▶ テンプル セラピューティクス ベスローテン フェンノートシャップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-28
(54)【発明の名称】末梢神経の線維症及び低酸素関連損傷を処置する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/198 20060101AFI20240521BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240521BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240521BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20240521BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240521BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240521BHJP
【ＦＩ】
A61K31/198
A61P25/02
A61P37/06
A61K38/05
A61K45/00
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023568494
(86)(22)【出願日】2022-05-04
(85)【翻訳文提出日】2023-12-21
(86)【国際出願番号】 IB2022054134
(87)【国際公開番号】W WO2022234489
(87)【国際公開日】2022-11-10
(31)【優先権主張番号】63/185,456
(32)【優先日】2021-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521005890
【氏名又は名称】テンプル セラピューティクス ベスローテン フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ゴーシュ ニラブ
(72)【発明者】
【氏名】グズマン ラファエル
【テーマコード（参考）】
4C084
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA09
4C084BA14
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA02
4C084MA16
4C084MA28
4C084MA34
4C084MA63
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084NA15
4C084ZA201
4C084ZA202
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA20
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA36
4C206MA48
4C206MA54
4C206MA83
4C206MA85
4C206MA86
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA20
4C206ZB08
4C206ZC75
(57)【要約】
本明細書には、末梢神経損傷、より詳細には末梢神経線維症などの低酸素関連組織損傷を処置及び予防するための方法及び組成物が記載される。記載される前記方法は、治療上有効量のグルタミンの供給源を末梢神経又は末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に投与することを含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において末梢神経線維症を処置又は予防する方法であって、前記方法は、１つ以上の末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に投与することを含み、グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中又は手術後に投与する、方法。
【請求項2】
１つ以上の追加用量のグルタミン供給源を、最初の投与の後の特定の期間、最初の投与の後の一定の時間間隔、及び／又は全ての外科的切開の閉鎖の直前に対象に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術中に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記外科的処置が、前記対象の腹腔に影響する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記外科的処置が、前記対象の胸腔に影響する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記外科的処置が、前記対象の頭部、頸部、又は脊椎に影響する、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記外科的処置が、前記対象の１つ以上の四肢に影響する、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記グルタミンの供給源が、グルタミンを含むオリゴペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記オリゴペプチドが、ジペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ジペプチドが、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記グルタミンの供給源が、Ｌ-グルタミンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記グルタミンの供給源が、Ｄ-グルタミンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記グルタミンの供給源を、追加の１つ以上の活性医薬成分と共に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記グルタミンの供給源を、注射、局所投与、経皮投与、又はイオントフォレーシスによって投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
外科的処置を受ける対象において、１つ以上の末梢神経における癒着を処置又は予防する方法であって、前記方法は、末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む組織に投与することを含み、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中又は手術後に投与する、方法。
【請求項16】
前記グルタミンの供給源が、グルタミンを含むオリゴペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記オリゴペプチドが、ジペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ジペプチドが、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
対象の１つ以上の末梢神経に対する低酸素関連損傷を処置又は予防する方法であって、前記方法は、低酸素関連組織損傷を受ける組織に対して治療上有効量のグルタミン供給源を外科的処置中に対象に投与することを含み、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中又は手術後に投与する、方法。
【請求項20】
前記外科的処置が、前記対象の腹腔に影響する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記外科的処置が、前記対象の胸腔に影響する、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記外科的処置が、前記対象の頭部、頸部、又は脊椎に影響する、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記外科的処置が、前記対象の１つ以上の四肢に影響する、請求項１９に記載の方法。
【請求項24】
前記グルタミン供給源中のグルタミンが、Ｌ-グルタミンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項25】
前記グルタミン供給源中のグルタミンが、Ｄ-グルタミンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項26】
１つ以上の末梢神経又は末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に有効量のグルタミンを投与することを含む、被験者の１つ以上の末梢神経に対する線維症の発生率を予防的に減少させる方法。
【請求項27】
低酸素関連の損傷を受けた末梢神経におけるＨＩＦ-１αを減少させる方法であって、前記方法は、１つ以上の末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む１つ以上の組織へ投与することを含み、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中、又は手術後に投与する、方法。
【請求項28】
有効量のグルタミンの供給源を含む、対象における末梢神経の癒着又は線維症の処置又は軽減のためのキットであって、前記グルタミンの供給源を、外科的移植可能なフィルム、注射物質、局所用クリーム及びイオントフォレーシスに適した剤形からなる群から選択される剤形として製剤化する、キット。
【請求項29】
前記グルタミンの供給源及び生物学的に許容される担体を含むプレフィルドシリンジをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項30】
前記グルタミンの供給源を含浸した外科用フィルムをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項31】
前記グルタミンの供給源が、約１０質量％～約５０質量％である、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象における低酸素関連組織損傷の処置に関する。より詳細には、本方法は、特定の投与計画に従って外科的処置の間に対象における低酸素関連組織損傷の処置に関する。
【背景技術】
【0002】
末梢神経系は、脳及び脊髄（中枢神経系）を全身につなぐ４３対の運動神経及び感覚神経のネットワークである。これらの神経は、感覚、運動及び運動協調の機能を制御している。前記神経は、もろく、及び末梢神経損傷（“ＰＮＩ”）は、外傷又は病期によって引き起こされ得る。慢性炎症、神経周囲癒着（ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、及び痕跡化（ｓｃａｒｉｎｇ）を伴う末梢神経線維症が、ＰＮＩ患者でしばしば報告される。
【0003】
ＰＮＩの重症度は、低酸素症を含む様々な病理生理学的状態の存在によって影響を受け得る。慢性的な低酸素症及び低酸素症の期間は、末梢性ポリニューロパチーを誘発することが報告されている。分子レベルにおいて、低酸素症に対する応答は、酸素依存性のα-サブユニット（ＨＩＦ-１α、ＨＩＦ-２α）及び酸素依存性のβ-サブユニットからなる低酸素誘導因子（ＨＩＦｓ）によって組織化される。ＨＩＦ-α-サブユニットは、構成的に発現し、及び酸素正常状態において速やかに分解される。しかしながら、低酸素下では、ＨＩＦ-１α及びＨＩＦ-２αは、安定化し、及び活性転写複合体を形成する。前記複合体は、多数の下流標的遺伝子のプロモーター領域で低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）に結合し、集合的に低酸素に対する適応反応を開始する。低酸素状態下で、前記αサブユニットは、核に転移し、及び前記βサブユニットと共にヘテロ二量体を形成する。前記ＨＩＦヘテロ二量体は、低酸素応答性因子に結合し、及びさらに他のコアクチベーターと会合し、遺伝子発現を制御する。ここ数年の研究から、ＨＩＦ１αシグナル伝達が、過剰なＥＣＭの活性及び産生を通じて、線維形成の促進に関与していることが示された。コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなどのＥＣＭ因子の過剰な沈着は、組織線維化の特徴であり、及びＨＩＦ１αは、低酸素条件下でＥＣＭ因子のアップレギュレーションに関与することが分かっている。さらに、線維性疾患におけるＨＩＦ１αの過剰発現は、線維症の病因にＨＩＦ１αが関与していることをさらに示している。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、末梢神経損傷、より詳細には末梢神経線維症などの低酸素関連組織損傷を処置及び予防するための化合物及び方法の必要性に関する。前記方法は、治療上有効な量のグルタミンの供給源を末梢神経又は末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に投与することを含む。
