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特表2024-520906リンパ球除去療法後の二次的自己免疫に関する新規予測バイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-27
(54)【発明の名称】リンパ球除去療法後の二次的自己免疫に関する新規予測バイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/49 20060101AFI20240520BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240520BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240520BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240520BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240520BHJP
【ＦＩ】
G01N33/49 X
A61K45/00
A61P37/06
A61P25/00
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023569824
(86)(22)【出願日】2022-05-13
(85)【翻訳文提出日】2023-12-21
(86)【国際出願番号】 US2022029262
(87)【国際公開番号】W WO2022241259
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】63/188,302
(32)【優先日】2021-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500034653
【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ダレン・フィリップ・ベイカー
(72)【発明者】
【氏名】エマヌエーレ・デ・リナルディス
(72)【発明者】
【氏名】リチャ・ハナームサガー
(72)【発明者】
【氏名】エヴィス・ハヴァリ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァージニア・サヴォヴァ
(72)【発明者】
【氏名】シュリーニヴァス・シャンカラ
【テーマコード（参考）】
2G045
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA24
4C084AA17
4C084NA20
4C084ZB081
4C084ZB082
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
(57)【要約】
本発明は、リンパ球除去療法（例えば、抗ＣＤ５２抗体療法）後の原発性自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者において、患者からの生体試料における、全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）と呼ばれる新規細胞型の比率、および／または幼若血小板比率（ＩＰＦ）値に基づいて、二次的自己免疫のリスクを評価する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リンパ球除去療法後に原発性自己免疫疾患を有する患者において、二次的自己免疫を発症するリスクを評価する方法であって：ａ）患者から血液試料を採取することと、
ｂ）（ｉ）血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣの比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することを含む、前記方法。
【請求項2】
原発性自己免疫疾患の患者を治療する方法であって：ａ）リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高まらないと診断された患者を選択することであって、前記リスクは、
（ｉ）患者からの血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣの比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することによって診断されたことと、
ｂ）治療有効量のリンパ球除去療法を患者に投与こと
を含む方法。
【請求項3】
前記決定する工程は、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
原発性自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
リンパ球除去療法は、リンパ球除去抗体療法である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記抗体は、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合部分である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブの６つのＣＤＲを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブである、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
第１および第２の基準は、リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症しない前記原発性自己免疫疾患の患者、または健康な被験者から得られる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
血液試料は、赤血球が溶解した血液試料である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
血液試料は、末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）試料であり、場合により試料中の好中球が除去されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ＰＬＣ比率は、対照被験者の比率と比較して２標準偏差を超えて減少する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
ＩＰＦ値は、対照被験者の値と比較して２標準偏差を超えて増加する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ＰＬＣは、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＳＰＡＲＣ＋ＴＲＥＭＬ１＋であることを特徴とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
患者からの生体試料中の全ＰＬＣ集団のうち幼若ＰＬＣの比率を決定する工程をさらに含み、第３の基準と比較した幼若ＰＬＣの比率の増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記幼若ＰＬＣは、ＣＤ４１低ＣＤ６１低ＰＤＧＦＡ高ＰＤＣＤ１０高であり、場合によりさらにＤＡＢ２高ＲＧＳ１０高ＲＧＳ１８高ＴＳＣ２２Ｄ１高であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
第３の基準は、リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症しない前記原発性自己免疫疾患の患者、または健康な被験者から得られる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
二次的自己免疫は、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、バセドウ病、橋本病、グッドパスチャー病、膜性糸球体腎炎、赤血球無形成、自己免疫性甲状腺疾患、一過性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、１型糖尿病、円形脱毛症／全身脱毛症、白斑、筋痛症、サルコイドーシス、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性肝炎、および自己免疫性リンパ球減少症からなる群から選択される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
原発性自己免疫疾患は、再発性ＭＳである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
原発性自己免疫疾患は、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲ－ＭＳ）である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
原発性自己免疫疾患は、二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
患者における原発性自己免疫疾患の治療に使用するためのリンパ球除去療法であって、患者は、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高まっていないものとして選択されており、前記リスクは、（ｉ）患者からの血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣの比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することによって診断された、リンパ球除去療法。
【請求項24】
患者における原発性自己免疫疾患を治療するための医薬品の製造におけるリンパ球除去療法の使用であって、患者は、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高まっていないものとして選択されており、前記リスクは、（ｉ）患者からの血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣの比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することによって診断された、前記使用。
【請求項25】
前記治療および／または前記選択は、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法に従っている、請求項２３に記載の使用または請求項２４に記載の使用のためのリンパ球除去療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１８８，３０２号からの優先権を主張するものである。その優先権出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／１８８，３０２号からの優先権を主張するものである。その優先権出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系を侵す、免疫介在性の慢性炎症性神経変性疾患である。炎症、脱髄、ならびに軸索の損傷および喪失に起因する運動機能および感覚機能の喪失が特徴である（非特許文献１、非特許文献２）。ＭＳ患者は、病気の進行に伴い、身体障害、疲労、疼痛、および認知機能障害が増加し、幅広い重篤な臨床症状を示す。ＭＳは全世界で２００万人以上が罹患しており、男性より女性の方が少なくとも２～３倍多い。ＭＳは患者のＱＯＬに大きな影響を与え、平均で５年から１０年余命を縮める。
【0003】
ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体であるアレムツズマブは、再発型ＭＳ（ＲＭＳ）の治療薬として承認されている。その有効性は臨床試験で証明されているが、その使用は、治療後数か月あるいは数年たって現れる予測不可能な非ＭＳの二次的自己免疫と関連している。アレムツズマブ治療患者のおよそ４０％が自己免疫性甲状腺イベントを呈し、２％が血小板欠乏症（免疫性血小板減少症；ＩＴＰ）（非特許文献３）であり、０．３４％が自己免疫性腎症（非特許文献４）である。二次的自己免疫の予測バイオマーカーがないため、臨床診療では、これらの自己免疫イベントを早期に発見するために、医薬品リスク管理計画またはリスク評価・リスク緩和戦略（ＲＭＰ／ＲＥＭＳ）を実施し、注意深くモニタリングする必要がある。
【0004】
したがって、アレムツズマブのようなリンパ球除去療法による治療を検討している患者において、二次的自己免疫の発症リスクを予測するための新規バイオマーカーを同定する必要性が満たされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｆｒｉｅｓｅら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１４年）１０（４）：２２５－３８
【非特許文献2】ＴｒａｐｐおよびＮａｖｅ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００８年）２３１：２４７－６９
【非特許文献3】Ｃｕｋｅｒら、Ｍｕｌｔ Ｓｃｌｅｒ Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ Ｅｎｇｌ．（２０２０年）２６：４８－５６
【非特許文献4】Ｐｈｅｌｐｓら、Ｍｕｌｔ Ｓｃｌｅｒ Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ Ｅｎｇｌ．（２０１９年）２５：１２７３－８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本開示は、ＭＳのような自己免疫疾患の治療におけるリスク管理を改善するための、新規かつ有用な方法を提供する。本方法は、二次的自己免疫のような治療副作用を軽減し、医療提供者および患者が自己免疫疾患治療のための治療計画を選択し、治療後のモニタリングを行う際に役立つ。本開示の方法は、ＭＳ患者において、リンパ球除去療法（例えば、アレムツズマブ療法）の前であっても検出される低含有量の血小板系細胞（ＰＬＣ）および／または幼若血小板比率（ＩＰＦ）の高値が、療法後に二次的自己免疫を発症するリスクの増大と相関するという発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一態様では、本開示は、リンパ球除去療法後に原発性自己免疫疾患を有する患者において二次的自己免疫を発症するリスクを評価する方法であって：
