特表 2024-521175 微生物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-28

(54)【発明の名称】微生物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240521BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240521BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P1/04

C12N9/00

C12N15/11 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12N1/00 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573070

(86)(22)【出願日】2021-05-28

(85)【翻訳文提出日】2024-01-24

(86)【国際出願番号】 EP2021064391

(87)【国際公開番号】W WO2022248061

(87)【国際公開日】2022-12-01

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518160355

【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100182305

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 鉄平

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100221958

【弁理士】

【氏名又は名称】篠田 真希恵

(74)【代理人】

【識別番号】100192441

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 仁

(72)【発明者】

【氏名】ロバートソン ウェスリー イー．

(72)【発明者】

【氏名】ファンケ ルイーズ エフ． エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】デ ラ トレ ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】フレデンス ジュリウス

(72)【発明者】

【氏名】エリオット トーマス エス．

(72)【発明者】

【氏名】ダンケルマン ダニエル エル．

(72)【発明者】

【氏名】ウィリス ジュリアン シー． ダブリュー．

(72)【発明者】

【氏名】ビーティー アダム ティー．

(72)【発明者】

【氏名】チン ジェイソン ダブリュー．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA21

4B065CA24

(57)【要約】

本発明は、非標準アミノ酸を含有するポリマーの産生のための原核細胞、及び前記細胞を作製する方法に関する。本発明はまた、本発明の細胞によって産生された新たに得ることができるポリマーにも関する。加えて、本発明は、対で使用され、これらに限定されないが、本発明の原核細胞などの宿主細胞において有用性が見出され得る新規直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）及び直交性ｔＲＮＡに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

原核細胞であって、
第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；並びに
前記第１の内因性ｔＲＮＡ及び前記第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含む、前記原核細胞。

【請求項2】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第１の内因性ｔＲＮＡが、前記第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであり；及び／又は
ゲノムの必須遺伝子が、第２のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第２の内因性ｔＲＮＡが、前記第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１に記載の原核細胞。

【請求項3】

ゲノムが、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第１の内因性ｔＲＮＡが、前記第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであり；及び／又は
ゲノムが、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第２の内因性ｔＲＮＡが、前記第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１又は２に記載の原核細胞。

【請求項4】

第１のタイプのセンスコドンがＴＣＡであり、第１の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであり；及び／又は
第２のタイプのセンスコドンがＴＣＧであり、第２の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡである、
請求項１～３のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項5】

親株におけるＴＣＡコドンの複数の出現が、ＡＧＴに置き換えられており；及び／又は
親株におけるＴＣＧコドンの複数の出現が、ＡＧＣに置き換えられている、請求項４に記載の原核細胞。

【請求項6】

第１の内因性終結因子を発現せず；及び
前記第１の内因性終結因子が不必要であるように、第１のタイプの終止コドンがゲノム内で再コード化されている、
請求項１～５のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項7】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプの終止コドンの出現を含有せず、第１の内因性終結因子が前記第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子である、請求項６に記載の原核細胞。

【請求項8】

ゲノムが、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、及び第１の内因性終結因子が、前記第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子である、請求項６又は７に記載の原核細胞。

【請求項9】

第１のタイプの終止コドンがＴＡＧであり、第１の内因性終結因子がＲＦ－１である、請求項６～８のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項10】

親株におけるＴＡＧコドンの出現がＴＡＡに置き換えられている、請求項９に記載の原核細胞。

【請求項11】

配列番号３～８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを含む原核細胞。

【請求項12】

第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡを発現し、
前記第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び前記第３の直交性ｔＲＮＡが、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第３の直交性ｔＲＮＡが、第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である、
請求項６～１１のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項13】

第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対が、
ＡｆＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；又は
ＭｊＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹ
である、請求項１２に記載の原核細胞。

【請求項14】

第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、
前記第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び前記第１の直交性ｔＲＮＡが、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第１の直交性ｔＲＮＡが、第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、
請求項１～１３のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項15】

第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、ＭｍＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであり、及び第１の直交性ｔＲＮＡが、ＭｍｔＲＮＡ^ＰｙｌＹ _ＹＹＹ又はＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡである、請求項１４に記載の原核細胞。

【請求項16】

第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２のｔＲＮＡを発現し、
前記第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡが、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第２の直交性ｔＲＮＡが、第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、
請求項１～１５のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項17】

第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであり、及び第２の直交性ｔＲＮＡがＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ又はＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡである、請求項１６に記載の原核細胞。

【請求項18】

原核細胞の増殖速度が、親株の参照原核細胞の増殖速度より速い、請求項１～１７のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項19】

参照原核細胞が、第１のタイプのセンスコドンと、第２のタイプのセンスコドンと、第１のタイプの終止コドンとを除去するためのゲノムの再コード化により直接得られた親株の細胞である、請求項１８に記載の原核細胞。

【請求項20】

参照原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡと、第２の内因性ｔＲＮＡと、第１の内因性終結因子との除去後に直接得られた親株の細胞である、請求項１８に記載の原核細胞。

【請求項21】

ファージ感染及び／又はＦプラスミドの水平伝播に対して耐性である、請求項１～２０のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項22】

ファージ感染及び／又はＦプラスミドの水平伝播に対して完全に耐性である、請求項１～２０のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項23】

細菌細胞又は大腸菌細胞である、請求項１～２２のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項24】

生存可能である、請求項１～２３のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項25】

改変された原核細胞を産生する方法であって、
（ｉ）第１のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現させるように原核細胞を改変するステップであって、前記原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように前記第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含む前記ステップ；
（ii）前記第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下で前記原核細胞をインキュベートするステップ；並びに
（iii）前記第１の内因性ｔＲＮＡが発現しないように、前記第１の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
を含む、前記方法。

【請求項26】

ステップ（ｉ）及び（ii）がステップ（iii）の前に実施される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

（ａ）第２のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように原核細胞を改変するステップであって、前記原核細胞が、第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように前記第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含む前記ステップ；
（ｂ）前記第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下で前記原核細胞をインキュベートするステップ；及び
（ｃ）前記第２の内因性ｔＲＮＡが発現しないように、前記第２の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
をさらに含む、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

ステップ（ｉ）及び（ii）がステップ（iii）の前に実施され、及び／又はステップ（ａ）及び（ｂ）がステップ（ｃ）の前に実施される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、ステップ（ｉ）、（ii）、（iii）の前に実施されるか；又は
ステップ（ａ）が、ステップ（ｉ）と同時に実施され、ステップ（ｂ）がステップ（ii）と同時に実施され、及びステップ（ｃ）がステップ（iii）と同時に実施されるか；又は
ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、ステップ（ｉ）、（ii）、（iii）の後に実施される、
請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、又はゲノムが、前記第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まない、請求項２５～２９のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

第１のタイプのセンスコドンがＴＣＡであり、第１の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡである、請求項２５～３０のいずれかに記載の方法。

【請求項32】

ＴＣＡコドンがＡＧＴに置き換えられている、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、ＭｍＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであり、第１の直交性ｔＲＮＡが、ＭｍｔＲＮＡ^ＰｙｌＹ _ＹＹＹ又はＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡである、請求項２５～３２のいずれかに記載の方法。

【請求項34】

ゲノムの必須遺伝子が、第２のタイプのセンスコドンの出現を含まないか、又はゲノムが、前記第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まない、請求項２５～３３のいずれかに記載の方法。

【請求項35】

第２のタイプのセンスコドンがＴＣＧであり、第２の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡである、請求項２５～３４のいずれかに記載の方法。

【請求項36】

ＴＣＧコドンがＡＧＣに置き換えられている、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであり、第２の直交性ｔＲＮＡがＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ又はＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡである、請求項２５～３６のいずれかに記載の方法。

【請求項38】

方法が適用される原核細胞のゲノムが、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１、配列番号３、又は配列番号４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一である、請求項２５～３７のいずれかに記載の方法。

【請求項39】

第１のタイプの終止コドンを解読するために適切な第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように原核細胞を改変するステップであって、第１のタイプの終止コドンが、第１の内因性終結因子が不必要であるようにゲノム内で再コード化されている前記ステップをさらに含む、請求項２５～３８のいずれかに記載の方法。

【請求項40】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプの終止コドンの出現を含まないか、又はゲノムが、前記第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まない、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

第１のタイプの終止コドンがＴＡＧであり、前記第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子がＲＦ－１である、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

ＴＡＧコドンがＴＡＡに置き換えられている、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対が、
ＡｆＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹであるか；又は
ＭｊＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹである、
請求項３９～４２のいずれかに記載の方法。

【請求項44】

ステップ（ｉ）及び（ａ）の前に、
再コード化されたゲノムを含む原核細胞を含む細胞培養物において変異導入を誘発するステップ、
前記細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ、
前記細胞培養物から、培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップ
を含み；
ステップ（ｉ）又は（ａ）が、前記選択された原核細胞に適用される、請求項２５～４３のいずれかに記載の方法。

【請求項45】

変異導入、変異、及び選択が、平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

変異導入の誘発が、変異導入プラスミドの使用を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

変異導入プラスミドがＭＰ６である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

ステップ（ｉ）の前に、２ラウンドの変異導入及び選択が適用される、請求項４４～４７のいずれかに記載の方法。

【請求項49】

ステップ（iii）及び／又は（ｃ）の後に、
原核細胞から細胞培養物を得るステップ、
前記細胞培養物において変異導入を誘発するステップ、
前記細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ、及び
前記細胞培養物から、培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップ
をさらに含む、請求項２５～４８のいずれかに記載の方法。

【請求項50】

変異導入、変異、及び選択が、平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

変異導入の誘発が、変異導入プラスミドの使用を含み、前記変異導入プラスミドが、第１若しくは第２のタイプのセンスコドンのいかなる出現を含有することも、第１のタイプの終止コドンのいかなる出現を含有することもない、請求項４９又は５０に記載の方法。

【請求項52】

変異導入プラスミドがＭＰ６であり、前記ＭＰ６が、変異導入第１又は第２のタイプのセンスコドンのいかなる出現を含有することも、第１のタイプの終止コドンのいかなる出現を含有することもないように再コード化されている、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

３ラウンドの変異導入及び選択が適用される、請求項４９～５２のいずれかに記載の方法。

【請求項54】

変異導入が、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０、又は２００以上の世代にわたって行われる；及び／又は
細胞培養物が、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００、又は２００以上の世代にわたって指数増殖条件で維持される、請求項４４～５３のいずれかに記載の方法。

【請求項55】

原核細胞が、細菌細胞又は大腸菌細胞である、請求項２５～５４のいずれかに記載の方法。

【請求項56】

ポリマーを合成する方法であって、
ｉ）請求項１～２４のいずれかに記載の原核細胞、又は請求項２５～５５のいずれかに記載の方法に従って生成された原核細胞を提供するステップであって、前記原核細胞が、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含むステップ；及び
前記原核細胞を、ポリマーをコードする核酸配列と接触させるステップであって、前記核酸配列が第１のタイプのセンスコドンを含むステップ；
ii）前記原核細胞を、前記第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第１の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；並びに
iii）前記原核細胞をインキュベートして、前記第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して前記第１の非標準アミノ酸の前記ポリマーへの組み込みを可能にするステップ
を含む、前記方法。

【請求項57】

原核細胞が、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含み、核酸配列が第２のタイプのセンスコドンを含み、及び
ステップii）が、前記第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第２の非標準アミノ酸の存在下で前記原核細胞をインキュベートするステップを含み；及び
ステップiii）が、前記原核細胞をインキュベートして、第２の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して前記第２の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

原核細胞が、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含み、核酸配列が第１のタイプの終止コドンを含み、及び
ステップii）が、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第３の非標準アミノ酸の存在下で前記原核細胞をインキュベートするステップを含み；及び
ステップiii）が、前記原核細胞をインキュベートして、第３の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して前記第３の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップを含む、請求項５６又は５７に記載の方法。

【請求項59】

iv）合成されたポリマーを精製するステップ
をさらに含む、請求項５６～５８のいずれかに記載の方法。

【請求項60】

合成されたポリマーが、別の非標準アミノ酸に直接隣接する少なくとも１つの非標準アミノ酸を含む、請求項５６～５９のいずれかに記載の方法。

【請求項61】

ポリマーが、互いに直接隣接する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０以上の非標準アミノ酸の鎖を含む、請求項５６～６０のいずれかに記載の方法。

【請求項62】

ポリマーが大環状分子である、請求項５６～６１のいずれかに記載の方法。

【請求項63】

非標準アミノ酸が、ＢｏｃＫ、ＣｂｚＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅのいずれか１つ又は任意の組合せを含む、請求項５６～６２のいずれかに記載の方法。

【請求項64】

請求項５６～６３のいずれかに記載の方法によって得られた、又は得ることができるポリマー。

【請求項65】

単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項66】

配列番号９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり、以下の変異の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａ；ii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｑ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iv）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｓ、Ｖ１６８Ｍ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ｇ；及びｖ）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｆ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａのいずれか１つを含む、請求項６５に記載の単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ。

【請求項67】

配列番号１０～１４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項６５に記載の単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ。

【請求項68】

単離されたアーケオグロブス・フルギダスチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項69】

配列番号１６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり、以下の変異の群：ｉ）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、及びＮ１９０Ｎ；ii）Ｙ３６Ｔ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｋ；及びiii）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｎのいずれか１つを含む、請求項６８に記載の単離されたＡｆＴｙｒＲＳ。

【請求項70】

配列番号１６～１９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項６８に記載の単離されたＡｆＴｙｒＲＳ。

【請求項71】

単離されたＬｕｍ１ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項72】

Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳが、配列番号３２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり、以下の変異の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｖ１６８Ｖ；及びii）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆのいずれか１つを含む、請求項７１に記載の単離されたＬｕｍ１ＰｙｌＲＳ。

【請求項73】

Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳが、配列番号３２～３４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項７１に記載の単離されたＬｕｍ１ＰｙｌＲＳ。

【請求項74】

単離されたＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項75】

ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳが、配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり、以下の置換Ｌ１２３Ｍ、Ｌ１２７Ｉ、Ｙ１２８Ｆ、Ｍ１３１Ａ、及びＶ１６９Ｆを含む、請求項７４に記載の単離されたＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ。

【請求項76】

ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳが、配列番号３５又は配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項７４に記載の単離されたＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ。

【請求項77】

単離されたＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項78】

ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号３７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり、以下の変異の群：ｉ）Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｙ２０８Ｙ、及びii）Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、Ｙ２０８Ｆのいずれか１つを含む、請求項７７に記載の単離されたＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項79】

ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号３７～３９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項７７に記載の単離されたＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項80】

単離されたＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項81】

ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４０と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項８０に記載の単離されたＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項82】

単離されたＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項83】

ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項８２に記載の単離されたＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項84】

単離されたＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項85】

ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項８４に記載の単離されたＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項86】

単離されたＩ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項87】

Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項８６に記載の単離されたＩ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項88】

単離されたＤ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項89】

Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項８８に記載の単離されたＤ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項90】

単離されたＤ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント。

【請求項91】

Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳが、配列番号４５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である、請求項９０に記載の単離されたＤ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ。

【請求項92】

ｔＲＮＡシンテターゼが、ＡｌｌｏｃＫ、ＡｌｋＫ、ＢｏｃＫ、Ｂｔａ、ＣｂｚＫ、ＣｙｐＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、ＮＭＨ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、及びｏ－メチル－チロシンのいずれかに対して変更された選択性を有する、請求項６５～９１のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ。

【請求項93】

配列番号１５、２０、４６～５２、５４～５８、６１～６６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一である、単離されたｔＲＮＡ。

【請求項94】

請求項６５～９２のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡを含む宿主細胞であって、前記ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、前記宿主細胞。

【請求項95】

以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞：
（ｉ）直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、請求項６５～６７のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡ；
（ii）ＡｆＴｙｒＲＳ及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、アーケオグロブス・フルギダスチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ、
（iii）ＭｍＰｙｌＲＳｔＲＮＡシンテターゼ及びＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、ＭｍＰｙｌＲＳｔＲＮＡシンテターゼ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ。

【請求項96】

以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞：
（ｉ）直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、請求項６５～６７のいずれかに記載のｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡ；
（ii）ＡｆＴｙｒＲＳ及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、ＡｆＴｙｒＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；
（iii）ＭｊＴｙｒＲＳ及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹが直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、Ｍ・ヤンナスキイチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹ。

【請求項97】

以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞：
ｉ）クラスＡ ΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；
ii）クラスＢ ΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；及び
iii）ＭｍＰｙｌＲＳ／Ｓｐｅ^ＰｙｌｔＲＮＡ対。

【請求項98】

原核細胞、又は真核細胞、細菌細胞、大腸菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞である、請求項９４～９６のいずれかに記載の宿主細胞。

【請求項99】

ゲノムが再コード化されている原核細胞の増殖速度を改善する方法であって
再コード化されたゲノムを含む前記原核細胞を含む細胞培養物において変異導入を誘発するステップ、
前記細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ、
前記細胞培養物から、培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップ
を含む、前記方法。

【請求項100】

変異導入、変異、及び選択が、平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部である、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

変異導入の誘発が、変異導入プラスミドの使用を含み、任意で前記変異導入プラスミドが再コード化された変異導入プラスミドである、請求項９９又は１００に記載の方法。

【請求項102】

変異導入プラスミドがＭＰ６である、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

２ラウンドの変異導入及び選択が適用される、請求項９９～１０２のいずれかに記載の方法。

【請求項104】

変異導入が、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０、又は２００以上の世代にわたって行われる；及び／又は
細胞培養物が、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００、又は２００以上の世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持される、
請求項９９～１０３のいずれかに記載の方法。

【請求項105】

原核細胞が、細菌細胞又は大腸菌細胞である、請求項９９～１０４のいずれかに記載の方法。

【請求項106】

原核細胞の増殖速度が、親株の参照原核細胞の増殖速度より速い、請求項９９～１０５のいずれかに記載の方法から得られた、又は得ることができる原核細胞。

【請求項107】

原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡを発現せず；
前記第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み；
第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、
前記第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び前記第１の直交性ｔＲＮＡが、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第１の直交性ｔＲＮＡが、前記第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、
原核細胞。

【請求項108】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第１の内因性ｔＲＮＡが前記第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１０７に記載の原核細胞。

【請求項109】

ゲノムが、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第１の内因性ｔＲＮＡが、前記第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１０７又は１０８に記載の原核細胞。

【請求項110】

第１のタイプのセンスコドンがＴＣＡであり、第１の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであるか；又は
前記第１のタイプのセンスコドンがＴＣＧであり、前記第１の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡである、請求項１０７～１０９のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項111】

親株におけるＴＣＡコドンの複数の出現がＡＧＴに置き換えられている；及び／又は
前記親株におけるＴＣＧコドンの複数の出現がＡＧＣに置き換えられている、
請求項１１０に記載の原核細胞。

【請求項112】

原核細胞が、第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；
前記第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み；
第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２のｔＲＮＡを発現し、
前記第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡが、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第２の直交性ｔＲＮＡが、前記第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、
請求項１０７～１１１のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項113】

ゲノムの必須遺伝子が、第２のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第２の内因性ｔＲＮＡが前記第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１１２に記載の原核細胞。

【請求項114】

ゲノムが、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第２の内因性ｔＲＮＡが前記第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、請求項１１２又は１１３に記載の原核細胞。

【請求項115】

第２のタイプのセンスコドンがＴＣＡであり、第２の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであるか；又は
前記第２のタイプのセンスコドンがＴＣＧであり、前記第２の内因性ｔＲＮＡがｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡである、請求項１１２～１１４のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項116】

原核細胞が、第１の内因性終結因子を発現せず；
前記第１の内因性終結因子が不必要であるように、第１のタイプの終止コドンがゲノム内で再コード化されており；
前記原核細胞が、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡを発現し、
前記第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び前記第３の直交性ｔＲＮＡが、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び
前記第３の直交性ｔＲＮＡが、前記第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である、
請求項１０７～１１５のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項117】

ゲノムの必須遺伝子が、第１のタイプの終止コドンの出現を含有せず、第１の内因性終結因子が、前記第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子である、請求項１１６に記載の原核細胞。

【請求項118】

ゲノムが、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第１の内因性終結因子が、前記第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子である、請求項１１６又は１１７に記載の原核細胞。

【請求項119】

第１のタイプの終止コドンがＴＡＧであり、第１の内因性終結因子がＲＦ－１である、請求項１１６～１１８のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項120】

親株におけるＴＡＧコドンの出現がＴＡＡに置き換えられている、請求項１１９に記載の原核細胞。

【請求項121】

細菌細胞又は大腸菌細胞である、請求項１０７～１２０のいずれかに記載の原核細胞。

【請求項122】

生存可能である、請求項１０７～１２１のいずれかに記載の原核細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非標準（non-canonical）アミノ酸を含有するポリマーの産生のための新規原核細胞、及び前記細胞を作製する方法に関する。本発明はまた、本発明の原核細胞によって産生された新たに得ることができるポリマーにも関する。加えて、本発明は、対（pair）で使用され、これらに限定されないが、本発明の原核細胞などの宿主細胞において有用性が見出され得る新規直交性（orthogonal）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）及び直交性ｔＲＮＡに関する。

【背景技術】

【0002】

自然界は、６４個のトリプレットコドンを使用して２０個の標準アミノ酸で構成されるタンパク質の合成をコード化し、ほとんどのアミノ酸は、１つより多くの同義コドンによってコードされる。センスコドン及びそれらを読み取るｔＲＮＡをゲノムから除去すると、新規ウイルス耐性様式及び非標準ヘテロポリマーの生合成をコード化する能力を含む、天然の生物学に見出されないいくつかの特性を有する細胞の作製を可能にし得るという仮説が広く立てられている（非特許文献１、２、３、及び４）。しかし、これらの仮説は、実験によって試験されておらず、推測のままである。

【0003】

大腸菌（E.coli）から終結因子－１（ＲＦ－１）（したがってＴＡＧ終止コドンで翻訳を効率的に停止させる能力）を除去すると、ファージの限定的なサブセットに対して何らかの耐性を提供する。しかしながら、この耐性は一般的ではなく、ＴＡＧ終止コドンが翻訳の終止のために使用されることはほとんどないため、及びウイルス遺伝子がアンバーコドンで実際に終止する場合であっても、終止コドンを読み取ることができなくても全長のウイルスタンパク質の合成を制限しないため、ファージはしばしばＲＦ－１の非存在下で繁殖する（非特許文献５）。これに対し、センスコドンは一般的に、ウイルスゲノムにおいてアンバーコドンより少なくとも１０倍多く、ウイルス遺伝子の長さにわたって存在する。

【0004】

細胞において新規モノマーをコードするための現在の戦略は、無効であるか又はコードする連続するモノマーと不適合である（非特許文献８、９、１０、１１、１２、及び１３）単一のタイプのモノマー（一般的にアンバー終止コドンに応答して）（非特許文献１、６、７）をコードすることに限定されており、これらの限定は、完全に非標準モノマーからなる非標準ヘテロポリマー配列の合成を除外している。

【0005】

最近、２つのセンスコドン（セリンコドンＴＣＧ及びＴＣＡ）及び終止コドン（ＴＡＧ）の全てのアノテートされた出現（occurrence）が同義コドンに置き換えられた、合成の再コード化されたゲノムを用いて大腸菌株Ｓｙｎ６１が作製された（非特許文献１４）。この株は、それが派生した（derived）株より１．６倍遅く増殖する。

【0006】

したがって、非標準アミノ酸を含有するポリマーの合成のための新規プラットフォームがなおも必要である。

【0007】

非標準アミノ酸を含有するポリマーの合成のための現在のプラットフォームの一部は、直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を利用する。そのような対を使用して、タンパク質合成の際に非標準アミノ酸を挿入してもよい。これらの対は、別個の（distinct）標的コドンを解読する（decode）及び他のａａＲＳの基質ではない一意的モノマーを使用するためにさらに改変しなければならない。

【0008】

複数の非標準アミノ酸をポリマーに挿入することが可能なプラットフォームを開発するためには、複数のａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を利用する必要がある。別個のコドンを認識し、別個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を組み込む複数の改変された相互直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の同定は、なおも未解決の問題である。各々の新規ｎｃＡＡ、ａａＲＳ、ｔＲＮＡ、及びコドンは、共に機能しなければならず、各内因性のアミノ酸、ａａＲＳ、及びイソアクセプターｔＲＮＡ群及びその同族（cognate）コドン群に対して直交性でなければならない。したがって、各々の新規ｎｃＡＡ：ａａＲＳ：ｔＲＮＡ：コドンセットに関して、新規セットと内因性の翻訳機構との間の３つの相互作用（ｎｃＡＡ：ａａＲＳ、ａａＲＳ：ｔＲＮＡ、及びｔＲＮＡ：コドン）を確立し、及び１２０の相互作用（６×２０個の相互作用；この解析は、天然アミノ酸に関する全てのイソアクセプターを１と計数し、アミノ酸の全てのコドンを１と計数し、したがって制御しなければならない相互作用の保存的推定値を提供する）を最小限にしなければならない。その上、１より多くのｎｃＡＡを組み込む場合、追加のｎｃＡＡ：ａａＲＳ：ｔＲＮＡ：コドンセットの成分間の相互作用の可能性があり、これらもまた最小限にしなければならない。３つの別個のｎｃＡＡをコードするためにｎｃＡＡ：ａａＲＳ：ｔＲＮＡ：コドンセットをポリペプチドに生成することは、９の特異的相互作用を確立する必要があり、３セットの成分間の１８の相互作用を含む、少なくとも３７８の特異的相互作用を最小限にすることが必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】J. W. Chin, Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)

【非特許文献2】D. de la Torre, J. W. Chin, Reprogramming the genetic code. Nature Reviews Genetics 22, 169-184 (2020)

【非特許文献3】T. Passioura, H. Suga, Reprogramming the genetic code in vitro. Trends Biochem Sci 39, 400-408 (2014)

【非特許文献4】A. C. Forster et al., Programming peptidomimetic syntheses by translating genetic codes designed de novo. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6353-6357 (2003)

【非特許文献5】N. J. Ma, F. J. Isaacs, Genomic Recoding Broadly Obstructs the Propagation of Horizontally Transferred Genetic Elements. Cell Systems 3, 199-207 (2016)

【非特許文献6】D. D. Young, P. G. Schultz, Playing with the Molecules of Life. ACS Chemical Biology 13, 854-870 (2018)

【非特許文献7】C. C. Liu, P. G. Schultz, Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annual Review of Biochemistry 79, 413-444 (2010)

【非特許文献8】Y. Zhang et al., A semi-synthetic organism that stores and retrieves increased genetic information. Nature 551, 644-647 (2017)

【非特許文献9】E. C. Fischer et al., New codons for efficient production of unnatural proteins in a semisynthetic organism. Nature Chemical Biology 16, 570-576 (2020)

【非特許文献10】H. Neumann, K. Wang, L. Davis, M. Garcia-Alai, J. W. Chin, Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome. Nature 464, 441-444 (2010)

【非特許文献11】K. Wang et al., Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nature Chemistry 6, 393-403 (2014)

【非特許文献12】D. L. Dunkelmann, J. C. W. Willis, A. T. Beattie, J. W. Chin, Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non-canonical amino acids. Nature Chemistry 12, 535-544 (2020)

【非特許文献13】J. S. Italia et al., Mutually Orthogonal Nonsense-Suppression Systems and Conjugation Chemistries for Precise Protein Labeling at up to Three Distinct Sites. Journal of the American Chemical Society 141, 6204-6212 (2019)

【非特許文献14】J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

そのため、新規直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を提供すること、及び組み合わせて使用した場合に機能的であるａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を同定することが必要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本明細書において、非標準アミノ酸を含有するポリマーの産生にとって適切な原核細胞を提供する。本発明者らは、例えば生存可能な細胞をもたらすために内因性遺伝子の欠失によって、原核細胞から１、２、又はそれより多くの内因性ｔＲＮＡを除去することが可能であることを実証する。本発明者らは、除去した内因性ｔＲＮＡを、直交性ｔＲＮＡに置き換えてもよいことを実証する。本発明者らはさらに、これらのプロセスによって導入され得る任意の増殖欠損を克服する方法も提供する。本発明者らはまた、改変原核細胞がファージに対して完全に耐性であることを示す実験データも提供する。

【0012】

本発明の一態様では、原核細胞であって、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；並びに第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡが不必要である（dispensable）ように、第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化（recode）されているゲノムを含む原核細胞が提供される。

【0013】

一部の実施形態では、ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第１の内因性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンの同族の（cognate）ｔＲＮＡであり；及び／又はゲノムの必須遺伝子は、第２のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、第２の内因性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである。

【0014】

一部の実施形態では、ゲノムは、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第１の内因性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであり；及び／又はゲノムは、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、第２の内因性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである。

【0015】

一部の実施形態では、第１のタイプのセンスコドンは、ＴＣＡであり、第１の内因性ｔＲＮＡはｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであり；及び／又は第２のタイプのセンスコドンはＴＣＧであり、第２の内因性ｔＲＮＡはｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡである。親株におけるＴＣＡコドンの複数の出現が、ＡＧＴに置き換えられていてもよく；及び／又は親株におけるＴＣＧコドンの複数の出現がＡＧＣに置き換えられていてもよい。

【0016】

一部の実施形態では、原核細胞は、第１の内因性終結因子（release factor）を発現せず；及び第１のタイプの終止コドンは、第１の内因性終結因子が不必要であるようにゲノム内で再コード化されている。

【0017】

ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しなくてもよく、第１の内因性終結因子は、第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子であってもよい。

【0018】

ゲノムは、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよく、第１の内因性終結因子は、第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子であってもよい。第１のタイプの終止コドンは、ＴＡＧであってもよく、第１の内因性終結因子はＲＦ－１であってもよい。親株におけるＴＡＧコドンの出現が、ＴＡＡに置き換えられていてもよい。

【0019】

一部の実施形態では、ゲノムは、配列番号３～８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一である。

【0020】

一部の実施形態では、原核細胞は、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡは、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び第１の直交性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能である。

【0021】

第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであってもよく、第１の直交性ｔＲＮＡは、ＭｍｔＲＮＡ^ＰｙｌＹ _ＹＹＹ又はＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであってもよい。

【0022】

一部の実施形態では、原核細胞は、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２のｔＲＮＡを発現し、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡは、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、第２の直交性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能である。

【0023】

第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであってもよく、第２の直交性ｔＲＮＡは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ又はＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであってもよい。

【0024】

一部の実施形態では、原核細胞は、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡを発現し、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡは、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び第３の直交性ｔＲＮＡは、第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である。

【0025】

第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ＡｆＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；又はＭｊＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹであってもよい。

【0026】

原核細胞の増殖速度は、親株の参照原核細胞の増殖速度より速くてもよい。参照原核細胞は、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び第１のタイプの終止コドンを除去するためにゲノムを再コード化することによって直接得られた親株の細胞であってもよい。参照原核細胞は、第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び第１の内因性終結因子の除去時に直接得られた親株の細胞であってもよい。

【0027】

原核細胞は、ファージ感染及び／又はＦプラスミドの水平伝播に対して耐性であり得る。原核細胞は、ファージ感染及び／又はＦプラスミドの水平伝播に対して完全に耐性であり得る。

【0028】

原核細胞は、細菌細胞又は大腸菌（Escherichia coli）細胞であり得る。原核細胞は生存可能である。

【0029】

本発明の一態様では、配列番号３～８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを有する原核細胞が提供される。配列同一性の計算は、外因性の配列、例えば直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の挿入のための任意の配列を除外し得る。

【0030】

本発明の別の態様では、改変原核細胞を産生する方法であって、
（ｉ）第１のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように原核細胞を改変するステップであって、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含むステップ；
（ii）原核細胞を、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
（iii）第１の内因性ｔＲＮＡが発現しないように第１の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
を含む方法が提供される。

【0031】

一実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ii）は、ステップ（iii）の前に実施される。別の実施形態では、ステップ（iii）は、ステップ（ｉ）及び（ii）の前に実施される。

【0032】

方法は、
（ａ）第２のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように、原核細胞を改変するステップであって、原核細胞が、第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含むステップ；
（ｂ）原核細胞を、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
（ｃ）第２の内因性ｔＲＮＡが発現しないように、第２の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
をさらに含み得る。

【0033】

一実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ii）は、ステップ（iii）の前に実施され、並びに／又はステップ（ａ）及び（ｂ）は、ステップ（ｃ）の前に実施される。別の実施形態では、ステップ（iii）はステップ（ｉ）及び（ii）の前に実施され、並びに／又はステップ（ｃ）は、ステップ（ａ）及び（ｂ）の前に実施される。

【0034】

一部の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、ステップ（ｉ）、（ii）、（iii）の前に実施され；又はステップ（ａ）は、ステップ（ｉ）と同時に実施され、ステップ（ｂ）は、ステップ（ii）と同時に実施され、及びステップ（ｃ）は、ステップ（iii）と同時に実施され；又はステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、ステップ（ｉ）、（ii）、（iii）の後に実施される。

【0035】

ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよく、又はゲノムは、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。第１のタイプのセンスコドンは、ＴＣＡであってもよく、第１の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであってもよい。ＴＣＡコドンは、ＡＧＴに置き換えられていてもよい。

【0036】

第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであってもよく、第１の直交性ｔＲＮＡは、ＭｍｔＲＮＡ^ＰｙｌＹ _ＹＹＹ又はＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであってもよい。

【0037】

ゲノムの必須遺伝子は、第２のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよく、又はゲノムは、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。第２のタイプのセンスコドンは、ＴＣＧであってもよく、第２の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡであってもよい。ＴＣＧコドンは、ＡＧＣに置き換えられてもよい。

【0038】

第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントであってもよく、及び第２の直交性ｔＲＮＡは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ又はＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであってもよい。

【0039】

方法が適用される原核細胞のゲノムは、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１、配列番号３、又は配列番号４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であり得る。

【0040】

方法は、第１のタイプの終止コドンを解読するために適切な第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように原核細胞を改変するステップであって、第１の内因性終結因子が不必要であるように、第１のタイプの終止コドンがゲノム内で再コード化されているステップをさらに含み得る。ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しなくてもよく、又はゲノムは、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。第１のタイプの終止コドンは、ＴＡＧであってもよく、第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子は、ＲＦ－１であってもよい。ＴＡＧコドンは、ＴＡＡに置き換えられてもよい。

【0041】

第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ＡｆＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；又はＭｊＴｙｒＲＳ、若しくは非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹであってもよい。

【0042】

方法は、ステップ（ｉ）及び（ａ）の前に、
再コード化されたゲノムを含む原核細胞を含む細胞培養において変異導入（mutagenesis）を誘発する（inducing）ステップ、
細胞培養物を指数関数的な（exponential）増殖条件下で維持するステップ、
培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を、前記細胞培養物から選択するステップ
を含んでもよく、並びに
ステップ（ｉ）又は（ａ）は選択された原核細胞に適用され得る。

【0043】

変異導入、変異、及び選択は、平行（parallel）変異導入及び動的平行（dynamic parallel）選択プロセスの一部であり得る。変異導入の誘発は、変異導入プラスミドの使用を含み得る。変異導入プラスミドは、ＭＰ６であり得る。

【0044】

一実施形態では、ステップ（ｉ）の前に、２ラウンドの変異導入及び選択を適用する。

【0045】

方法は、ステップ（iii）及び／又は（ｃ）の後に、
原核細胞からの細胞培養物を得るステップ、
細胞培養物において変異導入を誘発するステップ、
細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ、及び
培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を、前記細胞培養物から選択するステップ
をさらに含み得る。

【0046】

変異導入、変異、及び選択は、平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部であり得る。変異導入の誘発は、変異導入プラスミドの使用を含んでもよく、変異導入プラスミドは、第１又は第２のタイプのセンスコドンのいかなる出現を含有することも、第１のタイプの終止コドンのいかなる出現を含有することもない。変異導入プラスミドは、ＭＰ６であってもよく、ＭＰ６は、第１若しくは第２のタイプのセンスコドンのいかなる出現を含有することも、第１のタイプの終止コドンのいかなる出現を含有することもないように再コード化されている。３ラウンドの変異導入及び選択を適用してもよい。

【0047】

本発明の方法において、変異導入を、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０又は２００以上の世代にわたって行ってもよく；及び／又は細胞培養物を、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００又は２００以上の世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持してもよい。

【0048】

一部の実施形態では、原核細胞は、細菌細胞又は大腸菌細胞である。

【0049】

本発明のさらなる態様では、ポリマーを合成する方法であって、
ｉ）本発明の、又は本発明の方法に従って生成された原核細胞を提供するステップであって、原核細胞が、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含むステップ；及び前記原核細胞を、ポリマーをコードする核酸配列と接触させるステップであって、前記核酸配列が第１のタイプのセンスコドンを含むステップ；
ii）原核細胞を、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第１の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
iii）原核細胞をインキュベートして、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第１の非標準アミノ酸をポリマーに組み込むことを可能にするステップ
を含む方法が提供される。

【0050】

一実施形態では、原核細胞は、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含み、核酸配列は、第２のタイプのセンスコドンを含み、及び
ステップii）は、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第２の非標準アミノ酸の存在下で原核細胞をインキュベートするステップを含み；及び
ステップiii）は、原核細胞をインキュベートして、第２の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第２の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップを含む。

【0051】

別の実施形態では、原核細胞は、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含み、核酸配列は第１のタイプの終止コドンを含み、及び
ステップii）は、原核細胞を、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第３の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップを含み；及び
ステップiii）は、原核細胞をインキュベートして、第３の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第３の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップを含む。

【0052】

ポリマーを合成する方法はいずれも、合成されたポリマーを精製するステップをさらに含み得る。

【0053】

合成されたポリマーは、別の非標準アミノ酸に直ちに隣接する少なくとも１つの非標準アミノ酸を含み得る。ポリマーは、互いに直ちに隣接する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０以上の非標準アミノ酸の鎖を含み得る。ポリマーは、大環状分子（macrocycle）であり得る。非標準アミノ酸は、ＢｏｃＫ、ＣｂｚＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅのいずれか１つ又は任意の組合せであり得る。

