ホーム > 特許ランキング > フンダシオン デル セクトル パブリコ エスタタル セントロ ナショナル デ インベスティガシオネス オンコロジカス カルロス テルセーロ（エフェ．エセ．ペ． セエネイオ）
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ フンダシオン デル セクトル パブリコ エスタタル セントロ ナショナル デ インベスティガシオネス オンコロジカス カルロス テルセーロ（エフェ．エセ．ペ． セエネイオ）の特許一覧 ▶ ウニベルシタ アウトノマ デ バルセロナの特許一覧 ▶ テロメア セラピューティクス エセエレの特許一覧
特表2024-521063ＴＥＲＴをコードする組換えウイルスゲノム及びウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-28
(54)【発明の名称】ＴＥＲＴをコードする組換えウイルスゲノム及びウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240521BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240521BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240521BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240521BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/864 ZNA
A61K35/76
A61P11/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023570195
(86)(22)【出願日】2022-05-12
(85)【翻訳文提出日】2024-01-10
(86)【国際出願番号】 EP2022062990
(87)【国際公開番号】W WO2022238557
(87)【国際公開日】2022-11-17
(31)【優先権主張番号】21382441.0
(32)【優先日】2021-05-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523427342
【氏名又は名称】フンダシオン デル セクトル パブリコ エスタタル セントロ ナショナル デ インベスティガシオネス オンコロジカス カルロス テルセーロ（エフェ．エセ．ペ． セエネイオ）
(71)【出願人】
【識別番号】521440507
【氏名又は名称】ウニベルシタ アウトノマ デ バルセロナ
(71)【出願人】
【識別番号】523427353
【氏名又は名称】テロメア セラピューティクス エセエレ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブラスコ マリア
(72)【発明者】
【氏名】マルティネス パウラ
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ トゥベール マリア ファティマ
(72)【発明者】
【氏名】ヒメネス センツァーノ ヴェロニカ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア マルティネス ミケル
(72)【発明者】
【氏名】カサナ ロレンテ エステファニア
【テーマコード（参考）】
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA56
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZB21
(57)【要約】
本明細書において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムが記載される。本明細書に記載される態様は、肺線維症、心筋梗塞、及びそれらに関連する病態等のテロメア長の短縮に関連する病態の治療において使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムであって、前記ウイルスゲノムの全長は、４７００ヌクレオチド未満であり、前記組織特異的プロモーターは、肺特異的プロモーターであり、かつ前記プロモーターは、配列番号１２と少なくとも８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる、組換えウイルスゲノム。
【請求項2】
前記プロモーターは、配列番号１２と少なくとも９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる、請求項１に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項3】
前記プロモーターは、本質的に配列番号１２のヌクレオチド配列のみからなるか、又はそれのみからなる、請求項１に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項4】
前記ＴＥＲＴをコードする配列は、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項5】
ａ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、ｂ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号６及び配列番号９のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｃ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項6】
前記組換えウイルスゲノムは、前記ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたコザックコンセンサス配列を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項7】
前記組換えウイルスゲノムは、前記ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリＡ配列を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項8】
前記ゲノムは、組換えアデノ随伴ウイルスゲノムである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム。
【請求項9】
請求項８に規定される組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項10】
前記ウイルスベクターは、血清型１型、血清型２型、血清型３型、血清型４型、血清型５型、血清型６型、血清型７型、血清型８型、血清型９型、血清型ｒｈ１０型、血清型ｒｈ８型、血清型Ｃｂ４型、血清型ｒｈ７４型、血清型ＤＪ型、血清型２／５型、血清型２／１型、血清型１／２型、又は血清型Ａｎｃ８０型のものである、請求項８に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項11】
前記ウイルスベクターは、血清型６型又は血清型９型のものである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項12】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項13】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものであり、かつ前記組織特異的プロモーターは、請求項２又は３のいずれかに規定される通りである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項14】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものであり、かつ前記組織特異的プロモーターは、請求項３に規定される通りである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム又は請求項９～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含み、任意に１種以上の薬学的に許容可能な成分を更に含む医薬組成物。
【請求項16】
医薬として使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項９～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
テロメア長の短縮と関連する病態の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項９～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項18】
肺線維症の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項９～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項19】
気管内投与を介した肺線維症の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えウイルスゲノム、請求項９～１４のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に記載される態様及び実施の形態は、医学、特に遺伝子療法の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
テロメアは、ＤＮＡ修復及び分解活性から染色体の末端を保護する役割のある染色体の末端にある特殊な構造物である（非特許文献１）。哺乳動物のテロメアは、シェルテリンとして知られる多重タンパク質複合体によって結合されたＴＴＡＧＧＧリピートからなる。テロメアの保護には、最小限の長さのＴＴＡＧＧＧリピートの存在、及びシェルテリン複合体の完全性が必要とされる。テロメアが大幅に短くなると、テロメアはその保護機能を失い、テロメアでの持続的なＤＮＡ損傷反応が誘発され、続いてそれにより細胞老化応答が引き起こされる。
【0003】
テロメラーゼは、関連するｎｃＲＮＡ要素（Ｔｅｒｃ、テロメラーゼＲＮＡ要素）を鋳型として使用することにより染色体の末端へとＴＴＡＧＧＧリピートをｄｅ ｎｏｖｏで付加することによってテロメア短縮（attrition）を補うことができる細胞逆転写酵素（ＴＥＲＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、ＴＰ２、ＴＲＴ、ＥＳＴ２、ＴＣＳ１としても知られる）である（非特許文献２）。テロメラーゼは、殆どの成体幹細胞コンパートメントにおいて発現されるが、殆どの体細胞では、テロメラーゼは出生後にサイレンシングされ、テロメアは次第に短縮されていく。これは、殆どのヒト組織及びマウス組織において、加齢に伴ってテロメアの短縮が起こるという事実によって証明されている（非特許文献３）。
【0004】
短縮されたテロメアは、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニ貧血、肺線維症、及び心血管疾患（ＣＶＤ）等の多くの疾患と関連している。これらの疾患の重症度及びそれらに罹患した患者の予後不良を考慮すると、テロメア長の短縮に関連する疾患を治療する改善された療法が必要とされる。
【0005】
テロメラーゼによる治療的介入は、大幅に短い長さを超えたテロメア損失を防ぐことを目的として、短縮されたテロメアに関連する病態についての可能性を秘めた治療に相当する。ＣＭＶプロモーターの制御下でテロメラーゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ）を使用するようなＡＡＶによるＴＥＲＴ遺伝子療法は、マウスの健康寿命を延ばすこと（非特許文献４）、かつ再生不良性貧血及び肺線維症（特許文献１、非特許文献５、非特許文献６）並びに心血管疾患（特許文献２、非特許文献７）等のテロメア長の短縮に関連する病態を治療することに有効であることが以前に明らかにされており、非特許文献８によれば、ニワトリトロポニンプロモーターの制御下でテロメラーゼをコードするＡＡＶ９ベクターを利用して、マウス心臓及びヒト心筋細胞におけるドキソルビシン毒性の回復が実証された。既存のＡＡＶベクターは、標的組織での低い遺伝子発現、治療対象組織以外の組織でのオフターゲット遺伝子発現、及び欠損したウイルスゲノムを含む中間ベクター種の発生等のＴＥＲＴ遺伝子療法におけるそれらの有効性に影響を与える不利点を伴う。上記を考慮すると、ＴＥＲＴを利用する遺伝子療法用の組換えウイルスゲノム及びベクターの改善を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１６／０２０３４５号
【特許文献2】国際公開第２０１６／０２０３４６号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Blackburn et al. Cell 2001; 106(6):661-673
【非特許文献2】Greider & Blackburn. Cell 1985; 43:405-413
【非特許文献3】Blasco, Nat Chem Biol. 2007; 3:640-649
【非特許文献4】Bernardes de Jesus et al. EMBO Mol Med 2012; 4:691-704
【非特許文献5】Beier et al. Blood 2012; 120(15):2990-3000
【非特許文献6】Povedano et al. eLife 2018; 7: e31299
【非特許文献7】Baer et al. Nat Comm 2014; 5:5863
【非特許文献8】Chatterjee et al. Mol Ther 2021; 29(4): 1-16)
【発明の概要】
【0008】
本発明の一態様は、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムであって、ウイルスゲノムの全長が４７００ヌクレオチド未満である、組換えウイルスゲノムに関する。幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターが肺特異的プロモーター又は心臓特異的プロモーターであるようなものである。幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルスゲノムである。幾つかの実施の形態において、プロモーターは、ＳｐＢプロモーター、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２Ｖプロモーター、トロポニンプロモーター、及びそれらの誘導体からなる群より選択される。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードする配列は、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている。幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、
ａ）ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｂ）ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、若しくは配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号９のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｃ）ＴＥＲＴをコードする配列は、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるようなものである。
ａ）ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｂ）ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、若しくは配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号９のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｃ）ＴＥＲＴをコードする配列は、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるようなものである。
【0009】
幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、プロモーターが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１６、好ましくは配列番号１２、配列番号１５、又は配列番号１６を有するヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるようなものである。幾つかの実施の形態において、組換えウイルスゲノムは、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたコザックコンセンサス配列を更に含む。幾つかの実施の形態において、組換えウイルスゲノムは、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリＡ配列を更に含む。
【0010】
本発明の別の態様は、本発明の組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターに関する。幾つかの実施の形態において、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、ウイルスベクターが血清型１型、血清型２型、血清型３型、血清型４型、血清型５型、血清型６型、血清型７型、血清型８型、血清型９型、血清型ｒｈ１０型、血清型ｒｈ８型、血清型Ｃｂ４型、血清型ｒｈ７４型、血清型ＤＪ型、血清型２／５型、血清型２／１型、血清型１／２型、又は血清型Ａｎｃ８０型、好ましくは血清型６型又は血清型９型であるようなものである。
【0011】
本発明の別の態様は、本発明の組換えウイルスゲノム又は本発明のアデノ随伴ウイルスベクターを含み、任意に１種以上の薬学的に許容可能な成分を更に含む医薬組成物に関する。
【0012】
本発明の別の態様は、医薬として使用される、本発明の組換えウイルスゲノム、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター、又は本発明の医薬組成物に関する。幾つかの実施の形態において、本発明の組換えウイルスゲノム、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター、又は本発明の医薬組成物は、テロメア長の短縮に関連する病態の治療及び／又は予防において使用される。幾つかの実施の形態において、本発明の組換えウイルスゲノム、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター、又は本発明の医薬組成物は、肺線維症、心筋梗塞、又はそれらに関連する病態の治療及び／又は予防において使用される。
【0013】
詳細な説明
本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を利用する遺伝子療法において有用な組換えウイルスゲノム及び組換えウイルスベクターを提供する。本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び組換えウイルスベクターは、既知のウイルスゲノム及びウイルスベクターに比べて、以下の利点の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は全てを示す：
標的組織におけるＴＥＲＴ発現の増加、
オフターゲット組織におけるＴＥＲＴ発現の減少、
低いカプシド形成能力を有するウイルスベクターの利用に付随する欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成の防止、
治療有効性の向上。
本発明は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を利用する遺伝子療法において有用な組換えウイルスゲノム及び組換えウイルスベクターを提供する。本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び組換えウイルスベクターは、既知のウイルスゲノム及びウイルスベクターに比べて、以下の利点の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は全てを示す：
標的組織におけるＴＥＲＴ発現の増加、
オフターゲット組織におけるＴＥＲＴ発現の減少、
低いカプシド形成能力を有するウイルスベクターの利用に付随する欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成の防止、
治療有効性の向上。
【0014】
本明細書の実施例のセクションにおいても実証されるように、ＴＥＲＴを利用する遺伝子療法における本発明の組換えウイルスゲノム及び組換えウイルスベクターの適用から、既存の治療戦略を超える有効性の顕著な改善が期待される。したがって、本明細書に記載される本発明の態様及び実施の形態は、本明細書で論じられる問題及び要求の少なくとも一部を解決する。
【0015】
組換えウイルスゲノム
第１の態様において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムであって、ウイルスゲノムの全長が４７００ヌクレオチド未満である、組換えウイルスゲノムが提供される。
第１の態様において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムであって、ウイルスゲノムの全長が４７００ヌクレオチド未満である、組換えウイルスゲノムが提供される。
【0016】
ウイルスゲノムはＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子からなり得る。上記分子は一本鎖又は二本鎖であり得る。上記分子は、線状、環状、分節型（多数の核酸片から構成される）、又は非分節型であり得る。ウイルスゲノム末端は、反復配列、化学修飾、及び／又は二次構造を含んでいてもよく、これらは、それぞれの宿主におけるウイルスゲノム複製を支援する等の調節機能を有し得る。本発明の文脈において、ウイルスゲノムを細胞内に導入する際に、そこに含まれるＴＥＲＴコーディングヌクレオチド配列の発現が可能となる限り、あらゆるウイルスゲノムが企図され得る。幾つかの実施の形態において、ウイルスゲノムは、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、ワクシニアウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。
【0017】
好ましい実施の形態において、組換えウイルスゲノムはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する。したがって、好ましい実施の形態において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムであって、ウイルスゲノムの全長が４７００ヌクレオチド未満である、組換えＡＡＶゲノムが提供される。
【0018】
「アデノ随伴ウイルスゲノム」（ＡＡＶゲノム）という用語は、パルボウイルス科（Family Parvoviridae）のディペンドパルボウイルス属（genus Dependoparvovirus）（ディペンドウイルスとも呼ばれる）に属するウイルスのゲノムを指す。天然に存在する（野生型）ＡＡＶゲノムは、およそ４．７ｋｂの長さである。ゲノムには、ＤＮＡ鎖の両末端に逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれている。
【0019】
「組換え」（代替的に「キメラ」又は「操作された」と呼ばれる）ウイルスゲノムは、天然の調節配列及び／又は転写されるＤＮＡ領域が天然には起こらない様式で除去、修飾、又は他には並置された、及び／又は非天然の調節配列及び／又は転写されるＤＮＡ領域が組み込まれたウイルスゲノム等の、自然界（野生型ウイルスゲノム）では通常見られないウイルスゲノムである。
【0020】
本発明による組換えウイルスゲノムは、任意に、ＡＡＶゲノムに由来する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。上記配列は、それぞれの宿主における組換えウイルスゲノムの維持を強化することができる。逆方向末端反復配列は、組換えウイルスゲノムの５’側及び３’側に含まれていてもよい（それぞれ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ）。適切な逆方向末端反復配列は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５等のようなあらゆるアデノ随伴ウイルスの血清型に由来し得る。好ましいＩＴＲは、配列番号１９（５’ＩＴＲ）及び配列番号２０（３’ＩＴＲ）を含む、本質的にそれらのみからなる、又はそれらのみからなる配列によって表されるＡＡＶ２のＩＴＲである。本発明はまた、好ましくは、５’ＩＴＲとしての配列番号１９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列、及び３’ＩＴＲとしての配列番号２０と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列の使用を包含する。
【0021】
幾つかの実施の形態において、好ましい組換えウイルスゲノムは、組換えアデノ随伴ウイルスゲノム（ＡＡＶゲノム）である。上記ゲノムは、その天然に付随する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでいても、又は含まなくてもよい。好ましくは、上記ゲノムは、アデノ随伴ウイルス血清型２型（ＡＡＶ２）のＩＴＲを含み、より好ましくは、配列番号１９（５’ＩＴＲ）及び配列番号２０（３’ＩＴＲ）を含む。
【0022】
本発明による組換えウイルスゲノムは、４７００ヌクレオチド未満の全長を有する。本発明者らは、驚くべきことに、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス等の低いカプシド形成能力を有するウイルスを発現ベクターとして利用する場合、上述の長さを超えないことにより、欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成を防止することが可能となり、その結果、上記ベクターの治療有効性の改善がもたらされることを見出した。幾つかの実施の形態において、組換えウイルスゲノムは、４６８０ヌクレオチド未満、４６６０ヌクレオチド未満、４６４０ヌクレオチド未満、４６２０ヌクレオチド未満、４６００ヌクレオチド未満、４５８０ヌクレオチド未満、４５６０ヌクレオチド未満、４５４０ヌクレオチド未満、４５２０ヌクレオチド未満、又は４５００ヌクレオチド未満、好ましくは４６８０ヌクレオチド未満の全長を有する。
【0023】
幾つかの実施の形態において、組換えウイルスゲノムは、４４００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４４２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４４４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４４６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４４８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４５００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４５２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４５４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４５６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４５８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４６２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４６４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、４６６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド、又は４６８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは４４００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチドの長さを有する。
【0024】
幾つかの実施の形態において、組換えウイルスゲノムは、４４００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４４２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４４４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４４６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４４８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４５００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４５２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４５４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４５６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４５８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４６００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４６２０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４６４０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、４６６０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチド、又は４６８０ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは４４００ヌクレオチド～４７００ヌクレオチド±１０ヌクレオチドの長さを有する。
【0025】
「テロメラーゼ逆転写酵素」（ＴＥＲＴ）（代替的には、ＴＰ２、ＴＲＴ、ＥＳＴ２、又はＴＣＳ１としても知られる）（ＥＣ２．７．７．４９）は、テロメラーゼホロ酵素複合体の触媒要素であり、その主な活性は、酵素のｎｃＲＮＡ要素（Ｔｅｒｃ、テロメラーゼＲＮＡ要素）内の鋳型配列をコピーすることによって単純な配列リピートを染色体末端に付加する逆転写酵素として作用することによってテロメアを伸長させることである。ＴＥＲＴは、６ヌクレオチドのテロメア反復単位５’－ＴＴＡＧＧＧ－３’による３’染色体末端のＲＮＡ依存性の伸長を触媒する。当業者によれば、限定されるものではないが、ＴＥＲＴ断片等のＴＥＲＴの改変型が依然として機能性であれば、その用語にはＴＥＲＴの上記改変型も包含されることが理解される。この文脈において、機能性であるとは、改変型タンパク質が、非改変型タンパク質と比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の触媒活性を示すことを指す。改変型のＴＥＲＴはまた、非改変型タンパク質と比較して増加した機能性を示す場合もある。この文脈において、増加した機能性とは、改変型タンパク質が、非改変型タンパク質と比較して少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、又は少なくとも２００％の触媒活性を示すことを指す。本明細書の別の場所で論じられるように、ＴＥＲＴの触媒活性を、当該技術分野における標準的方法に従って測定することができる。
【0026】
本発明によるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、ＴＥＲＴ遺伝子のコーディング配列（ＣＤＳ）を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。「コーディング配列」又は「コーディング領域」とは、タンパク質をコードする遺伝子の部分を指す。上記ヌクレオチド配列は、天然に存在する（代替的には、「野生型」とも呼ばれる）配列と比較して、改変されていても、又は改変されていなくてもよい。適切な非限定的な改変は、ヌクレオチドの挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換から選択され得る。当業者によれば、上記で論じられたＴＥＲＴの改変型の発現をもたらす改変も包含されるものと理解される。ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、イントロン及び／又は５’非翻訳領域及び／又は３’非翻訳領域等のＴＥＲＴ遺伝子の非コーディング領域を含んでも、又は含まなくてもよく、好ましくは、非コーディング領域を含まない。したがって、幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ＴＥＲＴ遺伝子のコーディング領域を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ＴＥＲＴ遺伝子のコーディング配列のみからなる。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードする好ましいヌクレオチド配列は、ＴＥＲＴ遺伝子の天然に付随する３’ＵＴＲ領域を含まない。
【0027】
ヌクレオチド配列の改変を、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 3rd edition (2003), John Wiley & Sons Incのような標準的なハンドブック、及びSambrook and Green, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 4th Edition (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press（どちらも、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）等の当該技術分野において既知のあらゆる組換えＤＮＡ技術を使用して実施することができる。Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488（部位特異的突然変異誘発について説明している）及びRoberts et al. (1987) Nature 328:731-734又はWells, J.A., et al. (1985) Gene 34: 315（カセット突然変異誘発について説明している）も参照のこと。
【0028】
本発明による組換えウイルスゲノムに含まれるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、上記遺伝子を含む組換えウイルスゲノムが導入される細胞の本来のヌクレオチド配列に相当する場合もあれば、又は相当しない場合もある。上記ヌクレオチド配列は、あらゆるＴＥＲＴをコードする配列に由来し得る。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は哺乳動物を起源とする。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ネズミ科動物、ウサギ科動物、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、又はヒトを起源とする。ヒトにおいては、長いアイソフォーム（ＮＣＢＩ ＣＣＤＳ ＩＤ：３８６１．２）及び短いアイソフォーム（ＮＣＢＩ ＣＣＤＳ ＩＤ：５４８３１．１）といった長さが異なる２種のＴＥＲＴアイソフォームが存在する。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、ネズミ科動物（マウス又はラット等）又はヒトを起源とし、好ましくはヒトを起源とし、より好ましくは、そのヌクレオチド配列は、ヒトＴＥＲＴの長いアイソフォーム若しくは短いアイソフォーム又はそれらの改変型である。
【0029】
ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列の改変はコドン最適化を含み得る。したがって、幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはヒト細胞又はマウス細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている。「コドン最適化」の説明は、本明細書において「一般情報」と題するセクションで後述される。
【0030】
幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。配列番号４は、マウスＴＥＲＴのアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｏ７０３７２－１）を示す。
【0031】
幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号７若しくは配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。配列番号７は、ヒトＴＥＲＴの長いアイソフォームのアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｏ１４７４６－１）を示す。配列番号１０は、ヒトＴＥＲＴの短いアイソフォームのアミノ酸配列（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｏ１４７４６－３）を示す。
【0032】
幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴをコードする好ましいヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0033】
したがって、好ましい実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列であって、
ａ）ＴＥＲＴをコードする配列が、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列、若しくは配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるか、
ｂ）ＴＥＲＴをコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、若しくは配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６若しくは配列番号９と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるか、又は、
ｃ）ＴＥＲＴをコードする配列が、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、ヌクレオチド配列を含む。
ａ）ＴＥＲＴをコードする配列が、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０のいずれか１つのアミノ酸配列、若しくは配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるか、
ｂ）ＴＥＲＴをコードする配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、若しくは配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６若しくは配列番号９と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなるか、又は、
ｃ）ＴＥＲＴをコードする配列が、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、ヌクレオチド配列を含む。
【0034】
本発明によるテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結される。「作動可能に連結される」の説明は、本明細書において「一般情報」と題するセクションで後述される。本開示全体を通じて、「プロモーター」及び「プロモーター配列」という用語は区別なく使用され、「転写調節配列」又は「調節配列」により置き換えられ得る。これらの用語の定義は「一般情報」のセクションに示される。
【0035】
「組織特異的」プロモーター又は「器官特異的」プロモーターは、それぞれ特定の種類の組織又は器官において活性なプロモーターである。上記プロモーターは、構成的であっても、又は誘導性であってもよい。これらの用語の定義は「一般情報」のセクションに示される。この用語はまた、上記組織又は器官の特定の細胞において活性なプロモーター（細胞特異的プロモーター）も包含する。この文脈において、「プロモーター活性」という用語は、プロモーターに作動可能に連結されたコーディングヌクレオチド配列の転写を開始する上記プロモーターの能力を指す。組織特異的プロモーター及び器官特異的プロモーターは、主に１つの組織又は器官における、及び／又は組織又は器官の特定の細胞における１つ以上の遺伝子の発現を調節する。幾つかの実施の形態において、組織特異的プロモーター及び器官特異的プロモーターは、他の組織又は器官における検出可能なレベルの（「リーキーな」）発現をなおも可能にし得る。他の組織又は器官におけるリーキーな発現とは、当業者が既知の標準的なアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ）によってｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルで評価されて、組織特異的発現又は器官特異的発現と比較して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍低いが、なおも検出可能である発現を意味する。
【0036】
プロモーターの組織特異的性質及び／又は器官特異的性質の評価を、例えばSambrook and Green（上記参照）に記載されるような標準的な分子ツールボックス技術によって行うことができる。非限定的な例として、本明細書に記載される組換えウイルスゲノムのいずれかを含み、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列がＧＦＰをコードするヌクレオチド配列によって置き換えられたあらゆる発現ベクターが生成され得る。次いで、本明細書に記載されるように形質導入された細胞、組織、及び器官を、標準的なプロトコルに従って、例えば本開示の実施例のセクションに記載されるように、ＲＮＡレベル若しくはタンパク質レベル、又は免疫染色法及び／又は顕微鏡法（例えば、蛍光顕微鏡法、光学顕微鏡法、明視野顕微鏡法等）に基づいて発現について評価することができる。
【0037】
本発明によるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列は、上記プロモーターを含む組換えウイルスゲノムが導入される細胞の本来のプロモーター配列に相当する場合もあれば、又は相当しない場合もある。幾つかの実施の形態において、プロモーター配列は哺乳動物を起源とする。幾つかの実施の形態において、プロモーター配列は、ネズミ科動物、ウサギ科動物、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、又はイヌを起源とする。幾つかの実施の形態において、プロモーター配列は、ネズミ科動物（マウス又はラット等）又はヒトを起源とし、好ましくはヒトを起源とする。
【0038】
実施例において実証されるように、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び器官特異的プロモーターにより、標的組織における遺伝子発現の増加、及びオフターゲット組織における遺伝子発現の減少が可能になることを見出した。
【0039】
幾つかの実施の形態において、本発明による組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、肺特異的プロモーター又は心臓特異的プロモーターであり、好ましくは肺特異的プロモーターである。
【0040】
「肺特異的プロモーター」は、肺及び／又は肺組織及び／又は肺細胞において転写を開始することができるプロモーターである。上記プロモーターは、他の器官及び身体部分においてリーキーな発現をなおも可能にする場合もあれば、又は可能にしない場合もある。「肺特異的」には、本明細書において後述するように、他の器官、組織、又は細胞と比較して、肺及び／又は肺組織及び／又は肺細胞におけるヌクレオチド配列の優先的な又は優勢な発現を駆動するプロモーターも包含される。肺での転写は、気管、気管支、胸膜、横隔膜、細気管支、肺胞、又は上皮等の関連領域において検出され得る。肺上皮の細胞において転写を開始することができるプロモーターが有利である。肺胞ＩＩ型上皮細胞（ＡＴＩＩ細胞）において転写を開始することができるプロモーターが特に有利である。したがって、幾つかの実施の形態において、肺特異的プロモーターは、肺胞ＩＩ型上皮細胞特異的（ＡＴＩＩ細胞特異的）プロモーターである。幾つかの実施の形態において、好ましい肺特異的プロモーターは、サーファクタントタンパク質Ａ（ＳｐＡ）プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳｐＢ）プロモーター、及びそれらの誘導体からなる群より選択され、好ましくはＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0041】
「心臓特異的プロモーター」（代替的には、「心特異的プロモーター」として知られる）は、心臓及び／又は心臓組織及び／又は心臓細胞において転写を開始することができるプロモーターである。上記プロモーターは、他の器官及び身体部分においてリーキーな発現をなおも可能にする場合もあれば、又は可能にしない場合もある。「心臓特異的」には、本明細書において後述するように、他の器官、組織、又は細胞と比較して、心臓及び／又は心臓組織及び／又は心臓細胞におけるヌクレオチド配列の優先的又は優勢な発現を駆動するプロモーターも包含される。心臓での転写は、三尖弁、肺動脈弁、僧帽弁、大動脈弁、左心房、右心房、左心室、右心室、上皮、又は心筋等の関連領域において検出され得る。心筋の細胞において転写を開始することができるプロモーターが有利である。心筋細胞において転写を開始することができるプロモーターが特に有利である。したがって、幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは心筋特異的プロモーターである。幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは心筋細胞特異的プロモーターである。幾つかの実施の形態において、好ましい心臓特異的プロモーターは、ミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）、トロポニン（ＴＮＴ）プロモーター、及びそれらの誘導体からなる群より選択され、好ましくはトロポニン（ＴＮＴ）プロモーター又はその誘導体である。幾つかの実施の形態において、好ましい心筋特異的プロモーター又は心筋細胞特異的プロモーターは、ミオシン軽鎖２ｖ（ＭＬＣ２ｖ）、トロポニン（ＴＮＴ）プロモーター、及びそれらの誘導体からなる群より選択され、好ましくはトロポニン（ＴＮＴ）プロモーター又はその誘導体である。
【0042】
本発明の文脈において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、他の組織又は器官と比較して優先的な又は優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高い、又はそれより高い）特定の組織及び／又は器官におけるヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターであり得る。他の器官又は組織は、肝臓、ＣＮＳ、脳、脂肪組織（白色及び／又は褐色）、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、膵臓、精巣、精巣上体、腸等であり得る。好ましくは、他の器官又は組織は肝臓及び脂肪組織（白色及び／又は褐色）である。
【0043】
肺特異的プロモーターは、好ましくは、脳、脂肪組織（白色及び／又は褐色）、心臓、及び／又は肝臓、好ましくは脳、褐色脂肪組織、及び／又は心臓から選択される１つ以上の組織及び／又は器官と比較して優先的な又は優勢な肺におけるヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターであり得る。心臓特異的プロモーターは、好ましくは、脂肪組織（白色及び／又は褐色）、肝臓、腸、精巣、及び／又は骨格筋から選択される１つ以上の組織及び／又は器官と比較して優先的な又は優勢な心臓におけるヌクレオチド配列の発現を駆動することができるプロモーターであり得る。発現を「一般情報」のセクションに記載されるように評価することができる。
【0044】
本発明によるプロモーターのヌクレオチド配列は、対応する天然に存在する配列と比較して改変されていてもよい。このような改変されたプロモーターは、本明細書において、代替的に、それらの天然に存在する型（野生型）の「誘導体」とも呼ばれる場合がある。適切な非限定的な改変は、ヌクレオチドの挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換から選択され得る。本明細書の別の場所で論じられるように、適切な改変には、限定されるものではないが、エンハンサー又は他のプロモーター配列等の他のヌクレオチド配列とのプロモーター配列の融合物も含まれる。特に有利なのは、対応する天然に存在するプロモーター配列と比較して、長さが最小化されたプロモーター配列（「短縮型のプロモーター」又は「プロモーター断片」）をもたらす改変である。短縮型のプロモーターは、好ましくは、対応する天然に存在するプロモーター配列の配列長さの少なくとも５％、少なくとも１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、又は４０％を含み得る。
【0045】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、１０００ヌクレオチド未満、９００ヌクレオチド未満、８００ヌクレオチド未満、７００ヌクレオチド未満、又は６５０ヌクレオチド未満の長さを有し得る。
【0046】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、１００ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～９００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド～８００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド～７００ヌクレオチド、又は３５０ヌクレオチド～６５０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【0047】
好ましい実施の形態において、肺特異的プロモーターは、ＳｐＢプロモーター、好ましくはヒトＳｐＢプロモーターの短縮型である。幾つかの実施の形態において、好ましい肺特異的プロモーターは、配列番号１１の配列長さの少なくとも１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、又は４０％、好ましくは少なくとも３８％又は４０％を含み、より好ましくは、配列番号１２、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を含む。
【0048】
幾つかの実施の形態において、好ましい心臓特異的プロモーターは、ＭＬＣ２ｖプロモーター、好ましくはヒトＭＬＣ２ｖプロモーターの短縮型であり、より好ましくはヒトＭＬＣ２ｖプロモーターの２９６ヌクレオチドの断片である。幾つかの実施の形態において、ヒトＭＬＣ２ｖプロモーターの２９６ヌクレオチドの断片は、配列番号１３の配列、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列を有する。
【0049】
幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは、Henderson et al. J Biol Chem 264;30:18142-8, (1989)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるラットＭＬＣ２ｖプロモーターの２５０ヌクレオチドの断片ではなく、及び／又は心臓特異的プロモーターは、Ian Phillips et al. Hypertension 39:651-655, (2002)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるラットＭＬＣ２ｖプロモーターの２８１ヌクレオチドの断片（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：Ｕ２６７０８のヌクレオチド－２６４～＋１７に相当する）ではない。
【0050】
幾つかの実施の形態において、好ましい心臓特異的プロモーターは、トロポニンプロモーター、好ましくはヒトトロポニンプロモーターの短縮型であり、より好ましくは、Werfel et al. Cardiovasc Res 104;1:15-23, (2014)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるヒトトロポニンプロモーターの５４４塩基対の断片（配列番号１６）、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【0051】
本発明によるプロモーターの誘導体は、好ましくは、対応する天然に存在する配列の転写開始能力の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を示す。配列改変方法及び転写開始能力（「プロモーター強度」）を評価する方法は本明細書の別の場所で論じられる。
【0052】
本明細書において論じられるプロモーター又はその誘導体は、組換えウイルスゲノムにおいて単コピー又は多コピーで存在し得る。
【0053】
本発明による組換えウイルスゲノムは、限定されるものではないが、シグナル配列、核局在化シグナル、発現エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、コザック配列等のようなＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された追加のヌクレオチド配列を更に含んでいてもよい。上記配列は、上記プロモーターを含む組換えウイルスゲノムが導入される細胞の本来の配列に相当する場合もあれば、又は相当しない場合もある。
【0054】
「エンハンサー」は、作動可能に連結された配列の転写を刺激し得る配列である。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列の場合には、連続しかつ読み枠を共有している。しかしながら、エンハンサーは、エンハンサーが転写を制御するコーディング配列と連続している必要はない。連結は、使いやすい制限部位でのライゲーション、又はその代わりに挿入されたアダプター若しくはリンカーでのライゲーション、又は遺伝子合成によって達成される。エンハンサーは、単一配列として使用されてもよく、又は他のエンハンサー及び／又は本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターのいずれかとの融合ヌクレオチド配列に含まれてもよい。エンハンサー－プロモーター融合物は、天然に存在するプロモーターと比較して短縮されたプロモーター誘導体を利用して、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列の発現を駆動する場合、転写駆動能力を増強するのに特に有利であり得る。
【0055】
幾つかの実施の形態において、本発明の組換えウイルスゲノムは、ＣＭＶエンハンサー（配列番号１４）を含む。幾つかの実施の形態において、本発明の組換えウイルスゲノムは、ＣＭＶエンハンサーと、ＭＬＣ２ｖプロモーターの短縮型との間の融合物（以後、代替的にＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターとも呼ばれる）を含む。好ましくは、上記融合物は、本明細書の別の場所で論じられるように、ＣＭＶエンハンサーと、ヒトＭＬＣ２ｖプロモーターの２９６ヌクレオチドの断片との間のものである（配列番号１５）。
【0056】
したがって、幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、ＳｐＢ、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ、トロポニンプロモーター、及びそれらの誘導体からなる群より選択されるプロモーターを含み、好ましくは、上記プロモーターはＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0057】
幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーター、より詳細にはトロポニンプロモーターは、ニワトリトロポニンプロモーターではない。幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーター、より詳細にはトロポニンプロモーターは、Prasad et al. Gene Ther 18(1):43-52, (2011)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるニワトリトロポニンプロモーターの４１１ヌクレオチドの断片ではない。幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーター、より詳細にはトロポニンプロモーターは、非特許文献８（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるニワトリトロポニンプロモーターではない。
【0058】
幾つかの実施の形態において、肺特異的プロモーターは、配列番号１１又は配列番号１２、好ましくは配列番号１２と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0059】
幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１６のいずれか１つ、好ましくは配列番号１５又は配列番号１６、より好ましくは配列番号１６と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0060】
