特表 2024-521192 薬物耐性癌を処置するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-28

(54)【発明の名称】薬物耐性癌を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4188 20060101AFI20240521BHJP

   A61K 31/16 20060101ALI20240521BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240521BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240521BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20240521BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20240521BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4188 ZNA

A61K31/16

A61P35/00

A61P43/00 121

A61P43/00 111

C12N9/99

C12Q1/68

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573405

(86)(22)【出願日】2022-05-30

(85)【翻訳文提出日】2024-01-25

(86)【国際出願番号】 CN2022095983

(87)【国際公開番号】W WO2022247954

(87)【国際公開日】2022-12-01

(31)【優先権主張番号】63/194,585

(32)【優先日】2021-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523447269

【氏名又は名称】ノーベルワイズ・ファーマシューティカル・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｎｏｖｅｌｗｉｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(74)【代理人】

【識別番号】100103230

【弁理士】

【氏名又は名称】高山 裕貢

(72)【発明者】

【氏名】ホアン，チョン－ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ホウ，チア－チョン

【テーマコード（参考）】

4B063

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QR36

4B063QR72

4B063QR77

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB05

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206HA16

4C206KA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZB26

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明は、テモゾロミド（ＴＭＺ）耐性癌患者を処置するための組み合わせ剤および方法であって、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによってＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することによりＴＭＺ耐性を克服するのに有効な相対比で、ＴＭＺとアイソフォーム選択的ＨＤＡＣ８阻害剤、例えば、ＢＭＸとの組み合わせ含む、組み合わせ剤および方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための組み合わせ剤であって、テモゾロミド（ＴＭＺ）および、式Ａ：

【化1】

［式中、
Ｒ^１は、水素、アルキル、アルケニル、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環または５員もしくは６員のヘテロ環、または（ＣＨ_２）ｍＲ^４であり；
Ｘは、Ｃ、－Ｏ－、－Ｎ－または－Ｓ－であり；
Ｙは、－Ｏ－、－ＮＨまたは－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４アルキルであり；
ｎは、０～１０の整数であり；
ｍは、０～５の整数であり；
Ｒ^２およびＲ^３は独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^４は、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、またはハロゲン、－ＣＦ_３、－ＯＲ^７もしくは－ＮＲ^７Ｒ^８によって置換されていてもよい５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は独立して、水素またはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^５は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＣ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、シクロアルキル、炭素環およびヘテロ環は、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＯ_２、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－６アルキルチオ、ＯＲ^７''、ＮＲ^７Ｒ^８またはＣＦ_３によって場合により置換されていてよく；そして
Ｒ^６は、Ｈであるか、ヒドロキシもしくはＣ_２－Ｃ_１０アルケニルによって置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_１０アルキルであるか、またはＲ^１と一緒になって－Ｃ_２Ｈ_２－となる］
の構造を有する化合物Ａ、またはその薬学的に許容できる塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグまたは溶媒和物を含み、
ＴＭＺおよび化合物Ａは、ＴＭＺ耐性を効果的に克服する相対比で組み合わされている、組み合わせ剤。

【請求項2】

化合物Ａが、

【化2】

の構造を有する化合物ＢＭＸである、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項3】

ＴＭＺ耐性が、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化によって克服される、請求項１または２に記載の組み合わせ剤。

【請求項4】

ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化が、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによるものである、請求項３に記載の組み合わせ剤。

【請求項5】

ＴＭＺおよび化合物Ａが、別々にまたは順次に投与される、請求項１～４のいずれかに記載の組み合わせ剤。

【請求項6】

ＴＭＺおよびＢＭＸを含む、請求項１～５のいずれかに記載の組み合わせ剤。

【請求項7】

癌が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤。

【請求項8】

患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための方法であって、請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の治療有効量を患者に投与することを含む方法。

【請求項9】

癌が、ＧＢＭまたはＣＲＣである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

患者において薬物耐性癌の最適個別化処置のための方法であって、患者におけるＷＴ－ｐ５３の発現を判定すること、および、ＷＴ－ｐ５３の発現が患者に存在する場合に、治療有効量の請求項１に記載の化合物Ａまたはそれと前記薬物との組み合わせ剤を患者に投与することを含む、方法。

【請求項11】

薬物が、ＴＭＺである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

薬物耐性癌が、ＴＭＺ耐性のＧＭＢまたはＣＲＣである、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

ＴＭＺ耐性癌患者のための医薬またはキットを製造するための、請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の使用。

【請求項14】

癌が、ＧＢＭまたはＣＲＣである、請求項１１に記載の使用。

【請求項15】

ＴＭＺ耐性のＷＴ－ｐ５３ ＧＢＭ患者またはＣＲＣ患者の最適個別化処置のための医薬またはキットを製造するための、請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本非仮出願は、米国特許法第１１９条（ａ）に基づき、２０２１年５月２８日出願の米国仮特許出願第６３／１９４，５８５号の優先権を主張し、その全内容は引用により本明細書に包含される。

【0002】

本発明は、薬物耐性癌、特にＴＭＺ耐性癌を処置するための新たな組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0003】

多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も悪性度の高い腫瘍の１つであり、侵襲性パターンおよび高い再発率を有し、世界保健機関の悪性度ＩＶの星状細胞腫である［１］。手術および放射線療法と化学療法との併用による集学的処置にもかかわらず、ＧＢＭ患者の予後は依然として不良であり、平均生存期間は１５か月未満であり、治療抵抗性を示す［２～４］。

【0004】

結腸癌または結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、最も一般的な悪性腫瘍の１種であり、世界的にみて癌による死亡の３番目に多い原因である。結腸癌またはＣＲＣの標準的処置は既に十分に研究され、確立しているが、死亡率が高く、かつ臨床上挑戦的であるといった課題が依然としてある。この疾患は前兆となる症状が少ないため、患者は最初の評価時に進行癌と診断されることが多く、その結果、５年生存率は約１０％である［５～６］。ＣＲＣの標準的処置は手術、放射線療法および／または化学療法であり、オキサリプラチン（Ｏｘｐ）およびそのプロドラッグであるカペシタビンが臨床診療に広く使用されている［７～８］。残念ながら、この種のＤＮＡ架橋剤による処置では、全処置サイクルを完了した後でも最初の数年以内に再発することが依然として普通となっている［９］。

【0005】

テモゾロミド（ＴＭＺ）は、血液脳関門の透過性が良好である、アルキル化剤であるダカルバジンのイミダゾテトラジン親油性プロドラッグである。ＴＭＺは、生理的ｐＨにおいて自発的な非酵素的変換を介し、反応性化合物５－（３－メチルトリアゼン－１－イル）－イミダゾール－４－カルボキサミド（ＭＴＩＣ）となる［１０］。ＭＴＩＣの細胞毒性は、主にグアニンのＯ６位およびＮ７位で起こるＤＮＡのアルキル化（メチル化）によるものと考えられている。ＴＭＺは、２００５年にＦＤＡに最初に承認されて以来、新たに診断された多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）に対する標準的化学療法として広く使用されている。ＧＢＭの他にも、ＴＭＺはダカルバジンと同等の有効性を有することが証明されている。このため、ＴＭＺは、標準的処置後の悪性黒色腫の患者にも「適応外」で使用されている。加えて、他の適応症、例えば、脳転移、リンパ腫、神経内分泌腫瘍、下垂体腫瘍、ユーイング肉腫、原始神経外胚葉性腫瘍、難治性白血病、肺癌、および他の腫瘍におけるＴＭＺの有効性を実証するために、多くの臨床試験が進行中である［１１］。ＴＭＺは、臨床において高齢者、小児、または緩和療法中の患者に対して忍容性が良好な処置であり、単剤として、またはアジュバント（放射線療法または化学療法）の第一選択(first-line)もしくは第ｘ選択(x-line)処置として使用することができる。しかし、Ｏ６－メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）の過剰発現のため、ＴＭＺで処置された患者において薬物耐性が生じる。したがって、これは、ＧＢＭを首尾良く処置するために克服しなければならない臨床的に意味のある大きな障害である。

【0006】

しかし、ＴＭＺに反応する患者は５０％未満に過ぎず、それは、Ｏ６－メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）が過剰発現するからであり、ＭＧＭＴはグアニンのＯ６位のメチル化を逆行させ、それによってＧＢＭ細胞におけるＤＮＡを修復し、化学療法の効果に抵抗する［１２～１４］。新たに診断されたＣＲＣ患者とＴＭＺ処置を受けた再発ＣＲＣ患者との間のＭＧＭＴタンパク質レベルを比較することにより、ＭＧＭＴの減少がＴＭＺ処置の有効性を促進する可能性が裏付けられた［１５～１７］。ＭＧＭＴは、プロモーターのメチル化に加えて、さまざまな転写因子、例えば、ｐ５３、Ｓｐ１、ＮＦ－κＢ、ＣＥＢＰ、およびＡＰ－１８によっても調整される。これらのうち、ｐ５３は、ＭＧＭＴプロモーターと直接相互作用することによってＭＧＭＴ転写を下方調整する［１８，１９］。このため、ＭＧＭＴプロモーターのメチル化に加えて、ｐ５３はＭＧＭＴ発現を調整してＴＭＺ耐性を引き起こす可能性がある。このように、ＴＭＺ耐性を克服するためには、ＭＧＭＴを調整するさらなる機構を同定しなければならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、薬物耐性癌、特にＴＭＢ耐性のＧＢＭまたはＣＲＣに対する新しくより優れた療法または処置を開発することが望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0008】

したがって、本発明は、薬物耐性癌、例えば、ＴＭＺ耐性のＧＢＭまたはＣＲＣの処置のための新たな方法を提供する。

【0009】

本発明において、化合物Ｘ、例えば、ＢＭＸが、ＧＢＭ－Ｒ細胞株ならびにＣＲＣ細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯに対するＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し得ることが予想外に見出された。したがって、本発明は、患者において薬物耐性癌、特にＴＭＺ耐性のＧＢＭまたはＣＲＣの処置のための新たな方法であって、前記患者にＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ剤を投与することを含む方法を提供する。

【0010】

本発明において、ヒストンデアセチラーゼ８阻害剤（ＨＤＡＣ８ｉ）であるＢＭＸ（ＮＢＭ－Ｔ－Ｌ－ＢＭＸ－ＯＳ０１）は、結腸直腸癌細胞、ヒト臍帯内皮細胞、肺癌細胞および神経膠芽細胞腫細胞において有意な抗細胞増殖効果を示し、これはまた、動物の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｐｈ）モデルにおいて腫瘍抑制能力も示す［２０，２１］。しかし、ＢＭＸは癌細胞の薬物耐性を克服し得ることが、本発明において予想外に見出された。本発明の一例では、ＢＭＸは、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによってＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することにより、ＧＢＭ－Ｒ細胞を克服することができた。ヒトＧＢＭ組織およびＧＢＭ－Ｒ細胞株におけるＨＤＡＣ８の高発現はＭＧＭＴレベルと相関すること、ならびにＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ、ＧＢＭ－Ｒ細胞株におけるＷＴ（野生型）－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を通じてＷＴ－ｐ５３媒介性アポトーシスを誘導することが確認された。さらに、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞株におけるβ－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／サイクリンＤ１／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を介した細胞増殖およびＧＳＣ表現型活性を抑制した。

【0011】

本発明の一例では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ｐ５３／ｐ２１／Ｐｕｍａ／Ｂａｘを上方調整することを介してＣＲＣ細胞における細胞周期停止、老化、オートファジーおよびアポトーシスを誘発し、それがＷｎｔ／β－カテニン／サイクリンＤ１／ｃ－Ｍｙｃ／ｐ６２経路の下方調整のクロストークによって損なわれることが証明された。したがって、ＢＭＸは、ＷＴ－ｐ５３を有するＴＭＺ耐性のＧＢＭ患者またはＣＲＣ患者の最適個別化処置（プレシジョン個別化医療：precision personal treatment）のための有望な戦略となる可能性がある。

【0012】

したがって、一態様において、本発明は、ＴＭＺ耐性癌を処置するための組み合わせ剤であって、ＴＭＺおよび、式Ａ：

【化1】

［式中、
Ｒ^１は、水素、アルキル、アルケニル、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環または５員もしくは６員のヘテロ環、または（ＣＨ_２）ｍＲ^４であり；
Ｘは、Ｃ、－Ｏ－、－Ｎ－または－Ｓ－であり；
Ｙは、－Ｏ－、－ＮＨまたは－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４アルキルであり、
ｎは、０～１０の整数であり、
ｍは、０～５の整数であり、
Ｒ^２およびＲ^３は、独立してＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^４は、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、またはハロゲン、－ＣＦ_３、－ＯＲ^７もしくは－ＮＲ^７Ｒ^８によって置換されていてもよい５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は、独立して水素またはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｒ^５は、ＯＨ、ＮＨ_２またはＣ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、シクロアルキル、炭素環およびヘテロ環は、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＯ_２、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－６アルキルチオ、ＯＲ^７''、ＮＲ^７Ｒ^８またはＣＦ_３によって場合により置換されていてもよく、
Ｒ^６は、Ｈであるか、ヒドロキシもしくはＣ_２－Ｃ_１０アルケニルで置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_１０アルキルであるか、またはＲ^１と一緒になって－Ｃ_２Ｈ_２－となる］
の構造を有する化合物Ａ、またはその薬学的に許容できる塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグまたは溶媒和物を含み、
ＴＭＺおよび化合物Ａは、ＴＭＺ耐性を効果的に克服する相対比で組み合わされている、組み合わせ剤を提供する。

