特表2024-521209 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ カウンシル　オブ　サイエンティフィック　アンド　インダストリアル　リサーチの特許一覧

特表2024-521209ｓｉＲＮＡ送達ベクター

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2-1
2-2
3
4
5
6

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-28

(54)【発明の名称】ｓｉＲＮＡ送達ベクター

(51)【国際特許分類】

A61K 47/54 20170101AFI20240521BHJP

A61K 47/69 20170101ALI20240521BHJP

A61K 47/24 20060101ALI20240521BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240521BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20240521BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240521BHJP

A61K 31/713 20060101ALI20240521BHJP

A61K 9/51 20060101ALI20240521BHJP

C07F 9/6561 20060101ALN20240521BHJP

【ＦＩ】

A61K47/54

A61K47/69

A61K47/24

A61K48/00

A61K45/00

A61P35/00

A61K31/713

A61K9/51

C07F9/6561 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574125

(86)(22)【出願日】2022-06-03

(85)【翻訳文提出日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 IB2022055214

(87)【国際公開番号】W WO2022254405

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】202111024926

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508176500

【氏名又は名称】カウンシルオブサイエンティフィックアンドインダストリアルリサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山康文

(72)【発明者】

【氏名】コタムラジュ，スリジリダー

(72)【発明者】

【氏名】バトゥーラ，サレンダー・レッディ

(72)【発明者】

【氏名】シャイカ，アルタブ

(72)【発明者】

【氏名】ニーリ，パラヴィーン・クマール

(72)【発明者】

【氏名】サラヴヤ，パナンギパリ

(72)【発明者】

【氏名】バネルジー，ラジクマール

(72)【発明者】

【氏名】テナティ，ラジャマナール

(72)【発明者】

【氏名】ガジャラクシュミ，シングル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H050

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076DD63

4C076FF63

4C076FF68

4C084AA13

4C084AA17

4C084MA05

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA03

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB26

4H050AA03

4H050AB20

(57)【要約】

６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体が提供されている。複合体は、ナノ粒子または非ウイルスベクターに自己組織化されて、負電荷を持つ薬剤の送達を促進する。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。それ故に、本発明は、そのような負電荷を持つ薬剤を標的細胞に送達する方法を提供し、特に細胞膜を横断する治療剤または診断剤の送達を促進し、また治療剤または診断剤の送達を介した治療または診断の方法を提供する。６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質はＭｉｔｏ－Ｅｓｃとすることができ、負電荷を持つ薬剤はｓｉＲＮＡなどの核酸とすることができる。さらに、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、がんの治療に有効であると考えられる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と負電荷を持つ薬剤との複合体。

【請求項2】

前記６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質が、

式中、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子であり、
Ｒ_１はアリール、シクロアルキル、またはヘテロアリールであり、
Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合もしくは三重結合を含むＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であるか、または、
－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－、または、
－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、
式中、
ｐは２または３であり、ｎは３～６の整数であり、ｍは２～４の整数であり、
Ｒ_２はＯ、ＮＨ、またはＳである、請求項１に記載の複合体。

【請求項3】

前記複合体が式Ｉの化合物であり、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤であり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子であり、
Ｒ_１はアリール、シクロアルキル、またはヘテロアリールであり、
Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合もしくは三重結合を含むＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であるか、または、
－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－、または、
－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、
式中、
ｐは２または３であり、ｎは３～６の整数であり、ｍは２～４の整数であり、
Ｒ_２はＯ、ＮＨ、またはＳである、請求項１に記載の複合体。

【請求項4】

前記複合体が式ＩＩの化合物であり、

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤であり、
Ｒは水素、一つ以上の置換アルキル、一つ以上の置換アリール、または一つ以上の置換ヘテロ原子である、請求項１に記載の複合体。

【請求項5】

前記複合体が式ＩＩＩの化合物であり、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤である、請求項１に記載の複合体。

【請求項6】

前記負電荷を持つ薬剤が治療剤、診断剤、または核酸から選択される、請求項１～５に記載の複合体。

【請求項7】

前記核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から選択される、請求項６に記載の複合体。

【請求項8】

前記複合体がナノ粒子の形態である、請求項１～７に記載の複合体。

【請求項9】

がんを治療、改善または診断する方法であって、前記方法が、請求項１～７に記載の複合体の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項10】

がんの治療または診断に使用する、請求項１～７に記載の複合体。

【請求項11】

請求項１～７に記載の複合体と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項12】

Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが式ＶＩの化合物で表される、医薬組成物。

【請求項13】

がんの治療に使用する、請求項１１～１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項１～７に記載の複合体の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項15】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項１１～１２に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項16】

Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体であって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが式ＶＩの化合物で表される、複合体。

