したように、Ｎ末端ｅｃデグロン融合によって影響されない（試料１～６）。大型Ｒｅｐ発現は、５μＭのＴＭＰによって処理された試料について、２４時間後の時点で高い（試料３対試料６）。大型Ｒｅｐの分子量は、それがｅｃＤＨＦＲデグロンによってタグ付け（Ｎ末端）されるとより大きく、それらの試料（試料１～６）についてシフトが観察される。予想されたように、小型Ｒｅｐタンパク質について、その分子量が同じままであるため、シフトは観察されない。
【0146】
図１３Ｂは、Ｃ末端ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質のウェスタンブロットを表示する。この研究では、Ｃ末端ｅｃデグロン含有Ｒｅｐ（Ｃ－ｅｃデグロンＲｅｐ）コンストラクトをＡＡＶ産生に使用し、Ｃａｐ遺伝子を別個のプラスミドとして提供する。小型および大型Ｒｅｐの発現は、５μＭのＴＭＰでより多い（試料３対試料６）。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐの分子量は、Ｃ末端ｅｃＤＨＦＲデグロン（試料１～６）で大きく、両方のタンパク質でシフトが観察される。
【0147】
図１３Ｃは、図１３ａおよび１３ｂからの試料のＡＡＶ力価を表示する。ｅｃＤＨＦＲデグロン含有Ｒｅｐを含むプラスミドを介して産生されたＡＡＶの力価レベルを分析した。ＴＭＰの添加は、Ｃ末端デグロンコンストラクトのＡＡＶ力価を増加させ、Ｒｅｐ発現に関するウェスタンブロットデータと相関する。
【0148】
Ｄ．オーキシンまたはｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐタンパク質発現およびＡＡＶ産生
本研究において、オーキシン由来デグロンまたはｅｃＤＨＦＲ由来デグロンのいずれかを有するＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。オーキシン由来デグロンは、以下のアミノ酸配列を有する：
オーキシン由来デグロンは、以下のＤＮＡ配列を有する：
この研究では、ＲＨＭ４－１を、上記セクション６Ａで提示された材料および方法に従ってＡＡＶカプシドとして使用した。
本研究において、オーキシン由来デグロンまたはｅｃＤＨＦＲ由来デグロンのいずれかを有するＲｅｐタンパク質を介したＡＡＶ産生の制御を調べた。オーキシン由来デグロンは、以下のアミノ酸配列を有する：
【0149】
図１４Ａは、オーキシン誘導性デグロンまたはｅｃＤＨＦＲデグロンでタグ付けされているＲｅｐのウェスタンブロットを表示する。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐのサイズは、Ｃ末端オーキシン誘導性デグロン含有Ｒｅｐプラスミド（試料３～６）で大きく、両方のタンパク質についてシフトが観察される。オーキシン誘導性デグロンについてのＲｅｐ発現の変化は、デグロンタグ付き小型Ｒｅｐと同じサイズを有する非特異的バンドの存在のために、観察が難しい。この非特異的バンドは、トランスフェクトされていない試料（試料９）であっても存在する。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐの発現は、Ｃ末端タグ付きｅｃＤＨＦＲデグロンの場合には、ＴＭＰ（試料７および８）でより多い。小型Ｒｅｐおよび大型Ｒｅｐのサイズは、Ｃ末端ｅｃＤＨＦＲデグロン（試料７および８）で大きく、シフトが観察される。
【0150】
図１４Ｂは、図１４Ａからの試料のＡＡＶ力価を表示する。図１４Ｂに例示するように、オーキシン誘導性デグロンおよびｅｃＤＨＦＲデグロンは、ＡＡＶ力価を制御することができ、ここでは、オーキシン誘導性デグロンは、オーキシンおよびＴＩＲ１ユビキチンリガーゼが、細胞中に存在する場合にだけオーキシン依存性デグロンと共に機能する。ＴＩＲ－１タンパク質のアミノ酸配列は、下記の通りである：