【0054】

本発明の一態様では、本発明のポリマーを合成する方法によって得られた又は得ることができるポリマーが提供される。

【0055】

本発明の一態様では、単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、配列番号９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であってもよく、以下の変異の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａ；ii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｑ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iv）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｓ、Ｖ１６８Ｍ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ｇ；及びｖ）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｆ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａのいずれか１つを含み得る。単離された１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、配列番号１０～１４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0056】

本発明の一態様では、単離されたアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）チロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。単離されたＡｆＴｙｒＲＳは、配列番号１６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であってもよく、以下の変異の群：ｉ）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、及びＮ１９０Ｎ；ii）Ｙ３６Ｔ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｋ；及びiii）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｎのいずれか１つを含み得る。単離されたＡｆＴｙｒＲＳは、配列番号１６～１９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0057】

本発明の一態様では、単離されたＬｕｍ１ＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳは、配列番号３２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であってもよく、以下の変異の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｖ１６８Ｖ；及びii）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆのいずれか１つを含み得る。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳは、配列番号３２～３４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0058】

本発明の一態様では、単離されたＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳは、配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であってもよく、以下の置換Ｌ１２３Ｍ、Ｌ１２７Ｉ、Ｙ１２８Ｆ、Ｍ１３１Ａ、及びＶ１６９Ｆを含む。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳは、配列番号３５又は配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0059】

本発明の一態様では、単離されたＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号３７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であってもよく、以下の変異の群：ｉ）Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｙ２０８Ｙ、及びii）Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、Ｙ２０８Ｆのいずれか１つを含む。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号３７～３９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0060】

本発明の一態様では、単離されたＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４０と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0061】

本発明の一態様では、単離されたＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0062】

本発明の一態様では、単離されたＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0063】

本発明の一態様では、単離されたＩ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0064】

本発明の一態様では、単離されたＤ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0065】

本発明の一態様では、単離されたＤ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアントが提供される。Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、配列番号４５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0066】

本発明のｔＲＮＡシンテターゼは、ＡｌｌｏｃＫ、ＡｌｋＫ、ＢｏｃＫ、Ｂｔａ、ＣｂｚＫ、ＣｙｐＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、ＮＭＨ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、及びｏ－メチルチロシンのいずれかに対して変更された選択性を有し得る。

【0067】

本発明の一態様では、単離されたｔＲＮＡが提供され、単離されたｔＲＮＡは、配列番号１５、２０、４６～５２、５４～５８、６１～６６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一である。

【0068】

本発明の一態様では、本発明に従うｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡを含む宿主細胞であって、ｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡが直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、宿主細胞が提供される。

【0069】

本発明の一態様では、以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞が提供される：
（ｉ）直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、本発明に従うｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡ；
（ii）ＡｆＴｙｒＲＳ及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、アーケオグロブス・フルギダスチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；
（iii）ＭｍＰｙｌＲＳｔＲＮＡシンテターゼ及びＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹが、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、ＭｍＰｙｌＲＳｔＲＮＡシンテターゼ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ。

【0070】

本発明の一態様では、以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞が提供される：
（ｉ）直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、本発明に従うｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡ；
（ii）ＡｆＴｙｒＲＳ及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹが直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、ＡｆＴｙｒＲＳ、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹ；
（iii）ＭｊＴｙｒＲＳ及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹが直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、Ｍ．ヤンナスキイ（M jannaschii）チロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）、又は非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するバリアント、及びＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹ。

【0071】

本発明の一態様では、以下のリストから選択される２つ又は３つの項目の任意の組合せを含む宿主細胞が提供される：ｉ）クラスＡ ΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；ii）クラスＢ ΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；及びiii）ＭｍＰｙｌＲＳ／Ｓｐｅ^ＰｙｌｔＲＮＡ対。

【0072】

宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞、細菌細胞、大腸菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞であり得る。

【0073】

本発明の一態様では、ゲノムが再コード化されている原核細胞の増殖速度を改善する方法であって、
再コード化されたゲノムを含む原核細胞を含む細胞培養物において変異導入を誘発するステップ、
細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ、
培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を、前記細胞培養物から選択するステップ
を含む方法が提供される。

【0074】

変異導入、変異、及び選択は、平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部であり得る。変異導入の誘発は、変異導入プラスミドの使用を含み得る。変異導入プラスミドは、再コード化された変異導入プラスミド、例えば第１及び／又は第２のタイプのセンスコドン、及び任意で第１のタイプの終止コドンを除去するように再コード化された変異導入プラスミドであり得る。変異導入プラスミドは、ＭＰ６であり得る。２ラウンドの変異導入及び選択を適用してもよい。変異導入を、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０又は２００以上の世代にわたって行ってもよく；及び／又は細胞培養物を、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００、２００、又はそれより多くの世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持してもよい。原核細胞は、細菌細胞又は大腸菌細胞であり得る。

【0075】

本発明の一態様では、本発明の原核細胞の増殖速度を改善する方法のいずれかによって得られた又は得ることができる原核細胞であって、原核細胞の増殖速度が、親株の参照原核細胞の増殖速度より速い原核細胞が提供される。

【0076】

本発明の一態様では、原核細胞であって、第１の内因性ｔＲＮＡを発現せず；第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み；第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡが第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び第１の直交性ｔＲＮＡが第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能である原核細胞が提供される。

【0077】

ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよく、第１の内因性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであってもよい。ゲノムは、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい、及び第１の内因性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであってもよい。第１のタイプのセンスコドンは、ＴＣＡであってもよく、第１の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであってもよい；又は第１のタイプのセンスコドンは、ＴＣＧであってもよく、第１の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡであってもよい。親株におけるＴＣＡコドンの複数の出現がＡＧＴに置き換えられていてもよく；及び／又は親株におけるＴＣＧコドンの複数の出現がＡＧＣに置き換えられていてもよい。

【0078】

さらなる実施形態では、原核細胞は、第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み；第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２のｔＲＮＡを発現し、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡが第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し；及び第２の直交性ｔＲＮＡが、第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能である。ゲノムの必須遺伝子は、第２のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよく、第２の内因性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであってもよい。ゲノムは、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよく、第２の内因性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであってもよい。第２のタイプのセンスコドンはＴＣＡであってもよく、及び第２の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡであってもよく；又は第２のタイプのセンスコドンはＴＣＧであってもよく、及び第２の内因性ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡであってもよい。

【0079】

さらなる実施形態では、原核細胞は、第１の内因性終結因子を発現せず；第１のタイプの終止コドンは、第１の内因性終結因子が不必要であるようにゲノム内で再コード化されており；原核細胞は、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡを発現し；第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡは、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し；及び第３の直交性ｔＲＮＡは、第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である。ゲノムの必須遺伝子は、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しなくてもよく、及び第１の内因性終結因子は、第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子であってもよい。ゲノムは、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよく、第１の内因性終結因子は、第１のタイプの終止コドンの同族の終結因子であってもよい。第１のタイプの終止コドンはＴＡＧであってもよく、第１の内因性終結因子はＲＦ－１であってもよい。親株におけるＴＡＧコドンの出現は、ＴＡＡに置き換えられていてもよい。

【0080】

原核細胞は、細菌細胞又は大腸菌細胞であり得る。原核細胞は生存可能である。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】株の進化及びＳｙｎ６１Δ３の作製を示す図である。（Ａ）株進化の概略図である。セリン及びタンパク質終止をコードするコドンを、ｔＲＮＡのアンチコドン又はそれらを解読することが予測される終結因子に黒い線でつなぐ。対応するｔＲＮＡ及び終結因子をコードする遺伝子を黒色の枠で示す。Ｓｙｎ６１の解読規則を有する細胞を、全体を通してピンク色の枠で示す。２ラウンドの平行変異導入及び動的選択により、Ｓｙｎ６１、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）を作製した。ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ、及びｐｒｆＡを欠失させてＳｙｎ６１Δ３を作製した。最後に、３ラウンドの平行変異導入及び動的選択を適用してＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）を作製した；Ｓｙｎ６１Δ３及びＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）を、全体を通して淡い青緑色の枠で表す。（Ｂ）Ｓｙｎ６１及びＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の発達における全ての中間株の増殖速度。増殖速度を、各株についてｎ＝８の同型培養について測定した増殖曲線に基づいて計算した。統計学に関しては方法を参照されたい。

【図2-1】～

【図2-2】溶解性ファージの繁殖及び細胞溶解がＳｙｎ６１Δ３において妨害されることを示す図である。（Ａ）Ｓｙｎ６１Δ３のウイルス感染の概略図。ｓｅｒＵ（ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡをコードする）、ｓｅｒＴ（ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡをコードする）、及びｐｒｆＡ（ＲＦ－１をコードする）の欠失は、ＵＣＧ、ＵＣＡ及びＵＡＧコドンを読み取り不可にし、リボソームは、ここでウイルスｍＲＮＡに関して示されるように、それらを含有するｍＲＮＡ内のこれらのコドンで停滞する（stall）。（Ｂ）Ｔ６ファージのゲノムにおけるＴＣＧ、ＴＣＡ、及びＴＡＧコドンの数及びその位置の概略図である。（Ｃ）培養物に、Ｔ６ファージを感染多重度（ＭＯＩ）５×１０^－２で感染させ、総力価（細胞内ファージプラス遊離のファージ）を４時間にわたってモニターした。ゲンタマイシンによる処置を使用して、タンパク質合成を除去し、ウイルスタンパク質を合成することができない、又は新たなウイルス粒子を産生することができない細胞の制御を提供する。（Ｄ）Ｔ６は、Ｓｙｎ６１バリアントを効率よく溶解するが、Ｓｙｎ６１Δ３は溶解しない。培養物にパネル（Ｃ）を感染させ、ＯＤ_６００を４時間後に測定した。（Ｅ）各表記のファージにおけるｋｂ当たりの表記のコドンの数である。（Ｆ～Ｇ）Ｓｙｎ６１Δ３は、複数のファージを同時感染させても生存する：（Ｆ）感染後（＋）又は非感染後（－）の表記の時点での培養物の写真である。培養物にファージλ、Ｐ１、Ｔ４、Ｔ６、及びＴ７をそれぞれ、ＭＯＩ＝１×１０^－２で感染させた。（Ｇ）培養物のＯＤ_６００を、４時間後に測定した。全ての実験を３回の独立した同型培養で実施し、ドットは、独立した同型培養を表し、線（パネル（Ｃ））又はバー（パネル（Ｄ）及び（Ｇ））は平均値を表す。写真（パネル（Ｆ））は、３つの独立した同型培養からのデータの代表である。

【図3-1】～

【図3-3】Ｓｙｎ６１Δ３における２つのセンスコドン及び終止コドンの非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）への再定義（reassignment）を示す図である。（Ａ）各コドンの再定義の概略図である。直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ_ＹＹＹ対（ＹＹＹは、直交性ｔＲＮＡ（Ｏ－ｔＲＮＡによってコードされる）のアンチコドンの配列である）のＳｙｎ６１Δ３（淡い青緑色の枠、図１Ａに記載されるように）への導入は、所望の遺伝子に導入された同族のコドン（ＸＸＸ）の解読を可能にする。直交性対は、ＸＸＸコドンに応答した非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の組み込みを方向付ける。これらのコドン再定義を、濃い灰色の枠で示す。（Ｂ）ＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンは、Ｓｙｎ６１Δ３における翻訳機構によって読み取られず、コドン再定義は、ｎｃＡＡのＵｂ_{１１ＸＸＸ}への組み込みを可能にする。１１位での単一のＴＣＧ、ＴＣＡ、又はＴＡＧコドン（Ｕｂ_{１１ＸＸＸ}）を含む、又は標的コドンを含まない（ｗｔ）直交性ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ対及びＣ末端Ｈｉｓ_６タグユビキチンをコードするプラスミドを、Ｓｙｎ６１Δ３に導入した。「ＸＸＸ」は、標的コドンを指し、「ＹＹＹ」は、同族のアンチコドンを指す。ユビキチン－Ｈｉｓ_６の発現を、ＭｍＰｙｌＲＳのｎｃＡＡ基質であるＢｏｃＫの非存在下（－）又は存在下（＋）で実施した。全長のユビキチン－Ｈｉｓ_６が、抗Ｈｉｓ_６抗体によって等しい数の細胞からの細胞溶解物において検出された。（Ｃ）表記の標的コドンを有するＵｂ_{１１ＸＸＸ}遺伝子からのＢｏｃＫを組み込むユビキチン－Ｈｉｓ_６、Ｕｂ－（１１ＢｏｃＫ）－Ｈｉｓ_６の産生を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって確認した。理論的質量：９４８７．７Ｄａ；実測質量：９４８７．８Ｄａ（ＴＣＧ）、９４８７．８Ｄａ（ＴＣＡ）、９４８８．０（ＴＡＧ）。１００Ｄａ小さいピークは、ＢｏｃＫからのｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルの喪失に起因する。（Ｄ）パネル（Ｂ）と同様であるが、しかしＵｂ遺伝子の１１位及び６５位で標的コドンを含有するＵｂ_{１１ＸＸＸ，６５ＸＸＸ}を使用する。（Ｅ）表記の標的コドンを有するＵｂ_{１１ＸＸＸ６５ＸＸＸ}遺伝子からの１１位及び６５位でＢｏｃＫを組み込むユビキチン－Ｈｉｓ_６の産生を、ＥＳＩ－ＭＳによって確認した。理論的質量：９６２９．０Ｄａ；実測質量：９６２９．２Ｄａ（ＴＣＧ）、９６２９．０Ｄａ（ＴＣＡ）、９６２９．０Ｄａ（ＴＡＧ）。－１００Ｄａのより小さいピークはＢｏｃＫからのｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルの喪失に対応する。（Ｆ）パネル（Ｂ）と同じであるが、Ｕｂ遺伝子の１１、１４、及び６５位で標的コドンを含有するＵｂ_{１１ＸＸＸ，１４ＸＸＸ，６５ＸＸＸ}を使用する。（Ｇ）表記の標的コドンを有するＵｂ_{１１ＸＸＸ，１４ＸＸＸ，６５ＸＸＸ}の１１、１４、及び６５位でＢｏｃＫを組み込むユビキチン－Ｈｉｓ_６の産生を、ＥＳＩ－ＭＳによって確認した。理論的質量：９７５６．１Ｄａ；実測質量：９７５６．２Ｄａ（ＴＣＧ）、９７５６．０Ｄａ（ＴＣＡ）、９７５６．０Ｄａ（ＴＡＧ）。－１００Ｄａ又は－２００Ｄａのより小さいピークはそれぞれ、１つ又は２つのＢｏｃＫ残基からのｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルの喪失に対応する。（Ｈ）パネル（Ｂ）と同じであるが、Ｕｂ遺伝子の９、１１、１４、及び６５位で標的コドンを含有するＵｂ_{９ＸＸＸ，１１ＸＸＸ，１４ＸＸＸ，６５ＸＸＸ}を使用する。（Ｉ）表記の標的コドンを有するＵｂ_{９ＸＸＸ，１１ＸＸＸ，１４ＸＸＸ，６５ＸＸＸ}の９、１１、１４、及び６５位でＢｏｃＫを組み込むユビキチン－Ｈｉｓ_６の産生をＥＳＩ－ＭＳによって確認した。理論的質量：９８８３．３Ｄａ；実測質量：９８８３．２Ｄａ（ＴＣＧ）、９８８３．２Ｄａ（ＴＣＡ）、９８８３．２Ｄａ（ＴＡＧ）。－１００Ｄａ又は－２００Ｄａのより小さいピークはそれぞれ、１つ又は２つのＢｏｃＫ残基からのｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルの喪失に対応する。全ての実験を、生物学的反復実験で３回実施し、類似の結果を得た。

【図4-1】～

【図4-2】Ｓｙｎ６１Δ３細胞におけるＴＣＧ、ＴＣＡ、及びＴＡＧコドンへの別個の非標準アミノ酸の２重（double）及び３重（triple）の組み込みを示す図である。（Ａ）Ｓｙｎ６１Δ３における、ＴＣＧ（青色の枠）、ＴＣＡ（金色の枠）及びＴＡＧ（緑色の枠）コドンの別個のｎｃＡＡへの再定義である。単一細胞において３つ全てのコドンを別個のｎｃＡＡに再定義することは、３つの改変された３重直交性（triply orthogonal）アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を必要とする。各対は、別個のｎｃＡＡを認識し、別個のコドンを解読しなければならない。これらの３重直行性対からのｔＲＮＡを、Ｏ－ｔＲＮＡ^１－３と表示する。（Ｂ）単一の遺伝子におけるＴＣＧ及びＴＡＧコドンに応答した２つの別個の非標準アミノ酸の組み込みである。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ対及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ対（３０）（それぞれ、Ｎ^ε－（カルボベンジルオキシ）－Ｌ－リシン（ＣｂｚＫ）のＴＣＧへの組み込み、及び（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）のＴＡＧへの組み込みを方向付ける）を含有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）に、ＣｂｚＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅを提供した。細胞はまた、Ｕｂ_{１１ＴＣＧ，６５ＴＡＧ}（ＴＣＧ／ＴＡＧ）又はＵｂ９_{ＴＣＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＡＧ，６５ＴＡＧ}（２×ＴＣＧ／２×ＴＡＧ）、又は標的コドンを含有しないｗｔ Ｕｂも含有した。ユビキチン－Ｈｉｓ_６の発現を、ｎｃＡＡの非存在下（－）又は存在下で実施した。全長のユビキチン－Ｈｉｓ_６が、抗Ｈｉｓ_６抗体によって等しい数の細胞からの細胞溶解物中で検出された。（Ｃ）パネル（Ｅ）に記載されるようにＣｂｚＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅの存在下で発現させ、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡクロマトグラフィーによって精製した、精製Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）（黒色の軌跡）及びＵｂ－（１１ＣｂｚＫ、１４ＣｂｚＫ、５７ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）（灰色の軌跡）のＥＳＩ－ＭＳ解析である。これらのデータはそれぞれ、ＴＣＧ及びＴＡＧコドンに応答したＣｂｚＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅの定量的組み込みを確認する。Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）、理論的質量：９７０７．８１Ｄａ；実測質量：９７０７．４０Ｄａ．Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、１４ＣｂｚＫ、５７ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）、理論的質量：１００５５．００Ｄａ；実測質量：１００５５．６０Ｄａ。（Ｄ）単一の遺伝子における３つの別個の非標準アミノ酸のＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンへの組み込みである。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ対、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡ対及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ対を含有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）に、ＣｂｚＫ、ＢｏｃＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅを提供した。細胞はまた、Ｕｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}（ＴＣＧ／ＴＣＡ／ＴＡＧ）も含有した。この遺伝子の発現を、ｎｃＡＡの非存在下（－）又は存在下（＋）で実施した。全長のＵｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＢｏｃＫ）－Ｈｉｓ_６は、抗Ｈｉｓ_６抗体によって、等しい細胞数からの細胞溶解物中で検出された。（Ｅ）精製Ｕｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＢｏｃＫ）のＥＳＩ－ＭＳ、理論的質量：９８２０．９７Ｄａ；実測質量：９８２０．８０Ｄａ。ウェスタンブロット実験（パネル（Ｂ）及び（Ｄ））を、５つの生物学的反復実験において実施し、類似の結果を得た。ＥＳＩ－ＭＳデータ（パネル（Ｃ）及び（Ｅ））を１回収集した。

【図5-1】～

【図5-3】非標準ヘテロポリマー及び大環状分子のプログラム可能なコード化された合成を示す図である。（Ａ）２つの別個のｎｃＡＡモノマー（Ａ（濃い青色）及びＢ（緑色）と表示される）のリボソーム重合化における基本ステップ。Ａ及びＢで構成される全ての線状ヘテロポリマー配列を、これらの４つの基本ステップからコード化することができる。（Ｂ）ヘテロポリマー配列（非標準モノマーを星印で示す）のコード化。ヘテロポリマーにおけるモノマーの配列を、ユーザーによって記載されるコドンの配列によってプログラムする。モノマー（Ａ及びＢ）の同一性を、細胞に添加したアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対によって定義する。細胞を、単一のＤＮＡ配列からの異なるヘテロポリマー配列をコードするようにリプログラムすることができる。配列は、ｓｆＧＦＰ－Ｈｉｓ_６の３位での挿入としてコードされた。再定義スキーム１（ｒ．ｓ．１）は、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ対を使用してＡｌｌｏｃＫをモノマーＡとして定義し、及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡ対を使用してＣｂｚＫをモノマーＢとして定義する（図Ｓ７、Ｄ～Ｅ）。ｒ．ｓ．２は、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ対を使用してＢｏｃＫをモノマーＡとして定義し、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ対を使用してｐ－Ｉ－ＰｈｅをモノマーＢとして定義する。ｒ．ｓ．３は、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ対を使用して、ＣｂｚＫをモノマーＡとして定義し、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ対を使用してｐ－Ｉ－ＰｈｅをモノマーＢとして定義する。（Ｃ～Ｅ）表記のｎｃＡＡで構成されるコードされた配列の重合化、及びＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）における得られたｓｆＧＦＰ－Ｈｉｓ６発現は、培地への両方のｎｃＡＡの添加に依存した。（Ｆ）表記のｎｃＡＡ六量体を含有する精製ｓｆＧＦＰ－Ｈｉｓ６バリアントのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ。ＢｏｃＫ／ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ（Ｎ末端メチオニンの喪失後の予想される質量：２９１７２．０７Ｄａ；観察された質量：２９１７１．８Ｄａ）、ＣｂｚＫ／ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ（Ｎ末端メチオニンの喪失後の予想される質量：２９２７４．１３Ｄａ；観察された質量：２９２７４．０Ｄａ）及びＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ（Ｎ末端メチオニンの喪失後の予想される質量：２９０９１．６４Ｄａ；観察された質量：２９０９２．２Ｄａ）。ＥＳＩ－ＭＳデータを１回収集した。（Ｇ）遊離の非標準ポリマーのコード化された合成。四量体及び六量体をコードするＤＮＡ配列を、ｒ．ｓ．１（Ｂ）と同じ対を含有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）細胞において、ＳＵＭＯと、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ， chitin-binding domain）にカップリングしたＧｙｒＡインテインとの間に挿入した。コンストラクトの発現後のＵｌｐ１切断及びＧｙｒＡトランス－チオエステル化切断は、遊離の非標準四量体及び六量体ポリマーの単離をもたらした。追加のシステインをポリマー配列のすぐ上流に付加すると、大環状非標準ポリマーの自己切断及び放出をもたらす。（Ｈ～Ｊ）精製された線状及び環状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫヘテロポリマーの化学構造及びＥＳＩ－ＭＳスペクトル。生のＥＳＩ－ＭＳスペクトルは、異なる非標準ペプチドに関して相対強度及び観察されたｍ／ｚ比を示す。予想される［Ｍ＋Ｈ］^＋又は［Ｍ＋２Ｈ］^２＋イオンに対応する観察された質量を、太字で強調する。他の付加物及び断片イオンを、これらと比較して表示する。

【図6-1】～

【図6-3】（Ｓ１）Ｓｙｎ６１株の進化及びノックアウトを示す図である。（Ａ）自動平行進化の概略図である。クローン培養物を淡黄色で示し、各ウェル中の変異導入集団を別個の影によって表す。変異誘発培養物を、ロボットプラットフォームにおいてランダム変異誘発後に６サイクルの動的平行選択を行って１７～７０世代にわたって増殖させた。吸光度（ＯＤ_６００）を定期的に評価し、３つのウェルのＯＤ_６００が０．５に達すると全てのウェルを再希釈し、およそ５２世代にわたる指数関数相での連続的な増殖を可能にする。最後に単コロニーを、変異導入集団から単離し、増殖の測定及び全ゲノムシーケンシングによって特徴付けた。図面を、許可を得てSchmied et al.（J. S. Italia et al., Mutually Orthogonal Nonsense-Suppression Systems and Conjugation Chemistries for Precise Protein Labeling at up to Three Distinct Sites. Journal of the American Chemical Society 141, 6204-6212 (2019)）から改作した。（Ｂ）進化させたプールから単離したＳｙｎ６１及びＳｙｎ６１Δ３子孫の系列。着色したブロックは、各ラウンド後に独立して進化したプールから単離した個々のクローンを表す。下線を付したクローンは続くラウンドの進化のために選択された。灰色のブロックは、増殖によって特徴付けられたクローンを表し、一部（Ｃ０２．６、Ｃ０４．７、Ａ１１．３、Ｅ７．２）をシーケンシングしたが、図Ｓ２においてさらなるＯＲＦ変異分析のために検討しなかった。進化した株のシーケンシング分析において同定した全ての変異のリストを、データファイルＳ１に提供する。Ｓｙｎ６１Δ３によるラウンド１で示されなかった１６の追加のクローンは、Ｇ５．２、Ｆ８．２、Ａ１１．１、Ｆ１１．３、Ｅ１０．１、Ｆ１１．１０、Ｆ５．２、Ｇ８．１、Ｄ１．２、Ｄ１１．１、Ｆ１１．８、Ｆ１１．２、Ｄ８．４、Ａ９．１、Ｆ８．１、Ｆ１１．６である。（Ｃ）Ｓｙｎ６１からＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）への株の発達の概略図である。セリン及びタンパク質終止をコードするコドンを、ｔＲＮＡのアンチコドン又はそれらを解読すると予想される終結因子に黒色の線でつなぐ；全ての配列は５’から３’に書かれている。対応するｔＲＮＡ及び終結因子をコードする遺伝子を黒色の枠で示す。本発明者らは、自動平行変異導入及び動的選択を実施して、より急速増殖型のＳｙｎ６１、Ｓｙｎ６１（ｅｖ１）を作製した。次に、この株を、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）へとさらに進化させた。各株において獲得した変異を、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ，open reading frame）における変異、非コード変異、及び遺伝子間領域の変異として分離する。株発達の際に獲得した全ての変異の詳細なリストに関しては、データファイルＳ１を参照されたい。ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ、及びｐｒｆＡの標的化欠失により、Ｓｙｎ６１Δ３を作製した。このプロセスにおいて、本発明者らは、２つの座で再配列を観察した：ｉ）４２９ｂｐの欠失をもたらすＣＲＩＳＰＲアレイの崩壊、及びii）リボソームオペロンｒｒｎＣの高度に相同なリボソームオペロンｒｒｎＢからの重複したセグメントによる部分的置き換え。ｗｔ Ｓｙｎ６１と比較した対応する変化は１９の変異に上る。さらに３ラウンドのその後の進化後、本発明者らはそれぞれ、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）、及びＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）を単離した。（Ｄ）約１７世代の変異導入による１ラウンドのＳｙｎ６１の進化後に増殖速度が増加した単離された４つのクローンの増殖速度である。９６の平行進化プール中２つ（Ｃ０２及びＣ０４）が、改善された増殖を有するクローンを生じた。同じプールから派生したクローン（Ｃ０２．５及びＣ０２．７、又はＣ０４．７及びＣ０４．４）の配列は、ほぼ同一であり、したがってそれらはクローン性であると考えられた。１より多くの変異を有するオープンリーディングフレームを図Ｓ２に記載する。増殖速度を、各株に関してｎ＝８の同型培養から計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。（Ｅ）Ｃ０４．４（Ｓｙｎ６１（ｅｖ１））の約１７世代の変異導入から出発する第２ラウンドのＳｙｎ６１の進化後に増殖速度が増加した単離された３つのクローンの増殖速度である。９６の平行進化プール中２つ（Ｅ１０及びＡ１１）が、改善された増殖を有するクローンを生じた。増殖速度を、各株に関してｎ＝８の同型培養から計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。（Ｆ）１１の独立したプールから派生した、約７０世代の変異導入による１ラウンドのＳｙｎ６１Δ３の進化後に増殖速度が増加した単離された２２個のクローンの増殖速度である。増殖速度を、各株についてｎ＝５の同型培養又はｎ＝１（赤色の星印で示す）の培養物について計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。（Ｇ）Ｆ１１．９（Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３））の約４５世代の変異導入から出発する第２ラウンドのＳｙｎ６１Δ３の進化後に増殖速度が増加した独立したプールから単離された７つのクローンの増殖速度である。増殖速度を、各株に関してｎ＝６の同型培養について計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。（Ｈ）Ｅ７．４（Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４））の約６０世代の変異導入から出発する第３ラウンドのＳｙｎ６１Δ３の進化後に増殖速度が増加した独立したプールから単離された５つのクローンの増殖速度である。増殖速度を、各株に関してｎ＝６の同型培養から計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。（Ｉ）最も進化したＳｙｎ６１派生物（derivative）（Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５））の倍加時間を、標準的な実験条件下で記録された増殖曲線から計算した。３つの独立した培養物を、振とうフラスコ中、３７℃で増殖させ、ＯＤ_６００の測定を、指数関数的な増殖の間１０分毎に行った。各独立培養物に関して、指数関数相の間の６０分のウィンドウを選択して、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）に関して平均増殖速度０．０２６±５×１０^－４、及び倍加時間３８．７２±１．０２分を計算した。統計学に関しては、方法を参照されたい。

【図7-1】～

【図7-2】（Ｓ２）オープンリーディングフレームが、Ｓｙｎ６１進化の間に１回より多く変異したことを示す図である。（Ａ）この解析に関して、本発明者らは、１４のクローンを選択し、１つは各プールからシーケンシングされたクローンであり、図Ｓ１Ｂに着色したブロックで示す。本発明者らは、単一の株又は進化的に関連する株においてＳｙｎ６１とＳｙｎ６１Δ３の間で１回より多く変異したオープンリーディングフレームを同定した。単一の株又は進化の歴史を通して関連する株に生じる変異は、独立でなくてもよい。例えば、Ｅ１０．４のｎｒｄＥに導入された有害なフレームシフト変異は、遺伝子が既に不活化されていることから、ｎｒｄＥにおける追加の変異が好都合であるように又は不都合であるように選択されないことを意味し得る。本発明者らは、平均で世代あたりｂｐあたり２×１０^－６の変異が、誘発されたランダム変異導入により導入されたことを観察した。平均すると、本発明者らは、変異導入及び選択のラウンドあたりゲノム内のＯＲＦに８７．２５の変異を蓄積した。各変異が独立であると仮定すると、同じオープンリーディングフレーム（大腸菌において３５５６のＯＲＦを与える）において少なくとも２つの変異を発見する確率は０．６５である。したがって、これらの変異は、偶然に同じＯＲＦで見出される可能性がないわけではない。本発明者らのデータは、それらが、再コード化された株の適合性を改善する広く多様な方法であることで一貫している。赤色の星印は、未成熟終止コドン及び典型的に１ｂｐの挿入又は欠失によるフレームシフトを含む有害な変異を示す。赤色の枠は、必須遺伝子を表示し、パネル（Ａ）及び（Ｂ）の緑色の枠は、ノックアウト後進化の際に１つの追加の変異によって影響を受けた遺伝子を表示する。進化した株のシーケンシング解析において同定された全ての変異のリストを、データファイルＳ１に提供する。（Ｂ）独立して派生した株におけるＳｙｎ６１とＳｙｎ６１Δ３の間で１回より多く変異したオープンリーディングフレーム。２３Ｓ ｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼであるｒｒｍＪは、最初の進化の間にＳｙｎ６１再コード化事象（Ｓ１９７）に非常に近位の互いに４０ｂｐ以内に２つのナンセンス変異（Ｐ１９０Ｌ、Ｖ２０３Ａ）を獲得した。平均すると、本発明者らは、変異導入及び選択のラウンドあたりゲノム内のＯＲＦにおいて８７．２５の変異を蓄積した。各変異が独立であると仮定すると、同じオープンリーディングフレーム（Ｓｙｎ６１において３５５６のＯＲＦを与える）において少なくとも２つの変異を発見する確率は０．６５である。したがって、これらの変異は、偶然に同じＯＲＦで見出される可能性がないわけではない。全体として、独立して進化した株に生じた変異の間に重複はほとんどなかった。本発明者らのデータは、それらが、再コード化された株の適合性を改善する広く多様な方法であることで一貫している。（Ｃ）単一の株又は関連する株におけるＳｙｎ６１Δ３とＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）との間で１回より多く変異したオープンリーディングフレーム。染色体分離に関与する必須の遺伝子であるｐａｒＥは、全体的に最高の変異数を蓄積した。パネル（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）の緑色の枠は、解読要素のノックアウト前にＳｙｎ６１進化の間で派生した株における１つの追加の変異によって影響を受けた遺伝子を表示する。平均すると、本発明者らは、変異導入及び選択のラウンドあたりゲノム内のＯＲＦにおいて６２．３の変異を蓄積した。各変異が独立であると仮定すると、同じリーディングフレーム（Ｓｙｎ６１において３５５６のＯＲＦを与える）において少なくとも２つの変異を発見する確率は０．４１である。したがって、これらの変異は、偶然に同じＯＲＦで見出される可能性がないわけではない。全体として独立して進化した株に生じた変異の間に重複はほとんどなかった。これらのデータは、それらが、再コード化された株の適合性を改善する広く多様な方法であることで一貫している。（Ｄ）同じ進化ラウンド内で独立して派生した株におけるＳｙｎ６１Δ３とＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の間で１回より多く変異したオープンリーディングフレーム。独立して進化した株において同じ進化ラウンド内で影響を受けたＯＲＦは、先祖に対する強い進化圧を示し得る。４つの同一の変異が、ラウンド２後に派生した全ての株においてｔｏｐＡに記録された。本発明者らは、Ｆ１１．９のシーケンシング後で株を個別の変異導入プールに分割する前に１ｂｐの欠失が起こったことを疑う。ｓｂｃＤ及びｎｕｏＧは、Ｓｙｎ６１Δ３の初回進化における独立した変異によって最も影響を受ける。全体として、独立して進化した株に生じた変異の間に重複はほとんどなく、再コード化された株の適合性を改善する広く多様な方法を示している。平均すると、本発明者らは、変異導入及び選択のラウンドあたりゲノム内のＯＲＦにおいて６２．３の変異を蓄積した。各変異が独立であると仮定すると、同じオープンリーディングフレーム（Ｓｙｎ６１において３５５６のＯＲＦを与える）における少なくとも２つの変異を発見する確率は０．４１である。したがって、これらの変異は、偶然に同じＯＲＦで見出される可能性がないわけではない。全体として独立して進化した株に生じた変異の間に重複はほとんどなかった。これらのデータは、それらが、再コード化された株の適合性を改善する広く多様な方法であることで一貫している。（Ｅ）個別の進化ラウンド内で独立して派生した株におけるＳｙｎ６１Δ３及びＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の間で１回より多く変異したオープンリーディングフレーム。２以下の変異が、Ｓｙｎ６１Δ３進化のラウンドにわたって独立して現れた。平均すると、本発明者らは、変異導入及び選択のラウンドあたりゲノム内のＯＲＦにおいて６２．３の変異を蓄積した。各変異が独立であると仮定すると、同じオープンリーディングフレーム（Ｓｙｎ６１において３５５６のＯＲＦを与える）において少なくとも２つの変異を発見する確率は０．４１である。したがって、これらの変異は、偶然に同じＯＲＦで見出される可能性がないわけではない。全体として独立して進化した株に生じた変異の間に重複はほとんどなかった。これらのデータは、それらが、再コード化された株のその適合性を改善する広く多様な方法であることで一貫している。

【図8-1】～

【図8-2】（Ｓ３）ファージの繁殖がＳｙｎ６１Δ３において除去されることを示す図である。（Ａ）Ｓｙｎ６１バリアントの感染４時間後の相対的総ファージ力価（図２Ｃを参照されたい）。感染に起因する遊離及び細胞内ファージの力価を、培養物からファージを単離し、単離物を連続希釈し、それを使用してプレート上で大腸菌ＭＧ１６５５に感染させることによって決定した。Ｓｙｎ６１Δ３、及びタンパク質合成、したがってファージ産生が阻害されるゲンタマイシン処置Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）の培養物は、４時間後に同じ量のファージを含有するが、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）及びＳｙｎ６１ΔＲＦ－１は、ファージを繁殖させ、感染をもたらす。示したプレートは、表記の希釈である。（Ｂ）タンパク質合成は、ゲンタマイシン処置細胞において除去される。Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）対照及びゲンタマイシンによって処置したＳｙｎ６１（ｅｖ２）を、^３５Ｓ－Ｍｅｔ／Ｃｙｓによって増殖させ、標識されたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びホスフォイメージングによって可視化した。ホスホスクリーンに２週間露出した後、ゲンタマイシン処置試料ではシグナルは観察されなかった。（Ｃ）Ｓｙｎ６１及びその派生物の感染時のＴ７ファージの総力価。培養物を、ファージにＭＯＩ＝５×１０^－５（感染多重度）で感染させ、総力価を４時間にわたってモニターした。（Ｄ）Ｔ７は、Ｓｙｎ６１バリアントを効率的に溶解したが、Ｓｙｎ６１Δ３を溶解しなかった。培養物をパネル（Ｃ）の通りに感染させ、ＯＤ_６００を４時間後に測定した。（Ｅ）図２Ｂと同様の、ファージλ、Ｐ１、Ｔ４、及びＴ７のゲノムにおけるＴＣＧ、ＴＣＡ、及びＴＡＧコドン密度の概略図。

【図9-1】～

【図9-3】（Ｓ４）ＭＳ－ＭＳスペクトルが、Ｓｙｎ６１Δ３において１、２、３、又は４個のＴＣＧコドンを含有するレポーターへの部位特異的非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の組み込みを確認することを示す図である。（Ａ）１１位でＢｏｃＫを含有するＵｂ_{１１ＴＣＧ}レポーター（Ｕｂ－（１１ＢｏｃＫ））（図３、Ｂ及びＣを参照されたい）を、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡによって精製し、トリプシン消化に供した後、ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ解析を行った（完全な詳細は方法を参照されたい）。トリプシンペプチドは、ＴＣＧコドンの１１位でのＢｏｃＫの部位特異的組み込みを確認する。（Ｂ～Ｃ）（Ａ）と同様の、Ｕｂ－（１１ＢｏｃＫ、６５ＢｏｃＫ）のＬＣ／ＭＳ－ＭＳ解析（図３、Ｄ及びＥを参照されたい）。トリプシンペプチドは、１１位（Ｂ）及び６５位（Ｃ）でＴＣＧコドンへのＢｏｃＫの部位特異的組み込みを確認する。（Ｄ～Ｅ）（Ａ）と同様の、Ｕｂ－（１１ＢｏｃＫ、１４ＢｏｃＫ、６５ＢｏｃＫ）のＬＣ／ＭＳ－ＭＳ解析（図３、Ｆ及びＧを参照されたい）。トリプシンペプチドは、１１位、１４位（Ｄ）及び６５位（Ｅ）でＴＣＧコドンへのＢｏｃＫの部位特異的組み込みを確認する。（Ｆ～Ｇ）（Ａ）と同様の、Ｕｂ－（９ＢｏｃＫ、１１ＢｏｃＫ、１４ＢｏｃＫ、６５ＢｏｃＫ）のＬＣ／ＭＳ－ＭＳ解析（図３、Ｈ及びＩを参照されたい）。残基９、１１、及び１４（Ｆ）を含有するトリプシンペプチドは、３つのＢｏｃＫ質量を有する正確な親イオン質量で見出された。この親イオンの断片化パターンは、１１及び１４位でＴＣＧコドンへのＢｏｃＫの部位特異的組み込みを確認したが、ＢｏｃＫを９位に局在化させるほど十分なｂ及びｙシリーズイオンはなかった。（Ｇ）トリプシンペプチドは、６５位でＴＣＧコドンへのＢｏｃＫの部位特異的組み込みを確認する。