ａ）患者から血液試料を採取することと、
ｂ）（ｉ）血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することを含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定することを含む。
ａ）患者から血液試料を採取することと、
ｂ）（ｉ）血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率
を決定することを含む、前記方法を提供する。
特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定することを含む。
【0008】
別の態様では、本開示は、原発性自己免疫疾患を有する患者を治療するための方法であって：
ａ）リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高まらないと診断された患者を選択することであって、そのリスクは、
（ｉ）血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まり示す、比率
を決定することによって診断されたことと、
ｂ）治療有効量のリンパ球除去療法を患者に投与すること
を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定することを含む。
ａ）リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高まらないと診断された患者を選択することであって、そのリスクは、
（ｉ）血液試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、第１の基準と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まりを示す、比率、および／または
（ｉｉ）血液試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、第２の基準と比較したＩＰＦの増加は、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクの高まり示す、比率
を決定することによって診断されたことと、
ｂ）治療有効量のリンパ球除去療法を患者に投与すること
を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本方法は、（ｉ）および（ｉｉ）の両方を決定することを含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、原発性自己免疫疾患は多発性硬化症（ＭＳ）である。特定の実施形態では、原発性自己免疫疾患は、再発性ＭＳ、再発寛解型ＭＳ（ＲＲ－ＭＳ）、または二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）である。
【0010】
いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法は、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合部分などのリンパ球除去抗体療法である。特定の実施形態では、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブの６つのＣＤＲを有する。特定の実施形態では、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する。特定の実施形態では、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブである。
【0011】
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、第１および第２の基準は、リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症しない当該原発性自己免疫疾患の患者から、または健康な被験者から得られる。
【0012】
いくつかの実施形態では、血液試料は赤血球が溶解した血液試料である。いくつかの実施形態では、血液試料は末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）試料である（例えば、試料中の好中球は除去されている）。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＰＬＣ比率は対照被験者の比率と比較して２標準偏差を超えて減少する。いくつかの実施形態では、ＩＰＦ値は対照被験者の値と比較して２標準偏差を超えて減少する。
【0014】
いくつかの実施形態では、ＰＬＣはＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＳＰＡＲＣ＋ＴＲＥＭＬ１＋であることを特徴とする。
【0015】
本開示の方法は、患者からの生体試料中の全ＰＬＣ集団のうち幼若ＰＬＣの比率を決定する工程をさらに含むことができ、第３の基準と比較して幼若ＰＬＣの比率が増加することは、治療後に患者が二次的自己免疫を発症するリスクが高まることを示している。いくつかの実施形態では、幼若ＰＬＣはＣＤ４１低ＣＤ６１低ＰＤＧＦＡ高ＰＤＣＤ１０高であり、場合によりさらにＤＡＢ２高ＲＧＳ１０高ＲＧＳ１８高ＴＳＣ２２Ｄ１高であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、第３の基準は、リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症しない当該原発性自己免疫疾患の患者から、または健康な被験者から得られる。
【0016】
いくつかの実施形態では、二次的自己免疫は、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、バセドウ病、橋本病、グッドパスチャー病（抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）病）、膜性糸球体腎炎（膜性腎症）、赤血球無形成、自己免疫性甲状腺疾患、一過性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、１型糖尿病、円形脱毛症／全身脱毛症、白斑、筋痛症、サルコイドーシス、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性肝炎、および自己免疫性リンパ球減少症からなる群から選択される。
【0017】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すものではあるが、限定ではなく例示のためにのみ与えられるものであることを理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】すべての主要な免疫細胞型（Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）、ならびに希少細胞型（形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、および血小板様細胞）の相対的存在量を示す棒グラフ、ならびに血小板様細胞が、二次的自己免疫を発症する患者と比較して、二次的自己免疫を発症しない患者において有意に濃縮されていることを示す散布図である（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；スチューデントｔ検定 ＊＊ｐ＜０．０１）。実線の円は二次的自己免疫を発症した患者から採取した試料を表し；実線の四角形は二次的自己免疫を発症しなかった患者から採取した試料を表す。
【図2】二次的自己免疫を発症した患者（ｓＡＩ）と二次的自己免疫を発症しなかった患者（非ｓＡＩ）における、アレムツズマブ治療前後のｓｃ－ＲＮＡｓｅｑデータに基づく個々の患者におけるＰＬＣ存在量を示す散布図である。大きな四角形で表された非ｓＡＩ患者は、Ｔ２４（第１クールの２４か月後）でＰＬＣ数の減少を示し、追跡期間４年から７年の間にｓＡＩを発症した。
【図3】Ｔ０（治療前）とＴ２４（アレムツズマブの第１クールの２４か月後）の両時点で、二次的自己免疫を発症していない患者において血小板系細胞（ＰＬＣ）が濃縮されていることを示す散布図である（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；二元配置分散分析、ＡＩ状態の全体的効果 ＊＊ｐ＜０．０１）。実線の円は二次的自己免疫を発症した患者から採取した試料を表し；実線の四角形は二次的自己免疫を発症しなかった患者から採取した試料を表す。
【図4-1】ＳＰＡＲＣ、ＴＲＥＭＬ１、ＧＰ９、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＡ２Ｂ、およびＧＰ１Ｂの遺伝子発現レベルを示す散布図とそれに付随するＳＰＲＩＮＧプロットを示す図である（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ；シダックの多重比較検定による二元配置分散分析 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊ｐ＜０．００１）。実線の円は二次的自己免疫を発症した患者から採取した試料を表し；実線の四角形は二次的自己免疫を発症しなかった患者から採取した試料を表す。
【図5】フローサイトメトリーによる全血、新鮮ＰＢＭＣ、および凍結ＰＢＭＣ中の血小板の割合を示す棒グラフである（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図6】フローサイトメトリーによる全血、新鮮ＰＢＭＣ、および凍結ＰＢＭＣ中のＰＬＣの割合を示す棒グラフである（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図7】１）ＴＲＥＭＬ１高ＳＰＡＲＣ＋または２）ＴＲＥＭＬ１低ＳＰＡＲＣ＋である細胞のうち、ＲＢＣが溶解した血液、新鮮ＰＢＭＣ、および凍結ＰＢＭＣ中のＰＬＣの割合を定量化した棒グラフである。
【図8】サブセット１（幼若／休止トランスクリプトーム状態）またはサブセット２（成熟／活性化トランスクリプトーム状態）に属するｓＡＩ群および非ｓＡＩ群内の細胞の割合を示す棒グラフである。
【図9A】アレムツズマブ治療前のＭＳ患者に由来する１６１のベースライン試料からのＲＮＡｓｅｑデータの教師なしクラスタリング解析を示すヒートマップである。図９Ａは、二次的自己免疫を発症した患者（「ＡＩ濃縮患者」、左）と二次的自己免疫を発症しなかった患者（「非ＡＩ濃縮患者」、右）における、６つの成熟ＰＬＣ遺伝子（ＧＰ１ＢＡ、ＰＰＢＰ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＳＰＡＲＣ、およびＴＲＥＭＬ１）と５つの幼若ＰＬＣ遺伝子（ＰＤＣＤ１０、ＲＧＳ１０、ＤＡＢ２、ＴＳＣ２２Ｄ１、およびＲＧＳ１８）の相対発現レベルを示している。図９Ｂは、図９Ａと同じヒートマップを示し、さらにヒートマップの下部に甲状腺活動、人種、および性別などの患者の特徴に関する情報を示している。
【図9B】アレムツズマブ治療前のＭＳ患者に由来する１６１のベースライン試料からのＲＮＡｓｅｑデータの教師なしクラスタリング解析を示すヒートマップである。図９Ａは、二次的自己免疫を発症した患者（「ＡＩ濃縮患者」、左）と二次的自己免疫を発症しなかった患者（「非ＡＩ濃縮患者」、右）における、６つの成熟ＰＬＣ遺伝子（ＧＰ１ＢＡ、ＰＰＢＰ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＳＰＡＲＣ、およびＴＲＥＭＬ１）と５つの幼若ＰＬＣ遺伝子（ＰＤＣＤ１０、ＲＧＳ１０、ＤＡＢ２、ＴＳＣ２２Ｄ１、およびＲＧＳ１８）の相対発現レベルを示している。図９Ｂは、図９Ａと同じヒートマップを示し、さらにヒートマップの下部に甲状腺活動、人種、および性別などの患者の特徴に関する情報を示している。
【図10A】異なるサンプリング時間（０か月、１２か月、および２４か月）における図９Ａおよび９Ｂに示した特定の遺伝子の発現レベルを示すプロットであり、成熟ＰＬＣ遺伝子を図１０Ａに示し、幼若ＰＬＣを１０Ｂに示している。二次的自己免疫を発症した患者（「ＡＩ」、上）および二次的自己免疫を発症しなかった患者（「非ＡＩ」、下）のデータを示す。
【図10B】異なるサンプリング時間（０か月、１２か月、および２４か月）における図９Ａおよび９Ｂに示した特定の遺伝子の発現レベルを示すプロットであり、成熟ＰＬＣ遺伝子を図１０Ａに示し、幼若ＰＬＣを１０Ｂに示している。二次的自己免疫を発症した患者（「ＡＩ」、上）および二次的自己免疫を発症しなかった患者（「非ＡＩ」、下）のデータを示す。
【図11】ＭＳ患者ベースライン試料からのＲＮＡｓｅｑデータの教師なしクラスタリング解析を示すヒートマップであり、患者の一部はＩＦＮβ－１ａで治療されている。図９Ａおよび９Ｂに示したものと同じ成熟ＰＬＣ遺伝子および幼若ＰＬＣ遺伝子についてのデータを提供する。「ＡＩ」：二次的自己免疫を発症した患者。「非ＡＩ」：二次的自己免疫を発症しなかった患者。
【図12A】二次的自己免疫を発症した患者（ｓＡＩ；実線の円）および二次的自己免疫を発症していない患者（非ｓＡＩ；実線の四角形）におけるＴ０（ベースライン）での幼若血小板比率（ＩＰＦ）臨床値の箱ひげプロットであり；正常範囲は赤色の括弧で示されている（エラーバーは１０～９０パーセンタイルの範囲にまたがる）。
【図12B】二次的自己免疫を発症する患者（ｓＡＩ；実線の円）と二次的自己免疫を発症しない患者（非ｓＡＩ；実線の四角形）におけるＩＰＦ臨床値の経時的変化（０～２４か月）を示すプロットである（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；二元配置分散分析、全体的なｓＡＩ状態の差 ＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【図13】Ｔ０（ベースライン）における、二次的自己免疫を発症する患者（ｓＡＩ；実線の円）と二次的自己免疫を発症しない患者（非ｓＡＩ；実線の四角形）のＩＰＦ臨床値と単一細胞データからのＰＬＣの割合の相関グラフである。左：ＩＰＦ値のみ、またはＩＰＦ値とＰＬＣ値の割合のいずれかに基づく、今回のコホート内の患者の真のｓＡＩおよび真の非ｓＡＩ同定の事後解析。右：所定の患者コホートでの治療前のＡＩ状態の同定における臨床ＩＰＦ値と単一細胞ＰＬＣデータの組み合わせ使用の表図。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本開示は、リンパ球除去療法後の原発性自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）を有する患者における二次的自己免疫の発症は、リンパ球除去前であっても、対照被験者と比較して、血小板系細胞（ＰＬＣ）の存在量が低いこと、および／または幼若血小板比率（ＩＰＦ）の値が高いことと関連するという発見に基づいている。対照被験者は、例えば、健康な被験者、またはリンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症しない原発性自己免疫疾患の患者であることができる。したがって、ＰＬＣの比率の減少および／またはＩＰＦの増加は、リンパ球除去後の二次的自己免疫の発生リスクを評価するための予測バイオマーカーとなる。
