特表 2024-521107 目的の組換え産物を産生するための修飾細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-28

(54)【発明の名称】目的の組換え産物を産生するための修飾細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20240521BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240521BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240521BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240521BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

C12N5/10 ZNA

C12P21/02 C

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/113 Z

C12N15/86 Z

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571894

(86)(22)【出願日】2022-05-20

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 US2022030345

(87)【国際公開番号】W WO2022246259

(87)【国際公開日】2022-11-24

(31)【優先権主張番号】63/191,781

(32)【優先日】2021-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

２．プルロニック

３．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ミサギ， シャーラム

(72)【発明者】

【氏名】カステラーノ， ブライアン メギア

(72)【発明者】

【氏名】タン， タンミン

(72)【発明者】

【氏名】アシュケナージ， アヴィ ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】スネデカー， ブラッドリー アール．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064AG27

4B064AG32

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、特定の内因性細胞タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、および目的の組換え産物、例えば、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子または組換えウイルスベクターの産生にそのような細胞を使用する方法に関する。これらの修飾は、改善された細胞培養性能（例えば、生存能力および産物力価の増大）を含む、いくつかの重要な領域に所望の形質を有する操作された細胞を生成するように特に選択された。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、
（ａ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、細胞培養中に修飾細胞のアポトーシスを促進し、
（ｂ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を調節する、修飾細胞。

【請求項2】

修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、１つ以上の内因性タンパク質が、ＢＣＬ２結合Ｘ、アポトーシス制御因子（ＢＡＸ）およびＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ）からなる内因性タンパク質群から選択され、内因性タンパク質のうちの１つがプロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）である、修飾細胞。

【請求項3】

ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現が、減少または排除される、請求項２に記載の修飾細胞。

【請求項4】

目的の組換え産物を発現するように操作される、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項5】

目的の組換え産物を発現する組換え細胞から生成される、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項6】

１つ以上の内因性タンパク質が、検出可能な発現を有しない、請求項４または５に記載の修飾細胞。

【請求項7】

目的の組換え産物が、ウイルスベクターを含む、請求項４または５に記載の修飾細胞。

【請求項8】

目的の組換え産物が、ウイルス粒子を含む、請求項４または５に記載の修飾細胞。

【請求項9】

目的の組換え産物が、組換えタンパク質を含む、請求項４または５に記載の修飾細胞。

【請求項10】

組換えタンパク質が、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である、請求項９に記載の修飾細胞。

【請求項11】

抗体が、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である、請求項１０に記載の修飾細胞。

【請求項12】

抗体が、単一の重鎖配列、および単一の軽鎖配列、またはその抗原結合断片からなる、請求項１０に記載の修飾細胞。

【請求項13】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項14】

抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項15】

目的の組換え産物が、１つ以上の標的位置で細胞ゲノムに組み込まれた外因性核酸配列によってコードされる、請求項４または５に記載の修飾細胞。

【請求項16】

検出可能なＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現しない、請求項１から１５のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項17】

低下したレベルのＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項18】

修飾動物細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項19】

修飾動物細胞が、修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である、請求項１８のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項20】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の修飾細胞を含む組成物。

【請求項21】

（ａ）請求項１から１９のいずれか一項に記載の修飾細胞を培養すること、および
（ｂ）培養培地または修飾細胞から目的の組換え産物を回収すること
を含む、目的の組換え産物を産生する方法であって、
目的の組換え産物を発現する修飾細胞が、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す、方法。

【請求項22】

（ａ）ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸を細胞に適用して、前記内因性遺伝子の発現を減少させるかまたは排除すること、ならびに
（ｂ）非修飾細胞と比較して前記内因性遺伝子の発現が減少または排除されている修飾細胞を選択すること
を含む、修飾細胞を産生する方法。

【請求項23】

修飾が、目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入前に、または目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入後に行われる、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ヌクレアーゼ支援遺伝子標的化系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはメガヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

遺伝子発現の減少が、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される、請求項２２から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ＲＮＡサイレンシングが、ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウンからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

目的の組換え産物が、核酸配列によってコードされる、請求項２１および２３から２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

核酸配列が、１つ以上の標的位置で修飾細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、請求項２１および２３から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

修飾細胞によって発現される目的の組換え産物が、修飾細胞の細胞ゲノムにランダムに組み込まれた核酸配列によってコードされる、請求項２１および２３から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

目的の組換え産物が、ウイルスベクターを含む、請求項２１および２３から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

目的の組換え産物が、ウイルス粒子を含む、請求項２１および２３から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

目的の組換え産物が、組換えタンパク質を含む、請求項２１および２３から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

組換えタンパク質が、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

抗体が、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

抗体が、単一の重鎖配列、および単一の軽鎖配列、またはその抗原結合断片からなる、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

抗体がモノクローナル抗体である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

目的の産物を精製すること、目的の産物を採取すること、および／または目的の産物を製剤化することを含む、請求項２１から３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

修飾細胞が修飾動物細胞である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

修飾動物細胞が、修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である、請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

野生型のＢａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々のポリヌクレオチドおよび機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりも高い特異的産生性を有する、請求項１から４０のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項42】

Ｂａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々の機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりもアポトーシスに対して耐性である、請求項１から４１のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【請求項43】

フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、または連続灌流細胞培養プロセスで使用される、請求項１から４２のいずれか一項に記載の修飾細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／１９１，７８１号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が援用されており、それに対して優先権が主張される。

【0002】

本開示は、特定の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、および目的の組換え産物、例えば、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子または組換えウイルスベクターの産生にそのような細胞を使用する方法に関する。これらの修飾は、生存能力の改善、および産物力価の増大を含む、重要な領域に予想外の相乗的形質を有する操作された細胞を生成する。

【背景技術】

【0003】

細胞生物学および免疫学の急速な進歩により、がん、心血管疾患および代謝性疾患を含む様々な疾患のための新規の治療用組換え産物、例えば、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子および組換えウイルスベクターを開発する需要が高まっている。これらの生物医薬品候補は、一般に、目的の産物を発現することができる市販の細胞株によって製造される。例えば、ＣＨＯ細胞は、モノクローナル抗体を産生するように広く適合されている。

【0004】

細胞による特定のタンパク質の発現は、細胞培養性能にとって有害である。例えば、アポトーシスを促進するタンパク質は、培養物の生存能力および産生性を低下させ得る。さらに、生物医薬品の産生の過程で、組換え産物の発現は、細胞適応を誘発する高いタンパク質恒常性負荷（ｐｒｏｔｅｏｓｔａｔｉｃ ｂｕｒｄｅｎ）を課す可能性がある。例えば、細胞は、多くの場合、タンパク質恒常性負荷の増加を軽減するために、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を利用する。しかし、ＵＰＲは、全体的なタンパク質翻訳の減少を最終的にもたらし、目的の組換え産物について達成される力価に悪影響を及ぼし得る。

【0005】

したがって、当技術分野では、目的の組換え産物、例えば、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子または組換えウイルスベクターを産生するためのさらに効率的な方法、修飾細胞および組成物が必要とされており、ここで、目的の組換え産物を発現する修飾細胞は、細胞生存能力、および目的の産物の産生に関連する力価に関連する改善された属性を示す。そのような改善された細胞は、細胞のゲノムを修飾すること（すなわち、細胞株操作）によって実現され得る。

【発明の概要】

【0006】

特定の実施形態では、本開示は、修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、（ａ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、細胞培養中に修飾細胞のアポトーシスを促進し、（ｂ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を調節する、修飾細胞に関する。

【0007】

特定の実施形態では、本開示は、修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、１つ以上の内因性タンパク質が、ＢＣＬ２結合Ｘ、アポトーシス制御因子（ＢＡＸ）およびＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ）からなる内因性タンパク質群から選択され、内因性タンパク質のうちの１つがプロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）である、修飾細胞に関する。

【0008】

特定の実施形態では、本開示は、修飾細胞であって、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現が、減少または排除される修飾細胞に関する。

【0009】

特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、修飾細胞は、目的の組換え産物を発現するように操作される。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、修飾細胞は、目的の組換え産物を発現する組換え細胞から生成される。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、１つ以上の内因性タンパク質は、検出可能な発現を有しない。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、目的の組換え産物は、ウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、目的の組換え産物は、ウイルス粒子を含む。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、目的の組換え産物は、組換えタンパク質を含む。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、組換えタンパク質は、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、抗体は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、抗体は、単一の重鎖配列、および単一の軽鎖配列、またはその抗原結合断片からなる。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、抗体はモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、目的の組換え産物は、１つ以上の標的位置で細胞ゲノムに組み込まれた外因性核酸配列によってコードされる。

【0010】

特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、修飾細胞は、検出可能なＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現しない。特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、修飾細胞は、低下したレベルのＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現する。

【0011】

特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞に関し、修飾細胞は修飾動物細胞である。特定の実施形態では、修飾動物細胞は、修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である。

【0012】

特定の実施形態では、本開示は、上記の修飾細胞を含む組成物に関する。

【0013】

特定の実施形態では、本開示は、（ａ）上記の修飾細胞を培養すること、および（ｂ）培養培地または修飾細胞から目的の組換え産物を回収することを含む、目的の組換え産物を産生する方法であって、目的の組換え産物を発現する修飾細胞が、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す、方法に関する。

【0014】

特定の実施形態では、本開示は、（ａ）ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｎｄ／ｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＢＡＸ，ＢＡＫ，ａｎｄ ＰＥＲＫ）を細胞に適用して、上記内因性遺伝子の発現を減少させるかまたは排除すること、ならびに（ｂ）非修飾細胞と比較して上記内因性遺伝子の発現が減少または排除されている修飾細胞を選択することを含む、修飾細胞を産生する方法に関する。

【0015】

修飾細胞を産生するための上記の方法の特定の実施形態では、修飾は、目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入前に、または目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入後に行われる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼ支援遺伝子標的化系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはメガヌクレアーゼからなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子発現の減少は、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシングは、ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウンからなる群から選択される。

【0016】

特定の実施形態では、目的の組換え産物は、核酸配列によってコードされる。特定の実施形態では、核酸配列は、１つ以上の標的位置で修飾細胞の細胞ゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、修飾細胞によって発現される目的の組換え産物は、修飾細胞の細胞ゲノムにランダムに組み込まれた核酸配列によってコードされる。

【0017】

特定の実施形態では、目的の組換え産物は、ウイルスベクターを含む。特定の実施形態では、目的の組換え産物は、ウイルス粒子を含む。特定の実施形態では、目的の組換え産物は、組換えタンパク質を含む。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である。特定の実施形態では、抗体は、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態において、抗体は、単一の重鎖配列および単一の軽鎖配列、またはそれらの抗原結合断片からなる。特定の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0018】

上記の方法の特定の実施形態では、目的の産物を精製すること、目的の産物を採取すること、および／または目的の産物を製剤化することを含む。

【0019】

上記の方法の特定の実施形態では、修飾細胞は修飾動物細胞である。特定の実施形態では、修飾動物細胞は、修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である。

【0020】

特定の実施形態では、本開示は、野生型のＢａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々のポリヌクレオチドおよび機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりも高い特異的産生性を有する修飾細胞に関する。

【0021】

特定の実施形態では、本開示は、Ｂａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々の機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりもアポトーシスに対して耐性である修飾細胞に関する。

【0022】

特定の実施形態では、本開示は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、または連続灌流細胞培養プロセスで使用される修飾細胞に関する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】ＰＤＧＦＲａは、ＵＰＲ活性化によってダウンレギュレートされる。図１Ａは、ｍＡｂ１発現ＣＨＯ細胞をｐＨ７．０７で増殖させた場合、ＰＤＧＦＲａタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルがそれぞれダウンレギュレートされたことを示す。

【図1B】図１Ｂは、ｍＡｂ１発現ＣＨＯ細胞をｐＨ７．０７で増殖させた場合、ＰＤＧＦＲａタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルがそれぞれダウンレギュレートされたことを示す。

【図1C】図１Ｃは、化学的ＵＰＲ誘導物質：ツニカマイシンおよびＤＴＴによって処理した２つのｍＡｂ１発現宿主細胞株、ＣＨＯ ＤＧ４４およびＣＨＯ－Ｋ１のウエスタンブロット分析を示す。

【図1D】図１Ｄは、ツニカマイシンおよびＤＴＴによって処理した、図１Ｃの両宿主細胞株におけるＰＤＧＦＲａ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。

【図1E】図１Ｅは、ＵＰＲ経路特異的阻害剤の存在下でＵＰＲを活性化するためにツニカマイシンによって処理したｍＡｂ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウエスタンブロット分析を示す。ＸＢＰ－１のＲＴ－ＰＣＲパネルは、ＩＲＥ１アルファＲＮａｓｅ活性化を示す。

【図1F】図１Ｆは、ＵＰＲ経路特異的阻害剤の存在下でツニカマイシンによって処理したＣＨＯ－Ｋ１細胞内のＰＤＧＦＲａ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。

【図1G】図１Ｇは、ツニカマイシンおよびＰＥＲＫ阻害剤によって処理したＷＴおよびＰＥＲＫ ＫＯ空宿主ＣＨＯ－Ｋ１（クローン９）細胞株のウエスタンブロット分析を示す。

【図2A】図２Ａは、様々なＵＰＲ経路特異的阻害剤の存在下でＵＰＲを活性化するためにタプシガルジンによって処理したｍＡｂ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウエスタンブロット分析を示す。ＸＢＰ－１のＲＴ－ＰＣＲパネルは、ＩＲＥ１アルファＲＮａｓｅ活性化を示す。

【図2B】図２Ｂは、様々なＵＰＲ経路特異的阻害剤の存在下でＵＰＲを活性化するためにツニカマイシンによって処理した空宿主ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウエスタンブロット分析を示す。

【図2C】図２Ｃは、様々なＵＰＲ経路特異的阻害剤の存在下でタプシガルジンによって処理したＣＨＯ－Ｋ１細胞内のＰＤＧＦＲａ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。

【図2D-E】図２Ｄは、対照としてルシフェラーゼに対するｓｇＲＮＡを用いた、ＰＥＲＫ遺伝子に対するＣａｓ９－ｓｇＲＮＡのウエスタンブロット分析を示す。図２Ｅは、ＰＥＲＫをノックアウトするためにＣａｓ９を使用した後の空宿主ＣＨＯ－Ｋ１単一細胞クローンのウエスタンブロット分析を示す。図１Ｇではクローン９を使用した。

【図3A-B】ＰＤＧＦＲａシグナル伝達は細胞増殖、例えば、ＣＨＯ細胞増殖に重要であり、増殖因子シグナル伝達はＰＤＧＦＲａ阻害後にインタクトである。図３Ａは、タンパク質合成、細胞周期進行および細胞増殖の上流のＰＤＧＦＲａおよびインスリン受容体（ＩＲ）シグナル伝達の概略図である。太い矢印は、それぞれの受容体による強度の高い活性化を示す。図３Ｂは、シードトレイン培地中のＰＤＧＦＲａ阻害剤および／またはインスリンの存在下または非存在下での４日後の空のＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞のＶＣＣおよび生存率％を示す。

【図3C】図３Ｃは、シードトレイン培地中のＰＤＧＦＲａ阻害剤および／またはインスリンの存在下または非存在下での４日後の（図３Ｂの）空宿主ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウエスタンブロット分析を示す。

【図3D】図３Ｄは、産生中のＰＤＧＦＲａ阻害剤および／またはインスリンの存在下でのｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞の１２日目の相対ＩＶＣＣ、生存率％、相対力価および相対Ｑｐを示す。

【図4A】図４Ａは、シードトレイン培地中のＰＤＧＦＲａ阻害剤濃度を増加させた際の４日後の空宿主ＣＨＯ－Ｋ１細胞生細胞数（ＶＣＣ）および生存率％を示す。

【図4B】図４Ｂは、シードトレイン培地中のＰＤＧＦＲａ阻害剤濃度を増加させた際の４日後の空宿主ＣＨＯ－Ｋ１細胞のウエスタンブロット分析を示す。

【図4C】図４Ｃは、１０μＭ濃度のＰＥＲＫ阻害剤の存在下または非存在下で産生させた際のウエスタンブロット分析ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞を示す。

【図4D】図４Ｄは、ＰＥＲＫ阻害剤の存在下または非存在下でのｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞の産生中のＵＰＲ、ＣＨＯＰおよびＧＡＤＤ３４のＰＥＲＫ分岐の下流標的のｑＰＣＲ分析を示す。