【図10】（Ｓ５）Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）におけるセンスコドン及びアンバーコドン抑制のＧＳＴ－ＭＢＰ比較を示す図である。直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対及びその対応するｎｃＡＡを有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）細胞は、センスコドン又はアンバーコドンに応答して全長のＧＳＴ－ＭＢＰタンパク質を効率よく生成する。本発明者らは、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）細胞又はＭＤＳ４２細胞（対照）に、直交性ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ対をコードするプラスミド及び同族のＧＳＴ－ＸＸＸ－ＭＢＰレポーターをコードするプラスミドを共トランスフェクトした；ＸＸＸは、野生型（ｗｔ）コドン、ＴＣＧセンスコドン、又はＴＡＧ終止コドンのいずれかをコードし、及びＹＹＹは、その同族のアンチコドンを指す。ＢｏｃＫ（５ｍＭ）の非存在下（－）又は存在下（＋）でのＧＳＴ－ＸＸＸ－ＭＢＰ発現の誘発後、発現したタンパク質を、グルタチオンセファロースビーズによってプルダウンした。結合した試料を、還元グルタチオンによって溶出させ、得られた全長のＧＳＴ－ＭＢＰ又は切断型ＧＳＴ産物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）細胞におけるＴＣＧセンスコドン及びＴＡＧ終止コドンの両方に関して、効率的なＧＳＴ－ＭＢＰ全長の合成は、ＢｏｃＫの存在時に限って検出された（収量に関してはデータファイルＳ４を参照されたい）。

【図11】（Ｓ６）Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）が、９個のセンスコドンの、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）における非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）への再定義を可能にすることを示す図である。（Ａ）Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）は、ＥＬＰ_{９ｘ（ＴＣＧ）}における９個のＴＣＧコドンへの複数部位のｎｃＡＡの組み込みを可能にする。本発明者らは、直交性ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ対をコードするプラスミド及びＥＬＰ_{９ｘ（ＴＣＧ）}をコードするプラスミドを共形質転換した；これは、ＥＬＰコード化配列の９個のリピートを含有し、各リピートはＴＣＧコドンを含有し、Ｈｉｓ_６タグは、３’末端でコードされる。「VPGVGVPGVGVPGXGVPGVGVPGVG」の各ＥＬＰリピート（配列番号１）。プラスミドの配列は、GenBank受託番号ＭＷ８７９７３２であり、本明細書において配列番号２として提供され、２４の標準アミノ酸及び１つのｎｃＡＡ残基（Ｘ）を含有する。ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡプラスミドによって形質転換した細胞では、ＥＬＰ_{９ｘ（ＴＣＧ）}発現が、ＢｏｃＫの非存在下（－）又は存在下（＋）で誘発された。次に、本発明者らは、抗Ｈｉｓ_６抗体を使用して、正規化した細胞溶解物からの全長タンパク質（ＥＬＰ_{９ｘ（ＢｏｃＫ）}）産生をモニターし、効率的なＥＬＰ_{９ｘ（ＢｏｃＫ）}合成が、アラビノース（Ａｒａ）及びＢｏｃＫの両方の存在下に限って検出された。直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の効率に関する比較として、細胞を、ＥｃｔＲＮＡ^Ａｌａ _ＣＧＡをコードするプラスミド、ＴＣＧコドンに応答してアラニン組み込みを方向付けるＣＧＡアンチコドンを有するキメラアラニルｔＲＮＡによって個別に形質転換し、そこから本発明者らは、アラビノース（Ａｒａ）の存在下で効率的なＥＬＰ_{９ｘ（Ａｌａ）}の合成を検出した。ウェスタンブロットを、３回の生物学的反復実験で実施し、類似の結果を得た。（Ｂ）（Ａ）に記載した実験からのＮｉ^２＋－ＮＴＡ精製ＥＬＰ_{９ｘ（ＢｏｃＫ）}－Ｈｉｓ_６のＥＳＩ－ＭＳは、ＢｏｃＫの９個のＴＣＧコドンへの組み込みを確認する。理論的質量：２３２２２．３２Ｄａ；実測質量：２３２２１．８０Ｄａ．ＥＳＩ－ＭＳデータは１回収集した。

【図12-1】～

【図12-2】（Ｓ７）２重及び３重の非標準アミノ酸組み込みのために使用したａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の相互直交性を示す図である。（Ａ～Ｃ）図４及び図５における２重及び３重の別個の非標準アミノ酸組み込みのために使用したａａＲＳ／ｔＲＮＡ対は、相互に直交性である。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ対、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡ対及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ対を含有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）（それぞれ、ＣｂｚＫのＴＣＧへの組み込み、ＢｏｃＫのＴＣＡへの組み込み、及びｐ－Ｉ－ＰｈｅのＴＡＧへの組み込みを方向付ける）に、ＣｂｚＫ、ＢｏｃＫ及びｐ－ＩＰｈｅを提供した。細胞はまた、ＧＦＰ_３ＴＣＧ（パネルＡ）、ＧＦＰ_３ＴＣＡ（パネルＢ）、又はＧＦＰ_３ＴＡＧも含有した（パネルＣ）。ＧＦＰ_３ＴＣＧを含有する細胞から精製したＧＦＰ－Ｈｉｓ_６のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ解析は、ＣｂｚＫを組み込んだが、ＢｏｃＫ又はｐ－Ｉ－Ｐｈｅは組み込まなかった。ＧＦＰ_３ＴＣＡはＢｏｃＫの組み込みをもたらし、ＧＦＰ_３ＴＡＧは、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅの組み込みをもたらした。（Ｄ、Ｅ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡ対は、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）において別個のコドンに応答して別個のｎｃＡＡを組み込む。直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡは、各々、その別個の同族のコドンに応答してその別個の同族のｎｃＡＡを組み込む。ＧＦＰ_３ＸＸＸレポータープラスミドを有するＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）細胞におけるＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡの両方の存在下で、本発明者らは、ＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫの両方の存在下（＋／＋）でＧＦＰを発現させた。（Ｄ）Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ精製ＧＦＰ_３ＴＣＧのＥＳＩ－ＭＳは、ＡｌｌｏｃＫの組み込みに対応する質量を生じたが、ＣｂｚＫの組み込みに対応する質量は生じず、したがってその同族のｎｃＡＡ及び同族のコドンに関するＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡの直交性を実証している。（Ｅ）Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ精製ＧＦＰ_３ＴＡＧのＥＳＩＭＳは、ＣｂｚＫの組み込みに対応する質量を生じたが、ＡｌｌｏｃＫの組み込みに対応する質量を生じず、したがってその同族のｎｃＡＡ及び同族のコドンに関する１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡ対の直交性を実証している。

【図13-1】～

【図13-3】（Ｓ８）ＭＳ－ＭＳスペクトルが、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）における２重、２重－２重、及び３重のユビキチンレポーターへの別個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の部位特異的組み込みを確認することを示す図である。（Ａ、Ｂ）Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）２重（図４Ｂを参照されたい）、Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、１４ＣｂｚＫ、５７ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、６５ｐ－ＩＰｈｅ）２重－２重（図４Ｂを参照されたい）、及びＵｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＢｏｃＫ）３重（図４Ｄを参照されたい）ｎｃＡＡ組み込みを、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡによって精製し、トリプシン消化後にＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析に供して、別個のセンス及び終止コドンへの別個のｎｃＡＡの部位特異的組み込みを確認した（完全な詳細に関しては方法を参照されたい）。２重のＵｂ_{１１ＴＣＧ，６５ＴＡＧ}遺伝子への２重の別個のｎｃＡＡ組み込みに関して、精製タンパク質Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）は、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧコドン（Ａ）への、及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅの６５ＴＡＧコドン（Ｂ）への部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）Ｕｂ_{１１ＴＣＧ，１４ＴＣＧ，５７ＴＡＧ，６５ＴＡＧ}遺伝子における２重－２重の別個のｎｃＡＡ組み込みに関して、精製タンパク質Ｕｂ－（１１ＣｂｚＫ、１４ＣｂｚＫ、５７ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、６５ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）は、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧ及び１４ＴＣＧコドン（Ｃ）への、並びにｐ－Ｉ－Ｐｈｅの５７ＴＡＧ（Ｄ）及び６５ＴＡＧコドン（Ｅ）への部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｆ）Ｕｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}遺伝子への３重の別個のｎｃＡＡ組み込みに関して、精製タンパク質Ｕｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＢｏｃＫ）は、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅの９ＴＡＧコドンへの、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＢｏｃＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。

【図14】（Ｓ９）Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）における単一のタンパク質への３つの別個の非標準アミノ酸をコードする複数の例を示す図である。（Ａ）Ｓｙｎ６１におけるコドン再定義及び３重ｎｃＡＡ組み込みを実証するために使用した８個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の化学構造。数字は、（Ｂ）で提供されたｎｃＡＡの同一性を示す。（Ｂ）Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）における単一のタンパク質に３つの別個のｎｃＡＡをコードする７つの例。細胞を、Ｈｉｓ_６－タグＵｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}（又はｗｔ Ｕｂ）レポータープラス３つの相互直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドによって形質転換し、レポーターの発現を、ｎｃＡＡの非存在下（－）又は存在下（＋）でＬ－アラビノースの添加によって誘発した。全長のレポーター発現を、ＯＤ_６００分光光度法による測定によって正規化した等しい数の細胞から抗Ｈｉｓ_６抗体によるウェスタンブロットによって検出した。ｗｔ Ｕｂの発現及びＣｂｚＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ及びＢｏｃＫ／ＡｌｌｏｃＫ／ＣｙｐＫ／ＡｌｋＫ（レーン１～６）の組み込みに関して、細胞は、対１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡ及びＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡを含有した。ＡｌｌｏｃＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ及びＣｂｚＫ（レーン７及び８）の組み込みに関して、細胞は対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡ（参考文献J. N. Beyer et al., Overcoming Near-Cognate Suppression in a Release Factor 1-Deficient Host with an Improved Nitro-Tyrosine tRNA Synthetase. Journal of Molecular Biologyから））及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}ＵＧＡを含有した。ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、ＣｂｚＫ及びＡｌｌｏｃＫ／ＡｌｋＫ（レーン９～１１）の組み込みに関して、細胞は対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ、ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡ（参考文献K. C. Schultz et al., A Genetically Encoded Infrared Probe. Journal of the American Chemical Society 128, 13984-13985 (2006)から）及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＵＧＡを含有した。全ての例において、Ｕｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}の発現は、３つの同族のｎｃＡＡの提供に依存した。（Ｃ）本発明者らは、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）においてＮｉ^２＋－ＮＴＡビーズによってＵｂ－Ｈｉｓ_６レポーターを精製し（方法を参照されたい）、（Ｂ）で詳述した非天然アミノ酸の７つの異なる組合せのＥＳＩ－ＭＳ解析を実施した。各軌跡は、数字で示される位置で指定されたｎｃＡＡを有する異なるユビキチン種に対応する。Ｕｂ（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＢｏｃＫ）理論的質量：９８２０．９７Ｄａ；観察された質量：９８２０．８Ｄａ～１００Ｄａのピークは、ＢｏｃＫのｔｅｒｔブトキシカルボニルの喪失に対応する。Ｕｂ（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＡｌｌｏｃＫ）理論的質量：９８０４．９４Ｄａ；観察された質量：９８０５．０Ｄａ．Ｕｂ（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＣｙｐＫ）理論的質量：９８３０．９７Ｄａ；観察された質量：９８３０．８Ｄａ．Ｕｂ（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＡｌｋＫ）理論的質量：９８０２．８８Ｄａ；観察された質量：９８０３．０Ｄａ．Ｕｂ（９（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）、１１ＡｌｌｏｃＫ、１４ＣｂｚＫ）理論的質量：９７４０．０９Ｄａ；観察された質量：９７４０．０Ｄａ．Ｕｂ（９ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、１１ＡｌｌｏｃＫ、１４ＣｂｚＫ）理論的質量：９７２０．０９Ｄａ；観察された質量：９７２０．２Ｄａ．Ｕｂ（９ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、１１ＡｌｋＫ、１４ＣｂｚＫ）理論的質量：９７１７．９９Ｄａ；観察された質量：９７１８．６Ｄａ。ＥＳＩ－ＭＳデータを１回収集した。標的コドンに応答する３重のｎｃＡＡ組み込みのさらなる確認に関しては図Ｓ１０を参照されたい。収量に関してはデータファイルＳ４を参照されたい。

【図15-1】～

【図15-3】（Ｓ１０）６つの追加の３重の別個の非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）の組合せからのＭＳ－ＭＳスペクトルが、対象となる３つのｎｃＡＡのＵｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}レポーターへの部位特異的組み込みを確認することを示す図である。（Ａ）３つの別個のｎｃＡＡのＵｂ_{９ＴＡＧ，１１ＴＣＧ，１４ＴＣＡ}遺伝子への組み込みをコード化するために、本発明者らは、３つの直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を発現させ、及び対応する３つのｎｃＡＡをＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）細胞に添加した。ｎｃＡＡを含有するユビキチンを、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡによって精製し、トリプシン消化後にＬＣ／ＭＳ－ＭＳ解析に供し、別個のｎｃＡＡの別個のＴＣＧ、ＴＣＡ、及びＴＡＧコドンへの部位特異的組み込みを確認した（完全な詳細に関しては方法を参照されたい）。ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答したｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｂｚＫ、及びＡｌｌｏｃｋの３重のｎｃＡＡ組合せをコードするために、図４Ｄと同じａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用した。精製されたタンパク質Ｕｂ－（９ｐ－ＩＰｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＡｌｌｏｃＫ）は、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅの９ＴＡＧコドンへの、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＡｌｌｏｃＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｂ）ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答したｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｂｚＫ、及びＣｙｐＫの３重を組み込むｎｃＡＡ組合せに関して、図４Ｄと同じａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用した。精製タンパク質Ｕｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＣｙｐＫ）は、残基９（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）、１１（ＣｂｚＫ）、及び１４（ＣｙｐＫ）を含有する正確な親イオン質量を有するトリプシンペプチドを生じた。この親イオンの断片化パターンは、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＣｙｐＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みを確認したが、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅを９位に局在化するほど十分なｂ及びｙシリーズイオンが存在しなかった。（Ｃ）ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答したｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｂｚＫ、及びＡｌｋＫを組み込む３重ｎｃＡＡの組合せに関して、図４Ｄと同じａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用した。精製タンパク質Ｕｂ－（９ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、１１ＣｂｚＫ、１４ＡｌｋＫ）は、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅの９ＴＡＧコドンへの、ＣｂｚＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＡｌｋＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｄ）ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答した３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、ＡｌｌｏｃＫ、及びＣｂｚＫを組み込む３重のｎｃＡＡの組合せに関して、本発明者らは、直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡ（参考文献J. N. Beyer et al., Overcoming Near-Cognate Suppression in a Release Factor 1-Deficient Host with an Improved Nitro-Tyrosine tRNA Synthetase. Journal of Molecular Biologyから）、及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＵＧＡを使用した。精製タンパク質Ｕｂ－（９（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）、１１ＡｌｌｏｃＫ、１４ＣｂｚＫ）は、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒの９ＴＡＧコドンへの、ＡｌｌｏｃＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＣｂｚＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｅ）ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答したｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、ＡｌｌｏｃＫ、及びＣｂｚＫを組み込む３重のｎｃＡＡの組合せに関して、本発明者らは、直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ、ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡ（参考文献K. C. Schultz et al., A Genetically Encoded Infrared Probe. Journal of the American Chemical Society 128, 13984-13985 (2006)から）、及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＵＧＡを使用した。精製タンパク質Ｕｂ－（９ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、１１ＡｌｌｏｃＫ、１４ＣｂｚＫ）は、ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの９ＴＡＧコドンへの、ＡｌｌｏｃＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＣｂｚＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。（Ｆ）ＴＡＧ、ＴＣＧ、及びＴＣＡコドンにそれぞれ応答したｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、ＡｌｋＫ、及びＣｂｚＫを組み込む３重のｎｃＡＡの組合せに関して、パネル（Ｅ）と同じ直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用した。精製タンパク質Ｕｂ－（９ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、１１ＡｌｌｏｃＫ、１４ＣｂｚＫ）は、ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの９ＴＡＧコドンへの、ＡｌｋＫの１１ＴＣＧコドンへの、及びＣｂｚＫの１４ＴＣＡコドンへの部位特異的組み込みに対応するトリプシンペプチドを生じた。

【図16-1】～

【図16-2】（Ｓ１１）非標準の基本ステップ及びヘテロ四量体のコード化された細胞合成を示す図である（Ａ）ＢｏｃＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅで作製され、ＧＦＰの３位での挿入としてコードされるヘテロポリマー配列の合成にとって必要な基本ステップ。ＢｏｃＫ（モノマーＡ）及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅ（モノマーＢ）はそれぞれ、図５Ｂにおける再定義スキーム２（ｒ．ｓ．２）と同様に、対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧコドンに方向付けられる。重合化及びｓｆＧＦＰ発現はｎｃＡＡの培地への添加に依存した。（Ｂ）ＣｂｚＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅで作製され、図５Ｂにおける再定義スキーム３（ｒ．ｓ．３）と同様に、対１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるコード化基本ステップ。（Ｃ）ＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫで作製され、図５Ｂにおける再定義スキーム１（ｒ．ｓ．１）と同様に、対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるコード化基本ステップ。（Ｄ）図５と同様に、ＴＣＧ及びＴＡＧコドンを有するヘテロ四量体配列の遺伝子コード化の概略図。（Ｅ）ＢｏｃＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅで作製され図５Ｂにおける再定義スキーム２（ｒ．ｓ．２）と同様に、対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるコード化四量体。（Ｆ）ＣｂｚＫ及びｐ－Ｉ－Ｐｈｅで作製され、図５Ｂにおける再定義スキーム３（ｒ．ｓ．３）と同様に、対１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡ及びＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）／ＡｆｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるコード化四量体。（Ｇ）ＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫで作製され、図５Ｂにおける再定義スキーム１（ｒ．ｓ．１）と同様に、対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるコード化四量体。

【図17】（Ｓ１２）非標準ヘテロ八量体のコード化細胞合成を示す図である。（Ａ）ＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫで作製され、ｓｆＧＦＰの３位での挿入として合成された、図５Ｂにおける再定義スキーム１（ｒ．ｓ．１）と同様に、対ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ及び１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}ＣＵＡを使用してＴＣＧ及びＴＡＧにそれぞれ方向付けられるヘテロ八量体のコード化。（Ｂ）ＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫで構成されたコード化配列の重合化、及び得られたｓｆＧＦＰ－Ｈｉｓ６発現は、培地への両方のｎｃＡＡの添加に依存する。（Ｃ）８個の連続するｎｃＡＡの表記のセットを含有する精製されたｓｆＧＦＰ－（３ＡｌｌｏｃＫ、４ＣｂｚＫ、５ＡｌｌｏｃＫ、６ＣｂｚＫ、７ＡｌｌｏｃＫ、８ＣｂｚＫ、９ＡｌｌｏｃＫ、１０ＣｂｚＫ）のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ。Ｎ末端メチオニンの喪失及びアセチル化後の予想質量：２９６０８．２８Ｄａ；観察された質量：２９６０７．６０Ｄａ。ＥＳＩ－ＭＳデータを２回収集した。

【図18】（Ｓ１３）線状及び環状非標準ヘテロポリマーの切除を示す図である。ヘテロポリマーは、Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ及びＧｙｒＡインテイン（４１）－ＣＢＤ融合体との間でコードされ、発現され、及びＳＵＭＯ後のシステインの付加は自己環化を可能にする。単一のステップで、ペプチドは、Ｕｌｐ１及びＤＴＴの添加を通して切除又は環化される。Ｕｌｐ１は、急速にＮ末端ＳＵＭＯを除去するが、Ｃ末端ＧｙｒＡインテインは、ＤＴＴ又はＮ末端システインによるトランスチオエステル化を通して切断される。放出されたヘテロポリマーは、Ｃ１８カラムでの反応から精製することができ、又は不溶性の場合は、遠心分離によって、及び熱酸性メタノールによる抽出によって分離することができる。環化は、Ｎ→Ｓアシルシフトによってペプチド結合の形成を通して不可逆的であるが、ＤＴＴチオエステルは加水分解する。

【図19】ラムダファージに対するＲＦ１媒介（ΔＲＦ１）耐性は、ｓｓｒＡのＫＯ時に元に戻ることを示す図である。これとは逆に、トリプルノックアウト（Δ３）細胞におけるラムダファージ耐性はΔｓｓｒＡによって低減されない。

【図20-1】～

【図20-2】様々なａａＲＳの配列アライメントを提供することを示す図である。「^＊」は、全ての整列したａａＲＳ配列において見出される残基を示す。「：」は、整列させた配列間で強い類似性を有する残基を示し、及び「．」は、整列させた配列間の一部の類似性を示す残基を示す。Ｍｍは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）であり；Ｍｂは、メタノサルシナ・バルケリ（Methanosarcina barkeri）であり；１Ｒ２６は、メタノメチロフィルス種（Methano methylophilus sp.）である。１Ｒ２６；Ｌｕｍ１は、メタノマシリコッカス・ルミンエンシス（Methanomassiliicoccus luminyensis）１であり；Ｎｉｔｒｏは、ニトロソスフェリア・アルカエオン（Nitrososphaeria archaeon）であり；Ｔｒｏｎは、メタノナトロンアーカエウム・サーモフィルム（Methanonatronarchaeum thermophilum）であり；Ｇｅｍｍは、ゲンマティモナス門（Gemmatimonadetes）の細菌であり；ＰＧＡ８は、ペプトストレプトコッカス科（Peptostreptococcaceae）の細菌ｐＧＡ－８であり；Ｉ２は、デスルホスポロシヌス種（Desulfosporosinus sp.）Ｉ２であり；Ｃｌｏｓは、クロストリジウム目（Clostridiales）の細菌であり；Ｄ１２１は、デルタプロテオバクテリウム（Deltaproteobacteria）細菌であり；及びＤ４１６は、別のデルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacteria）である。

【発明を実施するための形態】

【0082】

本発明者らは、本明細書において、例えば内因性遺伝子の欠失によって原核細胞から第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを除去して、生存可能な細胞をもたらすことが可能であることを実証する。

【0083】

このように、本発明の第１の態様では、原核細胞であって、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；並びに第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含む原核細胞が提供される。

【0084】

内因性ｔＲＮＡは、内因性ｔＲＮＡが、その同族のコドン（複数可）を解読することを可能にする形態で存在しない場合、発現していないと考えられる。このように、内因性ｔＲＮＡは、原核細胞内で内因性ｔＲＮＡの機能的形態の産生を防止する任意の方法を使用して除去され得る。例えば、内因性遺伝子が欠失されてもよく、又は遺伝子の一部が発現を防止するために欠失されてもよい。調節配列を欠失させてもよく、又は発現を防止するように変更してもよい。或いは、ナンセンス、フレームシフト、又はミスセンス変異が、機能的形態でのｔＲＮＡの発現を防止してもよい。

【0085】

内因性ｔＲＮＡの除去は、ゲノムが、特定のタイプのセンスコドンの出現を除去するために再コード化されている原核細胞において実施される。「再コード化（Recoding）」とは、本明細書で使用される場合、コドンの出現がゲノムから除去されるように、あるタイプのコドンの出現を異なるコドンに置き換えることである。再コード化されたセンスコドンを、同義コドンに置き換えて、コードされるポリペプチドを変化させることなく、異なるコドン使用をもたらしてもよい。或いは、例えばコードされるポリペプチドの配列の変更が生存率に影響を及ぼさない場合、センスコドンを、非同義コドンに置き換えてもよい。欠失した内因性ｔＲＮＡは、再コード化の観点から不必要であるｔＲＮＡである。「不必要（Dispensable）」とは、本明細書で使用される場合、原核細胞の生存にとって必要ではないことを意味する。

【0086】

生存可能な原核細胞は、代謝的に活性であることが可能な細胞である。特定の実施形態では、本発明の生存可能な原核細胞は、適した培地中及び特定の種又は株の適した条件下で培養した場合に増殖することが可能であり得る。そのような原核細胞は、培養することが可能であると呼ばれ得る。一例として、原核細胞が大腸菌などの細菌細胞である場合、生存率の評価は、ＬＢ培地を含む培地中、又はＬＢアガーを含むアガー上、３７℃で前記細菌を培養することによって実施され得る。培地又はアガーに、２％グルコースを補充してもよい。細菌の増殖を、標準的なアプローチ、例えばＯＤ_６００の測定を使用してモニターしてもよい。代替のアプローチ、又は特定の原核細胞、細菌株、細菌種に適合させたアプローチ、又はマーカー遺伝子を含むことに関するアプローチは、当業者に公知である。

【0087】

置き換えられている（又は欠失している）１又は２以上のセンスコドンを解読するｔＲＮＡを欠失させてもよく、原核細胞は、ｔＲＮＡが、置き換えられている（又は欠失している）１又は２以上のセンスコドンのみを解読する場合；又は或いはｔＲＮＡが、置き換えられている（又は欠失している）１又は２以上のセンスコドン、及び置き換えられていない（又は欠失していない）１又は２以上のセンスコドンを解読する場合、ｔＲＮＡが、置き換えられていない（又は欠失していない）１又は２以上のセンスコドンが不必要である場合（すなわち、ｔＲＮＡが解読する１つ又は残りのセンスコドンは、１又は２以上の代替ｔＲＮＡによって解読される）、生存可能のままである。例えば、原核細胞のゲノムが、ＴＣＡセンスコドンを欠如する場合、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡをコードするｓｅｒＴを欠失させてもよく、及び／又はゲノムがＴＣＧセンスコドンを欠如する場合、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡをコードするｓｅｒＵを欠失させてもよい。このように、一実施形態では、原核細胞は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡもｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡも発現しない。

【0088】

再コード化される第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現数は、原核細胞の生存率を維持しながら前記センスコドンに対応する同族のｔＲＮＡの除去を可能にするために妥当である。例えば、これは、必須遺伝子からの第１及び第２のタイプのセンスコドンの全ての出現を除去することによって達成され得る。遺伝子の産物が原核細胞の生存にとって必要である場合、遺伝子は、本明細書で使用される場合、「必須」である。例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的形態の発現の防止が原核細胞の非生存をもたらす場合、遺伝子は、必須であると考えられる。特に、遺伝子内の「ブランク」コドン（すなわち、細胞が対応するｔＲＮＡ又は終結因子を含有しないコドン）が細胞生存率の喪失をもたらす場合、遺伝子は必須であると考えられる。したがって、一実施形態では、生存率を失うことなくブランクコドンを認容することができない原核細胞の遺伝子は全て再コード化されるが、ブランクコドンを認容することができる遺伝子は再コード化されなくてもよい。このように、当業者は、同族のｔＲＮＡが不必要であるか否かを評価することによって、全ての必須遺伝子が再コード化されているか否かを評価することができる。

【0089】

特定の実施形態では、原核細胞であって、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；原核細胞の必須遺伝子が第１のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、及び第１の内因性ｔＲＮＡが、第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであり；及び原核細胞の必須遺伝子が第２のタイプのセンスコドンの出現を含有せず、及び第２の内因性ｔＲＮＡが、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、原核細胞が提供される。

【0090】

特定の実施形態では、ゲノムは、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現を含まない、１００以上、２００以上、又は３００以上の必須遺伝子を含む。例えば、ゲノムにおける全て又は実質的に全ての必須遺伝子が、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現を含まなくてもよい。

【0091】

一部の実施形態では、必須遺伝子は、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌＤ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎＤ、ｐｔｈ、ｐｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒＥ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｈｂＶ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｇｐｓＡ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏＴ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、及びｄｎａＣからなるリストの１又は２以上から選択され得る。

【0092】

特に、必須遺伝子は、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌＤ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎＤ、ｐｔｈ、ｐｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒＥ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｈｂＶ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｇｐｓＡ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏＴ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、及びｄｎａＣからなるリストの１又は２以上から選択され得る。

【0093】

他の実施形態では、本発明の原核細胞は、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの５以下の出現を含むゲノムを含み得る。ゲノムは、親ゲノムから派生してもよく、又は第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現の１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満を含んでもよい。ゲノムは、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現を含まない、１００以上、２００以上、又は１０００以上の遺伝子を含み得る。特にゲノムにおける全て又は実質的に全ての遺伝子が、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現を有しなくてもよい。

【0094】

このように、特定の実施形態では、原核細胞であって、原核細胞が第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず；原核細胞のゲノムが、第１のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、及び第１の内因性ｔＲＮＡが、第１のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡであり；並びに原核細胞のゲノムが、第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含むか、又は出現を含まず、及び第２の内因性ｔＲＮＡが、第２のタイプのセンスコドンの同族のｔＲＮＡである、原核細胞が提供される。

【0095】

特定の実施形態では、ゲノムは、第１のタイプのセンスコドンの出現を含まず、及び第２のタイプのセンスコドンの出現を含まない。

【0096】

ゲノムは、親ゲノムから派生してもよく、天然の第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの５以下（例えば、５、４、３、２、若しくは１）の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。特定の実施形態では、ゲノムは、親ゲノムから派生し、天然の第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現を含まない。

【0097】

一部の実施形態では、ゲノムは、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１５００以上、又は２０００以上の再コード化された遺伝子を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、翻訳の証拠及び／又は予想されるタンパク質産物の証拠が存在する遺伝子である。例えば、ゲノムは、翻訳の証拠及び／又は予想されるタンパク質産物の証拠が存在する、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１５００以上、又は２０００以上の再コード化された遺伝子を含み得る。

【0098】

一実施形態では、ゲノム内の全てのアノテートされたオープンリーディングフレームは、第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現を有しない。本発明の原核細胞は、細菌細胞、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌のゲノムは、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１にアノテートされているように、第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよい。

【0099】

特定の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は、第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現を有しない。特定の実施形態では、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの残りの出現のいずれからもタンパク質は翻訳されず、及び／又は第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの残りの出現を含む遺伝子は、推定の又は非コード遺伝子である。一部の実施形態では、第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの残りの出現を含む遺伝子の翻訳は、低減される及び／又は防止される（例えば、遺伝子は、５’配列に終止コドンを含み得る）。

【0100】

センスコドンの任意の残りの出現は、ゲノムが確実に生存可能であるために必要であり得る。例えば、ゲノムにおける第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの１又は２以上、特に全ての残りの出現は、必須遺伝子の調節エレメントに存在し得る；並びに／又は第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの１又は２以上、特に全ての残りの出現は、翻訳の証拠又は予想されるタンパク質産物の証拠が存在しない遺伝子（すなわち、推定の又は非コード遺伝子）に存在し得る。

【0101】

本明細書で使用される場合、「センスコドン」は、アミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットである。このように、センスコドンは、遺伝子予測によって、すなわちタンパク質をコードするゲノムの領域（すなわち、遺伝子）及び対応するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定することによって、ゲノムにおいて同定され得る。典型的に、ゲノムは、天然に６１のセンスコドン：ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＧ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＡＴＧ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＴＧＧ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、及びＧＴＧ（ＤＮＡのコード鎖上で５’から３’に読み取る）を含む。標準的な遺伝子コードは、６１のトリプレットコドンを使用して２０の標準アミノ酸をコードする。アミノ酸２０個中１８個は、１つより多くの同義コドンによってコードされる。第１又は第２のタイプのセンスコドンは天然のセンスコドン、すなわち、親ゲノムに存在するセンスコドンであり得る。

【0102】

ＤＮＡにおける６１のセンスコドンは、その対応するｍＲＮＡに転写され、その後１又は２以上のｔＲＮＡによって解読される。ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ中のセンスコドンによって方向付けられるようにアミノ酸をリボソームへと運ぶ。ｔＲＮＡは、相補的アンチコドンを介して１又は２以上のセンスコドンを認識し得る。センスコドンの配列はその後、ポリペプチド（すなわち、アミノ酸の配列）へと翻訳される。大腸菌ゲノムにおけるコドン及びアンチコドンの相互作用は、国際公開第２０２０／２２９５９２号パンフレット（参照により本明細書に組み入れられる）の図１７に示される。

【0103】

第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンをゲノム全体に除去するが、他のセンスコドンを除去しないことは、前記第１又は第２のタイプのセンスコドンに対応する同族のｔＲＮＡを、ゲノムに残っているセンスコドンを解読する能力を除去することなく、欠失させることを可能にする。

【0104】

セリンのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、その同族のｔＲＮＡのアンチコドンを認識しない。これは、内因性のシンテターゼによるミスアミノアシル化を方向付けない同族のアンチコドンを有するｔＲＮＡの導入を通して新規アミノ酸へのコドンの定義を容易にし得る。このように、再コード化されたセンスコドンは、ＴＣＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ、又はＡＧＣから選択され得る。特定の実施形態では、第１及び第２のタイプのセンスコドンは、ＴＣＡ及びＴＣＧである。

【0105】

センスコドンの除去を達成するために、それらを同義センスコドンに置き換えてもよい。これは、コードされるタンパク質配列を確実に変化させないために好ましい。例えば、原核細胞は、親ゲノムにおける第１又は第２のタイプのセンスコドンの出現の９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％が同義センスコドンに置き換えられているゲノムを有し得る。当業者は、適切な同義センスコドンの置き換えを推定することができる。例えば、大腸菌において、典型的にＴＣＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ及びＡＧＣは全て、セリンをコードする。

【0106】

一部の実施形態では、置き換えは規定の置き換えであり、すなわち１つのセンスコドンが単一の同義センスコドンに置き換えられる。好ましくは、親ゲノムにおける第１又は第２のタイプのセンスコドンの出現の９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、又は１００％が規定の（すなわち、単一の）同義センスコドンに置き換えられる。

【0107】

例えば、規定の置き換えは、ＴＣＧの、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ、又はＡＧＣのいずれか１つによる置き換え；又はＴＣＡの、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ、又はＡＧＣのいずれか１つによる置き換えであり得る。

【0108】

特に、置き換えは、ＴＣＧのＡＧＴ若しくはＡＧＣのいずれかへの置き換え；又はＴＣＡのＡＧＴ若しくはＡＧＣのいずれか１つへの置き換えの１又は２以上から選択される。特定の実施形態では、ＴＣＧは、ＡＧＣに置き換えられ、及びＴＣＡはＡＧＴに置き換えられる。

【0109】

好ましくは、これらのコドン置き換えのいずれも、大腸菌において高度に保存された制御配列であるリボソーム結合部位（ＡＧＧＡＧＧ）に影響を及ぼさない。選択されたコドン置き換えを、小さい試験領域（例えば、必須の標的遺伝子及び標的コドンの両方において豊富なゲノムの２０ｋｂ領域）において試験して、生存率を評価してもよい。コドンの置き換えが、小さい試験領域で実行可能でない場合、それらを無視してもよい。

【0110】

親ゲノムにおけるセンスコドンの既定の置き換えによる同義センスコドンとの置き換えが生存可能な原核細胞をもたらさない場合、代替の置き換え同義センスコドンを使用してもよい。例えば、親ゲノムにおける第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現の９９．９％が、規定の（すなわち、単一の）同義センスコドンに置き換えられてもよく、及び残りの０．１％が代替の同義センスコドンに置き換えられてもよい。例えば、ＴＣＧの出現の９９．９％が、ＡＧＣに置き換えられてもよく、０．１％が、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ、若しくはＡＧＣに置き換えられてもよく；及び／又はＴＣＡの出現の９９．９％が、ＡＧＴに置き換えられてもよく、０．１％が、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴ若しくはＡＧＣに置き換えられてもよい。

【0111】

一部の例では、センスコドンの特定の出現を、生存率に影響を及ぼすことなく、潜在的同義センスコドンのいずれかに置き換えなくてもよい。生存率を保持するために、センスコドンを生存率に影響を及ぼさない非同義センスコドンと置き換えてもよい。例えば、親ゲノムにおける第１及び／又は第２のタイプのセンスコドンの出現の９９．９％を、規定の（すなわち、単一の）同義センスコドンに置き換えてもよく、残りの０．１％を代替の非同義センスコドンに置き換えてもよい。

【0112】

本発明者らは、さらに、得られた細胞が、少なくとも２つの内因性ｔＲＮＡを発現しないように、及び少なくとも１つの内因性終結因子を発現しないように、生存率を保持しながら本発明の原核細胞から内因性の終結因子を除去することが可能であることを実証している。このように、一実施形態では、原核細胞は、第１の内因性終結因子を発現せず、第１のタイプの終止コドンは、第１の内因性終結因子が不必要であるように原核細胞のゲノム内で再コード化されている。

【0113】

第１の内因性終結因子の除去は、ゲノムが、第１のタイプの終止コドンの出現を除去するために再コード化されている原核細胞において実施され得る。任意で、除去された終止コドンを同義コドンに置き換える。欠失させた内因性終結因子は、再コード化に関して不必要である因子である。

【0114】

特定の実施形態では、原核細胞であって、原核細胞が第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び第１の内因性終結因子を発現せず；並びに原核細胞のゲノムが、第１及び第２の内因性ｔＲＮＡが同族である複数のセンスコドンを除去するために、及び第１の内因性終結因子が同族である複数の終止コドンを除去するために、再コード化されている原核細胞が提供される。