【0020】
上記の知見に基づき、本開示は、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）による治療などのリンパ球除去療法を検討する際に、原発性自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）を有する患者のリスク管理を改善する方法を提供する。例えば、ＭＳ患者が療法後に二次的自己免疫を発症するリスクが高いか高くないかを医療提供者が判断できるようにすることで、医療提供者は、患者が療法を受けるべきか（例えば、患者のリスクが増大していない場合）、あるいは患者が療法を受けるべきではないか、療法後に二次的自己免疫のモニタリングを強化すべきか（例えば、患者がリスクを高めている場合）を判断することができる。
【0021】
例えば、本開示は、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大する原発性自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）を有する患者において、二次的自己免疫を発症するリスクを評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、リスクが増大しないと評価された患者をリンパ球除去療法で治療する。いくつかの実施形態では、リスクが増大すると評価された患者をリンパ球除去療法で治療しない。いくつかの実施形態では、リスクが増大すると評価された患者はリンパ球除去療法を受け、その後、リスクが増大しないと評価された患者と比較して、モニタリングを強化される。
【0022】
本開示はまた、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大しない原発性自己免疫疾患を有する患者（例えば、ＭＳ患者）を治療するための方法を提供する。
【0023】
本開示はまた、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大する原発性自己免疫疾患を有する患者（例えば、ＭＳ患者）を治療する方法であって、療法後に（リスクが増大しない患者に対するモニタリングと比較して）二次的自己免疫の発症に対するモニタリングを強化する方法を提供する。このようなモニタリングの強化は、リンパ球除去療法後に医療提供者が決定する適切なモニタリング計画に従うことができる。リスクのある患者に対する適切なモニタリング計画は、限定されるものではないが、例えば１週間、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、または１年の間隔で、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫についてより頻繁にモニタリングすることを含むことができる。例えば、１年超、２年超、３年超、４年超、５年超、またはそれより長く、長期間にわたってモニタリングを続けることができ、これは、患者によっては、リンパ球除去療法後１年以上経過するまで、二次的自己免疫が認められないことがあるからである。また、二次的自己免疫の徴候がないか、専門医による綿密な医学的検査（血液検査など）を行うなど、モニタリングを強化する必要がある場合もある。さらに、ＭＳの治療のためにリンパ球除去薬を患者に配布する薬剤師または臨床スタッフは、患者がＰＬＣレベルの低下および／またはＩＰＦ値の上昇（場合により幼若ＰＬＣレベルの上昇を伴う）を示した場合、薬剤使用後に二次的自己免疫を発症するリスクが増大することについて患者にカウンセリングを行うことが求められる可能性がある。また、薬剤師または臨床スタッフは、患者に薬剤を配布する前に、患者からインフォームド・コンセントを得ることが求められる場合もある。
【0024】
Ｉ．リスク評価の方法
自己免疫疾患（例えばＭＳ）患者が、リンパ球除去後に二次的自己免疫を発症するリスクは、以下を判定することによって評価することができる：
ｉ）患者からの生体（例えば、血液）試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、対照被験者と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少がリスクの上昇を示す、比率；および／または
ｉｉ）生体試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、対照被験者と比較したＩＰＦの増加は、リスクの高まりを示す、比率。
自己免疫疾患（例えばＭＳ）患者が、リンパ球除去後に二次的自己免疫を発症するリスクは、以下を判定することによって評価することができる：
ｉ）患者からの生体（例えば、血液）試料の全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率であって、対照被験者と比較したＰＬＣ（例えば、成熟ＰＬＣ）の比率の減少がリスクの上昇を示す、比率；および／または
ｉｉ）生体試料中の幼若血小板比率（ＩＰＦ）であって、対照被験者と比較したＩＰＦの増加は、リスクの高まりを示す、比率。
【0025】
いくつかの実施形態では、リスクはｉ）（および場合によりｉｉ））、さらにｉｉｉ）生体試料中の全ＰＬＣ集団中の幼若ＰＬＣの比率を決定することによって評価され、対照被験者と比較して幼若ＰＬＣの比率が増加することは、リスクが高まることを示している。いくつかの実施形態では、リスクはｉｉｉ）、またはｉｉ）およびｉｉｉ）を決定することによって評価される。
【0026】
いくつかの実施形態では、リスクは、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、またはそれらの任意の組み合わせを決定し、さらにｉｖ）生体試料中の成熟血小板または活性化血小板に対する抗体の存在について試験することによって評価され、対照被験者と比較して抗（成熟／活性化）血小板抗体が増加することは、リスクが高まることを示している。いくつかの実施形態では、リスクはｉｖ）を決定することによって評価される。
【0027】
特定の実施形態では、患者から得られた生体試料は、血液（例えば、全血、新鮮に単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または凍結ＰＢＭＣ）、血清、血漿、尿、唾液、リンパ液、または脳脊髄液などの体液試料である。特定の実施形態では、生体試料は、赤血球（ＲＮＡ）が溶解した血液である。
【0028】
特定の実施形態では、治療後に二次的自己免疫を発症した患者における相対的ＰＬＣ存在量、ＩＰＦ値、および／または幼若ＰＬＣ比率は、対照被験者、例えば健康な被験者を基準としている。この文脈での健康な被験者とは、自己免疫疾患のない（例えば、自己免疫疾患の検出可能な症状のない）人を含め、既知の炎症性状態のない人のことである。いくつかの実施形態では、健康な被験者はリンパ球減少症ではない。いくつかの実施形態では、対照被験者は、リンパ球除去後に二次的自己免疫を発症しない自己免疫疾患患者である。
【0029】
自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者由来の生体試料中の相対的ＰＬＣ存在量、ＩＰＦ値、および／または幼若ＰＬＣ比率に関する情報を得ることは、その患者の治療および治療後のモニタリング計画を選択する上で有用である。リンパ球除去療法の前に情報を得ることができれば、療法後に二次的自己免疫を発症する相対的リスクを患者に知らせることができ、それに応じて治療を決定することができる。また、「リスクがある」と分類された患者には、治療後のモニタリングを強化する必要性、例えば、専門医によるより頻繁でより綿密な検査の必要性を伝えることもできる。したがって、この情報は自己免疫疾患の治療における（医師、薬剤師、および患者による）リスク管理を改善する。リンパ球除去治療中または治療後の情報を得ることも、二次的自己免疫の発症をモニタリングし、治療を決定するのに有用である可能性がある。
【0030】
Ａ．血小板系細胞
血小板系細胞（ＰＬＣ）は、血小板に強く類似しているが、そのより大きいサイズ、粒状性、および転写産物含量において血小板とは異なる、新規で稀な血小板様細胞型である。ＰＬＣは、ＣＤ４１およびＣＤ６１のような古典的な血小板マーカーを発現している他、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ Ｒｉｃｈ ｉｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）およびＴＲＥＭＬ１（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｌｉｋｅ １）など、血小板と高いレベルで普遍的には結合していない追加の表面マーカーも発現している。
血小板系細胞（ＰＬＣ）は、血小板に強く類似しているが、そのより大きいサイズ、粒状性、および転写産物含量において血小板とは異なる、新規で稀な血小板様細胞型である。ＰＬＣは、ＣＤ４１およびＣＤ６１のような古典的な血小板マーカーを発現している他、ＳＰＡＲＣ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ Ｒｉｃｈ ｉｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）およびＴＲＥＭＬ１（Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｌｉｋｅ １）など、血小板と高いレベルで普遍的には結合していない追加の表面マーカーも発現している。
【0031】
以下の実施例で詳述するように、ＰＬＣはいくつかのマーカーの発現が異なる２つの異なるサブセットを含むことが見出された。第１のサブセット（サブセット１）は、血小板マーカーの発現がより低く、血小板由来増殖因子サブユニットＡ（ＰＤＧＦＡ）、抑制マーカー（例えば、プログラム細胞死１０（ＰＤＣＤ１０））、および核タンパク質（例えば、ＤＡＢ２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１８、およびＴＳＣ２２Ｄ１）の発現がより高いことが特徴である。第２のサブセット（サブセット２）は、アクチン遺伝子ＡＣＴＢおよびＡＣＴＧ１、ならびに好中球の強力な化学誘引および活性化因子である血小板由来増殖因子ＰＰＢＰの発現が比較的高い。第２のサブセットはまた、ＳＰＡＲＣ遺伝子およびＴＲＥＭＬ１遺伝子の発現も豊富である。サブセット１には、治療後に二次的自己免疫を発症した患者のほとんどのＰＬＣが含まれる。本発明者らはさらに、２つのサブセットの間には成熟度と活性化状態に違いがあり、サブセット１は幼若ＰＬＣまたは休止状態のＰＬＣ（治療後の二次的自己免疫を呈する患者に豊富）を表し、サブセット２は成熟ＰＬＣまたは活性化ＰＬＣを表すことを発見した。
【0032】
したがって、ＰＬＣは、特定の細胞表面マーカーの発現に基づいて同定することができる。いくつかの実施形態では、ＰＬＣは、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＳＰＡＲＣ、および／またはＴＲＥＭＬ１の同時発現（例えば、ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＳＰＡＲＣ＋ＴＲＥＭＬ１＋）に基づいて同定することができる。特定の実施形態では、成熟ＰＬＣまたは活性化ＰＬＣは、ＭＹＬ９、ＣＬＵ、ＰＰＢＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＲＥＭＬ１、ＡＣＴＢ、ＮＣＯＡ４、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＡＰ００１１８９．４、Ｆ１３Ａ１、ＰＡＲＶＢ、ＡＬＯＸ１２、ＲＢＰＭＳ２、ＰＶＡＬＢ、ＰＦ４Ｖ１、ＡＲＰＣ１Ｂ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＰＫＭ、ＴＡＧＬＮ２、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＨＬＡ．Ｅ、ＦＥＲＭＴ３、ＬＴＢＰ１、ＧＳＮ、ＣＤ９、Ｃ６ｏｒｆ２５、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＳＥＲＦ２、およびＣ１９ｏｒｆ３３の任意の組み合わせの同時発現に基づいて同定することができる。特定の実施形態では、成熟ＰＬＣまたは活性化ＰＬＣは、ＧＰ１ＢＡ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＰＰＢＰ、ＳＰＡＲＣ、および／またはＴＲＥＭＬ１の同時発現、例えば、当該マーカーのうち任意の２、３、４、５、６、７、または８種すべての組み合わせ（例えば、ＡＣＴＢ高ＡＣＴＧ１高ＰＰＢＰ高ＳＰＡＲＣ高ＴＲＥＭＬ１高）の同時発現に基づいて同定される。特定の実施形態では、幼若ＰＬＣまたは休止状態のＰＬＣは、ＲＧＳ１８、ＡＣＲＢＰ、ＰＴＣＲＡ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＭＹＬ４、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ、ＴＭＥＭ４０、ＳＬＣ４０Ａ１、ＳＭＩＭ５、ＴＡＬ１、ＰＥＧＦＡ、ＦＡＭ１１０Ａ、ＴＨＥＭ５、ＡＲＨＧＡＰ６、ＮＦＥ２、ＭＭＤ、ＮＥＸＮ、ＳＣＧＢ１Ｃ１、ＤＮＭ３、ＧＰ６、ＧＦＩ１Ｂ、ＬＩＭＳ１、ＧＳＴＯ１、ＤＡＢ２、ＥＲＶ３．１、ＥＬＯＶＬ７、およびＬＣＮ２の任意の組み合わせの同時発現に基づいて同定することができる。特定の実施形態では、幼若ＰＬＣまたは休止状態のＰＬＣは、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＣＤ１０、ＤＡＢ２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１８、および／またはＴＳＣ２２Ｄ１の同時発現、例えば、当該マーカーのうち任意の２、３、４、５、または６種すべての組み合わせ（例えば、ＤＡＢ２高ＲＧＳ１０高ＲＧＳ１８高ＴＳＣ２２Ｄ１高）の同時発現に基づいて同定することができる。例えば、幼若ＰＬＣは、ＣＤ４１低ＣＤ６１低ＰＤＧＦＡ高ＰＤＣＤ１０高であると特徴付けることができる。
