特表 2024-520862 希土類元素の分離のためのタンパク質を含む組成物及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-24

(54)【発明の名称】希土類元素の分離のためのタンパク質を含む組成物及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/14 20060101AFI20240517BHJP

   C07K 1/00 20060101ALI20240517BHJP

【ＦＩ】

C07K1/14 ZNA

C07K1/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577148

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-02-09

(86)【国際出願番号】 US2022033462

(87)【国際公開番号】W WO2022266120

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,311

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520098419

【氏名又は名称】ローレンス リバモア ナショナル セキュリティ リミテッド ライアビリティ カンパニー

(71)【出願人】

【識別番号】505098708

【氏名又は名称】ザ ペン ステイト リサーチ ファンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100111501

【弁理士】

【氏名又は名称】滝澤 敏雄

(72)【発明者】

【氏名】パーク ダン マクファーランド

(72)【発明者】

【氏名】デブロンド ゴーチエ

(72)【発明者】

【氏名】ドン ジエ

(72)【発明者】

【氏名】ジャオ ヨンチン

(72)【発明者】

【氏名】マトックス ジョセフ アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】コトルボ ジョセフ アルフレッド

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA60

(57)【要約】

この開示は、ＲＥＥの優先的な分離のためのＲＥＥ結合タンパク質、加えてその使用方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＥＥ含有材料中に存在する非ＲＥＥ元素から希土類元素（ＲＥＥ）を分離するための方法であって、
ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質を提供する工程；
ｂ）所定量の前記タンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記タンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；
ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；並びに
ｄ）前記１種又は複数種のＲＥＥを前記タンパク質から分離して、前記１種又は複数のＲＥＥの精製された画分及び再生された前記タンパク質を生産する工程
を含む、前記方法。

【請求項2】

再生されたタンパク質を再使用して、工程（ａ）～（ｄ）を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

分離する工程（ｃ）が、ＲＥＥ含有材料から１種又は複数種のＲＥＥを分離する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

分離する工程（ｃ）が、１種若しくは複数種の個々のＲＥＥ、ＲＥＥのグループ、周期表において互いに隣接するＲＥＥ、類似のイオン半径を有するＲＥＥ、又はそれらの組合せを優先的に分離する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

タンパク質が、ＲＥＥ含有材料中の非ＲＥＥと結合しない、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

タンパク質が、ＬａｎＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

ＬａｎＭが、Ｃ末端システイン残基、Ｎ末端システイン残基、又は内部システイン残基を含む、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

システイン残基が、グリシンセリンアミノ酸リンカーを介してＬａｎＭに連結されている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

タンパク質が、工程（ｃ）において、２～約１０のｐＨで、１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

ＲＥＥが、工程（ｄ）において、約２未満のｐＨでタンパク質から分離される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

ＲＥＥが、工程（ｄ）において、水溶性有機キレート化剤を使用してタンパク質から分離される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

ＲＥＥ材料が、希土類鉱石、地熱塩水、石炭、石炭副産物、採掘尾鉱、酸性鉱山排水、リン酸石膏、保守終了製品、電子機器廃棄物、産業排水、又はＲＥＥ源から生じた総ＲＥＥ混合物、例えばこれらの鉱石から得られた塩（例えば酸化物、シュウ酸塩、炭酸塩など）から得られた浸出液である、請求項１又は請求項２に記載の方法。

【請求項15】

ＲＥＥ含有材料が、低グレードの材料、高グレードの材料、又はそれらの組合せである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項16】

希土類元素（ＲＥＥ）分離のための材料を調製するための方法であって、
ａ）ＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質と、コンジュゲーション剤で官能化した多孔質支持体材料とを提供する工程；
ｂ）前記タンパク質を、前記コンジュゲーション剤により前記多孔質支持体材料に結合させる工程
を含む、前記方法。

【請求項17】

工程（ａ）の前に、多孔質支持体材料をコンジュゲーション剤で官能化する工程を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

コンジュゲーション剤が、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ－ＮＨＳ）、ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＢＣＮ－ＮＨＳ）、及びジベンゾシクロオクチン－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ）、又はアルキン部分から選択される、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

タンパク質が、ＬａｎＭである、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

ＬａｎＭが、Ｃ末端システイン残基、Ｎ末端システイン、又は内部システインを含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

システインが、グリシンセリンアミノ酸リンカー又は親水性リンカーを介してＬａｎＭに連結されている、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

多孔質支持体材料がアガロースマイクロビーズである、請求項１６に記載の方法。

【請求項25】

タンパク質がシステイン残基を含むＬａｎＭであり、タンパク質を多孔質支持体材料に結合させる工程が、クリックケミストリーによりＣ末端システイン残基をコンジュゲーション剤と反応させることを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項26】

タンパク質を多孔質支持体材料に結合させる工程が、水性条件下で行われる、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

ビーズ材料が高濃度のＬａｎＭを有する、請求項１６に記載の方法。

【請求項28】

高濃度が、多孔質支持体材料の総体積の１ｍＬ当たり、少なくとも約２μｍｏｌ、約３μｍｏｌ、約４μｍｏｌ、約５μｍｏｌ、約６μｍｏｌ、約７μｍｏｌ、約８μｍｏｌ、約９μｍｏｌ又は約１０μｍｏｌのＬａｎＭである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

タンパク質が、多孔質支持体材料内に埋め込まれているか、及び／又はその表面上にある、請求項１６に記載の方法。

【請求項30】

ビーズをカラム、膜、ビーズ、又はそれらの組合せに組み込む工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項31】

少なくとも１種のＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質を含む、希土類元素（ＲＥＥ）分離のための生物吸着剤であって、前記タンパク質がビーズ内に埋め込まれているか又はその表面にある、前記生物吸着剤。

【請求項32】

タンパク質がＬａｎＭである、請求項３１に記載のビーズ。

【請求項33】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

ＬａｎＭが、Ｃ末端システイン残基、Ｎ末端システイン、又は内部システインを含む、請求項３３又は３４に記載のビーズ。

【請求項36】

システインが、グリシンセリンアミノ酸リンカー又は親水性リンカーを介してＬａｎＭに連結されている、請求項３５に記載のビーズ。

【請求項37】

ビーズがアガロースを含む、請求項３１に記載のビーズ。

【請求項38】

ビーズ中のタンパク質の濃度が、ビーズの総体積の１ｍＬ当たり、少なくとも約２μｍｏｌ、約３μｍｏｌ、約４μｍｏｌ、約５μｍｏｌ、約６μｍｏｌ、約７μｍｏｌ、約８μｍｏｌ、約９μｍｏｌ又は約１０μｍｏｌのタンパク質である、請求項３１に記載のビーズ。

【請求項39】

ＲＥＥ含有材料から希土類元素（ＲＥＥ）を優先的に分離する方法であって、
（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；
（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質は１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；
（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；
（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第１のｐＨを含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から重ＲＥＥ（ＨＲＥＥ）を優先的に分離する工程；
（ｇ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤を含む溶液又は第２のｐＨを有する溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＭＲＥＥを分離する工程；及び
（ｈ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第３のｐＨを含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＬＲＥＥを分離する工程
を含む、前記方法。

【請求項40】

第１の吸収／脱離サイクル（「第１のサイクル」）を含む、ＲＥＥ含有材料から希土類元素（ＲＥＥ）を分離するための方法であって、前記第１のサイクルが、
ａ）バイオソープション材料を含有するカラムを、ＲＥＥ含有材料でローディングする工程であって、前記バイオソープション材料が、前記ＲＥＥ含有材料中に存在するＲＥＥを吸着して、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を形成することが可能なタンパク質を含む、前記工程；及び
ｂ）前記１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種若しくは複数のＲＥＥ又はＲＥＥの１つ若しくは複数のグループを優先的に分離させることが可能な第１の溶液で、第１のＲＥＥが富化された画分を溶出させる工程を含む脱離プロセスを使用して、前記１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種若しくは複数のＲＥＥ又はＲＥＥの１つ若しくは複数のグループを分離する工程
を含む、前記方法。

【請求項41】

第１の溶液が第１の選択されたｐＨを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

第１の選択されたｐＨが、約３．０又はそれ未満である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

第１の選択されたｐＨが、約２．５又はそれ未満である、請求項４０に記載の方法。

【請求項44】

第１の選択されたｐＨが、約２．０又はそれ未満である、請求項４０に記載の方法。

【請求項45】

第１の選択されたｐＨが、約１．５である、請求項４０に記載の方法。

【請求項46】

第１の溶液が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ジメルカプロール、マロン酸塩、イミノ二酢酸塩、ジグリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸、カテコール、ポリアミノカルボキシレート、ヒドロキシピリジノン、又はヒドロキサメートから選択されるキレート化剤を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項47】

第１の溶液が約３．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

第１の溶液が約１５．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

第１の溶液が約３０．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項50】

脱離プロセスが、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを脱離させることが可能な第２の溶液を用いて、第２のＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第２の工程をさらに含む、請求項３９～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

第２の溶液が第２の選択されたｐＨを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

第２の選択されたｐＨが第１の選択されたｐＨより低い、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

第２の選択されたｐＨが２．５又はそれ未満である、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

第２の選択されたｐＨが２．０又はそれ未満である、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

第２の選択されたｐＨが１．５又はそれ未満である、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

第２の溶液が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ジメルカプロール、マロン酸塩、イミノ二酢酸塩、ジグリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸、カテコール、ポリアミノカルボキシレート、ヒドロキシピリジノン、又はヒドロキサメートから選択されるキレート化剤を含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項57】

第２の溶液がクエン酸塩を第１の溶液より高い濃度で含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

第２の溶液が約１５．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

第２の溶液が約２５．０～約５０．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項60】

第２の溶液が約７５．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項61】

第１の溶液及び第２の溶液が約２．５～１．５の間のｐＨを有する、請求項５０に記載の方法。

【請求項62】

第１の溶液が約２．０～約２．５のｐＨを含み、第２の溶液が約１．５～約２．０のｐＨを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項63】

第１の溶液が２．１のｐＨを含み、第２の溶液が１．７のｐＨを含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

第１の溶液がクエン酸塩を約３．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液がクエン酸塩を約１５ｍＭの濃度で含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項65】

第１の溶液がクエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液がクエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項66】

脱離プロセスが、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを脱離させることが可能な第３の溶液を用いて、第３のＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第３の工程をさらに含む、請求項３９～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

第３の溶液が第３の選択されたｐＨを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

第３の選択されたｐＨが第２の選択されたｐＨより低く、第１の選択されたｐＨが第２の選択されたｐＨより低い、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

第３の選択されたｐＨが、約１．５又はそれ未満である、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

第３の選択されたｐＨが、約１．５である、請求項６６に記載の方法。

【請求項71】

第３の溶液が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ジメルカプロール、マロン酸塩、イミノ二酢酸塩、ジグリコール酸、ヒドロキシピリジノン、又はヒドロキサメートから選択されるキレート化剤を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項72】

第３の溶液がクエン酸塩を第２の溶液より高い濃度で含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項73】

第３の溶液が約７５．０ｍＭのクエン酸塩を含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項74】

第１の溶液が約２．０～約２．５の間のｐＨを含み、第２の溶液が約１．５～約２．０の間のｐＨを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項75】

第１の溶液が約２．１のｐＨを含み、第２の溶液が約１．７のｐＨを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項76】

第１の溶液がクエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液がクエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含み、第３の溶液が、約１．５のｐＨを含む、請求項６６に記載の方法。

【請求項77】

脱離プロセスが、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを脱離させることが可能な第４の溶液を用いて、第４のＲＥＥが富化された（ｅｎｒｉｇｈｔｅｄ）画分をカラムから溶出させる第４の工程をさらに含む、請求項３９～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

第１の溶液がＳｃを優先的に脱離させるための３０ｍＭのマロン酸塩溶液であり、第２の溶液がＹを優先的に脱離させるための１５ｍＭのクエン酸塩溶液であり、第３の溶液がＭＲＥＥ及びＨＲＥＥを脱離させるための５０～７５ｍＭのクエン酸塩溶液であり、第４の溶液がＬａ及びＣｅを脱離させるために約１．５のｐＨを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

第２の吸収／脱離サイクル（「第２のサイクル」）をさらに含み、前記第２のサイクルが、
ａ）バイオソープション材料を含有するカラムを、第１のＲＥＥが富化された画分でローディングして、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を形成する工程；及び
ｂ）１つ又は複数の精製溶液を用いてカラムから第１の高純度ＲＥＥが富化された画分を溶出させる工程を含む脱離プロセスを使用して、前記１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを分離する工程
を含む、請求項３９～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

ＲＥＥが富化された画分若しくは複数の画分、又は高純度ＲＥＥが富化された画分若しくは複数の画分を溶出させた後に、クリアリング溶液を使用してタンパク質を再生する工程をさらに含む、請求項３９～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

クリアリング溶液が緩衝液及び／又は約１．０のｐＨを含む溶液を含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

ＲＥＥ材料が水溶液である、請求項３９～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

タンパク質がＬａｎＭである、請求項３９～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

ＬａｎＭが、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項86】

バイオソープション材料がビーズである、請求項３９～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

ビーズがアガロースを含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

ビーズ中のタンパク質の濃度が、ビーズの総体積の１ｍＬ当たり、少なくとも約２μｍｏｌ、約３μｍｏｌ、約４μｍｏｌ、約５μｍｏｌ、約６μｍｏｌ、約７μｍｏｌ、約８μｍｏｌ、約９μｍｏｌ又は約１０μｍｏｌのタンパク質である、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

ＬａｎＭが、Ｃ末端システイン残基、Ｎ末端システイン、又は内部システインを含む、請求項８６～８８のいずれか１項に記載のビーズ。

【請求項90】

システインが、グリシンセリンアミノ酸リンカー又は親水性リンカーを介してＬａｎＭに連結されている、請求項８９に記載のビーズ。

【請求項91】

分離する工程（ｃ）が、１種又は複数種の個々のＲＥＥ、ＲＥＥのグループ、周期表において互いに隣接するＲＥＥ、類似のイオン半径を有するＲＥＥ又はそれらの組合せを優先的に分離する、請求項３９～９０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項92】

タンパク質が、ＲＥＥ含有材料中の非ＲＥＥ金属と結合しない、請求項３９に記載の方法。

【請求項93】

ＲＥＥ材料が、希土類鉱石、地熱塩水、石炭、石炭副産物、採掘尾鉱、酸性鉱山排水、リン酸石膏、保守終了製品、電子機器廃棄物、産業排水、又はＲＥＥ源から生じた総ＲＥＥ混合物、例えばこれらの鉱石から得られた塩（例えば酸化物、シュウ酸塩、炭酸塩など）から得られた浸出液である、請求項３９～９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項94】

ＲＥＥ含有材料からスカンジウム及びイットリウムを優先的に分離する方法であって、
（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；
（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；
（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；
（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第１のキレート化剤溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からスカンジウムを優先的に分離する工程；
（ｅ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、第２のキレート化剤溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からイットリウムを優先的に分離する工程；
（ｆ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、第３のキレート化剤溶液を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から重（ＨＲＥＥ）及び中ＲＥＥ（ＭＲＥＥ）を分離する工程；及び
（ｇ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、第４のキレート化剤溶液又は低いｐＨ（＜１．７）を有する溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から軽ＲＥＥ（Ｌａ及びＣｅ）を分離する工程
を含む、前記方法。

【請求項95】

第１の溶液がマロン酸塩を約２０～５０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液がクエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含有し、第３の溶液がクエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含み、第４の溶液が、約１．５のｐＨを有する、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

ＲＥＥ含有材料からスカンジウムを優先的に分離する方法であって、
（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；
（ｂ）前記複数のタンパク質を、ＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；
（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；
（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第１のｐＨの溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からイットリウム及びＨＲＥＥを優先的に分離する工程；
（ｅ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第２のｐＨの溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＭＲＥＥ及びＬＲＥＥを優先的に分離する工程；
（ｆ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、第３のｐＨの溶液を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からスカンジウムを分離する工程
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が、全ての参考文献及びそれと共に提出された付録を含め全て本明細書に明示されているかのように参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、２０２１年６月１４日に出願された米国特許出願第６３/２１０,３１１号の利益を主張する。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
米国政府は、ローレンス・リバモア国立研究所（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のオペレーションのための、米国エネルギー省とローレンス・リバモア・ナショナル・セキュリティＬＬＣ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣ）との間の契約番号ＤＥ－ＡＣ５２－０７ＮＡ２７３４４、及び米国エネルギー省とペンシルバニア州立大学との間の契約番号ＳＣ－ＤＥ００２１００７に従って本出願において権利を有する。

【背景技術】

【0003】

希土類元素（「ＲＥＥ」）は、地球の地殻から採掘される。その独特な物理的及び化学特性のために、これらの元素は、例を挙げると、高性能磁石、レーザー、コンピューターメモリー、携帯電話、触媒コンバーター、カメラ及び望遠鏡レンズ、並びに環境技術、例えば風力タービン及びハイブリッド車などを含む、ますます多くの先端技術製品において重要である。
米国を含む多くの国々がＲＥＥを生産するが、中国がＲＥＥの優勢な生産国であり続けており、世界の供給量の７０～９０％を占めている。ＲＥＥは採掘が難しく、その理由の一つは、経済的な抽出に十分な高い濃度でそれらが見出されることが稀であることである。ＧＰＳ制御ドリルとガンマ線サンプリングとを使用することにより、地質学者が、より多くのＲＥＥを含有する鉱石を特定することが可能になる。鉱石は、トリウムなどの天然放射活性物質が混ざっていることが多く、ＲＥＥの抽出及び加工のための現在の方法は、有機溶媒、アンモニア塩、アルキルリン含有抽出溶媒、及び強い鉱酸などの発癌性のある毒素を大量に必要とする。金属のリーチング及び分離は、高いエネルギー／資本コスト、高いＣＯ₂放出、及び多くの好ましくない健康及び環境への影響を有する。
ＲＥＥに対する需要が急増し続けているため、ＲＥＥ供給の増加と多様化を助け、クリーンで低コストの抽出プロセスを開発し、効率を改善し、再使用や再利用によりＲＥＥを再び獲得するためのツールの必要が未だにある。特には、効率を最大化し廃棄物を最小化することに重点を置いて、特に、ＲＥＥ含量が非ＲＥＥと比べて低いＲＥＥ供給材料からＲＥＥを優先的に分離することが可能なツールの開発が求められている。

【発明の概要】

【0004】

ＲＥＥ含有材料における非ＲＥＥからの希土類元素（ＲＥＥ）の優先的な分離、並びに個々に、及びグループでの両方での特定のＲＥＥの他のＲＥＥからの分離のための方法及び材料が提供される。ある特定の実施形態において、このような方法は、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記タンパク質を、ＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記タンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；並びに（ｄ）前記１種又は複数のＲＥＥを前記タンパク質から分離して、前記１種又は複数種のＲＥＥの精製された画分及び再生された前記タンパク質を生産する工程を含む。
他の実施形態において、希土類元素（ＲＥＥ）分離のための材料を調製するための方法が提供される。このような方法は、（ａ）ＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質と、コンジュゲーション剤で官能化した多孔質支持体材料、とを提供する工程；及び（ｂ）前記タンパク質を、前記コンジュゲーション剤により多孔質支持体材料に結合させる工程を含む。

【0005】

ある特定の実施形態において、ＲＥＥ含有材料から希土類元素（ＲＥＥ）を優先的に分離する方法が提供される。前記方法は、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤を含む第１の溶液又は第１のｐＨを有する第１の溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から重ＲＥＥ（ＨＲＥＥ）を優先的に分離する工程；（ｇ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤を含む第２の溶液又は第２のｐＨを有する第２の溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から中ＲＥＥ（ＭＲＥＥ）を分離する工程；及び（ｈ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤を含む第３の溶液又は第３のｐＨを有する第３の溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から軽ＲＥＥ（ＬＲＥＥ）を分離する工程を含む。

【0006】

ある特定の実施形態において、キレート化剤を使用して、ＲＥＥ含有材料からスカンジウム及びイットリウムを優先的に分離する方法が提供される。前記方法は、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第１のキレート化剤溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からスカンジウムを優先的に分離する工程、（ｅ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第２のキレート化剤溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からイットリウムを優先的に分離する工程；（ｆ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第３のキレート化剤溶液を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から重（ＨＲＥＥ）及び中ＲＥＥ（ＭＲＥＥ）を分離する工程；及び（ｇ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第４のキレート化剤溶液又は低いｐＨ（＜１．７）を有する溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質から軽ＲＥＥ（ＬＲＥＥ、この場合、Ｌａ及びＣｅ）を分離する工程を含む。ある特定の実施形態において、第１の溶液はマロン酸塩を２０～５０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液はクエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含有し、第３の溶液はクエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含み、第４の溶液は約１．５のｐＨを有する。

【0007】

ある特定の実施形態において、ｐＨを使用して、ＲＥＥ含有材料からスカンジウムを優先的に分離する方法が提供される。前記方法は、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合することができる複数のタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して、複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第１のｐＨの溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からイットリウム及びＨＲＥＥを優先的に分離する工程、（ｅ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を第２のｐＨの溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＭＲＥＥ及びＬＲＥＥを優先的に分離する工程；（ｆ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、第３のｐＨの溶液を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からスカンジウムを分離する工程を含む。

【0008】

ある特定の実施形態において、ＲＥＥ含有材料から希土類元素（ＲＥＥ）を分離するための方法は、吸収／脱離サイクルを含む。このような実施形態において、吸収／脱離サイクルは、バイオソープション材料を含有するカラムを、ＲＥＥ含有材料でローディングする工程であって、バイオソープション材料が、ＲＥＥ含有材料中に存在するＲＥＥを吸着して、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成することが可能なタンパク質を含む、前記工程；及び１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種若しくは複数のＲＥＥ又はＲＥＥの１つ若しくは複数のグループを優先的に分離させることが可能な第１の溶液で、第１のＲＥＥが富化された画分を溶出させる工程を含む脱離プロセスを使用して、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種若しくは複数のＲＥＥ又はＲＥＥの１つ若しくは複数のグループを分離する工程を含む。一部の実施形態において、脱離プロセスは、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを脱離させることが可能な第２の溶液を用いて、第２のＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第２の工程を含む。他の実施形態において、脱離プロセスは、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から１種又は複数種のＲＥＥを脱離させることが可能な第３の溶液を用いて、第３のＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第３の工程を含む。富化された画分のそれぞれは、フィード溶液（すなわち、ＲＥＥ含有材料）より高い濃度のＲＥＥを有し得る。

【0009】

一部の実施形態において、第１の吸着／脱離サイクルの後に、第２の吸収／脱離サイクルが実行されてもよい。このような実施形態において、第２の吸着／脱離サイクルは、バイオソープション材料を含有するカラムを第１のＲＥＥが富化された画分でローディングして、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を形成する工程；及び第１の溶液を用いて第１の高純度ＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる工程を含む脱離プロセスを使用して、１種又は複数種のＲＥＥを、１つ又は複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体から分離する工程を含む。一部の実施形態において、第２のサイクルの脱離プロセスは、第２の溶液を用いて第２の高純度ＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第２の工程を含む。他の実施形態において、脱離プロセスは、第３の溶液を用いて第３の高純度ＲＥＥが富化された画分をカラムから溶出させる第３の工程をさらに含む。

【0010】

ある特定の実施形態において、第１、第２及び第３の溶液のそれぞれは、特許請求される優先的な分離を達成するために、特定の選択されたｐＨを有するように設計されているか、キレート化剤を含むか、又はその両方である。一部の実施形態において、第１の溶液は第１の選択されたｐＨを有する。一部の態様において、第１の選択されたｐＨは、３．０若しくはそれ未満、２．５若しくはそれ未満、２．０若しくはそれ未満、又は約１．５若しくはそれ未満であってもよい。他の実施形態において、第１の溶液はキレート化剤を含む。ある特定の態様において、キレート化剤は、クエン酸塩である。一部の実施形態において、クエン酸塩は、第１の溶液中に約３．０ｍＭ又は約１５．０ｍＭの濃度で存在する。キレート化剤が使用される場合、このような溶液のｐＨは３．０より高く、一部の実施形態において、キレート化剤溶液は４．０より高い、約４～７の間の、又は７を超えるｐＨを有する。

【0011】

一部の実施形態において、第２の溶液は第２の選択されたｐＨを含む。一部の実施形態において、第２の選択されたｐＨは第１の選択されたｐＨより低い。ある特定の態様において、第２の選択されたｐＨは、２．５若しくはそれ未満、２．０若しくはそれ未満、又は１．５若しくはそれ未満である。他の実施形態において、第２の溶液は、キレート化剤を含む。ある特定の態様において、キレート化剤はクエン酸塩である。一部の実施形態において、第２の溶液はクエン酸塩を第１の溶液より高い濃度で含む。一部の実施形態において、クエン酸塩は、第２の溶液中に約１５．０ｍＭのクエン酸塩の濃度で存在する。一部の実施形態において、クエン酸塩は、第２の溶液中に約２５．０～約５０．０ｍＭの間のクエン酸塩の濃度で存在する。一部の実施形態において、クエン酸塩は、第２の溶液中に約７５．０ｍＭのクエン酸塩の濃度で存在する。キレート化剤が使用される場合、このような溶液のｐＨは３．０より高く、一部の実施形態において、キレート化剤溶液は、４．０より高い、５．０より高い、約５～７の間の、又は７を超えるｐＨを有する。