【請求項17】

６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と負電荷を持つ薬剤との複合体を含むナノ粒子。

【請求項18】

前記６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質が、式ＩＶ、ＶまたはＩＶの化合物から選択され、

【請求項19】

式Ｉの化合物の複合体を含み、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子であり、
Ｒ_１はアリール、シクロアルキル、またはヘテロアリールであり、
Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合もしくは三重結合を含むＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であるか、または、
－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－、または、
－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、
式中、
ｐは２または３であり、ｎは３～６の整数であり、ｍは２～４の整数であり、
Ｒ_２はＯ、ＮＨ、またはＳである、請求項１７に記載のナノ粒子。

【請求項20】

式ＩＩの化合物の複合体を含み、

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、一つ以上の置換アルキル、一つ以上の置換アリール、または一つ以上の置換ヘテロ原子である、請求項１７に記載のナノ粒子。

【請求項21】

式ＩＩＩの化合物の複合体を含み、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンである、請求項１７に記載のナノ粒子。

【請求項22】

前記負電荷を持つ薬剤が治療剤、診断剤、または核酸から選択される、請求項１７～２１に記載のナノ粒子。

【請求項23】

前記核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から選択される、請求項２２に記載のナノ粒子。

【請求項24】

前記負電荷を持つ対イオンが、ハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される、請求項１７～２１に記載のナノ粒子。

【請求項25】

前記ナノ粒子が１００～２００ｎｍのサイズを有する、請求項１７～２４に記載のナノ粒子。

【請求項26】

前記ナノ粒子が３０～４０ｍＶの表面電荷を有する、請求項１７～２４に記載のナノ粒子。

【請求項27】

がんを治療、改善または診断する方法であって、前記方法が、請求項１７～２６に記載のナノ粒子の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項28】

がんの治療または診断に使用する、請求項１７～２６に記載のナノ粒子。

【請求項29】

請求項１７～２６に記載のナノ粒子と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項30】

薬学的に許容可能な担体または賦形剤とともにナノ粒子を含む医薬組成物であって、前記ナノ粒子がＭｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体を含み、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが式ＶＩの化合物によって表される、医薬組成物。

【請求項31】

がんの治療に使用する、請求項２９～３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項１７～２６に記載のナノ粒子の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項33】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項２９～３０に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項34】

Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体を含むナノ粒子であって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが式ＶＩの化合物で表される、ナノ粒子。

【請求項35】

式Ｉの化合物であって、

【請求項36】

式ＩＩの化合物であって、

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、一つ以上の置換アルキル、一つ以上の置換アリール、または一つ以上の置換ヘテロ原子である、化合物。

【請求項37】

式ＩＩＩの化合物であって、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンである、化合物。

【請求項38】

前記負電荷を持つ薬剤が治療剤、診断剤、または核酸から選択される、請求項３５～３７に記載の化合物。

【請求項39】

核酸が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から選択される、請求項３８に記載の化合物。

【請求項40】

前記負電荷を持つ対イオンがメシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される、請求項３５～３７に記載の化合物。

【請求項41】

がんを治療、改善、または診断する方法であって、前記方法が、請求項３５～４０に記載の化合物の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項42】

がんの治療または診断に使用する、請求項３５～４０に記載の化合物。

【請求項43】

請求項３５～４０に記載の化合物と、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項44】

式ＩＩＩの化合物であって、

式中、ＺはｓｉＲＮＡである、化合物と、
薬学的に許容可能な担体または賦形剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項45】

がんの治療に使用する、請求項４３～４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項３５～４０に記載の化合物の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項47】

負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法であって、前記方法が、請求項４３～４４に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。

【請求項48】

式ＩＩＩの化合物であって、

式中、
ＺはｓｉＲＮＡである、化合物。

【請求項49】

式Ｉの化合物であって、

【請求項50】

式ＩＩの化合物であって、

式中、ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素である、
がんの治療に使用する、化合物。

【請求項51】

式ＩＩＩの化合物であって、

式中、
Ｚは負電荷を持つ薬剤または負電荷を持つ対イオンである、
がんの治療に使用する、化合物。

【請求項52】

前記負電荷を持つ薬剤が治療剤、診断剤、または核酸から選択される、請求項４９～５１に記載の化合物。

【請求項53】

核酸が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から選択される、請求項５２に記載の化合物。

【請求項54】

前記負電荷を持つ対イオンがハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される、請求項４９～５１に記載の化合物。

【請求項55】

がんが乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がん、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんから選択される、請求項４９～５１に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡなどの核酸のための新規の送達ベクターを提供し、様々な疾患および／または障害の予防または治療のためのそれらの使用を改善する。さらに発明は、乳がんなどのがんに対する新規治療法を提供する。