【0115】

内因性終結因子は、内因性終結因子が、その同族のコドン（複数可）を解読することを可能にする形態で存在しない場合、発現していないと考えられる。このように、内因性終結因子は、原核細胞内の内因性終結因子の機能的形態の産生を防止する任意の方法を使用して除去され得る。例えば、発現を防止するために、内因性遺伝子を欠失させてもよく、又は遺伝子の一部を欠失させてもよい。発現を防止するために、制御配列を欠失又は変更してもよい。或いは、ナンセンス、フレームシフト、又はミスセンス変異は、機能的形態での終結因子の発現を防止し得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、「終止コドン」は、タンパク質への翻訳の終止をコードするヌクレオチドトリプレットである。典型的に、ゲノムは天然に、３つの終止コドン：ＴＡＡ（「オークル（ochre）」）、ＴＧＡ（「オパール（opal）」又は「褐色（umber）」）及びＴＡＧ（「アンバー（amber）」）。を含む。

【0117】

除去される第１のタイプの終止コドンの出現数は、原核細胞の生存率を維持しながら前記終止コドンに対応する同族の終結因子の除去を可能にするために妥当である。

【0118】

このように、一部の実施形態では、原核細胞の必須遺伝子は、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しない。必須遺伝子は、本明細書で考察される任意の遺伝子、特に第１又は第２のタイプのセンスコドンの除去に関連して考察される遺伝子であり得る。特定の実施形態では、ゲノムは、第１のタイプの終止コドンの出現を含まない、１００以上、２００以上、又は３００以上の必須遺伝子を含む。例えばゲノムにおける全て又は実質的に全ての必須遺伝子が、第１のタイプの終止コドンの出現を含まなくてもよい。

【0119】

例えば、ゲノムは、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び第１のタイプの終止コドンの出現を含まない、１００以上、２００以上、又は３００以上の必須遺伝子を含み得る。特に、ゲノムにおける全て又は実質的に全ての必須遺伝子が、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び第１のタイプの終止コドンの出現を含まなくてもよい。

【0120】

一部の実施形態では、ゲノムは、第１のタイプの終止コドンの１０以下、若しくは５以下の出現を含むか、又は出現を含まない。例えば、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の例を含むか、又は例を含まない。

【0121】

特定の実施形態では、第１のタイプの終止コドンはＴＡＧであり、及び第１の内因性終結因子はＲＦ－１である。そのような実施形態ではアンバー終止コドン（ＴＡＧ）の１０以下、若しくは５以下の出現が存在してもよく、又は出現が存在しなくてもよい。他の例では、親ゲノムにおけるＴＡＧの９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は全ての出現が、ＴＡＡ（オークル終止コドン）に置き換えられる。特定の実施形態では、ゲノムは、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）の出現を含まず、任意で親ゲノムにおけるＴＡＧの全ての出現が、ＴＡＡ（オークル終止コドン）に置き換えられる。

【0122】

一実施形態では、ゲノム内の全てのアノテートされたオープンリーディングフレームは、第１のタイプの終止コドンの出現を有しない。本発明の原核細胞は、細菌細胞、好ましくは大腸菌であってもよく、大腸菌のゲノムは、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１にアノテートされているように、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しなくてもよい。

【0123】

特定の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は、第１のタイプの終止コドンの出現を有しない。特定の実施形態では、第１のタイプの終止コドンの残りの出現のいずれからもタンパク質は翻訳されず、及び／又は第１のタイプの終止コドンの残りの出現を含む遺伝子は、推定の又は非コード遺伝子である。一部の実施形態では、第１のタイプの終止コドンの残りの出現を含む遺伝子の翻訳は、低減及び／又は防止される（例えば、遺伝子は５’配列に終止コドンを含み得る）。

【0124】

第１のタイプの終止コドンの任意の残りの出現は、ゲノムが生存可能であることを確保するために必要であり得る。例えば、ゲノムにおける第１のタイプの終止コドンの１又は２以上、特に全ての残りの出現が、必須遺伝子の制御エレメントに存在してもよく；及び／又は第１のタイプの終止コドンの１又は２以上、特に全ての残りの出現が、翻訳の証拠又は予想されるタンパク質産物の証拠が存在しない遺伝子（すなわち、推定又は非コード遺伝子）に存在し得る。

【0125】

したがって、一部の実施形態では、ゲノムは、第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現を含まず、及び１つの終止コドン、好ましくはアンバー終止コドン（ＴＡＧ）の出現を含まない。特定の実施形態では、ゲノムは、センスコドンＴＣＧ及びＴＣＡの出現を含まず、及びアンバー終止コドン（ＴＡＧ）の出現を含まず、任意で親ゲノムにおけるＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧは、同義コドンに置き換えられ、例えば親ゲノムにおけるＴＣＧの出現の９９．９％以上が、ＡＧＣに置き換えられ、親ゲノムにおけるＴＣＡの出現の９９．９％以上がＡＧＴに置き換えられ、及び親ゲノムにおけるＴＡＧの出現の全てがＴＡＡに置き換えられる。

【0126】

特定の実施形態では、原核細胞のゲノムは、センスコドンＴＣＧがＡＧＣに置き換えられているように、センスコドンＴＣＡがＡＧＴに置き換えられているように、及び終止コドンＴＡＧがＴＡＡに置き換えられているように再コード化されており、及び十分数の前記コドンが、２つの同族のｔＲＮＡ及び同族の終結因子が不必要であるように再コード化されている。

【0127】

特定の実施形態では、本発明の原核細胞は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡ、又はＲＦ－１を発現しない大腸菌細胞であり、センスコドンＴＣＡの出現は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡが不必要である（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＡの出現がＡＧＴに置き換えられている）ように再コード化されており、センスコドンＴＣＧの出現は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが不必要である（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＧの出現がＡＧＣに置き換えられている）ように再コード化されており、及び終止コドンＴＡＧの出現は、ＲＦ－１が不必要である（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＡＧの出現がＴＡＡに置き換えられている）ように再コード化されている。原核細胞はまた、ＴＣＡ、ＴＣＧ、及びＴＡＧコドンを解読することが可能な第１、第２，及び第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含むように、並びにポリマー形成の際にそのような部位に非標準アミノ酸を取り込むように改変されていてもよい。

【0128】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１に提供される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、ゲノムは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが機能的に発現しないように（例えば、ｓｅｒＴ及びｓｅｒＵを欠失させることによって）さらに変更されている。ゲノムは、ＲＦ－１が機能的に発現しないように（例えば、ｐｒｆＡを欠失させることによって）さらに変更されていてもよい。GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１に従うゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１ ＷＴと呼ぶ。

【0129】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、ゲノムは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが機能的に発現しないように（例えば、ｓｅｒＴ及びｓｅｒＵを欠失させることによって）さらに変更されている。ゲノムは、ＲＦ－１が機能的に発現しないように（例えば、ｐｒｆＡを欠失させることによって）さらに改変されていてもよい。配列番号３に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１（ｅｖ１）と呼ぶ。

【0130】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含み、ゲノムは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが機能的に発現しないように（例えば、ｓｅｒＴ及びｓｅｒＵを欠失させることによって）さらに変更されている。ゲノムは、ＲＦ－１が機能的に発現しないように（例えば、ｐｒｆＡを欠失させることによって）さらに改変されていてもよい。配列番号４に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１（ｅｖ２）と呼ぶ。

【0131】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。配列番号５に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１Δ３と呼ぶ。

【0132】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。配列番号６に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）と呼ぶ。

【0133】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。配列番号７に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）と呼ぶ。

【0134】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞のゲノムは、配列番号８（GenBank受託番号ＣＰ０７１７９９．１としても提供される）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。配列番号８に記載のゲノムを含む大腸菌株を、本明細書に開示される実施例においてＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）と呼ぶ。

【0135】

本明細書において、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを含む原核細胞が提供される。原核細胞は、細菌、例えば大腸菌である。一部の実施形態では、配列同一性パーセンテージの計算は、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対又は複数の直交性対の発現を可能にするために挿入されている任意の配列を除外する。配列同一性パーセンテージの計算は、ゲノムにさらに導入されている任意の外因性配列もさらに除外し得る。１００％未満の同一性を有するゲノムは、本明細書に開示される再コード化されたセンスコドン及び終止コドンを含んでもよく、したがってそのような実施形態では、バリエーションは、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、又は第１のタイプの終止コドンを再導入しない。

【0136】

本発明者らは、前記原核細胞の産生の際に特定のステップを講じなければ、再コード化されたゲノムを有する、又は第１及び／若しくは第２の内因性ｔＲＮＡを欠如する原核細胞が、増殖欠損を有し得ることを同定した。これらのステップを、本明細書に記載する。

【0137】

本発明者らは、変異導入を誘発する何らかの方法、例えば変異導入プラスミドの使用を伴う方法が、本発明の原核細胞において機能的ではないことにさらに注目した。本発明者らは、具体的に適合させた試薬の提供を通してこの問題を克服している。

【0138】

このように、特定の実施形態では、原核細胞の増殖速度は、親株の参照原核細胞の増殖速度より速い。

【0139】

増殖速度は、本発明の原核細胞の細胞培養物、及び参照原核細胞の細胞培養物を調製すること、並びに培養培地の吸光度の変化の割合を比較することによって比較され得る。一部の実施形態では、原核細胞は細菌細胞、例えば大腸菌であり、及び増殖速度は、ＬＢ培地中、３７℃、２５℃、又は４２℃での倍加時間を決定することによって比較される。本発明の原核細胞の倍加時間は、参照原核細胞の倍加時間より１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、又は３倍速くなり得る。

【0140】

「親株」は、本発明の原核細胞の発達の一部として存在するか、又は作製された株である。したがって、本発明の原核細胞は、親株から直接又は間接的に派生する。親株はまた、「祖先系統（progenitor strain）」とも呼ばれ得る。

【0141】

親株は、特定のタイプのセンスコドン及び／又は終止コドンを除去するためにゲノムの再コード化時であるがさらなるステップを講じる前に得られた原核細胞株であり得る。親株は、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び第１のタイプの終止コドンが、本発明の原核細胞と同じ方法で再コード化されているゲノムを含んでもよく、親株は、全ての内因性ｔＲＮＡｓ及び終結因子を含有する。例えば、親株は、ＴＣＧ、ＴＣＡ、及びＴＡＧコドン数を除去又は低減するためにゲノムの再コード化時に得られた株であり得る。特定の実施形態では、親株はＳｙｎ６１であってもよく、又はＳｙｎ６１（すなわち、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１の配列）のゲノムを含んでもよい。

【0142】

親株は、第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び／又は終結因子の除去時であるが、さらなるステップを講じる前に得られた原核細胞株であり得る。例えば、親株は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡ、及びＲＦ－１の除去時に得られた株であり得る。特定の実施形態では、親株は、Ｓｙｎ６１Δ３であってもよく、又はＳｙｎ６１Δ３（配列番号５）のゲノムを含んでもよい。

【0143】

本発明者らは、本発明の原核細胞がファージに耐性であることを実証する本明細書の実験データを提供する。細胞ｔＲＮＡの除去がファージ耐性を提供することは以前に仮説が立てられていたが、本発明者らは、第１の及び第２の内因性ｔＲＮＡの除去が、完全な耐性を提供することを見出した。ファージ耐性のこのレベルは、これらの２つのｔＲＮＡを除去する相加効果から予測されるレベルを超えている。特定の理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、内因性ｔＲＮＡが、それらが解読することができるコドンにおいて重複すること、及びｔＲＮＡがコドンに会合することが通常既知ではない場合であっても何らかの程度の読み飛ばしが起こり得ることに注目する。そのため、第１及び第２の内因性ｔＲＮＡの除去は、相乗作用を示して完全に耐性の原核細胞を提供する。

【0144】

先の段落に加えて、本発明者らは、本明細書において本発明の原核細胞が、ウイルス繁殖のレスキューをもたらし得る変異の蓄積に対してより耐性であることを実証するデータを提供する。例えば、本発明者らは、少なくとも何らかのファージ耐性を有する他の株において遺伝子ｓｓｒＡをノックアウトすることが、ウイルス繁殖をレスキューすることができることに注目する。これに対し、本発明の原核細胞からのｓｓｒＡのノックアウトは、ウイルス繁殖をレスキューしない（図１９）。そのため、本発明の原核細胞は、たとえさらなる変異が蓄積する場合であっても、驚くほど強力なファージ耐性を実証する。

【0145】

したがって、一実施形態では、本発明の原核細胞は、ファージ感染に対して耐性である。ファージは、ゲノムにおいて第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び／又は第１のタイプの終止コドンを含有する任意のファージであり得る。例えば、本発明の原核細胞は、Ｔ４ファージ、Ｔ６ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、又はＰ１ｖｉｒファージに対して耐性であり得る。一部の実施形態では、本発明の原核細胞は、これらの例の５つ全てに対して耐性である。

【0146】

本発明の原核細胞は、遺伝子の水平伝播、例えばＦプラスミドの水平伝播に対して耐性であり得る。

【0147】

本発明の原核細胞は、親株の細胞である参照原核細胞より感染又は遺伝子の水平伝播に対して耐性であり得る。親株は、本明細書に記載される任意の株であり得る。

【0148】

一部の実施形態では、本発明の原核細胞は、ファージに対して完全に耐性である。原核細胞は、Ｔ４ファージ、Ｔ６ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、及びＰ１ｖｉｒファージに対して完全に耐性であり得る。「完全に耐性」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の原核細胞の培養物の増殖速度が前記培養物中の関連するファージを含むことによって実質的又は完全に影響を受けないことを意味する。対照は、同量の殺滅されたファージを含むことであり得る。関連するファージは、原核細胞の親株を感染させることが可能であるファージであろう。

【0149】

特定の実施形態では、本発明の原核細胞は、細菌細胞である。細菌細胞は、異種タンパク質産生、特に１つ又は２以上の非標準アミノ酸を含むポリペプチドの産生にとって適切な任意の種の細胞であり得る（例えば、Ferrer-Miralles, N. and Villaverde, A., 2013. Microbial Cell Factories, 12:113に記載されているもの）。適切な細菌宿主細胞としては、エスケリキア属（escherichia）（例えば、大腸菌）、カウロバクテリア（caulobacteria）（例えば、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus））、光栄養細菌（例えば、ロドバクター・スフェロイデス（Rodhobacter sphaeroides））、低温適応細菌（例えば、シュードアルテロモナス・ハロプランクチス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、シェワネラ種（Shewanella sp）株Ａｃ１０）、シュードモナス菌（pseudomonads）（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、好塩性細菌（例えば、ハロモナス・エロンガタ（Halomonas elongate）、クロモハロバクター・サレキシゲンス（Chromohalobacter salexigens））、ストレプトマイセス属（streptomycetes）（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus））、ノカルジア属（nocardia）（例えば、ノカルジア・ラクタムデュランス（Nocardia lactamdurans））、マイコバクテリア属（mycobacteria）（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis））、コリネフォーム（coryneform）細菌（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum））、バシラス綱（bacilli）（例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens））、ビブリオ（vibrio）菌（例えば、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）、ビブリオ・ナトリゲンス（Vibrio natriegens））、及び乳酸菌（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバシラス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバシラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri））が挙げられる。一部の実施形態では、細菌は、グラム陰性菌である。

【0150】

特定の実施形態では、細菌は、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、又は志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）である。より好ましくは、細胞は大腸菌である。適切な大腸菌細胞としては、Ｋ－１２、ＭＧ１６５５、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＡＤ４９４、Ｏｒｉｇａｍｉ、ＨＭＳ１７４、ＢＬＲ（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）、Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＳＨｕｆｆｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、及びｍ１５ ｐＲＥＰ４、又はそれらの派生物（Rosano, G.L. and Ceccarelli, E.A., 2014. Frontiers in microbiology, 5, p.172）．が挙げられる。特に、細胞は、ＭＧ１６５５又はＢＬ２１、又はその派生物であり得る。ＭＧ１６５５は、大腸菌の野生型株であると考えられている。この株のゲノム配列のGenBankＩＤは、Ｕ０００９６である。ＢＬ２１は、広く市販されている。例えば、これは、New England BioLabs社のカタログ番号Ｃ２５３０Ｈから購入することができる。

【0151】

原核細胞は、同じ種又は株から派生するゲノムを含有し得るか、又は異なる種から派生し得る。例えば、原核細胞が大腸菌である場合、ゲノムは大腸菌ゲノムであり得る。

【0152】

直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む原核細胞
本発明者らは、本明細書において、直交性対を形成する第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡが、内因性ｔＲＮＡを置き換えるために本発明の原核細胞に導入され得ることを実証する実験データを提供する。第１の直交性ｔＲＮＡは、ゲノムから除去されているタイプのセンスコドンを解読してもよく、例えば、第１のタイプのセンスコドンは、本明細書に開示される任意の方法でゲノムから除去されていてもよい。第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、非標準アミノ酸であり得るアミノ酸によって直交性の同族のｔＲＮＡを特異的にアミノアシル化する。したがって、原核細胞は、第１のタイプのセンスコドンが非標準アミノ酸をコードするために再利用されるように、内因性ｔＲＮＡが、第１の直交性ｔＲＮＡに置き換えられているシステムを含有し得る。

【0153】

加えて、本発明者らは、本明細書において、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対及び第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対が、本発明の原核細胞に導入され得ることを実証する実験データを提供する。第１のｔＲＮＡは、ゲノムから除去されたセンスコドンの１つを解読してもよく、及び第２のｔＲＮＡは、他のセンスコドンを解読してもよい。直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、その直交性の同族のｔＲＮＡを、非標準アミノ酸であり得るアミノ酸によって特異的にアミノアシル化する。したがって、原核細胞は、２又は３以上のセンスコドンが、非標準アミノ酸をコードするために再利用されているシステムを含有し得る。

【0154】

終止コドンが再コード化されている細胞において、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を、原核細胞に導入し、第３の非標準アミノ酸をコードするために再コード化された終止コドンを使用することを可能にしてもよい。したがって、原核細胞は、２又は３以上のセンスコドン及び１又は２以上の終止コドンが、第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸をコードするために再利用されているシステムを含有し得る。特定の実施形態では、原核細胞は、ＴＣＡ、ＴＣＧ、及びＴＡＧが、第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸をコードするシステムを含有する。第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸（amino）は、互いに異なり得る。

【0155】

このように、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）－ｔＲＮＡ対は、原核細胞のタンパク質合成装置を使用して、非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを方向付けることが可能であり得る。直交性シンテターゼは、内因性ｔＲＮＡを認識せず、及び直交性同族のｔＲＮＡ（内因性シンテターゼの効率的な基質ではない）を細胞に提供される（又は細胞によって合成される）非標準アミノ酸によって特異的にアミノアシル化する（Chin, J.W., 2017. Nature, 550(7674), 53-60）。

【0156】

一実施形態では、原核細胞であって、原核細胞が第１の内因性ｔＲＮＡを発現せず、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡが第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、及び第１の直交性ｔＲＮＡが第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、原核細胞が提供される。

【0157】

別の実施形態では、原核細胞であって、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡを発現せず、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み、
原核細胞が、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡは第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、第１の直交性ｔＲＮＡが、第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能であり、並びに
原核細胞が、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡを発現し、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡは第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、第２の直交性ｔＲＮＡが、第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能である、
原核細胞が提供される。

【0158】

なお別の実施形態では、原核細胞であって、
原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び第１の内因性終結因子を発現せず、
原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化されている、並びに第１の内因性終結因子が不必要であるように第１のタイプの終止コドンが再コード化されているゲノムを含み、
原核細胞が、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡを発現し、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第１の直交性ｔＲＮＡが第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、第１の直交性ｔＲＮＡが第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能であり、
原核細胞が、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡを発現し、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第２の直交性ｔＲＮＡが第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、第２の直交性ｔＲＮＡが第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能であり；並びに
原核細胞が、第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡを発現し、
第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び第３の直交性ｔＲＮＡが第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成し、並びに
第３の直交性ｔＲＮＡが第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である、
原核細胞が提供される。

【0159】

本明細書で使用されるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、多様であり得る。実施例では特定のｔＲＮＡシンテターゼ配列が使用されている場合があるが、本発明は、これらの実施例のみに限定されないと意図される。原則として、ｔＲＮＡチャージ（アミノアシル化）機能を提供する任意のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することができる。例えば、ｔＲＮＡシンテターゼは、古細菌などの任意の適切な種、例えばメタノサルシナ（Methanosarcina）、例えばアレタノサルシナ・バルケリ（Alethanosarcina barkeri）ＭＳ；メタノサルシナ・バルケリ・フサロ種（Methanosarcina barkeri str. Fusaro）；メタノサルシナ・マゼイＧ０１；メタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）Ｃ２Ａ；メタノサルシナ・サーモフィラ（Methanosarcina thermophila）；又はメタノコッコイデス（Methanococcoides）、例えばメタノコッコイデス・ブルトニイ（Methanococcoides burtonii）に由来し得る。或いは、ｔＲＮＡシンテターゼは、細菌、例えばデスルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、例えばデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）ＤＣＢ－２；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＹ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＰＣＰ１；又はデスルホトマクルム
・アセトキシダンス（Desulfotomaculum acetoxidans）ＤＳＭ ７７１に由来し得る。

【0160】

アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｙｌＲＳ）であり得る。ＰｙｌＲＳは、野生型又は遺伝子改変されたＰｙｌＲＳであり得る。遺伝子改変されたＰｙｌＲＳは、例えばNeumann et al. (Nat Chem Biol 4:232, 2008)、及びT. Yanagisawa et al., Multistep Engineering of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase to Genetically Encode Ne-(o-Azidobenzyloxycarbonyl) lysine for Site-Specific Protein Modification. Chemistry & Biology 15, 1187-1197 (2008)によって、欧州特許第ＥＰ２１９２１８５Ａ１号明細書、及び国際公開第２０１６／０６６９９５号パンフレット（各々が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。適切には、非標準アミノ酸（複数可）の組み込み効率を増加させる遺伝子改変されたｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子を選択する。ＰｙｌＲＳは、メタノサルシナ・バルケリ（ＭｂＰｙｌＲＳ）又はメタノサルシナ・マゼイ（ＭｍＰｙｌＲＳ）であり得る。

【0161】

本明細書で使用されるｔＲＮＡは、多様であり得る。特定のｔＲＮＡが実施例で使用されているが、本発明は、これらの実施例のみに限定されないと意図される。原則として、任意のｔＲＮＡを使用することができ、但し、選択したｔＲＮＡシンテターゼと適合性であることを条件とする。

【0162】

ｔＲＮＡは、古細菌、例えばメタノサルシナ、例えばメタノサルシナ・バルケリＭＳ；メタノサルシナ・バルケリ・フサロ種；メタノサルシナ・マゼイＧ０１；メタノサルシナ・アセチボランスＣ２Ａ；メタノサルシナ・サーモフィラ；又はメタノコッコイデス、例えばメタノコッコイデス・ブルトニイなどの任意の適切な種に由来し得る。或いは、ｔＲＮＡは、細菌、例えばデスルフィトバクテリウム、例えばデスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＤＣＢ－２；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＹ５１；デスルフィトバクテリウム・ハフニエンスＰＣＰ１；又はデスルホトマクルム・アセトキシダンスＤＳＭ７７１に由来し得る。

【0163】

ｔＲＮＡ遺伝子は、野生型ｔＲＮＡ遺伝子であり得るか、又は変異したｔＲＮＡ遺伝子であり得る。適切には、非天然アミノ酸（複数可）の組み込み効率を増加させる変異したｔＲＮＡ遺伝子を選択する。一実施形態では、変異したｔＲＮＡ遺伝子は、Biochemistry (2013) 52, 10（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＰｙｌＴのＵ２５Ｃバリアントである。

【0164】

一実施形態では、変異したｔＲＮＡ遺伝子は、Fan et al. (Nucleic Acids Research doi:10.1093/nar/gkv800)（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＰｙｌＴのＯｐｔバリアントである。

【0165】

一実施形態では、変異したｔＲＮＡ遺伝子は、Ｕ２５Ｃ及びＰｙｌＴのＯｐｔバリアントの両方を含み、すなわちこの実施形態では、ｔＲＮＡ、例えばＰｙｌＴｔＲＮＡ_ＣＵＡ遺伝子は、Ｕ２５Ｃ及びＯｐｔ変異の両方を含む。

【0166】

一実施形態では、ｔＲＮＡをコードする配列は、ｔＲＮＡＰｙｌをコードするメタノサルシナ・マゼイピロリシンのピロリシンｔＲＮＡ（ＰｙｌＴ）遺伝子である。

【0167】

アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びｔＲＮＡ対は、D. Cervettini et al., Rapid discovery and evolution of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase-tRNA pairs. Nature Biotechnology 38, 989-999 (2020)、又はDunkelmann et al. (Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNAsynthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non-canonical amino acids, Nature Chemistry, Vol 12, June 2020 P535-544)に開示され得るか、又は開示されたものから改作され得る。これらの文書の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0168】

背景の節で言及したように、ａａＲＳ、ｔＲＮＡ、及びコドンは、好ましくは共に機能し、各々の内因性アミノ酸、ａａＲＳ、及びイソアクセプターｔＲＮＡ基、及びそれらの同族のコドン群に対して直交性である。加えて、第１、第２、及び第３のｎｃＡＡ：ａａＲＳ：ｔＲＮＡ：コドンセットの構成要素間の相互作用の可能性があるが、これらもまた、好ましくは最小限となる。

【0169】

そのため、別個のコドンを認識し、別個の非標準アミノ酸を組み込み、及び組み合わせて使用することができる複数の改変された相互直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の同定は、当技術分野に貴重な貢献を提供する。本発明者らは、本明細書において新規ａａＲＳ及びｔＲＮＡ対を提供し、及び同様に、本明細書において組み合わせて機能することが実証された前記対の新規組合せも提供する。

【0170】

このように、本発明の一態様では、メタノメチロフィルス種のａａＲＳが提供される。

【0171】

１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ）。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MAEHFTDAQIQRLREYGNGTYKDMEFADVSAREKAFTKLMSDASRDNESALKGMIAHPARQGLSRLMNDIADALVADGFIEVRTPIIISKDALAKMTITPDKPLFKQVFWIDDKRALRPMLAPSLYTVMRSLRDHTDGPVKIFEMGSCFRKESHSGMHLEEFTMLNLVDMGPAGDATESLKKYIGIVMKAAGLPDYQLVHEESDVYKETIDVEINGQEVCSAAVGPHYLDAAHDVHEPWAGAGFGLERLLTIRQGYSTVMKGGASTTYLNGAKMD（配列番号９）
を有し得る。

【0172】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含む１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｌ１２１、Ｌ１２５、Ｙ１２６、Ｍ１２９、Ｎ１６６、Ｖ１６８、Ｙ２０６、Ａ２２３で置換の任意の１つ又は組合せを含む、配列番号９に従い得る。前述の残基での変異を使用して、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有する１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのバリアントを生成してもよい。

【0173】

シンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、以下の変異：ｉ）Ｙ１２６Ｇ及びＭ１２９Ｌ、又はii）Ｍ１２９Ａ及びＹ２０６Ｆを含む１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのミュータントであり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、Ｎε－（カルボベンジルオキシ）－ｌ－リシン（ＣｂｚＫ）の組み込みを方向付けるために適切である。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、配列番号１０又は１１に従い得る。

【0174】

シンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＡｌｌｏｃＫ）であり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＡｌｌｏｃＫ）は、変異Ｎ１６６Ｑ及びＹ２０６Ｆを含む１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、６－Ｎ－Ａｌｌｏｃ－Ｌ－リシン（ＡｌｌｏｃＫ）の組み込みを方向付けるために適切である。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＡｌｌｏｃＫ）は、配列番号１２に従い得る。

【0175】

シンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）であり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）は、変異Ｎ１６６Ｓ、Ｖ１６８Ｍ、Ｙ２０６Ｆ、及びＡ２２３Ｇを含む１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、及び３－ベンゾチエニル－Ｌ－アラニン（Ｂｔａ）の組み込みを方向付けるために適切である。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）は、配列番号１３に従い得る。

【0176】

シンテターゼは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）であり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、変異Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆを含む１Ｒ２６ＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、３－Ｎ－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮＭＨ）の組み込みを方向付けるために適切である。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、配列番号１４に従い得る。

【0177】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号９～１４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一である。ａａＲＳは、配列番号９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の変異の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａ；ii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iii）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｑ、Ｖ１６８Ｖ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ａ；iv）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ｍ、Ｎ１６６Ｓ、Ｖ１６８Ｍ、Ｙ２０６Ｆ、Ａ２２３Ｇ；及びｖ）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｎ１６６Ｎ、Ｖ１６８Ｆ、Ｙ２０６Ｙ、Ａ２２３Ａのいずれか１つを含む。

【0178】

図２０は、配列アライメントであって、「^＊」は、全ての整列させたａａＲＳ配列に見出される残基を示し、「：」は、整列させた配列間の強い類似性内の残基を示し、及び「．」は、整列させた配列間で何らかの類似性がある残基を示す、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号９～１４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基のみに見出される。

【0179】

１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、及びそのバリアント及び派生物は、ｔＲＮＡメタノメチロフィルス・アルブス（Methanomethylophilus alvus）（Ａｌｖ）ｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}と対を形成し得る。

【0180】

このように、本発明の別の態様では、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}が提供される。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}は、以下の配列：
GGGGGACGGTCCGGCGACCAGCGGGTCTNNNAAACCTAGCcttgCGGGGTTCGACaCCCCGGTCTCTCGCCA（配列番号６１）を有し得て、アンチコドンは、「ＮＮＮ」トリプレットである。

【0181】

特定の実施形態では、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}は、以下の配列：
GGGGGACGGTCCGGCGACCAGCGGGTCTCTAAAACCTAGCcttgCGGGGTTCGACaCCCCGGTCTCTCGCCA（配列番号１５）を有し得る。

【0182】

ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}は、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡは、本明細書に例示されるが、本発明は、この様式に限定される必要はない。ｔＲＮＡは、配列番号１５又は６１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0183】

本発明の一態様では、本明細書に開示される任意の１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ、又はそのバリアント又は派生物、並びに本明細書に開示される任意のＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}、又はそのバリアント若しくは派生物を含む宿主細胞であって、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ及びＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}が直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する、宿主細胞が提供される。宿主細胞は、異種タンパク質産生、特に１又は２以上の非標準アミノ酸を含むポリペプチドの産生にとって適切な任意の細胞であり得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌であり得る。宿主細胞は真核細胞、例えば哺乳動物又は昆虫細胞株であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書で開示される本発明の任意の細菌であり得る。

【0184】

１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ及びＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）}はまた、単離された形態で本明細書に提供される。分子は、それが天然の環境で見出されない場合（すなわち、それが天然に存在する細胞において野生型タンパク質として発現されない場合）、本明細書で使用される場合、「単離された」と考えられる。分子は、単離されてもよく、別の組成物の一部として見出されてもよい（例えば、分子を天然に発現しない宿主細胞によって発現される場合）。

【0185】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、アーケオグロブス・フルギダスチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｆＴｙｒＲＳ）である。ＡｆＴｙｒＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切である。ＡｆＴｙｒＲＳは、以下の配列：
MDITEKLRLITRNAEEVVTEEELRQLIETKEKPRAYVGYEPSGEIHLGHMMTVQKLMDLQEAGFEIIVLLADIHAYLNEKGTFEEIAEVADYNKKVFIALGLDESRAKFVLGSEYQLSRDYVLDVLKMARITTLNRARRSMDEVSRRKEDPMVSQMIYPLMQALDIAHLGVDLAVGGIDQRKIHMLARENLPRLGYSSPVCLHTPILVGLDGQKMSSSKGNYISVRDPPEEVERKIRKAYCPAGVVEENPILDIAKYHILPRFGKIVVERDAKFGGDVEYASFEELAEDFKSGQLHPLDLKIAVAKYLNMLLEDARKRLGVSV（配列番号１６）
を有し得る。

【0186】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＡｆＴｙｒＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｙ３６、Ｌ６９、Ｈ７４、Ｑ１１６、Ｄ１６５、Ｉ１６６、又はＮ１９０で置換の任意の１つ又は組合せを含む配列番号１６に従い得る。前述の残基での変異を使用して、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するＡｆＴｙｒＲＳのバリアントを生成してもよい。

【0187】

別の実施形態では、シンテターゼは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）であり得る。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）は、以下の変異：Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、及びＩ１６６Ｇを含むＡｆＴｙｒＲＳのミュータントであり得て、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅの組み込みを方向付けるために適切である。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）は、配列番号１７に従い得る。

【0188】

別の実施形態では、シンテターゼは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）であり得る。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）は、以下の変異：Ｙ３６Ｔ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、及びＮ１９０Ｋを含むＡｆＴｙｒＲＳのミュータントであり得て、ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの組み込みを方向付けるために適切である。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）は、配列番号１８に従い得る。

【0189】

別の実施形態では、シンテターゼは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｏ－メチル－チロシン）であり得る。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｏ－メチル－チロシン）は、以下の変異：Ｙ３６Ｉ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇを含むＡｆＴｙｒＲＳのミュータントであり得て、ｏ－メチル－チロシンの組み込みを方向付けるために適切である。ＡｆＴｙｒＲＳ（ｏ－メチル－チロシン）は、配列番号１９に従い得る。

【0190】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号１６～１９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号１６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の群：ｉ）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｍ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｎ；ii）Ｙ３６Ｔ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｋ；及びiii）Ｙ３６Ｉ、Ｌ６９Ｌ、Ｈ７４Ｌ、Ｑ１１６Ｅ、Ｄ１６５Ｔ、Ｉ１６６Ｇ、Ｎ１９０Ｎのいずれか１つを含む。

【0191】

ＡｆＴｙｒＲＳ、及びそのバリアント及び派生物は、ｔＲＮＡＡｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹと対を形成し得る。Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹは、以下の配列：
CCCGCCCTAGCTCAGAGGTAGAGCGTGCTTCTNNNAAAAGCATGGTCCCCGGTTCAAATCCTGGGGGCGGGACCA（配列番号６２）を有し得て、アンチコドンは、「ＮＮＮ」トリプレットである。

【0192】

特定の実施形態では、Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）}は、以下の配列：
CCCGCCCTAGCTCAGAGGTAGAGCGTGCTTCTctaAAAAGCATGGTCCCCGGTTCAAATCCTGGGGGCGGGACCA（配列番号２０）を有し得る。

【0193】

Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡは、本明細書に例示されるが、本発明は、この様式に限定される必要はない。ｔＲＮＡは、配列番号２０又は６２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0194】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、ＭｍＰｙｌＲＳである。ＭｍＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞に使用するために適切なａａＲＳである。ＭｍＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL（配列番号２１）
を有し得る。

【0195】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＭｍＰｙｌＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｌ３０１、Ａ３０２、Ｌ３０５、Ｙ３０６、Ｌ３０９、Ｎ３４６、Ｃ３４８、Ｙ３８４、Ｖ４０１、又はＷ４１７の置換の任意の１つ又は組合せを含む、配列番号２１に従い得る。前述の残基での変異は、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するＭｍＰｙｌＲＳのバリアントを生成するために使用され得る。

【0196】

シンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｐａ）であり得る。ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｐａ）は、変異Ａ３０２Ｔ、Ｎ３４６Ｔ、Ｃ３４８Ｔ、及びＷ４１７Ｃを含むＭｍＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）の組み込みを方向付けるために適切である。ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｐａ）は、配列番号２２に従い得る。

【0197】

シンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）であり得る。ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）は、変異Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｍ、Ｙ３８４Ｆ、及びＶ４０１Ｇを含むＭｍＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、３－ベンゾチエニル－Ｌ－アラニン（Ｂｔａ）の組み込みを方向付けるために適切である。ＭｍＰｙｌＲＳ（Ｂｔａ）は、配列番号２３に従い得る。

【0198】

シンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＭｍＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、変異：ｉ）Ｙ３０６Ｇ、又はii）Ｌ３０９Ａ、Ｃ３４８Ｖ、Ｙ３８４Ｆを含むＭｍＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、Ｎ６－Ｃｂｚ－Ｌ－リシン（ＣｂｚＫ）の組み込みを方向付けるために適切である。ＭｍＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、配列番号２４又は配列番号２５に従い得る。

【0199】

シンテターゼは、ＭｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）であり得る。ＭｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、変異Ｌ３０１Ｍ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９Ａ、及びＣ３４８Ｆを含むＭｍＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、３－Ｎ－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮＭＨ）の組み込みを方向付けるために適切である。ＭｍＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、配列番号２６に従い得る。

【0200】

他の実施形態では、ＭｍＰｙｌＲＳは、ＢｏｃＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、又はＡｌｋＫの組み込みを方向付けるために適切となるように適合され得る。

【0201】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号２１～２６のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号２１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の群：ｉ）Ｌ３０１Ｌ、Ａ３０２Ｔ、Ｌ３０５Ｌ、Ｙ３０６Ｙ、Ｌ３０９Ｌ、Ｎ３４６Ｔ、Ｃ３４８Ｔ、Ｙ３８４Ｙ、Ｖ４０１Ｖ、Ｗ４１７Ｃ；ii）Ｌ３０１Ｌ、Ａ３０２Ａ、Ｌ３０５Ｌ、Ｙ３０６Ｙ、Ｌ３０９Ｌ、Ｎ３４６Ｓ、Ｃ３４８Ｍ、Ｙ３８４Ｆ、Ｖ４０１Ｇ、Ｗ４１７Ｗ；iii）Ｌ３０１Ｌ、Ａ３０２Ａ、Ｌ３０５Ｌ、Ｙ３０６Ｇ、Ｌ３０９Ｌ、Ｎ３４６Ｎ、Ｃ３４８Ｃ、Ｙ３８４Ｙ、Ｖ４０１Ｖ、Ｗ４１７Ｗ、iv）Ｌ３０１Ｌ、Ａ３０２Ａ、Ｌ３０５Ｌ、Ｙ３０６Ｙ、Ｌ３０９Ａ、Ｎ３４６Ｎ、Ｃ３４８Ｖ、Ｙ３８４Ｆ、Ｖ４０１Ｖ、Ｗ４１７Ｗ；及びｖ）Ｌ３０１Ｍ、Ａ３０２Ａ、Ｌ３０５Ｉ、Ｙ３０６Ｆ、Ｌ３０９Ａ、Ｎ３４６Ｎ、Ｃ３４８Ｆ、Ｙ３８４Ｙ、Ｖ４０１Ｖ、Ｗ４１７Ｗのいずれか１つを含む。