【図5A】ＰＤＧＦＲａレベルは、ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株における産生中に安定化される。図５Ａは、ＰＥＲＫをノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用した後のｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１単一細胞クローンのウエスタンブロット分析を示す。

【図5B】図５Ｂは、ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１ ＰＥＲＫ ＫＯ細胞の１４日目の相対ＩＶＣＣ、生存率％、相対力価および相対Ｑｐを示す。

【図5C】図５Ｃは、ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１ ＷＴおよびＰＥＲＫ ＫＯ細胞の産生のウエスタンブロット分析を示す。

【図6A】ＰＥＲＫおよびＢａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯは、バイオプロセスの結果を相乗的に増加させる。図６Ａは、ＰＥＲＫをノックアウトするためにＣａｓ９を使用した後のシードトレインにおけるｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１単一細胞クローンのウエスタンブロット分析を示す。

【図6B】様々なバイオプロセス、すなわち、リーン産生培地、リッチ産生培地、およびリッチ産生培地を使用した強化プロセスにわたる様々なｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１宿主の全体的な力価（図６Ｂに示される）。

【図6C】様々なバイオプロセス、すなわち、リーン産生培地、リッチ産生培地、およびリッチ産生培地を使用した強化プロセスにわたる様々なｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１宿主の相対Ｑｐ（図６Ｃに示される）。

【図6D】図６Ｄは、リッチ産生培地中の様々なｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１宿主のウエスタンブロット分析を示す。

【図6E-1】図６Ｅは、リーン産生培地およびリッチ産生培地中の重鎖ｍＲＮＡレベルおよび軽鎖ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。

【図6E-2】図６Ｅは、リーン産生培地およびリッチ産生培地中の重鎖ｍＲＮＡレベルおよび軽鎖ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す。

【図7A】図７Ａは、相対力価、ＱｐおよびＩＶＣＣを示す、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯバックグラウンドまたはＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯバックグラウンドのいずれかにおけるｍＡｂ３発現プールの６日間の産生のバイオプロセスの結果を示す。

【図7B】図７Ｂは、相対力価、ＱｐおよびＩＶＣＣを示す、ＷＴ、ＰＥＲＫ ＫＯ、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯまたはＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯバックグラウンドのいずれかにおけるＦａｂ１発現プールの１４日間の産生のバイオプロセスの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本開示は、特定の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）、および目的の組換え産物、例えば、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子または組換えウイルスベクターの産生にそのような修飾細胞を使用する方法に関する。これらの修飾は、生存能力の改善、および産物力価の増大を含む、いくつかの重要な領域に所望の形質を有する操作された細胞を生成する。

【0025】

モノクローナル抗体などの異種分子の発現に一般的に使用される方法の１つは、フェドバッチプロセスによるものであり、このプロセスでは、細胞は最初に播種され、次いで、産生期間の経過にわたってバッチで供給される。産生プロセス中の様々な要因が、不良な産生および産物品質の結果につながる可能性がある。１つの要因は、異種分子の大量の合成によるタンパク質恒常性ストレス（ｐｒｏｔｅｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ）の増加である。小胞体（ＥＲ）は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を活性化することによってこのストレスに適応することができる。ＵＰＲは、ＥＲがその最大タンパク質フォールディング能力に達し、タンパク質合成およびフォールディングに対する増大した要求に対応することができない場合に典型的に引き起こされる。ＵＰＲは、フォールディングされていないポリペプチドの蓄積を感知し、ＥＲを拡大し、シャペロン産生を増加させ、全体的なタンパク質翻訳を減少させることによってＥＲホメオスタシスを促進するシグナル伝達経路を活性化することによって応答する３つの同定されたＥＲ膜貫通タンパク質を有する。これらのプロセスがタンパク質恒常性ストレスを緩和することができない場合、持続的なＵＰＲ活性化はアポトーシス細胞死をもたらし得る。通常の状態では、これらのＵＰＲセンサーは、ＥＲ内腔の免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）と呼ばれるＥＲシャペロンによって結合されており、これにより、それらは不活性に保たれる。ＥＲ内腔にフォールディングされていないタンパク質が蓄積すると、ＢｉＰはこれらのセンサーから解離して、ＥＲタンパク質恒常性ストレスを減少させるためにフォールディングされていないタンパク質またはミスフォールドタンパク質のフォールディングを補助し、それによって、ＵＰＲ受容体の活性化を可能にする。

【0026】

３つのＵＰＲセンサーは、イノシトール要求性酵素１（ｉｎｏｓｉｔｏｌ－ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １）（ＩＲＥ１）、プロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）および活性化転写因子６（ＡＴＦ６）である。ＵＰＲのＩＲＥ１分岐は最も保存されており、ＩＲＥ１はキナーゼおよびリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の両方として機能する。ＩＲＥ１は、ＸＢＰ１（Ｘボックス結合タンパク質１）ｍＲＮＡ転写物の非従来的なスプライシングに関与している。このスプライシングは、短い形態のＸＢＰ１を産生し、この短い形態は、ＵＰＲ標的遺伝子を調節してＥＲのタンパク質フォールディング能力を増加させる転写因子である。これらの標的遺伝子は、脂質生合成酵素およびＥＲＡＤ（ＥＲ関連分解）成分を調節することによってＥＲを拡大および修飾する。ＵＰＲの別の分岐、ＰＥＲＫ（プロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ）はキナーゼであるが、リボヌクレアーゼ活性を欠く。活性化されると、ＰＥＲＫは、ｅＩＦ２アルファをリン酸化することによって全体的なｍＲＮＡ翻訳を減少させ、それによって、その活性を低下させる。同時に、短いオープン読み枠を含有する、ｍＲＮＡのサブセットは、選択的なタンパク質翻訳を受ける。これらのｍＲＮＡの１つは、Ｃ／ＥＢＰ相同タンパク質（ＣＨＯＰ）と呼ばれる別の転写因子の発現を調節する活性化転写因子４（ＡＴＦ４）をコードし、これにより、Ｂｉｍおよびデスレセプター５（ＤＲ５）を含むアポトーシス経路の成分が調節される。ＰＥＲＫの適度な活性化はＣＨＯＰを介して細胞保護的に機能するが、ＰＥＲＫ活性化が延びると細胞死がもたらされる。最後に、ＵＰＲのＡＴＦ６分岐は、ＥＲからゴルジ装置へのＡＴＦ６の輸送およびタンパク質分解活性化を伴う。タンパク質分解の際に、ＡＴＦ６は、タンパク質フォールディングシャペロンに関与するＥＲタンパク質、例えば、ＢｉＰおよびＧＲＰ９４、ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどのフォールダーゼの産生を増加させることによってＥＲ能力を増加させるのに役立つ転写因子として機能する。ＵＰＲの３つの分岐は、全体的なタンパク質フォールディング負荷を減少させると同時にＥＲのタンパク質フォールディング能力を増加させることによって、タンパク質恒常性ストレスを緩和するために協働する。

【0027】

本開示は、Ｂａｘ／Ｂａｋ二重ノックアウト（ＤＫＯ）抗体発現細胞株においてＰＥＲＫをノックアウトすることにより、生存能力および増殖の増加が明らかにされ、驚くべきことに、対照細胞株と比較して特異的産生性および力価の相乗的増加も示されたという発見に少なくとも部分的に基づく。

【0028】

限定ではなく明確にするために、本開示の主題の詳細な説明は、以下のサブセクションに分割される：
５．１ 定義；
５．２ 内因性タンパク質の発現の減少または排除；
５．３ 遺伝子特異的修飾を含む細胞；
５．４ 細胞培養方法；
５．５ 目的の組換え産物の産生；および
５．６ 例示的な非限定的な実施形態

【0029】

５．１。定義
本明細書中で使用される用語は一般に、本開示の文脈内で、かつ、各用語が使用される具体的な文脈においての、当該技術分野における通常の意味を有する。特定の用語を以下で、または、本明細書の他の箇所にて論じ、本開示の組成物および方法、ならびに、それらの作製および使用方法について記載する、実践者向けの追加の案内を示す。

【0030】

本明細書で使用する場合、特許請求の範囲、および／または明細書内で、「を含む」という用語と共に用いられる場合、語句「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、これは「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。

【0031】

本明細書で使用する場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）／ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する（ｈａｖｉｎｇ／ｈａｓ）」、「することができる」、「を含有する」という用語、およびこれらの変形は、追加の作用または構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、または単語であることが意図される。また、本開示では、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、それら「から成る」、およびそれら「から本質的に成る」他の実施形態も企図されている。

【0032】

「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味し、これは、一部には、値を測定または決定する方法、すなわち、測定システムの制限に依存するものである。例えば、「約」は、当技術分野の慣例によって、３以内または３を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、更に好ましくは５％まで、更になお好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、更に好ましくは２倍以内を意味し得る。

【0033】

用語「細胞培養培地」および「培養培地」は、以下のカテゴリーのうちの１つ以上からの少なくとも１つの成分を典型的に提供する、哺乳動物細胞を増殖させるために使用される栄養素溶液を指す：
１）通常はグルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー源；
２）あらゆる必須アミノ酸、通常は２０個のアミノ酸＋システインの基本的なセット；
３）低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物；
４）遊離脂肪酸；ならびに
５）微量元素（微量元素は、通常はマイクロモル範囲の非常に低い濃度で典型的に必要とされる無機化合物または天然に存在する元素として定義される）。

【0034】

栄養素溶液には、場合により、以下のカテゴリーのいずれかからの１つ以上の成分を補充することができる：
１）例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮増殖因子としてのホルモンおよび他の増殖因子；
２）例えば、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートとしての塩およびバッファー；
３）例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチンなどのヌクレオシドおよび塩基；ならびに
４）タンパク質および組織の加水分解物。

【0035】

細胞を「培養すること」とは、細胞を、細胞の生残および／または成長および／または増殖に好適な条件下にて、細胞培養培地と接触させることを意味する。

【0036】

「バッチ培養液」とは、培養プロセスの開始時に、細胞培養のための全ての構成成分（細胞、および全ての培養栄養素を含む）が、培養バイオリアクターに供給されている培養液を意味する。

【0037】

本明細書で使用する場合、「フェドバッチ培養細胞培養液」とは、細胞と培地が培養バイオリアクターに最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養プロセス中に培養液に連続して、または個別に増加して供給され、培養終了前に、周期的に細胞および／または生成物が回収される、またはされない、バッチ培養液を意味する。

【0038】

場合によっては連続培養液と呼ばれる「還流培養液」とは、細胞が、例えば濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングなどにより培養液中に保持され、培地が連続して、段階的に、または断続的に（またはこれらの任意の組み合わせで）導入され、培養バイオリアクターから取り除かれる培養液である。

【0039】

本明細書で使用する場合、「細胞」という用語は、動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、宿主細胞、組換え細胞、および組換え宿主細胞を意味する。このような細胞は、一般に、適切な栄養素および／または増殖因子を含有する培地に入れた場合に増殖および生存可能な、動物、例えば、哺乳動物、組織から得られるかまたはそれに由来する細胞株である。

【0040】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、区別なく使用され、外因性核酸を続いて導入して組換え細胞を作製することができる細胞およびそれらの子孫を指す。これらの宿主細胞はまた、特定の内因性宿主細胞タンパク質の発現を変化または欠失させるように修飾（すなわち、操作）されていてもよい。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一である必要はないが、変異を含むことができる。元の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。これらの宿主細胞に外因性核酸を導入すると（例えば、トランスフェクションによって）、元の「宿主細胞」、「宿主細胞株」または「宿主細胞株」に由来する組換え細胞が作製される。用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」はまた、そのような組換え細胞およびそれらの子孫を指し得る。

【0041】

用語「組換え細胞」、「組換え細胞株」および「組換え細胞培養物」は、区別なく使用され、目的の組換え産物の発現を可能にするために外因性核酸が導入された細胞およびそれらの子孫を指す。そのような細胞によって発現される組換え産物は、組換えタンパク質、組換えウイルス粒子または組換えウイルスベクターであり得る。

【0042】

用語「動物宿主細胞」または「動物細胞」は、適切な栄養素および増殖因子を含有する培地中の単一層培養または懸濁培養のいずれかに置いた場合に増殖および生存可能な、動物に由来する細胞株を指す。以下に記載される哺乳動物細胞に加えて、本開示の文脈内の好適な動物宿主細胞の例には、限定するものではないが、無脊椎動物細胞および非哺乳動物脊椎動物（例えば、鳥類、爬虫類および両生類）細胞が挙げられ得る。無脊椎動物細胞の例には、以下の昆虫細胞、すなわち、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）が挙げられる。例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７－５５（１９８８）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．８（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６）．ｐｐ．２７７－２７９；およびＭａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２－５９４（１９８５）を参照されたい。

【0043】

用語「哺乳動物宿主細胞」または「哺乳動物細胞」とは、適切な栄養素および成長因子を含有する培地内の、単一層培養液または懸濁培養液のいずれかに配置したときに、増殖および生残可能な哺乳動物に由来する細胞株を意味する。特定の細胞株に必要な増殖因子は、例えば、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９８４）、およびＢａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ｃｅｌｌ，２２：６４９に記載されているように、過度な実験を伴わず経験的に速やかに決定される。典型的には、細胞は、目的の、多量の特定のタンパク質、例えば糖タンパク質を、培地中に発現させて分泌させることができる。本開示の文脈内の好適な哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７，２４７号）；ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９ １９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１ １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８ １９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられ得る。特定の実施形態では、哺乳動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７，２４７号）が挙げられる。

【0044】

細胞培養物の「増殖期」とは、細胞が一般に、急速に分裂する、指数的に細胞が増殖する期間（対数期）を意味する。増殖期にて、細胞が維持される時間の長さは、例えば細胞の種類、細胞の増殖速度、および／または培地の状態に基づいて変化することができる。特定の実施形態において、この期の間に、細胞は一定期間（通常１～４日間）、細胞増殖が最大化されるような条件下において培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、過度な実験をすることなく想到される、特定の宿主細胞に対して決定される。「細胞増殖が最大化されるような期間および条件下」などは、特定の細胞株に対して、細胞増殖および分裂が最適であると測定される培養条件を意味する。特定の実施形態において、増殖期の間に、細胞は、特定の細胞株に対しての最適な増殖が達成されるように、一般に約３０～４０℃の加湿・制御大気下にて、必要な添加剤を含有する栄養素培地にて培養される。特定の実施形態において、細胞は、約１～４日間、通常は２～３日間の期間、増殖期で維持される。

【0045】

細胞培養の「産生期」とは、細胞増殖が停滞する／停滞を続ける期間を意味する。対数的な細胞増殖は典型的には、この期の前、または間に低下し、タンパク質産生に引き継がれる。産生期の間、対数的な細胞増殖は終わり、タンパク質産生が主となる。この期間の間、培地は一般に、タンパク質の連続した産生を支え、所望の糖タンパク質生成物を得るために補充される。フェドバッチ培養および／または還流細胞培養プロセスは、この期の間に細胞培地を補充するかまたは新鮮な培地を提供して、所望の細胞密度、生存率、および／または組換えタンパク質生成物の力価を達成および／または維持する。産生期は大規模に実施することができる。

【0046】

タンパク質の活性に関して本明細書で使用する場合、「活性」という用語は、酵素活性、リガンド結合、薬物輸送、イオン輸送、タンパク質局在化、受容体結合、および／または構造活性を含むがこれらに限定されないタンパク質の任意の活性を指す。そのような活性は、タンパク質の発現を低減または排除し、それによってタンパク質の存在を低減または排除することによって調節、例えば低減または排除することができる。そのような活性はまた、得られた修飾タンパク質が野生型タンパク質と比較して低減または排除された活性を示すように、タンパク質をコードする核酸配列を改変することによって、調節、例えば低減または排除することができる。

【0047】

「発現」または「発現する」という用語は、本明細書において、宿主細胞内で生じる転写および翻訳を意味するように用いられる。宿主細胞内での産生遺伝子の発現度合いは、細胞内に存在する、対応するｍＲＮＡの量、または、細胞により産生される産生遺伝子によりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて測定することができる。例えば、産生遺伝子から転写されるｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーションにより定量化されるのが望ましい。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．７．３－７．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）．産生遺伝子によりコードされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすること、または、そのような活性とは無関係な、タンパク質と反応可能な抗体を使用するウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイ等のアッセイを用いることのいずれかにより定量化することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｐｐ．１８．１－１８．８８（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）．