【0033】
本開示の方法では、相対的ＰＬＣ存在量（全細胞中のＰＬＣ、例えば成熟ＰＬＣの比率）は、当業者に周知の多くの技法で測定することができる。いくつかの実施形態では、生体試料が被験者から得られ、試料中の相対的ＰＬＣ存在量が、ＲＮＡ含有細胞の検出に適した任意の方法またはアッセイによって測定される。特定の実施形態では、相対的ＰＬＣ存在量は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイなどのフローサイトメトリー分析（例えば、高次元フローサイトメトリー分析）、またはｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）を使用して測定される。特定の他の実施形態では、相対的ＰＬＣ存在量は、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して測定される。特定の実施形態では、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは液滴ベースのパラレルｓｃＲＮＡ－ｓｅｑである。
【0034】
いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法（例えば、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体療法）後に二次的自己免疫を発症するリスクが増大する自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者は、対照被験者と比較して、生体試料（例えば、血液）中の全細胞のうちＰＬＣの比率が減少しており、ＰＬＣの比率は、対照被験者の比率と比較して、＞１．５、＞２、＞３、＞４、または＞５（例えば、＞２）の標準偏差で減少している。
【0035】
いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法（例えば、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体療法）後に二次的自己免疫を発症するリスクが増大する自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者は、対照被験者と比較して、生体試料（例えば、血液）中の全ＰＬＣのうち幼若ＰＬＣの比率が増加しており、幼若ＰＬＣの比率は、対照被験者の比率と比較して、＞１．５、＞２、＞３、＞４、または＞５（例えば、＞２）の標準偏差で増加している。
【0036】
特定の統計解析を適用して、試験試料中の相対的ＰＬＣ存在量または幼若ＰＬＣ比率が基準レベル（例えば、対照被験者からのもの）と有意に異なるかどうかを判定することができる。このような統計解析は当業者には周知であり、パラメトリック（例えば、両側スチューデントのｔ検定）またはノンパラメトリック（例えば、ウィルコクソン・マン・ホイットニーのＵ検定）検定が挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
Ｂ．幼若血小板比率（ＩＰＦ）
リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症した自己免疫疾患患者は、治療後に二次的自己免疫を発症しない患者とは、血小板成熟度の臨床的指標が異なる可能性がある。具体的には、本発明者らは、アレムツズマブ治療後に甲状腺自己免疫を発症した患者は、甲状腺自己免疫を発症しない患者と比較して、治療前の幼若血小板比率（ＩＰＦ）値が有意に高いことを発見した。
リンパ球除去治療後に二次的自己免疫を発症した自己免疫疾患患者は、治療後に二次的自己免疫を発症しない患者とは、血小板成熟度の臨床的指標が異なる可能性がある。具体的には、本発明者らは、アレムツズマブ治療後に甲状腺自己免疫を発症した患者は、甲状腺自己免疫を発症しない患者と比較して、治療前の幼若血小板比率（ＩＰＦ）値が有意に高いことを発見した。
【0038】
ＩＰＦは、ＲＮＡを依然として保持している循環血小板の比率を反映している。ＩＰＦは末梢血中の若い網状血小板を測定するパラメータである。急激な血小板破壊が観察される状況では、ＩＰＦは通常高値になる。
【0039】
本開示の方法では、ＩＰＦは、当業者に周知の多くの技法で測定することができる。ＩＰＦは通常、フローサイトメトリー（高次元フローサイトメトリーなど）または血液学的分析によって測定される。例えば、幼若血小板の残存ＲＮＡ量はチアゾールオレンジ（ＴＯ）などの色素で容易に染色でき、ＩＰＦはフローサイトメトリーで測定できる。あるいは、自動血液システムの網状赤血球／光学的血小板チャネルで行われる光学的蛍光法を使用してＩＰＦを定量することもできる。この方法では、ポリメチン蛍光色素を使用して網状細胞、血小板膜、および顆粒のＲＮＡ／ＤＮＡを染色する。この方法では、網状赤血球、赤血球、および蛍光血小板を同時に計数することができる。ＩＰＦを定量化する他の方法としては、例えば、生体（例えば末梢血）試料中のＩＰＦの特異的トランスクリプトームシグネチャ、および／または生体（例えば全血）試料中のＩＰＦ濃縮細胞集団を探すこと；あるいはｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）が挙げられる。
【0040】
したがって、いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法後に二次的自己免疫を発症する自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者のリスクを評価するための本明細書に記載の任意の方法は、患者からの生体試料中のＩＰＦ値を決定する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンパ球除去療法（例えば、アレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体療法）後に二次的自己免疫を発症するリスクが増大する患者は、生体試料（例えば、血液）においてＩＰＦ値が増加しており、ＩＰＦ値は、対照被験者のＩＰＦ値と比較して、＞１．５、＞２、＞３、＞４、または＞５（例えば、＞２）の標準偏差で増加している。
【0041】
いくつかの実施形態では、リスクの増加は、対照被験者と比較して、ＩＰＦ値の増加およびＰＬＣ存在量の低下と相関している。
【0042】
ＩＩ．リンパ球除去療法
本明細書で使用される場合、「リンパ球除去療法」とは、リンパ球減少をもたらす循環リンパ球、例えばＴ細胞および／またはＢ細胞の治療的減少による免疫抑制の一種を指す。多発性硬化症の治療に、例えば自家骨髄移植（ＢＭＴ）または全リンパ球照射を使用した場合、リンパ球除去が長期化する。例えば、Ｃｏｘら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５年）３５：３３３２－４２を参照されたい。例えば、リンパ球除去は、チモグロブリン、シクロホスファミド、および全身照射を併用することで達成することができる。ＭＳ患者のリンパ球除去はまた、多くの薬物治療によっても達成することができる。例えば、ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ）は、ＭＳ患者を治療するリンパ球除去療法に使用されている。アレムツズマブ誘導リンパ球減少は、臨床的にも放射線学的にも中枢神経系の炎症を効果的に低減することが示されている（Ｃｏｌｅｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９９年）４６：２９６－３０４；Ｃｏｌｅｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００８年）３５９：１７８６－１８０１）。
本明細書で使用される場合、「リンパ球除去療法」とは、リンパ球減少をもたらす循環リンパ球、例えばＴ細胞および／またはＢ細胞の治療的減少による免疫抑制の一種を指す。多発性硬化症の治療に、例えば自家骨髄移植（ＢＭＴ）または全リンパ球照射を使用した場合、リンパ球除去が長期化する。例えば、Ｃｏｘら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５年）３５：３３３２－４２を参照されたい。例えば、リンパ球除去は、チモグロブリン、シクロホスファミド、および全身照射を併用することで達成することができる。ＭＳ患者のリンパ球除去はまた、多くの薬物治療によっても達成することができる。例えば、ヒト化抗ＣＤ５２モノクローナル抗体、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈ）は、ＭＳ患者を治療するリンパ球除去療法に使用されている。アレムツズマブ誘導リンパ球減少は、臨床的にも放射線学的にも中枢神経系の炎症を効果的に低減することが示されている（Ｃｏｌｅｓら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９９年）４６：２９６－３０４；Ｃｏｌｅｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００８年）３５９：１７８６－１８０１）。
【0043】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリンパ球除去療法は、ＣＤ５２発現細胞を標的とする薬剤である。特定の実施形態では、リンパ球除去療法は、抗ＣＤ５２抗体またはその抗原結合部分である。抗体は、例えば、モノクローナル、ポリクローナル、オリゴクローナル、または二機能性であることができる。特定の実施形態では、抗ＣＤ５２抗体または抗原結合部分は、アレムツズマブと同じエピトープに結合する。抗体または抗原結合部分は、アレムツズマブの６つのＣＤＲアミノ酸配列または重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含むことができる。特定の実施形態では、抗ＣＤ５２抗体はアレムツズマブである。
【0044】
本明細書で使用される場合「抗原結合部分」という用語は、その部分が由来する抗体全体と同じ抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。「抗原結合部分」の例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ｓｃＦｖ、およびダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される抗体およびその抗原結合部分は、当該技術分野で周知の任意の方法によって作製することができる。
【0045】
自己免疫疾患（例えば、ＭＳ）患者を治療するためのリンパ球標的療法では、他の薬剤も使用することができる。これらの薬剤は、リンパ球細胞死を引き起こすか、またはリンパ球機能を阻害するものであることができる。（１）アレムツズマブと生物学的に類似した薬剤、すなわち、アレムツズマブと同じもしくは異なるエピトープに結合するか、またはＣＤ５２への結合についてアレムツズマブと競合する他の抗ＣＤ５２抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体）など、ＣＤ５２を有する細胞を標的とする薬剤；（２）抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＤ３８抗体、抗ＴＣＲ抗体、および抗インテグリン抗体（例えば、ナタリズマブ）などのリンパ球上の細胞表面分子を標的とするペプチド、タンパク質、および抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体）などの生体分子；（３）リンパ球に特異的または非特異的に送達される細胞毒素（例えば、アポトーシス誘導剤、シクロホスファミド、アルキル化剤、およびＤＮＡインターカレーター）；（４）前述の抗体の抗原結合部分、（５）ＩＭｉＤ（例えば、テリフルノミド）、ならびに（６）ＢＴＫ阻害剤（例えば、トレブルチニブ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
ＩＩＩ．患者集団
本開示の方法は、自己免疫疾患（二次的自己免疫と区別するために、「原発性」自己免疫疾患）を有する患者の文脈で使用することができる。原発性自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）脳炎、強皮症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）スペクトラム障害（ＭＯＧＳＤ）、または視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）であることができる。
本開示の方法は、自己免疫疾患（二次的自己免疫と区別するために、「原発性」自己免疫疾患）を有する患者の文脈で使用することができる。原発性自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）脳炎、強皮症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）スペクトラム障害（ＭＯＧＳＤ）、または視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）であることができる。
【0047】
いくつかの実施形態では、原発性自己免疫疾患は、ＭＳ、例えば再発寛解型ＭＳ、原発性進行型ＭＳ、または二次進行型ＭＳである。本開示の文脈におけるＭＳ患者とは、例えば、症状の病歴、ならびに磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、脊髄穿刺、誘発電位検査、および血液試料の実験室分析などの検査を用いた神経学的検査によって、ＭＳの一種であると診断された患者である。
【0048】