【0012】

一部の実施形態において、第１の溶液及び第２の溶液は約２．５～１．５の間のｐＨを有する。他の実施形態において、第１の溶液は約２．０～約２．５の間のｐＨを含み、第２の溶液は約１．５～約２．０の間のｐＨを含む。他の実施形態において、第１の溶液は２．１のｐＨを含み、第２の溶液は１．７のｐＨを含む。一部の実施形態において、第１の溶液は、クエン酸塩を約３．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液は、クエン酸塩を約１５ｍＭの濃度で含む。他の実施形態において、第１の溶液は、クエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液は、クエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含む。
他の実施形態において、第３の溶液は第３の選択されたｐＨを含む。他の実施形態において、第３の選択されたｐＨは第２の選択されたｐＨより低く、第１の選択されたｐＨは第２の選択されたｐＨより低い。他の実施形態において、第３の選択されたｐＨは約１．５若しくはそれ未満又は約１．５である。他の実施形態において、第３の溶液は、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ジメルカプロール、マロン酸塩、イミノジアセテート、ジグリコール酸、ヒドロキシピリジノン、ヒドロキサメート、カテコール、ポリアミノカルボキシレート、酢酸塩、ニトリロトリアセテート、ジピコリン酸、α－ヒドロキシイソ酪酸、又は他のモノ、ジ、及びトリカルボン酸から選択されるキレート化剤を含む。他の実施形態において、第３の溶液は、クエン酸塩を、第２の溶液より高い濃度で含む。他の実施形態において、第１の溶液は、約７５．０ｍＭのクエン酸塩を含む。

【0013】

他の実施形態において、第１の溶液はクエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含み、第２の溶液はクエン酸塩、約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含み、第３の溶液は約１．５のｐＨを有する。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載される方法はまた、ＲＥＥが富化された画分若しくは複数の画分、又は高純度ＲＥＥが富化された画分若しくは複数の画分を溶出させた後に、クリアリング溶液を使用してタンパク質を再生する工程も含む。ある特定の実施形態において、クリーニング（又はクリアリング）溶液は、緩衝液及び／又は約１．０のｐＨを含む溶液（例えば、ＨＣｌ又はＨ₂ＳＯ₄又はＨＣｌ／Ｈ₂ＳＯ₄混合物）を含む。

【0014】

ある特定の実施形態において、本開示に従って使用されるタンパク質は、ランモジュリン（ＬａｎＭ）である。一部の実施形態において、ＬａｎＭは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＬａｎＭは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、バイオソープション材料が提供される。バイオソープション材料は、少なくとも１種のＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質を含む、希土類元素（ＲＥＥ）分離のためのマイクロビーズで構成されていてもよく、タンパク質は、ビーズに埋め込まれているか又はその表面上にある。ある特定の実施形態において、タンパク質は、ＬａｎＭである。

【0015】

ある特定の実施形態において、バイオソープション材料はマイクロビーズで構成されている。ある特定の実施形態において、ビーズはアガロースを含む。ある特定の実施形態において、ビーズ中のタンパク質の濃度は、ビーズの総体積の１ｍＬ当たり、少なくとも約２μｍｏｌ、約３μｍｏｌ、約４μｍｏｌ、約５μｍｏｌ、約６μｍｏｌ、約７μｍｏｌ、約８μｍｏｌ、約９μｍｏｌ又は約１０μｍｏｌのタンパク質である。一部の実施形態において、ＬａｎＭはＣ末端システイン残基、Ｎ末端システイン、又は内部システインを含む。一部の実施形態において、システインは、グリシン－セリン－グリシンアミノ酸リンカー又は親水性リンカーを介してＬａｎＭに連結されている。

【0016】

一部の実施形態において、分離する工程は、１種若しくは複数の個々のＲＥＥ、ＲＥＥのグループ、周期表において互いに隣接するＲＥＥ、類似のイオン半径を有するＲＥＥ又はそれらの組合せを優先的に分離する。ある特定の実施形態において、タンパク質はＲＥＥ含有材料中の非ＲＥＥ金属と結合しない。

【0017】

ある特定の実施形態において、ＲＥＥ材料は、希土類鉱石、地熱塩水、石炭、石炭副産物、採掘尾鉱、酸性鉱山排水、リン酸石膏、保守終了製品、電子機器廃棄物、産業排水、又はＲＥＥ源から生じた総ＲＥＥ混合物、例えばこれらの鉱石から得られた塩（例えば酸化物、シュウ酸塩、炭酸塩など）から得られた浸出液である。一部の実施形態において、ＲＥＥ材料は水溶液である。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の開示の実施形態に従って固定化ＬａｎＭを使用するＲＥＥの分離のための例示的な方法を示す図である。

【図2A-2D】本発明の開示の実施形態によるアガロースマイクロビーズ上へのＬａｎＭの固定化を確認する例示的なスキーム、プロット、及び画像を示す図である。チオール－マレイミドクリックケミストリーを介したアガロースマイクロビーズ上へのＬａｎＭの固定化（図２Ａ）は、アミノアガロース、Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、マレイミドアガロース、及びＬａｎＭアガロースのフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）（図２Ｂ）、ＬａｎＭ固定化動態（図２Ｃ）、及び蛍光顕微鏡法（図２Ｄ、スケールバーは、１００μｍであり、下の画像は、上の画像の分割チャンネルである）によって確認された。

【図3A-3G】固定化ＬａｎＭが低いｐＨでＲＥＥと結合する能力を保持し、本発明の開示の実施形態による再使用に関して安定であることを確認する例示的なプロットを示す図である。プロットは、ｐＨの関数としてのＮｄ破過曲線（図３Ａ）、ＨＣｌ濃度の関数としてのＮｄ脱離曲線（図３Ｂ）、１０回の連続した吸収／脱離サイクルを用いたＮｄ破過曲線に基づくカラム再使用性を確認するプロット（図３Ｃ）、ｐＨ３におけるＹ、Ｌａ、Ｎｄ、Ｄｙ及びＬｕの独立した単一元素の破過曲線（図３Ｄ）、非ＲＥＥに対するＬａｎＭカラムのＮｄ選択性を確認するための合成フィード溶液を使用した金属イオン破過曲線（図３Ｅ）、ｐＨ１．５のＨＣｌでの処理後の金属イオンの脱離プロファイル（図３Ｆ）、並びにＦｅからＮｄを優先的に分離するＬａｎＭの能力を評価するためのクエン酸塩を含有する二成分Ｎｄ／Ｆｅ溶液を使用した破過実験（図３Ｇ）を含む。

【図4A-4B】溶液中のＬａｎＭが本発明の開示の実施形態に従って３当量のＲＥＥと結合することを確認する例示的なプロットを示す図である。プロットは、インジケーターとしてキシレノールオレンジを使用した競合滴定アッセイ（図４Ａ）、及びＡ２７５ｎｍにおける吸光度の増加として追跡されたランタンに対するＬａｎＭの構造的な応答を示すプロットを含む（図４Ｂ）。

【図5A-5B】本発明の開示の実施形態に従って、溶液中でのリガンド競合がＲＥＥ種内分離を引き起こし得ることを示唆する例示的なプロットを示す図である。プロットは、タンパク質の固有なチロシン蛍光発光の変化によってモニターされた化学量論的な滴定（図５Ａ）及びクエン酸塩を使用したＲＥＥ脱離（図５Ｂ）を含む。

【図6A-6F】本発明の開示の実施形態に従って２段階のｐＨスキームを使用してＲＥＥの対を分離する固定化ＬａｎＭの能力を確認する例示的なプロットを示す図である。ＲＥＥの対を分離する固定化ＬａｎＭの能力は、段階的なｐＨスキームを使用して、単一元素がローディングされたカラムの累積的な脱離プロファイルを分析することによって確認され（図６Ａ、ＲＥＥイオン脱離を、脱離した総ＲＥＥに対して正規化した；実験条件：９０％飽和までカラムをローディングするのに、独立した単一のＲＥＥ溶液を使用した）、Ｄｙ：Ｎｄの５０：５０混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．１及び１．７）に供し（図６Ｂ）、Ｄｙ：Ｎｄの５：９５混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．２及び１．７）に供し（図６Ｃ）；Ｙ：Ｎｄの２２：７８混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．３及び１．７）に供した（図６Ｄ）。図６Ｅに、２段階ｐＨスキームを使用することによる供給材料及び３つの脱離ゾーン中のＲＥＥ組成の要約を提供する。

【図7A-7D】本発明の開示の実施形態に従って段階的なキレート化剤濃度及びｐＨスキームを使用してＲＥＥの対を分離する固定化ＬａｎＭの能力を確認する例示的なプロットを示す図である。ＲＥＥの対を分離する固定化ＬａｎＭの能力は、段階的なクエン酸塩濃度（ｐＨ５）スキームを使用した単一元素がローディングされたカラムの累積的な脱離プロファイルを分析することによって確認された（図７Ａ）；Ｄｙ：Ｎｄの５：９５混合物で構成される供給材料を、１５ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供した（図７Ｂ）；Ｄｙ：Ｎｄの５０：５０混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供し（図７Ｃ）、Ｙ：Ｎｄの２２：７８混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供した（図７Ｄ）（各パネルの上の値は、垂直の点線で分割した各溶出ゾーンを超えるＲＥＥの純度を示す）。図６Ｆに、クエン酸塩－ｐＨスキームを使用することによる供給材料及び３つの脱離ゾーン中のＲＥＥ組成の要約を提供する。

【図8A-8F】低グレードの供給材料浸出液からＲＥＥを分離し、抽出する固定化ＬａｎＭの能力を確認する例示的なプロットを示す図である。低グレードの供給材料浸出液からＲＥＥを分離し、抽出する固定化ＬａｎＭの能力は、パウダー川盆地（ＰＲＢ）フライアッシュ浸出溶液からのＲＥＥ回収のためのＬａｎＭカラムを使用して確認され、結果は、金属イオンの吸着プロファイル（図８Ａ、吸着条件：ｐＨ５、０．５ｍＬ／分。１ベッド体積＝０．８ｍＬ）、ＰＲＢフィード中の金属組成及び回収されたバイオソープション溶液（図８Ｂ）；ＰＲＢフィード及び回収されたバイオソープション溶液中の金属イオン（ただし１価イオンは除く）のパーセンテージ（図８Ｃ）、選択された非ＲＥＥに対する総ＲＥＥの分離係数（図８Ｄ）、２段階のｐＨスキームによるＨＲＥＥ（Ｔｂ－Ｌｕ＋Ｙ）及びＬＲＥＥ（Ｌａ－Ｇｄ）の選択的な脱離（図８Ｅ）、並びにＰＲＢフィード及び３つの溶出ゾーン中の総ＲＥＥに対するＲＥＥ比率（図８Ｆ）によって分析された。

【図9】ＬａｎＭアガロースカラム（脱離条件：ｐＨ１．５のＨＣｌ）を使用することによるＰＲＢフライアッシュ浸出液の脱離プロファイルを示す例示的なプロットを示す図である。

【図10A-10B】本発明の開示の実施形態に従ってＲＥＥ分離の基準を形成するＲＥＥのなかでもＬａｎＭ－ＲＥＥ安定性における主要な差を実証する例示的なプロットを示す図である。プロットは、ＬａｎＭ－アガロースカラムを使用したランタニド系列の破過曲線（図１０Ａ、フィード：各ＲＥＥの濃度：１３μＭ；ｐＨ３．０、１０ｍＭのグリシン）及びイオン半径の関数としての個々のＲＥＥの破過点（図１０Ｂ）を含む。

【図11A-11D】本発明の開示の実施形態に従って段階的なｐＨでの脱離スキームに供される場合の、総ＲＥＥをＨＲＥＥ、ＭＲＥＥ、及びＬＲＥＥ画分に分離することを可能にするＬａｎＭカラム（９０％容量までローディングした）の有効性を実証する例示的なプロットを示す図である。プロットは、ベッド体積に対する各ＲＥＥの正規化した濃度（図１１Ａ及び１１Ｃ）及びベッド体積に対する各ＲＥＥの累積的な脱離（図１１Ｂ及び１１Ｄ）を示す。図１１Ａ及び１１Ｂにおいて、フィード組成は以下の通りであった：Ｙ：７２．７μＭ；Ｌａ：５３．４μＭ；Ｃｅ：１１３．５μＭ；Ｐｒ：１３．４μＭ；Ｎｄ：５１．５μＭ；Ｓｍ：１０．２μＭ；Ｅｕ：２．２μＭ；Ｇｄ：９．５μＭ；Ｔｂ：１．４μＭ；Ｄｙ：７．９μＭ；Ｈｏ：１．４μＭ；Ｅｒ：４．０μＭ；Ｔｍ：０．５μＭ；Ｙｂ：３．０μＭ；Ｌｕ：０．４μＭ。図１１Ｃ及び１１Ｄにおいて、図１１Ａ及び１１Ｂで使用されるフィード組成に、スカンジウムを各ランタニドと等価な濃度で追加した。

【図12】本発明の開示の実施形態による抽出物Ｓｃに対するＬａｎＭの親和性を示す例示的なプロットを示す図である。プロットは、ＬａｎＭが、ｐＨ５において１．３Ｅ－１３Ｍ（０．１３ｐＭ）のＳｃの熱力学的な解離定数（Ｋｄとして公知）を呈示することを示す。

【図13】溶液中のＬａｎＭからのマロン酸塩によって誘導されたＳｃ及びＬｕの解離が高度に選択的であることを示す例示的なプロットを示す図であり、これから、Ｓｃは最も重いＲＥＥであるＬｕから分離できることが示唆され、したがって、本発明の開示の実施形態に従って同様に他のランタニド及びＹでも分離できる可能性がある（実験は、１００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ５において、２０μＭのタンパク質を用いて実行された）。

【図14】Ｌｕ、Ｌａ、Ｃｅのクエン酸塩によって誘導された解離データを示す例示的なプロットを示す図であり、本発明の開示の実施形態に従ってＹ及びＭＲＥＥからＬｕを分離するためにクエン酸塩を使用する可能性を実証する。（この図に示されるＮｄ、Ｄｙ、及びＹのデータは、図５と同じである）。

【図15A-15B】クエン酸塩は、本発明の開示の実施形態に従って、ＬａｎＭアガロースカラムからイオン半径の昇順で優先的にスカンジウムを、次いでＨＲＥＥ、次いでＭＲＥＥ、次いでＬＲＥＥを脱離させることを示す例示的なプロットを示す図である。プロットは、ＬａｎＭアガロースカラムを使用したクエン酸塩によってキレート化されたＲＥＥの破過曲線［図１５Ａ、フィード：ｐＨ３．５条件における、２０ｍＭのクエン酸塩中の等モル（各０．０１３ｍＭ）のＲＥＥ（Ｓｃ、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、及びＬｕ）］及び異なるクエン酸塩濃度を使用したＲＥＥの段階的な脱離（図１５Ｂ、プロットは、ベッド体積に対する各ＲＥＥの累積的な脱離を描写する）を示す。図１５Ｂの場合、実験条件：ベッド体積の２１倍量のＲＥＥ溶液をＬａｎＭカラムにポンプ注入して、約９０％カラム飽和を達成し、続いてベッド体積の１０倍量の脱イオン水で洗浄した。次いでクエン酸塩濃縮工程を含むｐＨ５脱離溶液（３～７５ｍＭ）を、カラムにポンプ注入した。フィード：ｐＨ３．０の１０ｍＭのグリシン中の等モルのＲＥＥ（Ｓｃ、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、及びＬｕ）。段階的なクエン酸塩脱離スキームに供される場合、総ＲＥＥをＨＲＥＥ、ＭＲＥＥ、及びＬＲＥＥ画分に分離することを可能にするＬａｎＭカラム（９０％容量までローディングした）の有効性を実証する。

【図16A-16B】ＬａｎＭ（配列番号３）の残基１～４０を除去することで、本発明の開示の実施形態に従って、ＲＥＥ対タンパク質が２：１の化学量論的な比率でＲＥＥと結合できる機能性タンパク質が得られることを実証する例示的なプロットを示す図である。固有なチロシン蛍光によって判断される通り、ＬａｎＭΔ１－４０は、約２当量のＬａ及びＤｙと結合し（図１６Ａ）、このようなＬａｎＭΔ１－４０は、ｗｔ－ＬａｎＭと類似した（ただし同一ではない）溶液状の金属解離特性を示すことから（脱着剤としてクエン酸塩を使用して）、生産的なＥＦハンドが保存されており、類似の分離戦略がこのバリアントにも適用することが可能であることが示唆される（図１６Ｂ）。プロットは、ＬａｎＭΔ１－４０バリアントが、その第１の非生産的なＥＦハンドが除去されており、ＲＥＥ結合の化学量論（図１６Ａ）及びｐＨ５における１００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭＯＰＳ中のクエン酸塩によって誘導された金属解離（図１６Ｂ）に関して試験された（全ての実験は、２０μＭのタンパク質を用いて実行された）ＬａｎＭΔ１－４０蛍光測定器実験を含む。

【図17A-17C】本発明の開示の実施形態による二重ＬａｎＭバリアント（配列番号４）による化学量論的なＲＥＥ結合を実証する例示的なプロットを示す図である。プロットは、ｐＨ６におけるマイクロモルより強い親和性を呈示する約５当量の金属結合を示唆するキシレノールオレンジ競合アッセイ（図１７Ａ）、約４当量のＲＥＥ結合ことを示唆するチロシン吸光度アッセイ（図１７Ｂ）、及びｐＨ５における４当量のＲＥＥ結合ことを示唆するチロシン蛍光アッセイ（図１７Ｃ）を含む。

【図18】二重ＬａｎＭバリアントの金属解離特性が、ｗｔ－ＬａｎＭに類似していることを実証する例示的なプロットを示す図であり、二重ＬａｎＭが、本発明の開示の実施形態に従ってカラム容量を増加させるための生産的な手段であることを示唆している。プロットは、１００ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭＯＰＳ中、ｐＨ５で試験された二重ＬａｎＭバリアント（２０μＭ）のクエン酸塩によって誘導された金属解離曲線を含む。

【図19】本発明の開示の実施形態に従って３つのカラムローテーションスキームを用いた固定化ＬａｎＭを使用したＲＥＥの連続フロー分離の例示的な方法を示す図である。

【図20】本発明の開示の実施形態に従ってＬａｎＭアガロースカラムを使用した金属イオン破過曲線の例示的なプロットを示す図である（フィード：バイオリキシビバントをｐＨ３．５で使用して生成された電子機器廃棄物浸出液。バイオリキシビバントは、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）培養物の上清から調製されたものであり、リーチング剤として主としてグルコン酸及び他の有機酸を含む）。

【図21】ＬａｎＭはＮｄ／Ｄｙ分離後の高純度のＮｄ及びＤｙの生産を可能にすることを示すグラフである。Ｄｙ：Ｎｄの５：９５混合物（ｐＨ３）を含む溶液を、２回のカップリングされた吸着／脱離サイクルに供した。第１のサイクル（左のパネル）は、高純度のＮｄ溶液（９９．９％）及びアップグレードされたＤｙ（４４％Ｄｙ／５６％Ｎｄ）溶液を生成した。アップグレードされたＤｙ溶液を、第２の吸着／脱離サイクル（右のパネル）でのフィード溶液として使用して、高純度のＤｙ及びＮｄ画分を生成した。各ｐＨ工程の持続時間は、濃い灰色の破線によって描写され、第２の軸に対応する。

【図22】電子機器廃棄物のバイオ浸出液（ｂｉｏｌｅａｃｈａｔｅ）からのＲＥＥ回収及び分離を示す図である。（Ａ）段階的なＮｄ／Ｐｒ及びＤｙ回収並びに分離プロセスの概略図。（Ｂ）流出液中の金属の相対濃度（流入液と比較した）。パネルＡに示される工程間の移行は、垂直の灰色の点線によって描写される。ストリップ溶液のｐＨ値は、より濃い灰色の水平な点線で示される。（Ｃ）カラムから溶出させたＲＥＥの絶対濃度。（Ｄ）電子機器廃棄物試験の前及び後におけるカラムのＮｄ破過曲線によるカラム再使用性の実証。

【図23】電子機器廃棄物供給材料からの例示的なＤｙ対Ｎｄ／Ｐｒ分離を示すグラフである。第１の抽出工程からのＤｙが富化された画分（２９％のＤｙ）と同一な組成を有する合成溶液を２段階の脱離プロセスに供して、高純度のＤｙ及びＮｄ画分を生成した。

【図24】（Ａ）ＬＲＥＥ（Ｌａ＋Ｃｅ）除去戦略を試験するために使用された合成ＲＥＥ溶液の元素組成を示すグラフである。ＲＥＥ組成は、典型的な鉱石ベースの浸出溶液（例えば、褐廉石）中のＲＥＥ比率を反映する。（Ｂ）段階的なクエン酸塩濃度（ｐＨ５）スキームを使用した、パネルＡに描写された合成ＲＥＥ供給材料でローディングされたＬａｎＭカラムの累積的なＨＲＥＥ／ＭＲＥＥ／ＬＲＥＥ脱離プロファイル。ＲＥＥ脱離を、各グループにおいて脱離した総ＲＥＥに対して正規化した。

【図25】（Ａ）段階的なクエン酸塩濃度（ゾーンＩ：１５ｍＭ；ゾーンＩＩ：５０ｍＭ、ｐＨ５）及びｐＨ（ゾーンＩＩＩ：ｐＨ１．５）スキームを使用した、ＲＥＥがローディングされたカラム（供給材料組成は図２Ａに描写される）の脱離プロファイル。（Ｂ）クエン酸塩－ｐＨスキームを使用した、フィード溶液中の総ＲＥＥに対する最初の供給材料及び３つの脱離領域におけるＲＥＥ分布の要約を示すグラフである。

【図26】Ｓｃを含有する鉱石（例えば、褐廉石）及び廃棄物（例えば、ボーキサイト）供給材料におけるＲＥＥ組成と類似した合成溶液の相対的なＲＥＥ組成を示すグラフである。

【図27】（Ａ）クエン酸塩はＲＥＥからのスカンジウムの高純度及び高収率の分離を可能にすることを示す図である。脱離プロファイル及び（Ｂ）段階的なクエン酸塩（３ｍＭ及び１５ｍＭ、ｐＨ５で）及びｐＨ１．５脱離スキーム後のＲＥＥがローディングされたＬａｎＭカラムの累積的な脱離（収率）を示すグラフである。（Ｃ）最初の供給材料及び３つの脱離画分におけるＲＥＥ分布。

【図28】マロン酸塩がＲＥＥからのスカンジウムの高純度及び高収率の分離を可能にすることを示す。ＬａｎＭカラムを、典型的なＳｃを含有する鉱石ベースの供給材料浸出溶液におけるＲＥＥ組成と類似した合成ＲＥＥ溶液でローディングした。３０ｍＭ及び５０ｍＭのマロン酸塩での処理後の（Ａ）脱離プロファイル及び（Ｂ）累積的な脱離（収率）。

【図29】Ｓｃが富化された画分を生成するための段階的なｐＨ脱離スキームの使用を示すグラフである。ＬａｎＭカラムを、典型的なＳｃを含有する鉱石ベースの供給材料浸出溶液におけるＲＥＥ組成と類似した合成ＲＥＥ溶液でローディングした。段階的なｐＨ勾配での処理後の（Ａ）脱離プロファイル及び（Ｂ）累積的な脱離（収率）及び（Ｃ）相対組成。

【図30】ＲＥＥ間の選択性の定量的な尺度を提供する、固定化ＬａｎＭのＲＥＥシリーズにわたる分配係数を示すグラフである。カラムを最初に脱イオン水で洗浄し、次いでカラムに空気を吹き入れることによって除去した。次に、５ｍＬのフィード溶液１又は２（合計１５μｍｏｌのＲＥＥ）を０．５ｍＬ／分で２時間カラムに循環させ、次いでカラムに空気を押し込むことによって除去した。平衡状態の液体を［Ｍ］ａｄとして収集した。次いで４ｍＬの０．１ＭのＨＣｌをカラムに通し、流出液を［Ｍ］ｄｅとして収集した。カラム：ＷＴ－ＬａｎＭ（０．９ｍＬ、約３．５μｍｏｌ／ｍＬのＮｄ吸着容量）。カラムはそれでもなお、水素処理される場合に約０．８ｍＬの水を含有する。自由水をカラムに空気を吹き入れることによって除去した。溶液１。ｐＨ５における等モルの（各０．３３ｍＭ、合計３ｍＭ）Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ。溶液２。ｐＨ５における等モルの（各０．３３ｍＭ、合計３ｍＭ）Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｙ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

