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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-28
(54)【発明の名称】バイオマーカーとしての繊毛タンパク質および使用方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240521BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240521BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240521BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023571914
(86)(22)【出願日】2022-05-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 US2022030298
(87)【国際公開番号】W WO2022246229
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/191,126
(32)【優先日】2021-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511148204
【氏名又は名称】ザ メディカル カレッジ オブ ウィスコンシン インク
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100134832
【弁理士】
【氏名又は名称】瀧野 文雄
(74)【代理人】
【識別番号】100165308
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 俊明
(74)【代理人】
【識別番号】100115048
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 康弘
(72)【発明者】
【氏名】ラムチャンドラン ラマーニ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045BB03
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB03
2G045CB07
2G045CB11
2G045CB12
2G045CB14
2G045CB30
2G045DA36
2G045FA37
2G045FB01
2G045FB03
4B063QA01
4B063QA07
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR55
4B063QS33
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、試料中の繊毛マーカーを検出するための方法およびキット、ならびに対象の内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を検出および治療するためのその使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
内皮損傷もしくは内皮機能不全または血管損傷を、それを必要とする対象において検出する方法であって、対象からの生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップ
を含み、
対照と比較して生物学的試料中に検出されたより高いレベルの繊毛が、内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を示す、
方法。
【請求項2】
１つまたは複数のマーカーを検出するステップが、試料を繊毛のマーカーに対する１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、
抗体と試料中のマーカーとの結合を検出するステップと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
検出するステップが酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
検出するステップがフローサイトメトリーによるものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
繊毛の１つまたは複数のマーカーが繊毛マーカーまたは基底小体繊毛マーカーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
１つまたは複数のマーカーが、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８、アセチル化αチューブリンおよびＮＲＦ２から選択される１つまたは複数の繊毛マーカー、ならびにγチューブリンまたはインバーシンから選択される１つまたは複数の基底小体マーカーを検出するステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
内皮損傷または血管損傷を処置するために治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷が、鎌状赤血球貧血、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、動脈－静脈奇形、静脈瘤、変化した腫瘍血管系、出血、子癇前症および高血圧症から選択される疾患に関連する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
生物学的試料が、血清、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、涙、滑液、母乳、胆汁、羊水、房水、膣潤滑、汗、リンパ液および骨髄から選択される試料である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
少なくとも１つの繊毛マーカーに結合する少なくとも１つの抗体と、使用説明書と、を含むキット。
【請求項12】
検出標識を有する少なくとも１つの二次抗体をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
１つまたは複数の抗体が、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される繊毛マーカーに結合する、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項14】
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を有する対象におけるＳＣＤに関連する閉塞事象を検出する方法であって、対象からの第１の生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップ
を含む、方法。
【請求項15】
対象からの試料中の赤血球上の繊毛を検出する方法であって、対象から血液試料を得るステップと、
試料から赤血球（ＲＢＣ）を分離するステップと、
赤血球の表面上の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項16】
ＲＢＣ上の繊毛の検出が損傷した血管を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
対象から第２の血液試料を得るステップと、試料から第２のセットの赤血球を分離するステップと、
ＲＢＣの表面上の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップと、
第１の試料からのＲＢＣ上の繊毛のレベルを第２の試料と比較するステップであって、第２の試料が第１の試料よりも遅い時間に採取され、ＲＢＣと関連する繊毛の増加は、対象内の１つまたは複数の血管への損傷を示す、ステップと、
をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
同じ対象からの第２の生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップであって、第２の生物学的試料が第１の生物学的試料よりも遅い時間に採取される、ステップをさらに含み、
第１の試料と比較して、第２の試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーのレベルの増加が閉塞事象を示す、
請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
１つまたは複数のマーカーを検出するステップが、試料を繊毛のマーカーに対する１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、
試料中の１つまたは複数のマーカーへの抗体の結合を検出するステップと、
を含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
試料を、検出可能なマーカーを有する二次抗体と接触させるステップと、試料中の検出可能なマーカーを検出するステップと、
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
繊毛のマーカーに対する抗体または二次抗体が固体支持体に結合している、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
検出するステップが酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるものである、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
検出するステップがフローサイトメトリーによるものであり、任意選択で、繊毛のマーカーに対する抗体または二次抗体がビーズに結合している、請求項１４から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
繊毛の１つまたは複数のマーカーが繊毛マーカーまたは基底小体繊毛マーカーである、請求項１４から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
１つまたは複数のマーカーが、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８、アセチル化αチューブリンおよびＮＲＦ２から選択される１つまたは複数の繊毛マーカー、ならびにγチューブリンまたはインバーシンから選択される１つまたは複数の基底小体マーカーを検出するステップを含む、請求項１４から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項27】
閉塞事象を処置するために治療薬を投与するステップをさらに含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
閉塞事象が、血管壁の脆弱化または出血に対する感受性の増加を含む、請求項１４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
対象から試料を得るステップを含む、請求項１から１０および１４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２０日に出願された米国仮出願第６３／１９１，１２６号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２０日に出願された米国仮出願第６３／１９１，１２６号の優先権を主張し、その内容全体が参照により組み込まれる。
【0002】
連邦により援助された研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ６１ＨＬ１５４２５４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ６１ＨＬ１５４２５４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0003】
配列表
配列表は本出願に添付され、サイズが１５１８バイトであり、２０２２年５月１９日に作成された「６５００５３．００８８４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本出願と共に電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表は本出願に添付され、サイズが１５１８バイトであり、２０２２年５月１９日に作成された「６５００５３．００８８４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本出願と共に電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
繊毛は、内皮細胞（ＥＣ）の頂端管腔表面から突出する微小管ベースの細胞小器官であり、低流量センサと広くみなされている。以前の報告は、高い剪断応力でＥＣ表面上の繊毛が失われることを示唆しており、より最近の証拠は、細胞表面からの繊毛の物理的除去である脱毛が哺乳動物細胞における繊毛喪失の主な機構であることを示唆している。
高い血流または低い血流によって引き起こされ、内皮損傷または機能不全または血管損傷につながる変化を検出する新しいマーカーおよび方法が必要とされている。
高い血流または低い血流によって引き起こされ、内皮損傷または機能不全または血管損傷につながる変化を検出する新しいマーカーおよび方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
内皮細胞上に発現される繊毛およびその関連タンパク質は、乱流に遭遇すると失われ、細胞から繊毛が除去され、赤血球および体液上で検出される。したがって、この遊離繊毛は、血管機能障害および損傷に関連する血流の変化のバイオマーカーとして使用することができる。
【0006】
一態様では、本開示は、内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷の検出を必要とする対象において内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を検出する方法であって、対象からの生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップを含み、対照と比較して生物学的試料中で検出されたより高いレベルの繊毛が、内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を示す方法を提供する。
【0007】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの繊毛マーカーに結合する少なくとも１つの抗体と、使用説明書とを含むキットを提供する。キットは、検出可能な標識を有する少なくとも１つの二次剤をさらに含み得る。１つまたは複数の抗体は、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される繊毛マーカーに結合し得る。
【0008】
別の態様では、本開示は、ＳＣＤを有する対象における鎌状赤血球症（ＳＣＤ）に関連する閉塞事象を検出する方法であって、対象からの第１の生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップを含む方法を提供する。
【0009】
さらなる態様では、本開示は、対象からの試料中の赤血球上の繊毛を検出する方法を提供し、本方法は、対象から血液試料を得るステップと、試料から赤血球（ＲＢＣ）を分離するステップと、赤血球の表面上の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】剪断応力により、脳ＥＣがインビトロでより少ない繊毛タンパク質を発現することを示す図である。ＨＢＭＶＥＣを、Ｉｂｉｄｉ流動システムによって剪断応力の段階的強度（２ｄｙｎｅ／ｃｍ２、４ｄｙｎｅ／ｃｍ２、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）に供した。合計２ｄｙｎｅ／ｃｍ２を「定常状態」流動条件として利用した。示される持続時間での流動の後に、繊毛関連タンパク質の発現をフローサイトメトリーによってＭＦＩとして定量した。繊毛の形成および機能を制御すると報告された転写因子であるＮＲＦ２も研究に含めた。試料中のタンパク質の発現を、それぞれの「流れなし」対照に対して正規化した。ＡＮＯＶＡを実施して、１０分または２４時間の時点について、実験群と定常状態対照群とを比較した。ＡＮＯＶＡは２通りであった。分析はまた、２ｄｙｎｅ／ｃｍ２群で１０分～２４時間行った。３つすべてのタンパク質発現において、４ｄｙｎｅ／ｃｍ２群と１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２群との間に統計的差異は観察されなかった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。この図に報告されるすべての群について、ＩＦＴ８８を除いてｎ＝６である（１０ｄｙｎｅ群についてはｎ＝５）。
【図2A-K】剪断ストレスがインビトロで内皮細胞および上皮細胞の崩壊を引き起こすことを示す図である。（Ａ～Ｄ）単層上で成長させたＨＵＶＥＣ。２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の流体剪断応力を細胞に灌流し、灌流液を収集した。滴濃縮された灌流液をＤＩＣ顕微鏡で分析し、繊毛（アセチル化α－チューブリン）（Ｂ）および基底小体（γ－チューブリン）（Ｃ）のマーカーで染色した。拡大画像もボックス内に示されている。（Ｄ）重ね合わせた画像を示す。（ＥおよびＦ）それぞれ１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２剪断応力の印加前（上のパネル）および印加後（下のパネル）の上皮細胞集団からの繊毛の有無についての免疫染色（アセチル化α－チューブリン、緑色、繊毛；ＤＡＰＩ、青色、核）。（ＧおよびＨ）単一の生細胞における一次繊毛の位相コントラストＤＩＣ画像（白い点線のボックス）。同じ細胞を、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の流体剪断応力を４分間印加する前後に画像化した。（Ｉ）ＤＩＣ顕微鏡下で灌流する。（Ｊ）別の実験では、灌流液を収集し、蛍光および位相差撮像（Ｉ）の両方を使用して繊毛の存在を確認するために繊毛マーカー（アセチル化α－チューブリン；緑色）で染色した。（Ｋ）繊毛および細胞溶解物を繊毛マーカー（アセチル化αチューブリン）で免疫ブロットして、灌流液中の繊毛の存在を分子的に確認した（ｎ＝６）。Ｅ－Ｋはブタ腎臓上皮細胞（ＬＬＣ－ＰＫ１）を表す。
【図3A-B】剪断応力が、インビボでより少ない繊毛タンパク質を有するＥＣをもたらすことを示す図である。２９．５ｈｐｆでのＦｌｋ１ｍＣｈｅｒｒｙＡｒｌ１３ｂＧＦＰ二重遺伝子導入ゼブラフィッシュ胚を、３２℃の温度に３時間さらした。単一細胞を脱絨毛胚から採取し、繊毛特異的タンパク質の発現を、生きているＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）対非ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－）においてフローサイトメトリーによって定量した。代表的なドットプロットは、ＥＣ（Ａ）を同定するためにＦＡＣＳ分析中に適用されるゲーティング戦略を示す。応力応答性タンパク質Ｋｌｆ４をＥＣ（Ｂ）で定量した。タンパク質の定量化を、ＭＦＩを測定することによって行った。
【図3C-D】繊毛特異的タンパク質をＥＣ（Ｃ）および非ＥＣ（Ｄ）において定量した。Ａｒｌ１３ｂ発現は、緑色蛍光タンパク質発現の増強によって特徴付けられる。Ａｒｌ１３ｂの場合ｎ＝６（ＥＣおよび非ＥＣの場合）；γ－チューブリンｎ＝５（ＥＣおよび非ＥＣについて）；Ｉｆｔ８８ｎ＝４（ＥＣ）およびｎ＝５（非ＥＣ）；インバーシン（ＥＣおよび非ＥＣについてｎ＝３）；Ｋｌｆ４ｎ＝３（ＥＣおよび非ＥＣについて）。線形混合モデルを使用して、ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）または非ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－）内の処置群と対照群との差を調べた。１日以内に入れ子に処理された時間をランダムとして処理した。ＡＲＬ１３ｂおよびインバーシン発現データを対数変換して適合を改善した。