したがって、好ましい実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、又は配列番号１６、好ましくは配列番号１２、配列番号１５、又は配列番号１６、より好ましくは配列番号１２又は配列番号１６、最も好ましくは配列番号１２を有するヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるプロモーターを含む。
【0061】
コザック配列（代替的に、本明細書においてはコザックコンセンサス配列とも呼ばれる）は、タンパク質翻訳開始部位として機能し、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を増強し得る核酸モチーフである。幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたコザックコンセンサス配列を含む。好ましくは、上記コザックコンセンサス配列はヒトを起源とする。幾つかの実施の形態において、好ましいコザックコンセンサス配列は、配列番号１７と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0062】
ポリアデニル化配列（代替的に、本明細書において「ポリＡ配列」又は「ポリＡ尾部」とも呼ばれる）は、ｍＲＮＡ配列の核外輸送、翻訳、及び／又は安定性を増強することによって作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現を増強し得る一続きの多数のアデノシン一リン酸のみからなるヌクレオチド配列である。幾つかの実施の形態において、本発明による組換えウイルスゲノムは、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリＡ配列を含む。好ましくは、上記ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウサギβ－グロビンポリＡ配列、又はウシ成長ホルモンのポリＡ配列から選択され、より好ましくはウシ成長ホルモンのポリＡ配列である。幾つかの実施の形態において、好ましいポリＡ配列は、配列番号１８と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0063】
幾つかの実施の形態において、好ましい組換えウイルスゲノムは、肺特異的プロモーター、好ましくはＳｐＢプロモーター又はその誘導体、より好ましくは配列番号１１又は配列番号１２、好ましくは配列番号１２と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるプロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムであり、ここで、このウイルスゲノムの全長は４７００ヌクレオチド未満である。任意に、遺伝子コンストラクトは、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ２のゲノムに由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。幾つかの実施の形態において、そのような組換えウイルスゲノムは、配列番号２１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0064】
幾つかの実施の形態において、好ましい組換えウイルスゲノムは、心臓特異的プロモーター、好ましくはＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター又はその誘導体、より好ましくは配列番号１５と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるプロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムであり、ここで、このウイルスゲノムの全長は４７００ヌクレオチド未満である。任意に、遺伝子コンストラクトは、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ２のゲノムに由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。幾つかの実施の形態において、そのような組換えウイルスゲノムは、配列番号２２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0065】
幾つかの実施の形態において、好ましい組換えウイルスゲノムは、心臓特異的プロモーター、好ましくはトロポニンプロモーター又はその誘導体、より好ましくは配列番号１６と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるプロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムであり、ここで、このウイルスゲノムの全長は４７００ヌクレオチド未満である。任意に、遺伝子コンストラクトは、ＡＡＶ、好ましくはＡＡＶ２のゲノムに由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。幾つかの実施の形態において、そのような組換えウイルスゲノムは、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。
【0066】
本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、組織特異的遺伝子発現及び／又は器官特異的遺伝子発現に有用である。したがって、更なる態様において、本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターが提供される。幾つかの実施の形態において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、肺特異的プロモーター、好ましくは本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター又はその誘導体、より好ましくは本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター、更により好ましくは本明細書に記載されるヒトＳｐＢプロモーターの短縮型である。幾つかの実施の形態において、好ましい肺特異的プロモーターは、配列番号１１の配列長さの少なくとも５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、又は４０％、好ましくは少なくとも３８％又は４０％を含み、より好ましくは、配列番号１２を含む。幾つかの実施の形態において、組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターは、心臓特異的プロモーター、好ましくは本明細書に記載されるＭＬＣ２ｖプロモーター又はその誘導体、より好ましくは本明細書に記載されるＭＬＣ２ｖプロモーター、更により好ましくは本明細書に記載されるヒトＭＬＣ２ｖプロモーターの短縮型である。幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは配列番号１３を含む。幾つかの実施の形態において、心臓特異的プロモーターは配列番号１５を含む。
【0067】
本明細書に記載されるあらゆる配列について、幾つかの実施の形態において、本明細書において使用される配列同一性又は配列類似性のレベルは、好ましくは７０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
【0068】
発現ベクター
本明細書に記載される組換えウイルスゲノムを、発現ベクター中に配置することができる。したがって、更なる態様において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノムを含む発現ベクターが提供される。
本明細書に記載される組換えウイルスゲノムを、発現ベクター中に配置することができる。したがって、更なる態様において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノムを含む発現ベクターが提供される。
【0069】
「発現ベクター」の説明は「一般情報」と題するセクションに示される。当業者によれば、「発現ベクター」という用語が非ウイルスベクター及びウイルスベクターを含むものと理解される。適切な発現ベクターは、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等のような細胞間での遺伝子又は核酸の移行を促進することができるあらゆる遺伝因子から選択され得る。適切な発現ベクターはまた、脂質複合体又は裸のＤＮＡ等の化学的ベクターであってもよい。「裸のＤＮＡ」又は「裸の核酸」は、標的細胞の細胞質への核酸の送達を促進するウイルス粒子、細菌細胞、又は他の封入手段内に収容されていない核酸分子を指す。任意に、裸の核酸を、標的細胞への核酸の送達を促進するのに当該技術分野において使用される標準的手段と会合させて、例えば、消化管を通じた核酸の輸送を促進させ、核酸を胃酸及び／又はヌクレアーゼから保護し、及び／又は腸粘液の浸透に役立てることができる。
【0070】
好ましい実施の形態において、発現ベクターはウイルス発現ベクターである。「ウイルス発現ベクター」の説明は「一般情報」と題するセクションにて示されている。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターであってもよい。
【0071】
好ましい実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、好ましくは組換えＡＡＶゲノムを含む発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。アデノ随伴ウイルスベクターは代替的に、本明細書においてアデノ随伴ベクター又はアデノ随伴ウイルス由来ベクター又はＡＡＶベクターとも呼ばれる場合もある。「アデノ随伴ウイルスベクター」の説明は「一般情報」と題するセクションにて示されている。上記ベクターは典型的には、およそ４７００ヌクレオチド（４．７ｋｂ）のヌクレオチド配列カプシド形成能力を有する。実施例で実証されるように、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＡＶベクターを発現ベクターとして利用する場合、欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成が防止され、上記ベクターの治療有効性が増加するため、本発明の組換えウイルスゲノムが、顕著な予想外の利点を示すことを見出した。好ましいＡＡＶベクターは、血清型１型のＡＡＶ（ＡＡＶ１）、血清型２型のＡＡＶ（ＡＡＶ２）、血清型３型のＡＡＶ（ＡＡＶ３）、血清型４型のＡＡＶ（ＡＡＶ４）、血清型５型のＡＡＶ（ＡＡＶ５）、血清型６型のＡＡＶ（ＡＡＶ６）、血清型７型のＡＡＶ（ＡＡＶ７）、血清型８型のＡＡＶ（ＡＡＶ８）、血清型９型のＡＡＶ（ＡＡＶ９）、血清型ｒｈ１０型のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ８型のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ８）、血清型Ｃｂ４型のＡＡＶ（ＡＡＶＣｂ４）、血清型ｒｈ７４型のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ＤＪ型のＡＡＶ（ＡＡＶＤＪ）、血清型２／５型のＡＡＶ（ＡＡＶ２／５）、血清型２／１型のＡＡＶ（ＡＡＶ２／１）、血清型１／２型のＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）、及び血清型Ａｎｃ８０型のＡＡＶ（ＡＡＶＡｎｃ８０）からなる群より選択され得て、好ましくは血清型６型、血清型８型、又は血清型９型のＡＡＶ（ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９）からなる群より選択され、より好ましくは血清型６型のＡＡＶ（ＡＡＶ６）又は血清型９型のＡＡＶ（ＡＡＶ９）から選択され、更により好ましくは血清型９型のＡＡＶ（ＡＡＶ９）である。
【0072】
幾つかの実施の形態において、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶ６又はＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９であり、肺特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムを含み、ここで、ウイルスゲノムの全長は、本明細書において先で記載したように４７００ヌクレオチド未満である。任意に、組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのゲノム、好ましくはＡＡＶ２に由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。上記発現ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0073】
幾つかの実施の形態において、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶ６又はＡＡＶ９であり、ＳｐＢプロモーター又はその誘導体に作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶウイルスゲノムを含み、ここで、ウイルスゲノムの全長は、本明細書において先で記載したように４７００ヌクレオチド未満である。好ましくは、プロモーター配列は、配列番号１１又は配列番号１２、好ましくは配列番号１２と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。任意に、組換えＡＡＶウイルスゲノムは、ＡＡＶのゲノム、好ましくはＡＡＶ２に由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。上記発現ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0074】
幾つかの実施の形態において、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶ６又はＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９であり、心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶウイルスゲノムを含み、ここで、ウイルスゲノムの全長は、本明細書において先で記載したように４７００ヌクレオチド未満である。任意に、組換えＡＡＶウイルスゲノムは、ＡＡＶのゲノム、好ましくはＡＡＶ２に由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。上記発現ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0075】
幾つかの実施の形態において、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶ６又はＡＡＶ９であり、ＭＬＣ２ｖプロモーター又はその誘導体に作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶウイルスゲノムを含み、ここで、ウイルスゲノムの全長は、本明細書において先で記載したように４７００ヌクレオチド未満である。好ましくは、プロモーター配列は、配列番号１３又は配列番号１５、好ましくは配列番号１５と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。任意に、組換えＡＡＶウイルスゲノムは、ＡＡＶのゲノム、好ましくはＡＡＶ２に由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。上記発現ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0076】
幾つかの実施の形態において、好ましい発現ベクターは、ＡＡＶ６又はＡＡＶ９であり、トロポニンプロモーター又はその誘導体に作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶウイルスゲノムを含み、ここで、ウイルスゲノムの全長は、本明細書において先で記載したように４７００ヌクレオチド未満である。好ましくは、プロモーター配列は、配列番号１６と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなる。任意に、組換えＡＡＶウイルスゲノムは、ＡＡＶのゲノム、好ましくはＡＡＶ２に由来する５’側及び３’側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を更に含む。上記発現ベクターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、又は配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号３、配列番号６、又は配列番号９のいずれか１つ、より好ましくは配列番号６又は配列番号９と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、又はそれのみからなるＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0077】
ヌクレオチド配列をベクター化する組換えＡＡＶベクター（「ｒＡＡＶ」とも呼ばれる）の生成は以前に記載されており、Ayuso E, et al., Curr. Gene Ther. 2010; 10:423-436、Okada T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:1013-1021、Zhang H, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:922-929、及びVirag T, et al., Hum. Gene Ther. 2009; 20:807-817（いずれも引用することによりその全てが本明細書の一部をなす）を参照のこと。これらのプロトコルを使用して又は適合させて、本発明によるＡＡＶベクターを作製することができる。したがって、別の態様において、本明細書に記載されるアデノ随伴ウイルスベクターを生成する方法が提供される。
【0078】
要するに、この方法は一般に、（ａ）発現されるヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶゲノムを細胞へと導入することと、（ｂ）細胞内にＡＡＶヘルパーコンストラクトを存在させること又は導入することと（ここで、ヘルパーコンストラクトは組換えＡＡＶゲノムから欠落しているウイルス機能を含む）、任意に（ｃ）ヘルパーウイルス及び／又はヘルパーウイルスプラスミドを宿主細胞へと導入することとを含む。ＡＡＶベクターの複製及びゲノムのＡＡＶベクターへのパッケージングを達成するには、ＡＡＶベクターの複製及びパッケージング用の全ての構成要素が存在する必要がある。これらの構成要素としては、典型的には、ＡＡＶのｃａｐタンパク質、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質、及び任意に、ＡＡＶが複製に関して依存するウイルスタンパク質が挙げられる。ｒｅｐ領域及びｃａｐ領域は、当該技術分野において既知であり、例えばChiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）又は米国特許第５，１３９，９４１号（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照のこと。ＡＡＶのｃａｐタンパク質及びｒｅｐタンパク質は、同じＡＡＶの血清型に由来しても、又は異なる血清型の組合せに由来してもよく、好ましくは、これらはＡＡＶ６又はＡＡＶ９の血清型に由来する。ＡＡＶが複製に関して依存するウイルスタンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型及びＨＳＶ２型等）、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はアデノウイルス等のあらゆるウイルス、好ましくはアデノウイルスに由来してもよい。
【0079】
幾つかの実施の形態において、産生細胞系統は、本発明による組換えＡＡＶゲノム（ＩＴＲによって両側が挟まれたＴＥＲＴ発現カセットを含む）と、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質をコードし、かつヘルパー機能を提供するコンストラクト（複数の場合もある）（ヘルパーコンストラクト（複数の場合もある））とで一過的にトランスフェクションされる。幾つかの実施の形態において、この細胞系統は、安定的にヘルパー機能を提供し、本発明による組換えＡＡＶゲノム（ＩＴＲによって両側が挟まれたＴＥＲＴ発現カセットを含む）と、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質をコードするコンストラクト（複数の場合もある）とで一過的にトランスフェクションされる。幾つかの実施の形態において、この細胞系統は、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質並びにヘルパー機能を安定的に提供し、本発明による組換えＡＡＶゲノムで一過的にトランスフェクションされる。別の実施の形態において、この細胞系統は、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質を安定的に提供し、本発明による組換えＡＡＶウイルスゲノムと、ヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドとで一過的にトランスフェクションされる。幾つかの実施の形態において、この細胞系統は、本発明による組換えＡＡＶゲノム、ｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質、並びにヘルパー機能を安定的に提供する。これらのＡＡＶ産生系及び他のＡＡＶ産生系を作製及び使用する方法は当該技術分野において記載されている。Muzyczka Nらの米国特許第５，１３９，９４１号、Zhou Xらの米国特許第５，７４１，６８３号、Samulski Rらの米国特許第６，０５７，１５２号、Samulski Rらの米国特許第６，２０４，０５９号、Samulski Rらの米国特許第６，２６８，２１３号、Rabinowitz Jらの米国特許第６，４９１，９０７号、Zolotukhin Sらの米国特許第６，６６０，５１４号、Shenk Tらの米国特許第６，９５１，７５３号、Snyder Rらの米国特許第７，０９４，６０４号、Rabinowitz Jらの米国特許第７，１７２，８９３号、Monahan Pらの米国特許第７，２０１，８９８号、Samulski Rらの米国特許第７，２２９，８２３号、及びFerrari Fらの米国特許第７，４３９，０６５号（いずれも引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照のこと。
【0080】
ｒＡＡＶベクター中に存在する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、典型的には、ＡＡＶ血清型のゲノム（好ましくは、本明細書に開示される血清型ＡＡＶ２のゲノム）の逆方向末端反復領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、又は実質的にそれと同一のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列と、２つのＩＴＲ間に挿入された本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列とを少なくとも含む。ベクターゲノムは一般に、ｒＡＡＶカプシドへのベクターゲノムの効率的なパッケージングを可能にするのに、両側にある５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。上記ＩＴＲ配列は、必ずしもｒＡＡＶベクターと同じＡＡＶ血清型に由来する必要はない。
【0081】
幾つかのＡＡＶ血清型の完全なゲノム及び対応するＩＴＲは配列決定されている（Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））。これらを、当該技術分野において既知の化学的合成によって、例えばApplied Biosystems Inc.（米国カリフォルニア州、フォスターズ）によって供給されるオリゴヌクレオチド合成装置を使用して、又は標準的な分子生物学技術によってクローニングし、又は作製することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムからクローニングすることも、又はＡＡＶのＩＴＲを含むベクターから切り出すこともできる。ＩＴＲヌクレオチド配列を、標準的な分子生物学技術を使用して、本明細書に記載される組織特異的プロモーター及び／又は器官特異的プロモーターに作動可能に連結されたＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列のいずれかの末端にライゲーションすることができ、又は代替的には、ＩＴＲ間のＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列に置き換えることができる。
【0082】
好ましくは、ｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）遺伝子又はｃａｐ（カプシド）遺伝子等のウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を一切含まない。このｒＡＡＶゲノムは、例えば、当該技術分野において既知の抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）をコードする遺伝子、又は化学的に、酵素的に、若しくは他の方法で検出可能な及び／又は選択可能な生成物をコードする遺伝子（例えばｌａｃＺ、ａｐｈ等）等のマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を更に含んでいてもよい。
【0083】
産生細胞への導入を、形質転換、形質導入、及びトランスフェクション等の標準的なウイルス学的技術を使用して行うことができる。殆どのベクターは、そのベクターを感染させた産生細胞中で複製しない。細胞系統及び発現ベクターの実施可能な組合せの例は、Sambrook and Green（上記参照）、及びMetzger et al (1988) Nature 334: 31-36（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されている。例えば、適切な発現ベクターは、酵母、例えばＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）、例えば昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、及び細菌細胞、例えばＥ．コリ（E. coli）中で発現され得る。したがって、細胞は原核生物又は真核生物の産生細胞であり得る。細胞は、液体培地中又は固体培地上での培養に適した細胞であり得る。最後に、産生細胞は、当該技術分野において既知の標準条件下で培養して、集合したＡＡＶベクターを生成した後に、これらをポリエチレングリコール沈殿又はＣｓＣｌ勾配等の標準的な技術を使用して精製する（Xiao et al. 1996, J. Virol. 70: 8098-8108（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））。残留するヘルパーウイルス活性を、例えば熱失活等の既知の方法を使用して失活させることができる。
【0084】
次いで、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び発現ベクターを、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al.、上記参照）及びSambrook and Green（上記参照）等の標準的なハンドブックにおいて論じられているように、標準的な分子技術を使用して宿主細胞へと導入することができる。ウイルスベクターの場合、形質導入を使用することが好ましい。形質導入された宿主細胞は、ウイルスベクターのタンパク質シェルを含んでいても、又は含まなくてもよい。「宿主細胞」又は「標的細胞」（代替的に、「細胞」又は「操作された細胞」とも呼ばれる）は、本明細書の別の場所に記載される哺乳動物被験体の肺細胞又は心臓細胞等のＤＮＡ送達が行われる細胞を指す。特にＡＡＶベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞のどちらにも形質導入することができる。
【0085】
したがって、本発明は更に、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム又は発現ベクターのいずれかで形質導入された宿主細胞を提供する。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム又は発現ベクターのいずれかで形質導入された宿主細胞は、脊椎動物の肺細胞等の肺細胞、好ましくは哺乳動物の肺細胞、より好ましくは哺乳動物の肺胞ＩＩ型上皮細胞（ＡＴＩＩ細胞）である。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム又は発現ベクターのいずれかで形質導入された宿主細胞は、ラット、マウス、イヌ、又はヒト、好ましくはマウス又はヒト、より好ましくはヒトの肺細胞、好ましくは肺胞ＩＩ型上皮細胞（ＡＴＩＩ細胞）である。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム又は発現ベクターのいずれかで形質導入された宿主細胞は、脊椎動物の心臓細胞等の心臓（心）細胞、好ましくは哺乳動物の心臓細胞、より好ましくは哺乳動物の心筋細胞である。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム又は発現ベクターのいずれかで形質導入された宿主細胞は、ラット、マウス、イヌ、又はヒト、好ましくはマウス又はヒト、より好ましくはヒトの心臓細胞、好ましくは心筋細胞である。
【0086】
提供される宿主細胞は、必ずしも個体内に存在する必要はない。当業者によれば、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び発現ベクターの導入が細胞培養物において実施され得ると理解される。幾つかの実施の形態において、提供される宿主細胞は、人工器官、好ましくは人工肺又は人工心臓内に存在する。幾つかの実施の形態において、提供される宿主細胞は、オルガノイド、好ましくは肺オルガノイド又は心臓オルガノイド内に存在する。本明細書において定義される「オルガノイド」は、現実的な微小解剖学的構造を示すｉｎ ｖｉｔｒｏで三次元的に生成された器官の小型版及び簡略版である。当業者であれば、当該技術分野において一般的に既知の手順を適用することによって、本発明の宿主細胞を使用して、そのような人工器官及び／又はオルガノイドに至ることができる。人工器官及び／又はオルガノイド内に存在する形質導入された宿主細胞を、当該技術分野において一般的に既知の手順を使用して、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、イヌ、又はヒト、より好ましくはマウス又はヒト、最も好ましくはヒトに移植することができる。
【0087】
組成物
更なる態様において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び／又は本明細書に記載される発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターを含み、任意に１つ以上の薬学的に許容可能な成分を更に含む組成物が提供される。このような組成物は、遺伝子療法組成物と呼ばれる場合がある。好ましくは、組成物は、医薬組成物である。医薬組成物等の組成物は、特定の投与様式に適するように製剤化され得る。適切な投与様式は、本明細書の別の場所に記載されている。特定の投与様式に適したものであると本明細書に記載される組成物に最も適切である製剤の種類と同様に製剤化方法も十分に当業者の技能の範囲内であり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 23rd edition, Elsevier (2020)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）等の標準的なハンドブックに記載されている。
更なる態様において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び／又は本明細書に記載される発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターを含み、任意に１つ以上の薬学的に許容可能な成分を更に含む組成物が提供される。このような組成物は、遺伝子療法組成物と呼ばれる場合がある。好ましくは、組成物は、医薬組成物である。医薬組成物等の組成物は、特定の投与様式に適するように製剤化され得る。適切な投与様式は、本明細書の別の場所に記載されている。特定の投与様式に適したものであると本明細書に記載される組成物に最も適切である製剤の種類と同様に製剤化方法も十分に当業者の技能の範囲内であり、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 23rd edition, Elsevier (2020)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）等の標準的なハンドブックに記載されている。
【0088】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な成分」としては、薬学的に許容可能な担体、充填剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤、及び／又は添加剤が挙げられる。したがって、１種以上の薬学的に許容可能な成分は、薬学的に許容可能な担体、充填剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤、及び／又は添加剤からなる群より選択され得る。このような薬学的に許容可能な担体、充填剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤、及び／又は添加剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（上記参照）において見出すことができる。
【0089】
本発明の組成物中に更なる化合物が存在してもよい。上記化合物は、組成物の送達に役立つものであり得る。この文脈における適切な化合物の例は、小胞又はリポソーム内に複合体化又は捕捉された本明細書に記載される各構成成分を、細胞膜を通じて送達する複合体、ナノ粒子、ミセル、及び／又はリポソームを形成することができる化合物である。これらの化合物の多くは当該技術分野において既知である。適切な化合物は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又はポリプロピレンイミン若しくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）、リポフェクチン（商標）、ＤＯＴＡＰを含み得る。適切な化合物の追加の例は、不活性担体（例えば、炭酸カルシウム及び糖類、例えばスクロース、マンニトール、ラクトース、又はデキストロース等）、溶媒（例えば、水、生理食塩水等）、及び噴射剤ガス（例えば、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、フルオロカーボン（ＦＣ）、又はヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）等）である。
【0090】
幾つかの実施の形態において、組成物、好ましくは、医薬組成物は、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム及び／又は本明細書に記載される発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターの、限定されるものではないが、鼻腔内投与、気管内投与、肺内投与、又は吸入を介した投与等の特定の投与様式に適するように製剤化される。例示的な製剤の非限定的な例は、気道及び／又は肺への送達に適した担体中の粒子のエアロゾル剤、液剤、及び／又は懸濁液剤、及び乾燥粉末剤である。
【0091】
幾つかの実施の形態において、組成物、好ましくは、医薬組成物は送達デバイス内に含まれる。幾つかの実施の形態において、組成物、好ましくは、医薬組成物は、吸入を介した送達に適した送達デバイス（吸入デバイス）内に含まれる。このようなデバイスは当該技術分野において一般に既知であり、多くは市販されており、吸入器（例えば、固定用量吸入器、定量噴霧式吸入器、乾燥粉末吸入器等）及びネブライザー（例えば、ジェット式ネブライザー、超音波式ネブライザー、メッシュ式ネブライザー等）が挙げられる。ネブライザーは、典型的には、エアロゾル粒子の生成によって動作する。本明細書に記載されるエアロゾル化組成物の送達用の例示的なネブライザーとしては、ＡＥＲｘ（商標）（Aradigm）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（商標）（Mallinkrodt）、Ｐａｒｉ ＬＣ Ｐｌｕｓ（商標）又はＰａｒｉ ＬＣ Ｓｔａｒ（商標）（Pari GmbH、ドイツ）、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ Ｐｕｌｍｏ－Ａｉｄｅ、及びＡｃｏｒｎ ＩＩ（商標）（Marquest Medical Products）が挙げられる。
【0092】
方法及び使用
また、本明細書においては、療法において使用される、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び組成物が提供される。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び組成物は、医薬として使用される。
また、本明細書においては、療法において使用される、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び組成物が提供される。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び組成物は、医薬として使用される。
【0093】
本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び組成物は、テロメア長の短縮に関連する病態の治療及び／又は予防において特に有効である。「テロメア長の短縮」の定義は「一般情報」と題するセクションにおいて示されている。したがって、更なる態様において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は組成物は、テロメア長の短縮に関連する病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は組成物は、テロメア長の短縮に関連する肺病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。このような病態の非限定的な例は、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫症候群、及びそれらに関連する病態である。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は組成物は、テロメア長の短縮に関連する心臓病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。このような病態の非限定的な例は、冠状動脈疾患、末梢動脈疾患、心筋梗塞、及びそれらに関連する病態である。好ましい実施の形態において、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は組成物は、肺線維症、心筋梗塞、又はそれらに関連する病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。
【0094】
肺線維症とは、肺組織の瘢痕化を特徴とする病態を指す。肺線維症は、限定されるものではないが、肺細胞のテロメア短縮、慢性炎症過程、感染症、環境化合物、電離放射線（例えば、胸部の腫瘍を治療する放射線療法）、遺伝的素因、又は慢性的病状（狼瘡、関節リウマチ等）を含む多くの要因によって引き起こされる可能性がある。肺線維症には、原因を特定することができない肺線維症を指す特発性肺線維症（ＩＰＦ）が含まれる。肺線維症の症状としては、限定されるものではないが、肺の瘢痕化、線維化容積の発生、肺容積の減損、息切れ、空咳、疲労、体重減少、及びばち状指が挙げられる。肺線維症に関連する病態としては、限定されるものではないが、肺高血圧症、呼吸不全、気胸、及び肺癌が挙げられる。幾つかの実施の形態において、肺線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）であり得る。
【0095】
心筋梗塞とは、心臓筋肉（心筋）の組織死（梗塞）を特徴とする病態を指す。心筋梗塞は、限定されるものではないが、心臓細胞のテロメア短縮、アテローム性動脈硬化症、高血圧（高血圧症）、高コレステロール血症、糖尿病、冠状動脈性心臓病、喫煙、肥満、身体活動不足、環境化合物、感染症、遺伝的素因、又は慢性炎症及びその他の病状を含む多くの要因によって引き起こされる可能性がある。心筋梗塞の症状としては、限定されるものではないが、心臓の瘢痕化、心不全、不整脈、疲労、心臓痛、心原性ショック、又は心停止が挙げられる。心筋梗塞に関連する病態としては、限定されるものではないが、心筋梗塞事象（心臓発作）、心筋梗塞に起因する組織損傷（心筋細胞の損失を含む）、心筋梗塞に起因する心筋の線維化、及び心筋梗塞に起因する心機能の低下が挙げられる。
【0096】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される肺特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物は、テロメア長の短縮に関連する肺病態、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。好ましくは、肺特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0097】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物は、テロメア長の短縮に関連する心臓病態、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態の治療及び／又は予防において使用するのに提供される。好ましくは、心臓特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、トロポニンプロモーター、又はその誘導体、好ましくはトロポニンプロモーター又はその誘導体である。
【0098】
更なる態様において、テロメア長の短縮に関連する病態を治療及び／又は予防する方法であって、それを必要とする被験体等の被験体に、治療有効量の本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は組成物を投与することを含む、方法が提供される。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は肺病態であり、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態である。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は心臓病態であり、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態である。
【0099】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する肺病態、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防する方法であって、それを必要とする被験体等の被験体に、治療有効量の本明細書に記載される肺特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、肺特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0100】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する心臓病態、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防する方法であって、それを必要とする被験体等の被験体に、治療有効量の本明細書に記載される心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、心臓特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、トロポニンプロモーター、又はその誘導体、好ましくはトロポニンプロモーター又はその誘導体である。
【0101】
本明細書において使用される場合、「有効量」は、有益な結果又は所望の結果を発揮するのに十分な量である。したがって、「治療有効量」は、それを必要とする被験体に投与した場合、限定されるものではないが、テロメア長の短縮に関連する病態、好ましくは本明細書の別の場所に記載される肺線維症、心筋梗塞、又はそれらに関連する病態の少なくとも１つの症状の強さの低減及び／又はそれらの少なくとも１つのパラメーターの改善等の本明細書に記載される何らかの治療効果を発揮するのに十分な量である。「治療有効」量は、個体の年齢、疾患の進行、及び全体的な全身状態に応じて、被験体ごとに異なることになる。あらゆる個々の場合における適切な「治療有効」量も、当業者によれば、本明細書で後述する方法及び／又は本明細書の実験部分の方法等の日常的な実験を使用して決定することができる。「必要とする被験体」は、テロメア長の短縮に関連する病態に罹患している、及び／又はそれを発症するリスクがあるあらゆる個体であり得る。
【0102】
更なる態様において、テロメア長の短縮に関連する病態を治療及び／又は予防する医薬を製造するための、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、又は組成物の使用が提供される。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は肺病態であり、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態である。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は心臓病態であり、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態である。
【0103】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する肺病態、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防する医薬を製造するための、本明細書に記載される肺特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物の使用が提供される。好ましくは、肺特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0104】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する心臓病態、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防する医薬を製造するための、本明細書に記載される心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物の使用が提供される。好ましくは、心臓特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、トロポニンプロモーター又はその誘導体、好ましくはトロポニンプロモーター又はその誘導体である。
【0105】
更なる態様において、テロメア長の短縮に関連する病態を治療及び／又は予防するための、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター、又は組成物の使用が提供される。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は肺病態であり、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態である。幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する病態は心臓病態であり、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態である。
【0106】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する肺病態、好ましくは肺線維症又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防するための、本明細書に記載される肺特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物の使用が提供される。好ましくは、肺特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＳｐＢプロモーター又はその誘導体である。
【0107】
幾つかの実施の形態において、テロメア長の短縮に関連する心臓病態、好ましくは心筋梗塞又はそれに関連する病態を治療及び／又は予防するための、本明細書に記載される心臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノム、上記ゲノムを含む発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、及び／又は上記ゲノム及び／又はベクターを含む組成物の使用が提供される。好ましくは、心臓特異的プロモーターは、本明細書に記載されるＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、トロポニンプロモーター又はその誘導体、好ましくはトロポニンプロモーター又はその誘導体である。
【0108】
本発明による使用される組換えウイルスゲノム、使用される発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、使用される組成物、方法、及び使用の文脈内で、療法及び／又は医薬は、肺におけるＴＥＲＴの発現、好ましくは特異的な発現を含み得る。本発明による使用される組換えウイルスゲノム、使用される発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）、使用される組成物、方法、及び使用の文脈内で、療法及び／又は医薬は、心臓におけるＴＥＲＴの発現、好ましくは特異的な発現を含み得る。発現の説明は「一般情報」と題するセクションに示されている。幾つかの実施の形態において、ＴＥＲＴの発現は、肝臓、ＣＮＳ、脳、脂肪組織（白色及び／又は褐色）、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、膵臓、精巣、精巣上体、腸等からなる群より選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種の器官における発現を含まない。
【0109】
好ましい実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は医薬の投与を繰り返す必要はない。幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は医薬の投与を、毎年、又は２年毎、３年毎、４年毎、５年毎、６年毎、７年毎、８年毎、９年毎、若しくは１０年毎（列挙された値のいずれか２つの間の間隔を含む）に繰り返すことができる。
【0110】
治療される被験体は、脊椎動物、好ましくはネコ、マウス、ラット、イヌ、又はヒト等の哺乳動物であり得る。好ましい実施の形態において、治療される被験体はヒトである。治療の適用を、テロメア長の短縮に関連する病態、好ましくは肺線維症、心筋梗塞、又はそれらに関連する病態に罹患している、及び／又はそれらを発症するリスクがある個体、個体の細胞、組織、及び／又は器官に対して実施することができる。治療の適用を、当該技術分野において既知の適切な手段を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで直接的に又は間接的に実施することができる。本発明の組換えウイルスゲノム及び／又は発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）及び／又は組成物を個体又は上記個体の細胞、組織、及び／又は器官に与える手段の改善は、これまで既に達成されてきた進歩を考慮すると、予想されるものである。当然のことながら、そのような今後の改善は、本発明の上述の効果を達成するのに実現され得る。疾患又は病態に応じて、上記個体の細胞、組織、及び／又は器官は、本明細書で先に記載した通りであり得る。本発明の組換えウイルスゲノム及び／又は発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター、及び／又は組成物を投与する場合、そのような遺伝子コンストラクト及び／又は発現ベクター及び／又は組成物を、送達方法に適合可能な溶液中に溶解することが好ましい。このような溶液は当該技術分野において一般に既知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy（上記参照）を参照のこと。
【0111】
治療の適用を、当該技術分野において一般に既知の様々な投与様式を使用して実施することができる。投与様式は、静脈内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、吸入を介した投与、実質内投与、皮下投与、関節内投与、脂肪組織内投与、経口投与、肝内投与、内臓内投与、耳内投与、胸郭内投与、肺内投与、心内投与、経心内膜投与、又は気管内投与であり得る。肺特異的発現に好ましい投与様式は、吸入を介した投与、鼻腔内投与、気管内投与、肺内投与、及び静脈内投与である。「気管内投与」又は「気管内注入」は、気管への直接投与を指す。「静脈内投与」は、典型的には注射による静脈内への直接投与を指す。心臓特異的投与に好ましい投与様式は、心内投与、経心内膜投与、又は静脈内投与である。「心内投与」は、心臓筋肉又は心室への直接投与を指す。「経心内膜投与」は、心内膜への直接投与を指す。
【0112】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は治療用の医薬の投与は、既知の治療、療法、使用、又は医薬の投与に対して、以下の利益の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は全てを示す：
標的組織におけるＴＥＲＴ発現の増加、
オフターゲット組織におけるＴＥＲＴ発現の減少、
低いカプシド形成能力を有するウイルスベクターの利用に付随する欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成の防止、
治療有効性の向上。
標的組織におけるＴＥＲＴ発現の増加、
オフターゲット組織におけるＴＥＲＴ発現の減少、
低いカプシド形成能力を有するウイルスベクターの利用に付随する欠損したウイルスゲノムを含む中間種の形成の防止、
治療有効性の向上。
【0113】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は治療用の医薬の投与は、テロメアの短縮を緩和し、除去し、予防し、及び／又は反転させる。
【0114】
「短縮されたテロメア」又は「短いテロメア」は一般に、或る特定の長さ、例えば８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ、又はそれより短い長さを下回るテロメアを指す。当業者によれば、テロメア長は個体が健康であるかどうかだけでなく、個体の年齢にも依存すると理解される。典型的には、短縮されたテロメアは、或る特定の年齢層に属する健康な個体の集団のテロメア長の２０パーセンタイル又は１０パーセンタイルより下の長さを有し、これはテロメアの２０％又は１０％がそれを下回るテロメア長を示す。反対に、長いテロメアは、典型的には、或る特定の年齢層に属する健康な個体の集団のテロメア長の８０パーセンタイル又は９０パーセンタイルより上の長さを有する。テロメア長を、当該技術分野において一般に既知の方法に従って、治療を受けた個体から直接採取された試料、又は治療を受けた個体の細胞、組織、及び／又は器官から採取された試料において評価することができる。例えば、Gonzalez-Suarez et al. (2001) EMBO J 20(11): 2619-30（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されているように、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｑ－ＦＩＳＨ）、又はハイスループット定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＨＴ Ｑ－ＦＩＳＨ）等の標準的なハイブリダイゼーション技術を使用することができる。代替的には、テロメア長を、特許文献２、Canela et al. (2007) Methods Mol Biol 371: 45-72、又はBaer et al. (2018) Nat Comm 5: 5863（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）の開示内容のいずれか１つに記載されるように測定することができる。また、テロメア長を、例えば本明細書の実施例のセクションに示される当該技術分野における標準的な手順を使用して本明細書の別の場所で論じられるテロメア長の短縮に関連する病態の症状及び／又はパラメーターの悪化又は改善を監視することによって推測することもできる。
【0115】
絶対的なテロメア長と、治療期間にわたるテロメアの延長又は短縮の速度とのどちらも決定することができるように、治療期間全体を通して試料を採取することができる。試料を治療期間中毎日採取しても、又はより長い間隔で採取してもよい。幾つかの実施の形態において、試料は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、又はより長い間隔で採取される。採取された試料中の短縮されたテロメアの割合を比較することによってテロメア長の比較を行うことができる。ＦＩＳＨ又はＱ－ＦＩＳＨ等のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術によって測定される試料の平均強度を下回る強度を示すテロメアの率を測定することによって、短縮されたテロメアの割合を評価することができる。幾つかの実施の形態において、短縮されたテロメアの割合は、試料の平均強度と比較して、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、又はそれより低い強度を示すテロメアの率である。幾つかの実施の形態において、治療を受けた個体から直接採取された試料、又は治療を受けた個体の細胞、組織、及び／又は器官から採取された試料中の短縮されたテロメアの割合は、コントロール試料と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又はそれより大きく減少する。コントロール試料は、治療開始前の治療を受ける個体、又は治療を受ける個体の細胞、組織、及び／又は器官から、及び／又は同じ病態に罹患している未治療の個体、又は同じ病態に罹患している未治療の個体の細胞、組織、及び／又は器官から採取され得る。
