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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-28
(54)【発明の名称】非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240521BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240521BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 W
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571140
(86)(22)【出願日】2022-05-13
(85)【翻訳文提出日】2023-11-15
(86)【国際出願番号】 KR2022006924
(87)【国際公開番号】W WO2022245066
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】10-2021-0065761
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0065760
(32)【優先日】2021-05-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0078025
(32)【優先日】2021-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521504245
【氏名又は名称】プレクソジェン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】キム，スゥ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジ ミン
【テーマコード（参考）】
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045DA66
2G045FB01
2G045FB03
(57)【要約】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカーに関し、より詳細には、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含むことにより、高い正確度で非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を診断できる組成物及びキット、並びに非アルコール性脂肪肝炎治療剤投与後の予後を正確に予測できる組成物及びキットに関し、本発明に組成物及びキットは、非アルコール性脂肪肝疾患の診断、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測及び非アルコール性脂肪肝疾患治療剤のスクリーニング製剤として様々に活用可能である。
【選択図】 図１０
【選択図】 図１０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与した個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物。
【請求項2】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与した個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用キット。
【請求項6】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１に記載のキット。
【請求項7】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１に記載のキット。
【請求項8】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットである、請求項３に記載のキット。
【請求項9】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与した個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の予後予測のための情報提供方法。
【請求項10】
測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含む、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項11】
前記測定段階は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含む、請求項１０に記載の情報提供方法。
【請求項12】
前記生物学的試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項13】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項14】
前記情報提供方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の発病が疑われる個体から分離された試料から測定されたエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルが、正常対照群の試料から分離された試料から測定されたレベルよりも低い場合に、非アルコール性脂肪肝疾患の発病危険が高いか、非アルコール性脂肪肝疾患の予後が悪いと判定する、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項15】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項16】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１５に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項17】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１５に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項18】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１７に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項19】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項20】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１９に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項21】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１９に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項22】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットである、請求項２１に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項23】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、個体の非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）診断のための情報提供方法。
【請求項24】
測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含む、請求項２３に記載の情報提供方法。
【請求項25】
前記測定段階は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含む、請求項２３に記載の情報提供方法。
【請求項26】
前記生物学的試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項２３に記載の情報提供方法。
【請求項27】
生物学的試料から測定した値が正常対照群試料の値よりも低い場合に非アルコール性脂肪肝疾患であると判定する判定段階をさらに含む、請求項２４に記載の情報提供方法。
【請求項28】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項２３に記載の情報提供方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカーに関し、より詳細には、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、高い正確度で非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を診断できる組成物及びこれを含むキットに関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞は多分化能を有する間質細胞で、造骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞に分化可能な細胞のことを指す。間葉系幹細胞は、軟骨や骨組織、靭帯、骨髄間質などの様々な結合組織に分化できるので、関節炎や、外傷、火傷などによる軟部組織の欠損を治療するなど、様々な疾患への治療用途として研究されている。
【0003】
一方、非アルコール性脂肪肝は、過度なアルコール摂取無しで肝細胞に中性脂肪であるトリグリセロイドが蓄積されることが特徴である。非アルコール性脂肪肝は、現代人の高脂肪及び高炭水化物の摂取と関連した栄養過剰によって増加の一途にある。肥満、糖尿において非アルコール性脂肪肝がしばしば観察されるが、様々な因子が非アルコール性脂肪肝と関連しているとされている。非アルコール性脂肪肝を持つ成人の８０％がインスリン抵抗性糖尿病及び心臓疾患などの代謝異常疾患に発展することが報告されている。
【0004】
非アルコール性脂肪肝は、非アルコール性単純脂肪肝（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）と炎症を伴う非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）とに分類されるが、長期間放置すると、肝炎、肝線維、肝硬変などの深刻な肝疾患に進行することがある。非アルコール性脂肪肝は、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）で脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を持つことを特徴とする。
【0005】
非アルコール性単純脂肪肝は非アルコール性脂肪肝炎に進行することがあるため、非アルコール性脂肪肝炎において脂肪の蓄積は、様々なレベルの肝の炎症及び傷跡と関連し、多くの場合、インスリン抵抗性、異常脂質血症及び高血圧と関連すると知られている。非アルコール性脂肪肝炎は、過体重、高いコレステロール及びトリグリセロイド数値、及び／又はインスリン抵抗性を有する人々からしばしば発生する。
【0006】
しかしながら、近年、肥満人口の増加に伴って非アルコール性脂肪肝炎患者が増加するにもかかわらず、安全で且つ長期服用可能な非アルコール性脂肪肝炎の治療剤の開発は僅かしか進んでおらず、非アルコール性脂肪肝炎の診断のための製剤やキットの開発は満足できない状況である。したがって、慢性疾患である非アルコール性脂肪肝炎の診断に適合しながら、正確で迅速な非アルコール性脂肪肝炎の診断用組成物又はキットの開発と非アルコール性脂肪肝炎治療剤投与後の予後診断組成物に対する要求が高まっている状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
そこで、本発明者らは、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の診断マーカーとしてエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質を用いて迅速で正確に非アルコール性脂肪肝疾患を診断できることを確認した。
【0008】
そこで、本発明の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用組成物を提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用キットを提供することである。
【0010】
本発明のさらに他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断のための情報提供方法を提供することである。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患治療剤スクリーニング方法を提供することである。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物を提供することである。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用キットを提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカーに関し、本発明に係る非アルコール性脂肪肝疾患の診断用組成物、予後予測用組成物又はそれらのキットは、迅速で正確に非アルコール性脂肪肝疾患を診断でき、非アルコール性脂肪肝疾患治療剤投与後の予後を正確に予測できる。
【0016】
そこで、本発明者らは、本発明に係るエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤が、既存方法に比べてより正確に非アルコール性脂肪肝疾患を診断し且つ予後を予測できることを確認した。
【0017】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0018】
本発明の一態様は、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物である。
【0019】
本明細書における用語「マーカー（ｍａｒｋｅｒ）」は、非アルコール性脂肪肝疾患を有する個体を正常群個体と区分して診断できる物質で、非アルコール性脂肪肝疾患を有する個体において増加又は減少を示すポリペプチド、タンパク質又は核酸、脂質、糖脂質、糖タンパク質又は糖などのような有機生体分子をいずれも含んでよく、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患を有する個体においてレベルが減少するタンパク質であってよいが、これに限定されるものではない。
【0020】
本明細書において用語「エクソソーム」とは、細胞が細胞外に分泌したり、細胞内に存在する、脂質二重層で構成された膜構造を有する小胞（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）であり、ほとんど全ての真核生物の体液に存在する。エクソソームの直径は３０～１０００ｎｍ程度であり、多重小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合する際に細胞から放出されるか、細胞膜から直ちに放出される。エクソソームが、凝固、細胞－細胞間コミュニケーション及び細胞性免疫を仲裁する機能的役割を担うために、細胞内の生体分子であるタンパク質、生体活性脂質及びＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を輸送する役割を担うことはよく知られている。
【0021】
エクソソームは微細小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を包括する概念である。エクソソームのマーカータンパク質としてはＣＤ６３、ＣＤ８１などが知られており、その他にはＥＧＦＲのような細胞表面の受容体、信号伝達関連分子、細胞付着関連タンパク質、ＭＳＣ関連抗原、熱衝撃タンパク質（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）、小胞形成に関連したＡｌｉｘなどのタンパク質が知られている。
【0022】
本明細書における用語「ＡｐｏＡ－１タンパク質」は、ＡｐｏＡ－１遺伝子によってコードされるタンパク質であり、ＨＤＬパーティクルの主要タンパク質成分として脂質代謝において特定の役割を担うことが知られている。ＡｐｏＡ－１は、しばしば心血管疾患の予測のためのバイオマーカーとして用いられることが知られているが、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のバイオマーカーとしての用途は知られたことがない。本発明の発明者らは、個体の血漿内でエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１のタンパク質レベル測定により、非アルコール性脂肪肝疾患が発病した或いは発病が疑われる個体の発病の有無を正確に診断できることを確認した。
【0023】
本明細書における用語「非アルコール性脂肪肝疾患」は、慢性肝疾患の中で最も一般的な疾患であり、２型糖尿病、肥満及び代謝症候群と密接な関係があると知られており、単純脂肪症（ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）から非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）、さらには肝硬変症までを含む疾患を意味する。
【0024】
本発明において用語「診断」は、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、非アルコール性脂肪肝疾患発病の有無を確認することである。
【0025】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）であってよい。
【0026】
本明細書における用語「非アルコール性脂肪肝炎」は、非アルコール性脂肪肝疾患の一つで、脂肪肝と共に炎症或いは線維化を伴うことを特徴とする進行性肝疾患であり、肝硬変や肝癌を誘発する前区疾患を意味する。