【0013】

本発明の一実施態様において、化合物Ａは、

【化2】

の構造を有する化合物ＢＭＸである。

【0014】

本発明によれば、ＴＭＺ耐性は、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによって、ＴＭＺ媒介性細胞毒性効果を強化することにより克服される。

【0015】

本発明において、ＴＭＺおよび化合物Ａ、例えばＢＭＸは、別々にまたは順次に投与される。

【0016】

本発明の一例において、癌は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または結腸直腸癌（ＣＲＣ）である。

【0017】

別の態様において、本発明は、患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための方法であって、本発明による組み合わせ剤の治療有効量を患者に投与することを含む、方法を提供する。

【0018】

本発明の一例において、癌はＧＢＭまたはＣＲＣである。

【0019】

さらなる一態様において、本発明は、患者において薬物耐性癌の最適個別化処置のための方法であって、患者におけるＷＴ－ｐ５３の発現を判定すること、および、ＷＴ－ｐ５３の発現が患者に存在する場合に、治療有効量のＢＭＸまたはそれと前記薬物との組み合わせ剤を患者に投与することを含む方法を提供する。

【0020】

本発明の一実施態様において、薬物はＴＭＺである。

【0021】

本発明の特定の一実施態様において、薬物耐性癌は、ＴＭＺ耐性癌、特にＧＭＢまたはＣＲＣである。

【0022】

本発明において、ＢＭＸがＷＴ－ｐ５３癌細胞の阻害を強化するのに有効であることが確認された。

【0023】

さらなる一態様において、本発明は、ＴＭＺ耐性癌を処置するための医薬またはキットを製造するための、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせ剤の使用を提供する。

【0024】

本発明を、以下の実施例によってさらに説明する。しかし、以下の実施例は、単に説明の目的を意図しており、本発明を実際に限定するものと解釈されるべきではないことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0025】

本発明の前述の発明の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読む場合に、より良く理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現時点で好ましい実施態様を図面に示す。

【0026】

【図1】図１は、バイオインフォマティクスツールによるＨＤＡＣ８と関連する可能性のある遺伝子についての経路分析を提供し、ここではｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８をＣＬＵＥデータベースに入力し、スコアが９０を上回るＣＰおよびＰＣＬを選択した（Ａ）。標的遺伝子を、さらなる実験のためにＣＰＤＢ経路分析データベース（Ｂ）に入力した。（Ｃ）ｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８についてＣＰおよびＰＣＬ（スコアが９０を上回る）を選択するための上位１０の経路。１０の経路は以下の通りである：ＶＥＧＦ；ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路；ＪＡＫ ＳＴＡＴ経路および調整；シグナル伝達経路；ＭＡＰＫシグナル伝達経路－ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ヒト）；アポトーシス；オートファジー；ＨＩＦ－１シグナル伝達経路；ＴＮＦ関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）シグナル伝達経路；Ｗｎｔシグナル伝達経路。ＶＥＧＦ；ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路；ＪＡＫ ＳＴＡＴ経路および調整；シグナル伝達経路；ＭＡＰＫシグナル伝達経路－ホモサピエンス（ヒト）；アポトーシス；オートファジー；ＨＩＦ－１シグナル伝達経路；ＴＮＦ関連の弱いアポトーシス誘導物質（ＴＷＥＡＫ）シグナル伝達経路；Ｗｎｔシグナル伝達経路。

【0027】

【図2】図２は、ＢＭＸがＧＢＭ細胞（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）の成長および増殖を阻害したこと、ならびにＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせ剤がＧＢＭ－Ｒ細胞（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）の成長および増殖を阻害することを示している。（Ａ）ＢＭＸの化学構造。（Ｂ）０．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、３０μＭ、または５０μＭのＢＭＸによる処置後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｃ）０．２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、または８００μＭのＴＭＺによる処置後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｄ）さまざまな濃度（０．２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、または８００μＭ）のＴＭＺを含むかまたは含まない１０μＭのＢＭＸによる２４時間の処置後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞の生存率。（Ｅ）さまざまな濃度（０．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、３０μＭ、または５０μＭ）のＢＭＸを含むかまたは含まない５０μＭのＴＭＺによる２４時間の処置後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞の生存率。（Ｆ）１０μＭのＢＭＸを含むかまたは含まない５０μＭのＴＭＺによる２４時間、４８時間、および７２時間の処置後のＧＢＭ－Ｒ細胞の生存率。（Ｇ）ＴＭＺ（５０μＭ）を含むかまたは含まないＢＭＸ（０μＭ、５μＭ、または１０μＭ）によるＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の１４日間のコロニー原性アッセイ。データは、３つの実験からの平均±ＳＥＭとして表される。^＊対照（Ａ１７２およびＵ８７ＭＧ）との比較でｐ＜０．０５、＃（Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ）との比較でｐ＜０．０５。

【0028】

【図3】図３は、ＢＭＸがＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路を標的化してＧＢＭ－Ｒ細胞の細胞増殖を抑制することによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化したことを示している。（Ａ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭまたは１０μＭのＢＭＸによる４８時間の処置後のＧＢＭ－Ｒ細胞のＧＳＫ－３βおよびβ－カテニンの活性化状態。（Ｂ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭまたは１０μＭのＢＭＸによる４８時間の処置後のＧＢＭ－Ｒ細胞のｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１タンパク質レベル。（Ｃ）１０μＭのＭＧ１３２を含むかまたは含まない１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺによる処置後のＧＢＭ－Ｒ細胞におけるβ－カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／４１）のリン酸化状態ならびにｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１タンパク質発現の変化。

【0029】

【図4】図４は、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせ剤が、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＴＭＺ媒介性アポトーシスを促進することによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化したことを示している。（Ａ）ＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸによる４８時間の処置のＧＢＭ（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）およびＧＢＭ－Ｒ（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）細胞の細胞周期分布。（Ｂ）Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２／Ｍ期にある細胞の百分率をヒストグラムに示す。（Ｃ）ｓｕｂＧ１の百分率の棒グラフ。（Ｄ）ＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸによる４８時間の処置のＧＢＭ（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）およびＧＢＭ－Ｒ（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）細胞のアネキシンＶ／ＰＩアポトーシスアッセイ。（Ｅ）アポトーシス細胞の百分率を示すヒストグラム。

【0030】

【図5】図５は、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせ剤が、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害によるＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化したことを示している。（Ａ）ＧＢＭ（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）およびＧＢＭ－Ｒ（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）細胞株におけるＷＴ－ｐ５３およびＭＧＭＴの発現パターン。（Ｂ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭまたは１０μＭのＢＭＸによる４８時間の処置のＵ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ細胞でのＷＴ－ｐ５３、ＭＧＭＴ、Ｐ２１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、Ｐｕｍａ、および切断型カスパーゼ－３のタンパク質変化。（Ｃ）ＧＢＭ（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）およびＧＢＭ－Ｒ（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）細胞の、５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭまたは１０μＭのＢＭＸによる４８時間の処置は、ＭＧＭＴレベルを低下させ、ＷＴ－ｐ５３およびＰｈｏｓｐｈｏ－ＷＴ－ｐ５３レベル（ｓｅｒ １５）を上昇させた。β－アクチンを内部対照として使用した。

【0031】

【図6】図６は、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせ剤がＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＧＳＣ形成を減少させたことを示している。（Ａ）親細胞株と耐性娘細胞株との間でのＣＳＣ関連遺伝子（ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２）発現の状態。（Ｂ）Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ細胞に、５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭおよび１０μＭのＢＭＸを４８時間投与した後のＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２タンパク質レベルの変化。（Ｃ）外科的生検で得られたヒト原発性ＧＢＭ（放射線療法と化学療法との同時併用前の同じ患者）および再発ＧＢＭ腫瘍組織（放射線療法と化学療法の同時併用後）におけるＨＤＡＣ８およびＣＳＣ関連遺伝子（ＣＤ１３３およびＣＤ４４）の免疫組織化学的染色。

【0032】

【図7】図７は、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＴＭＺ耐性を克服するためのＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせの機序の作業モデルを提供する。

【0033】

【図8】図８は、ＧＢＭ細胞株の遺伝的特徴を示す（Ａ）ウエスタンブロットによるＧＢＭ細胞におけるＡｂｃａｍ ｃｏｍｐａｎｙ製のＨＤＡＣ８の発現。

【0034】

【図9】図９は、ＢＭＸが強力な半合成ＨＤＡＣ８阻害剤であったことを示す。（Ｂ）ビッグデータ分析を通じてのＭＧＭＴメチル化ペアＧＢＭの試験。野生型および突然変異体（ｍｕｔａｔｎｔ）は、それぞれ青色および赤色で標識されている（片側ｔ検定、^＊：ｐ＜０．０５）。（Ａ）ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）により刺激したＨＤＡＣ８発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して決定した。（Ｂ）ＴＭＺ（５０μＭ）を含むかまたは含まないＢＭＸ（０～１０μＭ）で刺激したＨＤＡＣ８発現レベルを、ウエスタンブロット法を使用して決定した。

【0035】

【図10】図１０は、ＢＭＸ、およびＢＭＸとＴＭＺとが、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ－Ｒ、Ａ１７２およびＡ１７２－Ｒの成長および増殖を阻害したことを示している。（Ａ）指定濃度のＢＭＸ（０．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、３０μＭまたは５０μＭ）で２４時間、４８時間および７２時間処置した後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｂ）指定濃度のＴＭＺ（０．２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは８００μＭ）で２４時間、４８時間および７２時間処置した後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｃ）異なる濃度（０．２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭまたは８００μＭ）のＴＭＺを含むかまたは含まない１０μＭのＢＭＸで２４時間、４８時間および７２時間処理した後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｄ）異なる濃度（０．５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、３０μＭまたは５０μＭ）のＢＭＸを含むかまたは含まない５０μＭのＴＭＺで２４時間、４８時間および７２時間処置した後のＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。（Ｅ）１０μＭのＢＭＸを含むかまたは含まない５０μＭのＴＭＺで２４、４８時間および７２時間処置した後のＧＢＭ－Ｒ細胞株の細胞生存率。

【0036】

【図11】図１１は、ＧＢＭ細胞におけるＢＭＸのインビトロ細胞毒性を示す。（Ａ）Ｕ８７およびＵ８７Ｒ細胞、ならびに（Ｂ）Ａ１７２およびＡ１７２Ｒ細胞を、ＴＭＺ（５０および１００μＭ）で処置した。ＧＢＭ細胞に対するＴＭＺのこの阻害効果は、クローン原性アッセイを使用して決定した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0037】

【図12】図１２は、野生型ｐ５３（ＷＴ－ｐ５３）である２種の親ＧＢＭ細胞株（Ａ１７２およびＵ８７ＭＧ）および２種のＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞株のＨＤＡＣ８発現レベルを含む、神経膠芽細胞腫における薬物および遺伝子の情報を示す。

【0038】

【図13】図１３は、ＢＭＸ、ＴＭＺ、オキサリプラチンおよびドキソルビシンの組み合わせが、ＣＲＣ細胞における細胞増殖を阻害したことを示す。（Ａ）さまざまな薬物濃度および処置時間によるＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるＢＭＸ、ＴＭＺ、Ｏｘｐ、Ｄｏｘ、ＢＭＸ＋ＴＭＺ、ＢＭＸ＋ＯｘｐまたはＢＭＸ＋Ｄｏｘの増殖を、ＣＣＫ－８法を使用してアッセイした。（Ｂ）ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるＢＭＸ、ＴＭＺ、Ｏｘｐ、ＢＭＸ＋ＴＭＺ、およびＢＭＸ＋Ｏｘｐの異なる処置によるコロニー形成能アッセイで、クローンを定量し、統計図として提示した。（Ｃ）ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞における異なる濃度のＢＭＸ、またはＴＭＺと組み合わせた異なる濃度のＢＭＸによる４８時間の処置後の細胞周期分析、ならびに各細胞周期相にある細胞の割合。（Ｄ）異なる濃度のＢＭＸ、またはＴＭＺと組み合わせた異なる濃度のＢＭＸによる４８時間の処置後のアポトーシス分析、ならびにＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞における細胞のアポトーシス率。結果はすべて、３つの独立した実験からの平均±ｓ．ｄ．として示される。対照（ＨＴ２９細胞）との比較で^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、対照（ＨＣＴ１１６細胞）との比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１、対照（ＲＫＯ細胞）との比較で†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１。