【0116】
幾つかの実施の形態において、肺線維症又はそれに関連する病態を治療する治療若しくは療法若しくは使用又は医薬の投与は、肺の瘢痕化、線維化容積の発生、肺容積の減損、息切れ、空咳、疲労、体重減少、及びばち状指、好ましくは線維化容積の発生及び／又は肺容積の減損からなる群より選択される症状を緩和し、除去し、及び／又は予防し、及び／又はそれらと関連するパラメーターを改善する。
【0117】
幾つかの実施の形態において、心筋梗塞又はそれに関連する病態を治療する治療若しくは療法若しくは使用又は医薬の投与は、心臓の瘢痕化、心不全、不整脈、疲労、心臓痛、心原性ショック、又は心停止、好ましくは心臓の瘢痕化からなる群より選択される症状を緩和し、除去し、及び／又は予防し、及び／又はそれらと関連するパラメーターを改善する。
【0118】
本明細書において論じられる病態の症状の緩和は、個体において、上記個体の細胞、組織、又は器官において、医師による評価で、上記症状が改善若しくは軽減されること、又は典型的な症状の進行が減速したことを意味し得る。典型的な症状の軽減又は改善は、症状の進行の減速又は症状の完全な消失を意味し得る。症状、したがって症状の軽減も様々な方法、大部分は臨床検査及び日常的な実験室試験を含む関連する病態の診断において使用されるのと同じ方法を使用して評価することができる。実験室試験としては、巨視的方法及び微視的方法の両方、分子的方法、Ｘ線等の放射線撮影法、ＣＴスキャン、肺活量測定、生化学的方法、免疫組織化学的方法等を挙げることができる。この文脈において、「軽減」（又は「改善」）は、実験部分において実施されるアッセイ等の当業者が既知のアッセイを使用して少なくとも検出可能な軽減（又は検出可能な改善）を意味する。軽減は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％の軽減であり得る。軽減は、本発明の組換えウイルスゲノム及び／又は発現ベクター（好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター）及び／又は組成物を使用した治療の少なくとも１週間後、１ヶ月後、６ヶ月後、１年後、又はそれ以降に見られる可能性がある。好ましくは、軽減は単回投与後に観察される。幾つかの実施の形態において、軽減は、好ましくは単回投与後に少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年の期間、又はそれより長い期間にわたって観察される。
【0119】
パラメーターの改善は、個体において、上記個体の細胞、組織、又は器官において、医師による評価で、関連疾患に関連する典型的なパラメーター（例えば、肺線維症の場合の肺容積）の値が改善されることを意味し得る。この文脈において、パラメーターの改善は、上記パラメーターが健康な個体によって示される値により近い値をとることを意味すると解釈され得る。パラメーターの改善は、本発明の組換えウイルスベクター及び／又は発現ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター及び／又は組成物を使用した治療の少なくとも１週間後、１ヶ月後、６ヶ月後、１年後、又はそれ以降に見られる可能性がある。好ましくは、改善は単回投与後に観察される。幾つかの実施の形態において、改善は、好ましくは単回投与後に少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年の期間、又はそれより長い期間にわたって観察される。
【0120】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は治療用の医薬の投与は、治療開始前の同じ個体又は同じ病態に罹患している未治療の個体と比較して、治療を受けた個体の全体的なフィジカルフィットネスの増加をもたらす。全体的なフィジカルフィットネスを、関連病態に関連する身体的属性を医師による評価で評価及び／又は測定することによって決定することができ、全体的なフィジカルフィットネスの増加は、少なくとも１つのそのような属性が改善されることを意味し得る。身体的属性の例としては、空咳、疲労等が挙げられる。
【0121】
幾つかの実施の形態において、本明細書に記載される治療若しくは療法若しくは使用又は治療用の医薬の投与は、同じ病態に罹患している未治療の個体と比較して、治療を受けた個体の寿命の増加をもたらす。上記寿命の延長は、治療される関連病態に依存し得て、好ましくは５％、１０％、１５％、２０％、又はそれより長い。
【0122】
一般情報
特段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって慣用的に通常理解され、かつ本開示を考慮して解釈されるのと同じ意味を有する。
特段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって慣用的に通常理解され、かつ本開示を考慮して解釈されるのと同じ意味を有する。
【0123】
肺及び心臓
本明細書において使用される「肺」及び「心臓」という用語は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、それぞれ呼吸器系及び心臓血管系の器官を指す。「上皮」細胞は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、上皮組織の細胞を指す。「肺胞上皮」は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、肺胞の上皮組織の細胞を指す。「心筋細胞」は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、心筋の細胞を指す。
本明細書において使用される「肺」及び「心臓」という用語は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、それぞれ呼吸器系及び心臓血管系の器官を指す。「上皮」細胞は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、上皮組織の細胞を指す。「肺胞上皮」は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、肺胞の上皮組織の細胞を指す。「心筋細胞」は、当業者によって慣用的に通常理解されるように、心筋の細胞を指す。
【0124】
配列同一性
本発明の文脈において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列等のヌクレオチド配列は、タンパク質断片又はポリペプチド又はペプチド又はペプチド誘導体をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列によって表される。本発明の文脈において、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴ断片、断片、又はポリペプチド若しくはペプチド若しくはペプチド誘導体は、アミノ酸配列によって表される。
本発明の文脈において、ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列等のヌクレオチド配列は、タンパク質断片又はポリペプチド又はペプチド又はペプチド誘導体をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列によって表される。本発明の文脈において、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＴ断片、断片、又はポリペプチド若しくはペプチド若しくはペプチド誘導体は、アミノ酸配列によって表される。
【0125】
所与の配列識別番号（配列番号）によって本明細書において特定される各核酸分子又はタンパク質断片又はポリペプチド又はペプチド又はペプチド誘導体又はコンストラクトは、開示されるこの特定の配列に限定されるものではないと理解されるべきである。本明細書において特定される各コーディング配列は、所与のタンパク質断片若しくはポリペプチド若しくはペプチド若しくはペプチド誘導体若しくはコンストラクトをコードするか、又はそれ自体がタンパク質断片若しくはポリペプチド若しくはコンストラクト若しくはペプチド若しくはペプチド誘導体である。
【0126】
本出願全体を通じて、所与のタンパク質断片又はポリペプチド又はペプチド又はペプチド誘導体をコードする特定のヌクレオチド配列の配列番号（配列番号Ｘを例として挙げる）について言及するたびに、これを以下によって置き換えることができる：
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉ．遺伝暗号の縮重により（ｉ）の核酸分子の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列、又は、
ｉｉｉ．配列番号Ｘのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％のアミノ酸同一性若しくはアミノ酸類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、
ｉｉ．遺伝暗号の縮重により（ｉ）の核酸分子の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列、又は、
ｉｉｉ．配列番号Ｘのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％のアミノ酸同一性若しくはアミノ酸類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【0127】
配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
【0128】
本出願全体を通じて、特定のアミノ酸配列の配列番号（配列番号Ｙを例として挙げる）について言及するたびに、これを以下によって置き換えることができる：アミノ酸配列の配列番号Ｙと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性又は配列類似性を有する配列を含むアミノ酸配列によって表されるポリペプチド。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性又は配列類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
【0129】
所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のそれぞれとの同一性パーセンテージ又は類似性パーセンテージに基づき本明細書に記載される各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、更なる好ましい実施の形態において、所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列のそれぞれと少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性又は類似性を有する。
【0130】
各非コーディングヌクレオチド配列（すなわち、プロモーター又は別の調節領域）を、特定のヌクレオチド配列の配列番号（配列番号Ａを例として挙げる）と少なくとも６０％の配列同一性又は配列類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えることができる。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号Ａと少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。好ましい実施の形態において、プロモーター等のこのような非コーディングヌクレオチド配列は、当業者が既知のプロモーターの活性等の非コーディングヌクレオチド配列の活性を少なくとも示すか、又はそれを発揮する。
【0131】
「相同性」、「配列同一性」等の用語は、本明細書において区別なく使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として説明される。好ましい実施の形態において、配列同一性は、２つの所与の配列番号の全長又はその部分に基づいて計算される。その部分とは、好ましくは両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を意味する。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、そのような配列の文字列間の一致によって決定される、アミノ酸配列又は核酸配列の間の配列関連性の程度を指す。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」を、限定されるものではないが、Bioinformatics and the Cell: Modern Computational Approaches in Genomics, Proteomics and transcriptomics, Xia X., Springer International Publishing, New York, 2018、及びBioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Mount D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2004（それぞれ引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載される方法を含む既知の方法によって容易に計算することができる。
【0132】
「配列同一性」及び「配列類似性」を、２つの配列の長さに応じて、グローバルアラインメントアルゴリズム又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列をアラインメントすることによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適にアラインメントさせるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ニードルマン－ヴンシュ）を使用してアラインメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、スミス－ウォーターマン）を使用してアラインメントされる。配列が配列同一性の或る特定の最小パーセンテージ（以下に記載される）を少なくとも共有する場合（例えば、デフォルトパラメーターを使用するＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅ又はＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒのプログラムによって最適にアラインメントされる場合）、配列を「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ぶことができる。
【0133】
グローバルアラインメントは、２つの配列が同様の長さを有する場合に配列同一性を決定するのに適切に使用される。配列が実質的に異なる全体的な長さを有する場合、スミス－ウォーターマンアルゴリズムを使用するもの等のローカルアラインメントが好ましい。ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅでは、ニードルマン－ヴンシュのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列がそれらの長さ全体（全長）にわたって、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化してアラインメントされる。ＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒでは、スミス－ウォーターマンのローカルアラインメントアルゴリズムが使用される。一般に、ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅ及びＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒのデフォルトパラメーターが使用され、ここで、ギャップオープンペナルティ＝１０（ヌクレオチド配列）／１０（タンパク質）及びギャップ延長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド配列）／０．５（タンパク質）である。ヌクレオチド配列については、使用されるデフォルトのスコア行列はＤＮＡｆｕｌｌであり、タンパク質については、デフォルトのスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））。
【0134】
代替的に、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のようなアルゴリズムを使用して、公開データベースに対して検索することによって、類似性又は同一性のパーセンテージを決定することができる。したがって、本発明の幾つかの実施の形態の核酸配列及びタンパク質配列を「クエリ配列」として更に使用し、公開データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を特定することができる。このような検索を、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）のＢＬＡＳＴｎプログラム又はＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行して、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を取得することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較目的のギャップありアラインメントを取得するには、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ワールドワイドウェブにおいてwww.ncbi.nlm.nih.gov/でアクセス可能なアメリカ国立生物工学情報センターのホームページを参照のこと。
【0135】
任意に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者であれば、いわゆる保存的アミノ酸置換も考慮に入れることができる。本明細書において使用される場合、「保存的」アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることを指す。保存的置換についてのアミノ酸残基のクラスの例を以下の表に示す（本明細書では表１として組み入れられている）。
【0136】
【0137】
【0138】
【0139】
例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示される配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに好ましい保存的置換は以下の通りである：Ａｌａ→Ｓｅｒ、Ａｒｇ→Ｌｙｓ、Ａｓｎ→Ｇｌｎ又はＨｉｓ、Ａｓｐ→Ｇｌｕ、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ又はＡｌａ、Ｇｌｎ→Ａｓｎ、Ｇｌｕ→Ａｓｐ、Ｇｌｙ→Ｐｒｏ、Ｈｉｓ→Ａｓｎ又はＧｌｎ、Ｉｌｅ→Ｌｅｕ又はＶａｌ、Ｌｅｕ→Ｉｌｅ又はＶａｌ、Ｌｙｓ→Ａｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ、Ｍｅｔ→Ｌｅｕ又はＩｌｅ、Ｐｈｅ→Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒ、Ｓｅｒ→Ｔｈｒ、Ｔｈｒ→Ｓｅｒ、Ｔｒｐ→Ｔｙｒ、Ｔｙｒ→Ｔｒｐ又はＰｈｅ、及びＶａｌ→Ｉｌｅ又はＬｅｕ。
【0140】
遺伝子又はコーディングヌクレオチド配列
「遺伝子」という用語は、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）へと転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、例えばポリアデニル化部位及び／又は転写終結部位を含むプロモーター、５’リーダー配列、コーディング領域、及び３’非翻訳領域（３’末端）等の作動可能に連結された幾つかの断片を含む。キメラ遺伝子又は組換え遺伝子（ＴＥＲＴ遺伝子等）は、例えばプロモーターが転写ＤＮＡ領域の一部又は全部と天然には関連付けられていない遺伝子等の天然には通常見られない遺伝子である。「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性なＲＮＡ、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドへと翻訳され得るＲＮＡに転写される過程を指す。
「遺伝子」という用語は、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）へと転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、例えばポリアデニル化部位及び／又は転写終結部位を含むプロモーター、５’リーダー配列、コーディング領域、及び３’非翻訳領域（３’末端）等の作動可能に連結された幾つかの断片を含む。キメラ遺伝子又は組換え遺伝子（ＴＥＲＴ遺伝子等）は、例えばプロモーターが転写ＤＮＡ領域の一部又は全部と天然には関連付けられていない遺伝子等の天然には通常見られない遺伝子である。「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性なＲＮＡ、すなわち生物学的に活性なタンパク質又はペプチドへと翻訳され得るＲＮＡに転写される過程を指す。
【0141】
本発明の文脈において、ＴＥＲＴ遺伝子は通常、細胞内で発現され得ないか、又は不十分なレベルで発現され得る。この文脈において、「不十分な」とは、上記ＴＥＲＴ遺伝子が細胞内で発現しているが、本明細書に記載される病態及び／又は疾患が依然として発症する可能性があることを意味する。この場合、本発明はＴＥＲＴの過剰発現を可能にする。コーディングヌクレオチド配列は、細胞の本来の配列、細胞内に天然に存在しない配列を含んでいてもよく、両方の組合せを含んでいてもよい。遺伝子は、細胞内でのＴＥＲＴをコードする配列の発現に適切な調節配列に作動可能に連結され得る、ＴＥＲＴをコードする配列及び／又は本明細書において先で特定された追加のタンパク質を含み得る。好ましくは、導入された遺伝子は宿主細胞のゲノム内に組み込まれない。
【0142】
プロモーター
本明細書において使用される場合、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ以上のコーディング配列の転写を制御する機能があり、かつコーディング配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについての結合部位、転写開始部位、及び限定されるものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー、及び活性化因子タンパク質の結合部位を含むあらゆる他のＤＮＡ配列、及び直接的に又は間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが当業者に既知のヌクレオチドのあらゆる他の配列の存在により構造的に特定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、殆どの生理学的条件及び発生条件下で殆どの組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサーの適用によって生理学的又は発生的に調節されるプロモーターである。本明細書において使用される場合、「調節因子」又は「転写調節因子」は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質である。このセクションの別の場所に記載されるように発現を評価することができる。「転写開始能力」又は「プロモーター強度」は、プロモーターが作動可能に連結されるコーディングヌクレオチド配列の転写を開始するプロモーターの能力の程度を指す。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、１つ以上のコーディング配列の転写を制御する機能があり、かつコーディング配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについての結合部位、転写開始部位、及び限定されるものではないが、転写因子結合部位、リプレッサー、及び活性化因子タンパク質の結合部位を含むあらゆる他のＤＮＡ配列、及び直接的に又は間接的に作用してプロモーターからの転写の量を調節することが当業者に既知のヌクレオチドのあらゆる他の配列の存在により構造的に特定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、殆どの生理学的条件及び発生条件下で殆どの組織において活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば化学的インデューサーの適用によって生理学的又は発生的に調節されるプロモーターである。本明細書において使用される場合、「調節因子」又は「転写調節因子」は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質である。このセクションの別の場所に記載されるように発現を評価することができる。「転写開始能力」又は「プロモーター強度」は、プロモーターが作動可能に連結されるコーディングヌクレオチド配列の転写を開始するプロモーターの能力の程度を指す。
【0143】
作動可能な連結
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、転写調節配列は、これがコーディング配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能な連結とは、連結されるＤＮＡ配列が典型的には連続しており、２つのタンパク質コーディング領域をつなぐ必要がある場合には連続しており、読み枠内にあることを意味する。連結を、使いやすい制限部位でのライゲーション、又はその代わりに挿入されたアダプター若しくはリンカーでのライゲーション、又は遺伝子合成によって実現することができる。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれている場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、転写調節配列は、これがコーディング配列の転写に影響を与える場合に、コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能な連結とは、連結されるＤＮＡ配列が典型的には連続しており、２つのタンパク質コーディング領域をつなぐ必要がある場合には連続しており、読み枠内にあることを意味する。連結を、使いやすい制限部位でのライゲーション、又はその代わりに挿入されたアダプター若しくはリンカーでのライゲーション、又は遺伝子合成によって実現することができる。
【0144】
タンパク質及びアミノ酸
「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「アミノ酸配列」という用語は区別なく使用され、特定の作用様式、サイズ、三次元構造、又は起源とは無関係に、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。本明細書に記載されるアミノ酸配列において、アミノ酸又は「残基」は３文字記号により表される。これらの３文字記号だけでなく対応する１文字記号も当業者は既知であり、以下の意味を有する：Ａ（Ａｌａ）はアラニンであり、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステインであり、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸であり、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸であり、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニンであり、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシンであり、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジンであり、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシンであり、Ｋ（Ｌｙｓ）はリジンであり、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシンであり、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニンであり、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギンであり、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリンであり、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミンであり、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニンであり、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリンであり、Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニンであり、Ｖ（Ｖａｌ）はバリンであり、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファンであり、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンである。残基は、あらゆるタンパク質形成性アミノ酸であってよいだけでなく、Ｄ－アミノ酸及び翻訳後修飾によって形成される修飾アミノ酸等の非タンパク質形成性アミノ酸、またあらゆる非天然アミノ酸であってもよい。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「アミノ酸配列」という用語は区別なく使用され、特定の作用様式、サイズ、三次元構造、又は起源とは無関係に、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。本明細書に記載されるアミノ酸配列において、アミノ酸又は「残基」は３文字記号により表される。これらの３文字記号だけでなく対応する１文字記号も当業者は既知であり、以下の意味を有する：Ａ（Ａｌａ）はアラニンであり、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステインであり、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸であり、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸であり、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニンであり、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシンであり、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジンであり、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシンであり、Ｋ（Ｌｙｓ）はリジンであり、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシンであり、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニンであり、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギンであり、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリンであり、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミンであり、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニンであり、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリンであり、Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニンであり、Ｖ（Ｖａｌ）はバリンであり、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファンであり、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンである。残基は、あらゆるタンパク質形成性アミノ酸であってよいだけでなく、Ｄ－アミノ酸及び翻訳後修飾によって形成される修飾アミノ酸等の非タンパク質形成性アミノ酸、またあらゆる非天然アミノ酸であってもよい。
【0145】
発現ベクター
「発現ベクター」又は「ベクター」又は「送達ベクター」という語句は一般に、例えば、遺伝子又はコーディング配列の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を、そのような配列と適合可能な宿主に導入することによって、細胞内で遺伝子発現を得るのに使用される分子生物学におけるツールを指す。発現ベクターは、細胞内で安定化してエピソーム性のままであることができるゲノムを運搬することができる。本発明の文脈内で、細胞は、ベクターを作製するのに使用される細胞、又はベクターが投入される細胞を包含することを意味し得る。代替的に、ベクターは、例えば相同組換え又はその他の方法を通じて細胞のゲノムに組み込むことが可能である。
「発現ベクター」又は「ベクター」又は「送達ベクター」という語句は一般に、例えば、遺伝子又はコーディング配列の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を、そのような配列と適合可能な宿主に導入することによって、細胞内で遺伝子発現を得るのに使用される分子生物学におけるツールを指す。発現ベクターは、細胞内で安定化してエピソーム性のままであることができるゲノムを運搬することができる。本発明の文脈内で、細胞は、ベクターを作製するのに使用される細胞、又はベクターが投入される細胞を包含することを意味し得る。代替的に、ベクターは、例えば相同組換え又はその他の方法を通じて細胞のゲノムに組み込むことが可能である。
【0146】
ウイルスベクター
ウイルスベクター又はウイルス発現ベクター、ウイルス遺伝子療法ベクターは一般に、例えば、遺伝子又はコーディング配列の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を、そのような配列と適合可能な宿主に導入することによって、細胞内で遺伝子発現を得るのに分子生物学において使用されるウイルス由来ベクターを指す。
ウイルスベクター又はウイルス発現ベクター、ウイルス遺伝子療法ベクターは一般に、例えば、遺伝子又はコーディング配列の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を、そのような配列と適合可能な宿主に導入することによって、細胞内で遺伝子発現を得るのに分子生物学において使用されるウイルス由来ベクターを指す。
【0147】
ウイルスベクター又はウイルス遺伝子療法ベクターは、遺伝子療法に適したベクターである。遺伝子療法に適したベクターは、Anderson 1998, Nature 392: 25-30、Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71、Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40、Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604、Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6、Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53、Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16、Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403、Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7、Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64、Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3、特許文献２、特許文献１、Baer et al, 2018, Nat. Comm. 5: 5863、van Lieshout et al, 2018, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9、及びこれらに引用される参考文献（いずれも引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されている。
【0148】
特に適切な遺伝子療法ベクターとしては、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。これらのベクターは、滑膜細胞及び肝臓細胞を含む多岐にわたる種類の分裂細胞及び非分裂細胞に感染する。細胞侵入後のアデノウイルスベクター及びＡＡＶベクターのエピソーム性により、これらのベクターは、前述の通り治療用途に適している（Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604、Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43、特許文献２、特許文献１、Baer et al, 2018, Nat. Comm. 5: 5863、van Lieshout et al, 2018, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の非常に安定した長期発現（イヌでは９年まで（Niemeyer et al, Blood. 2009 Jan 22;113(4):797-806）及びヒトでは約１０年（Buchlis, G. et al., Blood. 2012 Mar 29;119(13):3038-41））をもたらすことが知られているため、更により好ましい。好ましいアデノウイルスベクターは、Russell（2000、上記参照）により概説される通りに、宿主応答を低減するように改変される。ＡＡＶベクターを使用して遺伝子療法を行う方法は、Wang et al., 2005, J Gene Med. March 9 (Epub ahead of print)、Mandel et al., 2004, Curr Opin Mol Ther. 6(5):482-90、及びMartin et al., 2004, Eye 18(11):1049-55、Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec 22;365(25):2357-65、Apparailly et al, Hum Gene Ther. 2005 Apr;16(4):426-34、特許文献２、特許文献１、Baer et al, 2018, Nat. Comm. 5: 5863、van Lieshout et al, 2018, Mol. Ther. Meth. Clin. Dev. 9（いずれも引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）によって記載されている。
【0149】
別の適切な遺伝子療法ベクターとしては、レトロウイルスベクターが挙げられる。本発明における適用に好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに基づく発現コンストラクトである。レンチウイルスベクターは、感染して分裂細胞及び非分裂細胞のゲノムに安定に組み込む能力を有する（Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））。レンチウイルスに基づく発現コンストラクトの構築方法及び使用方法は、米国特許第６，１６５，７８２号、米国特許第６，２０７，４５５号、米国特許第６，２１８，１８１号、米国特許第６，２７７，６３３号、及び米国特許第６，３２３，０３１号、並びにFederico（1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53）及びVigna et al.（2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16）（いずれも引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されている。他の適切な遺伝子療法ベクターとしては、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、又はワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【0150】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）
本明細書において同義語として使用される「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、及び「ＡＡＶ粒子」という用語は、ＡＡＶの少なくとも１つのカプシドタンパク質（好ましくは特定のＡＡＶ血清型の全てのカプシドタンパク質から構成される）と、カプセル化されたＡＡＶゲノムのポリヌクレオチドとから構成されるウイルス粒子を指す。その粒子が、ＡＡＶ逆方向末端反復配列によって両側が挟まれた異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される遺伝子又は組換えウイルスゲノム等の野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド）を含む場合、これらは典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は「ＡＡＶウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」として知られている。ＡＡＶは、パルボウイルス科のディペンドパルボウイルス属（ディペンドウイルスとも呼ばれる）に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７ｋｂの長さを有し、陽性又は陰性で検出され得る一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。本発明はまた、ｄｓＡＡＶ又はｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用を包含する。ゲノムには、ＤＮＡ鎖の両末端の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐとが含まれている。ｒｅｐのフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要なタンパク質Ｒｅｐをコードする４つの重複遺伝子でできている。ｃａｐのフレームは、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３と重複するヌクレオチド配列を含み、これらは相互作用して正二十面体対称のカプシドを形成する（Carter and Samulski., 2000及びGao et al, 2004（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照）。
本明細書において同義語として使用される「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、及び「ＡＡＶ粒子」という用語は、ＡＡＶの少なくとも１つのカプシドタンパク質（好ましくは特定のＡＡＶ血清型の全てのカプシドタンパク質から構成される）と、カプセル化されたＡＡＶゲノムのポリヌクレオチドとから構成されるウイルス粒子を指す。その粒子が、ＡＡＶ逆方向末端反復配列によって両側が挟まれた異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される遺伝子又は組換えウイルスゲノム等の野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド）を含む場合、これらは典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は「ＡＡＶウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」として知られている。ＡＡＶは、パルボウイルス科のディペンドパルボウイルス属（ディペンドウイルスとも呼ばれる）に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７ｋｂの長さを有し、陽性又は陰性で検出され得る一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。本発明はまた、ｄｓＡＡＶ又はｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用を包含する。ゲノムには、ＤＮＡ鎖の両末端の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐとが含まれている。ｒｅｐのフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要なタンパク質Ｒｅｐをコードする４つの重複遺伝子でできている。ｃａｐのフレームは、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３と重複するヌクレオチド配列を含み、これらは相互作用して正二十面体対称のカプシドを形成する（Carter and Samulski., 2000及びGao et al, 2004（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照）。
【0151】
好ましいウイルスベクター又は好ましい遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターである。本明細書において使用されるＡＡＶベクターは、好ましくは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）を含む。本明細書において使用される「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において説明されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェル内でカプシド形成されたＡＡＶゲノムの部分を含む組換えベクターを指す。ＡＡＶゲノムの部分は、本明細書の別の場所に記載されるように、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５等のようなアデノ随伴ウイルス血清型に由来する逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含み得る。
【0152】
カプシドタンパク質から構成されるタンパク質シェルは、あらゆるＡＡＶ血清型に由来し得る。タンパク質シェルは、カプシドタンパク質シェルと呼ばれる場合もある。ｒＡＡＶベクターは、１つの又は好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失していてもよいが、なおも機能的なＩＴＲ核酸配列を含んでいてもよい。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、及びパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であっても、又は野生型配列と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有してもよく、又は機能性が維持される限り、例えばヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失、又は置換によって改変されていてもよい。この文脈において、機能性とは、ゲノムをカプシドシェルに直接パッケージングした後に、感染対象の宿主細胞又は標的細胞内での発現を可能にする能力を指す。本発明の文脈において、カプシドタンパク質シェルは、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲとは異なる血清型であってもよい。
【0153】
選ばれた核酸配列によって表される核酸分子は、好ましくは、上記で特定されたｒＡＡＶゲノム又はＩＴＲ配列の間に挿入され、例えば、発現コンストラクトは、コーディング配列に作動可能に連結された発現調節エレメントと、３’終結配列とを含む。上記核酸分子は、導入遺伝子と呼ばれる場合もある。
【0154】
「ＡＡＶヘルパー機能」とは、一般に、トランスでｒＡＡＶベクターに提供されるｒＡＡＶの複製及びパッケージングに必要とされる対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＡＡＶベクターにおいて欠けているＡＡＶ機能を補完するが、これらはＡＡＶのＩＴＲ（これらはｒＡＡＶベクターゲノムによって提供される）を欠いている。ＡＡＶヘルパー機能には、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコーディング領域及びｃａｐコーディング領域、又はそれらの機能的に実質的に同一の配列が含まれる。Ｒｅｐ領域及びＣａｐ領域は、当該技術分野において既知であり、例えばChiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319)又は米国特許第５，１３９，９４１号（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を参照のこと。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパーコンストラクトにおいて提供され得る。宿主細胞へのヘルパーコンストラクトの導入は、例えば、本明細書において特定されるｒＡＡＶベクター中に存在するｒＡＡＶゲノムの導入の前又は導入と同時に、形質転換、トランスフェクション、又は形質導入によって行うことができる。したがって、本発明のＡＡＶヘルパーコンストラクトは、一方ではｒＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェルについて、他方では上記ｒＡＡＶベクターの複製及びパッケージングにおいて存在するｒＡＡＶゲノムについて、これらが血清型の所望の組合せをもたらすように選択され得る。
【0155】
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製及びパッケージングに必要とされる追加の機能を提供する。適切なＡＡＶヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型及びＨＳＶ２型等）、及びワクシニアウイルスが挙げられる。ヘルパーウイルスによって提供される追加の機能を、米国特許第６，５３１，４５６号（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるように、プラスミドを介して宿主細胞に導入することもできる。
【0156】
「形質導入」とは、ウイルスベクターによるレシピエント宿主細胞への核酸分子の送達を指す。例えば、本発明によるＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入により、そのベクターに含まれる組換えウイルスゲノムの形質導入された細胞への導入がもたらされる。
【0157】
発現
発現を、当業者が既知のあらゆる方法によって評価することができる。例えば、形質導入された組織における遺伝子発現のレベルをｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルでｑＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、タンパク質由来ペプチドの質量分析、又はＥＬＩＳＡ等の当業者が既知の標準的なアッセイによって測定することによって、発現を評価することができる。
発現を、当業者が既知のあらゆる方法によって評価することができる。例えば、形質導入された組織における遺伝子発現のレベルをｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルでｑＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、タンパク質由来ペプチドの質量分析、又はＥＬＩＳＡ等の当業者が既知の標準的なアッセイによって測定することによって、発現を評価することができる。
【0158】
発現を、本明細書に記載される組換えウイルスゲノム、発現ベクター、又は組成物の投与後にいつでも評価することができる。本明細書の幾つかの実施の形態において、発現を、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１４週間後、１６週間後、１８週間後、２０週間後、２２週間後、２４週間後、２８週間後、３２週間後、３６週間後、４０週間後、又はそれ以降に評価することができる。
【0159】
コドン最適化
本明細書において使用される「コドン最適化」とは、既存のコーディング配列を改変し、又はコーディング配列を設計して、例えば、コーディング配列から転写された転写産物のＲＮＡ分子の発現宿主細胞若しくは生物における翻訳を改善するのに又はコーディング配列の転写を改善するのに使用される過程を指す。コドン最適化としては、限定されるものではないが、発現宿主生物のコドン選択に適合するようにコーディング配列についてのコドンを選択することを含む過程が挙げられる。例えば、哺乳動物、好ましくはネズミ科動物、イヌ、又はヒトの発現宿主のコドン選択に適合させる。コドン最適化により、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳に悪影響を与える可能性がある要素（例えば、終結配列、ＴＡＴＡボックス、スプライス部位、リボソーム侵入部位、反復配列及び／又はＧＣリッチ配列、及びＲＮＡの二次構造又は不安定性モチーフ）も排除される。幾つかの実施の形態において、コドン最適化された配列は、元の非コドン最適化配列と比較して、遺伝子発現、転写、ＲＮＡの安定性、及び／又は翻訳において少なくとも３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれより大きな増加を示す。
本明細書において使用される「コドン最適化」とは、既存のコーディング配列を改変し、又はコーディング配列を設計して、例えば、コーディング配列から転写された転写産物のＲＮＡ分子の発現宿主細胞若しくは生物における翻訳を改善するのに又はコーディング配列の転写を改善するのに使用される過程を指す。コドン最適化としては、限定されるものではないが、発現宿主生物のコドン選択に適合するようにコーディング配列についてのコドンを選択することを含む過程が挙げられる。例えば、哺乳動物、好ましくはネズミ科動物、イヌ、又はヒトの発現宿主のコドン選択に適合させる。コドン最適化により、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳に悪影響を与える可能性がある要素（例えば、終結配列、ＴＡＴＡボックス、スプライス部位、リボソーム侵入部位、反復配列及び／又はＧＣリッチ配列、及びＲＮＡの二次構造又は不安定性モチーフ）も排除される。幾つかの実施の形態において、コドン最適化された配列は、元の非コドン最適化配列と比較して、遺伝子発現、転写、ＲＮＡの安定性、及び／又は翻訳において少なくとも３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれより大きな増加を示す。
【0160】
一般用語
本書及びその特許請求の範囲において、「含む（to comprise）」という動詞及びその活用形は、その単語の前にある（following）ものが含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、具体的に挙げられていないものは除外されない。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載される組成物が具体的に特定されたもの以外の追加の成分（複数の場合もある）を含んでいてもよく、上記追加の成分（複数の場合もある）が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載される方法又は使用が具体的に特定されたもの以外の追加の工程（複数の場合もある）を含んでいてもよく、上記追加の工程（複数の場合もある）が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が具体的に特定されたもの以外の追加のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいてもよく、上記追加のヌクレオチド又はアミノ酸が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。
本書及びその特許請求の範囲において、「含む（to comprise）」という動詞及びその活用形は、その単語の前にある（following）ものが含まれることを意味する非限定的な意味で使用されるが、具体的に挙げられていないものは除外されない。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載される組成物が具体的に特定されたもの以外の追加の成分（複数の場合もある）を含んでいてもよく、上記追加の成分（複数の場合もある）が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載される方法又は使用が具体的に特定されたもの以外の追加の工程（複数の場合もある）を含んでいてもよく、上記追加の工程（複数の場合もある）が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。さらに、「のみからなる（to consist）」という動詞は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が具体的に特定されたもの以外の追加のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいてもよく、上記追加のヌクレオチド又はアミノ酸が本発明の特有の特性を変更しないことを意味する「本質的に・・・のみからなる（to consist essentially of）」によって置き換えることができる。
【0161】
不定冠詞（"a" or "an"）による要素への指示は、文脈上、唯一の要素しか存在しないことが明確に要求されない限り、１つより多くの要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞（"a" or "an"）は通常、「少なくとも１」を意味する。