希土類元素（ＲＥＥ）は、イットリウム、スカンジウム、及びランタニドで構成されており、これらは電気自動車、風力タービン、及びＬＥＤなどのクリーンエネルギー技術にとって重要であるため、化石燃料時代から低炭素時代への移行に必須である。¹しかしながら、これに対して現在のＲＥＥ抽出及び分離プロセスは、高いエネルギー消費を必要とし、多様なＲＥＥサプライチェーンの開発を妨害する深刻な環境的な負担をもたらし、クリーンエネルギー技術の環境上の利益を損なう。^2、3新たに出現したクリーンエネルギー技術市場のＲＥＥの要求を満たすために、含まれるＲＥＥ含有資源、低グレードの源及び再利用可能な廃棄物からの環境に優しいＲＥＥ抽出を可能にする新しい処理手法を開発することは避けられない。

【0020】

ＲＥＥ間の分離は、それらの類似した物理化学的な特性とＲＥＥを含有する堆積物中における同時出現とのために^4、5特に難しく、ＲＥＥ生産中の環境への全影響の約３０％を占める^2、6、7。現在、ＲＥＥ分離は、酸浸出溶液中での不純物からの一次的なＲＥＥ分離とそれに続く液体-液体抽出によるグループ又は個々のＲＥＥ分離を含む化学集約的な湿式冶金プロセスによるものが主流である⁵。許容できるレベルのＲＥＥ富化を達成するために、液体-液体抽出は、大量の液体廃棄物を生じる何百もの段階（すなわち、ミキサーセトラー又はパルスカラム）を必要とする場合がある。さらに、液体-液体抽出にとって、従来と異なる源、例えば産業廃棄物や保守終了消費者用電子機器（例えば、電子機器廃棄物）からの変動しやすい又は薄いＲＥＥ浸出溶液を処理することは極めて難しく、このような処理は、膨大な量の浸出溶液を有機溶媒と接触させる必要があり、結果として、大規模な分離ユニット（すなわち、高ＣＡＰＥＸ）及び水系に分散された溶媒の損失が生じる。

【0021】

溶媒損失を低減するために、有機溶媒中にＲＥＥ選択的リガンド（抽出溶媒）を溶解させ、固体支持体内にローディングすることによって、液体-液体抽出プロセスをカラムクロマトグラフィーに適合させてきた^8、9。しかしながら、それでもなおこの物理的な含浸戦略は、静止している液相のリーチングを必然的に生じ、交差汚染及び再使用性の限定を引き起こす¹⁰。化学的リガンド（抽出溶媒）が固体支持体樹脂上に共有結合で固定化されている固体-液体抽出（ＳＬＥ）は、液体-液体抽出に比べて、固体吸着剤とＲＥＥ含有溶液との間のより速い相分離、プロセス中に存在する有機希釈剤の量の著しい低減、及び最小の抽出溶媒損失¹⁵、などの数々の利点を提供する^11~14。しかしながら、ＲＥＥ分離に採用されるＳＬＥ吸着剤のほとんどが液体-液体抽出に使用される既存の合成有機抽出溶媒（リガンド）（例えばＨＤＥＨＰ、ＴＢＰ、ＴＯＤＧＡ、又はＣｙａｎｅｘ誘導体）に基づいており、ＲＥＥ抽出及び分離に関するその選択性は通常、限定される¹⁶。

【0022】

生物学的なリガンドをＳＬＥプロセスに組み込むことは、新規の化学及び環境的に持続可能なＲＥＥ分離プロセスの開発の可能性をもたらす¹⁷。例えば、ランタニド結合タグ（ＬＢＴ）は、ＲＥＥに対する高親和性及び選択性に関して操作された短いペプチドであり、これはバイオマテリアル表面（細胞、ｃｕｒｌｉ繊維など）上に提示され、様々な供給材料浸出液からの中及び重ＲＥＥの選択的な回収のためにＳＬＥで採用されている^18、19。しかしながら、それでもなお、Ｚｎ²⁺、Ｃｕ²⁺、及び大量のＣａ²⁺に対する選択性、ｐＨ５未満のＲＥＥ結合の増加、ＲＥＥ供給材料に適合する条件を有する方法への必要性が未だある¹⁸。

【0023】

ＲＥＥ抽出にとって特に重要なのはランモジュリン（ＬａｎＭ）であり、これは、近年発見された、小さい（１２ｋＤａ）ペリプラズムタンパク質であり、メチロトローフ細菌におけるランタニド取り込み及び利用経路の一部である²⁰。ＬａｎＭの生化学及び生物物理学的な特徴付けから、他の非ＲＥＥカチオンに対してＲＥＥへの驚くべき選択性、ほぼ２．５もの低いｐＨまでＲＥＥと結合する能力、及び繰り返しの酸処理サイクルに対する驚くべきロバスト性が明らかにされた¹⁶。このタンパク質の高親和性にもかかわらず、脱離は相対的に穏やかな処理（ｐＨを低下させること、又は水溶性カルボキシレートのような一般的なキレート化剤）によって誘導でき、ＲＥＥと結合し、それを脱離させることを複数回行うことができる。さらに、ＬａｎＭはまた、重ＲＥＥよりも中－軽ＲＥＥに対する稀な選好も示す；控えめではあるが、このような選好は、軽／重ＲＥＥグループの効率的な分離を可能にし、又は重要なＲＥＥ対の効率的な分離をも可能にする²⁰。

【0024】

現在のＲＥＥ分離アプローチの技術的、経済的、及び環境的な制限に対処するために、タンパク質ベースのＲＥＥ分離方法が本明細書で提供される。タンパク質ベースのＲＥＥ分離方法は、ＲＥＥ選択的なＬａｎＭタンパク質キレート化剤又はその誘導体を使用するバイオマテリアルベースの全て水性のＲＥＥ抽出及び分離スキームである。容易なタンパク質再使用を可能にするために、固定化ＬａｎＭは、生物学的に再生可能であり商業的に入手可能な多孔質アガロースマイクロビーズ上に固定化される²¹。得られたバイオマテリアルにより、従来と異なる低グレードのＲＥＥ供給材料からグループ分けされたＲＥＥの効果的な抽出が可能になった。さらに、中－軽ＲＥＥへのＬａｎＭの選好を利用することによって、本明細書に記載されるＲＥＥ分離方法は、ＲＥＥ対（Ｎｄ／Ｄｙ、及びＹ／Ｎｄ）間の高純度の分離、及び重ＲＥＥ（ＨＲＥＥ）と軽ＲＥＥ（ＬＲＥＥ）との間のグループ分けされた分離を提供する。したがって、このアプローチの液体-液体抽出を超える主な利点は、単一の全て水性の吸着／脱離サイクル内における非ＲＥＥからの一次ＲＥＥ抽出と重及び軽ＲＥＥ間の二次分離との組合せである。

【0025】

この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態及び代替の適用においてどのように本発明を実行するかが当業者に明らかになるであろう。しかしながら、全ての本発明の様々な実施形態が本明細書に記載されるわけではない。ここで提示される実施形態は、単に一例として提示され、限定ではないことが理解されるであろう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、以下に記載される本発明の範囲又は幅を限定するものと解釈されるべきではない。
詳細な説明は、読み手の利便性のために様々なセクションに分けられ、いずれのセクションで見出される開示も、別のセクションにおける開示と組み合わせることができる。明細書において読み手の利便性のためにタイトル又はサブタイトルが使用される場合があり、これらが本発明の開示の範囲に影響を及ぼすことは意図されない。
文脈上別段の指定がない限り、本明細書に記載される発明の様々な特徴は、あらゆる組合せで使用できることが具体的に意図される。さらに、本開示はまた、一部の実施形態において、本明細書に記載されるいずれの特徴又は特徴の組合せも排除又は省略できることも予期する。例示のために、本明細書において複合体が成分Ａ、Ｂ及びＣを含むと述べられる場合、Ａ、Ｂ若しくはＣのいずれか、又はそれらの組合せを、単独で、又はあらゆる組合せで省略したり放棄したりできることが具体的に意図される。

【0026】

定義
全ての数値の表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、範囲を含めて、１．０又は０．１の増加量で、必要に応じて、又は代替として、＋／－１５％、又は代替として１０％、又は代替として５％、又は代替として２％の変動で（＋）又は（－）に変動する近似値である。必ずしも明示的に述べられるとは限らないが、全ての数値の表示は、用語「約」が前につくことが理解されるものとする。ことが理解されるであろうこのような範囲の様式は、利便性と簡潔さのために使用され、範囲の限定として明示的に特定された数値を含むだけでなく、その範囲内に含まれる全ての個々の数値又は部分範囲も、各数値及び部分範囲が明示的に特定されているかのように含むものとして柔軟に理解されるべきである。例えば、約１～約２００の範囲内の比率は、約１及び約２００の明示的に列挙された上下限を含むだけでなく、個々の比率、例えば約２、約３、及び約４、並びに部分範囲、例えば約１０～約５０、約２０～約１００なども含むと理解されるべきである。また、必ずしも明示的に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は、単に例示的なものであり、その均等物が当業界において公知であることも理解されるものとする。

【0027】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、複数のタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
用語「約」は、本明細書で使用される場合、例えば量又は濃度などの測定可能な値を指す場合、特定された量の、２０％、１０％、５％、１％、０．５％の変動を包含すること、又は０．１％ほどの変動も包含することを意味する。
用語又は「許容できる」、「有効な」、又は「十分な」は、本明細書で開示されるいずれかの成分、範囲、用量の形態などの選択を記載するのに使用される場合、前記成分、範囲、用量の形態などが、開示された目的に好適であることを意図する。

【0028】

語句「ない」又は「実質的にない」は、任意の競合する金属が、精製されたＲＥＥ材料、組成物、又は溶出した溶液の総質量又は体積の、約０．０００１％未満、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約５％未満、又は約１０％未満の量で存在することを指す。
語句「クリックケミストリー」は、本明細書で使用される場合、分子構成要素を共有結合で連結させる穏やかな条件下で迅速に選択的に進行する有機反応の一群を指す。
「及び／又は」はまた、本明細書で使用される場合、関連する列挙された項目の１つ又は複数のありとあらゆる可能性のある組合せに加えて、二者択一（「又は」）として解釈される場合、組合せの除外も指し、それらを包含する。

【0029】

タンパク質
本開示の態様は、ＥＥ選択的なランモジュリン（ＬａｎＭ）タンパク質を含む、ＲＥＥの分離における使用のためのタンパク質を提供する。

【0030】

ランモジュリン（ＬａｎＭ）は、一部のメチル栄養生物によって生産される約１２ｋＤａの低分子量タンパク質であり、天然のランタニド調節タンパク質である。野生型Ｍ．エキストロクエンス（Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）のＬａｎＭタンパク質は、配列番号１の配列を有し、任意に、Ｎ又はＣ末端にＨｉｓ－タグ付けされていてもよい。本開示の方法及び組成物はＬａｎＭタンパク質を利用する。好適なＬａｎＭタンパク質としては、野生型Ｍ．エキストロクエンスのＬａｎＭタンパク質、又は少なくとも２つのＥＦハンドモチーフを有する他の生物由来のホモログが挙げられ、少なくとも１つのＥＦハンドモチーフは、少なくとも３個のカルボン酸残基を有し、ＥＦハンドモチーフのうち少なくとも２つは、１０～１５残基のスペースによって隔てられている。本明細書における言及は、一般的に「ランモジュリン」、「ＬａｎＭ」又は「ＬａｎＭタンパク質」に対してなされ、本明細書に記載される野生型及びホモログを含むことが理解されるべきである。「ＬａｎＭ」は、１つ若しくは複数のＬａｎＭ単位を有する全長タンパク質、又は１つ若しくは複数のＬａｎＭ単位を含むその一部を含み得る。ＬａｎＭ単位は、少なくとも２つのＥＦハンドモチーフを含み、少なくとも１つのＥＦハンドモチーフは、少なくとも３個のカルボン酸残基を有し、ＥＦハンドモチーフの少なくとも２つは、１０～１５残基のスペースによって隔てられている。言及を簡易化するために、ランモジュリン、ＬａｎＭ又はＬａｎＭタンパク質への言及により議論がなされ、全長タンパク質及び好適なＬａｎＭ単位を有する全長タンパク質の一部の両方を含むことが理解されるべきである。

【0031】

このタンパク質のＥＦハンドの固有な特徴は、これまでにタンパク質の最初の特徴付けにおいて論じられている（Cotruvo et al., J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 44, 15056－15061）。Ｍ．エキストロクエンスのＡＭ１ランモジュリンに加えて他の生物由来のホモログの生化学的及び構造的な研究に基づいて、ランモジュリンタンパク質ドメインは、特定の主要な特徴を有する。多くの例において、ＥＦハンドの少なくとも１つは、第２の位置にプロリン残基を含有していた。しかしながら、全てのＬａｎＭホモログがこのような残基を有しているわけではない；その上それらは、例えば隣接するＥＦハンドの少なくとも２つの間の間隔（１０～１５残基、例えば１２～１３残基）、及びＥＦハンドにおける追加のカルボン酸残基などの、同定されたＬａｎＭの他の主要な特徴を呈示する。特に、隣接するＥＦハンド間の間隔が、カルモジュリンなどの従来のＥＦハンドを含有するタンパク質からそれらを区別するこれらのタンパク質の顕著な特徴であると考えられる。Ｍ．エキストロクエンスのＬａｎＭに対して極めて低い（＜４０％）同一性を有する配列でさえも、上述した他の一般的な特徴が保存されている場合、類似した特性を有する可能性がある。実施形態において、ＬａｎＭは、配列番号１の配列を有するＭ．エキストロクエンスの野生型ＬａｎＭであり、任意に末端Ｈｉｓタグ付けされていてもよい。実施形態において、ＬａｎＭは野生型ＬａｎＭのホモログであってもよい。好適なホモログは、少なくとも２つのＥＦハンドモチーフを有し、少なくとも１つのＥＦハンドモチーフは、少なくとも３つのカルボン酸残基を有し、ＥＦハンドモチーフの少なくとも２つは、１０～１５残基（１２～１３残基を含む）のスペーサーによって隔てられている。例えば、タンパク質は、以下の形態：（Ｄ／Ｎ）－Ｘ１－（Ｄ／Ｎ）－Ｘ２－（Ｄ／Ｎ）－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８－（Ｅ／Ｄ）を有する、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＥＦハンドモチーフを含んでいてもよく、ここで、番号付けされた各Ｘは、任意の残基であり（各位置において必ずしも同じ残基とは限らない）；Ｘ６及び／又はＸ８は、Ｄ又はＥであり、グリシンが好ましいが、Ｘ３においては必ずしもそうではない。
本実施形態において、ＬａｎＭは、これらのＥＦハンドに、又はタンパク質中のそれ以外の場所に置換された、任意の天然又は天然にはないアミノ酸を含んでいてもよい。実施形態において、本開示の方法で使用されるタンパク質は、適切なアミノ酸スペーサーと一緒に、単一のポリペプチド単位に連結されたあらゆる数のランモジュリンドメイン（本明細書ではＬａｎＭ単位として言及される）を含んでいてもよい。実施形態において、ＬａｎＭは、１つのみのＬａｎＭタンパク質単位を含む。実施形態において、ＬａｎＭは、本明細書で使用される場合、第２の位置にプロリン残基を含む。実施形態において、ＬａｎＭは、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの隣接するＥＦハンド間に、１０～１５残基、例えば１２～１３残基を含む。一部の実施形態において、ＬａｎＭは、本明細書で使用される場合、ＥＦハンドの１つ又は複数において、追加のカルボン酸残基を含み、例えば、３個若しくはそれより多く、４個若しくはそれより多く、又は５個若しくはそれより多くのカルボン酸残基を含む。

【0032】

野生型Ｍ．エキストロクエンスのＬａｎＭの配列番号１（ＥＦハンドモチーフは下線で示される）
ＡＰＴＴＴＴＫＶＤＩＡＡＦＤＰＤＫＤＧＴＩＤＬＫＥＡＬＡＡＧＳＡＡＦＤＫＬＤＰＤＫＤＧＴＬＤＡＫＥＬＫＧＲＶＳＥＡＤＬＫＫＬＤＰＤＮＤＧＴＬＤＫＫＥＹＬＡＡＶＥＡＱＦＫＡＡＮＰＤＮＤＧＴＩＤＡＲＥＬＡＳＰＡＧＳＡＬＶＮＬＩＲ
野生型のホモログの一部の例としては、以下が挙げられる（注：配列は、予測されるシグナル配列の除去後に示される）。

【0033】

例Ａ：ＲＨ ＡＬ１
ＡＫＭＤＭＫＡＩＤＰＤＳＤＧＴＶＳＬＡＥＡＱＤＡＡＡＫＫＦＡＡＭＤＰＤＮＤＧＴＩＤＬＫＥＡＫＧＫＭＡＫＡＫＦＫＫＴＤＡＤＮＤＧＴＶＤＫＡＥＹＳＡＬＶＥＳＡＦＫＡＡＤＰＤＧＤＧＴＬＤＡＫＥＬＫＴＰＡＧＱＫＬＬＳＬＩＱ
このタンパク質において、ＥＦハンドの１つは、プロリンを欠如しており、ＥＦ１は、９位及び１１位においてカルボキシレートを欠如しているが、それでもなおピコモル濃度範囲の希土類元素の遊離濃度で構造的な応答を受ける。

【0034】

Ｂ：ハンシュレゲリア属種（Ｈａｎｓｓｃｈｌｅｇｅｌｉａ ｓｐ．）
ＡＳＧＡＤＡＬＫＡＬＮＫＤＮＤＤＳＬＥＩＡＥＶＩＨＡＧＡＴＴＦＴＡＩＮＰＤＧＤＴＴＬＥＳＧＥＴＫＧＲＬＴＥＫＤＷＡＲＡＮＫＤＧＤＱＴＬＥＭＤＥＷＬＫＩＬＲＴＲＦＫＲＡＤＡＮＫＤＧＫＬＴＡＡＥＬＤＳＫＡＧＱＧＶＬＶＭＩＭＫ
このタンパク質において（３１％の同一性）、ＥＦハンドのうち１つのみが第２の位置にプロリンを有し、１つのみが第１の位置にＡｓｐ残基を有する。しかしながら、それは、それでもなお、ピコモル濃度範囲の希土類元素の遊離濃度に対して構造的な応答を受け、他の金属（例えばカルシウム）に対してはそれよりかなり弱い構造的な応答を受ける。

【0035】

例Ｃ：キサントモナス・アクソノポディス
ＡＱＡＱＶＱＶＱＤＳＱＱＹＬＱＲＭＤＴＤＧＤＧＲＶＳＬＤＥＹＬＡＷＭＳＹＡＦＤＱＲＤＴＤＨＤＧＶＬＱＧＤＥＬＰＧ ＲＲＧＫＰＩＴＲＡＡＨＲＡＴＬＩＡＲＦＡＲＱＤＡＮＧＤＧＹＬＳＡＲＥＬＬＡＰＰＲ
このタンパク質は、Ｍ．エキストロクエンスのＬａｎＭと約３３％の配列同一性を有し、３つのみのＥＦハンド（下線で示される；Ｍ．エキストロクエンスのＬａｎＭとの配列アライメントに基づいてＥＦ１、ＥＦ２、及びＥＦ４と称される）を含有し、これらのうちどれもプロリンを有さないが、それでもピコモル濃度範囲の希土類元素の遊離濃度に対して構造的な応答を受け、他の元素（例えばカルシウム）に対してはそれよりかなり弱い構造的な応答を受ける。ここで留意すべきことに、ＥＦ１及びＥＦ２は、わずか１３残基離れているだけにもかかわらず、この配列における隣接するＥＦ２とＥＦ４との間の距離は、ＥＦハンドの１つ（ＥＦ３）が失われているため、ほとんどのランモジュリンの場合より長い（２５アミノ酸）。

【0036】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列若しくはそれらの一部、又は配列番号１と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、それからなる、又はそれから本質的になる。

【0037】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列若しくはそれらの一部、又は配列番号２と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む、それからなる、又はそれから本質的になる。

【0038】

ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはそれらの一部、又は配列番号３と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列を含む、それからなる、又はそれから本質的になる。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列若しくはそれらの一部、又は配列番号４と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、それからなる、又はそれから本質的になる。
ＬａｎＭタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又はそれらの一部と１００％未満の同一性を有するアミノ酸配列を含むある特定の実施形態において、配列の差をもたらす置換の全ては、保存的置換である。他の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、ＬａｎＭタンパク質に対する１つ又は複数の非保存的置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、ＬａｎＭタンパク質に対する１、２、３、４、若しくは５つ又はそれより多くの保存的置換を含む。

【0039】

表1.例示的なLanMアミノ酸配列

【0040】

ＲＥＥは、イットリウムと１５種のランタニド元素とを含む１７種の化学元素のグループである。スカンジウムは、ほとんどのＲＥＥ鉱床で見出され、多くの場合そこに含まれている。
表2: 希土類元素

【0041】

ＲＥＥ結合タンパク質は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ルテチウム（Ｌｕ）、スカンジウム（Ｓｃ）、イットリウム（Ｙ）、又はそれらのあらゆる組合せのいずれかと結合することができる。ＲＥＥ結合リガンドは、あらゆる酸化状態の元素（例えば、Ｌｎ²⁺、Ｌｎ³⁺、Ｌｎ⁴⁺など）のいずれとも結合することができる。

【0042】

一部の実施形態において、ＲＥＥ結合タンパク質（例えば、ＬａｎＭ）は、約０．１ｐＭ～約１μＭの間の結合親和性（すなわち、Ｋ_d、タンパク質複合体に一般的に使用される熱力学的解離定数）を有する３価のランタニドイオン（例えばＲＥＥ）と結合する。一部の実施形態において、Ｋ_dは、約０．１ｐＭ、約１００ｐＭ、約５００ｐＭ、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５００ｎＭ、又は約１μＭである。さらに他の実施形態においてＫ_dはｐＭの範囲内である。親和性は、当業者に公知のあらゆる好適な手段によって決定することができる。非限定的な例としては、ＲＥＥでの滴定、及び蛍光、円偏光二色性、ＩＣＰ、ＮＭＲ又は熱量測定を使用する検出が挙げられる。固い結合の配列の場合、競合実験を採用することが必要な場合がある。

【0043】

一部の実施形態において、ＬａｎＭはシステイン残基を含む。一部の実施形態において、システイン残基は、Ｃ末端システイン残基、Ｎ末端システイン残基、又は内部システイン残基である。一部の実施形態において、短い、親水性のフレキシブルなリンカーは、ＬａｎＭからシステイン残基を分離する。例示的なリンカーとしては、Ｇｌｙ_xＳｅｒ_yの１～１０回の繰り返しを含むグリシン－セリンアミノ酸鎖を有するものが挙げられ、ここで、ｘ及びｙは、それぞれ独立して、０～１０の整数であり、ただしｘとｙとが両方とも０であることは無い（例えば、ＧｌｙＳｅｒＧｌｙ、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂；（Ｇｌｙ₃Ｓｅｒ）₂；Ｇｌｙ₂Ｓｅｒ；又はそれらの組合せ、例えば（Ｇｌｙ₃Ｓｅｒ）₂Ｇｌｙ₂Ｓｅｒ）。

【0044】

一部の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列又はそれらの一部及びＣ末端システイン残基、例えば、ＧＳＧＣを含む、それからなる、又はそれから本質的になる。一部の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列又はそれらの一部及びＣ末端システイン残基、例えば、ＧＳＧＣを含む、それからなる、又はそれから本質的になる。一部の実施形態において、本明細書で提供されるＬａｎＭタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列又はそれらの一部及びＣ末端システイン残基、例えば、ＧＳＧＣを含む、それからなる、又はそれから本質的になる。

【0045】

バイオソープション系
また、ＬａｎＭタンパク質を含む所定量のタンパク質を含む、ＲＥＥ抽出及び優先的な分離のための系（すなわち、バイオソープション／吸着媒体）も提供される。
バイオソープションは、吸着、吸収、イオン交換、表面複合体形成、及び沈殿などの様々なメカニズムに基づく化学的プロセスである。タンパク質又はバイオマスなどの生物学的な起源からの材料とカップリングされる場合、この材料はバイオソープション材料と称される。バイオソープション材料は、例えば、ＲＥＥに結合して、それらをＲＥＥ含有材料（例えば、供給材料）から分離することができる。ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離するためのタンパク質を含むバイオソープション材料が本明細書で提供される。ＲＥＥ抽出及び優先的な分離は所定量のタンパク質を含む。