【0039】

【図14】図１４は、ＢＭＸ、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせによって誘導されるアポトーシスおよびオートファジーの効果が、ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害によって媒介されたことを示す。（Ａ）種々の濃度のＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）および種々の濃度のＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより４８時間処置したＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるｐ５３、ｐ５３ Ｌｙｓ３８２アセチル化、ｐ５３ Ｓｅｒ１５リン酸化、ｐ２１、ｐ１６、ＭＧＭＴ、γＨ２ＡＸ、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ３の発現のウエスタンブロット分析。（Ｂ）種々の濃度のＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）および種々の濃度のＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより４８時間処置したＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞における切断型カスパーゼ－３、切断型カスパーゼ－７、切断型カスパーゼ－８、切断型カスパーゼ－９および切断型ＰＡＲＰタンパク質の発現。（Ｃ）種々の濃度のＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）および種々の濃度のＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより４８時間処置したＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるＢａｘ、Ｂｃｌ－２、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、ＢａｋおよびＰｕｎａタンパク質の発現。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。

【0040】

【図15】図１５は、ＢＭＸ、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせが、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において細胞老化を誘導することを示す。ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせの老化関連β－ガラクトシダーゼ（ＳＡβ－ｇａｌ）染色。細胞を１０μＭのＢＭＸ＋ＴＭＺ（５０μＭ）で４８時間処置し、細胞をＳＡβ－ｇａｌで染色した（青色の細胞質染色）。スケールバー、５０μｍ。ＳＡβ－ｇａｌ活性の定量。結果はすべて、３つの独立した実験からの平均±ｓ．ｄ．として示される。対照（ＨＴ２９細胞）との比較で^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１；対照（ＨＣＴ１１６細胞）との比較で＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１；対照（ＲＫＯ細胞）との比較で†ｐ＜０．０５、††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１。

【0041】

【図16】図１６は、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせが、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるＣＳＣ形成を減少させたことを示す。ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞に、５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭおよび１０μＭのＢＭＸを４８時間投与した後のＣＤ１３３、ＣＤ４４およびＳＯＸ２タンパク質レベルの変化。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。

【0042】

【図17】図１７は、ＢＭＸが、ＣＲＣ細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路を標的化することによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化したことを示す。（Ａ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まない５μＭまたは１０μＭのＢＭＸによる４８時間の処置後のＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞のＧＳＫ－３β、β－カテニン活性化状態、ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１。（Ｂ）ＧＳＫ－３β、β－カテニン活性化状態、ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現は、Ｔ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において、５０μＭのＴＭＺおよびＭＧ１３２を含むかまたは含まないＢＭＸによって上方調整される。（Ｃ）Ｐ５３およびＭＧＭＴの発現は、Ｔ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において、５０μＭのＴＭＺおよびＭＧ１３２を含むかまたは含まないＢＭＸによって上方調整される。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。

【0043】

【図18】図１８は、オートファジーが、ＢＭＸ単独（ａｌｏｎｇ）、ＢＭＸおよびＴＭＺの組み合わせによる細胞死の誘導に関与したことを示す。（Ａ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）で処置したＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるＬＣ３およびＰ６２／ＳＱＳＴＭ１の発現を、ウエスタンブロットによって評価した。（Ｂ）Ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１の発現は、Ｔ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において、５０μＭのＴＭＺおよびＭＧ１３２を含むかまたは含まないＢＭＸによって下方調整される。（Ｃ）ＢＡＦおよびＶＡＤによる前処置は、５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）に４８時間曝露させたＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞の細胞アポトーシスを減少させた。（Ｄ）５０μＭのＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）に対するＶＡＤおよびＢＡＦの効果は、切断型カスパーゼ－３、切断型ＰＡＲＰ、Ｐ６２およびＬＣ３の発現を誘導した。ＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。

【発明を実施するための形態】

【0044】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0045】

本発明は、ＴＭＺおよび化合物Ａの組み合わせを使用して、ＴＭＺ耐性癌（例えば、ＧＢＭおよびＣＲＣ）の患者を処置するための新たな方法を提供する。

【0046】

化合物Ａは、新規の小分子アイソフォーム－選択的ＨＤＡＣ８阻害剤である。化合物Ａは、米国特許第７，９９４，３５７号に開示されており、その内容はその全体が引用により本明細書に包含される。化合物Ａは、式Ａ、またはその薬学的に許容できる塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグもしくは溶媒和物の構造を有する：

【0047】

【化3】

［式中、
Ｒ^１は、水素、アルキル、アルケニル、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環または５員もしくは６員のヘテロ環、または（ＣＨ_２）ｍＲ^４であり；
Ｘは、Ｃ、－Ｏ－、－Ｎ－または－Ｓ－であり；
Ｙは、－Ｏ－、－ＮＨまたは－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４アルキルであり；
ｎは、０～１０の整数であり；
ｍは、０～５の整数であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、独立してＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^４は、ハロゲン、－ＣＦ_３、－ＯＲ^７または－ＮＲ^７Ｒ^８によって置換されていてもよいＣ_５－Ｃ_６シクロアルキルまたは５員もしくは６員の不飽和炭素環またはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は、独立して水素またはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^５は、ＯＨ、ＮＨ_２またはＣ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環またはヘテロ環であり、ここで、シクロアルキル、炭素環およびヘテロ環は、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＯ_２、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－６アルキルチオ、ＯＲ^７”、ＮＲ^７Ｒ^８またはＣＦ_３によって場合により置換されていてよく、
Ｒ^６は、Ｈであるか、ヒドロキシもしくはＣ_２－Ｃ_１０アルケニルによって置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_１０アルキルであるか、またはＲ^１と一緒になって－Ｃ_２Ｈ_２－となる］。

【0048】

本発明の特定の一実施態様において、化合物ＡはＢＭＸであり、これはYang YC et al.［２２］で報告されているように、オストールの半合成に由来し、学習と記憶において新規な役割を果たす：

【化4】

【0049】

ＢＭＸは、毒性が最も低く、血液脳関門を通過する能力がある、アイソフォーム選択的ＨＤＡＣ８阻害剤であることが知られている［２２］。

【0050】

本明細書で使用される場合、「テモゾロミド」または「ＴＭＺ」という用語は、特に「Ｔｅｍｏｄａｒ」という商品名で販売されていて、いくつかの脳腫瘍、例えば、多形神経膠芽腫または悪性星状細胞腫を処置するために使用される薬物を意味する。ＴＭＺは以下の構造を有する：

【化5】

【0051】

テモゾロミド（ＴＭＺ）は、一部の癌の処置、例えば、星状細胞腫に対する第二選択処置および多形神経膠芽腫に対する第一選択処置に使用されるアルキル化剤である。また、オラパリブとテモゾロミドとの組み合わせが、再発小細胞肺癌に対して実質的な臨床的活性を示すことも見出されている。

【0052】

本明細書で使用される場合、「多形神経膠芽腫」、「神経膠芽細胞腫」または「ＧＢＭ」という用語は、正常な脳細胞から生じるか、または既存の低悪性度星状細胞腫から発生する脳癌を意味する。ＧＢＭを予防する方法は知られていない。処置は通常、手術を伴い、その後に化学療法および放射線療法が使用される。テモゾロミド（ＴＭＺ）による薬物療法が、化学療法の一部として使用されることが多い。

【0053】

本明細書で使用される場合、腸癌または直腸癌としても知られる「結腸癌」、「結腸直腸癌」または「ＣＲＣ」という用語は、結腸または直腸（大腸の一部）から発生した癌を意味する。その徴候および症状には、便中の血液、便通の変化、体重減少、および疲労が含まれ得る。ＣＲＣの標準的処置は手術、放射線療法および／または化学療法であり、オキサリプラチン（Ｏｘｐ）およびそのプロドラッグであるカペシタビンが臨床診療に広く使用されている。残念ながら、この種のＤＮＡ架橋剤による処置下での再発は、全サイクルを完了した後でさえ、最初の数年以内であることが依然として一般的である。

【0054】

本発明において、ＢＭＸは、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、かつＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによってＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することにより、ＴＭＺ耐性を克服することが見出された。本発明における結果は、ＢＭＸまたはそれとＴＭＺとの組み合わせが、ＴＭＺ耐性のＷＴ－ｐ５３ ＧＢＭまたはＣＲＣ細胞の最適個別化処置に有望であることを示した。

【0055】

本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、これらの例は、限定ではなく実証の目的で提供される。

【実施例】

【0056】

１．１ 材料および方法

【0057】

１．１．１ 細胞培養および試薬

【0058】

本試験には、４種類のＧＢＭ細胞株Ｕ８７、Ｕ８７Ｒ、Ａ１７２およびＡ１７２Ｒを使用した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から、ヒトＧＢＭ細胞株Ｕ８７－ＭＧ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１４；起源不明のＧＢＭ）およびＡ１７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６２０；ＡＴＣＣ）の提供を受けた。Ｕ８７ＲおよびＡ１７２Ｒ細胞は、Ｄｒ．Ｔｓｕｎｇ－Ｉ ＨｓｕおよびＤｒ．Ｊｉａｎ－Ｙｉｎｇ Ｃｈｕｎｇ（Ｔｈｅ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔａｉｐｅｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から入手した。これらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および５０μＭのＴＭＺを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で少なくとも６０日間維持した。Ｕ８７ＲおよびＡ１７２Ｒ細胞におけるＴＭＺ耐性を、コロニー形成アッセイを使用して確認した（図１１）。細胞を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を補充したＤＭＥＭ中で培養し、加湿インキュベーター内で３７℃および５％ ＣＯ_２で維持した。ＮＢＭ－ＢＭＸ（ＢＭＸ）、（Ｅ）－２－（４－メトキシベンジルオキシ）－３－プレニル－４－メトキシ－Ｎ－ヒドロキシシナミドは、ＮａｔｕｒｅＷｉｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から提供された。

【0059】

１．１．２ 細胞増殖およびコロニー形成アッセイ

【0060】

本発明者らはウェル当たり３０００個のＧＢＭ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、一晩かけてそれらを接着させた。ＢＭＸおよびＴＭＺ単剤療法に対する細胞株の反応性を検証するために、細胞を異なる用量のＢＭＸまたはＴＭＺにより２４、４８、および７２時間処置した。ＢＭＸ－ＴＭＺの組み合わせに対する細胞の反応性を確認するために、細胞をＢＭＸ（１０μＭ）を含むかもしくは含まない異なる用量のＴＭＺ（０～８００μｇ／ｍＬ）により２４、４８、および７２時間処置するか、またはＴＭＺ（５０μＭ）を含むかもしくは含まない異なる用量のＢＭＸ（０～５０μＭ）により２４、４８、および７２時間処置した。処置後に、指定の時点でＣＣＫ８キット（Ｔａｒｇｅｔｍｏｌ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を使用して吸収値を測定した。結果は、少なくとも３回反復の平均±標準偏差として報告する。

【0061】

Ａ１７２、Ａ１７２－Ｒ、Ｕ８７ＭＧおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ細胞を６ｃｍ培養皿に播種して（１０００個／皿）、１４日間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットにより２５℃で２０分間染色した。コロニーを水道水で注意深く洗浄した後、少なくとも５０個の細胞と定義されるコロニーの数を計数して分析した。結果は、３つの独立した実験からの平均コロニー数±ＳＥとして表される。

【0062】

１．１．３ 逆転写－定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）

【0063】

ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、ｍＲＮＡ発現の定量分析に使用した。細胞（２×１０^５個）を６ウェルプレートに播種し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅａｉｄ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の使用により、全ＲＮＡの１０ｎｇ試料をｃＤＮＡに転写した。Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造元が提供する手順に従い、１８ｓを内部参照として遺伝子の発現を定量した。すべての手順は、製造元のプロトコールに従って実施した。熱サイクル条件は以下の通りとした：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、ならびに９５℃で１５秒間および６０℃で１秒間を４０サイクル。各試料を３連で分析した。閾値サイクル（Ｃｔ）値は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ソフトウェアを使用して計算した。各ｍＲＮＡの相対発現は、２－（ΔＣｔ）法を使用して計算した。ＨＤＡＣ８のプライマー配列は以下の通りであった：
ＨＤＡＣ８ 順方向 ５’－ＧＣＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡ－３’（配列番号１）、
ＨＤＡＣ８ 逆方向 ５’－ＡＴＡＣＴＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＡＴＣＣ－３’（配列番号２）。
１８ｓ 順方向 ５’－ＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣ－３’（配列番号３）、
１８ｓ 逆方向 ５’－ＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＡＴＣＡ－３’（配列番号４）。

【0064】

１．１．４ ＤＮＡ細胞周期のフローサイトメトリー分析

【0065】

ＤＮＡ細胞周期については、ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）による４８時間の処置の後に、細胞をトリプシン処理により回収し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、メタノールで固定した。続いて細胞を再度洗浄し、最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲＮアーゼＡに供し、１０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに、暗所で４℃で１５分間インキュベートした。細胞周期分析は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。