【0027】
本明細書における用語「タンパク質のレベルを測定する製剤」とは、試料に含まれた標的タンパク質のレベルを測定する方法に用いられる製剤を意味する。タンパク質のレベルを測定する製剤は、当業界に公知されたタンパク質検出製剤を含んでよく、例えば、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動（ｒｏｃｋｅｔ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、免疫クロマトグラフィー法（ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）及びタンパク質チップ分析法（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｓｓａｙ）などの方法に使用される抗体を含んでよいが、これに限定されるものではない。
【0028】
本発明の一具現例において、タンパク質のレベルを測定する製剤は、タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものであってよい。
【0029】
本発明の一具現例において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってよい。
【0030】
本明細書における用語「抗体」は、タンパク質又はペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合可能なタンパク質性分子を意味する。抗体は、各遺伝子を通常の方法によって発現ベクターにクローニングしてマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質を得、得られたタンパク質から通常の方法によって製造されてよい。抗体の形態は特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の断片又は組換え抗体など、抗原結合性を有するものであれば、それの一部も本発明の抗体に含まれる。本発明において抗体には全ての免疫グロブリン抗体が含まれる他、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれてよい。なお、抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する完全な形態の他、抗体分子の機能的な断片も含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどであってよい。
【0031】
本明細書における用語「アプタマー」とは、一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子を意味する。アプタマーは、その塩基配列によって様々な３次元構造を有してよく、抗原－抗体反応のように特定物質に対して高い親和力を有し得る。アプタマーは、所定の標的分子に結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害することができる。
【0032】
本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）核酸又はこれらの混合物であってよく、その形態が直鎖状又は環状であってよいが、それらに限定されない。アプタマーは、それぞれの塩基配列を参照して、当該技術の分野における通常の知識を有する者が公知の方法によって容易に作製可能である。
【0033】
本発明の他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患が発病した或いは発病が疑われる個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患診断用キットである。
【0034】
本発明において、キットは、抗体の免疫学的検出のため、基材、適当な緩衝溶液、発色酵素又は蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質などを含んでよい。
【0035】
基材は、特に次に限定されないが、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラスでできたスライドガラスなどが用いられてよく、発色酵素は、特に次に限定されないが、ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカラインホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が用いられてよい。蛍光物質は、次に限定されないが、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなどであってよく、発色基質液は、特に次に限定されないが、ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））又はＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）であってよい。
【0036】
本発明において、キットは、個体の非アルコール性脂肪肝疾患診断に使用するための試薬をさらに含んでよい。試薬は、バッファー、指示薬、又はその組合せを含んでよいが、これに限定されるものではない。
【0037】
本発明の一具現例において、キットは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットであってよい。
【0038】
本発明のさらに他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患が発病した或いは発病が疑われる個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、個体の非アルコール性脂肪肝疾患診断のための情報提供方法である。
【0039】
本発明の一具現例において、方法は、測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含んでよい。
【0040】
本発明の一具現例において、測定段階は、ＡｐｏＡ－１タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含んでよい。
【0041】
本明細書における用語「個体」は、非アルコール性脂肪肝疾患が発病した或いは発病の可能性があるヒトを含む全ての動物を意味できる。動物は、ヒトの他、これと類似の症状の治療を要するウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラクダ、カモシカ、イヌ、ネコなどの哺乳動物であってよいが、これに限定されない。
【0042】
本明細書における用語「正常対照群」とは、非アルコール性脂肪肝疾患が発病しないか又は発病が疑われない個体を意味する。
【0043】
本明細書における用語「試料」とは、非アルコール性脂肪肝疾患が発病した患者から分離され、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質の発現レベルを測定する直接的な対象を意味する。
【0044】
本発明の一具現例において、試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってよい。
【0045】
本発明の一具現例において、方法は、生物学的試料から測定した値が正常対照群試料の値よりも低い場合に非アルコール性脂肪肝疾患として判定する判定段階をさらに含んでよい。
【0046】
本発明のさらに他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療候補物質を、疾患の発病した個体から分離される生物学的試料に処理して、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質の発現程度を測定する測定段階、及び測定したタンパク質発現程度を、候補物質を処理していない対照群の発現程度と比較する比較段階を含む、非アルコール性脂肪肝疾患治療剤スクリーニング方法である。
【0047】
本明細書における用語「治療候補物質」とは、個体の試料から測定されるエクソソーム内のＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを増加させ、非アルコール性脂肪肝疾患の治療可能性がある物質であり、オリゴヌクレオチド、タンパク質、化合物などを制限なく含む。
【0048】
本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」は、数個～数十個のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）で重合して形成された重合体を意味する。
【0049】
本発明に係るスクリーニング方法の比較段階において、個体から分離される生物学的試料内のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルが対照群に比べて有意に増加する場合に、候補物質は非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤として可能性があることを意味する。
【0050】
本発明のさらに他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤を投与した個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物である。
【0051】
本明細書における用語「非アルコール性脂肪肝疾患治療剤」は、非アルコール性脂肪肝疾患を治療するか、非アルコール性脂肪肝疾患の重症度又は関連パラメータを改善又は緩和させ得る全ての物質を意味し、例えば、本発明者らは、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から分離されたエクソソームが、既存の臨床で用いられる治療剤に比べて、非アルコール性脂肪肝疾患の治療、緩和改善の効果に優れていること確認した。
【0052】
本明細書における用語「予後」とは、疾患の経過及び死亡又は生存の結果をあらかじめ予測する行為を意味する。より具体的には、予後又は予後予測とは、疾患の経過は患者の生理的又は環境的状態によって異なることがあり、このような患者の状態を総合的に考慮して治療前／後の病気の経過を予測する全ての行為と解釈されてよい。本発明の目的上、予後は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療前／後、疾患の経過及び完治の有無をあらかじめ予想して非アルコール性脂肪肝疾患患者の無病生存率又は生存率を予測する行為と解釈されてよい。
【0053】
例えば、「予後が良い」と予測することは、治療されたか否かに関係なく、非アルコール性脂肪肝疾患患者の生存率が高いレベル又は脂肪肝疾患と関連した指標が改善されたレベルを示し、非アルコール性脂肪肝疾患患者が治療される可能性が高いということを意味し、「予後が悪い」と予測することは、非アルコール性脂肪肝疾患の治療後の患者の生存率が低いか、脂肪肝疾患と関連した指標が悪化したレベルを示すことを意味する。
【0054】
一例として、本発明者らは、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する場合に、既存の臨床に使用されている血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する場合に比べて、非アルコール性脂肪肝疾患の改善の有無をより正確に把握できることを確認した。
【0055】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤は、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む組成物であってよい。
【0056】
本明細書において用語「幹細胞」は未分化された細胞で、自己複製能力を有しながら２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指す。本発明の幹細胞は、自己又は同種由来幹細胞であってよい。
【0057】
本明細書において用語「誘導万能幹細胞」は、体細胞のような既に分化した細胞に脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘導して初期の未分化された状態に戻り、全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有するようになった細胞を意味する。
【0058】
前記脱分化は、特定遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ－４など）を導入して発現させるか、前記特定遺伝子が導入された細胞で作られた脱分化誘導タンパク質を注入して誘導されてよい。
【0059】
前記全分化能は、生体を構成する３種の胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）、すなわち、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）及び外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）起源の組織又は器官に分化できる能力を意味する。
【0060】
本明細書において用語「間葉系幹細胞」は多分化能を有する細胞で、造骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞に分化できる幹細胞のことを指す。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞が最も多く用いられるが、骨髄の他にも、臍帯又は臍帯血、脂肪組織、羊水、奥歯の歯牙突起（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来し得る。間葉系幹細胞は、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。
【0061】
前記「誘導万能幹細胞」は、分化した細胞から人為的な脱分化過程によって多能性分化能を有するように誘導された細胞を指す言葉で、脱分化幹細胞とも呼ばれる。
【0062】
本発明において、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞は、ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないものであってよい。
【0063】
本明細書における用語「誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞」は、誘導万能幹細胞から間葉系幹細胞に完全に分化する直前段階の細胞で、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の一種と見なすことができ、ＳＳＥＡ－４タンパク質を発現しなく、追加培養によって完全な間葉系幹細胞の性質を有することになる細胞を意味する。
【0064】
本発明において、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞は、ＳＳＥＡ－４タンパク質を発現しない誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞から分化したものであってよい。
【0065】
前記人為的な脱分化過程は、レトロウイルス、レンチウイルス及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介又は非ウイルス性ベクターの利用、タンパク質及び細胞抽出物などを利用する非ウイルス媒介脱分化因子の導入によって行われるか、幹細胞抽出物、化合物などによる脱分化過程を含む。
【0066】
前記誘導万能幹細胞は、胚芽幹細胞とほぼ同じ特性を有し、具体的には、類似の細胞形状を示し、遺伝子及びタンパク質発現パターンが類似であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで全分化能を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入させた時にキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成し、遺伝子の生殖線転移（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。
【0067】
本発明の誘導万能幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどの全ての哺乳動物由来の誘導万能幹細胞を含むが、好ましくは、ヒト由来の誘導万能幹細胞である。
【0068】
また、本発明の前記誘導万能幹細胞が脱分化する前の体細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水又は胎盤などに由来する体細胞であってよいが、これに限定されない。
【0069】
本発明において誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエクソソームは、上述した誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞（ＢｘＣ）内に存在したり又はＢｘＣから分泌されたエクソソームを意味する。
【0070】
本明細書において用語「有効成分として含む」とは、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエクソソームが非アルコール性脂肪肝疾患の予防又は治療活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。
【0071】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤は、前処理物質で前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む組成物であってよい。
【0072】