【0048】

本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」は、概して、約１０より多くのアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を指す。ポリペプチドは、宿主細胞と相同でありうるか、または好ましくは外因性であってよく、これは、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生されるヒトタンパク質、または哺乳動物細胞によって産生される酵母ポリペプチドなど、利用されている宿主細胞に対して異種、すなわち外来であることを意味する。ある特定の実施形態では、哺乳動物ポリペプチド（もともと哺乳類生物から誘導されるポリペプチド）が用いられ、より好ましくは、培地に直接分泌されるものが用いられる。

【0049】

「タンパク質」という用語は、高次の三次構造および／または四次構造を生成するのに十分な鎖長を持つアミノ酸の配列を指す。これは、そのような構造を有しない「ペプチド」または他の低分子量の薬物と区別するためである。本明細書のタンパク質は、典型的には、少なくとも約１５～２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有する。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例としては、宿主細胞タンパク質、ならびに全ての哺乳動物タンパク質、特に、治療用および診断用抗体等の治療用および診断用タンパク質、ならびに、１つ以上の鎖間および／または鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、１つ以上のジスルフィド結合を含有する一般的なタンパク質が挙げられる。

【0050】

用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定するものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体（例えば、単一の重鎖配列と単一の軽鎖配列とからなる抗体（そのようなペアリングの多量体を含む））、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。

【0051】

本明細書で使用する場合、抗体の「抗体断片」、「抗原結合部」（もしくは単に「抗体部」）、または、抗体の「抗原結合断片」とは、抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照のこと。

【0052】

用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の起源または種に由来し、その重鎖および／または軽鎖の残りの部分が、異なる起源または種に由来する抗体のことを指す。

【0053】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプのことを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。特定の実施形態では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。特定の実施形態では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。

【0054】

本明細書で使用する場合、「力価」という用語は、所与の量の培地体積で分けられた細胞培養液により産生された、組み換えにより発現した抗体の総量を意味する。力価は典型的には、１ミリリットルまたは１リットルの培地当たりの、抗体のミリグラムの単位（ｍｇ／ｍＬまたはｍｇ／Ｌ）にて表される。特定の実施形態では、力価は、１リットルの培地当たりの抗体のグラム（ｇ／Ｌ）で表される。力価は、異なる培地条件下でタンパク質生成物を得ることと比較しての、力価の増加割合といった、相対的な測定値の観点から表現または評価することができる。

【0055】

「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基またはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、およびリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、それにより前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’から３’に向かって表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡを含む）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成形態、およびこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状または環状であり得る。加えて、核酸分子という用語には、センス鎖およびアンチセンス鎖の双方、ならびに一本鎖形態および二本鎖形態が含まれる。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。非天然ヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖もしくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基または化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ、例えば宿主または患者において本開示の抗体を直接発現させるためのベクターとして好適なＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、非修飾であり得るか、または修飾され得る。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性および／またはコードされた分子の発現を高めるように化学修飾され得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６または欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。

【0056】

本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。

【0057】

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体の、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0058】

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0059】

本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。

【0060】

一般に、抗体は、６つのＣＤＲ、すなわち、ＶＨに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、およびＶＬに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９５～１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；ならびに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）および９３～１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））。

【0061】

特に指定されない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、または、任意の他の科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。

【0062】

「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害剤を含むがこれに限定されない、１種以上の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

【0063】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち該集団を構成する個々の抗体が、可能性の或る変異体抗体（これらは例えば天然に存在する変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じ、そのような変異体は通常少量存在する）を除き、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示の主題に従ったモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、そのような方法および他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。

【0064】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照）。抗原結合特異性を与えるには、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。

【0065】

本明細書で使用する場合、「細胞密度」という用語は、所与の体積の培地中での、細胞の数を意味する。特定の実施形態では、より高いタンパク質産生能をもたらすという点で、高い細胞密度が望ましい。細胞密度は、培地から試料を抽出し、顕微鏡の下で細胞を分析すること、市販されている細胞計数装置を使用すること、または、バイオリアクターそのもの（もしくは培地および懸濁細胞が通過して、バイオリアクターに戻るループ）に導入した、市販されている好適なプローブを使用することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の技術により監視することができる。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」は、「異種」、すなわち、利用される宿主細胞に対して外来性である核酸、例えば、非ヒト宿主細胞に導入される、ヒト抗体をコードする核酸によってコードされる抗体を含むペプチドおよびタンパク質を一般に指す。

【0067】

本明細書で使用される場合、用語「組換えウイルス粒子」は、天然に存在し得るか、またはワクチン産生に使用するために外因性核酸を組み換えることによって産生され得るウイルス粒子を一般に指す。

【0068】

本明細書で使用される場合、用語「組換えウイルスベクター」は、限定するものではないが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルスに基づく組換えベクターを含む、例えば、遺伝子療法に使用するために外因性ウイルス要素を発現するように修飾されたウイルスベクターを一般に指す。

【0069】

５．２。内因性タンパク質の発現の減少または排除
特定の実施形態では、本開示は、１つ以上の内因性タンパク質の発現が減少または排除される修飾細胞、例えば、ＣＨＯ細胞に関する。例えば、限定するものではないが、修飾細胞内の内因性タンパク質発現を減少させるかまたは排除するための方法には、（１）例えば、欠失、挿入、置換またはそれらの組合せを遺伝子に導入することによる、内因性タンパク質またはその成分をコードする遺伝子の修飾、（２）内因性タンパク質またはその成分をコードするｍＲＮＡの転写および／または安定性を減少させるかまたは排除すること、ならびに（３）内因性タンパク質またはその成分をコードするｍＲＮＡの翻訳を減少させるかまたは排除することが含まれる。特定の実施形態では、タンパク質発現の減少または排除は、標的化ゲノム編集によって得られる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくゲノム編集を使用して、１つ以上の標的遺伝子を修飾し、編集のために標的とされた単数または複数の遺伝子の発現の減少または排除をもたらすことができる。

【0070】

特定の実施形態では、発現の減少または排除のために標的とされる内因性細胞タンパク質のうちの１つ以上は、アポトーシスの促進に果たすそれらの役割に基づいて選択される。アポトーシスは培養物の生存能力および産生性を低下させる可能性があるため、そのようなタンパク質の発現を減少させるかまたは排除することは、培養物の生存能力および産生性に良い影響を及ぼし得る。例えば、限定するものではないが、アポトーシスの促進に果たすその役割に基づいて選択される細胞タンパク質は、ＢＣＬ２結合Ｘ、アポトーシス制御因子（ＢＡＸ）またはＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ）である。

【0071】

特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＸの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、ＢＡＸとは、本明細書で使用される場合、真核生物ＢＡＸ細胞タンパク質、例えば、ＣＨＯ ＢＡＸ細胞タンパク質（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１００６８９０３２；ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＥＦ１０４６４３．１）およびその機能的バリアントを指す。特定の実施態様では、本明細書で使用される場合、ＢＡＸの機能的バリアントは、目的の組換え生成物の生成に使用される修飾細胞の野生型ＢＡＸ配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するＢＡＸ配列バリアントを包含する。

【0072】

特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＫの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、ＢＡＫとは、本明細書で使用される場合、真核生物ＢＡＫ細胞タンパク質、例えば、ＣＨＯ ＢＡＫ細胞タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＥＦ１０４６４４．１）およびその機能的バリアントを指す。特定の実施形態では、ＢＡＫの機能的バリアントは、本明細書で使用される場合、目的の組換え産物の産生に使用される修飾細胞の野生型ＢＡＫ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＢＡＫ配列バリアントを包含する。

【0073】

特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＸおよびＢＡＫの発現の減少または排除を示す。

【0074】

特定の実施形態では、発現の減少または排除のために標的とされる内因性細胞タンパク質のうちの１つ以上は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の調節に果たすそれらの役割に基づいて選択される。例えば、限定するものではないが、ＵＰＲの調節に果たすその役割に基づいて選択される細胞タンパク質は、イノシトール要求性酵素１（ＩＲＥ１）、プロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）または活性化転写因子６（ＡＴＦ６）である。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、ＰＥＲＫとは、本明細書で使用される場合、真核生物ＰＥＲＫ細胞タンパク質、例えば、ＣＨＯ ＰＥＲＫ細胞タンパク質（遺伝子ＩＤ：１００７６５３４３；ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＧＷ０３６５８．１；ならびにアイソフォームＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿０２７２８５３４４．２およびＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿０１６８３１８４４．１）およびその機能的バリアントを指す。特定の実施形態では、ＰＥＲＫの機能的バリアントは、本明細書で使用される場合、目的の組換え産物の産生に使用される修飾細胞の野生型ＰＥＲＫ配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するＰＥＲＫ配列バリアントを包含する。

【0075】

特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、以下の内因性タンパク質、すなわち、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す。

【0076】

特定の実施形態では、本開示の細胞は、非修飾、すなわち、「参照」細胞内の内因性細胞タンパク質の発現と比較して、１つ以上の内因性細胞タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾される。特定の実施形態では、参照細胞は、１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現が減少または排除されていない細胞である。特定の実施形態では、参照細胞は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫをコードする遺伝子の野生型対立遺伝子の少なくとも１つまたは両方を含む細胞である。例えば、限定するものではないが、参照細胞は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫをコードする遺伝子の両野生型対立遺伝子を有する細胞である。特定の実施形態では、参照細胞はＷＴ細胞である。特定の実施形態では、１つ以上の内因性細胞タンパク質の発現を減少させるかまたは排除する修飾は、目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入前に行われる。特定の実施形態では、１つ以上の内因性細胞タンパク質の発現を減少させるかまたは排除する修飾は、目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入後に行われる。

【0077】

特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満である。特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質の発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約９０％未満、約８０％未満、約７０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満である。

【0078】

特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％である。特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質の発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％である。

【0079】

特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下である。特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約４０％以下である。特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質の発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下である。

【0080】

特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約１％～約９０％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約２５％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９０％、約１％～約８０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約７０％～約８０％、約７５％～約８０％、約１％～約７０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、約５０～約７０％、約６０～約７０％、約６５～約７０％、約１～約６０％、約１０～約６０％、約２０～約６０％、約３０～約６０％、約４０～約６０％、約５０％～約６０％、約５５％～約６０％、約１％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約１％～約４０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約３０％～約４０％、約３５％～約４０％、約１％～約３０％、約１０％～約３０％、約２０％～約３０％、約２５％～約３０％、約１％～約２０％、約５％～約２０％、約１０％～約２０％、約１５％～約２０％、約１％～約１０％、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約３０％、約５％～約４０％である。特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約１％～約９０％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約２５％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９０％、約１％～約８０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約７０％～約８０％、約７５％～約８０％、約１％～約７０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、約５０～約７０％、約６０～約７０％、約６５～約７０％、約１～約６０％、約１０～約６０％、約２０～約６０％、約３０～約６０％、約４０～約６０％、約５０％～約６０％、約５５％～約６０％、約１％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約１％～約４０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約３０％～約４０％、約３５％～約４０％、約１％～約３０％、約１０％～約３０％、約２０％～約３０％、約２５％～約３０％、約１％～約２０％、約５％～約２０％、約１０％～約２０％、約１５％～約２０％、約１％～約１０％、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約３０％、約５％～約４０％である。

【0081】

特定の実施形態では、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように修飾された細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞の対応する内因性タンパク質発現の約５％～約４０％である。

【0082】

特定の実施形態では、様々な参照細胞（例えば、対応する遺伝子の野生型対立遺伝子の少なくとも１つまたは両方を含む細胞）内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現レベルは変動し得る。

【0083】

特定の実施形態では、遺伝子操作系を使用して、１つ以上の特定の内因性タンパク質の発現（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫ発現）を減少させるかまたは排除する。当該技術分野において公知の様々な遺伝子組換えシステムを、本明細書で開示される方法のために使用することができる。そのような系の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、ならびに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などの遺伝子サイレンシングによってタンパク質発現を減少させるかまたは排除するための他のツールの使用が挙げられる。従来の、改善された、または修正されたＣａｓシステム、および、Ｃｐｆ－１などの、その他の細菌ベースのゲノム切除ツールを含む、当該技術分野において公知の任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、本明細書で開示される方法と共に使用することができる。

【0084】

特定の実施形態では、１つ以上の遺伝子、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドなどの内因性タンパク質をコードする遺伝子の一部は、細胞内の対応する内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するために欠失される。特定の実施形態では、遺伝子の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％が欠失される。特定の実施形態では、遺伝子の約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下または約９０％以下が欠失される。特定の実施形態では、遺伝子の約２％～約９０％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約２５％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９０％、約２％～約８０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約７０％～約８０％、約７５％～約８０％、約２％～約７０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、約５０％～約７０％、約６０％～約７０％、約６５％～約７０％、約２％～約６０％、約１０％～約６０％、約２０％～約６０％、約３０％～約６０％、約４０％～約６０％、約５０％～約６０％、約５５％～約６０％、約２％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約２％～約４０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約３０％～約４０％、約３５％～約４０％、約２％～約３０％、約１０％～約３０％、約２０％～約３０％、約２５％～約３０％、約２％～約２０％、約５％～約２０％、約１０％～約２０％、約１５％～約２０％、約２％～約１０％、約５％～約１０％、または約２％～約５％が欠失される。

【0085】

特定の実施形態では、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つのエクソンは、細胞内で少なくとも部分的に欠失される。本明細書で使用される「部分的に欠失される」は、例えば、エクソンの領域の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約２％～約９０％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約２５％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約８５％～約９０％、約２％～約８０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約７０％～約８０％、約７５％～約８０％、約２％～約７０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％、約５０％～約７０％、約６０％～約７０％、約６５％～約７０％、約２％～約６０％、約１０％～約６０％、約２０％～約６０％、約３０％～約６０％、約４０％～約６０％、約５０％～約６０％、約５５％～約６０％、約２％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約４５％～約５０％、約２％～約４０％、約１０％～約４０％、約２０％～約４０％、約３０％～約４０％、約３５％～約４０％、約２％～約３０％、約１０％～約３０％、約２０％～約３０％、約２５％～約３０％、約２％～約２０％、約５％～約２０％、約１０％～約２０％、約１５％～約２０％、約２％～約１０％、約５％～約１０％、または約２％～約５％が欠失されることを指す。

【0086】

特定の非限定的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、細胞内の１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現を減少させるかまたは排除する。クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞にて発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集に利用する場合、システムは、Ｃａｓ９（ｃｒＲＮＡをガイドとして利用してＤＮＡを修飾することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９により使用され、Ｃａｓ９と活性の複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般にヘアピンループ形態である）に結合する領域と共に、宿主ＤＮＡの正しい部分にｃｒＲＮＡをガイドするためのＲＮＡを含有する）、および、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９との活性の複合体を形成する）を含む。用語「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、細胞内のゲノム配列またはエピソーム配列などの標的配列へのＣａｓ９などのＲＮＡガイドヌクレアーゼの特異的会合（または「標的化」）を促進する任意の核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含み、あるいはキメラと呼ばれる）またはモジュラー（例えば、二重化によって互いに通常会合しているｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡなどの複数、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。

【0087】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９戦略は、ベクターを使用して細胞をトランスフェクトすることができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９を使用して、細胞内の標的ＤＮＡを識別して、直接結合するための配列であるため、各用途に対して設計することができる。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを合わせてパッケージ化して、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。細胞内にトランスフェクションするために、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９遺伝子と共に結合させ、ベクター内に組み入れることができる。

【0088】

特定の実施形態では、１つ以上の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現を減少させるかまたは排除するのに使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９分子と、内因性タンパク質またはその成分をコードする遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡとを含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドをコードする遺伝子の領域である。標的配列は、遺伝子内の任意のエクソン領域またはイントロン領域であり得る。

【0089】

特定の実施形態において、ｇＲＮＡは単一のベクターで細胞に投与され、Ｃａｓ９分子は第２のベクターで細胞に投与される。特定の実施形態において、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子は、単一のベクターで細胞に投与される。あるいは、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子のそれぞれが、別のベクターにより投与されることができる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、１つ以上のｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞に送達され得、例えば、エレクトロポレーションによって送達され得る（例えば、細胞にＲＮＰを送達する追加の方法については、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１－１２２：９－１５（２０１７）を参照）。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を細胞に投与すると、内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現が減少または排除される。