【0046】

これらのバイオソープション媒体としては、例えば、バイオフィルム、マイクロビーズ、及びカーボンナノチューブが埋め込まれた膜が挙げられ、これらは、連続フロー下での吸着に使用することができる。フロースルーセットアップでの使用のためのバイオソープション媒体におけるタンパク質固定化は、単一工程での、例えば、液体-液体分離、遠心分離、ろ過を必要とすることのない、又はその両方での、混合金属溶液中の他のＲＥＥからのＲＥＥの分離を含む、ＲＥＥを含有する混合金属溶液からの完全な（又は実質的に完全な）ＲＥＥの分離を可能にすることが予期される。
一部の実施形態において、バイオソープション材料は、ビーズ及び／又はカプセルである。一部の実施形態において、ビーズ及び／又はカプセルはＲＥＥの分離に好適なものである。一部の実施形態において、ビーズ及び／又はカプセルはＲＥＥ選択的タンパク質を含む。一部の実施形態において、バイオソープション材料はマイクロビーズである。本明細書で使用される場合、用語「カプセル」は「ビーズ」と互換的に使用される。

【0047】

一部の実施形態において、タンパク質は、固体支持体、例えば、カラム、膜、ビーズなどに付着されている。一部の実施形態において固体支持体は多孔質支持体材料である。固体支持体は、当業者に公知のあらゆる好適な組成物であってもよく、例えば、ポリマー、アガロース、アルギネート、アクリルアミド、再生セルロース、セルロースエステル、プラスチック、又はガラスが挙げられる。
一実施形態において、タンパク質は、ビーズ内に、又はビーズの表面に結合している（すなわち、埋め込まれている）。一部の実施形態において、ビーズはポリマーである。好適なポリマーとしては、ＰＥＧ（例えば、約１０％ＰＥＧ）、アルギネート（例えば、約２％アルギン酸カルシウム）、アクリルアミド（例えば、約１０％ポリアクリルアミド）、及びアガロースが挙げられる。他の実施形態において、ビーズは、ガラス、プラスチック、又は鋼である。

【0048】

他の実施形態において、本開示は、ＲＥＥ分離のためのマイクロビーズ溶液を調製する方法を提供する。一部の実施形態において、ＲＥＥ分離のためのビーズを調製するための本方法は、（ａ）ＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質と、コンジュゲーション剤で官能化した多孔質支持体材料、とを提供する工程；及び（ｂ）タンパク質を、コンジュゲーション剤を介して多孔質支持体材料に結合させる工程を含む。
一部の実施形態において、本方法は、支持体材料を末端アミン（例えば、－ＮＨ₂）で官能化する工程を含む。一部の実施形態において、多孔質支持体材料は、アガロースを含む。一部の実施形態において、多孔質支持体材料は、アミンによって官能化されたアガロースである。

【0049】

一部の実施形態において、コンジュゲーション剤はマレイミドである。このような実施形態において、本方法は、末端アミンをマレイミドと反応させて、マレイミドによって官能化されたアガロースビーズを形成する工程をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、マレイミドは、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。
一部の実施形態において、本方法は、マレイミドで官能化した多孔質支持体材料をＲＥＥ選択的タンパク質と結合させる工程をさらに含む。一部の実施形態において、タンパク質は、システイン残基を含む。一部の実施形態において、多孔質支持体材料は、多孔質支持体材料のマレイミド及びタンパク質のシステイン残基を介してＲＥＥ選択的タンパク質に結合させる。一部の実施形態において、システイン残基を含むＲＥＥ選択的タンパク質は、「クリック」ケミストリーにより多孔質支持体材料のマレイミドに結合させる。ＲＥＥ選択的タンパク質を、「クリック」ケミストリーにより多孔質支持体材料に結合させることは、生体適合性の反応条件下、すなわち有機溶媒がない水性条件下での結合を可能にすることから有利である。

【0050】

一部の実施形態において、タンパク質を多孔質支持体材料に結合させることは、コンジュゲーション剤を使用するあらゆるバイオコンジュゲーション手法を含み得る。一部の実施形態において、バイオコンジュゲーション方法は、チオール－エン「クリック」ケミストリーを使用する。一部の実施形態において、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、多孔質支持体構造へのタンパク質のバイオコンジュゲーションのためのコンジュゲーション剤として使用することができる。コンジュゲーション剤としても使用できる例示的なＮＨＳ架橋剤としては、ジベンゾシクロオクチン（ｄｉｂｅｎｚｙｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ－ＮＨＳ）、ビシクロノニン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＢＣＮ－ＮＨＳ）、及びジベンゾシクロオクチン－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＤＢＣＯ－スルホ－ＮＨＳ）が挙げられる。一部の実施形態において、バイオコンジュゲーション方法はアルキン／アザイド「クリック」ケミストリーを使用する。例えば、アルキン／アザイド「クリック」ケミストリーは、コンジュゲーション剤として使用されるアルキン部分を含む多孔質支持体材料に、アザイド部分を含むタンパク質を結合させるために利用することができる。

【0051】

一部の実施形態において、ビーズは高濃度のＲＥＥ選択的なタンパク質を有する。タンパク質の高度なローディングは、少なくとも部分的に、利用可能なＲＥＥ結合部位の数を増加させることによってバイオソープション材料の飽和容量を強化するように作用できることが予期される。ＲＥＥ結合部位の数の増加は、ＲＥＥ結合リガンドと複合体化してタンパク質－ＲＥＥ複合体を形成するＲＥＥ含有材料からのＲＥＥの、より大きいパーセンテージをもたらす（例えば、飽和容量の増加）。一部の実施形態において、飽和容量の増加は、吸着容量の増加（すなわち、ＲＥＥ含有材料の単位体積又は単位質量当たりのＲＥＥ選択的タンパク質と複合体化するＲＥＥの数の増加）と相関する。飽和及び吸着容量の増加は、ＲＥＥ分離プロセスにおける遠心分離及びろ過などの追加のエネルギーを消耗する工程の必要性をなくすことが予期される。

【0052】

一部の実施形態において、タンパク質（例えば、ＬａｎＭ）の高濃度は、総多孔質支持体材料（例えば、マイクロビーズ）の１ｍＬ当たり、約２μｍｏｌ（μｍｏｌ／ｍＬ）のタンパク質、２．２μｍｏｌ／ｍＬ、２．４μｍｏｌ／ｍＬ、２．６μｍｏｌ／ｍＬ、２．８μｍｏｌ／ｍＬ、３．０μｍｏｌ／ｍＬ、３．２μｍｏｌ／ｍＬ、３．４μｍｏｌ／ｍＬ、３．６μｍｏｌ／ｍＬ、３．８μｍｏｌ／ｍＬ、４μｍｏｌ／ｍＬ、５μｍｏｌ／ｍＬ、１０μｍｏｌ／ｍＬ、１５μｍｏｌ／ｍＬ、２０μｍｏｌ／ｍＬ、２５μｍｏｌ／ｍＬ、３０μｍｏｌ／ｍＬ、３５μｍｏｌ／ｍＬ、４０μｍｏｌ／ｍＬ、４５μｍｏｌ／ｍＬ、又は５０μｍｏｌ／ｍＬのタンパク質である。一部の実施形態において、タンパク質（例えば、ＬａｎＭ）の高濃度は、総多孔質支持体材料（例えば、マイクロビーズ）の１ｍＬ当たり、約２μｍｏｌ／ｍＬ～約４μｍｏｌ／ｍＬ、約３μｍｏｌ／ｍＬ～約４μｍｏｌ／ｍＬ、約２．２μｍｏｌ／ｍＬ～約３μｍｏｌ／ｍＬ、約３．２μｍｏｌ／ｍＬ～約４μｍｏｌ／ｍＬ、約２μｍｏｌ／ｍＬ～約３．６μｍｏｌ／ｍＬ、約１０μｍｏｌ／ｍＬ～約３０μｍｏｌ／ｍＬ、約２０μｍｏｌ／ｍＬ～約３０μｍｏｌ／ｍＬ、約１０μｍｏｌ／ｍＬ～約４０μｍｏｌ／ｍＬ、約２０μｍｏｌ／ｍＬ～約４０μｍｏｌ／ｍＬ、又は約２５μｍｏｌ／ｍＬ～約５０μｍｏｌ／ｍＬである。

【0053】

一部の実施形態において、タンパク質の高濃度は、ビーズの総質量の、少なくとも約２０質量パーセント（質量％）、少なくとも約５質量％、少なくとも約１０質量％、少なくとも約１５質量％、少なくとも約２０質量％、少なくとも約２５質量％、少なくとも約３０質量％、少なくとも約３５質量％、少なくとも約４０質量％、少なくとも約４５質量％、少なくとも約５０質量％、少なくとも約５５質量％、少なくとも約６０質量％、少なくとも約６５質量％、少なくとも約７０質量％、少なくとも約７５質量％、少なくとも約８０質量％、少なくとも約８５質量％、少なくとも約９０質量％、少なくとも約９５質量％、若しくはそれより多くであるか、又は総多孔質支持体材料（例えば、マイクロビーズ）の、少なくとも約２０体積パーセント（ｖｏｌ％）、少なくとも約５ｖｏｌ％、少なくとも約１０ｖｏｌ％、少なくとも約１５ｖｏｌ％、少なくとも約２０ｖｏｌ％、少なくとも約２５ｖｏｌ％、少なくとも約３０ｖｏｌ％、少なくとも約３５ｖｏｌ％、少なくとも約４０ｖｏｌ％、少なくとも約４５ｖｏｌ％、少なくとも約５０ｖｏｌ％、少なくとも約５５ｖｏｌ％、少なくとも約６０ｖｏｌ％、少なくとも約６５ｖｏｌ％、少なくとも約７０ｖｏｌ％、少なくとも約７５ｖｏｌ％、少なくとも約８０ｖｏｌ％、少なくとも約８５ｖｏｌ％、少なくとも約９０ｖｏｌ％、少なくとも約９５ｖｏｌ％、若しくはそれより多くである。

【0054】

一部の実施形態において、タンパク質の高い吸着容量は、タンパク質１グラム（ｇ）当たり、少なくとも約１ミリグラム（ｍｇ）、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約６ｍｇ、少なくとも約７ｍｇ、少なくとも約８ｍｇ、少なくとも約９ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１１ｍｇ、少なくとも約１２ｍｇ、少なくとも約１３ｍｇ、少なくとも約１４ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約１６ｍｇ、少なくとも約１７ｍｇ、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約１９ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２１ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２３ｍｇ、少なくとも約２４ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、少なくとも約２７ｍｇ、少なくとも約２８ｍｇ、少なくとも約２９ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３１ｍｇ、少なくとも約３２ｍｇ、少なくとも約３４ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約３６ｍｇ、少なくとも約３７ｍｇ、少なくとも約３８ｍｇ、少なくとも約３９ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４１ｍｇ、少なくとも約４２ｍｇ、少なくとも約４３ｍｇ、少なくとも約４４ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約４６ｍｇ、少なくとも約４７ｍｇ、少なくとも約４８ｍｇ、少なくとも約４９ｍｇ、又は少なくとも約５０ｍｇのＲＥＥである。

【0055】

一部の実施形態において、タンパク質の高い吸着容量は、タンパク質１グラム（ｇ）当たり、少なくとも約１ミリグラム（ｍｇ）、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約６５ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約８５ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約９５ｍｇ、又は少なくとも約１００ｍｇのＲＥＥである。一部の実施形態において、タンパク質は、タンパク質１ｇ当たり約３０～約７０ｍｇの間のＲＥＥの吸着容量を有する。

【0056】

一部の実施形態において、タンパク質の高い吸着容量は、バイオソープション媒体（例えば、系及び／又は材料）１グラム（ｇ）当たり、少なくとも約０．１ミリグラム（ｍｇ）、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約６５ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約８５ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約９５ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇのＲＥＥである。一部の実施形態において、タンパク質は、バイオソープション媒体１ｇ当たり約３０～約７０ｍｇの間のＲＥＥの吸着容量を有する。

【0057】

別の実施形態において、タンパク質は、ビーズ内に、及び／又はビーズの表面上に封入されている。タンパク質がビーズ内に、及び／又はビーズの表面上に封入されている場合、ビーズは、ＲＥＥと効率的に結合することができる。ＲＥＥ含有材料がビーズ上を流れるか及び／又はビーズを通ると、固定化ＬａｎＭタンパク質は、ビーズ内とビーズの表面上の両方にＲＥＥを捕獲することができ、これは、ビーズの総体積に対する利用可能な結合部位（すなわち、結合リガンド）の比率を増加させることによってビーズの吸着容量を最適化する。

【0058】

一部の実施形態において、支持体材料（例えば、マイクロビーズ）は多孔質である。一部の実施形態において、支持体材料は、繊維状材料である。例えば、一部の実施形態において、支持体材料は、電界紡糸繊維（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ｆｉｂｅｒ）を用いて生産された繊維状材料である。多孔質支持体材料は、ＲＥＥ含有材料のフローが、ビーズの外表面だけでなく内表面にも接触することを可能にし、それによってＲＥＥの支持体材料の飽和及び吸着容量を増加させる（すなわち、接近しやすさを増加させる）。一部の実施形態において、多孔質支持体材料は、少なくとも約０．１０ｎｍ、少なくとも約１．０ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約２５０ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約３５０ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍ、少なくとも約４５０ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約５５０ｎｍ、少なくとも約６００ｎｍ、少なくとも約６５０ｎｍ、少なくとも約７００ｎｍ、少なくとも約７５０ｎｍ、少なくとも約８００ｎｍ、少なくとも約８５０ｎｍ、少なくとも約９００ｎｍ、少なくとも約９５０ｎｍ、又は少なくとも約１０００ｎｍの孔径を有する。一部の実施形態において、多孔質支持体材料は、約１．０ｎｍ～約５００ｎｍ、約０．１０ｎｍ～約１０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約３００ｎｍ～約６００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０００ｎｍ、又は約６００ｎｍ～約８００ｎｍの孔径を有する。

【0059】

方法
また、ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離するために、さらに、他のＲＥＥからＲＥＥを分離するために、タンパク質、例えばＬａｎＭを使用する方法も提供される。
ＲＥＥ含有材料からのＲＥＥの優先的な分離は、電池、磁石、及びエレクトロニクスなどの技術の開発にとって重要であるが、ＲＥＥの化学的特性が類似していることにより、互いに分離すること、および、他の非ＲＥＥから分離することが極めて困難になる。一般的な技術は、特にＲＥＥが競合する金属、例えば非ＲＥＥ（例えば、アルカリ、アルカリ性、及び他の遷移金属）の混合物の存在下にある場合、ＲＥＥに対する低い選択性が妨げになっている。より一層困難なのは、競合する金属がＲＥＥよりはるかに高い濃度で存在する場合、それら競合する金属からＲＥＥを分離することである。ＲＥＥ分離における内在的な困難性のために、従来の技術は、ＲＥＥを高純度で分離する能力において限界があり、さらに、工業的なバルクスケールでＲＥＥを優先的に分離することが可能な系の開発を妨げてきた。本発明の開示は、高い選択性、高い効率、及び低コストでのＲＥＥの優先的な分離のための方法であって、それぞれ大規模な工業スケールでＲＥＥを分離することが可能な系に役立つことを特徴とする方法を提供する。一部の実施形態において、ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離するための方法は、他のＲＥＥ又は非ＲＥＥから個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループを分離する工程を含む。個々のＲＥＥの優先的な分離は、別のＲＥＥ（例えば、Ｅｒ）、ＲＥＥのグループ、又は非ＲＥＥのいずれかからのＲＥＥ（例えば、Ｌａ）の単離であって、分離後に存在する（すなわち、溶出した溶液中に）他の元素、ＲＥＥ若しくは非ＲＥＥが存在しないか又は実質的に存在しないような単離を指す。例えば、本明細書で提供される優先的な分離方法は、Ｙ、Ｄｙ、及びＴｂ（すなわち、ＲＥＥのグループ）からの、並びに／又は、競合する金属（すなわち、非ＲＥＥ）からのＮｄ（すなわち、個々のＲＥＥ）の分離を可能にする。一部の実施形態において、優先的な分離は、分離後に（すなわち、溶出した溶液中に）他の個々のＲＥＥ、ＲＥＥのグループ及び／若しくは非ＲＥＥが存在しないか又は実質的に存在しない、個々のＲＥＥの高純度の分離を提供する。

【0060】

一態様において、ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離するための方法であって、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記タンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記タンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合してタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記タンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；並びに（ｄ）前記タンパク質からＲＥＥを分離して、再生された前記タンパク質を生産する工程、を含む前記方法、が本明細書で提供される。一部の実施形態において、記載された工程は１度実行される。他の実施形態において、工程又は工程の一部は、１回より多く、例えば、２、３、４、５回、又はそれより多くの回数実行される。一部の実施形態において、工程又は工程の一部は、１つより多くのＲＥＥ含有材料を用いて、例えば１、２、３、４、５、又はそれより多くのＲＥＥ含有材料を用いて、１回より多く実行される。

【0061】

一部の実施形態において、工程又は工程の一部は、ＲＥＥの少なくとも約１００％、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、又は少なくとも約１０％がタンパク質－ＲＥＥ複合体から分離されるまで繰り返される。

【0062】

一部の実施形態において、タンパク質は、そのタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程の前にカラムに添加される。一部の実施形態において、カラムにタンパク質を添加する前に、タンパク質は、固体構造物（例えば、ビーズ及び／又はカプセル）内に、又はその表面に結合される。タンパク質は、カラムに添加されると、カラムクロマトグラフィーにおいて慣習的に定義される通り、固定相として使用される。これにより、ＲＥＥ含有材料がカラムに導入され、カラムを通って流動する、連続フロー系が可能になる。一部の実施形態において、フローはカラムの上から下である。一部の実施形態において、フローは逆転し、フローはカラムの下から上である。

【0063】

ある特定の実施形態において、１つ又は複数の吸着／脱離サイクルを含む、ＲＥＥ含有材料から希土類元素（ＲＥＥ）を分離するための方法である。一部の実施形態において、本明細書で開示される方法は、２回又はそれより多くの吸着／脱離サイクルを含んでいてもよい。一部の実施形態において、各サイクルは、ＲＥＥを、別々にタンパク質に吸着させ、タンパク質から脱離させる工程を含む。例えば、一部の実施形態において、タンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程のとき、ＲＥＥをタンパク質に吸着させ（すなわち、タンパク質－ＲＥＥ複合体を形成し）、次いで溶液を導入するときに、ＲＥＥをＲＥＥ結合リガンドから脱離させる（すなわち、タンパク質からＲＥＥを解離させることによって、タンパク質－ＲＥＥ複合体を壊して離れた状態にする）。一部の実施形態において、カラムが飽和するまで（すなわち、全ての、又は実質的に全てのタンパク質結合部位がＲＥＥに結合してタンパク質－ＲＥＥを形成するまで）、タンパク質を含むカラム上にＲＥＥ含有材料を流動させる。一部の実施形態において、タンパク質結合部位の、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約５０％が、ＲＥＥと結合される。最初の吸着工程で、ＲＥＥを保持しながら（すなわち、ＲＥＥ結合リガンドと結合したまま）、非ＲＥＥの大部分（すなわち、５０％より多く）がカラムを通り過ぎる。次いでカラムを溶液で洗浄して、残留した未結合のＲＥＥ又は非ＲＥＥを洗い流すか又はタンパク質－ＲＥＥ複合体から分離させる。飽和及び洗浄後、溶液を使用して、タンパク質からＲＥＥを差次的に分離する（すなわち、溶出させる）。本明細書で開示される実施形態によれば、差次的に分離／溶出させたＲＥＥ溶液は、フィード溶液と比較してより高濃度のＲＥＥを有し得る、ＲＥＥが富化された溶液である。

【0064】

一部の実施形態において、ＲＥＥは、質量移行プロセス中に同時に、ＲＥＥ結合リガンドに吸着し、それから脱離される。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ含有材料をタンパク質を含むカラム上に流動させ、タンパク質結合部位の一部のみがＲＥＥを吸着してタンパク質－ＲＥＥ複合体を形成する。次いで溶液はカラムを通って流動し、ＲＥＥがカラムの上から下に進むにつれて、ＲＥＥは一連の吸着及びＲＥＥ結合リガンドからの脱離（すなわちこれは、動的なプロセスである）を受ける。ＲＥＥ結合リガンド（すなわち、固相）及び調整可能な溶液（すなわち、移動相）に対する各ＲＥＥの親和性の差が、カラムを通るＲＥＥの移動速度を制御する。より重いＲＥＥとタンパク質とで形成される複合体は、より軽いＲＥＥ及びタンパク質とで形成される複合体と比較して弱いため、より重いＲＥＥは軽いＲＥＥより速くカラムを通って移動し、これによりＲＥＥの優先的な分離のための方法が提供される。具体的には、ランモジュリンがＳｃと最も強い複合体を形成することを考えれば、Ｙは、ＨＲＥＥと共に移動し、それに対してＳｃは、最も遅くカラムを通って移動する。同時の吸着及び脱離プロセスは、個々のＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループの高純度での分離を可能にする。この方法は、高度に精製されたＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループを得るために、費用がかかる化学樹脂の使用又は有害な溶媒との使用を必要とする従来のＲＥＥ分離プロセスを超える利点を提供する。

【0065】

一部の実施形態において、ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離するための方法は、改変可能な溶液を導入する工程をさらに含む。改変可能な溶液は、ＲＥＥをタンパク質に導入するのに使用される最初の溶液と比較して異なる濃度のキレート化剤及び／又は異なるｐＨを有する溶液である。改変可能な溶液は、ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを優先的に分離する。溶液（すなわち、移動相）に対する個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループの親和性は増加するが、ＲＥＥ結合リガンド（すなわち、固定相）に対する個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループの親和性は減少する方式で溶液が改変される場合、優先的な分離を達成することができる。逆に、ＲＥＥ結合リガンド（すなわち、固定相）に対する個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループの親和性は増加するが、ＲＥＥ溶液に対する個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループの親和性は減少する様式で溶液が改変される場合にも、優先的な分離を達成することもできる。

【0066】

一部の実施形態において、他のＲＥＥから１種又は複数種のＲＥＥを選択的に脱離させるために、ＲＥＥは、別々に、タンパク質に吸着させ、タンパク質から脱離させる。例えば、一部の実施形態において、カラムが飽和するまで（すなわち、全ての、又は実質的に全てのタンパク質結合部位がＲＥＥに結合して、タンパク質－ＲＥＥを形成するまで）、タンパク質を含むカラム上にＲＥＥ含有材料を流動させる。一部の実施形態において、タンパク質結合部位の、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約５０％が、ＲＥＥに結合される。一部の実施形態において、飽和したら、１つ又は複数の溶液を使用して、逐次的な方式で、タンパク質から１種又は複数種のＲＥＥを差次的に分離する（すなわち、溶出させる）。例えば、一部の実施形態において、第１の溶液はＨＲＥＥを分離するのに使用され、第２の溶液はＭＲＥＥを分離するのに使用され、第３の溶液はＬＲＥＥを分離するのに使用される。他の実施形態において、タンパク質から１種又は複数種のＲＥＥを優先的に分離するために、１つ又は複数の溶液が使用される。

【0067】

一部の実施形態において、ＲＥＥを優先的に分離するための方法は連続的であり、ＲＥＥ分離は、遠心分離及び／又はろ過などの追加の多大なエネルギーを要する工程によって中断されない。他の実施形態において、ＲＥＥを優先的に分離するための方法は、遠心分離、ろ過、又はその両方の追加の工程を含む。
一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は、約２．４～約７のｐＨで形成される。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、又は約１０のｐＨで形成される。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は約２．４～約１０のｐＨで形成され、タンパク質はいかなる非ＲＥＥ成分（例えば、非ＲＥＥ金属）とも結合しない。

【0068】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質は、タンパク質１つ当たり２つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は、２：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり２つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質は、ＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は２：１である。
一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質は、タンパク質１つ当たり３つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は３：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり３つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は、３：１である。

【0069】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質は、タンパク質１つ当たり４つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は４：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり４つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は４：１である。

【0070】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり５つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は５：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり５つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は５：１である。
一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり６つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は６：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり６つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は６：１である。

【0071】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり７つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は７：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり７つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は７：１である。
一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり８つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は、８：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり８つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は８：１である。

【0072】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり９つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は９：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり９つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は９：１である。
一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はタンパク質１つ当たり１０のＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は１０：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１０のＲＥＥ１つのタンパク質当たり１０個のＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭであり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は１０：１である。