本明細書において用語「前処理」とは、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞の培養過程において前処理物質が添加された細胞培養培地を誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞に接触させる過程を意味する。
【0073】
本発明の一具現例において、前処理物質は、１－（ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸［１－（６－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－２－ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ］又はエキセンディン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）であってよい。
【0074】
１－（ベンゾチアゾリルスルホニル）－５－クロロ－１水素－インドール－２ブタン酸［１－（６－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）－５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－２－ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ］は、「ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）」という名称で使われてよく、ペルオキシソーム増殖体活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＰＡＲｓ）のアゴニストである。
【0075】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤は、ラニフィブラノールで前処理された、誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞から分離されたエクソソームを有効成分として含む組成物（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）であってよい。
【0076】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎であってよい。
【0077】
本発明の一具現例において、タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものであってよい。
【0078】
本発明の一具現例において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってよい。
【0079】
本発明のさらに他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤を投与した個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用キットである。
【0080】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎であってよい。
【0081】
本発明の一具現例において、タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものであってよい。
【0082】
本発明の一具現例において、キットは、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットであってよい。
【0083】
本発明のさらに他の態様は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療剤を投与した個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測のための情報提供方法である。
【0084】
本発明の一具現例において、方法は、測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含んでよい。
【0085】
本発明の一具現例において、測定段階は、タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含んでよい。
【0086】
本発明の一具現例において、生物学的試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であってよい。
【0087】
本発明の一具現例において、方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の発病が疑われる個体から分離された試料から測定されたエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルが、正常対照群の試料から分離された試料から測定されたレベルよりも低い場合に、非アルコール性脂肪肝疾患の発病危険が高いか、非アルコール性脂肪肝疾患の予後が悪いと判定することであってよい。
【0088】
本発明の一具現例において、方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の発病が疑われる個体から分離された試料から測定されたエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルが、正常対照群の試料から分離された試料から測定されたレベルよりも低い場合に、非アルコール性脂肪肝疾患の発病危険が高いか、非アルコール性脂肪肝疾患の予後が悪いと判定する判定段階をさらに含んでよい。
【0089】
本発明の一具現例において、非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）であってよい。
【発明の効果】
【0090】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカーに関し、より詳細には、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含むことにより、高い正確度で非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を診断できる組成物及びキット、並びに非アルコール性脂肪肝炎治療剤投与後の予後を正確に予測できる組成物及びキットに関し、本発明の組成物及びキットは、非アルコール性脂肪肝疾患の診断、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測及び非アルコール性脂肪肝疾患治療剤のスクリーニング製剤として様々に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0091】
【図1】ＢｘＣ－ｅ（前処理されていないＢｘＣのエクソソーム）及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ（ラニフィブラノールで前処理された誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞に由来するエクソソーム）のプロテオミックシグネチャーを示すヒートマップである。
【0092】
【図2】本発明の一実施例に係るＢｘＣ－Ｖ３７ｅエクソソームの薬物シグネチャーを示すグラフである。
【0093】
【図3】ＨｅｐＧ２においてＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーのＫＥＧＧ経路を示す。赤色表記は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅのシグネチャータンパク質を示し、青色表記は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理によって上方調節されたシグネチャー遺伝子を示し、黒色表記は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅのシグネチャー薬品と関連した標的を示す。
【0094】
【図4】本発明の一実施例によってＰＢＳ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与した正常及びメチオニン／コリン欠乏（ＭＣＤ－ｄｉｅｔ）食餌誘導ＮＡＳＨマウスの肝組織写真である。
【0095】
【図5】本発明の一実施例に係るＰＢＳ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与したＮＡＳＨマウスの血清から測定したＡＬＴレベルを示すグラフである。（正常（ｎｏｒｍａｌ）；ｎ＝６、ＭＣＤ－ｄｉｅｔ；ｎ＝５）。
【0096】
【図6】本発明の一実施例に係るＰＢＳ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与したＮＡＳＨマウスの血清から測定したＡＳＴレベルを示すグラフである。（正常（ｎｏｒｍａｌ）；ｎ＝６、ＭＣＤ－ｄｉｅｔ；ｎ＝５）。
【0097】
【図7】本発明の一実施例によってＰＢＳ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与したＭＣＤ食餌誘導マウスの肝組織においてヘマトキシリン及びエオシン染色結果を示す写真である（ＧＬＰ－１Ｒ作用剤は陽性対照群として使用され、スケールバーは５０μｍ。）。
【0098】
【図8】炎症、肥大及び脂肪症指数の指数を用いてＮＡＦＬＤ活性指数（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ；ＮＡＳ）を分析した結果を示すグラフである（データは平均±ＳＥＭで表示され、＊ ｐ＜０．０５；＊＊＊ ｐ＜０．００１）
【0099】
【図9】誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞（ＢｘＣ）から分離したエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の脂肪分化抑制効果を示す図である。
【0100】
【図10】本発明の一実施例によってＰＢＳ、ＧＬＰ－１Ｒ作用剤又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与したＮＡＳＨマウスの血清から得たエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の免疫ブロット分析（ウェスタンブロット）結果を示す写真である。
【0101】
【図11】本発明の一実施例によってＰＢＳ、ＧＬＰ－１Ｒ作用剤又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与したＮＡＳＨマウスの血清から得たエクソソームＡｐｏＡ－１の免疫ブロット分析（ウェスタンブロット）結果を示すグラフである。
【0102】
【図12】本発明の一実施例によって対照群（ｎ＝２０）及び肥満ＮＡＦＬＤ被験者の血清から、２兄糖尿病があるか（ｎ＝１６）又はない（ｎ＝１９）ヒトエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１レベルを測定した結果を示すグラフである。
【0103】
【図13】図１３から図２４は、本発明の一実施例によってヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、代謝パラメータ［ＢＭＩ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＢＰ（Ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＤＢＰ（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、Ｈｓ－ＣＲＰ、ＴＧ、ＴＣ、ＨＩＳ及びＮＡＦＬＤ肝脂肪スコア（ｌｉｖｅｒ ｆａｔ ｓｃｏｒｅ）］との相関関係を示すグラフである。図１３は、ヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＢＭＩとの相関関係を示す。
【図14】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＡＬＴとの相関関係を示す。
【図15】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＡＳＴとの相関関係を示す。
【図16】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＳＢＰとの相関関係を示す。
【図17】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＤＢＰとの相関関係を示す。
【図18】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、インスリンとの相関関係を示す。
【図19】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＨＯＭＡ－ＩＲとの相関関係を示す。
【図20】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、Ｈｓ－ＣＲＰとの相関関係を示す。
【図21】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＴＧとの相関関係を示す。
【図22】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＴＣとの相関関係を示す。
【図23】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＨＩＳとの相関関係を示す。
【図24】本発明の一実施例によるヒト血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコアとの相関関係を示す。
【0104】
【図25】図２５～図３６は、本発明の一実施例によってヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、代謝パラメータ［ＢＭＩ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＢＰ（Ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＤＢＰ（Ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、Ｈｓ－ＣＲＰ、ＴＧ、ＴＣ、ＨＩＳ及びＮＡＦＬＤ肝脂肪スコア］との相関関係を示すグラフである。図２５は、ヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＢＭＩとの相関関係を示す。
【図26】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＡＬＴとの相関関係を示す。
【図27】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＡＳＴとの相関関係を示す。
【図28】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＳＢＰとの相関関係を示す。
【図29】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＤＢＰとの相関関係を示す。
【図30】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、インスリンとの相関関係を示す。
【図31】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＨＯＭＡ－ＩＲとの相関関係を示す。
【図32】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、Ｈｓ－ＣＲＰとの相関関係を示す。
【図33】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＴＧとの相関関係を示す。
【図34】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＴＣとの相関関係を示す。
【図35】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＨＩＳとの相関関係を示す。
【図36】本発明の一実施例によるヒト血清中のＡｐｏＡ－１タンパク質レベルと、ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコアとの相関関係を示す。
【0105】
【図37】ＭＣＤ食餌マウスに、ＮＡＳＨ治療候補物質として知られたデュラグルチドを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡＳＴ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0106】
【図38】ＭＣＤ食餌マウスに、ＮＡＳＨ治療候補物質として知られたデュラグルチドを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるｈｓ－ＣＲＰ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0107】
【図39】ＭＣＤ食餌マウスに、ＮＡＳＨ治療候補物質として知られたデュラグルチドを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡＣＣ１数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0108】
【図40】ＭＣＤ食餌マウスに、ＮＡＳＨ治療候補物質として知られたデュラグルチドを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＮＲＦ２数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0109】
【図41】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡＳＴ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0110】
【図42】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるｈｓ－ＣＲＰ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0111】