【0090】

特定の実施形態では、遺伝子操作系は、細胞内の１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現を減少させるかまたは排除するためのＺＦＮ系である。ＺＦＮは制限酵素として作用することができ、これは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより作製される。ジンクフィンガードメインを操作して、特異的なＤＮＡ配列を標的化することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ゲノム内で所望の配列を標的化することが可能になる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは典型的には、複数の、個別のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれが複数の塩基対を認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成するための、最も一般的な方法は、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的な、ＺＦＮの切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の、非特異的切断ドメインである。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列内で二本鎖の切断（ＤＳＢ）を行うことにより、タンパク質の発現を調節し、これは、相同テンプレートの不存在下にて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。このような修復は、塩基対の欠失または挿入をもたらし、フレームシフトを生成し、有害なタンパク質の産生を防止することができる（Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；３３（１８）：５９７８－９０（２００５））。ＺＦＮの複数の対を使用して、ゲノム配列の大きなセグメント全体を完全に除去することもできる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．；２０（１）：８１－９（２０１０））。

【0091】

特定の実施形態では、遺伝子操作系は、細胞内の１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現を減少させるかまたは排除するためのＴＡＬＥＮ系である。ＴＡＬＥＮは、操作してＤＮＡの特異的な配列を切断することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮに類似した原理で作動する。ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより生成される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定のヌクレオチドを強く認識する２つの可変位置を有する３３～３４のアミノ酸の繰り返しモチーフで構成されている。これらのＴＡＬＥのアレイを組み立てることによって、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを操作して、所望のＤＮＡ配列に結合させ、それによって、ゲノムの特定の位置で切断するようにヌクレアーゼを誘導することができる（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２９（２）：１３５－６（２０１１））。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫをコードする。

【0092】

特定の実施形態では、１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現は、対応する核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを使用して減少または排除され得る。このようなオリゴヌクレオチドの非限定例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。特定の実施形態では、このようなオリゴヌクレオチドは、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫ核酸配列の少なくとも一部に対して相同であり得、対応する核酸配列に対するその部分の相同性は、少なくとも約７５、または少なくとも約８０、または少なくとも約８５、または少なくとも約９０、または少なくとも約９５、または少なくとも約９８パーセントである。特定の非限定的な実施形態において、相補部分は、少なくとも１０個のヌクレオチド、または少なくとも１５個のヌクレオチド、または少なくとも２０個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチド、または少なくとも３０個のヌクレオチドを構成することができ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ分子は、最大１５、または最大２０、または最大２５、または最大３０、または最大３５、または最大４０、または最大４５、または最大５０、または最大７５、または最大１００ヌクレオチド長であることができる。アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ分子は、ＤＮＡ、または非定型もしくは天然に存在しない残基、例えば、これに限定されないがホスホロチオエート残基を含むことができる。

【0093】

本明細書に開示される遺伝子操作系は、ウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターを使用して細胞に送達され得る。キャプシドタンパク質が、ヒト細胞を感染させるのに機能的である場合、レトロウイルスベクターと、適切なパッケージング株の組み合わせが好適である。限定するものではないが、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１－４３７）、ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５－２９０２）およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０－６４６４）を含む様々なアンホトロピックなウイルス産生細胞株が知られている。非両種性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、またはＧＡＬＶエンベロープおよび当該技術分野で知られている他の任意のものでシュードタイプされた粒子も好適である。形質導入の可能な方法にはまた、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による、プロデューサー細胞との細胞の直接共培養、または例えば、Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３－２３０；およびＨｕｇｈｅｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、適切な増殖因子およびポリカチオンの有無にかかわらず、ウイルス上清のみもしくは濃縮ベクターストックとの培養も含まれる。

【0094】

他の形質導入ウイルスベクターを使用して、本明細書に開示される細胞を修飾することができる。特定の実施形態では、選択されたベクターは、高い感染効率と、安定な組込みおよび発現とを示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７，１９９６；およびＭｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照）。使用することができる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０，１９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０，１９９３；ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ，１９９５のベクターも参照のこと）が含まれる。レトロウイルスベクターは、特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，３９９，３４６号）。

【0095】

本明細書に開示される細胞の遺伝子操作には、非ウイルス手法も使用することができる。例えば、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で核酸を投与することによって、または外科的条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）によって、核酸分子を細胞に導入することができる。遺伝子導入のための、他の非ウイルス方法としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、および原形質融合を用いる、インビトロでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームもまた、核酸分子を細胞内に送達するのに、潜在的に有益である可能性がある。対象の罹患組織への正常な遺伝子の移植は、正常な核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自己または異種の初代細胞またはその子孫）に移入し、その後、細胞（またはその子孫）を標的組織に注射するか、または全身的に注射することによっても達成され得る。

【0096】

５．３ 遺伝子特異的修飾を含む細胞
一態様では、本開示は、１つ以上の内因性タンパク質の発現が減少または排除された１つ以上の細胞、例えば、動物細胞を含む細胞または組成物に関する。特定の実施形態では、細胞では、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現が減少または排除されている。

【0097】

本明細書で使用される場合、発現の排除とは、参照細胞と比較した場合の細胞内の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現の排除を指す。本明細書で使用される場合、発現の減少とは、参照細胞と比較した場合の細胞内の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現の減少を指す。

【0098】

本開示の主題に関連して有用な細胞の非限定的な例には、無脊椎動物細胞および非哺乳動物脊椎動物（例えば、鳥類、爬虫類および両生類）細胞、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）細胞、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）細胞、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞およびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＨＦＲ ＣＨＯ細胞）、ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（例えば、ＣＯＳ－７ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ヒト胎児由来腎臓株（例えば、懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされたＨＥＫ ２９３またはＨＥＫ ２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝がん株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、骨髄腫細胞株（例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０）が挙げられる。特定の実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞の追加の非限定的な例には、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞およびＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞が挙げられる。

【0099】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、目的の組換え産物を発現する。特定の実施形態では、目的の組換え産物は組換えタンパク質である。特定の実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体である。目的の組換え産物の追加の非限定的な例は、セクション５．５に記載される。

【0100】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、商業的に有用な量の目的の組換え産物の産生のために使用され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、参照細胞、例えば、ＷＴ細胞よりも高い産生性および高い力価ならびに増加した／拡大した生存能力を少なくとも部分的に介して、目的の組換え産物の商業的に有用な量の産生を促進する。

【0101】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、目的の組換え産物をコードする核酸を含み得る。特定の実施形態では、核酸は、１つ以上のベクター、例えば発現ベクター中に存在し得る。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される細胞内で自己複製し得る（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、細胞への導入時に細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、細胞ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクター、発現ベクターは、それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を誘導し得る。一般に、組換えＤＮＡ技法において利用される発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。本開示で使用するための発現ベクターの更なる非限定例としては、等価な機能的役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。

【0102】

特定の実施形態では、目的の組換え産物をコードする核酸は、本明細書に開示される細胞に導入され得る。特定の実施形態では、細胞への核酸の導入は、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、微小核体媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含む、当技術分野で公知の任意の方法によって行われ得る。特定の実施形態では、細胞は、真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、細胞はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

【0103】

特定の実施形態では、目的の組換え産物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれ得る（「ランダム組込み」または「ＲＩ」）。例えば、限定するものではないが、目的の組換え産物をコードする核酸は、１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現が減少または排除されるようにも修飾されている細胞のゲノムにランダムに組み込まれ得る。

【0104】

特定の実施形態では、目的の組換え産物をコードする核酸は、標的化された様式（本明細書で詳細に説明される「標的化組込み」または「ＴＩ」）で宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。例えば、限定するものではないが、目的の組換え産物をコードする核酸は、１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現が減少または排除されるように修飾されている細胞のゲノムに標的化された様式で組み込まれ得る。特定の実施形態では、目的の組換え産物をコードする核酸の導入のためのＴＩ宿主細胞の使用は、堅牢で安定な細胞培養性能をもたらし、得られた目的の組換え産物内の配列バリアントのリスクを低下させる。ＴＩ宿主細胞、およびその使用のための戦略は、参照によりその内容全体が組み込まれる米国特許出願公開第２０２１０００２６６９号に詳細に記載されている。

【0105】

標的化組込みを使用する特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれている遺伝子座は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、およびＮＷ＿ ００３６１５４１１．１から選択される配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。

【0106】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５、およびそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。

【0107】

特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０～４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２～７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０～６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９～１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６～３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５～２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６～１０５１１７、およびそれらに対して少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。

【0108】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５、およびそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によって５’に隣接している。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７、およびそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によって３’に隣接している。特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、および少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０～４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２～７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０～６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９～１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６～３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５～２７０１７６８、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６～１０５１１７に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。

【0109】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、およびＮＷ＿ ００３６１５４１１．１、ならびにそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作用可能に結合している。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列に作用可能に結合しているヌクレオチド配列は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿ ００６８８４５９２．１、ＮＷ＿ ００６８８１２９６．１、ＮＷ＿ ００３６１６４１２．１、ＮＷ＿ ００３６１５０６３．１、ＮＷ＿ ００６８８２９３６．１、およびＮＷ＿ ００３６１５４１１．１から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。

【0110】

特定の実施態様において、目的の生成物をコードする核酸を、トランスポサーゼ型組込みを使用して宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。トランスポザーゼに基づく組込み技術は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｒｕｂｉｔｓｙｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５（１０）：ｅ８９（２０１７）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１０（２５）：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７（２０１３）および国際公開第２００４／００９７９２号に開示されている。

【0111】

特定の実施形態では、目的の組換え産物をコードする核酸は、宿主細胞ゲノムにランダムに組み込まれ得る（「ランダム組込み」または「ＲＩ」）。特定の実施形態では、ランダム組み込みは、当技術分野において既知の任意の方法またはシステムにより媒介されうる。特定の実施形態では、ランダム組み込みは、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションシステムにより媒介される。

【0112】

特定の実施形態では、標的化組み込みは、ランダム組み込みと組み合わせることができる。特定の実施形態では、標的化組み込みに続いてランダム組み込みを行うことができる。特定の実施形態において、無作為組み込みは標的組み込みの後に続けることができる。例えば、限定するものではないが、目的の組換え産物をコードする核酸は、１つ以上の特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫの発現が減少または排除されるように調節されている細胞のゲノムにランダムに組み込まれ得、目的の同じ組換え産物をコードする核酸は、標的化された様式で細胞のゲノムに組み込まれ得る。

【0113】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、１つ以上の変化した遺伝子を含む。特定の実施形態では、遺伝子に対する変化は、内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除する。特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞は、１つ以上の変化したＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫ遺伝子を含む。特定の実施形態では、変化したＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫ遺伝子のその後の転写物は、発現が減少または排除された内因性タンパク質をコードする。特定の実施形態では、１つ以上の変化した遺伝子は、コード化領域の破壊によって変化させられる。特定の実施形態では、遺伝子の変化は、二対立遺伝子の変化を含む。特定の実施形態では、遺伝子の変化は、１以上の塩基対、２以上の塩基対、３以上の塩基対、４以上の塩基対、５以上の塩基対、６以上の塩基対、７以上の塩基対、８以上の塩基対、９以上の塩基対、１０以上の塩基対、１１以上の塩基対、１２以上の塩基対、１３以上の塩基対、１４以上の塩基対、１５以上の塩基対、１６以上の塩基対、１７以上の塩基対、１８以上の塩基対、１９以上の塩基対、または２０以上の塩基対の欠失を含む。

【0114】

特定の実施形態では、本開示は、修飾細胞、または１つ以上の修飾細胞を含む組成物に関し、修飾細胞、または１つ以上の修飾細胞を含む組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：１）修飾細胞は、修飾を欠く類似の細胞と比較して改善された細胞培養性能を示す；および２）修飾細胞は、修飾を欠く類似の細胞と比較して改善された生存能力を示す。

【0115】

特定の実施形態では、本開示は、以下の特徴の全部を有する細胞、または１つ以上の細胞を含む組成物に関する：１）修飾細胞は、修飾を欠く類似の細胞と比較して改善された細胞培養性能を示す；および２）修飾細胞は、修飾を欠く類似の細胞と比較して改善された生存能力を示す。

【0116】

特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、修飾を欠く類似の細胞と比較して改善された細胞培養性能を示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ｉ）増加した／拡大した生存能力、および代謝のためのさらに健常なミトコンドリア、ならびに／またはｉｉ）さらに高い産生性およびさらに高い力価に起因して、改善された細胞培養性能を示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫの発現の減少または排除に起因して、増加した／拡大した生存能力、および代謝のためのさらに健常なミトコンドリアを示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＸの発現の減少または排除に起因して、増加した／拡大した生存能力、および代謝のためのさらに健常なミトコンドリアを示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＫの発現の減少または排除に起因して、増加した／拡大した生存能力、および代謝のためのさらに健常なミトコンドリアを示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＰＥＲＫの発現の減少または排除に起因して、さらに高い産生性およびさらに高い力価を示す。特定の実施形態では、本開示の修飾細胞は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫの発現の減少または排除に起因して、増加した／拡大した生存能力、および改善された細胞培養性能を示す。

【0117】

特定の実施形態では、本開示は、改善された細胞培養性能を示す１つ以上のＴＩ細胞を含む修飾細胞または組成物に関する。特定の実施形態では、本開示のＴＩ細胞は、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、本開示のＴＩ細胞は、ＢＡＸの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、本開示のＴＩ細胞は、ＢＡＫの発現の減少または排除を示す。特定の実施形態では、本開示のＴＩ細胞は、ＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す。

【0118】

特定の実施形態では、細胞は細胞株である。特定の実施形態では、細胞は、一定数の世代にわたって培養された細胞株である。特定の実施形態では、細胞は初代細胞である。

【0119】

特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが特定のレベルに維持され、１０、２０、３０、５０、１００、２００または３００世代にわたって２０％未満で増加または減少する場合、安定である。特定の実施形態では、いかなる選択もせずに培養物を維持することができる場合、目的のポリペプチドの発現は安定である。特定の実施形態では、目的の遺伝子のポリペプチド生成物が約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、または約１６ｇ／Ｌに達する場合、目的のポリペプチドの発現は高い。

【0120】

目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションまたは注入を含むがこれらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、またはナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学ベースのトランスフェクション法によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方は、本明細書中に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。

【0121】

５．４。細胞培養方法
一態様では、本開示は、本明細書に開示される修飾細胞を培養することを含む、目的の組換え産物を産生する方法を提供する。当技術分野で公知の哺乳動物細胞に適した培養条件は、本明細書に開示される修飾細胞を培養するために使用され得るか（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８３）５６：２２１－２３４）、または当業者によって容易に決定され得る（例えば、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）を参照）。

【0122】

細胞培養物は、培養される特定の細胞に適した培地中で調製され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、例示的な栄養素溶液である。さらに、参照によりその全開示が本明細書に組み込まれるＨａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第５，１２２，４６９号または米国特許第４，５６０，６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；および国際公開第８７／００１９５号に記載されている培地のいずれかを培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ／ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ））、微量元素（通常、終濃度にてマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）、脂質類（リノレン酸または他の脂肪酸）およびそれらの好適な単体、ならびにグルコース、または等価なエネルギー供給源を補充することができる。任意の他の必要な補充物も、当業者に既知であろう適切な濃度で含まれ得る。

【0123】

特定の実施形態では、特定の内因性タンパク質の活性を低下させるおよび／または排除するように修飾された細胞は、ＣＨＯ細胞である。本開示のＣＨＯ細胞を培養するために、任意の好適な培地を使用することができる。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞を培養するための好適な培地は、アミノ酸、塩、糖およびビタミンなどのいくつかの成分の改変された濃度を有し、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン；組換えヒトインスリン、加水分解ペプトン、例えば、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ ＨＳもしくはＰｒｉｍａｔｏｎｅ ＲＬ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）または同等物；細胞保護剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８または同等のプルロニックポリオール；ゲンタマイシン；ならびに微量元素を場合により含有する、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ－１２に基づく配合物などの基礎培地成分を含有し得る（ＤＭＥＭおよびＨＡＭ Ｆ１２培地の組成については、細胞株およびハイブリドーマのアメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ、第６版、１９８８、３４６～３４９頁の培養培地配合物を参照）（米国特許第５，１２２，４６９号に記載されているような培地の配合が特に適切である）。