ＭＳは散在性硬化症としても知られ、臨床的、病理学的、および放射線学的症状がかなり異質であることを特徴とする複雑な疾患である。ＭＳは、免疫系が中枢神経系を攻撃し、脱髄を引き起こす自己免疫状態である（ＣｏｍｐｓｔｏｎおよびＣｏｌｅｓ、Ｌａｎｃｅｔ（２００８年）３７２（９６４８）：１５０２－１７）。ＭＳは、神経線維を包んで電気的に絶縁しているミエリン鞘と呼ばれる脂肪層を破壊する。この疾患では、ほとんどの神経症状が現れる可能性があり、身体障害および認知障害へと進行することが多い（ＣｏｍｐｓｔｏｎおよびＣｏｌｅｓ、２００８年）。新しい症状は、個別の発作で起こることもあれば（再発型）、時間をかけてゆっくりと蓄積していくこともある（進行型）（Ｌｕｂｌｉｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６年）４６（４）：９０７－１１）。発作と発作の間に、症状が完全に消失することもあるが（寛解）、特に疾患が進行すると、永続的な神経学的問題が生じることが多い（Ｌｕｂｌｉｎら、１９９６年）。いくつかの亜型、すなわち進行のパターンが報告されており、それらは予後や治療法の決定にとって重要である。１９９６年、米国国立多発性硬化症学会は、４つの亜型の定義を標準化した：再発寛解型、二次性進行型、一次性進行型、および進行性再発型（Ｌｕｂｌｉｎら、１９９６年）。
【0049】
再発寛解型亜型（ＲＲＭＳ）は、増悪または再発と呼ばれる予測不能な急性発作が起こり、その後、数か月から数年間、新たな疾患活動性の徴候が認められない比較的平穏な期間（寛解）が続くのが特徴である。これは、ほとんどのＭＳ患者の初期経過を表している。ＲＲＭＳはこの疾患の中で最も不均一で複雑な表現型であり、特に初期には異なるレベルの疾患活動性と重症度とによって特徴付けられる。炎症が優勢だが、神経変性もある。脱髄は数日から数か月続く急性再発時に生じ、その後、疾患活動性のない寛解期に部分的または完全に回復する。ＲＲＭＳはＭＳ集団の約６５～７０％が罹患し、二次進行型ＭＳに進行する傾向がある。
【0050】
二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）は、再発寛解型の経過で始まるが、その後、明確な寛解期はなく、時折、再発、軽度の寛解、または停滞が現れることがあり、急性発作の間に進行性の神経減少へと進展する。承認された疾患修飾療法が利用可能になる以前は、ＭＳの自然史研究のデータから、ＲＲＭＳ患者の半数が１０年以内にＳＰＭＳに移行し、９０％が２５年以内にＳＰＭＳに移行することが実証された。ＳＰＭＳは、ＭＳ患者全体のおよそ２０～２５％が罹患している。
【0051】
一次進行性亜型（ＰＰＭＳ）は、ＭＳの初期症状が現れた後、明らかな寛解はなく、徐々にではあるが着実に障害が進行するのが特徴である（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．（２００７年）６（１０）：９０３－１２）。発症から障害の進行が特徴で、一時的に軽度の改善または停滞が見られることもある。ＰＰＭＳ患者のごく一部に再発が起こる場合がある。ＭＳ患者全体のおよそ１０％がＰＰＭＳである。原発性進行性亜型の発症年齢は、通常、他の亜型よりも遅い（Ｍｉｌｌｅｒら、２００７年）。男性も女性も同じように影響を受ける。
【0052】
進行性再発型ＭＳ（ＰＲＭＳ）は、急性発作を伴う着実な神経減少を特徴とし、その後いくらか回復することもあれば、回復しないこともある。これは、本明細書の上記に記載したすべての亜型の中で最も一般的でないものである。
【0053】
非標準的な行動をとる症例も記載されており、ＭＳの境界型と呼ばれることもある（Ｆｏｎｔａｉｎｅ、Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）（２００１年）１５７（８－９ Ｐｔ２）：９２９－３４）。これらの型には、デビック病、バロー同心性硬化症、シルダーびまん性硬化症、およびマールブルク多発性硬化症が含まれる（Ｃａｐｅｌｌｏら、Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．２５ Ｓｕｐｐｌ（２００４年）４：Ｓ３６１－３；Ｈａｉｎｆｅｌｌｎｅｒら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．（１９９２年）５５（１２）：１１９４－６）。
【0054】
一般に、「再発型ＭＳ」（ＲＭＳ）という規制表現は、ＲＲＭＳと再発を伴うＳＰＭＳの両方を含んでいる。このフレーズは一般的に患者の３種の異なる亜型を指す：ＲＲＭＳ、再発を伴うＳＰＭＳ、ならびにＭＲＩで病変の時間的および空間的播種が認められる臨床的に孤立した脱髄イベント（例えば、欧州医薬品庁、医薬品委員会の「多発性硬化症治療のための医薬品の臨床試験に関するガイドライン」（改訂２版、２０１５年）を参照されたい）。
【0055】
ＩＶ．二次的自己免疫
自己免疫は、最初の（「原発性」）疾患、例えば「原発性」自己免疫疾患、例えばＭＳの発症後に生じる場合、本明細書では「二次的自己免疫」（ｓＡＩ）と呼ばれる。二次的自己免疫は、例えばリンパ球除去療法後にリンパ球減少を起こした、あるいは起こしたことのあるＭＳ患者に生じることがある。一部の患者では、リンパ球除去療法（例えばアレムツズマブによる治療）の直後に二次的自己免疫が生じる。他の患者では、二次的自己免疫は、リンパ球除去療法の数か月後あるいは数年後まで生じない場合もあり；そのような患者の中には、二次的免疫が生じるまでに、リンパ球（総リンパ球数）がかなり回復し、もはやリンパ球減少ではなくなっている場合もある。したがって、場合によっては、抗ＣＤ５２抗体などのリンパ球除去療法を受けた患者は、二次的自己免疫の徴候がないか注意深くモニタリングし、適時に治療を受ける必要がある。
自己免疫は、最初の（「原発性」）疾患、例えば「原発性」自己免疫疾患、例えばＭＳの発症後に生じる場合、本明細書では「二次的自己免疫」（ｓＡＩ）と呼ばれる。二次的自己免疫は、例えばリンパ球除去療法後にリンパ球減少を起こした、あるいは起こしたことのあるＭＳ患者に生じることがある。一部の患者では、リンパ球除去療法（例えばアレムツズマブによる治療）の直後に二次的自己免疫が生じる。他の患者では、二次的自己免疫は、リンパ球除去療法の数か月後あるいは数年後まで生じない場合もあり；そのような患者の中には、二次的免疫が生じるまでに、リンパ球（総リンパ球数）がかなり回復し、もはやリンパ球減少ではなくなっている場合もある。したがって、場合によっては、抗ＣＤ５２抗体などのリンパ球除去療法を受けた患者は、二次的自己免疫の徴候がないか注意深くモニタリングし、適時に治療を受ける必要がある。
【0056】
二次的自己免疫としては、自己免疫性甲状腺疾患（グレーブス病、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺腫、橋本病、および甲状腺炎（例えば、一過性甲状腺炎））、自己免疫性血球減少症（特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性リンパ球減少症、および赤血球無形成を含む）、１型糖尿病、円形脱毛症（例えば、全身脱毛症）、白斑、筋痛症、サルコイドーシス、自己免疫性肝炎、ならびに糸球体腎炎（例えば、膜性糸球体腎炎）および抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）病（グッドパスチャー症候群）を含む腎症が挙げられるが、これらに限定されない。このような二次的自己免疫疾患を診断およびモニタリングする技術は、症状の評価および血液分析などの医学的検査を含め、当業者には周知である。本発明は、あらゆる既知の方法の使用を想定している。例えば、二次的自己免疫の徴候を検出する手段として、患者の体液（例えば血液）中の自己抗体レベルを測定することができる。具体的には、抗核抗体、抗平滑筋抗体、および抗ミトコンドリア抗体を測定することができる。抗核抗体が検出された場合は、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗リボ核タンパク質抗体、および抗Ｌａ抗体を測定するための追加アッセイを行うことができる。自己免疫性甲状腺疾患を検出するために、抗甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）抗体および抗甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター抗体を測定することができ；抗ＴＰＯ抗体または抗ＴＳＨレセプター抗体が検出された場合は、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４、およびＴＳＨレベルを測定することにより、甲状腺機能が影響を受けているかどうかを測定することができる。自己免疫性血小板減少症を検出するために、抗血小板抗体を測定することができ；血小板レベルの測定は抗血小板抗体の存在が血小板数の減少を引き起こしているかどうかを判定するのに役立つ可能性がある。
【0057】
Ｖ．自己免疫疾患患者の治療および検査用キット
本発明は、多発性硬化症などの原発性自己免疫疾患を治療するためのキットを提供する。本発明のキットは、例えば、リンパ球除去薬（例えば、アレムツズマブ）、およびこの薬剤の禁忌、例えば、この薬剤による治療後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大する可能性を患者または医療提供者に知らせるための説明書を含むことができる。リスクの増大は、対照被験者と比較して、患者から採取した生体（例えば、血液）試料において、（ｉ）全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率の減少、（ｉｉ）ＩＰＦ値の増加、および／または（ｉｉｉ）全ＰＬＣ集団中の幼若ＰＬＣの比率の増加、これらの任意の組み合わせ、および場合により（ｉｖ）成熟血小板または活性化血小板に対する抗体の増加と関連するか、またはこれらによって示される。
本発明は、多発性硬化症などの原発性自己免疫疾患を治療するためのキットを提供する。本発明のキットは、例えば、リンパ球除去薬（例えば、アレムツズマブ）、およびこの薬剤の禁忌、例えば、この薬剤による治療後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大する可能性を患者または医療提供者に知らせるための説明書を含むことができる。リスクの増大は、対照被験者と比較して、患者から採取した生体（例えば、血液）試料において、（ｉ）全細胞中の血小板系細胞（ＰＬＣ）の比率の減少、（ｉｉ）ＩＰＦ値の増加、および／または（ｉｉｉ）全ＰＬＣ集団中の幼若ＰＬＣの比率の増加、これらの任意の組み合わせ、および場合により（ｉｖ）成熟血小板または活性化血小板に対する抗体の増加と関連するか、またはこれらによって示される。
【0058】
他の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患患者からの生体（例えば、血液）試料中の、全血球中のＰＬＣの比率、ＩＰＦ値、および／または全ＰＬＣ中の幼若ＰＬＣの比率を検出するためのキット、および／またはリンパ球除去後に二次的自己免疫疾患を発症するリスクが増大する患者を同定するためのキットを提供する。このようなキットは、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＳＰＡＲＣ、および／もしくはＴＲＥＭＬ１などのＰＬＣマーカー（および／または本明細書に記載される任意の他のＰＬＣ／成熟ＰＬＣマーカー）；ＰＤＧＦＡ、ＰＤＣＤ１０、ＤＡＢ２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１８、および／もしくはＴＳＣ２２Ｄ１などの幼若ＰＬＣマーカー（および／または本明細書に記載される任意の他の幼若ＰＬＣマーカー）；ならびに／またはＩＰＦ値を検出するための試薬；ならびに場合により患者から生体試料（例えば、血液試料）を採取するよう使用者に指示する指示書を含むことができる。このようなキットは、ＭＳ患者などの患者の医療診断を行うために、適切な規制当局によって検証または承認されている。
【0059】
本明細書において特に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載したものと類似または同等の方法および材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載される免疫学、医学、薬化学および製薬化学、ならびに細胞生物学に関連して使用される用語、および技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。さらに、文脈上別途要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態全体を通して、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数または整数群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数群を排除することを意味しないと理解される。本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記された基準値に類似した値を指す。特定の実施形態では、この用語は、特に記載がない限り、またはさもなければ文脈から明らかな場合を除き、記載された基準値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下のいずれかの方向（より大きい、またはより小さい）に収まる値の範囲を指す。
【0060】
本明細書に記載されたすべての刊行物およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書には多くの文献が引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが当技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成していることを認めるものではない。
【0061】
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は例示のみを目的としたものであり、いかなる様式においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【実施例1】
【0062】
アレムツズマブ治療患者における免疫細胞型構成の決定
方法：
臨床試験および試料採取