【図43】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡＣＣ１数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0112】
【図44】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＰＣＮＡ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0113】
【図45】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるｈｓ－ＣＲＰ数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【0114】
【図46】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるオイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色結果変化の相関関係を示すグラフである。
【0115】
【図47】ＭＣＤ食餌マウスにＢｘＣ－ｅを投与し、ＰＢＳ投与グループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡｎｎｅｘｉｎＡ５数値変化率の相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0116】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与した個体から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含む、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物に関する。
【実施例】
【0117】
以下、本発明を、下記の実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0118】
実施例１：材料及び方法
【0119】
１－１．動物実験
６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄野生型（ＷＴ）マウスは、Ｋｏａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄから入手し、１２週間Ｃｈｏｗ食餌（ｎ＝６）又はメチオニン／コリン欠乏食餌（ＭＣＤ－ｄｉｅｔ）（ｎ＝１５）で飼育した。動物管理及び手順は、大韓民国の株式会社ノタス（Ｋｎｏｔｕｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の齧歯類動物施設区域の承認を受けた（承認番号：１９－ＫＥ－２６５）。ＭＣＤ－ｄｉｅｔ食餌マウスは、１８週に２ｎｍｏｌ／ｋｇデュラグルチド（ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ，ＧＬＰ－１受容体作用剤）を隔日で４週間皮下注射し、１匹当たりに４００μｇのＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１日１回、週に３回、４週間静脈注射した。実験の終了時にマウスを麻酔し、血清と肝組織を収集した。環境条件は次を維持するように設定した：温度、２３±３℃；相対湿度、５５±１５％；換気、１０～２０回の時間当たり換気；光度、１５０～３００Ｌｕｘ；１２時間明／１２時間暗の周期で調節。
６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄野生型（ＷＴ）マウスは、Ｋｏａｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄから入手し、１２週間Ｃｈｏｗ食餌（ｎ＝６）又はメチオニン／コリン欠乏食餌（ＭＣＤ－ｄｉｅｔ）（ｎ＝１５）で飼育した。動物管理及び手順は、大韓民国の株式会社ノタス（Ｋｎｏｔｕｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の齧歯類動物施設区域の承認を受けた（承認番号：１９－ＫＥ－２６５）。ＭＣＤ－ｄｉｅｔ食餌マウスは、１８週に２ｎｍｏｌ／ｋｇデュラグルチド（ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ，ＧＬＰ－１受容体作用剤）を隔日で４週間皮下注射し、１匹当たりに４００μｇのＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１日１回、週に３回、４週間静脈注射した。実験の終了時にマウスを麻酔し、血清と肝組織を収集した。環境条件は次を維持するように設定した：温度、２３±３℃；相対湿度、５５±１５％；換気、１０～２０回の時間当たり換気；光度、１５０～３００Ｌｕｘ；１２時間明／１２時間暗の周期で調節。
【0120】
１－２．細胞培養
細胞保持のために、ヒト一次肝細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン抗生剤及び成長補助剤（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）及びＴＨＰ－１単核球（ＡＴＣＣ）と共に肝細胞基本培地（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。そして、成長補助剤（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）及びＴＨＰ－１単核球（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）及び１％抗生剤／抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と共に培養した。ＮＡＳＨ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作るために、ヒト一次肝細胞を２％ ＦＢＳ＋ＤＭＥＭにおいて１００ｍＭ ＦＡ（２オレイン酸：１パルミチン酸）で４８時間処理した後、無血清ＤＭＥＭに１００ｍＭ ＦＡ含有の１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを供給した。また、５００ｎＭタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を無血清ＤＭＥＭにおいてＢｘＣ－Ｖ３７ｅで２４時間同時に処理した。一方、ＴＨＰ－１単核球は、１０％ ＦＢＳ＋ＲＰＭＩにおいて２４時間２００ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで刺激した。その後、１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで無血清ＤＭＥＭにおいて２４時間処理した。両細胞とも５％ ＣＯ２及び９５％加湿インキュベーターで３７℃で成長させた。リン酸化レベルを評価するために、ヒト一次肝細胞とＴＨＰ－１大食細胞を１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅで２４時間処理した。その後、１００ｍＭ ＦＡ又は２００ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγをそれぞれ一次肝細胞に３０分間（ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ及びｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫ）又はＴＨＰ－１大食細胞に１０分間（ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ６５）添加した。
細胞保持のために、ヒト一次肝細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ，ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン抗生剤及び成長補助剤（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）及びＴＨＰ－１単核球（ＡＴＣＣ）と共に肝細胞基本培地（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。そして、成長補助剤（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）及びＴＨＰ－１単核球（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）及び１％抗生剤／抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）と共に培養した。ＮＡＳＨ ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作るために、ヒト一次肝細胞を２％ ＦＢＳ＋ＤＭＥＭにおいて１００ｍＭ ＦＡ（２オレイン酸：１パルミチン酸）で４８時間処理した後、無血清ＤＭＥＭに１００ｍＭ ＦＡ含有の１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを供給した。また、５００ｎＭタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を無血清ＤＭＥＭにおいてＢｘＣ－Ｖ３７ｅで２４時間同時に処理した。一方、ＴＨＰ－１単核球は、１０％ ＦＢＳ＋ＲＰＭＩにおいて２４時間２００ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで刺激した。その後、１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγで無血清ＤＭＥＭにおいて２４時間処理した。両細胞とも５％ ＣＯ２及び９５％加湿インキュベーターで３７℃で成長させた。リン酸化レベルを評価するために、ヒト一次肝細胞とＴＨＰ－１大食細胞を１００μｇ／ｍＬ ＢｘＣ－Ｖ３７ｅで２４時間処理した。その後、１００ｍＭ ＦＡ又は２００ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮγをそれぞれ一次肝細胞に３０分間（ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ及びｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫ）又はＴＨＰ－１大食細胞に１０分間（ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ６５）添加した。
【0121】
１－３．誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞前駆細胞（ＢｘＣ）の分離及び培養
誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）を、１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された誘導万能幹細胞から、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代して上記と同じ培地で７日間追加培養し、本発明の誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を作製した。本発明者らは、前記誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。
誘導万能幹細胞（ｉＰＳＣ）を、１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された誘導万能幹細胞から、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現しないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代して上記と同じ培地で７日間追加培養し、本発明の誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を作製した。本発明者らは、前記誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。
【0122】
ＢｘＣと命名された誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を、培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］で追加培養した。
【0123】
１－４．誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞（ＢｘＣ）由来エクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）分離
培養された誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（以下、ＢｘＣ）培養培地を回収して３００ｘｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞残余物を除去した。上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００ｘｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上澄液をさらに取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離して上澄液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に希釈して以下の実験に使用した。
培養された誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（以下、ＢｘＣ）培養培地を回収して３００ｘｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞残余物を除去した。上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００ｘｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上澄液をさらに取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離して上澄液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に希釈して以下の実験に使用した。
【0124】
１－５．ｐａｎ－ＰＰＡＲ作用剤前処理ｉＭＳＣの培養及びＲＮＡ－ｓｅｑ分析
ｉＭＳＣ（継代数４）は、Ｔ－７５フラスコ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃、５％ ＣＯ２及び９５％湿度条件で１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）及び１％抗生剤／抗真菌剤（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）で培養した。９０％コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達した時に、細胞をＴｒｙＰＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で分離し、１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で４層Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）に接種した。翌日、細胞を１０μＭラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）で２４時間処理した後、培地を吸引し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＤＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で洗浄した。
ｉＭＳＣ（継代数４）は、Ｔ－７５フラスコ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃、５％ ＣＯ２及び９５％湿度条件で１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）及び１％抗生剤／抗真菌剤（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）で培養した。９０％コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達した時に、細胞をＴｒｙＰＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で分離し、１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で４層Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ）に接種した。翌日、細胞を１０μＭラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）で２４時間処理した後、培地を吸引し、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＤＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で洗浄した。
【0125】