【0066】

１．１．５ アポトーシスのフローサイトメトリー分析

【0067】

ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）における細胞アポトーシスを分析するために、ＣＦ（登録商標）４８８Ａ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｎｄ ＰＩ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造元の指示書に従って使用して、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ／ＰＩ染色を行った。ＰＩおよびアネキシンのフローサイトメトリーによる分析は、処置後４８時間で行った。合計１０，０００個の核を、ＦＡＣＳフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。

【0068】

１．１．６ 免疫組織化学染色

【0069】

４μｍ厚パラフィン切片に対して免疫組織化学染色を行った。切片の脱蝋および水和を行って、４℃で一晩置いた。ＣＤ１３３（ＡＰ１８０２ａ、Ａｂｇｅｎｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐ６２（ａｂ５６４１６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、およびＬＣ３ＩＩ（ＡＰ１８０２ａ、Ａｂｇｅｎｔ）に対する抗体については、標準的なアビジン－ビオチン複合体法を使用した。切片を室温に戻した後、ビオチン化二次抗体および西洋ワサビ標識ストレプトアビジンを添加した。続いて、試料を３７℃でオーブン内でインキュベートした。続いて、ＤＡＢ発色、ヘマトキシリン対比染色、勾配アルコール脱水、およびキシレン透明化を実施した。その後、すべての試料を中性ゴムで密封した。ヒトの脳組織：本試験における倫理規定は、Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの施設内審査委員会の承認を受けた（Ｎｏ．ＫＭＵＨＩＲＢ－Ｆ（Ｉ）－２０２０００２４）。本試験に参加した対象全員からインフォームド・コンセントを得た。

【0070】

１．１．７ ウエスタンブロット分析

【0071】

細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ、１０×ＲＩＰＡ緩衝液）中に溶解させた。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。ＳＤＳローディング緩衝液をタンパク質試料と混合した。タンパク質（２０μｇ／レーン）を、８％～１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離して、ＰＶＤＦ膜に移行させ、これをトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）－Ｔｗｅｅｎ ２０（０．５％；ＴＢＳ－Ｔ）中にて５％ウシ血清アルブミンにより室温で１時間かけてブロッキングし、一次抗体とともに４４℃で一晩インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで十分に洗浄した後、ＨＲＰシグナルを化学的ＨＲＰ基質で検出した。使用した抗体を表３に列挙する。各標的タンパク質のシグナルは、増強化学発光試薬とのインキュベーションおよびＸ線フィルムへの曝露によって可視化した。

【0072】

１．１．８ 統計分析

【0073】

データは平均値±標準偏差として提示する。統計分析は一元配置分散分析を使用して行った。データはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較した。統計学的有意水準は^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１に設定した。

【表1】

【0074】

１．１．９ マルチデータベースプラットフォームを通じてＨＤＡＣ８阻害剤の考えられる機序を予測する
間接的プロセス：ＣＬＵＥにより、ｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８の結合性スコアをそれらの１００万のプロファイルから計算し、対立的化合物および遺伝子摂動との類似性について順序付けた。基準を９０を上回る正のスコアでフィルタリングし、生物学的機能におけるｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８調整因子として各場合の標的化遺伝子を収集した。この遺伝子リストをＣＰＤＢプラットフォームに入力してエンリッチメント分析を行って、明確な経路情報を得る。直接的プロセス：ＢＭＸ－Ｌ１０００遺伝子発現データに基づいて、ＨｅｐＧ２細胞において薬物の生物学的機能に反応する上方調整遺伝子および下方調整遺伝子の両方をリスト化する。ＢＭＸ（１μＭ）をＤＭＳＯ対照と比較して、±１．５倍の変化、ｐ値＜０．０５により、有意な差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を定義する。このようにして、ＤＥＧを、経路分析のためにＣＰＤＢを検索するための入力として使用した。優先順位付けされた経路を絞り込むために、本発明者らは２つの結果に関心を抱き、共通のエレメントを選択した。

【0075】

１．２ 結果：

【0076】

１．２．１ バイオインフォマティクスツールを通じてのＨＤＡＣ８阻害剤の考えられる発現プロファイルの経路分析

【0077】

ＨＤＡＣ８阻害剤および遺伝子関与の考えられる機序について探索するために、本発明者らは、包括的機序分析のためのコネクティビティマップ（Ｃ－Ｍａｐ）および統合ネットワークベースの細胞シグネチャー統一環境ライブラリー（Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｎｅｔｗｏｒｋ－Ｂａｓｅｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（ＣＬＵＥ）システムデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｕｅ．ｉｏ／）およびＣｏｎｓｅｎｓｕｓＰａｔｈＤＢ （ＣＰＤＢ） プラットフォーム（ｈｔｔｐ：／／ｃｐｄｂ．ｍｏｌｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／）を使用した。本発明者らは、直接分析と間接分析という２通りのバイオインフォマティクスプロセスをそれぞれ利用した（図１Ａ）。直接分析については、ＨｅｐＧ２細胞を、ＢＭＸの生物学的機能に反応するＬ１０００プレート中でＢＭＸにより処置した（図１Ａ、右）。１．５倍への変化を伴う有意な差次的発現遺伝子（１５８３個の上方調整および９００個の下方調整）を使用して、ＣＰＤＢプラットフォームを検索し、考えられる経路を明らかにした（ｐ値＜０．０５）。次に、本発明者らは、ＣＬＵＥプラットフォームの間接的アプローチ、パターンマッチングアルゴリズムを通じて、ＨＤＡＣ８の阻害機能を分析した。ｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８シグネチャーをＢＭＸ処置（ＨＤＡＣ８阻害剤）のシミュレーションとして使用して、本発明者らは続いてＣＬＵＥにアクセスし、ＣＬＵＥは、１９，８１１種の小分子化合物または遺伝子摂動（例えば、１８，４９３種類のｓｈＲＮＡ、３，４６２種類の過剰発現コンストラクト）からの類似シグネチャーパターンに一致する１００万を上回るプロファイルを計算し、続いてコネクティビティスコアを得た。正のスコアは、クエリシグネチャーとインスタンスシグネチャーとの間に類似の機序があることを示し、負のスコアは逆の機能を意味した。本発明者らの基準により、化合物（ＣＰ）、ノックダウン遺伝子（ＫＤ）、過剰発現遺伝子（ＯＥ）、および摂動因子クラス（ＰＣＬ）の９０を上回るコネクティビティスコアを選択した。ＣＬＵＥは、類似の機能化合物または同じファミリー遺伝子を、作用機序として仮定し得る特定のグループに分類した。しかし、このビッグデータシステムは詳細な経路情報を提供しなかった。このため、本発明者らは、ｓｈＨＤＡＣ８およびＢＭＸ処置細胞からの補完的分析のためにＣＰＤＢプラットフォームを組み合わせた（図１Ａ、左）。これらの異なるバイオインフォマティクスパイプラインにより、いくつかの機序／経路が得られると考えられ、本発明者らはこれらの２つのデータセットを交差させて、可能性のある考えられる経路をフィルタリングした。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、本発明者らのマルチデータベースプラットフォーム（図１Ｂ）を介して明らかになった最上位の機序の１つである。

【0078】

１．２．２ ＢＭＸはＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し、ＧＢＭ－Ｒ細胞の成長および増殖を阻害した

【0079】

ＨＤＡＣ８が治療抵抗性ＧＢＭと相関するか否かを調べるために、本発明者らは、２種の親ＧＢＭ細胞株（Ａ１７２およびＵ８７ＭＧ、Ａ１７２およびＵ８７ＭＧは野生型ｐ５３（ＷＴ－ｐ５３）である、図１２）および２種のＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞株（Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ、ＷＴ－ｐ５３の変異体）のＨＤＡＣ８発現レベルを調べた。ＨＤＡＣ８の過剰発現が、両方のＧＢＭ－Ｒ細胞株で検出された（図８Ａおよび８Ｂ）。

【0080】

本実施例では、ＮＢＭ－ＢＭＸ（Ｎａｔｕｒｅ Ｗｉｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ＆Ｍｅｄｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより提供；本稿ではＢＭＸを使用した）をＨＤＡＣ８阻害剤として使用して、さらなる実験のためにｓｈＲＮＡ ＨＤＡＣ８の効果を模倣した。ＢＭＸ（３９７．４６Ｄａ）の構造を図２Ａに示す。４種の細胞株をＢＭＸで処置し、ＨＤＡＣ８ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のＢＭＸ誘導阻害を検出することによって、ＢＭＸがＨＤＡＣ８阻害剤であることが確認された（図９Ａおよび９Ｂ）。

【0081】

ＢＭＸは、ＧＢＭ細胞およびＧＢＭ－Ｒ細胞の両方において、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の感受性を強化し得ると考えられている。本実施例では、Ａ１７２／Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ／Ｕ８７ＭＧ－Ｒ細胞において、ＧＢＭおよびＧＢＭ－Ｒを処置する際に、ＢＭＸとＴＭＺとの間に組み合わせ効果が存在することが見出された。ＭＴＴアッセイを行って、ＢＭＸ単独群、ＴＭＺ単独群、および組み合わせ群について、異なる濃度での２４、４８および７２時間で細胞増殖および細胞生存率を評価した。各単独処置群において、結果は、各群における細胞毒性効果が時間依存的に増加することを示唆した（図１０Ａ）。これらの結果、ＢＭＸ単独でのＩＣ_５０値は、Ａ１７２／Ａ１７２－Ｒ細胞では２１．００±２．３４μＭ／５２．６４±３．６２μＭ超、およびＵ８７ＭＧ／Ｕ８７ＭＧ－Ｒ細胞では２９．８４±２．３２μＭ／６８．１３±４．６９μＭ超であることが明らかになり（図２Ｂ）、ＢＭＸ単独ではＧＢＭ細胞増殖を阻害するが、ＧＢＭ－Ｒ細胞の増殖は阻害しないことが示唆された。また、ＴＭＺ単独でのＩＣ_５０値は、Ａ１７２／Ｕ８７ＭＧ細胞では７３．４８±３．６５μＭ／８０．９９±１．６８μＭ、およびＡ１７２－Ｒ／Ｕ８７ＭＧ－Ｒ細胞では５９５．０７±２３．４２μＭ／３０２．５１±１５．２４μＭであり、ＧＢＭ－Ｒ細胞の信頼性が確認された（図２Ｃ）。組み合わせ処置群では、ＢＭＸ１０μＭを使用して、異なる用量のＴＭＺと組み合わせ（図２Ｄ）、ＴＭＺ ５０μＭ（ＧＢＭ－Ｒ細胞株における維持濃度と同じ）で異なる用量のＢＭＸと組み合わせ（図２Ｅ）、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＴＭＺ介在性細胞毒性効果を最も強化し得るＢＭＸおよびＴＭＺの用量を決定した。データから、５０μＭのＴＭＺと１０μＭのＢＭＸが、両方のＧＢＭ－Ｒ細胞株で最も高い細胞毒性効果を発揮したことが明らかになった。本発明者らはこの組み合わせを時間依存的に使用したところ、４８時間で細胞毒性効果を認めた（図２Ｆ、ＢＭＸ １０μＭの４８時間で：０．８８倍、０．７７倍、０．６３倍；ＢＭＸおよびＴＭＺ：０．７４倍、０．５６倍、０．４７倍）。クローン原性アッセイからも、ＢＭＸ単独ではなく、１０μＭのＢＭＸと５０μＭのＴＭＺが、ＧＢＭ－Ｒ細胞を抑制したことが明らかになった（図２Ｇ）。上記のことから考えて、データは、この組み合わせ処置が、ＧＢＭ細胞（Ｕ８７ＭＧおよびＡ１７２）およびＧＢＭ－Ｒ細胞（Ｕ８７ＭＧ－ＲおよびＡ１７２－Ｒ）の成長および増殖を阻害すること、ならびに１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺの組み合わせがＧＢＭ－Ｒ細胞に対して最も高い細胞毒性効果（細胞増殖および細胞生存率の抑制）を発揮することを示唆している。それにもかかわらず、ＢＭＸ単独での細胞生存率もなお中程度に低下し、抑制効果のないＴＭＺ単独と比較して、Ａ１７２Ｒ／Ｕ８７Ｒにおける薬理学的細胞毒性効果の部分的能力を示した。したがって、さらなる実験では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ処置をＢＭＸ単独と比較した。

【0082】

１．２．３ ＢＭＸは、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路を標的化することによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化した