凍結保存されたＰＢＭＣ試料は、ＣＡＭＭ３２３試験（ＣＡＲＥ－ＭＳ Ｉ、Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ００５３０３４８）から入手した。本試験では、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲ－ＭＳ）と診断され、以前、ＭＳ疾患修飾療法による治療歴のない患者を、ベースライン時（Ｔ０）に連続５日間および１２か月後（Ｔ１２）に連続３日間、アレムツズマブで治療し、またはインターフェロンβ－１ａ皮下注射（４４μｇ、週３回）で治療した。全血（６～８ｍＬ）を、Ｔ０、Ｔ１２（第１クールの１２か月後）、およびＴ２４（第２クールの１２か月後）の時点で、クエン酸ナトリウムを含むＣＰＴ（商標）チューブに採取した。この研究では、合計３２人の患者のＴ０時点およびＴ２４時点の試料を分析し、そのうち１１人はアレムツズマブ治療後に二次的自己免疫（ｓＡＩ、甲状腺イベントの発生で定義）を発症し、１８人は発症せず（非ｓＡＩ）、３人の患者は自己抗体の存在で定義される臨床検査値異常（ＬＡ）を有していた（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００９年）１１９：２０５２－６１）。判定では、甲状腺イベントは検査所見（例えば、ＴＳＨ異常）または臨床的有害事象（ＡＥ）のいずれかを有することと定義された。診断された場合、臨床ＡＥはグレーブス病（すなわち甲状腺機能亢進症）、橋本病（すなわち甲状腺機能低下症）、一過性甲状腺炎、グレーブス病から甲状腺機能低下症への移行、橋本病から甲状腺機能亢進症への移行、または不明と分類された。年齢、性別、またはＢＭＩなどの人口統計学的共変量はｓＡＩとの関連を示さなかった（データは示さず）。自己免疫発症のタイムラインは、先行研究に記載されている（Ｂｅｒｇｅｒら、ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ（２０１７年）３１：３３－５０；Ｈａｖｒｄｏｖａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１７年）８９：１１０７－１６）。
方法：
臨床試験および試料採取
凍結保存されたＰＢＭＣ試料は、ＣＡＭＭ３２３試験（ＣＡＲＥ－ＭＳ Ｉ、Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ００５３０３４８）から入手した。本試験では、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲ－ＭＳ）と診断され、以前、ＭＳ疾患修飾療法による治療歴のない患者を、ベースライン時（Ｔ０）に連続５日間および１２か月後（Ｔ１２）に連続３日間、アレムツズマブで治療し、またはインターフェロンβ－１ａ皮下注射（４４μｇ、週３回）で治療した。全血（６～８ｍＬ）を、Ｔ０、Ｔ１２（第１クールの１２か月後）、およびＴ２４（第２クールの１２か月後）の時点で、クエン酸ナトリウムを含むＣＰＴ（商標）チューブに採取した。この研究では、合計３２人の患者のＴ０時点およびＴ２４時点の試料を分析し、そのうち１１人はアレムツズマブ治療後に二次的自己免疫（ｓＡＩ、甲状腺イベントの発生で定義）を発症し、１８人は発症せず（非ｓＡＩ）、３人の患者は自己抗体の存在で定義される臨床検査値異常（ＬＡ）を有していた（Ｊｏｎｅｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．（２００９年）１１９：２０５２－６１）。判定では、甲状腺イベントは検査所見（例えば、ＴＳＨ異常）または臨床的有害事象（ＡＥ）のいずれかを有することと定義された。診断された場合、臨床ＡＥはグレーブス病（すなわち甲状腺機能亢進症）、橋本病（すなわち甲状腺機能低下症）、一過性甲状腺炎、グレーブス病から甲状腺機能低下症への移行、橋本病から甲状腺機能亢進症への移行、または不明と分類された。年齢、性別、またはＢＭＩなどの人口統計学的共変量はｓＡＩとの関連を示さなかった（データは示さず）。自己免疫発症のタイムラインは、先行研究に記載されている（Ｂｅｒｇｅｒら、ＣＮＳ Ｄｒｕｇｓ（２０１７年）３１：３３－５０；Ｈａｖｒｄｏｖａら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２０１７年）８９：１１０７－１６）。
【0063】
ＰＢＭＣの処理および保存
採血後、ＣＰＴ（商標）チューブを臨床現場で遠心分離し、赤血球（ＲＢＣ）をゲルバリア内に捕捉した。ＰＢＭＣの血漿層および白色バフィーコートを出荷前に混合した。ＣＰＴ（商標）チューブを室温で検査室に送り、採取後６０時間以内に処理した。ＰＢＭＣの採取はクラスＩＩの生物学的安全キャビネット内で行った。細胞を血漿中に静かに５～１０回、転倒混和した後、ＣＰＴ（商標）チューブを開け、ゲル上の懸濁液全体を滅菌した１５ｍＬコニカルチューブに移した。溶液の体積を記録した。試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱すことなく血漿を除去および廃棄した。ペレットを穏やかにピペッティングして再懸濁し、ダルベッコＰＢＳ（１Ｘ）を加えて容量を１０～１３ｍＬにした。次いで、試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離した。ペレットを乱すことなく上清を吸引し、ダルベッコＰＢＳ（１Ｘ）を加えて容量を１０ｍＬにした。試料を転倒混和し、静かに混合した。白血球数、およびリンパ球％および単球％は、Ｇｅｎ－Ｓ血液分析装置を使用して決定した。細胞の生存率は、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）で処理することにより決定した。続いて、試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットをピペッティングで静かに再懸濁した。凍結溶液Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）２ｍＬを加え、１ｍＬピペットを使用して混合した。細胞溶液１ｍＬをクライオバイアル２個に分注し、－８０℃で最低２４時間、最大７２時間保存した後、液体窒素で長期保存した。
採血後、ＣＰＴ（商標）チューブを臨床現場で遠心分離し、赤血球（ＲＢＣ）をゲルバリア内に捕捉した。ＰＢＭＣの血漿層および白色バフィーコートを出荷前に混合した。ＣＰＴ（商標）チューブを室温で検査室に送り、採取後６０時間以内に処理した。ＰＢＭＣの採取はクラスＩＩの生物学的安全キャビネット内で行った。細胞を血漿中に静かに５～１０回、転倒混和した後、ＣＰＴ（商標）チューブを開け、ゲル上の懸濁液全体を滅菌した１５ｍＬコニカルチューブに移した。溶液の体積を記録した。試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離した後、細胞ペレットを乱すことなく血漿を除去および廃棄した。ペレットを穏やかにピペッティングして再懸濁し、ダルベッコＰＢＳ（１Ｘ）を加えて容量を１０～１３ｍＬにした。次いで、試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離した。ペレットを乱すことなく上清を吸引し、ダルベッコＰＢＳ（１Ｘ）を加えて容量を１０ｍＬにした。試料を転倒混和し、静かに混合した。白血球数、およびリンパ球％および単球％は、Ｇｅｎ－Ｓ血液分析装置を使用して決定した。細胞の生存率は、ヨウ化プロピジウムで染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）で処理することにより決定した。続いて、試料を３００ｇで１０～１５分間遠心分離し、上清を吸引した。ペレットをピペッティングで静かに再懸濁した。凍結溶液Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）２ｍＬを加え、１ｍＬピペットを使用して混合した。細胞溶液１ｍＬをクライオバイアル２個に分注し、－８０℃で最低２４時間、最大７２時間保存した後、液体窒素で長期保存した。
【0064】
シングルセルワークフローのためのＰＢＭＣの解凍および前処理
Ｈａｎａｍｓａｇａｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０２０年）１０：２２１９に以前に記載されているように、凍結保存したＰＢＭＣを、小さな結晶が残るまで３７℃の水浴中で１～２分間解凍した（一度にバイアル２個）。クライオバイアルを水浴から取り出し、ワイドボアピペットチップを使用して細胞溶液を滅菌済み２ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに移した。クライオバイアルを１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに移した。試料を１５０ｇ、５分間、室温（ＲＴ）で遠心分離した。上清を注意深く除去し、ワイドボアピペットチップを使用して１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで試料を洗浄した。試料を上記と同じ条件でさらに２回、合計３回洗浄した。最終洗浄後、細胞を１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルー（０．４％、ＧＩＢＣＯ（商標）カタログ番号１５２５００６１）を染色液として、血球計数器（Ｃ－Ｃｈｉｐ（商標）、ＳＫＣ、カタログ番号ＤＨＣＦ０１５）を使用して計数した。生存率が７５％未満であることが判明した場合、試料をＤｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９０－１０１）を使用した「クリーンアップ」工程に供した。細胞を再度洗浄し、５００μＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、計数した。容量を０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ装置で細胞をカプセル化した。
Ｈａｎａｍｓａｇａｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０２０年）１０：２２１９に以前に記載されているように、凍結保存したＰＢＭＣを、小さな結晶が残るまで３７℃の水浴中で１～２分間解凍した（一度にバイアル２個）。クライオバイアルを水浴から取り出し、ワイドボアピペットチップを使用して細胞溶液を滅菌済み２ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに移した。クライオバイアルを１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに移した。試料を１５０ｇ、５分間、室温（ＲＴ）で遠心分離した。上清を注意深く除去し、ワイドボアピペットチップを使用して１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで試料を洗浄した。試料を上記と同じ条件でさらに２回、合計３回洗浄した。最終洗浄後、細胞を１ｍＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、トリパンブルー（０．４％、ＧＩＢＣＯ（商標）カタログ番号１５２５００６１）を染色液として、血球計数器（Ｃ－Ｃｈｉｐ（商標）、ＳＫＣ、カタログ番号ＤＨＣＦ０１５）を使用して計数した。生存率が７５％未満であることが判明した場合、試料をＤｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９０－１０１）を使用した「クリーンアップ」工程に供した。細胞を再度洗浄し、５００μＬの０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、計数した。容量を０．０４％ＢＳＡ／ＰＢＳで１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ装置で細胞をカプセル化した。
【0065】
シングルセルトランスクリプトミクス
細胞容量を１×１０６細胞／ｍＬに調整した後、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’遺伝子発現ライブラリー調製のプロトコルを使用した。試料あたり８０００個の細胞を標的とした。２１００バイオアナライザー装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－４６２６）を用いて一意にインデックス化されたライブラリーの質を決定し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＫａｐａ（商標）ライブラリー定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＫＫ４８２４－０７９６０１４０００１）を使用して定量した。ライブラリーを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、シーケンシングのために等モル濃度（２ｎＭ）でプールした。
細胞容量を１×１０６細胞／ｍＬに調整した後、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５’遺伝子発現ライブラリー調製のプロトコルを使用した。試料あたり８０００個の細胞を標的とした。２１００バイオアナライザー装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号５０６７－４６２６）を用いて一意にインデックス化されたライブラリーの質を決定し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムでＫａｐａ（商標）ライブラリー定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＫＫ４８２４－０７９６０１４０００１）を使用して定量した。ライブラリーを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈し、シーケンシングのために等モル濃度（２ｎＭ）でプールした。
【0066】
シーケンシングは、ＮＯＶＡｓｅｑ（商標）６０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で、ＮＯＶＡｓｅｑ（商標）６０００ Ｓ２試薬キット（３００サイクル、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号２００２８３１４）を使用して行った。シーケンス深度およびサイクル数は１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓの推奨：Ｒｅａｄ１＝２６サイクル、ｉ７ ｉｎｄｅｘ＝８サイクル、Ｒｅａｄ２＝９８サイクルに従い、細胞あたり３５，０００回の読み取りのシーケンス深度を目指した。
【0067】
シングルセルパイプライン、前処理、およびＱＣ