小分子添加時にタンパク質分解を阻害したＦＫＢＰおよびｅｃＤＨＦＲ依存性デグロンとは異なり、オーキシン誘導性デグロンは、それにタグ付けされたタンパク質の分解をもたらす。オーキシン誘導性デグロンが機能するには、オーキシン、ＴＩＲ１、およびデグロンが存在する必要がある。ＡＡＶ産生は、オーキシン媒介デグロンのすべての成分（デグロン、オーキシンおよびＴＩＲ１）が存在する試料（試料４）については検出不能である。これは、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端でのＡＡＶ産生の制御に対するこのデグロンの機能性を示している。ｅｃＤＨＦＲデグロンタグ付きＲｅｐは、ＴＭＰ分子の存在下でＡＡＶを産生することができ（試料８）、これは、ＴＭＰ分子なし（試料７）では検出不能であった。
【0151】
Ｅ．Ｓｈｉｅｌｄ１またはｄＴａｇ１３の存在下でのＲｅｐタンパク質発現およびＡＡＶ産生
図１５は、Ｓｈｉｅｌｄ１およびｄＴａｇ１３の異なる用量のＡＡＶ産生に対する影響を表示する。この研究では、Ｃ末端タグ付きデグロンを含むＲｅｐコンストラクトを、Ｓｈｉｅｌｄ１およびｄＴａｇ１３の異なる用量で試験した。力価に対する影響を見るために、異なるＳｈｉｅｌｄ１レベルを比較した。Ｓｈｉｅｌｄ１は、ＡＡＶ産生を増加させるために、５００ｎＭの濃度でより有効である。ｄＴａｇ１３も試験され、これは、いくつかのＦＫＢＰ由来ドメインに結合し、それらの分解をさらに引き起こす分子である。この研究において、ｄＴａｇ１３は、ＡＡＶ産生の基底レベルを減少させなかった。
図１５は、Ｓｈｉｅｌｄ１およびｄＴａｇ１３の異なる用量のＡＡＶ産生に対する影響を表示する。この研究では、Ｃ末端タグ付きデグロンを含むＲｅｐコンストラクトを、Ｓｈｉｅｌｄ１およびｄＴａｇ１３の異なる用量で試験した。力価に対する影響を見るために、異なるＳｈｉｅｌｄ１レベルを比較した。Ｓｈｉｅｌｄ１は、ＡＡＶ産生を増加させるために、５００ｎＭの濃度でより有効である。ｄＴａｇ１３も試験され、これは、いくつかのＦＫＢＰ由来ドメインに結合し、それらの分解をさらに引き起こす分子である。この研究において、ｄＴａｇ１３は、ＡＡＶ産生の基底レベルを減少させなかった。
【0152】
Ｆ．転写レベルコントロールシステムおよび／またはデグロンレベルコントロール下でのＲｅｐタンパク質発現およびＡＡＶ産生
図１６Ａは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターのコントロール下のＣ末端デグロンを含むＲｅｐのウェスタンブロットを表示する。ＴＲＥ３ＧプロモーターのＤＮＡ配列は、下記の通りである：
この研究では、図１８Ａに示すように、Ｔｅｔ応答エレメント含有プロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）が、Ｒｅｐ遺伝子の前方にクローニングされる。このプロモーターは、Ｔｅｔタンパク質およびドキシサイクリン誘導の存在下で活性化され得る。Ｔｅｔ応答エレメントプロモーターコントロール下のＣ末端デグロンを含むＲｅｐは、ＡＡＶ産生制御に対して機能的であることが示されている。大型Ｒｅｐは、Ｔｅｔプロモーターのコントロール下にあり、小型Ｒｅｐの発現は、ｐ１９プロモーターによって提供される（試料１～５）。大型Ｒｅｐの発現は、このシステムによって厳重にコントロールされており、ドキシサイクリンの添加時に検出することができる（試料３および４）。Ｓｈｉｅｌｄ１は、小型Ｒｅｐの発現（試料１対試料２）および大型Ｒｅｐの発現（試料３対試料４）をアップレギュレートすることができる。別個のプラスミドを用いてＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇトランス活性化タンパク質を供給し、ここでは、トランス活性化タンパク質の発現は、ユビキタスＣＭＶプロモーターのコントロール下にある（試料１～４）。トランス活性化タンパク質のアミノ酸配列は、下記の通りである：
ＣＭＶプロモーターのＤＮＡ配列は、下記の通りである：
図１６Ａは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターのコントロール下のＣ末端デグロンを含むＲｅｐのウェスタンブロットを表示する。ＴＲＥ３ＧプロモーターのＤＮＡ配列は、下記の通りである：
【0153】
