特表 2024-521105 肺癌の処置用組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-28

(54)【発明の名称】肺癌の処置用組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240521BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240521BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240521BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240521BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240521BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240521BHJP

   A61K 33/243 20190101ALN20240521BHJP

   A61K 31/282 20060101ALN20240521BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240521BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 U

A61K39/395 N ZNA

A61P11/00

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61P37/04

A61K33/243

A61K31/282

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571866

(86)(22)【出願日】2022-05-24

(85)【翻訳文提出日】2023-11-20

(86)【国際出願番号】 EP2022064061

(87)【国際公開番号】W WO2022248478

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】63/192,217

(32)【優先日】2021-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ジャーコウスキー，ザ サード，アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】デニス，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】トラーニ，レオ

(72)【発明者】

【氏名】ニュートン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】シャイア，ノラ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA59

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA12

4C086HA28

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA59

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206JB16

4C206KA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZA59

4C206ZB09

4C206ZB26

4C206ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

開示されるのは、局所進行性の（病期ＩＩＩ）、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を、化学放射線療法（ｃＣＲＴ）と同時に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１活性を阻害する抗体により処置する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法であって、前記患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法。

【請求項2】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記化学放射線療法は白金ベースである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項6】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はスゲマリマブである、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項7】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処置は、１５００ｍｇの前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を前記患者に静脈内に４週毎（Ｑ４Ｗ）に投与することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、病期ＩＩＩである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、局所進行性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学放射線療法の１日目に投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法であって、前記患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法。

【請求項12】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記化学放射線療法は白金ベースである、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はスゲマリマブである、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項17】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処置は、１５００ｍｇの前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を前記患者に静脈内に４週毎（Ｑ４Ｗ）に投与することを含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、病期ＩＩＩである、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、局所進行性である、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学放射線療法の１日目に投与される、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を処置する方法であって、前記患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法。

【請求項22】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記化学放射線療法は白金ベースである、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項26】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はスゲマリマブである、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項27】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処置は、１５００ｍｇの前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を前記患者に静脈内に４週毎（Ｑ４Ｗ）に投与することを含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学放射線療法の１日目に投与される、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に使用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せ。

【請求項30】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に使用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せ。

【請求項31】

病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に使用される抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せ。

【請求項32】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体はヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項33】

前記化学放射線療法は白金ベースである、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項34】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項３２又は３３に記載の使用のための組合せ。

【請求項35】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、
配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１；及び
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２；及び
配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；及び
配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１；及び
配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２；及び
配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む、請求項３２又は３３に記載の使用のための組合せ。

【請求項36】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はスゲマリマブである、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項37】

前記ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体による処置は、１５００ｍｇの前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を前記患者に静脈内に４週毎（Ｑ４Ｗ）に投与することを含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項38】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、病期ＩＩＩである、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項39】

前記切除不能なＮＳＣＬＣは、局所進行性である、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項40】

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学放射線療法の１日目に投与される、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。

【請求項41】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に使用される薬剤の製造における抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用。

【請求項42】

切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に使用される薬剤の製造における抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用。

【請求項43】

病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に使用される薬剤の製造における抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

肺癌は、数十年間、世界で最も共通する癌であり、２０１２年までに概算１８０万の新しい症例があり、新しい全ての癌の１２．９％に相当した。また、癌による最も一般的な死因であり、１５９万人の死亡（総計の１９．４％）があった。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、全肺癌のおよそ８０％～８５％を占め、患者の３０％はＩＩＩ期疾患を示す。パフォーマンスステータス（ＰＳ）が良好であり、且つ切除不能なＩＩＩ期ＮＳＣＬＣの患者の標準的な処置は、根治目的で同時に施される白金ベースのダブレット化学療法及び放射線療法（ｃＣＲＴ）である。逐次ＣＲＴに対して同時ＣＲＴのメタアナリシスは、同時療法によるより良好な転帰を実証したが、ｃＣＲＴによっても、５年全生存率（ＯＳ）は１５％～３２％に及ぶ。したがって、ｃＣＲＴを超えて患者生存率をブーストさせる新規な治療的アプローチの大きな必要性は、まだ満たされていない。

【0002】

腫瘍微環境内での腫瘍及び骨髄細胞上のプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、活性化Ｔ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ－１に結合して、その活性を阻害する。デュルバルマブは、ＰＤ－１及びＣＤ８０に対するＰＤ－Ｌ１の結合をブロックして、Ｔ細胞が腫瘍細胞を認識して殺傷することを可能にする選択的且つ高親和性のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。デュルバルマブは、複数の進行型固形腫瘍にわたる早期臨床研究において、抗腫瘍活性を促進することを示しており、白金後の局所進行性の、又は転移性の尿路上皮癌に関して承認されている。

【0003】

局所進行性の癌の臨床管理方法の向上についての必要性に対処する際に、本開示は、後期の、局所進行性の、切除不能なＮＳＣＬＣを患う患者に対して、化学放射線療法（ｃＣＲＴ）と同時にデュルバルマブの投与を含む方法を提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、一般に、局所進行性の（病期ＩＩＩ）、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を、化学放射線療法（ｃＣＲＴ）と同時に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１活性を阻害する抗体により処置する方法に関する。

【0005】

本明細書中で提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法であって、患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法である。

【0006】

また、本明細書中で提供されるのは、切除不能なＮＳＣＬＣを患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法であって、患者を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法である。また、本明細書中で提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に用いられる抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せである。

【0007】

また、本明細書中で提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に用いられる抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せである。

【0008】

また、本明細書中で提供されるのは、病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に用いられる抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せである。

【0009】

また、提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用である。

【0010】

また、提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用である。

【0011】

また、提供されるのは、病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】［図１］本明細書中で開示される方法についての一般的な研究設計を示す。

【図2】［図２Ａ］処置スケジュール及び定義済みのエンドポイントを示すスキーマである。各群は、６頭のマウスを含有した。腫瘍がおよそ１００～２００ｍｍ^３となったときに放射線療法（ＲＴ）を施した。アッセイの時点は、示すとおりであった。［図２Ｂ］長手方向経路分析のバブルダイアグラム（表４由来）を示す。経路がＹ軸上に、時点がＸ上に記載されている。バブルのサイズは、各経路の絶対倍率変化発現値を示す。［図２Ｃ］切除時の腫瘍容量を示す。データを、平均±ＳＥＭとして表した。各群は、６頭のマウスを含有した。＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定。

【図3】［図３Ａ－３Ｃ］各時点でのＮＴ腫瘍とＲＴ腫瘍間の差別的に調節された遺伝子及び上流レギュレータを示すネットワークマップを示す。遺伝子及び上流レギュレータは、ＲＴによる処置後１日目（図３Ａ）、３日目（図３Ｂ）、及び７日目（図３Ｃ）にて、それらの細胞コンパートメントに分けられる。［図３Ｄ］長手方向経路分析のバブルダイアグラム（表３のデータ由来）を示す。経路がＹ軸上に、時点がＸ上に記載されている。バブルの色は、遺伝子調節の方向を示す。バブルのサイズは、この経路の絶対倍率変化発現値を示す。経路の略語：樹状細胞（ＤＣ）とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞間のクロストーク；細菌及びウイルスの認識－細菌及びウイルスの認識におけるパターン認識受容体の役割；自然免疫系及び適応免疫系－自然免疫細胞と適応免疫細胞間の伝達。

【図4】［図４Ａ－４Ｆ］ＲＴが、腫瘍浸潤骨髄細胞集団の変化の原因となることを示す。細胞を、ＲＴ（又は時間がマッチするＮＴ対象）後の１、３、又は７日目の非処置（ＮＴ）（黒色のバー）又はＲＴ処置（７Ｇｙ）（灰色のバー）腫瘍から単離した。図４Ａは、Ｆ４／８０^＋細胞の存在についてフローサイトメトリによって分析した腫瘍試料を示す。図４Ｂ及び４Ｃは、Ｆ４／８０^＋細胞上でのＣＤ８６及びＣＤ２０６の発現（ＭＦＩ）を示す。描写的なヒストグラムが、アイソタイプ対照（黒色の線）、ＮＴ（黒色の実線）、及びＲＴ（灰色の線）と対応する棒グラフの上に示されている。図４Ｄは、Ｆ４／８０^＋であったＣＤ８６^＋細胞及びＣＤ２０６^＋細胞のパーセンテージを示し、箱ひげプロットは、ＮＴ（黒色）又はＲＴ処置（灰色）腫瘍についてのＣＤ８６^＋／ＣＤ２０６^＋比を示す。図４Ｅ及び４Ｆは、腫瘍組織内でのＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｌｏ及びＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｈｉ細胞の頻度を示す。平均±ＳＥＭがプロットされている。各群は、６頭のマウスを含有した。ＮＴを、照射を受けた群と比較した場合の＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。