【図4A-D】鎌状赤血球が脳ＥＣに付着して欠損を誘発し、繊毛が鎌状赤血球およびＳＣＤ由来の血漿に見られることを示す図である。鎌状赤血球（ＳＳ）または健常（ＡＡ）ＲＢＣに曝露したＨＢＭＶＥＣを剪断応力（１ｄｙｎｅ／ｃｍ２）に供し、応力誘導後にＥＣに接着したＳＳ（ｎ＝６）およびＡＡ（ｎ＝５）ＲＢＣの割合を計算したところ、Ｐ＝０．００８１（Ａ）であった。流動前にＳＳおよびＡＡ ＲＢＣをＡＲＬ１３ｂ繊毛について試験し、循環ＳＳ ＲＢＣ（ｎ＝１６）対ＡＡ ＲＢＣ（ｎ＝１２）に付着したＡＲＬ１３ｂ繊毛の割合を定量したところ、Ｐ＜０．０００１（Ｂ）であった。フロー後に、ＥＣとの相互作用時に、ＡＡ ＲＢＣ（ｎ＝６）ではなくＳＳ ＲＢＣ（ｎ＝１１）上でＡＲＬ１３ｂ発現、Ｐ＝０．０００６（Ｃ）。（Ａ～Ｃ）マン・ホイットニー－ウィルコクソン検定Ｐ値を示す。ＳＳ ＲＢＣの塗抹標本の代表的な分野（倍率６３倍；スケールバー＝２０μｍ）は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ａｒｌ１３ｂ抗体（Ｄ）で検出されるこれらの鎌状赤血球上の繊毛の存在を示す。ウェスタンブロットのプロットは、鎌状赤血球（ＳＳ）に対する健常対照（ＡＡ）の血漿試料中の繊毛特異的タンパク質の検出を示す。
【図4E-F】赤色のアスタリスクは、定量（Ｅ）に使用した上部ＩＦＴ８８バンドを表す。４つのＡＡおよびＳＳ試料のみからのウェスタンブロットをＥに示すことに留意されたい。他の６つの試料のための別個のゲルを実行し、定量した。定量は、各群からの１０個すべての試料を含む。繊毛特異的タンパク質を、健常対照（ＡＡ）（ｎ＝１０）対鎌状赤血球（ＳＳ）（ｎ＝１０）の血漿試料から定量し、ハウスキーピングタンパク質ｂＡＣＴＩＮ（Ｆ）に対して正規化した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。群間で比較するために、両側ｔ検定またはマン・ホイットニー－ウィルコクソン検定を行った。
【図5A-B】鎌状赤血球によって引き起こされる繊毛の脱落は、ＲＢＣによって誘発されるＥＣ ＲＯＳ生成の増加に依存する。ヒト脳微小血管ＥＣを、曝露前に、ＮＯＸ阻害剤アポシニン（Ａ）で偽処置または処置したか、または鎌状赤血球（ＳＳ ＲＢＣ）で処置しなかった（ｎ＝６）。ＳＳ ＲＢＣへのＨＢＭＶＥＣの曝露は、ＮＯＸに依存するＥＣにおけるＲＯＳ生成を増加させた。フローサイトメトリー分析は、ＳＳ ＲＢＣに結合したＡＲＬ１３ｂ（ｎ＝６）が、アポシニン（Ｂ）で前処理した剪断ストレスＥＣとの相互作用の前（ベースライン）および後であることを示す。＊Ｐ＜０．０５、および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。＋ａ＝アポシニンで処理したＥＣ。Ａについては、１元配置ＡＮＯＶＡ検定を行い、Ｂについては、ウィルコクソンの符号順位検定を行った。
【図6A-C】ＲＯＳ産生の減衰がＥＣ中の繊毛タンパク質を救済することを示す図である。ＨＢＭＶＥＣを、ＮＯＸ阻害剤ＶＡＳ２８７０の存在下または非存在下でＲＯＳ誘導性ＰＭＡで処理した。非処置群も対照として含めた。ＲＯＳ産生をフローサイトメトリー（Ａ）によってＭＦＩとして定量した。酸化ストレスに対抗するタンパク質ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１）を定量した（Ｂ）。繊毛の形成および機能を制御すると報告された転写因子であるＮＲＦ２も研究に含めた（Ｃ）。
【図6D-E】繊毛タンパク質はＰＭＡによってダウンレギュレートされ、ＮＯＸ阻害剤ＶＡＳ２８７０によってレスキューされる（ＤおよびＥ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＡＮＯＶＡ（１ウェイ）を実施し、ボンフェローニの補正を用いて多重比較を調整した（全群ｎ＝５）。
【図7A-B】Ｉｂｉｄｉフローシステムによって誘発される剪断応力の検証を示す図である。ヒト脳微小血管内皮細胞を、ｉｂｉｄｉ流動システムによって誘導されるように、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力に２４時間供し、続いて、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ａ）によって流動応答遺伝子ＫＬＦ４またはＫＬＦ２、ならびにフローサイトメトリー（Ｂ）によってそれぞれのタンパク質についてモニターした。ＫＬＦ４およびＫＬＦ２遺伝子発現をＧＡＰＤＨに対して正規化し、倍率変化としてプロットした。＊Ｐ＜０．０５
【図8A-F】インビトロでシェーカー法によって誘導された剪断応力後の脳内皮細胞からの繊毛タンパク質の喪失を示す図である。ヒト脳微小血管内皮細胞を、「シェーカー」法によって誘導される剪断応力の段階的強度（４ｄｙｎｅ／ｃｍ２および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）に供し、その後に、繊毛特異的タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって定量した。応力応答性タンパク質を、中央蛍光強度を測定することによって、非繊毛ハウスキーピング（Ｂ）または繊毛特異的タンパク質（Ｃ～Ｆ）と共に定量した（Ａ）。すべてのタンパク質について、群間比較（４ｄｙｎｅ対対照、１０ｄｙｎｅ対対照および４ｄｙｎｅ対１０ｄｙｎｅ）を行った。３つすべての群の比較において、Ａｒｌ１３ｂ、チューブリン、ＩＦＴ８８およびインバーシンタンパク質についてＰ、０．００１。Ａｌｋ１については、４ｄｙｎｅ対対照についてＰ＝０．０００３、１０ｄｙｎｅ対対照についてＰ＝０．００１、および４ｄｙｎｅ対１０ｄｙｎｅの比較についてＰ＝０．０００４。ダイニンは、Ｐは、４ｄｙｎｅ対対照および１０ｄｙｎｅ対対照について０．００１であり、Ｐ＝４ｄｙｎｅ対１０ｄｙｎｅの比較について０．０１７３である。ｎ＝４であるβ－アクチンを除くすべてのタンパク質標的についてＮ＝３。
【図9A-B】インビトロおよびインビボでの剪断応力ＥＣ ＦＡＣＳ実験のスキームを示す図である。Ａは、ＦＡＣＳ分析のための剪断応力後のＨＢＭＶＥＣの処理のスキームを示す。Ｂは、ＦＡＣＳ前の魚処理条件およびその後の分析のスキームを示す。
【図10】ゼブラフィッシュにおける温度誘発剪断応力の実験設計を示す図である。３つの群およびそれぞれのインキュベーションの条件を図形式で示す。すべての血流パラメータを受精（ｈｐｆ）後４８時間に評価した。
【図11A-B】３２℃および３５℃の２つの温度で評価したＰＭＢＣ流量パラメータを示す図である。Ａは、３２℃で３つの群（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）にわたって原始中脳チャネル（ＰＭＢＣ）で測定されたパルス、血流速度、血管直径および剪断応力を示す。Ｂは、３５℃で３つの群（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）にわたってＰＭＢＣにおいて測定されたパルス、血流速度、血管径および剪断応力を示す。＊Ｐ＜０．００１。
【図12A-B】３２℃および３５℃の２つの温度で評価したＤＡ流量パラメータを示す図である。Ａは、３２℃で３つの群（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）にわたって背側大動脈（ＤＡ）で測定されたパルス、血流速度、血管径および剪断応力を示す。Ｂは、３５℃で３つの群（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）にわたってＤＡで測定されたパルス、血流速度、血管径および剪断応力を示す。＊Ｐ＜０．００１。
【図13A-B】３２℃の２つの温度で評価したＰＭＢＣおよびＤＡ流量パラメータを示す図である。Ａは、３２℃で３つの群（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）にわたって原始中脳チャネル（ＰＭＢＣ）で測定されたパルス、血流速度、血管直径および剪断応力を示す。Ｂは、３つの群にわたってＤＡで測定されたパルス、血流速度、血管径および剪断応力を示す（図Ｓ２に示すＧ１～Ｇ３）。＊Ｐ＜０．０００１。
【図14A-F】３５℃および３２℃でのカスパーフィッシュのホールマウント画像を示す図である。Ａ、Ｄ（群１）、Ｂ、Ｅ（群２）およびＣ、Ｆ（群３）受精後４８時間のＣａｓｐｅｒ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ（４８ｈｐｆ）３５℃および３２℃でインキュベートした魚胚をＯ－ジアニシジン染色（赤血球）で染色した。３５℃での群３（Ｃ）の胚は湾曲した軸を示すことに留意されたい。前方が左であり、後方が右である。背側が上である。
【図15A-C】循環しているマウス鎌状赤血球上の繊毛を示す図である。ＡおよびＢは、ＩＦＴ８８およびＡｒｌ１３ｂ抗体について染色されたＳＳ鎌状マウス由来の血液スメアを示す。緑色染色はＲＢＣ上の繊毛である。パネルＣの定量化は、パネルＡおよびＢとは異なる実験からのものである。対照（ＡＡ）対鎌状赤血球（ＳＳ）に付着したＡｒｌ１３ｂ陽性繊毛の定量化のために、１群あたり４匹のマウスを使用した。各マウスからの１つの塗抹標本、および各塗抹標本における４つの視野を計数した。したがって、対照マウスおよび鎌状マウス群（群あたりｎ＝４）からカウントした１６個の塗抹標本からの合計データを提示する。＃Ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、生物学的試料中の繊毛を検出するための方法およびキットならびにその使用を提供する。本開示では、繊毛が疾患状態における流れの変化（高または低）のバイオマーカーとして機能し、したがって患者の疾患の予後または診断マーカーとして使用され得ることを実証する。流量は、体内でより低いかまたはより高く、血管損傷および損傷をもたらし得る。したがって、体内のすべての血管の根底にあるＥＣは、細胞表面に繊毛を分配または保持することによって変化した流れパターンに反応する流れセンサの第１のラインである。したがって、正味の結果は、生物学的流体中の多かれ少なかれ繊毛であり、これはアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ分析）によって監視することができる。いくつかの実施形態では、繊毛に関連する基底小体は、生体流体（血清、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、涙、滑液、母乳、胆汁、羊水、房水、膣潤滑、汗、リンパ液、骨髄）中の繊毛の起源のマーカーとして機能する。
【0012】
繊毛の長さは、血管における機械感覚作用と相関していることが多く、低い剪断応力を受けている細胞はより長い繊毛を有し、高い剪断応力を受けている血管内の細胞はより短い繊毛を有するかまたは繊毛を有しない。繊毛は、管腔内に突出し、中心体由来の構造である、基底小体に接続する移行線維を介して細胞に固定される軸糸からなる。最近の研究は、繊毛が哺乳動物細胞から物理的に除去され得ることを示唆しており、これは脱落と呼ばれるプロセスであり、これは繊毛膜および軸索素を基底小体から放出する。実施例は、循環中の繊毛タンパク質の検出または定量化が、血流の変化または血液粘度の変化の病的状態のバイオマーカーとして役立ち得ることを実証している。実施例は、定常状態の対照と比較して、内皮細胞に対する高剪断応力が、１０分間の灌流後に、繊毛関連タンパク質の発現を約２０％減少させたことを示す（図１）。群におけるタンパク質発現の低下は、灌流後２４時間でさらに顕著であった（＞５０％）（図１）。さらに、脳および全身血管系では、ＳＣＤにおける閉塞事象は、内皮への鎌状赤血球の接着によって開始されると仮定されている。実施例は、ＳＣＤ患者の血漿中の繊毛タンパク質が高い可能性があることを実証している。繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリンおよびＩＦＴ８８（図４、ＥおよびＦ）の存在についてウェスタンブロットを使用して、ＳＣＤ患者１０名および健常個体１０名の血漿を試験した。健常志願者と比較して、３つすべての繊毛タンパク質がＳＣＤ患者由来の血漿中で濃縮され（図４Ｆ）、血管閉塞および／または血流障害の素因を有する病的状態を実証し、繊毛タンパク質はＲＢＣの表面に存在し、ＥＣ接触時にＲＢＣ上にさらに蓄積し、血漿中で濃縮される。繊毛タンパク質は、血管内皮の血流媒介変化を診断するためのバイオマーカーとして使用され得る。
【0013】
一実施形態では、繊毛特異的タンパク質を、内皮損傷または機能不全のバイオマーカーとして血漿中で定量することができる。実施例は、ＥＣおよび上皮細胞からの細胞培養物中の排出物中に繊毛断片を検出し、ＥＣ中のインビボでより少ない繊毛発現細胞を検出することができた。さらに、ヒト鎌状赤血球は、正常なＲＢＣと比較して、その表面上のＡＲＬ１３ｂ繊毛タンパク質の増強を示し、間欠的流動条件下で脳ＥＣに遭遇すると、これらの鎌状赤血球上の繊毛タンパク質の存在は２．３倍高かった。これらの結果は、健常血漿と比較してＳＣＤ血漿中でより高いレベルの繊毛タンパク質の検出と一致する。興味深いことに、本発明者らは、ＳＣＤ患者の血漿中の繊毛構造の３つの代表的な成分（すなわち、軸糸、移行帯および基底小体）をすべて観察した。ＳＣＤの場合、ＲＢＣ上の増強された繊毛タンパク質の同定は、ＳＣＤ患者で観察される両方の臨床的に関連する特徴である、血管壁の脆弱化および出血に対する感受性などの有害事象を予後判定し得る。この情報を有することは、情報に基づいた臨床判断を行うために有益である。
【0014】
方法：
一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象の内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を検出する方法を提供する。この方法は、対象からの生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出することを含む。実施例に示すように、対照と比較して生物学的試料中に検出されたより高いレベルの繊毛は、対象の内皮損傷または機能障害または血管損傷を示す。次いで、この方法は、内皮損傷もしくは機能不全もしくは血管損傷を治療することができる治療薬を投与すること、または対象の血管系を監視すること（例えば、ＭＲＩなど）をさらに含むことができる。
一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象の内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷を検出する方法を提供する。この方法は、対象からの生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出することを含む。実施例に示すように、対照と比較して生物学的試料中に検出されたより高いレベルの繊毛は、対象の内皮損傷または機能障害または血管損傷を示す。次いで、この方法は、内皮損傷もしくは機能不全もしくは血管損傷を治療することができる治療薬を投与すること、または対象の血管系を監視すること（例えば、ＭＲＩなど）をさらに含むことができる。
【0015】
内皮損傷または機能不全は、バリア機能の喪失および血管壁への細胞物質の浸潤ならびに生理学的血管緊張の喪失を特徴とする。一酸化窒素媒介性の生理学的血管拡張の喪失、内皮接着の増加、ならびに白血球およびマクロファージの内皮下血管壁への移動が存在する。低酸素、剪断力および酸化ストレスは、内皮機能不全の引き金となる事象である。とりわけ、これは、アセチルコリンまたはセロトニンなどの通常は血管弛緩を生じる血管作動性物質が血管収縮を引き起こす状況をもたらす。内皮機能障害に関連する障害は、高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、免疫系機能不全、感染症、炎症、心血管疾患、脳卒中、鎌状赤血球貧血、動脈－静脈奇形、静脈瘤、腫瘍血管系の変化、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、出血および子癇前症を含む。
血管損傷は、血液の喪失、血餅、あざ、腫脹、痛み、痛みまたは腫脹を引き起こすものを含む、血管機能の破壊である。
血管損傷は、血液の喪失、血餅、あざ、腫脹、痛み、痛みまたは腫脹を引き起こすものを含む、血管機能の破壊である。
【0016】
本明細書で使用される場合、「対象」は、「患者」または「個体」と交換可能であり得、治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物であり得る動物を意味する。特定の実施形態では、対象はヒト対象である。必要としている対象は、内皮損傷または機能不全が生じている可能性のある任意の対象であり得、それには、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、免疫系機能不全、感染症、炎症、心血管疾患、脳卒中、鎌状赤血球症、鎌状赤血球貧血、動脈－静脈奇形、静脈瘤、腫瘍脈管構造の変化、出血および子癇前症を有するかまたはこれらと診断された対象が含まれるが、これらに限定されない。１つの例において、対象は鎌状赤血球症を有する。
【0017】
本明細書で使用される「生物学的試料」という用語は、対象から分離された組織、細胞、および／または生物学的流体を含む試料を含むが、これらに限定されない。生物学的試料の例としては、組織、細胞、生検、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液および涙が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生物学的試料は生検（腫瘍生検など）である。生物学的試料は、対象（例えば、血液または組織のサンプリングによって）または第三者（例えば、医療提供者または検査技師などの仲介者から受け取ったもの）から直接得ることができる。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、組織、細胞、生検、血液、リンパ、血清、血漿、尿、唾液、粘液および涙からなる群から選択される。特定の実施形態では、生物学的試料は生検を含む。
【0018】
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「バイオマーカー」という用語は、疾患または状態のリスクまたは発生率を予測するのに有用な様々な濃度で対象に存在する生物学的分子を指す。例えば、バイオマーカーは、内皮損傷または血管損傷のリスクがある対象においてより多い量またはより少ない量で存在するタンパク質であり得る。バイオマーカーは、対象の内皮損傷または血管損傷の指標またはマーカーとして使用される核酸、リボ核酸、またはポリペプチドを含むことができる。他の実施形態では、マーカーは繊毛のマーカーを含み得る。他の実施形態では、マーカーは、基底小体繊毛マーカーであり得る。特定の実施形態では、マーカーは、ＡＤＰ－リボシル化因子様タンパク質１３Ｂ（ＡＲＬ１３ｂ）、層間輸送タンパク質８８ホモログ（ＩＦＴ８８）、アセチル化αチューブリン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）、およびγチューブリンまたはインバーシンから選択される１つまたは複数の基底小体マーカー、ならびにそれらの任意の適切な組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の繊毛マーカー、あるいは３つ以上の繊毛マーカーを検出することを含む。
【0019】
いくつかの態様では、繊毛の１つまたは複数のマーカーは、繊毛マーカーまたは基底小体繊毛マーカーである。いくつかの実施形態では、検出するステップは、少なくとも１つの繊毛マーカーおよび少なくとも１つの基底小体マーカーを検出する。１つまたは複数のマーカーは、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択され得る。１つの例において、１つまたは複数の繊毛マーカーは、ＡＤＰ－リボシル化因子様タンパク質１３Ｂ（ＡＲＬ１３ｂ）、層間輸送タンパク質８８ホモログ（ＩＦＴ８８）、アセチル化－αチューブリンおよび核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）から選択され、１つまたは複数の基底小体マーカーは、γ－チューブリンまたはインバーシンから選択される。