【0202】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号２１～２６のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基のみに見出される。

【0203】

ＭｍＰｙｌＲＳ及び派生物は、ｔＲＮＡＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹと対を形成し得る。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、以下の配列を有し得て：
GGaAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTNNNAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCA（配列番号６３）、アンチコドンは、「ＮＮＮ」トリプレットである。

【0204】

一実施形態では、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌは、以下の配列：
GGaAACCTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGCCGGGTTAGATTCCCGGGGTTTCCGCCA（配列番号２７）を有し得る。

【0205】

ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡを、本明細書に例示するが、本発明は、この様式に限定される必要はない。ｔＲＮＡは、配列番号２７又は６３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0206】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、Ｍ・ヤンナスキイチロシル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）である。ＭｊＴｙｒＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。ＭｊＴｙｒＲＳは、J. N. Beyer et al., Overcoming Near-Cognate Suppression in a Release Factor 1-Deficient Host with an Improved Nitro-Tyrosine tRNA Synthetase. Journal of Molecular Biology（参照により本明細書に組み込まれる）に開示され得る。

【0207】

ＭｊＴｙｒＲＳは、以下の配列：
MDEFEMIKRNTSEIISEEELREVLKKDEKSAYIGFEPSGKIHLGHYLQIKKMIDLQNAGFDIIILLADLHAYLNQKGELDEIRKIGDYNKKVFEAMGLKAKYVYGSEFQLDKDYTLNVYRLALKTTLKRARRSMELIAREDENPKVAEVIYPIMQVNDIHYLGVDVAVGGMEQRKIHMLARELLPKKVVCIHNPVLTGLDGEGKMSSSKGNFIAVDDSPEEIRAKIKKAYCPAGVVEGNPIMEIAKYFLEYPLTIKRPEKFGGDLTVNSYEELESLFKNKELHPMDLKNAVAEELIKILEPIRKRL（配列番号２８）
を有し得る。

【0208】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＭｊＴｙｒＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｙ３２、Ｌ６５、Ｈ７０、Ｆ１０８、Ｑ１０９、Ｄ１５８、Ｉ１５９、又はＬ１６２の置換のいずれか１つ又は組合せを含む、配列番号２８に従い得る。前述の残基での変異を使用して、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するＭｊＴｙｒＲＳのバリアントを生成してもよい。

【0209】

別の実施形態では、シンテターゼは、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）であり得る。ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）は、変異Ｙ３２Ｈ、Ｈ７０Ｔ、Ｄ１５８Ｈ、Ｉ１５９Ａ、及びＬ１６２Ｒを含むＭｊＴｙｒＲＳのミュータントである。ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）は、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒの組み込みを方向付けるために適切である。ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）は、配列番号２９に従い得る。

【0210】

別の実施形態では、シンテターゼは、ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）であり得る。ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）は、変異Ｙ３２Ｌ、Ｌ６５Ｖ、Ｆ１０８Ｗ、Ｑ１０９Ｍ、Ｄ１５８Ｇ、及びＩ１５９Ａを含むＭｊＴｙｒＲＳのミュータントである。ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）は、ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの組み込みを方向付けるために適切である。ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）は、配列番号３０に従い得る。

【0211】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号２８～３０のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号２８と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の群：ｉ）Ｙ３２Ｈ、Ｌ６５Ｌ、Ｈ７０Ｔ、Ｆ１０８Ｆ、Ｑ１０９Ｑ、Ｄ１５８Ｈ、Ｉ１５９Ａ、Ｌ１６２Ｒ；及びii）Ｙ３２Ｌ、Ｌ６５Ｖ、Ｈ７０Ｈ、Ｆ１０８Ｗ、Ｑ１０９Ｍ、Ｄ１５８Ｇ、Ｉ１５９Ａ、Ｌ１６２Ｌのいずれか１つを含む。

【0212】

ＭｊＴｙｒＲＳ及び派生物は、ｔＲＮＡＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹと対を形成し得る。ＭｊＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹは、J. N. Beyer et al., Overcoming Near-Cognate Suppression in a Release Factor 1-Deficient Host with an Improved Nitro-Tyrosine tRNA Synthetase. Journal of Molecular Biologyに開示され得る。ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹは、以下の配列：
CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTNNNAATCCGCATGGCAGGGGTTCAAATCCCCTCCGCCGGACCA（配列番号６４）を有し得て、アンチコドンは、「ＮＮＮ」トリプレットである。

【0213】

一実施形態では、ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒは、以下の配列：
CCGGCGGTAGTTCAGCAGGGCAGAACGGCGGACTCTAAATCCGCATGGCAGGGGTTCAAATCCCCTCCGCCGGACCA（配列番号３１）を有し得る。

【0214】

ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＧＡを本明細書に例証するが、本発明は、この様式に限定される必要はない。ｔＲＮＡは、配列番号３１又は６４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0215】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、メタノマシリコッカス・ルミンエンシス１（Ｌｕｍ１）ＰｙｌＲＳである。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MDTRLTPAQAQRIREMGGTVDPSLAFSSEAERESAFQRISADLQGANLAKIRRCAEAPERHPIGSLENTLACALAAKGFIEVKTPMMIPADGLVKMGIDESHPLWNQVFWVGPKKALRPMLAPNLYFLMRHLRRSVPAPLLLFEIGPCFRKESRGSNHLEEFTMLNLVELAPQADATERLKEHIATVMNAVGLPYELVVEGSEVYGTTIDVEVDGVELASGAVGPLPMDKPHGITEPWAGVGFGLERIALMRTKEQNIKKVGRSLVYVNGARIDI（配列番号３２）
を有し得る。

【0216】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＬｕｍ１ＰｙｌＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｌ１２１、Ｌ１２５、Ｙ１２６、Ｍ１２９、及びＶ１６８で置換の任意の１つ又は組合せを含む、配列番号３２に従い得る。前述の残基での変異を使用して、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するＬｕｍ１ＰｙｌＲＳのバリアントを生成してもよい。

【0217】

シンテターゼは、Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、変異Ｙ１２６Ｇ及びＭ１２９Ｌを含むＬｕｍ１ＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、ＣｂｚＫの組み込みを方向付けるために適切である。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、配列番号３３に従い得る。

【0218】

シンテターゼは、Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）であり得る。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、変異Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、及びＶ１６８Ｆを含むＬｕｍ１ＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、３－Ｎ－メチル－Ｌ－ヒスチジン（ＮＭＨ）の組み込みを方向付けるために適切である。Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、配列番号３４に従い得る。

【0219】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号３２～３４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号３２と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の群：ｉ）Ｌ１２１Ｌ、Ｌ１２５Ｌ、Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、Ｖ１６８Ｖ；及びii）Ｌ１２１Ｍ、Ｌ１２５Ｉ、Ｙ１２６Ｆ、Ｍ１２９Ａ、Ｖ１６８Ｆのいずれか１つを含む。

【0220】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号３２～３４のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0221】

Ｌｕｍ１ＰｙｌＲＳ及び派生物は、Ｍ・インテンスチナリス（M. intenstinalis）ｔＲＮＡと対を形成し得る。そのようなｔＲＮＡは、以下の配列：
GGCGAACTGGTCCGGGACCACCAGGCCTNNNAAGCCACGGTTAGCCGGGTTCAACTCCCGGGTTCGTCGCCA（配列番号６５）を有し得て、アンチコドンは、「ＮＮＮ」トリプレットである。

【0222】

一実施形態では、Ｍ・インテンスチナリスｔＲＮＡは、以下の配列：
GGCGAACTGGTCCGGGACCACCAGGCCTctaAAGCCACGGTTAGCCGGGTTCAACTCCCGGGTTCGTCGCCA（配列番号６６）を有し得る。

【0223】

Ｍ・インテンスチナリスｔＲＮＡは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号６５又は６６と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0224】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳであり、これは、ニトロソスフェリア・アルカエオン（ＮＣＢＩタンパク質受託番号はＨＨＰ５２４１５．１である）のａａＲＳである。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞に使用するために適切なａａＲＳである。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MSKIRFTRGQIHRLIELGAEPTELERDFETEAERDKEFNKIAENLARKNLKNIKDFLEQRRKPLVRVIEEKLRTTALRLGFSEVVTPIIIPRLFIKRMGIDEGDPLWKQVMLIDDKRALRPMLAPNLYVLMAKLSNIVRPVKIFEIGPCFRRETGGRYHLEEFTMFNMVELAPEGDPKERLLDYIDTIMRDIGLNYTISVEPSNVYGETLDVVVNGIEVASAAIGPKPIDANWGVREPWIGVGFGVERLAMLVGGYNSIARIAKSLSYLDGSTLSVIKLRW（配列番号３５）
を有し得る。

【0225】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0226】

シンテターゼは、ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）であり得る。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、変異Ｌ１２３Ｍ、Ｌ１２７Ｉ、Ｙ１２８Ｆ、Ｍ１３１Ａ、及びＶ１６９Ｆを含むＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、ＮＭＨの組み込みを方向付けるために適切である。ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ（ＮＭＨ）は、配列番号３６に従い得る。

【0227】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号３５又は配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の置換Ｌ１２３Ｍ、Ｌ１２７Ｉ、Ｙ１２８Ｆ、Ｍ１３１Ａ、及びＶ１６９Ｆを含む。

【0228】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号３５又は配列番号３６と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0229】

ＮｉｔｒｏＰｙｌＲＳ及び派生物は、メタノハラルケウム・サーモフィルム（Methanohalarchaeum thermophilum）から派生するｔＲＮＡと対を形成し得る。そのようなｔＲＮＡは、以下の配列：GGGGGGCTGGTCGGGTGGCCAAGGGGGCTCTAAACCCTCGGTTGCCGGGTTCAACTCCCGGGCTCCCCACCA（配列番号５３）を有し得る。

【0230】

配列番号５３は、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0231】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これはクロストリジウム目細菌（受託番号ＮＬＹ８２５２９．１）のａａＲＳである。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞に使用するために適切なａａＲＳである。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MENFTITQTERLKQLNCENDVLELEFEDSEARNSKFREIEIGRVKKGKENIKNLLKEKHITISDEVGNKLSDWLMSKDYTKVLTPTIISKDQLKAMTIDEENHLFSQVFWIDNNKCLRPMLAPNLYIVMRELKRITNEPVKIFEIGSCFRKESQGARHMNEFTMLNMVELASVEDGKQLDTLKALAHEAMESLGVESYELVIEESAVYGSTLDIEIDGIEVASGSYGPHELDANWDIFDTWVGIGFGIERLAMAINGGSTIKKYGRSINFIDGETMKL（配列番号３７）
を有し得る。

【0232】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。特定の実施形態では、ａａＲＳは、以下の残基：Ｙ１２６、Ｍ１２９、Ｙ２０８で置換の任意の１つ又は組合せを含む、配列番号３７に従い得る。前述の残基での変異を使用して、非標準アミノ酸に対して変更された選択性を有するＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントを生成してもよい。

【0233】

シンテターゼは、ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、変異：ｉ）Ｙ１２６Ｇ及びＭ１２９Ｌ、又はii）Ｍ１２９Ａ及びＹ２０８Ｆを含むＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳのミュータントであり得て、及びＣｂｚＫの組み込みを方向付けるために適切である。ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）は、配列番号３８又は配列番号３９に従い得る。

【0234】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号３７～３９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。ａａＲＳは、配列番号３７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、以下の群：ｉ）Ｙ１２６Ｇ、Ｍ１２９Ｌ、及びＹ２０８Ｙ、又はii）Ｙ１２６Ｙ、Ｍ１２９Ａ、又はＹ２０８Ｆのいずれか１つを含む。

【0235】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号３７～３９のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0236】

ＣｌｏｓΔＮＴＤＰｙｌＲＳ並びにそのバリアント及び派生物は、以下の配列：
GGGGAACGGATCGGATGGATCACATAGACTCTAAATCTATGTAGCCGAGTGAAACTCTCGGGTTCCTCGCCA（ＣｌｏｓｔＲＮＡ；配列番号５６）に従うｔＲＮＡと対を形成し得る。

【0237】

ＣｌｏｓｔＲＮＡは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５６と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0238】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、メタノナトロンアルカエウム・サーモフィルム（Methanonatronarchaeum thermophilum）（ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳ）から派生したａａＲＳである。ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MEFTVTQKQRLQELGFEGVFPSDFEDVDERNRFFEELVGRLRDRNRKRFERLVGNKIPFWRKVSSDLRNRFYELGFVEVRTPEIISYSLLEKMEISDDLREQVYWLEEDNRCLRPMLAPNLYNELRHFNRISNQSKVRIFEIGTCFRREKSSSEHLNEFTMLNAVEMGDIGDTEERLDRLIEEVFGEFTDYKKVGEESSLYGKTVDVLVDGVEVASCIAGPHPLDSNWSIDQPWVGIGLGVERLAMLLDDGSTAKAYGNSYIYQDGVRLDIK（配列番号４０）
を有し得る。

【0239】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0240】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４０と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0241】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４０と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0242】

ＴｒｏｎΔＮＴＤＰｙｌＲＳ並びにそのバリアント及び派生物は、以下の配列：
GGGGGGCTGGTCGGGGTGACCACGGAGGCTCTAAACCTCCCTTAGCCGGGTTCAACTCCCGGGTCCCTCGCCA（ＴｒｏｎｔＲＮＡ；配列番号５２）に従うｔＲＮＡと対を形成し得る。

【0243】

ＴｒｏｎｔＲＮＡは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0244】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これは、ゲンマティモナス門（Gemmatimonadetes）細菌（受託番号ＮＮＭ０３６９１．１）のａａＲＳである。ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MGITWSKTQKDRLRALRADGARLADSFEGRPQRDQAFQDLEGALAKARRKELEDLRAGHGRPGLCRLQTTLEGTLVGAGFVQVATPTIMSRGLLAKMGVTKNHDLFEQVFWLDRDRCLRPMLAPHLYYVIKDLLRLWEKPLGIFEVGSCFRKDSQGARHSNEFTMLNLCEFGLPEEDRGGRLREMAEVVTRAAGVHEYELEESASTVYGGTLDVVSVDGLELGSGAMGPHPLDHAWRITDTWVGIGFGLERLLMTVNRETSIGKMGRSLAYLDGIPLSI（配列番号４１）
を有し得る。

【0245】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0246】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0247】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0248】

ＧｅｍｍΔＮＴＤＰｙｌＲＳ及び派生物は、ｔＲＮＡＧｅｍｍｔＲＮＡと対を形成し得る。ＧｅｍｍｔＲＮＡは、以下の配列：
GGGGAGTGGATCGATACAAGATCGTGTGGGCTCTAAACCCACATAGCTCGGTGTGACTCCGGGGCTCCCCACCA（配列番号４６）を有し得る。

【0249】

ＧｅｍｍｔＲＮＡは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号４６と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0250】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これはペプトストレプトコッカス科（Peptostreptococcaceae）細菌ｐＧＡ－８（受託番号ＳＦＥ２５４２７．１）のａａＲＳである。ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MQYSNTQRERLVQLNIDASLLEATFEDAEARDASFRSLEKELAKKAKTHLRSLLSSDAVTGSQAVGNTLCSWLQQKGFTRVDTPTIISDKMLDKMSIDDKHHLREQVFWIDRHKCLRPMLAPNLYIVMRELKKTLNTPVKIFEMGSCFRKESQGARHMNEFTMLNFVELATVKDGEQKEYLEKMAREAMAALKIDDYELIIEESTVYGTTVDIEIDGIEVASGAYGPHELDSAWAVFDTWVGIGFGIERLAMAMNGGKTIKRFGRSTNYLDGVPISL（配列番号４２）
を有し得る。

【0251】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0252】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0253】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0254】

ＰＧＡ８ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ並びにバリアント及び派生物は、ｔＲＮＡＰＧＡ８ｔＲＮＡと対を形成し得る。ＰＧＡ８ｔＲＮＡは、以下の配列：
GGGGAGTGGATCGTATTGATCGTATGGACTCTAAATCCATAAAGCCGAGTGAGACTCTCGGACTCCTCGCCA（配列番号５４）を有し得る。

【0255】

ＰＧＡ８ｔＲＮＡは、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0256】

本明細書に開示される別のａａＲＳは、Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これは、デスルホスポロシヌス種Ｉ２（受託番号ＷＰ＿０４５５７６２７１．１）のａａＲＳである。Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MGIIWTPIQKQRLQELNASEAQREMCFESQQARDRAFQEQEHSLVVEGKRRLMELRDIKRRPSLSVLEQQLVEALTQQGFVQVVTPTIISKTSLAKMSVSDDHPLFSQVFWLDSKRCLRPMLAPNLYTLWKDLLRLWEKPIRIFEIGTCYRKESKGSLHLNEFTMLNLTELGLPEDQRHQRLEELASLVMETVGIADYEMELTTSVVYGDTLDVVKGIELGSSAMGPHPLDDQWGIIDPWVGIGFGLERLLMIKEGSQNVQSMGRSLTYLNGVRLNI（配列番号４３）
を有し得る。

【0257】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＩ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0258】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0259】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0260】

Ｉ２ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ及び派生物は、以下のｔＲＮＡ：
GGGGGGTAGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGCTAGACGGGTGAAACTCCCGTACTCCTCGCCA（Ｉ２ＣＵＡＧ；配列番号４７）
GGGGCGTCGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGCGCAACGGGTGAAACTCCCGTACGCCTCGCCA（Ｉ２ｂ８；配列番号４８）
GGGGTGTTGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGGTAGACGGGTGAAACTCCCGTACACCTCACCA（Ｉ２ｂ３２；配列番号４９）
GGGGTGTAGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGAACAACGGGTGAAACTCCCGTACACCTCGCCA（Ｉ２ｂ７２；配列番号５０）
GGGGCGTTGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGGCCGACGGGTGAAACTCCCGTACACCTCTCCA（Ｉ２Ｈ５２；配列番号５１）
GGGGGGTAGATCGGATTGATCGCGTGGACTCTAAATCCGCGTAGACGGGTGAAACTCCCGTACTCCTCGCCA（Ｉ２；配列番号５５）
のいずれかと対を形成し得る。

【0261】

配列番号４７～５１及び５５は、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号４７～５１及び５５のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0262】

本明細書で開示される別のａａＲＳは、Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これはデルタプロテオバクテリア（受託番号ＲＬＣ０４１２１．１）のａａＲＳである。Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MIPWTQTQTQRLNELNAPDSALKKSFDGEPAREKAYQALEKSLVTTQRRRLAEFQTTHRRPELCRLENKLAEMLTQDGFAQVTTPIIMSRGLLKKMSIDSKHPLNSQIFWLQEDKCLRPMLAPHLYYLLVDLLRIWKRPVRIFEIGPCFRKESRGSKHASEFTMLNLVEMGTPENTRRERIQDVGSRVATAAGVKNYRFETVTSEIYGDTIDIVAGKDGLEIASAAMGPHPLDRPWKINESWIGIGFGLERLLMASHRSRNLARFGRSLAYLDGVRLNＩ（配列番号４４）
を有し得る。

【0263】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＤ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0264】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0265】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0266】

Ｄ１２１ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ及び派生物は、以下のｔＲＮＡ：
GGGGGGTGGATCGTAATGAGATCGTGTGGACTCTAAATCCACATAGACGGGTGCAACTCCCGTACTCCCCGCCA（配列番号５７）と対を形成し得る。

【0267】

配列番号５７は、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５７と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0268】

本明細書で開示される別のａａＲＳは、Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳであり、これはデルタプロテオバクテリア（受託番号ＲＴＺ９９４１６．１）のａａＲＳである。Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、本発明の原核細胞において使用するために適切なａａＲＳである。Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳは、以下の配列：
MNSSWTEVQRHRLKELNGAEKDLETAFGDDLQRNRAFQKLEKQLVYQERKRLDRLLDTRFRPLRCELESLLIDALKCEGFTRVETPTIISQNDLERMSIDRSHPFNDQVYRVDSKHCLRPMLAPGLYRLMKDLARIRSGKPVRIFEIGPCFRKETSGARHAGEFTMLNLVEMRIEKGSRRFRIETLAKRIMHAAGIDTYDLVDEPSEVYNTTLDIVCGSDPLEVASCAMGPHPLDAAWGIIDTWVGLGFGLERLLMARENSPGIGKWCKSVSYLDGIRLTL（配列番号４５）
を有し得る。

【0269】

一実施形態では、シンテターゼは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するために必要な変異をさらに含むＤ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳのバリアントである。

【0270】

一実施形態では、ａａＲＳは、配列番号４５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％類似又は同一であり得る。

【0271】

図２０は、配列アライメントを提供する。ａａＲＳは、配列番号４５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得て、バリエーションは、ｉ）「^＊」；ii）「^＊」若しくは「：」、又はiii）「^＊」、「：」、若しくは「．」によって印を付けられていない残基に限って見出される。

【0272】

Ｄ４１６ΔＮＴＤＰｙｌＲＳ及び派生物は、以下のｔＲＮＡ：
GGGGAGTGGATCGGATGAGATCGCATGGGCTCTAAACCCATGTAGCCGGGTGCGACTCCCGGGCTTCCCTCCA（配列番号５８）と対を形成し得る。

【0273】

配列番号５８は、任意のアンチコドンを含むように改変され得る。ｔＲＮＡは、配列番号５８と少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0274】

特定の実施形態では、本明細書に開示される任意のａａＲＳは、ＡｌｌｏｃＫ、ＡｌｋＫ、ＢｏｃＫ、Ｂｔａ、ＣｂｚＫ、ＣｙｐＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、ＮＭＨ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ、及びｏ－メチル－チロシンのいずれかの認識を可能にする、又はそれらに対する特異性を変更するように改変され得る。

【0275】

本発明の一態様では、本明細書に開示される任意のａａＲＳ、又はそのバリアント若しくは派生物、及び本明細書に開示される任意のｔＲＮＡ、又はそのバリアント若しくは派生物を含む宿主細胞であって、ａａＲＳ及びｔＲＮＡが直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を形成する宿主細胞が提供される。宿主細胞は、異種タンパク質産生、特に１又は２以上の非標準アミノ酸を含むポリペプチドの産生にとって適切な任意の細胞であり得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌であり得る。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物又は昆虫細胞株であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書に開示される本発明の任意の細菌であり得る。

【0276】

ａａＲＳ及びｔＲＮＡはまた、本明細書において単離された形態で提供される。

【0277】

本発明者らは、本明細書において、以下の直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対が、２つ又は３つの対：ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＡｆＴｙｒＲＳ／Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹのいずれかの組合せで使用され得ることを実証するデータを提供する。

【0278】

このように、本発明の一態様では、群：ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＡｆＴｙｒＲＳ／Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹから選択される任意の１つ、２つ、又は３つの直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む宿主細胞が提供される。ａａＲＳは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するように改変され得る。ａａＲＳは、本明細書に開示されるバリアントのいずれかであり得る。ｔＲＮＡは、本明細書に開示されるバリアントのいずれかであり得る。

【0279】

本発明者らは、本明細書において、以下の直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対が、２つ又は３つの対：ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹの任意の組合せで使用され得ることを実証するデータを提供する。

【0280】

このように、本発明の一態様では、群：ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹから選択される任意の１つ、２つ、又は３つの直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む宿主細胞が提供される。ａａＲＳは、非標準アミノ酸の認識を可能にする、又は非標準アミノ酸に対する特異性を変更するように改変され得る。ａａＲＳは、本明細書に開示される任意のバリアントであり得る。ｔＲＮＡは、本明細書に開示される任意のバリアントであり得る。

【0281】

本発明の別の態様では、群：ｉ）クラスＡΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；ii）クラスＢΔＮＰｙｌＲＳ／^{ΔＮＰｙｌ}ｔＲＮＡ対；及びiii）ＭｍＰｙｌＲＳ／Ｓｐｅ^ＰｙｌｔＲＮＡ対から選択される任意の１つ、２つ、又は３つの直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む宿主細胞が提供される。ａａＲＳ及びｔＲＮＡのクラスは、Dunkelmann et al. (Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNAsynthetase/tRNApairs enable the genetic encoding of three distinct non-canonical amino acids, 2020)に記載されている。

【0282】

直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を、宿主細胞において発現させてもよい。宿主細胞は、異種タンパク質産生、特に１又は２以上の非標準アミノ酸を含むポリペプチドの産生にとって適切な任意の細胞であり得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌であり得る。宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物又は昆虫細胞株であり得る。宿主細胞は、ヒト細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書に開示される本発明の任意の細菌であり得る。

【0283】

本明細書において、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含むゲノムを含む細菌であって、センスコドンＴＣＧを解読することが可能な第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対、センスコドンＴＣＡを解読することが可能な第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対、及び終止コドンＴＡＧを解読することが可能な第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む細菌が提供される。ゲノムの配列同一性の計算は、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対（すなわち、細菌は、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するようにさらに改変された株Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の細菌であり得る）の発現にとって必要な配列を除外すべきである。一実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＡｆＴｙｒＲＳ／Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡであり、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹはＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得て、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得て、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹはＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得て、及びＡｆＴｙｒＲＳは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）であり得る。別の実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ｉ）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；ii）１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びiii）ＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡであり、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得て、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得て、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得て、及びＭｊＴｙｒＲＳは、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）又はＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）であり得る。

【0284】

本発明の原核細胞において発現される直交性ｔＲＮＡシンテターゼの基質は、任意の非標準アミノ酸であり得る。したがって、本発明の原核細胞を使用して、第１の非標準アミノ酸、第２の非標準アミノ酸、及び任意で第３の非標準アミノ酸を含むポリマーを生成してもよい。

【0285】

本明細書で使用される場合、「非標準アミノ酸」という用語は、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－フェニルアラニン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－プロリン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－トリプトファン、及びＬ－チロシンを除く任意のアミノ酸を意味する。

【0286】

非標準アミノ酸は、非天然アミノ酸であり得る。本明細書で使用される場合、「非天然アミノ酸」は、遺伝子コードにおいて天然にコードされることも見出されることもない任意のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、タンパク質を構成しないアミノ酸であり得る。このように、非天然アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－システイン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－フェニルアラニン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－リシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－プロリン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－トリプトファン及びＬ－チロシン、Ｌ－ピロリシン、及びＬ－セレノシステインを除く任意のアミノ酸であり得る。

【0287】

本発明と共に使用するために適切な非標準アミノ酸は、特に限定されない。適切な非標準アミノ酸は、当業者に周知であり、例えばNeumann, H., 2012. FEBS letters, 586(15), pp.2057-2064；及びC. C. Liu, P. G. Schultz, Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annual Review of Biochemistry 79, 413-444 (2010)（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアミノ酸である。一部の実施形態では、非標準アミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、フェニルセレノシステイン、セレノシステイン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－メチルチロシン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｐ－シアノフェニルアラニン、ｍ－シアノフェニルアラニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、Ｌ－ＤＯＰＡ、３－アミノチロシン、３－ヨードチロシン、ｐ－イソプロピルフェニルアラニン、３－（２－ナフチル）アラニン、ビフェニルアラニン、ホモグルタミン、Ｄ－チロシン、ｐ－ヒドロキシフェニル乳酸、２－アミノカプリル酸、ビピリジルアラニン、ＨＱ－アラニン、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン、ｏ－ニトロベンジルシステイン、ｏ－ニトロベンジルセリン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルセリン、ｏ－ニトロベンジルリシン、ｏ－ニトロベンジルチロシン、２－ニトロフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ｐ－カルボキシメチルフェニルアラニン、３－ニトロチロシン、スルホチロシン、アセチルリシン、メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、ピロリジン、Ｃｂｚ－リシン、Ｂｏｃ－リシン、アリルオキシカルボニルリシン、Ｎ^ε－（（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル）－Ｌ－リシン（ＢｏｃＫ）、Ｎε－（カルボベンジルオキシ）－Ｌ－リシン（ＣｂｚＫ）、Ｎ^ε－アリルオキシカルボニル－Ｌ－リシン（ＡｌｌｏｃＫ）、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヨードフェニル）プロパン酸（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの１又は２以上から選択される。第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸は、前述の非標準アミノ酸の任意の組合せであり得る。

【0288】

特定の実施形態では、非標準アミノ酸は、ＢｏｃＫ、ＣｂｚＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ（図Ｓ９を参照されたい）のいずれか１つであり得る。第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸は、ＢｏｃＫ、ＣｂｚＫ、ＡｌｌｏｃＫ、ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ、ＣｙｐＫ、ＡｌｋＫ、３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ、及びｐ－Ａｚ－Ｐｈｅの任意の組合せであり得る。

【0289】

本発明の原核細胞の使用
本発明の原核細胞は、第１、第２、及び／又は第３の非標準アミノ酸を含むポリマー又はタンパク質を合成するために使用され得る。特定の実施形態では、本発明の原核細胞は、２つ又は３つの異なるタイプの非標準アミノ酸を含むポリマー又はタンパク質を合成するために使用され得る。非標準アミノ酸は、本明細書に開示される任意のアミノ酸であり得る。

【0290】

このように、本発明の一態様では、ポリマーを合成する方法であって、
ｉ）第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む本発明の原核細胞を提供するステップ；及び前記原核細胞を、ポリマーをコードする核酸配列と接触させるステップであって、前記核酸配列が第１のタイプのセンスコドンを含むステップ；
ii）原核細胞を、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である第１の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；並びに
iii）原核細胞をインキュベートして、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第１の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップ
を含む方法が提供される。

【0291】

特定の実施形態では、ポリマーを合成する方法であって、
ｉ）第１及び第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む本発明の原核細胞を提供するステップ；及び前記原核細胞を、ポリマーをコードする核酸配列と接触させるステップであって、前記核酸配列が第１のタイプのセンスコドン及び／又は第２のタイプのセンスコドンを含むステップ；
ii）原核細胞を、第１及び第２の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップであって、第１の非標準アミノ酸が、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であり、及び第２の非標準アミノ酸が、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であるステップ；並びに
iii）原核細胞をインキュベートして、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介しての第１の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込み、及び第２の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介しての第２の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップ
を含む方法が提供される。

【0292】

一実施形態では、ポリマーを合成する方法であって、
ｉ）第１、第２、及び第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む本発明の原核細胞を提供するステップ；並びに前記原核細胞を、ポリマーをコードする核酸配列と接触させるステップであって、前記核酸配列が第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び／又は第１のタイプの終止コドンを含むステップ；
ii）原核細胞を、第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップであって、第１の非標準アミノ酸が第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であり、第２の非標準アミノ酸が第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であり、及び第３の非標準アミノ酸が第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質であるステップ；
iii）原核細胞をインキュベートして、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第１の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込み、第２の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第２の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込み、及び／又は第３の第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を介して第３の非標準アミノ酸のポリマーへの組み込みを可能にするステップ
を含む方法が提供される。

【0293】

原核細胞を、核酸配列と接触させるステップは、核酸配列がタンパク質などのポリマーを産生するために解読され得るように、原核細胞に核酸を提供する任意の形態を取り得る。

【0294】

本発明の方法に使用するための原核細胞は、第１、及び任意で第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対、及び任意で第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含む、本明細書に記載される任意の細胞であり得る。例えば、一実施形態では、本発明の方法に使用するための原核細胞は、第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び第１の内因性終結因子を発現せず；及び第１のタイプのセンスコドン及び第２のタイプのセンスコドンが、第１の内因性ｔＲＮＡ及び第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように、原核細胞のゲノム内で再コード化されており、並びに第１のタイプの終止コドンが、第１の内因性終結因子が不必要であるように原核細胞のゲノム内で再コード化されている、原核細胞である。再コード化の性質は、本明細書に開示される本発明の任意の原核細胞について記載されている通りであり得る。第１の直交性ｔＲＮＡは、第１のタイプのセンスコドンを解読することが可能であり、第２の直交性ｔＲＮＡは、第２のタイプのセンスコドンを解読することが可能であり、及び第３の直交性ｔＲＮＡは、第１のタイプの終止コドンを解読することが可能である。原核細胞は、大腸菌であり得る。

【0295】

特定の実施形態では、本発明の方法に使用するための原核細胞は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡ、又はＲＦ－１を発現せず、センスコドンＴＣＡの出現が、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡが不必要であるように再コード化されており（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＡの出現がＡＧＴに置き換えられている）、センスコドンＴＣＧの出現が、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが不必要であるように（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＧの出現がＡＧＣに置き換えられているように）再コード化されており、及び終止コドンＴＡＧの出現が、ＲＦ－１が不必要であるように（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＡＧの出現がＴＡＡに置き換えられているように）再コード化されている大腸菌細胞である。細菌は、ＴＣＡ、ＴＣＧ、及びＴＡＧコドンを解読することが可能であり、並びに第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸を、ポリマー形成の際にそのような部位に組み込むことが可能である第１、第２、及び第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を含むように改変されている。

【0296】

特定の実施形態では、本発明の方法に使用するための原核細胞は、Ｓｙｎ６１Δ３、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）、又はＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）である。そのため、原核細胞は、配列番号５～８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを含み得る。配列同一性パーセンテージの計算は、直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対の発現を可能にするために挿入されている任意の配列を除外する。

【0297】

直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、本明細書に記載される任意の対であり得る。

【0298】

特定の実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びＡｆＴｙｒＲＳ／Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹである。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得る。ＡｆＴｙｒＲＳは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）であり得る。Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＹＹＹは、Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡであり得る。

【0299】

他の実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹである。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得る。ＭｊＴｙｒＲＳは、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）又はＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）であり得る。ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＹＹＹは、ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡであり得る。

【0300】

図Ｓ５は、センスコドン又は終止コドンに応答してｎｃＡＡを含有するタンパク質を作製するためのＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の使用に関するデータを表す。対照として、ＭＤＳ４２細胞も、終止コドンに応答してｎｃＡＡを含有するタンパク質を作製するために使用した。この図から見ることができるように、アンバーコドンに応答して組み込まれたｎｃＡＡを含有するレポータータンパク質の収量（野生型と比較した比率）は、対照と比較してＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）に関して大きく改善した。そのため、本明細書に開示される原核細胞及び前記原核細胞を使用する方法は、同じ産物を産生する場合であっても、先行技術を超える驚くべき改善である。

【0301】

タンパク質の収量に関するさらなるデータを表１（データファイルＳ４）に提供する。

【0302】

原核細胞、例えば大腸菌細胞は、典型的にはほとんどの真核細胞翻訳後修飾、例えばユビキチン化、グリコシル化、リン酸化を組み込むことも、典型的に他の真核細胞成熟プロセス及びタンパク質分解タンパク質成熟も行うこともできない。加えて、正確なジスルフィド結合形成及びリポ多糖類（lipolysaccharide）夾雑物は厄介であり得る（Ovaa, H., 2014. Frontiers in chemistry, 2, p.15を参照されたい）。しかしながら、治療タンパク質、例えば抗体、酵素、及びサイトカインは、一般的に翻訳後修飾及びジスルフィド結合を有し、しばしばその正確にフォールディングされた状態を達成するためにタンパク質分解成熟を必要とする。このように、治療タンパク質の大部分は、真核細胞及び哺乳動物細胞系において産生される。しかしながら、原核細胞、例えば大腸菌における発現は一般的により安価であり、遺伝子改変をより受けやすく、ミュータントライブラリ開発に関して多用途であり、工業規模での発酵にとって適切である（Ovaa, H., 2014. Frontiers in chemistry, 2, p.15）。

【0303】

このように、一部の実施形態では、合成されたポリマーは、治療ポリペプチドであり、任意で、哺乳動物タンパク質改変が１又は２以上の非標準アミノ酸を介して導入されている。合成されたポリマーは、非標準アミノ酸の少なくとも３つの別個のタイプを含む治療タンパク質などのタンパク質であり得る。

【0304】

本発明の原核細胞を使用して、その各々が他方とは異なり得る第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸を含有するポリマーが生成され得ることを示す実験データを本明細書に提供する。驚くべきことに、本発明者らは、互いに直接隣接する非標準アミノ酸を含有するポリマーが産生され得ることを示す。実際に、ポリマーは、非標準アミノ酸のみを含有し得る。リボソームが同時に１つの非標準アミノ酸を認容することができることは公知であったが、同じリボソーム内の同時に２つの非標準アミノ酸が生産的ペプチド合成を可能にすることはこれまで示されていなかった。実施例に考察されるように、２つの別個のモノマー（Ａ及びＢ）で構成される線状ポリマーに関して、４つの基本的な重合化ステップ（Ａ＋Ｂ－＞ＡＢ、Ｂ＋Ａ－＞ＢＡ、Ａ＋Ａ－＞ＡＡ、Ｂ＋Ｂ－＞ＢＢ）が存在し、そこから任意の配列を構成することができる（図５Ａ）。リボソーム媒介重合化に関して、これらの４つの基本ステップは、Ａ部位又はＰ部位基質として作用する各モノマーに対応し、同じモノマーの別のコピー又は別個のモノマーと結合を形成する（図５Ａ）。実施例に提示される実験データは、本発明者らが知る限り、これらの４つの重合化ステップの各々が可能であることを示した最初のデータである。

【0305】

このように、一部の実施形態では、合成されたポリマー、ポリペプチド、又はタンパク質は、別の非標準アミノ酸に直接隣接する少なくとも１つの非標準アミノ酸を含み得る。このポリマー、ポリペプチド、又はタンパク質は、互いに直接隣接する２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１５又は２０以上の非標準アミノ酸の鎖を含み得る。鎖は、２つ又は３つの別個の非標準アミノ酸を含み得る。

【0306】

一部の実施形態では、ポリペプチドは、合成されたポリマーから切除可能であり得る。例えば、核酸は、対象となる産物のいずれかの側に切断又は切断可能部位をコードし得る。切除された産物は、非標準アミノ酸のみで形成され得るか、又は１つ若しくは２以上の標準アミノ酸を含み得る。切除された産物は、本明細書に記載される非標準アミノ酸の鎖であり得る。