【図5】［図５Ａ－５Ｆ］ＲＴが、腫瘍浸潤リンパ球の頻度及び表現型に影響を与えたことを示す。細胞を、ＲＴ（又は時間がマッチするＮＴ対象）後の１、３、又は７日目の非処置（ＮＴ）（黒色のバー）又はＲＴ処置（７Ｇｙ）（灰色のバー）腫瘍から単離した。図５Ａ及び５Ｂは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋腫瘍浸潤Ｔ細胞の頻度を示す。図５Ｃ及び５Ｄは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＣＤ６９発現を示す。図５Ｅは、ＣＤ４^＋集団のパーセンテージとして表される腫瘍浸潤ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋（Ｔ_ｒｅｇ）細胞を示す。図５Ｆは、ＣＤ８^＋細胞の、Ｔ_ｒｅｇ細胞に対する比率を示す。平均±ＳＥＭがプロットされている。各群は、６頭のマウスを含有した。ＮＴを、照射を受けた群と比較した場合の＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。

【図6】［図６Ａ－６Ｇ］ＲＴが、腫瘍内でのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１双方の高い発現をもたらし、これが処置の有効性を軽減したことを示す。細胞を、ＲＴ（又は時間がマッチするＮＴ対象）後の１、３、又は７日目の非処置（ＮＴ）（黒色のバー）又はＲＴ処置（７Ｇｙ）（灰色のバー）腫瘍から単離した。図６Ａ及び６Ｂは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＰＤ－１発現を示す。図６Ｃ及び６Ｄは、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞上でのＰＤ－Ｌ１発現を示す。図６Ｅは、ＣＤ４５^－腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１発現を示す。平均±ＳＥＭがプロットされている。ＮＴを、照射を受けた群と比較した場合の＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。図６Ｆ及び６Ｇは、７Ｇｙ ＲＴ単独での、又は１０ｍｇ／ｋｇにて１週間３ｑｗに投与されるαＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂと組み合わせた処置後の、腫瘍が確立されたマウスの腫瘍増殖曲線及びカプラン・マイアー曲線を示す。実験群は、少なくとも６頭のマウスを含有し、２つの独立した研究を代表する。７Ｇｙ ＲＴ単独と比較した^＋＋Ｐ＜０．０１。ＮＴ対照と比較した＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図7】［図７Ａ－７Ｂ］時間がマッチする未処置対照腫瘍のパーセンテージとして、７Ｇｙ ＲＴ後の１、３、及び７日目に取り出した、照射を受けた腫瘍組織からの系統（図７Ａ）及び表現型（図７Ｂ）マーカーの倍率変化を示すヒートマップを示す。太い箱で囲んだ値は、時間がマッチする未処置の試料と比較して、統計学的に有意であったものである。各群は、６頭のマウスを含有した。（マン・ホイットニーＵ、Ｐ＜０．０５）。

【図8】［図８Ａ－８Ｄ］腫瘍細胞集団の分析に使用したゲーティング戦略を示す。図８Ａは、白血球ゲートを描くのに用いた、脾臓から単離した生きている白血球上でのゲーティングを示す。図８Ｂは、腫瘍組織におけるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ ＦｏｘＰ３^＋細胞を示す。図８Ｃは、脾臓及び腫瘍組織におけるＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｌｏ及び^ｈｉ集団を示す。図８Ｄは、ＣＤ４５^－腫瘍細胞を示す。

【図9】［図９］ＮＴ（黒色）又は７Ｇｙ（灰色）ＲＴ後の１、３、又は７日目に単離した腫瘍組織内でのＣＤ４５^＋細胞のパーセンテージを示す。Ｐ＜０．０１、マン・ホイットニーＵ。各群は、６頭のマウスを含有した。＊＊Ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定。

【図10】［図１０Ａ－１０Ｂ］ＮＴ及びＲＴ処置腫瘍組織由来のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋細胞におけるＣＤ６９（図１０Ａ）及びＰＤ－１（図１０Ｂ）発現の描写的なヒストグラムを示す。図１０Ａは、空のヒストグラムがアイソタイプ対照であることを示す。図１０Ｂは、パターン化されたヒストグラムがアイソタイプ対照であることを示し、黒色の線はＮＴであり、灰色の線は７Ｇｙ ＲＴである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

特に定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての科学技術用語は、本開示が属する当該技術の当業者によって一般的に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本開示で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供するものである：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書中で用いられる以下の用語は、別段の指定がない限り、以下のものに帰属する意味を有する。

【0014】

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び「有している（ｈａｖｉｎｇ）」等は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得；「から本質的になる」又は「本質的になる」は、同様に、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し得、開放型（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）であり、列挙されているものの基本的又は新規な特性が、列挙されているもの以外の存在により変化しない限り、列挙されているもの以外の存在を許容するが、先行技術の態様を除外する。

【0015】

特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で用いられる用語「又は」は、包括的であると理解される。特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で用いられる用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、単数形又は複数形であると理解される。

【0016】

特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で用いられる用語「約」は、当該技術における通常の許容範囲内、例えば、平均値の２標準偏差内として理解される。約は、明示される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解され得る。文脈から明確である場合を除き、本明細書中で提供される全ての数値は、用語約によって修飾される。

【0017】

本明細書中で提供されるあらゆる組成物又は方法は、本明細書中で提供される他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わされ得る。

【0018】

本明細書中で提供される範囲は、当該範囲内の値の全てに関する省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群からのあらゆる数字、数字の組合せ、又は下位範囲を含むと理解される。

【0019】

本明細書中で用いられる「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を指す。例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、米国特許第８，７７９，１０８号明細書及び米国特許第９，４９３，５６５号明細書に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0020】

本明細書中で用いられる用語「デュルバルマブ」は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４９３，５６５号明細書（ここでデュルバルマブは「２．１４Ｈ９ＯＰＴ」と称される）に開示されるとおり、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合し、且つＰＤ－Ｌ１の、ＰＤ－１受容体及びＣＤ８０受容体への結合をブロックする抗体を指す。デュルバルマブの結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン断片は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）を媒介する役割を果たす補体成分Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体への結合を引き下げるＩｇＧ１重鎖の定常ドメイン内の三重変異を含有する。デュルバルマブは、ヒトＴ細胞活性化のＰＤ－Ｌ１媒介抑制をインビトロで軽減し得、異種移植モデルにおいて、Ｔ細胞依存性の機構を介して腫瘍増殖を阻害する。

【0021】

「完全奏効」（ＣＲ）は、測定可能であろうとなかろうと、全ての病変の消失、及び新たな病変なしを指す。初めて記述した日時から４週間以上の、繰返しの継続的な評価を用いて、確証を得ることができる。新たな測定不可能病変は、ＣＲを排除する。

【0022】

「部分寛解」（ＰＲ）は、ベースラインに対して≧５０％の腫瘍負荷の低下を指す。初めて記述した日時から少なくとも４週の継続的な繰返しの評価を用いて、確証を得ることができる。

【0023】

「進行性疾患」（ＰＤ）は、最小記録（最下点）に対して≧２５％の腫瘍負荷の増大を指す。初めて記述した日時から少なくとも４週の継続的な繰返しの評価によって、確証を得ることができる。新たな測定不可能病変は、ＰＤを定義しない。

【0024】

「安定」（ＳＤ）は、ＣＲ、ＰＲ、又はＰＤの基準を満たさないことを指す。ＳＤは、ベースラインに対して５０％の腫瘍負荷の低下が確立され得ず、且つ最下点と比較して２５％の増大が確立され得ないことを示す。

【0025】

非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、ＮＳＣＬＣの３つの主要なサブタイプ：扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞（未分化）癌のいずれかを指し得る。他のサブタイプとして、腺扁平上皮癌及び肉腫様癌が挙げられる。

【0026】

本明細書中で用いられる「ＰＤ－Ｌ１」は、ＰＤ－Ｌ１配列に対して少なくとも約８５％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列、又はその断片を指し得る。ＰＤ－Ｌ１は、当該技術において、Ｂ７－Ｈ１とも称される。一部の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド、又はその断片は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１２５４６３５に対して少なくとも約８５％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し、そしてＰＤ－１及びＣＤ８０結合活性を有する。
ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド配列
ＮＣＢＩ登録番号 ＮＰ＿００１２５４６３５

【化1】

【0027】

一部の実施形態において、「ＰＤ－Ｌ１核酸分子」は、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例示的なＰＤ－Ｌ１核酸分子配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００１２６７７０６で提供される。
ＰＤ－Ｌ１核酸配列
ＮＣＢＩ登録番号 ＮＭ＿００１２６７７０６ ｍＲＮＡ

【化2】

【化3】

【化4】

【0028】

プログラム死－１（「ＰＤ－１」）は、Ｔ細胞レギュレータの拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーの約３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．“Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ ＰＤ－１，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｍｂｅｒ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｕｐｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ，”ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７－９５（１９９２）参照）。