【0073】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質はＬａｎＭタンパク質であり、ＬａｎＭタンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列又はそれらの一部を含むか、又はそれから本質的になり、タンパク質１つ当たり４つのＲＥＥと結合する。例えば、一部の実施形態において、ＲＥＥ対タンパク質の化学量論的な比率は、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体は１つのタンパク質当たり４つのＲＥＥを含む。一部の実施形態において、タンパク質はＬａｎＭ（配列番号４）であり、ＲＥＥ対ＬａｎＭの化学量論的な比率は、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、又は１０：１である。
一部の実施形態において、ＲＥＥは、タンパク質－ＲＥＥ複合体を約２．４未満のｐＨを有する溶液と接触させることによってタンパク質から分離される。一部の実施形態において、溶液は、約２．４未満、約２．３未満、約２．２未満、約２．１未満、約２未満、約１．９未満、約１．８未満、約１．７未満、約１．６未満、約１．５未満のｐＨ、又はそれ未満のｐＨを有する。本明細書に記載される実施形態によれば、具体的な、又は特定されたｐＨを有する溶液は、そのｐＨを生じることが当業界において公知のあらゆる溶液若しくは組成物、例えば、ＨＣＬ溶液、Ｈ₂ＳＯ₄溶液、ＨＮＯ₃溶液、ＨＣｌ／ＮａＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄／ＫＨＳＯ₄／Ｎａ₂ＳＯ₄の混合物、若しくは他の混合物を有する溶液、グリシンの溶液、又は所望の溶液を生産することが可能な他のあらゆる相溶性溶媒を使用することによって生成される。

【0074】

一部の実施形態において、ＲＥＥは、ＲＥＥ－複合体をキレート化剤を含む溶液と接触させることによってタンパク質から分離される。キレート剤としては、非ＲＥＥ金属又はＲＥＥと結合することが可能な官能基を含むあらゆる化合物を挙げることができる。例えば、ある特定の実施形態において、キレート化剤又はキレート剤は、モノカルボン酸、ジカルボン酸、又はトリカルボン酸であってもよい。キレート化剤又はキレート剤の非限定的な例としては、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ジメルカプロール、マロン酸塩、イミノ二酢酸塩、ジグリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸、ポリアミノカルボキシレート、ヒドロキシピリジノン、カテコール、ヒドロキサメート、酢酸塩、ニトリロトリアセテート、ジピコリン酸、又はα－ヒドロキシイソ酪酸が挙げられる。

【0075】

一部の実施形態において、ＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループは、他のいずれかのＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループに対して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％の純度で分離される。
一部の実施形態において、ＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループは、他のいずれかの元素に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％、の純度で分離される。

【0076】

一部の実施形態において、ＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループは、いずれかの非ＲＥＥ成分に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％の純度で分離される。一部の実施形態において、非ＲＥＥ成分は、Ｍｇ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｃａ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｚｎ²⁺、Ｕ、Ｔｈ、並びにＲＥＥを含有する供給材料に見出される他のアルカリ、アルカリ土類、及び遷移金属から選択される非ＲＥＥ元素である。
一部の実施形態において、本明細書で提供される方法は、Ｆｅ³⁺からのＲＥＥの優先的な分離を可能にする。一部の実施形態において、ＬａｎＭは、Ｆｅ³⁺と比べてＲＥＥに対して、より高い選択性（すなわち、結合親和性）を有する。一部の実施形態において、Ｆｅ³⁺は、タンパク質－ＲＥＥ複合体を約４～約５のｐＨを有する溶液と接触させることによってＲＥＥから優先的に分離される。この場合、Ｆｅ³⁺は溶液から沈殿し、ＲＥＥはタンパク質に結合したままである。一部の実施形態において、続いてＲＥＥはタンパク質－ＲＥＥ複合体を２．４又はそれ未満のｐＨを有する溶液と接触させることによって、タンパク質－ＲＥＥ複合体から分離される。

【0077】

一部の実施形態において、ＲＥＥ及び／又はＲＥＥのグループは、Ｆｅ³⁺に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約１００％の純度で分離される_。

【0078】

一部の実施形態において、本方法は、周期表において互いに隣接するＲＥＥの優先的な分離を提供する。例えば、一部の実施形態において、本方法は、ＣｅからＬａの、ＰｒからＣｅの、ＮｄからＰｒの、ＰｍからＮｄの、ＳｍからＰｍの、ＥｕからＳｍの、ＧｄからＥｕの、ＴｂからＧｂの、ＤｙからＴｂの、ＨｏからＤｙの、ＥｒからＨｏの、ＴｍからＥｒの、ＹｂからＴｍの、及び／又はＬｕからＹｂの優先的な分離を提供する。

【0079】

一部の実施形態において、本方法は、類似したイオン半径を有する他のＲＥＥ又は非ＲＥＥ金属からのＲＥＥの優先的な分離を提供する。例えば、一部の実施形態において、本方法は、ＹからＬａの、ＹからＣｅの、ＹからＰｒの、ＹからＮｄの、ＹからＰｍの、ＹからＳｍの、ＹからＥｕの、ＹからＧｂの、ＹからＴｂの、ＹからＤｙの、ＹからＨｏの、ＹからＥｒの、ＹからＴｍの、ＹからＹｂの、ＹからＬｕの、又はＹからＳｃの優先的な分離を提供する。
一部の実施形態において、方法は、ＳｃからのＲＥＥの優先的な分離を提供する。例えば、一部の実施形態において、方法は、ＳｃからＬａの、ＳｃからＣｅの、ＳｃからＰｒの、ＳｃからＮｄの、ＳｃからＰｍの、ＳｃからＳｍの、ＳｃからＥｕの、ＳｃからＧｂの、ＳｃからＴｂの、ＳｃからＤｙの、ＳｃからＨｏの、ＳｃからＥｒの、ＳｃからＴｍの、ＳｃからＹｂの、ＳｃからＬｕの、又はＳｃからＹの優先的な分離を提供する。

【0080】

一部の実施形態において、方法は、ＲＥＥのイオン半径、原子半径、及び／又は質量に基づくＲＥＥの優先的な分離を提供する。一部の実施形態において、より小さいイオン半径を有するＲＥＥは、大きい原子半径を有するＲＥＥから優先的に分離される。一部の実施形態において、ＲＥＥの優先的な分離は、ランタニド収縮の作用によって影響を受け、ランタニドのイオン半径は、周期表の左から右にかけて（すなわち、ＬａからＬｕにかけて）移動すると著しく減少する。一部の実施形態において、本方法は、ＲＥＥのイオン半径、原子半径、及び／又は質量に基づく、２段階の脱離プロセスを使用するＲＥＥの優先的な分離を提供する。

【0081】

一部の実施形態において、２段階脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体を、特定のｐＨを有する第１の溶液、及び、特定のｐＨを有する第２の溶液と接触させることを含む。一部の実施形態において、脱離プロセスの第１の工程は、タンパク質－ＲＥＥ複合体に第１のｐＨを有する溶液を導入することを含み、脱離プロセスの第２の工程は、タンパク質－ＲＥＥ複合体に第２のｐＨを有する溶液を導入することを含む。他の実施形態において、脱離プロセスは２回より多くの工程を含む。一部の実施形態において、脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体に、特定のｐＨを含む第１の溶液を導入する第１の工程、特定のｐＨを含む第２の溶液を導入する第２の工程、及び特定のｐＨを含む第３の溶液を導入する第３の工程を含む。一部の実施形態において、脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体に、特定のｐＨを含む第１の溶液を導入する第１の工程、特定のｐＨを含む第２の溶液を導入する第２の工程、及び特定のｐＨを含む第３の溶液を導入する第３の工程、及び特定のｐＨを有する第４の溶液を導入する第４の工程を含む。一部の実施形態において、第１のｐＨは、約１．９～約２．４である。例えば、一部の実施形態において、第１のｐＨは、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、又は約２．４である。一部の実施形態において、第２のｐＨは、約１．５～約１．７である。例えば、一部の実施形態において、第２のｐＨは、約１．５、約１．６、又は約１．７である。２回より多くの工程を含む他の実施形態において、ｐＨは、逐次的に約２．４～約１．５の間又はそれ未満に低くされる。一部の実施形態において、第１のｐＨ（すなわち、より高いｐＨ）を有する溶液をタンパク質－ＲＥＥ複合体と接触させることは、ＲＥＥ－複合体から、より小さいイオン半径を有するＲＥＥを分離するが、より大きいイオン半径を有するＲＥＥは、ＲＥＥ－複合体から分離されない。一部の実施形態において、第２のｐＨを有する溶液を接触させること（すなわち、ｐＨを低くすること）は、ＲＥＥ複合体から、より小さいイオン半径を有するＲＥＥを分離する。一部の実施形態において、より小さいイオン半径を有するＲＥＥは、Ｄｙ又はＹであり、より大きいイオン半径を有するＲＥＥは、Ｎｄ又はＰｒである。一部の実施形態において、本方法は、ＮｄからＤｙの、ＰｒからＤｙの、又はＮｄからＹの優先的な脱離を可能にする。一部の実施形態において、本方法は、ＬＲＥＥ（例えば、Ｌａ－Ｎｄ）、ＨＲＥＥ（Ｈｏ－Ｌｕに加えてＹ）、及び中ＲＥＥ（ＭＲＥＥ；Ｓｍ－Ｄｙ）の優先的な分離を可能にする。

【0082】

一部の実施形態において、２段階の脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤を含む第１の溶液及び特定のｐＨを有する別の溶液（例えば、第２の溶液）と接触させることを含む。一部の実施形態において、脱離プロセスの第１の工程は、タンパク質－ＲＥＥ複合体にキレート化剤を含む溶液を導入することを含み、脱離プロセスの第２の工程は、タンパク質－ＲＥＥ複合体に特定のｐＨを有する溶液を導入することを含む。他の実施形態において、脱離プロセスは２段階より多くの工程を含む。一部の実施形態において、脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体に、キレート化剤を含む第１の溶液を導入する第１の工程、キレート化剤溶液を含む第２の溶液を導入する第２の工程、及び特定のｐＨを有する第３の溶液を導入する第３の工程を含む。一部の実施形態において、脱離プロセスは、タンパク質－ＲＥＥ複合体に、キレート化剤を含む第１の溶液を導入する第１の工程、キレート化剤溶液を含む第２の溶液を導入する第２の工程、及びキレート化剤溶液を含む第３の溶液を導入する第３の工程、及び特定のｐＨを有する第４の溶液を導入する第４の工程を含む。一部の実施形態において、キレート化剤はクエン酸塩又はマロン酸塩である。一部の実施形態において、特定のｐＨは３．０未満である。一部の実施形態において、特定のｐＨは２．０未満である。一部の実施形態において、特定のｐＨは、約１．７～約２．４の間である。例えば、一部の実施形態において、ｐＨは、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、又は約２．４である。一部の実施形態において、キレート化剤を含む溶液をタンパク質－ＲＥＥ複合体と接触させることは、ＲＥＥ－複合体から、より小さいイオン半径を有するＲＥＥを分離し、それに対して、より大きいイオン半径を有するＲＥＥは、ＲＥＥ－複合体から分離しない。一部の実施形態において、特定のｐＨ（例えば、１．７～２．２）で溶液を接触させることは、ＲＥＥ複合体から、より小さいイオン半径を有するＲＥＥを分離する。一部の実施形態において、より小さいイオン半径を有するＲＥＥは、Ｄｙ又はＹであり、より大きいイオン半径を有するＲＥＥは、Ｎｄ又はＰｒである。一部の実施形態において、方法は、ＮｄからＤｙの、ＰｒからＤｙの、又はＮｄからＹの優先的な脱離を可能にする。一部の実施形態において、本方法は、ＬＲＥＥ（例えば、Ｌａ－Ｎｄ）、ＨＲＥＥ（Ｈｏ－Ｌｕに加えてＹ）、及びＭＲＥＥ（Ｓｍ－Ｄｙ）の優先的な分離を可能にする。

【0083】

一部の実施形態において、ＬＲＥＥ、例えばＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、又はＥｕは、ＨＲＥＥ、例えばＧｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ、Ｓｍ、Ｙ、又はＳｃから優先的に分離される。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）タンパク質－ＲＥＥ複合体を、第１の濃度のキレート剤（例えば、クエン酸塩）と接触させる工程であって、ＨＲＥＥがタンパク質－ＲＥＥ複合体から分離する、前記工程、及び（ｂ）残存するタンパク質－ＲＥＥ複合体（例えば、ＬＲＥＥに結合したタンパク質）を、第２の濃度のキレート剤（例えば、クエン酸塩）と接触させて残存するＲＥＥを分離する工程、を含む、ＨＲＥＥからのＬＲＥＥの優先的な分離を提供する。一部の実施形態において、キレート剤の第１の濃度は約５ｍＭ～約１０ｍＭである。例えば、一部の実施形態において、キレート剤の第１の濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、又は約１０ｍＭである。一部の実施形態において、キレート剤の第２の濃度は、約１５ｍＭ～約５０ｍＭである。例えば、一部の実施形態において、キレート剤の第２の濃度は、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、又は約５０ｍＭである。

【0084】

一部の実施形態において、本開示は、単一工程でＲＥＥを優先的に分離するための方法を提供する。単一工程分離は、ＲＥＥ含有材料が１回タンパク質に導入され、分離後には異なるＲＥＥのグループ及び／又は非ＲＥＥからの他の元素を含まずに、又は実質的に含まずに、個々のＲＥＥ又はＲＥＥのグループの単離及び精製がなされる（すなわち、ＲＥＥ含有材料は、高い純度を達成するために２回以上カラムに導入される必要がない）場合に生じるものである。これは、ＲＥＥ含有材料の複数回の精製を必要とすることから非効率的なだけでなく費用もかかる従来のＲＥＥ分離技術とは対照的である。

【0085】

本発明の開示の態様はまた、ＬａｎＭなどのＲＥＥ選択的タンパク質を使用してＲＥＥ含有材料からＳｃを優先的に分離する方法も提供する。Ｓｃは、タンパク質－ＲＥＥ複合体（例えば、タンパク質－Ｓｃ複合体）からＳｃを選択的に脱離させることによって、ＲＥＥ及び非ＲＥＥ含有材料から優先的に分離することができる。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体を、タンパク質からＳｃを分離するが他のＲＥＥは分離しないキレート化剤を含む溶液と接触させることによって、Ｓｃをタンパク質から選択的に脱離させる。一部の実施形態において、この溶液はマロン酸塩を含む。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体をマロン酸塩を含む溶液と接触させることは、タンパク質－ＲＥＥ複合体を破壊することなく（例えば、ＲＥＥをタンパク質から分離することなく）Ｓｃを選択的に脱離させ、この場合ＲＥＥはＨＲＥＥである。非限定的な実施形態において、このような溶液（例えば、第１の溶液）はマロン酸塩を２０～５０ｍＭの濃度で含む。別の非限定的な実施形態において、このような溶液（例えば、第１の溶液）はクエン酸塩を約３．０ｍＭの濃度で含む。Ｓｃが第１の溶液を用いて脱離されたならば、１つ又は複数の追加の溶液を追加のＲＥＥを選択的に脱離させるのに使用することができる。例えば、一部の実施形態において、クエン酸塩を約１５．０ｍＭの濃度で含有する第２の溶液、及びクエン酸塩を約２５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で含有する第３の溶液、及び約１．５のｐＨを有する第４の溶液を、逐次的にタンパク質－ＲＥＥ複合体上に流動させて、それぞれＹの追加のＲＥＥ、ＨＲＥＥ／ＭＲＥＥ、及びＬａ／Ｃｅを除去することができる。

【0086】

一部の実施形態において、ＲＥＥ選択的タンパク質を使用してＳｃをＲＥＥ含有材料から優先的に分離する方法は、（ａ）１種又は複数種のＲＥＥと選択的に結合できる複数のタンパク質を提供する工程；（ｂ）前記複数のタンパク質をＲＥＥ含有材料と接触させる工程であって、前記複数のタンパク質が１種又は複数種のＲＥＥの少なくとも一部と結合して複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体及びＲＥＥ枯渇材料を形成する、前記工程；（ｃ）前記ＲＥＥ枯渇材料の少なくとも一部から前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を分離する工程；（ｄ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、キレート化剤、例えば、マロン酸塩又はクエン酸塩を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＳｃを分離する工程；（ｅ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、低濃度のキレート化剤を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＨＲＥＥ（例えば、Ｌｕ、Ｙｂ）を分離する工程；（ｆ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、中濃度のキレート化剤（例えば、マロン酸塩又はクエン酸塩）を含む溶液又は約２．３のｐＨを含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＹを分離する工程；（ｇ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、高濃度のキレート化剤を含む溶液又は中程度のｐＨを有する溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＭＲＥＥを分離する工程；及び（ｈ）前記複数のタンパク質－ＲＥＥ複合体を、低いｐＨ（１．７）を含む溶液と接触させることによって、前記複数のタンパク質からＬＲＥＥを分離する工程、を含む。一部の実施形態において、キレート化剤はクエン酸塩である。一部の実施形態において、低濃度のキレート化剤を含む溶液は、キレート化剤を約５ｍＭの濃度で含む。一部の実施形態において、キレート化剤はクエン酸塩である。一部の実施形態において、中濃度のキレート化剤を含む溶液はキレート化剤を約１５ｍＭの濃度で含む。一部の実施形態において、高濃度のキレート化剤を含む溶液はキレート化剤を約３０ｍＭの濃度で含む。一部の実施形態において、より高いｐＨを有する溶液は約２．３のｐＨを有する。一部の実施形態において、中程度のｐＨを有する溶液は約２．１のｐＨを有する。一部の実施形態において、低いｐＨを有する溶液は約１．７のｐＨを有する。

【0087】

ＲＥＥ含有材料は、ＲＥＥを含有することがわかっているか又はＲＥＥを含有すると疑われるあらゆる材料であり得る。一部の実施形態において、この材料は、固体材料、半固体材料、又は水性媒体である。好ましい実施形態において、この材料は水溶液である。ＲＥＥの抽出における使用のための好適な材料の非限定的な例としては、希土類鉱石（例えば、バストネサイト、モナザイト、ロパライト、ゼノタイム、褐廉石、及びラテライトイオン吸着粘土）から得られた浸出液、地熱塩水、石炭、石炭副産物、採掘尾鉱、リン酸石膏、固体源材料の酸浸出液、イオン交換方法を介して固体材料から抽出されるＲＥＥ溶液、又は他の鉱石材料、例えばＲＥＥを含有する粘土、火山灰、有機材料、及び火成岩や堆積岩と反応するあらゆる固体／液体が挙げられる。

【0088】

一部の実施形態において、ＲＥＥ含有材料は低グレードの材料であり、ＲＥＥは低グレードの材料の総質量の約２質量％未満でしか存在しない。他の実施形態において、ＲＥＥ含有材料は高グレードの材料であり、ＲＥＥは高グレードの材料の総質量の約２質量％より多くで存在する。
一部の実施形態において、ＲＥＥ含有材料は、ＲＥＥ含有材料の総質量の、約５質量％未満、約１０質量％未満、約１５質量％未満、約２０質量％未満、約２５質量％未満、約３０質量％未満、約３５質量％未満、約４０質量％未満、約４５質量％未満、約５０質量％未満のＲＥＥを含む。

【0089】

タンパク質は、例えばコンパクトな蛍光電球、エレクトロセラミクス、燃料電池電極、ＮｉＭＨ電池、永久磁石、触媒コンバーター、カメラ及び望遠鏡レンズ、炭素照明（ｃａｒｂｏｎ ｌｉｇｈｔｉｎｇ）用途、コンピューターハードドライブ、風力タービン、ハイブリッド車、Ｘ線及び磁気画像システム、テレビのスクリーン、コンピューターのスクリーン、流動クラッキング触媒、再利用されたランプからの蛍光体粉末などの再利用されたＲＥＥを含有する製品からＲＥＥを回収することにも使用することができる。これらの材料は、例えば、スカンジウム、イットリウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、プロメチウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、又はそれらのあらゆる組合せを含む所定量のＲＥＥを含有することを特徴とする。一部の実施形態において、ＲＥＥは、所定の産業からの液体廃棄物ストリーム（例えば、そのＲＥＥからの汚染除去を必要とする工場からの排出液、又はガドリニウム回収の可能性がある病院の排出液）又はこれらのＲＥＥ含有材料に由来する浸出溶液から回収される。

【0090】

一部の実施形態において、材料は、タンパク質を提供する前に前処理される。好適な前処理の非限定的な例としては、酸リーチング、バイオリーチング、イオン交換抽出、ｐＨ調整、酸化鉄沈殿、温度冷却（例えば、地熱塩水）が挙げられる。他の実施形態において、タンパク質を提供する前に、ＲＥＥ含有材料を精製して非ＲＥＥ金属の少なくとも一部を除去する。
一部の実施形態において、タンパク質の少なくとも一部は、ＲＥＥ含有材料を接触させる前に固体支持体の表面に付着される（すなわち、固定化される）。一部の実施形態において、固体支持体の表面へのタンパク質の付着は可逆的である。フロースルーセットアップにおける使用のためのバイオソープション媒体におけるタンパク質固定化は、単一工程でのＲＥＥを含有する混合金属溶液からの完全な（又は実質的に完全な）ＲＥＥの分離を可能にすることが予期される。一実施形態において、ＲＥＥ含有材料（例えば、混合金属溶液）中のＲＥＥの、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％が、単一工程で抽出される。一部の実施形態において、従来の抽出方法を使用した単一工程で抽出されたＲＥＥの量と比較して、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％多くのＲＥＥ含有材料（例えば、混合金属溶液）中のＲＥＥが単一工程で抽出される。

【0091】

タンパク質へのＲＥＥの結合は可逆的であってもよい。一部の実施形態において、タンパク質－ＲＥＥ複合体中のＲＥＥの少なくとも一部がタンパク質から脱離される（すなわち、除去又は分離される）。好適な方法の非限定的な例としては、酸処理（例えば、硫酸／ＨＮＯ₃及びＨＣｌ）、クエン酸塩、酢酸塩、マロン酸塩、及びグルコン酸塩が挙げられる。好ましい実施形態において、除去工程は酸ストリッピングによって実行される。別の好ましい実施形態において、除去工程は所定量のクエン酸塩を使用して実行される。

【0092】

タンパク質は再使用してもよい。一部の実施形態において、本方法は、タンパク質からＲＥＥを取り除いて、タンパク質を再生する工程をさらに含む。タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０回、又はそれより多くの回数使用することができる。他の実施形態において、タンパク質は使い捨てである。タンパク質は、当業者公知のあらゆる手段によって再生することができる。例えば、クエン酸塩を洗い落とすために緩衝液でタンパク質をクリーニングして、タンパク質を再生してもよい。一実施形態において、本方法は、再生されたタンパク質を再使用してＲＥＥ含有材料からのＲＥＥの抽出を行うことをさらに含む。
タンパク質は、その高い吸着容量も維持しながら、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０回、又はそれより多くの回数再使用することができる。一部の実施形態において、タンパク質は、吸着サイクルのそれぞれの間に、タンパク質１ｇ当たり、約１０ｍｇのＲＥＥ、約１５ｍｇのＲＥＥ、約２０ｍｇのＲＥＥ、約３０ｍｇのＲＥＥ、約４０ｍｇのＲＥＥ、約５０ｍｇのＲＥＥ、約６０ｍｇのＲＥＥ、又は約７０ｍｇのＲＥＥの吸着容量を維持する。一部の実施形態において、タンパク質は、９サイクルにわたり、タンパク質１ｇ当たり約３０～約７０ｍｇのＲＥＥの吸着容量を維持する。

【0093】

本開示の態様は、（ａ）ＲＥＥと選択的に結合できるタンパク質、及び（ｂ）ＲＥＥ含有材料からＲＥＥを差次的に分離するための指示書、を含むキットを提供する。一部の実施形態において、このタンパク質は多孔質支持体材料（例えば、マイクロビーズ）に結合している。

【0094】

実施例

【実施例1】

【0095】

ＲＥＥ分離のためのタンパク質ベースの方法
ＲＥＥが結合している供給材料から開始する個々のＲＥＥの抽出及びそれに続く分離は、再生可能エネルギー技術の成長と持続可能性のために困難であるものの必須の課題の代表である。現在のＲＥＥ処理方法の技術的及び環境上の限界を克服するための重要な工程として、以下の実施例は、ＲＥＥ選択的なランモジュリン（ＬａｎＭ）タンパク質を使用する、バイオベースであり全て水性のＲＥＥ抽出及び分離スキームを実証する。ＬａｎＭを、チオール－マレイミドクリックケミストリーを使用して多孔質支持体材料上に結合させて、フロースルー条件下でＲＥＥ精製及び分離ができるようにした。固定化ＬａｎＭは、驚くべきＲＥＥ選択性や低いｐＨでＲＥＥと結合する能力などの、遊離タンパク質の魅力的な特性を維持する。この実施例はさらに、クリーンエネルギーにとって重要なＲＥＥ対であるＮｄ／Ｄｙ及びＮｄ／Ｙの高純度の分離を達成し、単回のカラム実行で工業的に重要な低グレードの浸出液を別々の重及び軽ＲＥＥ画分に変換するＬａｎＭの能力を実証する。以下のプロセスの先行技術を超える主な利点は、低グレードの供給材料浸出液との適合性、有機溶媒を欠くこと、及びカラム容量の約９０％を使用しながらも特定のＲＥＥ対の効率的な分離を達成する能力であり、これらは、従来のイオン交換クロマトグラフィーとは対照的である。この技術は、ＲＥＥ供給材料に広く適用可能な、持続可能であり低コストのＲＥＥ回収及び分離プロセスが可能になるように、さらに発展させることができる。図１は、実施例１で概説したＲＥＥ分離の全体的なプロセスを描写する、簡易化した概略図を提供する。