【0083】

ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化によって機序を調べた。経路分析に基づき、標準的なＷｎｔシグナル伝達（Ｗｎｔ／β－カテニンとしても知られる）経路がＧＢＭ－Ｒ細胞の増殖に関与することを仮定した。各細胞における遺伝的背景から、Ｗｎｔ遺伝子、例えば、大腸腺腫性ポリポーシスおよびβ－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）に突然変異がないことが示された。β－カテニンの状態を検出するためのβ－カテニン活性型としてのホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１）。ＧＳＫ３β（Ｓ９）をβ－カテニンのリン酸化に使用して、β－カテニンを分解した。その結果、Ｕ８７ＲおよびＡ１７２Ｒ細胞では、１０μＭのＢＭＸと５０μＭのＴＭＺとがβ－カテニンのタンパク質レベルを直接低下させ、ＧＳＫ３βによるリン酸化を通じてホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１）のタンパク質レベルを低下させ、一方、ＢＭＸ単独はこれらのレベルをわずかに低下させただけであったことが示された。さらに、ＧＳＫ３β（Ｓ９）のリン酸化レベルも低下したことから、ＧＳＫ３β活性が上昇してβ－カテニンがリン酸化されたことが示された（図３Ａ）。増殖マーカーであるｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１に対するＢＭＸの効果を検討したところ、ＢＭＸはＴＭＺを含む場合も含まない場合もそれらのレベルを低下させることが認められた（図３Ｂ）。

【0084】

β－カテニンタンパク質レベルがタンパク質分解により低下することを検証するために、ＧＢＭ－Ｒ細胞をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処置した。その結果、ＭＧ１３２の適用は、１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺの下で、β－カテニンの分解を逆行させ、ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現を増加させることが明らかになった（図３Ｃ）。これらの結果から、ＢＭＸはＳｅｒ９リン酸化の下方調整を通じてＧＳＫ３β活性を強化し、その結果、Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１でのβ－カテニンのリン酸化を強化して、タンパク質分解を誘発することが実証された。以上を総合すると、これらのデータから、１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺは、部分的にＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路を介して、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し、したがって、ＧＢＭ－Ｒ細胞増殖を低下させることが明らかになった。

【0085】

１．２．４ ＢＭＸは、ＧＢＭ－Ｒ細胞においてＴＭＺ介在性アポトーシスを促進することによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化した。

【0086】

ＢＭＸが細胞周期停止を誘導し得るか否かを調べるために、Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ細胞株における細胞周期に対するＢＭＸ（５μＭおよび１０μＭ）単独および５０μＭのＴＭＺとの組み合わせの効果について分析した。その結果、１０μＭのＢＭＸが単独で、Ａ１７２－Ｒ細胞（７０．３４％）およびＵ８７ＭＧ－Ｒ細胞（７７．９５％）においてＧ０／Ｇ１期の細胞周期停止を誘導したことが明らかになった。次に、５および１０μＭのＢＭＸと５０μＭのＴＭＺとは、両方のＧＢＭ－Ｒ細胞株において、Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期停止量を増加させただけでなく、サブ－Ｇ１期の停止（アポトーシス）も引き起こした（図４Ａ～Ｃ）。

【0087】

フローサイトメトリーにより、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、Ａ１７２－Ｒ／Ｕ８７ＭＧ－Ｒ細胞株において、アポトーシス細胞（２１．７％／２５．９５％）を用量依存的に高い百分率で生じさせたことが明らかになった（図４Ｄ）。さらに、１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺによる処置後には、後期アポトーシスも優勢であった（図４Ｅ）。したがって、ＢＭＸ単独は細胞周期停止を誘導し得、細胞増殖を抑制するのみで、アポトーシスを誘導しなかったが、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞においてＴＭＺ介在性アポトーシスを促進し、細胞毒性の強化を導いた。

【0088】

１．２．５ ＢＭＸは、ＧＢＭ－Ｒ細胞においてＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害によるＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化した

【0089】

ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせはＴＭＺ介在性アポトーシスを促進する可能性があることから、本発明者らは、ＢＭＸはＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を介してＴＭＺ介在性アポトーシスを強化し得ると推測した。本発明者らはまず、Ａ１７２／Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ／Ｕ８７ＭＧ－Ｒ細胞におけるＷＴ－ｐ５３およびＭＧＭＴレベルを検討し、ＴＭＺ耐性がＷＴ－ｐ５３およびＭＧＭＴに関連することを確認した（図５Ａ）。バイオインフォマティクス分析からも、患者の３３％のみがｐ５３突然変異を有し、それ以外はｐ５３ ＷＴであることが示唆された（表２）。次に、ＴＣＧＡおよびドライバーＤＢデータベースを評価して、ｐ５３突然変異とｐ５３ ＷＴとの間の全生存率を比較検討した。コロニー形成アッセイ（図１１）により、ｐ５３ ＷＴ症例は突然変異症例と比較してＧＢＭ患者の予後不良を示すことが明らかになった。

【0090】

本発明者らは、ＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスにおけるアポトーシス促進性シグナル伝達系について検討した。ＭＧＭＴをＴＭＺ修復能についても検討した。その結果、アポトーシス促進性マーカー、例えば、Ｐ２１、Ｂａｘ／Ｂｃｌ２、およびＰｕｍａのレベルは上昇し、ＭＧＭＴのレベルは５０μＭのＴＭＺを含むおよび含まないＢＭＸによる処置後に低下することが明らかになった。しかし、切断型カスパーゼ－３は、１０μＭのＢＭＸと５０μＭのＴＭＺとの組み合わせの場合にのみ認められた（図５Ｂ）。ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害においてアポトーシスがＢＭＸ単独、ＴＭＺ単独、またはそれらの組み合わせによって誘導されるか否かを明らかにするために、Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ細胞を、５および１０μＭのＢＭＸを含むかまたは含まない５０μＭのＴＭＺにより処置した。ＴＭＺ単独では、ＷＴ－ｐ５３およびＤＮＡ損傷マーカー（ＷＴ－ｐ５３－ｓｅｒ１５）を増加させることなく、ＭＧＭＴ発現を中程度にしか抑制することができないことがわかった。しかし、１０μＭのＢＭＸと５０μＭのＴＭＺとの組み合わせではＭＧＭＴ発現は明らかに減少した。さらに、ＷＴ－ｐ５３およびＤＮＡ損傷マーカー（ＷＴ－ｐ５３－ｓｅｒ１５）の発現レベルも上昇し、このことはＭＧＭＴがＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスによって負に調整されることを意味する（図５Ｃ）。

【0091】

さらに、ｐ５３ ＷＴおよび突然変異細胞（図８Ｂ）の散布図を評価することによって、ＧＢＭ ｐ５３ ＷＴ細胞はＭＧＭＴが高メチル化されており、ＭＧＭＴの ｍＲＮＡおよびタンパク質発現も低下していることが見出された。さらに、ＴＭＺ単独では、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスを誘導することができなかった。しかし、これらのデータから、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を通じてＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し得ることが示唆された。ＢＭＸ単独はＭＧＭＴレベルを中程度に低下させることができたが、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスを誘導しなかった。

【表2】

【0092】

１．２．６ ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせはＧＢＭ－Ｒ細胞におけるＧＳＣ形成を減少させた

【0093】

ＧＳＣマーカーはＧＢＭ耐性の中核であることから、本発明者らはすべての細胞株におけるＧＳＣマーカーのレベルを検討した；Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ細胞においてＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２の高い発現レベルが検出され、このことはＴＭＺ耐性が部分的にＧＳＣマーカーと関連することを意味する（図６Ａ）。さらに、１０μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺによる処置は、両方のＧＢＭ－Ｒ細胞株においてＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２の発現レベルを明らかに低下させた（図６Ｂ）。したがって、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞においてＧＳＣマーカーを減弱させて幹細胞表現型を変換させることによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することができたと考えられる。

【0094】

本発明者らはまた、ＴＭＺ耐性ＧＢＭヒト組織におけるＨＤＡＣ８およびＧＳＣマーカーについても、免疫組織化学を通して検討した（図６Ｃ）。その結果、ＨＤＡＣ８およびＧＳＣはＧＢＭにおけるＴＭＺ耐性と密接に関連することが明らかになった。

【0095】

１．３．結論

【0096】

前臨床試験では、ＨＤＡＣが神経膠腫に対して抗腫瘍効果を有することが示されているが、過去の研究には、化学療法抵抗性ＧＢＭの処置について言及したものや予想したものはなかった。本発明では、新規アイソタイプ選択的ＨＤＡＣ８阻害剤であるＢＭＸが、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２経路を下方調整することによって幹細胞性を阻害することだけでなく、ＴＭＺ耐性ＧＢＭ細胞においてＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整してアポトーシスを誘導することによっても、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し得ることを初めて見出した。さらに、ＷＴ－ｐ５３／ＭＧＭＴ逆行とＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫβシグナル伝達経路との逆相関が、ＧＢＭおよびＴＭＺ耐性ＧＢＭにおける発癌性の役割に関与する可能性があることも明らかになった。

【0097】

上述の結果に基づいて、以下の作業モデルを提案する（図７参照）。

【0098】

まず、ＴＭＺ耐性ＧＢＭにおけるβ－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／サイクリンＤ１／ＳＯＸ２シグナル伝達経路（右側の経路）。本発明者らの以前の研究および本試験におけるバイオインフォマティクス分析によれば、Ｗｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路はＧＢＭに対する療法の選択に影響を及ぼす可能性がある［１７］。本発明では、ＢＭＸは、ＴＭＺを含まない場合も含む場合（細い線および太い線）もともに、Ｓｅｒ９リン酸化を下方調整することによってＧＳＫ３β活性を強化し、その結果、Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１でのβ－カテニンリン酸化を強化し、β－カテニンタンパク質分解を誘発することが示された。β－カテニンの分解は、プロテアソーム阻害剤としてのＭＧ１３２により確認された。未分解のβ－カテニンは核内に移行してＴＣＬ４に結合して、下流標的遺伝子、例えば、ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１を活性化して、細胞増殖を誘導し、細胞周期を継続させる。ＢＭＸ単独（細い線）およびＢＭＸとＴＭＺと（太い線）はいずれもｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現を抑制し、細胞周期停止を誘導した。しかし、ＢＭＸ単独ではｓｕｂＧ１期の細胞周期停止を誘導することができなかったＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせのみが顕著な細胞周期停止を誘導し、ｓｕｂＧ１期に進行させ、このことはそれがＧＢＭ－Ｒ細胞における後期アポトーシスを誘導したことを意味する（図７の右下部の点線）。

【0099】

さらに、ＧＳＣはＧＢＭにおける治療抵抗性にも重要な働きを果たす。ＧＳＣは、神経幹細胞マーカー、例えば、ＣＤ１３３およびＣＤ４４、ならびに転写因子、例えば、ＳＯＸ２の高発現を通じた、インビトロおよびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）の両方での自己再生能力を特徴とする［２３］。本発明では、ＢＭＸがＴＭＺを含まない場合も含む場合もともに、ＧＳＣの発現を下方調整することによって幹細胞性を抑制することにより、ＣＤ１３３およびＣＤ４４だけでなくＳＯＸ２も減弱させることが明らかになった［２４］。以前に報告されたように、ｃ－Ｍｙｃは神経膠腫のＣＳＣを維持するためにも必要である［２４］。ＢＭＸ単独およびＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞におけるβ－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／サイクリンＤ１／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を介したＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することによって細胞増殖を抑制したと結論付けることができる。

【0100】

さらに、ＴＭＺ耐性ＧＢＭにおいて、ＷＴ－ｐ５３はＭＧＭＴ阻害を媒介していた（図７の左側の経路）。ＧＢＭにおけるＴＭＺの作用機序は、Ｏ６位のグアニンへのメチル化によるＤＮＡ損傷である。ＭＧＭＴはメチル化を逆行させてＧＢＭ細胞におけるＤＮＡを修復し、ＧＢＭ耐性を発揮する。ＭＧＭＴ非依存的経路もＴＭＺ耐性に重要な役割を果たすものの［２５～２７］、ＭＧＭＴ依存的経路は依然としてＴＭＺ耐性の主要な経路と考えられている。本発明では、ＧＢＭ－Ｒ細胞株（Ａ１７２－ＲおよびＵ８７ＭＧ－Ｒ）は高レベルのＭＧＭＴタンパク質を発現しており、したがって、ＭＧＭＴ依存的経路が実際にこれらの細胞株におけるＴＭＺ耐性の主要な機序であることが確認された。ＢＭＸはＭＧＭＴ依存性ＧＢＭ－Ｒ細胞株においてＭＧＭＴ発現を抑制し、ＤＮＡ損傷修復に対するＭＧＭＴの能力を減弱させたと推測され得る。ＧＢＭ－Ｒ細胞株では、ＢＭＸ単独はＭＧＭＴ発現を中程度に低下させ、ＴＭＺ単独は低下させなかったが（図５Ｂおよび図５Ｃ）、これらの組み合わせは明らかにＭＧＭＴタンパク質レベルを低下させ、ＴＭＺ介在性アポトーシスをＭＧＭＴ依存的に強化した。