【0162】
本明細書において使用される場合、「少なくとも」を伴うと、特定の値はその特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２」は「２以上」、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５…等と同じであると理解される。
【0163】
さらに、詳細な説明及び特許請求の範囲における第１、第２、第３等の用語は、同様の要素間を区別するのに使用されるものであって、必ずしも順番又は時系列順序を説明するのに使用されるわけではない。このように使用される用語は、適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施の形態は、本明細書に記載又は例示された以外の順序で動作可能であることを理解されたい。
【0164】
「約」又は「およそ」という語は、数値（例えば、約１０）と関連して使用される場合、好ましくは、その値が指定された値（１０）の１％多い値又は少ない値であってもよいことを意味する。
【0165】
本明細書において使用される場合、「及び／又は」という用語は、指定された場合の１つ以上が、単独で、又は指定された場合の少なくとも１つ、ないし指定された場合の全てと組み合わせて起こり得ることを示す。
【0166】
様々な実施の形態が本明細書に記載されている。本明細書において特定される各実施の形態は、特段の指示がない限り、互いに組み合わせることができる。
【0167】
本明細書において引用される全ての特許出願、特許、及び印刷出版物は、あらゆる定義、主題のディスクレーマー又は放棄を除き、また、盛り込まれた資料が本明細書の明示的な開示と矛盾する範囲（この場合、本開示の言葉が優先される）を除き、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【0168】
当業者であれば、本明細書に記載されるものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識し、これらを本発明の実施において使用し得るであろう。実際、本発明は、決して記載された方法及び材料に限定されるものではない。
【0169】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0170】
【図1】ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクターとＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターとの間の肺特異的発現の比較を示す図である。マウスを、短縮型ＳｐＢプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与した。ＧＦＰ発現レベルを、肺（図１Ａ）、肝臓、及び精巣上体周囲白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）（図１Ｂ）においてＡＡＶ投与の４週間後に定量的ＰＣＲによって評価した。結果は平均相対発現（ＡＵ）＋ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰに対する）。
【図2】ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスの組織におけるＧＦＰ陽性細胞の定量化を示す図である。マウスを、短縮型ＳｐＢプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与した。生理食塩液をコントロールとして使用した。ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ、又は生理食塩水で処置されたマウスの肺、肝臓、心臓、及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを定量化した。結果をＡＡＶ投与の４週間後に定量的ＰＣＲによって評価した。結果は平均パーセンテージ＋ＳＥＭとして表される。ｎ＝３～４。＊＊＊ｐ＜０．０５、ｎｓは非有意である。バーをつなぐ直線は比較を示す。
【図3】ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスの組織におけるＧＦＰ陽性細胞の可視化を示す図である。マウスを、短縮型ＳｐＢプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与した。結果をＡＡＶ投与の４週間後に評価した。生理食塩液をコントロールとして使用した。肺、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、心臓、及び肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を、ＧＦＰに対するウサギモノクローナル抗体を使用した免疫組織化学染色によって検出し、光学顕微鏡法によって視覚化した。
【図4】ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクターとＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターとの間の心臓特異的発現の比較を示す図である。マウスを、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶエンハンサー－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）の２通りの異なる用量（マウス当たり５×１０１１個又はマウス当たり２×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ））で、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与して処置した。ＧＦＰ発現レベルを、心臓（図４Ａ）、肝臓、及び精巣上体周囲白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）（図４Ｂ）においてＡＡＶ投与の３週間後に定量的ＰＣＲによって評価した。結果は平均相対発現（ＡＵ）＋ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（マウス当たり２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶエンハンサー－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰに対する）。
【図5】ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスの組織におけるＧＦＰ陽性細胞の可視化及び定量化を示す図である。マウスを、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）の２通りの異なる用量（マウス当たり５×１０１１個（低（Ｌ）用量）又はマウス当たり２×１０１２個（高（Ｈ）用量）のウイルスゲノム（ｖｇ））で、尾静脈を介して静脈内投与して処置した。結果をＡＡＶ投与の３週間後に評価した。注射していないマウスをコントロールとして使用した。心臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、精巣上体、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、脾臓、精巣、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるＧＦＰ陽性細胞を、ＧＦＰに対するウサギモノクローナル抗体を使用した免疫組織化学染色によって検出し、光学顕微鏡法によって視覚化した。図５Ａにおいて、心臓におけるＧＦＰ陽性細胞を可視化している。図５Ｂにおいて、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、精巣上体、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、脾臓、精巣、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを定量化している。結果は平均パーセンテージ＋ＳＥＭとして表される。ｎ＝２～６。＊＊＊ｐ＜０．０５、ｎｓは非有意である。バーをつなぐ直線は比較を示す。
【図6】ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクターとＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターとの間の心臓特異的発現の比較を示す図である。７週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスを、短縮型ＴＮＴプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与した。ＧＦＰ発現レベルを、心臓、肝臓、及び精巣上体周囲白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）においてＡＡＶ投与の４週間後に定量的ＰＣＲによって評価した。結果は平均相対発現（ＡＵ）＋ＳＥＭとして表される。＊＊ｐ＜０．０１（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰに対する）。
【図7】ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスの組織におけるＧＦＰ陽性細胞の可視化を示す図である。７週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスを、短縮型ＴＮＴプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）投与した。注射していないマウスをコントロールとして使用した。結果をＡＡＶ投与の４週間後に評価した。褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、心臓、及び肝臓におけるＧＦＰ陽性細胞を、ＧＦＰに対するウサギモノクローナル抗体を使用した免疫組織化学染色によって検出し、光学顕微鏡法によって視覚化した。
【図8】沈降速度分析的超遠心分離によるＡＡＶベクターの特性評価を示す図である。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（図８Ａ、５２９１ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮ（図８Ｂ、５２９１ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ（図８Ｃ、４６３８ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴ（図８Ｄ、４６７６ヌクレオチド）、ＡＡ９－ＴＮＴ－ｍｏＴＥＲＴ（図８Ｅ、４５３６ヌクレオチド）。沈降速度遠心分離を２００００ｒｐｍで実施した。粒子の沈降を、同じ実行時に２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。Ｃ（Ｓ）分布内の各ピークの相対パーセンテージを、分布内の全ての種のモル濃度の合計に対する各種のモル濃度に基づいて計算した。空のベクター、中間種、及び全長ゲノムを含むベクターに対応するピークを矢印で示している。
【図9】アルカリアガロースゲル電気泳動によるＡＡＶベクターの特性評価を示す図である。精製したベクターＤＮＡを変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。バンドのサイズ及び質（スメアの存在）を検査して、ゲノムの完全性を評価した。ＭＷはＤＮＡラダーを示す。Ｉ．Ｓ．は中間種の存在を示す。（図９Ａ）ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ（ウェル「１」、４６３８ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ウェル「２」、５２９１ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮ（ウェル「３」、５２９１ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴ（ウェル「４」、４６７６ヌクレオチド）。（図９Ｂ）ＡＡ９－ＴＮＴ－ｍｏＴＥＲＴ（ウェル「５」、４５３６ヌクレオチド）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ウェル「２」、５２９１ヌクレオチド）。
【図10】肺線維症マウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴの治療有用性の評価を示す図である。ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。ブレオマイシン傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクター又はＡＡＶ９－ｎｕｌｌベクター（ネガティブコントロール）のいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。ウイルス処置の１週間後、３週間後、及び５週間後に、罹患した肺の容積の減少を測定するのにＣＴスキャンを実施したところ、処置開始時と比べて異常なＣＴパターンが示された。（図１０Ａ）ＣＴスキャンによって測定された異常な線維症パターンの減少（％）の時系列。（図１０Ｂ）処置１週間後のＣＴ異常パターンの退縮速度。結果は初期線維症パターンの平均パーセンテージ＋ＳＥＭとして表される。ｎ＝４。
【図11】マウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴによる肺線維症治療の治療有効性の評価を示す図である。ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ～０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。疾患の進行を毎週のＣＴスキャンによって追跡した。毎週のＣＴスキャンを実施して、処置開始時に対する線維化した肺の容積の減少を測定した。（図１１Ａ）ＣＴスキャンによって測定された異常な線維化容積の減少（％）の時系列。（図１１Ｂ）処置の最初の６週間の間に計算された罹患した容積の減少速度。
【図12】ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置された肺線維症を伴うマウスの肺試料におけるＴＥＲＴの発現レベル及び活性を示す図である。ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ～０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肺試料においてＴＥＲＴの発現レベル及び活性を測定した。（図１２Ａ）ＴＥＲＴの活性（ＨＥＫ２９３Ｔに対する）を肺試料において測定した。（図１２Ｂ）ＴＥＲＴの発現レベル（アクチンに対する）。結果は平均パーセンテージ＋ＳＥＭとして表される。ｎ＝８～１０。
【図13】ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置されたマウスの肺試料におけるテロメア長の分析を示す図である。Ａ及びＢ．ＡＴＩＩ細胞のＳＰＣ陽性細胞（Ａ）及びＳＰＣ陰性細胞（Ｂ）における平均核強度。Ｃ及びＤ．ＡＴＩＩ細胞のＳＰＣ陽性細胞（Ｃ）及びＳＰＣ陰性細胞（Ｄ）における平均テロメア強度。Ｅ及びＦ．ＡＴＩＩ細胞のＳＰＣ陽性細胞（Ｅ）及びＳＰＣ陰性細胞（Ｆ）におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下の短いテロメアのパーセンテージ。Ｇ及びＨ．ＡＴＩＩ細胞のＳＰＣ陽性細胞（Ｅ）及びＳＰＣ陰性細胞（Ｆ）におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下の短いテロメアのパーセンテージ。Ｇ～Ｈ．ＡＴＩＩ細胞のＳＰＣ陽性細胞（Ｇ）及びＳＰＣ陰性細胞（Ｈ）におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上の長いテロメアのパーセンテージ。Ｉ．肺試料におけるＳＰＣ免疫蛍光及びテロメアＦｉｓｈ法の代表的な画像。
【図14】肺試料、肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるＴｅｒｔの発現レベル及びテロメラーゼ活性（ＴＲＡＰ）の定量化を示す図である。 ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ～０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肺試料、肝臓試料、心臓試料、及び脳試料においてＴＥＲＴの発現レベル及び活性を測定した。
【図15】ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴのＰＦ退縮における治療有効性の評価を示す図である。実験構成。 短いテロメアによって誘発された肺線維症のマウスモデルを使用する。このモデルは、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにおける低用量、つまり正常な長さのテロメアを有する野生型マウスにおいては線維症を誘発しない用量のブレオマイシン（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）の気管内注入に基づいている。ブレオマイシン（ブレオ）傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算する。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、真正の肺線維症パターンを診断する。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。疾患の進行をＣＴスキャンによって追跡した。感染１週間後、感染２週間後、感染４週間後、感染６週間後にＣＴスキャンを実施して、処置開始時に対する線維化した肺の容積の減少を測定した。感染８週間後にマウスを屠殺する。
【図16】様々なＰＦスコアを有する肺線維化病理の代表的な画像を示す図である。 線維症スコアの組織病理学的な代表画像。グレード１及びグレード２における肺胞間中隔の線維性肥厚をマッソン・トリクローム（Masson's Trichrome）（矢印を参照）及びピクロシリウスレッド（Picro Sirius Red）（矢印を参照）で示した。グレード３においては、肺胞間中隔の肥厚を伴う孤立した線維化領域（矢印を参照）。
【図17】エンドポイント（ＡＡＶ９処置の８週間後）での肺の組織病理学的分析及びＣＴ分子イメージングとの相関を示す図である。 ＡＡＶ９処置の８週間後のＰＦスコア（Ａ）及びＣＴ値（Ｂ）の定量化。ＰＦスコアとＣＴ値との間で相関分析を行った（Ｃ）。 肺線維症（ＰＦ）組織学的スコア：シリウスレッド（Sirius red）で染色された１０視野（２００倍）の分析に基づく肺線維症の半定量的スコア付け（Lawson et al, 2005, 2011、Degryse AL et al 2012） グレード０：正常な肺構造、 グレード１：肺胞間中隔の一部（５０％以下）の厚さの増加、 グレード２：線維化病変の形成を伴わない肺胞間中隔の５０％超の肥厚化、 グレード３：孤立した線維化病変の形成を伴う肺胞間中隔の肥厚化、 グレード４：実質構造の全体的又は準全体的な歪みを伴う多数の線維化病変。
【図18】肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるテロメラーゼ発現（ｑＰＣＲ）を示す図である。 ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肝臓（Ａ）試料、心臓（Ｂ）試料、及び脳（Ｃ）試料においてＴＥＲＴの発現レベルを測定した。
【図19】肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるテロメラーゼ活性（ＴＲＡＰ）を示す図である。 ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肝臓（Ａ）試料、心臓（Ｂ）試料、及び脳（Ｃ）試料においてテロメラーゼ活性を測定した。
【図20】Ｉｍｍｕｎｏ ｑＦＩＳＨ ＣＣ１０及びＴｅｌプローブ及びＤＡＰＩの代表的な画像を示す図である。 ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置されたマウスの肺試料におけるＣＣ１０免疫蛍光及びテロメアＦｉｓｈ法の代表的な画像。
【図21】Ｉｍｍｕｎｏ－ｑＦＩＳＨ ＣＣ１０－Ｔｅｌの定量化（クララ細胞特異的）を示す図である。 ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置されたマウスの肺試料中のクララ細胞におけるテロメア長の分析。ＣＣ１０陽性クララ細胞における平均核強度（Ａ）、ＣＣ１０陽性クララ細胞における平均テロメア強度（Ｂ）、ＣＣ１０陽性クララ細胞におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下の短いテロメアのパーセンテージ（Ｃ）、及びＣＣ１０陽性クララ細胞におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上の長いテロメアのパーセンテージ（Ｄ）。
【図22】ＳＭＡ及びＦ４／８０の定量化を示す図である。 肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肺試料において平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性領域（上のパネル）及びマクロファージＦ４／８０陽性細胞（下のパネル）を分析した。ＳＭＡ染色及びＦ４／８０染色の代表的なＩＨＱ画像を右に示す。
【図23】肺試料におけるγＨ２ＡＸ陽性細胞、ｐ５３陽性細胞、及びｐ２１陽性細胞の定量化を示す図である。 肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。処置８週間後にマウスを屠殺し、肺試料においてγＨ２ＡＸ（上のパネル）陽性細胞、ｐ５３（真ん中のパネル）陽性細胞、及びｐ２１（下のパネル）陽性細胞を分析した。γＨ２ＡＸ染色、ｐ５３染色、及びｐ２１染色の代表的なＩＨＱ画像を右に示す。
【図24】実験構成を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後及び感染９週間後にマウスを屠殺する。右上葉、右中葉、右下葉、大静脈後葉（post-caval lobe）、及び左葉の５つの肺葉においてＧＦＰ発現を評価する。肝臓、心臓、及び脳においてもＧＦＰ発現を評価して、オフターゲット組織に対処する。
【図25】ウイルスベクターによる感染の３週間後での肺葉におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後にマウスを屠殺する。右上葉、右中葉、右下葉、大静脈後葉、及び左葉の５つの肺葉においてＧＦＰ発現をｑＰＣＲによって評価する。
【図26】ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肺試料におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後及び感染９週間後にマウスを屠殺する。ＧＦＰ発現を肺においてｑＰＣＲによって評価する（部分ａ）は３週間時であり、部分ｂ）は９週間時である）。
【図27】ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肺試料におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後及び感染９週間後にマウスを屠殺し、両方の時点での結果を取得する。ＧＦＰ発現を肺においてｑＰＣＲによって評価する。
【図28】ウイルスベクターによる感染の３週間後での肺葉におけるＩＨＣ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後にマウスを屠殺する。右上葉、右中葉、右下葉、大静脈後葉、及び左葉の５つの肺葉においてＩＨＱによりＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを評価する。
【図29】ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肺試料におけるＩＨＣ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後（図ａ）に示されるデータ）及び感染９週間後（図ｂ）に示されるデータ）にマウスを屠殺する。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを肺においてＩＨＱによって評価する。
【図30】ＧＦＰ ＩＨの代表的な画像を示す図である。 ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のいずれかで、マウス当たり１０１２個のｖｇにて形質導入された肺におけるＧＦＰ染色の代表的なＩＨＱ画像。
【図31】抗ＳｐＣ及び抗ＧＦＰによる二重ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す図である。 ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のいずれかで、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量にて形質導入された肺におけるＧＦＰ染色及びＳｐＣ染色の代表的なＩＨＱ画像。感染９週間後にマウスを屠殺する。ＳｐＣは肺胞ＩＩ型細胞のマーカーである。
【図32】抗ＣＣ１０及び抗ＧＦＰによる二重ＩＨＣ染色の代表的な画像を示す図である。 ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のいずれかで、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量にて形質導入された肺におけるＧＦＰ染色及びＣＣ１０染色の代表的なＩＨＱ画像。感染９週間後にマウスを屠殺する。ＣＣ１０はクララ細胞のマーカーである。
【図33】ウイルスベクターによる感染の９週間後での肺試料におけるＩＨＣ分析を示す図である。 マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量でＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）による感染の９週間後での肺試料におけるＳＰＣ陽性細胞のパーセンテージ（Ａ）、ＳＰＣ－ＧＦＰ二重陽性細胞のパーセンテージ（Ｂ）、全ＧＦＰ陽性細胞のＳＰＣ陽性のパーセンテージ（Ｃ）、ＣＣ１０－ＧＦＰ二重陽性細胞のパーセンテージ（Ｄ）、及び全ＧＦＰ陽性細胞のＣＣ１０陽性細胞のパーセンテージ（Ｅ）の定量化。
【図34】ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肺試料、肝臓試料、心臓試料におけるＩＨＣ分析を示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後及び感染９週間後にマウスを屠殺する。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを肝臓（Ａ、Ｂ）、心臓（Ｃ、Ｄ）、及び肺（Ｅ、Ｆ）においてＩＨＱによって評価する。
【図35】ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルを示す図である。 健康な野生型マウスに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ７２９、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４１、ＵＡＢ）、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ８９３、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（バッチ９４２、ＵＡＢ）、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（バッチ９４３、ＵＡＢ）、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（バッチ９４４、ＵＡＢ）のベクターを、マウス当たり１０１１個のｖｇ（Ｄ１）、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）、及びマウス当たり１０１２個のｖｇ（Ｄ３）の用量で気管内投与する。感染３週間後及び感染９週間後にマウスを屠殺する。ＧＦＰ発現を肝臓（Ａ、Ｂ）、心臓（Ｃ、Ｄ）、及び肺（Ｅ、Ｆ）においてｑＰＣＲによって評価する。
【図36】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ－ｂＧＨベクターのバッチＡＡＶ－９５３の等密度ＣｓＣｌ勾配を示す図である。
【図37】ＡＡＶ－９５３バッチのタンパク質染色（シプロルビー（Sypro Ruby）染色）を示す図である。ＶＰはウイルス粒子である。
【図38】ＡＡＶ－９５３バッチのアルカリアガロースゲルを示す図である。ＭＷは分子量である。
【図39】ｍｏＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現を示す図である。３通りの異なるＭＯＩ（細胞当たり３２０００個のｖｇ（３２Ｋ）、細胞当たり６４０００個のｖｇ（６４Ｋ）、及び細胞当たり１２８０００個のｖｇ（１２８Ｋ））にてベクターＡＡＶ－９５３を感染させた２ｖ６．１１細胞におけるマウスに最適化されたＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現レベル。ＮＩは非感染である。ＡＵは任意単位である。
【図40】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ（ＡＡＶ－９５３バッチ）のアルカリアガロースゲルを示す図である。ＭＷは分子量である。
【図41】実験構成を示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。１群当たり１０匹のマウスが含まれている。感染６週間後にマウスを屠殺する。
【図42】ウイルスゲノムの定量化を示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。１群当たり１０匹のマウスが含まれている。感染６週間後にマウスを屠殺する。肺試料及び肝臓試料における細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２の２種の異なるプライマーセットを使用したｑＰＣＲによって分析した。
【図43】肺におけるＴｅｒｔの発現を示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。１群当たり１０匹のマウスが含まれている。感染６週間後にマウスを屠殺する。肺におけるＴｅｒｔの転写発現レベルを、セット１及びセット２の２種の異なるプライマーセットを使用したｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析する。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されている。セット２は、フォワードプライマー（５’－ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＴ Ｃ－３’）から構成されている。
【図44】オフターゲット器官におけるＴｅｒｔの発現及び活性を示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。１群当たり１０匹のマウスが含まれている。感染６週間後にマウスを屠殺する。肝臓におけるＴｅｒｔの転写発現レベルを、プライマーセット１を使用したｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析する。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されている（左のパネル）。肝臓試料におけるテロメラーゼ活性を、ｑ－ＰＣＲに基づくテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析する（右のパネル）。
【図45】肺におけるテロメラーゼ活性を示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。感染６週間後にマウスを屠殺する。肺試料におけるテロメラーゼ活性を、テロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析する。肺試料におけるテロメラーゼ発現とテロメラーゼ活性との間に相関が示される。
【図46】ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープを示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。感染６週間後にマウスを屠殺する。ｍｏＴｅｒｔを発現する肺細胞のパーセンテージを、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ陽性細胞によって分析する。肺形質導入効率を分析するのに、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡに特異的なプローブを設計し、ACDBIO（www.acdbio.com）から購入した。
【図47】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔがＡＴＩＩ細胞及びクララ細胞においてのみ発現されることを示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。感染６週間後にマウスを屠殺する。肺試料におけるプロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色、並びにセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色の代表的な画像。
【図48】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔがテロメアを延長し、６週間で形質導入細胞において核当たりより多数のテロメアスポット数をもたらすことを示す図である。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。感染６週間後にマウスを屠殺する。ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、肺試料中のｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。ｍｏＴｅｒｔを発現しない細胞及びｍｏＴｅｒｔを発現する細胞における平均テロメア強度、平均核強度、及び核当たりのテロメアスポットの平均数が示されている。結果は平均＋ＳＥＭとして表される。ｎ＝１０匹のマウス。
【図49】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔ形質導入マウスを示す図である。テロメア分布：２０％パーセンタイル及び８０％パーセンタイル。 健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で気管内投与する。感染６週間後にマウスを屠殺する。ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、肺試料中のｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。２つの実験群（ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ－Ｄ１及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ－Ｄ２）における、ｍｏＴｅｒｔを発現しない細胞及びｍｏＴｅｒｔを発現する細胞における平均テロメア強度、平均核強度、及び核当たりのテロメアスポットの平均数を取得して、形質導入されていない細胞（Ｔｅｒｔ ＲＮＡスコープ陰性細胞）に対する２０％パーセンタイル及び８０％パーセンタイルを計算した。
【図50】短いテロメアによって誘発された肺線維症の治療におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴの治療有効性の評価を示す図である。実験構成。 ブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．７ｍｇ）を、８週齢のＧ２－Ｔｅｒｔ－／－雄マウス及びＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに気管内注入した。肺線維症と診断されたマウスに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ又はマウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを気管内（ＩＴ）投与した。疾患の進行をＣＴスキャンによって追跡した。感染１週間後、感染２週間後、感染４週間後、感染６週間後にＣＴスキャンを実施して、処置開始時に対する線維化した肺の容積の減少を測定した。感染６週間後又は感染１１週間後のいずれかでマウスを屠殺する。１群当たり１０匹のマウスを長期追跡検査用に残す。
【図51】ＲＮＡスコープによる線維化肺におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔの肺形質導入効率を示す図である。 肺線維症と診断されたマウスに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ又はマウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを気管内（ＩＴ）投与した。ｍｏＴｅｒｔを発現する肺細胞のパーセンテージを、感染１１週間後の肺試料におけるｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ陽性細胞によって分析する（右のパネル）。比較の目的で、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で形質導入した野生型の健康な動物、並びにＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で形質導入した野生型の健康な動物における感染６週間後の肺細胞のパーセンテージを示す（左のパネル）。
【図52】ウイルスゲノムの定量化を示す図である。 肺線維症と診断されたマウスに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ又はマウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを気管内（ＩＴ）投与した。肺試料、肝臓試料、心臓試料、及び脳試料における細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２の２種の異なるプライマーセットを使用したｑＰＣＲによって分析した。試料は、感染６週間後及び感染１１週間後に屠殺したマウスに対応する（上のパネル）。比較の目的で、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で形質導入した野生型の健康な動物、並びにＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ（Ｄ１）及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇ（Ｄ２）で形質導入した野生型の健康な動物の感染６週間後の肺試料及び肝臓試料における細胞当たりのウイルスゲノム数を示す（下のパネル）。
【図53】Ｔｅｒｔ発現－ｑＰＣＲを示す図である。 肺線維症と診断されたマウスに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ又はマウス当たり５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかを気管内（ＩＴ）投与した。テロメラーゼ発現を、肺試料、肝臓試料、心臓試料、及び脳試料において感染１１週間後にｑＰＣＲによって評価する（上のパネル）。テロメラーゼ発現を、肺において感染６週間後及び感染１１週間後（左下のパネル）と、感染６週間後（右下のパネル）とで評価する。３つのプロットは、個々の独立したマウスを分析する３つの異なる独立したＰＣＲの実行に対応する。５×１０１１個のｖｇのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのｖｇで形質導入された野生型の健康なマウスの肺試料を、ポジティブコントロールとして並行して（最初のバー）実行した。
【図54】ＡＡＶベクターにクローニングされた４つの異なるＴＥＲＴ配列を示す図である。４６５０ｂｐのＡＡＶベクターゲノムは、ＳｐＢプロモーターと、対応するＴＥＲＴのＣＤＳと、ｂＧＨのポリＡシグナルとを含み、全ては２つのＡＡＶ２のＩＴＲによって両側が挟まれている。
【図55】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｏＴＥＲＴ－ＩＤ（ＡＡＶ－９６２ベクターバッチ）の分析的超遠心分離によって得られた沈降プロファイルを示す図である。ｘ軸はスベドベリ単位（Ｓ）で表される沈降係数を表し、ｙ軸は２６０ｎｍ（実線）及び２８０ｎｍ（破線）で測定されたＳの関数としての濃度（ｃ（Ｓ））の正規化値を表す。
【図56】ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｏＴＥＲＴ－ＩＤ（ＡＡＶ－９６２バッチ）のアルカリアガロースゲルを示す図である。ＭＷは分子量である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0171】
実施例１の一般的な手順
被験体の特徴
短縮型のヒトＳｐＢプロモーター、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、及びＴＮＴプロモーターの組織特異性を評価するのに、雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを使用した。マウスに標準食（２０１８Ｓ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ（商標）、Harlan Labs., Inc.、米国ウィスコンシン州、マディソン）を自由に摂食させ、１２時間の明暗サイクル（午前８時に点灯）及び安定した温度（２２℃±２）に保持した。組織の試料採取の前に、マウスを吸入麻酔薬イソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（商標）、Abbott Laboratories、米国イリノイ州、アボットパーク）によって麻酔し、頭部切断した。対象となる組織を切除し、分析するまで－８０℃で又はホルマリンを用いて保存した。全ての実験手順は、バルセロナ自治大学の動物実験及び人体実験についての倫理委員会（Ethics Committee for Animal and Human Experimentation of the Universitat Autonoma de Barcelona）によって承認された。
被験体の特徴
短縮型のヒトＳｐＢプロモーター、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、及びＴＮＴプロモーターの組織特異性を評価するのに、雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを使用した。マウスに標準食（２０１８Ｓ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ（商標）、Harlan Labs., Inc.、米国ウィスコンシン州、マディソン）を自由に摂食させ、１２時間の明暗サイクル（午前８時に点灯）及び安定した温度（２２℃±２）に保持した。組織の試料採取の前に、マウスを吸入麻酔薬イソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（商標）、Abbott Laboratories、米国イリノイ州、アボットパーク）によって麻酔し、頭部切断した。対象となる組織を切除し、分析するまで－８０℃で又はホルマリンを用いて保存した。全ての実験手順は、バルセロナ自治大学の動物実験及び人体実験についての倫理委員会（Ethics Committee for Animal and Human Experimentation of the Universitat Autonoma de Barcelona）によって承認された。
【0172】
組換えＡＡＶベクター
血清型９型の一本鎖ＡＡＶベクターを、標準的な方法（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）に従ってＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによって生成した。細胞を１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ２、平坦；Corning（商標）、Sigma-Aldrich Co.、米国ミズーリ州、セントルイス）においてＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ中で８０％のコンフルエンスになるまで培養し、リン酸カルシウム法を使用してＡＡＶ２のＩＴＲによって両側が挟まれた発現カセットを有するプラスミドと、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子及び血清型９型のＡＡＶのｃａｐ遺伝子を有するヘルパープラスミドと、アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドとを用いて同時トランスフェクションさせた。使用した導入遺伝子は、１）短縮型のヒトＳｐＢプロモーター（配列番号１２）、２）短縮型のヒトＭＬＣ２ｖプロモーター（配列番号１５）に融合されたＣＭＶエンハンサー、又は３）短縮型のヒトＴＮＴプロモーター（配列番号１６）によって駆動されるマウスコドン最適化（配列番号３）されたＴＥＲＴコーディング配列とした。ユビキタスＣＭＶプロモーターによって駆動される３’ＵＴＲを含む野生型マウスＴＥＲＴコーディング配列（配列番号１）をコントロールとして使用した（非特許文献４）。非コーディングプラスミドを使用してヌルベクターを生成した。ＡＡＶを、ポリエチレングリコール沈殿工程と、２つの連続する塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配とに基づいた最適化された方法で精製した。この第２世代のＣｓＣｌに基づくプロトコルにより、空のＡＡＶカプシド並びにＤＮＡ及びタンパク質の不純物が激減した（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）。精製したＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、濾過して－８０℃で貯蔵した。ウイルスベクターを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイキット（Invitrogen）を使用して蛍光によって決定した。ファージラムダＤＮＡを標準曲線として使用して、ウイルスベクターの力価を計算した。ベクターを当該技術分野において既知の分子生物学技術に従って構築した。
血清型９型の一本鎖ＡＡＶベクターを、標準的な方法（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）に従ってＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによって生成した。細胞を１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ２、平坦；Corning（商標）、Sigma-Aldrich Co.、米国ミズーリ州、セントルイス）においてＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ中で８０％のコンフルエンスになるまで培養し、リン酸カルシウム法を使用してＡＡＶ２のＩＴＲによって両側が挟まれた発現カセットを有するプラスミドと、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子及び血清型９型のＡＡＶのｃａｐ遺伝子を有するヘルパープラスミドと、アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドとを用いて同時トランスフェクションさせた。使用した導入遺伝子は、１）短縮型のヒトＳｐＢプロモーター（配列番号１２）、２）短縮型のヒトＭＬＣ２ｖプロモーター（配列番号１５）に融合されたＣＭＶエンハンサー、又は３）短縮型のヒトＴＮＴプロモーター（配列番号１６）によって駆動されるマウスコドン最適化（配列番号３）されたＴＥＲＴコーディング配列とした。ユビキタスＣＭＶプロモーターによって駆動される３’ＵＴＲを含む野生型マウスＴＥＲＴコーディング配列（配列番号１）をコントロールとして使用した（非特許文献４）。非コーディングプラスミドを使用してヌルベクターを生成した。ＡＡＶを、ポリエチレングリコール沈殿工程と、２つの連続する塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配とに基づいた最適化された方法で精製した。この第２世代のＣｓＣｌに基づくプロトコルにより、空のＡＡＶカプシド並びにＤＮＡ及びタンパク質の不純物が激減した（Ayuso, E. et al., 2010. Curr Gene Ther. 10(6):423-36）。精製したＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、濾過して－８０℃で貯蔵した。ウイルスベクターを、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡアッセイキット（Invitrogen）を使用して蛍光によって決定した。ファージラムダＤＮＡを標準曲線として使用して、ウイルスベクターの力価を計算した。ベクターを当該技術分野において既知の分子生物学技術に従って構築した。
【0173】
ＡＡＶベクターの全身投与
適量のＡＡＶ溶液を０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）を含むＰＢＳ中で希釈し、送達の瞬間に圧力をかけずに外側尾静脈へと手動で注射した。注射前に、動物を２５０Ｗの赤外線加熱ランプ（Philips NV、オランダ、アムステルダム）の下に数分間置いて、血管を拡張させ、尾静脈を見やすくし、尾静脈へとよりアクセスし易くした。プラスチック製保定器（Harvard Apparatus、米国マサチューセッツ州、ホリストン）を使用して、注射のために動物を固定した。適切な保定装置を使用したため、麻酔を使用しなかった。３０ゲージの針を利用して動物に注射した。
適量のＡＡＶ溶液を０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ（商標）を含むＰＢＳ中で希釈し、送達の瞬間に圧力をかけずに外側尾静脈へと手動で注射した。注射前に、動物を２５０Ｗの赤外線加熱ランプ（Philips NV、オランダ、アムステルダム）の下に数分間置いて、血管を拡張させ、尾静脈を見やすくし、尾静脈へとよりアクセスし易くした。プラスチック製保定器（Harvard Apparatus、米国マサチューセッツ州、ホリストン）を使用して、注射のために動物を固定した。適切な保定装置を使用したため、麻酔を使用しなかった。３０ゲージの針を利用して動物に注射した。
【0174】
ＲＮＡ分析
単離試薬（肺試料、肝臓試料、及び心臓試料用のＴｒｉｐｕｒｅ（Roche）、並びにｅＷＡＴ試料用のＱＩＡｚｏｌ（Qiagen））及びＲＮｅａｓｙ組織ミニキット（RNeasy Tissue Minikit）（Qiagen NV、オランダ、フェンロー）を使用して製造業者のプロトコルに従って、様々な組織から全ＲＮＡを取得した。残留するウイルスゲノムを除去するのに、全ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Qiagen NV、オランダ、フェンロー）で処理した。得られたＲＮＡの濃度及び純度をＮａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ－１０００、ThermoCientific）を使用して決定した。ＲＴ－ＰＣＲでは、１μｇのＲＮＡ試料をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（０４３７９０１２００１、Roche、米国、カリフォルニア）を使用して製造業者のプロトコルに従って逆転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅＩＩ（商標）（Cepheid、米国、サニーベール）においてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Rocheの参照番号０４８８７３５２００１、Roche Diagnostics、ドイツ）を使用して実施した。データをＲｐｌｐ０値で正規化し、以前に記載されたように（Pfaffl, M., Nucleic Acids Res. 2001; 29(9):e45）分析した。
単離試薬（肺試料、肝臓試料、及び心臓試料用のＴｒｉｐｕｒｅ（Roche）、並びにｅＷＡＴ試料用のＱＩＡｚｏｌ（Qiagen））及びＲＮｅａｓｙ組織ミニキット（RNeasy Tissue Minikit）（Qiagen NV、オランダ、フェンロー）を使用して製造業者のプロトコルに従って、様々な組織から全ＲＮＡを取得した。残留するウイルスゲノムを除去するのに、全ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩ（Qiagen NV、オランダ、フェンロー）で処理した。得られたＲＮＡの濃度及び純度をＮａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ－１０００、ThermoCientific）を使用して決定した。ＲＴ－ＰＣＲでは、１μｇのＲＮＡ試料をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（０４３７９０１２００１、Roche、米国、カリフォルニア）を使用して製造業者のプロトコルに従って逆転写した。リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅＩＩ（商標）（Cepheid、米国、サニーベール）においてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Rocheの参照番号０４８８７３５２００１、Roche Diagnostics、ドイツ）を使用して実施した。データをＲｐｌｐ０値で正規化し、以前に記載されたように（Pfaffl, M., Nucleic Acids Res. 2001; 29(9):e45）分析した。
【0175】
沈降速度分析的超遠心分離によるＡＡＶベクターの特性評価
ＡＡＶベクターを、分析的超遠心分離（ＡＵＣ）によって特性評価した。４５０マイクロリットルの試料を２区分の速度セルの試料区分にロードし、４５０μｌのＰＢＳ＋０．００１％のＰＦ６８を対応する参照区分（ＵＶ－ＶＩＳ吸光光学装置を備えたBeckman-Coulterの分析的超遠心分離機Ｏｐｔｉｍａ ＸＬＡ）にロードした。沈降速度遠心分離を２００００ｒｐｍで実施した。粒子の沈降を、同じ実行時に２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。Ｃ（Ｓ）分布内の各ピークの相対パーセンテージを、以前に記載されたように（Burnham, B. et al., 2015, Hum Gene Ther Methods 26(6):228-42）、分布内の全ての種のモル濃度の合計に対する各種のモル濃度に基づいて計算した。
ＡＡＶベクターを、分析的超遠心分離（ＡＵＣ）によって特性評価した。４５０マイクロリットルの試料を２区分の速度セルの試料区分にロードし、４５０μｌのＰＢＳ＋０．００１％のＰＦ６８を対応する参照区分（ＵＶ－ＶＩＳ吸光光学装置を備えたBeckman-Coulterの分析的超遠心分離機Ｏｐｔｉｍａ ＸＬＡ）にロードした。沈降速度遠心分離を２００００ｒｐｍで実施した。粒子の沈降を、同じ実行時に２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。Ｃ（Ｓ）分布内の各ピークの相対パーセンテージを、以前に記載されたように（Burnham, B. et al., 2015, Hum Gene Ther Methods 26(6):228-42）、分布内の全ての種のモル濃度の合計に対する各種のモル濃度に基づいて計算した。
【0176】
アルカリアガロースゲル電気泳動によるＡＡＶベクターのゲノムの完全性の決定
ＡＡＶベクターのゲノムの完全性を、一本鎖ＤＮＡを分析することができるアルカリアガロースゲル電気泳動（変性条件）によって評価した。最初に、８μｇのベクターゲノムを、ＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（DNeasy blood and tissue kit）（Qiagen）を使用して製造業者のプロトコルに従って精製した。抽出したＤＮＡ（約１μｇ）をアルカリローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間煮沸し、氷上で３分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。最後に、バンドのサイズ及び質を検査して、ゲノムの完全性を評価した。
ＡＡＶベクターのゲノムの完全性を、一本鎖ＤＮＡを分析することができるアルカリアガロースゲル電気泳動（変性条件）によって評価した。最初に、８μｇのベクターゲノムを、ＤＮｅａｓｙ血液・組織キット（DNeasy blood and tissue kit）（Qiagen）を使用して製造業者のプロトコルに従って精製した。抽出したＤＮＡ（約１μｇ）をアルカリローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間煮沸し、氷上で３分間インキュベートした。次に、ＤＮＡを変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。最後に、バンドのサイズ及び質を検査して、ゲノムの完全性を評価した。
【0177】
発現の可視化
心臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、精巣上体、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、脾臓、精巣、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるＧＦＰ陽性細胞を、ＧＦＰに対するウサギモノクローナル抗体（Ｄ５．１、Cell Signaling、番号２９５６）を使用した免疫組織化学染色によって検出し、光学顕微鏡法によって視覚化した。
心臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、精巣上体、腸、腎臓、肝臓、肺、筋肉、膵臓、脾臓、精巣、及び白色脂肪組織（ＷＡＴ）におけるＧＦＰ陽性細胞を、ＧＦＰに対するウサギモノクローナル抗体（Ｄ５．１、Cell Signaling、番号２９５６）を使用した免疫組織化学染色によって検出し、光学顕微鏡法によって視覚化した。
【0178】
コンピューター断層撮影
コンピューター断層撮影（ＣＴ）によるｉｎ－ｖｉｖｏでの肺イメージングを、小型実験動物用に特別に設計された高解像度ＣＴシステム（ＣＴ Ｌｏｃｕｓ、GE Healthcare）において行った。導入期間中は４％の割合のイソフルラン（ＩｓｏＶｅｔ Ｂｒａｕｎ）で、維持期間（スキャン時間）中は２％でマウスを麻酔した。マイクロＣＴ画像取得は、下肢に焦点を当てたシングルベッドにおいて４５０μＡ／８０ｋＶのＸ線管を用いて、ガントリーをおよそ１４分間で完全に１回転させて収集された４００個の投影からなっていた。２－Ｄ画像及び３－Ｄ画像を取得し、ソフトウェアプログラムＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（GE Healthcare）を使用して分析した。
コンピューター断層撮影（ＣＴ）によるｉｎ－ｖｉｖｏでの肺イメージングを、小型実験動物用に特別に設計された高解像度ＣＴシステム（ＣＴ Ｌｏｃｕｓ、GE Healthcare）において行った。導入期間中は４％の割合のイソフルラン（ＩｓｏＶｅｔ Ｂｒａｕｎ）で、維持期間（スキャン時間）中は２％でマウスを麻酔した。マイクロＣＴ画像取得は、下肢に焦点を当てたシングルベッドにおいて４５０μＡ／８０ｋＶのＸ線管を用いて、ガントリーをおよそ１４分間で完全に１回転させて収集された４００個の投影からなっていた。２－Ｄ画像及び３－Ｄ画像を取得し、ソフトウェアプログラムＭｉｃｒｏＶｉｅｗ（GE Healthcare）を使用して分析した。
【0179】
統計学的分析
全ての結果は平均±ＳＥＭとして表される。群間の差をスチューデントのｔ検定によって比較した。Ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。
全ての結果は平均±ＳＥＭとして表される。群間の差をスチューデントのｔ検定によって比較した。Ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。
【0180】
実施例１．１．ヒトＳｐＢプロモーターの短縮型を使用したＡＡＶによる肺特異的導入遺伝子発現
低いカプシド形成能力（およそ４．７ｋｂ）のＡＡＶベクターと併せて当該技術分野において典型的に使用される長いＴＥＲＴ配列の長さは、ＡＡＶベクターのカプシド形成能力を超えずにテロメラーゼをコードする発現カセットにおいて使用することができるプロモーター配列の数を大幅に制限する。ＴＥＲＴコーディング配列及び発現カセットの更なる構成要素（すなわち、ポリＡ配列、ＡＡＶのＩＴＲ）と併せて肺特異的プロモーターを利用することによって引き起こされるＡＡＶカプシド形成能力を超えないように、短縮型（６３２ヌクレオチド、配列番号１２）のヒトサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳｐＢ）プロモーター（野生型ヒトＳｐＢプロモーターのサイズ：１５９７ヌクレオチド、配列番号１１）を設計した。野生型ヒトＳｐＢプロモーターは、肺中のクララ細胞及びＡＴＩＩ細胞における発現を駆動する。
低いカプシド形成能力（およそ４．７ｋｂ）のＡＡＶベクターと併せて当該技術分野において典型的に使用される長いＴＥＲＴ配列の長さは、ＡＡＶベクターのカプシド形成能力を超えずにテロメラーゼをコードする発現カセットにおいて使用することができるプロモーター配列の数を大幅に制限する。ＴＥＲＴコーディング配列及び発現カセットの更なる構成要素（すなわち、ポリＡ配列、ＡＡＶのＩＴＲ）と併せて肺特異的プロモーターを利用することによって引き起こされるＡＡＶカプシド形成能力を超えないように、短縮型（６３２ヌクレオチド、配列番号１２）のヒトサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳｐＢ）プロモーター（野生型ヒトＳｐＢプロモーターのサイズ：１５９７ヌクレオチド、配列番号１１）を設計した。野生型ヒトＳｐＢプロモーターは、肺中のクララ細胞及びＡＴＩＩ細胞における発現を駆動する。
【0181】
短縮型のヒトＳｐＢプロモーターが肺特異的導入遺伝子の発現を媒介することができるかどうかを研究するのに、この短縮型プロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ）又はユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でマーカータンパク質ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）を、ＨＥＫ２９３産生細胞における三重トランスフェクションによってクローニングして生成した。１．７５×１０１２個のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量のＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを、尾静脈を介してマウスに静脈内（ＩＶ）投与した。生理食塩液をＩＶ投与したマウスの群をコントロールとして使用した。ＡＡＶ投与の４週間後に、肺、肝臓、及び精巣上体周囲白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）においてＧＦＰ発現レベルを評価した。肺におけるＧＦＰ発現レベルは、ＣＭＶプロモーターによって媒介されるレベルよりも低かったが（図１Ａ）、短縮型のＳｐＢプロモーターは白色脂肪組織におけるＧＦＰ発現を妨げ、肝臓におけるＧＦＰ発現レベルの８０％の低下を媒介した（図１Ｂ）。肺、肝臓、心臓、及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージの定量化により、短縮型ＳｐＢプロモーターの肺特異性が更に確認された（図２及び図３）。短縮型のプロモーターの使用は、特異性の喪失、及び肺以外のオフターゲット組織における無差別な導入遺伝子発現をもたらし得た。驚くべきことに、本明細書において使用される短縮型のプロモーターは、高度に特異的な肺発現を媒介することができた。
【0182】
実施例１．２．短縮型の心臓特異的プロモーターを使用したＡＡＶによる心臓特異的導入遺伝子発現
心筋細胞特異的ＭＬＣ２ｖプロモーターの短縮型（２９６ヌクレオチド、配列番号１３）も設計した。野生型ＭＬＣ２ｖプロモーターのこの短縮型のプロモーター強度を高めるのに、上記プロモーターと併せてＣＭＶエンハンサー（３８０ヌクレオチド、配列番号１４）を使用した（ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ、配列番号１５）。
心筋細胞特異的ＭＬＣ２ｖプロモーターの短縮型（２９６ヌクレオチド、配列番号１３）も設計した。野生型ＭＬＣ２ｖプロモーターのこの短縮型のプロモーター強度を高めるのに、上記プロモーターと併せてＣＭＶエンハンサー（３８０ヌクレオチド、配列番号１４）を使用した（ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ、配列番号１５）。
【0183】
ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターが心臓における特異的発現を媒介することができるかどうかを研究するのに、８週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスを２通りの異なる用量（マウス当たり５×１０１１個（低（Ｌ）用量）のウイルスゲノム（ｖｇ）又はマウス当たり２×１０１２個（高（Ｈ）用量）のウイルスゲノム（ｖｇ））のＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクターで処置した。コントロールとして、追加の２つのマウス群を、同用量のユビキタスＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ）で処置した。ＡＡＶの３週間後に、動物を屠殺し、ＧＦＰの発現及び生成のレベルを様々な組織において評価した。ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクターで、特にマウス当たり２×１０１２個のｖｇの用量で処置されたマウスは、心臓において力強いＧＦＰ発現を示した（図４Ａ）。さらに、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージの定量化により、高用量のＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを投与したマウスよりも、低用量及び高用量のＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクターで処置された動物の心臓において、形質導入細胞の数がより多いことが明らかになった（図５Ａ及び図５Ｂ）。さらに、ＣＭＶ－ｅｎｈＭＬＣ２ｖプロモーターは、精巣、精巣上体、白色脂肪組織、骨格筋、肺、腸、脳、脾臓、及び腎臓におけるＧＦＰの発現及び生成を妨げた（図４Ｂ及び図５Ｂ）。しかしながら、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ＧＦＰベクター又はＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスにおいて、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが類似した組織である膵臓、褐色脂肪組織、又は肝臓においてＧＦＰ生成を制限することはできなかった（図４Ｂ及び図５Ｂ）。ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターによって媒介される導入遺伝子の発現は完全に心臓特異的ではなかったが、このプロモーターの使用により、ＣＭＶプロモーターと比較してより多数の組織においてＧＦＰ発現が妨げられた。
【0184】
ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーターによって示される心臓特異性よりも高い心特異性を達成するのに、ヒトトロポニン（ＴＮＴ）プロモーターの短縮型（５４４ヌクレオチド、配列番号１６）を使用した。ＴＮＴプロモーターの短縮型の強度及び組織特異性を評価するのに、１．７５×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクターを７週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６マウスに投与した。コントロールとして、１つのマウスの群を１．７５×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターで処置した。ＡＡＶ投与の４週間後に、マウスを屠殺し、ＧＦＰ発現レベルを評価した。ＴＮＴプロモーターの短縮型は、ＣＭＶプロモーターで得られるレベルと同様の心臓におけるＧＦＰ発現レベルを媒介した（図６）。さらに、ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ＧＦＰベクターで処置されたマウスでは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターを与えた動物よりも低い肝臓におけるＧＦＰレベル（２５％の減少）が示され、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織においては導入遺伝子の発現がないことが示された（図６及び図７）。
【0185】
実施例１．３．ウイルスゲノムサイズの最適化によりＡＡＶ中間種の生成が妨げられる
ＣＭＶプロモーターの制御下でマウステロメラーゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ）を使用した肺におけるテロメラーゼ発現は、肺線維症及び心筋梗塞における治療有用性を媒介することが報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。しかしながら、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターのウイルスゲノムのサイズは、およそ４．７ｋｂのＡＡＶカプシド形成限界を大幅に超える５２９１ヌクレオチドであった。さらに、ウイルスゲノムのサイズが大きいため、ポリＡ配列を発現カセットに含めることができなかった。上記ＡＡＶベクターの生成により、幾つかの異なる中間種を含むベクターが生じた（図８Ａ）。注目すべきことに、全長ウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターは明確に検出されなかった（図８Ａ）。さらに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターのゲノムの完全性の分析により、全長ＡＡＶゲノムに対応するおよそ５．３ｋｂのバンドと、欠損したゲノムに対応する幅広いスメアとが明らかになった（図９Ａ及び図９Ｂ）。ＣＭＶプロモーターの制御下でネズミ科動物のテロメラーゼの触媒的に不活性な形態をコードし、ウイルスゲノムサイズも５２９１ヌクレオチドであるＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮ）（非特許文献４）について、ゲノムの完全性及びＡＡＶ中間種の生成を評価したところ、同様の結果が得られた（図８Ｂ及び図９Ａ）。
ＣＭＶプロモーターの制御下でマウステロメラーゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ）を使用した肺におけるテロメラーゼ発現は、肺線維症及び心筋梗塞における治療有用性を媒介することが報告されている（非特許文献６、非特許文献７）。しかしながら、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターのウイルスゲノムのサイズは、およそ４．７ｋｂのＡＡＶカプシド形成限界を大幅に超える５２９１ヌクレオチドであった。さらに、ウイルスゲノムのサイズが大きいため、ポリＡ配列を発現カセットに含めることができなかった。上記ＡＡＶベクターの生成により、幾つかの異なる中間種を含むベクターが生じた（図８Ａ）。注目すべきことに、全長ウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターは明確に検出されなかった（図８Ａ）。さらに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターのゲノムの完全性の分析により、全長ＡＡＶゲノムに対応するおよそ５．３ｋｂのバンドと、欠損したゲノムに対応する幅広いスメアとが明らかになった（図９Ａ及び図９Ｂ）。ＣＭＶプロモーターの制御下でネズミ科動物のテロメラーゼの触媒的に不活性な形態をコードし、ウイルスゲノムサイズも５２９１ヌクレオチドであるＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮ）（非特許文献４）について、ゲノムの完全性及びＡＡＶ中間種の生成を評価したところ、同様の結果が得られた（図８Ｂ及び図９Ａ）。
【0186】
ヒトＳｐＢプロモーターの短縮型の制御下でテロメラーゼをコードするＡＡＶベクターにおける中間種の生成を回避するのに、マウステロメラーゼ（ｍＴＥＲＴ）及びヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）のコーディング配列の網羅的な研究を行った。ｍＴＥＲＴのｃＤＮＡ（３７８６ヌクレオチド、配列番号１）を、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを欠失させることによって改変し、３３６９ヌクレオチドの長さのコーディング配列（配列番号２）を得て、ＴＥＲＴコーディング配列の長さを最小限に抑えた。さらに、上記配列をコドン最適化して、タンパク質産生（ｍｏＴＥＲＴ、配列番号３）を改善した。ＴＥＲＴコーディング配列のサイズを減少させ、短縮型のヒトＳｐＢプロモーター、ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター、又はＴＮＴプロモーターを使用した結果、ウシ成長ホルモンのポリＡ配列（配列番号１８）を、ＡＡＶのカプシド形成限界を超えずに発現カセット中に含めることができた。具体的には、ウイルスゲノムのサイズは、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴについては４６３８ヌクレオチド（配列番号２１）、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴについては４６７６ヌクレオチド（配列番号２２）、かつＡＡＶ９－ＴＮＴ－ｍｏＴＥＲＴについては４５３６ヌクレオチド（配列番号２３）であった。発現カセットにポリＡ配列を含めることで、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率が高まるためＴＥＲＴタンパク質産生の改善が可能となり、不所望な３’ＵＴＲ配列の生成を回避してｍＲＮＡの適切な終結の促進が可能となり得る。これらのベクターについては、ＡＡＶ中間種は検出されなかった（図８Ｃ～図８Ｅ）。ゲノムの完全性の分析により、全長ＡＡＶゲノムに相当するおよそ４．７ｋｂのバンドが明らかになり、欠損したゲノムが存在しないことが更に確認された（図９Ａ及び図９Ｂ）。さらに、ＡＡＶ９－Ｓｐｂ－ｍｏＴＥＲＴ、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴ、及びＡＡＶ９－ＴＮＴ－ｍｏＴｅｒｔにおいて観察された完全長ベクターゲノムに対応するバンドのより高い強度により、これらのＡＡＶ調製物において、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮと比べて完全長ゲノムの数がより多いことが示された（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【0187】
実施例１．４．ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターは肺線維症における治療有用性を媒介する
次に、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターが肺線維症の治療有用性を媒介し得るかどうかを評価した。短いテロメアによって誘発された肺線維症のマウスモデルを使用した（Povedano el al (2015) Cell Rep 12, 286-299）。このモデルは、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにおける低用量、つまり正常な長さのテロメアを有する野生型マウスにおいては線維症を誘発しない用量のブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ）の気管内注入に基づいている。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクター又はＡＡＶ９－ｎｕｌｌベクターのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。ウイルス処置の１週間後、３週間後、及び５週間後に、疾患の進行を長期的に追跡するのにＣＴスキャンを実施した。処置開始時と比較して異常なＣＴパターンを示す肺罹患容積の減少は、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで形質導入されたマウスにおいて、既に１週間後にＡＡＶ９－ｎｕｌｌで形質導入されたマウスと比較して有意に高かった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。
次に、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターが肺線維症の治療有用性を媒介し得るかどうかを評価した。短いテロメアによって誘発された肺線維症のマウスモデルを使用した（Povedano el al (2015) Cell Rep 12, 286-299）。このモデルは、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにおける低用量、つまり正常な長さのテロメアを有する野生型マウスにおいては線維症を誘発しない用量のブレオマイシン（体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ）の気管内注入に基づいている。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクター又はＡＡＶ９－ｎｕｌｌベクターのいずれかを静脈内（ＩＶ）投与した。ウイルス処置の１週間後、３週間後、及び５週間後に、疾患の進行を長期的に追跡するのにＣＴスキャンを実施した。処置開始時と比較して異常なＣＴパターンを示す肺罹患容積の減少は、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで形質導入されたマウスにおいて、既に１週間後にＡＡＶ９－ｎｕｌｌで形質導入されたマウスと比較して有意に高かった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。
【0188】
実施例１．５．肺線維症の退縮におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴの有効性の比較研究
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴベクターと比較した、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴによって媒介される肺線維症治療における治療有効性も評価した。Ｇ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにブレオマイシンを気管内投与し、ブレオ傷害の２週間後に各マウスについてＣＴを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかをＩＶ投与した。ブレオマイシン傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、ベースラインでの健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴベクターと比較した、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴによって媒介される肺線維症治療における治療有効性も評価した。Ｇ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにブレオマイシンを気管内投与し、ブレオ傷害の２週間後に各マウスについてＣＴを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのいずれかをＩＶ投与した。ブレオマイシン傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、ベースラインでの健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。
【0189】
ＡＡＶ９処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に、疾患の進行をＣＴによって長期的に追跡調査した。ＡＡＶ９処置の６週間後と８週間後との間に罹患容積の変化は検出されなかったことから、これは疾患の慢性化を示している（図１１Ａ）。したがって、処置の最初の６週間の間に罹患容積の減少速度を計算した。罹患肺容積の減少速度は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴの両方の処置において同様であり、コントロール群よりも速かった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。処置の８週間後にマウスを屠殺した。肺試料においてＴＥＲＴの発現レベル及び活性（ＴＲＡＰ）を測定した。テロメラーゼ発現をｑＰＣＲによって分析した。テロメラーゼ活性を、以前に記載されたように（Herbert et al. Nat Protoc 1;583-1590, (2006)（引用することによりその全体が本明細書の一部をなす））測定した。結果は、未処置動物と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴのどちらで処置された動物においても、より高いＴＥＲＴ発現及びより高いテロメラーゼ活性を裏付けている（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
【0190】
実施例１．６．テロメア長、Ｔｅｒｔ発現、及びテロメラーゼ活性
ＡＴＩＩ細胞の特異抗体である抗ＳＰＣ及びテロメアプローブを用いたｉｍｍｕｎｅ－ｑ－Ｆｉｓｈを実施して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝６）処置マウスの肺切片におけるテロメア強度を定量化した。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ群及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ群の両者は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ処置群と比較して、ＡＴＩＩ細胞だけでなくＳＰＣ陰性細胞においても平均核強度及び平均スポット強度の増加を示した（図１３Ａ～図１３Ｄ）。さらに、短いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより低かった（図１３Ｅ及び図１３Ｆ）。長いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより高かった（図１３Ｇ及び図１３Ｈ）。アッセイの代表的な画像を図１３Ｉに示す。これらの結果は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置された肺における真正のテロメア長の増加を示している。
ＡＴＩＩ細胞の特異抗体である抗ＳＰＣ及びテロメアプローブを用いたｉｍｍｕｎｅ－ｑ－Ｆｉｓｈを実施して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝６）処置マウスの肺切片におけるテロメア強度を定量化した。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ群及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ群の両者は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ処置群と比較して、ＡＴＩＩ細胞だけでなくＳＰＣ陰性細胞においても平均核強度及び平均スポット強度の増加を示した（図１３Ａ～図１３Ｄ）。さらに、短いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより低かった（図１３Ｅ及び図１３Ｆ）。長いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより高かった（図１３Ｇ及び図１３Ｈ）。アッセイの代表的な画像を図１３Ｉに示す。これらの結果は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置された肺における真正のテロメア長の増加を示している。
【0191】
Ｔｅｒｔの発現レベル及びテロメラーゼ活性を、肺、肝臓、脳、及び心臓において、それぞれｑ－ＰＣＲ及びＴＲＡＰ分析によって決定した（図１４）。結果は、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴが心臓でも脳でも発現していないことを裏付けている。
【0192】
実施例２．肺線維症の退縮におけるＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴの有効性の比較研究
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴを、ＰＦ（肺線維症）退縮におけるそれらの治療有効性について評価した。短いテロメアによって誘発された肺線維症のマウスモデルを使用した。このモデルは、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにおける低用量、つまり正常な長さのテロメアを有する野生型マウスにおいては線維症を誘発しない用量のブレオマイシン（体重１Ｋｇ当たり０．５ｍｇ～０．７ｍｇ）の気管内注入に基づいていた。ブレオマイシン（ブレオ）傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴを、ＰＦ（肺線維症）退縮におけるそれらの治療有効性について評価した。短いテロメアによって誘発された肺線維症のマウスモデルを使用した。このモデルは、８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスにおける低用量、つまり正常な長さのテロメアを有する野生型マウスにおいては線維症を誘発しない用量のブレオマイシン（体重１Ｋｇ当たり０．５ｍｇ～０．７ｍｇ）の気管内注入に基づいていた。ブレオマイシン（ブレオ）傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。
【0193】
目的
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターと比較した、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔによって媒介されるＰＦ退縮における治療有効性の評価。
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターと比較した、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔによって媒介されるＰＦ退縮における治療有効性の評価。
【0194】
研究デザイン
ベクター：
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ（配列番号２５は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
ベクター：
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ（配列番号２５は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
【0195】
投与量：
マウス当たり２×１０１２個のｖｇ。
マウス当たり２×１０１２個のｖｇ。
【0196】
Ｇ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウス（ｎ＝４８）にブレオマイシン（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）を気管内投与した。ブレオマイシン（ブレオ）傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。ブレオ傷害の２週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝７）、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝８）、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝９）のいずれかをＩＶ投与した。ＡＡＶ９処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に、疾患の進行をＣＴによって長期的に追跡調査した。
【0197】
図１５において、そこに実験構成を示す。
【0198】
材料及び方法
試験物品及びコントロール物品
ブレオマイシン（Sigma-Aldrichの１５３６１）溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）を気管内投与用に調製して、マウスにおいて肺線維症を誘発した（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）。フェンタニル、メデトミジン、及びミダゾラム（４０％（容量／容量）－２０％（容量／容量）－４０％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり５ｍＬ）を腹腔内（ＩＰ）注射することによってマウスを麻酔した。ナロキソン及びアチパメゾール（８５％（容量／容量）－１５％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり３．５ｍＬ）のＩＰ注射によって麻酔を解除した。
試験物品及びコントロール物品
ブレオマイシン（Sigma-Aldrichの１５３６１）溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）を気管内投与用に調製して、マウスにおいて肺線維症を誘発した（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）。フェンタニル、メデトミジン、及びミダゾラム（４０％（容量／容量）－２０％（容量／容量）－４０％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり５ｍＬ）を腹腔内（ＩＰ）注射することによってマウスを麻酔した。ナロキソン及びアチパメゾール（８５％（容量／容量）－１５％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり３．５ｍＬ）のＩＰ注射によって麻酔を解除した。
【0199】
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔであった。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌをテロメラーゼ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。ウイルスベクターを尾部注射により静脈内（ＩＶ）投与した。
【0200】
試験系
８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに、ブレオマイシン（Sigma-Aldrich １５３６１）溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）を気管内注入により接種して、マウスにおいて肺線維症を誘発した（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。フェンタニル、メデトミジン、及びミダゾラム（４０％（容量／容量）－２０％（容量／容量）－４０％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり５ｍＬ）を腹腔内（ＩＰ）注射することによってマウスを麻酔した。ナロキソン及びアチパメゾール（８５％（容量／容量）－１５％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり３．５ｍＬ）のＩＰ注射によって麻酔を解除した。
８週齢のＧ３－Ｔｅｒｔ－／－雄マウスに、ブレオマイシン（Sigma-Aldrich １５３６１）溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ）を気管内注入により接種して、マウスにおいて肺線維症を誘発した（体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇ）。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。フェンタニル、メデトミジン、及びミダゾラム（４０％（容量／容量）－２０％（容量／容量）－４０％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり５ｍＬ）を腹腔内（ＩＰ）注射することによってマウスを麻酔した。ナロキソン及びアチパメゾール（８５％（容量／容量）－１５％（容量／容量））を含む溶液（体重１ｇ当たり３．５ｍＬ）のＩＰ注射によって麻酔を解除した。
【0201】
ブレオ傷害の３週間後、各マウスについてＣＴを実施して、真正の肺線維症パターンを診断した。肺線維症と診断されたマウスに、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔのいずれかをＩＶ投与した。ブレオマイシン傷害の前に、各マウスについて初期ＣＴを実施して、ベースラインでの健康な肺の容積を計算し、疾患の進行を更に計算した。ＡＡＶ９処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に、疾患の進行をＣＴによって長期的に追跡調査した。ウイルス処置の８週間後に、マウスを生化学的研究及び組織病理学的研究のために屠殺する。
【0202】
実験プロトコル
この作業の目的は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターと比較して、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔによって媒介される肺線維症の退縮における治療有効性に対処することであった。８週間後、動物を屠殺し、試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を採取した。ｑＰＣＲ又はＴＲＡＰによって分析される組織試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の組織試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋する。組織試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を、テロメラーゼ発現（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）及び活性（ＴＲＡＰ）レベルの比較分析用に収集した。毒性評価用にもマウス組織のパラフィンブロックを収集する。肺の免疫組織病理学的研究を、免疫組織化学染色及び免疫蛍光染色によって実施した。さらに、テロメア長の研究を、クララ細胞及び肺胞ＩＩ型細胞において定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ｑ－Ｆｉｓｈ）によって実施した。
この作業の目的は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターと比較して、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔによって媒介される肺線維症の退縮における治療有効性に対処することであった。８週間後、動物を屠殺し、試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を採取した。ｑＰＣＲ又はＴＲＡＰによって分析される組織試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の組織試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋する。組織試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を、テロメラーゼ発現（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）及び活性（ＴＲＡＰ）レベルの比較分析用に収集した。毒性評価用にもマウス組織のパラフィンブロックを収集する。肺の免疫組織病理学的研究を、免疫組織化学染色及び免疫蛍光染色によって実施した。さらに、テロメア長の研究を、クララ細胞及び肺胞ＩＩ型細胞において定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ｑ－Ｆｉｓｈ）によって実施した。
【0203】
テロメラーゼ発現
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、フォワードプライマー（５’－ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧ－３’）を使用してｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、フォワードプライマー（５’－ＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧ－３’）を使用してｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
【0204】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert et al., Nature Protocols, 2006）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert et al., Nature Protocols, 2006）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
【0205】
免疫組織化学
組織試料を１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンワックス中に包埋し、２．５μｍで切片化した。組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノールから水までの段階的な系列によって再水和した。圧力下で２分間煮沸した１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で処理した脱パラフィン化組織切片において免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。マッソン・トリクローム染色及びピクロシリウスレッド染色を実施して、コラーゲン蓄積物を定量化した。肺切片におけるＳＭＡ、Ｆ４／８０、ｇＨ２ＡＸ、ｐ５３、ｐ２１のＩＨＣ染色を、マウスモノクローナル（１ａ４）ＤＡＫＯ ＩＲ６１１、ラットモノクローナル（ＣＩ：Ａ３－１）ＡＢＤ ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ４９７、マウスモノクローナル（ＪＢＷ３０１）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０５－６３６、ラットモノクローナル（ＰＯＥ３１６ Ａ／Ｅ９）ＣＮＩＯモノクローナル抗体コアユニットＡＭ（ＰＯＥ３１６）、及びラットモノクローナル（２９１Ｈ／Ｂ５）ＣＮＩＯモノクローナル抗体コアユニットをそれぞれ用いて実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡法によって分析した。
組織試料を１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンワックス中に包埋し、２．５μｍで切片化した。組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノールから水までの段階的な系列によって再水和した。圧力下で２分間煮沸した１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で処理した脱パラフィン化組織切片において免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。マッソン・トリクローム染色及びピクロシリウスレッド染色を実施して、コラーゲン蓄積物を定量化した。肺切片におけるＳＭＡ、Ｆ４／８０、ｇＨ２ＡＸ、ｐ５３、ｐ２１のＩＨＣ染色を、マウスモノクローナル（１ａ４）ＤＡＫＯ ＩＲ６１１、ラットモノクローナル（ＣＩ：Ａ３－１）ＡＢＤ ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ４９７、マウスモノクローナル（ＪＢＷ３０１）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ０５－６３６、ラットモノクローナル（ＰＯＥ３１６ Ａ／Ｅ９）ＣＮＩＯモノクローナル抗体コアユニットＡＭ（ＰＯＥ３１６）、及びラットモノクローナル（２９１Ｈ／Ｂ５）ＣＮＩＯモノクローナル抗体コアユニットをそれぞれ用いて実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡法によって分析した。
【0206】
ｉｍｍｎｏ ｑ－Ｆｉｓｈ
肺切片におけるプロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）及びセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）の免疫染色を、ウサギポリクローナル抗ｐｒｏＳＰ－Ｃ（Merck、ＡＢ３７８６）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗ＣＣ１０（Santa Cruz、ｓｃ－３６５９９２）を用いて実施した。免疫染色後、４％のパラホルムアルデヒドでの２０分間の固定を行った後に、定量的テロメア蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ｑ－Ｆｉｓｈ）により肺胞ＩＩ型細胞及びクララ細胞におけるテロメア長を分析する。
肺切片におけるプロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）及びセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）の免疫染色を、ウサギポリクローナル抗ｐｒｏＳＰ－Ｃ（Merck、ＡＢ３７８６）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗ＣＣ１０（Santa Cruz、ｓｃ－３６５９９２）を用いて実施した。免疫染色後、４％のパラホルムアルデヒドでの２０分間の固定を行った後に、定量的テロメア蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ｑ－Ｆｉｓｈ）により肺胞ＩＩ型細胞及びクララ細胞におけるテロメア長を分析する。
【0207】
データの分析及び管理
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
【0208】
結果
合計４８匹のマウスに体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇのブレオマイシンを投与した。３週間後にＣＴを実施したところ、肺線維症と診断された（図１５）。２４匹のマウスは、線維化表現型と一致する異常なＣＴパターンを示した。肺線維症と診断されたマウス（ｎ＝２４）に、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝７）、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝８）、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝９）のいずれかをＩＶ投与した。
合計４８匹のマウスに体重１Ｋｇ当たり０．７ｍｇのブレオマイシンを投与した。３週間後にＣＴを実施したところ、肺線維症と診断された（図１５）。２４匹のマウスは、線維化表現型と一致する異常なＣＴパターンを示した。肺線維症と診断されたマウス（ｎ＝２４）に、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝７）、２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝８）、又は２×１０１２個のｖｇのＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝９）のいずれかをＩＶ投与した。
【0209】
分子イメージングの結果
ＡＡＶ９処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に、疾患の進行をＣＴによって長期的に追跡調査した（図１５）。ＡＡＶ９処置の６週間後と８週間後との間に罹患容積の変化は検出されなかったことから、これは疾患が慢性化していることを示している。したがって、処置の最初の６週間の間に罹患容積の減少速度を計算した。罹患肺容積の減少速度は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔの両方の処置において同様であり、コントロール群よりも早く減少した（図１１Ａ、図１１Ｂ）。処置８週間後にマウスを屠殺し、免疫組織化学及び発現／活性分析用にホルマリン組織試料及び新鮮な組織試料（肝臓、心臓、脳、及び肺）を採取した。
ＡＡＶ９処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び８週間後に、疾患の進行をＣＴによって長期的に追跡調査した（図１５）。ＡＡＶ９処置の６週間後と８週間後との間に罹患容積の変化は検出されなかったことから、これは疾患が慢性化していることを示している。したがって、処置の最初の６週間の間に罹患容積の減少速度を計算した。罹患肺容積の減少速度は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔの両方の処置において同様であり、コントロール群よりも早く減少した（図１１Ａ、図１１Ｂ）。処置８週間後にマウスを屠殺し、免疫組織化学及び発現／活性分析用にホルマリン組織試料及び新鮮な組織試料（肝臓、心臓、脳、及び肺）を採取した。
【0210】
組織病理学的分析の結果
マウス病理学者が組織病理学的分析を盲目的に実施した。全ての肺試料に肺線維症の組織学的スコアを与えた。シリウスレッドで染色された１０視野（２００倍）の分析に基づく肺線維症の半定量的スコア付け（グレード０～グレード４）（Lawson et al, 2005, 2011、Degryse AL et al 2012）（図１６）。各グレードの定義は以下の通りである：
グレード０：正常な肺構造、
グレード１：肺胞間中隔の一部（５０％以下）の厚さの増加、
グレード２：線維化病変の形成を伴わない肺胞間中隔の５０％超の肥厚化、
グレード３：孤立した線維化病変の形成を伴う肺胞間中隔の肥厚化、
グレード４：実質構造の全体的又は準全体的な歪みを伴う多数の線維化病変。
マウス病理学者が組織病理学的分析を盲目的に実施した。全ての肺試料に肺線維症の組織学的スコアを与えた。シリウスレッドで染色された１０視野（２００倍）の分析に基づく肺線維症の半定量的スコア付け（グレード０～グレード４）（Lawson et al, 2005, 2011、Degryse AL et al 2012）（図１６）。各グレードの定義は以下の通りである：
グレード０：正常な肺構造、
グレード１：肺胞間中隔の一部（５０％以下）の厚さの増加、
グレード２：線維化病変の形成を伴わない肺胞間中隔の５０％超の肥厚化、
グレード３：孤立した線維化病変の形成を伴う肺胞間中隔の肥厚化、
グレード４：実質構造の全体的又は準全体的な歪みを伴う多数の線維化病変。
【0211】
結果を図１６に表す。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ処置されたコントロール群は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ処置群及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔ処置群の両方と比較して２倍高いＰＦスコアを示した（図１７Ａ）。注目すべきことに、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ処置群とＡＡＶ９－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔ処置群との間に有意差は観察されなかったことから、これは両方のベクターが線維化表現型の回復において同等に有効であったことを示している。これらの結果は、処置８週間後のＣＴ値と一致している（図１７Ｂ）。実際、ＣＴ値とＰＦスコアとの間のピアソン相関分析は、有意性の高い相関を示している（ｐ＜０．０００１）（図１７Ｃ）。
【0212】
全ての器官の完全な組織病理学的分析も実施したところ、８週間の処置時間窓においてテロメラーゼ遺伝子療法の二次的効果がないことが明らかになった。病理学的所見を表２に記載する。観察された肺炎はブレオマイシン処置によって誘発されたものである。一部のマウスで肝臓、腎臓、及び腸において観察される病理は散発的であり、マウスにおいて共通している。精巣における尿細管萎縮はテロメラーゼ欠損マウスに特徴的である。
【0213】
【0214】
テロメラーゼ発現及びテロメラーゼ活性の結果
肺試料においてテロメラーゼの発現レベル（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）及び活性（ＴＲＡＰ）を測定した。結果は、未処置動物と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔのどちらで処置された動物においても、より高いＴｅｒｔ発現及びより高いテロメラーゼ活性を示している（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
肺試料においてテロメラーゼの発現レベル（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）及び活性（ＴＲＡＰ）を測定した。結果は、未処置動物と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔのどちらで処置された動物においても、より高いＴｅｒｔ発現及びより高いテロメラーゼ活性を示している（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。
【0215】
肝臓試料、心臓試料、及び脳試料においてテロメラーゼの発現レベル（ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）（図１８Ａ～図１８Ｃ）及び活性（ＴＲＡＰ）を測定した（図１９Ａ～図１９Ｃ）。テロメラーゼは、肝臓においてＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔの両方のベクターで検出され、心臓においてはＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔのみで検出された。脳試料において、テロメラーゼは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔの両方のベクターで検出されたが、他の分析された組織と比較して非常に低いレベルであった。処置８週間後に、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｔｅｒｔを感染させた肝臓試料を唯一の例外として、肝臓、心臓、及び脳において３つのベクター間でテロメラーゼ活性の有意差は検出されなかった（図１９Ａ～図１９Ｃ）。結果は、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴが心臓でも脳でも発現していないことを裏付けている。
【0216】
定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）によるテロメア長の分析
ＡＴＩＩ細胞の特異抗体である抗ＳＰＣ及びテロメアプローブを用いたｉｍｍｕｎｅ－ｑ－Ｆｉｓｈを実施して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝６）処置マウス、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウスの肺切片におけるテロメア強度を定量化した。アッセイの代表的な画像を図１３に示す。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ群及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ群の両者は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ処置群と比較して、ＡＴＩＩ細胞において平均核強度及び平均スポット強度の増加を示した（図１３）。さらに、短いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより低かった（図１３）。長いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより高かった（図１３）。これらの結果は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍｏＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置された肺における真正のテロメア長の増加を示している。
ＡＴＩＩ細胞の特異抗体である抗ＳＰＣ及びテロメアプローブを用いたｉｍｍｕｎｅ－ｑ－Ｆｉｓｈを実施して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝６）処置マウス、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウスの肺切片におけるテロメア強度を定量化した。アッセイの代表的な画像を図１３に示す。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ群及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ群の両者は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ処置群と比較して、ＡＴＩＩ細胞において平均核強度及び平均スポット強度の増加を示した（図１３）。さらに、短いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより低かった（図１３）。長いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上）は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料と比較して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔにおいてより高かった（図１３）。これらの結果は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍｏＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴで処置された肺における真正のテロメア長の増加を示している。
【0217】
クララ細胞の特異抗体である抗ＣＣ１０及びテロメアプローブを用いたｉｍｍｕｎｅ－ｑ－Ｆｉｓｈを実施して、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（ｎ＝６）処置マウス、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウス、及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（ｎ＝７）処置マウスの肺切片におけるテロメア強度を定量化した。アッセイの代表的な画像を図２０に示す。３つの群の中で、平均核強度、平均スポット強度、短いテロメア（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の２０パーセンタイルより下）又は長いテロメアのパーセンテージ（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロール試料の８０パーセンタイルより上）のいずれにおいても、差異は検出されなかった（図２１Ａ～図２１Ｄ）。これらの結果は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴｅｒｔベクターもＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔベクターもクララ細胞においては発現されないことを示している。