【0096】

方法
化学物質及び材料
ＲＥＥ塩化物塩（＞９９．９％）、溶媒、及び緩衝液を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。アミンによって官能化されたアガロースビーズを、Ｎａｎｏｃｓ Ｉｎｃから購入した。Ｎ－スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）をＣｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から購入し、それ以上精製しなかった。ＮＨＳ－フルオレセイン（５／６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）、混合された異性体をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。

【0097】

ＬａｎＭの調製物
ＬａｎＭ－ＧＳＧＣをコードする遺伝子を含有するプラスミドを、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｐＥＴ－２９ｂ（＋）－ＬａｎＭ－ＧＳＧＣ）から得た。遺伝子配列は、停止コドンの前に（ｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｇｃ）が挿入されたコドン最適化ｗｔ－ＬａｎＭ配列からなっていた²⁰。０．６のＯＤ_600nmにおいて０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ＮＥＢ）において、３７℃にてタンパク質を過剰発現させた。精製は、全ての緩衝液が５ｍＭのＴＣＥＰを含有していたことを除き、記載される通りに行った³⁹。簡単に言えば、細胞を溶解させ、２５ｍＬの（２．５×５．０ｃｍ）Ｑ－セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗカラムにローディングし、０．０１～１ＭのＮａＣｌ濃度勾配を使用して溶出させた。ＬａｎＭ－ＧＳＧＣを含有する画分を、さらに、３０ｍＭのＭＯＰＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ₂、５％グリセロール、５ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ７．０におけるゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇカラム（１２０ｍＬ））を使用して精製した。ＬａｎＭ－ＧＳＧＣを含有する画分を、ＦＰＬＣによって、２０ｍＭの酢酸塩、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ４．０に交換し、約３ｍＭに濃縮し、貯蔵のために液体Ｎ₂中で凍結した。

【0098】

アガロースビーズのマレイミドによる官能化
アミンによって官能化されたアガロースマイクロビーズ（１．２ｍｌ）を５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、約１．７ｍＬ（１．２ｍＬのマイクロビーズ及び０．５ｍＬのＰＢＳ上清）の最終体積で再懸濁した。０．１５ｇのＳＭＣＣを３．４ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、次いでマイクロビーズと合わせた。室温における振盪ミキサー上で２．５時間のインキュベーション後、官能化したアガロースマイクロビーズを、ＤＭＳＯで３回洗浄して未反応のＳＭＣＣを除去し、カップリング緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、５０ｍＭのＫＣｌ、及び１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））で３回洗浄してＤＭＳＯ溶媒を除去した。次いで２時間以内に、マレイミドマイクロビーズをＬａｎＭ固定化に使用した。

【0099】

ＬａｎＭ固定化
チオール－マレイミドクリックケミストリーコンジュゲーション反応を使用してＬａｎＭ固定化を行った。具体的には、固定化の直前に、ＬａｎＭ－ＧＳＧＣタンパク質の緩衝液を、ＶｉｖａＳｐｉｎ（登録商標）２遠心濃縮機（３，０００ｇ／ｍｏｌの分子量カットオフ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してｐＨ７．０のカップリング緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＫＣｌ、及び１０ｍＭのＥＤＴＡ）に交換して、約２ｍＭの最終的なタンパク質濃度を得た。次いで２ｍＬのＬａｎＭ溶液を１ｍＬのマレイミド－マイクロビーズと合わせ、コンジュゲーション反応を室温で１６時間行った。結合していないＬａｎＭタンパク質をｐＨ７のカップリング緩衝液で洗浄することによって除去し、ＬａｎＭ－マイクロビーズを、後続の試験のためにｐＨ７のカップリング緩衝液中で貯蔵した。マレイミド－マイクロビーズはまた、結合していない対照サンプルとして、ＬａｎＭタンパク質なしでカップリング緩衝液と共にインキュベートした。

【0100】

破過カラム実験
エコノカラム（Ｅｃｏｎｏ－Ｃｏｌｕｍｎ）ガラスクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；５ｃｍ×０．５ｃｍ）を、ＬａｎＭ－マイクロビーズを重量測定によって添加する前にＭｉｌｌｉＱ水（１８．２ＭΩ・ｃｍ^-1）で充填した。カラムを２５ｍＭのＨＣｌ、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、破過実験を行う前に緩衝溶液で調整した（破過実験の場合と同じ緩衝液、以下を参照されたい）。ＲＥＥストック溶液を、１ｍＭのＨＣｌ中に個々のＲＥＥ塩化物塩を溶解させることによって調製した。ストック溶液を、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ５：ホモピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸、Ｈｏｍｏ－ＰＩＰＥＳ）；ｐＨ４：酢酸（ａｃｅｔａｔｅ ａｃｉｄ）；ｐＨ３．５～２．２：グリシン）又はＨＣｌのいずれかで、所望のｐＨにて釈した。ＲＥＥ溶液を、別段の規定がない限り０．５ｍＬ／分でポンプ注入し、カラム流出液を１．０ｍＬで分取した。単一のＲＥＥイオン溶液の場合、ＲＥＥイオン濃度をアルセナゾ ＩＩＩアッセイによって定量化した。具体的には、４０μＬのサンプルを、４０μＬの１２．５質量％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と合わせ、次いで６．２５質量％のＴＣＡ中の０．１質量％のろ過した１２０μＬのアルセナゾに添加した。６５２ｎｍでの吸光度を測定し、標準品と比較して、ＲＥＥ金属イオン濃度を決定した。比色アッセイの正確さは、ＩＣＰ－ＭＳによる以前の研究でも確認されている。ＲＥＥ混合物又は浸出液を用いた実験のために、金属イオン濃度をＩＣＰ－ＭＳによって決定した。

【0101】

ＲＥＥ対分離実験の場合、金属イオン純度は以下の通りと定義される。

【数1】

式中、Ｃ_REE1及びＣ_REE2は、それぞれＲＥＥ１及びＲＥＥ２のモル濃度である。

【数2】

式中、Ｙ_i及びＹ_jは、それぞれ溶離剤中の金属イオンｉ及びｊのモル濃度である。Ｘ_i及びＸ_jは、それぞれフィード中の金属イオンｉ及びｊのモル濃度である。

【0102】

ランモジュリンのＲＥＥ間の選択性を決定するために、ＬａｎＭ相（結合した）及び液相（未結合の）間のＲＥＥ分布係数（Ｄ）が以下の通り計算される。

【数3】

式中、［Ｍ］_LanM及び［Ｍ］_Liquidは、それぞれ平衡状態のＬａｎＭ相及び液相における金属モル濃度である。ここで留意すべきことに、［Ｍ］_Liquid＝［Ｍ］_adである；しかしながら、遊離ＲＥＥを吸着プロセスから完全に除去することはできないため、［Ｍ］_LanM＝（［Ｍ］_de×４－［Ｍ］_ad×０．８）／４である。
分離係数（ＳＦ）は以下の通りと定義される。

【数4】

式中、Ｄ_REE1及びＤ_REE2は、それぞれＲＥＥ１及びＲＥＥ２の分布係数である。２つのバッチから収集されたＤ値を正規化するために、以下の方程式が使用される。

【数5】

【0103】

フルオレセインによるＬａｎＭ標識
ＬａｎＭ（０．３ｍＬ、２ｍＭ）を、スピンカラム（Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１００ｍＭのＫＣｌ及び８ｍＭのＮｄ³⁺を含む４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（１０ｍＭ；ｐＨ７）に交換した。フルオレセインＮＨＳエステル（１ｍｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、３０μＬ）に溶解し、約３ｍｇ／ｍＬの最終濃度でＬａｎＭ溶液に添加した。室温で３時間のインキュベーション後、タグを有さない色素を、スピンカラム（Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム、７Ｋ ＭＷＣＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除去した。

【0104】

共焦点顕微鏡法
共焦点顕微鏡法のために、フルオレセインで標識されたＬａｎＭ（Ｆ－ＬａｎＭ）を、アガロースマイクロビーズ上への固定化のために使用した。次いでマイクロビーズを、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）褪色防止封入剤（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）の液滴と共に顕微鏡ガラスカバースリップ上に滴下した。４０×ＮＡ１．１水浸顕微鏡対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を使用して、サンプルを画像化した。Ａｉｒｙｓｃａｎモードを使用してＬａｎＭアガロースの３Ｄ蛍光画像を獲得した。

【0105】

Ｓｃ及びＮｄ定量のためのアルセナゾＩＩＩアッセイ
バッチ実験におけるＳｃ及びＮｄ濃度並びに破過曲線を、アルセナゾＩＩＩアッセイを使用して決定した。具体的には、Ｓｃの場合、８０μＬのサンプルを、１００μＬの０．２ＭのｐＨ２．８グリシン緩衝液と合わせ、次いで２０μＬの０．２Ｍグリシン中の０．３質量％のろ過したアルセナゾに添加した。Ｎｄの場合、４０μＬのサンプルを、４０μＬの１２．５質量％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と合わせ、次いで１２０μＬの６．２５質量％ＴＣＡ中の０．１質量％のろ過したアルセナゾに添加した。吸光度（Ｎｄは６５２ｎｍでの；Ｓｃは６７５ｎｍでの）を測定し、標準と比較して金属イオン濃度を決定した。比色アッセイの正確さは、ＩＣＰ－ＭＳによる以前の研究でも確認された。

【0106】

ｗｔ－ＬａｎＭの分光蛍光滴定
２０μＭのキレックス処理したＬａｎＭの溶液を、２０ｍＭの酢酸塩、１００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ５．０で調製した。金属化したＬａｎＭから開始した実験では、４０μＭ（２当量）の金属も添加した。タンパク質溶液（６００μＬ）を、１０ｍｍの石英分光蛍光分析キュベット（Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌｓ、１８Ｆ－Ｑ－１０－ＧＬ１４－Ｓ）に入れ、パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）蛍光分光計ＦＬ６５００をカイネティックモード（８０ｋＷの出力、２７８ｎｍの励起、２．５ｎｍの励起スリット幅、３０７ｎｍの放出、５ｎｍの放出スリット幅）で使用してアッセイした。少なくとも０．６μＬの滴定液（１０ｍＭの金属又は１ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５．０、のいずれか）の添加、それに続き約１分間のシグナル平衡により滴定を行った。各データポイントにつき、平衡後に１０秒のシグナルを平均した。これらの値を希釈のために補正し、アポタンパク質についてＦ_307nm＝１に正規化した。

【0107】

誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）
多元素合成溶液及び浸出溶液の元素組成をＩＣＰ－ＭＳを使用して決定した。Ｄｙ／Ｎｄ二成分合成溶液の場合、ＩＣＰ－ＭＳ分析をＩＣＰ－ＭＳで実行した。全てのサンプル及び補正標準を、濃硝酸（７０質量％、純度≧９９．９９９％の微量金属ベース、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を２．５％（ｖ／ｖ）まで使用して酸性化し、Ｉｎ、Ｒｈ、及びＢｉの内部標準でスパイクして、分析中のシグナル強度のシフトを調整した。二重荷電及び多原子干渉を低減するために、水素（Ｃａ及びＳｉの場合）とヘリウム（全ての他の元素の場合）反応ガスモードの両方でサンプルを分析した。石炭灰浸出液の複雑なマトリックスのために、⁴⁵Ｓｃ及び¹⁵³Ｅｕでの質量干渉を調整するための補正方程式を使用することが必要であった。破過曲線にわたる高いサンプリング頻度を考慮して、カラム破過試験には単一の複製を使用した。全てのフィード溶液は３連で実行した。複雑な合成溶液及び浸出溶液における金属イオン定量化の実験上の不確実性を説明するために、各金属イオン濃度につき３連のフィード溶液に基づいて変動係数を決定した。

【0108】

ＰＲＢ石炭灰のリーチング及びｐＨ調整
以前の研究に従って、ＰＲＢ石炭灰のリーチング及びｐＨ調整を実行した^34、35。簡単に言えば、２０１７年に収集された微粉炭火力発電所からのＰＲＢ石炭フライアッシュサンプルを、４０ｍＬの１ＭのＨＣｌ溶液中で、８５℃で４時間、１００ｇ／Ｌのパルプ密度でリーチングした。浸出液を室温に冷却し、３０００ｇで１５分間遠心分離して、全ての溶解していない粒子を除去した。次いで浸出溶液の上清を収集し、所望のエンドポイントｐＨ値が達成されるまで１０ＭのＮａＯＨストック溶液を滴下添加した（組合せｐＨ電極によってモニターしながら）。ｐＨ調整した浸出液を再び遠心分離してｐＨ調整中に形成された沈殿を除去し、次いで０．２μｍのポリプロピレンフィルターを使用してろ過した。

【0109】

結果及び議論
アガロースマイクロビーズ上へのＬａｎＭの固定化
フロースルー様式でのＲＥＥ回収のためのＬａｎＭの適用を容易にするために、ＧＳＧスペーサーと共にＣ末端システイン残基を含有するＬａｎＭバリアント（以降、「ＬａｎＭ」）を、チオール－マレイミドクリックケミストリーを使用してアガロースマイクロビーズに固定化した（図２Ａ）^22、23。物理的な結合や封入などの他の固定化戦略と比較して、部位特異的な共有付着は、安定で表面接近可能なタンパク質提示を可能にし、これは、厳しい条件（例えば、低いｐＨや高いイオン強度）下での吸着／脱離の繰り返しのサイクルにとって望ましい。末端システイン残基のコードが容易であることとその低いｐＨでの安定性を考慮して（下記参照）、チオールマレイミドケミストリーに従った。精製されたＬａｎＭを低いｐＨで操作して（方法を参照）、ＬａｎＭ固定化に有害作用を与えることが見出された還元剤の使用（データは示されない）を回避しながら硫黄酸化を排除した。アガロースビーズのマレイミド及びＬａｎＭ官能化をＦＴ－ＩＲによって確認し（図２Ｂ）、１６時間のコンジュゲーション反応にわたりコンジュゲーション溶液中の遊離のＬａｎＭ濃度を定量化することによって、固定化動態をモニターした。図２Ｂで示されるように、１０６０ｃｍ^-1のピークは、アガロースポリマーの主鎖を形成するグリコシド結合に割り当てられた。ＳＭＣＣスペクトルにおいて、１２００ｃｍ^-1及び１７０６ｃｍ^-1に配置されたピークは、それぞれスクシンイミド及びマレイミド基に割り振られた。アミン官能化したアガロースのＳＭＣＣとの反応後、１７０６ｃｍ^-1のピークの存在及び１２００ｃｍ^-1のピークの欠如は、成功したマレイミド官能化を示す。最後に、チオール－マレイミドクリックケミストリーの後、ＬａｎＭアガローススペクトルは、それぞれアミドＩ及びアミドＩＩに対応する１６５０ｃｍ^-1及び１５２０ｃｍ^-1において２つのピークを示したことから、ＬａｎＭタンパク質の固定化が示唆される。

【0110】

添加されたＬａｎＭのおよそ９７％が３時間以内に装荷され（図２Ｃ）、結果として固定化密度は２．８９±０．３４μｍｏｌ ＬａｎＭ／ｍＬアガロースになった。アガロースビーズ中のＬａｎＭの分布を可視化するために、固定化中に、蛍光タグを有するＬａｎＭのバリアント（ＦＩＴＣ－ＬａｎＭ、緑色）を組み込んだ。共焦点顕微鏡画像化により、アガロースマイクロビーズ中のＦＩＴＣ－ＬａｎＭの均質な分布が確認された（図２Ｄ）。

【0111】

固定化ＬａｎＭは、低いｐＨでＲＥＥと結合する能力を保持し、再使用に関して安定である
フロースルー条件下でのＲＥＥ抽出に関する固定化ＬａｎＭの有効性を試験するために、固定ベッドカラムにＬａｎＭ結合体をパッキングし、合成ＲＥＥを含有する溶液を用いて流入液破過挙動を評価した。代表的なモデルＲＥＥ系として、ＲＥＥ鉱床において豊富に存在することと、再生可能エネルギー技術にとって極めて重要であることにより、Ｎｄ³⁺を選択した。図３Ａで示されるように、Ｎｄ破過へのｐＨの作用を評価した（実験条件：１０ｍＭのグリシン緩衝液中の０．２ｍＭのＮｄ（ｐＨ＞２．２の条件；ｐＨ＜２．１条件の場合、ＮｄをＨＣｌ溶液で希釈した。）、０．５ｍＬ／分の流速；対照実験をマレイミドによって官能化されたアガロースをパッキングしたカラムをｐＨ３で使用することにより実行した）。Ｎｄ破過点（ｐＨ５における）は、空隙容量の通過に起因する結合していないアガロースビーズでのベッド体積の１倍量とは対照的に、ベッド体積の約２５倍量後に生じたことから、ＬａｎＭが固定化されたときにＲＥＥへの高親和性を保持することが示される（図３Ａ）。

【0112】

ＬａｎＭカラムの吸着容量は５．７８μｍｏｌ／ｍＬであった。これは、固定化されたＬａｎＭ当たりのＮｄの化学量論が２：１であることに対応する。これは、図４Ａ及び４Ｂで示されるように溶液中のＬａｎＭの吸収容量とは対照的である。特には、ＬａｎＭ－ＣｙｓのＬａ（ＩＩＩ）での化学量論的な滴定は、インジケーターとしてキシレノールオレンジを使用した競合滴定によって証明されたように（図４Ａ、滴定を、キレックス処理された２０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ６．０で実行した）、３当量のＲＥＥの結合を実証し（図４Ａ及び４Ｂ）、ＬａｎＭのＬａ（ＩＩＩ）に対する構造的な応答を、Ａ２８４ｎｍにおけるシフトとして追跡した（図４Ｂ、滴定を、キレックス処理した３０ｍＭのＭＯＰＳ、１００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７で実行した）。興味深いことに、これらの結果は、溶液中ではＬａｎＭは３当量のＲＥＥと結合することを示しており（図４Ａ及び４Ｂ）、これは、固定化したとき又はカラム様式で、１つの金属部位が不安定化されることを示唆している。
先行の研究から、この発見に基づき、可溶化したＬａｎＭは、２．５～３もの低いｐＨでＲＥＥと結合できることが明らかにされ、１．７～５のｐＨ範囲にわたるＮｄ抽出性能への流入液のｐＨの作用を試験した（図３Ａ）。結果は、固定化ＬａｎＭが、ｐＨ２．４まで下げてもＮｄと効果的に結合できることを示し、これは可溶化したＬａｎＭの結果と一致する¹⁶。溶液中で観察された挙動と一致して、固定化ＬａｎＭへのＮｄの結合はｐＨ２．２で５０％低減され、ｐＨ≦１．７では有意でなくなる。

【0113】

ＲＥＥ結合のｐＨ依存性を利用して、ＨＣｌ溶液をＮｄ飽和カラムにポンプで通すことによってＮｄ脱離を試験した。図３Ｂで示されるように、Ｎｄ破過へのｐＨ（ＨＣｌ濃度）の作用を評価した（ベッド体積の４０倍量のｐＨ３の０．２ｍＭのＮｄを前もってカラムに吸着させた）。ｐＨ１．７以下で、ベッド体積の１～６倍量の鋭い脱離ピークが観察され、Ｎｄはフィード溶液と比べて１桁を超えて濃縮された（図３Ｂ）。対照的に、ｐＨ２．０のＨＣｌ溶液は、次第に小さくなる脱離プロファイルをもたらし、Ｎｄの＞９５％を脱離させるのにベッド体積の１６．５倍量が必要であった。重要なことに、１０回連続する吸収／脱離サイクル（それぞれｐＨ３．０及び１．５）が吸着容量の低減をもたらさなかった（図３Ｃ、実験条件：０．５ｍＬ／分の流速。脱離条件：ベッド体積の１０倍量のｐＨ１．５のＨＣｌ）ことを考えれば、ＬａｎＭベースの吸着剤は、低いｐＨへの繰り返し曝露に対して強い。ＲＥＥシリーズ全体に対する固定化ＬａｎＭの親和性をさらに決定するために、他の代表的なＲＥＥ（すなわち、Ｙ、Ｌａ、Ｄｙ、及びＬｕ；図３Ｄ、実験条件：フィード：０．２ｍＭ）での破過曲線をｐＨ３．０で示したところ、Ｎｄのものと区別できない結果が得られた。全体として、結果は、低いｐＨ条件下における固定化ＬａｎＭによる有効で可逆的なＲＥＥ結合を実証する。

【0114】

ＬａｎＭはＲＥＥの高純度回収及び濃縮を可能にする
固定化ＬａｎＭのＲＥＥ選択性を試験するために、Ｎｄ（０．２ｍＭ）破過実験を、ＲＥＥを含有する供給材料が豊富なミリモルレベルのＭｇ²⁺、Ａｌ³⁺、Ｃａ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｃｕ²⁺、及びＺｎ²⁺を含有するｐＨ３．０の合成フィード溶液を用いて実行した²⁴。Ｎｄの破過はベッド体積の２４倍量の後に起こったが（図３Ｅ、実験条件：１４ｍＭのＮａ、３．３ｍＭのＭｇ、９．１ｍＭのＡｌ、２．３ｍＭのＣａ、１．９ｍＭのＣｏ、１．９ｍＭのＮｉ、１．８ｍＭのＣｕ、２．１ｍＭのＺｎ、及び０．２ｍＭのＮｄ、ｐＨ３を含有する合成フィード溶液を使用する、金属イオン破過曲線）、それに対して全ての非ＲＥＥは空隙容量で出現した。重要なことに、Ｎｄ破過曲線及びそれに続く脱離曲線は、非ＲＥＥが欠如した合成溶液を用いて観察された曲線と区別できなかったことから（図３Ｆ、灰色のひし形は、競合する非ＲＥＥイオンなしでのＮｄ破過／脱離プロファイルを示す。実験条件：ｐＨ１．５のＨＣｌでの処理後の金属イオンの脱離プロファイルを収集した）、プロセス中、ＲＥＥ及び非ＲＥＥの挙動はＬａｎＭの選択性のために完全に切り離されていることが示される。最後に、Ｆｅ³⁺の限定的な溶解性が多元素実験におけるその使用を阻むため、配位によりＦｅ溶解性を維持するためにクエン酸塩を含有する二成分Ｎｄ／Ｆｅ溶液を使用した破過実験によって、Ｆｅ³⁺への選択性を上回るＮｄ³⁺へのＬａｎＭの選択性を確認した（図３Ｇ、実験条件：フィード：Ｎｄ＋クエン酸塩：０．２ｍＭのＮｄ、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ３；Ｎｄ＋Ｆｅ＋クエン酸塩：０．２ｍＭのＮｄ、０．９ｍＭのＦｅ、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ３）。以下の表３に、図３Ｇで収集されたデータに関する合成フィードにおけるイオン濃度を列挙する。

【0115】

表3.合成フィード溶液のイオン濃度(mM)

【0116】

Ｆｅ³⁺イオンへの選択性を上回るＮｄへのＬａｎＭの選択性を、（１）ｐＨ３条件（＜１００μＭ）におけるそれらの低い溶解性、及び（２）Ｆｅ（ＯＨ）₃の形態でコロイド粒子を形成する可能性があるｐＨ３～４範囲におけるＦｅ³⁺イオンの不安定のために、別々に研究した。以前の研究は、このようなコロイド粒子は、２年まで溶液中で懸濁液として安定して存在する可能性があるが、その小さいサイズのために０．２２μｍフィルターでさえも効果的に除去できないことを示した。加えて、このようなコロイド粒子は、フロースルー実験中に固体吸着剤材料及びカラムに物理的に付着する可能性がある。これに対処するために、２０ｍＭのクエン酸塩をＮｄ／Ｆｅ合成溶液に添加して、ｐＨ３条件におけるＦｅ³⁺イオンの溶解性を改善し、Ｆｅ³⁺に対するＬａｎＭのＲＥＥ選択性の研究を可能にした。図３Ｇで示されるように、Ｎｄ破過曲線は、Ｆｅ³⁺の存在及び非存在でほとんど同一であることから、ＬａｎＭはそれでもなお、固定化後もＦｅ³⁺に対して高いＲＥＥ選択性を有することが示される。実際に、より高いｐＨではＦｅ³⁺溶解性がより低くなることから（ｐＨ４において＜１０μＭ、及びｐＨ５において＜０．０１μＭ）、ｐＨをｐＨ４～５範囲に増加させることによってＦｅ不純物の大部分を除去することができる。