【0020】
１つまたは複数のマーカーのレベルを測定するための「制御」という用語は、非疾患患者、既知量のマーカーを有する陽性対照からの試料を指すことができ、または経時的なマーカーのレベルの変化を監視するために使用することができるより早い時点から同じ患者から採取された最初の試料を指すことができる。当業者は、マーカーのレベルを適切に測定できるように適切な制御を選択することができる。
【0021】
例えば、本方法は、同じ対象からの第２の生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップをさらに含んでいてもよく、生物学的試料は、第１の試料よりも遅い時間に採取される。いくつかの態様では、第１の試料と比較した第２の試料中の繊毛タンパク質のレベルの上昇は、対象の内皮損傷または機能不全または血管損傷を示し得る。したがって、本明細書に記載の繊毛マーカーを経時的に監視および検出して、対象の内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷のリスクまたは発生を評価することができると考えられる。
【0022】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のマーカーを検出するステップは、試料を繊毛のマーカーに対する１つまたは複数の抗体と接触させるステップ、および試料中の抗体の存在を検出するステップを含む。繊毛のマーカーに対する適切な抗体は、当技術分野で見出され得るか、または実験動物を使用して適切なモノクローナル抗体を作製することによって作製され得る。
【0023】
適切な抗体は商業的に見出される。本明細書で使用される一次抗体には、ＡＲＬ１３ｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１７７１１－Ｉ－ＡＰ）、アセチル化チューブリン（ＳｉｇｍａカタログＴ６７９３）、ＩＦＴ８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＰＡ５－１８４６７）、インバーシン（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１０５８５－Ｉ－ＡＰ）、ダイニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＭＡ１－０７０）、ｇチューブリン（ＧｅｎｅＴｅｘカタログＧＴＸ１１３２８６）、Ａｌｋ１（Ａｂｃａｍカタログａｂ５１８７０）、ＫＬＦ４（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１１８８０－Ｉ－ＡＰ）、ＨＯ－１（ＢＤ、カタログ５６６３９１）、ＮＲＦ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ９３９２０２）およびｂアクチン（ＳｉｇｍａカタログＡ５４４１およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ４９７０Ｐ）が含まれる。使用される二次抗体は、ヤギ抗マウスＰＥＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ロバ抗ウサギＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ヤギＡＦ６５７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ウサギＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびロバ抗ウサギＡＦ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。しかしながら、本開示はこれらの抗体によって限定されず、特異的かつ感受性であり、繊毛マーカーに強く結合することができる任意の適切な抗体を、本明細書中に記載される開示の実施において使用することができる。
【0024】
適切には、繊毛のマーカーに結合することができる一次抗体は、検出可能なマーカーに直接コンジュゲートされ得る。他の例では、第１の抗体に結合することができる二次試薬または二次抗体を使用することができ、二次抗体は検出可能なマーカーにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、対照タンパク質もマーカーの定量のための尺度として使用され、例えば、対照タンパク質を複数の量で試験し、シグナルの輝度をタンパク質の量と相関させて、試料中の繊毛マーカーの量を相関させる曲線を作成する。これらの技術は当技術分野で周知である。
【0025】
適切な検出可能なマーカーは当技術分野で公知であり、例えば、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ、ｄｓＲｅｄなど）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍなどであり、当該技術分野で知られているすべてのもの、例えば、参照によりその全体が組み込まれるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｄｍｉｔｒｉｙ Ｍ．Ｃｈｕｄａｋｏｖ、Ｍｉｋｈａｉｌ Ｖ．Ｍａｔｚ、Ｓｅｒｇｅｙ ＬｕｋｙａｎｏｖおよびＫｏｎｓｔａｎｔｉｎ Ａ．Ｌｕｋｙａｎｏｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１０ ９０：３、１１０３－１１６３に記載されているものを含む）、レポーター酵素、リガンド／基質結合（ビオチン／ストレプトアビジン）、および当技術分野で公知の他のものが挙げられる。
【0026】
レポーター酵素を使用する場合、検出は、測定可能な産物を産生するための適切な基質とのインキュベーションを介してレポーター酵素の活性を測定することによって達成される。適切な酵素標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。他の適切な酵素には、β－ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびカタラーゼが含まれるが、これらに限定されない。基質の選択は、必要なアッセイ感度およびシグナル検出に利用可能な機器（分光光度計、蛍光光度計または光度計）に依存する。
【0027】
いくつかの実施形態では、検出方法は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することによる検出である。ＥＬＩＳＡ技術は当技術分野で容易に知られている。ＥＬＩＳＡは、とりわけ、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、またはサンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。いくつかの態様では、表面上のマーカーの直接的または間接的な固定化を使用することができる。他の実施形態では、一次または二次抗体ベイは、適切な表面に固定化される。
【0028】
別の実施形態では、検出は、例えばビーズにコンジュゲートさせた抗体に繊毛マーカーを結合させることによって、マーカーがコンジュゲートさせたビーズを用いたフローサイトメトリー、または当技術分野で公知の他の適切な方法を用いた検出である。
【0029】
本明細書に記載の方法は、追加の洗浄ステップを有し得る。洗浄ステップは、抗体またはレポーターマーカーに特異的に結合しない無関係のタンパク質または他の分子の任意の付加を除去するために加えられ得る。
検出は、アッセイにおいて直接または二次レポーターマーカーを介して生成されたシグナルを測定することを含み得る。
検出は、アッセイにおいて直接または二次レポーターマーカーを介して生成されたシグナルを測定することを含み得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、本方法は、内皮損傷または血管損傷を処置するための治療薬を投与するステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療する」という用語はそれぞれ、症状を緩和すること、一時的または永続的に結果として生じる症状の原因を排除すること、および／または出現を予防もしくは遅延させること、または指定された疾患もしくは障害の結果として生じる症状の進行もしくは重症度を逆転させることを意味する。
【0031】
検出されている内皮損傷もしくは機能不全または血管損傷は、疾患または障害に関連し得る。鎌状赤血球貧血、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、動脈－静脈奇形、静脈瘤、腫瘍血管系の変化、出血、子癇前症および高血圧から選択される。適切には、内皮損傷は、子癇前症、多発性嚢胞腎疾患、高血圧および脳卒中に関連し得る。
【0032】
鎌状赤血球症は一群の血液障害であり、最も一般的なものは鎌状赤血球貧血である。鎌状赤血球症は血管閉塞を引き起こし、疼痛、虚血および臓器損傷を引き起こし得る。適切な治療には、とりわけ、疼痛および輸血を軽減するための薬剤が含まれる。
【0033】
アテローム性動脈硬化症またはアテローム硬化性血管疾患は、動脈の壁の疾患であり、動脈の病変および狭窄をもたらす。内皮への損傷は、血管収縮と血管拡張との間のバランスを乱し、アテローム性動脈硬化症を促進または悪化させる多くの事象／過程を開始させ、これらには、内皮透過性、血小板凝集、白血球接着、およびサイトカインの生成の増加が含まれる。アテローム性動脈硬化症の適切な治療は、食事の変更、治療薬（例えば、スタチンおよび例えばエゼチミブ（Ｚｅｔｉａ）と呼ばれるコレステロール吸収阻害剤を含む他のコレステロール薬）、血液希釈剤（例えば、Ｗａｒｆｒｉｎ、アスピリン、クマジンなど）、血圧薬、外科的処置（血管形成術およびステント留置、動脈内膜切除術、線溶療法であり得る。
【0034】
ストークス（stoke）は、脳への血流不足が細胞死を引き起こす医学的状態である。内皮機能不全は脳卒中後に起こり、酸化ストレス、炎症、血管緊張の増加、血液脳関門（ＢＢＢ）損傷、および脳内のさらなる血栓血管合併症をもたらす。血液希釈剤を含む適切な処置は公知である。脳卒中は、脳内に漏出する血液成分に関連し、繊毛バイオマーカー試験によって事前に予後判定することができ、有害作用の前に予防措置（例えば、抗凝血剤処置）を可能にする。
【0035】
動静脈奇形（ＡＶＭ）は、体内の血管群が誤って形成された場合に発生する。これらの奇形では、動脈および静脈が異常に絡み合って直接接続を形成し、正常組織を迂回する。繊毛タンパク質レベルのモニタリングは、病変内の流れの変化の検出を可能にし、これは現在、撮像によって、または流れが漏れた後に診断される。コイルなどの包含および奇形に対するそれらの効果などの治療処置も、繊毛バイオマーカー検出キットによって決定することができる。
【0036】
静脈瘤としても知られている静脈瘤は、表在静脈が拡大してねじれる医学的状態である。機能不全内皮は、炎症カスケードを永続させる極めて重要な役割を有し、その結果、病理学的な静脈変化および慢性静脈疾患の悪化をもたらす。内皮機能不全は、静脈瘤と深部静脈血栓症との間の関連において中心的な役割を果たし得る。現在の治療は、手術、レーザー治療および減血薬である。これらの治療の効果は、血液から繊毛バイオマーカープロファイルを検出するための本明細書に記載の方法によって評価および監視することができる。
【0037】
出血は、損傷した血管および損なわれた透過性内皮から循環系から逃げる血液である。これは、差し迫った危機を止めるための綿密な監視および追加の予防臨床措置をもたらす。
子癇前症は、高血圧の発症を特徴とする妊娠障害である。母親の血圧上昇は、子供の早期出産につながる。したがって、繊毛バイオマーカーを用いて血圧変化の増加を早期に検出することは、処置の経過を変えるであろう。内皮機能不全は、高血圧ならびに子癇前症に関連する他の症状および合併症の多くをもたらす。子癇前症は、とりわけ、乳児の早期出産、高血圧薬によって治療することができる。
子癇前症は、高血圧の発症を特徴とする妊娠障害である。母親の血圧上昇は、子供の早期出産につながる。したがって、繊毛バイオマーカーを用いて血圧変化の増加を早期に検出することは、処置の経過を変えるであろう。内皮機能不全は、高血圧ならびに子癇前症に関連する他の症状および合併症の多くをもたらす。子癇前症は、とりわけ、乳児の早期出産、高血圧薬によって治療することができる。
【0038】
高血圧は、高血圧（ＨＢＰ）としても知られ、動脈内の血圧が持続的に上昇する医学的状態である。適切な処置は当技術分野で公知であり、例えば、血圧を低下させることができる血圧薬が含まれる。高血圧は、血液中のより多くの繊毛タンパク質をもたらし、したがって、投薬計画の変更をもたらす。
【0039】
多発性嚢胞腎疾患は、脳内の血管が膨らむ傾向があり、血管の破損および出血について監視される患者に関連する。血液希釈剤および降圧薬が使用される。繊毛検査を行うと、破裂しやすい血管は、繊毛タンパク質および血液中への沈着を増加させる可能性があり、これは治療の経過を変化させる。
【0040】
脳損傷は、本明細書に記載の繊毛バイオマーカー法を使用してモニタリングすることができる。本方法は、患者がＭＲＩ検査を必要とするかどうかを決定することができる。これは、仕事への復帰およびＭＲＩコストの節約、またはＥＲでどの患者に直ちに注意を払う必要があるかの優先順位付けに大きな意味を有する。繊毛バイオマーカー検査の他の利点としては、小児および１０代への「脳放射線」曝露を最小限に抑えることが挙げられる。繊毛試験はまた、処置が脳損傷に有効であるかどうか、および処置がどの程度有効であるかを決定するために使用され得る。
【0041】
本明細書に記載の方法は、腫瘍脈管構造を治療するために使用することができる。腫瘍内の血管は蛇行しており、異常な流れを有する。したがって、血流を正常化することは、薬物が腫瘍に浸透するのを助けるであろう。しかし、流れが正規化されているか否かは、現在、撮像によって判定されている。繊毛バイオマーカー試験は、治療後の腫瘍床における流動の有効性を評価するのに役立つ。また、繊毛は、治療に抵抗性の腫瘍細胞上でより長い。耐性細胞のための信頼できる検出プラットフォームはない。バイオマーカーキットを使用したこれらの細胞の繊毛分析により、耐性集団を知ることができ、次いで、耐性集団を殺傷の標的とすることができる。
【0042】
生物学的試料は、対象から採取された試料である。例えば、適切な生物学的試料は、血清、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、涙、滑液、母乳、胆汁、羊水、房水、膣潤滑、汗、リンパ液、および骨髄であり得る。好ましい実施形態では、生物学的試料は血液または血漿試料である。
【0043】
別の実施形態では、本開示は、ＳＣＤを有する対象の鎌状赤血球症（ＳＣＤ）に関連する閉塞事象を検出する方法を提供する。この方法は、対象からの生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出することを含む。本開示はまた、対象から採取された生物学的試料内の繊毛マーカーのレベルを経時的にモニタリングする方法を提供する。例えば、本方法は、同じ対象からの第２の生物学的試料中の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップであって、生物学的試料が第１の試料よりも遅い時間に採取され、第１の試料と比較した第２の試料中の繊毛タンパク質のレベルの増加が閉塞事象を示す、ステップをさらに含んでもよい。したがって、閉塞事象のリスクまたは発症の評価を与えるために、本明細書に記載の繊毛マーカーを経時的に監視および検出することができると考えられる。
【0044】
１つまたは複数のマーカーを検出するステップは、試料を繊毛のマーカーに対する１つまたは複数の抗体と接触させるステップと、試料中の抗体の存在を検出するステップと、を含むことができる。いくつかの態様では、本方法は、試料を検出可能なマーカーを有する二次抗体と接触させるステップと、試料中の検出可能なマーカーを検出するステップと、をさらに含む。いくつかの例において、第１の抗体または第２の抗体は、固体支持体に結合される。いくつかの態様では、本方法は、とりわけ、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーを含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＳＣＤを有する対象における閉塞事象を処置するために治療薬を投与するステップをさらに含む。
【0046】
「閉塞事象」という用語は、他の特徴の中でも、血管壁の脆弱化または出血に対する感受性の増加を含む。適切な治療には、例えば、とりわけ、疼痛を軽減するための薬物療法（ＮＳＡＩＤＳ、アスピリン、麻薬など）および輸血が含まれるが、これらに限定されない。さらに、スキャンが推奨されてもよい（例えば、ＭＲＩなど）。例えば、繊毛レベルが高い場合、動脈瘤（拡張血管）が破損の徴候を示している可能性があり、これは患者の健康にとって良好ではないので、スキャンが推奨され得る。現在、彼らは、そのような拡張血管について患者を日常的にスキャンし、経時的に悪化しないことを望んでいる。これらのスキャンは、診療所への定期的なスケジュールされた訪問時に行われる。したがって、テストを指示することによって不要なスキャンを保存することは有益である。また、日常的ではなく必要なときにスキャンすることは、対象がさらされるスキャンの回数を減らし、対象を監視するための非侵襲的手段を提供する。さらに、差し迫った危機に基づいて治療の経過を変えることは、増加した繊毛を同定することによって臨床的にも有益である。
【0047】
別の実施形態では、本開示は、対象からの試料中の赤血球上の繊毛を検出する方法を提供し、本方法は、対象から血液試料を得るステップと、試料から赤血球（ＲＢＣ）を分離するステップと、赤血球の表面上の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップと、を含む。ＲＢＣ上の繊毛の検出は、損傷した血管を示す。本方法は、対象から第２の血液試料を得るステップと、試料から第２のセットの赤血球を分離するステップと、ＲＢＣの表面上の繊毛の１つまたは複数のマーカーを検出するステップと、第１の試料からのＲＢＣ上の繊毛のレベルを第２の試料と比較するステップであって、第２の試料が第１の試料よりも遅い時間に採取され、ＲＢＣと関連する繊毛の増加は、対象内の１つまたは複数の血管への損傷を示す、ステップと、をさらに含んでもよい。第１および第２の試料は、モニタリングのために数週間、数ヶ月または数年離れて採取され得る。適切には、本方法は、第３、第４、第５、第６などの試料を採取し、先の試料と比較して、試料中の繊毛濃度の変化を監視し、対象内の任意の変化に変更することを含んでもよい。例えば、本明細書に記載の状態を監視するために、試料を毎月採取することができる。いくつかの例では、妊娠している対象を監視するために、試料を毎週（例えば、子癇前症）採取してもよい。
【0048】
キット：
別の実施形態では、本発明は、生物学的試料中の繊毛マーカーを測定するためのキットを含む、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。適切には、キットは、少なくとも１つの繊毛マーカーに結合する少なくとも１つの抗体、および使用説明書を含むことができる。キットは、検出標識を有する少なくとも１つの二次抗体をさらに含んでもよい。本明細書で企図されるキットは、繊毛マーカーに結合する１つまたは複数の抗体を含むことができ、繊毛マーカーは、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される。
別の実施形態では、本発明は、生物学的試料中の繊毛マーカーを測定するためのキットを含む、本明細書に記載の方法を実施するためのキットを提供する。適切には、キットは、少なくとも１つの繊毛マーカーに結合する少なくとも１つの抗体、および使用説明書を含むことができる。キットは、検出標識を有する少なくとも１つの二次抗体をさらに含んでもよい。本明細書で企図されるキットは、繊毛マーカーに結合する１つまたは複数の抗体を含むことができ、繊毛マーカーは、ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８、インバーシン、核因子－赤血球系因子２関連因子２（ＮＲＦ２）およびアセチル化α－チューブリンからなる群から選択される。