【0029】

ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球上で（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ－１ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔ ａｎｄ Ｂ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（５）：７６５－７２ （１９９６）； Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｂｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ ＡＰＣ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５５３８－４５ （２００２））、そして低レベルにてナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞内で発現される（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｔａ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｙｍｕｓ ｏｆ ＰＤ－ｌ－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ，”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：８９１－９８（２０００）；Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１７（４）：２８８－９８（２００７））。ＰＤ－１は、ＰＤＬ－１又はＰＤＬ－２の結合による活性化に続く免疫系の下方制御を担う受容体であり（Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｏｚｃｏ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７））、細胞死誘導物質として機能する（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｓｕｂｕｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｖｅｒｓｅ Ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．８３：１９３－２０２ （２００５）；Ｌａｚａｒ－Ｍｏｌｎａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－１（ＰＤ－１）ａｎｄ Ｉｔｓ Ｌｉｇａｎｄ ＰＤ－Ｌ２，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（３０）：１０４８３－８８（２００８））。このプロセスは、多くの腫瘍において、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を介して利用されて、免疫応答の抑制の原因となる。

【0030】

ＰＤ－１は、腫瘍学において免疫媒介治療に関して十分検証された標的であり、なかでも黒色腫及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置においては臨床試験はポジティブである。ＰＤ－１／ＰＤＬ－１相互作用の拮抗阻害は、Ｔ細胞活性化を増大させて、宿主免疫系による腫瘍細胞の認識及び排除を増強する。感染症及び腫瘍を処置するための、そして適応免疫応答を上方調節するための抗ＰＤ－１抗体の使用が提案されている。

【0031】

本明細書中で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン又はその断片若しくは誘導体を指し、インビトロ又はインビボのいずれで生成されるかに拘わらず、抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドを包含する。当該用語は、以下に限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、ヒト単鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異した、及びグラフト化抗体を含む。本開示のために、「インタクトな抗体」のように用語「インタクト」によって修飾されている場合を除き、用語「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ等の抗体断片、及び抗原結合機能、すなわちＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する能力を保持する他の抗体断片も包含する。典型的には、そのような断片は、抗原結合ドメインを含む。

【0032】

本明細書中で用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。

【0033】

本明細書中で用いられる用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」、及び「結合断片」は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。場合により、抗原が大きい場合、抗原結合ドメインは、抗原の一部のみに結合し得る。抗原結合ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の一部は、「エピトープ」又は「抗原決定基」と称される。抗原結合ドメインは、典型的に、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）及び抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む；しかしながら、必ずしも双方を有する必要はない。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片は、Ｖ_Ｈドメインのみからなるが、依然として、インタクトな抗体の一部の抗原結合機能を保持する。

【0034】

抗体の結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって生成される。結合断片として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び単鎖抗体が挙げられる。「二重特異的」又は「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一である抗体と理解される。酵素パパインによる抗体の消化により、「Ｆａｂ」断片としても知られている２つの同一の抗原結合断片、及び抗原結合活性はないが結晶化する能力を有する「Ｆｃ」断片が生じる。酵素ペプシンによる抗体の消化により、抗体分子の２つのアームが連結されたままで２つの抗原結合部位を備えるＦ（ａｂ’）２断片が生じる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。本明細書中で用いられる用語「Ｆｖ」は、抗原認識部位及び抗原結合部位の双方を保持する抗体の最小断片を指す。本明細書中で用いられる用語「Ｆａｂ」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨＩドメインを含む抗体の断片を指す。

【0035】

本明細書中で用いられる用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。本開示の抗体は、限定されないが、全天然抗体、二重特異的抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、及び非慣用抗体を含む。

【0036】

本明細書中で用いられる用語「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見出されるような通常伴われる成分を、種々の程度で含まない物質を指す。「単離する」は、起源又は周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」は、単離よりも高い分離度を示す。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も、タンパク質の生物学的特性に物質的に影響を及ぼしたり、その他の有害な帰結を引き起こしたりしないように、その他の物質から十分に解放されている。

【0037】

本明細書中で用いられる用語「特異的に結合する」は、分子（例えばポリペプチド）を認識し、且つこれに結合するが、試料、例えば生体試料中の他の分子を実質的に認識し、且つこれに結合しない化合物（例えば抗体）に言及することを意味する。例えば、特異的に結合する２つの分子は、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成する。特異的結合は、高い親和性及び低～中程度のキャパシティを特徴とし、これらは通常、親和性が低く、キャパシティが中程度～高い非特異的結合と区別される。典型的には、結合は、親和定数Ｋ_Ａが１０^６Ｍ^－１よりも高いか、又はより好ましくは１０^８Ｍ^－１よりも高い場合に、特異的であるとみなされる。必要であれば、非特異的結合は、結合条件を変化させることによって、特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく引き下げることができる。結合を可能するのに適切な結合条件、例えば、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度は、常用の技術を用いて当業者によって最適化され得る。

【0038】

本明細書中で一般に用いられる用語「処置する」、「処置している」、「処置」等は、障害若しくは疾患、及び／又は障害若しくは疾患と関連する徴候の進行を和らげ、改善し、又は遅延させることを指す。除外するものではないが、障害、疾患、又は症状の処置は、障害、疾患、若しくは症状、又は関連する徴候を完全に排除することを要求するものではないことが認識されよう。ＮＳＣＬＣに関連する特定の実施形態において、「処置する」、「処置している」、「処置」は、一次又は二次臨床エンドポイントのいずれか１つ又は組合せを達成することを指し得る。

【0039】

本明細書中で提供されるのは、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法であって、患者を、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法である。

【0040】

また、本明細書中で提供されるのは、切除不能なＮＳＣＬＣを患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法であって、患者を、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法である。

【0041】

また、本明細書中で提供されるのは、病期ＩＩＩの切除不能なＮＳＣＬＣを患う患者を処置する方法であって、患者を、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法により同時に処置することを含む方法である。

【0042】

一部の実施形態において、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ、又はスゲマリマブである。一部の実施形態において、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ、アベルマブ、又はアテゾリズマブである。一部の実施形態において、ヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体はデュルバルマブである。

【0043】

本明細書中で提供される方法に用いられるデュルバルマブ及びその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖、又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。デュルバルマブ軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１で示され、そしてデュルバルマブ重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号２で示される。デュルバルマブ重鎖可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、及び配列番号５（ＣＤＲ３）で示され、そしてデュルバルマブ軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号６（ＣＤＲ１）、配列番号７（ＣＤＲ２）、及び配列番号８（ＣＤＲ３）で示される。

【0044】

一部の実施形態において、本明細書中で提供される方法に用いられるデュルバルマブ又はその抗原結合断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、本明細書中で提供される方法に用いられるデュルバルマブ又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、配列番号３～５のＫａｂａｔ定義ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号６～８のＫａｂａｔ定義ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。当業者であれば、当業者に知られているＣｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義、又は他のＣＤＲ定義を容易に識別するであろう。一部の実施形態において、本明細書中で提供される方法に用いられるデュルバルマブ又はその抗原結合断片は、米国特許第８，７７９，１０８号明細書及び米国特許第９，４９３，５６５号明細書（これらの文献はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示される２．１４Ｈ９ＯＰＴ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖のＣＤＲ配列を含む。

【0045】

デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、患者に利益を提供しながら４週毎に１回投与され得る。更なる実施形態において、患者は、追加の後続用量が投与される。後続用量は、患者の年齢、体重、臨床的評価、腫瘍負荷、及び／又は主治医の判断が挙げられる他の要因に応じて、種々の時間間隔で投与され得る。

【0046】

一部の実施形態において、複数回用量のデュルバルマブ又はその抗原結合断片が患者に投与される。一部の実施形態において、少なくとも３回用量、少なくとも４回用量、少なくとも５回用量、少なくとも６回用量、少なくとも７回用量、少なくとも８回用量、少なくとも９回用量、少なくとも１０回用量、少なくとも１５回用量、少なくとも２６用量、又は少なくとも２０回用量超が患者に投与され得る。一部の実施形態において、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、２週毎に、２週にわたって、４週の処置期間にわたって、６週の処置期間にわたって、８週の処置期間にわたって、１２週の処置期間にわたって、２４週の処置期間にわたって、１年の処置期間にわたって、又は１年超の処置期間にわたって投与される。

【0047】

一部の実施形態において、用量間の間隔は、３週毎であり得る。一部の実施形態において、用量間の間隔は、４週毎（Ｑ４Ｗ）であり得る。一部の実施形態において、用量間の間隔は、２カ月毎（例えば、維持段階の間）であり得る。

【0048】

一部の実施形態において、患者は、抗ＰＤ－Ｌ１又はその抗原結合断片の１回以上の用量が投与され、当該用量は、１５００ｍｇの固定用量である。一部の実施形態において、患者は、４週毎に１５００ｍｇのヒト抗ＰＤ－Ｌ１が投与される。一部の実施形態において、患者は、抗ＰＤ－Ｌ１の１回以上の用量が投与され、当該用量は約２０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態において、患者は、１５００ｍｇのヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体が静脈内に４週毎（Ｑ４Ｗ）に投与される。