【0307】

線状若しくは環状ポリマーを含む合成されたポリマー、又はタンパク質は、合成方法後に精製され得る。精製は、ポリマー又はタンパク質を細胞及びそれが作製される培養物から分離するために当技術分野で公知の任意の形態を取り得る。

【0308】

本発明者らは、本明細書において環状ポリマーを産生するために本発明の原核細胞の使用を実証する。環状ポリマーは、本明細書に記載されるポリマーの合成を介して生成してもよく、ポリマーは自己環化することが可能である。方法は、ポリマーからのペプチドの切除を含み得て、ペプチドは、自己環化することが可能である。前記自己環化は、切除プロセスの一部であり得るが、必ずしもその必要はない。最終産物は大環状分子であり得る。

【0309】

大環状分子は４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０以上のモノマーを含み得る。大環状分子は、少なくとも第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸を含み得る。

【0310】

本発明の原核細胞を使用して、任意の他の方法で得ることができない産物を生成することができる。そのため、本発明の一態様において、本発明の方法から得られる又は本発明の方法によって得ることができるポリマーが提供される。一実施形態では、ポリマーは、少なくとも１つの第１の非標準アミノ酸、少なくとも１つの第２の非標準アミノ酸、及び任意で少なくとも１つの第３の非標準アミノ酸を含み、第１、第２、及び第３の非標準アミノ酸は、互いに異なる。ポリマーは、別の非標準アミノ酸に直接隣接する少なくとも１つの非標準アミノ酸を含み得る。ポリマーは、互いに直接隣接する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０以上の非標準アミノ酸の鎖を含み得る。ポリマーは、大環状分子であっても線状であってもよい。本発明の大環状分子は、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のモノマーを含み得る。

【0311】

本発明の原核細胞は、少なくとも１つの非標準アミノ酸を組み込む標的ポリマー又はタンパク質の産生にとって適切であり得て、産生速度は、野生型対照の産生速度の少なくとも５％、１０％、１５％、２５％、３５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、又は１４０％である。

【0312】

本発明の原核細胞は、少なくとも１つの非標準アミノ酸を組み込む標的ポリマー又はタンパク質の産生にとって適切であり得て、収量は、少なくとも０．５、１、２、５、７．５、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ／ｌであり得る。

【0313】

本発明の原核細胞を作製する方法
本発明の原核細胞を生成する方法を本明細書に提供する。前記方法の態様は、前記原核細胞を生成するための驚くほど有効なプロセスを提供し、驚くほど有益な特性を有する原核細胞をもたらす。

【0314】

このように、本発明の一態様では、原核細胞を産生する方法であって、
（ｉ）原核細胞を、第１のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように改変するステップであって、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含むステップ；
（ii）原核細胞を、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
（iii）第１の内因性ｔＲＮＡが発現しないように、第１の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
を含む方法が提供される。

【0315】

ステップ（ii）及び（iii）は、ステップ（ｉ）の前に実施されてもよい。

【0316】

特定の実施形態では、上記の方法のステップ（ｉ）及び（ii）は、ステップ（iii）の前に実施される。本発明者らは、この特定の順序が驚くほど有効であること、及び原核細胞が、方法の間改善された増殖を有することを発見した。理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、有益な効果が、ゲノムに残存し得るアノテートされていないセンスコドンの停滞の低減から生じるという仮説を立て、したがってステップのこの特定の順序は、この停滞を軽減し、増殖を改善する。

【0317】

特定の実施形態では、原核細胞を産生する方法であって、
（ｉ）原核細胞を、第１のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現させるように改変するステップであって、原核細胞が、第１の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含むステップ；
（ii）原核細胞を、第１の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
（iii）第１の内因性ｔＲＮＡが発現しないように第１の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ；及び
（ａ）原核細胞を、第２のタイプのセンスコドンを解読するために適切な第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現させるように改変するステップであって、原核細胞が、第２の内因性ｔＲＮＡが不必要であるように第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含むステップ；
（ｂ）原核細胞を、第２の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの基質である非標準アミノ酸の存在下でインキュベートするステップ；及び
（ｃ）第２の内因性ｔＲＮＡが発現しないように第２の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変するステップ
を含む方法が提供される。

【0318】

第１又は第２の内因性ｔＲＮＡが発現しないように、第１又は第２の内因性ｔＲＮＡをコードする内因性遺伝子を改変することは、原核細胞内の内因性ｔＲＮＡの機能的形態の産生を防止する任意の技術に従い得る。内因性ｔＲＮＡの機能的形態は、ｔＲＮＡ同族コドン（複数可）を解読することを可能にする形態である。例えば、内因性遺伝子を、発現を防止するために、欠失させてもよく、又は遺伝子の一部を欠失させてもよい。調節配列を欠失させてもよく、又は発現を防止するために変更してもよい。或いは、ナンセンス、フレームシフト、又はミスセンス変異は、機能的形態のｔＲＮＡの発現を防止し得る。

【0319】

ステップ（ii）及び（iii）を、ステップ（ｉ）の前に実施してもよく、並びにステップ（ｂ）及び（ｃ）を、ステップ（ａ）の前に実施してもよい、

【0320】

特定の実施形態では、上記の方法のステップ（ｉ）及び（ii）は、ステップ（iii）の前に実施される。加えて又は或いは、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、ステップ（ｃ）の前に行ってもよい。本発明者らは、この特定の順序が驚くほど有効であることを発見し、及び原核細胞は、方法の間改善された増殖を有する。理論に拘束されるわけではないが、本発明者らは、有益な効果が、ゲノムに残存し得るアノテートされていないセンスコドンの停滞の低減から生じるという仮説を立て、したがってステップのこの特定の順序は、この停滞を軽減し、増殖を改善する。

【0321】

不必要な内因性ｔＲＮＡの欠失を伴う第２の直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を導入するステップ（ステップ（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ））は、第１の直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を導入して第１の内因性ｔＲＮＡを欠失させるステップ（（ステップ（ｉ）、（ii）、及び（iii））の前、同時、又は後に実施してもよい。

【0322】

一実施形態では、方法は、原核細胞を、第１のタイプの終止コドンを解読するために適切な第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現させるように改変するステップをさらに含み、第１のタイプの終止コドンは、第１の内因性終結因子が不必要であるように原核細胞のゲノム内で再コード化されている。

【0323】

このことは、本明細書において考察される第１及び第２のタイプのセンスコドンの出現が低減された再コード化されたゲノムを含む任意の原核細胞に当てはまり得る。例えば、必須遺伝子（本明細書において考察されるように）は、第１又は第２のタイプのセンスコドンの出現を含有しなくてもよい。或いは又は加えて、ゲノムは、第１又は第２のタイプのセンスコドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。

【0324】

方法は、第１のタイプの終止コドンを解読するために適切な第３の直交性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対を発現するように原核細胞を改変するステップをさらに含んでもよく、第１のタイプの終止コドンは、第１の内因性終結因子が不必要であるように原核細胞のゲノム内で再コード化されている。このことは、本明細書において考察される第１のタイプの終止コドンの出現が低減された再コード化されたゲノムを含む任意の原核細胞に当てはまり得る。例えば、必須遺伝子（本明細書において考察されるように）は、第１のタイプの終止コドンの出現を含有しなくてもよい。或いは又は加えて、ゲノムは、第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１の出現を含んでもよく、又は出現を含まなくてもよい。

【0325】

原核細胞を産生する方法は、例えば、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡ、又はＲＦ－１を発現しない大腸菌細胞に適用してもよく、センスコドンＴＣＡの出現は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡが不必要であるように再コード化されており（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＡの出現は、ＡＧＴに置き換えられている）、センスコドンＴＣＧの出現は、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡが不必要であるように再コード化されており（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＣＧの出現は、ＡＧＣに置き換えられている）、及び終止コドンＴＡＧの出現は、ＲＦ－１が不必要であるように再コード化されている（例えば、親株の必須遺伝子におけるＴＡＧの出現は、ＴＡＡに置き換えられている）。

【0326】

特に、方法は、Ｓｙｎ６１、Ｓｙｎ６１（ｅｖ１）、又はＳｙｎ６１（ｅｖ２）に適用され得る。そのため、方法は、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１、配列番号３、又は配列番号４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを含む細菌に適用され得る。

【0327】

細胞に挿入された直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、本明細書に記載される任意のものを含む、任意の適切な対であり得る。

【0328】

特定の実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対は、ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びＡｆＴｙｒＲＳ／Ａｆ－ｔＲＮＡ^{Ｔｙｒ（Ａ０１）} _ＣＵＡである。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得る。ＡｆＴｙｒＲＳは、ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）であり得る。

【0329】

他の実施形態では、直交性ｔＲＮＡシンテターゼ－ｔＲＮＡ対はＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ；１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ／ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹ；及びＭｊＴｙｒＲＳ／ＭｊｔＲＮＡ^Ｔｙｒ _ＣＵＡである。ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹは、ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＵＧＡであり得る。１Ｒ２６ＰｙｌＲＳは、１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）であり得る。ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＹＹＹは、ＡｌｖｔＲＮＡ^{ΔＮＰｙｌ（８）} _ＣＧＡであり得る。ＭｊＴｙｒＲＳは、ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－Ｔｙｒ）又はＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）であり得る。

【0330】

本発明者らは、特定のステップを講じなければ、原核細胞を産生する方法が、増殖欠損をもたらし得ることを発見した。これらの増殖欠損を克服するために、本発明者らは、変異導入及び選択方法を利用する。特定の実施形態では、そのような方法ステップは、本明細書に開示される原核細胞を産生する方法ステップの前に実施される。そのような方法は、本発明の文脈に応用され得ることは驚くべきである。本発明者らは、当初、増殖欠損が、限定量のｓｅｒＶが原因であり得ると仮定したが、さらなる実験は、このことが正しくないことを明らかにした（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）。そのため、増殖欠損を克服できるか否かは不明であった。加えて、本発明者らは、ランダム変異導入及び選択がゲノムの再コード化の一部を元に戻し得ること、及びブランクコドンの読み飛ばしをもたらす可能性があり得ると仮定した。しかしながら、本明細書に開示される実験によって実証されるように、本発明者らは、所望の機能性を失うことなく増殖欠損を元に戻すことができた。

【0331】

このように、一実施形態では、原核細胞を産生する方法のステップの前に、方法は、本明細書に開示される再コード化されたゲノムを含む任意の原核細胞を含む細胞培養物において変異導入を誘発するステップ；細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ；前記細胞培養物から培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップを含み、原核細胞を産生する方法のステップは、選択された原核細胞に適用される。

【0332】

変異導入、変異、及び選択ステップは、本明細書に開示される平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部であり得る。平行変異導入及び動的平行選択プロセスは、W. H. Schmied et al., Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているものであり得る。

【0333】

一実施形態では、変異導入の誘発は、変異導入プラスミドの使用を含む。

【0334】

特定の実施形態では、変異導入の誘発は、変異導入プラスミド「ＭＰ６」の使用を含む。ＭＰ６は、A. H. Badran, D. R. Liu, Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nature Communications 6, 8425 (2015)（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。ＭＰ６は、配列番号５９に従い得る。

【0335】

一部の実施形態では、変異導入は、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０、又は２００以上の世代にわたって行われ得る。特定の実施形態では、変異導入は、およそ１～２００、５～１００、１０～２５、１５～２０、又は１７世代にわたって行われ得る。

【0336】

一部の実施形態では、変異導入後、変異誘発（mutator）培養物を、連続的な増殖で維持してもよい。例えば、変異誘発培養物を、複数の容器（例えば、９６ウェルプレートのウェル）に移してもよい。培養物のＯＤ_６００を、移入後、及び増殖速度に応じてその後２～９時間毎に測定してもよい。ＯＤ_６００が少なくとも３つの変異誘発培養物に関して０．５の閾値に到達すると、全ての培養物を、新しい容器に希釈してもよい（例えば、１／４００）。培養物が閾値に達しない場合、３つの最高ＯＤ_６００値を使用して次のＯＤ_６００測定時点、すなわち閾値に達するまでに要する時間を推定してもよい。３つより少ない培養物が、３回の連続するＯＤ_６００測定後に閾値に達する場合、培養物をさらに１２時間インキュベートした後、測定された細胞密度にかかわらず希釈ステップを行う。全体として、このプロセスは、急速に増殖する培養物を指数関数的な増殖で維持するための努力において選択圧を柔軟に調節する。

【0337】

一部の実施形態では、細胞培養物は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００、又は２００以上の世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持され得る。特定の実施形態では、細胞培養物は、およそ２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は５０世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持され得る。例示的な実施形態では、世代数は５２である。

【0338】

変異導入、維持、及び選択の複数のラウンドを細胞培養物に適用してもよい。例えば、１、２、３、４、５、又は１０以上のラウンドを適用してもよい。特定の実施形態では、２ラウンドが適用される。一実施形態では、各ラウンドは、およそ１０～２５（例えば１７）世代にわたる変異導入の誘発、及びおよそ２０～８０（例えば５０）世代にわたる指数関数的な増殖条件下での維持を含む。

【0339】

変異導入、変異、及び選択ステップは、Ｓｙｎ６１、Ｓｙｎ６１（ｅｖ１）、又はＳｙｎ６１（ｅｖ２）に適用され得る。そのため、方法は、GenBank受託番号ＣＰ０４０３４７．１、配列番号３、又は配列番号４に提供される配列のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、又は１００％同一であるゲノムを含む細胞に適用され得る。

【0340】

本発明者らは、特定のステップを講じなければ、第１の内因性ｔＲＮＡ、第２の内因性ｔＲＮＡ、及び／又は第１の内因性終結因子の除去が増殖欠損をもたらし得ることをさらに発見した。これらの増殖欠損を克服するために、本発明者らは、変異導入及び選択方法を利用する。特定の実施形態では、そのような方法ステップは、本明細書に開示される原核細胞を産生する方法ステップの後に実施される。内因性遺伝子の除去前のステップに関して、ランダム変異導入及び選択は、原核細胞の所望の技術的特色の一部を元に戻し、例えばブランクコドンの読み飛ばしをもたらし得ると仮定された。しかしながら、再度、本発明者らは驚くべきことに、増殖欠損が、所望の機能性を失うことなく、改善され得ることを見出した。

【0341】

このように、一実施形態では、原核細胞を産生する方法のステップの後に、方法は、原核細胞から細胞培養物を得るステップ；細胞培養物において変異導入を誘発するステップ；細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ；及び前記細胞培養物から、培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップをさらに含む。

【0342】

変異導入、変異、及び選択ステップは、本明細書に開示される平行変異導入及び動的平行選択プロセスの一部であり得る。平行変異導入及び動的平行選択プロセスは、W. H. Schmied et al., Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)（参照により本明細書に組み入れられる）に開示され得る。

【0343】

本発明者らは、変異導入プラスミドＭＰ６が、内因性ｔＲＮＡを欠如する細胞において機能的でないことを発見した。この問題を回避するために、本発明者らは、「再コード化されたＭＰ６」と呼ばれる新規プラスミドを設計した。このプラスミドは、配列番号６７に従い得る。

【0344】

他の実施形態では、変異導入プラスミドは、公知のプラスミドであり得て、プラスミドは、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコード、及び／又は第１のタイプの終止コドンを除去するように、及び前記コドンを同義コドンに置き換えるように再コード化されている。例えば、変異導入プラスミドは、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、又は第１のタイプの終止コドンの５、４、３、２、若しくは１のみの出現を含有してもよく、又は出現を含有しなくてもよい。特定の実施形態では、変異導入プラスミドは、第１又は第２のタイプのセンスコドンのいかなる出現を含有することも、第１のタイプの終止コドンのいかなる出現を含有することもない。

【0345】

そのため、本明細書において再コード化された原核細胞において変異導入を誘発するために再コード化されたＭＰ６又は再コード化された変異導入プラスミドの使用が提供される。そのような使用は、本明細書に開示される本発明の原核細胞を産生する方法の一部を形成し得る。

【0346】

一部の実施形態では、変異導入は、５、１０、１５、１７、２０、３０、４５、６０、７０、８０、１００、１５０、又は２００以上の世代にわたって行われ得る。特定の実施形態では、変異導入は、少なくとも２０、２５、３０、３５、又は４０世代にわたって行われる。特定の実施形態では、変異導入は、およそ１～２００、５～１００、１０～９０、又は２５～７５世代にわたって行われ得る。特定の例では、変異導入は、少なくとも又は約４５、６０、７０世代にわたって行われ得る。

【0347】

一部の実施形態では、変異導入後、変異誘発培養物を、連続的な増殖で維持してもよい。このプロセスは、内因性ｔＲＮＡ及び終結因子の除去前に実施されるステップに関連して考察したものと同じであり得る。

【0348】

一部の実施形態では、細胞培養物は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、５２、６０、７０、８０、１００、又は２００以上の世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持され得る。特定の実施形態では、細胞培養物は、およそ２０～８０、３０～７０、４０～６０、又は５０世代にわたって指数関数的な増殖条件下で維持され得る。例示的な実施形態では、世代数は５２である。

【0349】

変異導入、維持、及び選択の複数のラウンドを細胞培養物に適用してもよい。例えば、１、２、３、４、５、又は１０以上のラウンドを適用してもよい。特定の実施形態では、３ラウンドが適用される。一実施形態では、各ラウンドは、少なくとも２０世代にわたる変異導入の誘発、及びおよそ２０～８０（例えば、５０）世代にわたる指数関数的な増殖条件下での維持を含む。特定の実施形態では、第１のラウンドは、およそ７０世代を含み得る。第２のラウンドは、４５世代を含み得る、及び第３のラウンドは、６０世代の変異導入を含み得る。

【0350】

本発明の原核細胞を産生する方法の間の任意の段階において、方法は、表現型決定アッセイを含み得る。表現型決定アッセイは、第１のタイプのセンスコドン、第２のタイプのセンスコドン、及び第１のタイプの終止コドンが再コード化されたままであるか否かの解析を含む。アッセイは、原核細胞を、レポーター、例えばＧＦＰ（適切なレポーターは実施例で考察する）に連結された再コード化されたコドンを含むレポータープラスミドによって形質転換することを含み得る。ｎｃＡＡを組み込むために再コード化されたコドンを解読することが可能な直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対もまた、挿入される。次に、アッセイは、ｎｃＡＡに依存するレポーターシグナルが存在するか否かを決定するためにｎｃＡＡ基質の存在下又は非存在下で細胞をインキュベートすることを含み得る。さらなる詳細を実施例に提供する。

【0351】

上記のように、本発明者らは、驚くべきことに、変異導入及び選択方法が、再コード化に影響を及ぼすことなく再コード化されたゲノムを有する原核細胞に適用され得ることを発見した。

【0352】

このように、本発明の一態様では、ゲノムが再コード化されている原核細胞の増殖速度を改善する方法であって
再コード化されたゲノムを含む原核細胞を含む細胞培養物において変異導入を誘発するステップ
細胞培養物を指数関数的な増殖条件下で維持するステップ
前記細胞培養物から、培養初期と比較して増殖速度が増加した原核細胞を選択するステップ
を含む方法が提供される。

【0353】

原核細胞は、第１のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み得る。第１のタイプのセンスコドンの再コード化は、本明細書に開示される任意の再コード化されたタイプのセンスコドンを含む任意のセンスコドンであり得る。原核細胞は、第１及び第２のタイプのセンスコドンが再コード化されているゲノムを含み得る。第１及び第２のタイプのセンスコドンの再コード化は、本明細書に開示される任意の再コード化されたタイプのセンスコドンを含む任意の２つのセンスコドンであり得る。

【0354】

変異導入を誘発する、細胞を維持する、及び細胞を選択する方法は、本明細書に開示される任意の方法であり得る。

【0355】

ゲノムを再コード化する方法
以下の方法は、センス又は終止コドンを同義コドンに置き換えるために当業者がゲノムを再コード化することを可能にする。さらなる情報は、ｉ)K. Wang et al., Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64 (2016); ii)J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)；iii）国際公開第２０１８／０２０２４８号パンフレット、及びiv）国際公開第２０２０／２２９５９２号パンフレット（その各々が参照により本明細書に組み入れられる）において入手可能である。

【0356】

一例では、好ましくは１又は２以上の組換え媒介遺伝子操作のラウンドを使用して、親ゲノムの１０～１０００ｋｂ、５０～１０００ｋｂ、１００～１０００ｋｂ、又は１００～５００ｋｂを編集し、２又は３以上の異なる部分的に合成されたゲノムを提供する。このように、好ましい例では、組換え媒介遺伝子操作の各ラウンドは、親ゲノムにおけるＤＮＡの１０ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、１００ｋｂ以上、又は約１００ｋｂを挿入又は置き換える。

【0357】

本明細書で使用される場合、「組換え媒介遺伝子操作」（同様に「組換え」としても公知である）という用語は、相同組換え系に基づく遺伝子操作のための方法（すなわち、ゲノムの編集）である。典型的に、組換えは、バクテリオファージタンパク質、ＲａｃファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、又はバクテリオファージラムダのＲｅｄαβδのいずれかによって媒介される大腸菌における相同組換えに基づく。組換え媒介遺伝子操作の任意の適切な方法を使用してもよい。組換え媒介遺伝子操作の方法は、当業者に周知である。

【0358】

「古典的組換え」（大腸菌におけるラムダｒｅｄ媒介組換えによって例証される）の場合、合成ＤＮＡの短い領域をゲノムに挿入してもよく、又は合成ＤＮＡの短い領域を使用して、２ステッププロセス：ｉ）陽性選択マーカーにカップリングされ、及び各々の末端で相同性領域（ＨＲ）によってゲノムの標的領域に隣接する、合成ＤＮＡのストレッチを有する線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）による細胞の形質転換、及びii）相同領域によって媒介される組換え後の陽性選択マーカーによるゲノム組み込みに関する選択で、ゲノムＤＮＡを置き換えてもよい。このアプローチを使用して、ゲノムＤＮＡの２～３ｋｂを挿入又は置き換えることができる。このように、古典的組換えを使用する場合、親ゲノムの１００～５００ｋｂを編集するためには、多くのラウンドの組換え媒介遺伝子操作が必要であろう。

【0359】

このように、好ましい例では、１又は２以上のラウンドの組換え媒介遺伝子操作は、１又は２以上のラウンドのプログラムされた組換えを通してのゲノム操作増強のためのレプリコン切除（ＲＥＸＥＲ，replicon excision for enhanced genome engineering through programmed recombination）を含む。

【0360】

ＲＥＸＥＲは、国際公開第２０１８／０２０２４８号パンフレットに記載されている。ＲＥＸＥＲの各ラウンドを使用して、親ゲノムにおけるＤＮＡの約５０ｋｂ～２５０ｋｂ、又は約１００ｋｂを挿入又は置き換えてもよい。

【0361】

このように、１又は２以上のラウンドの組換え媒介遺伝子操作は
ｉ）エピソームレプリコン（例えば、プラスミド又は細菌人工染色体）及び標的核酸（例えば、ゲノム）を含む宿主細胞（例えば、大腸菌）を提供するステップであって、エピソームレプリコンがドナー核酸配列（すなわち、合成領域）を含み、ドナー核酸配列が以下の順：５’－相同組換え配列１－所望の配列－相同組換え配列２－３’を含み、所望の配列が陽性選択マーカーを含み、及び標的核酸が以下の順：５’－相同組換え配列１－陰性選択マーカー－相同組換え配列２－３’を含むステップ；
ii）前記宿主細胞において核酸の組換えを支持することが可能なヘルパータンパク質（複数可）（例えば、ラムダＲｅｄタンパク質）を提供するステップ；
iii）前記宿主細胞において核酸切除を支持することが可能なヘルパータンパク質（複数可）及び／又はＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質／ＲＮＡ）を提供するステップ；
iv）前記ドナー核酸配列の切除を誘発するステップ；
ｖ）切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ；及び
vi）前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体に関して選択するステップ
を含み得る。

【0362】

前記ドナー核酸が前記標的核酸に組み込まれた組換え体を適切に選択することは、ドナー核酸の陽性選択マーカーの獲得及び標的核酸の陰性選択マーカーの喪失に関して選択することを含む。ドナー核酸の陽性選択マーカーの獲得及び標的核酸の陰性選択マーカーの喪失に関する適切な選択は、同時に行われる。適切には、前記所望の配列は、陽性選択マーカー及び陰性選択マーカーの両方を含む。適切には、陰性選択マーカーは、ｓａｃＢ（スクロース感受性）、ｒｐｓＬ（Ｓ１２リボソームタンパク質－ストレプトマイシン感受性）、及びｐｈｅ^{ＳＴ２５１Ａ＿Ａ２９４Ｇ}（４－クロロフェニルアラニン感受性）からなる群から選択される。適切には、陽性選択マーカーは、Ｃｍ^Ｒ（クロラムフェニコール耐性）、Ｋａｎ^Ｒ（カナマイシン耐性）、Ｈｙｇ^Ｒ（ヒグロマイシン耐性）、ゲンタマイシン^Ｒ（ゲンタマイシン耐性）、及びテトラサイクリン^Ｒ（テトラサイクリン耐性）からなる群から選択される。適切には、組換え体を選択するステップは、前記陽性及び陰性マーカーの連続的選択、又は前記陰性及び陽性マーカーの連続的選択を含む。適切には、組換え体を選択するステップは、前記陽性及び陰性マーカーの同時の選択を含む。

【0363】

適切には、上記の前記方法は、標的核酸配列において少なくとも１つの二本鎖切断を誘発するステップをさらに含み、前記二本鎖切断は、前記相同組換え配列１と前期相同組換え配列２の間である。適切には、少なくとも２つの二本鎖切断が標的核酸配列に誘発され、前記二本鎖切断は、前記相同組換え配列１と前期相同組換え配列２の間である。

【0364】

適切には、前記切除されたドナー核酸は、前記相同組換え配列１で始まり、前記相同組換え配列２で終わる。

【0365】

適切には、前記エピソームレプリコンは、ドナー核酸配列とは無関係に陰性選択マーカーを含む。適切には、前記方法は、ドナー核酸配列とは無関係に前記陰性選択マーカーの喪失に関して選択することによってエピソームレプリコンの喪失に関して選択するさらなるステップを含む。適切には、前記エピソームレプリコンは、以下の順序を含む：切除切断部位１－ドナー核酸配列－切除切断部位２。適切には、前記標的核酸は、前記宿主細胞内で機能することが可能な自身の複製開始点を保有する。適切には、前記エピソームレプリコンは、プラスミド核酸である。適切には、前記エピソームレプリコンは、細菌人工染色体（ＢＡＣ， bacterial artificial chromosome）である。適切には、前記標的核酸は、宿主細胞ゲノムである。

【0366】

エピソームレプリコン（例えば、ＢＡＣ）を、例えばＳ・セレビジエ（S. cerevisiae）において、Kouprina、N.、et al., 2004. Methods Mol Biol 255, 69-89に記載されるように相同組換えによってアセンブルしてもよい。アセンブリは、各々が６～１３ｋｂの長さである７～１４ストレッチの合成ＤＮＡ；選択コンストラクト（陰性選択マーカー及び／又は陽性選択マーカーを含む）；及びＢＡＣシャトルベクターバックボーンを結合させ得る。合成ＤＮＡのストレッチは集合的に、エピソームレプリコン中のドナー核酸配列（すなわち、合成領域）に対応し、各ストレッチは、互いに重複するＤＮＡ配列の８０～２００ｂｐを含み、重複する領域は、いかなる再コード化標的も含まない。ストレッチは、適切な制限部位（例えば、ＢｓａＩ、ＡｖｒII、ＳｐｅＩ、又はＸｂａＩ）が隣接するｐＳＣ１０１又はｐＳＴベクターにおいて供給され得る。このように、アセンブリの間、合成ＤＮＡストレッチを、対応する制限酵素による消化によって切除してもよい。エピソームレプリコンのアセンブリをシーケンシングによって確認してもよい。

【0367】

適切には、２つの相同性領域は、３０～１００ｂｐ、又は４０～５０ｂｐ、又は約５０ｂｐの長さであり得る。

【0368】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構を切除のために使用してもよい。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構は、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び２つのスペーサーＲＮＡを含み、スペーサーＲＮＡは、切除のために２つの相同性領域を標的とする。好ましい実施形態では、スペーサーＲＮＡは、線状二本鎖スペーサーである。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構は、Ｃａｓ９及び２つのｓｇＲＮＡを含み、ｓｇＲＮＡは、切除のために２つの相同性領域を標的とする。

【0369】

ラムダｒｅｄ組換え機構を、組換えのために使用してもよい。ラムダｒｅｄ組換え機構は、ラムダアルファ／ベータ／ガンマを含み得る。

【0370】

方法は、１又は２以上のラウンドのＲＥＸＥＲ、すなわち第１のドナー核酸配列による上記のステップを実施すること、前記ドナー核酸配列に連続するさらなるドナー配列（複数可）を選択すること、及び前記ステップを、部分的に合成されたゲノムがアセンブルされるまで前記さらなるドナー核酸配列（複数可）によって繰り返すことを含み得る。これは、Wang, K. et al., 2016. Nature 539, 59-64に記載され、国際公開第２０２０／２２９５９２号パンフレットの図４に図示されているゲノム段階的交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ，genome stepwise interchange synthesis）として公知である。

【0371】

好ましい例では、ドナー配列（複数可）は、合成ゲノムの領域に対応する。

【0372】

このように、ドナー配列（複数可）（すなわち、合成領域）は、１つ又は２つ以上のセンスコドンの２０以下の出現を含んでもよく；及び／又はドナー配列（複数可）は、１又は２以上のセンスコドンの出現を含まない、１０以上、２０以上、又は１００以上の遺伝子を含んでもよい。

【0373】

ドナー配列（複数可）（すなわち、合成領域）は、１又は２以上のセンスコドンの各々の５０以下、２０以下、１０以下、５以下の出現を有するか、又は出現を有さず；及び／又は親ゲノムにおける対応する領域と比較して１又は２以上のセンスコドンの各々の１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満の出現を含む；及び／又は１又は２以上のセンスコドンの出現を含まない、１０以上、２０以上、又は１００以上の遺伝子を含むことを除き、親ゲノムの配列（すなわち、非合成領域）と同一であり得る。

【0374】

ドナー配列（複数可）（すなわち、合成領域）をまた、親ゲノム配列（すなわち、非合成領域）と比較してリファクタリングを行ってもよい。３’，３’重複（すなわち、反対方向での遺伝子対）の場合、合成インサートを遺伝子の間に挿入してもよい。３’，３’重複の場合、合成インサートは、重複領域を含み得る。５’，３’重複の場合（すなわち、同じ方向の遺伝子対）、合成インサートは、遺伝子の間に挿入され得る。５’，３’重複の場合、合成インサートは：（ｉ）終止コドン；（ii）重複領域の上流から約２０～２００ｂｐ、又は２０～１００ｂｐ、又は２０～５０ｂｐ；及び（iii）重複領域を含み得る。好ましくは、合成インサートは、（ｉ）終止コドン；（ii）重複領域の上流から約２０ｂｐ；及び（iii）重複領域を含む。好ましい実施形態では、終止コドンは、下流の遺伝子の当初の開始部位とインフレームである。好ましくは、終止コドンはＴＡＡである。

【0375】

好ましくは、ドナー配列（複数可）（すなわち、合成領域）は、集合的に５０～１００００ｋｂ、１００～５０００ｋｂ、１００～２０００ｋｂ、１００～１０００ｋｂ、又は１００～５００ｋｂのサイズである。好ましくは、各ドナー配列は、５０～３００ｋｂ、１００～２００ｋｂ、又は約１００ｋｂのサイズである。

【0376】

したがって、ドナー配列は、各々約１００ｋｂのサイズであり得て、１又は２以上のセンスコドンの出現を含まないこと、及び親ゲノムにおける１又は２以上のセンスコドンを含む重複領域を共有する全ての遺伝子対がリファクタリングされること、遺伝子対が、センスコドンの置き換えが遺伝子の対の両方又は片方のコードされるタンパク質配列を変化させる対であることを除き、親ゲノムの対応する配列と同一である。

【0377】

好ましい例では、ゲノムの生存率は、組換え媒介遺伝子操作の各ラウンド後に試験される。一部の例では、ゲノムの配列は、組換え媒介遺伝子操作の各ラウンド後に確認される。

【0378】

一部の実施形態では、ゲノムは、低減された合成ゲノム又は最小の合成ゲノムである。「低減されたゲノム」は、親ゲノムのサイズが、非必須遺伝子及び／又は非コード領域を除去することによって低減されているゲノムである。「最小ゲノム」は、その最小サイズまで低減されているが、なおも、例えばゲノムの全ての非必須領域を欠失させることによって生存したままであるゲノムである。

【0379】

リファクタリング
ゲノムは、複数の重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有し、これは、３’、３’（反対方向のＯＲＦの間）又は５’、３’（同じ方向のＯＲＦの間）として分類することができる。置き換えられるセンスコドンは、親ゲノムにおける両方のクラスの重複内で見出され得る。

【0380】

重複内の各ＯＲＦのセンスコドンの置き換えは、いずれかのＯＲＦ（すなわち、同義コドン（複数可）を導入することによって）のコードされるタンパク質配列を変化させることなく達成することができ、次にこれは、必ずしも親ゲノムを編集（例えば、リファクタリング）する必要はない。しかしながら、コードされるタンパク質配列が、センスコドンの置き換えによって変化する（すなわち、１又は２以上の同義センスコドンが、ＯＲＦの１つ又は両方に導入されない）場合、親ゲノムを編集（例えば、リファクタリング）する必要があり得る。

【0381】

このように、一部の例では、親ゲノムにおけるセンスコドンを含む重複領域を共有する１又は２以上の遺伝子対がリファクタリングされる。「リファクタリングされた」とは、遺伝子が、コードされるタンパク質配列に対する変化を防止するために再構築されることを意味する。好ましくは、遺伝子対は、センスコドンの置き換え（例えば、定義された同義コドン置き換え）が、遺伝子対の両方又は片方のコードされたタンパク質配列を変化させる遺伝子対である。最も好ましくは、親ゲノムにおけるセンスコドンを含む重複領域を共有する全ての遺伝子対はリファクタリングされ、遺伝子対は、センスコドンの置き換え（例えば、定義された同義コドンの置き換え）が、遺伝子対の両方又は片方のコードされたタンパク質配列を変化させる遺伝子対である。

【0382】

３’，３’重複（すなわち、反対方向の遺伝子対）の場合、合成インサートを、遺伝子の間に挿入してもよい。３’，３’重複の場合、合成インサートは、重複領域を含み得る。

【0383】

５’，３’重複（すなわち、上流の遺伝子及び下流の遺伝子を含む同じ方向の遺伝子対）の場合、合成インサートを、遺伝子の間に挿入してもよい。５’，３’重複の場合、合成インサートは、（ｉ）終止コドン；（ii）重複領域の上流から約２０～２００ｂｐ、又は２０～１００ｂｐ、又は２０～５０ｂｐ；及び（iii）重複領域を含み得る。好ましくは、合成インサートは、（ｉ）終止コドン；（ii）重複領域の上流から約２０ｂｐ；及び（iii）重複領域を含む。これは、下流のＯＲＦに関してＲＢＳの配列及びこのＲＢＳとその開始コドンの間の距離を保存する。

【0384】

好ましい実施形態では、終止コドンは、下流の遺伝子の元の開始部位とインフレームである。好ましくは、終止コドンはＴＡＡである。

【0385】

全般
全ての例において、「原核細胞」と記載される場合、本発明はまた、複数の原核細胞を含有する細胞培養物にも拡大される。同様に、「細菌」と記載される場合、本発明はまた、複数の細菌を含有する細菌培養物にも拡大される。

【0386】

配列比較は、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの公開された及び市販のコンピュータープログラムは、２つ又は３つ以上の配列間の配列同一性を計算することができる。

【0387】

当業者は、２つの核酸配列間のパーセンテージ同一性を計算する方法を認識している。２つの核酸配列間のパーセンテージ同一性を計算するためには、２つの配列のアライメントを最初に準備しなければならず、その後に配列同一性の値を計算する。２つの配列のパーセンテージ同一性は、（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）又はＳｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）によって適用される）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（例えば、Ｗａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）によって適用される）、又はＬＡＬＩＧＮアプリケーション（例えば、Ｍａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）によって適用される）；及び（ii）アライメント方法、例えばローカル対グローバルアライメント、使用される行列によって使用されるパラメーター、及びギャップに適用されるパラメーターに応じて異なる値を取り得る。

【0388】

アライメントを作製した後、２つの配列間のパーセンテージ同一性を計算する多くの異なる方法が存在する。例えば、同一性の数を：（ｉ）最も短い配列の長さ；（ii）アライメントの長さ；（iii）配列の長さの平均値；（iv）非ギャップ位置の数；又は（ｖ）オーバーハングを除外する等価の位置の数によって除算してもよい。さらに、パーセンテージ同一性はまた、強い長さ依存性であることも認識される。したがって、配列対がより短ければ、偶然に起こると予想され得る配列同一性はより高くなる。

【0389】

次に、２つの核酸配列間のパーセンテージ同一性の計算を、（Ｎ／Ｔ）^＊１００のようなアライメントから計算してもよく、式中Ｎは、配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除くものと比較した位置の総数である。

【0390】

配列アライメントは、ペアワイズ配列アライメントであり得る。適切なサービスは、Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｗａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｍａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、ＬＡＬＩＧＮ、又はＧｅｎｅＷｉｓｅを含む。一例として、２つの核酸配列間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば行列（ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップオープン（１０）、ギャップ伸長（０．５）、エンドギャップペナルティ（偽）、エンドギャップオープン（１０）、及びエンドギャップ伸長（０．５）に設定したサービスＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して計算してもよい。別の例では、２つの核酸配列の間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば行列（ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップオープン（１）、ギャップ伸長（１）に設定したサービスＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）を使用して計算され得る。

【0391】

本明細書に記載される（任意の添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面を含む）全ての特色、及び／又はそのように開示された任意の方法又はプロセスのステップの全てを、そのような特色の少なくとも一部及び／又はステップが相互に排他的である組合せを除く任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わせてもよい。