【0049】
別の実施形態では、繊毛を検出するためのＥＬＩＳＡキットが提供される。ＥＬＩＳＡキットは、固体支持体、繊毛に特異的に結合する少なくとも１つの一次抗体、一次抗体に特異的であり、検出可能なマーカーを有する少なくとも１つの二次抗体、および使用説明書を含む。検出可能なマーカーは酵素レポーターであり得る。検出可能なマーカーは、蛍光マーカーまたは比色マーカーであり得る。一態様では、ＥＬＩＳＡキットは、本明細書に記載の方法を使用して、繊毛起源の細胞上に発現されたタンパク質に基づいて、繊毛の基底小体の検出をスクリーニングすることができる。キットは、本明細書中に記載される繊毛の基底小体に特異的な１つまたは複数の抗体を含むであろう。別の態様では、繊毛および繊毛マーカーの基底小体の両方をスクリーニングするための組み合わせＥＬＩＳＡキットを提供することができる。キットは、少なくとも１つの繊毛マーカーおよび少なくとも１つの基底小体マーカー抗体、ならびに両方のマーカーを別々に検出する方法（例えば、各マーカーに対する異なるレポーター分子）を含むことができる。別の態様では、キットは、基礎研究または臨床試料のために繊毛および基底小体を検出するための免疫蛍光検出キットであってもよく、このキットは繊毛マーカーに結合する１つまたは複数の抗体を含む。一次抗体は蛍光分子に直接コンジュゲートさせてもよいし、蛍光コンジュゲートさせた二次抗体を用いてもよい。適切な抗体は公知であり、本明細書に記載されている。
【0050】
本明細書に記載のキットおよび方法は、従来の検出方法を上回る利点を提供する。ＥＣは、いくつか例を挙げると、子癇前症、多発性嚢胞腎疾患、高血圧および脳卒中などの様々な病態生理学的状態において変化した流れまたは剪断応力を経験するので、循環ＥＣは、血管傷害または内皮機能不全の可能性のあるバイオマーカーと考えられている。しかし、流通数が少なく、検出が困難であるため、用途が限定されていた。一方、ここに示すように、損傷したＥＣからの繊毛は、循環および生物学的試料中で容易に検出することができる。血液成分が管腔側に発現されるＥＣ繊毛の唯一の接触点であることを考慮すると、この方法は循環ＥＣを検出するより良い代替法である。また、繊毛がほとんどのＥＣ床で発現され、流れが繊毛の完全性に影響を及ぼすことを考えると、流れが損なわれた任意の状態が繊毛バイオマーカーの適用の機会を構成し、血管損傷に対する繊毛バイオマーカーの値を広げる。少なくとも、血液または他の体液中および流れによって影響を受ける様々な状態の繊毛タンパク質を検出する能力は、医師に可能性のある病理を知らせるための臨床ツールボックス内の追加のツールを提供する。要約すると、本発明者らの研究は、循環中の繊毛特異的タンパク質が、内皮の流動関連ホメオスタシスが損なわれる疾患の予後予測マーカーに開発され得るかどうか、およびどのように開発され得るかを理解するための広範な調査を保証する。
【0051】
本開示は、本明細書に記載の構造、構成要素の配置、または方法ステップの特定の詳細に限定されない。本明細書に開示する組成物および方法は、以下の開示に照らして当業者に明らかになる様々な方法で作製、実施、使用、実施および／または形成することができる。本明細書で使用される表現および用語は、説明のみを目的としており、特許請求の範囲を限定するものとみなされるべきではない。様々な構造または方法ステップを指すために明細書および特許請求の範囲で使用される第１、第２、および第３などの順序インジケータは、任意の特定の構造またはステップ、またはそのような構造またはステップに対する任意の特定の順序または構成を示すと解釈されることを意味しない。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「例えば、」）の使用は、単に本開示を容易にすることを意図しており、特に請求されない限り、本開示の範囲に対するいかなる限定も意味しない。本明細書のいかなる文言も、図面に示す構造も、特許請求されていない要素が開示された主題の実施に不可欠であることを示すと解釈されるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびその変形の本明細書における使用は、その後に列挙される要素およびその均等物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として列挙された実施形態はまた、それらの特定の要素「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」として企図される。
【0052】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に含まれる各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図しているにすぎず、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％～５０％と記載されている場合、２％～４０％、１０％～３０％、または１％～３％などの値が本明細書に明示的に列挙されていることを意図している。これらは、具体的に意図されたものの例にすぎず、列挙された最低値と最高値との間の数値のすべての可能な組み合わせが、本開示において明示的に述べられているとみなされるべきである。特定の列挙された量または量の範囲を説明するための「約」という単語の使用は、製造公差、測定値を形成する際の機器および人的エラーなどのために考慮され得るかまたは当然考慮される値など、列挙された量に非常に近い値がその量に含まれることを示すことを意味する。量に関するすべての百分率は、特に指示しない限り重量による。
【0053】
本明細書で引用された非特許または特許文献を含む任意の参考文献が先行技術を構成することは認められない。特に、特に明記しない限り、本明細書における任意の文書への言及は、これらの文書のいずれかが米国または任意の他の国における当技術分野の共通の一般知識の一部を形成することの承認を構成しないことが理解されよう。参考文献のいずれの議論も、その著者が主張することを述べており、本出願人は、本明細書に引用された文献のいずれかの正確さおよび適切性に異議を申し立てる権利を留保する。本明細書で引用されるすべての参考文献は、特に明記しない限り、参照により完全に組み込まれる。本開示は、引用された参考文献に見られる定義および／または説明の間に矛盾がある場合に管理するものとする。
【0054】
以下の実施例は、例示のみを意図しており、本発明または添付の特許請求の範囲に対する限定を意図していない。
【実施例】
【0055】
実施例１：繊毛タンパク質は、血管系における流れの変化のバイオマーカーである
繊毛は、ほとんどの真核細胞に存在する微小管ベースの細胞小器官であり（１）、中央ダブレットを囲む９つの外側微小管ダブレットの配置（９＋２）またはそうでない（９＋０）に基づいて区別される。９＋０の繊毛は、しばしば一次非運動性繊毛と呼ばれ、９＋２の繊毛は運動性繊毛と呼ばれる（２）。しかしながら、混合繊毛（運動性および非運動性）が真核細胞において見出され得ることを示唆する最近の証拠を考慮すると、これらの定義を見直す必要がある（３）。繊毛は、細胞の機械センサとして機能する。血管系を裏打ちする内皮細胞（ＥＣ）では、９＋０の繊毛が頂端（管腔）表面に見られることが多く、血流を感知し、これらの機械的シグナルを剪断応答挙動を制御する細胞内の化学シグナルに変換すると考えられている（４，５）。機械センサとしての一次内皮繊毛の役割は、インビトロのマウス大動脈ＥＣ、分離されたマウス動脈、エクスビボのヒト胎盤由来の血管、およびインビボマウスモデルにおいて報告されている（６－１０）。生理学的血流からの剪断応力は、繊毛屈曲を誘発する（１１）。剪断応力、すなわち、内皮の表面上の血流の接線方向の力は、通常、大血管系および微小血管系全体にわたって変化し、異なる生理学的条件および病理学的条件において劇的に変化し得る。繊毛の長さは、血管における機械感覚作用と相関していることが多く、低い剪断応力を受けている細胞はより長い繊毛を有し、高い剪断応力を受けている血管内の細胞はより短い繊毛を有するかまたは繊毛を有しない（１２，１３）。ゼブラフィッシュおよび哺乳動物の両方において、一次繊毛は低剪断応力の領域が豊富であると考えられる（１１，１４）。低剪断応力では、哺乳動物の網膜血管系において、一次繊毛が骨形成タンパク質９と協調して作用して、高剪断応力媒介血管リモデリングの開始前に血管退縮を最小限に抑えることが示唆されている（１５）。したがって、全体として、ＥＣ繊毛は、低剪断応力センサとして広く考えられている。
我々自身の研究では、これらの初期所見のいくつかを確証し、若年性ゼブラフィッシュ血管系の分岐接合部などの低剪断応力の領域でＥＣ繊毛を同定した（１６）。したがって、剪断応力が増加した条件下でＥＣ繊毛に何が起こるかについて疑問が生じる。Ｉｏｍｉｎｉらによる精液研究は、１５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層状剪断応力を１時間受けているヒト臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）からの一次繊毛の分解を示す（１３）。繊毛は、管腔内に突出し、基底小体に接続する移行線維を介して細胞に固定される軸糸からなり、これは中心体由来構造（１）である。最近の研究は、繊毛が哺乳動物細胞から物理的に除去され得ることを示唆しており、これは脱落と呼ばれるプロセスであり、繊毛膜および軸索糸を基底小体から放出する（１７）。無傷の脱落繊毛を培養培地中に回収し、膜断片および軸索糸断片の両方を含有した。さらに、この脱灰プロセスは迅速であると報告され、哺乳動物細胞における繊毛喪失の主な様式として示唆された。別の研究では、おそらく腎臓上皮細胞からの化学的に誘導された急性腎障害（１８）に供されたマウスの尿中に全繊毛または部分的な繊毛断片が観察され、したがってこの現象は複数の細胞型および組織に起因すると考えられた。胚性ＥＣにおける高剪断応力誘導性崩壊の結果は、胚性ゼブラフィッシュ（１６，１９－２１）における血管不安定性および出血ならびに血管バリア完全性（２２，２３）と直接関連している。マウス（２４，２５）では、繊毛変異体は広範な出血を示す。これらの研究は、ＥＣ中の繊毛が血管ホメオスタシスの破壊時に分解され（崩壊）、したがって循環中への繊毛断片の放出を引き起こすという仮説を集合的に示唆する。循環中の繊毛タンパク質の検出または定量化は、血流の変化または血液粘度の変化の病的状態のバイオマーカーとして役立ち得る。この研究では、細胞、脊椎動物、およびヒトのモデル系の組み合わせを使用してこの仮説を試験した。
繊毛は、ほとんどの真核細胞に存在する微小管ベースの細胞小器官であり（１）、中央ダブレットを囲む９つの外側微小管ダブレットの配置（９＋２）またはそうでない（９＋０）に基づいて区別される。９＋０の繊毛は、しばしば一次非運動性繊毛と呼ばれ、９＋２の繊毛は運動性繊毛と呼ばれる（２）。しかしながら、混合繊毛（運動性および非運動性）が真核細胞において見出され得ることを示唆する最近の証拠を考慮すると、これらの定義を見直す必要がある（３）。繊毛は、細胞の機械センサとして機能する。血管系を裏打ちする内皮細胞（ＥＣ）では、９＋０の繊毛が頂端（管腔）表面に見られることが多く、血流を感知し、これらの機械的シグナルを剪断応答挙動を制御する細胞内の化学シグナルに変換すると考えられている（４，５）。機械センサとしての一次内皮繊毛の役割は、インビトロのマウス大動脈ＥＣ、分離されたマウス動脈、エクスビボのヒト胎盤由来の血管、およびインビボマウスモデルにおいて報告されている（６－１０）。生理学的血流からの剪断応力は、繊毛屈曲を誘発する（１１）。剪断応力、すなわち、内皮の表面上の血流の接線方向の力は、通常、大血管系および微小血管系全体にわたって変化し、異なる生理学的条件および病理学的条件において劇的に変化し得る。繊毛の長さは、血管における機械感覚作用と相関していることが多く、低い剪断応力を受けている細胞はより長い繊毛を有し、高い剪断応力を受けている血管内の細胞はより短い繊毛を有するかまたは繊毛を有しない（１２，１３）。ゼブラフィッシュおよび哺乳動物の両方において、一次繊毛は低剪断応力の領域が豊富であると考えられる（１１，１４）。低剪断応力では、哺乳動物の網膜血管系において、一次繊毛が骨形成タンパク質９と協調して作用して、高剪断応力媒介血管リモデリングの開始前に血管退縮を最小限に抑えることが示唆されている（１５）。したがって、全体として、ＥＣ繊毛は、低剪断応力センサとして広く考えられている。
我々自身の研究では、これらの初期所見のいくつかを確証し、若年性ゼブラフィッシュ血管系の分岐接合部などの低剪断応力の領域でＥＣ繊毛を同定した（１６）。したがって、剪断応力が増加した条件下でＥＣ繊毛に何が起こるかについて疑問が生じる。Ｉｏｍｉｎｉらによる精液研究は、１５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層状剪断応力を１時間受けているヒト臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）からの一次繊毛の分解を示す（１３）。繊毛は、管腔内に突出し、基底小体に接続する移行線維を介して細胞に固定される軸糸からなり、これは中心体由来構造（１）である。最近の研究は、繊毛が哺乳動物細胞から物理的に除去され得ることを示唆しており、これは脱落と呼ばれるプロセスであり、繊毛膜および軸索糸を基底小体から放出する（１７）。無傷の脱落繊毛を培養培地中に回収し、膜断片および軸索糸断片の両方を含有した。さらに、この脱灰プロセスは迅速であると報告され、哺乳動物細胞における繊毛喪失の主な様式として示唆された。別の研究では、おそらく腎臓上皮細胞からの化学的に誘導された急性腎障害（１８）に供されたマウスの尿中に全繊毛または部分的な繊毛断片が観察され、したがってこの現象は複数の細胞型および組織に起因すると考えられた。胚性ＥＣにおける高剪断応力誘導性崩壊の結果は、胚性ゼブラフィッシュ（１６，１９－２１）における血管不安定性および出血ならびに血管バリア完全性（２２，２３）と直接関連している。マウス（２４，２５）では、繊毛変異体は広範な出血を示す。これらの研究は、ＥＣ中の繊毛が血管ホメオスタシスの破壊時に分解され（崩壊）、したがって循環中への繊毛断片の放出を引き起こすという仮説を集合的に示唆する。循環中の繊毛タンパク質の検出または定量化は、血流の変化または血液粘度の変化の病的状態のバイオマーカーとして役立ち得る。この研究では、細胞、脊椎動物、およびヒトのモデル系の組み合わせを使用してこの仮説を試験した。
【0056】
結果
ＥＣにおける剪断応力の増加は、インビトロでの崩壊を促進する。ＥＣ繊毛に対する剪断応力の影響をインビトロで試験するために、微小血管脳血管床、ヒト初代脳微小血管ＥＣ（ＨＢＭＶＥＣ）、および大血管静脈床、ＨＵＶＥＣから細胞を選択した。本発明者らは、以前に報告された（２６）ＨＢＭＶＥＣに０、２、４、および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層流剪断応力を加え、細胞を剪断応力に供するための２つの異なる方法を使用した。マイクロ流体デバイスに基づく一方向剪断応力法（Ｉｂｉｄｉシステム）では、２ｄｙｎｅ／ｃｍ２で開始し、１０分および２４時間にわたって４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２に増加させた剪断応力の段階的強度を使用した（図１）。循環運動に関連する剪断応力に基づくシェーカー法を用いて、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２を４分間適用した（図８）。剪断ストレス後に、特異的マーカー：ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、ＡＬＫ１（フロー）、ＡＲＬ１３ｂ（繊毛軸糸）、γ－チューブリン（繊毛基底小体）、ＩＦＴ８８（繊毛移行帯タンパク質）、インバーシン（繊毛基底小体）、ＮＲＦ２（繊毛関連遺伝子）およびｂＡＣＴＩＮ（ハウスキーピング遺伝子）のＦＡＣＳ分析のために細胞を収集した（図９Ａ）。両方の方法で、脳ＥＣにおける対照フローマーカー発現の増加を観察した。Ｉｂｉｄｉ法では、ＫＬＦ４（図７Ａ）およびＫＬＦ２（図７Ｂ）の発現は、２４時間で「流れなし」対照と比較して、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２条件で有意に増加した。シェーカー法では、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２（Ｐ＜０．０００１）でのＡＬＫ１発現細胞の線形増加が観察された（図８Ａ）。
両方の方法で、興味深いことに、試験したすべての繊毛マーカーは、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２および４ｄｙｎｅ／ｃｍ２でタンパク質レベルの低下を示し（図１および図８、Ｃ－Ｆ）、ハウスキーピングｂＡＣＴＩＮタンパク質発現に変化はなかった（図８Ｂ）。Ｉｂｉｄｉ法では、２４時間と比較して１０分のより短い期間で、より低いタンパク質発現レベルが一般に観察され（図１）、これは生理学的に定常状態の状況である２ｄｙｎｅ／ｃｍ２で明確であった。１０分および２４時間で、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２群は、定常状態の対照群と比較して、繊毛関連タンパク質発現の有意な減少を示した。定常状態の対照と比較して、実験群（４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）は、１０分の灌流後に繊毛関連タンパク質の発現が約２０％少なかった（図１）。群におけるタンパク質発現の低下は、灌流後２４時間でさらに顕著であった（＞５０％）（図１）。
単層上にプレーティングしたＨＵＶＥＣについて、本発明者らは、文献（２７，２８）に以前に報告されたように、シェーカー法を使用して２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で高剪断応力を加えた。流出物を収集し、液滴濃縮し、示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法によって分析した。繊毛マーカーのアセチル化α－チューブリンおよび基底小体（γ－チューブリン）の流出液に対して染色を行った。示されるように（図２、Ａ～Ｄ）、流出物はアセチル化α－チューブリン（図２Ｂ）およびγ－チューブリン（図２Ｃ）タンパク質の両方について陽性を示した。本発明者らはまた、振盪器法を使用して、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をブタ腎臓上皮細胞株、ＬＬＣ－ＰＫ１に適用し、剪断応力後の繊毛マーカーであるアセチル化αチューブリン（図２、ＥおよびＦ）について染色し、これは、剪断応力後の繊毛マーカー染色の喪失を明確に示した。位相差顕微鏡法（図２Ｇ、白い箱）によって観察された単一の繊毛は、剪断応力後に欠落していた（図２Ｈ）。さらに、これらの実験から収集された排出物（図２Ｉ）はアセチル化α－チューブリンについて陽性であり（図２Ｊ）、アセチル化α－チューブリンについてのウェスタンブロットは、分離された繊毛における発現を明確に示し、同じ分離株においてアクチンタンパク質は検出されなかった（図２Ｋ）。したがって、まとめて、これらのデータは、２ｄｙｎｅ／ｃｍ２を超える剪断応力が、繊毛の除去、細胞表面での繊毛タンパク質の喪失、ならびに大血管床および微小血管床ならびに腎臓上皮細胞の排出液中の繊毛タンパク質および断片の存在に影響を及ぼし得ることを主張する。