【0049】

一部の実施形態において、患者は、デュルバルマブ又はその抗原結合断片の１回以上の用量が投与され、当該用量は、１５００ｍｇの固定用量である。一部の実施形態において、患者は、４週毎に１５００ｍｇのデュルバルマブが投与される。一部の実施形態において、患者は、デュルバルマブの１回以上の用量が投与され、当該用量は約２０ｍｇ／ｋｇである。

【0050】

患者に投与されることとなるデュルバルマブ又はその抗原結合断片の量は、種々のパラメータ、例えば、患者の年齢、体重、臨床評価、腫瘍負荷、及び／又は主治医の判断が挙げられる他の要因に応じて調製され得、またそれらに依存し得る。一部の実施形態において、用量は固定用量である。

【0051】

一部の実施形態において、本明細書中で提供される方法に従うデュルバルマブ又はその抗原結合断片の投与は、非経口投与を介する。例えば、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、静脈内注入又は皮下注射によって投与され得る。一部の実施形態において、当該投与は、静脈内注入による。

【0052】

一部の実施形態において、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、化学放射線療法と同時に投与される。本明細書中で用いられる用語「同時に」は、デュルバルマブ又はその抗原結合断片の投与及び化学放射線療法の施用が互いに約３日以内であることを指す。一部の実施形態において、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、化学放射線療法の約２日以内に投与される。一部の実施形態において、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、化学放射線療法の約１日以内に投与される。一部の実施形態において、デュルバルマブ又はその抗原結合断片は、化学放射線療法のサイクル１の１日目に投与される。

【0053】

一部の実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、化学放射線療法の１日目に投与される。

【0054】

一部の実施形態において、化学療法は、白金ベースの治療剤を含む。

【0055】

一部の実施形態において、同時化学放射線療法は、進行型ＮＳＣＬＣを患う患者のための認められた標準的な第一選択のあらゆる処置を含む。一部の実施形態において、標準的な第一選択の処置として、化学療法、放射線療法、又は双方（化学放射線療法）が挙げられ得る。一部の実施形態において、療法は、１つ以上の白金ベースの化学療法剤を含み得る。一部の実施形態において、化学放射線療法は、白金ベースである。一部の実施形態において、１つ以上の白金ベースの化学療法剤は、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、又はそれらの組合せから選択され得る。本明細書中に記載される白金ベースの療法は、例えば、シスプラチン又はカルボプラチンを、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、ビノレルビン等の別の抗癌剤と共に投与する、シングレット又はダブレットレジメンを含み得る。

【0056】

本開示は、切除不能な局所進行性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者を処置する方法であって、患者に、ヒトＰＤ－Ｌ１抗体及び化学放射線療法を同時に施すことを含む方法に関する。開示される処置の方法は、患者の無増悪生存期間（ＰＦＳ）、全奏効率（ＯＲＲ）、全生存期間（ＯＳ）、及びランダム化から２４ヵ月目に生きている患者の割合（ＯＳ２４）の相当な向上を実現することができる。

【0057】

一部の実施形態において、当該方法は、プラセボと比較して、ＰＦＳの増大を実現する。一部の実施形態において、当該方法は、プラセボと比較して、ＯＲＲの増大を実現する。一部の実施形態において、当該方法は、プラセボに対して、ＯＳの増大を実現する。

【0058】

一部の実施形態において、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に用いられるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せが提供される。一部の実施形態において、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に用いられるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せが提供される。一部の実施形態において、病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に用いられるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せが提供される。

【0059】

一部の実施形態において、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において無増悪生存期間（ＰＦＳ）を延長する方法に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用が提供される。一部の実施形態において、切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を患う患者において全奏効率（ＯＲＲ）を増大させる方法に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用が提供される。一部の実施形態において、病期ＩＩＩの切除不能な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置に用いられる薬剤の製造におけるヒト抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び同時的な化学放射線療法を含む組合せの使用が提供される。

【0060】

全生存期間（ＯＳ）は、処置の日付から開始して、あらゆる原因による死までの期間に関する。ＯＳは、例えば、１２か月、１８か月、２４か月等の期間内の全生存期間を指す場合がある。そのような期間は、例えば、処置開始後の２４か月目に生存している患者の数（％）を指す「ＯＳ２４」として、２４か月目の全生存期間のカプラン・マイアー推定法により特定され得る。

【0061】

無増悪生存期間（ＰＦＳ）は、処置の日付から開始して、客観的な病勢進行（ＲＥＣＩＳＴ １．１）又は死（進行の不在下でのあらゆる原因による）の日付までの期間に関する。一部の実施形態において、本開示の方法は、ＰＦＳの増大を実現する。一部の実施形態において、方法は、少なくとも９か月～少なくとも約２４か月（例えば、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４か月、又はそれ以上、最大約５年）のＰＦＳを実現する。

【0062】

客観的奏効率（ＯＲＲ）は、ＲＥＣＩＳＴ １．１による完全奏効（ＣＲ）又は部分奏効（ＰＲ）の少なくとも１つの訪問奏効（ｖｉｓｉｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）がある患者の数（％）を指す。

【0063】

本明細書中に記載され、且つ実施例によって示される方法は、局所進行性の切除不能なＮＳＣＬＣの処置を実現する。一部の実施形態において、切除不能な癌として、いくつかの医学的理由の少なくとも１つのために、手術によって完全には除去され得ない癌が挙げられる。癌が切除不能であり得る理由として、例えば、腫瘍サイズ（例えば、安全に除去するには大き過ぎ、且つ／又は必須器官の部分の広範な除去を必要とし得る）、腫瘍位置（例えば、血管又は神経等の重要な構造と物理的に絡み合う腫瘍）、腫瘍の除去が、全ての癌を制御するには有効でない腫瘍転移、又は手術のリスクを許容できないレベルまで高める他の医学的状態（例えば、心疾患、肺疾患、糖尿病）が挙げられる。さらに、切除不能なＮＳＣＬＣは、可能な外科切除を許容する程度まで、腫瘍のサイズを引き下げるのに有効であり得る積極的な処置の後に、永久に切除不能というわけではない場合がある。さらに、切除不能なＮＳＣＬＣはまた、外科手術によって完全に除去されないが、１つ以上の外科手技によって部分的に除去され得るＮＳＣＬＣ（又は遠隔転移）を指し得る。例として、減量手術、並びに、肺癌の一部、及び転移性病変の一部を除去する外科手術が挙げられる。

【0064】

特定の実施形態において、本明細書中で開示される方法は、切除不能な癌に用いられ得る。

【0065】

本明細書中に記載され、且つ示される本開示の方法は、後期（例えば病期ＩＩＩ）の局所進行性の、切除不能なＮＳＣＬＣを患う患者の処置に用いられ得る。癌病期分類は、一般に知られており、且つ当該技術において受け入れられているあらゆる試験を用いて実行され得る。一部の実施形態において、癌病期分類は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ’ｓ（ＡＪＣＣ’ｓ）ＴＮＭシステムを含み得る。一般に、ＴＮＭシステムは、原発腫瘍（腫瘍、Ｔ）のサイズ及び位置；癌がリンパ節に広がっているか、そして広がっているならば、発症したリンパ節（節、Ｎ）の位置及び数；並びに癌が身体の他の部分に広がっているか、そして広がっているならば、遠隔癌（転移、Ｍ）の範囲及び位置を判定するための種々の試験及びスキャンの結果を提供する。癌の各種類は、それ自体の特定のシステムを有し得るが、ＴＮＭ病期分類システムは、一般に、文字毎にスケーリングされる点数化を用いる。

【0066】

一部の実施形態において、切除不能なＮＳＣＬＣは、病期ＩＩＩである。一部の実施形態において、切除不能なＮＳＣＬＣは、局所進行性である。一部の実施形態において、切除不能なＮＳＣＬＣは、病期ＩＩＩ且つ局所進行性である。

【0067】

腫瘍について、「Ｔ」は、一般的な腫瘍サイズ、位置、及び近隣の組織中に侵入しているかを記述する数字（例えば０～４）と関連する。より大きいか、又はより侵入的な腫瘍ほど、大きい数が付与され、そして癌に応じて、「ａ」、「ｂ」、又は「ｍ」（多発性の場合）等の小文字を加えて、更なる詳細が提供され得る。

【0068】

同様に、節について、「Ｎ」は、癌がリンパ節内に見出されたかを記述するための数字（例えば０～３）と関連し、また、癌を含有するリンパ節の数を示し得る。多くのリンパ節が癌に関与しているほど、大きい数字が割り当てられる。