【0392】

本発明をよりよく理解するために、及び同じ実施形態がどのように行われ得るかを示すために、本発明を制限することを意図しない以下の実施例を参照する。

【実施例】

【0393】

細胞ｔＲＮＡを除去して、その同族のコドンを読み取り不能にすることは、ウイルス感染症に対する遺伝的ファイアウォールを作製し、センスコドンの再定義を可能にするとする仮説が広がっている。しかしながら、これらの仮説を試験することは、そのような細菌が作製されていなかったことから不可能であった。本明細書において、大腸菌における同義コドン圧縮及び実験的進化後、本発明者らは、通常、２つのセンスコドン及び終止コドンを解読するｔＲＮＡ及び終結因子－１を欠失させ；得られた細胞は、標準的な遺伝子コードを読み取ることができず、ウイルスのカクテルに対して完全に耐性である。本発明者らは、これらのコドンを再定義して、３つの別個の非標準アミノ酸を含有するタンパク質の効率的な合成を可能にする。重要なことに、本発明者らは、多様な非標準ヘテロポリマー及び大環状分子のコード化された翻訳のための細胞の容易なリプログラミングを実証する。

【実施例1】

【0394】

Ｓｙｎ６１Δ３の作製
本発明者らは、細菌細胞のゲノムにおけるアノテートされたＴＣＡ、ＴＣＧ及びＴＡＧコドンを置き換えることが、単一の株におけるこれらのコドンを解読するｓｅｒＴ及びｓｅｒＵ（ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡをコードする）及びｐｒｆＡ（ＲＦ－１をコードする）の欠失を可能にすると予測した（図１Ａ）。本発明者らは、ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ及びｐｒｆＡを、Ｓｙｎ６１から派生した個別の株において欠失させることができることを以前に示した（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）；しかしながら、これは、これらの遺伝子間の潜在的なエピスタシスをとらえたものではない。そのため、本明細書に開示される実験では、ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ及びｐｒｆＡを、Ｓｙｎ６１から派生した単一の株で欠失させることができるか否かを調べた。

【0395】

Ｓｙｎ６１は、それが派生した株より１．６倍遅く増殖する（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）。ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ及びｐｒｆＡ欠失前の株の増殖速度を増加させるために、以前に記載されたランダム平行変異導入及び自動動的平行選択ストラテジーを適用した（W. H. Schmied et al., Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function. Nature 564, 444-448 (2018)）；このアプローチは、フィードバック制御を使用して、増殖速度に基づいて変異した培養物を劇的に希釈し、それによって変異した集団内から速く増殖する株を選択する（図Ｓ１Ａ）。変異導入及び選択の２連続ラウンドを通して、株Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）を作製し、これは１．３倍速く増殖した（図１Ｂ、図Ｓ１Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ、及びデータファイルＳ１及びＳ２）。

【0396】

次に、ｓｅｒＵ、ｓｅｒＴ及びｐｒｆＡを、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）から切除して、Ｓｙｎ６１Δ３を作製した（図１Ａ、図Ｓ１Ｃ、及びデータファイルＳ１及びＳ２）。これは、Ｓｙｎ６１における標的コドンを除去することが、同じ株における標的コドンの全ての解読体の欠失を可能にするために十分であることを実証した。しかしながら、Ｓｙｎ６１Δ３は、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）より１．７倍遅く増殖した（図１Ｂ）。この増殖の減少は、アノテートされていない及び標的化されなかったＳｙｎ６１のゲノムにおける標的コドンの存在に起因し得て（M. R. Hemm et al., Small Stress Response Proteins in Escherichia coli: Proteins Missed by Classical Proteomic Studies. Journal of Bacteriology 192, 46 (2010)、S. Meydan et al., Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Mol Cell 74, 481-493 e486 (2019)）、及びｔＲＮＡが果たし得る他の非標準的役割に起因し得る（A. Katz, S. Elgamal, A. Rajkovic, M. Ibba, Non-canonical roles of tRNAs and tRNA mimics in bacterial cell biology. Mol Microbiol 101, 545-558 (2016)、Z. Su, B. Wilson, P. Kumar, A. Dutta, Noncanonical Roles of tRNAs: tRNA Fragments and Beyond. Annu Rev Genet 54, 47-69 (2020)）。

【0397】

Ｓｙｎ６１Δ３をＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）に進化させるために、ランダム平行変異導入及び自動動的平行選択の３連続ラウンドを実施したところ、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）はＳｙｎ６１Δ３より１．６倍速く増殖した（図１Ａ及びＢ、図Ｓ１Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、及びＨ、及びデータファイルＳ１）。振とうフラスコ中のＬＢ培地中で増殖させると、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の倍加時間は、３８．７２＋／－１．０２分であった（図Ｓ１Ｉ）。Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）は、４８２個の追加の変異、つまり４２０個の置換及び６２個のインデルを含み、そのうち７２個はＳｙｎ６１に関して遺伝子間領域にある（データファイルＳ１及びＳ３、図Ｓ２）。標的コドンは、元に戻らず、本発明者らの再コード化スキームの安定性をさらに実証した。非必須遺伝子における１６のセンスコドンを、標的コドン（５×ＴＣＧ、３×ＴＣＡ、８×ＴＡＧ）に変換した；これらの頻度は、他のコドンに関して観察された頻度と同等である（データファイルＳ１）。その後の実験は、Ｓｙｎ６１Δ３又は（入手可能であれば）その進化した派生物を使用してこれらの株の新規特性を調べた。

【0398】

材料及び方法－実施例１
遺伝子の再コード化
この研究で使用した遺伝子及びプラスミドに関して、遺伝子コードを圧縮する必要があった。タンパク質ＣＤＳの遺伝子コードを、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプト（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）を使用して、Ｓｙｎ６１（ＴＣＧからＡＧＣ、ＴＣＡからＡＧＴ、ＴＡＧからＴＡＡ）の設計において実行された再コード化規則を使用して圧縮した。配列の詳細に関してはデータファイルＳ２を参照されたい。

【0399】

再コード化されたヘルパー及びＭＰ６プラスミドの構築
この節からの全てのクローニング手順を、いずれもストレプトマイシンに対する耐性のためにｒｐｓＬＫ４３Ｒ変異を含有する大腸菌ＤＨ１０ｂ又はＭＤＳ４２において実施した。全てのラムダｒｅｄ媒介組換え実験のために本試験を通して使用したヘルパープラスミドは、参考文献（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）に記載された再コード化型の「ヘルパー」プラスミドｐＫＷ２０＿ＣＤＦｔｅｔ＿ｐＡｒａＲｅｄＣａｓ９＿ｔｒａｃｒＲＮＡであり、これは、本明細書において「再コード化されたヘルパー」と呼ばれる；配列の詳細に関してはデータファイルＳ２を参照されたい。

【0400】

再コード化されたヘルパープラスミドを構築するために、配列を最初に、２０～２５ｂｐのオーバーラップを有する以下の５つの区分に分割した：ｉ）ａｒａＣ、ｐＢＡＤプロモーター及びラムダｒｅｄガンマをコードする区分１、ii）ラムダｒｅｄベータ及びアルファの後に一意的ＢｓａＩ部位をコードする区分２、iii）ＢｓａＩ部位に隣接するＣａｓ９をコードする区分３、iv）ａｐｒａＲ選択マーカーをコードする区分４、及びｖ）ｐＣＤＦ起源、ｔｒａｃｒＲＮＡカセット、及びアンピシリンプロモーターをコードする区分５。

【0401】

区分１～３は、Ｇｅｎｅｗｉｚ社が合成し、区分４は、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成され、及び区分５は、当初のヘルパープラスミドからＰＣＲによって増幅した（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）。

【0402】

再コード化されたヘルパープラスミドをアセンブルするために、最初に区分４及び５を、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって組み合わせた。次に産物を、ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）によって、区分１及び２と共に中間プラスミドにアセンブルした。中間プラスミドを大腸菌ＭＤＳ４２に形質転換し、その配列を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって確認した。最後に、中間プラスミドをＢｓａＩによって消化し、ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって区分３と共にアセンブルして、再コード化されたヘルパープラスミドを生成した。プラスミド配列を、ＮＧＳによって確認した。

【0403】

本発明者らは、Ｓｙｎ６１株進化のために再コード化型のＭＰ６変異導入プラスミドを設計した（A. H. Badran, D. R. Liu, Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nature Communications 6, 8425 (2015)）。再コード化された配列を、クローニングの間、変異導入構成要素の発現を最小限にするために以下の４つの重複する区分に分割した：ｉ）ａｒａＣ及びｐＢＡＤプロモーターをコードする区分１、ii）ｄｎａＱ９２６の大部分の後にＡｖｒII部位、ＰｍＣＤＡ１、及びクロラムフェニコール耐性のためのｃａｔをコードする区分２、iii）ｄｎａＱ９２６のＮ末端の後にｄａｍ、ｓｅｑＡ、ｅｍｒＲ、及びｕｇｉをコードする区分３、及びiv）ｐＣＤＦ起源を含有する区分４。区分１～３を、Ｇｅｎｅｗｉｚ及びＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが合成し、区分４は、元のＭＰ６プラスミドからＰＣＲによって増幅した（A. H. Badran, D. R. Liu, Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nature Communications 6, 8425 (2015)）。区分４を、ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）によって区分１及び２と組み合わせ、中間プラスミドを生成し、及び区分間の重複を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。最後に、中間プラスミドを、AvrIIによって消化し、ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって区分３と共にアセンブルして再コード化されたＭＰ６を生成した。プラスミド配列をＮＧＳによって確認した（配列の詳細に関してはデータファイルＳ２を参照されたい）。

【0404】

自動平行進化及び株の単離
２ラウンドの平行変異導入及び自動動的平行選択を、Ｓｙｎ６１に適用し、次にＳｙｎ６１Δ３に３ラウンドを適用した。変異導入に関して、Ｓｙｎ６１を、変異導入プラスミドＭＰ６（A. H. Badran, D. R. Liu, Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nature Communications 6, 8425 (2015)）（又はＳｙｎ６１Δ３及び派生進化物に関しては再コード化されたＭＰ６）によって形質転換し、細胞を２％グルコース及び２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有したＬＢアガー上で増殖させた。９６個の個々のコロニーを採取して２％グルコース及び２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＬＢ培地２００μＬを含有するウェルに入れ、コロニーを３７℃、２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。密度の高い終夜培養物を、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充した新鮮なＬＢ培地に１／４００倍希釈し、ＯＤ_６００が約０．１となるまで増殖させた。変異導入を、Ｌアラビノースを０．５％の最終濃度まで添加することによって誘発し、各ウェルにおいて独立した変異誘発培養物を作製した。変異誘発培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍで２４時間増殖させた。新しい誘発培地（２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び０．５％Ｌ－アラビノースを有するＬＢ）への１／４００倍希釈ステップ後、培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍでさらに２４時間増殖させた。これは、誘発された変異導入によるおよそ１７世代の増殖相に等しい（２ｘｌｏｇ_２（４００））。後の進化ラウンドでは、変異導入の誘発を７０世代まで延長した。変異導入を、Ｓｙｎ６１進化のラウンド１及び２に関しておよそ１７世代の間誘発した。Ｓｙｎ６１Δ３進化の間、変異導入を、ラウンド１で約７０世代、ラウンド２で約４５世代、及びラウンド３で約６０世代の間誘発した。

【0405】

変異導入後、変異誘発培養物を、変異導入を抑制するために２％グルコースを補充したＬＢ培地２００μｌを有する新しい９６ウェルプレートに１／２倍希釈した。プレートを、ロボティクスプラットフォーム（Thermofisher社製のＣｙｔｏｍａｔ ２ＣインキュベーターシェーカーにアクセスするBeckman Coulter社製のＢｉｏｍｅｋ ＦＸｐ、及びMolecular Devices社製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｉ３プレートリーダー）に移して連続的に増殖させ（３７℃、４００ｒｐｍ）、最も速く増殖するクローンに関して自動動的平行選択を行った（スクリプトはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＪＷＣｈｉｎ－Ｌａｂで入手可能）。ＯＤ_６００を、各ウェルにおいて開始時に測定し、その後、増殖速度に応じて２～９時間毎に定期的に測定した。ＯＤ_６００が少なくとも３つの変異誘発ウェルに関して０．５の閾値に達すると、全ての培養物を、２％グルコースを補充したＬＢ ２００μＬを有する新しいプレートに１／４００倍希釈した。いずれのウェルも閾値に達しなかった場合、プレート間で３つの最高のＯＤ_６００値を使用して、次のＯＤ_６００測定時点、すなわち、閾値に達するまでに要する時間を推定した。連続する３回のＯＤ_６００測定後に閾値に達したウェルが３個未満であった場合、プレートをさらに１２時間インキュベートして測定された細胞密度にかかわらず、希釈ステップを実行した。全体として、このプロセスは、最も速く増殖するウェルを指数関数的な増殖に維持するための努力における選択圧を柔軟に調整する。６回の希釈ステップ（推定で５２世代の増殖に等しい）後、ワークフローを終了し、以下に記載される最終プレートにおける全ての進化した変異誘発ウェルの増殖速度を決定した。最も低い倍加時間を有する進化集団のウェルを、２％グルコース及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを有するＬＢアガープレートで画線培養し、３７℃で終夜インキュベートして、単コロニーを得た。４～１２個の個々の進化したコロニーを、各画線培養集団から採取し、進化前の祖先株と直接比較して個々のクローンに関して増殖速度を測定した。最も早く増殖するクローンを、次世代シーケンシング及び以下のようにさらなる解析のために調製した。

【0406】

１ラウンドのＳｙｎ６１進化後、９６ウェルプレートの１０個の独立したウェルからの細胞を、画線培養して、単コロニーを得た。８０個のクローンをこれらの画線培養から採取し、その倍加時間をスクリーニングした。最初に単離されたスクリーニングしたクローン８０個中２０個は、単一の反復実験で低減された倍加時間を示した。しかし、これらのクローン中４個のみが、反復実験で行われたその後の測定で改善された増殖を示した。これらの４つのクローンのうち２つ（Ｃ０２．５及びＣ０２．６）は、単一のウェルから派生し、他の２つのクローンは、いずれも別個の単一のウェルから派生する（Ｃ０４．４及びＣ０４．７）。４つ全てのクローンをシーケンシングした（全ての蓄積された変異の完全なリストに関してはデータファイルＳ１を参照されたい）。これらのクローンのうち１つ（Ｃ０４．４）を先に進めてＳｙｎ６１（ｅｖ１）と再度命名した。

【0407】

Ｓｙｎ６１（ｅｖ１）の進化後、９６ウェルプレートの１２個の独立したウェルからの細胞を画線培養して、単コロニーを得た。８８個のクローンをこれらの画線培養から採取して、その倍加時間をスクリーニングした。最初に単離されたスクリーニングされたクローン８８個中１８個が、１回の反復実験で低減された倍加時間を示した。しかし、これらのクローンのうち３個のみが、反復実験で実施したその後の測定で改善された増殖を示した。これらのクローンのうち２個（Ａ１１．２及びＡ１１．３）は、単一のウェルから派生し、第３のクローン（Ｅ１０．４）は、別個のウェルに由来した。３つのクローンを全てシーケンシングした（全ての蓄積された変異の完全なリストに関してはデータファイルＳ１を参照されたい）。これらのクローン中１個（Ａ１１．２）を先に進めてＳｙｎ６１（ｅｖ２）と再度命名した。Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）を使用してＳｙｎ６１Δ３を生成した。

【0408】

Ｓｙｎ６１Δ３を、２つの９６ウェルプレートで進化させた。４２個の独立したウェルからの細胞を画線培養し、全体で１８４個のクローンをこれらの画線培養細胞から採取し、その倍加時間をスクリーニングした（クローンの８８個は、プレート１の２２個のウェルに由来し、９６個のクローンは、プレート２の２０個のウェルに由来した）。クローン１８４個中１３０個は、当初Ｓｙｎ６１Δ３と比較して顕著に低減された倍加時間を示した。最も速く増殖するクローン２２個を（ほとんどの）反復増殖実験において特徴付けた。これらのクローンは、１１個の独立したウェルから派生した（プレート２：Ｆ１１．２、Ｆ１１．３、Ｆ１１．５、Ｆ１１．６、Ｆ１１．７、Ｆ１１．８、Ｆ１１．９、Ｆ１１．１０（全て、ウェルＦ１１から）、Ｅ１０．１、Ｅ５．１、Ｆ５．２、Ｆ８．１、Ｆ８．２、Ｇ５．２、Ａ１１．１；プレート１：Ａ７．４、Ｄ８．２、Ｄ８．４、Ａ９．１、Ｇ８．１、Ｄ１．２、Ｄ１１．１）。以下のクローンをシーケンシングして、さらなるシーケンシング解析のために選択した（全ての蓄積された変異の完全なリストに関してはデータファイルＳ１を参照されたい）：Ａ７．４、Ｆ１１．９、Ｅ５．１、Ｄ８．２。これらのクローンの１つ（Ｆ１１．９）を先に進めて、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）と再度命名した。

【0409】

Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）の９６個の独立したウェルを進化させた。最も低い全体的倍加時間（overall doubling time）を有する１９個のウェルを画線培養し、１つのウェルが画線培養において生存しなかったために１８個のウェルから９０個のクローンを単離した。３７個のクローンは、単一の反復測定では低減された倍加時間を示した。最も速く増殖する２２個のクローンを、反復測定のために選択し、５つの別個のウェルからの８個のクローンを、先祖と比較して改善された増殖を有すると特定した：Ｅ７．４、Ｅ７．２（ウェルＥ７から）；Ｅ１０．３、Ｅ１０．４（ウェルＥ１０から）；Ｄ５．３、Ｄ５．１（ウェルＤ５から）；Ｄ８．１、Ｂ９．１。４つのクローンをシーケンシングし、さらなるシーケンシング解析のために選択した：Ｅ７．４、Ｅ７．２、Ｅ１０．４、Ｄ５．３及びＤ８．１（データファイルＳ１）。最も改善された増殖を有する１つのクローン（Ｅ７．４）を、次の進化ラウンドのために選択し、これをＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）と再度命名した。

【0410】

Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）を、１つの９６ウェルプレート（プレート１）において進化させ、実験が初回のプログラム（次の希釈までの増殖の最大時間１２時間）により改善された倍加時間を有するいかなるウェルも生じなかった後、選択プログラムを適合させた（次の希釈までの増殖の最大時間を１２時間ではなくて６．５時間に設定した）。同様に、プレート１において中間の変異導入を行うことなく、連続の選択ラウンドも実施し、得られた進化したプールセットをプレート２と呼ぶ。全体として、適合させた動的選択後に生存したウェルは少なかった。１３個のウェルを、プレート１から画線培養し、７個のウェルをプレート２から画線培養し、全体で１５２個のクローンを、単一の反復測定でスクリーニングした（プレート１から９６個及びプレート２から５６個）。４３個のクローンが最初に改善された増殖を示したが、非進化前駆体と比較して反復測定で再現性よく速い増殖を示したのは５個のクローンに過ぎず、全て別個のウェルからであった：プレート１：Ｂ１２．３、Ｄ５．３、Ｇ１２．６、Ｅ７．３；プレート２：Ｅ８．４。１つのクローンを、この試験で使用した最も進化したＳｙｎ６１派生物として選択し（Ｂ１２．３）、これをＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）と再度命名した。

【0411】

ラムダｒｅｄ組換えによりＳｙｎ６１Δ３を生成するためのｐｒｆＡ、ｓｅｒＵ及びｓｅｒＴの欠失
Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）におけるｓｅｒＵ、ｓｅｒＴ及びｐｒｆＡのスカーレス欠失を実施し、各欠失を連続する２つのラムダｒｅｄ媒介組換えを通して進行させた。第１の組換えでは、２倍選択マーカーカセットをレシピエント細胞に提供し標的遺伝子を置き換えた。第２の組換えでは修復鋳型を提供し、２倍選択マーカーを除去して、これを、標的遺伝子に対応する配列のみが欠失している標的座の天然の環境と置き換えた。

【0412】

再コード化型のｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒ選択マーカーカセット（J. Fredens et al., Total synthesis of Escherichia coli with a recoded genome. Nature 569, 514-518 (2019)）を、全ての欠失のために使用した。再コード化されたｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒを、ｓｅｒＵ、ｓｅｒＴ及びｐｒｆＡの隣接するゲノム配列に対して約５０ｂｐの相同性を含有するオリゴによって増幅した。ｓｅｒＵ、ｓｅｒＴ及びｐｒｆＡの修復鋳型を、オーバーラップ伸長ＰＣＲを通して構築した；標的遺伝子の直ちに上流及び下流の５００～６００ｂｐの領域を、約４０ｂｐ重複するように設計されたオリゴによってＳｙｎ６１ゲノムＤＮＡ鋳型から増幅した。次に、これらの２つの断片を、オーバーラップ伸長ＰＣＲによって１つのＰＣＲ産物に組み合わせ、これを修復鋳型として使用した。全てのオリゴヌクレオチド配列をデータファイルＳ２に提供する。

【0413】

第１の組換えに関して、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）細胞を、再コード化されたヘルパープラスミドによって形質転換した。単コロニーを、５０μｇ／ｍｌアプラマイシンを有する２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで振とうさせながら終夜増殖させた。終夜培養物を、５０μｇ／ｍｌアプラマイシンを有する２ｘＹＴ培地５００ｍＬにＯＤ_６００＝０．０５となるように希釈し、細胞を、３７℃で振とうさせながらＯＤ_６００＝約０．２となるまで増殖させた。ラムダｒｅｄ発現を誘発するために、Ｌ－アラビノース粉末を培養物に最終濃度０．５重量／体積％となるように添加し、３７℃で振とうさせながらさらに１時間インキュベートした。細胞を、ＯＤ_６００＝約０．６で回収し、細胞を、以前に記載されたように（K. Wang et al., Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64 (2016)）エレクトロコンピテントにした。エレクトロコンピテント細胞１００μＬを、ｓｅｒＵ座と相同性を有するｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒ ＰＣＲ産物約４μｇによって電気穿孔し、ＳＯＢ ４ｍＬ中で１時間回復させた後、５０μｇ／ｍｌアプラマイシンを補充した２ｘＹＴ １００ｍＬに移した。４時間後、細胞を遠心沈降させ、Ｈ_２Ｏ ５００μＬ中に再懸濁させ、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアプラマイシン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した２ｘＹＴアガープレートにおいて連続希釈して播種した。プレートを３７℃で終夜インキュベートし、その後個々のコロニーを採取した。これらのコロニーを、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアプラマイシン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補充した２ｘＹＴアガープレート上に再度画線培養した。３７℃で終夜インキュベーション後、対象となる欠失を、所望の座に隣接するプライマーによるコロニーＰＣＲによって確認した。このプロセスを、得られた株Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）ΔｓｅｒＵ∴ｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒにおいて再度繰り返し、ｓｅｒＵ修復鋳型を提供し、２％グルコース、５０μｇ／ｍｌアプラマイシン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した２ｘＹＴアガープレート上で対比選択した。ｒｐｓＬ－ｋａｎ^Ｒカセットの除去を、コロニーＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。類似の２ステッププロセスを通してのｓｅｒＴ及びｐｒｆＡの連続的欠失は、Ｓｙｎ６１Δ３の作製をもたらした。

【0414】

増殖速度の測定及び解析
細菌コロニーを、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＬＢ中、３７℃で終夜増殖させた。終夜培養物を、９６ウェルプレートに新しい培地２００μＬ中で１：２００倍希釈した。増殖を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏプレートリーダー（Tecan AG社、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって、３７℃、高速の線形振とうによってモニターした。ＯＤ_６００の測定を、５分毎に１８時間行った。倍加時間を決定するために、増殖曲線を、ｌｏｇ_２変換し、全ての連続する時点での一次導関数を決定した（ｄ（ｌｏｇ_２（ｘ））／ｄｔ）。本発明者らは、ｌｏｇ_２導関数の最大値を有する連続する１０個の時点に対する平均値を使用して、倍加時間を計算した（１／平均値（ｌｏｇ_２導関数の最大値））。増殖速度を、ｌｏｇ_２導関数の最大値を有する連続する１０個の時点に対する線形フィットの勾配として計算した（上記で決定した通り）。カーブフィッティング（直線回帰）を、Ｐｒｉｓｍ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して同時に反復実験について実施した。エラーバーは、±フィットの標準誤差を示す。

【0415】

標準的な実験条件下での増殖を決定するために、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）の終夜培養物を、２５０ｍｌコニカルフラスコ中新しい培地８０ｍｌ中に１：１００倍希釈した。３つの反復実験培養物を、３７℃で振とうさせながら（２２０ｒｐｍ）インキュベートし、ＯＤ_６００測定を、指数関数相の間に１０分毎、１０～３０分毎に行った。各独立した培養物に関して、本発明者らは増殖曲線をｌｏｇ_２変換し、指数関数相の間の最も速い増殖を有する６０分間のウィンドウを選択した。増殖速度（勾配）及び倍加時間（１／勾配）を、ウィンドウ内の連続する６つの時点でｌｏｇ_２導関数への線形フィットから計算した。カーブフィッティング（直線回帰）をＰｒｉｓｍ７（Ｇｒａｐｈｐａｄ）によって各反復実験について実施し、平均倍加時間及び増殖速度を計算した。エラーバーは、±平均値の標準誤差を示す。

【0416】

次世代シーケンシングのための全ゲノムライブラリの調製
所望のクローンからコロニーを採取し、これを使用して、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＬＢ ５ｍＬに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで振とうさせながら終夜インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、ＤＮＥａｓｙ血液組織キット（QIAgen社）によって、製造元の使用説明書に従ってこれらの培養物から抽出した。精製されたゲノムＤＮＡから、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリ調製キット（Illumina社）によって手作業で、又はＢｉｏｍｅｋ ＦＸｐ（Beckman Coulter社、スクリプトはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＪＷＣｈｉｎ－Ｌａｂで入手可能）によって、容量を低減させて製造元のプロトコールに従ってペアードエンドシーケンシングライブラリを調製した：投入ｇＤＮＡ（０．２ｎｇ／μＬ、１μＬ）、ＴＤ緩衝液（２μＬ）、ＡＴＭ（１μＬ）、ＮＴ緩衝液（１μＬ）、インデックス（１μＬ）、ＮＰＭ（３μＬ）。インデックス配列は、「Illumina Adapter Sequence」サポート文書（Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡインデックス、１６頁、２０２０年６月）から生成し、Biomers社から購入し、１０μＭで使用した。次にライブラリを、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Beckman Coulter社）によって製造元の使用説明書に従って（６：１０のビーズ：反応体積比）で精製した。ライブラリを、Ｑｕｂｉｔ（Thermofisher社）によって定量し、その後プールして変性させ、ｖ３ ＭｉＳｅｑ試薬キットを使用してＭｉＳｅｑ（Illumina社）において製造元の使用説明書に従って６００サイクル（２×３００サイクル）又は１５０サイクル（２×７５サイクル）のいずれかのペアードエンドシーケンシングを行った。

【0417】

Ｓｙｎ６１ノックアウト及び進化した株の解析
この作業で生成されたＳｙｎ６１派生物のゲノム配列を分析するために、本発明者らは、次世代シーケンシング読み取りデータ（上記で生成したもの）を参照ゲノムと整列させ、変異、欠失、及び挿入を同定する（D. E. Deatherage, J. E. Barrick, Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol 1151, 165-188 (2014)）ソフトウェアパッケージであるｂｒｅｓｅｑを使用した。プログラムを使用して、各進化ラウンド又は標的遺伝子ノックアウト（ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ、ｐｒｆＡ）後の単離されたクローンを解析し、これらの株の生成の間に生じる変異を同定する（データファイルＳ１は、全ての中間株及び変異のリストを含有する）。加えて、以前に記載されたワークフロー（K. Wang et al., Defining synonymous codon compression schemes by genome recoding. Nature 539, 59-64 (2016)）（スクリプトはｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＴｉｏｎｇＳｕｎ／ｉＳｅｑで入手可能）を使用して、読み取りデータを参照Ｓｙｎ６１ゲノム配列と整列させ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ H. Thorvaldsdottir, J. T. Robinson, J. P. Mesirov, Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics 14, 178-192 (2013)）において読み取りデータのアライメントを可視化した。さらに、本発明者らは、１つより多くの変異を有するＯＲＦを同定した（図Ｓ２）。これらの同じ進化したプールから派生したクローンは、その配列がほぼ同一であることが見出されたことから、本発明者らは、解析のためにプールあたり、最も全体的な変異を有する１つのみのクローンを選択した。本発明者らは、解読要素の除去後に遺伝的背景の変更によりＳｙｎ６１Δ３の進化において獲得された変異とは別個に、ｓｅｒＴ、ｓｅｒＵ及びｐｒｆＡの欠失の前に、進化の間に蓄積したＯＲＦにおける全ての変異を比較した。変異が独立した事象であると仮定して、本発明者らは、少なくとも２つの変異が１つのＯＲＦにおいて偶然生じる確率を

【0418】

【数1】

【0419】

（式中、ａは、ＯＲＦの総数（Ｓｙｎ６１では、ａ＝３５５６）であり、ｂは、１ラウンドの進化後のＯＲＦに蓄積した変異の平均数である）によって計算した。

【実施例2】

【0420】

ｔＲＮＡ欠失は、Ｓｙｎ６１Δ３におけるウイルス産生を除去する
本発明者らは、ｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＣＧＡ及びｔＲＮＡ^Ｓｅｒ _ＵＧＡ及びＲＦ－１をコードする遺伝子の欠失がファージ増殖に及ぼす影響を、Ｓｙｎ６１Δ３（図２Ａ）により改変された１ステップ増殖実験（L. You, P. F. Suthers, J. Yin, Effects of Escherichia coli Physiology on Growth of Phage T7 In Vivo and In Silico. Journal of Bacteriology 184, 1888 (2002)）において調べた。

【0421】

Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）に関して、ファージＴ６（溶解性のＴ－ｅｖｅｎファミリーの代表（図２Ｂ））の総力価は、感染した細胞が新規ファージ粒子を産生するために投入力価より２－ｌｏｇｓ_１０上に上昇する前に短期間低下した（ファージ感染細胞として）（図２Ｃ、図Ｓ３Ａ）。予想されたように、Ｓｙｎ６１（ｅｖ２）のＯＤ_６００は、溶解性であるＴ６ファージの感染により減少した（図２Ｄ）。Ｓｙｎ６１ΔＲＦ－１（データファイルＳ１）及びＳｙｎ６１（ｅｖ２）は、同等のタイムスケールで同等のレベルのファージを産生し、感染時にＯＤ_６００の類似の変化を示した。本発明者らは、ＲＦ－１単独の欠失が、Ｔ６ファージ産生又は細胞溶解に対して、もしあるとしてもほとんど効果を有しないという結論に達する。

【0422】

Ｓｙｎ６１Δ３のＴ６ファージによる感染は、総ファージ力価の着実な減少をもたらした。重要なことに、この減少は、タンパク質合成の際に観察されたものと同等であり、したがって細胞におけるファージ産生は、ゲンタマイシンの添加により完全に阻害された（図２Ｃ、図Ｓ３Ｂ）。その上、Ｔ６感染は、Ｓｙｎ６１Δ３の増殖にほとんど影響を及ぼさなかった（図２Ｄ）。本発明者らは、Ｓｙｎ６１Δ３が、Ｔ６ファージによる感染時に新規ファージ粒子を産生しない、及びＴ６ファージがこれらの細胞を溶解しないという結論に達する。類似の結果が、その４０ｋｂゲノムに５７個のＴＣＧコドン、１１４個のＴＣＡコドン、及び６個のＴＡＧコドンを有するＴ７ファージについても得られた（図Ｓ３Ａ、Ｃ及びＤ）。本発明者らは、そのゲノムにアンバー終止コドンより１０～５８倍多くのＴＣＡ又はＴＣＧセンスコドンを有するラムダ、Ｐ１ｖｉｒ、Ｔ４、Ｔ６及びＴ７を含有するファージのカクテルによって細胞を処置し（図２Ｅ、図Ｓ３Ｅ）、このファージカクテルによる処置がＳｙｎ６１（ｅｖ２）及びＳｙｎ６１ΔＲＦ－１の溶解をもたらすが、Ｓｙｎ６１Δ３の増殖にはほとんど影響を及ぼさなかったことを見出し（図２、Ｆ及びＧ）、このことは、Ｓｙｎ６１Δ３におけるｔＲＮＡの欠失が広範囲のファージに対する耐性を提供することを示唆した。

【0423】

材料及び方法－実施例２
全般的なファージの方法
ファージλ、Ｐ１ｖｉｒ、Ｔ４、及びＴ６は、Ｇｅｏｒｇｅ Ｓａｌｍｏｎｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）から提供された。ファージＴ７は、ＡＴＣＣ（ＢＡＡ－１０２５－Ｂ２）から得た。各ファージストックの力価を、ファージ緩衝液（１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１％ゼラチン）中でストックを連続希釈することによって推定し、トップアガー（０．３５％アガーを有するＬＢアガー）において大腸菌ＭＧ１６５５に感染させ、プラークを３７℃で終夜成熟させた。プラークを計数し、各ストックについてＰＦＵ／ｍＬを計算した。

【0424】

感染性ファージの総力価
大腸菌Ｓｙｎ６１バリアントの終夜培養物を２ｘＹＴにおいてＯＤ_６００＝０．５となるように希釈した後、５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブに３ｍＬを移し、それらにファージＴ６又はＴ７（それぞれ、ＭＯＩ＝５×１０^－２及び５×１０^－５）を感染させた。各ファージに関して、ファージを２ｘＹＴ ３ｍＬに添加した無細胞対照を含んだ。次に、感染した培養物を、３７℃で４時間インキュベートし、２２０ｒｐｍで振とうさせた。適当な時点で、試料の１００μＬを、氷中で各培養物からファージ緩衝液４００μＬ及びクロロホルム５０μＬを含有する微量遠心チューブに移した。試料を直ちに十分ボルテックス処理し、１３０００×ｇで４分間遠心分離し、ＬｏＢｉｎｄ微量遠心チューブ（Eppendorf社）に移し、４℃で保存した。ファージ力価を定量するために、各試料をファージ緩衝液中で連続希釈した。適当な希釈液１０μＬを使用して、２ｘＹＴ中で増殖させた大腸菌ＭＧ１６５５の終夜培養物２００μＬに感染させた。感染した細胞を、ｍｏｌｔｅｎトップアガー４ｍＬと混合し、ＴＹＥアガープレートに注いだ。乾燥後、プレートを３７℃で終夜インキュベートして、菌叢を増殖させ、ファージプラークを発達させた。プラークの数を計数し、希釈倍数を乗算することによって元の試料のファージ力価を計算した。

【0425】

バックグラウンド対照として、大腸菌Ｓｙｎ６１を、代謝的に不活性にした：本発明者らは、終夜培養物を、２ｘＹＴ １０ｍＬ中でＯＤ_６００＝１となるように希釈し、ゲンタマイシンを１０００μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、細胞を３７℃、２２０ｒｐｍで振とうさせながら６時間インキュベートした。細胞を４０００×ｇで１０分間遠心分離した後、抗生物質を含有する上清を吸引した。不活性な細胞を、２ｘＹＴ中でＯＤ_６００＝０．５となるように再懸濁させ、それらに上記のようにファージを感染させた。本発明者らは、ゲンタマイシン処置細胞の代謝活性を、新たに合成されたタンパク質への３５Ｓ組み込みによって評価した。ゲンタマイシン処置大腸菌Ｓｙｎ６１培養物（ＯＤ_６００＝０．５）１ｍＬを、メチオニン及びシステインの３５Ｓ標識混合物（１１ｍＣｉ／ｍＬ、１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Perkin Elmer社ＮＥＧ０７２）１．５μＬの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。

【0426】

本発明者らは、インキュベーション終了時のＯＤ_６００を測定し、細胞を４０００×ｇで１０分間遠心沈降させ、細胞を冷ＰＢＳによって洗浄した。上記のＯＤ_６００測定に基づいて、細胞を、１ｘＢｕｇＢｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Merck社）に１．４×１０^９個／ｍＬ（光路長１ｃｍでＯＤ_６００ １．０＝１×１０^９個／ｍＬと仮定する）の密度で再懸濁させた。細胞を１時間溶解し、細胞２．８×１０^７個の等価物を、４～１２％Ｂｉｓ－ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルの各レーンにロードした。次に、本発明者らは、溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、Ｑｕｉｃｋクマシー染色（Neo Biotech社）によって製造元の使用説明書に従って染色した。得られたゲルを乾燥させ、ストレージ蛍光スクリーン（GE Healthcare Life Sciences社）に２週間露光した後、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎ（GE Healthcare Life Sciences社）においてイメージングした。

【0427】

ファージ感染アッセイ
複数のファージに同時に感染させるために、本発明者らは、上記のようにＳｙｎ６１バリアントの培養物を調製し、５つ全てのファージのカクテル（λ、Ｐ１ｖｉｒ、Ｔ４、Ｔ６、及びＴ７、各ファージに関してＭＯＩ＝１×１０^－２）を添加した。細胞増殖及び溶解を、４時間後のＯＤ_６００の測定によってモニターし、非感染培養物と比較した。

【0428】

ファージゲノムＴＣＧ、ＴＣＡ、ＴＡＧコドン計数
本発明者らは、カスタムＰｙｔｈｏｎ３．７スクリプトを使用して異なるファージのゲノムにおけるＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンの数及び位置を同定した。簡単に説明すると、スクリプトは、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ（P. J. A. Cock et al., Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics 25, 1422-1423 (2009)）を使用して所望のファージのアノテートされたゲノムを含有するGenBankファイルを開き、次にコード配列をスキャンして、標的コドン及びその位置を同定し、それらをメモリーに保存する。Ｐｙｔｈｏｎライブラリのｍａｔｐｌｏｔｌｉｂ（J. D. Hunter, Matplotlib: A 2D Graphics Environment. Computing in Science & Engineering 9, 90-95 (2007)）を使用して、各標的コドンの位置が垂直線で表されるゲノムのプロットを生成する。スクリプトは、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＪＷＣｈｉｎ－Ｌａｂで入手可能である。

【実施例3】

【0429】

ｎｃＡＡの組み込み
ｎｃＡＡ組み込みのための標的コドンの再定義
本発明者らは、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）においてＵｂ_{１１ＸＸＸ}遺伝子（１１位にＴＣＧ、ＴＣＡ又はＴＡＧを有するユビキチン－Ｈｉｓ_６）、及び同族の直交性ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ対をコードする遺伝子（T. Yanagisawa et al., Multistep Engineering of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase to Genetically Encode Ne-(o-Azidobenzyloxycarbonyl) lysine for Site-Specific Protein Modification. Chemistry & Biology 15, 1187-1197 (2008)）（アンチコドンは、Ｕｂ遺伝子の１１位のコドンと相補的である）を発現させた（図３Ａ、データファイルＳ２）。