ＲＮＡシーケンスは、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社製の応用プログラムによってＲＮＡシーケンシングプロトコルを適用した。階層的クラスタリングは、｜ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅｓ｜≧２及び独立ｔ－ｔｅｓｔ ｐ＜０．０５を満たす差等変動されたスクリプトのパターンを提示するための類似性尺度であり、完全連結（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ）及びユークリッド距離（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）アルゴリズムを用いて分析した。ｇＰｒｏｆｉｌｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｉｔ．ｃｓ．ｕｔ．ｅｅ／ｇｐｒｏｆｉｌｅｒ／ｇｏｓｔ）及びＫＥＧＧ経路（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ）に基づいて重要な遺伝子目録に対する遺伝子強化及び経路分析を行った。
【0126】
１－６．ｐａｎ－ＰＰＡＲ作用剤前処理されたｉＭＳＣエクソソームの分離
ラニフィブラノール前処理ｉＭＳＣ由来のエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）を下記のように分離した。
ラニフィブラノール前処理ｉＭＳＣ由来のエクソソーム（ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ）を下記のように分離した。
【0127】
ラニフィブラノール前処理されたｉＭＳＣ培地は、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ、ｘｏｎｏ－ｆｒｅｅ ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ培地（Ｇｉｂｃｏ）に替えた。培養３日後に培養液を収穫し、３００ｇで１０分間遠心分離した後、上澄液を２，０００ｇで２０分間遠心分離した。上澄液を１０，０００ｇでさらに８０分間遠心分離した。その後、０．２μｍ真空フィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で上澄液を濾過した。最後に、エクソソームは、１００，０００ｇで８０分間超遠心分離によって分離され、その後、ペレットはＰＢＳで洗浄して超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）したし、エクソソームペレットをＰＢＳに再懸濁させた。
【0128】
１－７．極低温透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）
フォルムバール／カーボン（ｆｏｒｍｖａｒ／ｃａｒｂｏｎ）フィルムでコートされた２００－ｍｅｓｈ銅グリッド（ＭｉＴｅＧｅｎ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）を親水性処理した。ＥＶサスペンション（４μＬ）をグリッドに置いてそれぞれ１００％及び４℃の湿度及び温度で９０秒間ブロットした。グリッドの細胞外小胞は、１２０ｋｖでＴａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ ＦＥＩ ＴＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３６，０００倍の倍率で視覚化した。
フォルムバール／カーボン（ｆｏｒｍｖａｒ／ｃａｒｂｏｎ）フィルムでコートされた２００－ｍｅｓｈ銅グリッド（ＭｉＴｅＧｅｎ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）を親水性処理した。ＥＶサスペンション（４μＬ）をグリッドに置いてそれぞれ１００％及び４℃の湿度及び温度で９０秒間ブロットした。グリッドの細胞外小胞は、１２０ｋｖでＴａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ ＦＥＩ ＴＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３６，０００倍の倍率で視覚化した。
【0129】
１－８．ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）分析
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅに対する粒子サイズ分布及び濃度測定は、ＮＴＡに基づくｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）で行った。分析のために、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを滅菌ＰＢＳ（１：１００）で希釈してＮＴＡの最適体積に到達させた。測定は、２３．０～２５．２℃の範囲の室温でＢｌｕｅ ４８８ｎｍレーザーとｓＣＭＯＳカメラを数回反復して行った。サンプル分析は、シャッター６００、ゲイン２５０、カメラレベル１０、ＮＴＡバージョン３．０００６４及び感知臨界値１０のようなカメラ設定及び処理条件で１０分間行った。
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅに対する粒子サイズ分布及び濃度測定は、ＮＴＡに基づくｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００機器（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）で行った。分析のために、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを滅菌ＰＢＳ（１：１００）で希釈してＮＴＡの最適体積に到達させた。測定は、２３．０～２５．２℃の範囲の室温でＢｌｕｅ ４８８ｎｍレーザーとｓＣＭＯＳカメラを数回反復して行った。サンプル分析は、シャッター６００、ゲイン２５０、カメラレベル１０、ＮＴＡバージョン３．０００６４及び感知臨界値１０のようなカメラ設定及び処理条件で１０分間行った。
【0130】
１－９．ＤｉＲ及びＤｉＤ及び蛍光イメージングでＢｘＣ－Ｖ３７ｅラベリング
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＬｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｔｒａｃｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のプロトコルによって３７℃で１０分間１μｇ／ｍＬ ＤｉＲバッファーと共に培養した。その後、ＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１００，０００ｘｇ及び４℃で８０分間遠心分離し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。最後に、２００又は４００μｇのＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを０．１ｍＬ ＰＢＳに再懸濁し、静脈経路を通じてＣ５６ＢＬ／６マウスに注入した。２４時間後、ＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＩｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって７４０ｎｍの励起波長、７９０ｎｍの励起波長及び７９０ｎｍの放出波長で検出した。関心領域（ＲＯＩ）の強度は、ステラジアン（ｓｔｅｒｉｄｉａｎ）当たり平方センチメートル当たり秒当たり最大光子数（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の単位で表示した。ＤｉＤ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを製造する手順は、上に説明した方法と同一にして製造した。ＤｉＤ－標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅをヒト一次肝細胞又はＴＨＰ－１大食細胞に、それぞれの刺激の有無に関係なく２４時間処理した。２４時間後、ＤｉＤ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｕ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＬｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｔｒａｃｅｒｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）のプロトコルによって３７℃で１０分間１μｇ／ｍＬ ＤｉＲバッファーと共に培養した。その後、ＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを１００，０００ｘｇ及び４℃で８０分間遠心分離し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。最後に、２００又は４００μｇのＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを０．１ｍＬ ＰＢＳに再懸濁し、静脈経路を通じてＣ５６ＢＬ／６マウスに注入した。２４時間後、ＤｉＲ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅをＩｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって７４０ｎｍの励起波長、７９０ｎｍの励起波長及び７９０ｎｍの放出波長で検出した。関心領域（ＲＯＩ）の強度は、ステラジアン（ｓｔｅｒｉｄｉａｎ）当たり平方センチメートル当たり秒当たり最大光子数（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）の単位で表示した。ＤｉＤ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅを製造する手順は、上に説明した方法と同一にして製造した。ＤｉＤ－標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅをヒト一次肝細胞又はＴＨＰ－１大食細胞に、それぞれの刺激の有無に関係なく２４時間処理した。２４時間後、ＤｉＤ標識されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｕ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
【0131】
１－１０．生物情報学分析
ＨｅｐＧ２細胞に１００ｍＭ脂肪酸（２オレイン酸：２パルミチン酸）処理６時間後にＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で全ＲＮＡを回収した。回収されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ２．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてプロファイリングした。脂肪酸誘導発現変動遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ；ＤＥＧｓ）は、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅカットオフ１．５と確認した。ＤＥＧは、ＦＤＲ ｑ－値カットオフ０．０５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ）でＫＥＧＧを用いた遺伝子セットの強化分析を受けた。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ特徴は、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ）、タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）及び連結性（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）マップ分析によって構成された。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを脂肪酸処理されたＨｅｐＧ２細胞に適用し、全ＲＮＡを前述のようにプロファイリングした。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧは、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅカットオフ１．５と確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅが豊富なタンパク質は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ヨンセ・プロテオム研究所，ソウル）を用いて定性及び定量的に確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧは、連結性マップ図分析によってＢｘＣ－Ｖ３７ｅと類似の転写体プロファイルを有する薬物とその標的遺伝子を確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧ、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅのタンパク質及び確認されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅ類似薬物の標的遺伝子は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーと確認された。確立されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーは、（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ）との相互作用信頼度０．９においてタンパク質－タンパク質相互作用ネットワーク及び機能的強化分析を受けた。
ＨｅｐＧ２細胞に１００ｍＭ脂肪酸（２オレイン酸：２パルミチン酸）処理６時間後にＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で全ＲＮＡを回収した。回収されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ２．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてプロファイリングした。脂肪酸誘導発現変動遺伝子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ；ＤＥＧｓ）は、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅカットオフ１．５と確認した。ＤＥＧは、ＦＤＲ ｑ－値カットオフ０．０５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ）でＫＥＧＧを用いた遺伝子セットの強化分析を受けた。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ特徴は、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ）、タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）及び連結性（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）マップ分析によって構成された。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを脂肪酸処理されたＨｅｐＧ２細胞に適用し、全ＲＮＡを前述のようにプロファイリングした。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧは、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅカットオフ１．５と確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅが豊富なタンパク質は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ヨンセ・プロテオム研究所，ソウル）を用いて定性及び定量的に確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧは、連結性マップ図分析によってＢｘＣ－Ｖ３７ｅと類似の転写体プロファイルを有する薬物とその標的遺伝子を確認した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって誘導されたＤＥＧ、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅのタンパク質及び確認されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅ類似薬物の標的遺伝子は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーと確認された。確立されたＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーは、（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ）との相互作用信頼度０．９においてタンパク質－タンパク質相互作用ネットワーク及び機能的強化分析を受けた。
【0132】
１－１１．流細胞分析
分離されたエクソソームは、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。肝細胞再生に対するエクソソーム効果を分析するために、肝細胞をエクソソーム処理後に抗ヒトＣＤ９０ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。ｉＭＳＣがＭＳＣに対する典型的な細胞表面マーカーを発現するかを確認するために、ｉＭＳＣをＣＤ７３ＡＰＣ、ＣＤ１０５ＰＥ、ＣＤ４５ＦＩＴＣ、ＣＤ３１ＰＥ及びＣＤ３４ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）及びＣＤ９０ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。分析は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