【0117】

まとめると、これらの結果は、固定化ＬａｎＭは溶液中のＬａｎＭの高いＲＥＥ選択性を保持し、非ＲＥＥからＲＥＥを分離するのに採用できることを示唆する。

【0118】

溶液中のリガンド競合はＲＥＥ間の分離の可能性を明らかにする
ＬａｎＭの初期の特徴付けにより、このタンパク質が、ほとんどのＲＥＥリガンドと比べて逆の親和性傾向を呈示することが明らかになり、Ｌａ³⁺－Ｎｄ³⁺へは最大の、ほぼ類似した親和性を示し、Ｈｏ³⁺へは約５分の１の親和性を示した²⁰。しかしながら、ＲＥＥ間の分離に関するこれらの差を利用するための溶液中¹⁶及びカラム上でのＲＥＥ抽出の以前の研究（上記参照）は未だ試みられていない。重ＲＥＥ選好を有する穏やかなキレート化剤、例えばクエン酸塩との競合²⁵は、脱着性のプロセスにおける強化された選択性を可能にし得ることが予期される。この原理を確立するために、まず溶液中のＬａｎＭとのリガンド競合を調査した。ＬａｎＭにおけるチロシン残基単独の蛍光は、ＲＥＥ結合のときに消光されるという観察が利用され、これは、２つのタンパク質コンフォメーションにおける異なる溶媒曝露及び水素結合に起因する可能性がある²⁶。ＲＥＥでのＬａｎＭの滴定は、２当量でチロシン蛍光における最大の変化を示した。ＲＥＥは、第３の当量の結合で打ち消された（図５Ａ）。この第３の当量に関与するＲＥＥ結合部位はまた、固定化のときに不安定化される部位にも対応すると仮定された。この蛍光の変化は、ＬａｎＭからのＲＥＥ脱離のための条件をアッセイするための便利な手掛かりを提供する。Ｙ、Ｄｙ、又はＮｄ結合したＬａｎＭでの個々の滴定を使用するこれらの研究は、ＬａｎＭの見かけのＫ_dを考慮して予測された通りに、クエン酸塩が、ＬＲＥＥの前にＨＲＥＥに関してＬａｎＭに選択的に打ち勝ったことを明らかにした（図５Ｂ）。例えば、６ｍＭのクエン酸塩は、ＬａｎＭからほぼ完全にＤｙを脱離させるのに十分であり、それに対して、Ｎｄは、それでもなおタンパク質に完全に結合している。鋭い脱離プロファイル（４倍の濃度範囲にわたり生じる）は、ＬａｎＭ金属の結合の挙動における協同性と一致する²⁰。これらの結果は、ＬａｎＭの高いＲＥＥ親和性にもかかわらず、ＲＥＥを脱離させるのに穏やかなキレート化剤を使用できることを実証する。さらに、重要なことに、条件の調整は、ＬＲＥＥ－ＬａｎＭ複合体を不安定化することなく、ＬａｎＭからＨＲＥＥを選択的に脱離させるのに使用でき、オンカラムでの分離のための段階を設定できる。以下の表４に、図５Ａ及び５Ｂで収集されたデータに関する合成フィード中のイオン濃度を列挙する。

【0119】

表4.図5A～5Bにおける合成フィード溶液中のイオン濃度(mM)

【0120】

ＲＥＥ対間の分離
次の実験は、まずｐＨの所定範囲にわたり個々のＲＥＥがローディングされたＬａｎＭカラム（図６Ａ、ＲＥＥイオン脱離を脱離した総ＲＥＥに正規化した；実験条件：独立した単一のＲＥＥ溶液を使用して、９０％飽和までカラムをローディングした）及びクエン酸塩工程（図７Ａ、ｐＨ５）を使用して、脱離条件の慎重な選択が、ＲＥＥ間のオンカラムでの分離を可能にするかどうかを検査した。ランタニド（Ｌａ及びＬｕ）の全体のイオン半径の範囲を網羅するために、さらに、再生可能エネルギー技術に関するそれらの臨界に基づいて（Ｙ、Ｐｒ、Ｎｄ、及びＤｙ）、ＲＥＥの代表的なセット（Ｙ、Ｌａ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｄｙ、及びＬｕ）を独立して試験した。各ＲＥＥにつき両方の脱離条件下で別個の溶出プロファイルを観察した（図６Ａ及び図７Ａ）。クエン酸塩の場合、ＲＥＥ溶出の順番はイオン半径と相関しており、ＬａｎＭ－ＲＥＥ及びクエン酸塩－ＲＥＥ複合体の相対的な親和性とほぼ一致した。Ｎｄは、Ｌａと比較して脱離により低いｐＨを必要としたという注目すべき例外を除いて、ｐＨに関して類似した傾向が観察されたが、この結果は、ＬａｎＭ－Ｌａと比較して、ＬａｎＭ－Ｎｄ複合体についてより相対的な安定性を示唆しており、Ｎｄ／Ｐｒ範囲におけるＬａｎＭに関する安定性の局所的な最大値と一致する^16、20。試験されたＬａｎＭ ＲＥＥ複合体間の安定性の差は、特定のＲＥＥ対間の分離を達成するのに活用できることが予期される。

【0121】

Ｄｙ／Ｎｄ分離のための単一の吸着／脱離サイクル。上記の結果に導かれて、５０：５０のモル比のＮｄ及びＤｙの溶液でカラムを９０％飽和までローディングし、それに続いて段階的な脱離プロセス（図６Ｂ、Ｄｙ：Ｎｄの５０：５０混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．１及び１．７）に供した。図７Ｂ、Ｄｙ：Ｎｄの５０：５０混合物で構成される供給材料を、１５ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、それに続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供した）によって、ＬａｎＭのＲＥＥ分離の有効性を試験した。注目すべきことに、Ｄｙ及びＮｄは、２段階ｐＨ脱離スキームを採用するか、又は最初のクエン酸塩媒介Ｄｙ脱離と後続のＮｄのｐＨ媒介溶出を組み合わせるかのいずれかによって、別の画分に高純度で溶出した。２段階ｐＨスキームに関して、Ｄｙの７６．２％が、最初のｐＨ２．１脱離で９９．９％の純度で溶出し、一方でＮｄの７６．８％が、第２のｐＨ１．７脱離で９９．９％の純度で溶出した。ローディングされたＲＥＥ材料の２４％未満が、ピークがオーバーラップする領域に存在していた；フィード溶液と同一なＮｄ／Ｄｙ組成（５０．８％Ｄｙ；図８Ｂ）であることを考慮すると、この画分は、最初のフィード溶液と合わせて、将来の精製サイクル中に加工することができる（したがって、ＲＥＥのいかなる損失も回避される）。１５ｍＭのクエン酸塩を使用する脱離は、吸着したＤｙの９４．２％を９９．１％の純度で溶出させ、一方で後続のｐＨ脱離工程は、残存するＮｄ（９９．２％）を９４．６％の純度で溶出させた。まとめると、これらの結果は、高純度のＤｙ／Ｎｄ生成物は、両方の金属イオンの等モル混合物から開始した場合に得ることができることを示す。

【0122】

ＮｄＦｅＢ磁石を含む電子機器廃棄物を反映する供給材料組成物を用いて試験するために、カラムを、９５％Ｎｄ及び５％Ｄｙで構成されるフィード溶液で９０％の飽和までローディングした²⁷。合わせたＮｄ／Ｐｒ含量（典型的には３：１のＮｄ：Ｐｒ）の代用品としてのＮｄの使用は、ｐＨ又はクエン酸塩濃度の関数としての両方の金属イオンのほぼ同一な脱離プロファイルによって裏付けられる（図６Ａ及び７Ａ）。Ｎｄ／ＰｒからのＤｙの成功した分離は、磁石製造サプライチェーンにフィードバック可能な高い価値のジスプロシウム及びジジム酸化物生成物の生産を可能にすると予想される。図６Ｃ（Ｄｙ：Ｎｄの５：９５混合物で構成される供給材料を９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．２及び１．７）に供した）及び図７Ｃ（Ｄｙ：Ｎｄの５０：５０混合物で構成される供給材料を９０％カラム飽和までローディングし、次いで１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供した）で示されるように、２段階ｐＨ及びクエン酸塩脱離スキームは両方とも、Ｄｙ純度を有意にアップグレードさせながら高純度のＮｄ画分（それぞれ９９．８％及び９８．７％）をもたらした。例えば、ｐＨ２．２溶出工程は４６．１％の純度で８８．６％のＤｙ含量をもたらし、一方でクエン酸塩脱離工程は４８．９％の純度で７３．９％のＤｙをもたらした。

【0123】

Ｄｙ／Ｎｄ分離のための２つの吸着／脱離サイクル。５０：５０混合物を用いた成功したＤｙ／Ｎｄ分離の結果を考慮して（図６Ｂ）、９５％Ｎｄ／５％Ｄｙ供給材料から最初のカラム工程（すなわち、第１の吸着／脱離サイクル）で生成したおよそ５０の純度のＤｙ画分（図６Ｃ）を試験して、これらの画分が、第２の吸着／脱離サイクルを実行することによってさらに高純度にアップグレードできるかどうかを決定した。この目的を達成するために、９５％Ｎｄ／５％Ｄｙフィードを使用したＮｄ／Ｄｙ分離を５回繰り返して、第２の分離工程（又はサイクル）を可能にするのに十分な体積の４４％純度のＤｙ脱離画分を蓄積した（図２１）。Ｎｄ／Ｄｙフィード溶液の薄い性質にもかかわらず、ＬａｎＭカラムは高いローディング収率（＞９９％）を呈示し、ｐＨ脱離工程後にそれぞれ９９．２％の純度の８８％のＤｙ及び９９．９％の純度の８２％のＮｄを達成した。これらの結果は、ＬａｎＭカラムが、電子機器廃棄物浸出液に典型的な低純度のＤｙ溶液から開始して、ＮｄからＤｙを効果的に分離できることを示唆する。より一層高い収率及び生成物純度は、より高い操作体積を用いて達成される可能性がある。加えて、カラム操作条件、例えばｐＨ、競合キレート化剤の同一性、並びに濃度、流速、及びカラムの幾何学的配置を入念に調整することで、さらなるＲＥＥ分離が実現される可能性がある。

【0124】

電子機器廃棄物サンプルを用いたＤｙ／Ｎｄ分離。合成溶液を用いた結果は、ＬａｎＭが、２回の吸着／脱離サイクルで９５％Ｎｄ／５％Ｄｙフィードを高純度のＮｄ及びＤｙ生成物に効果的に分離できることを示唆した。実際の電子機器廃棄物からのＲＥＥの回収及び分離を実証するために、ＨＤＤスクラップ（ＩＮＬ）から調製されたバイオ浸出液を使用して段階的な分離スキームを試験した。電子機器廃棄物バイオ浸出液をＬａｎＭカラム上にローディングした後（吸着工程）、蒸留水での洗浄工程を使用して、未結合の金属イオン及びバイオリキシビアントを除去した。次いでｐＨ２．２及びｐＨ１．５における２段階脱離を使用して、Ｄｙを選択的に脱離させ、それぞれ高純度のＮｄ／Ｐｒを生成した。最終的に、１ＭのＨＣｌ処理工程を使用してＦｅ沈殿を除去し、ＬａｎＭカラムを再生した（図２２Ａ～Ｂ）。

【0125】

このスキームを使用して、Ｄｙ濃縮物（２８．９％；総ＲＥＥに対して）及び高純度のＮｄ／Ｐｒ（９９．３％）溶液を得た。合成溶液を用いた先行の結果に基づいて、第２のカラム工程を使用して、さらにＤｙ画分を高純度にアップグレードすることが可能である。中程度のレベルのＦｅ不純物を各脱離画分中に共に抽出したが、以前の研究は、このＦｅは、溶液をｐＨ６に調整することにより誘導された沈殿によって効果的に除去できることを示している。カラムに残存するＦｅは、１ＭのＨＣｌ（ｐＨ０）クリーニング工程によって除去してもよい（図２２Ｃ）。最後に、０．４ｍＭのＮｄ溶液（ｐＨ３）と再生されたカラムを用いた破過曲線を使用して、カラム安定性を試験した（図２２Ｄ）。吸着容量におけるＲＥＥの損失は観察されなかった。この研究は、電子機器廃棄物バイオ浸出液を処理してＤｙ濃縮物及び高純度のＮｄ／Ｐｒを生産するためにＬａｎＭカラムを使用できることを示した。

【0126】

２８．９％のＤｙ画分を高純度のＤｙ及びＮｄへとさらに精製するための第２のカラム工程（すなわち、第２の吸着／脱離サイクル）の有効性を試験するために、合成の７１％Ｎｄ／２９％Ｄｙ供給材料溶液を、ランモジュリンカラム上にローディングし、２段階のｐＨ脱離プロセスに供した。高純度のＤｙ及びＮｄ溶液を得た（図２３）。
上記で論じられた固定化ＬａｎＭの分離及び精製プロセスと比較して、他の抽出方法は、それほど有効ではない。例えば、Ｎｄ／Ｄｙ分離のためにビス（２，４，４－トリメチルペンチル）ホスフィン酸（Ｃｙａｎｅｘ２７２）を使用した近年の液体-液体抽出研究において、６．７％のＤｙを含有するフィード溶液を、単回の抽出段階を使用して約４７％純度のＤｙに濃縮し、８５．８％のＤｙ抽出収率を得た²⁸。２－エチルヘキシルホスホン酸モノ－２－エチルヘキシルエステル（ＰＣ８８Ａ）リガンドでの向流抽出の配置を採用した別の研究は、それぞれ、２０％Ｄｙ／８０％Ｎｄフィード溶液を７６．７％及び９５．２％純度のＤｙ溶液にアップグレードするのに３及び４つの抽出段階を要した²⁹。したがって、固定化ＬａｎＭは、高純度（９９．９％まで）のＮｄ及びＤｙ分離を生じさせるための、有効で環境に優しい、液体-液体抽出の代替物として使用することができる。

【0127】

次に、ＮｄからＹを分離するＬａｎＭの能力を試験したところ（図６Ｄ、Ｙ：Ｎｄの２２：７８混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで２段階ｐＨ脱離スキーム（２．３及び１．７）に供した。図７Ｄ、Ｙ：Ｎｄの２２：７８混合物で構成される供給材料を、９０％カラム飽和までローディングし、次いで１０ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）、続いてｐＨ１．７を使用した２段階の脱離スキームに供した）、両方のＲＥＥは、一次ＲＥＥ鉱床（例えば、モナザイト、ゼノタイム、及び／又は褐廉石を含有するもの）中に豊富であり、グリーンエネルギー技術にとって重要であるとみなされる。フィード溶液中のＹ及びＮｄの比率をそれぞれ２２％及び７８％に設定して、典型的な石炭副産物浸出液におけるＨＲＥＥ対ＬＲＥＥの比率に類似させた^30、31。２段階ｐＨ脱離の後に２つの別個のピークを収集し、それぞれ９５．６％のＹ純度及び９９．８％Ｎｄの純度が達成された。流入液フィード溶液（７９．１％Ｎｄ＋２０．９％Ｙ）とほぼ同一な組成の小さいオーバーラップ領域（吸着した金属の＜２５％）を収集し、後続の吸着／脱離サイクルでフィード溶液として再利用してもよい。注目すべきことに、クエン酸塩／ｐＨの組合せは、ほぼ完全なＹ／Ｎｄ分離をもたらした；Ｙの９５．８％が９９．４％の純度で溶出し、一方でＮｄの９９．７％が＞９９．９％の純度で溶出した。したがって、単一の吸着／脱離サイクルを用いて、Ｙは、Ｎｄから分離することができる。２段階ｐＨスキーム及びクエン酸塩－ｐＨスキームを使用することによる供給材料及び３つの脱離ゾーン中のＲＥＥ組成の要約をそれぞれ図６Ｅ及び６Ｆに提供する。以下の表５に、図６Ａ～６Ｆで収集されたデータに関する合成フィード中のイオン濃度を列挙する。

【0128】

表5.図6A～6Fにおける合成フィード溶液中のイオン濃度(μM)

【0129】

低グレードの供給材料浸出液からのグループ分けしたＲＥＥの抽出及び分離
石炭フライアッシュや赤泥などの豊富な廃棄物からＲＥＥを回収することは、採掘に固有の汚染を回避しながらＲＥＥ供給を多様化するための見込みのある手段を提供する。しかしながら、このような低グレードのＲＥＥを含有する廃棄物から生産された浸出溶液は、Ａｌ³⁺、Ｃａ²⁺、及びＦｅ³⁺などの高レベルの金属イオン不純物を含有しており、従来の液体-液体抽出アプローチにとって問題がある^5、24。例えば、Ａｌ³⁺は、一般的に、液体-液体抽出においてＲＥＥと共に抽出され、結果として低いＲＥＥ純度及びゲル状の水酸化物を介したエマルジョンの形成を引き起こす²⁴。同様に、他の不純物、例えばＣａ²⁺は、石膏形成を介して液体-液体抽出プロセス中に汚染を引き起こす可能性がある³²。したがって、浸出溶液は、一般的に、液体-液体抽出ユニットにフィードする前に不純物を除去するための前処理沈殿工程に供される。選択的な沈殿は、Ｆｅ³⁺などの特定の不純物を除去するのに効果的であるが、Ａｌ³⁺の完全な除去は、ＲＥＥ水酸化物が水酸化アルミニウムと共沈するために大きな困難さをもたらす^24、33。それゆえに、非ＲＥＥ不純物、特にＡｌ³⁺及びＣａ²⁺と比べて高いＲＥＥ選択性を有するＲＥＥ抽出方法が非常に望ましい。

【0130】

工業的に関連する性能の試験として、ＬａｎＭカラムベースのＲＥＥの抽出及び分離の概念を、亜歴青炭（ＰＲＢ）フライアッシュから調製された低グレードの浸出液（０．０４３％のＲＥＥ、１価イオンは排除された）を使用して実証した^34、35。浸出液は、Ｎａ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｃａ、及びＳｒのｍＭのレベル（表６Ａ～６Ｂ）と比較して、約１５０μＭの総ＲＥＥ、並びに著しい遷移金属含量（例えば、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｃｕ、及びＭｎ）を含有する。ＬａｎＭベースのカラムを使用して、ＲＥＥの破過はベッド体積の３０倍量後に生じ、それに対して非ＲＥＥは空隙容量に溶出した（図８Ａ、金属イオンの吸着プロファイル；吸着条件：ｐＨ５、０．５ｍＬ／分。ベッド体積の１倍量＝０．８ｍＬ）。吸着した金属含量のＲＥＥ純度を評価するために、ｐＨ１．５溶液を使用した非選択的な脱離後に金属イオン組成を決定した。ＲＥＥの９６．５％より多くが、最も濃縮された画分（総３．９ベッド体積）内に脱離し、平均富化係数６．９であった（図８Ｂ及び図９、ＰＲＢフィード中の金属組成及び回収されたバイオソープション溶液）。８８．２％（図８Ｃ、ＰＲＢフィード及び回収されたバイオソープション溶液中の金属イオンのパーセンテージ（１価イオンは除く）のパーセンテージ）の総ＲＥＥの純度が観察され、これは、フィード溶液（０．０４３％のＲＥＥ、１価イオンが排除されている）と比較して、純度において２０５０倍という著しい増加を示す。重要なことに、放射性核種のウランはＰＲＢ浸出液から濃縮されなかった。

【0131】

表6A. pH5におけるPRBフィード溶液中のイオン濃度(μM)

【0132】

表6B. PRB脱離溶液の3つの最も濃縮された画分におけるイオン濃度(μM)

*各元素の不確定要素を表5Aからの3連の試験に基づき仮定した。

【0133】

従来の液体-液体抽出アプローチを用いてＬａｎＭカラムベースの方法のＲＥＥ選択性を評価するために（図８Ｄ、点線より上の値は、非ＲＥＥより高いＲＥＥ親和性を示唆する）、卑金属イオンに対する総ＲＥＥの分離係数を、匹敵する組成物の石炭フライアッシュ浸出液と共に広く市販されている抽出溶媒であるジ－２－エチル－ヘキシルリン酸（ＤＥＨＰＡ）を使用して作成されたデータと比較した³⁶。ＬａｎＭベースのアプローチがＦｅ及びＳｉを除き全ての非ＲＥＥ不純物に抗して高い選択性を呈示したが、Ｍｇ²⁺、Ａｌ³⁺、及びＣａ²⁺への選択性がそれより数桁高いことは、それらの豊富な低グレードの供給材料浸出液を考慮すると特に説得力がある^31、37。Ｓｉ及びＦｅに対するより低い相対的な選択性は、カラム上に蓄積し、低ｐＨでの脱離工程中に溶解するろ過不可能なコロイド粒子の形成を反映していることが予期される。したがって、現在のカラムベースのアプローチは、ＬａｎＭの作用を最大化するためにＦｅ／Ｓｉ含量を除去するためのプレカラム方法を必要とする。要約すると、これらの結果から、多様な金属イオン不純物を含有する低グレードの浸出液からＲＥＥを選択的に濃縮する固定化ＬａｎＭの能力が強調される。

【0134】

吸着段階中における非ＲＥＥ不純物の大部分の有効な除去を実証した後、２段階ｐＨ脱離スキームを使用したＰＲＢ浸出液からの吸着したＲＥＥのグループ分離（ＬＲＥＥ（Ｌａ－Ｇｄ）：７２％；ＨＲＥＥ（Ｔｂ－Ｌｕ＋Ｙ）：２８％）を可能にするＬａｎＭの能力を試験した。ＨＲＥＥ及びＬＲＥＥ画分にグループ分けしたＲＥＥの分離は、液体-液体抽出中における重要な初期工程であり、ＨＲＥＥを富化するための複数の抽出及びストリッピング段階を必要とし、典型的には、非ＲＥＥ不純物除去段階で使用されるものと比較して異なる抽出溶媒の使用を含む⁵。主としてＨＲＥＥ又はＬＲＥＥのいずれかで構成される２つの別個のピークを観察した（図８Ｅ）；ＨＲＥＥの８２％が、ｐＨ２．３で７２．６％の純度で溶出し、一方でＬＲＥＥの８０％が、ｐＨ１．７の脱離で９８．８％の純度で溶出した。Ｓｃはまた、他のＲＥＥと共に抽出され、ＬＲＥＥグループと共に脱離した；しかしながら、その濃度はＰＲＢ浸出液中において特に低かった（０．０２μＭ）。イオン吸着から生成した酸浸出液からの類似した純度のＬＲＥＥ分離を達成するために、段階的な液体-液体抽出プロセスを介して１１段階の向流抽出が必要であり、２種の共通の抽出溶媒、２－エチル－ヘキシルホスホン酸モノ－２－エチルヘキシルエステル（ＨＥＨ（ＥＨＰ）、Ｐ５０７）及びジ－（２－エチルヘキシル）リン酸（ＨＤＥＨＰ、Ｐ２０４）が逐次的に活用された³⁸。まとめると、これらの結果から、ＬａｎＭカラムの主な利点：有機溶媒又は有害化学物質を使用することなく、単一の吸着／脱離工程で、低グレードの浸出液を用いて、非ＲＥＥ不純物の除去とグループ分けしたＲＥＥ分離の両方を達成する能力が強調される。Ｎｄ／Ｄｙ、及びＮｄ／Ｙ対を用いた分離データに基づき、複数の吸着／脱離工程を連結することによって、及び／又は脱離工程における有機キレート化剤の慎重な組込みによって、ＨＲＥＥ及びＬＲＥＥグループ内でのより精密な分離が可能である。２段階のｐＨスキームによるＨＲＥＥ（Ｔｂ－Ｌｕ＋Ｙ）及びＬＲＥＥ（Ｌａ－Ｇｄ）の選択的な脱離は、図８Ｅに示され（パネルＤの上の値は、総ＲＥＥ含量に対するＬＲＥＥ又はＨＲＥＥの純度を示し、３つの溶出ゾーンを垂直の点線によって分割する）、ＰＲＢフィード及び３つの溶出ゾーン中の総ＲＥＥに対するＲＥＥ比率は、図８Ｆに示される（実験条件：ベッド体積の２９．１倍量のＰＲＢフライアッシュ浸出液を、０．９４ｍＬのカラムにポンプ注入し、続いてベッド体積の１０倍量のｐＨ３．５の水での洗浄工程を行った。ベッド体積の１６倍量のｐＨ２．３のＨＣｌ溶液及びベッド体積の１０倍量のｐＨ１．７のＨＣｌ溶液を逐次的に用いて脱離を実行した）。図８Ａ～８Ｄで収集されたデータに関する合成フィード中のイオン濃度は、以下の表７に列挙され、図８Ｅ及び８ＦにおけるＰＲＢ浸出液フィード、及び３つの脱離ゾーン中のイオン濃度（μＭ）は、以下の表８に列挙される。