【0430】

ｎｃＡＡを添加しない場合、１１位で標的コドンを有するＵｂ遺伝子からユビキチンはほとんど又は全く検出されなかったが、対照実験は、ユビキチンが、任意の標的コドンを含有しない「野生型」遺伝子から産生されることを実証した（図３Ｂ）。このように、標的コドンはいずれも、Ｓｙｎ６１Δ３における内因性の翻訳機構によって読み取られなかった。このことは、標的コドンの全てが、この株において直交性であることをさらに実証する。

【0431】

ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ対（Ｎ^ε－（（ｔｅｒｔ－ブトキシ）カルボニル）－Ｌ－リシン（ＢｏｃＫ））のｎｃＡＡ基質を添加すると（T. Yanagisawa et al., Multistep Engineering of Pyrrolysyl-tRNA Synthetase to Genetically Encode Ne-(o-Azidobenzyloxycarbonyl) lysine for Site-Specific Protein Modification. Chemistry & Biology 15, 1187-1197 (2008)）、ユビキチンが、野生型対照と同等のレベルで産生された（図３Ｂ、データファイルＳ４）。ＥＳＩ－ＭＳ及びＭＳ／ＭＳは、相補的なＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＹＹＹ対を使用して各標的コドンに応答してＵｂの１１位でＢｏｃＫの遺伝的に方向付けられた組み込みを実証した（図３Ｃ、図Ｓ４Ａ）。追加の実験は、ＧＳＴ－ＭＢＰにおけるセンス及び終止コドンに応答してｎｃＡＡの効率的な組み込みを実証した（図Ｓ５、データファイルＳ４）。本発明者らは、標的コドンの各々に応答して、２、３、又は４個のｎｃＡＡを単一のポリペプチドに組み込むＵｂ－Ｈｉｓ_６の良好な収量を実証し（データファイルＳ４、図３、Ｄ～Ｉ、及び図Ｓ４、Ｂ～Ｇ）、及び単一の反復タンパク質における９個のＴＣＧコドンに応答した９個のｎｃＡＡの組み込みをさらに実証した（図Ｓ６）。併せると、これらの結果は、センスコドンＴＣＧ及びＴＣＡ、及び終止コドンＴＡＧが、Ｓｙｎ６１Δ３派生物においてｎｃＡＡを有効に再定義することができることを実証した。

【0432】

別個の標的コドンに応答した別個のｎｃＡＡのコード化
次に、本発明者らは、別個のｎｃＡＡを認識し、別個のコドンを解読する改変された相互直交性ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を使用してＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）においてＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンを別個のｎｃＡＡに定義した（図４Ａ、図Ｓ７）。本発明者らは、ＴＣＧ及びＴＡＧコドンに応答して２つの別個のｎｃＡＡをユビキチンに組み込み（図４Ｂ、図Ｓ８Ａ～Ｂ）、及びユビキチンの４つの部位での２つの別個のｎｃＡＡの組み込みを実証し、各ｎｃＡＡは、タンパク質における２つの異なる位置で組み込まれる（図４Ｂ及びＣ、及び図Ｓ８Ｃ～Ｅ、及びデータファイルＳ４）。本発明者らは、ＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンに応答して、３つの別個のｎｃＡＡをユビキチンに組み込んだ（図４Ｄ、Ｅ、及び図Ｓ８Ｆ）。本発明者らは、各々が３つの別個のｎｃＡＡを組み込むユビキチンの７つの異なる型を合成することによってそのアプローチの全般性を実証した（図Ｓ９、図Ｓ１０、データファイルＳ４）。

【0433】

コードされた非標準ポリマー及び大環状分子
２つの別個のモノマー（Ａ及びＢ）で構成される線状ポリマーに関して、任意の配列を構成することができる４つの基本重合化ステップ（Ａ＋Ｂ－＞ＡＢ、Ｂ＋Ａ－＞ＢＡ、Ａ＋Ａ－＞ＡＡ、Ｂ＋Ｂ－＞ＢＢ）が存在する（図５Ａ）。リボソーム媒介重合化に関して、これらの４つの基本ステップは、Ａ部位又はＰ部位基質として作用する各モノマーに対応し、同じモノマーの別のコピーと、又は別個のモノマーと結合を形成する（図５Ａ）。本発明者らは、ｓｆＧＦＰ遺伝子のコドン３にＴＣＧ－ＴＣＧ（ＡＡをコードする；モノマーＡは、この命名法ではＴＣＧコドンに任意に定義された）、ＴＡＧ－ＴＡＧ（ＢＢをコードする；モノマーＢは、ＴＡＧコドンに定義された）、ＴＣＧ－ＴＡＧ（ＡＢをコードする）及びＴＡＧ－ＴＣＧ（ＢＡをコードする）を挿入することによって各基本ステップをコード化した。本発明者らは、モノマーの３つの対の基本ステップを実証した：Ａ＝ＢｏｃＫ、Ｂ＝ｐ－ＩＰｈｅ；Ａ＝ＣｂｚＫ、Ｂ＝ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ；Ａ＝Ｎε－アリルオキシカルボニル－Ｌ－リシン（ＡｌｌｏｃＫ）、Ｂ＝ＣｂｚＫ（図５Ｂ、図Ｓ１１）。本発明者らは、６つの完全に非天然の四量体配列及びモノマーの各対に関して六量体配列、並びにＡｌｌｏｃＫ、ＣｂｚＫ対に関しては八量体配列（全体で２２個の合成ポリマー配列）を遺伝的にコード化した（図Ｓ１１、図５、Ｃ、Ｄ、及びＥ、図Ｓ１２）。全てのコード化された重合化は、ｎｃＡＡ依存的であり（図Ｓ１１、図５、Ｃ、Ｄ及びＥ、図Ｓ１２Ｂ）、ＥＳＩ－ＭＳは、本発明者らがｓｆＧＦＰ融合体としての非標準六量体及び八量体を合成したことを確認した（図５Ｆ、図Ｓ１２Ｃ）。本発明者らは、ＳＵＭＯ及びＧｙｒＡ－ＣＢＤ及び精製された遊離のポリマーの間でＡｌｌｏｃＫ及びＣｂｚＫで構成される四量体及び六量体配列をコード化した（図５、Ｇ、Ｈ、及びＩ、図Ｓ１３）。最後に、本発明者らは、非リボソームペプチドシンテターゼの産物に類似の非天然大環状分子の合成をコード化した（図５、Ｇ及びＪ）。

【0434】

【表1】

【0435】

材料及び方法－実施例３
ユビキチン及びＧＦＰを発現させるためのベクターの構築
全てのクローニングを、大腸菌ＤＨ１０ｂにおいて行った。ユビキチン（Ｕｂ）又はｓｆＧＦＰを発現させるためのプラスミドを、ｐＢＡＤ発現系に基づいて構築した（T. S. Elliott et al., Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology 32, 465-472 (2014)）。再コード化された野生型ユビキチン、ｓｆＧＦＰ、ａｐｒａ^Ｒ、及びａｒａＣを、ｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として注文した。次にプラスミドを、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）との４ピースアセンブリを通して構築し、重複する断片は、ＰＣＲによって増幅された、ｉ）再コード化された野生型Ｕｂ又はｓｆＧＦＰ、ii）再コード化されたａｐｒａ^Ｒ、iii）再コード化されたａｒａＣ、及びiv）ｐＢＡＤベクター起源領域のいずれかであった。これは、プラスミドｐＢＡＤ＿Ｕｂ－ｗｔ＿ｒｅｃ及びｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰ－ｗｔ＿ｒｅｃを生成した。ＴＣＧ、ＴＣＡ、又はＴＡＧコドンがＵｂ又はｓｆＧＦＰ遺伝子に導入されているこれらのプラスミドのバリアントを、ｐＢＡＤ＿Ｕｂ－ｗｔ＿ｒｅｃ及びｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰ－ｗｔ＿ｒｅｃの部位特異的変異導入によって生成した。全てのプラスミドの配列の詳細に関してはデータファイルＳ２を参照されたい。

【0436】

ＴＣＧ、ＴＣＡ、又はＴＡＧコドンを解読するためのａａＲＳ／ｔＲＮＡプラスミドの構築
全てのクローニングを、大腸菌ＤＨ１０ｂにおいて行った。１つのタイプのｎｃＡＡを組み込むために、本発明者らは、ｎｃＡＡ組み込みを方向付ける、ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対をコードするｐＭＢ１ベースのプラスミドを使用した。アンチコドンＣＧＡ及びＵＧＡを有するｔＲＮＡ^Ｐｙｌコンストラクトの場合、本発明者らは、アンチコドンステムループ（ＡＳＬ－アンチコドンプラスいずれかの側に６ヌクレオチド）全体が、アンチコドンＣＧＡ及びＵＧＡを有するｓｅｒＵ（ＣＧＡの場合）又はｓｅｒＴ（ＵＧＡの場合）大腸菌遺伝子のＡＳＬ配列と置き換えられるように、ｐｙｌＴｔＲＮＡ遺伝子（参考文献C. Fan, H. Xiong, N. M. Reynolds, D. Soll, Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Research 43, e156-e156 (2015)からのｐｙｌＴｏｐｔ変異を含む）を設計した。

【0437】

ｐＭＢ１ベースのａａＲＳ／ｔＲＮＡプラスミドを、ｉ）ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成された、構成的ｇｌｎＳプロモーターの制御下の再コード化されたａａＲＳ、ii）ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成された、ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの間に配置されたｔＲＮＡ遺伝子、iii）再コード化されたｋａｎ^Ｒ遺伝子、及びiv）以前に記載されたｐＭＢ１ベースのプラスミド（T. S. Elliott et al., Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology 32, 465-472 (2014)）からＰＣＲによって増幅されたｐＭＢ１ベクター起源を含む、複数の断片のＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって構築した。この戦略によって、プラスミドｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ／ＵＧＡ／ＣＵＡ）をアセンブルした。全てのプラスミド配列は、データファイルＳ２に記載されるそのGenBank受託番号を介して入手可能である。

【0438】

２重又は３重ｎｃＡＡ組み込みのためにａａＲＳ／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドの設計及び構築
２重及び３重の別個のｎｃＡＡ組み込み実験に関して、本発明者らは、２つのａａＲＳ／ｔＲＮＡ対（D. L. Dunkelmann, J. C. W. Willis, A. T. Beattie, J. W. Chin, Engineered triply orthogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA pairs enable the genetic encoding of three distinct non-canonical amino acids. Nature Chemistry 12, 535-544 (2020)）をポリシストロニックにコードするプラスミドを設計した。本発明者らは、ｇｌｎＳプロモーターの下流に２つのａａＲＳ ＣＤＳを配置し；ａａＲＳ遺伝子の間の遺伝子間領域を、ＲＢＳ計算プログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｓｌａｂ．ｎｅｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）によって最適化した。両方のｔＲＮＡ遺伝子を、ｌｐｐプロモーターの下流に配置した。ｔＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間領域は、大腸菌ゲノムにおけるａｌａＸ及びａｌａＷ遺伝子の間の遺伝子間領域に基づいた。

【0439】

２つのａａＲＳ／ｔＲＮＡ対をコードするプラスミドを構築するために、本発明者らは、個々のｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）としてその対応するＲＢＳ配列がその前にある再コード化されたａａＲＳ遺伝子を注文した。ポリシストロニックｔＲＮＡを、ｌｐｐプロモーター、ｒｒｎＣターミネーター、及び遺伝子間領域と共に、単一のｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として注文した。本発明者らは、ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）によって、ｋａｎ^Ｒ（上記）を含有するｐＭＢ１バックボーンと共にａａＲＳ遺伝子及びｔＲＮＡを共にコードする合成ＤＮＡ断片をアセンブルした。このように、本発明者らは、プラスミドｐＭＢ１＿１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）＿ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）＿ＡｌｖｔＲＮＡ－ΔＮＰｙｌ（８）（ＣＧＡ）＿ＡｆｔＲＮＡ－Ｔｙｒ（Ａ０１）（ＣＵＡ）、ｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）＿ＭｍｔＲＮＡＰｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）＿ＡｌｖｔＲＮＡ－ΔＮＰｙｌ（８）（ＣＵＡ）、ｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＡｆＴｙｒＲＳ（ｐ－Ｉ－Ｐｈｅ）＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌｏｐｔ（ＣＧＡ）－ＡｆｔＲＮＡ－Ｔｙｒ（Ａ０１）（ＣＵＡ）及びｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌｏｐｔ（ＣＧＡ）＿ＡｌｖｔＲＮＡ－ΔＮＰｙｌ（８）（ＵＧＡ）を生成した。プラスミド配列は、データファイルＳ２に記載されるそのGenBank受託番号を介して入手可能である。

【0440】

３つの別個のｎｃＡＡを組み込むために、本発明者らは、ｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＵＧＡ）を鋳型として、ｉ）ｇｌｎＳプロモーターの制御化でＭｍＰｙｌＲＳ、及びii）ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの間にｐｙｌＴ－ｓｅｒＴ（ＵＧＡ）キメラｔＲＮＡ遺伝子（上記を参照されたい）を包含するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。次に、本発明者らは、部位特異的変異導入を使用して、ユビキチンのコドン９、１１及び１４位がそれぞれ、ＴＡＧ、ＴＣＧ及びＴＣＡに置換されている中間ｐＢＡＤ＿Ｕｂ派生物を個別に作製した。次に、ＭｍＰｙｌＲＳ／ｐｙｌＴｓｅｒＴ（ＵＧＡ）断片をＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって中間プラスミドにおけるユビキチン遺伝子の下流に挿入した。最後に、部位特異的変異導入を、得られたプラスミドにおいて、参考文献C. Fan, H. Xiong, N. M. Reynolds, D. Soll, Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Research 43, e156-e156 (2015)と同様にｔＲＮＡ^Ｐｙｌの配列に「ｏｐｔ」変異の導入を方向付けるプライマーによって実施し、ｐＢＡＤ＿Ｕｂ９ＴＡＧ１１ＴＣＧ１４ＴＣＡ－ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＵＧＡ）を生成した。本発明者らは、このプラスミドを開始点として使用して、親プラスミドのａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を、ＨｉＦｉ ａｓｓｅｍｂｌｙによってＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）又はＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－ＴｙｒＲＳ）の再コード化された合成ＤＮＡ断片、又はその対応するｔＲＮＡと置き換えることによって、ｐＢＡＤ＿Ｕｂ９ＴＡＧ１１ＴＣＧ１４ＴＣＡ－ＭｊＴｙｒＲＳ（ｐ－Ａｚ－Ｐｈｅ）＿ｔＲＮＡ－Ｍｊ－Ｔｙｒ（ＣＵＡ）及びｐＢＡＤ＿Ｕｂ９ＴＡＧ１１ＴＣＧ１４ＴＣＡ－ＭｊＴｙｒＲＳ（３－Ｎｉｔｒｏ－ＴｙｒＲＳ）＿ｔＲＮＡ－Ｍｊ－Ｔｙｒ（ＣＵＡ）を作製した。配列をデータファイルＳ２に詳述する。

【0441】

ＢｏｃＫ及びｐ－Ｉ－ＰｈｅのｓｆＧＦＰへの組み込みを記載する実験（図５Ｃ及びＦ）は、ｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰ＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）の派生物を使用した。ｐＢＡＤ＿Ｕｂ９ＴＡＧ１１ＴＣＧ１４ＴＣＡ－ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＵＧＡ）から開始して、本発明者らは、ＨｉＦｉ ＡｓｓｅｍｂｌｙによってＵｂ遺伝子を野生型ｓｆＧＦＰに置き換えた。本発明者らは、次に、部位特異的変異導入によって異なるコドンの組合せを導入することによってｓｆＧＦＰの３位を派生物化（derivatize）した。最後に、部位特異的変異導入を使用して、得られたプラスミドの各々においてＡＳＬをｓｅｒＴからｓｅｒＵに置き換え、ｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰ＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）派生物のセットを生成した（プラスミドの完全なリストに関してはデータファイルＳ２を参照されたい）。

【0442】

標的コドンを含有するユビキチンのＳｙｎ６１発現のウェスタンブロット分析
ユビキチンバリアントを発現させるために、本発明者らは、エレクトロコンピテントＳｙｎ６１Δ３、Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ３）又はＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）細胞６０μＬを、ｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＹＹＹ）プラスミド（ｓｅｒＵ（ＣＧＡ）、ｓｅｒＴ（ＵＧＡ）、又はＣＵＡアンチコドンのいずれかを有する、データファイルＳ２を参照されたい）及び関連するｐＢＡＤ＿Ｕｂプラスミド（プラスミドあたり１μＬ）によって共形質転換した。電気穿孔した細胞を、予め３７℃に加温したＳＯＢ １ｍＬ中に回収し、卓上サーモミキサー（Eppendorf社）において１０００ｒｐｍで１時間３０分振とうさせた。回収後、細胞１ｍＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを含有する予め加温した２ｘＹＴ ６ｍＬ中に希釈した。次に、希釈した細胞を２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で１８時間インキュベートした。終夜培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、５０μｇ／ｍＬアプラマイシン、０．２重量／体積％Ｌ－アラビノース、及び０ｍＭ又は５ｍＭのいずれかの（ＢｏｃＫ）を含有する予め加温した２ｘＹＴ ５～５０ｍＬに１：１００倍希釈することによって、ユビキチンの発現を開始させた。２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で８時間発現させた後、細胞を、遠心分離（４，０００×ｇで２０分間）により回収し、沈降物をさらに使用するまで－２０℃で凍結した。発現後ウェスタンブロット分析のために、本発明者らは、細胞５×１０^７個（光路長１ｃｍでＯＤ_６００ １．０＝１×１０^９個／ｍＬと仮定する）を、１．５ｍＬ微量遠心管での遠心分離（１００００×ｇ、１分間）によって回収した。細胞沈降物を、５％β－メルカプトエタノールを有する１×ＬＤＳ試料緩衝液（BioRad社）５０μＬ中に再懸濁させ、９５℃で５分間沸騰させた後、５分間ボルテックス処理した。各試料１０μＬを、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Invitrogen社）にロードし、１８０Ｖで４５分間電気泳動させた。ＰＶＤＦ膜への転写は、ｉＢｌｏｔ ２ ｓｅｍｉ－ｗｅｔ転写システムによって行った。次に膜を、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液５ｍＬによって３０分間ブロックし、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０を有するブロッキング緩衝液中で１：１０００倍希釈した抗Ｈｉｓ－タグ一次抗体（Abcam社、カタログ番号ａｂ１８１８４）５ｍＬと共にインキュベートした。室温で１時間後、膜を、各々０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ ５ｍＬによって５分間の洗浄を３回行った。二次抗体を、５ｍＬ体積中で１：１５０００倍希釈で添加し、ブロッキング緩衝液と０．０１％ＳＤＳを補充した０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０との５０／５０ミックス中に希釈した。二次抗体（ＩＲＤｙｅ ９２５－６８０７０、ＬｉＣｏｒ）を、室温で３０分間インキュベートした後、各々０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ ５ｍＬによる５分間の洗浄を３回行った。ウェスタンブロットのイメージングは、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏホスホイメージャー（GE Life Sciences社）において実施した。

【0443】

ＧＦＰ発現の測定
本発明者らは、ユビキチン遺伝子の発現と同じ培地条件下（上記の節を参照されたい）で、単一又は複数のＴＣＧ、ＴＣＡ、又はＴＡＧコドンを有する再コード化されたｓｆＧＦＰ遺伝子の発現を実施した。簡単に説明すると、細胞（Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４））５０μＬに、ｐＭＢ１に基づくａａＲＳ／ｔＲＮＡプラスミド（１μＬ）並びにｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰレポータープラスミド（１μＬ）の両方を同時に電気穿孔した。形質転換した細胞を、３７℃、１０００ｒｐｍで絶えず振とうさせながらＳＯＢ １ｍＬ中で１時間３０分間回復させ、その後、細胞１ｍＬ全体を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを含有する２ｘＹＴ ６ｍＬに接種し、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で終夜インキュベートした。本発明者らは、９６ウェルマイクロタイタープレートのフォーマットで発現を実施し、終夜培養物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、アプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｌ－アラビノース（０．２％）を含有する２ｘＹＴ ０．５ｍＬに、及び２ｍＭ ｎｃＡＡの存在下又は非存在下、１：１００で接種した。９６ウェルプレートを、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｈａｋｅｒ（Grant-bio社）において７５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で１６時間インキュベートした。３２００ｇで１０分間遠心分離後、細胞沈降物をＰＢＳ １５０μＬに再懸濁させた。細胞密度によって正規化したＧＦＰ発現を測定するために、再懸濁させた細胞１００μＬを、Costar社製の９６ウェル透明平底プレートに移し、ＯＤ_６００及びＧＦＰ蛍光（λ_ｅｘ：４８５ｎｍ；λ_ｅｍ：５２０ｎｍ）測定を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳプレートリーダー（BMG LABTECH社）においてゲインを２００に設定し、焦点調整を３．５ｍｍに設定して記録した。

【0444】

大腸菌からのＨｉｓ６ｘ－タグレポータータンパク質の精製
ｉ）ａａＲＳ／ｔＲＮＡ対を有するｐＭＢ１ベースのプラスミド、及びii）ｐＢＡＤ＿ｓｆＧＦＰ又はｐＢＡＤ＿Ｕｂ派生物を有する細胞（Ｓｙｎ６１Δ３（ｅｖ４）又はＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５））を、２２０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で終夜増殖させた。終夜培養物を、単一の標的コドンを含有するレポーターに関して１０ｍＬ容量で、及び複数のコドンを含有するレポーターに関してはより大きい容量（２０～５０ｍＬ）で調製した。発現培養物を、４０００×ｇで１０分間遠心分離させ、沈降物を氷中で冷却した後、細胞を、溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、１×Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標）タンパク質抽出試薬（Novagen（登録商標）社）、５０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ１、１００μｇ／ｍＬリゾチーム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、及び２０ｍＭイミダゾール）の当初の培養体積の１／２０に再懸濁させた。細胞再懸濁液を、４℃で３０分間インキュベートし、溶解物を遠心分離（１６０００×ｇ、４℃、３０分間）によって透明にした。透明にした溶解物の上清を、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡスラリー（Qiagen社）５０～１００μＬを含有する新しい微量遠心チューブに移した。Ｎｉ^２＋－ＮＴＡ混合物を、軽く反転させながら４℃で１時間インキュベートした。本発明者らは、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡビーズをフリット付きカラム（fritted column）上での重力濾過により収集し、それらを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）５００μＬに再懸濁させ、３回の洗浄を実施した。ポリヒスチジンタグタンパク質を溶出させるために、本発明者らは、次に洗浄したビーズを、溶出緩衝液（ＰＢＳ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８）１００μＬ中に再懸濁させた。遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１分間）後、溶出したタンパク質を含む上清を、新しい微量遠心チューブに移し、溶出手順を３回繰り返した。タンパク質発現収量（ｍｇ／Ｌ）を定量するために、本発明者らは、ＱｕｂｉｔＴＭタンパク質アッセイキット（ThermoScientific社）を、製造元のプロトコールに従って使用し、精製タンパク質をその後に解析するまで－２０℃で保存した。

【0445】

大腸菌からのＧＳＴタグレポータータンパク質の精製
細胞を、溶解物をグルタチオンセファロース（商標）４Ｂビーズ（GE Healthcare社）１００μＬと共に製造元のプロトコールに従ってインキュベートしたことを除き、Ｈｉｓ_６－タグレポーター発現と同一の方法で、１０ｍＬ容量で調製した。軽く攪拌しながら４℃で１時間インキュベーション後、本発明者らは、ビーズをＰＢＳ１ｍＬによって３回洗浄した。次に、本発明者らは、ビーズに結合したＧＳＴタグタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０中の１０ｍＭ還元グルタチオン１５０μＬによって溶出させた。溶出させたタンパク質を、１×ＬＤＳ試料緩衝液（BioRad社）の最終濃度と混合し、各試料１０μＬを、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動後、ゲルを、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Expedeon社）によって３０分間染色した後、水ですすいだ。

【0446】

Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ｎｃペプチド－ＧｙｒＡを発現させるためのベクターの構築
再コード化された野生型ＧｙｒＡ－ＣＢＤ及びＨｉｓ_６－ＳＵＭＯを、ｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として注文した。プラスミドを、ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍｉｘ （NEB社）によって４ピースアセンブリにアセンブルし、重複する断片は、ＳＵＭＯとＧｙｒＡの間にＧＳ４リンカーを含有した。アセンブリは、ｉ）ＰＣＲ増幅ＧＳ_４－ＧｙｒＡ－ＣＢＤ；ii）Ｈｉｓ_６－ＳＵＭＯ－ＧＳ_４；iii）ＭｍＰｙｌＲＳ／ＭｍｔＲＮＡ^Ｐｙｌ _ＣＧＡ）対を含有するＤＮＡ断片；及びiv）ｐＢＡＤ＿Ｕｂ－ｗｔ＿ｒｅｃからＰＣＲによって増幅されたｐＢＡＤバックボーンを含有した。これにより、プラスミドｐＢＡＤ＿ＳＵＭＯ－ＧＳ_４－ＧｙｒＡＣＢＤ＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）が生成された。非標準ペプチドコード化配列及び／又はシステインコドンがＳＵＭＯとＧｙｒＡの間に埋め込まれているこのプラスミドのバリアントを、部位特異的変異導入によって生成した。全てのプラスミドの配列の詳細に関してはデータファイルＳ２を参照されたい。

【0447】

Ｈｉｓ６－ＳＵＭＯ－ｎｃペプチド－ＧｙｒＡ－ＣＢＤ融合タンパク質の発現
本発明者らは、ｐＭＢ１＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿１Ｒ２６ＰｙｌＲＳ（ＣｂｚＫ）＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）＿ＡｌｖｔＲＮＡ－ΔＮＰｙｌ（８）（ＣＵＡ）プラスミドを含有するエレクトロコンピテントＳｙｎ６１Δ３（ｅｖ５）細胞６０μＬを、ｐＢＡＤ＿ＳＵＭＯ－ＸＸＸ－ＧｙｒＡ－ＣＢＤ＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）又はｐＢＡＤ＿ＳＵＭＯ－Ｃｙｓ－ＸＸＸ－ＧｙｒＡ－ＣＢＤ＿ＭｍＰｙｌＲＳ＿ＭｍｔＲＮＡ－Ｐｙｌ－ｏｐｔ（ＣＧＡ）派生物（ＸＸＸは、標的ペプチドのコード配列を示す）によって形質転換した。電気穿孔した細胞を、ＳＯＢ １ｍＬ中、３７℃、２００ｒｐｍで振とうさせながら回復させ、２時間後、細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを含有する２ｘＹＴ ２０ｍＬ中で希釈した。発現培養物を、ＴＢ培地５００ｍＬ中に増殖させた予備培養物を添加することによって接種し、抗生物質選択を維持した。ＴＢ培養物を、３７℃で、攪拌しながら（２００ｒｐｍ）ＯＤ_６００が２．５～３．０（約１２時間）となるまで増殖させた。発現を、０．４％Ｌ－アラビノースの添加によって誘発し、２ｍＭの両方のｎｃＡＡ（ＡｌｌｏｃＫ、ＣｂｚＫ）を添加した。１４時間後、培養物を、２５０ｍＬアリコートに分配し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）によって細胞を回収した。細胞沈降物をＰＢＳによって洗浄し、－２０℃で保存した。

【0448】

Ｈｉｓ６－ＳＵＭＯ－ｎｃペプチド－ＧｙｒＡ－ＣＢＤ融合タンパク質の精製及びペプチドの切除
凍結した細胞アリコートを融解し、ＤＮＡｓｅ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及びリゾチーム（０．１ｍｇ／ｍＬ）を補充した氷冷ＭＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．９、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を、空気圧ホモジナイザーの中に２回通過させ、溶解物を遠心分離（２５０００ｒｐｍ、２５分間）によってきれいにした。上清を、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡスラリー（２０％エタノール中の５０％ビーズ）１ｍＬと共に混合し、軽く攪拌しながら４℃で１時間インキュベートした。Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐカラム（BioRad社）を使用して、Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアガロースを、重力濾過を通して上清から分離した。濾液３０ｍＭイミダゾールを補充したＭＥＳ緩衝液３０ｍＬによって洗浄し、次にタンパク質を、２００ｍＭイミダゾールを含有するＭＥＳ緩衝液２ｍＬによって溶出させた。溶出液を、およそ１０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、緩衝液をＭＥＳ緩衝液に交換した。タンパク質４ｍｇ（ペプチド約１００μｇ）を、１０又は２００ｍＭ ＤＴＴ（環化又はＤＴＴ誘発切断）及び０．０４ｍｇ Ｕｌｐ１を含有するＭＥＳ緩衝液５００μＬ中で調製した各切除反応に使用した。反応物を、３７℃でインキュベートし、反応の進行をＬＣ－ＭＳによってモニターし、終了時（１８～４８時間）、遊離のペプチドを、Ｃ１８スピンカラム精製（線状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ四量体）又は熱酸性メタノール抽出（線状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ六量体、環状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ四量体）のいずれかによって精製した。

【0449】

Ｃ１８スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））精製に関して、プロトコールは、本質的に製造元の使用説明書の記載通りに実施し、唯一の変更点は、タンパク質を除去するために７０％ＡＣＮ、０．１％ＡｃＯＨによるさらなる洗浄ステップ及び溶出緩衝液を９０％ＭｅＯＨ、０．２％ＡｃＯＨに置換したことであった。簡単に説明すると、試料を、４×試料緩衝液（２０％ＡＣＮ、２％ＡｃＯＨ）と混合し、活性化して平衡にしたＣ１８スピンカラムに２００μＬずつをロードした。反応物を、１５００×ｇで３０秒間遠心分離させることによってカラムを２回通過させた。次に、カラムを洗浄緩衝液（５％ＡＣＮ及び０．５％ＡｃＯＨ）２００μＬによって２回洗浄し、タンパク質洗浄緩衝液（７０％ＡＣＮ、０．２％ＡｃＯＨ）２００μＬによって１回洗浄した。次に、ペプチドを、９０％ＭｅＯＨ、０．２％ＡｃＯＨの２０μＬによって２回溶出し、メタノールを空気流下で蒸発させた（乾固させない）。次に、試料に０．２％ＡｃＯＨの初回容量を再充填し、ＥＳＩ－ＭＳによって分析した。

【0450】

熱酸性メタノール抽出の場合、線状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ六量体及び環状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ四量体ペプチドが、反応混合物から沈殿し、これを遠心分離（５分間、２００００ｒｐｍ）によって収集することができ、上清を捨てた。ペプチドを、９０％メタノール１％ＡｃＯＨ ２００μＬ中に５５℃で２時間再溶解した（より長いインキュベーションはＡｌｌｏｃ及びＣｂｚ保護基の喪失を増加させる）。試料を、空気流下での蒸発によって４０μＬに低減させ、この時点で、メタノール濃度は、溶解度を確保するために２０％より上に維持された。試料を、線状ＡｌｌｏｃＫ／ＣｂｚＫ四量体ペプチドに関して上記の通りに分析した。

【0451】

インタクトタンパク質質量分析
本発明者らは、改変されたｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＬＣシステムを備えたＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２質量分析計を使用してＥＳＩ－ＭＳを行った。簡単に説明すると、注入されたタンパク質を、ＢＥＨ Ｃ４ ＵＰＬＣカラム（１．７μｍ；１．０×１００ｍｍ；Waters社）上で流速５０μＬ／分で分離した。ポンプは、２体積／体積％～８０体積／体積％（０．１体積／体積％ギ酸）から始まるアセトニトリル勾配を２０分間かけて送達した。カラムの出口を、ハイブリッド４重極子飛行時間型質量分析計（Waters社）を備えたエレクトロスプレーイオン化ソースに直接接続した。コーン電圧３０Ｖを使用して、データをポジティブイオンモードで、３００～２０００ｍ／ｚの範囲で獲得した。スキャンを、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Waters社）内のＭａｘＥｎｔ１関数を使用してデコンボリュートした。本発明者らは、ＧＰＭＡＷ（Lighthouse Data社）ソフトウェアによって理論上の野生型タンパク質の分子量を計算し、それらを手作業で編集してｎｃＡＡの分子量に適合させた。

【0452】

ｎｃＡＡ含有トリプシンペプチドのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）
本発明者らは、上記のようにｎｃＡＡを含有するユビキチン又はＧＦＰタンパク質を、そのＣ末端Ｈｉｓ_６タグによって精製し、及び４～１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen社）上で試料を精製した。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Expedeon社）染色後、本発明者らは、予想される標的タンパク質のおよその分子量で移動したゲル片を切除し、それらを以前に記載されたように（T. S. Elliott et al., Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology 32, 465-472 (2014)）ゲル内トリプシン消化に供した。切除したタンパク質ゲル片を、５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを有する５０体積／体積％アセトニトリルによって脱染した。１０ｍＭ ＤＴＴによる還元及び５５ｍＭヨードアセトアミドによるアルキル化後、タンパク質を、６ｎｇ／μＬトリプシン（Promega社、ＵＫ）によって３７℃で終夜消化した。トリプシンペプチドを、２体積／体積％アセトニトリルを有する２体積／体積％ギ酸中で抽出し、その後、Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｕ３０００ ＨＰＬＣ（ThermoScientific Dionex社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を備えたナノスケールキャピラリーＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって流速を３００ｎＬ／分に設定して分析した。ペプチドをＣ１８ Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ ５μｍ、１００μｍ×２０ｍｍ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ（ThermoScientific Dionex社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）で捕捉した後、Ｃ１８ Ｔ３ １．８μｍ、７５μｍ×２５０ｍｍ ｎａｎｏＥａｓｅカラム（Waters社、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）で分離した。アセトニトリルの勾配により、ペプチドを溶出させ、分析的カラムの出口を、４重極子Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ、ThermoScientific社、ＵＳＡ）と共にナノフローエレクトロスプレーイオン化ソースに直接接続した。データ依存的解析の場合、完全なＭＳスペクトルの６０，０００の解像度を使用した後、１２のＭＳ／ＭＳを使用した。ＭＳスペクトルを、３００～１，８００のｍ／ｚ範囲で収集した。得られたＬＣ－ＭＳ／ＭＳスペクトルを、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンプログラムを使用してタンパク質データベース（ＵｎｉＰｒｏｔ ＫＢ）に対して検索した。データベース検索パラメーターを、断片化イオントレランス０．１Ｄａを有する前駆体イオントレランス５ｐ．ｐ．ｍに限定した。本発明者らは、検索パラメーターの複数の改変：２つの欠失した酵素切断、メチオニン酸化の多様な改変、システインカルバミドメチル化、ピログルタミン酸、リシンのｎｃＡＡへの、トレオニンのｎｃＡＡへの、及びセリンのｎｃＡＡへの（ｎｃＡＡ変数は実験に基づく）改変を設定した。プロテオミクスソフトウェアＳｃａｆｆｏｌｄ ４を使用して、断片化スペクトルを可視化した。

【実施例4】

【0453】

考察
本発明者らは、Ｓｙｎ６１を進化させ、ＴＣＧ、ＴＣＡ及びＴＡＧコドンを解読するｔＲＮＡｓ及び終結因子を欠失させた。それらは、得られた株がウイルスのカクテルに対して完全な耐性を提供することを示す。その上、それらは、３つ全てのコドンに応答したコードされた非標準アミノ酸（ｎｃＡＡｓ）の組み込み、並びに完全に非標準のヘテロポリマー及び大環状分子のコード化されたプログラム可能な細胞合成を実証する。

【0454】

このように、本発明者らは、標準コードを読む能力からこの株を合成的に切り離し、この進歩は、ウイルス混入及び溶解（V. Bethencourt, Virus stalls Genzyme plant. Nature Biotechnology 27, 681-681 (2009)、J. Zahn, M. Halter, in Surveillance and Elimination of Bacteriophage Contamination in an Industrial Fermentation Process. (2018)）に関連する劇症型リスクなく、生物生産に関する潜在的根拠を提供する。本発明者らは、合成コドン圧縮及びそれらが実行されるコドン再定義戦略が、天然の進化の過程でコドン捕捉に関して提唱されるモデルと類似であることに注目する（S. Osawa, T. H. Jukes, Codon reassignment (codon capture) in evolution. Journal of Molecular Evolution 28, 271-278 (1989)）。

【0455】

今後の研究は、遺伝子コードをさらに圧縮及び再定義するために本明細書に例示される原理を拡大する。本発明者らは、細胞の翻訳機構の操作における現行の進歩と組み合わせると（D. de la Torre, J. W. Chin, Reprogramming the genetic code. Nature Reviews Genetics 22, 169-184 (2020)）、この研究が、緊急の潜在的に有用な特性を有する非標準ヘテロポリマーの拡大セットのプログラム可能でコード化された細胞合成を可能にすると予測する。

【0456】

（参考文献）
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3. J. W. Chin, Expanding and reprogramming the genetic code. Nature 550, 53-60 (2017)
4. D. de la Torre, J. W. Chin, Reprogramming the genetic code. Nature Reviews Genetics 22, 169-184 (2020)
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11. C. C. Liu, P. G. Schultz, Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annual Review of Biochemistry 79, 413-444 (2010)
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41. A. Telenti et al., The Mycobacterium xenopi GyrA protein splicing element: characterization of a minimal intein. Journal of Bacteriology 179, 6378 (1997)

【0457】

本明細書において言及されるデータファイルＳ１、データファイルＳ２、及びデータファイルＳ３は、刊行物：Wesley E. Robertson, Louise F. H. Funke, Daniel de la Torre, Julius Fredens, Thomas S. Elliott, Martin Spinck, Yonka Christova, Daniele Cervettini, Franz L. Boge, Kim C. Liu, Salvador Buse, Sarah Maslen, George P. C. Salmond, & Jason W. Chin, Sense Codon Reassignment Enables Viral Resistance and Encoded Polymer Synthesis, Scienceに見出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【配列表】

2024521175000001.app

【国際調査報告】