インビボでの剪断応力の増加は、より少ない量の繊毛タンパク質発現を有するＥＣをもたらす。ＥＣ繊毛に対する剪断応力の影響をインビボで試験するために、本発明者らは脊椎動物ゼブラフィッシュモデルシステムの汎用性を利用した（図９Ｂ）。以前、他の研究者（２９，３０）は、ゼブラフィッシュ胚のインキュベーション温度を２８℃から３４．５℃に上昇させると、その心拍数および血流量が増加することを報告した。温度を上昇させると、剪断応力は、原始中脳静脈チャネル（ＰＭＢＣ）（１６）では２．３から３．１ｄｙｎｅ／ｃｍ２に、背側大動脈（ＤＡ）では２．０から２．９７ｄｙｎｅ／ｃｍ２に増加すると計算した。しかし、これらの測定は、より高い温度での２８から３３ｈｐｆまでの５時間のインキュベーション後に、受精後３３時間（ｈｐｆ）に行われた。本発明者らは、温度（３２℃および３５℃）の影響の系統的分析を、２８ｈｐｆから開始するより短い（３．５時間および５時間）およびより長い（２４時間）インキュベーション期間（脳において血流が開始される）で行い、次いで、４８ｈｐｆでＰＭＢＣおよびＤＡにおける血流関連パラメータを測定した（図１０～図１３）。胚の３つの群（群あたりｎ＝２０～５０）（図１０）を、血流（パルス、血流速度、血管径、剪断応力）パラメータについてＰＭＢＣ血管（図１１および図１３Ａ）およびＤＡ血管（図１２および図１３Ｂ）の両方で分析した。試料は、群１（Ｇ１）：０～４８ｈｐｆ（２８℃）、群２（Ｇ２）：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、引き続いて３２℃または３５℃で３．５または５時間のインキュベーション、および４８ｈｐｆまで２８℃に戻る、ならびに群３（Ｇ３）：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、続いて３２℃または３５℃で４８ｈｐｆまでインキュベートする、を含んでいた（図１０）。本発明者らは、以下の全体的な観察を行った。（ａ）３２℃の温度を超える３５℃は、血流パラメータ（パルス、速度、血管径、および剪断応力）のより堅牢な変化を示したが、胚の脊柱側弯症（脊椎の湾曲）も誘発した（図１４）、（ｂ）血管の口径または位置に関係なく、大部分において、Ｇ３胚はより高い血流パラメータを示した、（ｃ）剪断応力値は、ＤＡ容器（２．５～３ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３２℃］または３．５～５．２ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３５℃］）と比較して、ＰＭＢＣ（３～５ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３２℃］または４～７ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３５℃］）の方が概して高かった、（ｄ）３２℃で３．５時間の曝露も、血流速度を除いてＰＭＢＣの評価されたパラメータに堅牢な変化を示し（図１３Ａ）、ＤＡに有意な変化は観察されなかった（図１３Ｂ）。この方法による剪断応力の増加は、ＥＣにおける繊毛の喪失に関連すると考えられる幹ではなく脳血管における出血のみを示したことは注目に値する（１６）。したがって、本発明者らは、遺伝子導入（Ｔｇ）（ｆｌｋ：ｍＣｈｅｒｒｙ；ｂアクチン：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）ゼブラフィッシュ胚のＰＭＢＣ中の剪断応力を増加させるために、約３時間のインキュベーションのより短い時点（２９．５～３２．５ｈｐｆ）およびより低い温度（３２℃）を選択し、ＥＣを赤色と標識し、繊毛を緑色と標識した。生ＥＣおよび標識ＥＣ（図９Ｂ）に対する単一細胞懸濁液およびその後のＦＡＣＳ分析を、方法の章に記載されるように行った。評価したマーカーには、Ｋｌｆ４（流れ）、Ａｒｌ１３ｂ（繊毛軸糸）、γ－チューブリン（繊毛基底小体）、インバーシン（繊毛基底小体）およびＩｆｔ８８（繊毛移行帯）が含まれた。剪断応力誘導群（実験）では、本発明者らはＥＣにおけるＫｌｆ４発現ＭＦＩの予想される増加を観察した（図３、ＡおよびＢ）。評価したすべての繊毛マーカーは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋（ＥＣ）集団で評価した場合、対照試料と比較して実験試料の減少を示した（図３Ｃ）。ｍＣｈｅｒｒｙ－（非ＥＣ）集団（図３Ｄ）では、ＥＣ集団で観察されたものと比較して、それぞれの繊毛関連タンパク質発現の減少はあまり顕著ではなかった。これらの結果は、脊椎動物胚の脳血管内の剪断応力が増加すると、ＥＣが細胞表面に発現する繊毛タンパク質が少なくなることを示唆している。
ＥＣにおける剪断応力の増加は、インビトロでの崩壊を促進する。ＥＣ繊毛に対する剪断応力の影響をインビトロで試験するために、微小血管脳血管床、ヒト初代脳微小血管ＥＣ（ＨＢＭＶＥＣ）、および大血管静脈床、ＨＵＶＥＣから細胞を選択した。本発明者らは、以前に報告された（２６）ＨＢＭＶＥＣに０、２、４、および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層流剪断応力を加え、細胞を剪断応力に供するための２つの異なる方法を使用した。マイクロ流体デバイスに基づく一方向剪断応力法（Ｉｂｉｄｉシステム）では、２ｄｙｎｅ／ｃｍ２で開始し、１０分および２４時間にわたって４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２に増加させた剪断応力の段階的強度を使用した（図１）。循環運動に関連する剪断応力に基づくシェーカー法を用いて、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２を４分間適用した（図８）。剪断ストレス後に、特異的マーカー：ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、ＡＬＫ１（フロー）、ＡＲＬ１３ｂ（繊毛軸糸）、γ－チューブリン（繊毛基底小体）、ＩＦＴ８８（繊毛移行帯タンパク質）、インバーシン（繊毛基底小体）、ＮＲＦ２（繊毛関連遺伝子）およびｂＡＣＴＩＮ（ハウスキーピング遺伝子）のＦＡＣＳ分析のために細胞を収集した（図９Ａ）。両方の方法で、脳ＥＣにおける対照フローマーカー発現の増加を観察した。Ｉｂｉｄｉ法では、ＫＬＦ４（図７Ａ）およびＫＬＦ２（図７Ｂ）の発現は、２４時間で「流れなし」対照と比較して、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２条件で有意に増加した。シェーカー法では、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２（Ｐ＜０．０００１）でのＡＬＫ１発現細胞の線形増加が観察された（図８Ａ）。
両方の方法で、興味深いことに、試験したすべての繊毛マーカーは、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２および４ｄｙｎｅ／ｃｍ２でタンパク質レベルの低下を示し（図１および図８、Ｃ－Ｆ）、ハウスキーピングｂＡＣＴＩＮタンパク質発現に変化はなかった（図８Ｂ）。Ｉｂｉｄｉ法では、２４時間と比較して１０分のより短い期間で、より低いタンパク質発現レベルが一般に観察され（図１）、これは生理学的に定常状態の状況である２ｄｙｎｅ／ｃｍ２で明確であった。１０分および２４時間で、４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２群は、定常状態の対照群と比較して、繊毛関連タンパク質発現の有意な減少を示した。定常状態の対照と比較して、実験群（４および１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２）は、１０分の灌流後に繊毛関連タンパク質の発現が約２０％少なかった（図１）。群におけるタンパク質発現の低下は、灌流後２４時間でさらに顕著であった（＞５０％）（図１）。
単層上にプレーティングしたＨＵＶＥＣについて、本発明者らは、文献（２７，２８）に以前に報告されたように、シェーカー法を使用して２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で高剪断応力を加えた。流出物を収集し、液滴濃縮し、示差干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法によって分析した。繊毛マーカーのアセチル化α－チューブリンおよび基底小体（γ－チューブリン）の流出液に対して染色を行った。示されるように（図２、Ａ～Ｄ）、流出物はアセチル化α－チューブリン（図２Ｂ）およびγ－チューブリン（図２Ｃ）タンパク質の両方について陽性を示した。本発明者らはまた、振盪器法を使用して、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をブタ腎臓上皮細胞株、ＬＬＣ－ＰＫ１に適用し、剪断応力後の繊毛マーカーであるアセチル化αチューブリン（図２、ＥおよびＦ）について染色し、これは、剪断応力後の繊毛マーカー染色の喪失を明確に示した。位相差顕微鏡法（図２Ｇ、白い箱）によって観察された単一の繊毛は、剪断応力後に欠落していた（図２Ｈ）。さらに、これらの実験から収集された排出物（図２Ｉ）はアセチル化α－チューブリンについて陽性であり（図２Ｊ）、アセチル化α－チューブリンについてのウェスタンブロットは、分離された繊毛における発現を明確に示し、同じ分離株においてアクチンタンパク質は検出されなかった（図２Ｋ）。したがって、まとめて、これらのデータは、２ｄｙｎｅ／ｃｍ２を超える剪断応力が、繊毛の除去、細胞表面での繊毛タンパク質の喪失、ならびに大血管床および微小血管床ならびに腎臓上皮細胞の排出液中の繊毛タンパク質および断片の存在に影響を及ぼし得ることを主張する。
インビボでの剪断応力の増加は、より少ない量の繊毛タンパク質発現を有するＥＣをもたらす。ＥＣ繊毛に対する剪断応力の影響をインビボで試験するために、本発明者らは脊椎動物ゼブラフィッシュモデルシステムの汎用性を利用した（図９Ｂ）。以前、他の研究者（２９，３０）は、ゼブラフィッシュ胚のインキュベーション温度を２８℃から３４．５℃に上昇させると、その心拍数および血流量が増加することを報告した。温度を上昇させると、剪断応力は、原始中脳静脈チャネル（ＰＭＢＣ）（１６）では２．３から３．１ｄｙｎｅ／ｃｍ２に、背側大動脈（ＤＡ）では２．０から２．９７ｄｙｎｅ／ｃｍ２に増加すると計算した。しかし、これらの測定は、より高い温度での２８から３３ｈｐｆまでの５時間のインキュベーション後に、受精後３３時間（ｈｐｆ）に行われた。本発明者らは、温度（３２℃および３５℃）の影響の系統的分析を、２８ｈｐｆから開始するより短い（３．５時間および５時間）およびより長い（２４時間）インキュベーション期間（脳において血流が開始される）で行い、次いで、４８ｈｐｆでＰＭＢＣおよびＤＡにおける血流関連パラメータを測定した（図１０～図１３）。胚の３つの群（群あたりｎ＝２０～５０）（図１０）を、血流（パルス、血流速度、血管径、剪断応力）パラメータについてＰＭＢＣ血管（図１１および図１３Ａ）およびＤＡ血管（図１２および図１３Ｂ）の両方で分析した。試料は、群１（Ｇ１）：０～４８ｈｐｆ（２８℃）、群２（Ｇ２）：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、引き続いて３２℃または３５℃で３．５または５時間のインキュベーション、および４８ｈｐｆまで２８℃に戻る、ならびに群３（Ｇ３）：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、続いて３２℃または３５℃で４８ｈｐｆまでインキュベートする、を含んでいた（図１０）。本発明者らは、以下の全体的な観察を行った。（ａ）３２℃の温度を超える３５℃は、血流パラメータ（パルス、速度、血管径、および剪断応力）のより堅牢な変化を示したが、胚の脊柱側弯症（脊椎の湾曲）も誘発した（図１４）、（ｂ）血管の口径または位置に関係なく、大部分において、Ｇ３胚はより高い血流パラメータを示した、（ｃ）剪断応力値は、ＤＡ容器（２．５～３ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３２℃］または３．５～５．２ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３５℃］）と比較して、ＰＭＢＣ（３～５ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３２℃］または４～７ｄｙｎｅ／ｃｍ２［３５℃］）の方が概して高かった、（ｄ）３２℃で３．５時間の曝露も、血流速度を除いてＰＭＢＣの評価されたパラメータに堅牢な変化を示し（図１３Ａ）、ＤＡに有意な変化は観察されなかった（図１３Ｂ）。この方法による剪断応力の増加は、ＥＣにおける繊毛の喪失に関連すると考えられる幹ではなく脳血管における出血のみを示したことは注目に値する（１６）。したがって、本発明者らは、遺伝子導入（Ｔｇ）（ｆｌｋ：ｍＣｈｅｒｒｙ；ｂアクチン：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）ゼブラフィッシュ胚のＰＭＢＣ中の剪断応力を増加させるために、約３時間のインキュベーションのより短い時点（２９．５～３２．５ｈｐｆ）およびより低い温度（３２℃）を選択し、ＥＣを赤色と標識し、繊毛を緑色と標識した。生ＥＣおよび標識ＥＣ（図９Ｂ）に対する単一細胞懸濁液およびその後のＦＡＣＳ分析を、方法の章に記載されるように行った。評価したマーカーには、Ｋｌｆ４（流れ）、Ａｒｌ１３ｂ（繊毛軸糸）、γ－チューブリン（繊毛基底小体）、インバーシン（繊毛基底小体）およびＩｆｔ８８（繊毛移行帯）が含まれた。剪断応力誘導群（実験）では、本発明者らはＥＣにおけるＫｌｆ４発現ＭＦＩの予想される増加を観察した（図３、ＡおよびＢ）。評価したすべての繊毛マーカーは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋（ＥＣ）集団で評価した場合、対照試料と比較して実験試料の減少を示した（図３Ｃ）。ｍＣｈｅｒｒｙ－（非ＥＣ）集団（図３Ｄ）では、ＥＣ集団で観察されたものと比較して、それぞれの繊毛関連タンパク質発現の減少はあまり顕著ではなかった。これらの結果は、脊椎動物胚の脳血管内の剪断応力が増加すると、ＥＣが細胞表面に発現する繊毛タンパク質が少なくなることを示唆している。
【0057】
循環ＲＢＣは脳ＥＣに付着し、接着後に繊毛タンパク質を蓄積する。並進的および臨床的意義を有する病態生理学モデルにおいて循環中の繊毛タンパク質を調査するために、本発明者らは鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を選択した。ＳＣＤは、ヘモグロビンのβグロビンタンパク質の６番目のアミノ酸をグルタミン酸からバリンに変化させるβグロビン遺伝子の単一変異によって引き起こされ（３１）、これは、ＲＢＣを鎌状赤血球ヘモグロビン（Ｈｂ Ｓ）の産生のために鎌状赤血球が高度に鎌状化しやすくし、したがって組織に酸素を送達するＨｂの能力を損なう。脳および全身の血管系では、ＳＣＤにおける閉塞事象は、内皮への鎌状赤血球の接着によって開始されると仮定されている（３２）。したがって、本発明者らは、鎌状赤血球が脳ＥＣに付着し、繊毛脱落を誘発し、ＳＣＤ患者由来の血漿中で繊毛タンパク質が高くなると仮定した。本発明者らは、最初に、正常なＨｂＡ（ＡＡ）を有する健康なボランティアと比較して、Ｈｂ Ｓ（ＳＳ）についてホモ接合性の患者から分離されたＲＢＣが脳ＥＣの単層に優先的に付着するかどうかを調べた。ＲＢＣのＥＣへの接着を定量化するための段階的高さフローチャンバ接着アッセイを以前に記載されているように行った（３３，３４）。実際、１ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力を受けた脳ＥＣに付着したＡＡ ＲＢＣの７％±１．８％と比較して、ＳＳ ＲＢＣの５８％±９％（図４Ａ）。次に、本発明者らは、フローチャンバ内の脳ＥＣへの曝露の前および後に、繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂの存在についてＳＳ患者から分離した循環ＲＢＣについてフローサイトメトリー分析を行った。結合ＡＲＬ１３ｂの１％±０．４７％を示したＡＡ ＲＢＣと比較して、ＳＳ ＲＢＣは、脳ＥＣをＡＡ ＲＢＣおよびＳＳ ＲＢＣにそれぞれ曝露する前に、結合ＡＲＬ１３ｂの２３％±２．５％までの顕著な２３倍の増加を示した（図４Ｂ）。フロー曝露時に、ＡＡ ＲＢＣ上のＡＲＬ１３ｂの存在は影響を受けなかったが、ＳＳ ＲＢＣ上で５４％±８．８％までさらに２．３倍増加し（図４Ｃ）、ＳＳ ＲＢＣが脳ＥＣから追加の繊毛を収集した可能性があることを示唆した。本発明者らは、ＳＳ ＲＢＣ上のＡＲＬ１３ｂの蓄積を直接視覚化するために血液スメアを実施した（図４Ｄ）。同様の血液スメアを鎌状赤血球症ＳＳマウスから分離し、ＡＲＬ１３ｂおよびＩＦＴ８８タンパク質について免疫染色した（図１５）。ＡＲＬ１３ｂおよびＩＦＴ８８陽性繊毛を発現するマウスＲＢＣが、ＳＳマウス由来のスメアにおいて見出された（図１５、ＡおよびＢ）。定量化（図１５）は、ＡＡマウス血液と比較してＳＳマウス血液におけるＡＲＬ１３ｂ陽性ＲＢＣの２倍濃縮を示した。最後に、本発明者らは、繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリンおよびＩＦＴ８８（図４、ＥおよびＦ）の存在についてウェスタンブロットを使用して、ＳＣＤ患者１０名および健常個体１０名の血漿を調べた。健常志願者と比較して、３つすべての繊毛タンパク質がＳＣＤ患者由来の血漿において濃縮された（図４Ｆ）。まとめると、これらのデータセットは、血管閉塞および／または血流障害の素因がある病的状態では、繊毛タンパク質がＲＢＣの表面に存在し、ＥＣ接触時にＲＢＣ上にさらに蓄積し、血漿が濃縮されることを示唆する。したがって、全体として、本発明者らの研究は、血管内皮の血流媒介変化を診断するための潜在的なバイオマーカーとして繊毛タンパク質を示唆している。
【0058】
ＥＣ繊毛安定性は脳ＥＣにおけるＲＯＳ生成に依存する。剪断応力またはＲＢＣ相互作用による脳ＥＣにおける繊毛の喪失に関連する根底にある機構を調査するために、本発明者らは過剰な活性酸素種（ＲＯＳ）および酸化ストレスに焦点を合わせた。以前の研究は、鎌状赤血球とＨＵＶＥＣとの相互作用が内皮酸化ストレスを誘導することを示唆している（３５）。したがって、本発明者らは、ＳＣＤ患者からのＳＳ ＲＢＣの脳ＥＣへの接着がＥＣにおけるＲＯＳ生成を誘引するかどうかを調査した。実際、脳ＥＣとのＳＳ ＲＢＣ相互作用は、ＥＣ ＲＯＳの基礎レベルと比較してＥＣ ＲＯＳレベルを増加させた（Ｐ＜０．０５；図５Ａ）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）阻害剤であるアポシニンによる脳ＥＣの前処理は、ＥＣにおけるＲＯＳ生成をベースラインレベルまで減少させ（Ｐ＜０．０００１；図５Ａ）、脳ＥＣにおけるＳＳ ＲＢＣ誘導性のＲＯＳ産生増加がＮＯＸ酵素の活性化に依存することを示唆した。ＳＳ ＲＢＣｓ－繊毛に対するＥＣ中のＲＯＳレベルの増加の影響を調べるために、その後の実験で、本発明者らは、アポシニンで前処理した脳ＥＣへのフローチャンバでの曝露の前後に、繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂの存在についてフローサイトメトリーＳＳ ＲＢＣによって分析した。アポシニン処置脳ＥＣへの曝露前に、ＳＳ ＲＢＣは約３５％のＡＲＬ１３ｂ繊毛発現を示したが、アポシニン処置脳ＥＣへの曝露後に、ＳＳ ＲＢＣはＡＲＬ１３ｂ発現の約２０％の減少を示した（Ｐ＜０．０５、図５Ｂ）。本発明者らは、これらのデータを、アポシニンによる脳ＥＣにおけるＮＯＸ酵素の阻害が、ＳＳ ＲＢＣが脳ＥＣからさらなるＡＲＬ１３ｂタンパク質を収集するのを妨げたことを意味すると解釈する。
【0059】
脳ＥＣにおける酸化ストレスの減衰が繊毛タンパク質レベルを救済するかどうかを評価するために、本発明者らは、ＮＯＸ小分子阻害剤ＶＡＳ２８７０の存在下または非存在下のＥＣにおいて、既知の酸化ストレス誘導剤であるＰＭＡでヒト脳ＥＣを処理した。次に、本発明者らは、フローサイトメトリー法を使用して、全ＲＯＳ、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ－１、酸化ストレス対抗体）、ならびに繊毛関連タンパク質ＮＲＦ２、ＩＦＴ８８、およびγ－チューブリンの発現を定量化した（図６）。予想通り、ＰＭＡは脳ＥＣにおいてＲＯＳを誘導し（図６Ａ）、これはＶＡＳ２８７０によって部分的に減弱された。ＨＯ－１レベル（図６Ｂ）は、ＰＭＡ処置脳ＥＣにおいてより低く、ＮＯＸ阻害時にレベルは対照レベルに回復した。興味深いことに、３つすべての繊毛関連タンパク質（図６、Ｃ～Ｅ）がＰＭＡ処置時に減少し、脳ＥＣにおけるＮＯＸ阻害時にレベルがベースラインに回復した。鎌状赤血球ＲＯＳデータと脳ＥＣベースのＲＯＳデータを合わせると、酸化ストレスは繊毛安定性に関与するＥＣにおける重要な経路の１つであるようである。
【0060】
考察