単一細胞解析は、以前に記載された通りに行った（Ｈａｎａｍｓａｇａｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０２０年）１０：２２１９）。簡単に説明すると、ＢＣＬ変換後、ＦＡＳＴｑをＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）バージョンｖ２．１．１で処理し、デマルチプレックス、アライメント、フィルタリング、バーコードカウンティング、ＵＭＩカウンティング、および遺伝子×バーコードマトリックスの作成を行った。続いて、社内で構築した前処理パイプラインを実行し、周囲のＲＮＡのバックグラウンド除去と、空のバーコード、ならびにストレス遺伝子およびミトコンドリア遺伝子のフィルタリングを行った。次いで、得られたｈｄｆ５ファイルを、ＳＰＲＩＮＧ（Ｗｅｉｎｒｅｂ、Ｗｏｌｏｃｋ、およびＫｌｅｉｎ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ Ｏｘｆ Ｅｎｇｌ．（２０１８年）３４：１２４６－８）と呼ばれる内部の単一細胞可視化ツールに入力した。ＳＰＲＩＮＧはまた、大規模なシングルセルデータセットのサイズを圧縮／縮小して、高速に可視化することもできる。次いで、社内で開発したツールを使用して、細胞型および細胞亜型の自動注釈付けを行い、新規細胞型の同定も行った。精査の結果、質の悪い試料を分析から除外した。簡単に説明すると、各試料のＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）ウェブサマリーを評価した。「クリフグラフ」がＱＣに合格すると判断された場合、シーケンシング深度が評価された。シーケンシング深度が低い試料については、低リード試料を考慮してライブラリーを再プールし、再シーケンシングした。全シーケンシングランのデータを統合し、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）で再実行した。ウェブサマリーを再度評価し、細胞数が少なく、「クリフグラフ」が悪い試料にフラグを立てた。除染およびフィルタリングのために内部パイプラインですべての試料を処理し（上記の通り）、ＳＰＲＩＮＧポータルで可視化した。ＳＰＲＩＮＧレイアウト上でクラスタリングが不十分な試料、または細胞数が１００未満の試料にはフラグを立てた。したがって、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）ＱＣおよびＳＰＲＩＮＧクラスタリングに不合格となった試料を解析から除外した。そのような試料を７つ特定し、除外した。得られた新しいデータセットにＬｅｍｔｒａｄａ＿ＳＣ（試料クリーンアップ）のラベルを付けた。これらの試料は異なる患者の異なる時点に属していたため、Ｌｅｍｔｒａｄａ＿ＳＣデータセットの患者からの対応のある試料を除外した別のデータセットを作成した。この新しいデータセットをＬｅｍｔｒａｄａ＿ＰＣ（患者クリーンアップ）と呼んだ。
単一細胞解析は、以前に記載された通りに行った（Ｈａｎａｍｓａｇａｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０２０年）１０：２２１９）。簡単に説明すると、ＢＣＬ変換後、ＦＡＳＴｑをＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）バージョンｖ２．１．１で処理し、デマルチプレックス、アライメント、フィルタリング、バーコードカウンティング、ＵＭＩカウンティング、および遺伝子×バーコードマトリックスの作成を行った。続いて、社内で構築した前処理パイプラインを実行し、周囲のＲＮＡのバックグラウンド除去と、空のバーコード、ならびにストレス遺伝子およびミトコンドリア遺伝子のフィルタリングを行った。次いで、得られたｈｄｆ５ファイルを、ＳＰＲＩＮＧ（Ｗｅｉｎｒｅｂ、Ｗｏｌｏｃｋ、およびＫｌｅｉｎ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ Ｏｘｆ Ｅｎｇｌ．（２０１８年）３４：１２４６－８）と呼ばれる内部の単一細胞可視化ツールに入力した。ＳＰＲＩＮＧはまた、大規模なシングルセルデータセットのサイズを圧縮／縮小して、高速に可視化することもできる。次いで、社内で開発したツールを使用して、細胞型および細胞亜型の自動注釈付けを行い、新規細胞型の同定も行った。精査の結果、質の悪い試料を分析から除外した。簡単に説明すると、各試料のＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）ウェブサマリーを評価した。「クリフグラフ」がＱＣに合格すると判断された場合、シーケンシング深度が評価された。シーケンシング深度が低い試料については、低リード試料を考慮してライブラリーを再プールし、再シーケンシングした。全シーケンシングランのデータを統合し、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）で再実行した。ウェブサマリーを再度評価し、細胞数が少なく、「クリフグラフ」が悪い試料にフラグを立てた。除染およびフィルタリングのために内部パイプラインですべての試料を処理し（上記の通り）、ＳＰＲＩＮＧポータルで可視化した。ＳＰＲＩＮＧレイアウト上でクラスタリングが不十分な試料、または細胞数が１００未満の試料にはフラグを立てた。したがって、ＣｅｌｌＲａｎｇｅｒ（商標）ＱＣおよびＳＰＲＩＮＧクラスタリングに不合格となった試料を解析から除外した。そのような試料を７つ特定し、除外した。得られた新しいデータセットにＬｅｍｔｒａｄａ＿ＳＣ（試料クリーンアップ）のラベルを付けた。これらの試料は異なる患者の異なる時点に属していたため、Ｌｅｍｔｒａｄａ＿ＳＣデータセットの患者からの対応のある試料を除外した別のデータセットを作成した。この新しいデータセットをＬｅｍｔｒａｄａ＿ＰＣ（患者クリーンアップ）と呼んだ。
【0068】
結果：
アレムツズマブ治療前後の細胞型の相対的存在量の変化
以前に観察されたように（Ｂａｋｅｒら、ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１７年）７４：９６１）、治療後の時点（第２クールの１２カ月後；Ｔ２４）でＢ細胞の増加およびＴ細胞の減少が検出された（データは示さず）。
アレムツズマブ治療前後の細胞型の相対的存在量の変化
以前に観察されたように（Ｂａｋｅｒら、ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１７年）７４：９６１）、治療後の時点（第２クールの１２カ月後；Ｔ２４）でＢ細胞の増加およびＴ細胞の減少が検出された（データは示さず）。
【0069】
さらに、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して決定された、各試料におけるこれらの細胞型の個々の割合は、臨床的に記録されたリンパ球数と強い相関があった。このことは、開発したパイプラインを使用して測定したｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ相対的存在量測定が、細胞数に関する信頼性の高い見解を提供することを示している。さらに、日常的に使用されている標準的な蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）よりも、細胞型に関してより深い解像度を提供した。いずれの群でも、単球数とＮＫ細胞数との合計に差は認められなかった（データは示さず）。シングルセルデータからのＮＫ細胞量も臨床値と強い相関があり（データは示さず）、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを臨床値の代理として使用する可能性がさらに強まった。
【0070】
アレムツズマブ治療前後のｓＡＩ患者対非ｓＡＩ患者におけるＢ細胞とＴ細胞の差
これまでの知見（Ｂａｋｅｒら、２０１７年；Ｅｖａｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１８年）１８：３２３－３４）と一致して、ナイーブＢ細胞数は有意に増加したが、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞数は治療後に減少したことが見出された（データは示さず）。Ｂ細胞およびＴ細胞の亜型については、ｓＡＩ患者対非ｓＡＩ患者で差は認められなかった（データは示さず）。
これまでの知見（Ｂａｋｅｒら、２０１７年；Ｅｖａｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．（２０１８年）１８：３２３－３４）と一致して、ナイーブＢ細胞数は有意に増加したが、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞数は治療後に減少したことが見出された（データは示さず）。Ｂ細胞およびＴ細胞の亜型については、ｓＡＩ患者対非ｓＡＩ患者で差は認められなかった（データは示さず）。
【0071】
未知の細胞型の分類
甲状腺イベントの有無にかかわらず、既知の細胞型や亜型の相対的存在量に差は見られなかったため、自動化アルゴリズムによって未知と分類された細胞型の存在量を分析した。驚くべきことに、甲状腺イベントを経験した人では、経験していない人に比べて、稀な血小板様細胞型（ＰＬＣ）が有意に低いことが明らかになった（図１、ｓＡＩが０．０７％；非ｓＡＩが０．５２％）。この効果は任意の特定の患者によるものではなかった（図２）。ＰＬＣの割合は低かった（０．１％未満）が、ｓＡＩと非ｓＡＩとの差は非常に有意であり、治療前と治療後の両時点で維持された（図３）。マーカー発現に基づくと（図４）、ＰＬＣは血小板に強く類似していたが、血小板とは普遍的には関連しない２つの追加の表面マーカー：ＳＰＡＲＣおよびＴＲＥＭＬを高レベルで発現していた。血小板は、ＰＢＭＣ調製物によく含まれる汚染物質である（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｃｙｔｏｍ Ｐａｒｔ Ｊ Ｉｎｔ Ｓｏｃ Ａｎａｌ Ｃｙｔｏｌ．（２００６年）６９：８６－９４）が、しかしながら、血小板は小さく、ＲＮＡを含むとは想定されない。したがって、この細胞型は、ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ捕捉に適した特別な物理的特徴（例えば、サイズがより大きい、転写産物含量が多い）を持つ血小板系細胞（ＰＬＣ）を構成していると仮定された。
甲状腺イベントの有無にかかわらず、既知の細胞型や亜型の相対的存在量に差は見られなかったため、自動化アルゴリズムによって未知と分類された細胞型の存在量を分析した。驚くべきことに、甲状腺イベントを経験した人では、経験していない人に比べて、稀な血小板様細胞型（ＰＬＣ）が有意に低いことが明らかになった（図１、ｓＡＩが０．０７％；非ｓＡＩが０．５２％）。この効果は任意の特定の患者によるものではなかった（図２）。ＰＬＣの割合は低かった（０．１％未満）が、ｓＡＩと非ｓＡＩとの差は非常に有意であり、治療前と治療後の両時点で維持された（図３）。マーカー発現に基づくと（図４）、ＰＬＣは血小板に強く類似していたが、血小板とは普遍的には関連しない２つの追加の表面マーカー：ＳＰＡＲＣおよびＴＲＥＭＬを高レベルで発現していた。血小板は、ＰＢＭＣ調製物によく含まれる汚染物質である（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｃｙｔｏｍ Ｐａｒｔ Ｊ Ｉｎｔ Ｓｏｃ Ａｎａｌ Ｃｙｔｏｌ．（２００６年）６９：８６－９４）が、しかしながら、血小板は小さく、ＲＮＡを含むとは想定されない。したがって、この細胞型は、ｓｃ－ＲＮＡｓｅｑ捕捉に適した特別な物理的特徴（例えば、サイズがより大きい、転写産物含量が多い）を持つ血小板系細胞（ＰＬＣ）を構成していると仮定された。
【実施例2】
【0072】
ＦＡＣＳを使用する血小板系細胞（ＰＬＣ）の同定
ＰＬＣの同一性を確認するため、２人の健康なドナーの試料を使用してＦＡＣＳ実験を行い、試料の単離および処理工程を通してＰＬＣの相対的存在量を推定した。
ＰＬＣの同一性を確認するため、２人の健康なドナーの試料を使用してＦＡＣＳ実験を行い、試料の単離および処理工程を通してＰＬＣの相対的存在量を推定した。
【0073】
方法：
フローサイトメトリー：
細胞の前処理
全血試料は、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡのサノフィ社内のドナー・リサーチ・プログラムを利用して、２人の健康な被験者から採取した。クエン酸ナトリウムを含むＣＰＴ（商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３６２７６１）にドナー１人当たり７５～１００ｍＬの血液を採取した。最初の実験では、上記のように血液からＰＢＭＣを単離した。この後、ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｅｌｌａｃａ（商標）ＭＸ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデルＭＸ－ＳＹＳ１）でヨウ化プロピジウム／アクリジンオレンジ染色（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、カタログ番号ＣＳ２－０１０６－５ＭＬ）を使用して計数した。新たに採取したＰＢＭＣの半分をＣｒｙｏｓｔｏｒ（商標）ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）に保存し、－８０℃で２４時間凍結した後、液体窒素で保存した。１週間後、細胞を解凍し、計数し、フローサイトメトリーにかけた。残りの半分の新鮮なＰＢＭＣを、抗体染色およびフロー解析のために処理した。第２の一連の実験では、健康なドナーを呼び戻し、上記のように血液を採取した。赤血球溶解は、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ａ１０４９２－０１、ロット番号２０４８６１１）を使用して、製造者の指示に従って行った。簡単に説明すると、各ドナーに対して５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）コニカルチューブを２本使用した。血漿を除去するために最初の遠心分離を行った後、およそ１０～１２ｍＬの全血を各５０ｍＬチューブに注いだ。ＡＣＫ緩衝液４５ｍＬを添加し、ＶＷＲ可変速ロッカーで１０分間インキュベートした。３回目の１０分間のインキュベーションの後、細胞ペレットはほとんど白色で、赤血球が溶解され、洗浄によって除去されたことを示した。この後、染色およびフローサイトメトリーのために細胞を処理した。