分離されたエクソソームは、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。肝細胞再生に対するエクソソーム効果を分析するために、肝細胞をエクソソーム処理後に抗ヒトＣＤ９０ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。ｉＭＳＣがＭＳＣに対する典型的な細胞表面マーカーを発現するかを確認するために、ｉＭＳＣをＣＤ７３ＡＰＣ、ＣＤ１０５ＰＥ、ＣＤ４５ＦＩＴＣ、ＣＤ３１ＰＥ及びＣＤ３４ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）及びＣＤ９０ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。分析は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
【0133】
１－１２．血清生化学検査
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ注射４週後に血清サンプルを収集し、ｂｌｏｏｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（７１８０，Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて次の媒介変数を検査した：ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））、ＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））、ＴＧ（トリグリセロイド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））、ブドウ糖、ＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ＿Ｃ（高密度リポタンパクコレステロール）、ＬＤＬ＿Ｃ（低密度リポタンパクコレステロール）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＧＧＴ（Ｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ注射４週後に血清サンプルを収集し、ｂｌｏｏｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｚｅｒ（７１８０，Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて次の媒介変数を検査した：ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））、ＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ））、ＴＧ（トリグリセロイド（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））、ブドウ糖、ＴＣ（総コレステロール）、ＨＤＬ＿Ｃ（高密度リポタンパクコレステロール）、ＬＤＬ＿Ｃ（低密度リポタンパクコレステロール）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、ＧＧＴ（Ｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。
【0134】
１－１３．実時間ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて肝組織及び様々な細胞類型から分離された。ｃＤＮＡは、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ ｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）と共に１μｇの全ＲＮＡを用いて合成した。増幅反応は、メーカーのプロトコルにしたがってＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。遺伝子発現レベルは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実時間ｑＰＣＲで測定した。
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて肝組織及び様々な細胞類型から分離された。ｃＤＮＡは、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＰｒｅＭｉｘ ｄＴ２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）と共に１μｇの全ＲＮＡを用いて合成した。増幅反応は、メーカーのプロトコルにしたがってＰｏｗｅｒＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。遺伝子発現レベルは、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実時間ｑＰＣＲで測定した。
【0135】
ＧＡＰＤＨは、各サンプルのｍＲＮＡ量の差を正規化するために参照遺伝子として使用された。相対的な遺伝子発現レベルは、２－ΔΔＣｔ方法を用いて分析し、それぞれの実験は３回行われた。
【0136】
１－１４．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
細胞又は組織は、プロテアーゼ抑制剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＮＰ４０溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で溶解させた。タンパク質濃度は、メーカーのプロトコルにしたがってＢｒａｄｆｏｒｄ ＡｓｓａｙＴＭ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。サンプルを４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３：１に希釈し、１００℃で１０分間加熱した。タンパク質をｐｒｅｃａｓｔ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にロード及び分離し、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。メンブレインをＥｖｅｒｙＢｌｏｔブロッキングバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５分間遮断した後、一次抗体と共に４℃で一晩培養した。全ての一次抗体はＥｖｅｒｙＢｌｏｔブロッキングバッファーで希釈された。使用された一次抗体は次の通りである：ａｎｔｉ－ＧＭ１３０、ＰＣＮＡ、ＡＭＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）、Ｐａｎ－Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ９、Ｃａｌｎｅｘｉｎ、Ａｂｃａ１、ＩＬ－１β、ｐ６５、ＡＣＣ１、Ａｎｎｅｘｉｎ５、β－ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ａｎｔｉ－ＡｐｏＡ－１（ＬＳＢｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＴＳＧ１０１、ＣＤ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α、ＰＧＣ－１α、ＮＲＦ２及びＣＨＯＰ（Ｎｏｖｕｓｂｉｏ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ，ＵＳＡ）。ＣＤ８１以外の全ての標的タンパク質は還元条件で行われた。メンブレインを１０分間５回洗浄した後、二次抗体と共に１時間培養した。二次抗体は、抗ウサギＩｇＧと抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）を使用した。メンブレインを１０分間５回洗浄した後、ＥＣＬ ＳｅｌｅｃｔＴＭウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて標的タンパク質を検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてイメージを分析した。
細胞又は組織は、プロテアーゼ抑制剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＮＰ４０溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で溶解させた。タンパク質濃度は、メーカーのプロトコルにしたがってＢｒａｄｆｏｒｄ ＡｓｓａｙＴＭ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。サンプルを４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で３：１に希釈し、１００℃で１０分間加熱した。タンパク質をｐｒｅｃａｓｔ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にロード及び分離し、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。メンブレインをＥｖｅｒｙＢｌｏｔブロッキングバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５分間遮断した後、一次抗体と共に４℃で一晩培養した。全ての一次抗体はＥｖｅｒｙＢｌｏｔブロッキングバッファーで希釈された。使用された一次抗体は次の通りである：ａｎｔｉ－ＧＭ１３０、ＰＣＮＡ、ＡＭＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）、Ｐａｎ－Ａｋｔ、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ａｎｔｉ－ＣＤ９、Ｃａｌｎｅｘｉｎ、Ａｂｃａ１、ＩＬ－１β、ｐ６５、ＡＣＣ１、Ａｎｎｅｘｉｎ５、β－ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、ａｎｔｉ－ＡｐｏＡ－１（ＬＳＢｉｏ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＴＳＧ１０１、ＣＤ８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＴＮＦ－α、ＰＧＣ－１α、ＮＲＦ２及びＣＨＯＰ（Ｎｏｖｕｓｂｉｏ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ，ＵＳＡ）。ＣＤ８１以外の全ての標的タンパク質は還元条件で行われた。メンブレインを１０分間５回洗浄した後、二次抗体と共に１時間培養した。二次抗体は、抗ウサギＩｇＧと抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）を使用した。メンブレインを１０分間５回洗浄した後、ＥＣＬ ＳｅｌｅｃｔＴＭウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて標的タンパク質を検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてイメージを分析した。
【0137】
１－１５．酵素連結免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡ分析は、市販中のマウスＥＬＩＳＡキットを用いて行った。メーカーのプロトコルにしたがってインスリン（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏ）、ｈｓ－ＣＲＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＦＡ（遊離脂肪酸）及びＡｐｏＡ－１（Ａｂｃａｍ）分析を行った。インスリンに対する分析感度は＜０．１９ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数は＜５．９３％及び＜６．３５％であった。ｈｓ－ＣＲＰに対する分析感度は＜０．０１５ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数は＜７．７％及び＜１０．８％であった。ＡｐｏＡ－１に対する分析感度は１１．２ｐｇ／ｍＬで、分析内及び分析間分散係数はそれぞれ＜４．７％及び＜５．６％であった。
ＥＬＩＳＡ分析は、市販中のマウスＥＬＩＳＡキットを用いて行った。メーカーのプロトコルにしたがってインスリン（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏ）、ｈｓ－ＣＲＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＦＡ（遊離脂肪酸）及びＡｐｏＡ－１（Ａｂｃａｍ）分析を行った。インスリンに対する分析感度は＜０．１９ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数は＜５．９３％及び＜６．３５％であった。ｈｓ－ＣＲＰに対する分析感度は＜０．０１５ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数は＜７．７％及び＜１０．８％であった。ＡｐｏＡ－１に対する分析感度は１１．２ｐｇ／ｍＬで、分析内及び分析間分散係数はそれぞれ＜４．７％及び＜５．６％であった。
【0138】
１－１６．組織病理学的分析
肝組織を１０％パラホルムアルデヒドに固定し、切断、脱水、パラフィン包埋のような一般的な組織処理を行った。５μｍの肝組織断面スライスをスライドに付着し、キシレンを用いて標本のパラフィンを除去した。エタノールで再水和した組織をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。オイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色の場合、組織をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて埋め立てた後、ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２０μｍで切片した。その後、Ｚｅｎ２．３ブルーエディションイメージ分析機（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて組織病理学的サンプルの分析を行い、総面積別染色面積の百分率に正規化した。ＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）の検査は、組織学的基準によってなされたし、全体面積による占有面積観察を基準に、大小胞性脂肪症、微細小胞性脂肪症及び肥大レベルは０～３点と評価した。脂肪症と肥大はいずれも４０～１００の倍率で評価された。炎症点数は、５個領域を無作為に選択し、０～３点と評価された。
肝組織を１０％パラホルムアルデヒドに固定し、切断、脱水、パラフィン包埋のような一般的な組織処理を行った。５μｍの肝組織断面スライスをスライドに付着し、キシレンを用いて標本のパラフィンを除去した。エタノールで再水和した組織をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。オイルレッドＯ（Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ）染色の場合、組織をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて埋め立てた後、ｃｒｙｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２０μｍで切片した。その後、Ｚｅｎ２．３ブルーエディションイメージ分析機（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて組織病理学的サンプルの分析を行い、総面積別染色面積の百分率に正規化した。ＮＡＦＬＤ活性点数（ＮＡＳ）の検査は、組織学的基準によってなされたし、全体面積による占有面積観察を基準に、大小胞性脂肪症、微細小胞性脂肪症及び肥大レベルは０～３点と評価した。脂肪症と肥大はいずれも４０～１００の倍率で評価された。炎症点数は、５個領域を無作為に選択し、０～３点と評価された。
【0139】
１－１７．免疫組織化学染色
肝組織組片があるスライドを、６０℃に保たれる乾燥器に入れ、１時間乾燥させた後、キシレンを用いてパラフィンを除去した。エタノールと水で再水和された組織を、０．０３％過酸化酵素と共に１５分間培養して内因性過酸化酵素を遮断した。Ｐｒｅｓ－ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ ９．０）を１２１℃で圧力鍋（ｐｒｅｓｓ ｃｏｏｋｅｒ）を用いて１５分間反応させ、抗原回収を行った。非特異的反応を防止するため、４％ ＢＳＡ＋デキストランを３０分間添加した。その後、抗ＴＮＦ－α（Ａｂｃａｍ）一次抗体を１時間反応させた後、抗ＬＡＩＳＴＥ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ）二次抗体と共に３０分間室温でゆっくり撹拌しながら培養した。その後、サンプルは、ＢＸ５３生物学的顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でイメージングしたし、分析のために代表イメージをキャプチャーした。