本発明者らの研究は、繊毛特異的タンパク質を血漿中で定量化することができ、内皮損傷または機能不全のバイオマーカーとして調査すべきであることを明らかにする。血管壁を裏打ちするＥＣでは、繊毛は低流量センサとして仮定されている（１１）。この仮説を支持して、繊毛は、血管内の曲率（１４，１６）など、流れが最小である血管壁の領域において実際に豊富である。定常状態下では、血管系は一定の流れを受ける。静脈系では、１～４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の平均剪断力が報告されているが、毛細管は１０～２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断を受ける（２６）。動脈では、剪断力は、総頸動脈における４ｄｙｎｅ／ｃｍ２から上腕動脈における１３ｄｙｎｅ／ｃｍ２まで変化する（３６）。本発明者らは以前に、ゼブラフィッシュ胚において、胚を３４．５℃でインキュベートすると、脳微小血管に２～４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力が誘導され、これが脳出血および原始中脳静脈チャネルの繊毛構造の喪失をもたらすことを実証した（１６）。他の研究者らは、ゼブラフィッシュにおける繊毛タンパク質の喪失が脳血管の不安定性を引き起こし、出血をもたらすことも報告している（１９）。さらに、一次繊毛は、ＨＵＶＥＣ（大血管）が１５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層状剪断応力を受けたときに分解される（１３）。したがって、まとめて、インビボで観察される４～２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断力は、ＥＣがインビトロで繊毛タンパク質を失うのに十分であり、実際にこの研究で観察された。ここで、本発明者らは、ＥＣおよび上皮細胞からの細胞培養物中の排出物中の繊毛断片を検出することができ、高剪断応力にさらされたＥＣにおいてインビボでより少ない繊毛発現細胞を検出することができた。
本発明者らの研究は、繊毛特異的タンパク質を血漿中で定量化することができ、内皮損傷または機能不全のバイオマーカーとして調査すべきであることを明らかにする。血管壁を裏打ちするＥＣでは、繊毛は低流量センサとして仮定されている（１１）。この仮説を支持して、繊毛は、血管内の曲率（１４，１６）など、流れが最小である血管壁の領域において実際に豊富である。定常状態下では、血管系は一定の流れを受ける。静脈系では、１～４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の平均剪断力が報告されているが、毛細管は１０～２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断を受ける（２６）。動脈では、剪断力は、総頸動脈における４ｄｙｎｅ／ｃｍ２から上腕動脈における１３ｄｙｎｅ／ｃｍ２まで変化する（３６）。本発明者らは以前に、ゼブラフィッシュ胚において、胚を３４．５℃でインキュベートすると、脳微小血管に２～４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力が誘導され、これが脳出血および原始中脳静脈チャネルの繊毛構造の喪失をもたらすことを実証した（１６）。他の研究者らは、ゼブラフィッシュにおける繊毛タンパク質の喪失が脳血管の不安定性を引き起こし、出血をもたらすことも報告している（１９）。さらに、一次繊毛は、ＨＵＶＥＣ（大血管）が１５ｄｙｎｅ／ｃｍ２の層状剪断応力を受けたときに分解される（１３）。したがって、まとめて、インビボで観察される４～２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断力は、ＥＣがインビトロで繊毛タンパク質を失うのに十分であり、実際にこの研究で観察された。ここで、本発明者らは、ＥＣおよび上皮細胞からの細胞培養物中の排出物中の繊毛断片を検出することができ、高剪断応力にさらされたＥＣにおいてインビボでより少ない繊毛発現細胞を検出することができた。
【0061】
剥離を容易にするためにＥＣ表面の繊毛が流れの変化によってどのように影響され得るかという問題は未解決のままであった。物理的流動の増加または妨害に加えて、本発明者らは、血液成分、特にＲＢＣが病的状態のＥＣ（１７）における崩壊過程にも寄与し得ると仮定した（図７）。本発明者らは、ＲＢＣ形態が鎌状の形状を有するように変化し、ＲＢＣがＥＣ膜に対する酸化ストレス媒介損傷を引き起こすことが知られているＳＣＤを選択した（３５，３７，３８）。さらに、ＳＣＤでは、鎌状赤血球のそれ自体および内皮への接着が増強されるために血流が変化し、血管閉塞を促進し（３９）、その後に、内皮への損傷を促進することができる（３５）。したがって、この病態生理学的モデルは、内皮への鎌状赤血球付着の結果であり得る損傷内皮から出現する繊毛タンパク質を同定する理想的な機会を提供する。注目すべきことに、本発明者らは、ヒト鎌状赤血球が、正常なＲＢＣと比較して、その表面上でＡＲＬ１３ｂ繊毛タンパク質の増強を示し、間欠的流動条件下で脳ＥＣに遭遇すると、これらの鎌状赤血球上の繊毛タンパク質の存在は２．３倍高かったことを見出した。これらの結果は、健常血漿と比較してＳＣＤ血漿中でより高いレベルの繊毛タンパク質の検出と一致する。興味深いことに、本発明者らは、ＳＣＤ患者の血漿中の繊毛構造の３つの代表的な成分、すなわち軸糸、移行帯および基底小体のすべてを観察し、繊毛の分解が部分的ではないことを示唆した。これらの結果は、哺乳動物細胞における最近の観察結果とも一致しており、ｍＣｈｅｒｒｙ－ａチューブリン（軸索素マーカー）を発現する細胞から繊毛が脱落し、繊毛断片中にａチューブリンが含まれており、軸索素が繊毛膜と一緒に脱落することを示唆している（１７）。
【0062】
静的および流動誘発性鎌状赤血球／脳ＥＣ相互作用における繊毛安定性に関連する基礎となる機構を調査するために、酸化ストレスおよびＲＯＳ生成に焦点を当てた（図７）。ヒト鎌状赤血球は、ＨＵＶＥＣ（３５）と同様の脳ＥＣに付着し、ＲＯＳ生成の増加を誘導する。ＮＯＸ阻害剤であるアポシニンで処理した脳ＥＣに曝露した鎌状赤血球は、繊毛タンパク質発現の減少を示した。これらのデータは、鎌状赤血球上の繊毛がＲＯＳクエンチ脳ＥＣとの相互作用に影響を受けることを主張している（図７）。この結果を説明するために、２つの相互に関連する可能性が現れる。すなわち、酸化ストレスが最小限に抑えられ、それによってＲＢＣがＥＣからより少ない繊毛を捕捉する場合にＥＣがより多くの繊毛を保持するか、またはＲＢＣがＲＯＳ阻害ＥＣと相互作用する場合にＲＢＣが繊毛を失い、それによって繊毛がより少なくなる。両者を区別することは困難である。静的条件下では、脳ＥＣはＰＭＡなどのストレス誘導剤に応答し、増強された全ＲＯＳを示し、これは異なるＮＯＸ阻害剤であるＶＡＳ２８７０で処理すると、ＰＭＡ誘導酸化ストレス後のＲＯＳ産生をクエンチした。興味深いことに、ＰＭＡ処置脳ＥＣで減少した繊毛タンパク質レベルは、ＮＯＸ阻害剤処置脳ＥＣでベースラインに戻った。静的条件の結果は、ＥＣの繊毛がＲＯＳ阻害時の相互作用に利用できない可能性を主張し、ＲＢＣがＲＯＳ阻害ＥＣとの相互作用時に繊毛を失うという第２の仮説を支持する。これらの結果は、ＥＣおよびＲＢＣの両方における繊毛安定性が、脳ＥＣにおけるＲＯＳレベルの増加の影響を受けやすいことを集合的に主張する。この解釈はまた、マウス腎臓における虚血傷害後に酸化ストレスの減少が一次繊毛長の回復を加速させることを示す上皮細胞における以前の研究と一致している（４０）。
【0063】
ＳＣＤの場合、ＲＢＣ上の増強された繊毛タンパク質の同定は、ＳＣＤ患者で観察される両方の臨床的に関連する特徴である、血管壁の脆弱化および出血に対する感受性などの有害事象を予後判定し得る。この情報を有することは、情報に基づいた臨床判断を行うために有益である。ＥＣは、いくつか例を挙げると、子癇前症、多発性嚢胞腎疾患、高血圧および脳卒中などの様々な病態生理学的状態において変化した流れまたは剪断応力を経験するので、循環ＥＣは血管傷害または内皮機能不全の可能性のあるバイオマーカーと考えられている（４１，４２）。しかし、流通数が少なく、検出が困難であるため、用途が限定されていた。一方、ここに示すように、損傷したＥＣからの繊毛は、循環中に容易に検出することができる。血液成分が管腔側に発現されるＥＣ繊毛の唯一の接触点であることを考えると、この方法はおそらく循環ＥＣを検出するより良い代替法である。また、繊毛がほとんどのＥＣ床で発現され、流れが繊毛の完全性に影響を及ぼすことを考えると、流れが損なわれた任意の状態が繊毛バイオマーカーの適用の機会を構成し、血管損傷に対する繊毛バイオマーカーの値を広げる。少なくとも、血液または他の体液中および流れによって影響を受ける様々な状態の繊毛タンパク質を検出する能力は、医師に可能性のある病理を知らせるための臨床ツールボックス内の追加のツールを提供する。要約すると、本発明者らの研究は、循環中の繊毛特異的タンパク質が、内皮の流動関連ホメオスタシスが損なわれる疾患の予後予測マーカーに開発され得るかどうか、およびどのように開発され得るかを理解するための広範な調査を保証する。
【0064】
方法
抗体
本研究で使用した一次抗体には、ＡＲＬ１３ｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１７７１１－Ｉ－ＡＰ）、アセチル化チューブリン（ＳｉｇｍａカタログＴ６７９３）、ＩＦＴ８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＰＡ５－１８４６７）、インバーシン（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１０５８５－Ｉ－ＡＰ）、ダイニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＭＡ１－０７０）、ｇチューブリン（ＧｅｎｅＴｅｘカタログＧＴＸ１１３２８６）、Ａｌｋ１（Ａｂｃａｍカタログａｂ５１８７０）、ＫＬＦ４（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１１８８０－Ｉ－ＡＰ）、ＨＯ－１（ＢＤ、カタログ５６６３９１）、ＮＲＦ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ９３９２０２）およびｂアクチン（Ｓｉｇｍａ カタログＡ５４４１およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ４９７０Ｐ）が含まれる。使用される二次抗体は、ヤギ抗マウスＰＥＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ロバ抗ウサギＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ヤギＡＦ６５７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ウサギＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびロバ抗ウサギＡＦ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
抗体
本研究で使用した一次抗体には、ＡＲＬ１３ｂ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１７７１１－Ｉ－ＡＰ）、アセチル化チューブリン（ＳｉｇｍａカタログＴ６７９３）、ＩＦＴ８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＰＡ５－１８４６７）、インバーシン（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１０５８５－Ｉ－ＡＰ）、ダイニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＭＡ１－０７０）、ｇチューブリン（ＧｅｎｅＴｅｘカタログＧＴＸ１１３２８６）、Ａｌｋ１（Ａｂｃａｍカタログａｂ５１８７０）、ＫＬＦ４（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈカタログ１１８８０－Ｉ－ＡＰ）、ＨＯ－１（ＢＤ、カタログ５６６３９１）、ＮＲＦ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ９３９２０２）およびｂアクチン（Ｓｉｇｍａ カタログＡ５４４１およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ４９７０Ｐ）が含まれる。使用される二次抗体は、ヤギ抗マウスＰＥＣｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ロバ抗ウサギＰＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ヤギＡＦ６５７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロバ抗ウサギＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびロバ抗ウサギＡＦ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
【0065】
細胞培養
初代ＨＢＭＶＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログＡＣＢＲＩ３７６）およびＨＵＶＥＣ（Ｇｌｙｃｏ Ｔｅｃｈ）を、内皮細胞完全培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、カタログＣ２２０１０）中５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ベンダーの説明に従って、小児男性ドナーから脳の皮質領域から細胞を分離した。生物学的関連性を高めるために細胞の天然の特性を保存するために抗体標識を使用せずに細胞を分離した。近位尿細管由来のＬＬ－ＣＰＫ１（ＣＬ１０１．１（商標））ブタ腎上皮細胞をＡＴＣＣから得た。すべての細胞培養ウェルを等しく播種し、ウェルを、条件ごとに２連または３連で対照条件対実験条件に無作為化した。すべての実験は、第４継代と第６継代との間で行った。約９０％のコンフルエンスに達した細胞を剪断応力実験に使用した。ＲＯＳ定量化実験のために、細胞を５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ８１３９－５ＭＧ）で１時間処理した。それぞれの実験群におけるＲＯＳ産生を阻害するために、細胞をＰＭＡ処理の１時間前に２０μＭ ＮＯＸ阻害剤ＶＡＳ２８７０（Ｓｉｇｍａ、カタログＳＭＬ０２７３－５ＭＧ）で処理した。
初代ＨＢＭＶＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログＡＣＢＲＩ３７６）およびＨＵＶＥＣ（Ｇｌｙｃｏ Ｔｅｃｈ）を、内皮細胞完全培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、カタログＣ２２０１０）中５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。ベンダーの説明に従って、小児男性ドナーから脳の皮質領域から細胞を分離した。生物学的関連性を高めるために細胞の天然の特性を保存するために抗体標識を使用せずに細胞を分離した。近位尿細管由来のＬＬ－ＣＰＫ１（ＣＬ１０１．１（商標））ブタ腎上皮細胞をＡＴＣＣから得た。すべての細胞培養ウェルを等しく播種し、ウェルを、条件ごとに２連または３連で対照条件対実験条件に無作為化した。すべての実験は、第４継代と第６継代との間で行った。約９０％のコンフルエンスに達した細胞を剪断応力実験に使用した。ＲＯＳ定量化実験のために、細胞を５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログＰ８１３９－５ＭＧ）で１時間処理した。それぞれの実験群におけるＲＯＳ産生を阻害するために、細胞をＰＭＡ処理の１時間前に２０μＭ ＮＯＸ阻害剤ＶＡＳ２８７０（Ｓｉｇｍａ、カタログＳＭＬ０２７３－５ＭＧ）で処理した。
【0066】
ヒト患者研究
Ｈｂ Ｓについてホモ接合性のＳＣＤを有する成人患者および健常成人ドナーから血液試料を採取した。患者およびドナーは、デューク大学で承認された試験プロトコルの下で募集した。ＳＣＤ患者はすべて、少なくとも３ヶ月間トランスフェクションされておらず、過去３週間急性血管閉塞クリーゼを経験しておらず、試験した患者の９８％はヒドロキシ尿素を服用していた。血液試料をクエン酸塩チューブに収集した。血漿の回収およびバフィーコートの除去と共に、すべてのＲＢＣをＣａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳで洗浄した。
Ｈｂ Ｓについてホモ接合性のＳＣＤを有する成人患者および健常成人ドナーから血液試料を採取した。患者およびドナーは、デューク大学で承認された試験プロトコルの下で募集した。ＳＣＤ患者はすべて、少なくとも３ヶ月間トランスフェクションされておらず、過去３週間急性血管閉塞クリーゼを経験しておらず、試験した患者の９８％はヒドロキシ尿素を服用していた。血液試料をクエン酸塩チューブに収集した。血漿の回収およびバフィーコートの除去と共に、すべてのＲＢＣをＣａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳで洗浄した。
【0067】
ウェスタンブロット
ＳＣＤ（ＳＳ）および健常（ＡＡ）志願者の患者から採取した血液から分離した血漿を、以下のタンパク質、すなわちＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８およびγ－チューブリンの定量に使用した。これらの試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、従来のウェスタンブロット法を実施した。使用される一次抗体は前に説明した。使用される二次抗体には、抗ウサギＨＲＰ（カタログ７０７４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗マウスＨＲＰ（カタログ７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が含まれる。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して定量を行い、ハウスキーピング対照タンパク質ｂＡＣＴＩＮに対してプロットした。
ＳＣＤ（ＳＳ）および健常（ＡＡ）志願者の患者から採取した血液から分離した血漿を、以下のタンパク質、すなわちＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８およびγ－チューブリンの定量に使用した。これらの試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、従来のウェスタンブロット法を実施した。使用される一次抗体は前に説明した。使用される二次抗体には、抗ウサギＨＲＰ（カタログ７０７４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗マウスＨＲＰ（カタログ７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が含まれる。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して定量を行い、ハウスキーピング対照タンパク質ｂＡＣＴＩＮに対してプロットした。
【0068】
インビトロＥＣ剪断応力実験