【0218】
免疫組織化学分析の結果
エンドポイント（ＡＡＶ９処置の８週間後）での肺の組織学的検査により、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置された肺が、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロールと比較して、より少ないコラーゲン蓄積、活性化筋線維芽細胞（ＳＭＡ）の存在の減少、及びより少ないマクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）を表すことが示された（図２２）。さらに、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置された肺では、より少ない数の損傷細胞（ｇＨ２ＡＸ陽性細胞）、したがって、ｐ５３陽性細胞及びｐ２１陽性細胞の数の減少が示された（図２３）。
エンドポイント（ＡＡＶ９処置の８週間後）での肺の組織学的検査により、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置された肺が、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌコントロールと比較して、より少ないコラーゲン蓄積、活性化筋線維芽細胞（ＳＭＡ）の存在の減少、及びより少ないマクロファージ浸潤（Ｆ４／８０）を表すことが示された（図２２）。さらに、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置された肺では、より少ない数の損傷細胞（ｇＨ２ＡＸ陽性細胞）、したがって、ｐ５３陽性細胞及びｐ２１陽性細胞の数の減少が示された（図２３）。
【0219】
結論
Ｔｅｒｔ処置マウスにおけるエンドポイントでのより少ない線維化病変、
活性化された線維芽細胞の存在及びマクロファージ浸潤（ＳＭＡ及びＦ４／８０）の減少、
ＤＮＡ損傷の減少及びＤＤＲの減弱、
ＡＴＩＩ細胞数の増加、
ｉｍｍｎｏ ｑＦＩＳＨ Ｓｐｃ／Ｔｅｌ及びＣＣ１０／Ｔｅｌ。Ｔｅｒｔ処置マウスにおけるＡＴＩＩ細胞中のより長いテロメア。クララ細胞におけるテロメア長に影響なし。
Ｔｅｒｔ処置マウスにおけるエンドポイントでのより少ない線維化病変、
活性化された線維芽細胞の存在及びマクロファージ浸潤（ＳＭＡ及びＦ４／８０）の減少、
ＤＮＡ損傷の減少及びＤＤＲの減弱、
ＡＴＩＩ細胞数の増加、
ｉｍｍｎｏ ｑＦＩＳＨ Ｓｐｃ／Ｔｅｌ及びＣＣ１０／Ｔｅｌ。Ｔｅｒｔ処置マウスにおけるＡＴＩＩ細胞中のより長いテロメア。クララ細胞におけるテロメア長に影響なし。
【0220】
実施例３．気管内送達経路の評価、並びに肺を遺伝子操作するのに最良のＡＡＶ血清型及びプロモーターの選択
気道へのＡＡＶベクターの局所送達は、鼻腔内投与又は気管内投与を介して報告されている（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Lisa A Santry. BMC Biotechnol. 2017 May 15;17(1):43、Laura P. van Lieshout, Methods Mol Biol. 2019;1950:361-372、Katz, MG. et al. J Cardiovasc Dev Dis. 2019 Feb 15;6(1):8、Kang, M. et al., Nat Commun. 2020 Aug6;11(1):3929）。中和抗体の開発は、ウイルスベクターを含む全ての遺伝子療法にとって重要な障壁である。この意味において、肺は反復投与が可能な器官の１つである。この点に関して、嚢胞性線維症（ＣＦ）に罹患しているマウス、ウサギ、非ヒト霊長類、及び患者における気道への局所送達に際してのＡＡＶベクターの再投与が報告されている（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Guggino, BW., et al. Expert OpinBiolTher. 2017 Oct;17(10):1265-1273）。高レベルの血清循環中和抗体が存在する場合でも最初の曝露から早ければ１ヶ月後に再投与は可能であり、全体的な導入遺伝子発現への影響は最小限であった（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Guggino, BW., et al. Expert OpinBiolTher. 2017 Oct;17(10):1265-1273）。
気道へのＡＡＶベクターの局所送達は、鼻腔内投与又は気管内投与を介して報告されている（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Lisa A Santry. BMC Biotechnol. 2017 May 15;17(1):43、Laura P. van Lieshout, Methods Mol Biol. 2019;1950:361-372、Katz, MG. et al. J Cardiovasc Dev Dis. 2019 Feb 15;6(1):8、Kang, M. et al., Nat Commun. 2020 Aug6;11(1):3929）。中和抗体の開発は、ウイルスベクターを含む全ての遺伝子療法にとって重要な障壁である。この意味において、肺は反復投与が可能な器官の１つである。この点に関して、嚢胞性線維症（ＣＦ）に罹患しているマウス、ウサギ、非ヒト霊長類、及び患者における気道への局所送達に際してのＡＡＶベクターの再投与が報告されている（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Guggino, BW., et al. Expert OpinBiolTher. 2017 Oct;17(10):1265-1273）。高レベルの血清循環中和抗体が存在する場合でも最初の曝露から早ければ１ヶ月後に再投与は可能であり、全体的な導入遺伝子発現への影響は最小限であった（Limberis, MP., et al. Proc Natl AcadSci U S A 2006 Aug 29;103(35):12993-8、Guggino, BW., et al. Expert OpinBiolTher. 2017 Oct;17(10):1265-1273）。
【0221】
この実施例の目的
気管内局所投与経路によるＡＡＶ９血清型及びＡＡＶ６血清型の肺形質導入効率、
ＡＡＶ６血清型対ＡＡＶ９血清型の肺指向性、
ＣＭＶプロモーターとＳｐＢプロモーターとの間の比較研究、
様々なウイルス力価による肺形質導入効率、
ＳｐＢプロモーターの生体内分布及び組織特異性。
気管内局所投与経路によるＡＡＶ９血清型及びＡＡＶ６血清型の肺形質導入効率、
ＡＡＶ６血清型対ＡＡＶ９血清型の肺指向性、
ＣＭＶプロモーターとＳｐＢプロモーターとの間の比較研究、
様々なウイルス力価による肺形質導入効率、
ＳｐＢプロモーターの生体内分布及び組織特異性。
【0222】
研究デザイン
ベクター：
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（配列番号２６は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（配列番号２７は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（配列番号２６は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（配列番号２７は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
ベクター：
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ（配列番号２６は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ（配列番号２７は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ（配列番号２４は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ（配列番号２６は、ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ（配列番号２７は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
【0223】
投与量：
マウス当たり１０１１個のｖｇ、
マウス当たり５×１０１１個のｖｇ、
マウス当たり１０１２個のｖｇ。
マウス当たり１０１１個のｖｇ、
マウス当たり５×１０１１個のｖｇ、
マウス当たり１０１２個のｖｇ。
【0224】
健康な野生型マウスに、上記の用量でベクターを気管内投与した。感染３週間後又は感染９週間後にマウスを屠殺した。右上葉、右中葉、右下葉、大静脈後葉、及び左葉の５つの肺葉においてＧＦＰ発現を評価した。肝臓、心臓、及び脳においてもＧＦＰ発現を評価して、オフターゲット組織に対処した。ＧＦＰ発現を定量的ＰＣＲ及び免疫組織化学によって分析した。図２４において、実験構成を示す。
【0225】
材料及び方法
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰであった。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌを、ＧＦＰ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ、及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰであった。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌを、ＧＦＰ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
【0226】
試験系
遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６Ｊ．ＯｌａＨｓｄの９週齢の野生型マウスに、ウイルスベクターを含む３０ｍＬのＰＢＳ ０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Gibco、参照番号：２４０－０３２、ロット：１８３６６６４）を気管内注入により接種した。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。マウスを酸素中の１％～３％のイソフルランを用いて吸入により麻酔した。
遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６Ｊ．ＯｌａＨｓｄの９週齢の野生型マウスに、ウイルスベクターを含む３０ｍＬのＰＢＳ ０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Gibco、参照番号：２４０－０３２、ロット：１８３６６６４）を気管内注入により接種した。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。マウスを酸素中の１％～３％のイソフルランを用いて吸入により麻酔した。
【0227】
実験プロトコル
この実施例の目的は、次のことに対処することであった：
１．気管内局所投与経路によるＡＡＶ９血清型及びＡＡＶ６血清型の肺形質導入効率、
２．ＡＡＶ６血清型対ＡＡＶ９血清型の肺指向性、
３.ＣＭＶプロモーターとＳｐＢプロモーターとの間の比較研究、
３．様々なウイルス力価による肺形質導入効率、
４．ＳｐＢプロモーターの生体内分布及び組織特異性。
この実施例の目的は、次のことに対処することであった：
１．気管内局所投与経路によるＡＡＶ９血清型及びＡＡＶ６血清型の肺形質導入効率、
２．ＡＡＶ６血清型対ＡＡＶ９血清型の肺指向性、
３.ＣＭＶプロモーターとＳｐＢプロモーターとの間の比較研究、
３．様々なウイルス力価による肺形質導入効率、
４．ＳｐＢプロモーターの生体内分布及び組織特異性。
【0228】
６種の異なるベクター（ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰ、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌ、ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌ）を、３通りの異なるウイルス用量（１０１１、５×１０１１、又は１０１２）で健康な野生型マウスにおいて気管内送達した。合計１２０匹のマウスをこのアッセイに割り当てた。３週間後及び９週間後に、動物を屠殺し、試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を採取した。
【0229】
５種の肺葉を個別に試料採取して、ウイルスの広がりが肺葉間で均一であるかどうかをアッセイした。ｑＰＣＲによって分析される肺試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の肺試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋した。
【0230】
ＧＦＰの転写発現レベルを、フォワードプライマー（５’－ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＴＡＡ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＧＴＣ Ａ－３’）を使用してｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
【0231】
ＧＦＰ、ＳＰＣ、及びＣＣ１０の免疫組織化学検出
組織試料を１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンワックス中に包埋し、２．５μｍで切片化した。組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノールから水までの段階的な系列によって再水和した。圧力下で２分間煮沸した１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で処理した脱パラフィン化組織切片において免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。肺切片、肝臓切片、脳切片、及び心臓切片におけるＧＦＰのＩＨＣ染色を、ウサギモノクローナル（Ｄ５．１）抗ＧＦＰ（１：１００、Cell Signaling Technology）を用いて実施した。肺切片におけるプロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）のＩＨＣ染色を、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）を用いて実施した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）のＩＨＣ染色を、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）を用いて実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡法によって分析した。
組織試料を１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、パラフィンワックス中に包埋し、２．５μｍで切片化した。組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノールから水までの段階的な系列によって再水和した。圧力下で２分間煮沸した１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で処理した脱パラフィン化組織切片において免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。肺切片、肝臓切片、脳切片、及び心臓切片におけるＧＦＰのＩＨＣ染色を、ウサギモノクローナル（Ｄ５．１）抗ＧＦＰ（１：１００、Cell Signaling Technology）を用いて実施した。肺切片におけるプロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）のＩＨＣ染色を、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）を用いて実施した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）のＩＨＣ染色を、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）を用いて実施した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡法によって分析した。
【0232】
データの分析及び管理
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
【0233】
逸脱
計画的又は計画外のどちらのプロトコルからのあらゆる逸脱もこの研究報告書に文書化する。
計画的又は計画外のどちらのプロトコルからのあらゆる逸脱もこの研究報告書に文書化する。
【0234】
計画的逸脱
感染９週間後に屠殺したマウスに対応する肺試料を以下のように採取した。左肺葉をドライアイス上で収集し、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析用に－８０℃で貯蔵した。右葉をホルマリン中で固定し、ＩＨＣ分析用にパラフィン包埋用の単一のカセットに入れた。この逸脱は、異なる肺葉の間でウイルスの広がりに有意差が検出されなかったことを考慮して、感染３週間後のＧＦＰ発現レベルの分析からの結果に基づいて計画された。
感染９週間後に屠殺したマウスに対応する肺試料を以下のように採取した。左肺葉をドライアイス上で収集し、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析用に－８０℃で貯蔵した。右葉をホルマリン中で固定し、ＩＨＣ分析用にパラフィン包埋用の単一のカセットに入れた。この逸脱は、異なる肺葉の間でウイルスの広がりに有意差が検出されなかったことを考慮して、感染３週間後のＧＦＰ発現レベルの分析からの結果に基づいて計画された。
【0235】
結果
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後でのｑ－ＲＴ－ＰＣＲによる肺試料におけるＧＦＰ発現の定量化
感染３週間後の様々な肺葉におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析からの結果を図２５に示す。使用されるどのベクターに関しても、異なる肺葉間でのウイルスの広がりの違いは観察されなかった。したがって、各肺からの５種の異なる肺葉の全てのデータをプールした（図２６Ａ）。図２６Ｂにおいて、感染９週間後の左肺葉におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析に対応するデータを示す。発現レベルは感染３週間後から感染９週間後まで維持された。この観察により、サンプルサイズを増加させるには３週間及び９週間で屠殺したマウスからのデータをプールすることが促された（図２７）。結果は、研究対象の全てのウイルス用量で、ＡＡＶ６血清型がＡＡＶ９血清型よりも高い発現レベルをもたらし、かつＳｐＢプロモーター及びＣＭＶプロモーターが同様の発現レベルを与えることを示している。さらに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇとマウス当たり１０１２個のｖｇとのウイルス力価の間でＧＦＰ発現レベルにおける差異は観察されなかったことから、これはマウス当たり５×１０１１個のｖｇ以下のウイルス力価では感染力が飽和することを示している。
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後でのｑ－ＲＴ－ＰＣＲによる肺試料におけるＧＦＰ発現の定量化
感染３週間後の様々な肺葉におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析からの結果を図２５に示す。使用されるどのベクターに関しても、異なる肺葉間でのウイルスの広がりの違いは観察されなかった。したがって、各肺からの５種の異なる肺葉の全てのデータをプールした（図２６Ａ）。図２６Ｂにおいて、感染９週間後の左肺葉におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析に対応するデータを示す。発現レベルは感染３週間後から感染９週間後まで維持された。この観察により、サンプルサイズを増加させるには３週間及び９週間で屠殺したマウスからのデータをプールすることが促された（図２７）。結果は、研究対象の全てのウイルス用量で、ＡＡＶ６血清型がＡＡＶ９血清型よりも高い発現レベルをもたらし、かつＳｐＢプロモーター及びＣＭＶプロモーターが同様の発現レベルを与えることを示している。さらに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇとマウス当たり１０１２個のｖｇとのウイルス力価の間でＧＦＰ発現レベルにおける差異は観察されなかったことから、これはマウス当たり５×１０１１個のｖｇ以下のウイルス力価では感染力が飽和することを示している。
【0236】
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後でのＩＨＣによる肺試料におけるＧＦＰ陽性細胞の定量化
感染３週間後の様々な肺葉におけるＩＨＣ分析からの結果を図２８に示す。使用されるどのベクターでも、異なる肺葉間でウイルスの広がりの違いは観察されなかったことから、これは肺葉全体にウイルス粒子が均一に分布していることを示している（図２８）。したがって、各肺からの５種の異なる肺葉の全てのデータをプールした（図２９Ａ）。図２９Ｂにおいて、感染９週間後の左肺葉におけるＩＨＣ分析に対応するデータを示す。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、アッセイにおいて３通りの力価で感染９週間後に検出することができなかったＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰを除いて、全てのウイルスベクターで感染３週間後から感染９週間後まで維持された（図２９）。この結果は、研究対象の全てのウイルス用量で、ＡＡＶ６血清型がＡＡＶ９血清型よりも高い肺指向性を示すことを指摘している。また、ＳｐＢプロモーター下でＧＦＰ発現を駆動するウイルスベクターは、血清型とは無関係に、ＣＭＶプロモーターを有するウイルスベクターよりも多くの感染細胞数をもたらす。さらに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇとマウス当たり１０１２個のｖｇとのウイルス力価の間でＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにおける差異は観察されなかったことから、これはマウス当たり５×１０１１個のｖｇ以下のウイルス力価では感染力が飽和することを示している。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、研究対象の３通りのウイルス用量で、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰベクターによる感染の３週間後から９週間後まで維持された。
感染３週間後の様々な肺葉におけるＩＨＣ分析からの結果を図２８に示す。使用されるどのベクターでも、異なる肺葉間でウイルスの広がりの違いは観察されなかったことから、これは肺葉全体にウイルス粒子が均一に分布していることを示している（図２８）。したがって、各肺からの５種の異なる肺葉の全てのデータをプールした（図２９Ａ）。図２９Ｂにおいて、感染９週間後の左肺葉におけるＩＨＣ分析に対応するデータを示す。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、アッセイにおいて３通りの力価で感染９週間後に検出することができなかったＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰを除いて、全てのウイルスベクターで感染３週間後から感染９週間後まで維持された（図２９）。この結果は、研究対象の全てのウイルス用量で、ＡＡＶ６血清型がＡＡＶ９血清型よりも高い肺指向性を示すことを指摘している。また、ＳｐＢプロモーター下でＧＦＰ発現を駆動するウイルスベクターは、血清型とは無関係に、ＣＭＶプロモーターを有するウイルスベクターよりも多くの感染細胞数をもたらす。さらに、マウス当たり５×１０１１個のｖｇとマウス当たり１０１２個のｖｇとのウイルス力価の間でＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージにおける差異は観察されなかったことから、これはマウス当たり５×１０１１個のｖｇ以下のウイルス力価では感染力が飽和することを示している。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、研究対象の３通りのウイルス用量で、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰベクター及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰベクターによる感染の３週間後から９週間後まで維持された。
【0237】
ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ及びＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰで形質導入された肺では、感染９週間後に、ＧＦＰ陽性細胞は非常に少なく、それぞれ全肺細胞の０．３％及び１％を下回ることが明らかになった。
【0238】
研究対象の全てのベクターを用いたマウス当たり１０１２個のｖｇの力価に対応する代表的な画像を図３０に示す。
【0239】
肺試料におけるウイルスベクターの標的となる肺胞ＩＩ型細胞及びクララ細胞の特定及び定量化
本実施例における研究対象の様々なウイルスベクターの標的となる肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴＩＩ）のパーセンテージ及びクララ細胞のパーセンテージを決定するのに、抗ＧＦＰ並びにそれぞれＡＴＩＩ細胞及びクララ細胞に特異的なマーカーである抗ＳｐＣ又は抗ＣＣ１０のいずれかを用いたＩＨＣによる二重染色を実施した。分析された肺は、感染９週間後に屠殺されたマウスに相当する。これらの染色の代表的な画像を図３１及び図３２に示す。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰを感染させた肺は、０．３％を下回るＧＦＰ陽性細胞を示す（図２９Ｂ）。ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰを感染させた肺は、１％を下回るＧＦＰ陽性細胞を示し（図２９Ｂ）、そのいずれもＣＣ１０陽性ではなかったことから、このベクターがクララ細胞を標的としないことを示している。ＧＦＰ陽性細胞は主にＳＰＣ陽性であったが、一部のＧＦＰ陽性細胞はＳＰＣ／ＣＣ１０陰性であることも判明したことから、このベクターがクララ細胞及びＡＴＩＩ細胞以外の他の細胞型も標的とすることを示している。
本実施例における研究対象の様々なウイルスベクターの標的となる肺胞ＩＩ型細胞（ＡＴＩＩ）のパーセンテージ及びクララ細胞のパーセンテージを決定するのに、抗ＧＦＰ並びにそれぞれＡＴＩＩ細胞及びクララ細胞に特異的なマーカーである抗ＳｐＣ又は抗ＣＣ１０のいずれかを用いたＩＨＣによる二重染色を実施した。分析された肺は、感染９週間後に屠殺されたマウスに相当する。これらの染色の代表的な画像を図３１及び図３２に示す。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰを感染させた肺は、０．３％を下回るＧＦＰ陽性細胞を示す（図２９Ｂ）。ＡＡＶ６－ＣＭＶ－ＧＦＰを感染させた肺は、１％を下回るＧＦＰ陽性細胞を示し（図２９Ｂ）、そのいずれもＣＣ１０陽性ではなかったことから、このベクターがクララ細胞を標的としないことを示している。ＧＦＰ陽性細胞は主にＳＰＣ陽性であったが、一部のＧＦＰ陽性細胞はＳＰＣ／ＣＣ１０陰性であることも判明したことから、このベクターがクララ細胞及びＡＴＩＩ細胞以外の他の細胞型も標的とすることを示している。
【0240】
ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰを感染させた肺は、５．７％、４％、及び１０％のＧＦＰ陽性細胞を示し（図２９Ｂ）、そのうちＧＦＰ陽性細胞の１００％がＳＰＣ陽性であったことから、このベクターがＡＴＩＩ細胞のみを標的とすることを示している。
【0241】
３通りのウイルス力価でＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰを形質導入した肺における定量化データを図３３に示す。ＳｐＣ陽性細胞、すなわちＡＴＩＩ細胞のパーセンテージは、分析した３通りのウイルス力価では全肺細胞の１４％～１７％に相当する（図３３Ａ）。全ＡＴＩＩ細胞のうち、３６％、４５％、及び５５％が、それぞれマウス当たり１０１１個のｖｇ、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ、及びマウス当たり１０１２個のｖｇでＧＦＰ陽性であった（図３３Ｂ）。全ＧＦＰ陽性細胞のうち、７３％、７８％、及び７３％ ７８％が、それぞれマウス当たり１０１１個のｖｇ、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ、及びマウス当たり１０１２個のｖｇで陽性のＡＴＩＩ細胞に相当する（図３３Ｃ）。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰの標的となるＣＣ１０陽性細胞、すなわちクララ細胞のパーセンテージは、マウス当たり１０１１個のｖｇ、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ、及びマウス当たり１０１２個のｖｇで、それぞれ７％、１５．５％、及び２０．２％に相当する（図３３Ｄ）。全ＧＦＰ陽性細胞のうち、１１．５％、２１．４％、及び３２．２％がクララ細胞に相当する（図３３Ｅ）。したがって、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ＧＦＰはＡＴＩＩ細胞（およそ８０％）及びクララ細胞（およそ２０％）を標的とする。
【0242】
オフターゲット器官：肝臓、心臓、及び脳へのウイルス指向性
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肝臓及び心臓におけるＩＨＣによるＧＦＰ陽性細胞の定量化
感染３週間後及び感染９週間後の肝臓試料及び心臓試料におけるＩＨＣ分析からの結果を図３４に表す。比較の目的で、肺試料からの結果も示す。どちらの時点でもＧＦＰ陽性細胞が検出されなかったため、ＡＡＶ６血清型は肝臓と心臓とのどちらも標的としなかった。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰは、感染３週間後及び感染９週間後に肝臓においてＧＦＰ陽性細胞をもたらし、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、所与のウイルス力価で、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰよりもＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰでの方が高い。ＧＦＰ陽性細胞の数は、感染３週間後と比較して９週間では大幅に減少した（図３４Ａ、図３４Ｂ）。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰで形質導入されたマウスからの心臓試料において、マウス当たり１０１１個のｖｇ及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇのより高いウイルス力価での感染の３週間後に全心臓細胞の０．１％を下回るごく少数のＧＦＰ陽性細胞しか検出されなかった（図３４Ｃ、図３４Ｄ）。
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肝臓及び心臓におけるＩＨＣによるＧＦＰ陽性細胞の定量化
感染３週間後及び感染９週間後の肝臓試料及び心臓試料におけるＩＨＣ分析からの結果を図３４に表す。比較の目的で、肺試料からの結果も示す。どちらの時点でもＧＦＰ陽性細胞が検出されなかったため、ＡＡＶ６血清型は肝臓と心臓とのどちらも標的としなかった。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰ及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰは、感染３週間後及び感染９週間後に肝臓においてＧＦＰ陽性細胞をもたらし、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージは、所与のウイルス力価で、ＡＡＶ９－ＳｐＢ－ＧＦＰよりもＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰでの方が高い。ＧＦＰ陽性細胞の数は、感染３週間後と比較して９週間では大幅に減少した（図３４Ａ、図３４Ｂ）。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＧＦＰで形質導入されたマウスからの心臓試料において、マウス当たり１０１１個のｖｇ及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇのより高いウイルス力価での感染の３週間後に全心臓細胞の０．１％を下回るごく少数のＧＦＰ陽性細胞しか検出されなかった（図３４Ｃ、図３４Ｄ）。
【0243】
明らかに、これらの結果は、肺細胞、特にＡＴＩＩ細胞及びクララ細胞に対するＳｐＢプロモーターの特異性だけでなく、ＡＡＶ９血清型と比較してＡＡＶ６を使用した場合にオフターゲット器官がより少ないことも裏付けている（図３４Ｅ、図３４Ｆ）。
【0244】
ウイルスベクターによる感染の３週間後及び９週間後での肝臓、心臓、及び脳におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルの定量化
感染３週間後及び感染９週間後での肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルの結果を図３５に示す。これら３つの器官においては、どちらの時点でもＧＦＰ発現は無視することができるほどであった。
感染３週間後及び感染９週間後での肝臓試料、心臓試料、及び脳試料におけるｑ－ＲＴ－ＰＣＲによるＧＦＰ発現レベルの結果を図３５に示す。これら３つの器官においては、どちらの時点でもＧＦＰ発現は無視することができるほどであった。
【0245】
結論
ＡＡＶ６血清型及びＳｐＢプロモーターを更なるアッセイに選択したところ（実施例５及び実施例６を参照）、ＡＡＶ６がＡＡＶ９血清型よりも優れていたが、ＡＡＶ９血清型を更なる分析用に廃棄すべきではない。選択されたウイルス力価はマウス当たり１０１１個のｖｇ及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇであった。ＡＡＶ６血清型及びＳｐＢプロモーターは肺に対して高度に特異的であり、気管内投与した場合にオフターゲット器官において指向性を示さなかった。
ＡＡＶ６血清型及びＳｐＢプロモーターを更なるアッセイに選択したところ（実施例５及び実施例６を参照）、ＡＡＶ６がＡＡＶ９血清型よりも優れていたが、ＡＡＶ９血清型を更なる分析用に廃棄すべきではない。選択されたウイルス力価はマウス当たり１０１１個のｖｇ及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇであった。ＡＡＶ６血清型及びＳｐＢプロモーターは肺に対して高度に特異的であり、気管内投与した場合にオフターゲット器官において指向性を示さなかった。
【0246】
実施例４．研究グレードのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターの生成及び特性評価
この実施例の目的は、研究グレードのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターを生成し、特性評価することであった。このために、プラスミドｐＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ－ｂＧＨを、ｐＲｅｐＣａｐ６及びＡＡＶ血清型６型の生成に必要なヘルパー遺伝子を含むｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションさせた。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターをＰＥＧ沈殿及び二重ＣｓＣｌ勾配によって精製し、ＰＢＳ（２×）＋０．００１％のＰＦ６８中で配合し、滅菌濾過した。精製後に、幾つかの品質属性を決定して、生成されたＡＡＶベクターを特性評価した。
この実施例の目的は、研究グレードのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターを生成し、特性評価することであった。このために、プラスミドｐＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ－ｂＧＨを、ｐＲｅｐＣａｐ６及びＡＡＶ血清型６型の生成に必要なヘルパー遺伝子を含むｐＡｄＨｅｌｐｅｒプラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションさせた。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴベクターをＰＥＧ沈殿及び二重ＣｓＣｌ勾配によって精製し、ＰＢＳ（２×）＋０．００１％のＰＦ６８中で配合し、滅菌濾過した。精製後に、幾つかの品質属性を決定して、生成されたＡＡＶベクターを特性評価した。
【0247】
方法
ＡＡＶベクターの生成
ローラーボトル内の接着性ＨＥＫ－２９３細胞を、トランスフェクション剤としてのＰＥＩ－ＭＡＸ（Polyscience）及び以下のプラスミド：１）ＲＥＰ２遺伝子及びＣＡＰ遺伝子をコードする最適化されたパッケージングプラスミドｐＲＥＰＣＡＰ、２）最小限のプラスミドサイズでＡＡＶベクター生成に必要とされる全てのアデノウイルス機能を提供する、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子をコードする最適化されたアデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ、３）ＡＡＶ２のＩＴＲ配列によって両側が挟まれた発現カセットを含むプラスミドで三重トランスフェクションさせた。
ＡＡＶベクターの生成
ローラーボトル内の接着性ＨＥＫ－２９３細胞を、トランスフェクション剤としてのＰＥＩ－ＭＡＸ（Polyscience）及び以下のプラスミド：１）ＲＥＰ２遺伝子及びＣＡＰ遺伝子をコードする最適化されたパッケージングプラスミドｐＲＥＰＣＡＰ、２）最小限のプラスミドサイズでＡＡＶベクター生成に必要とされる全てのアデノウイルス機能を提供する、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、及びＶＡ－ＲＮＡ遺伝子をコードする最適化されたアデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄＨｅｌｐｅｒ、３）ＡＡＶ２のＩＴＲ配列によって両側が挟まれた発現カセットを含むプラスミドで三重トランスフェクションさせた。
【0248】
トランスフェクションの７２時間後にＨＥＫ－２９３細胞を採取した。細胞を遠心分離によって培地（ＡＡＶベクターを含む）から分離し、超音波処理によって溶解した。溶解した細胞を遠心分離して細胞破片を除去し、上清（ＡＡＶベクターを含む）を保持し、ＡＡＶベクターを含む培地に加えた。次いで、全てのＡＡＶ粒子をＰＥＧ沈殿によって濃縮した（１）。ＡＡＶ－ＰＥＧペレットを再懸濁した後、上清を１００Ｕ／ｍｌの最終濃度でベンゾナーゼ（Merk）により処理した。次に、２回のＣｓＣｌ勾配遠心分離を実施して、完全なＡＡＶカプシドを空のＡＡＶカプシドから分離した。１回目のＣｓＣｌ勾配（不連続勾配、１６時間、スイングバケットローターＳＷ３２（Beckman）、２７０００ｒｐｍ）において、大部分のタンパク質不純物及び空のＡＡＶカプシドから完全なＡＡＶベクターを分離した。２回目の勾配（等密度勾配、４８時間、スイングバケットローターＳＷ４０Ｔｉ（Beckman）、３２０００ｒｐｍ）において、タンパク質不純物、中間種、及び残りの空のＡＡＶカプシドから完全なＡＡＶベクターを分離した。次に、完全なＡＡＶベクターを、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｓｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Life Technologies）を用いて、所望の配合バッファーによって透析した。最後に、ＡＡＶベクターをＭｉｌｌｅｘ ＧＶ ０．２μｍシリンジフィルター（Millipore）を用いて滅菌濾過し、－６０℃未満で貯蔵した。
【0249】
デジタルドロップレットＰＣＲ（digital droplet PCR）によるベクターゲノム力価の定量化
デジタルドロップレットＰＣＲによるベクターゲノム力価の定量化を、Bio RadによるＤｉｇｉｔａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）システムを使用して実施した。ｑＰＣＲ反応の前に、試料を１０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（カタログ番号０４７１６７２８００１、Roche）で消化して、ＡＡＶカプシドの外側に存在する可能性のあるＤＮＡ汚染物質を除去した。次いで、ＳＤＳを０．１％の最終濃度まで加えて７０℃で１時間インキュベートすることによってＡＡＶ粒子を溶解した。次に、ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで加えて、ＤＮＡｓｅＩ活性を阻害した。次いで、試料がこの技術の定量範囲内にほぼ確実に収まるように、試料を１ｍｌ当たり５×１０６個のｖｇまで希釈した。次いで、試料を、蛍光プローブ及びｍｏＴＥＲＴ配列を標的とするプライマー（フォワード：ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧ、リバース：ＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＣ、ＦＡＭ－プローブ：ＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＣＣ）及びＩＴＲ２配列を標的とするプライマー（フォワード：ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ、リバース：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ、ＨＥＸ－プローブ：ＨＥＸ－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＢＢＱ）を含むＰＣＲミックス溶液と混合した。
デジタルドロップレットＰＣＲによるベクターゲノム力価の定量化を、Bio RadによるＤｉｇｉｔａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）システムを使用して実施した。ｑＰＣＲ反応の前に、試料を１０ユニットのＤＮＡｓｅＩ（カタログ番号０４７１６７２８００１、Roche）で消化して、ＡＡＶカプシドの外側に存在する可能性のあるＤＮＡ汚染物質を除去した。次いで、ＳＤＳを０．１％の最終濃度まで加えて７０℃で１時間インキュベートすることによってＡＡＶ粒子を溶解した。次に、ＥＤＴＡを５ｍＭの最終濃度まで加えて、ＤＮＡｓｅＩ活性を阻害した。次いで、試料がこの技術の定量範囲内にほぼ確実に収まるように、試料を１ｍｌ当たり５×１０６個のｖｇまで希釈した。次いで、試料を、蛍光プローブ及びｍｏＴＥＲＴ配列を標的とするプライマー（フォワード：ＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧ、リバース：ＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴＣ、ＦＡＭ－プローブ：ＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＣＣ）及びＩＴＲ２配列を標的とするプライマー（フォワード：ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ、リバース：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ、ＨＥＸ－プローブ：ＨＥＸ－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－ＢＢＱ）を含むＰＣＲミックス溶液と混合した。
【0250】
続いて、プローブに特異的な液滴生成オイル（Droplet Generation Oil）（カタログ番号１８６３００５、Bio Rad）を加え、Bio RadによるＱＸ１００液滴生成装置（Droplet generator）（カタログ番号１８６－３００２）を使用することによって、液滴を形成した。次いで、液滴をＰＣＲプレートに移し、サーモサイクラーに入れ、ＰＣＲ増幅（６０℃で４０サイクル）に供した。最後に、ＱＸ１００液滴リーダー（droplet reader）（カタログ番号：１８６－３００１、Bio Rad）を使用して、液滴を陽性増幅又は陰性増幅について計数した。
【0251】
データ分析を、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアバージョン１．７．４（Bio Rad）を使用して実施した。最終力価を、手順中に行われる様々な希釈でソフトウェアによって提供される１μｌ当たりのコピーの値を補正することによって計算した。
【0252】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによるベクターゲノム力価の定量化
ＡＡＶベクターを、標準としてラムダＤＮＡ（キットに含まれている）を使用した蛍光分析法によるｄｓＤＮＡの濃度の決定を可能にするＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（カタログ番号Ｐ１１４９６、Invitrogen）を使用して定量化した。ＡＡＶベクターを、０．１％のＳＤＳとともに７０℃で１時間インキュベートしてカプシドを溶解するか、又はネガティブコントロールとして０．１％のＳＤＳなしで室温にてインキュベートした。次に、試料を徐々に２５℃まで冷却してｄｓＤＮＡを形成し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー中で希釈した。希釈した試料をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素と混合し、黒色の９６ウェルアッセイプレートへとロードした。蛍光をＳｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Multi-Mode Microplate Reader）を用いて測定した。
ＡＡＶベクターを、標準としてラムダＤＮＡ（キットに含まれている）を使用した蛍光分析法によるｄｓＤＮＡの濃度の決定を可能にするＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡアッセイキット（カタログ番号Ｐ１１４９６、Invitrogen）を使用して定量化した。ＡＡＶベクターを、０．１％のＳＤＳとともに７０℃で１時間インキュベートしてカプシドを溶解するか、又はネガティブコントロールとして０．１％のＳＤＳなしで室温にてインキュベートした。次に、試料を徐々に２５℃まで冷却してｄｓＤＮＡを形成し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー中で希釈した。希釈した試料をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素と混合し、黒色の９６ウェルアッセイプレートへとロードした。蛍光をＳｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Multi-Mode Microplate Reader）を用いて測定した。
【0253】
ベクターゲノム力価を定量化するのに、溶解されたＡＡＶベクターの蛍光シグナルから溶解されていないＡＡＶベクターの蛍光シグナルを差し引いてデルタ蛍光を取得した。Ｌａｍｂｄａ Ｓｔａｎｄａｒｄ段階希釈により作成された標準曲線を使用して、ｒＡＡＶ試料のデルタ蛍光値を補間し、こうしてベクターゲノム濃度をｎｇ／ｍｌで取得した。以下の式を使用して、ベクター力価をｎｇ／ｍｌからｖｇ／ｍｌで計算した：
ｖｇ／ｍｌ＝（ｎｇ／ｍｌ）×１．８５×１０１２×希釈／（ＡＡＶベクターの長さ）。
ｖｇ／ｍｌ＝（ｎｇ／ｍｌ）×１．８５×１０１２×希釈／（ＡＡＶベクターの長さ）。
【0254】
ＡＡＶベクタータンパク質染色の分析
ＡＡＶベクターをＬａｅｍｍｌｉバッファーで９５℃にて５分間処理してカプシドを変性させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、ＡＡＶベクターカプシドを形成するタンパク質と、バッチに混入している可能性のあるタンパク質とを分離した。タンパク質を、シプロルビー染色（Invitrogen）によって染色した。ＡＡＶベクターカプシドを形成する３つのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の存在、それらの正確な割合（同様の強度を有するＶＰ１バンド及びＶＰ２バンド、並びに最も高い強度を有するＶＰ３バンド）、及び不純物の存在を蛍光分析法（Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｇｅｎｅ Ｇｅｎｉｕｓバイオイメージングシステム）によって確認した。
ＡＡＶベクターをＬａｅｍｍｌｉバッファーで９５℃にて５分間処理してカプシドを変性させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、ＡＡＶベクターカプシドを形成するタンパク質と、バッチに混入している可能性のあるタンパク質とを分離した。タンパク質を、シプロルビー染色（Invitrogen）によって染色した。ＡＡＶベクターカプシドを形成する３つのウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）の存在、それらの正確な割合（同様の強度を有するＶＰ１バンド及びＶＰ２バンド、並びに最も高い強度を有するＶＰ３バンド）、及び不純物の存在を蛍光分析法（Ｓｙｎｇｅｎｅ Ｇｅｎｅ Ｇｅｎｉｕｓバイオイメージングシステム）によって確認した。
【0255】
光学密度によるベクターゲノム及びウイルス粒子力価の定量化
２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの試料の吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダーにおいてＴａｋｅ３マイクロボリュームプレートを使用して測定した。ｄｓＤＮＡの吸光係数をｓｓＤＮＡに変更するSommerら（２）によって記載された式に従って、ベクターゲノム及びウイルス粒子の力価を計算した。
ｖｐ／ｖｇ＝ＭＷＤＮＡ×（εｓｓＤＮＡ２６０－εｓｓＤＮＡ２８０×吸光度２６０／吸光度２８０）／（（吸光度２６０／吸光度２８０）×εカプシド２８０－εカプシド２６０））
ｖｇ／ｍｌ＝吸光度２６０×（６．０２×１０２０／（εｓｓＤＮＡ２６０×ＭＷ＋εカプシド２６０×ｖｐ／ｖｇ））、
式中、
εｓｓＤＮＡ２６０（吸光係数ｓｓＤＮＡ２６０）＝２７ｇ－１×Ｌ×ｃｍ－１
εｓｓＤＮＡ２８０（吸光係数ｓｓＤＮＡ２８０）＝１５ｇ－１×Ｌ×ｃｍ－１
ＭＷＤＮＡ（パッケージングされたＤＮＡの分子量）＝ヌクレオチド数×ＭＷヌクレオチド
ＭＷｓｓＤＮＡ＝ｎ゜Ａ×３１２．２Ｄａ＋ｎ゜Ｃ×２８８．２Ｄａ＋ｎ゜Ｇ×３２８．２Ｄａ＋ｎ゜Ｔ×３０３．２Ｄａ
εカプシド２６０（２６０ｎｍでのＡＡＶカプシドのモル吸光係数）
εカプシド２８０（２８０ｎｍでのＡＡＶカプシドのモル吸光係数）。
２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの試料の吸光度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダーにおいてＴａｋｅ３マイクロボリュームプレートを使用して測定した。ｄｓＤＮＡの吸光係数をｓｓＤＮＡに変更するSommerら（２）によって記載された式に従って、ベクターゲノム及びウイルス粒子の力価を計算した。
ｖｐ／ｖｇ＝ＭＷＤＮＡ×（εｓｓＤＮＡ２６０－εｓｓＤＮＡ２８０×吸光度２６０／吸光度２８０）／（（吸光度２６０／吸光度２８０）×εカプシド２８０－εカプシド２６０））
ｖｇ／ｍｌ＝吸光度２６０×（６．０２×１０２０／（εｓｓＤＮＡ２６０×ＭＷ＋εカプシド２６０×ｖｐ／ｖｇ））、
式中、
εｓｓＤＮＡ２６０（吸光係数ｓｓＤＮＡ２６０）＝２７ｇ－１×Ｌ×ｃｍ－１
εｓｓＤＮＡ２８０（吸光係数ｓｓＤＮＡ２８０）＝１５ｇ－１×Ｌ×ｃｍ－１
ＭＷＤＮＡ（パッケージングされたＤＮＡの分子量）＝ヌクレオチド数×ＭＷヌクレオチド
ＭＷｓｓＤＮＡ＝ｎ゜Ａ×３１２．２Ｄａ＋ｎ゜Ｃ×２８８．２Ｄａ＋ｎ゜Ｇ×３２８．２Ｄａ＋ｎ゜Ｔ×３０３．２Ｄａ
εカプシド２６０（２６０ｎｍでのＡＡＶカプシドのモル吸光係数）
εカプシド２８０（２８０ｎｍでのＡＡＶカプシドのモル吸光係数）。
【0256】
アルカリゲル電気泳動によるＡＡＶベクターのゲノムの完全性の決定
ＡＡＶベクターのゲノムの完全性を、一本鎖ＤＮＡを分析することができるアルカリアガロースゲル電気泳動（変性条件）によって評価した。最初に、５×１０１１個のｖｇの各バッチをアルカリローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間煮沸して、ＡＡＶ粒子を溶解させた。次に、ＤＮＡを変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。最後に、バンドのサイズ及び質を検査して、ゲノムの完全性を評価した。同量のベクターゲノムを処理してアルカリアガロースゲルにロードしたが、この技術の特性によりバンド強度に違いが観察される場合がある。バンド強度におけるこれらの推定上の違いにより、ベクター濃度における違いが説明されない場合がある。
ＡＡＶベクターのゲノムの完全性を、一本鎖ＤＮＡを分析することができるアルカリアガロースゲル電気泳動（変性条件）によって評価した。最初に、５×１０１１個のｖｇの各バッチをアルカリローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間煮沸して、ＡＡＶ粒子を溶解させた。次に、ＤＮＡを変性条件下でアガロースゲル電気泳動に供した。最後に、バンドのサイズ及び質を検査して、ゲノムの完全性を評価した。同量のベクターゲノムを処理してアルカリアガロースゲルにロードしたが、この技術の特性によりバンド強度に違いが観察される場合がある。バンド強度におけるこれらの推定上の違いにより、ベクター濃度における違いが説明されない場合がある。
【0257】
ＡＡＶベクターのゲノムは一本鎖ＤＮＡであるが、センス鎖及びアンチセンス鎖（およそ５０％の各鎖）によって形成される。二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡラダー等）又はプラス鎖及びマイナス鎖を有する一本鎖ＤＮＡにより、変性アガロースゲルにおいて、別々に流れるセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応する二重のバンド（又は拡散バンド）が示される場合がある（Eva Hegedues et al., 2009）。
【0258】
ＥＬＩＳＡによるウイルス粒子力価の定量化
ＡＡＶウイルス粒子（完全な粒子及び空の粒子）を、ＡＡＶ力価測定ＥＬＩＳＡキット（ＡＡＶ６力価測定ＥＬＩＳＡキット（AAV6 Titration ELISA kit）、Progen、商品番号ＰＲＡＡＶ６）を用いて定量化した。捕捉抗体は、集合していないカプシドタンパク質には存在しない立体構造エピトープを検出する。このアッセイはサンドイッチＥＬＩＳＡ技術に基づいている。集合したＡＡＶカプシド上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートのストリップ上にコーティングし、これを使用して試料からＡＡＶ粒子を捕捉した。捕捉されたＡＡＶ粒子を２段階で検出した。第一に、ＡＡＶに対するビオチンがコンジュゲートされたモノクローナル抗体を免疫複合体に結合させた。第二に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートがビオチン分子と反応した。基質溶液の添加により呈色反応が起こり、これは特異的に結合したウイルス粒子の量に比例していた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
ＡＡＶウイルス粒子（完全な粒子及び空の粒子）を、ＡＡＶ力価測定ＥＬＩＳＡキット（ＡＡＶ６力価測定ＥＬＩＳＡキット（AAV6 Titration ELISA kit）、Progen、商品番号ＰＲＡＡＶ６）を用いて定量化した。捕捉抗体は、集合していないカプシドタンパク質には存在しない立体構造エピトープを検出する。このアッセイはサンドイッチＥＬＩＳＡ技術に基づいている。集合したＡＡＶカプシド上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートのストリップ上にコーティングし、これを使用して試料からＡＡＶ粒子を捕捉した。捕捉されたＡＡＶ粒子を２段階で検出した。第一に、ＡＡＶに対するビオチンがコンジュゲートされたモノクローナル抗体を免疫複合体に結合させた。第二に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートがビオチン分子と反応した。基質溶液の添加により呈色反応が起こり、これは特異的に結合したウイルス粒子の量に比例していた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【0259】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイ：ｍＲＮＡ発現
この研究では、ＡＡＶベクターによる形質導入の増強を示すため、２ｖ６．１１細胞を使用した。ＨＥＫ２９３細胞から生成されたこの細胞系統においては、Ａｄ５ Ｅ４がエクジソン誘導性プロモーターの制御下で発現され、それによりエクジソン類似体であるポナステロンＡによるＥ４発現の誘導が可能となる。
この研究では、ＡＡＶベクターによる形質導入の増強を示すため、２ｖ６．１１細胞を使用した。ＨＥＫ２９３細胞から生成されたこの細胞系統においては、Ａｄ５ Ｅ４がエクジソン誘導性プロモーターの制御下で発現され、それによりエクジソン類似体であるポナステロンＡによるＥ４発現の誘導が可能となる。