図１６Ｂは、図１６Ａからの試料のＡＡＶ力価を表示する。この研究は、ＴＲＥ３Ｇプロモーターのコントロール下でＣ末端デグロンタグ付きＲｅｐを使用して、ＡＡＶ産生が制御され得ること、およびドキシサイクリン誘導が、ＡＡＶ産生を基底レベルから約２９倍増加させ得ることを示している。これらの試料からのＡＡＶ力価のレベルは、デグロンを含まない対照試料（試料６～８）と同等である。
【0154】
図１７Ａは、Ｃ末端デグロンを含むＲｅｐコンストラクトのウェスタンブロットを表示する。この研究では、ＴＲＥ３Ｇプロモーターコントロール下でのＲｅｐ－デグロンコンストラクトからのＡＡＶ産生に対する異なるドキシサイクリンレベルの影響を試験した。大型Ｒｅｐは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターコントロール下にある（試料１～１０）。ドキシサイクリンは、大型Ｒｅｐの発現を効果的に誘導する（試料３～８）。大型Ｒｅｐおよび小型Ｒｅｐの発現は、Ｓｈｉｅｌｄ１の存在下で増加される（試料２、４、６、および８対試料１、３、５、および７）。トランスフェクションからのＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇトランス活性化タンパク質を発現するプラスミドを省くと、ドキシサイクリン誘導の不活性化をもたらす（試料９および試料１０）。
【0155】
図１７Ｂは、図１７Ａからの試料のＡＡＶ力価を表示する。この研究は、ＴＲＥ３Ｇおよびデグロンのコントロール下のＲｅｐが、ポジティブコントロールの非制御Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドと同等のＡＡＶの量を産生し得ることを例示している。異なるドキシサイクリンレベルは、Ｓｈｉｅｌｄ１分子を含むかまたは含まずにＡＡＶ力価を増加させ得るが、デュアルシステムによるより厳重な制御の証拠として、基底レベルはＳｈｉｅｌｄ１の不在下でより低い（試料１）。
【0156】
図１８Ａは、ＴＲＥ３Ｇ－Ｒｅｐ－デグロンシステムにおけるＲｅｐタンパク質レベルに対するｐ５プロモーターの影響を表示する。この研究では、ＴＲＥ３Ｇプロモーターのコントロール下のデグロンタグ付きＲｅｐコンストラクトを含むプラスミドを、Ｒｅｐ遺伝子の３’においてｐ５プロモーターを含むか、または含まずに作製した。
【0157】
図１８Ｂは、Ｃ末端デグロンおよびＴＲＥ３Ｇプロモーターを含むＲｅｐコンストラクトのウェスタンブロットを表示する。この研究では、大型Ｒｅｐは、ＴＲＥ３Ｇプロモーターコントロール下にある（試料１～８）。ドキシサイクリンは、大型Ｒｅｐの発現を効果的に誘導し（試料３～４および７～８）、大型Ｒｅｐの発現は、Ｓｈｉｅｌｄ１の添加によってさらに増加される（試料４および試料８）。図に例示するように、両方のプラスミド（Ｒｅｐ遺伝子の３’においてｐ５プロモーターを含むか、または含まない）は、大型Ｒｅｐおよび小型Ｒｅｐを発現することができる。
【0158】
図１８Ｃは、図１８Ｂからの試料のＡＡＶ力価を表示する。この研究は、ＴＲＥ３Ｇシステムを使用する一過性トランスフェクションでは、Ｐ５プロモーターがＡＡＶ産生のために必須でない可能性があることを示している。図に例示するように、両方のプラスミドは、同等のレベルのＡＡＶ力価を生じ得る。これもまた、ガウシアルシフェラーゼを、目的の遺伝子（ＧＯＩ）として使用した。
【0159】
図２０Ａ～２０Ｂは、デグロンモチーフを有するコドン修飾Ｒｅｐを表示し、そのようなコンストラクトがＡＡＶ産生に使用され得ることを示す。図はまた、第２のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、制御エレメント下の小型Ｒｅｐおよびデグロンドメインを示す。これらのコンストラクトによって達成された結果は、開示された方法が、複数の制御エレメントで（それらが同じか異なるかに関わらず）、複数のデグロンドメインで（それらが同じか異なるかに関わらず）、およびＡＡＶタンパク質をコードする改変もしくは非改変遺伝子で動作するようにカスタマイズできることを実証している。
【0160】
実施例７：制御されたＡＡＶ産生のためのデグロンタグ付きヘルパー遺伝子