Ｉｂｉｄｉ灌流。インビトロで剪断応力を発生させるために、本発明者らはＩｂｉｄｉポンプシステムを利用した。灌流を開始する前に、ＨＢＭＶＥＣをμスライド（流路高さ０．６ｍｍ；Ｉｂｉｄｉ，８１１０６）上にスライドあたり０．５×１０６細胞で播種した。スライド、培地および灌流セット（赤色、１０９６２）を加湿細胞培養インキュベーションチャンバ（５％ＣＯ２中３７℃）内で一晩インキュベートした後に、灌流して気泡形成を防止した。灌流の直前に、培地をシリンジリザーバーに添加し（合計１２ｍＬ）、気泡を除去した。μスライドを滅菌条件下で灌流セットに取り付け、次いで、流体ユニットを細胞培養インキュベーションチャンバ内のＩｂｉｄｉポンプおよび空気チューブに接続した。ベンダー固有のＰｕｍｐＣｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用して、ＨＢＭＶＥＣを０、２、４、または１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で１０分間または２４時間灌流した。インビボ状態を模倣する定常状態の代表として合計２ｄｙｎｅ／ｃｍ２を含めた。１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２での高剪断応力の開始時の急性細胞剥離を防止するために、細胞を４ｄｙｎｅ／ｃｍ２で５分間流すように順応させ、次いで１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で１０分間または２４時間流した。２および４ｄｙｎｅ／ｃｍ２での実験では、順応は必要ではなく、細胞を１０分間または２４時間流動に供した。０．６ｍｍμスライドおよび赤色灌流セットを用いた製造業者の推奨に従って、可能な最小剪断応力は２．３ｄｙｎｅ／ｃｍ２（四捨五入して２ｄｙｎｅ／ｃｍ２と呼ぶ）であった。灌流直後に、細胞をＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２６０４０１３）でトリプシン処理し、下流分析に使用した。任意の大きさの灌流に供したすべての試料は、それぞれ流量制御なしであった。所与の試料における任意のタンパク質発現を、フローコントロールなしのものに対して正規化した。
Ｉｂｉｄｉ灌流。インビトロで剪断応力を発生させるために、本発明者らはＩｂｉｄｉポンプシステムを利用した。灌流を開始する前に、ＨＢＭＶＥＣをμスライド（流路高さ０．６ｍｍ；Ｉｂｉｄｉ，８１１０６）上にスライドあたり０．５×１０６細胞で播種した。スライド、培地および灌流セット（赤色、１０９６２）を加湿細胞培養インキュベーションチャンバ（５％ＣＯ２中３７℃）内で一晩インキュベートした後に、灌流して気泡形成を防止した。灌流の直前に、培地をシリンジリザーバーに添加し（合計１２ｍＬ）、気泡を除去した。μスライドを滅菌条件下で灌流セットに取り付け、次いで、流体ユニットを細胞培養インキュベーションチャンバ内のＩｂｉｄｉポンプおよび空気チューブに接続した。ベンダー固有のＰｕｍｐＣｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用して、ＨＢＭＶＥＣを０、２、４、または１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で１０分間または２４時間灌流した。インビボ状態を模倣する定常状態の代表として合計２ｄｙｎｅ／ｃｍ２を含めた。１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２での高剪断応力の開始時の急性細胞剥離を防止するために、細胞を４ｄｙｎｅ／ｃｍ２で５分間流すように順応させ、次いで１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２で１０分間または２４時間流した。２および４ｄｙｎｅ／ｃｍ２での実験では、順応は必要ではなく、細胞を１０分間または２４時間流動に供した。０．６ｍｍμスライドおよび赤色灌流セットを用いた製造業者の推奨に従って、可能な最小剪断応力は２．３ｄｙｎｅ／ｃｍ２（四捨五入して２ｄｙｎｅ／ｃｍ２と呼ぶ）であった。灌流直後に、細胞をＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２６０４０１３）でトリプシン処理し、下流分析に使用した。任意の大きさの灌流に供したすべての試料は、それぞれ流量制御なしであった。所与の試料における任意のタンパク質発現を、フローコントロールなしのものに対して正規化した。
【0069】
振盪器法
振盪インキュベーター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を前述のように使用して剪断応力を誘発した（４３）。応力の計算に使用される式は、剪断応力＝（６×Ｆ×ｍ）／（ｗ×ｈ２）であり、ここで、Ｆ＝慣性モーメント（すなわち、振盪器のｒｐｍおよびサイズに基づく遠心力の関数）、ｍ＝流体の粘度（すなわち、温度の関数）、ｗ＝プレートの直径（すなわち、皿の面積の関数）、ｈ＝流体の高さ（すなわち、体積の関数）である。
毎分２４０回転（ＲＰＭ）でオービタルシェーカー上に置かれた１００ｍｍ培養ディッシュ（細胞とコンフルエント）は、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をもたらし、９６ＲＰＭでは、４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をもたらした。細胞を４分間剪断応力下に置いた。
ＨＵＶＥＣおよび上皮細胞剪断ストレス実験については、以前に記載されたように（４３，４４）、機械的力によって崩壊を誘導した。細胞集団を最初に１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で手短に穏やかにすすいだ。先に論じたように（６）、１５０ｍｍ培養皿をフローチャンバに入れた。セルに１０または２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力を４分間かけた。切除した繊毛を含む培地を５０ｍＬ遠心管に慎重に移し、４℃で３０００ｇで３０分間遠心分離した。次いで、切除された繊毛を含む上清をポリアロマーチューブに移し、超遠心機において７万ｇ、４℃で１時間遠心分離した。次いで、さらなる分析のために、精製した一次繊毛をＰＢＳ緩衝液またはＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁した。
振盪インキュベーター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を前述のように使用して剪断応力を誘発した（４３）。応力の計算に使用される式は、剪断応力＝（６×Ｆ×ｍ）／（ｗ×ｈ２）であり、ここで、Ｆ＝慣性モーメント（すなわち、振盪器のｒｐｍおよびサイズに基づく遠心力の関数）、ｍ＝流体の粘度（すなわち、温度の関数）、ｗ＝プレートの直径（すなわち、皿の面積の関数）、ｈ＝流体の高さ（すなわち、体積の関数）である。
毎分２４０回転（ＲＰＭ）でオービタルシェーカー上に置かれた１００ｍｍ培養ディッシュ（細胞とコンフルエント）は、１０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をもたらし、９６ＲＰＭでは、４ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力をもたらした。細胞を４分間剪断応力下に置いた。
ＨＵＶＥＣおよび上皮細胞剪断ストレス実験については、以前に記載されたように（４３，４４）、機械的力によって崩壊を誘導した。細胞集団を最初に１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で手短に穏やかにすすいだ。先に論じたように（６）、１５０ｍｍ培養皿をフローチャンバに入れた。セルに１０または２０ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力を４分間かけた。切除した繊毛を含む培地を５０ｍＬ遠心管に慎重に移し、４℃で３０００ｇで３０分間遠心分離した。次いで、切除された繊毛を含む上清をポリアロマーチューブに移し、超遠心機において７万ｇ、４℃で１時間遠心分離した。次いで、さらなる分析のために、精製した一次繊毛をＰＢＳ緩衝液またはＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁した。
【0070】
定量的逆転写ＰＣＲ
ＴＲＩ試薬およびＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ２０５１）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、２５０ｎｇの全ＲＮＡ（ｉＳｃｒｉｐｔ ｇＤＮＡ ｃｌｅａｒ ｃＤＮＡ合成キット；ＢｉｏＲａｄ、１７２～５０３４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＲＮＡレベルを、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、およびＧＡＰＤＨのための特注設計のプライマー（プライマー３）を使用して定量し、ｃＤＮＡおよびプライマーをｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、１７２～５１２１）と混合し、以下のサイクルプロトコルで実行した。すなわち、９５℃で２：００分間、続いて９５℃で０：１０分間および６０℃で０：３０分間の４０サイクル（ＢｉｏＲａｄ、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム）である。２－ΔΔＣＴ法を用いて遺伝子発現の定量を行った（４５）。試料をすべて四連で流し、標的遺伝子をＧＡＰＤＨに対して正規化した。
プライマーは、ＫＬＦ２（１３３ｂｐ）－フォワード：ＣＡＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧＡ（配列番号１）、リバース：ＣＧＴＧＴＧＣＴＴＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧ（配列番号２）、ＫＬＦ４（１３２ｂｐ）－フォワード：ＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧ（配列番号３）、リバース：ＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣ（配列番号４）；およびＧＡＰＤＨ（１２８ｂｐ）－順方向：ＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧ（配列番号５）、逆方向：ＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴ（配列番号６）であった。
ＴＲＩ試薬およびＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ２０５１）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、２５０ｎｇの全ＲＮＡ（ｉＳｃｒｉｐｔ ｇＤＮＡ ｃｌｅａｒ ｃＤＮＡ合成キット；ＢｉｏＲａｄ、１７２～５０３４）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。ＲＮＡレベルを、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、およびＧＡＰＤＨのための特注設計のプライマー（プライマー３）を使用して定量し、ｃＤＮＡおよびプライマーをｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、１７２～５１２１）と混合し、以下のサイクルプロトコルで実行した。すなわち、９５℃で２：００分間、続いて９５℃で０：１０分間および６０℃で０：３０分間の４０サイクル（ＢｉｏＲａｄ、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム）である。２－ΔΔＣＴ法を用いて遺伝子発現の定量を行った（４５）。試料をすべて四連で流し、標的遺伝子をＧＡＰＤＨに対して正規化した。
プライマーは、ＫＬＦ２（１３３ｂｐ）－フォワード：ＣＡＣＣＡＡＧＡＧＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧＡ（配列番号１）、リバース：ＣＧＴＧＴＧＣＴＴＴＣＧＧＴＡＧＴＧＧ（配列番号２）、ＫＬＦ４（１３２ｂｐ）－フォワード：ＣＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＴＴＣＧ（配列番号３）、リバース：ＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣ（配列番号４）；およびＧＡＰＤＨ（１２８ｂｐ）－順方向：ＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧ（配列番号５）、逆方向：ＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴ（配列番号６）であった。
【0071】
インビトロ接着アッセイ
ＨＢＭＶＥＣを、２％ゼラチンでプレコートした透明なガラススライド上でコンフルエンスに達するまで培養した。脳ＥＣでコーティングしたスライドを洗浄し、次いで可変高さフローチャンバにはめ込み、ＲＢＣの接着を支持する能力について試験した。フローチャンバを、３７℃に設定した熱板（東海ヒット株式会社）に接続した倒立位相差顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ，Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｃ．）のステージに取り付けた。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ中０．２％（ｖ／ｖ）で懸濁した蛍光標識ＲＢＣをフローチャンバに注入し、流れなしで１０分間脳ＥＣに付着させた。流れに曝露する前に、将来の流れを向いた線に沿った７つの異なる位置のそれぞれで最低３つの視野を検査し、蛍光細胞の総数をカウントした。次いで、較正されたシリンジポンプを用いた流体流（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ）を１５分間開始した。流出物を収集し、ＲＢＣ接触による脳ＥＣからの繊毛排出についてフローサイトメトリーによって試験した。フローへの曝露後に、視野を検査し、脳ＥＣへの蛍光付着性ＲＢＣの数をカウントした。付着細胞の割合は、フローへの曝露後の１視野あたりに付着した細胞の数／フロー前の１視野あたりに存在する細胞の総数として示した。
壁剪断応力は、ｔｗ＝６Ｑｍ／ｗｈ２（式中、ｔｗ＝壁剪断応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ２））として計算した。Ｑ＝体積流量（ｃｍ３／ｓ）；ｍ＝媒体粘度、ｗ＝流路の幅、およびｈ＝顕微鏡スライドに沿った位置の関数としてのフローチャンバの高さ。小血管内の血流は、１～２ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で連続的（非拍動性）であってもよく、または流れは断続的（拍動性）であってもよい。本発明者らのデータは、拍動流条件を使用して得られた。
ＨＢＭＶＥＣを、２％ゼラチンでプレコートした透明なガラススライド上でコンフルエンスに達するまで培養した。脳ＥＣでコーティングしたスライドを洗浄し、次いで可変高さフローチャンバにはめ込み、ＲＢＣの接着を支持する能力について試験した。フローチャンバを、３７℃に設定した熱板（東海ヒット株式会社）に接続した倒立位相差顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ，Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｃ．）のステージに取り付けた。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ中０．２％（ｖ／ｖ）で懸濁した蛍光標識ＲＢＣをフローチャンバに注入し、流れなしで１０分間脳ＥＣに付着させた。流れに曝露する前に、将来の流れを向いた線に沿った７つの異なる位置のそれぞれで最低３つの視野を検査し、蛍光細胞の総数をカウントした。次いで、較正されたシリンジポンプを用いた流体流（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ）を１５分間開始した。流出物を収集し、ＲＢＣ接触による脳ＥＣからの繊毛排出についてフローサイトメトリーによって試験した。フローへの曝露後に、視野を検査し、脳ＥＣへの蛍光付着性ＲＢＣの数をカウントした。付着細胞の割合は、フローへの曝露後の１視野あたりに付着した細胞の数／フロー前の１視野あたりに存在する細胞の総数として示した。
壁剪断応力は、ｔｗ＝６Ｑｍ／ｗｈ２（式中、ｔｗ＝壁剪断応力（ｄｙｎｅ／ｃｍ２））として計算した。Ｑ＝体積流量（ｃｍ３／ｓ）；ｍ＝媒体粘度、ｗ＝流路の幅、およびｈ＝顕微鏡スライドに沿った位置の関数としてのフローチャンバの高さ。小血管内の血流は、１～２ｄｙｎｅ／ｃｍ２の剪断応力で連続的（非拍動性）であってもよく、または流れは断続的（拍動性）であってもよい。本発明者らのデータは、拍動流条件を使用して得られた。
【0072】
剪断応力ゼブラフィッシュ流れパラメータの測定
遺伝子導入株Ｔｇ（ｂａｃｔ：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）は、Ｂｒｉａｎ Ｃｉｒｕｎａ（カナダ、オンタリオ州、トロントのトロント大学）から入手した。Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＡＸ）、Ｃａｓｐｅｒおよび野生型ＡＢ系統は、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。野生型（ＡＢ）株由来の胚をこの研究で使用した。受精したばかりの胚を成体ゼブラフィッシュの自然繁殖によって調達し、色素形成を阻害するために０．１ｍＭ Ｎ－フェニルチオ尿素（ＰＴＵ；シグマ）を含有するＥ３培地中で２８．０℃で飼育した。剪断応力実験のために、２８ｈｐｆにおいて、魚胚を３つの群に分けた。すなわち、Ｇ１：０～４８ｈｐｆ（２８℃）、Ｇ２：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、引き続いて３２℃または３５℃で３．５または５時間インキュベートし、４８ｈｐｆまで２８℃に戻る、ならびにＧ３：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、続いて３２℃または３５℃で４８ｈｐｆまでインキュベートする（図１０）。その後に、対照胚および実験胚を撮像のために４８ｈｐｆで脱エコーした。立体顕微鏡（ＨＣＩｍａｇｅソフトウェアＨａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ高速カメラおよびワークステーションを備えたＺｅｉｓｓ ＳｔｅＲＥＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ１２顕微鏡）を使用して、以載されたように（４６）、ゼブラフィッシュ胚の血管を可視化した。ＰＭＢＣおよびＤＡについて、倍率１００倍で１０秒あたり１０００フレームでの心臓および尾の高速ビデオ顕微鏡動画を記録した。記録された動画を、Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ（バージョン３．４．４）からのＭｉｃｒｏＺｅｂｒａＬａｂ血流を使用して、本発明者らの以前のプロトコル（４７，４８）に従って分析し、以下の式を使用して各血管について４つの心臓パラメータ、すなわち、パルス、血流速度、血管直径、および剪断応力を計算した。τ＝４μＶｍｅａｎ／Ｄ、式中、μ＝血液粘度（ｄｙｎｅ／ｃｍ２）、Ｖ＝平均血流速度（μｍ／ｓ）、およびＤ＝血管直径（μｍ）。
この実験を複数回実施し、３つの独立した実験からのデータを報告する。
Ｏ－ジアニシジンを用いたＣａｓｐｅｒ ｚｅｂｒａｆｉｓｈのホールマウント染色
上記のセクションで説明したように、Ｃａｓｐｅｒ株由来の胚を使用して、剪断応力の誘導後の脳内の出血を視覚化した。４８ｈｐｆで、胚を脱絨毛し、Ｏ－ジアニシジン（染色ＲＢＣ）で染色した。０．６ｍｇ／ｍＬのＯ－ジアニシジン（Ｓｉｇｍａ）、０．６５％過酸化水素、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および４０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を混合することによって、染色液を調製した。胚を、自社製の卵水に溶解したＮ－フェニルチオ尿素であるＰＴＵ－Ｅ３培地で洗浄し、次いで０．６ｍｇ／ｍＬの染色液を添加し、暗所で１５分間放置した。染色後に、胚を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で少なくとも１時間後固定した。明視野顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ５０８、Ｚｅｉｓｓ社）下で撮像するために、３％（ｗ／ｖ）メチルセルロースを使用して胚をスライド上に固定した。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＥＲｃ ５ｓプロフェッショナルデジタルカメラを撮像に使用した。