【0005】
一態様は、対象における末梢神経線維症を処置又は予防する方法であり、前記方法は、１つ以上の末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に投与することを含み、グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術の前、手術中、又は手術後に投与する方法である。いくつかの実施態様において、１つ以上の追加用量のグルタミン供給源を、最初の投与の後の特定の期間、最初の投与の後の一定の時間間隔、及び／又は全ての外科的切開の閉鎖の直前に、対象に投与する。いくつかの実施態様において、グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術中に投与する。いくつかの実施態様において、グルタミンの供給源は、グルタミンを含むオリゴペプチドである。いくつかの実施態様において、前記オリゴペプチドは、ジペプチドである。いくつかの実施態様において、前記ジペプチドは、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンである。
【0006】
別の態様は、外科的処置を受けている対象において、１つ以上の末梢神経における癒着を処置又は予防する方法であって、前記方法は、末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む組織に投与することを含み、前記グルタミンの供給源は、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中、又は手術後に投与する方法である。
【0007】
別の態様は、対象の１つ以上の末梢神経に対する低酸素組織関連損傷を処置又は予防する方法であって、前記方法は、外科的処置の間に対象に低酸素関連組織損傷を受ける組織に治療上有効量のグルタミン供給源を投与する方法を含み、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中、又は手術後に投与する方法である。
【0008】
別の態様は、１つ以上の末梢神経又は前記末梢神経を取り囲む１つ以上の組織に有効量のグルタミンを投与することを含む、対象の１つ以上の末梢神経に対する線維症の発生率を予防的に減少させる方法である。
【0009】
別の態様は、低酸素関連の損傷をうけた末梢神経におけるＨＩＦ-１αを減少させる方法であって、前記方法は、１つ以上の末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む１つ以上の組織へ投与することを含み、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術前、手術中、又は手術後に投与することを含む方法である。
【0010】
別の態様は、有効量のグルタミンの供給源を含む、対象における末梢神経の癒着又は線維症の処置又は軽減のためのキットであり、前記グルタミンの供給源は、外科的移植可能なフィルム、注射物質、局所用クリーム、及びイオントフォレーシスに適した剤形からなる群から選択される剤形として製剤化される、キットである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
（図面及び現在好ましい実施形態の詳細な説明）
以下の段落は、本明細書に記載の前記発明の実施態様をより詳細に定義する。以下の実施態様は、本明細書に記載される本発明、実施態様、又は特定の態様の範囲から逸脱することなく、適切な変更及び適合がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかであるように、本発明を限定すること又はその範囲を狭めることを意味するものではない。本明細書に引用される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
以下の段落は、本明細書に記載の前記発明の実施態様をより詳細に定義する。以下の実施態様は、本明細書に記載される本発明、実施態様、又は特定の態様の範囲から逸脱することなく、適切な変更及び適合がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかであるように、本発明を限定すること又はその範囲を狭めることを意味するものではない。本明細書に引用される全ての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0013】
“グルタミン供給源”又は“グルタミンの供給源”という用語は、グルタミン及びその生理学的に許容される塩、並びに本明細書に記載されるようなグルタミンコンジュゲート及びグルタミンを含むペプチドを含む。
“投薬量”又は“用量”又は“剤形”という用語は、本明細書で使用される場合、単回投与又は複数回投与で療法効果を生み出すのに十分な量を含有するグルタミン供給源の任意の形態又は製剤を指す。
“外科的切開”という用語は、本明細書で使用される場合、腹腔鏡又は他の最小侵襲手術的技法のために作られた切開又は侵入点を含む外科的処置の前又は最中に、メス、レーザー、又は他の切断器具などの切断器具により作られた創傷を意味する。
“の予防”という用語は、本明細書で使用される場合、低減させるという意味を含む。低減量は、約０．００１％～約１００％であり得る。
“有効量”という用語は、所望の効果を達成する量である。例えば、本発明において、１つ以上のグルタミン供給源の有効量は、１つ以上の投与後に、低酸素関連組織損傷を予防又は低減する量である。
“薬物負荷”という用語は、本明細書で使用される場合、剤形の合計質量に対するグルタミン供給源の質量％を指す。
“製剤”又は“組成物”という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わされたグルタミン供給源を指す。
“長期放出（ｅｘｔｅｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）”又は“持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）”という用語は、本明細書で使用される場合、生理学的条件下又はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、長期間にわたり所望のプロファイルに従って活性成分を放出する組成物を指す。“長期間”とは、少なくとも約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、又はそれよりも更に長期の、具体的には生理学的条件下又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１８時間の期間にわたる連続した期間を意味する。
“遅延放出”という用語は、本明細書で使用される場合、活性成分が初期に放出されないように、例えば、数日、数分間又は数時間の期間後に、活性成分を放出する組成物を指す。遅延放出組成物は、例えば、生理学的条件下で又はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ある特定の期間後に剤形からの薬物又は有効成分の放出を提供することができる。
“投薬量”又は“用量”又は“剤形”という用語は、本明細書で使用される場合、単回投与又は複数回投与で療法効果を生み出すのに十分な量を含有するグルタミン供給源の任意の形態又は製剤を指す。
“外科的切開”という用語は、本明細書で使用される場合、腹腔鏡又は他の最小侵襲手術的技法のために作られた切開又は侵入点を含む外科的処置の前又は最中に、メス、レーザー、又は他の切断器具などの切断器具により作られた創傷を意味する。
“の予防”という用語は、本明細書で使用される場合、低減させるという意味を含む。低減量は、約０．００１％～約１００％であり得る。
“有効量”という用語は、所望の効果を達成する量である。例えば、本発明において、１つ以上のグルタミン供給源の有効量は、１つ以上の投与後に、低酸素関連組織損傷を予防又は低減する量である。
“薬物負荷”という用語は、本明細書で使用される場合、剤形の合計質量に対するグルタミン供給源の質量％を指す。
“製剤”又は“組成物”という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わされたグルタミン供給源を指す。
“長期放出（ｅｘｔｅｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）”又は“持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）”という用語は、本明細書で使用される場合、生理学的条件下又はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、長期間にわたり所望のプロファイルに従って活性成分を放出する組成物を指す。“長期間”とは、少なくとも約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、又はそれよりも更に長期の、具体的には生理学的条件下又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて約１８時間の期間にわたる連続した期間を意味する。
“遅延放出”という用語は、本明細書で使用される場合、活性成分が初期に放出されないように、例えば、数日、数分間又は数時間の期間後に、活性成分を放出する組成物を指す。遅延放出組成物は、例えば、生理学的条件下で又はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、ある特定の期間後に剤形からの薬物又は有効成分の放出を提供することができる。
【0014】
“処置”という用語は、障害に関連する状態、症状、障害、若しくはパラメータ、又はそれらの起こり易さを改善する（例えば、療法効果）ために有効な量、様式、又はモードで療法を施すことを指す。いくつかの実施態様において、“処置”という用語は、外科手術後の癒着形成を処置又は予防することを指す。他の実施態様では、“処置”という用語は、外科的手術を受けている患者の低酸素関連組織損傷を処置又は予防することを指す。
“予防的に処置する”という用語は、障害に関連する状態、症状、障害、若しくはパラメータを被る前にある量での療法を施すこと、又はそれらの起こり易さを低減することを指す。
“対象”という用語は、動物及びヒトを含むあらゆる哺乳動物を指す。前記対象は、その処置を必要とする医学的な患者であってもよい。一実施形態では、対象はヒトである。
“予防する”又は“低減する”という用語は、統計的に有意な程度又は当業者が検出可能な程度のいずれかまで、癒着又は線維症などの障害の進行を予防又は低減することを指す。
“実質的に”という用語は、本明細書で使用される場合、完全ではないが、重大な又は著しい程度であることを意味する。
“ａ”又は“ａｎ”は、本明細書で使用される場合、別様の指定がない限り、１つ又は複数を意味する。
“含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）”、“含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）”、“含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、及び“有すること（ｈａｖｉｎｇ）”等の用語は“含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”を意味する。
“予防的に処置する”という用語は、障害に関連する状態、症状、障害、若しくはパラメータを被る前にある量での療法を施すこと、又はそれらの起こり易さを低減することを指す。
“対象”という用語は、動物及びヒトを含むあらゆる哺乳動物を指す。前記対象は、その処置を必要とする医学的な患者であってもよい。一実施形態では、対象はヒトである。
“予防する”又は“低減する”という用語は、統計的に有意な程度又は当業者が検出可能な程度のいずれかまで、癒着又は線維症などの障害の進行を予防又は低減することを指す。
“実質的に”という用語は、本明細書で使用される場合、完全ではないが、重大な又は著しい程度であることを意味する。
“ａ”又は“ａｎ”は、本明細書で使用される場合、別様の指定がない限り、１つ又は複数を意味する。
“含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）”、“含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）”、“含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、及び“有すること（ｈａｖｉｎｇ）”等の用語は“含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”を意味する。