肝組織組片があるスライドを、６０℃に保たれる乾燥器に入れ、１時間乾燥させた後、キシレンを用いてパラフィンを除去した。エタノールと水で再水和された組織を、０．０３％過酸化酵素と共に１５分間培養して内因性過酸化酵素を遮断した。Ｐｒｅｓ－ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ ９．０）を１２１℃で圧力鍋（ｐｒｅｓｓ ｃｏｏｋｅｒ）を用いて１５分間反応させ、抗原回収を行った。非特異的反応を防止するため、４％ ＢＳＡ＋デキストランを３０分間添加した。その後、抗ＴＮＦ－α（Ａｂｃａｍ）一次抗体を１時間反応させた後、抗ＬＡＩＳＴＥ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ）二次抗体と共に３０分間室温でゆっくり撹拌しながら培養した。その後、サンプルは、ＢＸ５３生物学的顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でイメージングしたし、分析のために代表イメージをキャプチャーした。
【0140】
１－１８．活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）分析
一次肝細胞を２４時間４００μＭ Ｈ２Ｏ２で刺激した。その後、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを無血清ＤＭＥＭ培養培地においてＨ２Ｏ２で刺激された一次肝細胞に２４時間処理した後ＤＰＢＳで洗浄した。ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無血清ＤＭＥＭに最終濃度５μＭで細胞に添加し、３７℃で３０分間培養した。染色後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）に１０分間固定した後、ＤＰＢＳで３回洗浄した。核と細胞体はそれぞれ、ＮｕｃＢｌｕｅＴＭ固定細胞（Ｆｉｘｅｄ Ｃｅｌｌ）染色又はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対照染色された。この過程後、全てのサンプルをＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｕ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、核強度によるＲＯＳ陽性強度の百分率で分析した。
一次肝細胞を２４時間４００μＭ Ｈ２Ｏ２で刺激した。その後、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを無血清ＤＭＥＭ培養培地においてＨ２Ｏ２で刺激された一次肝細胞に２４時間処理した後ＤＰＢＳで洗浄した。ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を無血清ＤＭＥＭに最終濃度５μＭで細胞に添加し、３７℃で３０分間培養した。染色後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ，ＵＳＡ）に１０分間固定した後、ＤＰＢＳで３回洗浄した。核と細胞体はそれぞれ、ＮｕｃＢｌｕｅＴＭ固定細胞（Ｆｉｘｅｄ Ｃｅｌｌ）染色又はＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で対照染色された。この過程後、全てのサンプルをＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｕ（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて観察し、核強度によるＲＯＳ陽性強度の百分率で分析した。
【0141】
１－１９．細胞生存力分析
一次ヒト肝細胞（２×１０３ｃｅｌｌ／ｍＬ）を９６ウェルプレートで成長させ、３７℃及び５％ ＣＯ２条件で無血清ＤＭＥＭに４時間培養した。４５０ｎｍでの吸光度データ（ＯＤ値）は、マルチプレートリーダ（ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅが一次肝細胞の生存力に及ぼす影響は、メーカーのプロトコルによってＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）分析（Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
一次ヒト肝細胞（２×１０３ｃｅｌｌ／ｍＬ）を９６ウェルプレートで成長させ、３７℃及び５％ ＣＯ２条件で無血清ＤＭＥＭに４時間培養した。４５０ｎｍでの吸光度データ（ＯＤ値）は、マルチプレートリーダ（ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ＢｘＣ－Ｖ３７ｅが一次肝細胞の生存力に及ぼす影響は、メーカーのプロトコルによってＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）分析（Ｅｎｚｏ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【0142】
１－２０．ヒト血清の代謝パラメータ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）及びエクソソームＡｐｏＡ－１濃度測定
ソウルアサン病院機関審議委員会（承認番号：２００８－０３６７）とインハ大学病院（承認番号：０８－１１５，２０１６－０６－０１５）の承認を受けた研究プロトコル下で、２０名の健康な被験者、１９名の肥満ＮＡＦＬＤ被験者及び１６名の２型糖尿病を有する肥満ＮＡＦＬＤ被験者から血清サンプルの代謝特性を確認した。健康な集団は、ソウルアサン病院産婦人科で良性疾患によって選択的腹部手術を受けた。全ての肥満グループは、腹腔鏡ＲＹＧＢ手術を受けた。悪性又は重症の肝又は腎臓疾患の被験者と妊娠又は授乳中の女性は除外されたし、全ての被験者に登録時に書面同意を受けた。ＮＡＦＬＤの診断は、臨床的特徴と血液検査に基づいて診断した。採血３日前に、全ての被験者は糖尿病と高血圧治療剤を中断したし、血液サンプルは１２時間禁食後に採取され、血漿と血清は直ちに遠心分離で分離された。ＡＬＴ、ＡＳＴ、空腹ブドウ糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、コレステロール、トリグリセリド、肝脂肪症指数（Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ；ＨＩＳ）及びＮＡＦＬＤ肝脂肪指数（ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコア）及びｈｓ－ＣＲＰの循環濃度を、当業界に公知の通りに測定した。エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１濃度は、メーカーのプロトコルにしたがってヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を用いて測定した。ＡｐｏＡ－１に対する分析感度は＜３ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数はそれぞれ＜４％及び＜１０％であった。
ソウルアサン病院機関審議委員会（承認番号：２００８－０３６７）とインハ大学病院（承認番号：０８－１１５，２０１６－０６－０１５）の承認を受けた研究プロトコル下で、２０名の健康な被験者、１９名の肥満ＮＡＦＬＤ被験者及び１６名の２型糖尿病を有する肥満ＮＡＦＬＤ被験者から血清サンプルの代謝特性を確認した。健康な集団は、ソウルアサン病院産婦人科で良性疾患によって選択的腹部手術を受けた。全ての肥満グループは、腹腔鏡ＲＹＧＢ手術を受けた。悪性又は重症の肝又は腎臓疾患の被験者と妊娠又は授乳中の女性は除外されたし、全ての被験者に登録時に書面同意を受けた。ＮＡＦＬＤの診断は、臨床的特徴と血液検査に基づいて診断した。採血３日前に、全ての被験者は糖尿病と高血圧治療剤を中断したし、血液サンプルは１２時間禁食後に採取され、血漿と血清は直ちに遠心分離で分離された。ＡＬＴ、ＡＳＴ、空腹ブドウ糖、インスリン、ＨＯＭＡ－ＩＲ、コレステロール、トリグリセリド、肝脂肪症指数（Ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ；ＨＩＳ）及びＮＡＦＬＤ肝脂肪指数（ＮＡＦＬＤ肝脂肪スコア）及びｈｓ－ＣＲＰの循環濃度を、当業界に公知の通りに測定した。エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１濃度は、メーカーのプロトコルにしたがってヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）を用いて測定した。ＡｐｏＡ－１に対する分析感度は＜３ｎｇ／ｍＬで、分析内及び分析間の分散係数はそれぞれ＜４％及び＜１０％であった。
【0143】
１－２１．統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ用バージョン１８．０，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて行われた。３個以上のグループが含まれた比較では、Ｔｕｋｅｙの事後検定に対する一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて統計分析が行われた。比較に２グループのみが含まれた場合には、対をなす単側スチューデントｔ検定を用いた。データは平均±標準誤差（ＳＥ）で表現され、０．０５未満のｐ値は統計的に有意なものと見なした。
統計分析は、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ用バージョン１８．０，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて行われた。３個以上のグループが含まれた比較では、Ｔｕｋｅｙの事後検定に対する一元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて統計分析が行われた。比較に２グループのみが含まれた場合には、対をなす単側スチューデントｔ検定を用いた。データは平均±標準誤差（ＳＥ）で表現され、０．０５未満のｐ値は統計的に有意なものと見なした。
【0144】
実施例２：ＢｘＣ－Ｖ３７ｅエクソソームのＮＡＳＨに対する効果確認
２－１．ＮＡＳＨに対するＢｘＣ－Ｖ３７ｅ特性分析
２－１．ＮＡＳＨに対するＢｘＣ－Ｖ３７ｅ特性分析
【0145】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによってＢｘＣ－Ｖ３７ｅが豊富な総３２個のタンパク質が確認されたし、アポリポタンパクＡ－１（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－１）（豊富度＝１９１．３）、ＣＤ８１抗原（豊富度＝１８３．８）、トロンボスポンジン－１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１）（豊富度＝１５５．７）、コラーゲンアルファ－１（ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－１）（豊富度＝１１８．１）及びアルファ－２－アンチプラスミノ（ａｌｐｈａ－２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）（７７．２）が含まれたことが確認された（図１）。
【0146】
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの薬理学的結果を機能的に予測するために連結マップ分析を行った結果、５９個の標的遺伝子と関連した１８個の薬物がＢｘＣ－Ｖ３７ｅの転写体プロファイルと有意に類似していることを確認したし、ここには、トリシリビン（ＡＫＴ抑制剤、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ＝９９．７５）、ＥＩ－２７３（ＰＫＣ抑制剤、９９．５９）、４，５－ジアニリノフタルアミド（ＥＧＦＲ抑制剤、９８．６３）、ＢＲＤ－Ａ９４２９７８５９（ＸＩＡＰ抑制剤、９８．４９）及びＧＷ－０７４２（ＰＰＡＲ受容体作用剤、９４．６）が含まれたことが確認された（図２）。また、機能的濃縮は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅによって１１０個の上方調節された遺伝子が１１７個の標準信号経路で有意に豊富であることを示した（ｑ＜０．０５）。したがって、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーは、蛋白体、転写体及び連結マップ分析によって確認された１０８個の遺伝子で構成されたことを確認した。
【0147】
タンパク質－タンパク質相互作用ネットワーク及び機能的強化分析は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅシグネチャーが脂肪代謝、線維症、局所付着を含む炎症反応（ｑ＝５．７Ｅ－０４）、ケモカイン信号伝達経路（ｑ＝５．５Ｅ－０３）、非アルコール性脂肪肝疾患（ｑ＝６．２Ｅ－０３）、ＮＦ－ｋａｐｐａ Ｂ信号伝達経路（ｑ＝８．７Ｅ－０３）、インスリン信号伝達経路（ｑ＝１．１Ｅ－０２）及びＰＰＡＲ信号伝達経路（ｑ＝４．２Ｅ－０２）と関連した信号伝達経路において非常に強化していることを示し（図３）、このような結果は、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを肝脂肪症及び炎症に適用する可能性を示唆する。
【0148】
２－２．ＮＡＳＨモデルにおいてＢｘＣ－Ｖ３７ｅの生体内評価
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの治療機能を、ＭＣ－欠乏食餌（ＭＣ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ）によって誘導されたＮＡＳＨのマウスモデルを用いて調べた。肝の全体的な形態を調べた結果、ＭＣＤ－ｄｉｅｔマウスの肝は、正常マウスに比べて青白く変わることが観察された（図４）。これに対し、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅで処理されたＮＡＳＨマウスの肝は、対照群に見られるように、より暗く観察された。そして、デュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）及びＰＢＳ処理動物の肝では差異が観察されなかった。肝全体の重さは、ＰＢＳ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理されたＮＡＳＨマウスにおいて差がなかった（データは表示されない；ＭＣＤ＋ＰＢＳ，５．７８±０．１２％対ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ，５．３３±０．２３％）。血清分析は、ＰＢＳ処理された動物に比べて、ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅグループの血清において肝機能マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の濃度が有意に減少したことが見られた（図５及び図６）。
ＢｘＣ－Ｖ３７ｅの治療機能を、ＭＣ－欠乏食餌（ＭＣ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ）によって誘導されたＮＡＳＨのマウスモデルを用いて調べた。肝の全体的な形態を調べた結果、ＭＣＤ－ｄｉｅｔマウスの肝は、正常マウスに比べて青白く変わることが観察された（図４）。これに対し、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅで処理されたＮＡＳＨマウスの肝は、対照群に見られるように、より暗く観察された。そして、デュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）及びＰＢＳ処理動物の肝では差異が観察されなかった。肝全体の重さは、ＰＢＳ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅ処理されたＮＡＳＨマウスにおいて差がなかった（データは表示されない；ＭＣＤ＋ＰＢＳ，５．７８±０．１２％対ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅ，５．３３±０．２３％）。血清分析は、ＰＢＳ処理された動物に比べて、ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅグループの血清において肝機能マーカー（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の濃度が有意に減少したことが見られた（図５及び図６）。
【0149】
また、Ｈ＆Ｅ染色及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅの処理後の形態変化を観察した結果、ＭＣＤ＋ＰＢＳグループに比べて、ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅグループにおいてより少ない数の脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）及び炎症細胞の浸潤減少が発見されたし（図７）、ＮＡＦＬＤ深刻度の指標であるＮＡＳ点数分析は、ＭＣＤ＋ＢｘＣ－Ｖ３７ｅグループにおいて減少した（図８）。要するに、このようなデータは、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅが一般的にＮＡＳＨにおいて肝機能を改善させるということを示唆する。
【0150】
２－３．誘導万能幹細胞由来間葉系幹細胞前駆細胞由来エクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）の脂肪細胞分化抑制効果確認
ヒト脂肪細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を６ウェルプレートに分注し、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２培養器でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態に育つまで（最大で６日）培養させた。