遺伝子導入株Ｔｇ（ｂａｃｔ：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）は、Ｂｒｉａｎ Ｃｉｒｕｎａ（カナダ、オンタリオ州、トロントのトロント大学）から入手した。Ｔｇ（ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＡＸ）、Ｃａｓｐｅｒおよび野生型ＡＢ系統は、Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。野生型（ＡＢ）株由来の胚をこの研究で使用した。受精したばかりの胚を成体ゼブラフィッシュの自然繁殖によって調達し、色素形成を阻害するために０．１ｍＭ Ｎ－フェニルチオ尿素（ＰＴＵ；シグマ）を含有するＥ３培地中で２８．０℃で飼育した。剪断応力実験のために、２８ｈｐｆにおいて、魚胚を３つの群に分けた。すなわち、Ｇ１：０～４８ｈｐｆ（２８℃）、Ｇ２：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、引き続いて３２℃または３５℃で３．５または５時間インキュベートし、４８ｈｐｆまで２８℃に戻る、ならびにＧ３：０～２８ｈｐｆ（２８℃）、続いて３２℃または３５℃で４８ｈｐｆまでインキュベートする（図１０）。その後に、対照胚および実験胚を撮像のために４８ｈｐｆで脱エコーした。立体顕微鏡（ＨＣＩｍａｇｅソフトウェアＨａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ Ｆｌａｓｈ高速カメラおよびワークステーションを備えたＺｅｉｓｓ ＳｔｅＲＥＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ１２顕微鏡）を使用して、以載されたように（４６）、ゼブラフィッシュ胚の血管を可視化した。ＰＭＢＣおよびＤＡについて、倍率１００倍で１０秒あたり１０００フレームでの心臓および尾の高速ビデオ顕微鏡動画を記録した。記録された動画を、Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ（バージョン３．４．４）からのＭｉｃｒｏＺｅｂｒａＬａｂ血流を使用して、本発明者らの以前のプロトコル（４７，４８）に従って分析し、以下の式を使用して各血管について４つの心臓パラメータ、すなわち、パルス、血流速度、血管直径、および剪断応力を計算した。τ＝４μＶｍｅａｎ／Ｄ、式中、μ＝血液粘度（ｄｙｎｅ／ｃｍ２）、Ｖ＝平均血流速度（μｍ／ｓ）、およびＤ＝血管直径（μｍ）。
この実験を複数回実施し、３つの独立した実験からのデータを報告する。
Ｏ－ジアニシジンを用いたＣａｓｐｅｒ ｚｅｂｒａｆｉｓｈのホールマウント染色
上記のセクションで説明したように、Ｃａｓｐｅｒ株由来の胚を使用して、剪断応力の誘導後の脳内の出血を視覚化した。４８ｈｐｆで、胚を脱絨毛し、Ｏ－ジアニシジン（染色ＲＢＣ）で染色した。０．６ｍｇ／ｍＬのＯ－ジアニシジン（Ｓｉｇｍａ）、０．６５％過酸化水素、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）および４０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を混合することによって、染色液を調製した。胚を、自社製の卵水に溶解したＮ－フェニルチオ尿素であるＰＴＵ－Ｅ３培地で洗浄し、次いで０．６ｍｇ／ｍＬの染色液を添加し、暗所で１５分間放置した。染色後に、胚を４％パラホルムアルデヒド中、４℃で少なくとも１時間後固定した。明視野顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ５０８、Ｚｅｉｓｓ社）下で撮像するために、３％（ｗ／ｖ）メチルセルロースを使用して胚をスライド上に固定した。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ ＥＲｃ ５ｓプロフェッショナルデジタルカメラを撮像に使用した。
【0073】
インビボ（ゼブラフィッシュ）剪断応力実験
Ｔｇ（ｂａｃｔ：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）とＴｇ（ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＡＸ）の交雑からの胚をこの研究で使用した（図９Ｂ）。受精したばかりの胚を、成体ゼブラフィッシュの自然繁殖によって調達し、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４および０．０５％メチレンブルーを含有する１×Ｅ３胚培地（Ｅ３培地）中で２８．０℃に保った。剪断ストレス実験のために、２９．５ｈｐｆにおいて、魚胚を３２．０℃のインキュベーターに３時間移した。その後に、対照胚および実験胚を脱絨毛し、消化して単一細胞を得た（図９Ｂ）。使用した消化緩衝液の組成は、１０％ＦＣＳ、コラゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅＩ（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。胚を３７℃で３０分間消化し、続いて７０μｍセルストレーナーに通した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、下流用途に使用する前にＰＢＳで２回洗浄した。この実験を複数回実施し、３つの独立した実験からのデータを報告する。
Ｔｇ（ｂａｃｔ：Ａｒｌ１３ｂ－ＧＦＰ）とＴｇ（ｋｄｒｌ：ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＡＸ）の交雑からの胚をこの研究で使用した（図９Ｂ）。受精したばかりの胚を、成体ゼブラフィッシュの自然繁殖によって調達し、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．１７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４および０．０５％メチレンブルーを含有する１×Ｅ３胚培地（Ｅ３培地）中で２８．０℃に保った。剪断ストレス実験のために、２９．５ｈｐｆにおいて、魚胚を３２．０℃のインキュベーターに３時間移した。その後に、対照胚および実験胚を脱絨毛し、消化して単一細胞を得た（図９Ｂ）。使用した消化緩衝液の組成は、１０％ＦＣＳ、コラゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅＩ（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。胚を３７℃で３０分間消化し、続いて７０μｍセルストレーナーに通した。細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、下流用途に使用する前にＰＢＳで２回洗浄した。この実験を複数回実施し、３つの独立した実験からのデータを報告する。
【0074】
フローサイトメトリー
単一細胞懸濁液を３００ｇのＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．１％ ＮａＮ３を含む１×ＰＢＳ）で５分間３回洗浄し、その後に、適用可能な場合はいつでも死細胞を排除するために、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能黄色死細胞染色液と共にインキュベートした。次いで、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ、カタログ５５４７２２）または転写因子緩衝液セット（ＢＤ、カタログ５６２５７４）を用いて透過処理し、以下のタンパク質について染色した。すなわち、ＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８、インバーシン、ダイニン、γ－チューブリン、Ａｌｋ１、ＫＬＦ４、ＨＯ－１、ＮＲＦ２およびｂＡＣＴＩＮである。適切な二次試薬を使用して、それぞれのタンパク質を検出した。一次抗体を１：５０に希釈し、二次抗体を１：５００に希釈した。ＢＤ ｐｅｒｍ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（カタログ５５４７２３）を抗体希釈および洗浄に使用した。一次抗体を４５分間インキュベートし、二次抗体を４℃で３０分間インキュベートした。適切な二次抗体対照を含めた。全ＲＯＳを定量するために、アッセイキットを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ８８－５９３０－７４）に従って使用した。染色の完了後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。染色した細胞をフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）で流した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）を使用して試料取得を行い、その後にＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
ヒトＲＢＣ上の繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂの存在を決定するために、高さ可変流チャンバに注入する前の非標識ＲＢＣ、ならびに脳ＥＣとの相互作用後に収集したＲＢＣおよびＲＢＣを含有する流出物を、氷上で３０分間、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｒｌ１３ｂ抗体で標識した。次いで、ＲＢＣを洗浄し、前述のようにフローサイトメトリー分析によって試験した（４９）。脳ＥＣにおけるＲＯＳ生成が鎌状赤血球によって増加し、崩壊に寄与し得るかどうかを決定するために、脳ＥＣでコーティングしたスライドを偽処理するか、または３７℃で１時間１０μＭのＮＯＸ阻害剤アポシニンで前処理し、洗浄し、フローチャンバに取り付けた。次いで、処置した脳ＥＣを非標識鎌状赤血球に１０分間曝露した。既に詳細に記載されているように（５０）、ＣＭ－Ｈ２－ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＯＳレベルを試験するために、鎌状赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、スライドガラスから脳ＥＣを掻き取った。試料あたり１０万個の事象を取得し、フローサイトメトリー分析によって試験した。別個の実験では、上記のように、チャンバへの注入前（ベースラインレベル）および流動後に、ならびに１０μＭアポシニンで処理した脳ＥＣと相互作用すると、非標識鎌状赤血球をＡＲＬ１３ｂ繊毛タンパク質結合についてフローサイトメトリーによって試験した。
単一細胞懸濁液を３００ｇのＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＢＳおよび０．１％ ＮａＮ３を含む１×ＰＢＳ）で５分間３回洗浄し、その後に、適用可能な場合はいつでも死細胞を排除するために、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能黄色死細胞染色液と共にインキュベートした。次いで、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ、カタログ５５４７２２）または転写因子緩衝液セット（ＢＤ、カタログ５６２５７４）を用いて透過処理し、以下のタンパク質について染色した。すなわち、ＡＲＬ１３ｂ、ＩＦＴ８８、インバーシン、ダイニン、γ－チューブリン、Ａｌｋ１、ＫＬＦ４、ＨＯ－１、ＮＲＦ２およびｂＡＣＴＩＮである。適切な二次試薬を使用して、それぞれのタンパク質を検出した。一次抗体を１：５０に希釈し、二次抗体を１：５００に希釈した。ＢＤ ｐｅｒｍ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（カタログ５５４７２３）を抗体希釈および洗浄に使用した。一次抗体を４５分間インキュベートし、二次抗体を４℃で３０分間インキュベートした。適切な二次抗体対照を含めた。全ＲＯＳを定量するために、アッセイキットを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ８８－５９３０－７４）に従って使用した。染色の完了後に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。染色した細胞をフローサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）で流した。ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ）を使用して試料取得を行い、その後にＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
ヒトＲＢＣ上の繊毛タンパク質ＡＲＬ１３ｂの存在を決定するために、高さ可変流チャンバに注入する前の非標識ＲＢＣ、ならびに脳ＥＣとの相互作用後に収集したＲＢＣおよびＲＢＣを含有する流出物を、氷上で３０分間、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｒｌ１３ｂ抗体で標識した。次いで、ＲＢＣを洗浄し、前述のようにフローサイトメトリー分析によって試験した（４９）。脳ＥＣにおけるＲＯＳ生成が鎌状赤血球によって増加し、崩壊に寄与し得るかどうかを決定するために、脳ＥＣでコーティングしたスライドを偽処理するか、または３７℃で１時間１０μＭのＮＯＸ阻害剤アポシニンで前処理し、洗浄し、フローチャンバに取り付けた。次いで、処置した脳ＥＣを非標識鎌状赤血球に１０分間曝露した。既に詳細に記載されているように（５０）、ＣＭ－Ｈ２－ＤＣＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＯＳレベルを試験するために、鎌状赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、スライドガラスから脳ＥＣを掻き取った。試料あたり１０万個の事象を取得し、フローサイトメトリー分析によって試験した。別個の実験では、上記のように、チャンバへの注入前（ベースラインレベル）および流動後に、ならびに１０μＭアポシニンで処理した脳ＥＣと相互作用すると、非標識鎌状赤血球をＡＲＬ１３ｂ繊毛タンパク質結合についてフローサイトメトリーによって試験した。
【0075】
マウス鎌状赤血球：繊毛染色および定量化
血液塗抹標本調製のために、ＡＡ対照マウスおよびＳＳ鎌状マウス由来の全血約５μＬをスライドガラスに添加し、２４時間乾燥させた。スメアをアセトンで１０分間固定した。インキュベーションの最後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、１：５００の濃度の一次抗体（ＡＲＬ１３ｂまたはＩＦＴ８８）をスライドに添加し、４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体を１：５００の濃度で添加し、暗所において室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、スライドをＰＢＳで洗浄し、封入試薬を添加し、カバースリップを血液スメアの上に置き、ＲＢＣについては明視野、ＡＲＬ１３ｂまたはＩＦＴ８８陽性繊毛検出については４８８緑色チャネルを有する共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザーモジュール）で６３倍で画像化した。すべての繊毛陽性ＲＢＣをＩｍａｇｅＪソフトウェアの多点ツールで定量化し、グラフとして表した。
血液塗抹標本調製のために、ＡＡ対照マウスおよびＳＳ鎌状マウス由来の全血約５μＬをスライドガラスに添加し、２４時間乾燥させた。スメアをアセトンで１０分間固定した。インキュベーションの最後に、スライドをＰＢＳで洗浄し、１：５００の濃度の一次抗体（ＡＲＬ１３ｂまたはＩＦＴ８８）をスライドに添加し、４℃で一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、二次抗体を１：５００の濃度で添加し、暗所において室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、スライドをＰＢＳで洗浄し、封入試薬を添加し、カバースリップを血液スメアの上に置き、ＲＢＣについては明視野、ＡＲＬ１３ｂまたはＩＦＴ８８陽性繊毛検出については４８８緑色チャネルを有する共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザーモジュール）で６３倍で画像化した。すべての繊毛陽性ＲＢＣをＩｍａｇｅＪソフトウェアの多点ツールで定量化し、グラフとして表した。
【0076】
統計
データを平均およびＳＥＭとして提示した。群を転帰について比較するために、両側ｔ検定または１元または２元配置ＡＮＯＶＡを行った。ピアソンの相関および回帰分析を使用して、連続変数間の関係を調査した。異なる剪断応力下でのインビボでの繊毛タンパク質を、対照群の平均に対する倍率変化として表した。次いで、線形混合モデル（ＬＭＭ）を使用して、実験群と対照群との差を調べた。ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）または非ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－）内の繊毛タンパク質（ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８およびインバーシン）の差もＬＭＭによって分析した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｔｕｋｅｙ検定、またはボンフェローニ補正を使用して多重比較を調整した。データを対数変換して、いくつかの分析の適合性を改善した。パラメトリックな仮定が満たされない場合には、ノンパラメトリックテストを使用した。統計分析は、ＳＡＳ Ｖ９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ＲおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．０）を使用して行った。
データを平均およびＳＥＭとして提示した。群を転帰について比較するために、両側ｔ検定または１元または２元配置ＡＮＯＶＡを行った。ピアソンの相関および回帰分析を使用して、連続変数間の関係を調査した。異なる剪断応力下でのインビボでの繊毛タンパク質を、対照群の平均に対する倍率変化として表した。次いで、線形混合モデル（ＬＭＭ）を使用して、実験群と対照群との差を調べた。ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ＋）または非ＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ－）内の繊毛タンパク質（ＡＲＬ１３ｂ、γ－チューブリン、ＩＦＴ８８およびインバーシン）の差もＬＭＭによって分析した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｔｕｋｅｙ検定、またはボンフェローニ補正を使用して多重比較を調整した。データを対数変換して、いくつかの分析の適合性を改善した。パラメトリックな仮定が満たされない場合には、ノンパラメトリックテストを使用した。統計分析は、ＳＡＳ Ｖ９．４（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ＲおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．０）を使用して行った。
【0077】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
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【図1】
【図2A-K】
【図3A-B】
【図3C-D】
【図4A-D】
【図4E-F】
【図5A-B】
【図6A-C】
【図6D-E】
【図7A-B】
【図8A-F】
【図9A-B】
【図10】
【図11A-B】
【図12A-B】
【図13A-B】
【図14A-F】
【図15A-C】
【配列表】
【国際調査報告】