【0101】

図７に示すように、このモデルは２つの主要なシグナル伝達経路を含む。右側の経路：β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／サイクリンＤ１／Ｓｏｘ ２シグナル伝達経路。ＧＢＭ－Ｒ細胞株をＢＭＸ単独（細い線）またはＢＭＸとＴＭＺと（太い線）で処置すると、ＧＳＫ３β（Ｓ９）および活性β－カテニンが減少した。続いてｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１も減少して細胞周期停止を誘導し、幹細胞活性を減弱させた。しかし、ＢＭＸとＴＭＺと（破線）のみがアポトーシスを誘導した可能性がある。左側の経路：ＷＴ－ｐ５３はＭＧＭＴ阻害を媒介した。ＧＢＭ－Ｒ細胞株をＢＭＸ単独またはＢＭＸとＴＭＺとで処置すると、ＢＭＸ単独（細い線）およびＢＭＸとＴＭＺと（太い線）の両方で、ＷＴ－ｐ５３が増加し、ＭＧＭＴレベル、細胞周期停止および幹細胞性が下方調整された。しかし、ＷＴ－ｐ５３およびＤＮＡ損傷マーカー（ＷＴ－ｐ５３－ｓｅｒ１５、図示せず）は、細胞周期停止マーカー（Ｐ２１）およびアポトーシス促進マーカー（ＢＡＸ／Ｂｃｌ２、およびＰｕｍａ）の活性化の後に増加して、ＢＭＸとＴＭＺと（太い線）の場合にのみアポトーシスおよび細胞死を誘導し（太い線）、著しいＤＮＡ損傷を示した。赤色は上方調整を示す。緑色は下方調整を示す。

【0102】

本実施例では、ＢＭＸはＨＤＡＣの阻害において強化された効果をもたらし、ＷＴ－ｐ５３の回復を介してＭＧＭＴを減少させることが見出された（図５Ａ～ＣのすべてのＰ５３レーン）。本発明では、ＢＭＸ単独（左部分の細い線）は、ＷＴ－ｐ５３レベルを中程度に上昇させてＭＧＭＴ発現を中程度に下方調整させ、ＤＮＡ修復能を依然として維持するように導くことが示された（図５Ｂ）。また、ＨＤＡＣ阻害はＷＴ－ｐ５３の再活性を通じてＭＧＭＴ発現を低下させる可能性があることも推測された。ＢＭＸ単独は、ＷＴ－ｐ５３レベルを中程度に増加させ、ＭＧＭＴ発現を中程度に下方調整させ、ＤＮＡ修復の維持を導くことが示された。さらに、ＢＭＸ単独でも細胞周期停止マーカー（Ｐ２１）を誘導した。本発明では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ（左部分の太い線）は、ＷＴ－ｐ５３（およびｓｅｒ１５）の過剰発現およびＭＧＭＴ発現の下方調整を通じて広範なＤＮＡ損傷を誘導し、最終的にＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスを導いた（図５Ｃ）。この組み合わせは（ＢＭＸ単独と比較して）、細胞周期停止マーカー（Ｐ２１）、アポトーシス促進性タンパク質（Ｂａｘ／Ｂｃｌ２およびＰｕｍａ）の発現を増加させ、ＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスのために切断型カスパーゼ－３発現を誘導することもできた。以上を総合すると、これらの結果は、ＢＭＸ（図７の左部分の細い線）単独ではＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を部分的にしか誘導しなかったが、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ（図７の左部分の太い線）は、ＧＢＭ－Ｒ細胞株におけるＴＭＺ細胞毒性効果を強化して、ＴＭＺ耐性を克服したことを意味する。

【0103】

結論付けると、本発明において、ＢＭＸはβ－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによってＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することにより、ＴＭＺ耐性を克服することが、予想外に見出された。これらの知見は、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ＴＭＺ耐性ＷＴ－ｐ５３ ＧＢＭ細胞の最適個別化処置に有望であることを示す。

【0104】

実施例２

【0105】

２．１．材料および方法

【0106】

２．１．１ 細胞株および細胞培養

【0107】

本試験では、３種類のＣＲＣ細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯを使用した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から、ヒトＣＲＣ細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８；突然変異体ＴＰ５３、ｐ．Ｒ２７３Ｈ；ＡＰＣフレームシフト、ｐ．Ｅ１５５４ｆｓ；野生型β－カテニン）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７；野生型ＴＰ５３；野生型ＡＰＣ；欠失β－カテニン、ｐ．Ｓ４５ｄｅｌ）およびＲＫＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２５７７；野生型ＴＰ５３；野生型ＡＰＣ；野生型β－カテニン）の提供を受けた。上に挙げた３種のＣＲＣ細胞株を、５％ ＣＯ２を含有する細胞インキュベーション内において、３７℃に維持した付着培養条件下で培養した。ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９細胞の２種の細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、１％ペニシリンおよび１％ストレプトマイシンを補充したＭｃＣｏｙ ５Ａ培地で培養した。ＲＫＯ細胞は、１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンおよび１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＭＥＭ培地で培養した。細胞培養物を、３日毎にトリプシン処理によって継代した。ＢＭ－ＢＭＸ（ＢＭＸ）、（Ｅ）－２－（４－メトキシベンジルオキシ）－３－プレニル－４－メトキシ－Ｎ－ヒドロキシシナミドは、ＮａｔｕｒｅＷｉｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から提供された。

【0108】

２．１．２ 細胞増殖アッセイ

【0109】

本発明者らはウェル当たり４０００個のＣＲＣ細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、一晩かけてそれらを接着させた。ＢＭＸおよびＴＭＺ単剤療法に対する細胞株の反応性を検証するために、細胞を異なる用量のＢＭＸまたはＴＭＺにより２４、４８、および７２時間処置した。ＢＭＸ－ＴＭＺの組み合わせに対する細胞の反応性を確認するために、細胞をＢＭＸ（５μＭ）を含むかもしくは含まない異なる用量のＴＭＺ（０～１０００μｇ／ｍＬ）により２４、４８、および７２時間処置するか、またはＴＭＺ（５０μＭ）を含むかもしくは含まない異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）により２４、４８、および７２時間処置した。処置後に、指定の時点でＣＣＫ８キット（Ｔａｒｇｅｔｍｏｌ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を使用して吸収値を測定した。結果は、少なくとも３回反復の平均±標準偏差として報告する。

【0110】

２．１．３ ＤＮＡ細胞周期のフローサイトメトリー分析

【0111】

細胞を、ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下での異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）により４８時間処置した。未処置細胞を陰性対照として使用した。すべての試料を、少なくとも３回の独立した実験において３連で実行した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のフローサイトメトリー分析を行った。ＤＮＡ細胞周期については、細胞をトリプシン処理して遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、メタノールで固定した。続いて細胞を再度洗浄し、ＰＩ作業溶液（１０μｇ／ｍＬ ＰＩおよび２０ｍｇ／ｍＬ ＲＮアーゼＡ）とともに暗所、３７℃で１５分間インキュベートした。フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１０，０００個の個々の核のＰＩ蛍光を計算した。Ｇ０／Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期、およびサブＧ０／Ｇ１期の細胞の画分を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析し、各ヒストグラムについて平均ピーク蛍光強度として決定した。

【0112】

２．１．４ アポトーシスのフローサイトメトリー分析

【0113】

ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）におけるアポトーシス誘導を、ＣＦ（登録商標）４８８Ａ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｎｄ ＰＩ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造元の指示書に従って使用して、ホスファチジルセリンの膜外在化を検出することによってアッセイした［１６］。続いて、すべての試料を直ちにフローサイトメトリーによって分析した。

【0114】

２．１．５ 定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ

【0115】

Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅａｉｄ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）を製造元の指示書に従って使用して、細胞（２×１０^５個）からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度および純度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して２６０～２８０ｎｍで調べた。続いて、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を同じく製造元の指示書に従って使用して、ｃＤＮＡ合成を行った。ｑＰＣＲ反応は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造元の推奨に従って使用して、７５００ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において１８ｓを内部基準として行った。閾値サイクル（Ｃｔ）値は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ソフトウェアを使用して計算した。各ｍＲＮＡの相対発現は、２－（ΔＣｔ）法を使用して計算した。ＨＤＡＣ８のプライマー配列は以下の通りであった。
ＨＤＡＣ８ 順方向 ５’－ＧＣＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡ－３’（配列番号１）、
ＨＤＡＣ８ 逆方向 ５’－ＡＴＡＣＴＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＡＴＣＣ－３’（配列番号２）。
１８ｓ 順方向 ５’－ＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣ－３’（配列番号３）、
１８ｓ 逆方向 ５’－ＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＡＡＴＣＡ－３’（配列番号４）。

【0116】

２．１．６ コロニー形成アッセイ

【0117】

足場依存的増殖アッセイでは、細胞１，０００個を培地に再懸濁させて６ウェルプレートに播種した。ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で種々の濃度のＢＭＸ（０～１０μＭ）のみを添加した培地を２～３日毎に交換した。１４日後に培地を除去して、細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットにより２５℃で２０分間染色した。染色細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した後、クリスタルバイオレットの強度を５７０ｎｍの吸光度によって定量した。結果は、３つの独立した実験からの平均コロニー±ＳＥとして表される。

【0118】

２．１．７ 老化関連（ＳＡ）β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）分析

【0119】

β－ｇａｌ活性のＳＡ発現は、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（ＣＳ００３０－１ＫＴ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。手短に述べると、細胞を、ＴＭＺ（５０μＭ）の存在下または非存在下で異なる用量のＢＭＸ（０～１０μＭ）により４８時間処置して、ＰＢＳで洗浄し、固定溶液を使用して室温で０．５時間かけて固定し、続いてＳＡ－β－ｇａｌ染色溶液とともに３７℃で一晩インキュベートした。ＳＡ－β－ｇａｌ活性を、ｐＨ ６．０でのＸ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－３インドリルβ－Ｄ－ガラクトシド）染色によって検討した。青色に染色された老化細胞を写真撮影した。ランダムに選択した領域（ｎ＝３）を光学顕微鏡によって分析して、老化細胞の百分率を定量化した。

【0120】

２．１．８ ウエスタンブロット分析

【0121】

ウエスタンブロット分析を使用して、ＴＭＺ（５０μＭ）またはＯＸＰ（５μＭ）の存在下または非存在下で種々の濃度のＢＭＸ（０～１０μＭ）、およびＳＡＨＡ、ＶＰＡまたはＰＣＩ－３４０５１の下での試験細胞株の指定タンパク質発現レベルを検討した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析は、以前に概説された通りに、調製した溶解物について行った［１６］。アセチル－ヒストンＨ３（Ｌｙｓ９／Ｌｙｓ１４）、アセチル－ヒストンＨ４（Ｌｙｓ８）、Ｐ５３、アセチル－Ｐ５３（Ｌｙｓ３８２）、ホスホ－Ｐ５３（Ｓｅｒ１５）、Ｐ２１、Ｐ１６、ＭＧＭＴ、リン－Ｈ２ＡＸ（Ｓ１３９）、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、切断型カスパーゼ－３、切断型カスパーゼ－８、切断型カスパーゼ－７、切断型カスパーゼ－９、ＰＡＲＰ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｋ、Ｐｕｍａ、β－カテニン、ホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ／３３／３７／４１）、ＧＳＫ３β、ホスホ－ＧＳＫ３β（Ｓｅｒ ９）、ｃ－Ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｐ６２、ＬＣ３Ｂ、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＳＯＸ－２およびＨＤＡＣ８に対する特異的一次抗体を検出に使用し、ＧＡＰＤＨ、α－チューブリンまたはβ－アクチンを内部対照として使用した。一次抗体とのインキュベーションの後に、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とインキュベートして、ＨＲＰシグナルを化学的ＨＲＰ基質により検出した。本発明者らが使用した抗体を表４に示す。各標的タンパク質のシグナルは、増強化学発光試薬とのインキュベーションおよびＸ線フィルムへの曝露によって可視化した。

【0122】

【表3-1】

【表3-2】

【0123】

２．１．９ 統計分析

【0124】

データは平均値±標準偏差で示す。統計分析は一元配置分散分析を使用して行った。データはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して比較した。統計学的有意水準は^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１に設定した。

【0125】

２．２．結果

【0126】

２．２．１ ３種のＣＲＣ細胞株におけるＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせを最適化する

【0127】

ＣＲＣ細胞の成長に対するＢＭＸまたはＴＭＺの影響を調べるために、ＨＴ２９（ｐ５３突然変異）、ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型）およびＲＫＯ（ｐ５３野生型）の３種のヒト結腸直腸癌細胞株を利用した。それらをＢＭＸ（０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５、５および１０μＭ）またはＴＭＺ（２５、５０、１００、２００、４００、８００および１，０００μＭ）により別々に２４、４８および７２時間処置した。その結果、ＣＲＣ細胞の生存性は用量依存的に有意に阻害されることが示された。ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯ細胞におけるＢＭＸまたはＴＭＺ単独の最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）値を導き出した（表５）。インビボ腫瘍形成能を表すクローン原性アッセイを用いたところ、ＴＭＺは、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞のクローン原性アッセイにおける腫瘍球形成に対して有効であり、ＴＭＺのＩＣ５０値はそれぞれ３５９．４５±５０．４３、１３７．６６±２２．７３および２４４．０１±２９．４２μＭであった。その結果、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯを含む３種の結腸直腸癌細胞に対して、３通りのインキュベーション時間でＢＭＸおよびＴＭＺの基本的な細胞増殖阻害率が示された。