【0069】

転移について、「Ｍ」は、癌が身体の他の部分に広がっているか否かを示し、広がっていなければＭ０、又は広がっていればＭ１と標識される。

【0070】

Ｔ、Ｎ、及びＭの結果を組み合わせて、癌の病期、典型的には４病期：病期Ｉ（１）～ＩＶ（４）のうちの１つが決定される。また、一部の癌は、病期が０（ゼロ）である。病期０は、近隣の組織に全く広がっていない、元の組織に局所的に留まる上皮内癌を記述する。この病期の癌は、多くの場合、通常、外科手術により腫瘍全体を除去することによって、根治できる可能性が非常に高い。病期Ｉ又は早期の癌は、典型的には、近隣の組織中に深くは増殖しておらず、且つリンパ節又は身体の他の部分に広がっていない小さい癌又は腫瘍を記述するのに用いられる。病期ＩＩ及びＩＩＩは、近隣の組織中により深く増殖しており、且つリンパ節に広がっている可能性もあるが、他の組織には転移していない、より大きい癌又は腫瘍を記述する。病期ＩＶは、身体の他の器官又は部分に広がった癌を記述し、多くの場合、進行癌又は転移性癌と同定される。

【0071】

病期分類は、回復及び推奨治療の機会を提供するために、予後因子の任意選択的な分析を含んでもよい。予後因子は、癌細胞の外観、腫瘍マーカー発現の分析、及び腫瘍遺伝学の分析に基づいて癌を病期分類することを含み得る。

【0072】

癌は、処置の有効性を判定するために、又は再発癌のより多くの情報を得るために、同じ初期システムを用いて再び病期分類され得る。

【0073】

ＮＳＣＬＣの病期分類：ＮＳＣＬＣは、５つの病期：病期０（ゼロ）及び病期Ｉ～ＩＶ（１～４）がある。病期０のＮＳＣＬＣは、癌が近隣の組織中に増殖しておらず、且つ肺の外側に広がっていないことを示す。

【0074】

病期ＩのＮＳＣＬＣは、癌が、リンパ節に広がっていない小さい腫瘍であることを示す。病期Ｉは、腫瘍のサイズに基づいて、２つのサブステージに分けられる：病期ＩＡ腫瘍は、３センチメートル（ｃｍ）幅未満であり、病期ＩＢ腫瘍は、３ｃｍ幅を超えるが５ｃｍ幅未満である。病期ＩのＮＳＣＬＣは、癌の完全な外科的除去が可能であり得る。

【0075】

病期ＩＩは、２つのサブステージ（ＩＩＡ及びＩＩＢ）に分けられる。病期ＩＩＡは、近隣のリンパ節に広がっていない５ｃｍ幅を超えるが７ｃｍ幅未満の腫瘍、又は近隣のリンパ節に広がっている５ｃｍ幅未満の小さい腫瘍のいずれかであり得る。病期ＩＩＢは、リンパ節に広がっている５ｃｍ幅を超えるが７ｃｍ幅未満の腫瘍、又は肺内の近隣の構造中に増殖していても又はいなくてもよいが、リンパ節に広がっていない７ｃｍ幅を超える腫瘍のいずれかを記述し得る。病期ＩＩのＮＳＣＬＣは外科的処置が可能であり得る一方、通常、他の治療が、この病期のＮＳＣＬＣを処置するのに必要とされる。

【0076】

病期ＩＩＩは、サブステージＩＩＩＡ又はＩＩＩＢを含む。病期ＩＩＩＡの多くの癌及び病期ＩＩＩＢのほぼ全ての癌では、リンパ節への癌の広がり又は肺内の近隣の構造中への増殖により、外科手術が困難又は不可能である。いずれの状況における外科手術も、典型的には、癌の部分除去を必要とする。

【0077】

病期ＩＶのＮＳＣＬＣは、他方の肺内の複数の領域への広がり、肺若しくは心臓の周囲の流体、又は身体内での遠隔転移と関連する。ＮＳＣＬＣは、脳、骨、肝臓、及び副腎に広がる可能性がより高い。病期ＩＶのＮＳＣＬＣは、サブステージＩＶＡ（胸部内の広がり）及びＩＶＢ（胸部外の広がり）を含む。外科手術は、殆どの病期ＩＩＩ又はＩＶのＮＳＣＬＣではめったに成功せず、鎖骨の上方のリンパ節、又は胸部内の重要な構造（例えば、心臓、大血管、又は主要な肺の構造）に広がったならば、除去が不可能となり得る。特定の態様において、本明細書中で開示される患者は、病期ＩＶのＮＳＣＬＣ患者である。

【0078】

処置の経過の後に、再発性ＮＳＣＬＣが検出される。

【0079】

本明細書中で開示される方法の実践は、特に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用するが、これらは十分に当業者の範囲内である。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）等の文献に十分に説明されている。

【実施例】

【0080】

実施例１：局所進行性の、切除不能な非小細胞肺癌（病期ＩＩＩ）を患う患者における白金ベースの化学放射線療法と組み合わせたデュルバルマブの有効性
これは、局所進行性の、切除不能なＮＳＣＬＣ（病期ＩＩＩ）を患う患者における白金ベースの化学放射線療法（ＣＲＴ）と同時に与えられるデュルバルマブ（デュルバルマブ＋標準治療［ＳｏＣ］ＣＲＴ）の有効性及び安全性を評価する、第ＩＩＩ相無作為化二重盲検プラセボ対照マルチセンター国際研究である。

【0081】

局所進行性の、切除不能なＮＳＣＬＣ（病期ＩＩＩ）を患うおよそ３９０人の患者を動員して、３００人の患者を、２：１の比率でデュルバルマブ＋ＳｏＣ ＣＲＴ又はプラセボ＋ＳｏＣ ＣＲＴにランダム化した。患者を、年齢（＜６５対≧６５歳）及び病期（ＩＩＩＡ対ＩＩＩＢ／Ｃ）によって階層化する。

【0082】

この研究における対象は、局所進行性の、切除不能な（病期ＩＩＩ）疾患を呈する組織学的に、又は細胞学的に実証されたＮＳＣＬＣの≧１８歳の大人の対象を含む。全対象が、十分な器官及び髄機能を有することが必要とされた。

【0083】

対象は、放射線療法、治験薬、化学療法、及びｍＡｂが挙げられるが、これらに限定されない、ＮＳＣＬＣ用の以前の、又は現在の処置が施されていたならば、研究への参加から排除した。

【0084】

全ての患者は、放射線療法に加えて、以下の白金ベースのＳｏＣ化学療法オプションの１つを受ける：シスプラチン／エトポシド、カルボプラチン／パクリタキセル、ペメトレキセド／シスプラチン、又はペメトレキセド／カルボプラチン。化学療法処置レジメンを、表１において概説している。

【0085】

【表1】

【0086】

【表2】

【0087】

また、患者は、ＳｏＣ ＣＲＴと同時（すなわち、サイクル１の１日目［±３日］に始める）の静注を介して、４週毎にデュルバルマブ１５００ｍｇ又はプラセボを受ける。ＳｏＣ ＣＲＴの完了後の１６週腫瘍評価時の完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）、又は安定（ＳＤ）の患者が、コンソリデーション処置（１５００ｍｇ ｑ４ｗ ＩＶ）としてデュルバルマブ／プラセボを受け続ける。ＳｏＣ ＣＲＴの完了後の１６週腫瘍評価時のＲＥＣＩＳＴ １．１定義済み放射線学的進行性疾患の患者が、追跡調査まで進む。７５ｋｇの平均体重に基づいて、１５００ｍｇのデュルバルマブｑ４ｗの固定用量が、２０ｍｇ／ｋｇ ｑ４ｗに等しい。

【0088】

この研究の主要な目的は、盲検独立中央判定（ＢＩＣＲ）によって評価される固形腫瘍バージョン１．１（ＲＥＣＩＳＴ １．１）の応答評価基準による無増悪生存に関して、プラセボ＋ＳｏＣ ＣＲＴと比較して、デュルバルマブ＋ＳｏＣ ＣＲＴの有効性を評価することである。キーセカンダリエンドポイント（すなわち、多重試験手順に含まれるもの）は、ＢＩＣＲ、全生存期間、及び無作為化から２４ヵ月目に生きている患者の割合（ＯＳ２４）によって評価される、ＲＥＣＩＳＴ １．１による客観的奏効率である。

【0089】

実施例２：放射線療法の免疫学的結果を実証する同系マウス腫瘍モデルにおける遺伝子発現
材料及び方法
マウス腫瘍モデル。マウスを、ａｓｐｅｎｃｈｉｐｓ－２ べッディング、ｓｉｚｚｌｅｎｅｓｔネスティング材料、及び段ボールトンネルを備える、最大６頭の動物が入るＴｅｃｎｉｐｌａｓｔ １２８４ＩＶＣケージ内で、特定の病原体のない条件の下で収容した。マウスを、１２／１２の明／暗サイクルで収容して、濾過水を与えて、Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ １９％タンパク質押出加工ローデントダイエットを不断給餌した。