【0015】
本明細書に記載されるのは、低酸素関連組織損傷を処置するための方法であり、及び特に、特定の時間にグルタミン供給源を投与することによって末梢神経損傷及び末梢神経の線維性癒着を予防又は処置するための方法である。本明細書に記載される前記方法は、特定の期間内に少なくとも１回、対象にグルタミン供給源を投与することを含む。特定の実施態様において、前記グルタミン供給源を、対象に１回以上投与する。例えば、対象は、指定された期間内にグルタミン供給源の最初の用量を受け、次いで、指定された期間、一定の時間間隔、及び／又は全ての外科的切開の閉鎖の直前、及び／又は手術の完了後の期間にグルタミン供給源の１回以上の追加用量を受ける。
【0016】
本明細書に記載されるいくつかの実施態様は、末梢神経に対する低酸素関連組織損傷又は線維症を処置又は軽減する方法である。線維症は、コラーゲンの過剰な沈着、ＥＣＭマトリックスの収縮、組織損傷及び異常な創傷治癒によって特徴づけられる。痕跡化及び組織線維化は、線維芽細胞を含むエフェクター細胞の過剰活性化によって引き起こされる。線維芽細胞の過剰活性化及び筋線維芽細胞への分化は、コラーゲン形成及び痕跡組織の形成の量の差を生じさせる。末梢神経における過剰なコラーゲンの沈着は、損傷部位での軸索再生を阻害する。さらに、コラーゲンの架橋は、プロテアーゼ分解に抵抗力のある組織破壊を誘導する。慢性的な損傷による組織の線維化は、いくつかの細胞内及び細胞外因子の一連の生化学的シグナル伝達が関与する。これに加えて、低酸素の微小環境の存在は、組織損傷及び末梢性ニューロパチーを促進し得る。
【0017】
ＨＩＦ-１は、線維芽細胞に作用し、低酸素条件下でＥＣＭマトリックスを制御することにより、組織構造及び線維症の重要なレギュレーターになっている。併せて、有力な証拠は、ＨＩＦ１αが、様々な臓器の複雑な線維化を調節し、及びＨＩＦ１αのシグナル伝達は、臨床的に重要であることを示唆する。線維芽細胞及びマクロファージの病理学的結果に対するその役割は、ＰＮＩにおける薬理学的及び遺伝学的阻害のターゲットとしても適している。さらに、ＨＩＦ-１シグナル伝達カスケードのいくつかの構成要素は、様々な細胞外増殖因子の生化学的シグナル伝達を制御しており、組織リモデリングにおけるその多様な役割をさらに示している。
【0018】
グルタミンは、吸収が良く、創傷治癒を促進し、並びに好中球、マクロファージ、及びリンパ球の機能を調節する条件付き必須アミノ酸である。抗酸化作用のあるグルタチオンの産生のための基質としても機能する。異化ストレス（外傷、敗血症、熱傷）の間、グルタミンを、筋肉の貯蔵から血清中に放出し、及び筋肉中のグルタミンの細胞内レベルは、低下する。前記組織、特に内臓器官は、グルタミンを急速に取り込み、及びグルタミンの血清濃度は、その後に低下する。以前の研究では、ラットモデルにおいて腹膜癒着形成を予防するグルタミン含有溶液の有効性が実証されている。米国特許第９，０１１，８８３号を参照。
【0019】
さらに、グルタミンは、安全であり、吸収が良く、及び副作用は報告されていない。グルタミンは、創傷治癒を促進することが知られている。グルタミン及びそのジペプチドは、重症患者及び他の臨床現場において、非経口及び経腸的な補足成分として使用されてきた。グルタミンの供給源の最初の使用は、経腸投与（例えば、食品サプリメント）又は静脈経路による非経口投与のいずれかで採用されてきた。少なくとも１つの研究は、腹膜などの高血管領域へのグルタミンの投与を記載しており、血管系に容易に吸収されやすい。これらの部位では、Ｌ-グルタミンは、脈管切除及び癒着形成を引き起こす腹膜縫合による血管新生の喪失を予防した。従って、グルタミンは、血管系に取り込まれ及び血管新生の喪失を防ぐことにより、線維化及び癒着形成を防ぐことができると考えられた。本明細書に記載されるように、グルタミン供給源の末梢神経又は前記末梢神経を取り囲む細胞への適応は、線維症及びそれに伴う癒着が著しく減少させることが発見された。
【0020】
本明細書に記載されるいくつかの実施態様は、外科的処置を受けている対象の癒着形成、線維症、又は低酸素関連組織損傷を処置又は低減する方法である。本明細書で企図される例示的及び非限定的な外科的処置は、対象の頭部若しくは頸部、骨盤腔、腹腔、胸腔、又は１つ以上の対象の四肢に影響を及ぼす手術及び処置を含む。骨盤腔に影響を及ぼす手術の例は、これらに限定されないが、筋腫析出術、卵巣摘出術、子宮摘出術、子宮内膜症の除去、卵管結紮術を含み、つまり、これらに限定されないが、子宮、卵巣、管、前立腺、尿道を含む生殖器官、並びに膀胱、骨盤結腸、及び直腸のいずれかに関与する任意の腹腔鏡、腹壁切開、若しくは開放手術あるいは処置（拡張及び掻爬、ＩＶＦ等の子宮の膣内処置を含む）、又は主要な動脈、静脈、筋肉、及び骨盤腔の神経、膜、靭帯、若しくは内臓に関与する任意の手術が含まれる。腹腔に影響を及ぼす手術の例としては、これらに限定されないが、胆嚢摘出、肝臓切除、ラップバンド手術、結腸吻合、虫垂切除術、つまり、胃、肝臓、膵臓、脾臓、胆嚢、腎臓、並びに小腸及び大腸のほとんどに関与する任意の手術、主要な動脈、静脈、筋肉、及び腹腔の神経、膜、靭帯、又は内臓に関与する任意の手術を含む。胸腔に影響を及ぼす手術の例としては、これらに限定されないが、腹腔鏡又は腹壁切開又は開胸心血管手術及び処置、肺手術、肝臓手術、胆嚢手術、主要な動脈、静脈、筋肉、及び胸腔の神経、膜、靭帯、骨、又は内臓に関与する任意の手術を含む。対象の四肢の１つ以上に影響を及ぼす手術の例としては、これらに限定されないが、腕、脚、肘、肩、脊椎に関与する腹腔鏡又は腹壁切開又は開放手術を含むが、これらに限定されないが、主要な動脈、静脈、筋肉、及び神経、膜、靭帯、骨、又は内臓に関与する任意の手術を含み、頭頸部に影響を及ぼす手術の例としては、これらに限定されないが、脳眼科手術又は処置、耳、鼻咽頭、歯、歯茎及び顎の手術又は処置、顔、頭部及び頸部の美容再建手術及び処置、歯、歯茎及び顎の美容処置、主要な動脈、静脈、筋肉、及び頭頸部の神経、膜、靭帯、骨、又は内臓に関与する任意の手術を含む、腹腔鏡又は腹壁切開又は開放手術及び処置を含む。
【0021】
一実施態様において、グルタミンの供給源を、対象に１つ以上の末梢神経を含む手術の前、同時、又は後に投与する。事前の投与は、１つ以上の末梢神経が、線維症及び最終的な癒着を受けることから保護される。ある場合にはグルタミンの供給源の事前投与は、対象の関節炎及び手術後の回復時間をさらに短縮又は処置し得る。別の実施態様において、グルタミンの供給源を、１つ以上の末梢神経を含む手術を受けた後に対象に投与する。同様に、１つ以上の末梢神経を、さらなる線維化及び癒着を受けることから保護する。グルタミンの供給源の投与は、癒着を減少させ得ると考えられる。
【0022】
別の実施態様では、グルタミンの供給源を、対象が１つ以上の末梢神経に損傷を受けた後に、投与する。前記末梢神経の損傷は、事故、転倒、又はスポーツによって神経が引き伸ばされたり、圧迫されたり、押しつぶされたり、若しくは切断すること；糖尿病、ギラン-バレー症候群、及び手根管症候群などの医学的状態；狼瘡、関節リウマチ、シェーグレン症候群を含む自己免疫疾患；並びに動脈の狭窄、ホルモンバランスの乱れ及び腫瘍、化学療法又は放射線療法を含む癌治療を含む他の原因から生じ得る。
【0023】
いくつかの実施態様において、対象は、以前に１つ以上の末梢神経に手術又は損傷を受け、及びグルタミンの供給源を投与され、及び末梢神経の線維症及び／又は癒着の量の減少を有する。いくつかの実施態様において、対象の末梢神経における線維症及び癒着の減少の量は、グルタミンの供給源の投与後の被験者において少なくとも１０％である。いくつかの実施態様において、過去に手術又は損傷を有する対象内の癒着の減少の量は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、又はさらには１００％である。
【0024】
いくつかの実施態様において、線維症、炎症、血管新生、免疫細胞湿潤、痕跡化、関節柔軟性の低下、関節痛、若しくはそれらの状態の組み合わせを含む、１つ以上の末梢神経又は末梢神経に隣接した若しくは末梢神経を取り囲む１つ以上の組織の１つ以上の病理学的状態は、対象の１つ以上の末梢神経又は１つ以上の末梢神経を取り囲む１つ以上の組織にグルタミンの供給源を投与することにより軽減される。
【0025】
いくつかの実施態様において、末梢神経の１つ以上の病理学的状態の減少の量は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％又はさらに１００％まで減少する。前記末梢神経のこれらの病理学的状態を、当技術分野で公知の臨床試験により評価し得る。
【0026】
いくつかの実施態様において、グルタミンの供給源を、末梢神経又は末梢神経の周りを取り囲む１つ以上の組織におけるグルタミンの滞留時間の増加を指せる方法で、１つ以上の末梢神経に投与する。いかなる理論にも縛られることなく、グルタミンが、癒着又は線維症の事象を受けやすい末梢神経又は組織と接触している時間を増加させることは、癒着又は線維症の程度をより大きく軽減すると考えられる。グルタミンは、本質的に回転率が高く、及びリンパ球及びマクロファージを含む免疫細胞に速やかに吸収される。
【0027】
いくつかの実施態様において、グルタミンの供給源を、単回投与で１つ以上の末梢神経に投与し、有効量のグルタミンは、少なくとも約３０分～約４８時間、投与部位又はその近くで保持される。いくつかの実施態様において、単回投与後の有効量のグルタミンは、少なくとも約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、又は約４８時間、投与部位又はその近くで保持される。
【0028】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される末梢神経の癒着又は１つ以上の病理学的状態を軽減するためのグルタミンの供給源の有効量を、単回投与量で投与する。いくつかの実施態様において、単回投与で投与されるグルタミンの供給源の量は、対象の体重の約０．０００１ｇ／ｋｇ～約５ｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施態様において、単回投与で投与されるグルタミンの供給源の量は、約０．０００１ｇ／ｋｇ、約０．００１ｇ／ｋｇ、約０．０１ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約１ｇ／ｋｇ、約１．５ｇ／ｋｇ、約２ｇ／ｋｇ、約２．５ｇ／ｋｇ、約３ｇ／ｋｇ、約３．５ｇ／ｋｇ、約４ｇ／ｋｇ、約４．５ｇ／ｋｇ、約５ｇ／ｋｇである。対象に投与されるグルタミンの供給源の正確な量は、処置される前記末梢神経が受けた手術又は損傷、並びに対象の既存の線維性又は癒着の量及び病歴に応じて異なる。グルタミンは、無害なアミノ酸であるため、予期される副作用はなく、大量に投与し得る。
【0029】
本明細書に記載されるいくつかの実施態様は、対象における末梢神経線維症及び癒着を軽減するための医薬剤形である。いくつかの実施態様は、本明細書に記載される医薬剤形で、それを必要とする対象を処置するための方法である。適切な医薬剤形は、組織または末梢神経を取り囲む組織に投与するための、グルタミンの供給源及び他の医薬的に許容される担体並びに賦形剤を含む。
【0030】
いくつかの実施態様において、グルタミン供給源は、グルタミン又は任意の薬学的に許容されるその塩を含む。いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源は、Ｄ-グルタミン（Ｄ-ｇｌｕｔａｔｉｍｅ）を含むか、若しくはＤ-グルタミンであるか、又はＬ-グルタミンを含むか、若しくはＬ-グルタミンである。Ｌ-グルタミンは、比較的低い水溶性（すなわち、室温で約４０ｇ／Ｌ）及び保管中の低い安定性を有することが知られている。
【0031】