ヒト脂肪細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）を６ウェルプレートに分注し、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）を用いて３７℃、５％ ＣＯ２培養器でコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態に育つまで（最大で６日）培養させた。
【0151】
脂肪細胞を６日培養した後、１％ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に、脂肪分化培地［３４μＭパントテン酸塩（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）、６６μＭビオチン（ｂｉｏｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）及び０．０５Ｍ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）］が添加された基本培地で５日間培養した。その後、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）に脂肪分化培地［３４μＭパントテン酸塩（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）、６６μＭビオチン（ｂｉｏｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭインスリン（Ｓｉｇｍａ）及び１ｍＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｓｉｇｍａ）］が添加された培地でさらに９日間培養した。
【0152】
このとき、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、１０％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で１４日間培養した脂肪細胞、溶媒対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＢｘＣ－ｅを処理せずに脂肪分化条件で１４日間培養された脂肪細胞であり、ＢｘＣ－ｅ処理群は、ＢｘＣ－ｅが含まれた脂肪分化条件において１４日間培養された脂肪細胞である。
【0153】
培養液を完全に除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液を４００ｕｌ／ｗｅｌｌで添加して細胞を１時間固定させた。ＰＢＳで洗浄し、オイルレッドＯ標準溶液（Ｏｉｌ－ｒｅｄ Ｏ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を４００ｕｌ／ｗｅｌｌで添加し、分化した脂肪細胞内の脂肪を２時間染色させた。その後、オイルレッドＯ標準溶液を除去し、二次蒸留水を用いてウェルの壁に付いているオイルレッドＯ標準溶液を完全に除去した後、乾燥器に入れて５分間乾燥させた後、イソプロピルアルコール（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を５００ｕｌ／ｗｅｌｌになるようにウェルに添加した。
【0154】
マイクロプレートリーダ（Ｍｏｄｅｌ ６８０ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定し、脂肪の量を比較した。
【0155】
図９から確認できるように、本発明のＢｘＣに由来するエクソソーム（ＢｘＣ－ｅ）は、脂肪細胞の脂肪形成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）を抑制する効果に優れていることが分かる。
【0156】
２－４．エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質を用いた非アルコール性脂肪肝疾患診断の正確度評価
免疫ブロット分析を用いてＢｘＣ－Ｖ３７ｅにおいてＡｐｏＡ－１タンパク質レベルを定量的比較した。分析の結果、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質は、ＮＡＳＨマウスでは減少したのに対し、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与した動物では増加した（図１０及び図１１）。また、血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１は、対照群に比べてＮＡＦＬＤを有する肥満患者において減少した（図１２）。
免疫ブロット分析を用いてＢｘＣ－Ｖ３７ｅにおいてＡｐｏＡ－１タンパク質レベルを定量的比較した。分析の結果、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質は、ＮＡＳＨマウスでは減少したのに対し、ＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与した動物では増加した（図１０及び図１１）。また、血清中のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１は、対照群に比べてＮＡＦＬＤを有する肥満患者において減少した（図１２）。
【0157】
そして、ＥＬＩＳＡ分析によって得たヒトの血清ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１数値と非アルコール性脂肪肝疾患関連代謝パラメータ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）との相関関係を、ＳＰＳＳ統計プログラムを用いてスピアマン（ｓｐｅａｒｍａｎ）方式で分析した。Ｒ値が（＋）であれば正の相関関係を、（－）であれば負の相関関係を意味し、ｐ値が０．０５以下であれば統計的な有意性を有すると見なした。
【0158】
相関関係分析の結果、ヒトの血清においてＡｐｏＡ－１と代謝パラメータとの相関関係を分析したとき、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１とほぼ全ての非アルコール性脂肪肝疾患関連代謝パラメータは強い負の相関関係を示した（図１３～図２４）。そして、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１と非アルコール性脂肪肝疾患の関連代謝パラメータとの相関関係は、ＴＣ指標以外にはいずれも、ヒト血清ＡｐｏＡ－１と代謝パラメータとの相関関係よりも強力であることが観察された（図２５～図３６）。
【0159】
このような結果は、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質を用いた非アルコール性脂肪肝疾患の診断が、既存の血清中ＡｐｏＡ－１タンパク質をマーカーとして用いて非アルコール性脂肪肝疾患を診断する方法に比べて、飛び切り高い正確度で当該疾患を識別できることを意味し、血清中エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１が非アルコール性脂肪肝疾患に対する新しいバイオマーカーとして利用可能であることを示唆する。
【0160】
２－５．エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質を用いた非アルコール性脂肪肝疾患予後予測の正確度評価
ＮＡＳＨ治療剤投与後に血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１が既存ＮＡＳＨ関連パラメータの変化をどれくらいよく反映するかをテストし、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１を用いた予後分析正確度を評価した。
ＮＡＳＨ治療剤投与後に血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１が既存ＮＡＳＨ関連パラメータの変化をどれくらいよく反映するかをテストし、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１を用いた予後分析正確度を評価した。
【0161】
ＭＣＤ食餌マウスに、ＮＡＳＨ治療候補物質として知られたデュラグルチド（Ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）、ＢｘＣ－ｅ及びＢｘＣ－Ｖ３７ｅを投与し、ＰＢＳグループ対比の、血清中ＡｐｏＡ－１とエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の既存ＮＡＳＨ関連パラメータであるＡＳＴ、ＡＣＣ１、ｈｓ－ＣＲＰ、ＮＲＦ２、ＰＣＮＡ、ＡｎｎｅｘｉｎＡ５数値及びオイルレッドＯ染色結果の変化率の連関性を計算した後、ＳＰＳＳ統計プログラムの単純回帰分析（ｓｉｍｐｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて統計分析した（Ｐ値が０．０５以下であれば、統計的な有意性を有すると見なす。）。
【0162】
実験の結果、図３７～図４０から確認できるように、ＭＣＤ食餌マウスのデュラグルチド投与群のＰＢＳグループ対比ＡＳＴ、ＡＣＣ１、ｈｓ－ＣＲＰ及びＮＲＦ２数値の変化率は、ＰＢＳグループとデュラグルチド投与群間の血清中ＡｐｏＡ－１の変化率に比べて、ＰＢＳグループとデュラグルチド間のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の変化率とより有意な相関関係を有することが確認された。
【0163】
そして、図４１～図４４から確認できるように、ＭＣＤ食餌マウスのＢｘＣ－Ｖ３７ｅ投与群のＰＢＳグループ対比ＡＳＴ、ＡＣＣ１、ｈｓ－ＣＲＰ及びＰＣＮＡ数値の変化率は、ＰＢＳグループとＢｘＣ－Ｖ３７ｅ投与群間の血清中ＡｐｏＡ－１の変化率に比べて、ＰＢＳグループとＢｘＣ－Ｖ３７ｅ間のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の変化率とより有意な相関関係を有することが確認された。
【0164】
さらに、図４５～図４７から確認できるように、ＢｘＣ－ｅを投与した場合にも、ＭＣＤ食餌マウスのＢｘＣ－ｅ投与群のＰＢＳグループ対比ｈｓ－ＣＲＰ及びＡｎｎｅｘｉｎＡ５数値及びオイルレッドＯ染色結果の変化率は、ＰＢＳグループとＢｘＣ－ｅ投与群間の血清中ＡｐｏＡ－１の変化率に比べて、ＰＢＳグループとＢｘＣ－ｅ投与群間のエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１の変化率とより有意な相関関係を有することが確認された。
【0165】
これらの結果は、デュラグルチド、ＢｘＣ－ｅ又はＢｘＣ－Ｖ３７ｅのような治療剤を投与した後に、肝機能指標及び脂肪生成指標、炎症指標の変化程度を、血清中ＡｐｏＡ－１に比べてエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１がより正確に反映することを示す。したがって、本発明に係る非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物は、既存の予後予測組成物又は予後予測方法に比べてより正確に非アルコール性脂肪肝疾患の改善程度を正確に反映でき、非アルコール性脂肪肝疾患の診断と関連して様々に利用可能であることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【0166】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の診断用マーカーに関し、より詳細には、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、高い正確度で非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を診断できる組成物及びこれを含むキットに関する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与された個体からの生物学的試料に用いられる、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用組成物。
【請求項2】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与された個体からの生物学的試料に用いられる、非アルコール性脂肪肝疾患の予後予測用キット。
【請求項6】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項５に記載のキット。
【請求項7】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項５に記載のキット。
【請求項8】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットである、請求項５に記載のキット。
【請求項9】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の治療剤を投与した個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）の予後予測のための情報提供方法。
【請求項10】
測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含む、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項11】
前記測定段階は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含む、請求項１０に記載の情報提供方法。
【請求項12】
前記生物学的試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項13】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項14】
前記情報提供方法は、非アルコール性脂肪肝疾患の発病が疑われる個体から分離された試料から測定されたエクソソーム由来ＡｐｏＡ－１タンパク質のレベルが、正常対照群の試料から分離された試料から測定されたレベルよりも低い場合に、非アルコール性脂肪肝疾患の発病危険が高いか、非アルコール性脂肪肝疾患の予後が悪いと判定する、請求項９に記載の情報提供方法。
【請求項15】
エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体からの生物学的試料に用いられる、非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項16】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１５に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項17】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１５に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項18】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体の断片及び組換え抗体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項１７に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用組成物。
【請求項19】
エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する製剤を含み、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体からの生物学的試料に用いられる、非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項20】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項１９に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項21】
前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的な抗体又はアプタマーを含むものである、請求項１９に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項22】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キットである、請求項１９に記載の非アルコール性脂肪肝疾患診断用キット。
【請求項23】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）が発病した或いは発病が疑われる個体から分離された生物学的試料から、エクソソーム由来ＡｐｏＡ－１（Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＡｐｏＡ－１）タンパク質のレベルを測定する測定段階を含む、個体の非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）診断のための情報提供方法。
【請求項24】
測定されたタンパク質のレベルを、正常対照群の試料から測定された値と比較する比較段階をさらに含む、請求項２３に記載の情報提供方法。
【請求項25】
前記測定段階は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーを試料と接触させる接触段階を含む、請求項２４に記載の情報提供方法。
【請求項26】
前記生物学的試料は、個体から分離された組織、細胞、全血、血清又は血漿からなる群から選ばれるいずれか一つ以上である、請求項２３に記載の情報提供方法。
【請求項27】
生物学的試料から測定した値が正常対照群試料の値よりも低い場合に非アルコール性脂肪肝疾患であると判定する判定段階をさらに含む、請求項２４に記載の情報提供方法。
【請求項28】
前記非アルコール性脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）である、請求項２３に記載の情報提供方法。
【国際調査報告】