【0128】

【表4】

【0129】

ＢＭＸがＴＭＺの化学的感受性を改善するか否かを評価するために、ＢＭＸおよびＴＭＺを、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯ細胞に対して一緒に投与した。ＢＭＸ（５μＭ）とＴＭＺ（２５、５０、１００、２００および４００μＭ）との組み合わせは、ＢＭＸとＴＭＺを個々に投与した場合よりも大きな細胞成長阻害効果を示した。ＢＭＸ（５μＭ）とＴＭＺ（２５、５０、１００、２００および４００μＭ）との組み合わせは、ＢＭＸとＴＭＺを個々に投与した場合よりも大きな細胞成長阻害効果を示した。その後、ＴＭＺ ５０μＭと異なる濃度のＢＭＸ（０．３１３、０．６２５、１．２５、２．５、５および１０μＭ）との組み合わせを選択して、ＴＭＺおよびＢＭＸが細胞増殖を時間依存的に抑制することについて検証した。注目されることに、ＢＭＸは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯ細胞においてＴＭＺのＩＣ５０を低下させた（表５）。これらの知見は、ＢＭＸがＣＲＣ細胞の増殖を阻害し、ＴＭＺの化学的感受性を改善することを示唆した。５０μＭのＴＭＺと５μＭのＢＭＸとは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＲＫＯ細胞において最も高い細胞毒性効果を示した。本発明者らはこの組み合わせを時間依存的な様式で使用したところ、４８時間で細胞毒性効果を認めた。この知見から、ＢＭＸがＴＭＺの化学的感受性を改善することが示唆された。ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは細胞増殖を時間依存的に抑制した。したがって、その後のすべての実験は、ＴＭＺ ５０μＭを異なる濃度のＢＭＸ（２．５、５および１０μＭ）と組み合わせて４８時間使用することで行った。

【0130】

本発明者らは次に、ＢＭＸ単独またはＴＭＺとの組み合わせの存在下でのコロニー形成を検討した。通常の連続的様式では、本発明者らは、ＢＭＸを５０μＭのＴＭＺを組み合わせた場合にこの阻害効果が増加することを見出した。ＴＭＺ（１５０μＭ）を増やすと、ＢＭＸは５～１０μＭではなく１～２μＭに低下させることができる可能性がある。以上を総合すると、これらの結果から、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ使用は、ＣＲＣ癌細胞の増殖およびコロニー形成を相乗的に阻害することが示された。したがって、その後のすべての実験は、ＴＭＺ ５０μＭを異なる濃度のＢＭＸ（２．５、５および１０μＭ）と組み合わせて４８時間使用することで行った。

【0131】

２．２．２ ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせのＣＲＣに対する影響の従来の薬物との比較

【0132】

細胞周期の停止は、細胞増殖の阻害の主な原因の１つである。ＢＭＸまたは組み合わせによる処置が細胞成長を阻害したことの考えられる機序を評価するために、細胞周期プロフィールをフローサイトメトリーを使用してアッセイした。図１３に示すように、組み合わせ処置はＨＴ２９およびＨＣＴ１１６細胞においてＧ２／Ｍ期停止を有意に誘導し、他のいかなる単独の薬物よりもＧ２／Ｍ期停止に対してはるかに強い効果を示した。５０μＭのＴＭＺと２．５、５および１０μＭのＢＭＸとは、Ｇ０／Ｇ１期の細胞周期停止の量を増加させただけでなく、ＲＫＯ細胞株のｓｕｂＧ１期の停止（アポトーシス）も引き起こした。

【0133】

４８時間の処置後のＢＭＸとＴＭＺとの相乗効果を、３種のＣＲＣ細胞におけるアネキシンＶ結合によって測定した。ＢＭＸおよびＴＭＺによる処置は、各薬剤の個々と比較してアポトーシス細胞の百分率の顕著な増加を誘導した。ＢＭＸは、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において初期アポトーシス細胞を２３．７８％、４９．３４％および５９．１８％まで増加させ、後期アポトーシスも増加させた。組み合わせ処置では、４８時間のインキュベーション後に、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞における後期アポトーシスの集団は、１．０８％から１０．３６％に、３．６７％から１９．３７％に、および０．３２％から１６．４８％に増加した。

【0134】

２．２．３ ＢＭＸ、およびＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより誘導されるアポトーシスは、ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害によって媒介される

【0135】

ｐ５３経路は、化学療法薬によって誘導されるさまざまな癌細胞のアポトーシスに関与することが報告されている［２８］。ＢＭＸはｐ５３を活性化し、β－カテニン経路によって媒介される細胞死を導くことが示されている［１６］。ＢＭＸおよびＴＭＺの抗癌効果がＤＮＡ損傷に起因するか否かを明らかにするために、本発明者は異なるｐ５３表現型を有する３種のＣＲＣ細胞株における、ＤＮＡ損傷および対応するｐ５３経路マーカーについて検討した。ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるｐ５３、アセチル－ｐ５３（Ｌｙｘ３８２）、ｐ５３（Ｓｅｒ１５）、ｐ２１、ｐ１６、ＭＧＭＴ、γ－Ｈ２ＡＸ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、ＧＡＰＤＨを含むマーカーの基本的なタンパク質発現状態を考慮すると、ＢＭＸ単独は、ｐ５３の発現を強化しただけでなく、細胞成長に干渉する他の重要な遺伝子も調整した可能性がある。ＢＭＸ単独またはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせによる処置は、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞におけるｐ５３のリン酸化（Ｓｅｒ１５）およびγ－Ｈ２ＡＸのリン酸化（Ｓｅｒ１３９）のレベルを用量依存的に増加させた。ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞において、Ｌｙｓ３８２におけるｐ５３のアセチル化は時間依存な様式で増加し、ｐ５３の下流標的であるｐ２１およびｐ１６の発現が強化された。ｐ５３野生型細胞および突然変異体細胞に対するウエスタンブロット法の結果に示されるように、ＣＲＣのｐ５３野生型細胞はＭＧＭＴが高メチル化されており、ＭＧＭＴタンパク質発現もより同様に低下していた。さらに、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、Ｅ２Ｆ３発現を有意に減少させた（図１４Ａ）。興味深いことに、ヒストンＨ３のアセチル化も、ＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとによって増加した。このことは、ＢＭＸが細胞内のヒストンアセチルトランスフェラーゼおよび／またはＨＤＡＣの活性に影響を及ぼし、それがｐ５３を含むタンパク質のアセチル化を導くことを示唆する。ＢＭＸをＴＭＺと組み合わせることにより、ｐ５３発現の強化およびｐ５３機能により媒介されるＭＧＭＴ阻害の活性化を通じて、ｐ２１、ｐ１６の発現およびγＨ２ＡＸのリン酸化を増加させることができる（図１４Ａ）。

【0136】

アポトーシス促進性（ストレスまたは死）シグナルと、Ｂｃｌ－２およびＢｉｄ、Ｂａｘまたはｐｏｍａを含む抗アポトーシス分子との間のバランスが、カスパーゼ依存的経路を通じてアポトーシス応答が引き起こされる主な理由である［２９］。図１４Ｂに示されるカスパーゼの切断から、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９およびカスパーゼ－３の活性は低濃度のＢＭＸの下では有意な変化を示さないが、ＨＴ２９細胞においてＴＭＺと組み合わされると用量依存的な様式で高度に上方調整され、最終的にＰＡＲＰ切断およびアポトーシスに寄与することが示唆された。切断型カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ９およびカスパーゼＰＡＲＰのアポトーシスタンパク質発現レベルは、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞株において、ＢＭＸ １０μＭ処置後に濃度依存的に有意に増加することが見出された。さらに、本発明者らは、ｐ５３野生型細胞介在性アポトーシスにおけるアポトーシス促進性シグナル伝達系について検討した。その結果、ＢＭＸ処置は抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ－２のレベルを低下させ、アポトーシス促進性タンパク質Ｂａｘ、ＢｉｍおよびＰｕｍａを増加させることが明らかになった。しかし、ＢＭＸ処置はアポトーシス促進性Ｂｃｌ－２ファミリータンパク質ＢａｋおよびＢｉｄの上方調整を導かなかった。加えて、ＢＭＸとＴＭＺとの相乗効果はＢＭＸ単独よりも優れていた（図１４Ｃ）。ＴＭＺとＢＭＸとの組み合わせは、特にｐ５３野生型細胞、例えば、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯにおいて、各処置単独よりも多くの老化細胞を生じさせた（図１５）。ＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２はＣＳＣの薬物耐性と高度に関連し、ＣＲＣを含むＣＳＣの表現型マーカーとして使用されているため、ＢＭＸおよびＴＭＺによる処置は、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯにおいてＣＤ１３３、ＣＤ４４、およびＳＯＸ２の発現レベルを明らかに用量依存的に低下させた（図１６）。したがって、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＣＳＣマーカーを減弱させてＣＲＣ細胞の幹細胞性表現型を変換させることによって、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化することができたと考えられる。したがって、上記の結果から、ＣＲＣ細胞におけるＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ処置により、カスパーゼ依存的シグナル伝達経路が活性化され、細胞アポトーシスが誘導されることが示された。

【0137】

２．４ ＢＭＸは、ＣＲＣ細胞におけるＷｎｔ／βカテニン／ＧＳＫ３β経路を標的化することにより、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化した

【0138】

次に、ＢＭＸがＷｎｔ／β－カテニン活性に対するＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化する機序を、３種のＣＲＣ細胞で調べた。図３Ａに示すように、３種のＣＲＣ細胞では、ＢＭＸ処置によって、β－カテニン、ホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１）およびホスホ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）タンパク質の発現レベルが増加したが、ホスホ－β－カテニン（Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１）およびホスホ－ＧＳＫ－３β（Ｓｅｒ９）レベルは減少した。５μＭのＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ処置により、３種の細胞株においてβ－カテニンのタンパク質レベルは直接低下し、ホスホ－β－カテニン（Ｓ３３／Ｓ３７／Ｔ４１）のタンパク質レベルはＧＳＫ３βによるリン酸化を通じて低下した。さらに、本発明者らは、増殖マーカーｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１に対するＢＭＸの影響をさらに検討し、ＴＭＺを含むかまたは含まないＢＭＸ両方が、増殖マーカーであるｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１を減少させ得ることを認めた（図１７Ａ）。これらの結果から、５μＭのＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ処置が、Ｓｅｒ９のリン酸化の下方調整を通じてＧＳＫ３β活性を強化し、その結果、Ｓｅｒ３３／Ｓｅｒ３７／Ｔｈｒ４１でのβ－カテニンのリン酸化が強化して、タンパク質分解を誘発することが実証された（図１７Ｂ）。加えて、ＭＧ１３２の適用は、５μＭのＢＭＸおよび５０μＭのＴＭＺの下でβ－カテニンの分解を逆行させ、ＭＧＭＴ発現を増加させた（図１７Ｃ）。以上を総合すると、これらのデータから、ＢＭＸおよびＴＭＺが、部分的にＷｎｔ／β－カテニン／ＧＳＫ３β経路を介してＴＭＺ介在性細胞毒性効果を強化し、したがって、ＣＲＣ細胞の増殖を減少させることが明らかになった。

【0139】

２．５ オートファジーは、ＢＭＸ、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせによって誘導される細胞死において重要な調整因子として機能した

【0140】

脂質化されたＬＣ３およびオートファジー基質Ｐ６２は、オートファゴソームおよびオートファジーを評価するためのマーカーとしてよく使用される［１７］。ＢＭＸによる処置またはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせ処置でも、Ｐ６２およびＬＣ３のプロセシングされた形態であるＬＣ３－ＩＩの発現が濃度依存的に増加した（図１８Ａ）。β－カテニンはＰ６２の発現を負に調整する［１７，３０］。Ｐ６２のタンパク質レベルの低下がβ－カテニンタンパク質の分解によって引き起こされたことを検証するために、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２を、ＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより処置した細胞に適用した。予想された通り、ＢＭＸ誘導βカテニン分解は逆行し、Ｐ６２発現もＭＧ１３２を適用すると抑制された（図１８Ｂ）。組み合わせ処置によるβ－カテニンタンパク質の分解により、Ｐ６２はもはや阻害されなくなり、次いで、下流のオートファジー経路を誘発した（図１８Ｂ）。ＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより誘導される細胞死におけるオートファジーの役割を判定するために、本発明者らは、オートファジーの後期を阻害するタンパク質生合成阻害剤であるＢＡＦ、および細胞透過性汎カスパーゼ阻害剤（ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（カルボベンゾキシ－バリル－アラニル－アスパルチル－［Ｏ－メチル］－フルオロメチルケトン）を使用し、ＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせの添加前に細胞を処置したところ、本発明者らは、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫが、３種の細胞株においてＢＭＸおよびＴＭＺ処置により誘導される初期アポトーシスを抑制することを見出した。加えて、ＢＡＦ Ａ１による前処置は、フローサイトメトリーを介して得られるＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせによって誘導される細胞死を減少させ、これはＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせによって誘導される切断型カスパーゼ－３、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８およびカスパーゼ－９の発現低下の結果と一致していた。異なるオートファジー／アポトーシス関連タンパク質および対応するシグナル伝達経路の間の相互作用が同定されており、これは２つの経路間にクロストークが存在することを意味する。６ｃにより誘導されるオートファジーにおけるアポトーシスの役割を検討するために、本発明者らは、ＢＭＸまたはＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせを添加する前に、細胞をＢＡＦまたはＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫで処置した。図１８Ｄに示すように、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫおよびＢＡＦは早期のアポトーシス抑制を示したものの、ＢＡＦはすべての細胞においてＬＣ３Ｉ／ＩＩに干渉することなく、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより誘導されるカスパーゼ３活性化を抑制した。しかし、Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫは、ｐ５３突然変異体型細胞株において、ＬＣ３ Ｉ／ＩＩの干渉を伴って、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせにより誘導されるカスパーゼ３活性化を阻害した。以上を総合すると、これらの結果から、細胞死に際してオートファジーを刺激することの重要性が強調された。