従って、グルタミンの供給源は、また、さらなるキャリアアミノ酸を含むことができ、又はグルタミンは、オリゴペプチドの一部として組み込まれることができ、Ｌ-グルタミンの溶解度及び安定性の一方若しくは両方を増加させ得る。前記オリゴペプチドは、任意の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸を含み得る。適切なオリゴペプチドは、Ｌ-グルタミンを含み、及びＬ-グルタミンを供給するために代謝されることができる。好ましくは、そのようなペプチドは、Ｌ-グルタミンの増加した水溶性及び増加した安定性を示す。多くの場合、そのようなペプチドは、また、殺菌及び保存中の分解に対する増加した耐性を示す。Ｌ-グルタミンを含むオリゴペプチドは、当技術分野で公知の切断可能なリンカーペプチド部分をさらに含み得る。これらの切断可能なリンカーを、様々な骨格及びインプラントへの付着のため、並びに本明細書に記載される投与方法のために利用し得る。いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源は、ジペプチドの一部として組み込まれたＬ-グルタミンである。使用され得る２つのそのようなジペプチドは、Ｌ-グルタミン及びＬ-アラニン又はグリシンのいずれかを含むジペプチドである。前記ジペプチドのアラニル-グルタミン（Ｃ末端にグルタミン残基）は、水への高い溶解性（５６８ｇ／Ｌ）を有する。グリシル-グルタミン（Ｃ末端にグルタミン）も、グルタミンに比べて水への高い溶解性を有する（１５４ｇ／Ｌ）。後者のジペプチドのそれぞれは、加熱殺菌及び長期保存に十分安定であるため、それらは、静脈注射用の完全非経口栄養製剤に以前から採用されている。従って、一実施態様において、前記グルタミンの供給源は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンを含む。他の実施態様において、前記グルタミンの供給源は、ジペプチドの一部として組み込まれたＤ-グルタミンを含む。使用され得る２つのそのようなペプチドは、Ｄ-グルタミン及びＤ-アラニン又はグリシンのいずれかを含むジペプチドである。従って、一実施態様において、前記グルタミンの供給源は、Ｄ-アラニル-Ｄ-グルタミンを含む。いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源は、グルタミンを含むオリゴペプチドの一部として供給され、当該グルタミンの供給源の水溶性及び水溶液中での安定性は、グルタミン単体よりも高い。他の実施態様において、前記グルタミン供給源は、グルタミンコンジュゲートであり、少なくとも１つのグルタミン残基は、アミノエステル結合を介して化合物と結合している。そのようなグルタミン供給源の例は、ジクロロアセチルグルタミン、アセチルグルタミン、ブチリルグルタミン、ピルビルグルタミン、及びアミノエステル結合を介して任意の他の適切な有機酸とコンジュゲートしたグルタミンを含むが、これらに限定されない。
【0032】
Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンは、創傷治癒、免疫調節並びにＥＣＭマトリックス及び腹膜線維症の調節を促進する能力として知られるジペプチドである。私たちは、線維症組織における低酸素症は、傷害及び組織損傷の程度に応じて、慢性的なもの及び急性のものであり得ると考える。慢性低酸素症は、正確な傷害部位に存在すると仮定され、私たちは、一貫した低酸素症又は連続的な低酸素症として表現した。一方で、急性低酸素症は、不規則又は一時的な低酸素症に代表されるような正確な傷害部位から末梢端に存在し得る。任意の特定の理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、驚くべきことに低酸素の初代ラットの線維芽細胞にＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンなどのグルタミン供給源を投与すると、ＨＩＦ１-αが劇的にダウンレギュレートすることを見出した。さらに、ＨＩＦ１-αは、ＳＭＡＤシグナル伝達を含む他の線維化促進因子を調節するので、本発明者らは、グルタミン供給源がこれらの因子も同様にダウンレギュレートできることを見出した。結果的に、本発明者らは、グルタミン供給源を投与すること、観察により、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが低酸素傷害の両方の様式（慢性的な及び一時的な）を調整するという結論に至った。
【0033】
Ｌ-グルタミン及びペプチドを含むＬ-グルタミン（Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンを含む）の薬学的に許容される製剤は、市販されている。さらに、本明細書に記載される方法において使用するためのペプチドを含むＬ-グルタミンも、既知の方法論に従って合成することができ、並びに医薬的使用のために精製及び殺菌し得る。他の薬学的に許容されるものを、Ｄ-グルタミン及びペプチドを含むＤ-グルタミン（Ｄ-アラニル-Ｄ-グルタミンを含む）の調製物含むがこれらに限定されない、本発明の実施態様に従って調製し得る。
【0034】
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、１つ以上の追加の医薬品有効成分と投与する。前記追加の医薬品有効成分を、グルタミンの供給源と同様の方法又は異なる適切な非経口的方法若しくは経腸的方法で投与することができる。いくつかの実施態様において、追加の１つ以上の医薬品有効成分を、グルタミンの供給源の投与前、投与と同時に、又は投与後に同じ投与経路によってグルタミンの供給源とともに投与する。他の実施態様において、追加の１つ以上の医薬品有効成分を、グルタミンの供給源の投与前、投与と同時に、又は投与後に異なる投与経路によってグルタミンの供給源とともに投与する。適切な医薬品有効成分は、関節痛、炎症、又は癒着を処置するために使用される任意の医薬品又は薬剤を含む。例示的な及び非限定的な医薬品は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）アセクロフェナック、アセメタシン、アモキシプリン（ａｍｏｘｉｐｒｉｎ）、アスピリン、アザプロパゾン、ベノリラート、ブロムフェナク、カルプロフェン、セレコキシブ、サリチル酸コリンマグネシウム、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、エトリコキシブ、ファイスラミン（ｆａｉｓｌａｍｉｎｅ）、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、メロキシカム、メクロフェナミン酸、メフェナム酸、メロキシカム、メタミゾール、サリチル酸メチル、サリチル酸マグネシウム、ナブメトン、ナプロキセン、ニメスリド、オキシフェンブタゾン、パレコキシブ、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サリチル酸サリチル、スリンダク、スルフィンピラゾン、スプロフェン、テノキシカム、チアプロフェン酸、トルメチン、又はバルデコキシブ；セレコキシブ、ロフェコキシブ、プロスタグランジンなどの選択的ＣＯＸ-２阻害剤；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、及びグルコサミンなどの抗関節炎サプリメント；ベタメタゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンなどのコルチコステロイドを含む。前記グルタミンの供給源を、葉酸代謝拮抗薬（ａｎｔｉ-ｆｏｌａｔｅｓ）、メトトレキサート、レフルノミド、ミコフェノール酸モフェチル、スルファサラジン、アプレミラスト、トファミチニブ；トシリズマブ、セルトリズマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アバタセプト、インフリキシマブ、及びリツキシマブなどの生物製剤を含むが、これらに限定されない疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）などの抗自己免疫疾患薬さらに投与し得る。
【0035】
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、関節内注射、局所投与、経皮投与、イオンフォレーシス、又は外科的に投与する。
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、当技術分野で公知の関節内注射方法を含む注射によって、末梢神経又は末梢神経を取り囲む組織への送達のために処方する。一実施態様において、前記グルタミン供給源（例えば、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン）を、減菌蒸留水、減菌等張液、減菌生理食塩水、又は希釈されるとそのような溶液を形成する乾燥緩衝剤及び／又は塩混合物若しくは濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）などの薬学的に許容され得る担体とともに、水溶液の一部として製剤化し得る。
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、当技術分野で公知の関節内注射方法を含む注射によって、末梢神経又は末梢神経を取り囲む組織への送達のために処方する。一実施態様において、前記グルタミン供給源（例えば、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン）を、減菌蒸留水、減菌等張液、減菌生理食塩水、又は希釈されるとそのような溶液を形成する乾燥緩衝剤及び／又は塩混合物若しくは濃縮物（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）などの薬学的に許容され得る担体とともに、水溶液の一部として製剤化し得る。
【0036】
いくつかの実施態様において、前記製剤は、水相に溶解したグルタミン供給源を含む、液体、ペースト、微粒子（リポソーム及び他の小胞を含むが、これらに限定されない）、又はゲルであり得る。本明細書に記載される組成物は、そのような製剤であることができ、又は水和した場合にそのような製剤を生成することを意図した組成物であり得る。その最も簡単な形態において、本発明で使用するための製剤は、減菌水性液体ビヒクルに溶解したグルタミン供給源からなり、手術中に末梢神経に注入するために、又はその後に実施される関節内注射のために適している。前記製剤を、腹腔鏡手術又は椎弓切除術の際に作成されたポートから注入し得る。
【0037】
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、ゲル又はヒドロゲルの一部として製剤化する。ヒドロゲル製剤は、例えば、Ｌ-グルタミン又は少なくとも１つのグルタミン残基を含むジペプチド若しくはトリペプチドを含む適切な薬物の長期送達を可能にする。ヒドロゲルは、典型的には、薬物の高濃度適用をさらに可能にするデポー（ｄｅｐｏｔ）を形成する。グルタミンの供給源を含む前記ヒドロゲルを、投与前に生成し、及びさらなる移植のためにグルタミンの供給源を含浸し得る。あるいは、ｐＨ及び温度を含む環境変化後にｉｎ ｓｉｔｕで形成するヒドロゲルを、関節内注射に利用し得る。ｉｎ ｓｉｔｕヒドロゲル形成のための様々な物理的及び化学的架橋ポリマーが、当技術分野で公知である。例示的な及び非例示的なヒドロゲルは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）プロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（乳酸-Ｃｏ-グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｎ-イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリ（カプロラクトン）等のブロックを含むコポリマーが挙げられ得る。適切なヒドロゲルは、また、天然に存在するタンパク質及びペプチドから生成され得る。特定のヒドロゲル製剤は、適用部位又は処置される特定の関節によって決定され得る。
【0038】
いくつかの実施態様において、前記グルタミンの供給源を、当該グルタミンの供給源を含む移植可能なフィルムの一部として製剤化する。前記グルタミン供給源を、外科的に移植可能なフィルム又は他の外科的インプラントに適応又は含浸させ得る。例えば、前記グルタミンの供給源を、ゲルの一部として製剤化することができ、及びインプラントの外部に付着させ得る。Ｅｔｈｉｃｏｎ社からＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（登録商標）として市販されている織られた再吸収性セルロースなどの物質からなるインプラントを、本発明の液体製剤又はゲル製剤で含浸し得る。企図される他のフィルムは、ポリエステルアミドベースフィルム（ＰＥＡ-III）（例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１４／０５３５４２号Ａ１を参照）を含む。いくつかの他の実施態様において、前記グルタミンの供給源は、局所投与、経皮投与、又はイオントフォレーシス投与のために製剤化される。
【0039】
いくつかの実施態様において、剤形内のグルタミンの供給源の薬物負荷は、指定範囲内の各整数を含む、約２％～約９０％である。いくつかの実施態様において、前記薬物負荷は、約１０％～約８０％である。いくつかの実施態様において、前記薬物負荷は、約２０％～約６０％である。いくつかの実施態様において、前記薬物負荷は、約２０％～約５０％である。いくつかの実施態様において、前記薬物負荷は、約２０％～約４０％である。いくつかの実施態様において、前記薬物負荷は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、又は約９０％である。
【0040】