【0090】

ＣＴ２６結腸腺癌細胞株（２０１１年にＡＴＣＣから購入）を、１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清及び１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。細胞を、３ヵ月超の間継代せず、マイコプラズマ症の不在を確認するために定期的にスクリーニングした（ＰｌａｓｍｏＴｅｓｔ，Ｓｏｕｒｃｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｋ．）。１×１０^５個のＣＴ２６細胞を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｕ．Ｋ．）の後ろ、尾の基部から１ｃｍに皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍容量を、カリパスを用いて全長×幅×奥行としてｍｍ^３で測定して、体重を１日モニターした。

【0091】

腫瘍治療。腫瘍が１００～２００ｍｍ^３に達したときに、局所放射線を送達した。マウスを、鉛のシールド内に拘束して腫瘍のみを曝露させて、１２ｍＡ、及び２Ｇｙ／分の線量率での２５０ｋＶ Ｘ線（ＭＸＲ－３２０／３６ ｘ－ｒａｙ ｔｕｂｅ，Ｃｏｍｅｔ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いる７Ｇｙの単回線量によるＩＲへの局所曝露を許容した。マウスを、時間がマッチする未処置対照と一緒に、照射の１、３、及び７日後に犠牲にした。腫瘍を収集して、フローサイトメトリによる分析にフレッシュで用いた。各腫瘍由来の少なくとも２０ｍｇの組織を、遺伝子マイクロアレイ分析のために瞬間凍結した。組合せ研究のために、マウスは、ＲＴに続いて１０ｍｇ／ｋｇのαＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（クローン１０Ｆ．９Ｇ２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｕ．Ｋ．）を受けた（１週間３ｑｗに投与し、ＲＴの１日目に始めた）。腫瘍が１０００ｍｍ^３の容量に達したときに、又は治療後の１００日目の長期生存（ＬＴ）マウスについて、マウスを犠牲にした。フローサイトメトリ表現型タイピング研究及び組合せ研究が、２件の独立実験を代表する。

【0092】

エキソンマイクロアレイ分析。マイクロアレイ評価のために、各時点にて、各処置群から５つの異なる腫瘍をサンプリングして、単回研究を行った。フレッシュな凍結ＲＮＡ抽出を、ＲＮＡＳｔａｔ ６０（Ａｍｓｂｉｏ，Ｕ．Ｋ．）を用いて行って、総ＲＮＡの品質管理試験を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．）を用いて実行した。試料を、Ｏｖａｔｉｏｎ Ｐｉｃｏ ＷＴＡ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて増幅させた。ＱＣ試験の後に、ｃＤＮＡを断片化して、Ｅｎｃｏｒｅ Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮｕＧＥＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて標識してから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイについてのＮｕＧＥＮガイドラインに従って、マウスエキソンアレイにハイブリダイズした。マイクロアレイ分析を、Ｍｏｕｓｅ Ｅｘｏｎ １．０ ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｕ．Ｋ．）を用いて実行した。全てのマイクロアレイデータをＧＥＯに寄託した（登録番号ＧＳＥ７４８７５）。

【0093】

データ解析。生のマイクロアレイデータを、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＲＭＡ）にかけて、コアトランスクリプトプローブに関して前処理／正規化した（Ｂｏｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９（２）：１８５－９３（２００３））。続いて、品質管理を、データ保全性評価後に３つの外れ値（１日目の各処置群から１つ、及び３日目の放射線処置群から１つ）を除外して実行した。Ａｆｆｙ ＡＦＦＸ対照トランスクリプトを、情報価値がないトランスクリプトと一緒に除去した（ｌｏｇ２発現閾値＜３．６４７３及び分散閾値＜０．００８８）。８５００個の確実に検出されたトランスクリプトＩＤ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘトランスクリプトクラスターＩＤ）を、分析のために残した。

【0094】

比較を、時点単位で処置群に実行して（非処置対照射）、差別的に発現されたトランスクリプトＩＤ（上方制御又は下方制御）を、０．０５のカットオフｐ値を用いて特定した（ＡＮＯＶＡ）。時点単位のトランスクリプトＩＤ毎のメジアンｌｏｇ２強度値を、未処置の腫瘍群について算出してから、等しい時点にて処置試料から減算して、時点単位の対照正規化トランスクリプト発現強度を得た。階層クラスター分析（ＨＣＡ）；非正規化、リンケージ＝Ｗａｒｄ及び距離＝アンセンタード相関（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ）を実行して、試料及びトランスクリプトＩＤ単位で対照正規化トランスクリプト発現データをクラスター化した。差別的に調節された経路カテゴリー化遺伝子セットデータを、バブルダイアグラムとして時点単位でプロットした（ＭａｔＬａｂ）。バブルの色は、遺伝子調節の方向を示す。バブルのサイズは、各経路の絶対倍率変化発現値を示す。マウス遺伝子アノテーションを、ＢｉｏＭａｒｔ（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ遺伝子ＧＲＣｍ３８．ｐ２）及びＩＤコンバータ（Ａｌｉｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－８－９ （２００７））を用いてトランスクリプトＩＤに割り当てた。機能的エンリッチメント及びネットワーク分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ，Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実行した。少なくとも１．５倍上方制御又は下方制御されたトランスクリプトを経路に、そして上流レギュレータにマップした。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙエンリッチメント分析を、ｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｒｅｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１１ ｕｐｄａｔｅ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３０７－１５．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ３７８（２０１１））内のｇ：ＧＯＳｔ機能により実行した。

【0095】

フローサイトメトリ。腫瘍を、１ｍｍ^３のピースに切り分けて、ＰＢＳ中２Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｋ．）、３００ＣＤＵ／ｍＬコラゲナーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕ．Ｋ．）、及び０．９ｍｇ／ｍＬディスパーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｋ．）中で３７℃にて４０分間インキュベートして、ＦＡＣＳバッファ（１０％ＦＣＳ入りＰＢＳ）により１００μｍ細胞ストレーナに押し通した。ＣＤ１６／ＣＤ３２ Ｆｃブロッキング抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕ．Ｋ．）とのインキュベーション後に、ＣＤ４、ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｋ．）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＣＤ２０６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｕ．Ｋ．）、ＭＨＣ－ＩＩ、Ｆ４／８０、Ｇｒ１、ＮＫｐ４６、Ｂ２２０、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４（特に明記しない限り、全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｋ．）の発現を、フローサイトメトリによって分析した。ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕ．Ｋ．）を、死んだ細胞を排除するために含めた。調節Ｔ細胞を、Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ ＃３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｋ．）を用いて分析した

【0096】

統計分析。マン・ホイットニーＵ検定を用いて、２つの群間でフローサイトメトリーデータ及び腫瘍容量を比較した。遺伝子発現プロファイリングデータを、先に記載するように評価した。ログランクマンテル・コックス検定を、生存率データに実行した。ｐ＜０．０５であれば、データは統計的に異なるとみなした。

【0097】

ＲＴは、自然免疫及び適応免疫の活性化の原因となる。確立したＣＴ２６腫瘍を有する免疫応答性Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＲＴの単回７Ｇｙ線量を受け、そして腫瘍を、早期の転写変化を特定するエキソンマイクロアレイ分析用に、処置後１、３、及び７日目に切り出した（図２Ａ及び２Ｃ）。照射を受けた腫瘍のトランスクリプトームを、非処置（ＮＴ）の、時間がマッチする対照のものと比較して、時点の少なくとも１つについて、有意に差別的に発現された（上方制御又は下方制御された）７５７個の遺伝子（＋／－１．５倍率変化及びｐ≦０．０５）を特定した（表２）。予想されるｐ５３活性化経路（放射線依存性ＤＮＡ損傷及び細胞死）に加えて、データのＩＰＡ機能的エンリッチメント分析は、自然免疫機能及び適応免疫機能について、強い偏りを強調した。これらは、抗原提示、Ｔ細胞活性化及び細胞傷害、並びにケモカイン生成を含んだ（図２Ｂ及び３、並びに表３及び４）。差別的に調節された遺伝子の数が、１日目～７日目まで明らかに増大することは、注目に値した（表２）。

【0098】

表２：異なる時点でのカットオフ閾値（≧＋／－１．５倍率変化及びｐ≦０．０５、ＡＮＯＶＡ）を満たす上方制御又は下方制御された遺伝子の数。

【0099】

【表3】

【0100】

表３：７Ｇｙ ＩＲ後のＣＴ２６腫瘍における３つの時点（１、３、及び７日目）にて差別的に発現された遺伝子（倍率変化＝＋／－１．５及びｐ≦０．０５）と関連するキー支配的免疫学的経路（ＩＰＡソフトウェアによって分析）。＊複数の時点にて関係する経路。最も有意なｐ値のトップ１０に存在する非疾患関連免疫経路を強調している。

【0101】

【表4】

【0102】

表４：免疫又は放射線調節の関連がある機能的セットへのヒートマップ（図２）由来の各クラスター（Ａ～Ｅ）内のキー遺伝子の分類。各時点（放射線処置対非処置腫瘍）での遺伝子発現倍率変化を示し、有意なｐ値をアスタリスクにより示す（ｐ≦０．０５＊；ｐ≦０．０１＊＊；ｐ≦０．００５＊＊＊）。機能分類を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｍｏｕｓｅ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｐａｎｅｌ及び著者の知識によってガイドした。