【0124】

特定の実施形態では、特定の内因性タンパク質、例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫおよび／またはＰＥＲＫポリペプチドの発現を減少させるおよび／または排除するように修飾された細胞は、組換え産物を発現する細胞である。組換え産物は、目的の組換え産物を発現する細胞を様々な細胞培養条件下で増殖させることによって産生され得る。例えば、組換え産物の大規模または小規模産生のための細胞培養手順が、本開示の文脈内では有用である可能性がある。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、振盪フラスコ培養、または撹拌槽バイオリアクターシステムが挙げられるがこれらに限定されない手順を使用することができ（後者の２つのシステムでは、マイクロ担体と共に、または無しで）、代替的にバッチ式、フェドバッチ培養式、または連続式で操作することができる。

【0125】

特定の実施形態では、本開示の細胞培養は、撹拌槽バイオリアクターシステムで実施され、フェドバッチ手順を用いる。フェドバッチ培養では、細胞および培養培地は最初に培養容器に供給され、追加の培養栄養素は、培養の終了前に定期的な細胞および／または産物の採取を行うかどうかにかかわらず、培養中に連続的に、または個別に漸増させて培養物に供給される。フェドバッチ培養には、例えば、周期的に全ての培養物（細胞および培地を含む）が取り除かれ、新鮮な培地で交換される、半連続式フェドバッチ培養が含まれ得る。フェドバッチ培養は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞および全ての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される、単純なバッチ培養とは区別される。フェドバッチ培養はさらに、上清がプロセス中に培養容器から取り除かれない限りにおいて、還流培養とは区別することができる（還流培養では、細胞は例えば、濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングにより、培養物中に保持される。そして培地が連続して、または断続的に導入され、培養容器から取り除かれる）。

【0126】

特定の実施形態では、培養物の細胞は、特定の細胞、および企図される特定の産生計画に好適であり得る任意のスキームまたはルーチンに従って増殖させることができる。したがって、本開示は、単一工程または複数工程の培養手順を企図する。単一工程培養では、細胞は培養環境に接種され、本開示のプロセスは、細胞培養の単一産生期中に使用される。あるいは、複数の段階培養が想到される。複数段階培養において、細胞は多数の工程または段階で培養することができる。例えば、細胞を、第１工程または増殖期培養液中で成長させることができる。この段階において、場合により貯蔵庫から取り除かれた細胞が、成長および高生存能を促進するのに好適な培地に播種される。細胞培養物に新鮮な培地を添加することによって、好適な期間にわたって細胞を増殖期に維持することができる。

【0127】

特定の実施形態では、流培養または連続細胞培養条件を考案して、細胞培養液の増殖期における哺乳動物細胞の成長を増強する。増殖期において、細胞は、増殖のために最大化された条件下、および期間、増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などは、特定の宿主で用いられるものであり、当業者には明らかであろう。概して、ｐＨは、酸（例えばＣＯ２）または塩基（例えばＮａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５と７．５の間のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養に適切な温度範囲は、約３０℃と３８℃の間であり、適切なｄＯ２は空気飽和度の５～９０％である。

【0128】

特定の段階において、細胞を使用して、細胞培養の産生期または産生工程を播種することができる。あるいは、上述のとおり、産生期または工程を、播種または増殖期または工程と連続させることができる。

【0129】

特定の実施形態では、本開示に記載される培養方法は、細胞培養物から、例えば、細胞培養物の産生期から組換え産物を採取することをさらに含み得る。特定の実施形態では、本開示の細胞培養方法によって産生された組換え産物は、第３のバイオリアクター、例えば、産生バイオリアクターから採取され得る。例えば、限定するものではないが、開示される方法は、細胞培養物の産生期の完了時に組換え産物を採取することを含み得る。代替的または追加的に、組換え産物は、産生期の完了前に採取され得る。特定の実施形態では、組換え産物は、特定の細胞密度が達成されると、細胞培養物から採取され得る。例えば、限定するものではないが、細胞密度は、採取前に約２．０×１０^７細胞／ｍＬ～約５．０×１０^７細胞／ｍＬであり得る。

【0130】

特定の実施形態では、細胞培養液から生成物を回収することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集および細胞除去技術のうちの１つ以上を含むことができる。

【0131】

特定の実施形態では、目的の組換え産物は、細胞から分泌され得るか、または膜結合タンパク質、サイトゾルタンパク質もしくは核タンパク質であり得る。特定の実施形態では、馴化細胞培養培地から可溶型形態の組換え産物を精製することができ、発現細胞から膜画分全体を調製し、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの非イオン性界面活性剤によって膜を抽出することによって、膜結合形態の組換え産物を精製することができる。特定の実施形態では、細胞を溶解し（例えば、機械的な力、超音波処理および／または界面活性剤によって）、遠心分離によって細胞膜画分を除去し、上清を保持することによって、サイトゾルタンパク質または核タンパク質を調製することができる。

【0132】

５．５ 目的の組換え産物の産生
本開示の細胞および／または方法は、本明細書に開示される細胞によって発現され得る任意の目的の組換え産物を産生するために使用され得る。

【0133】

５．５．１ ウイルス粒子およびウイルスベクター産物
特定の実施形態では、本開示の細胞および／または方法は、ウイルス粒子またはウイルスベクターの産生に使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、ウイルス粒子の産生に使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、ウイルスベクターの産生に使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、ウイルスポリペプチドの発現に使用され得る。そのようなポリペプチドの非限定的な例には、ウイルスタンパク質、ウイルス構造（Ｃａｐ）タンパク質、ウイルスパッケージング（Ｒｅｐ）タンパク質、ＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスヘルパータンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、ウイルスポリペプチドはＡＡＶウイルスポリペプチドである。

【0134】

特定の実施形態では、ウイルス粒子またはウイルスベクターの産生に関連して有用な細胞には、限定するものではないが、ヒト胎児由来腎臓株（例えば、懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされたＨＥＫ ２９３またはＨＥＫ ２９３細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、ヒト肝がん株（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、骨髄腫細胞株（例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（例えば、ＣＯＳ－７ ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、マウス乳房腫瘍（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞およびＦＳ４細胞が含まれる。特定の実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞の追加の非限定的な例には、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞およびＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞が挙げられる。

【0135】

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生されるウイルス粒子によって保有され得る目的の遺伝子の例には、例えば、レニンなどの哺乳動物ポリペプチド；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血増殖因子；腫瘍壊死因子－アルファおよび－ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、デスレセプター５およびＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現および分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制因子；リラクシンＡ鎖；リラクシンＢ鎖；プロリラクシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）；血管内皮増殖因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＤおよびＰ１ＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄおよびそのダイマー）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４およびＦＧＦ９；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子の受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４受容体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えば、ＰＤＧＦＲ－αおよびＰＤＧＦＲ－β）および線維芽細胞成長因子受容体；ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、アンジオポエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１およびＴＩＥ２；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５またはＮＴ－６）、または神経発育因子、例えば、ＮＧＦ－ｂ；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータ、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４またはＴＧＦ－β５；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータおよびインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；制御タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４およびＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ－１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；ホリスタチン；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ、およびそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１およびトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１およびＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３ＣおよびＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣がん抗原）；イムノアドヘシン；および上述のポリペプチドのいずれかの断片および／またはバリアント、ならびに例えば、上述のタンパク質のいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられる。

【0136】

いくつかの実施形態では、本開示の哺乳動物細胞によって産生されるウイルス粒子によって保有される目的の遺伝子は、限定するものではないが、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ，ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５，ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１ ０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ １Ａ、ＩＬ １Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１ ０、ＩＬ １１、ＩＬ １２Ａ、ＩＬ １２Ｂ、ＩＬ １３、ＩＬ １４、ＩＬ １５、ＩＬ １６、ＩＬ １７、ＩＬ １７Ｂ、ＩＬ １８、ＩＬ １９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮおよびＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択されるサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質およびサイトカイン受容体を含む任意のタンパク質に結合する、またはそれと相互作用するタンパク質をコードし得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、本開示の哺乳動物細胞によって産生されるウイルス粒子によって保有される目的の遺伝子は、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ １３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ １５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ １６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ １７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ １８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ １９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２ ／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ ／ ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ １０（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ １１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ １２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ １３、ＣＸＣＬ １４、ＣＸＣＬ １６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ １（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２およびＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体またはケモカイン関連タンパク質に結合するか、またはそれと相互作用するタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、本開示の哺乳動物細胞によって発現されるポリペプチドは、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣がん抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬおよびＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ １８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－アルファ１；ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルソリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミンおよびヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１ Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；
ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７およびαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ，ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧもしくはＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェート輸送体３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７のトロンボスポンジンリピート（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（６の前立腺の膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、６の前立腺の膜貫通上皮抗原２、６の膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様および２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；ならびに／またはＺＦＰＭ２に結合し得るか、またはそれと相互作用し得る。

【0138】

多くの他のウイルス成分および／または他の目的の遺伝子は、本開示に従って哺乳動物細胞によってパッケージングされてもよく、上記の一覧は限定を意味するものではない。

【0139】

５．５．２ 組換えタンパク質産物
特定の実施形態では、本開示の細胞および／または方法は、組換えタンパク質、例えば、組換え哺乳動物タンパク質の産生に使用され得る。このような組換えタンパク質の非限定的な例には、ホルモン、受容体、抗体融合タンパク質（例えば、抗体－サイトカイン融合タンパク質）を含む融合タンパク質、調節因子、増殖因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質および抗体が挙げられる。本開示の細胞および／または方法は、産生されている分子、例えば、抗体に特異的ではない。

【0140】

特定の実施形態では、本開示の方法を、治療用および診断用抗体、またはその抗原結合断片を含む抗体の産生に、使用することができる。特定の実施形態では、本開示の細胞および方法によって産生される抗体は、限定するものではないが、単一特異性抗体（例えば、単一の重鎖配列および単一の軽鎖配列からなる抗体（このようなペアリングの多量体を含む））、多重特異性抗体およびその抗原結合断片であり得る。例えば、限定されるものではないが、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、二重エピトープ抗体、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）、二重作用ＦＡｂ（ＤＡＦ）、またはこれらの抗原結合断片であることができる。

【0141】

５．５．２．１ 多重特異性抗体
特定の態様では、本明細書に提供される細胞および方法によって産生される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部分、すなわち異なる抗原の異なるエピトープ（すなわち、二重特異的）、または、同じ抗原の異なるエピトープ（すなわち、二重エピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、本明細書に記載した完全長抗体または抗体断片として調製することができる。

【0142】

多重特異性抗体を作製するための技術には、限定するものではないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）、および「ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、およびＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が含まれる。多重特異性抗体は、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）を作製するための静電気操縦（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作すること、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）、および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）、軽鎖のミスペアリングの問題を回避するために共通の軽鎖技術を使用すること（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）、二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、および単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）、および例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することもできる。

【0143】

例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の別の非限定例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、および同第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片には、「二重作用性ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国特許第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。

【0144】

多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにおいてドメインクロスオーバを有する非対称形態で、すなわち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアームを交換する（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、また、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）ことによって提供され得る。特定の実施形態では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。ｃｒｏｓｓ－Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域１（ＣＨ１）から構成されるポリペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖とを含む。非対称Ｆａｂアームは、ドメイン界面に荷電または非荷電アミノ酸変異を導入して正しいＦａｂ対合を誘導することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５を参照のこと。

【0145】

多重特異性抗体に対する様々なさらなる分子フォーマットが、当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照）。

【0146】

特定の実施形態では、本明細書にも含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞上の表面抗原に、およびＴ細胞を再び標的として標的細胞を死滅させるための、ＣＤ３などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変成分に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。

【0147】

この目的のために有用であり得る二重特異性抗体形式の追加の非限定的な例には、限定するものではないが、２つのｓｃＦｖ分子が可撓性リンカーによって融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号および国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９，２９９－３０５（１９９６））およびその誘導体、例えば、タンデム型ダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディ形式に基づくが、さらに安定化させるためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、ならびに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３６，４５８－４６７（２０１０）に概説されている）が挙げられる。本明細書に含まれる、特定のＴ細胞二重特異性抗体形式は、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。

【0148】

５．５．２．２ 抗体断片
特定の態様では、本明細書において提供する細胞および方法により作製される抗体は、抗体断片である。例えば、限定するものではないが、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片またはＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨおよびＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）を産生する。よって「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を有する抗体断片のことである。「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加によりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を構成し、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0149】

特定の実施形態では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディである。「ダイアボディ」は、二価または二重特異性であってよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）にも記載されている。

【0150】

更なる態様では、抗体断片は一本鎖Ｆａｂ断片である。「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメインおよび上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序、すなわち、ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１またはｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合を介して安定化されている。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化される可能性がある。

【0151】

別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号を参照のこと。

【0152】

別の態様では、抗体フラグメントは単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。

【0153】

特定の態様では、本明細書において提供される細胞および方法により生成される抗体融合タンパク質は、抗体－サイトカイ融合タンパク質である。このような抗体－サイトカイン融合タンパク質は完全長抗体を含み得る一方、抗体－サイトカイン融合タンパク質の抗体は、特定の実施態様では、抗体断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、または小さな免疫タンパク質（ＳＩＰ）である。特定の実施態様では、サイトカインは、抗体のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。特定の実施態様では、抗体－サイトカイン融合タンパク質のサイトカインは、複数のサブユニットからなる。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、同じ（ホモマー）である。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、異なる（ヘテロマーである）。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、同じ抗体に融合する。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、異なる抗体に融合する。抗体－サイトカイン融合タンパク質の概説については、例えば、Ｍｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２：４２－５３（２０１９）を参照されたい。

【0154】

抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解が挙げられるがこれに限定されない、様々な技術により作製することができる。

【0155】

５．５．２．３ キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の態様では、本明細書において提供する細胞および方法により作製される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0156】

特定の態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つまたは複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

【0157】

ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号および米国特許第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャフリングに対する「誘導選択」手法を記載）にさらに記載されている。

【0158】

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、限定するものではないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が含まれる。

【0159】

５．５．２．４ ヒト抗体
特定の態様では、本明細書において提供する細胞および方法により作製される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。

【0160】

ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト可変領域を有するインタクトなヒト抗体またはインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾することができる。

【0161】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体もまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７－９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

【0162】

５．５．２．５ 標的分子
本明細書に開示される細胞および方法によって産生される抗体によって標的とされ得る分子の非限定的な例には、可溶型血清タンパク質およびその受容体ならびに他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書にて開示した細胞および方法により作製した抗体は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１ ０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１ ０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、およびＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択される、１つ、２つまたはそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、およびサイトカイン受容体に結合することができる。

【0163】

特定の実施形態では、本明細書にて開示した細胞および方法により作製される抗体は、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／Ｓ ＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、およびＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質に結合することができる。

【0164】

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生される抗体（例えば、二重特異性抗体などの多重特異性抗体）は、以下から選択される１つ以上の標的分子に結合することができる：０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣がん抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬおよびＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ １８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－アルファ１；ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルソリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミンおよびヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１ Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７およびαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９，ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ，ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧもしくはＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェート輸送体３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；
Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７のトロンボスポンジンリピート（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（６の前立腺の膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、６の前立腺の膜貫通上皮抗原２、６の膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様および２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；ならびにＺＦＰＭ２。

【0165】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞および方法によって産生される抗体は、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２）；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体またはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、およびアルファｖ／ベータ３インテグリン、例えば、そのアルファサブユニットまたはベータサブユニットのいずれか（例えば、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１８抗体または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ １７ ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどに結合することができる。

【0166】

特定の実施形態では、本明細書に提供される細胞および方法を使用して、補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合する抗体（または多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体）（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）を産生することができる。特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、（ａ）（ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；ならびに／または（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。上記の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３および配列番号１２５として米国特許第２０１６／０１７６９５４号に開示されている。（米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号の表７および８を参照）。

【0167】

特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含む
それぞれＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＶＨ ＳＳＹＹＭＡＷＶＲＱ ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹ ＫＡＥＷＡＫＧＲＶＴ ＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶ ＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶ ＤＴＡＴＹＹＣＡＳＤ ＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭ ＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳ（配列番号３１）
および
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳ ＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ ＡＳＥＴＥＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮ ＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３２）（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。上記のＶＨ配列およびＶＬ配列は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１１１として米国特許第２０１６／０１７６９５４号に開示されている。（米国特許出願公開第２０１６／０１７６９５４号の表７および８を参照）。特定の実施形態では、抗Ｃ５抗体は３０５Ｌ０１５である（米国特許第２０１６／０１７６９５４号を参照）。