フローサイトメトリー：
細胞の前処理
全血試料は、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡのサノフィ社内のドナー・リサーチ・プログラムを利用して、２人の健康な被験者から採取した。クエン酸ナトリウムを含むＣＰＴ（商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３６２７６１）にドナー１人当たり７５～１００ｍＬの血液を採取した。最初の実験では、上記のように血液からＰＢＭＣを単離した。この後、ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｅｌｌａｃａ（商標）ＭＸ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、モデルＭＸ－ＳＹＳ１）でヨウ化プロピジウム／アクリジンオレンジ染色（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、カタログ番号ＣＳ２－０１０６－５ＭＬ）を使用して計数した。新たに採取したＰＢＭＣの半分をＣｒｙｏｓｔｏｒ（商標）ＣＳ１０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９３０）に保存し、－８０℃で２４時間凍結した後、液体窒素で保存した。１週間後、細胞を解凍し、計数し、フローサイトメトリーにかけた。残りの半分の新鮮なＰＢＭＣを、抗体染色およびフロー解析のために処理した。第２の一連の実験では、健康なドナーを呼び戻し、上記のように血液を採取した。赤血球溶解は、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ａ１０４９２－０１、ロット番号２０４８６１１）を使用して、製造者の指示に従って行った。簡単に説明すると、各ドナーに対して５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）コニカルチューブを２本使用した。血漿を除去するために最初の遠心分離を行った後、およそ１０～１２ｍＬの全血を各５０ｍＬチューブに注いだ。ＡＣＫ緩衝液４５ｍＬを添加し、ＶＷＲ可変速ロッカーで１０分間インキュベートした。３回目の１０分間のインキュベーションの後、細胞ペレットはほとんど白色で、赤血球が溶解され、洗浄によって除去されたことを示した。この後、染色およびフローサイトメトリーのために細胞を処理した。
【0074】
補正、染色、およびフロー分析：
ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｎｆｌｕｘ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｂｌｅ、モデル６４６５００、ｓ／ｎ Ｘ６４６５００００１３７）で試料を実行する前に、Ｉｎｆｌｕｘプロトコルに従って自動補正を行った。簡単に説明すると、２滴の補正ビーズ（下記参照）と１試験の染色液を混合し、暗所にて氷上で２０分間インキュベートした後、５ｍＬのファルコンチューブに入れた３５０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。
ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｎｆｌｕｘ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｂｌｅ、モデル６４６５００、ｓ／ｎ Ｘ６４６５００００１３７）で試料を実行する前に、Ｉｎｆｌｕｘプロトコルに従って自動補正を行った。簡単に説明すると、２滴の補正ビーズ（下記参照）と１試験の染色液を混合し、暗所にて氷上で２０分間インキュベートした後、５ｍＬのファルコンチューブに入れた３５０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。
【0075】
すべての細胞を３００ｇ、５分間、４℃で遠心分離した。ペレットを３ｍＬのＢＤ染色緩衝液に再懸濁し、５ｍＬのファルコンポリプロピレンチューブに移した。細胞を再度遠心分離し、次いでペレットを１００μＬの染色パネルに懸濁し、暗所にて氷上で３０分間インキュベートした。染色パネルは：ＣＤ６１－ＢＶ５１０（５μＬ／試験）、ＣＤ４１Ａ－ＡＰＣ（２０μＬ／試験）、ＴＲＥＭＬ／ＴＬＴ－１－ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）、およびＳＰＡＲＣ－（３５０）（５μＬ／試験）からなった。インキュベーション後、３ｍＬの染色緩衝液を添加し、遠心分離した。上清を除去し、ペレットを２ｍＬの染色緩衝液に再懸濁し、製造元の指示に従ってＢＤ Ｉｎｆｌｕｘで分析した。ＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ（商標）の情報：振幅は４．９１、ドロップ振動数は４４．７０、流束絞りは１５、ドロップ位置は２００、最大ドロップは１０１、ドロップディレイは２８．４３、チューブ向け流束曲げは－８４、－３３、３３、８６に設定した。
【0076】
【表1】
【0077】
ゲーティング戦略：
死細胞を除いて、ＦＳＣとＳＳＣの対数スケールから生細胞をゲーティングした。生細胞のうち、「小細胞」はサイズが小さい（２～３μｍ）ため、ＦＳＣおよびＳＳＣで対数スケールを使用してゲーティングした。シングレットはトリガーパルス幅を使用してＦＳＣおよびＳＳＣゲートからゲーティングした。ＣＤ４１Ａ＋およびＣＤ６１＋を血小板のマーカーとみなし、シングルレットゲートからゲーティングした。ＣＤ４１Ａ＋ＣＤ６１＋ゲートから、ＳＰＡＲＣおよびＴＲＥＭＬ１の二重陽性によってＰＬＣを同定した。
死細胞を除いて、ＦＳＣとＳＳＣの対数スケールから生細胞をゲーティングした。生細胞のうち、「小細胞」はサイズが小さい（２～３μｍ）ため、ＦＳＣおよびＳＳＣで対数スケールを使用してゲーティングした。シングレットはトリガーパルス幅を使用してＦＳＣおよびＳＳＣゲートからゲーティングした。ＣＤ４１Ａ＋およびＣＤ６１＋を血小板のマーカーとみなし、シングルレットゲートからゲーティングした。ＣＤ４１Ａ＋ＣＤ６１＋ゲートから、ＳＰＡＲＣおよびＴＲＥＭＬ１の二重陽性によってＰＬＣを同定した。
【0078】
統計解析
フローデータの分析にはＦｌｏｗＪｏ（商標）（バージョン１０）を使用した。グラフの作成および統計解析の実行にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用した。有意水準を：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５により示す。
フローデータの分析にはＦｌｏｗＪｏ（商標）（バージョン１０）を使用した。グラフの作成および統計解析の実行にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用した。有意水準を：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５により示す。
【0079】
ＰＬＣ存在量の結果は、抗ＰＬＧＹ抗体の存在に対する頑強性を確認するため、この臨床検査値異常を示した１人のｓＡＩ患者（１０５５３１６３）を除外して検査した。有意水準はｐ＜０．０１５であり、この患者は除外された。
【0080】
結果：
ＰＬＣの識別
ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋細胞の割合は、全血では３５％であり、新鮮なＰＢＭＣ（好中球除去後）では５５％に増加し、凍結ＰＢＭＣでは３０％に減少することが観察された（図５）。しかしながら、ＰＬＣ（ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＳＰＡＲＣ＋ＴＲＥＭＬ１＋と定義）は全血のわずか０．５５％、新鮮および凍結ＰＢＭＣの０．１～０．２％を占めた（図６および７）。ＰＬＣのサイズおよび粒状性の物理的特徴をよりよく理解するために、ＳＳＣ／ＦＳＣゲーティングを用いて解析したところ、ＳＰＡＲＣ－ＴＲＥＭＬ１－（二重陰性）血小板と比較して、より大きく、より粒状であることが示された（データは示さず）。
ＰＬＣの識別
ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋細胞の割合は、全血では３５％であり、新鮮なＰＢＭＣ（好中球除去後）では５５％に増加し、凍結ＰＢＭＣでは３０％に減少することが観察された（図５）。しかしながら、ＰＬＣ（ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＳＰＡＲＣ＋ＴＲＥＭＬ１＋と定義）は全血のわずか０．５５％、新鮮および凍結ＰＢＭＣの０．１～０．２％を占めた（図６および７）。ＰＬＣのサイズおよび粒状性の物理的特徴をよりよく理解するために、ＳＳＣ／ＦＳＣゲーティングを用いて解析したところ、ＳＰＡＲＣ－ＴＲＥＭＬ１－（二重陰性）血小板と比較して、より大きく、より粒状であることが示された（データは示さず）。
【0081】
アレムツズマブ治療前のｓＡＩ患者対非ｓＡＩ患者のＰＬＣの差
この新しい細胞型の正体を明らかにした後、ＰＬＣトランスクリプトームのクラスタリングを行い、アレムツズマブ治療前のＰＬＣに甲状腺イベントを有する患者間の質的な違いがあるかどうかを決定した。いくつかのマーカーの発現およびその相対的な割合が異なる別個のＰＬＣのサブセットが存在することが見出された（データは示さず）。サブセット１（「幼若／休止状態のＰＬＣ」）はｓＡＩ患者のほとんどのＰＬＣを含み、５人の患者がその代表である。血小板マーカーの発現がより低く、ＰＤＧＦＡ、抑制マーカー（ＰＤＣＤ１０）、および核タンパク質（ＤＡＢ２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１８、およびＴＳＣ２２Ｄ１）の発現がより高いことが特徴である。第２のサブセット（サブセット２、「成熟／活性化」ＰＬＣ）は、アクチン遺伝子ＡＣＴＢおよびＡＣＴＧ１、増殖因子、強力な化学誘引物質、ならびに好中球ＰＰＢＰの活性化因子が比較的多い。このサブセットはまた、ＳＰＡＲＣ遺伝子およびＴＲＥＭＬ１遺伝子の発現も豊富であった。これらの結果から、２つのサブセット間の成熟度と活性化状態との違いが示唆され、ＰＬＣの幼若／休止状態を示すサブセットは甲状腺イベントを有するものに豊富であった（図８）。
この新しい細胞型の正体を明らかにした後、ＰＬＣトランスクリプトームのクラスタリングを行い、アレムツズマブ治療前のＰＬＣに甲状腺イベントを有する患者間の質的な違いがあるかどうかを決定した。いくつかのマーカーの発現およびその相対的な割合が異なる別個のＰＬＣのサブセットが存在することが見出された（データは示さず）。サブセット１（「幼若／休止状態のＰＬＣ」）はｓＡＩ患者のほとんどのＰＬＣを含み、５人の患者がその代表である。血小板マーカーの発現がより低く、ＰＤＧＦＡ、抑制マーカー（ＰＤＣＤ１０）、および核タンパク質（ＤＡＢ２、ＲＧＳ１０、ＲＧＳ１８、およびＴＳＣ２２Ｄ１）の発現がより高いことが特徴である。第２のサブセット（サブセット２、「成熟／活性化」ＰＬＣ）は、アクチン遺伝子ＡＣＴＢおよびＡＣＴＧ１、増殖因子、強力な化学誘引物質、ならびに好中球ＰＰＢＰの活性化因子が比較的多い。このサブセットはまた、ＳＰＡＲＣ遺伝子およびＴＲＥＭＬ１遺伝子の発現も豊富であった。これらの結果から、２つのサブセット間の成熟度と活性化状態との違いが示唆され、ＰＬＣの幼若／休止状態を示すサブセットは甲状腺イベントを有するものに豊富であった（図８）。
【0082】
実際、ベースライン患者の１６１個の試料のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを教師なしクラスタリング解析したところ、二次的自己免疫を発症しなかった患者では、成熟ＰＬＣのマーカーである可能性がある６つの遺伝子（ＧＰ１ＢＡ、ＰＰＢＰ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＳＰＡＲＣ、およびＴＲＥＭＬ１）の相対発現レベルがより高いことが明らかになった（図９Ａ）。この所見は、甲状腺の活動性、人種、および性別などの患者の特徴とは無関係であった（図９Ｂ）。６つの成熟ＰＬＣ遺伝子（図１０Ａ）および５つの幼若ＰＬＣ遺伝子（ＰＤＣＤ１０、ＲＧＳ１０、ＤＡＢ２、ＴＳＣ２２Ｄ１、およびＲＧＳ１８）（図１０Ｂ）の発現レベルを、アレムツズマブ治療後０か月、１２か月、および２４か月で評価した。二次的自己免疫を発症した患者では、成熟ＰＬＣ遺伝子の発現レベルが有意に低下していた。二次的自己免疫を発症した患者では、幼若ＰＬＣ遺伝子の発現レベルはほぼ同じかわずかに減少していた。
【0083】
ＩＦＮβ－１ａで治療したＭＳ患者から得られた試料のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータについても同様に教師なしクラスタリング解析を行ったところ、同じ成熟ＰＬＣ遺伝子および幼若ＰＬＣ遺伝子で異なるクラスタリングパターンが見られ、これらはアレムツズマブ治療後の二次的自己免疫発症リスクの特異的マーカーであることが示唆された（図１１）。
【0084】
これらの研究は、アレムツズマブ治療後の甲状腺イベントを有するかまたは有さない患者における血小板成熟度の臨床的測定値の違いを示唆している。この仮説を検証するために、コホートで利用可能な幼若血小板比率（ＩＰＦ）データの解析を行い、甲状腺イベントのある患者は、ない患者と比較してＴ０でのＩＰＦが有意に増加していることが見出された（図１２Ａ）。さらに、甲状腺イベントのある患者は、２年の期間を通して毎月の測定でＩＰＦの追跡率がより高かった（図１２Ｂ）。Ｔ０での高ＩＰＦはｓＡＩに特異的ではない。しかしながら、相対的ＰＬＣの低値とＩＰＦの高値は共に、ＩＰＦの高値単独よりもより特異的な指標であるように思われる（図１３）。
【0085】
ＰＬＣ欠損がｓＡＩの不顕性発現とどのように関連しているかを調べるために、臨床的なｓＡＩイベントを認めなかったが自己抗体が検出されたコホート内の３人の追加の患者からデータを得て：２人は抗ＰＬＧＬＹ抗体、もう１人は抗ＴＰＯ抗体を有していた。ＰＬＣは３つの試料すべてに見られなかった（データは示さず）。
【0086】
次に、Ｔ０でのＰＬＣの数値が４年後以降のＡＩの結果を示すかどうかを検討した。同じ患者について７年間の追跡データを得た。７年間のデータは、４年間の追跡後にＡＩを発症した１人の患者を除いて、４年間のデータとほぼ一致していた。この患者はＴ０と比較してＴ２４でＰＬＣが劇的に低下していることが観察された（図２）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【国際調査報告】