【0103】

【表5】

【0104】

【表6】

【0105】

また、応答のパターンは、各時点にて有意に差別的に調節されたトップ免疫関連上流レギュレータから増築したネットワークマップにおいて、明らかである（図３）。さらに、経路分析は、上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子の３０．８％が、免疫系プロセス（ＧＯ：０００２３７６）と関連することを強調しており、照射後の７日以内に免疫プロセスの優位性を強調する遺伝子セットと共に見られる４．３５Ｅ－７２の最も有意なエンリッチメントｐ値を与えた。しかしながら、遺伝子のほぼ５％超が、全３時点にわたって類似した挙動を示した（３８上方／３下方）ので、評価した３つの時点での放射線応答の異なる段階を強調した。

【0106】

差別的に発現された遺伝子の詳細な階層クラスター分析（ＨＣＡ）が、５つのクラスターを特定し、各々、異なる時点にて同時調節される遺伝子を含有した（図２Ｂ）。対照腫瘍における発現と比較した場合に、クラスターＡ内の遺伝子が、７日目に有意に上方制御された。経路分析は、大多数のこれらの遺伝子が、Ｔ細胞受容体シグナル伝達及びＣＤ２８シグナル伝達が挙げられる適応免疫細胞応答と関連することを実証した。この点の例証は、Ｃｄ３ｄ／ｅ／ｇ、Ｃｄ８ａ、及びＣｄ２８発現の増大であり、これは、ＣＤ３^＋／ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤又は増殖の増大を示唆している。また、活性抗腫瘍免疫応答のサインが、Ｉｆｎγの上方制御によって示唆された。関心対象の別の上方制御された遺伝子は、Ｔｎｆｓｆ１０であり、これは細胞死受容体ＴＲＡＩＬをコードする。放射線が、細胞死受容体及びそのリガンドの腫瘍細胞表面発現を誘導することが知られており、そしてＴ細胞上のＴＲＡＩＬの上方制御が、ＴＲＡＩＬ受容体の活性化を介して腫瘍細胞の死滅を導くのを助力し得る。興味深いことに、抑制免疫チェックポイント（例えば、Ｐｄ－１、Ｌａｇ３、及びＣｔｌａ４）の観察された同時発現は、この適応免疫応答が一過性であり得ることを示唆した。また、この免疫抑制腫瘍微環境の発達は、Ｃｄ３９／Ｅｎｔｐｄ１の上方制御によって補強され、これは、Ｃｄ７３の酵素活性と関連して、アデノシン依存性免疫細胞抑制に寄与することが知られている。

【0107】

第２のクラスター（Ｂ）は、自然免疫と関連する遺伝子だけでなく、免疫系の自然アームと適応アーム間の伝達に関係するタンパク質をコードする遺伝子によっても富化される。これらの遺伝子は、実験中に継続的に上方制御された。一部の遺伝子は１日目に有意に上方制御されたが、大部分の遺伝子の発現は３日目から有意に上方制御された。この発現パターンは、自然免疫応答が初期に開始されて、ＲＴの単回線量後の第１週の間、比較的一定のままであることを示唆している。このクラスター内の関連遺伝子は、Ｃｄ８０（ＡＰＣ上で発現される共刺激受容体）及びＩＬ１５（ナチュラルキラー細胞及びＴ細胞の強力なインデューサ／アクティベータとしての機能を果たす、単球及び樹状細胞によって発現されるサイトカイン）を含んだ。加えて、クラスターＢは、Ｎｏｓ２（活性化されたマクロファージ上のＩＦＮγによって誘導される酵素）、Ｃｆｂ（触媒サブユニットＢｂがＣ３転換酵素を活性化して、その後Ｂ細胞を活性化することができる補体Ｂ因子）、及びｔｏｌｌ様受容体３（Ｔｌｒ３）を含有した。さらに、Ｉｒｆ７、Ｉｒｆ９、Ｍｘ１、Ｏａｓ１ａ／ｇ、及びＯａｓ２、並びにケモカイン遺伝子Ｃｘｃｌ１０、Ｃｃｌ２／５／６及び７が挙げられるＩ型及びＩＩ型インターフェロン調節遺伝子が、このクラスターにおいて富化された。

【0108】

クラスターＣのプロファイルは、時点にわたってより一貫しており、クロノロジカル応答に関して「第１の遺伝子クラスター」とみなされ得る。これは、より早期の時点（１及び３日目）にて有意に上方制御された大きなセットの遺伝子を含み、より小さなサブセットが、後に上方制御された（３日目～７日目）。自然免疫応答、放射線依存性ＤＮＡ損傷修復及び細胞死、並びにケモカインは、このクラスターにおいて支配的な機能的エンリッチメントであったが、Ｔ細胞及び細胞傷害性、並びに抗原提示及びＢ細胞と関連するいくつかの遺伝子もまた存在した。自然免疫と関連する遺伝子は、Ｃ３、Ｃ１ｒａ、及びＣ１ｒｂ等の補体をコードするもの、並びにＳｔａｔ１が挙げられるインターフェロン調節遺伝子を含んだ。興味深いことに、Ｓｔａｔ１は、ＩＰＡ機能的エンリッチメント分析において全３時点にて上流レギュレータとして強調された（図３及び表４）。また、Ｃｃｌ４（マクロファージ及びＮＫ細胞の漸増と関連するケモカイン）等のケモカインは、１日目に強く上方制御された；抗原プロセシングと関連する遺伝子（Ｐｓｍｂ８／９／１０、Ｔａｐ１、及びＴａｐｂｐ）と同様であった。放射線依存性ＤＮＡ損傷修復及び細胞死、並びにＴ細胞及び細胞傷害が、このクラスターにおける支配的な機能的エンリッチメントであった。注目に値するデータセットの証明は、ｐ５３シグナル伝達と関連する遺伝子の発現であり、これは、ＩＲの直接的な効果と関連がある。ＩＲによって引き起こされるＤＮＡ損傷等の細胞ストレスが、ｐ５３を活性化して、細胞増殖を阻害して、腫瘍細胞にアポトーシスを開始させる。例えば、ｐ５３活性化は、細胞周期進行遺伝子Ｃｄｋｎ１ａのインヒビタの発現を誘導する（３日目にて１．７倍上方制御、ｐ＜０．０１）。同様に、死受容体（１日目にて１．８倍上方制御、ｐ＜０．０１）が、活性化ｐ５３によって誘導されることが知られており、細胞を、免疫エフェクタ細胞を発現するＦＡＳ－リガンドに対して高感度にする。適応免疫と関連する関連上方制御遺伝子が、Ｃｄ４０ｌｇ（通常、活性化ＣＤ４^＋ Ｔ細胞上で発現される）、免疫チェックポイントタンパク質Ｐｄ－ｌ１（Ｃｄ２７４）（３日目から有意に上方制御される）、及びＧｚｍｂ（グランザイムＢ）（標的細胞死滅の機能に加えて、基底膜リモデリング及びリンパ球移行に関与し、１日目以降有意に上方制御された）を含んだ。

【0109】

クラスターＤ内の遺伝子が、１日目に一過的に上方制御されてから、３日目に有意に下方制御された。経路分析は、ケモカイン発現（Ｃｘｃｌ９及びＣｘｃｌ１２）と共に、抗原提示（Ｈ２遺伝子、Ｃｄ７４、Ｃｄ２０９ｄ、及びＣｄ２０９ｃ）及びＢ細胞活性化（Ｃｄ２４ａ）と関連する遺伝子のエンリッチメントを実証した。抗原提示及びＢ細胞関連遺伝子のいずれも、７日目までに有意に差別的に調節されなかった。このことは、効果のカスケードが、免疫機能経路のさらに下流で進行したことを示唆している。

【0110】

特定された最後のクラスター（クラスターＥ）は、最も大きなクラスターであり、１８０個の遺伝子を含有した。放射線依存性ＤＮＡ損傷修復が、早ければ１日目に特定の遺伝子について明らかな有意な下方制御があるキー機能的エンリッチメントである（１日目Ｌｉｇ４；１及び３日目Ｇａｄｄ４５ａ、又は７日目Ｂｒｃａ１、Ｂｒｃａ２、Ｅｒｃｃ１、Ｐｏｌａ１、及びＰａｒｂｐ）。このデータは、照射後２４時間以内にＤＮＡの迅速な修復を明らかにする以前の研究を支持している。最後に、コレステロール生合成下方制御と放射線との強い関連が特定された。