【0168】

特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって産生される抗体は、ＯＸ４０に結合することができる（例えば、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体）。特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；ならびに／または（ａ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｃ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含む
それぞれＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＤＳＹＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤ ＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹ ＮＱＫＦＲＥＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＶＬＡＰ ＲＷＹＦＳＶＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）
および
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＧＨＴＬＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。

【0169】

特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。例えば、特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列；ならびに／または（ａ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｃ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２もしくは３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。特定の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＶＨ配列およびＶＬ配列を含む
それぞれＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴ ＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶ ＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹ ＳＥＫＦＫＧＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲ ＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶ ＴＶＳＳ（配列番号１６）
および
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳ ＳＹＩＶＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨ ＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＶＨ ＹＡＱＦＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）（これらの配列の翻訳後修飾を含む）。

【0170】

抗ＯＸ４０抗体に関する更なる詳細が、国際公開第２０１５／１５３５１３号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0171】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞および方法によって産生される抗体は、インフルエンザウイルスＢ血液凝集素、すなわち、「ｆｌｕＢ」に結合することができる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、インフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統由来の血液凝集素に結合するか、インフルエンザＢウイルスのＶｉｃｔｏｒｉａ系統由来の血液凝集素に結合するか、インフルエンザＢウイルスの祖先系統由来の血液凝集素に結合するか、またはインフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統、Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統および祖先系統由来の血液凝集素に結合する抗体）。抗ＦｌｕＢ抗体に関する更なる詳細は、国際公開第２０１５／１４８８０６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0172】

特定の実施形態では、本明細書にて開示した細胞および方法により作製した抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１またはＬＲＰ－８またはトランスフェリン受容体、ならびに、β－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、α－セクレターゼ、γ－セクレターゼ、タウセクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイドβペプチド、α－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ ＮＴＲ、ＣＤ４０、およびカスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１個の標的に結合することができる。

【0173】

特定の実施形態では、本明細書にて開示した細胞および方法により作製した抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体はＲＧ７８７６である。

【0174】

特定の実施形態では、本開示の細胞および方法を使用して、ポリペプチドを産生することができる。例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドは標的化された免疫サイトカインである。特定の実施形態において、標的化された免疫サイトカインはＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７８１３である。特定の実施形態では、標的化された免疫サイトカインはＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態では、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。

【0175】

特定の実施形態では、本明細書において提供する細胞または方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体等）は、ＣＥＡ、および、少なくとも１つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体等）は、腫瘍標的化サイトカイン、および少なくとも１つの追加の標的分子に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（すなわち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ１に基づく免疫サイトカイン、および少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（すなわち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥ）である。

【0176】

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファおよびＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３およびＩＬ－９；ＩＬ－１３およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－５；ＩＬ－５およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３およびＩＬ－２５；ＩＬ－１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ－１３およびＭＤＣ；ＩＬ－１３およびＭＥＦ；ＩＬ－１３およびＴＧＦ－～；ＩＬ－１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２およびＴＷＥＡＫ、ＩＬ－１３およびＣＬ２５；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３およびＡＤＡＭＳ、ＩＬ－１３およびＰＥＤ２、ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆ、ＣＥＡおよびＣＤ３、ＣＤ３およびＣＤ１９、ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３ＳおよびＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３ＳおよびＣＤ２０；ＣＤ３ＳおよびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ－ＳおよびＩＬ－６；ＣＤ２０およびＢＲ３、ＴＮＦアルファおよびＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－３、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－４、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－５、ＴＮＦアルファおよびＩＬ６、ＴＮＦアルファおよびＩＬ８、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－９、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１０、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１１、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１３、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１４、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１５、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１６、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１７、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１８、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１９、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２０、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２３、ＴＮＦアルファおよびＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファおよびＣＤ４、ＴＮＦアルファおよびＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファおよびＭＩＦ、ＴＮＦアルファおよびＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファおよびＰＧＥ４、ＴＮＦアルファおよびＰＥＧ２、ＴＮＦアルファおよびＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファおよびＴｅ３８、ＴＮＦアルファおよびＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファおよびＣＤ２２、ＴＮＦアルファおよびＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファおよびＧＰ１３０、ＴＮＦ ａおよびＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦおよびアンジオポエチン、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＰＤＧＦ、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡおよびＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２およびＤＲ５、ＶＥＧＦおよびＩＬ－８、ＶＥＧＦおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＣＤ６４、ＨＥＲ２およびＣＤ３、ＨＥＲ２およびＣＤ１６、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）およびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ４、ＩＬ－１４およびＩＬ－１３、ＩＬ－１３およびＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４およびＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ－１ Ｒ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ－６ＲおよびＴＮＦＲ１およびＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３、ＭＡＰＧおよびＣＤ２８、ＥＧＦＲおよびＣＤ６４、ＣＳＰＧｓおよびＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４およびＢＴＮ０２；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－ｌおよびＣＴＬＡ－４；ならびにＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合することができる。

【0177】

特定の実施形態において、本明細書において提供する方法に従い作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号１８～２１に記載のアミノ酸配列を含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＫＡＳＡＡＶＧ ＴＹＶＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳ ＡＳＹＲＫＲＧＶＰＳ
ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱ ＹＹＴＹＰＬＦＴＦＧ ＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰ
ＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴ ＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦ ＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ ＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬ
ＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦ ＮＲＧＥＣ（配列番号１８）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬ ＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬ ＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴ ＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥ ＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩ ＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴ
ＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧ ＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡ ＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣ ＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦ ＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳ ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ
ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ
ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣ（配列番号１９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ
ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ
ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬ
ＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧ ＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ ＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬ ＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹ ＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤ ＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭ ＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶ ＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧ ＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ
ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣＤＫＴ ＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ
ＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦ ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ ＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶ ＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥ ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ
ＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ
ＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶ ＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹ ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ ＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤ
ＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦ ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ ＳＰＧＫ（配列番号２０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ
ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤ ＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳ ＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ
ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＫＴＨＴ ＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧ
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ ＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ ＷＹＶＤＧＶＥＶＨ ＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹ
ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬ ＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧ ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ ＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥ ＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤ
ＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳ ＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤ ＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱ ＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ ＶＬＤＳＤＧＳＦＦ ＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲ
ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳ ＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹ ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ Ｋ（配列番号２１）

【0178】

抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関するさらなる詳細は、国際公開第２０１４／１２１７１２号に提供されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0179】

特定の実施形態では、本明細書にて開示した細胞および方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体等）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂである。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号２２～２５に記載のアミノ酸配列を含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴ ＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷ ＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ
ＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦ ＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰ ＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦ ＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴ
ＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳ ＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳ ＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣ ＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶ ＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴ ＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬ
ＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳ ＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧ ＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨ ＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫ ＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨ ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ
ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ
ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣ
ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫ
ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹ
ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭ ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹ ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰ ＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹ ＹＹＰＧＡＦＤＩＷＧ
ＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ ＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦ ＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧ ＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮ ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷ ＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮ
ＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳ ＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴ ＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫ ＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨ ＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳ ＦＮＲＧＥＣＤＫＴＨ
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ
ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ
ＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳ ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ
ＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫ ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２３）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦ ＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳ
ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ
ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ
ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ ＲＧＥＣ（配列番号２４）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶ ＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩ ＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫ ＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧ ＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤ ＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲ
ＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡ ＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧ ＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷ ＤＳＳＳＤＨＷＶＦＧ ＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳ ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ
ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ
ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ ＫＳＣ（配列番号２５）

【0180】

特定の実施形態では、本明細書にて開示した方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体等）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。

【0181】

任意に、他の分子にコンジュゲートされる可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。そのような細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換された細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原およびその形態は、当業者には明らかであろう。

【0182】

特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞および方法によって産生されるポリペプチド（例えば、抗体）は、色素または細胞傷害性剤、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの化学分子にさらにコンジュゲートするように結合することができる。本明細書に記載の方法を使用して作製した抗体または二重特異性抗体を含む免疫抱合体は、１つだけの重鎖、または１つだけの軽鎖の定常領域にコンジュゲートした細胞毒性剤を含有することができる。

【0183】

５．５．２．６ 抗体バリアント
特定の態様では、本明細書に提供される抗体、例えば、セクション５．５．５に示す抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切な改変を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことで、またはペプチド合成により調製することができる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行われ得る。

【0184】

５．５．２．６．１ 置換、挿入および欠失バリアント
ある特定の態様において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発に関心のある部位には、ＣＤＲおよびＦＲが含まれる。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載されるとおりである。目的の抗体中にアミノ酸置換を導入して、その生成物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0185】

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0186】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。

【0187】

ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる試験のために選択される結果として生じるバリアント（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修飾（例えば、改善）を有し、且つ／または親抗体の実質的に保持された特定の生物学的特性を有するであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成することができる、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つまたは複数のＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0188】

例えば抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）が行われ得る。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照）、および／または抗原と接触する残基に対して行われ得、得られたバリアントＶＨまたはＶＬは、結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化する、ＣＤＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。

【0189】

特定の態様では、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）は、ＣＤＲで行われ得る。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ内の抗原接触残基の外側であっててもよい。上記に提供される特定のバリアントＶＨおよびＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、または１つ、２つもしくは３つ以下のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。

【0190】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）のグループを同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。代替的に、または追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を同定することができる。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、または除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。

【0191】

アミノ酸配列挿入物には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入物が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）のための）または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドに対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が挙げられる。

【0192】

５．５．２．６．２ グリコシル化バリアント
ある特定の態様では、本明細書中に提供される抗体を変更して、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。

【0193】

抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮａｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの態様では、特定の改善された性質を有する抗体バリアントを作製するために、本開示の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。

【0194】

１つの態様において、非フコシル化オリゴ糖、すなわち、Ｆｃ領域に付着した（直接または間接的に）フコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹の第１のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、天然抗体または親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加した抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、または場合によっては約１００％（すなわち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定された、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、およびハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流または下流、すなわち位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸にも位置し得る。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した、このような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、および／または改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。

【0195】

フコシル化が低減した抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許第２００３／０１５７１０８号；および国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、およびノックアウト細胞株、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；および国際公開第２００３／０８５１０７号）、またはＧＤＰ－フコース合成もしくは輸送体タンパク質の活性が低減もしくは消失した細胞（例えば、米国特許第２００４２５９１５０号、米国特許第２００５０３１６１３号、米国特許第２００４１３２１４０号、米国特許第２００４１１０２８２号を参照）が挙げられる。

【0196】

さらなる態様において、抗体バリアントには、例えば、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているバイセクト型（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）オリゴ糖が提供される。そのような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化、および／または改善されたＡＤＣＣを有することができる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）、国際公開第９９／５４３４２号、同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。

【0197】

Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、および同第１９９９／２２７６４号に記載されている。

【0198】

５．５．２．６．３ Ｆｃ領域バリアント
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作成する。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

【0199】

特定の態様では、本開示は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有し、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能（補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）が不必要または有害である用途に対して望ましい候補となる抗体バリアントを企図する。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩを参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルを対象に評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号および国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。

【0200】

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つ以上の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる。

【0201】

ＦｃＲに対する結合が改善または減少したある特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号、およびＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照。）

【0202】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、および／または３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。

【0203】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４および２３５（ＥＵ番号付けの残基）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様では、抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域に、Ｄ２６５Ａおよび／またはＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照）。別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）である。

【0204】

いくつかの態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす改変がＦｃ領域に対して行われる。

【0205】

半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移行を担う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つまたは複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４のうちの１つ以上に置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４を参照）。

【0206】

マウスＦｃ－マウスＦｃＲｎ相互作用にとって重要なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４およびＨ４３５（ＥＵインデックスナンバリング）が相互作用に関与する（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０およびＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に重要であることが分かった（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の試験では、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５およびＹ４３６が相互作用に重要であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）では、残基２４８～２５９、および３０１～３１７、および３７６～３８２、および４２４～４３７の様々な変異型が報告され、調査されている。

【0207】

ある特定の態様において、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位および／または３１０位および／または４３５位（ＥＵナンバリングの残基）に置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、位置２５３、３１０および４３５にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照されたい。

【0208】

ある特定の態様において、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位および／または４３３位および／または４３６位（ＥＵナンバリングの残基）に置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、３１０位、４３３位および４３６位におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３ＡおよびＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号Ａ１を参照）。

【0209】

ある特定の態様において、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位および／または２５４位および／または２５６位（ＥＵナンバリングの残基）に置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、位置２５２、２５４、および２５６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅである。Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；および、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0210】

本明細書中に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つまたは２つが除去された、短縮されたＣ末端であり得る。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は、短縮されたＣ末端で終わるＰＧである。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６およびＫ４４７、ＥＵインデックス番号付けのアミノ酸位置）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書で明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックス番号付けのアミノ酸位置）を含む。

【0211】

５．５．２．６．４ システイン操作抗体バリアント
特定の態様では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基によって置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体を作製することが望ましい場合がある。特定の態様では、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、それは、本明細書で更に説明するように、例えば薬物部分またはリンカー－薬物部分等の他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、または国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。

【0212】

５．５．２．６．５ 抗体誘導体
特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であることができ、かつ分枝または非分枝であることができる。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／またはタイプは、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定され得る。

【0213】

５．５．２．７ イムノコンジュゲート
本開示はまた、１つまたは複数の治療剤、例えば細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位体にコンジュゲートした（化学結合した）、本明細書で開示される抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0214】

一態様では、イムノコンジュゲートは、前述の治療剤の１つ以上に抗体がコンジュゲートした、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、１つまたは複数の治療剤に接続される。治療剤および薬物およびリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概説が、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。

【0215】

別の態様では、イムノコンジュゲートは、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素またはこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセンを含む。

【0216】

別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされ、放射性コンジュゲートを形成する、本書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性抱合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えば、再びヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄を含むことができる。

【0217】

抗体および細胞毒性薬の複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）等の多様な二官能性タンパク質結合剤を使用して作製され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。

【0218】

本明細書中のイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、商業的に入手可能な（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，ＵＳＡから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない、架橋試薬で調製されたそのようなコンジュゲートを明確に企図するが、これらに限定されない。

【0219】

５．６ 例示的な非限定的な実施形態
Ａ。修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、
（ａ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、細胞培養中に修飾細胞のアポトーシスを促進し、
（ｂ）発現が減少または排除された内因性タンパク質のうちの１つ以上が、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を調節する、修飾細胞。

【0220】

Ｂ。修飾細胞であって、非修飾細胞内の内因性タンパク質の発現と比較して２つ以上の内因性タンパク質の発現を減少させるかまたは排除するように細胞が修飾され、１つ以上の内因性タンパク質が、ＢＣＬ２結合Ｘ、アポトーシス制御因子（ＢＡＸ）およびＢＣＬ２アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ）からなる内因性タンパク質群から選択され、内因性タンパク質のうちの１つがプロテインキナーゼＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）である、修飾細胞。

【0221】

Ｂ１。ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現が、減少または排除される、Ｂの修飾細胞。

【0222】

Ｂ２。目的の組換え産物を発現するように操作される、Ａ～Ｂ１のいずれか１つの修飾細胞。

【0223】

Ｂ３。目的の組換え産物を発現する組換え細胞から生成される、Ａ～Ｂ１のいずれか１つの修飾細胞。

【0224】

Ｂ４。１つ以上の内因性タンパク質が、検出可能な発現を有しない、Ｂ２またはＢ３の修飾細胞。

【0225】

Ｂ５。目的の組換え産物が、ウイルスベクターを含む、Ｂ２またはＢ３の修飾細胞。

【0226】

Ｂ６。目的の組換え産物が、ウイルス粒子を含む、Ｂ２またはＢ３の修飾細胞。

【0227】

Ｂ７。目的の組換え産物が、組換えタンパク質を含む、Ｂ２またはＢ３の修飾細胞。

【0228】

Ｂ８。組換えタンパク質が、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である、Ｂ７の修飾細胞。

【0229】

Ｂ９。抗体が、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である、Ｂ８の修飾細胞。

【0230】

Ｂ１０。抗体が、単一の重鎖配列、および単一の軽鎖配列、またはその抗原結合断片からなる、Ｂ８の修飾細胞。

【0231】

Ｂ１１。抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、Ｂ８～Ｂ１０のいずれか１つの修飾細胞。

【0232】

Ｂ１２。抗体がモノクローナル抗体である、Ｂ８～Ｂ１１のいずれか１つの修飾細胞。

【0233】

Ｂ１３。目的の組換え産物が、１つ以上の標的位置で細胞ゲノムに組み込まれた外因性核酸配列によってコードされる、Ｂ２またはＢ３の修飾細胞。

【0234】

Ｂ１４。検出可能なＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現しない、Ａ～Ｂ１３のいずれか１つの修飾細胞。

【0235】

Ｂ１５。低下したレベルのＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを発現する、Ａ～Ｂ１３のいずれか１つの修飾細胞。