いくつかの実施態様において、前記薬物は、移植可能なフィルムに含浸されている。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、指定範囲内の各整数を含む、約２％～約９０％である。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約１０％～約８０％である。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約２０％～約６０％である。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約２０％～約５０％である。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約２０％～約４０％である。いくつかの実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、又は約９０％である。一実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約３０％である。別の実施態様において、移植可能なフィルム中の前記薬物負荷は、約５０％である。
【0041】
いくつかの実施態様において、グルタミンの供給源を含む剤形は、数か月間又は数年間にわたって安定である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のグルタミンの供給源の医薬剤形は、２５℃及び６０％の相対湿度（ＲＨ）で、約１か月間、約２か月間、約３か月間、約４か月間、約５か月間、約６か月間、約９か月間、約１０か月間、約１１か月間、約１２か月間、又はさらに長期間にわたって安定である。
【0042】
本明細書に記載のいくつかの実施態様は、対象における末梢神経線維症又は癒着を予防又は軽減するためのキットである。本明細書に記載の前記キットは、本明細書に記載の適切な剤形のグルタミンの供給源（例えば、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン）を含む。本明細書に記載の前記キットは、処置される末梢神経に応じた指示及び適切な投与スケジュールをさらに含む。一実施態様において、前記キットは、注射物質として供給される剤形を含む。別の実施態様において、剤形は、前記グルタミンの供給源を含浸させたフィルムである剤形を含む。別の実施態様において、前記キットは、局所クリームである剤形を含む。別の実施態様において、前記キットは、イオントフォレーシス送達に適した剤形を含む。いくつかの実施態様において、前記キットは、それを必要とする対象への投与のための複数の剤形を含む。
【実施例】
【0043】
試験は、ラットの坐骨神経から単離及び精製した低酸素の初代線維芽細胞のＨＩＦ１αを介した線維化反応を制御するＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの能力を調査した。
【0044】
（ラット線維芽細胞の単離及び培養）
地元の獣医委員会及び州の獣医局は、安楽死、坐骨神経の採取、及び初代線維芽細胞の単離にさらに使用することを含む我々の試験及び動物プロトコルを承認した。成体のスプラーグドーリーラットを、ＣＯ2ガスチャンバーを用いて安楽死させ、並びに坐骨神経を、無菌状態ですぐに解剖し、及び氷冷したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）に入れた。各成体の坐骨神経は、Ｓｔｅｒｅｏ解剖顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｓｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、ドイツ）下で作業しながら、筋肉、脂肪及び血管を含む余分な組織を取り除いた。その後、神経上膜を、細かい鉗子を用いて剥がした。続いて、神経セグメントを小さい断片（２～５ｎｍ）に切り離し、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地を補充した６-ウェルプレートに５～６個のセグメントを１２～１４日間置いた。培地は、通常、２～３日ごとに交換した。初代線維芽細胞は、神経細胞から発生し（図１Ａ）、及び細胞が、コンフルエンシーに近づくと、組織セグメントを、鉗子を用いて６-ウェルプレートから取り除いた。細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄して、組織の残骸を除去し、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン化し、続いて１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を、トリパンブルーを用いてカウントし、及びさらなる実験までＴ２５／Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングした。実験の前に、単離した全ての細胞を、α-ＳＭＡ、ＨＳＰ４７及びＶｉｍｅｎｔｉｎで染色し、これらの細胞の表現型を確認した（図１Ｂ）。初代ラット線維芽細胞を用いた全ての実験を、初代～５代まで実施した。
地元の獣医委員会及び州の獣医局は、安楽死、坐骨神経の採取、及び初代線維芽細胞の単離にさらに使用することを含む我々の試験及び動物プロトコルを承認した。成体のスプラーグドーリーラットを、ＣＯ2ガスチャンバーを用いて安楽死させ、並びに坐骨神経を、無菌状態ですぐに解剖し、及び氷冷したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）に入れた。各成体の坐骨神経は、Ｓｔｅｒｅｏ解剖顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｓｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ、ドイツ）下で作業しながら、筋肉、脂肪及び血管を含む余分な組織を取り除いた。その後、神経上膜を、細かい鉗子を用いて剥がした。続いて、神経セグメントを小さい断片（２～５ｎｍ）に切り離し、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＢＩ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地を補充した６-ウェルプレートに５～６個のセグメントを１２～１４日間置いた。培地は、通常、２～３日ごとに交換した。初代線維芽細胞は、神経細胞から発生し（図１Ａ）、及び細胞が、コンフルエンシーに近づくと、組織セグメントを、鉗子を用いて６-ウェルプレートから取り除いた。細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄して、組織の残骸を除去し、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン化し、続いて１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を、トリパンブルーを用いてカウントし、及びさらなる実験までＴ２５／Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にプレーティングした。実験の前に、単離した全ての細胞を、α-ＳＭＡ、ＨＳＰ４７及びＶｉｍｅｎｔｉｎで染色し、これらの細胞の表現型を確認した（図１Ｂ）。初代ラット線維芽細胞を用いた全ての実験を、初代～５代まで実施した。
【0045】
（低酸素及びＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置）
低酸素微小環境を模倣するために、初代ラット線維芽細胞を、低酸素にさらした。細胞を、連続的な低酸素及び一時的な低酸素の２つの別個の条件にさらした。連続的な低酸素については、細胞を低酸素チャンバー（２％Ｏ2）で４８時間インキュベートし、並びに図１Ｃに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンを添加又は無添加で処置し、及び酸素正常状態に戻さなかった。その後、細胞を、回収し及び実験用に処置した。
一時的な低酸素については、細胞を、低酸素チャンバー（２％Ｏ2）で２時間インキュベートし、その後、酸素正常状態に４８時間戻し、図１Ｃに示すようにその時点で細胞を、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いず処置した。その後、細胞を、４８時間後に回収し、及び実験用に処置した。
低酸素微小環境を模倣するために、初代ラット線維芽細胞を、低酸素にさらした。細胞を、連続的な低酸素及び一時的な低酸素の２つの別個の条件にさらした。連続的な低酸素については、細胞を低酸素チャンバー（２％Ｏ2）で４８時間インキュベートし、並びに図１Ｃに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンを添加又は無添加で処置し、及び酸素正常状態に戻さなかった。その後、細胞を、回収し及び実験用に処置した。
一時的な低酸素については、細胞を、低酸素チャンバー（２％Ｏ2）で２時間インキュベートし、その後、酸素正常状態に４８時間戻し、図１Ｃに示すようにその時点で細胞を、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いず処置した。その後、細胞を、４８時間後に回収し、及び実験用に処置した。
【0046】
（増殖アッセイ）
初代線維芽細胞の増殖を、アラマーブルーアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で決定した。簡単に述べると、細胞を、前述の低酸素条件下で４８時間、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン用いず処置した９６-ウェルプレートにプレーティングした。アラマーブルーと細胞との相互作用を、５４０ｎｍ及び５８５ｎｍでそれぞれ蛍光を測定することにより、４時間分析した。
増殖を、また、ＥｄＵ－Ｃｌｉｃｋ４８８（ｂａｓｅｃｌｉｃｋ）を用いたフローサイトメトリーベースＥｄＵアッセイを用いて検出した。
初代線維芽細胞の増殖を、アラマーブルーアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で決定した。簡単に述べると、細胞を、前述の低酸素条件下で４８時間、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン用いず処置した９６-ウェルプレートにプレーティングした。アラマーブルーと細胞との相互作用を、５４０ｎｍ及び５８５ｎｍでそれぞれ蛍光を測定することにより、４時間分析した。
増殖を、また、ＥｄＵ－Ｃｌｉｃｋ４８８（ｂａｓｅｃｌｉｃｋ）を用いたフローサイトメトリーベースＥｄＵアッセイを用いて検出した。
【0047】
（細胞死アッセイ）
低酸素線維芽細胞の細胞死におけるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を、フローサイトメトリーを用いるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で決定した。細胞死アッセイについては、付着性の線維芽細胞を、低酸素条件下で培養し、及び様々な濃度で、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いず処置した。細胞を、４８時間後に回収し、及び洗浄し、及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖと７-ＡＡＤとで染色し、並びにフローサイトメトリーを用いて分析した。
低酸素線維芽細胞の細胞死におけるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を、フローサイトメトリーを用いるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で決定した。細胞死アッセイについては、付着性の線維芽細胞を、低酸素条件下で培養し、及び様々な濃度で、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いず処置した。細胞を、４８時間後に回収し、及び洗浄し、及びＡｎｎｅｘｉｎ Ｖと７-ＡＡＤとで染色し、並びにフローサイトメトリーを用いて分析した。
【0048】
（ウェスタンブロッティング）