【0135】

表7.図8A～8Dにおける合成フィード溶液のイオン濃度(μM)

【0136】

表8.図8E及び8FにおけるPRB浸出液フィード、及び3つの脱離ゾーンにおけるイオン濃度(μM)

【0137】

ｐＨベースの脱離を使用したＲＥＥの分離
ＲＥＥ間のＬａｎＭの差次的な親和性。固定化ＬａｎＭのＲＥＥ選択性の選好を特定するために、全てのＲＥＥ（Ｐｍを除く）を含有する合成溶液をカラム破過試験に使用した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。カラムが、単一元素実験によって決定された破過点に達するまでＲＥＥは溶出しなかった。破過はＬｕ、Ｙｂ、Ｔｍ、Ｙ、Ｅｒ、Ｈｏ、Ｄｙ、Ｔｂ、Ｇｄ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｅｕ、Ｎｄ、Ｐｒ、Ｓｍ、及びＳｃの順番で起こったことから、重ＲＥＥよりも中－軽ＲＥＥへの選好が明らかになり、これは、可溶化タンパク質の結合親和性決定に一致する。興味深いことに、破過領域において、重い希土類の流出液濃度は、そのフィード濃度のものより高く、これは、ＬａｎＭにより高い親和性を有するＲＥＥによる競合的な置き換えを示唆する。このＲＥＥ間のＬａｎＭの差次的な親和性は、ＲＥＥ分離に活用することができる。

【0138】

ランモジュリンのＲＥＥ間の選択性も定量化した。溶液と固定化ランモジュリンとの間のＲＥＥの平衡分布を定量化することによって分離係数を決定した（図３０）。より具体的には、ＲＥＥシリーズをＲＥＥの等モル濃度で２つの溶液に分け、これを、固定化ランモジュリンを含有するカラム上に平衡が達成されるまで循環式で流動させた。その後、吸着の前及び後における溶液中の金属イオン濃度を定量化した。全体として、データは、重ＲＥＥよりも軽－中ＲＥＥへのランモジュリンの強い選好を明らかにし、これは、図１０の競合破過曲線データ及び遊離のタンパク質の結合親和性決定と強く一致する。隣接するＲＥＥと中ＲＥＥとの間で分配係数の著しい差が観察されたことから（隣接する金属イオンでは１．４～１．８のＳＦ；以下の表１）、これらの元素の分離にランモジュリンを採用する可能性があることが強調される。対照的に、ＣｅからＥｕについて分配係数は最小の差であり（ＳＦは、この領域中のいずれの対に対しても、１．３未満であるか又はそれに等しい）、これは、ランモジュリンのＲＥＥへの親和性にのみ頼る分離プロセスは、これらのＲＥＥの分離に有効である可能性が低いことを示唆する。

【0139】

表1. 1回の吸着サイクル後のREEシリーズの分離係数_(1/2)。図30からの分配係数から決定された。

【0140】

ＲＥＥの差次的な破過に導かれて、段階的ｐＨを使用する、ＲＥＥがローディングされたＬａｎＭカラムからＲＥＥグループを選択的に脱離させる工程の可能性を調査した。このような実験を実用的な条件下で実行するために、ＬａｎＭカラムを、石炭フライアッシュ浸出液中のＲＥＥ組成に類似した合成ＲＥＥ溶液で事前にローディングし、次いで多工程ｐＨ脱離を採用した（図１１Ａ～１１Ｄ）。特には、等モルのＲＥＥイオン溶液につき、１３μＭの各ＲＥＥ（Ｌｕ、Ｙｂ、Ｔｍ、Ｙ、Ｅｒ、Ｈｏ、Ｄｙ、Ｔｂ、Ｇｄ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｅｕ、Ｎｄ、Ｐｒ、Ｓｍ、及びＳｃ）をｐＨ３、１０ｍＭのグリシン溶液に溶解させた。ＲＥＥ溶液を、ＬａｎＭカラムに０．５ｍＬ／分でポンプで通し、カラム流出液を１．０ｍＬで分取した。流出液中のＲＥＥ濃度をＩＣＰ－ＭＳによって決定した。ＲＥＥ溶出液を、３つのグループ：重ＲＥＥ（Ｈｏ－Ｌｕ＋Ｙ）、中ＲＥＥ（Ｇｄ－Ｄｙ）＋Ｌａ、及び軽ＲＥＥ（Ｃｅ－Ｅｕ）に分割した。まずｐＨ２．３～２．５の範囲内で重ＲＥＥが脱離し、それに対して、Ｌａを除く全ての軽ＲＥＥは、ｐＨがｐＨ２．１及びそれ未満に達するまでカラムに保持された。中ＲＥＥは中間のｐＨ範囲内で溶出した。これらの結果から、石炭フライアッシュ浸出液（又は他の鉱石ベースの供給材料浸出液）から共抽出されたＲＥＥは、単一の吸着／脱離サイクルで３つのサブグループに分離できることが示唆された。ＬａｎＭカラムでの追加の吸着／脱離サイクルを使用して、分離したグループ中のＲＥＥをさらに分離できることも考えられる。

【0141】

有機キレート化剤の戦略的な選択を使用したＲＥＥの分離
ＬａｎＭは、ＲＥＥからのＳｃ分離を可能にする。ＬａｎＭは、ピコモル未満の濃度の見かけの解離定数でＳｃと結合する（図１２）。この実験中、ＣＤ分光法を使用して、様々なマロン酸塩で緩衝化された遊離のＳｃ^III濃度で［θ］_222nmをモニターし、データをヒル式に当てはめた。Ｈｙｐｓｐｅｃコンピュータープログラム⁴⁰を使用して、２０ｍＭの酢酸塩、１００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ５中の様々なＳｃ－マロン酸塩系の分種化のダイアグラムを計算した。得られた遊離金属濃度を、標準的なＣＤ滴定プロトコールを使用して、親和性決定に使用した。Ｓｃ－マロン酸塩はシグナルに寄与していなかったため、１つのみのブランクが必要であった。印象的なことに、遊離のＬａｎＭを用いたデータは、キレート化剤であるマロン酸塩が、重ＲＥＥ－ＬａｎＭ結合に影響を与えない濃度でＬａｎＭ－Ｓｃ複合体からＳｃをストリッピングできることを示す（図１３）。したがって、マロン酸塩を採用して、最初の吸着工程でＬａｎＭカラムをＲＥＥでローディングすること、及び次いでＳｃを選択的に回収するためにマロン酸塩を使用することによって、ＲＥＥ供給材料浸出液からＳｃを高純度で分離することができる。次いで、さらなるＲＥＥの分離のために、他のキレート化剤を用いた、又はｐＨモジュレーションを介した後続の脱離工程を採用することができる。

【0142】

ＲＥＥ破過及び脱離へのクエン酸塩の作用。遊離のＬａｎＭに関する有望なクエン酸塩脱離データに基づき（図１４）、ＲＥＥ破過へのクエン酸塩の作用を調査した。全てのＲＥＥ（Ｐｍを除く）を含有する合成溶液を、カラム破過試験のためのｐＨ３．５の２０ｍＭのクエン酸塩で調製した。ＲＥＥ溶出物の破過の順番は、イオン半径と相関していた。（図１５Ａ）ＨＲＥＥ（Ｌｕ－Ｔｂ、Ｙ、Ｓｃ）は、第１のベッド体積の５倍量で破過し、それに対してＬＲＥＥ（Ｌａ－Ｎｄ）は、ベッド体積の２５倍量まで破過しなかった。等モルのＲＥＥ破過実験に導かれて、ＲＥＥがローディングされたＬａｎＭカラムからＲＥＥを選択的に脱離させるためにクエン酸塩工程を使用する可能性を調査した。（図１５Ｂ）。予想通りに、ＲＥＥ溶出物のＲＥＥ脱離の順番もイオン半径に従っていた。しかしながら、驚くべきことに、Ｌｕを含む全ての他のＲＥＥの前に、薄いクエン酸塩（３ｍＭ）によってＳｃの大部分（８０％）が脱離した。このデータは、遊離のＬａｎＭを用いた以前の研究とあわせて、共抽出されたＳｃは、薄いキレート化剤溶液を使用することによって全ての他のＲＥＥから効果的に分離できることを示唆する。クエン酸塩の代わりにマロン酸塩を使用することは、ＲＥＥからのＳｃのより一層クリーンな分離を可能にする（図１５Ａ及び１５Ｂ）。データはまた、クエン酸塩を用いた段階的な脱離プロセスが別々のＨＲＥＥ、ＭＲＥＥ、及びＬＲＥＥプールを生成するために採用できることも示唆する。

【0143】

クエン酸塩－ｐＨ段階的脱離による合成鉱石浸出液からのＳｃ／Ｙ分離。鉱石ベースの供給材料浸出溶液（例えば、ボーキサイト及びその廃棄物残留物、褐廉石、石炭及び石炭燃焼生成物；図２６）のＲＥＥ組成に類似した合成ＲＥＥ溶液を使用して、ランタニドからＳｃ及びＹを分離するための脱離ベースのプロセスを開発した。Ｓｃ及び重ＲＥＥへのクエン酸塩の優先的な結合を、ランモジュリン（ＬａｎＭ）による軽－中ＲＥＥの優先的な結合と組み合わせて考慮して、複数のクエン酸塩工程を使用する脱離スキームを試験して、そのスキームがＬ－ＭＲＥＥからＳｃ及びＹを分離するのに使用できるかどうかを決定した。図１５Ｂに提示された研究から、３ｍＭの及び１５ｍＭのクエン酸塩（ｐＨ５）濃度が、それぞれＬａｎＭカラムからのＳｃ及びＹの脱離において有効であったことが明らかにされた。さらに、３ｍＭのクエン酸塩脱離工程は、９６．４％の純度及び７７％の回収収率を有するＳｃ溶液をもたらした。図２７は、脱離プロファイル（Ａ）及び累積的な収率（Ｂ）を示す。１５～３０ｍＭのクエン酸塩を使用した後続の脱離工程から、Ｙ溶液を８８％の純度及び＞９０％の回収収率で得た。次に、７５ｍＭのクエン酸塩を使用して、高い有用性のＭＲＥＥ＋Ｎｄ／Ｐｒが富化された画分を生成した。ｐＨ１．５溶液を使用して残存するＲＥＥを脱離させ、Ｌａ／Ｃｅが富化された溶液を得た。これらの結果は、クエン酸塩－ｐＨ脱離戦略を使用することによって、吸着したランタニド画分からＳｃ及びＹを効果的に取り出せることを示す。

【0144】

マロン酸塩脱離による合成鉱石浸出液からのＳｃ／Ｙ分離。図１３に描写された遊離のランモジュリンタンパク質及びマロン酸塩キレート化剤を用いた有望なＳｃ／Ｌｕ分離の結果を考慮して、ＲＥＥからの高純度のＳｃ分離を達成するマロン酸塩の有効性を試験した。ＬａｎＭ－カラムを、鉱石ベースの供給材料浸出溶液（例えば、ボーキサイト及びその廃棄物残留物、褐廉石、石炭及び石炭燃焼生成物；図２６）でローディングし、増加するマロン酸塩の濃度を使用して脱離に供した。データは、３０ｍＭのマロン酸塩が、ＲＥＥがローディングされたランモジュリンカラムから高い純度及び収率で（＞９９％純度；＞９９％収率）Ｓｃを分離するのに十分であることを示唆する（図２８）。図２５及び２７のデータに基づいて、後続のクエン酸塩脱離工程が、Ｙが富化された画分、ＭＲＥＥが富化された画分、及びＬａ／Ｃｅが富化された画分を得るために採用される可能性が十分ある。要約すると、これらのデータは、カルボキシレートを含有するキレート化剤などの脱着剤と連動した場合、高純度のＳｃ溶液を得るランモジュリンの能力を強調する。

【0145】

Ｓｃ分離のためのｐＨベースの脱離。ＲＥＥよりもＳｃへのランモジュリンの優先的な結合を考慮して、ｐＨを使用する脱離スキームを試験して、そのスキームがＳｃ分離に使用できるかどうかを決定した。これを試験するために、ＬａｎＭ－カラムを、典型的なＳｃを含有する鉱石ベースの供給材料浸出溶液（例えば、ボーキサイト及びその廃棄物残留物、褐廉石、石炭及びその得られた燃焼生成物）におけるＲＥＥ組成と類似した合成ＲＥＥ溶液でローディングした。ｐＨの段階的な減少を使用したところ、Ｓｃは、最後の画分に３０％の純度で溶出することが観察された（図２９）。不純物は、ＨＲＥＥというよりＬＲＥＥ及びＭＲＥＥであるため、キレート化剤（例えば、マロン酸塩又はクエン酸塩）を使用して、上述したロジック論理に従って、Ｓｃは後続の工程において高純度で容易に分離することができる。

【0146】

有機キレート化剤を使用したグループ分けしたＲＥＥの分離
上記で提示された差次的な脱離実験に基づいて（図７Ａ及び図１５Ａ～Ｂ）、軽／中／重ＲＥＥを分離するための有望な候補としてクエン酸塩を同定した。ＬＲＥＥ／ＭＲＥＥ／ＨＲＥＥ間の脱離ベースのＲＥＥ分離のための最も有効な戦略を決定するために、ＬａｎＭ－カラムを、典型的な鉱石ベースの供給材料浸出溶液におけるＲＥＥ組成と類似した合成ＲＥＥ溶液（図２４Ａ；ＬＲＥＥ（Ｌａ＋Ｃｅ）：ＭＲＥＥ（Ｐｒ－Ｇｄ）：ＨＲＥＥ（Ｙ、Ｔｂ－Ｌｕ）＝約５０％：２５％：２５％）でローディングし、段階的なクエン酸塩脱離スキームを採用した（図２４Ｂ）。ＬａｎＭは中及び軽ＲＥＥに対して類似の高親和性を有し、ＭＲＥＥとＬＲＥＥとの分離のためのｐＨベースの脱離勾配の使用を妨げる。ＬＲＥＥよりもＭＲＥＥへのクエン酸塩のより高い親和性を考慮して、クエン酸塩を使用する脱離スキームを試験して、そのスキームがＬＲＥＥ／ＭＲＥＥ／ＨＲＥＥを別々のグループに分離するのに使用できるかどうかを決定した。ＨＲＥＥは１５ｍＭのクエン酸塩を使用してＭＲＥＥ及びＬＲＥＥから選択的に分離でき、一方で２５～５０ｍＭのクエン酸塩濃度は、ＬＲＥＥからＭＲＥＥを効果的に分離できることが見出された。

【0147】

ＲＥＥ分離のための最適なクエン酸塩濃度を決定した後、追跡実験を実行して、段階的なクエン酸塩－ｐＨスキームを介したグループ分けしたＲＥＥ分離を実証した（図２５Ａ～Ｂ）。ＨＲＥＥは、１５ｍＭのクエン酸塩脱離工程を使用してほぼ定量的に高純度で脱離された（９３．６％のＨＲＥＥ純度）。その後、５０ｍＭのクエン酸塩工程は、ＭＲＥＥが富化された溶液を７０．７％の純度で生産した。最後に、非選択的なｐＨ１．５脱離工程は、残存するＲＥＥを脱離させ、濃縮されたＬａ／Ｃｅ溶液（９０．６％の純度）を生産した。この結果は、合成ＲＥＥ組成物（一次鉱石におけるものの代表である）から開始する場合、軽ＲＥＥ（Ｌａ及びＣｅ）は、単一のクエン酸塩ベースの脱離工程でＨＲＥＥ及びＭＲＥＥから効果的に枯渇させることができることを示唆する。したがって、ＬａｎＭベースのアプローチは、単一の吸着／脱離プロセスにおけるＲＥＥ対非ＲＥＥの分離（吸着工程）及びグループ分けしたＨＲＥＥ／ＭＲＥＥ／ＬＲＥＥの分離（脱離工程）を可能にする。

【0148】

この分離作用は、他の可溶性有機キレート化剤、例えばイミノ二酢酸（ＩＤＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、［Ｓ，Ｓ］－エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジグルタル酸（ＥＤＤＧ）などでも観察される可能性があると予想される。マロン酸塩及びＨＩＢＡなどのキレート化剤は、Ｓｃ及びＨＲＥＥ脱離には有効であるが、合理的な濃度でＬａｎＭと競合するには不十分なＭＲＥＥ親和性を有する。

【0149】

結論
以下の実施例は、ＲＥＥ選択的タンパク質キレート化剤を使用する、バイオマテリアルベースの、全て水性のＲＥＥ抽出及び分離プラットフォームを実証した。この概念は、持続可能なＲＥＥ生産と、一次ＲＥＥ資源への世界的な依存を最小化することとへの重要な一歩を象徴する。近年発見されたＲＥＥ結合タンパク質キレート化剤であるＬａｎＭを、生物学的に再生可能なアガロース支持体樹脂上に固定化して、フロースルーＲＥＥ抽出及び容易な再使用を可能にした。固定化ＬａｎＭは、その驚くべきＲＥＥ選択性を保持し、非ＲＥＥ不純物からのほぼ定量的なＲＥＥ分離を容易にした。逐次的なｐＨ勾配又は穏やかなキレート化剤処理に続いて、電子機器廃棄物回収にとって最も重要なＲＥＥ対である共に抽出されたＮｄ／Ｄｙを、フィード比率に応じて１又は２回の吸着／脱離サイクルの内に、高純度（９９．９％純度）まで分離した。研究からさらに、単一の吸着／脱離サイクルでの重及び軽ＲＥＥグループへのＲＥＥの抽出及び分離のためのＬａｎＭの適用が実証された。開示されたプロセスの先行技術を超える主な利点は、低グレードの供給材料浸出液との適合性、有機溶媒の欠如、カラム容量全体を使用しながら特定のＲＥＥの高純度での分離を達成する能力、酸性供給材料との適合性、第１の吸着工程中におけるＲＥＥへの高い選択性、下流プロセスの最小化を可能にすること、及び放射性不純物（例えば、Ｕ及びＴｈ）の濃縮がないことである。

【実施例2】

【0150】

炭素原子の経済性及びＬａｎＭカラムのローディング能力を改善すること
実施例１で論じられた通り、２：１の化学量論のＮｄとそれに対する固定化ＬａｎＭを観察した。興味深いことに、溶液中ではＬａｎＭは３当量のＲＥＥと結合することから、固定化のときに、又はカラム様式では１つの金属部位が不安定化されるが示唆される。この結果は、２：１の化学量論を乱すことなくタンパク質を短くできる（すなわち、非機能的な結合部位を除去することによって）可能性があることを示唆した。２：１の化学量論を乱すことなくタンパク質の長さを短くすることは、カラムへのＬａｎＭの全体的な固定化率を増加させ、結果としてカラムにローディングできるＲＥＥの量を増加させることができ、それによってＲＥＥ含有材料からのＲＥＥ分離の有効性を増加させることができる。

【0151】

ＬａｎＭのアミノ酸配列は、固定化ＬａｎＭのＲＥＥ：ＬａｎＭの化学量論を乱すことなく短くすることができる
ＬａｎＭの最初の４０アミノ酸の除去（すなわち配列番号１のＮ末端からの１９アミノ酸）は、分子量の１０％低減及びＲＥＥとＬａｎＭの２：１の化学量論を有する機能性タンパク質をもたらし（図１６Ａ及び１６Ｂ）、さらに、意外なことに、Ｄｙ／Ｌａ分離の見込みを改善した（図１６Ａ及び１６Ｂ）；Ｄｙは、ＬａｎＭ－Ｌａ複合体の解離を引き起こさないクエン酸塩濃度で、ＬａｎＭから完全に回収することができた。これは、ＬａｎＭΔ１－４０を使用する高純度のＭＲＥＥとＬＲＥＥとの分離の可能性（表１、配列番号２）を強調する。

【0152】

二重ＬａｎＭタンパク質
ＬａｎＭカラムのＲＥＥ吸着容量を増加させるために、二重ＬａｎＭコンストラクト（ＬａｎＭ－二重（２－１）と呼ばれる。表１、配列番号３）を作製し、ＲＥＥ結合の化学量論を試験した。化学量論は、溶液中、約４：１～５：１であるが（すなわち、ＬａｎＭ単位のうち１つにおける第３の結合部位が機能的と考えられる）、２：１という化学量論の固定化単一ＬａｎＭに基づくと、固定化する場合は４：１である可能性が高い（図１７Ａ～１７Ｃ）。ＬａｎＭ－二重タンパク質は、末端システインが追加され、後続の試験のためのアガロース樹脂に固定化されると予想される。重要なことに、二重ＬａｎＭのＮｄ／Ｄｙ解離特性はＷＴ ＬａｎＭと極めて類似していた（図１８）。これは、二重ＬａｎＭが、脱着剤としてクエン酸塩を使用してオンカラムでのＮｄからのＤｙ分離を可能にすることを示唆する。

【実施例3】

【0153】

３つのカラムローテーションスキームを使用することによる連続的なＨＲＥＥ／ＬＲＥＥ分離
以下の実施例は、図１９で示されるように３つのＬａｎＭカラムをローテーションで使用することによるＲＥＥ分離のための連続的な方法を説明する。このようなスキームは、分離サイクルを完了させるのに４つの工程（工程Ａ～Ｄ）を含み、高度に効率的な、高い収率のＲＥＥ分離（すなわち＞９９．９％の純度、＞９９％の収率を有する単一のＲＥＥ生成物）を可能にする。

【0154】

方法
エコノカラムガラスクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ；５ｃｍ×０．５ｃｍ）を、ＬａｎＭ－マイクロビーズを重量測定によって添加する前に、脱イオン水で充填した。カラムを２５ｍＭのＨＣｌ、脱イオン水で洗浄し、破過実験の前に脱イオン水で調整した。ＲＥＥフィード溶液（３９μＭのＡｌ、２．３μＭのＭｎ、３．１ｍＭのＦｅ、５４μＭのＣｏ、２．５μＭのＣｕ、５．６μＭのＺｎ、３４．９μＭのＰｒ、３７１μＭのＮｄ、及び２１．８μＭのＤｙ）を、バイオリキシビバントを使用することによって調製して、電子機器廃棄物（電子機器廃棄物）からＲＥＥを溶脱させた。フィードを０．５ｍＬ／分でカラムにポンプ注入し、流出液を１．０ｍＬで分取した。流出液中のＲＥＥ濃度をＩＣＰ－ＭＳによって決定した。

【0155】

結果及び議論
工程Ａにおいて、ＲＥＥ溶液、例えばｐＨ＞２．５の条件でのＮｄ及びＤｙは、カラムｉにポンプ注入され、流出液はカラムｉｉによって収集される。カラムｉの全容量に達する前に、ＮｄとＤｙの両方がカラムｉによって抽出され、これは、図２０で示される以前の破過実験（ベッド体積の１～１０倍量）によって裏付けられる。しかしながら、カラムｉが空になったら（ベッド体積の１０倍量の後に）、Ｄｙイオンが、ＬａｎＭのＨＲＥＥよりも高いＬＲＥＥ選択性のためにＮｄによって選択的に置き換えられると予想される。工程１は、カラムｉにおいて全てのＤｙイオンがＮｄイオンで置き換えられたときに終わらせ、カラムｉでのＮｄ富化が可能になると予想される。カラムｉｉでＤｙイオンが収集されることは注目すべきことである。工程Ｂにおいて、カラムｉにおいてこれまでに抽出されたＮｄは、低いｐＨ又は穏やかなキレート化剤のいずれかにより脱離されて、高純度のＮｄ（９９．９％）を回収し、それに続く吸着のためにカラムｉを再生することになる。その間、カラムｉｉ及びカラムｉｉｉを直列に接続して、カラムｉｉが完全にＮｄでローディングされるまで、カラムｉｉでのＮｄ富化とカラムｉｉｉでのＤｙ富化を反復する。工程Ｃにおいて、同じ脱離及びＮｄ／Ｄｙ富化プロセスは、カラムの順番をローテーションして工程Ｂで記載されたように繰り返される。工程Ｄにおいて、Ｄｙ及びＮｄがそれぞれ回収されると予想される。次いで工程Ａは、新しい分離サイクルを開始するために繰り返されると予想される。注目すべきことに、このプロセスは、カラムｉｖが追加される場合、完全に連続的であってもよく、この場合、Ｄｙがローディングされたカラムは独立してＤｙ脱離を実行するためにカラムｉｖと交換されてもよく、そのＤｙ脱離は、Ｎｄ／Ｄｙ比率に応じてより低い頻度で実行されてもよい。

【0156】

前述のことから、本発明の具体的な実施形態は例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による限定を除き、限定されない。

【0157】

参考文献

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29-1】

【図29-2】

【図30】

【配列表】

2024520862000001.app

【国際調査報告】