【0236】

Ｂ１６。修飾動物細胞である、Ａ～Ｂ１５のいずれか１つの修飾細胞。

【0237】

Ｂ１７。修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である、Ｂ１６の修飾動物細胞。

【0238】

Ｂ１８。Ａ～Ｂ１７のいずれか１つの修飾細胞を含む組成物。

【0239】

Ｂ１９。（ａ）Ａ～Ｂ１７のいずれか１つの修飾細胞を培養すること、および
（ｂ）培養培地または修飾細胞から目的の組換え産物を回収すること
を含む、目的の組換え産物を産生する方法であって、
目的の組換え産物を発現する修飾細胞が、ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫの発現の減少または排除を示す、方法。

【0240】

Ｃ。（ａ）ＢＡＸ、ＢＡＫおよびＰＥＲＫを標的とするヌクレアーゼ支援および／または核酸を細胞に適用して、前記内因性遺伝子の発現を減少させるかまたは排除すること、ならびに
（ｂ）非修飾細胞と比較して前記内因性遺伝子の発現が減少または排除されている修飾細胞を選択すること
を含む、修飾細胞を産生する方法。

【0241】

Ｃ１。修飾が、目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入前に、または目的の組換え産物をコードする外因性核酸の導入後に行われる、Ｃによる方法。

【0242】

Ｃ２。ヌクレアーゼ支援遺伝子標的化系が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはメガヌクレアーゼからなる群から選択される、ＣまたはＣ１による方法。

【0243】

Ｃ３。遺伝子発現の減少が、ＲＮＡサイレンシングによって媒介される、ＣまたはＣ１による方法。

【0244】

Ｃ４。ＲＮＡサイレンシングが、ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ｓｈＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウン、ならびにｍｉＲＮＡ遺伝子標的化およびノックダウンからなる群から選択される、Ｃ３による方法。

【0245】

Ｃ５。目的の組換え産物が、核酸配列によってコードされる、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ４のいずれか１つの方法。

【0246】

Ｃ６。核酸配列が、１つ以上の標的位置で修飾細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ５のいずれか１つの方法。

【0247】

Ｃ７。修飾細胞によって発現される目的の組換え産物が、修飾細胞の細胞ゲノムにランダムに組み込まれた核酸配列によってコードされる、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ５のいずれか１つの方法。

【0248】

Ｃ８。目的の組換え産物が、ウイルスベクターを含む、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ７のいずれか１つの方法。

【0249】

Ｃ９。目的の組換え産物が、ウイルス粒子を含む、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ７のいずれか１つの方法。

【0250】

Ｃ１０。目的の組換え産物が、組換えタンパク質を含む、Ｂ１９およびＣ１～Ｃ７のいずれか１つの方法。

【0251】

Ｃ１１。組換えタンパク質が、抗体もしくは抗体融合タンパク質またはその抗原結合断片である、Ｃ１０の方法。

【0252】

Ｃ１２。抗体が、多重特異性抗体またはその抗原結合断片である、Ｃ１１の方法。

【0253】

Ｃ１３。抗体が、単一の重鎖配列、および単一の軽鎖配列、またはその抗原結合断片からなる、Ｃ１１の方法。

【0254】

Ｃ１４。抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、Ｃ１１～Ｃ１３のいずれか１つの方法。

【0255】

Ｃ１５。抗体がモノクローナル抗体である、Ｃ１１～Ｃ１３のいずれか１つの方法。

【0256】

Ｃ１６。目的の産物を精製すること、目的の産物を採取すること、および／または目的の産物を製剤化することを含む、Ｂ１９～Ｃ１５のいずれか１つの方法。

【0257】

Ｃ１７。修飾細胞が修飾動物細胞である、Ｃ１６の方法。

【0258】

Ｃ１８。修飾動物細胞が、修飾されたＳｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、Ａ５４９細胞またはヒーラ細胞である、Ｂ１９～Ｃ１７のいずれか１つの方法。

【0259】

Ｃ１９。野生型のＢａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々のポリヌクレオチドおよび機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりも高い特異的産生性を有する、Ａ～Ｃ１８のいずれかの修飾細胞または方法。

【0260】

Ｃ２０。Ｂａｘ遺伝子、Ｂａｋ遺伝子およびＰＥＲＫ遺伝子の各々の機能的コピーを含む対応する単離された動物細胞よりもアポトーシスに対して耐性である、Ａ～Ｃ１９のいずれかの修飾細胞または方法。

【0261】

Ｃ２１。フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、または連続灌流細胞培養プロセスで使用される、Ａ～Ｃ２０のいずれかの修飾細胞または方法。

【実施例】

【0262】

以下の実施例は、本明細書で開示される主題の例示にすぎず、いかなる意味でも制限とみなすべきではない。

【0263】

材料および方法
ベクターコンストラクト、細胞培養条件および産生
２つの別個の単位としての重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の両方の発現を、それらのそれぞれのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび制御因子エレメントによって導いた。プラスミドは、シミアンウイルス（ＳＶ）４０早期プロモーターおよびエンハンサーエレメントによって導かれる選択マーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはピューロマイシンをコードした。ＨＣ ＤＮＡおよびＬＣ ＤＮＡの３’領域に、ＳＶ４０後期ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を使用した。細胞を、１５０ｒｐｍ、３７℃および５％ＣＯ２で振盪する５０ｍＬチューブ回転容器内の独自の無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中で培養し、４×１０^５細胞／ｍＬの播種密度で３～４日ごとに継代した（Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0264】

以前に言及されているように（Ｈｓｕ，Ａｕｌａｋｈ，Ｔｒａｕｌ，＆Ｙｕｋ，２０１２）、３、７および１０日目に、様々な容器（チューブ回転およびＡＭＢＲ１５）をボーラス供給とともに使用して、独自の化学的に定義された培地を用いて、フェドバッチ産生培養を行った。抗細胞凝集剤を産生アッセイ中の全培養物に使用して、死細胞からのＤＮＡの放出による細胞凝集を防止した。リーン産生培地またはリッチ産生培地を使用して、低い（１～２×１０^６細胞／ｍＬ）または高い（１０×１０^６細胞／ｍＬ）播種密度で細胞を播種した。３日目に、３７℃から３５℃に培養温度を変化させた。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、力価を決定した。Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ項目番号３８３７２１）を使用して、生存率および生細胞数を決定した。

【0265】

ＰＥＲＫ（ＥＩＦ２ＡＫ３）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性破壊
ｓｇＲＮＡプライマー配列は、以下のとおりであった：
ＰＥＲＫ ｓｇＲＮＡ １：５’ＡＧＴＣＡＣＧＧＣＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＧ
ＰＥＲＫ ｓｇＲＮＡ ２：５’ＴＡＣＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ
ＰＥＲＫ ｓｇＲＮＡ ３：５’ＧＣＧＴＧＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧ
ルシフェラーゼｓｇＲＮＡ：５’ＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧＴＧＧＣＣＣ

【0266】

５００万個の細胞を洗浄し、バッファーＲ（Ｎｅｏｎ １００ｕＬキット カタログ：ＭＰＫ１００２５ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁した。５マイクログラムのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を細胞培養混合物に添加した。１，６２０Ｖで３×１０ｍｓのパルスを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。トランスフェクトした細胞を３日間培養し、続いて、限界希釈を介して単一細胞クローニングを行った。ウエスタンブロット分析によって、ＰＥＲＫノックアウトについて、プールおよび単一細胞クローンをスクリーニングした。

【0267】

ＩＲＥ１アルファＲＮａｓｅ活性を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ分析
ＣＨＯ－ＸＢＰ１ｓフォワードプライマー：５’ＣＣＴＴＧＴＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧ
ＣＨＯ－ＸＢＰ１ｓリバースプライマー：５’ＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣＧＧ

【0268】

Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（＃４３８９９８６）製の、使用したＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ ＣＴ－１ Ｓｔｅｐ Ｋｉｔおよびプロトコール。

【0269】

免疫ブロットおよび試薬
１５０万個の細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ ＥＤＴＡ不含ミニ錠剤カクテル）を含有する１×ＮＰ４０バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５％ＮＰ４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中、氷上で２０分間溶解した。溶解物をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（４～１２％Ｔｒｉｓグリシン）に供し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）－０．１％Ｔｗｅｅｎバッファー中５％ミルクを用いてブロックした後、それぞれの抗体を用いてメンブレンをブロットした。ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用して、ブロットを可視化した。以下の阻害剤を使用した：ＡＴＦ６ｉ（１０μＭ Ｃｅａｐｉｎ－Ａ７（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１６））、ＰＥＲＫｉ（１０μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ３９（Ａｘｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１２））、ＩＲＥ１ｉ６（１０μＭ ４ｕ８ｃ（Ｃｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１２））、ＩＲＥ１ｉ９（１０μＭ社内／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＰＤＧＦＲｉ（５～２０μＭ Ａｂｃａｍ、ＡＧ－１２９６）。以下の抗体を使用した：抗ＰＤＧＦＲａ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＳＴ）、Ｄ１Ｅ１Ｅ）、ウサギ抗ＢｉＰ（Ｃ５０Ｂ１２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１７７）、ウサギ抗ＰＥＲＫ（ＣＳＴ、Ｃ３３Ｅ１０）、マウス抗β－アクチン－ＨＲＰ（ＡＣ－１５）（Ａｂｃａｍ、ａｂ４９９００）、ウサギ抗ホスホ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（ＣＳＴ、Ｄ９Ｅ）、ウサギ抗Ａｋｔ（ＣＳＴ、５Ｇ３）、ウサギ切断型カスパーゼ３（ＣＳＴ、ａｓｐ１７５）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、０８５５２５２）、ウサギＩＲＥ１ａ（ＣＳＴ、１４Ｃ１０）、マウス抗ホスホ－ＩＲＥ１、マウス抗ＸＢＰ１、ウサギ抗Ｂａｘ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３２５０３）、ウサギ抗Ｂａｋ（ＣＳＴ、Ｄ４Ｅ４）、ロバ抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、７１１－０３５－１５２）、ウサギ抗ｓｏｄ２（ＣＳＴ、Ｄ３Ｘ８Ｆ）。

【0270】

実施例１：ＵＰＲ活性化はＰＤＧＦＲａ転写を減衰させ、その発現をダウンレギュレートする
特定のＣＨＯ細胞株における比較的低いｐＨ条件によって引き起こされる、シードトレイン培養時のＵＰＲの活性化が、標的ｐＨでの産生培地中の培養増殖に負の影響を及ぼす興味深い現象が、以前に記載された（Ｔｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。低ｐＨ条件に曝露された場合、この細胞株では、産生中の低増殖プロファイル、および不良なバイオプロセスの結果と相関する高い細胞内ＢｉＰレベルが検出された（Ｔｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。低ｐＨ条件対高ｐＨ条件での産生培養増殖の低下の基礎となる機構をさらによく理解するために、シードトレイン培養物を高ｐＨ条件および低ｐＨ条件下で維持し、質量分析によるプロテオミクス分析に供した。ＰＤＧＦＲａタンパク質レベルの発現の顕著な減少が低ｐＨ条件下で観察され（図１Ａ）、これはＰＤＧＦＲａ遺伝子の転写減衰に関連していた（図１Ｂ）。高い細胞内ＢｉＰレベルはＵＰＲ活性化を示すため、ＣＨＯ細胞内のＵＰＲレベルと低下したＰＤＧＦＲａレベルとの間の潜在的相関を調査することを決定した。ツニカマイシン（Ｔｕｎ、強いＵＰＲ誘導物質）およびＤＴＴ（弱いＵＰＲ誘導物質）を使用して、２つの抗体発現（ｍＡｂ１）ＣＨＯ宿主株、ＣＨＯ ＤＧ４４およびＣＨＯ－Ｋ１のシードトレイン培養物に対してＵＰＲを化学的に誘導した。最適なｐＨ条件下で、強いＵＰＲ誘導物質（Ｔｕｎ）を用いると、完全に機能的なＰＤＧＦＲａレベルが、両ＣＨＯ宿主バックグラウンドでタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルの両方で低下した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。ＵＰＲ活性化の指標としてのＢｉＰレベルは、強いおよび弱いＵＰＲ化学誘導物質に応答してそれに応じて増加することに留意されたい（図１Ｃ）。ツニカマイシン処理時に観察された低分子量ＰＤＧＦＲａタンパク質バンドは、ツニカマイシン処理がタンパク質グリコシル化を阻害することから、このタンパク質の非グリコシル化形態を表す（図１Ｃ）。

【0271】

ＵＰＲのどの分岐がＰＤＧＦＲａレベルの調節に関与しているかをさらに分析するために、強いＵＰＲ誘導物質（ツニカマイシンおよびタプシガルジン）を使用して、ＵＰＲ経路のＡＴＦ６分岐、ＰＥＲＫ分岐またはＩＲＥ１ａ分岐に対する特異的阻害剤を用いて処理したＣＨＯ－Ｋ１細胞に対してＵＰＲを誘導した（図１Ｅ、図１Ｆならびに図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらのデータにより、ツニカマイシン処理培養物（図１Ｅ）およびタプシガルジン処理培養物（図２Ａ）の細胞内ＢｉＰタンパク質およびＸＢＰ－１ ＲＮＡプロセシングのレベルの増加によって明らかなように、ＵＰＲ経路のＰＥＲＫ分岐の阻害が、ＵＰＲの他の分岐の活性化に影響を及ぼすことなく、タンパク質レベル（図１Ｅ）およびｍＲＮＡレベル（図１Ｆ）でＰＤＧＦＲａのダウンレギュレーションを救済したことが明らかにされた。ＵＰＲ経路のＰＥＲＫ分岐の活性化を介したＰＤＧＦＲａのダウンレギュレーションは、抗体発現細胞（図１Ｅおよび図２Ａ）および空宿主細胞（図２Ｂ）の両方で生じた。ＰＥＲＫ阻害剤の存在下で観察されたＰＥＲＫタンパク質のわずかに低い分子量は、この特異的阻害剤によるＰＥＲＫの共有結合修飾に起因すると思われる（図２Ｂ）。

【0272】

さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＣＨＯ－Ｋ１細胞においてＰＥＲＫ遺伝子をノックアウトするようにｓｇＲＮＡを設計および試験し（図２Ｄ）、最良のノックアウト表現型を有するトランスフェクトされたプール（ｓｇＰＥＲＫ＃２）を単一細胞クローニングして、ＰＥＲＫタンパク質を発現しない空のＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞株を単離した（図２Ｅ）。これらの空のＣＨＯ－Ｋ１ ＰＥＲＫ ＫＯ宿主細胞株を増殖、トランスフェクション率、選択培地での回収、および培養性能について評価して、野生型（ＷＴ）ＣＨＯ－Ｋ１宿主と同等の全体的な培養性能を有するＰＥＲＫ ＫＯ宿主細胞株を同定した。次いで、空のＷＴおよび空のＰＥＲＫ ＫＯ宿主細胞株（クローン９、図２Ｅ）をツニカマイシンおよびＰＥＲＫ阻害剤を用いて、または用いず処理して、ＵＰＲ誘導時のＰＤＧＦＲａ調節を評価した（図１Ｇ）。ＷＴ対照と比較して、ＰＤＧＦＲａ発現はＵＰＲ誘導時にダウンレギュレートされず、ＰＥＲＫ阻害剤の添加は、ＰＥＲＫ ＫＯ宿主におけるＰＤＧＦＲａ発現をさらに安定化しなかった（図１Ｇ）。

【0273】

本発明者らの抗体発現細胞株の１つであるｍＡｂ１ ＣＨＯ ＤＧ４４に対するこの調査により、転写のダウンレギュレーション、したがって、ＰＤＧＦＲａタンパク質の減少した発現が、細胞が低ｐＨに曝露されたシードトレイン培養物に由来する場合、産生中の不良な増殖結果の原因である可能性が高いことが明らかにされた（図１Ａおよび図１Ｂ）。この不良な増殖結果が、ＵＰＲ活性化を示す細胞内ＢｉＰレベルの増加と相関することが以前に示された（Ｔｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＵＰＲが化学的に誘導された場合、ＰＤＧＦＲａタンパク質レベルはまた、転写ダウンレギュレーション、すなわち、ＵＰＲ経路のＰＥＲＫ分岐の化学的阻害によって逆転され得る現象のために低下し、ＰＥＲＫ活性化がＰＤＧＦＲａダウンレギュレーションを媒介することが示唆された（図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆならびに図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃ）。これは、ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株に対するＵＰＲの化学的誘導が、ＰＤＧＦＲａ発現のダウンレギュレーションをもたらさなかった場合にさらに確認された（図１Ｇ）。