この実施例で例示されるように、デグロンタグ付きヘルパー遺伝子をＡＡＶ産生を制御するために使用することができる。ＡＡＶ産生に使用される古典的なヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子を含む。この実施例では、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子からの開かれた読み枠を、別個のプラスミドにクローニングした。Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡについて選択された開かれた読み枠は、それぞれ、ＤＢＰ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２である。実施例１～６に記載されたトリプルトランスフェクション法を修正して、トリプル産生で使用するために、Ｅ２Ａ－ＤＢＰ、Ｅ４－Ｅ３４Ｋ、またはＶＡ２遺伝子が単一のヘルパープラスミドの代わりに別個のプラスミドにおいて供給されることを可能にした。
この実施例で例示されるように、デグロンタグ付きヘルパー遺伝子をＡＡＶ産生を制御するために使用することができる。ＡＡＶ産生に使用される古典的なヘルパープラスミドは、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子を含む。この実施例では、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子からの開かれた読み枠を、別個のプラスミドにクローニングした。Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡについて選択された開かれた読み枠は、それぞれ、ＤＢＰ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２である。実施例１～６に記載されたトリプルトランスフェクション法を修正して、トリプル産生で使用するために、Ｅ２Ａ－ＤＢＰ、Ｅ４－Ｅ３４Ｋ、またはＶＡ２遺伝子が単一のヘルパープラスミドの代わりに別個のプラスミドにおいて供給されることを可能にした。
【0161】
Ａ．材料および方法
ヘルパー遺伝子を利用する本デグロン研究については、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、Ｅ４－Ｅ３４Ｋ遺伝子およびＶＡ２を、それぞれＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子のための開かれた読み枠として選択した。これらのＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子から選択された開かれた読み枠を、ＣＭＶプロモーターのコントロール下で別個のプラスミドにクローニングした。ＦＫＢＰ由来のデグロンを、Ｅ２Ａ－ＤＢＰ遺伝子のＣ末端にクローニングした。
ヘルパー遺伝子を利用する本デグロン研究については、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）、Ｅ４－Ｅ３４Ｋ遺伝子およびＶＡ２を、それぞれＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子のための開かれた読み枠として選択した。これらのＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ遺伝子から選択された開かれた読み枠を、ＣＭＶプロモーターのコントロール下で別個のプラスミドにクローニングした。ＦＫＢＰ由来のデグロンを、Ｅ２Ａ－ＤＢＰ遺伝子のＣ末端にクローニングした。
【0162】