タンパク質サンプルを、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ溶解及び抽出バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中に、６-ウェルプレートで増殖している細胞を再懸濁して調製した。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイ色素試薬（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）を用いて定量した。サンプルを、４Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、及び９５℃で６分間煮沸して変性させた。タンパク質濃度の推定後、２５μｇの総タンパク質を含む等しいたんぱく質サンプルを、ロードし、及び４～１５％のミニプロテインＴＧＸゲル（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）で分離した。分画したタンパク質を、Ｔｒａｎｓ-Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｂｉｏ-Ｒａｄ)を用いて０．２μｍのニトロセルロース膜に移した。膜を、５％スキムミルク（Ｎｏｎ-Ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）でブロックし、及び１次抗体と一晩インキュベートした。
タンパク質サンプルを、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ溶解及び抽出バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）中に、６-ウェルプレートで増殖している細胞を再懸濁して調製した。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイ色素試薬（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）を用いて定量した。サンプルを、４Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ）と混合し、及び９５℃で６分間煮沸して変性させた。タンパク質濃度の推定後、２５μｇの総タンパク質を含む等しいたんぱく質サンプルを、ロードし、及び４～１５％のミニプロテインＴＧＸゲル（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）で分離した。分画したタンパク質を、Ｔｒａｎｓ-Ｂｌｏｔ（登録商標）ＴｕｒｂｏＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ(Ｂｉｏ-Ｒａｄ)を用いて０．２μｍのニトロセルロース膜に移した。膜を、５％スキムミルク（Ｎｏｎ-Ｆａｔ ｄｒｙ ｍｉｌｋ）でブロックし、及び１次抗体と一晩インキュベートした。
【0049】
一晩のインキュベートの間、以下の１次抗体を、それぞれの濃度で使用した。抗コラーゲンＩ（１：５００；ａｂ３４７１０）及び抗コラーゲンＩＶ（１：５００、ａｂ６５８６）を、Ａｂｃａｍ社から購入した。抗ヒートショックタンパク質４７（ＨＳＰ-４７）（１：４００；ｓｃ-１３１５０）及び抗フィブロネクチン（１：５００；ｓｃ-８４２２）を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から取り寄せた。抗ＳＭＡＤ２／３（１：５００；８５８６５Ｓ）、抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００；９７１６６Ｓ）及び抗ＨＩＦ-１α（１：７５０；１４１７９Ｓ）を含む他の抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。
ホースラディッシュペルオキダーゼ標識２次抗体を１：５０００濃度で、免疫反応に使用し、及びタンパク質バンドの検出を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）を用いて行った。
ホースラディッシュペルオキダーゼ標識２次抗体を１：５０００濃度で、免疫反応に使用し、及びタンパク質バンドの検出を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ）を用いて行った。
【0050】
（免疫蛍光染色）
免疫蛍光顕微鏡検査法のために、細胞を、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置を用いて又は用いずに適切な低酸素条件下で、４-ウェルプレートチャンバースライド（ＩＢＩＤＩ）で培養した。細胞を、氷冷したＰＢＳで洗浄した後に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００で透過処理し、及びブロッキング試薬（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を３０分間インキュベートした後に、適切な１次抗体で一晩インキュベートした。洗浄工程後、培地を、標識し及び２次抗体とインキュベートし、並びに４’，６-ジアミジノ-２-フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を、用いて核を染色した。
免疫蛍光顕微鏡検査法のために、細胞を、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置を用いて又は用いずに適切な低酸素条件下で、４-ウェルプレートチャンバースライド（ＩＢＩＤＩ）で培養した。細胞を、氷冷したＰＢＳで洗浄した後に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ-１００で透過処理し、及びブロッキング試薬（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）を３０分間インキュベートした後に、適切な１次抗体で一晩インキュベートした。洗浄工程後、培地を、標識し及び２次抗体とインキュベートし、並びに４’，６-ジアミジノ-２-フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を、用いて核を染色した。
【0051】
蛍光顕微鏡の画像解析を、蛍光イメージングのためのＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｐｒｉｍｅ ９５Ｂカメラを備え付けたＮＩＫＯＮ Ｔｉ２倒立顕微鏡を用いて実施した。全ての画像を、デジタル化処理し、全ての定量化及びプレゼンテーションのためのさらなる調整は、ＮＩＳ-Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ解析ソフトウェアを用いて行われた。定量解析のために、独立したウェルのランダムフィールドの写真を、１０倍及び４０倍の拡大対物レンズで撮影し、及び各マーカーの総タンパク質発現量を、ＤＡＰＩ定量に基づく細胞の総数を基準として決定した。
【0052】
免疫蛍光のために、１次抗体とそれぞれの濃度を、以下に示す。抗コラーゲンＩ（１：５００；ａｂ３４７１０）、抗コラーゲンＩＶ（１：５００；ａｂ６５８６）、及び抗α-ＳＭＡ（１：５００；ａｂ１２４９６４）を、Ａｂｃａｍから購入した。抗ＨＳＰ-４７（１：２５０；ｓｃ-１３１５０）、抗フィブロネクチン（１：２５０；ｓｃ-８４２２）、及び抗ＨＩＦ-１α（１：５００；ｓｃ-１３５１５）をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から取り寄せた。抗ＳＭＡＤ２／３（１：５００；８５８６５Ｓ）を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手した。これに加えて、以下の２次抗体：ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（ＡＦ）４８８（Ａ１１０２９）、ヤギ抗マウスＡＦ５４６（Ａ１１０３０）、ヤギ抗ウサギＡＦ４８８（Ａ１１０３４）、及びヤギ抗マウスＡＦ５４６（Ａ１１０１０）をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手した。Ｓｉｇｍａ社のＤＡＰＩ（Ｄ９５６４）を、１：１０００の濃度で使用した。
【0053】
（リン酸化プロテオミクス解析のためのサンプル調製）
ラットの坐骨神経から線維芽細胞を分離した後、（８Ｅ１０初代線維芽細胞）を、８０μＬの８Ｍ尿素、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６＆Ｐ００４４）中で超音波処理（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、１０サイクル、３０秒ｏｎ／ｏｆｆ、Ｄｉａｇｅｎｏｄe、ベルギー)により溶解し、及びタンパク質を、前述のように消化した（ＰＭＩＤ：２７３４５５２８）。簡単に述べると、タンパク質を、５ｍＭのＴＣＥＰを用いて３７℃で６０分間還元し、及び１０ｍＭのクロロアセトアミドを用いて３７℃で３０分間アルキル化した。サンプルを１００ｍＭの炭酸アンモニウム緩衝液で希釈し、最終尿素濃度を１．６Ｍにした後、タンパク質を、シークエンスグレードの修飾済みトリプシン（１／５０、ｗ／ｗ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）と３７℃で１２時間インキュベートして消化した。５％ＴＦＡで酸性化した後に、ペプチドを、Ｃ１８逆相スピンカラム（Ｍａｃｒｏｓｐｉｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、製造会社の指示に従って脱塩し、真空下で乾燥させ、及び-２０℃でさらに使用するまで保存した。
ラットの坐骨神経から線維芽細胞を分離した後、（８Ｅ１０初代線維芽細胞）を、８０μＬの８Ｍ尿素、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、ホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６＆Ｐ００４４）中で超音波処理（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、１０サイクル、３０秒ｏｎ／ｏｆｆ、Ｄｉａｇｅｎｏｄe、ベルギー)により溶解し、及びタンパク質を、前述のように消化した（ＰＭＩＤ：２７３４５５２８）。簡単に述べると、タンパク質を、５ｍＭのＴＣＥＰを用いて３７℃で６０分間還元し、及び１０ｍＭのクロロアセトアミドを用いて３７℃で３０分間アルキル化した。サンプルを１００ｍＭの炭酸アンモニウム緩衝液で希釈し、最終尿素濃度を１．６Ｍにした後、タンパク質を、シークエンスグレードの修飾済みトリプシン（１／５０、ｗ／ｗ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）と３７℃で１２時間インキュベートして消化した。５％ＴＦＡで酸性化した後に、ペプチドを、Ｃ１８逆相スピンカラム（Ｍａｃｒｏｓｐｉｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、製造会社の指示に従って脱塩し、真空下で乾燥させ、及び-２０℃でさらに使用するまで保存した。
【0054】
ペプチドサンプルは、最近記載されたように（ＰＭＩＤ：２８１０７００８）ＡｓｓａｙＭＡＰ ＢｒａｖｏプラットフォームのＦｅ（III）-ＩＭＡＣカートリッジを使用して、リン酸化ペプチドを濃縮した。リン酸化濃縮ペプチドを、０．１％のギ酸水溶液に再懸濁し、並びにＥＡＳＹ-ｎＬＣ１０００及び６０℃に設定した特注カラムを取り付けたＱ-Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｐｌｕｓ質量分析計(いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用い、ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ペプチドを、Ｃ１８樹脂（ＲｅｐｒｏＳｉｌ-Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ、１．９μｍ樹脂;Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）を充填した自社製のＲＰ-ＨＰＬＣカラム（７５μｍ×３０ｃｍ）用い、０．２μＬ／ｍｉｎの流速で分離した。ペプチドの分離には、以下のグラジエント：５％Ｂ～８％Ｂを５分間、２０％Ｂまでを４５分間、２５％Ｂまでを１５分間、３０％Ｂまでを１０分間、３５％Ｂまでを７分間、４２％Ｂまでを５分間、５０％Ｂまでを３分間、９５％Ｂまでを２分間、次いで９５％Ｂで１８分間を、用いた。緩衝液Ａは、０．１％ギ酸水溶液であり、及び緩衝液Ｂは、８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸水溶液であった。
【0055】