【0274】

実施例２：ＰＤＧＦＲａシグナル伝達経路はＣＨＯ培養増殖に重要であり、インスリンシグナル伝達経路と並行して機能する
ＵＰＲ誘導性の不良な増殖プロファイルが、ＰＤＧＦＲａレベルの低下と相関することが以前に示された（図１Ａおよび図１Ｂ）（Ｔｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＰＤＧＦＲａおよびインスリンシグナル伝達経路は、重複する下流標的を有するが（図３Ａ）、インスリンシグナル伝達はＰＤＧＦＲａシグナル伝達を負に調節する（Ｃｉｒｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＣＨＯ細胞増殖におけるＰＤＧＦＲａシグナル伝達経路の重要性を試験するために、様々な濃度のＰＤＧＦＲａ阻害剤の存在下で空宿主ＣＨＯ－Ｋ１細胞を培養したところ、Ａｋｔシグナル伝達経路の減衰のために２０μＭ濃度（図３Ｂ）で細胞増殖が約５０％減少した（図３Ｃ）。ＰＤＧＦＲａ阻害剤を用いて処理したＣＨＯ培養物へのインスリンの添加は、未処理培養物と比較して、細胞増殖を部分的に救済し（図３Ｂ）、Ａｋｔリン酸化を増加させ、したがって、その活性化を増加させた（図３Ｃ）。これらの発見により、ＰＤＧＦＲａシグナル伝達経路およびインスリンシグナル伝達経路が実際にＣＨＯ細胞内で重複する下流標的を有すること、ならびにＰＤＧＦＲａ阻害剤の存在下でＡｋｔシグナル伝達経路がインタクトなままであることが確認された（図３Ｂおよび図３Ｃ）。ＰＤＧＦＲａシグナル伝達はまた、抗体発現（ｍＡｂ２）ＣＨＯ細胞株では、フェドバッチ産生の３日目の阻害が細胞生存能力に影響を及ぼすことなく細胞増殖を顕著に減少させたことから、ＣＨＯ産生培養増殖に重要である（図３Ｄ）。シードトレイン培養物（図３Ｂ）と同様に、産生培養物の３日目のインスリンの添加は、観察された細胞増殖阻害を部分的に救済した（図３Ｄ）。

【0275】

増殖因子を含まない化学的に定義された培地中で培養される、本発明者らのＣＨＯ細胞では、ＰＤＧＦＲａシグナル伝達経路が細胞増殖に重要であることが証明され（図４Ａおよび図４Ｂ）、本発明者らのＣＨＯ細胞がＰＤＧＦＲａリガンドを分泌するか、またはＰＤＧＦＲａシグナル伝達経路がこれらの細胞内で本質的に活性であることが示唆された。培養培地へのインスリンの添加は、ＰＤＧＦＲａシグナル伝達が阻害された場合に細胞増殖を部分的に救済し、ＰＤＧＦＲａおよびインスリン受容体（ＩＲ）の両方が部分的に重複するシグナル伝達経路を有することから（図３Ａ）、ＰＤＧＦＲａ阻害剤が特異的であり、下流のシグナル伝達に影響を及ぼさないことが暗示された（図３Ｂおよび図３Ｃ）。

【0276】

産生培養では、ＵＰＲのＰＥＲＫ分岐によるＰＤＧＦＲａのダウンレギュレーションも観察され、培養期間の終了に向かうＰＤＧＦＲａレベルの低下は、その下流標的タンパク質のｍＲＮＡレベルの急増によって明らかなように、さらに高いレベルのＰＥＲＫ活性と一致した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。ＰＥＲＫの化学的阻害は、その下流標的の転写増加を防止し、産生中のＰＤＧＦＲａレベルも安定化した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。

【0277】

実施例３：ＵＰＲのＰＥＲＫ分岐の活性化は、ＰＤＧＦＲａシグナル伝達を減衰させ、特異的産生性を低下させ、産生中の培養物の生存能力を促進する
ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株を使用して、ＰＥＲＫ阻害剤の非存在下（対照）または存在下（産生の３日目に添加）で、産生培養においてＰＥＲＫ活性化とＰＤＧＦＲａ発現のダウンレギュレーションとの間の相関をモニタリングした。産生培養の１３および１４日目に観察されたＰＤＧＦＲａのダウンレギュレーション（図４Ｃ、左パネル）は、ＰＥＲＫの下流標的であるＣＨＯＰ遺伝子およびＧＡＤＤ３４遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加と相関し（Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＰＥＲＫシグナル伝達経路の活性化が示された（図４Ｄ）。ＰＥＲＫ阻害剤の添加は、ＰＥＲＫシグナル伝達をブロックし（ＣＨＯＰおよびＧＡＤＤ３４のｍＲＮＡレベルは増加せず）、ＰＤＧＦＲａ発現のダウンレギュレーションを防止した（図４Ｃ右パネル、および図４Ｄ）。ＰＥＲＫ阻害剤を使用すると法外な費用がかかり、培養細胞に対するその潜在的なオフターゲット活性を完全に排除することができないため、ＰＤＧＦＲａダウンレギュレーションおよび産生培養性能に果たすこのシグナル伝達経路の役割を直接調査するために、ＰＥＲＫ ＫＯ ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株を作製することを決定した。

【0278】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して、ｍＡｂ２発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株のＰＥＲＫ遺伝子をノックアウトし、単一細胞クローニングの後、親細胞株と同等の増殖プロファイルを有する誘導されたＰＥＲＫ ＫＯ細胞株（図５Ａ、下線付きクローン）を産生培養において評価した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株は、親細胞株と比較して増殖および生存率の低下を全体的に示したが（図５Ｂ）、ＷＴ親細胞株と比較して、ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株の方がいずれも高い特異的産生性を有し、ほとんどの部分で高い力価を有した（図５Ｂ）。産生中のこれらの細胞株のウエスタンブロット分析により、産生の終了に向かってＰＤＧＦＲａ発現レベルの低下を示したＷＴ親細胞株と比較して、ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株ではＰＤＧＦＲａレベルが安定化されたことが確認された（図５Ｃ）。ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株の方が細胞内ＢｉＰタンパク質のレベルが高いことにより、ＵＰＲ活性化の増加が示されたが（図５Ｃ）、細胞増殖および生存率の観察された低下（図５Ｂ）は、カスパーゼ－３切断の増加と相関し、産生培養の終了に向かうアポトーシス経路の活性化が暗示された（図５Ｃ）。ＷＴまたはＰＥＲＫ ＫＯ細胞株によって発現された抗体は、同等の産物品質を有した。

【0279】

これらの発見から、ＵＰＲのＰＥＲＫ分岐の活性化が、シードトレインおよび産生培養の両方においてＰＤＧＦＲａの発現をダウンレギュレートすることが確認された。興味深いことに、ＰＥＲＫ ＫＯ培養物の方が、低い全体的な生存率および増殖を示したが、産生中の力価および特異的産生性は高かった（図５Ｂ）。これらの培養物における細胞内ＢｉＰレベルの増加と、高レベルのカスパーゼ－３切断とは、それぞれＵＰＲ経路およびアポトーシス経路の活性化を示し、培養物の生存能力の低下と相関した（図５Ｃ）。産生中の高レベルの特異的産生性は、細胞アポトーシスを引き起こし、早期ＰＥＲＫ活性化は、これらの細胞の特異的産生性を単純に低下させることによって細胞アポトーシスを減衰させる可能性が高い。

【0280】

実施例４：Ｂａｘ／Ｂａｋ二重ノックアウトＣＨＯ細胞株におけるＰＥＲＫのノックアウトは、導入遺伝子転写を増強し、アポトーシス細胞死を減衰させることによって特異的産生性および力価を劇的に増加させた
ＰＥＲＫ ＫＯクローンの方が産生中に高いレベルのアポトーシスを示したため（図５Ｃ）、ｍＡｂ３発現ＷＴ細胞株、またはＢａｘ／Ｂａｋ二重ノックアウト（ＤＫＯ）細胞株のｍＡｂ３発現プールにおいてＰＥＲＫ遺伝子をノックアウトした（図６Ａ）。Ｂａｘ／Ｂａｋは、ミトコンドリアで作用してアポトーシス細胞死を開始するタンパク質であり（Ｔａｙｌｏｒ，Ｃｕｌｌｅｎ，＆Ｍａｒｔｉｎ，２００８）、これらの遺伝子を欠失させると、細胞株はアポトーシスに対してさらに耐性になり、ＷＴ ＣＨＯ細胞株と比較して、長期産生プロセス中の生存能力および産生性が改善される可能性がある（Ｍｉｓａｇｈｉ，Ｑｕ，Ｓｎｏｗｄｅｎ，Ｃｈａｎｇ，＆Ｓｎｅｄｃｏｒ，２０１３）。単一細胞選別後、１）リーン産生培地を使用して、２）リッチ産生培地を使用して、および３）強化プロセスでリッチ産生培地を使用して、３つの異なる産生プラットフォームにわたって、ＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ三重ノックアウト（ＴＫＯ）クローン（図６Ａ）を対照（ＷＴ、ＰＥＲＫ ＫＯ、およびＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯプール）と比較した。ＴＫＯクローンは、全産生プラットフォームにわたって同等の産物品質属性を維持しながら（表３）、対照よりも高い力価および相対特異的産生性を示す良好なバイオプロセスの結果を示した（図６Ｂおよび図６Ｃならびに表２）。ＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯプールおよびクローンを試験する同様の産生プラットフォームから、ＰＥＲＫ遺伝子の欠失が、抗体（ｍＡｂ３）またはＦａｂ（Ｆａｂ１）を発現するさらに高い特異的産生性ＣＨＯ細胞をもたらすことが明確に明らかにされる（図７Ａ、図７Ｂおよび表４）。これらのデータは、Ｂａｘ／Ｂａｋ／ＰＥＲＫ ＴＫＯ ＣＨＯ細胞の特異的産生性の観察された増加が、クローン特異的または産物特異的ではなく、むしろ一般的な現象であることを示唆している。
表２。異なるバイオプロセスにわたるｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＫＯ細胞のバイオプロセスの結果。

表３。異なるバイオプロセスにわたるｍＡｂ３発現ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＫＯ細胞の産物品質。

表４。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯおよびＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯの単一細胞クローンのバイオプロセスの結果。

【0281】

ウエスタンブロット分析により、ＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯクローンは、親系統よりも、シードトレイン（図６Ａ）および産生培地（図６Ｄ）では抗体重鎖および軽鎖の細胞内レベルが高いことが明らかにされた。さらに、ＴＫＯクローンは、親系統よりも、産生時に安定化されたＰＤＧＦＲａ発現を示し、カスパーゼ－３切断を示さず、アポトーシス経路の阻害を示した（図６Ｄ）。興味深いことに、ＰＥＲＫ／Ｂａｘ／Ｂａｋ ＴＫＯクローンの方が高いレベルのＩＲＥ１ａ、リン－ＩＲＥ１ａ、および顕著に高いレベルのスプライシングされたＸＢＰ－１転写因子を有し、これらの細胞が産生時にタンパク質翻訳およびタンパク質恒常性ストレスの増加を経験していることが示された（図６Ｄ）。また、ＴＫＯクローンの方が高いレベルのＳｏｄ２タンパク質を示し、活性酸素種（ＲＯＳ）経路の活性化が暗示された（図６Ｄ）。これらの発見から、産生中のＵＰＲのＰＥＲＫ分岐の活性化が、タンパク質翻訳、ならびにＩＲＥ１ａ経路およびＲＯＳ経路の減衰を減少させ、それによって産生培養におけるアポトーシス細胞死を軽減することによって、タンパク質恒常性ストレスを累積的に減少させることが示唆される。これらの産生プロセスをさらに調査することにより、親細胞株と比較してＴＫＯクローンにおける重鎖転写物および軽鎖転写物のｍＲＮＡレベルの増加に対して特異的産生性の増加が関連付けられた（図６Ｅ）。これは、ＵＰＲのＰＥＲＫ分岐が、ＩＲＥ１ａシグナル伝達またはＰＤＧＦＲａシグナル伝達の減衰を介して直接的または間接的に、産生中のＣＭＶプロモーターからの導入遺伝子転写を減少させることを示唆している。

【0282】

上記のように、ＰＥＲＫ ＫＯ細胞株における特異的産生性の増加によるアポトーシスを防止するために、Ｂａｘ／Ｂａｋ二重ノックアウト細胞株を発現する抗体においてＰＥＲＫをノックアウトした（図６Ａ）。驚くべきことに、産生中のＴＫＯクローンにおける相乗効果は、同等のＩＶＣＣおよび生存率を有しながら、親系統よりも高い全体的な力価（最大８ｇ／Ｌ）および相対特異的産生性をもたらした（図６Ｂ、図６Ｃおよび表２）。この相乗効果は、Ｂａｘ遺伝子およびＢａｋ遺伝子の欠失によるアポトーシスシグナル伝達経路の減衰によるＩＲＥ１ａ活性の延長と併せて、ＵＰＲのＩＲＥ１ａ分岐を減衰させることが示されている、ＰＥＲＫの欠失によって引き起こされるＩＲＥ１ａシグナル伝達の増加（Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２０１８）によって説明され得る。産生中の本発明者らのＴＫＯクローンでは、リン酸化度が増大したＩＲＥ１ａ、およびその下流標的であるスプライシングされたＸＢＰ－１の存在の増加によって示される、ＩＲＥ１ａシグナル伝達の増加および延長が観察された（図６Ｄ）。ＸＢＰ－１は、バイオプロセスの結果を一過性に改善することが示されており（Ｒａｊｅｎｄｒａ，Ｈｏｕｇｌａｎｄ，Ｓｃｈｍｉｔｔ，＆Ｂａｒｎａｒｄ，２０１５）、抗体転写レベルの観察された増加（図６Ｅ）は、ＵＰＲのＰＥＲＫ分岐の活性化がＣＭＶプロモーターからの導入遺伝子転写を減衰させるか、またはＰＤＧＦＲａおよび／もしくはＩＲＥ１ａシグナル伝達が、直接、もしくはそれらの下流標的を介してＣＭＶプロモーターからの転写を増強する役割を果たすことを示唆している。ただし、これらのシグナル伝達経路間の正確な機構および相互作用は依然として決定されていない。

【0283】

本開示に提示される発見は、抗体発現ＣＨＯ細胞におけるＵＰＲの慢性活性化が、主にＰＤＧＦＲａレベルをダウンレギュレートするＰＥＲＫ経路を介して不良な増殖を引き起こし得ることを示唆している。これらの細胞におけるＵＰＲは、ＥＲにおけるタンパク質恒常性ストレスによって主に引き起こされ、ＥＲにおけるタンパク質恒常性ストレスは、細胞培養パラメータから、発現されるタンパク質のアミノ酸配列および組成に及ぶ多くの異なる要因によって引き起こされ得る。これは、タンパク質産生、したがって、ＥＲへの負荷が増加した場合に適応増殖を促進する方法であると考えられる。ＰＤＧＦＲａレベルを調節することによって細胞の増殖および代謝を減速させることにより、ＥＲ拡大のためにさらに多くの時間を与えることができ、これもまたＰＥＲＫ経路によって調節される。ＰＥＲＫ経路をノックアウトすることは、細胞が増殖することを可能にし得るが、細胞は、高率の特異的産生性およびタンパク質合成によって課される追加のストレスに適応することができないことから、アポトーシスももたらす可能性がある。これを回避するために、アポトーシス経路の成分（Ｂａｘ／Ｂａｋ遺伝子）の欠失と併せてＰＥＲＫ経路をノックアウトすることにより、高率の特異的産生性と細胞生存能力の増加とが達成される。したがって、本開示では、アポトーシス経路が減衰された哺乳動物タンパク質発現宿主細胞株においてＰＥＲＫをノックアウトすると、特異的産生性、したがって、培養力価が顕著に増加し得ることが提案される。

【0284】

本出願を通して引用される、全ての図面および全ての参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに寄託番号の内容物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれている。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D-E】

【図3A-B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E-1】

【図6E-2】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

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【国際調査報告】