トリプルトランスフェクション法を修正して、Ｅ２Ａ－ＤＢＰ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２遺伝子が単一のヘルパープラスミドの代わりに３つの別個のプラスミドにおいて供給されることを可能にした。トランスフェクションおよび細胞溶解については、本明細書に記載のＲｅｐ－デグロン実験と同じ試薬および方法を使用した。別個のヘルパープラスミドを用いたクインタプルトランスフェクションに使用されたプラスミドについてのモル比（ＩＴＲ－ＧＯＩ：Ｒｅｐ／Ｃａｐ：ＤＢＰ：Ｅ３４Ｋ：ＶＡ２）は、２：２：１：１：１であった。単一のヘルパープラスミドを用いたトリプルトランスフェクションに使用されたプラスミドについてのモル比（ＩＴＲ－ＧＯＩ：Ｒｅｐ／Ｃａｐ：ヘルパー）は、２：２：１であった。ＡＡＶ産生が抑制されているネガティブコントロール試料は、細胞をＩＴＲ－ＧＯＩプラスミドのみで（すなわち、ヘルパーおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドが省かれた）トランスフェクトすることによって達成された。実験の結果の分析のＤＢＰウェスタンブロットについては、ＣｕｓａＢｉｏ製の抗ＤＢＰポリクローナル抗体（ＣＳＢ－ＰＡ３６５８９２ＺＡ０１ＨＩＬ）を使用した。
【0163】
Ｂ．実験結果
図１９Ａに示すように、Ｅ２Ａ遺伝子から発現されたＤＢＰタンパク質が、ＦＫＢＰ由来デグロンモチーフでタグ付けされた。Ｅ２Ａ－ＤＢＰ－デグロンを発現するプラスミドが、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ＩＴＲ－ＧＯＩ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２を発現する他のプラスミドと共にトランスフェクトされた。７２時間の終了時に、細胞を溶解させ、ＡＡＶ力価レベルを分析した。ＩＴＲ－ＧＯＩプラスミド（すなわち、ヘルパーおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドを除外する）のみでトランスフェクトされた細胞を、ネガティブコントロール試料として使用した。Ｓｈｉｅｌｄ１分子の添加がないと、ＡＡＶ産生は、ネガティブコントロールから生じたｑＰＣＲ結果のバックグラウンドレベルと同じレベルで観察される（左側の濃いバー対右側のバー）。Ｓｈｉｅｌｄ１分子を添加すると、力価レベルはおよそ３倍増し、デグロンタグを有するＥ２Ａ－ＤＢＰを使用するＡＡＶ産生の制御を提供する（中央の縞模様のバー）。
図１９Ａに示すように、Ｅ２Ａ遺伝子から発現されたＤＢＰタンパク質が、ＦＫＢＰ由来デグロンモチーフでタグ付けされた。Ｅ２Ａ－ＤＢＰ－デグロンを発現するプラスミドが、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ＩＴＲ－ＧＯＩ、Ｅ４－Ｅ３４ＫおよびＶＡ２を発現する他のプラスミドと共にトランスフェクトされた。７２時間の終了時に、細胞を溶解させ、ＡＡＶ力価レベルを分析した。ＩＴＲ－ＧＯＩプラスミド（すなわち、ヘルパーおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドを除外する）のみでトランスフェクトされた細胞を、ネガティブコントロール試料として使用した。Ｓｈｉｅｌｄ１分子の添加がないと、ＡＡＶ産生は、ネガティブコントロールから生じたｑＰＣＲ結果のバックグラウンドレベルと同じレベルで観察される（左側の濃いバー対右側のバー）。Ｓｈｉｅｌｄ１分子を添加すると、力価レベルはおよそ３倍増し、デグロンタグを有するＥ２Ａ－ＤＢＰを使用するＡＡＶ産生の制御を提供する（中央の縞模様のバー）。
【0164】
図１９Ｂは、デグロンタグの付加に起因して、Ｅ２Ａ－ＤＢＰタンパク質のタンパク質サイズにおけるシフトを強調するウェスタンブロットを表示する。タグ付きタンパク質は、タグなしのＤＢＰタンパク質よりも約１２ｋＤａ大きい。左側の２つの試料はタグなしＤＢＰであり、一方右側の試料は、デグロンを含むＤＢＰの試料である。
【0165】
Ｃ．使用されたヘルパー遺伝子の配列
Ｅ２Ａ－ＤＢＰ核酸配列
Ｅ２Ａ－ＤＢＰアミノ酸配列
Ｅ４－３４Ｋ（ＯＲＦ６）核酸配列
Ｅ４－３４Ｋ（ＯＲＦ６）アミノ酸配列
ＶＡ２核酸配列：
ＶＡ２アミノ酸配列：
Ｅ２Ａ－ＤＢＰ核酸配列
【0166】
本明細書で引用されるすべての公開公報、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本開示に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【配列表】
【国際調査報告】