質量分析法を、ナノエレクトロスプレーイオン源を備え付けたＱ-Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｐｌｕｓ質量分析計（いずれもＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。各ＭＳ１スキャンに続いて、最も豊富な１０個のプリカーサイオンの高衝突解離（ｈｉｇｈ-ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ-ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＨＣＤ）をダイナミックエクスクルージョンで２０秒間行った。総サイクル時間は、約１秒であった。ＭＳ１では、３ｅ６イオンを、最大１００ｍｓの時間にわたってＯｒｂｉｔｒａｐセルに蓄積し、及び７０，０００ＦＷＨＭの分解能（２００ｍ／ｚ）でスキャンした。ＭＳ２スキャンを、１ｅ５イオンの目標設定、５０ｍｓの累積時間及び１７，５００ＦＷＨＭの分解能（２００ｍ／ｚ）で取得した。単電荷イオン及び電荷状態が未割り当てのイオンは、ＭＳ２イベントのトリガーから除外した。規格化したコリジョンエネルギーを、２７％に設定し、質量アイソレーションウィンドウは、１．４ｍ/ｚに設定し、及びマイクロスキャンを、各スペクトルについて取得した。
【0056】
取得した生ファイルを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩソフトウェア（ｖ２．０、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）にインポートし、デフォルトのパラメータを適応して全サンプルのペプチド前駆体イオン強度を抽出した。生成されたｍｇｆ-ファイルは、ＭＡＳＣＯＴを使用して、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ １．０．１３．１３）のＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｖｅｒｓｅｒツールを用いて生成されたドブネズミの予測される（Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ）Ｕｎｉｐｒｏｔエントリーの正常配列及び逆配列（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ，ｒｅｌｅａｓｅ ｄａｔｅ ２０２０／０３／１０）、並びに一般に観察される汚染物質（合計６０，６９０配列）を含むデコイデータベースに対して検索された。検索基準は、以下：完全なトリプシン特異性を、必要とし（リシン又はアルギニン残基の後に切断、プロリンが続く場合を除く）；３回の切断ミスが許され；カルバミドメチル化（Ｃ）を、固定修飾として設定し；酸化（Ｍ）及びリン酸化（ＳＴＹ）を、可変修飾として適応し；１０ｐｐｍ（前駆体）及び０．０２Ｄａ（断片）の質量許容差のように設定した。データベース検索結果を、データセット中の逆タンパク質配列のヒット数に基づき、ペプチドレベル及びタンパク質レベルのそれぞれで偽発見率（ＦＤＲ）を１％に設定するために、イオンスコアを用いてフィルタリングした。ラベルフリー定量からの定量解析の結果を、ＳａｆｅＱｕａｎｔ Ｒパッケージｖ．２．３．２．（ＰＭＩＤ：２７３４５５２８、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｅａｈｒｎｅ／ＳａｆｅＱｕａｎｔ/）を用いて処理し、ペプチド相対量を得た。この解析は、全てのＬＣ-ＭＳランにわたる総ピーク／レポーター面積を等しくすることによるグローバルデータの正規化、ｋｎｎアルゴリズムを用いたデータ補完、ＬＣ-ＭＳ／ＭＳランごとのピーク面積の合計、続いてペプチド存在比の計算が含まれる。アイソフォーム特異的なペプチドイオンシグナルのみを、定量化の対象とした。要約したペプチド発現値を、条件間で異なる豊富なペプチドの統計的検定に用いた。ここでは、経験ベイズ調整ｔ-検定を、Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｌｉｍｍａパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｉｏｃ／ｈｔｍｌ／ｌｉｍｍａ．ｈｔｍｌ）に実装されているように、適用した。得られたタンパク質及び条件ごとの比較ｐ-値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ-Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いる多重検定のために調整した。
【0057】
（統計分析）
統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを用いて行った。実験データ及びグラフプロットは、特に言及しない限り、３つの生物学的複製を含む少なくとも３つの独立した実験から特定の実験の平均±標準偏差として表される。様々な条件の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ-検定又は１元配置分析（ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって特徴づけられた。多重比較については、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用い、及びＰ値＜０．０５で統計的有意とみなした。統計的に有意な値は、その有意性の度合いを、*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）、****（ｐ＜０．０００１）で示した。
統計分析を、Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアを用いて行った。実験データ及びグラフプロットは、特に言及しない限り、３つの生物学的複製を含む少なくとも３つの独立した実験から特定の実験の平均±標準偏差として表される。様々な条件の統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ-検定又は１元配置分析（ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって特徴づけられた。多重比較については、Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用い、及びＰ値＜０．０５で統計的有意とみなした。統計的に有意な値は、その有意性の度合いを、*（ｐ＜０．０５）、**（ｐ＜０．０１）、***（ｐ＜０．００１）、****（ｐ＜０．０００１）で示した。
【0058】
（結果）
低酸素の初代線維芽細胞の細胞増殖及び生存率に影響を与えないＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン
低酸素は、線維化組織において主要な微小環境であるため、低酸素条件に暴露された初代ラットの神経周膜由来の線維芽細胞を用いて全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析を行った。Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置が、初代ラット線維芽細胞に影響を与えるかどうかを調査するために、アラマーブルーアッセイを用いて４８時間の生存率を調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素の初代ラット線維芽細胞の生存率及び細胞増殖に影響を与えないことを示した。１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭを含むいずれの濃度も、細胞生存率及び細胞増殖に著しい変化を引き起こさなかった。図２Ａ～２Ｄに示すように、未処置の対照と比較して、連続的（４８時間）及び一時的（２時間）低酸素にさらされた初期ラット線維芽細胞は、様々な濃度でＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置しても、細胞増殖に変化を示さなかった。
低酸素の初代線維芽細胞の細胞増殖及び生存率に影響を与えないＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン
低酸素は、線維化組織において主要な微小環境であるため、低酸素条件に暴露された初代ラットの神経周膜由来の線維芽細胞を用いて全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析を行った。Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置が、初代ラット線維芽細胞に影響を与えるかどうかを調査するために、アラマーブルーアッセイを用いて４８時間の生存率を調査した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素の初代ラット線維芽細胞の生存率及び細胞増殖に影響を与えないことを示した。１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭを含むいずれの濃度も、細胞生存率及び細胞増殖に著しい変化を引き起こさなかった。図２Ａ～２Ｄに示すように、未処置の対照と比較して、連続的（４８時間）及び一時的（２時間）低酸素にさらされた初期ラット線維芽細胞は、様々な濃度でＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置しても、細胞増殖に変化を示さなかった。
【0059】
連続的な低酸素下にさらされた初代線維芽細胞の線維性タンパク質の発現を下方制御するＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン
低酸素は、線維性疾患における線維化促進バイオマーカー及び癒着バイオマーカーの発現を増加させる。Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素微小環境に任意の変化を誘導するどうか調べるために、様々な濃度のＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの処置下でＨＩＦ１-αの発現を試験した。図３Ａに示すように、低酸素初代線維芽細胞の全ての細胞溶解液のウェスタンブロッティングは、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素微小環境、ＨＩＦ１-α及びＳＭＡＤ２／３の誘導に関与するマーカーを著しく下方制御することを示した。
ＨＩＦ１-αは、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭの濃度のＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いる処置において著しく下方制御された。ＳＭＡＤ２／３も、図３Ａに示すように、低酸素の初代線維芽細胞において、１００ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンのみで著しく下方制御された。
低酸素は、線維性疾患における線維化促進バイオマーカー及び癒着バイオマーカーの発現を増加させる。Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素微小環境に任意の変化を誘導するどうか調べるために、様々な濃度のＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの処置下でＨＩＦ１-αの発現を試験した。図３Ａに示すように、低酸素初代線維芽細胞の全ての細胞溶解液のウェスタンブロッティングは、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、低酸素微小環境、ＨＩＦ１-α及びＳＭＡＤ２／３の誘導に関与するマーカーを著しく下方制御することを示した。
ＨＩＦ１-αは、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭの濃度のＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを用いる処置において著しく下方制御された。ＳＭＡＤ２／３も、図３Ａに示すように、低酸素の初代線維芽細胞において、１００ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンのみで著しく下方制御された。
【0060】
加えて、他の線維化促進因子についてのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果をさらに調べた。４８時間の連続的な低酸素は、酸素正常状態の未処置の対照と比較して、コラーゲン-ＩＶ、コラーゲン-Ｉ、及びフィブロネクチンを含む線維化促進マーカーの発現を誘導することが観察された。図３Ｂに示すように、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンでの処置は、これらの線維性タンパク質の発現を用量依存的に著しく減少させた。ＨＹＰ４７は、コラーゲンの生合成を担うもう１つの重要な線維化促進因子であるので、ＨＳＰ４７についての我々の仮説を検証し、及び図３Ｂに示すようにＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンは、ＨＳＰ４７の発現を低下させるが、著しい下方制御は観察されなかった。
【0061】
Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンを様々な濃度で処置、又はＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンなしで処置した低酸素の初代線維芽細胞の免疫蛍光分析も、実施した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫蛍光分析が、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び９Ａに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置は、ＨＩＦ１-α及びＳＭＡＤ２／３を含む低酸素に対する細胞応答を担う因子の著しい減少をもたらすことを明らかにした。ＨＩＦ１-α及びＳＭＡＤ２／３は、核を染色され、及び両者は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置すると下方制御された。
【0062】
フィブロネクチン、コラーゲン-ＩＶ、コラーゲン-Ｉ及びＨＳＰ４７を含む線維化促進因子の細胞質の染色も行った。図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ及び９Ｂに示すように、これらの標的は、低酸素の初代線維芽細胞に蓄積しており、及びＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置された線維芽細胞において、それに対応して著しく下方制御されている。我々の統計解析は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置された線維芽細胞におけるＨＩＦ１-α、ＳＭＡＤ２／３、コラーゲン-ＩＶ、及びＨＳＰ４７の用量依存的な下方制御を明らかにしたが（図４Ａ、４Ｃ、４Ｄ及び４Ｅ）、フィブロネクチン及びコラーゲンＩについては用量非依存的に著しく減少した（図４Ａ及び４Ｂ）。この制御を理解するためのさらなる実験を、コラーゲンの生合成に関与する因子を減少させるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンのこの挙動を理解するために行う必要がある。
【0063】
一時的な低酸素下にさらされた初代線維芽細胞の線維性タンパク質の発現を下方制御するＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン
線維化組織におけるＨＩＦ１-αの過剰発現は、慢性又は急性の低酸素微小環境を生じさせる。一時的な低酸素下の初代ラット線維芽細胞における線維化促進因子に対するＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を、試験した。一時的な低酸素状態に２時間さらされ、その後にＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを併用又は併用せずに４８時間処置した低酸素の初代線維芽細胞におけるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を調査した。
線維化組織におけるＨＩＦ１-αの過剰発現は、慢性又は急性の低酸素微小環境を生じさせる。一時的な低酸素下の初代ラット線維芽細胞における線維化促進因子に対するＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を、試験した。一時的な低酸素状態に２時間さらされ、その後にＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンを併用又は併用せずに４８時間処置した低酸素の初代線維芽細胞におけるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの効果を調査した。
【0064】
ＨＩＦ１-αシグナル伝達で制御されるタンパク質と同様に、線維形成能を担う特定の標的の細胞内染色を、実施した。免疫蛍光分析は、図５Ａ、５Ｂ、５Ｄ、５Ｅ及び１０Ｂに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンが、フィブロネクチン、コラーゲン-Ｉ、コラーゲン-ＩＶ及びＨＳＰ４７を含む線維化促進タンパク質の発現を効果的に減少させることを示した。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び１０Ａに示すように、ＨＩＦ１-αシグナル伝達経路の下流標的、すなわちＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンにおけるＨＩＦ１-α及びＳＭＡＤ２／３の著しい下方制御も、同様に観察された。免疫細胞化学の後、細胞当たりの平均強度を、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置サンプルにおけるこれらのタンパク質について計算し、及び未処置の低酸素サンプルと比較した。Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンは、用量依存的に癒着及び線維性タンパク質の発現を著しく減少させた。図５Ｂ～５Ｅに示されるような全ての上記因子は、低酸素サンプルで著しく増加した（図５Ｂ～５Ｅ）。コラーゲン-Ｉを除く全てのタンパク質の発現の用量依存的な減少を、観測した。コラーゲンＩは、１ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンで著しく減少したが、その後は一定であった（図５Ａ、５Ｂ；補足３Ｂ）。
【0065】
一時的低酸素の初代線維芽細胞の全ての細胞溶解液のウェスタンブロッティングも、実施した。免疫細胞化学とは対照的に、ウェスタン分析は、所望の標的の用量依存的な制御はいずれも見られなかった。ＨＩＦ１-αシグナル伝達因子及び線維化促進機構標的は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置サンプルと比較して、低酸素サンプルで著しく増加した。図６Ｂに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンの様々な濃度にわたって顕著なダウンレギュレーションは、なにもなかった。興味深いことに、図６に示す１ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置の低酸素線維芽細胞では、ＣＯＬ-ＩＶの顕著なダウンレギュレーションを見出したが、図５Ｅに示すように、免疫蛍光分析とはわずかに異なった。
【0066】
Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置した低酸素線維芽細胞における重要なタンパク質の同定及びパスウェイ解析
この研究は、異なるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの濃度で処置された慢性低酸素条件下で処置されたＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンのリン酸化プロテオームプロファイルを編集する最初の試みである。合計５１１０個のタンパク質が、全４条件（０ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭ）でプロファイルされた。０ｍＭの低酸素サンプルと比較した場合、１３２２個のタンパク質が処置群（１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭ）間で著しく制御されていることが分かった。これらの１３２２個のタンパク質のうち、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンでは、６０７個のタンパク質が著しくダウンレギュレートし、及び７１５個は、著しくアップレギュレートした。各条件の生物学的トリプリケートを、使用し、及び全ての生物学的トリプリケートのプール解析を、処置群及び未処置の０ｍＭ条件間で実施した。ｌｏｇ_２比の正の値は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置群における関連タンパク質のアップレギュレーションを示し、一方で負の値は、ダウンレギュレーションを示す。重要な因子及び関連するパスウェイを同定するためのさらなる解析を、前述のようにＤＡＶＩＤ統計ソフトウェア及びＫＥＧＧパスウェイ解析を用いて実施した。解析は、ダウンレギュレートした標的に焦点を当て、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンによって制限され、線維化表現型を減少させるタンパク質及び関連経路を同定した。パスウェイ解析は、処置群で著しくダウンレギュレートしたタンパク質が、ｍＴＯＲ、ＰＩ３ｋ、細胞接着及び接着斑（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）と関連していたことを示した。
この研究は、異なるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの濃度で処置された慢性低酸素条件下で処置されたＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンのリン酸化プロテオームプロファイルを編集する最初の試みである。合計５１１０個のタンパク質が、全４条件（０ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭ）でプロファイルされた。０ｍＭの低酸素サンプルと比較した場合、１３２２個のタンパク質が処置群（１ｍＭ、１０ｍＭ及び１００ｍＭ）間で著しく制御されていることが分かった。これらの１３２２個のタンパク質のうち、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンでは、６０７個のタンパク質が著しくダウンレギュレートし、及び７１５個は、著しくアップレギュレートした。各条件の生物学的トリプリケートを、使用し、及び全ての生物学的トリプリケートのプール解析を、処置群及び未処置の０ｍＭ条件間で実施した。ｌｏｇ_２比の正の値は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置群における関連タンパク質のアップレギュレーションを示し、一方で負の値は、ダウンレギュレーションを示す。重要な因子及び関連するパスウェイを同定するためのさらなる解析を、前述のようにＤＡＶＩＤ統計ソフトウェア及びＫＥＧＧパスウェイ解析を用いて実施した。解析は、ダウンレギュレートした標的に焦点を当て、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンによって制限され、線維化表現型を減少させるタンパク質及び関連経路を同定した。パスウェイ解析は、処置群で著しくダウンレギュレートしたタンパク質が、ｍＴＯＲ、ＰＩ３ｋ、細胞接着及び接着斑（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）と関連していたことを示した。
【0067】
図７Ａ～７Ｃに示すように、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンは、細胞接着及び線維化の進行に関与する重要な因子を効果的にダウンレギュレートするが、これらの因子の発現におけるＬ-アラニル-Ｌ-グルタミンの用量依存的効果を同定することもできた。ＨＩＦ１-α、ＥＣＭ-相互作用、ＥＲＢｂ、ＦＯＸＯ及びＴＧＦ-βシグナル伝達経路に関連するいくつかの標的も、見出された。重要なことは、図８に示されるように、Ｆｎｄｃ１、Ｆｎｄｃ３ｂ、Ｃｏｌ1ａ1及びＡｋｔ１ｓ１、並びにＰｘｎを含む重要な線維化促進因子が、未処置の慢性低酸素サンプルと比較して、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミン処置サンプルで著しくダウンレギュレートされており、ウェスタンブロッティング及び免疫蛍光イメージングによるｉｎ-ｖｉｔｒｏの所見と一致している。
【0068】
さらに、タンパク質の分析は、Ｌ-アラニル-Ｌ-グルタミンで処置した初代線維芽細胞で著しくアップレギュレートされていることを見出した。パスウェイ解析は、これらのタンパク質が、ＧｎＲＨシグナル伝達、グルタミン酸作動性誘導シグナル伝達、軸索誘導シグナル伝達のアップレギュレーションと関連していることが示された。図７Ａ～７Ｃは、アップレギュレートされた因子の所見を要約したものである。
【0069】
本発明の特定の実施態様を、図示及び記載してきたが、本発明は、本明細書に記載した実施態様に限定されないことは明らかであろう。多数の修正、変更、変形、置換及び等価物は、以下に続く特許請求の範囲によって記載される本発明の要旨及び範囲から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【国際調査報告】