【0141】

２．３．結論

【0142】

従来の放射線化学療法を使用するＣＲＣ処置は、時に非効率的であるが、これは一部には、ＣＲＣ患者がこの療法レジメンに応答しないこと、および／または重度の薬物毒性に苦しむことが理由である。本発明では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ＨＣＣ細胞、特にＨＣＴ１１６およびＲＫＯにおいて、特異的かつ効率的で相乗的な抗増殖効果およびアポトーシス効果を示すことが実証された。結論として、ＢＭＸおよびＴＭＺは最良の相乗効果をもたらし、その機序は現時点で最も重要なリンクである。また、特異的ＨＤＡＣ８ｉであるＢＭＸは、テモゾロミド（ＴＭＺ）との組み合わせで細胞増殖を阻害し、細胞周期停止、細胞老化、オートファジーおよびアポトーシスを誘導し、細胞死をもたらしたと結論付けられる。

【0143】

また、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、カスパーゼ－３切断およびＰＡＲＰ活性化を通じて相乗的なアポトーシス性細胞死を誘導することが見出された。本発明では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ホスホ－ｐ５３（ｓｅｒ１５）の増強、ならびにＤＮＡ損傷、例えば、γ－Ｈ２ＡＸ病巣の増加を誘導することが実証された。ホスホ－ｐ５３（ｓｅｒ１５）の発現増加は、本発明者らの以前の研究［１６，１７］で報告されたｐ５３の総発現量の増加に起因する可能性がある。加えて、本研究では、ＢＭＸがＣＲＣ細胞の生存率に対してＴＭＺとのＨＤＡＣ依存的相乗効果を有する可能性があることも明らかになった。

【0144】

上記のことを考慮すると、ヒトＧＢＭ組織およびＧＢＭ－Ｒ細胞株におけるＨＤＡＣ８の高発現は、ＭＧＭＴレベルと相関する。ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞株において、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を通じて、ＷＴ－ｐ５３介在性アポトーシスを誘導した。さらに、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせは、ＧＢＭ－Ｒ細胞株においてβ－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／サイクリンＤ１／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を介した細胞増殖およびＧＳＣ表現型活性も抑制した。したがって、ＢＭＸは、ＷＴ－ｐ５３およびＴＭＺ耐性のＧＢＭ患者の精確個別化処置のための有望な戦略となり得る。

【0145】

全体的に、相乗的機序の指標として、本発明では、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ｐ５３／ｐ２１／Ｅ２Ｆ３／Ｂａｘを上方調整し、Ｗｎｔ／β－カテニン／サイクリンＤ１／ｃ－Ｍｙｃ／ｐ６２経路を下方調整することによって、ＣＲＣの細胞死の誘導に有効であることが実証された。したがって、ＢＭＸとＴＭＸとの組み合わせは、アポトーシスおよびオートファジーの誘導を含む細胞死に対して有望な効果をもたらすことが見出された。実施例における結果は、ＢＭＸとＴＭＺとの組み合わせが、ＣＲＣ細胞死に対するＨＤＡＣ８依存的相乗作用を理解するのに役立つことによって役割を果たす可能性を示す。これらの知見は、組み合わせ化学療法レジメンに対する耐性が生じる臨床的に重要な新たな機序を示唆する。

【0146】

本明細書は多くの詳細を含むが、これらは本発明の範囲または特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、そうではなくて本発明の特定の実施態様または実施例にとって特徴的な特徴の記載として解釈されるべきである。別々の実施態様または実施例の文脈において本明細書に記載されるある特定の特徴は、単一の実施態様において組み合わせて実施することも可能である。

【0147】

参考文献
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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2024521192000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-01-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための組み合わせ剤であって、テモゾロミド（ＴＭＺ）および、式Ａ：

【化1】

［式中、
Ｒ^１は、水素、アルキル、アルケニル、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環または５員もしくは６員のヘテロ環、または（ＣＨ_２）ｍＲ^４であり；
Ｘは、Ｃ、－Ｏ－、－Ｎ－または－Ｓ－であり；
Ｙは、－Ｏ－、－ＮＨまたは－Ｏ－Ｃ_１－Ｃ_４アルキルであり；
ｎは、０～１０の整数であり；
ｍは、０～５の整数であり；
Ｒ^２およびＲ^３は独立して、Ｃ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^４は、Ｃ_５－Ｃ_６シクロアルキル、またはハロゲン、－ＣＦ_３、－ＯＲ^７もしくは－ＮＲ^７Ｒ^８によって置換されていてもよい５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、Ｒ^７およびＲ^８は独立して、水素またはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり；
Ｒ^５は、ＯＨ、ＮＨ_２、またはＣ_５－Ｃ_６シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、シクロアルキル、炭素環およびヘテロ環は、ハロゲン、ＮＨ_２、ＮＯ_２、Ｃ_１－Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１－６アルキルチオ、ＯＲ^７''、ＮＲ^７Ｒ^８またはＣＦ_３によって場合により置換されていてよく；そして
Ｒ^６は、Ｈであるか、ヒドロキシもしくはＣ_２－Ｃ_１０アルケニルによって置換されていてもよいＣ_１－Ｃ_１０アルキルであるか、またはＲ^１と一緒になって－Ｃ_２Ｈ_２－となる］
の構造を有する化合物Ａ、またはその薬学的に許容できる塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグまたは溶媒和物を含み、
ＴＭＺおよび化合物Ａは、ＴＭＺ耐性を効果的に克服する相対比で組み合わされている、組み合わせ剤。

【請求項2】

化合物Ａが、

【化2】

の構造を有する化合物ＢＭＸである、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項3】

ＴＭＺ耐性が、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化によって克服される、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項4】

ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化が、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによるものである、請求項３に記載の組み合わせ剤。

【請求項5】

ＴＭＺおよび化合物Ａが、別々にまたは順次に投与される、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項6】

ＴＭＺおよびＢＭＸを含む、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項7】

癌が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、請求項１に記載の組み合わせ剤。

【請求項8】

患者において薬物耐性癌の最適個別化処置のための方法に使用するための、請求項１に記載の化合物Ａまたはそれと前記薬物との組み合わせ剤を含む医薬であって、ここで、該方法は、患者におけるＷＴ－ｐ５３の発現を判定すること、および、ＷＴ－ｐ５３の発現が患者に存在する場合に、治療有効量の請求項１に記載の化合物Ａまたはそれと前記薬物との組み合わせ剤を患者に投与することを含む、医薬。

【請求項9】

薬物が、ＴＭＺである、請求項８に記載の医薬。

【請求項10】

薬物耐性癌が、ＴＭＺ耐性のＧＭＢまたはＣＲＣである、請求項８または９に記載の医薬。

【請求項11】

請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤を含む、ＴＭＺ耐性癌患者のための医薬またはキット。

【請求項12】

癌が、ＧＢＭまたはＣＲＣである、請求項１１に記載の医薬またはキット。

【請求項13】

請求項１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤を含む、ＴＭＺ耐性のＷＴ－ｐ５３ ＧＢＭ患者またはＣＲＣ患者の最適個別化処置のための医薬またはキット。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１４６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0146】

本明細書は多くの詳細を含むが、これらは本発明の範囲または特許請求の範囲に対する限定として解釈されるべきではなく、そうではなくて本発明の特定の実施態様または実施例にとって特徴的な特徴の記載として解釈されるべきである。別々の実施態様または実施例の文脈において本明細書に記載されるある特定の特徴は、単一の実施態様において組み合わせて実施することも可能である。
さらに、本願発明は次の態様を含む。
［態様１］
患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための組み合わせ剤であって、テモゾロミド（ＴＭＺ）および、式Ａ：

【化6】

［式中、
Ｒ ^１ は、水素、アルキル、アルケニル、Ｃ _５ －Ｃ _６ シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環または５員もしくは６員のヘテロ環、または（ＣＨ _２ ）ｍＲ ^４ であり；
Ｘは、Ｃ、－Ｏ－、－Ｎ－または－Ｓ－であり；
Ｙは、－Ｏ－、－ＮＨまたは－Ｏ－Ｃ _１ －Ｃ _４ アルキルであり；
ｎは、０～１０の整数であり；
ｍは、０～５の整数であり；
Ｒ ^２ およびＲ ^３ は独立して、Ｃ _１ －Ｃ _６ アルキルであり；
Ｒ ^４ は、Ｃ _５ －Ｃ _６ シクロアルキル、またはハロゲン、－ＣＦ _３ 、－ＯＲ ^７ もしくは－ＮＲ ^７ Ｒ ^８ によって置換されていてもよい５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、Ｒ ^７ およびＲ ^８ は独立して、水素またはＣ _１ －Ｃ _６ アルキルであり；
Ｒ ^５ は、ＯＨ、ＮＨ _２ 、またはＣ _５ －Ｃ _６ シクロアルキル、５員もしくは６員の不飽和炭素環もしくはヘテロ環であり、ここで、シクロアルキル、炭素環およびヘテロ環は、ハロゲン、ＮＨ _２ 、ＮＯ _２ 、Ｃ _１ －Ｃ _６ アルコキシ、Ｃ _１－６ アルキルチオ、ＯＲ ^７ ''、ＮＲ ^７ Ｒ ^８ またはＣＦ _３ によって場合により置換されていてよく；そして
Ｒ ^６ は、Ｈであるか、ヒドロキシもしくはＣ _２ －Ｃ _１０ アルケニルによって置換されていてもよいＣ _１ －Ｃ _１０ アルキルであるか、またはＲ ^１ と一緒になって－Ｃ _２ Ｈ _２ －となる］
の構造を有する化合物Ａ、またはその薬学的に許容できる塩、立体異性体、エナンチオマー、プロドラッグまたは溶媒和物を含み、
ＴＭＺおよび化合物Ａは、ＴＭＺ耐性を効果的に克服する相対比で組み合わされている、組み合わせ剤。
［態様２］
化合物Ａが、

【化7】

の構造を有する化合物ＢＭＸである、態様１に記載の組み合わせ剤。
［態様３］
ＴＭＺ耐性が、ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化によって克服される、態様１または２に記載の組み合わせ剤。
［態様４］
ＴＭＺ介在性細胞毒性効果の強化が、β－カテニン／ｃ－Ｍｙｃ／ＳＯＸ２シグナル伝達経路を下方調整し、ＷＴ－ｐ５３介在性ＭＧＭＴ阻害を上方調整することによるものである、態様３に記載の組み合わせ剤。
［態様５］
ＴＭＺおよび化合物Ａが、別々にまたは順次に投与される、態様１～４のいずれかに記載の組み合わせ剤。
［態様６］
ＴＭＺおよびＢＭＸを含む、態様１～５のいずれかに記載の組み合わせ剤。
［態様７］
癌が、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）または結腸直腸癌（ＣＲＣ）である、態様１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤。
［態様８］
患者においてＴＭＺ耐性癌を処置するための方法であって、態様１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の治療有効量を患者に投与することを含む方法。
［態様９］
癌が、ＧＢＭまたはＣＲＣである、態様８に記載の方法。
［態様１０］
患者において薬物耐性癌の最適個別化処置のための方法であって、患者におけるＷＴ－ｐ５３の発現を判定すること、および、ＷＴ－ｐ５３の発現が患者に存在する場合に、治療有効量の態様１に記載の化合物Ａまたはそれと前記薬物との組み合わせ剤を患者に投与することを含む、方法。
［態様１１］
薬物が、ＴＭＺである、態様１０に記載の方法。
［態様１２］
薬物耐性癌が、ＴＭＺ耐性のＧＭＢまたはＣＲＣである、態様１０または１１に記載の方法。
［態様１３］
ＴＭＺ耐性癌患者のための医薬またはキットを製造するための、態様１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の使用。
［態様１４］
癌が、ＧＢＭまたはＣＲＣである、態様１１に記載の使用。
［態様１５］
ＴＭＺ耐性のＷＴ－ｐ５３ ＧＢＭ患者またはＣＲＣ患者の最適個別化処置のための医薬またはキットを製造するための、態様１～６のいずれかに記載の組み合わせ剤の使用。

【国際調査報告】