【0260】
感染の前日に、２ｖ６．１１細胞を１ウェル当たり２×１０５個の細胞の密度で２４ウェルプレートに播種した。抗生物質（ペニシリン＝１００００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン＝１００００μｇ／ｍｌ）及び１μｇ／ｍｌのポナステロンＡを補充した成長培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）中で３７℃及び５％ＣＯ２にて細胞を成長させた。
【0261】
感染前に、細胞を明視野顕微鏡で正確な細胞コンフルエンス（７０％～８０％）について評価した。細胞数を決定するのに、４つのウェルの細胞をトリプシン処理し、Ｓｃｅｐｔｅｒ ２．０ハンドヘルド自動セルカウンター（Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter）（Merck-Millipore）を用いて細胞数を定量化した。細胞にＡＡＶ－９５３ベクターを、細胞当たり３２０００個のｖｇ、細胞当たり６４０００個のｖｇ、及び細胞当たり１２８０００個のｖｇのＭＯＩにて感染させた。細胞を三連で感染させた。非感染２ｖ６．１１細胞（ＮＩ）をネガティブコントロールとして使用した。
【0262】
感染４８時間後で、かつ細胞生存率を評価した後に、細胞を５００μｌの１×ＰＢＳで穏やかに洗浄し、３５０μｌのＲＬＴ＋β－メルカプトエタノール（１０μｌ／ｍｌ）（ＲＮｅａｓｙミニキット（RNeasy Mini Kit）、Qiagen）中に収集した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen）及びＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ Ｉ（Qiagen）を用いて、製造業者によって提供されるプロトコルに従って抽出したが、但し、感染したＡＡＶベクターゲノムの適切な分解を確実にするのに、オンカラムＤＮＡｓｅ Ｉ消化を標準の１５分から３０分に延長した。１μｇの各ＲＮＡ試料を、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis kit）（Roche）を使用して逆転写させた。ｑＰＣＲを、プライマー及び２μｌの試料（１／１０希釈）を使用して三連で実施した。発現を定量化するのに、ｍｏＴＥＲＴを標的とするプライマー－プローブミックスを使用した（フォワードプライマー：ＧＧＡ ＡＧＴ ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＧＡ ＣＴＡ ＣＡＧ、リバースプライマー：ＣＡＧ ＣＴＴ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＴＴ、プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＣＴＡＣＧＣＣＣＡ／ＺＥＮ／ＧＡＣＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／）。ハウスキーピング遺伝子ｈＲｐｌｐ０用のプライマー－プローブミックスを使用して正規化した（フォワードプライマー：ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴ、リバースプライマー：ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＡ、プローブ：／５ＨＥＸ／ＡＡ ＣＴＣ ＴＧＣ Ａ／ＺＥＮ／ＴＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＴＧＧ Ａ／３ＩＡＢｋＦＱ）。
【0263】
品質管理：結果
ＡＡＶベクターの生成
バッチＡＡＶ－９５３を生成するのに、５０個のローラーボトルをトランスフェクションさせた。
ＡＡＶベクターの生成
バッチＡＡＶ－９５３を生成するのに、５０個のローラーボトルをトランスフェクションさせた。
【0264】
ＰＥＧ沈殿及び１回目の塩化セシウムの後、バッチＡＡＶ－９５３の２回目のＣｓＣｌ勾配により、完全なベクターに対応する強いバンドが示された（図３６）。空の粒子は１回目の勾配において除去された。
【0265】
ＡＡＶベクターをＰＢＳ（２×）＋０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８中で透析した。滅菌濾過後、２．６９５ｍｌのＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ－ｂＧＨを－８０℃で貯蔵した。
【0266】
デジタルドロップレットＰＣＲによるベクターゲノム力価の定量化
２つの定量化を２つの独立した日に実施した。ＡＡＶベクターを、全てのＡＡＶベクター中に存在する導入遺伝子（ｍｏＴＥＲＴ）及びＩＴＲ２を標的とする二重ｄｄＰＣＲアッセイで定量化した。
２つの定量化を２つの独立した日に実施した。ＡＡＶベクターを、全てのＡＡＶベクター中に存在する導入遺伝子（ｍｏＴＥＲＴ）及びＩＴＲ２を標的とする二重ｄｄＰＣＲアッセイで定量化した。
【0267】
【0268】
【0269】
ＡＡＶベクターの定量化に使用した２つのプライマーセットを用いて同様の力価が得られた。
【0270】
導入遺伝子（ｍｏＴＥＲＴ）を標的とするプライマーセットを用いて得られた力価を選択してバッチの力価として報告し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した。
【0271】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによるベクターゲノム力価の定量化
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイをｄｄＰＣＲアッセイの直交法として使用して、ＡＡＶベクターの力価を決定した。
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイをｄｄＰＣＲアッセイの直交法として使用して、ＡＡＶベクターの力価を決定した。
【0272】
【0273】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイとｄｄＰＣＲアッセイとの間で同様の力価が得られた。
【0274】
ＡＡＶベクタータンパク質染色の分析
ベクターのバッチ純度をシプロルビータンパク質染色によって決定した。ＡＡＶ－９５３バッチタンパク質染色により、３つのウイルス粒子（ＶＰ）及び優れた純度が示された（図３７）。
ベクターのバッチ純度をシプロルビータンパク質染色によって決定した。ＡＡＶ－９５３バッチタンパク質染色により、３つのウイルス粒子（ＶＰ）及び優れた純度が示された（図３７）。
【0275】
ＥＬＩＳＡによるウイルス粒子力価の定量化
Progen製のＡＡＶ６ ＥＬＩＳＡキット（商品番号ＰＲＡＡＶ６）を使用して、ＡＡＶ－９５３バッチのＡＡＶ粒子を定量化した。
Progen製のＡＡＶ６ ＥＬＩＳＡキット（商品番号ＰＲＡＡＶ６）を使用して、ＡＡＶ－９５３バッチのＡＡＶ粒子を定量化した。
【0276】
【0277】
ベクターゲノム及びウイルス粒子の同様の力価が得られたことから、これはバッチが主に完全な粒子から構成されていることを示している。
【0278】
光学密度によるベクターゲノム及びウイルス粒子力価の定量化
光学密度アッセイを、ＡＡＶベクターの力価を決定するｄｄＰＣＲアッセイの直交法、及びウイルス粒子の濃度を決定するＥＬＩＳＡの直交法の両方として使用した。
光学密度アッセイを、ＡＡＶベクターの力価を決定するｄｄＰＣＲアッセイの直交法、及びウイルス粒子の濃度を決定するＥＬＩＳＡの直交法の両方として使用した。
【0279】
【0280】
ベクターゲノム及びウイルス粒子の同様の力価が得られたことから、これはバッチが主に完全な粒子から構成されていることを示している。
【0281】
ＡＡＶベクターのゲノムの完全性の決定
ベクターゲノムの完全性をアルカリアガロースゲルによって決定した（図３８）。ＡＡＶ－９５３バッチは、全長ベクターゲノムに対応する４５００塩基付近に主バンドを示した。
ベクターゲノムの完全性をアルカリアガロースゲルによって決定した（図３８）。ＡＡＶ－９５３バッチは、全長ベクターゲノムに対応する４５００塩基付近に主バンドを示した。
【0282】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイ：ｍＲＮＡ発現
２ｖ６．１１細胞にベクターＡＡＶ－９５３を感染させて、ｍｏＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現を得た。さらに、ｍｏＴＥＲＴの発現レベルはベクター用量（ＭＯＩ）に比例していた（図３９）。
２ｖ６．１１細胞にベクターＡＡＶ－９５３を感染させて、ｍｏＴＥＲＴ ｍＲＮＡの発現を得た。さらに、ｍｏＴＥＲＴの発現レベルはベクター用量（ＭＯＩ）に比例していた（図３９）。
【0283】
本発明において使用されるＡＡＶ６－Ｓｐｂ－ｍｏＴＥＲＴベクターのベクターゲノムの完全性をアルカリアガロースゲルによって決定した（図４０）。ゲノムの完全性の分析により、全長ＡＡＶゲノムに相当するおよそ４．７ｋｂのバンドが明らかになり、欠損したゲノムが存在しないことが更に確認された（図４０）。ＡＡＶ９－Ｓｐｂ－ｍｏＴＥＲＴ、ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴ、及びＡＡＶ９－ＴＮＴ－ｍｏＴＥＲＴに対してなされた観察と同様に（図９Ａ及び図９Ｂ）、ＡＡＶ６－Ｓｐｂ－ｍｏＴＥＲＴにおいて観察された全長ベクターゲノムに対応するバンドの強度が高いほど、サイズ超過したＴＥＲＴをコードする発現カセットを含むＡＡＶベクター（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴ－ＤＮ）と比較して、このＡＡＶ調製物において全長ゲノムの数が多いことが示された（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【0284】
実施例５．健康なマウスにおけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔの気管内投与時の肺におけるテロメラーゼ発現レベルの評価
この実施例において、気管内投与によるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ形質導入マウスにおけるテロメラーゼの発現及び活性を測定し、マウス当たり１０１１個のｖｇとマウス当たり５×１０１１個のｖｇとの間で比較した。
この実施例において、気管内投与によるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ形質導入マウスにおけるテロメラーゼの発現及び活性を測定し、マウス当たり１０１１個のｖｇとマウス当たり５×１０１１個のｖｇとの間で比較した。
【0285】
研究デザイン
ベクター：
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ（配列番号２８は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
ベクター：
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ（配列番号２８は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１は、ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを表す）。
【0286】
投与量：
Ｄ１．マウス当たり１０１１個のｖｇ、
Ｄ２．マウス当たり５×１０１１個のｖｇ。
Ｄ１．マウス当たり１０１１個のｖｇ、
Ｄ２．マウス当たり５×１０１１個のｖｇ。
【0287】
健康な野生型マウス（９週齢）に、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをマウス当たり５×１０１１個のｖｇで、そしてＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔをマウス当たり１×１０１１個のｖｇ及びマウス当たり５×１０１１個のｖｇで気管内投与した。１群当たり１０匹のマウスが含まれていた。感染６週間後にマウスを屠殺した。ウイルスゲノム、テロメラーゼ発現レベル、及びテロメラーゼ活性を肺及びオフターゲット組織において評価した。ＡＡＶ６感染細胞のパーセンテージだけでなくテロメア長も分析した。図４１に実験構成を示す。
【0288】
材料及び方法
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔであった。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをテロメラーゼ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔであった。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをテロメラーゼ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
【0289】
試験系
遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６Ｊ．ＯｌａＨｓｄの９週齢の野生型マウスに、ウイルスベクターを含む３０ｍＬの２×ＰＢＳ ０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Gibco、参照番号：２４０－０３２、ロット：１８３６６６４）を気管内注入により接種した。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。マウスを、酸素中の１％～３％のイソフルランを用いて吸入により麻酔した。
遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６Ｊ．ＯｌａＨｓｄの９週齢の野生型マウスに、ウイルスベクターを含む３０ｍＬの２×ＰＢＳ ０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８（Gibco、参照番号：２４０－０３２、ロット：１８３６６６４）を気管内注入により接種した。注入には、血管内カテーテル（２４ゲージ、０．７５インチ、０．７ｍｍ×１９ｍｍ）を使用した（BD Insyte、参照番号：３８１２１２、ロット：９１４３５８４）。マウスを、酸素中の１％～３％のイソフルランを用いて吸入により麻酔した。
【0290】
実験プロトコル
このアッセイの目的は、次のことに対処することであった：
２種の異なるベクター（ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ）を、２通りの異なるウイルス用量（マウス当たり１０１１個のｖｇ、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ）で健康な野生型マウスにおいて気管内送達した。合計３０匹のマウスをこのアッセイに割り当てた。６週間後、動物を屠殺し、試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を採取した。
ｑＰＣＲによって分析される組織試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の組織試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋した。
このアッセイの目的は、次のことに対処することであった：
２種の異なるベクター（ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ）を、２通りの異なるウイルス用量（マウス当たり１０１１個のｖｇ、マウス当たり５×１０１１個のｖｇ）で健康な野生型マウスにおいて気管内送達した。合計３０匹のマウスをこのアッセイに割り当てた。６週間後、動物を屠殺し、試料（肺、肝臓、心臓、及び脳）を採取した。
ｑＰＣＲによって分析される組織試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の組織試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋した。
【0291】
テロメラーゼ発現
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、セット１及びセット２の２種の異なるプライマーセットを使用したｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されていた。セット２は、フォワードプライマー（５’－ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＴ Ｃ－３’）から構成されていた。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、セット１及びセット２の２種の異なるプライマーセットを使用したｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されていた。セット２は、フォワードプライマー（５’－ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＴ Ｃ－３’）から構成されていた。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
【0292】
ウイルスゲノムの定量化
示された組織からのＤＮＡを、塩析に基づく市販キット（ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット、Epicentre、文献番号１１３・６／２０１２ ＥＰＩＬＩＴ１１３ Ｒｅｖ．Ａ、カタログ番号ＭＣＤ８５２０１）を使用して抽出した。細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２（上記参照）を使用したｑＰＣＲによって分析した。検量線を、ｍｏＴｅｒｔ遺伝子を有する線状化プラスミドの段階希釈によって作成した。
示された組織からのＤＮＡを、塩析に基づく市販キット（ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット、Epicentre、文献番号１１３・６／２０１２ ＥＰＩＬＩＴ１１３ Ｒｅｖ．Ａ、カタログ番号ＭＣＤ８５２０１）を使用して抽出した。細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２（上記参照）を使用したｑＰＣＲによって分析した。検量線を、ｍｏＴｅｒｔ遺伝子を有する線状化プラスミドの段階希釈によって作成した。
【0293】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert et al., Nature Protocols, 2006）及びBlasco et al 1997（Blasco et al., Cell 1997）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert et al., Nature Protocols, 2006）及びBlasco et al 1997（Blasco et al., Cell 1997）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
【0294】
テロメラーゼＲＮＡスコープ
肺形質導入効率を分析するとともに、ｍｏＴｅｒｔを発現する特定の細胞型を特定するのに、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡに特異的なプローブを設計し、ACDBIO（www.acdbio.com）から購入した。プロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）に関して、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する肺胞ＩＩ型細胞のパーセンテージを定量的に分析した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）に関して、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現するクララ細胞のパーセンテージを定量的に分析した。
肺形質導入効率を分析するとともに、ｍｏＴｅｒｔを発現する特定の細胞型を特定するのに、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡに特異的なプローブを設計し、ACDBIO（www.acdbio.com）から購入した。プロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）に関して、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する肺胞ＩＩ型細胞のパーセンテージを定量的に分析した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）に関して、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現するクララ細胞のパーセンテージを定量的に分析した。
【0295】
テロメア長の分析
ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。
ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。
【0296】
データの分析及び管理
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
統計的有意性を対応のない両側検定のスチューデントの検定によって対処する。
【0297】
結果
肺（感染６週間後）
肺におけるテロメラーゼ活性の増加。発現とＴＲＡＰとの間の良好な相関。
肺における２０％を超える細胞のｍｏＴＥＲＴに対する陽性染色（ＲＮＡスコープ）（図４６を参照）。
ＳＰＣ（ＡＴＩＩ細胞）及びＣＣ１０（クララ細胞）による同時染色（図４７を参照）。
テロメア定量化（長さ）。同じ動物における細胞の比較（感染細胞対非感染細胞）。テロメアの延長は平均して４．５％（Ｄ１）、７．５％（Ｄ２）である（図４８を参照）。
平均核強度。テロメア長についての別の読み取り値（７．８％）（図４８を参照）。
スポット数が増加する。短いテロメアの延長（８％～１０％）（図４８を参照）。
テロメアの分布により、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔで形質導入された細胞において、短いテロメアのパーセンテージ（非形質導入細胞の２０％パーセンタイル）が減少し、かつ長いテロメアのパーセンテージ（非形質導入細胞の８０％パーセンタイル）が増加することが示された。さらに、テロメアスポットの数も、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔで形質導入された細胞において、同じマウスにおける形質導入されていない細胞と比較して増加する。これらの結果は、短いテロメアが実際に伸長していることを示している（図４９を参照）。
肺（感染６週間後）
肺におけるテロメラーゼ活性の増加。発現とＴＲＡＰとの間の良好な相関。
肺における２０％を超える細胞のｍｏＴＥＲＴに対する陽性染色（ＲＮＡスコープ）（図４６を参照）。
ＳＰＣ（ＡＴＩＩ細胞）及びＣＣ１０（クララ細胞）による同時染色（図４７を参照）。
テロメア定量化（長さ）。同じ動物における細胞の比較（感染細胞対非感染細胞）。テロメアの延長は平均して４．５％（Ｄ１）、７．５％（Ｄ２）である（図４８を参照）。
平均核強度。テロメア長についての別の読み取り値（７．８％）（図４８を参照）。
スポット数が増加する。短いテロメアの延長（８％～１０％）（図４８を参照）。
テロメアの分布により、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔで形質導入された細胞において、短いテロメアのパーセンテージ（非形質導入細胞の２０％パーセンタイル）が減少し、かつ長いテロメアのパーセンテージ（非形質導入細胞の８０％パーセンタイル）が増加することが示された。さらに、テロメアスポットの数も、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－Ｔｅｒｔで形質導入された細胞において、同じマウスにおける形質導入されていない細胞と比較して増加する。これらの結果は、短いテロメアが実際に伸長していることを示している（図４９を参照）。
【0298】
肝臓
肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏでテロメラーゼ発現は検出されなかった（図４４を参照）。
肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏでテロメラーゼ発現は検出されなかった（図４４を参照）。
【0299】
実施例６．ＡＡＶ６－ＳＰＢ－ＭＯＴＥＲＴの気管内投与時の肺におけるテロメラーゼ発現レベルの評価
この実施例においては、短期及び長期における肺線維症の退縮及び／又は治癒におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の有効性に取り組むことを目的としている。ＰＦ（肺線維症）と診断されたマウスの生存におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の効果。この実施例では、Povedano et al, 2015、非特許文献６において記載されるのと同じ肺線維症のマウスモデルを使用した。実験群当たり２０匹～３０匹の雄マウスを使用した。ＰＦマウスを、マウス当たり５×１０１１個のｖｇの用量のＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔでＩＴ（気管内）処置した。コントロールとして、ＰＦマウスの別のコホートにはＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌベクターをマウス当たり５×１０１１個のｖｇで与えた。ブレオ傷害の３週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、肺線維症の読み取り結果として異常な肺パターンが診断された。
この実施例においては、短期及び長期における肺線維症の退縮及び／又は治癒におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の有効性に取り組むことを目的としている。ＰＦ（肺線維症）と診断されたマウスの生存におけるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の効果。この実施例では、Povedano et al, 2015、非特許文献６において記載されるのと同じ肺線維症のマウスモデルを使用した。実験群当たり２０匹～３０匹の雄マウスを使用した。ＰＦマウスを、マウス当たり５×１０１１個のｖｇの用量のＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔでＩＴ（気管内）処置した。コントロールとして、ＰＦマウスの別のコホートにはＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌベクターをマウス当たり５×１０１１個のｖｇで与えた。ブレオ傷害の３週間後、各マウスについてコンピューター断層撮影（ＣＴ）を実施して、肺線維症の読み取り結果として異常な肺パターンが診断された。
【0300】
肺線維症と診断されたマウスを、気管内投与を使用してＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔベクターで処置した。ＡＡＶ６処置の１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、及び１０週間後に、短期の疾患の進行を長期的に追跡するのにＣＴを実施した。１群当たり１０匹のマウスを生存分析及び長期分析用に残した。肺の免疫組織病理学的研究を免疫組織化学によって実施した。さらに、テロメア長の研究を、定量的蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術（ｑ－Ｆｉｓｈ）によって実施した。Ｔｅｒｔの発現レベルを肺及び肝臓においてｑ－ＰＣＲによって決定し、テロメラーゼ活性をＴＲＡＰ分析によってＨＥＰで評価した。
【0301】
この実施例の目的を以下で次の通りにまとめる：
テロメラーゼ欠損線維症マウスにおける気管内投与によるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ形質導入マウスにおけるテロメラーゼの発現及び活性。
マウス当たり５×１０１１個のｖｇでの健康なマウスと線維症マウスとの間の比較。
テロメアの延長。
ＰＦ（肺線維症）の治療についてのテロメラーゼ遺伝子療法の有効性。
テロメラーゼ欠損線維症マウスにおける気管内投与によるＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ形質導入マウスにおけるテロメラーゼの発現及び活性。
マウス当たり５×１０１１個のｖｇでの健康なマウスと線維症マウスとの間の比較。
テロメアの延長。
ＰＦ（肺線維症）の治療についてのテロメラーゼ遺伝子療法の有効性。
【0302】
研究デザイン
ベクター：
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ（配列番号２８）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１）。
ベクター：
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ（配列番号２８）、
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ（配列番号２１）。
【0303】
投与量：
マウス当たり５×１０１１個のｖｇ。
マウス当たり５×１０１１個のｖｇ。
【0304】
材料及び方法
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔであった。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをテロメラーゼ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
試験物品及びコントロール物品
試験されるウイルスベクターは、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌ及びＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔであった。ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌをテロメラーゼ発現についてのネガティブコントロールとして使用した。
【0305】
ｑＰＣＲによって分析される組織試料をドライアイス上で収集し、免疫組織化学分析用の組織試料をホルマリン中に直接収集して、更にパラフィンブロック内に包埋した。
【0306】
テロメラーゼ発現
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されるプライマーセット１を使用してｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
Ｔｅｒｔの転写発現レベルを、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されるプライマーセット１を使用してｑ－ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。ＲＮＡ試料を、トリゾール及びジルコニウムビーズを用いて抽出した。ｃＤＮＡを、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ Ａｄｖ ｃＤＮＡキット（Bio-Rad、参照番号：１７２５０３７、バッチ：６４３７５６９９）を使用して合成した。
【0307】
ウイルスゲノムの定量化
示された組織からのＤＮＡを、沈殿に基づく市販キット（ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット、Epicentre、文献番号１１３・６／２０１２ ＥＰＩＬＩＴ１１３ Ｒｅｖ．Ａ、カタログ番号ＭＣＤ８５２０１）を使用して抽出した。細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２を使用したｑＰＣＲによって分析した。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されている。セット２は、フォワードプライマー（５’－ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＴ Ｃ－３’）から構成されている。検量線を、ｍｏＴｅｒｔ遺伝子を有する線状化プラスミドの段階希釈によって作成した。
示された組織からのＤＮＡを、沈殿に基づく市販キット（ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）ＤＮＡ精製キット、Epicentre、文献番号１１３・６／２０１２ ＥＰＩＬＩＴ１１３ Ｒｅｖ．Ａ、カタログ番号ＭＣＤ８５２０１）を使用して抽出した。細胞当たりのウイルスゲノムの数を、プライマーセット１及びプライマーセット２を使用したｑＰＣＲによって分析した。セット１は、フォワードプライマー（５’－ＴＡＧ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＡＡ ＧＧＡ ＴＡＧ Ａ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｇ－３’）から構成されている。セット２は、フォワードプライマー（５’－ＣＡＣ ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＡＧ ＡＡＧ－３’）及びリバースプライマー（５’－ＣＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＡＴ Ｃ－３’）から構成されている。検量線を、ｍｏＴｅｒｔ遺伝子を有する線状化プラスミドの段階希釈によって作成した。
【0308】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert BS, Hochreiter AE, Wright WE, Shay JW.著の「テロメア反復配列増幅プロトコルを使用したテロメラーゼ活性の非放射性検出（Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.）」 Nat Protoc. 2006;1(3):1583-90. Epub 2007/04/05. doi: 10.1038/nprot.2006.239. PubMed PMID: 17406450）及びBlasco et al 1997（Blasco MA, Lee HW, Hande MP, Samper E, Lansdorp PM, DePinho RA, et al.著の「テロメラーゼＲＮＡを欠いたマウス細胞によるテロメア短縮及び腫瘍形成（Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.）」 Cell. 1997;91(1):25-34. Epub 1997/10/23. doi: 10.1016/s0092-8674(01)80006-4. PubMed PMID: 9335332.）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
テロメラーゼ活性を、Herbert et al., 2006（Herbert BS, Hochreiter AE, Wright WE, Shay JW.著の「テロメア反復配列増幅プロトコルを使用したテロメラーゼ活性の非放射性検出（Nonradioactive detection of telomerase activity using the telomeric repeat amplification protocol.）」 Nat Protoc. 2006;1(3):1583-90. Epub 2007/04/05. doi: 10.1038/nprot.2006.239. PubMed PMID: 17406450）及びBlasco et al 1997（Blasco MA, Lee HW, Hande MP, Samper E, Lansdorp PM, DePinho RA, et al.著の「テロメラーゼＲＮＡを欠いたマウス細胞によるテロメア短縮及び腫瘍形成（Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.）」 Cell. 1997;91(1):25-34. Epub 1997/10/23. doi: 10.1016/s0092-8674(01)80006-4. PubMed PMID: 9335332.）に記載されるテロメア反復配列増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）によって分析した。
【0309】
テロメラーゼＲＮＡスコープ
肺形質導入効率を分析するとともに、ｍｏＴｅｒｔを発現する特定の細胞型を特定するのに、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡに特異的なプローブを設計し、ACDBIO（www.acdbio.com）から購入した。プロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）に関して、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する肺胞ＩＩ型細胞のパーセンテージを定量的に分析した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）に関して、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現するクララ細胞のパーセンテージを定量的に分析した。
肺形質導入効率を分析するとともに、ｍｏＴｅｒｔを発現する特定の細胞型を特定するのに、ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡに特異的なプローブを設計し、ACDBIO（www.acdbio.com）から購入した。プロサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ）に関して、ウサギモノクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＳＰＣ（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する肺胞ＩＩ型細胞のパーセンテージを定量的に分析した。肺切片におけるセクレトグロビンファミリー１Ａメンバー１（ＳＣＧＢ１Ａ１又はＣＣ１０）に関して、ヤギポリクローナル（ＥＰＲ１９８３９）抗ＣＣ１０（１：１００、ABCAM、参照番号：ａｂ２１１３２６）及びｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープによる二重免疫染色を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現するクララ細胞のパーセンテージを定量的に分析した。
【0310】
テロメア長の分析
ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。
ｍｏＴｅｒｔ ＲＮＡスコープ及びテロメアプローブを用いた二重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｑ－Ｆｉｓｈ）を実施して、ｍｏＴｅｒｔを発現する細胞におけるテロメア長を分析した。
【0311】
結果
Ｔｅｒｔノックアウト線維症マウスにおける野生型マウスと比較して同様の形質導入効率。肺における２０％を超える細胞のｍｏＴＥＲＴに対する陽性染色（ＲＮＡスコープ）（図５１）。
Ｔｅｒｔノックアウト線維症マウスにおける野生型マウスと比較して同様のウイルスゲノムのレベル（図５２）。
肝臓においてウイルスゲノムは検出されなかった（図５２）。
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の６週間後及び１１週間後に肺においてテロメラーゼ発現が容易に検出された（図５３）。
肝臓、心臓、及び脳においてテロメラーゼ発現は検出されなかった（図５３）。
Ｔｅｒｔノックアウト線維症マウスにおける野生型マウスと比較して同様の形質導入効率。肺における２０％を超える細胞のｍｏＴＥＲＴに対する陽性染色（ＲＮＡスコープ）（図５１）。
Ｔｅｒｔノックアウト線維症マウスにおける野生型マウスと比較して同様のウイルスゲノムのレベル（図５２）。
肝臓においてウイルスゲノムは検出されなかった（図５２）。
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｍｏＴｅｒｔ処置の６週間後及び１１週間後に肺においてテロメラーゼ発現が容易に検出された（図５３）。
肝臓、心臓、及び脳においてテロメラーゼ発現は検出されなかった（図５３）。
【0312】
実施例７．コドン最適化されたヒトテロメラーゼのコーディング配列の設計及び作製
遺伝子発現を改善し、ヒトＴＥＲＴ導入遺伝子の翻訳効率を高めるのに、ｍＲＮＡ配列を最適化した。コドンは、ｍＲＮＡからタンパク質に情報を伝達する遺伝暗号を表す。この過程はｔＲＮＡのコドン認識によって媒介され、こうして特定のアミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれる。１つの単独のアミノ酸が異なるコドンによってコードされる場合があるため、同じアミノ酸をコードする幾つかのｔＲＮＡが存在する。これにより、種特異的な様式で、同じアミノ酸に対して或るコドンが別のコドンよりも優先的に使用される。この現象はコドンバイアスとして知られている。したがって、特定の種に対するコドン使用の最適化は、導入遺伝子からのタンパク質産生を増加させるのに広く使用されている。さらに、ＧＣ含量、ＲＮＡ二次構造、リピート等のような、コドン最適化アルゴリズムにも組み込まれるタンパク質発現に対して重要な影響を与えるパラメーターも存在する。多くのウェブサイト及びソフトウェアには、様々なアプローチによるコドン最適化アルゴリズムが含まれている。最適化過程の複雑な性質のため、別のものよりも或る特定のものを使用することによる明確な利点はないため、最良のものを特定するには、幾つかの並行した最適化が必要とされる。
遺伝子発現を改善し、ヒトＴＥＲＴ導入遺伝子の翻訳効率を高めるのに、ｍＲＮＡ配列を最適化した。コドンは、ｍＲＮＡからタンパク質に情報を伝達する遺伝暗号を表す。この過程はｔＲＮＡのコドン認識によって媒介され、こうして特定のアミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれる。１つの単独のアミノ酸が異なるコドンによってコードされる場合があるため、同じアミノ酸をコードする幾つかのｔＲＮＡが存在する。これにより、種特異的な様式で、同じアミノ酸に対して或るコドンが別のコドンよりも優先的に使用される。この現象はコドンバイアスとして知られている。したがって、特定の種に対するコドン使用の最適化は、導入遺伝子からのタンパク質産生を増加させるのに広く使用されている。さらに、ＧＣ含量、ＲＮＡ二次構造、リピート等のような、コドン最適化アルゴリズムにも組み込まれるタンパク質発現に対して重要な影響を与えるパラメーターも存在する。多くのウェブサイト及びソフトウェアには、様々なアプローチによるコドン最適化アルゴリズムが含まれている。最適化過程の複雑な性質のため、別のものよりも或る特定のものを使用することによる明確な利点はないため、最良のものを特定するには、幾つかの並行した最適化が必要とされる。
【0313】
ｈｓｏＴＥＲＴ＿ＩＤは変異体１のコドン最適化ツールを使用して生成され、ｈｓｏＴＥＲＴ＿ＧＳは変異体２のコドン最適化ツールを使用して生成され、ｈｓｏＴＥＲＴ＿ＧＡは変異体３のコドン最適化ツールを使用して生成された。最後に、全ての配列は、最終的なＡＡＶベクターにクローニングするのに３’及び５’に特定の制限部位を含み（図５４）、遺伝子合成によって配列される。
【0314】
実施例８．ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｏＴＥＲＴ－ＩＤベクターの特性評価
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｓｏＴＥＲＴ－ＩＤベクターは、完全なベクターの主バンドと、それぞれ中間種及び凝集体に対応し得るより低い沈降係数及びより高い沈降係数の小さなバンドとを示した（図５５）。このバッチには空の粒子は存在しなかった。ベクターゲノムの完全性の分析により、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｓｏＴＥＲＴ－ＩＤベクターが全長ベクターゲノムに対応する４７００付近に主バンドを示すことが明らかになった（図５６）。
ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｓｏＴＥＲＴ－ＩＤベクターは、完全なベクターの主バンドと、それぞれ中間種及び凝集体に対応し得るより低い沈降係数及びより高い沈降係数の小さなバンドとを示した（図５５）。このバッチには空の粒子は存在しなかった。ベクターゲノムの完全性の分析により、ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｈｓｏＴＥＲＴ－ＩＤベクターが全長ベクターゲノムに対応する４７００付近に主バンドを示すことが明らかになった（図５６）。
【0315】
【0316】
配列番号６（ｈｏＴＥＲＴの長いアイソフォーム）
atgcctagag cacctagatg tagagctgtg cggagcctgc tgcggagcca ctatagagaa
gttctgcccc tggccacctt cgtgcgtaga cttggacctc aaggatggcg gctggtgcag
agaggcgatc ctgctgcttt tagagccctg gtggcccagt gtctcgtgtg cgttccatgg
gatgctagac ctccaccagc tgctcccagc ttcagacagg tgtcctgcct gaaagaactg
gtggccagag tgctgcagcg gctgtgtgaa aggggcgcca aaaatgtgct ggccttcggc
tttgctctgc tggatggtgc tagaggcgga cctcctgagg cctttacaac aagcgtgcgg
agctacctgc ctaacaccgt gacagatgcc ctgagaggat ctggcgcttg gggactgctg
ctgagaagag tgggagatga cgtgctggtg catctgctgg ctagatgcgc cctgtttgtg
ctggtggctc ctagctgtgc ctaccaagtc tgtggccctc cactgtatca gctgggcgct
gctacacagg ctagaccacc tccacatgcc agcggaccta gaagaaggct gggctgcgaa
agagcctgga accactctgt tagagaagcc ggcgtgccac tgggattgcc tgcacctggt
gcaagaagaa gaggcggcag cgcctctaga tctctgcctc tgcctaagag gcctcggaga
ggtgctgctc ctgagcctga gagaacacct gttggccaag gctcttgggc ccatcctggc
agaacaagag gccctagcga tagaggcttc tgcgtggtgt ctcctgccag acctgccgag
gaagccacat ctcttgaagg cgccctgagc ggcacaagac actctcaccc atctgtgggc
agacagcacc atgccggacc tccaagcaca agcagaccac ctagaccttg ggacacccct
tgtcctccag tgtacgccga gacaaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaagagcag
ctgaggccta gcttcctgct gtcctctctg aggccatctc tgaccggtgc tcggagactg
gtggaaacca tcttcctggg cagcagacct tggatgcccg gcacacctag aaggctgcct
agactgccac agcggtactg gcaaatgagg cccctgttcc tggaactgct gggcaatcac
gctcagtgcc cttatggcgt gctgctgaaa acccactgtc ctctgagagc cgccgtgaca
ccagcagctg gcgtttgtgc cagagagaag cctcaaggct ctgtggctgc ccctgaggaa
gaggacacag atcctagacg actggtgcag ctcctgcggc agcattctag tccatggcag
gtctacggat tcgtgcgggc ctgtctgaga aggcttgttc ctcctggact gtggggctcc
agacacaacg agcggcggtt tctgcggaac accaagaagt tcatcagcct gggaaagcac
gccaagctga gcctgcaaga gctgacctgg aagatgagcg tgcgggattg tgcatggctg
agaaggtccc caggcgtggg atgtgttcct gccgctgaac acagactgcg ggaagagatc
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgtcc gtgtacgtgg tcgaactgct tcggagcttc
ttctacgtga ccgagacaac cttccagaag aaccggctgt tcttctaccg gaagtccgtg
tggtccaagc tgcagagcat cggcattcgg cagcacctga agagagtgca gctgagagag
ctgagcgagg ctgaagtccg gcagcacaga gaagctagac cagctctgct gaccagcagg
ctgagattca tccccaagcc tgatggcctg cggcctatcg tgaacatgga ctatgttgtg
ggcgccagaa cctttcggag agagaagaga gccgagcggc tgacctctag agtgaaggcc
ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaaggcctg gactgctcgg agcctctgtt
ctgggcctcg acgatatcca cagagcttgg cggacctttg tgctgagagt cagagcccag
gatcctccac ctgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacacaatc
cctcaggaca gactgaccga agtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgt
gtgcggagat acgccgtggt gcagaaagcc gctcatggac atgtgcgcaa ggccttcaag
tcccacgtgt ccacactgac cgacctgcag ccttacatga gacagttcgt ggcccatctg
caagagacaa gccctctgag ggatgccgtg gtcatcgaac agagcagcag cctgaatgag
gccagctccg gcctgtttga cgtgttcctc agattcatgt gccaccacgc cgtgcggatc
agaggcaaga gctatgtgca gtgccagggc attccacagg gcagcatcct gagcacactg
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggaa aacaagctgt tcgccggcat cagacgcgac
ggcctgcttc tgagactggt cgacgatttc ctgctcgtga cccctcacct gacacacgcc
aagacctttc tgagaacact cgtgcggggc gtgccagagt atggctgtgt ggtcaacctg
agaaagaccg tggtcaactt ccccgtcgag gatgaagccc ttggcggcac agctttcgtg
cagatgcctg ctcacggact gttcccttgg tgcggactgc tcctggacac cagaacactg
gaagtgcaga gcgactacag cagctacgcc cggacatcta tcagagccag cctgaccttc
aaccggggct ttaaggccgg cagaaacatg cggagaaagc tgtttggagt gctgcggctg
aagtgccact ctttgtttct ggacctgcaa gtgaacagcc tgcagaccgt gtgcaccaac
atctacaaga ttctgctgct gcaagcctac cggttccacg cctgtgttct gcagctgccc
ttccaccagc aagtgtggaa gaaccctaca ttcttcctgc gcgtgatcag cgacaccgcc
agcctgtgtt actccatcct gaaggccaag aacgccggca tgtctctggg agctaaaggc
gctgctggac ctctgccttc tgaagcagtg cagtggctct gccaccaggc ctttctgctg
aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gctcactgag aacagctcag
acacagctga gcagaaagct gcctggcaca accctgacag ccctggaagc tgcagcaaac
cctgctctgc ccagcgactt caagaccatc ctggattga
atgcctagag cacctagatg tagagctgtg cggagcctgc tgcggagcca ctatagagaa
gttctgcccc tggccacctt cgtgcgtaga cttggacctc aaggatggcg gctggtgcag
agaggcgatc ctgctgcttt tagagccctg gtggcccagt gtctcgtgtg cgttccatgg
gatgctagac ctccaccagc tgctcccagc ttcagacagg tgtcctgcct gaaagaactg
gtggccagag tgctgcagcg gctgtgtgaa aggggcgcca aaaatgtgct ggccttcggc
tttgctctgc tggatggtgc tagaggcgga cctcctgagg cctttacaac aagcgtgcgg
agctacctgc ctaacaccgt gacagatgcc ctgagaggat ctggcgcttg gggactgctg
ctgagaagag tgggagatga cgtgctggtg catctgctgg ctagatgcgc cctgtttgtg
ctggtggctc ctagctgtgc ctaccaagtc tgtggccctc cactgtatca gctgggcgct
gctacacagg ctagaccacc tccacatgcc agcggaccta gaagaaggct gggctgcgaa
agagcctgga accactctgt tagagaagcc ggcgtgccac tgggattgcc tgcacctggt
gcaagaagaa gaggcggcag cgcctctaga tctctgcctc tgcctaagag gcctcggaga
ggtgctgctc ctgagcctga gagaacacct gttggccaag gctcttgggc ccatcctggc
agaacaagag gccctagcga tagaggcttc tgcgtggtgt ctcctgccag acctgccgag
gaagccacat ctcttgaagg cgccctgagc ggcacaagac actctcaccc atctgtgggc
agacagcacc atgccggacc tccaagcaca agcagaccac ctagaccttg ggacacccct
tgtcctccag tgtacgccga gacaaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaagagcag
ctgaggccta gcttcctgct gtcctctctg aggccatctc tgaccggtgc tcggagactg
gtggaaacca tcttcctggg cagcagacct tggatgcccg gcacacctag aaggctgcct
agactgccac agcggtactg gcaaatgagg cccctgttcc tggaactgct gggcaatcac
gctcagtgcc cttatggcgt gctgctgaaa acccactgtc ctctgagagc cgccgtgaca
ccagcagctg gcgtttgtgc cagagagaag cctcaaggct ctgtggctgc ccctgaggaa
gaggacacag atcctagacg actggtgcag ctcctgcggc agcattctag tccatggcag
gtctacggat tcgtgcgggc ctgtctgaga aggcttgttc ctcctggact gtggggctcc
agacacaacg agcggcggtt tctgcggaac accaagaagt tcatcagcct gggaaagcac
gccaagctga gcctgcaaga gctgacctgg aagatgagcg tgcgggattg tgcatggctg
agaaggtccc caggcgtggg atgtgttcct gccgctgaac acagactgcg ggaagagatc
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgtcc gtgtacgtgg tcgaactgct tcggagcttc
ttctacgtga ccgagacaac cttccagaag aaccggctgt tcttctaccg gaagtccgtg
tggtccaagc tgcagagcat cggcattcgg cagcacctga agagagtgca gctgagagag
ctgagcgagg ctgaagtccg gcagcacaga gaagctagac cagctctgct gaccagcagg
ctgagattca tccccaagcc tgatggcctg cggcctatcg tgaacatgga ctatgttgtg
ggcgccagaa cctttcggag agagaagaga gccgagcggc tgacctctag agtgaaggcc
ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaaggcctg gactgctcgg agcctctgtt
ctgggcctcg acgatatcca cagagcttgg cggacctttg tgctgagagt cagagcccag
gatcctccac ctgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacacaatc
cctcaggaca gactgaccga agtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgt
gtgcggagat acgccgtggt gcagaaagcc gctcatggac atgtgcgcaa ggccttcaag
tcccacgtgt ccacactgac cgacctgcag ccttacatga gacagttcgt ggcccatctg
caagagacaa gccctctgag ggatgccgtg gtcatcgaac agagcagcag cctgaatgag
gccagctccg gcctgtttga cgtgttcctc agattcatgt gccaccacgc cgtgcggatc
agaggcaaga gctatgtgca gtgccagggc attccacagg gcagcatcct gagcacactg
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggaa aacaagctgt tcgccggcat cagacgcgac
ggcctgcttc tgagactggt cgacgatttc ctgctcgtga cccctcacct gacacacgcc
aagacctttc tgagaacact cgtgcggggc gtgccagagt atggctgtgt ggtcaacctg
agaaagaccg tggtcaactt ccccgtcgag gatgaagccc ttggcggcac agctttcgtg
cagatgcctg ctcacggact gttcccttgg tgcggactgc tcctggacac cagaacactg
gaagtgcaga gcgactacag cagctacgcc cggacatcta tcagagccag cctgaccttc
aaccggggct ttaaggccgg cagaaacatg cggagaaagc tgtttggagt gctgcggctg
aagtgccact ctttgtttct ggacctgcaa gtgaacagcc tgcagaccgt gtgcaccaac
atctacaaga ttctgctgct gcaagcctac cggttccacg cctgtgttct gcagctgccc
ttccaccagc aagtgtggaa gaaccctaca ttcttcctgc gcgtgatcag cgacaccgcc
agcctgtgtt actccatcct gaaggccaag aacgccggca tgtctctggg agctaaaggc
gctgctggac ctctgccttc tgaagcagtg cagtggctct gccaccaggc ctttctgctg
aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gctcactgag aacagctcag
acacagctga gcagaaagct gcctggcaca accctgacag ccctggaagc tgcagcaaac
cctgctctgc ccagcgactt caagaccatc ctggattga
【0317】
配列番号９（ｈｏＴＥＲＴの短いアイソフォーム）
atgcctcggg ctcctagatg tagagccgtc agaagcctgc tgcggagcca ctatagagag
gtgctgcctc tggccacctt cgtgcgtaga cttggacctc aaggatggcg gctggtgcag
agaggcgatc ctgctgcttt tagagccctg gtggcccagt gtctcgtgtg cgttccatgg
gatgctagac ctccaccagc tgctcccagc ttcagacagg tgtcctgcct gaaagaactg
gtggccaggg tgctgcagag actgtgtgaa aggggcgcca agaacgtgct ggcctttgga
tttgctctgc tggatggcgc tagaggcgga cctcctgagg cctttacaac aagcgtgcgg
agctacctgc ctaacaccgt gacagatgcc ctgagaggat ctggcgcttg gggactgctg
ctgagaagag tgggagatga cgtgctggtg catctgctgg ccagatgcgc tctgtttgtg
ctggtggctc ctagctgcgc ctaccaagtt tgtggccctc cactgtatca gctgggcgct
gctacacagg ctagaccacc tccacatgcc agcggaccta gaagaaggct gggctgcgaa
agagcctgga accactctgt tagagaagcc ggcgtgccac tgggattgcc tgcaccaggt
gcaagaagaa gaggcggcag cgcctctaga tctctgcctc tgcctaagag gcctagaaga
ggggctgccc ctgagcctga gagaacacct gttggccaag gctcttgggc ccatcctggc
agaacaagag gccctagcga tagaggcttc tgcgtggtgt ctcctgccag acctgccgag
gaagccacat ctcttgaagg cgccctgagc ggcacaagac actctcaccc atctgtgggc
agacagcacc atgccggacc tccaagcaca agcagaccac ctagaccttg ggacacccct
tgtcctccag tgtacgccga gacaaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaagagcag
ctgaggccta gcttcctgct gtcctctctg aggccatctc tgaccggtgc tcggagactg
gtggaaacca tcttcctggg cagcagacct tggatgcccg gcacacctag aaggctgcct
agactgccac agcggtactg gcaaatgagg cccctgttcc tggaactgct gggcaatcac
gctcagtgcc cttatggcgt gctgctgaaa acccactgtc ctctgagagc cgccgtgaca
ccagcagctg gcgtttgtgc cagagagaag cctcaaggct ctgtggccgc tcctgaggaa
gaggacacag atcctagacg actggtgcag ctcctgagac agcacagctc tccatggcag
gtctacggat ttgtgcgggc ctgtctgaga aggctcgttc ctcctggact gtggggctcc
agacacaacg agcggcggtt tctgcggaac accaagaagt tcatcagcct gggaaagcac
gccaagctga gcctgcaaga gctgacctgg aagatgagcg tgcgggattg tgcatggctg
agaaggtccc caggcgtggg atgtgttcct gccgctgaac acagactgcg ggaagagatc
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgtcc gtgtacgtgg tcgaactgct tcggagcttc
ttctacgtga ccgagacaac cttccagaag aaccggctgt tcttctaccg gaagtccgtg
tggtccaagc tgcagagcat cggcatccgg cagcatctga agagagtgca gctgagagag
ctgagcgaag ccgaagtgcg gcagcacaga gaagctagac cagctctgct gaccagcagg
ctgagattca tccccaagcc tgatggcctg cggcctatcg tgaacatgga ctatgttgtg
ggcgccagaa cctttcggag agagaagaga gccgagcggc tgacctctag agtgaaggcc
ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaaggccag gactgctggg agcctctgtt
ctgggcctcg acgatatcca cagagcttgg cggacctttg tgctgagagt gcgagcccaa
gatcctccac ctgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacacaatc
cctcaggaca gactgaccga agtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgt
gtgcggagat acgccgtggt gcagaaagcc gctcatggac atgtgcgcaa ggccttcaag
tcccacgtgt ccacactgac cgacctgcag ccttacatga gacagttcgt ggcccatctg
caagagacaa gccctctgag ggatgccgtg gtcatcgaac agagcagcag cctgaatgag
gccagctccg gcctgtttga cgtgttcctc agattcatgt gccaccacgc cgtgcggatc
agaggcaaga gctatgtgca gtgccagggc attcctcagg gcagcatcct gagcacactg
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggaa aacaagctgt tcgccggcat cagacgcgac
ggcctgcttc tgagactggt cgacgatttc ctgctcgtga cccctcacct gacacacgcc
aagacctttc tgagctacgc ccggacctct atcagagcca gcctgacctt caaccggggc
tttaaggccg gcagaaacat gcggagaaag ctgtttggag tgctgcggct gaagtgccac
tctttgtttc tggacctgca agtgaacagc ctgcagaccg tgtgcaccaa catctacaag
attctgctgc tgcaagccta ccggttccac gcctgtgttc tgcagctgcc ctttcaccag
caagtgtgga agaaccctac attcttcctg cgcgtgatca gcgacaccgc cagcctgtgt
tactccatcc tgaaggccaa aaacgccggc atgagcctgg gagctaaagg cgctgctgga
cctctgcctt ctgaagcagt gcagtggctg tgtcaccagg cctttctgct gaagctgacc
cggcacagag tgacatatgt gcctctgctg ggctccctga gaaccgctca aacacagctg
agcagaaagc tgcctggcac aaccctgaca gccctggaag ctgcagcaaa ccctgctctg
cccagcgact tcaagaccat cctggattga
atgcctcggg ctcctagatg tagagccgtc agaagcctgc tgcggagcca ctatagagag
gtgctgcctc tggccacctt cgtgcgtaga cttggacctc aaggatggcg gctggtgcag
agaggcgatc ctgctgcttt tagagccctg gtggcccagt gtctcgtgtg cgttccatgg
gatgctagac ctccaccagc tgctcccagc ttcagacagg tgtcctgcct gaaagaactg
gtggccaggg tgctgcagag actgtgtgaa aggggcgcca agaacgtgct ggcctttgga
tttgctctgc tggatggcgc tagaggcgga cctcctgagg cctttacaac aagcgtgcgg
agctacctgc ctaacaccgt gacagatgcc ctgagaggat ctggcgcttg gggactgctg
ctgagaagag tgggagatga cgtgctggtg catctgctgg ccagatgcgc tctgtttgtg
ctggtggctc ctagctgcgc ctaccaagtt tgtggccctc cactgtatca gctgggcgct
gctacacagg ctagaccacc tccacatgcc agcggaccta gaagaaggct gggctgcgaa
agagcctgga accactctgt tagagaagcc ggcgtgccac tgggattgcc tgcaccaggt
gcaagaagaa gaggcggcag cgcctctaga tctctgcctc tgcctaagag gcctagaaga
ggggctgccc ctgagcctga gagaacacct gttggccaag gctcttgggc ccatcctggc
agaacaagag gccctagcga tagaggcttc tgcgtggtgt ctcctgccag acctgccgag
gaagccacat ctcttgaagg cgccctgagc ggcacaagac actctcaccc atctgtgggc
agacagcacc atgccggacc tccaagcaca agcagaccac ctagaccttg ggacacccct
tgtcctccag tgtacgccga gacaaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaagagcag
ctgaggccta gcttcctgct gtcctctctg aggccatctc tgaccggtgc tcggagactg
gtggaaacca tcttcctggg cagcagacct tggatgcccg gcacacctag aaggctgcct
agactgccac agcggtactg gcaaatgagg cccctgttcc tggaactgct gggcaatcac
gctcagtgcc cttatggcgt gctgctgaaa acccactgtc ctctgagagc cgccgtgaca
ccagcagctg gcgtttgtgc cagagagaag cctcaaggct ctgtggccgc tcctgaggaa
gaggacacag atcctagacg actggtgcag ctcctgagac agcacagctc tccatggcag
gtctacggat ttgtgcgggc ctgtctgaga aggctcgttc ctcctggact gtggggctcc
agacacaacg agcggcggtt tctgcggaac accaagaagt tcatcagcct gggaaagcac
gccaagctga gcctgcaaga gctgacctgg aagatgagcg tgcgggattg tgcatggctg
agaaggtccc caggcgtggg atgtgttcct gccgctgaac acagactgcg ggaagagatc
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgtcc gtgtacgtgg tcgaactgct tcggagcttc
ttctacgtga ccgagacaac cttccagaag aaccggctgt tcttctaccg gaagtccgtg
tggtccaagc tgcagagcat cggcatccgg cagcatctga agagagtgca gctgagagag
ctgagcgaag ccgaagtgcg gcagcacaga gaagctagac cagctctgct gaccagcagg
ctgagattca tccccaagcc tgatggcctg cggcctatcg tgaacatgga ctatgttgtg
ggcgccagaa cctttcggag agagaagaga gccgagcggc tgacctctag agtgaaggcc
ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaaggccag gactgctggg agcctctgtt
ctgggcctcg acgatatcca cagagcttgg cggacctttg tgctgagagt gcgagcccaa
gatcctccac ctgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacacaatc
cctcaggaca gactgaccga agtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgt
gtgcggagat acgccgtggt gcagaaagcc gctcatggac atgtgcgcaa ggccttcaag
tcccacgtgt ccacactgac cgacctgcag ccttacatga gacagttcgt ggcccatctg
caagagacaa gccctctgag ggatgccgtg gtcatcgaac agagcagcag cctgaatgag
gccagctccg gcctgtttga cgtgttcctc agattcatgt gccaccacgc cgtgcggatc
agaggcaaga gctatgtgca gtgccagggc attcctcagg gcagcatcct gagcacactg
ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggaa aacaagctgt tcgccggcat cagacgcgac
ggcctgcttc tgagactggt cgacgatttc ctgctcgtga cccctcacct gacacacgcc
aagacctttc tgagctacgc ccggacctct atcagagcca gcctgacctt caaccggggc
tttaaggccg gcagaaacat gcggagaaag ctgtttggag tgctgcggct gaagtgccac
tctttgtttc tggacctgca agtgaacagc ctgcagaccg tgtgcaccaa catctacaag
attctgctgc tgcaagccta ccggttccac gcctgtgttc tgcagctgcc ctttcaccag
caagtgtgga agaaccctac attcttcctg cgcgtgatca gcgacaccgc cagcctgtgt
tactccatcc tgaaggccaa aaacgccggc atgagcctgg gagctaaagg cgctgctgga
cctctgcctt ctgaagcagt gcagtggctg tgtcaccagg cctttctgct gaagctgacc
cggcacagag tgacatatgt gcctctgctg ggctccctga gaaccgctca aacacagctg
agcagaaagc tgcctggcac aaccctgaca gccctggaag ctgcagcaaa ccctgctctg
cccagcgact tcaagaccat cctggattga
【0318】
配列番号１２（短縮型のＳｐＢプロモーター）
ATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGC
ATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGC
【0319】
配列番号１５（ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖプロモーター）
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTTAACGTTTAAACTTAGACAATGGCAGGACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGTGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCCAGCAGGCTCCTTGAATTC
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTTAACGTTTAAACTTAGACAATGGCAGGACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGTGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCCAGCAGGCTCCTTGAATTC
【0320】
配列番号１６（短縮型のＴＮＴプロモーター）
CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAG
CTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAG
【0321】
配列番号２１（ＡＡＶ－ＳｐＢ－ｍｏＴＥＲＴ組換えアデノ随伴ウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATTCTAGATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATTCTAGATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0322】
配列番号２２（ＡＡＶ９－ＣＭＶｅｎｈ－ＭＬＣ２ｖ－ｍｏＴＥＲＴウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTTAACGTTTAAACTTAGACAATGGCAGGACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGTGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCCAGCAGGCTCCTTGAATTCATTTAAATTCTAGATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTTAACGTTTAAACTTAGACAATGGCAGGACCCAGAGCACAGAGCATCGTTCCCAGGCCAGGCCCCAGCCACTGTCTCTTTAACCTTGAAGGCATTTTTGGGTCTCACGTGTCCACCCAGGCGGGTGTCGGACTTTGAACGGCTCTTACTTCAGAAGAACGGCATGGGGTGGGGGGGCTTAGGTGGCCTCTGCCTCACCTACAACTGCCAAAAGTGGTCATGGGGTTATTTTTAACCCCAGGGAAGAGGTATTTATTGTTCCACAGCAGGGGCCGGCCAGCAGGCTCCTTGAATTCATTTAAATTCTAGATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0323】
配列番号２３（ＡＡＶ９－ＴＮＴ－ｍｏＴｅｒｔウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAGGAATTATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGGATCTGTCGGCAGGAATTATCGCTAGCACGCGTGCCACCATGACAAGAGCCCCTAGATGTCCTGCCGTCAGAAGCCTGCTGAGAAGCAGATACAGAGAAGTGTGGCCCCTGGCCACCTTCGTCAGAAGGCTTGGACCTGAAGGCAGACGGCTGGTTCAACCTGGCGACCCCAAGATCTACAGAACCCTGGTGGCTCAGTGCCTCGTGTGTATGCACTGGGGATCTCAGCCACCTCCTGCCGATCTGAGCTTTCACCAGGTGTCCAGCCTGAAAGAACTGGTGGCCAGAGTGGTGCAGAGACTGTGCGAGAGAAACGAGAGGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGAGCTGCTGAATGAAGCTAGAGGCGGCCCTCCTATGGCCTTCACATCTAGCGTGCGGAGCTACCTGCCTAACACCGTGATCGAGACACTGAGAGTGTCCGGCGCTTGGATGCTGCTGCTGAGCAGAGTGGGAGATGACCTGCTGGTGTACCTGCTGGCTCACTGTGCCCTCTATCTGCTGGTGCCTCCTAGCTGCGCTTACCAAGTGTGCGGAAGCCCTCTGTACCAGATCTGTGCCACCACCGACATCTGGCCTAGCGTGTCCGCTTCCTACAGACCCACAAGACCCGTGGGCAGAAACTTTACCAACCTGAGATTCCTGCAGCAGATCAAGAGCAGCTCCAGGCAAGAGGCCCCTAAGCCTCTTGCTCTGCCTAGCAGAGGCACCAAGAGACACCTGAGCCTGACCAGCACAAGCGTGCCCTCTGCCAAGAAAGCCAGATGCTACCCCGTGCCTAGAGTGGAAGAGGGCCCACATAGACAGGTGCTGCCTACACCTAGCGGCAAGAGCTGGGTTCCATCTCCTGCTAGAAGCCCTGAGGTGCCAACAGCCGAGAAGGACCTGAGCAGCAAGGGCAAAGTGTCCGACCTGTCTCTGAGCGGCAGCGTGTGTTGCAAGCACAAGCCTAGCAGCACCAGCCTGCTGTCCCCACCTAGACAGAACGCTTTCCAGCTGAGGCCCTTTATCGAGACAAGACACTTCCTGTACAGCAGAGGCGACGGCCAAGAGAGACTGAACCCTAGCTTCCTGCTGTCTAACCTGCAGCCTAACCTGACCGGCGCTAGAAGGCTGGTGGAAATCATCTTCCTGGGCAGCAGACCCAGAACCAGCGGACCTCTGTGTAGAACCCACAGACTGAGCAGACGGTACTGGCAGATGAGGCCCCTGTTCCAGCAGCTCCTGGTCAACCATGCCGAGTGTCAGTATGTGCGGCTGCTGAGGTCCCACTGCAGATTCAGAACCGCCAACCAGCAAGTGACAGACGCCCTGAACACAAGCCCTCCACACCTGATGGATCTGCTGAGACTGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTCTACGGCTTTCTGAGAGCCTGTCTGTGCAAGGTGGTGTCCGCATCTCTGTGGGGCACCAGACACAACGAGAGAAGATTCTTCAAGAACCTGAAGAAGTTCATCAGCCTGGGGAAGTACGGCAAGCTGTCCCTGCAAGAACTGATGTGGAAGATGAAGGTCGAGGACTGCCACTGGCTGAGGTCTAGCCCTGGCAAGGATAGAGTGCCTGCCGCTGAGCACAGGCTGAGAGAGAGAATCCTGGCCACATTCCTGTTCTGGCTGATGGACACCTACGTGGTGCAGCTGCTGCGGAGCTTCTTCTACATCACCGAGAGCACCTTCCAGAAGAACCGGCTGTTCTTCTACCGCAAGAGCGTGTGGTCCAAGCTGCAGAGCATCGGCGTCAGACAGCACCTGGAAAGAGTGCGCCTGAGAGAGCTGAGCCAAGAGGAAGTGCGGCACCACCAGGATACCTGGCTGGCCATGCCTATCTGCAGACTGAGATTCATCCCCAAGCCTAACGGCCTGAGGCCTATCGTGAACATGAGCTACAGCATGGGCACTAGAGCCCTGGGCAGAAGAAAGCAGGCCCAGCACTTCACCCAGAGGCTGAAAACCCTGTTCTCCATGCTGAACTACGAGCGGACAAAGCACCCTCATCTGATGGGCTCCTCTGTGCTGGGCATGAACGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTCGTGCTGAGAGTCAGAGCACTGGACCAGACACCTAGAATGTACTTCGTGAAGGCCGACGTGACAGGCGCCTACGATGCTATCCCTCAGGGCAAACTGGTGGAAGTGGTGGCCAACATGATCAGGCACAGCGAGTCCACCTACTGCATCAGACAGTACGCCGTCGTGCGGAGAGACTCTCAGGGACAAGTGCACAAGAGCTTCCGCAGACAAGTGACCACACTGAGCGATCTGCAGCCCTACATGGGCCAGTTTCTGAAGCACCTCCAGGACAGCGACGCCAGCGCTCTGAGAAACTCTGTGGTCATCGAGCAGTCCATCTCCATGAACGAGTCCAGCTCCAGCCTGTTCGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGGCACAGCGTGGTCAAGATCGGCGACAGATGTTACACCCAGTGCCAGGGCATCCCACAGGGAAGCAGTCTGAGCACACTGCTGTGCTCCCTGTGTTTCGGCGACATGGAAAACAAGCTGTTCGCCGAAGTGCAGCGCGACGGACTGCTCCTGAGATTTGTGGACGACTTCCTGCTCGTGACCCCTCACCTGGATCAGGCTAAGACCTTCCTGAGCACCCTGGTGCATGGCGTGCCAGAGTACGGCTGCATGATCAACCTGCAGAAAACCGTGGTCAACTTCCCCGTGGAACCTGGCACTCTTGGAGGCGCTGCTCCTTATCAGCTGCCCGCTCATTGTCTGTTCCCTTGGTGCGGACTGCTGCTGGACACACAGACCCTGGAAGTGTTCTGCGACTACAGCGGCTACGCCCAGACCAGCATCAAGACCAGCCTGACCTTCCAGTCCGTGTTCAAGGCCGGCAAGACCATGAGGAACAAGCTGCTGAGTGTGCTGAGGCTGAAGTGCCACGGCCTGTTTCTGGACCTGCAAGTGAACAGCCTGCAGACCGTGTGCATCAATATCTACAAGATCTTTCTGCTGCAAGCCTACCGGTTCCACGCCTGTGTGATTCAGCTGCCTTTCGACCAGAGAGTGCGGAAGAATCTGACATTCTTTCTGGGCATCATCAGCAGCCAGGCCAGCTGCTGTTACGCCATCCTGAAAGTGAAGAACCCCGGCATGACCCTGAAGGCCTCTGGCAGCTTTCCACCTGAAGCTGCCCATTGGCTGTGCTACCAGGCTTTCCTGCTGAAACTGGCTGCCCACAGCGTGATCTACAAGTGCCTGCTGGGCCCACTGAGAACAGCCCAGAAACTGCTGTGTCGGAAGCTGCCTGAAGCCACAATGACAATCCTGAAGGCTGCCGCCGATCCAGCTCTGAGCACCGACTTCCAGACCATCCTGGACTGAGAATTCGGATCCGATTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0324】
配列番号２４（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｎｕｌｌゲノム及びＡＡＶ６－ＣＭＶ－ｎｕｌｌウイルスゲノム）
GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTGCCTCGAGCAGCGCTGCTCGAGAGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
【0325】
配列番号２５（ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ｍＴＥＲＴウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCATGACCCGCGCTCCTCGTTGCCCCGCGGTGCGCTCTCTGCTGCGCAGCCGATACCGGGAGGTGTGGCCGCTGGCAACCTTTGTGCGGCGCCTGGGGCCCGAGGGCAGGCGGCTTGTGCAACCCGGGGACCCGAAGATCTACCGCACTTTGGTTGCCCAATGCCTAGTGTGCATGCACTGGGGCTCACAGCCTCCACCTGCCGACCTTTCCTTCCACCAGGTGTCATCCCTGAAAGAGCTGGTGGCCAGGGTTGTGCAGAGACTCTGCGAGCGCAACGAGAGAAACGTGCTGGCTTTTGGCTTTGAGCTGCTTAACGAGGCCAGAGGCGGGCCTCCCATGGCCTTCACTAGTAGCGTGCGTAGCTACTTGCCCAACACTGTTATTGAGACCCTGCGTGTCAGTGGTGCATGGATGCTACTGTTGAGCCGAGTGGGCGACGACCTGCTGGTCTACCTGCTGGCACACTGTGCTCTTTATCTTCTGGTGCCCCCCAGCTGTGCCTACCAGGTGTGTGGGTCTCCCCTGTACCAAATTTGTGCCACCACGGATATCTGGCCCTCTGTGTCCGCTAGTTACAGGCCCACCCGACCCGTGGGCAGGAATTTCACTAACCTTAGGTTCTTACAACAGATCAAGAGCAGTAGTCGCCAGGAAGCACCGAAACCCCTGGCCTTGCCATCTCGAGGTACAAAGAGGCATCTGAGTCTCACCAGTACAAGTGTGCCTTCAGCTAAGAAGGCCAGATGCTATCCTGTCCCGAGAGTGGAGGAGGGACCCCACAGGCAGGTGCTACCAACCCCATCAGGCAAATCATGGGTGCCAAGTCCTGCTCGGTCCCCCGAGGTGCCTACTGCAGAGAAAGATTTGTCTTCTAAAGGAAAGGTGTCTGACCTGAGTCTCTCTGGGTCGGTGTGCTGTAAACACAAGCCCAGCTCCACATCTCTGCTGTCACCACCCCGCCAAAATGCCTTTCAGCTCAGGCCATTTATTGAGACCAGACATTTCCTTTACTCCAGGGGAGATGGCCAAGAGCGTCTAAACCCCTCATTCCTACTCAGCAACCTCCAGCCTAACTTGACTGGGGCCAGGAGACTGGTGGAGATCATCTTTCTGGGCTCAAGGCCTAGGACATCAGGACCACTCTGCAGGACACACCGTCTATCGCGTCGATACTGGCAGATGCGGCCCCTGTTCCAACAGCTGCTGGTGAACCATGCAGAGTGCCAATATGTCAGACTCCTCAGGTCACATTGCAGGTTTCGAACAGCAAACCAACAGGTGACAGATGCCTTGAACACCAGCCCACCGCACCTCATGGATTTGCTCCGCCTGCACAGCAGTCCCTGGCAGGTATATGGTTTTCTTCGGGCCTGTCTCTGCAAGGTGGTGTCTGCTAGTCTCTGGGGTACCAGGCACAATGAGCGCCGCTTCTTTAAGAACTTAAAGAAGTTCATCTCGTTGGGGAAATACGGCAAGCTATCACTGCAGGAACTGATGTGGAAGATGAAAGTAGAGGATTGCCACTGGCTCCGCAGCAGCCCGGGGAAGGACCGTGTCCCCGCTGCAGAGCACCGTCTGAGGAGAGGATCCTGGCTACGTTCCTGTTCTGGCTGATGGACACATACGTGGTACAGCTGCTTAGGTCATTCTTTTACATCACAGAGAGCACATTCCAGAAGAACAGGCTCTTCTTCTACCGTAAGAGTGTGTGGAGCAAGCTGCAGAGCATTGGAGTCAGGCAACACCTTGAGAGAGTGCGGCTACGGGAGCTGTCACAAGAGGAGGTCAGGCATCACCAGGACACCTGGCTAGCCATGCCCATCTGCAGACTGCGCTTCATCCCCAAGCCCAACGGCCTGCGGCCCATTGTGAACATGAGTTATAGCATGGGTACCAGAGCTTTGGGCAGAAGGAAGCAGGCCCAGCATTTCACCCAGCGTCTCAAGACTCTCTTCAGCATGCTCAACTATGAGCGGACAAAACATCCTCACCTTATGGGGTCTTCTGTACTGGGTATGAATGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTTGTGCTGCGTGTGCGTGCTCTGGACCAGACACCCAGGATGTACTTTGTTAAGGCAGATGTGACCGGGGCCTATGATGCCATCCCCCCAGGGTAAGCTGGTGGAGGTTGTTGCCAATATGATCAGGCACTCGGAGAGCACGTACTGTATCCGCCAGTATGCAGTGGTCCGGAGAGATAGCCAAGGCCAAGTCCACAAGTCCTTTAGGAGACAGGTCACCACCCTCTCTGACCTCCAGCCATACATGGGCCAGTTCCTTAAGCATCTGCAGGATTCAGATGCCAGTGCACTGAGGAACTCCGTTGTCATCGAGCAGAGCATCTCTATGAATGAGAGCAGCAGCAGCCTGTTTGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGTCACAGTGTCGTAAAGATTGGTGACAGGTGCTATACGCAGTGCCAGGGCATCCCCCAGGGCTCCAGCCTATCCACCCTGCTCTGCAGTCTGTGTTTCGGAGACATGGAGAACAAGCTGTTTGCTGAGGTGCAGCGGGATGGGTTGCTTTTACGTTTTGTTGATGACTTTCTGTTGGTGACGCCTCACTTGGACCAAGCAAAAACCTTCCTCAGCACCCTGGTCCATGGCGTTCCTGAGTATGGGTGCATGATAAACTTGCAGAAGACAGTGGTGAACTTCCCTGTGGAGCCTGGTACCCTGGGTGGTGCAGCTCCATACCAGCTGCCTGCTCACTGCCTGTTTCCCTGGTGTGGCTTGCTGCTGGACACTCAGACTTTGGAGGTGTTCTGTGACTACTCAGGTTATGCCCAGACCTCAATTAAGACGAGCCTCACCTTCCAGAGTGTCTTCAAAGCTGGGAAGACCATGCGGAACAAGCTCCTGTCGGTCTTGCGGTTGAAGTGTCACGGTCTATTTCTAGACTTGCAGGTGAACAGCCTCCAGACAGTCTGCATCAATATATACAAGATCTTCCTGCTTCAGGCCTACAGGTTCCATGCATGTGTGATTCAGCTTCCCTTTGACCAGCGTGTTAGGAAGAACCTCACATTCTTTCTGGGCATCATCTCCAGCCAAGCATCCTGCTGCTATGCTATCCTGAAGGTCAAGAATCCAGGAATGACACTAAAGGCCTCTGGCTCCTTTCCTCCTGAAGCCGCACATTGGCTCTGCTACCAGGCCTTCCTGCTCAAGCTGGCTGCTCATTCTGTCATCTACAAATGTCTCCTGGGACCTCTGAGGACAGCCCAAAAACTGCTGTGCCGGAAGCTCCCAGAGGCGACAATGACCATCCTTAAAGCTGCAGCTGACCCAGCCCTAAGCACAGACTTTCAGACCATTTTGGACTAACCCTGTCTCCTTCCGCTAGATGAACATGGGCATTGTAGCCTCAGCACTCCTGGATCCACGTCACAAGAGGGACTGGTCAGTTGTGAGGCTAGGTCATCCTCCAAACCTCTGTGTCATGGGTGGTATGGGAGATTGTCCCAGTGCCTTGTTTCCTGTAACAGGCTTGATTTCTTTCCTGATGCCCTCAGGGAGGCAGATCCTATCCCTTTTAGTGGCAGGGATCCACTAGCACCAGCACATGAGGAGTGCACCCAGTGCACATGGGCACTGGGACAGTGGACAGGTGTGAGATTCCTGGGCCCTGGAGTCTTTTCACACCTAACCATGGGAGCCTGTCCCAGTACATCAGAGTGCCTCGGAGATGAAAAAGGACATCGAGCCAGTGACCTAAATTACAGCCTGAATATACTCTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATCGATTGAATTCATGACCCGCGCTCCTCGTTGCCCCGCGGTGCGCTCTCTGCTGCGCAGCCGATACCGGGAGGTGTGGCCGCTGGCAACCTTTGTGCGGCGCCTGGGGCCCGAGGGCAGGCGGCTTGTGCAACCCGGGGACCCGAAGATCTACCGCACTTTGGTTGCCCAATGCCTAGTGTGCATGCACTGGGGCTCACAGCCTCCACCTGCCGACCTTTCCTTCCACCAGGTGTCATCCCTGAAAGAGCTGGTGGCCAGGGTTGTGCAGAGACTCTGCGAGCGCAACGAGAGAAACGTGCTGGCTTTTGGCTTTGAGCTGCTTAACGAGGCCAGAGGCGGGCCTCCCATGGCCTTCACTAGTAGCGTGCGTAGCTACTTGCCCAACACTGTTATTGAGACCCTGCGTGTCAGTGGTGCATGGATGCTACTGTTGAGCCGAGTGGGCGACGACCTGCTGGTCTACCTGCTGGCACACTGTGCTCTTTATCTTCTGGTGCCCCCCAGCTGTGCCTACCAGGTGTGTGGGTCTCCCCTGTACCAAATTTGTGCCACCACGGATATCTGGCCCTCTGTGTCCGCTAGTTACAGGCCCACCCGACCCGTGGGCAGGAATTTCACTAACCTTAGGTTCTTACAACAGATCAAGAGCAGTAGTCGCCAGGAAGCACCGAAACCCCTGGCCTTGCCATCTCGAGGTACAAAGAGGCATCTGAGTCTCACCAGTACAAGTGTGCCTTCAGCTAAGAAGGCCAGATGCTATCCTGTCCCGAGAGTGGAGGAGGGACCCCACAGGCAGGTGCTACCAACCCCATCAGGCAAATCATGGGTGCCAAGTCCTGCTCGGTCCCCCGAGGTGCCTACTGCAGAGAAAGATTTGTCTTCTAAAGGAAAGGTGTCTGACCTGAGTCTCTCTGGGTCGGTGTGCTGTAAACACAAGCCCAGCTCCACATCTCTGCTGTCACCACCCCGCCAAAATGCCTTTCAGCTCAGGCCATTTATTGAGACCAGACATTTCCTTTACTCCAGGGGAGATGGCCAAGAGCGTCTAAACCCCTCATTCCTACTCAGCAACCTCCAGCCTAACTTGACTGGGGCCAGGAGACTGGTGGAGATCATCTTTCTGGGCTCAAGGCCTAGGACATCAGGACCACTCTGCAGGACACACCGTCTATCGCGTCGATACTGGCAGATGCGGCCCCTGTTCCAACAGCTGCTGGTGAACCATGCAGAGTGCCAATATGTCAGACTCCTCAGGTCACATTGCAGGTTTCGAACAGCAAACCAACAGGTGACAGATGCCTTGAACACCAGCCCACCGCACCTCATGGATTTGCTCCGCCTGCACAGCAGTCCCTGGCAGGTATATGGTTTTCTTCGGGCCTGTCTCTGCAAGGTGGTGTCTGCTAGTCTCTGGGGTACCAGGCACAATGAGCGCCGCTTCTTTAAGAACTTAAAGAAGTTCATCTCGTTGGGGAAATACGGCAAGCTATCACTGCAGGAACTGATGTGGAAGATGAAAGTAGAGGATTGCCACTGGCTCCGCAGCAGCCCGGGGAAGGACCGTGTCCCCGCTGCAGAGCACCGTCTGAGGAGAGGATCCTGGCTACGTTCCTGTTCTGGCTGATGGACACATACGTGGTACAGCTGCTTAGGTCATTCTTTTACATCACAGAGAGCACATTCCAGAAGAACAGGCTCTTCTTCTACCGTAAGAGTGTGTGGAGCAAGCTGCAGAGCATTGGAGTCAGGCAACACCTTGAGAGAGTGCGGCTACGGGAGCTGTCACAAGAGGAGGTCAGGCATCACCAGGACACCTGGCTAGCCATGCCCATCTGCAGACTGCGCTTCATCCCCAAGCCCAACGGCCTGCGGCCCATTGTGAACATGAGTTATAGCATGGGTACCAGAGCTTTGGGCAGAAGGAAGCAGGCCCAGCATTTCACCCAGCGTCTCAAGACTCTCTTCAGCATGCTCAACTATGAGCGGACAAAACATCCTCACCTTATGGGGTCTTCTGTACTGGGTATGAATGACATCTACAGGACCTGGCGGGCCTTTGTGCTGCGTGTGCGTGCTCTGGACCAGACACCCAGGATGTACTTTGTTAAGGCAGATGTGACCGGGGCCTATGATGCCATCCCCCCAGGGTAAGCTGGTGGAGGTTGTTGCCAATATGATCAGGCACTCGGAGAGCACGTACTGTATCCGCCAGTATGCAGTGGTCCGGAGAGATAGCCAAGGCCAAGTCCACAAGTCCTTTAGGAGACAGGTCACCACCCTCTCTGACCTCCAGCCATACATGGGCCAGTTCCTTAAGCATCTGCAGGATTCAGATGCCAGTGCACTGAGGAACTCCGTTGTCATCGAGCAGAGCATCTCTATGAATGAGAGCAGCAGCAGCCTGTTTGACTTCTTCCTGCACTTCCTGCGTCACAGTGTCGTAAAGATTGGTGACAGGTGCTATACGCAGTGCCAGGGCATCCCCCAGGGCTCCAGCCTATCCACCCTGCTCTGCAGTCTGTGTTTCGGAGACATGGAGAACAAGCTGTTTGCTGAGGTGCAGCGGGATGGGTTGCTTTTACGTTTTGTTGATGACTTTCTGTTGGTGACGCCTCACTTGGACCAAGCAAAAACCTTCCTCAGCACCCTGGTCCATGGCGTTCCTGAGTATGGGTGCATGATAAACTTGCAGAAGACAGTGGTGAACTTCCCTGTGGAGCCTGGTACCCTGGGTGGTGCAGCTCCATACCAGCTGCCTGCTCACTGCCTGTTTCCCTGGTGTGGCTTGCTGCTGGACACTCAGACTTTGGAGGTGTTCTGTGACTACTCAGGTTATGCCCAGACCTCAATTAAGACGAGCCTCACCTTCCAGAGTGTCTTCAAAGCTGGGAAGACCATGCGGAACAAGCTCCTGTCGGTCTTGCGGTTGAAGTGTCACGGTCTATTTCTAGACTTGCAGGTGAACAGCCTCCAGACAGTCTGCATCAATATATACAAGATCTTCCTGCTTCAGGCCTACAGGTTCCATGCATGTGTGATTCAGCTTCCCTTTGACCAGCGTGTTAGGAAGAACCTCACATTCTTTCTGGGCATCATCTCCAGCCAAGCATCCTGCTGCTATGCTATCCTGAAGGTCAAGAATCCAGGAATGACACTAAAGGCCTCTGGCTCCTTTCCTCCTGAAGCCGCACATTGGCTCTGCTACCAGGCCTTCCTGCTCAAGCTGGCTGCTCATTCTGTCATCTACAAATGTCTCCTGGGACCTCTGAGGACAGCCCAAAAACTGCTGTGCCGGAAGCTCCCAGAGGCGACAATGACCATCCTTAAAGCTGCAGCTGACCCAGCCCTAAGCACAGACTTTCAGACCATTTTGGACTAACCCTGTCTCCTTCCGCTAGATGAACATGGGCATTGTAGCCTCAGCACTCCTGGATCCACGTCACAAGAGGGACTGGTCAGTTGTGAGGCTAGGTCATCCTCCAAACCTCTGTGTCATGGGTGGTATGGGAGATTGTCCCAGTGCCTTGTTTCCTGTAACAGGCTTGATTTCTTTCCTGATGCCCTCAGGGAGGCAGATCCTATCCCTTTTAGTGGCAGGGATCCACTAGCACCAGCACATGAGGAGTGCACCCAGTGCACATGGGCACTGGGACAGTGGACAGGTGTGAGATTCCTGGGCCCTGGAGTCTTTTCACACCTAACCATGGGAGCCTGTCCCAGTACATCAGAGTGCCTCGGAGATGAAAAAGGACATCGAGCCAGTGACCTAAATTACAGCCTGAATATACTCTGAATTCCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0326】
配列番号２６（ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATTCGAGCGCAAGCTTGAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCCGCGCGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGATTCGAATCCCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACAAAAAATGCTTTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAAATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTGCTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTCTGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTGGATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTTGCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCTCCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACATTCGAGCGCAAGCTTGAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCCGCGCGATCTACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTGTAGGTAACCACGTGCGGACCGAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0327】
配列番号２７（ＡＡＶ－ＳｐＢ－ＧＦＰ組換えアデノ随伴ウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATTCTAGAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAACTCGAGCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【0328】
配列番号２８（ＡＡＶ６－ＳｐＢ－ｎｕｌｌゲノム及びＡＡＶ９－ＳｐＢ－ｎｕｌｌウイルスゲノム）
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCGATATCATAGGGCTGTCTGGGAGCCACTCCAGGGCCACAGAAATCTTGTCTCTGACTCAGGGTATTTTGTTTTCTGTTTTGTGTAAATGCTCTTCTGACTAATGCAAACCATGTGTCCATAGAACCAGAAGATTTTTCCAGGGGAAAAGGTAAGGAGGTGGTGAGAGTGTCCTGGGTCTGCCCTTCCAGGGCTTGCCCTGGGTTAAGAGCCAGGCAGGAAGCTCTCAAGAGCATTGCTCAAGAGTAGAGGGGGCCTGGGAGGCCCAGGGAGGGGATGGGAGGGGAACACCCAGGCTGCCCCCAACCAGATGCCCTCCACCCTCCTCAACCTCCCTCCCACGGCCTGGAGAGGTGGGACCAGGTATGGAGGCTTGAGAGCCCCTGGTTGGAGGAAGCCACAAGTCCAGGAACATGGGAGTCTGGGCAGGGGGCAAAGGAGGCAGGAACAGGCCATCAGCCAGGACAGGTGGTAAGGCAGGCAGGAGTGTTCCTGCTGGGAAAAGGTGGGATCAAGCACCTGGAGGGCTCTTCAGAGCAAAGACAAACACTGAGGTCGCTGCCACTCCTACAGAGCCCCCACGCCCCGCCCAGCTATAAGGGGCCATGCACCAAGCAGGGTACCCAGGCTGCAGAGGTGCGAATTCATTTAAATACGTGGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCCACGTGGATATCGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34-1】
【図34-2】
【図34-3】
【図35-1】
【図35-2】
【図35-3】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49-1】
【図49-2】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスゲノムであって、前記ウイルスゲノムの全長は、４７００ヌクレオチド未満であり、かつ前記組織特異的プロモーターは、配列番号１２のみからなる、組換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【請求項2】
前記ＴＥＲＴをコードする配列は、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項１に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【請求項3】
ａ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号４、配列番号７、若しくは配列番号１０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７若しくは配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列によって表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、ｂ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、及び配列番号９のいずれか１つ、好ましくは配列番号６及び配列番号９のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、又は、
ｃ）前記ＴＥＲＴをコードする配列は、遺伝暗号の縮重によりａ）若しくはｂ）のヌクレオチド配列の配列とは異なる配列のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれのみからなるか、若しくはそれのみからなる、請求項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【請求項4】
前記組換えウイルスゲノムは、前記ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたコザックコンセンサス配列を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【請求項5】
前記組換えウイルスゲノムは、前記ＴＥＲＴをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたポリＡ配列を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に規定される組換えアデノ随伴ウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項7】
前記ウイルスベクターは、血清型１型、血清型２型、血清型３型、血清型４型、血清型５型、血清型６型、血清型７型、血清型８型、血清型９型、血清型ｒｈ１０型、血清型ｒｈ８型、血清型Ｃｂ４型、血清型ｒｈ７４型、血清型ＤＪ型、血清型２／５型、血清型２／１型、血清型１／２型、又は血清型Ａｎｃ８０型のものである、請求項６に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項8】
前記ウイルスベクターは、血清型６型又は血清型９型のものである、請求項７に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項9】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものである、請求項８に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項10】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものであり、かつ前記組織特異的プロモーターは、請求項１に規定される通りである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項11】
前記ウイルスベクターは、血清型６型のものであり、かつ前記組織特異的プロモーターは、請求項１に規定される通りである、請求項９に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
【請求項12】
請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム又は請求項６～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含み、任意に１種以上の薬学的に許容可能な成分を更に含む医薬組成物。
【請求項13】
医薬として使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム、請求項６～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
テロメア長の短縮と関連する病態の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム、請求項６～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項15】
肺線維症の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム、請求項６～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項16】
気管内投与を介した肺線維症の治療及び／又は予防において使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスゲノム、請求項６～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルスベクター、又は請求項１２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】