【0111】

全体として、トランスクリプトーム分析は、ＣＴ２６腫瘍への放射線の単回線量が、ｐ５３依存性細胞死をトリガーすることを確認する。細胞死のトリガーは、おそらく、照射された腫瘍において、自然免疫応答及び適応免疫応答の双方を開始する律速工程である。実際に、遺伝子発現プロファイルは、ＲＴ誘導腫瘍細胞死が、自然免疫の補充及び活性化（ＩＦＮα発現、抗原プロセシング／提示、マクロファージ補充、及び樹状細胞成熟）の後に、適応免疫応答の活性化（ＩＦＮγシグナル伝達、Ｔ細胞細胞傷害、Ｔ細胞受容体シグナル伝達、及びＢ細胞活性化）の原因となることを示唆している。しかしながら、あらゆる生理系について、この生物学的免疫応答は、いくつかの免疫抑制分子の発現の増大によって実証されるように、一過性であると予想される。

【0112】

遺伝子マイクロアレイデータを確認して、タンパク質レベルでのＩＲに従う免疫構成要素の表現型変化をさらに調査するために、同じ組織を、フローサイトメトリによって同時に分析した。マッチした腫瘍組織からの系統マーカー及び表現型マーカーの倍率変化を示すヒートマップを、図７に要約している。

【0113】

ＲＴは、腫瘍浸潤骨髄細胞集団の表現型を変更する。マクロファージが、高い程度の系統可塑性を示す。しかしながら、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は支配的に、いくつかの癌型において、Ｍ２表現型に向けて歪められている。Ｍ２細胞は、ＣＤ２０６（マンノース受容体又はＭＲＣ１としても知られている）を発現し、不十分なＡＰＣであり、そして血管新生促進因子及び免疫抑制因子の放出を通して免疫逃避及び疾患進行に寄与し得る。これに対し、Ｍ１分化マクロファージは、有効なリンパ球活性化を可能にするＣＤ８６等の共刺激分子を共発現する。ＲＴ処置腫瘍及び時間マッチＮＴ対照腫瘍におけるＴＡＭの頻度及び分化状態の双方を分析した。Ｆ４／８０^＋ＴＡＭの全体数は、ＲＴ後に有意に変更しなかった（図４Ａ）一方、ＣＤ８６及びＣＤ２０６の発現は調節された。ＲＴの７日後、Ｆ４／８０^＋細胞は、ＮＴ時間マッチ対照と比較して、ＣＤ８６の発現を引き下げた（６９５．０±４６．６ ＮＴ対４９４．７±１３．９照射のＭＦＩ、Ｐ＜０．０５；図４Ｂ）。さらに、ＣＤ２０６発現は、ＲＴの３日後に、腫瘍浸潤Ｆ４／８０^＋細胞上で有意に引き下げられた（ＮＴの２６３．７±２３．８対照射を受けた腫瘍の９９．５±８．１のＭＦＩ。Ｐ＜０．００１；図４Ｃ）。また、この発現の引下げは、ＲＴ後７日目に観察された。また、応答の類似パターンが、トランスクリプトーム分析において観察された（表４）。ＣＤ８６^＋の、ＣＤ２０６^＋陽性Ｆ４／８０^＋細胞に対する比率は、時間マッチＮＴ対照と比較して、３日目に増大した（１．８±０．０５ ＮＴ対２．７±０．１２照射、Ｐ＜０．０１）（図４Ｄ）。ＣＤ８６及びＣＤ２０６の発現の変化に加えて、マクロファージ表現型のシフトもまた、照射後の遺伝子プロファイリングデータにおいて観察されるＮｏｓ２及びＳｔａｔ１発現の増大によって示唆される（図３及び表４）。さらに、Ｍ２様表現型に関係があるレジスチン様アルファ（Ｒｅｔｎｌａ）及びＣｄ１６３の遺伝子発現の低下（それぞれ６．９及び２倍）もまた、ＲＴの３日後に特定された（図３及び表４）。ＴＡＭの全体数の変化が見出されなかったならば、これらのデータは、ＲＴが、Ｍ１表現型に向かうマクロファージの一過性の偏りの原因となることを示唆している。

【0114】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、抗腫瘍免疫応答を抑制する能力を有するので、ＲＴの免疫原性に影響を与え得る。腫瘍浸潤ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｌｏ細胞の頻度の変化が、ＲＴ後のいかなる時点でも観察されなかった（図４Ｅ及びゲーティング戦略の図８）一方、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｈｉ細胞の２．７倍の増大（表現型的にＭＤＳＣと定義される）が、ＲＴ処置腫瘍において３日目に観察された（図４Ｆ）。この増大は、一過性であるようであった。というのも、７日目までに、ＣＤ１１ｂ^＋Ｇｒ１^ｈｉ細胞の頻度の有意差が、ＮＴ群とＲＴ処置群との間で観察されなかったからである。

【0115】

ＲＴが、Ｔ細胞活性化の原因となり、そして腫瘍におけるＣＤ８：Ｔｒｅｇ比を変更する。ＲＴが、腫瘍に浸潤するＣＤ４５^＋細胞の割合の全体的な増大の原因となった（図９）が、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞数は、時間マッチ対照と比較した場合に、ＲＴの３日後にそれぞれ５２％及び６３％引き下げられることが見出された（図５Ａ及び５Ｂ）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞数が処置の７日後に枯渇したままであった一方、ＣＤ８^＋Ｔ細胞数が回復して、ＲＴ処置腫瘍において増殖に向かう強い傾向があった（１５．９±３．０％～２５．９±３．８％。Ｐ＝０．０６）。興味深いことに、時間マッチ対照と比較して、早期の活性化マーカーＣＤ６９の高い発現が、残りの腫瘍浸潤ＣＤ４^＋（ＲＴ後３及び７日目）及びＣＤ８^＋（ＲＴ後１及び３日目）Ｔ細胞上で観察された（図５Ｃ及び５Ｄ並びに図１０Ａ）。このことは、ＲＴがＴ細胞活性化を誘導したことを示唆している。

【0116】

ＮＴ腫瘍内ですら、Ｔｒｅｇ表現型を有するＣＤ４^＋細胞の割合は、１日目から７日目まで３．３倍増大した（図５Ｅ）。このことは、腫瘍微環境が経時的にどのように変化するかを実証している。しかしながら、時間マッチ腫瘍の比較は、処置後７日目に評価した場合に、ＲＴがさらに、Ｔｒｅｇの頻度をさらに３２％増大させることを明らかにした。これにも拘わらず、多くの場合、癌においてより良好な予測と関連することが報告されているＣＤ８：Ｔｒｅｇ細胞比は、７日目のＮＴ対照と比較した場合に、ＲＴ処置腫瘍において２．５倍高かった（図５Ｆ）。

【0117】

ＲＴは、抗腫瘍有効性を制限する腫瘍微環境におけるＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の発現の原因となる。遺伝子プロファイリングデータは、ＲＴが腫瘍においていくつかの共抑制免疫チェックポイントの発現の増大の原因となることを明らかにした。ＲＴ後に観察されるＰｄ－ｌ１の、ｍＲＮＡレベルでの一貫した上方制御、及び７日目のＰｄｃｄ１（ＰＤ－１）の発現（図３及び表４）を考えると、最初の研究は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路に集中した。フローサイトメトリは、ｍＲＮＡデータの更なるコンテクスト化を可能にして、ＲＴの７日後のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞上でのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の双方の発現の増大を明らかにした（図６Ａ～６Ｄ及び図１０Ｂ）。さらに、ＲＴはまた、試験した全ての時点にて、腫瘍細胞上でのＰＤ－Ｌ１の発現の増大の原因となった（図６Ｅ）。このデータは、密接に、ｍＲＮＡレベルにて観察される発現パターンに似ていた（図３及び表４）。

【0118】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の遮断が、ＲＴの抗腫瘍有効性に影響を与えるかを判定するために、治療研究を行った。マウスは、ＲＴ（単回線量として７Ｇｙ）を単独で、又はαＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂと組み合わせて受けた。ＮＴコホートにおけるメジアン生存期間は１５．５日であった。これは、単剤療法として３ｑｗ送達されるαＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂによって有意に向上しなかった（メジアン生存期間＝１８日；図６Ｆ及び６Ｇ）。しかしながら、αＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂと組み合わせて施される場合のＲＴは、単独療法と比較した場合に、生存の有意な向上の原因となり、＞７０％のマウスが完全治療奏効を経験した。

【0119】

配列表
配列番号１
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３－ＶＨ ＣＤＲ１
ＧＦＴＦＳＲＹＷＭＳ
配列番号４－ＶＨ ＣＤＲ２
ＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧ
配列番号５－ＶＨ ＣＤＲ３
ＥＧＧＷＦＧＥＬＡＦＤＹ
配列番号６－ＶＬ ＣＤＲ１
ＲＡＳＱＲＶＳＳＳＹＬＡ
配列番号７－ＶＬ ＣＤＲ２
ＤＡＳＳＲＡＴ
配列番号８－ＶＬ ＣＤＲ３
ＱＱＹＧＳＬＰＷＴ

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024521105000001.app

【国際調査報告】