【背景技術】

【0002】

核酸は、免疫療法を含むがん治療の有望な治療候補として浮上している。核酸はプラスミド、ｍＲＮＡ、ＡＳＯ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、アプタマー、遺伝子編集ｇＲＮＡ、免疫調節ＤＮＡ／ＲＮＡなどの、ＤＮＡまたはＲＮＡの多様なクラスである。核酸治療薬は、遺伝子発現の変更（上方制御または下方制御）から免疫応答の調節に至る、多用途の機能を有する。核酸の高い特異性、多用途機能性、再現性のあるバッチごとの製造、調整可能な免疫原性によって、核酸はがん免疫療法の優れた候補となる。

【0003】

例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、広範囲の医学的状態を治療するための新規かつ有用な治療剤として浮上している。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された初めてのこのような治療は、成人患者における遺伝性トランスサイレチン媒介性アミロイドーシス（ｈＡＴＴＲ）によって引き起こされる末梢神経疾患（多発性ニューロパチー）の治療のために開発された薬品パチシラン（ＯＮＰＡＴＴＲＯ（商標））であり、これは末梢神経、心臓、他の器官における異常なアミロイドタンパク質の蓄積を特徴とする、希少で衰弱性の、かつしばしば致命的な遺伝性疾患である。ＦＤＡに承認されたｓｉＲＮＡ治療のさらなる例としては、急性肝性ポルフィリン症を有する成人患者の治療のためのＧＩＶＡＬＡＡＲＩ（商標）（ギボシラン）があり、これは（血液中の酸素を結合するのを助ける）ヘムの産生中に形成される有毒なポルフィリン分子の蓄積をもたらす遺伝性の障害である。他のｓｉＲＮＡ療法も開発中であり、臨床評価中である。

【0004】

ｓｉＲＮＡは治療にとって大きな潜在的可能性を有するが、生体液と組み合わせるために裸のまたは封入された核酸のいずれかを担体に導入することは、ｓｉＲＮＡの細胞生体内分布および細胞内バイオアベイラビリティを変化させる多くの生理学的障壁に直面するため、課題が残っている。投与後、未修飾のＤＮＡおよびＲＮＡは、標的細胞の表面に達することができる前に、細胞外酵素および細胞内酵素によって生体液中で急速に分解する。これは、核酸の活性、および核酸による細胞との相互作用に影響を及ぼし、核酸の治療成績を損ねる。さらに、核酸は、親水性でありかつ分子量が大きいため、細胞の取り込みが非常に制限されている。細胞に取り込まれることができるごく一部は通常、小胞（すなわち、エンドソーム）に内部移行され、これはその後リソソームに変換される。リソソーム内部での核酸の蓄積とその後消化は、核酸が細胞質または核の標的に到達することを妨げ、また核酸の有効性に対する有意な障壁である。例えば、ｓｉＲＮＡの限られた安定性、その免疫原性、およびｓｉＲＮＡ治療剤を細胞内の所望の標的部位内に送達するという課題、すなわち細胞膜を横断して細胞の細胞質内にｓｉＲＮＡを輸送することの困難さはすべて、ｓｉＲＮＡの有効性に対する障壁である。核酸の細胞内バイオアベイラビリティを増加させるために、多くの戦略が検討されてきた。これらの技法には主に、核酸の化学構造を改変すること、または遺伝物質をベクター（ウイルスまたは非ウイルス）に封入することが含まれる。これらのベクターは、細胞によって取り込まれるのに十分小さく、細胞結合およびその後の取り込みを促進するために、標的化部分または過剰な正電荷のいずれかを有するべきである。概してウイルスベクターは、より高い輸送効果を達成することができるものの、このようなベクターには安全性およびスケーラビリティの制限に関する懸念が残る。従って、非ウイルスベクターは、治療効果が低いにもかかわらず、好ましい。融合性の脂質もしくはペプチドまたは膜不安定化ポリマーの組み込みを使用して、エンドソーム／リソソームから細胞質内への遺伝物質の脱出を促進することができる。ｐＤＮＡを使用する場合、発現効率を高めるための核ホーミング配列でのタグ付けも利用できる。最後に、これらの複合体は、中間の安定性を有するべきであり、すなわち、核酸を標的部位に運ぶのに十分に堅牢であるべきであるが、標的の細胞内区画／細胞小器官では核酸から解離するべきである。例えば、負電荷を持つリン酸基がＲＮＡ分子内に存在することに起因して、標的部位への細胞内送達は送達ベクターの存在を必要とする。しかしながら、治療用組成物中に送達ベクターを含めることは、活性ＲＮＡ薬剤の治療能力を制限することができる。

【0005】

一般的に、非ウイルスベクターは、常に電荷を持つ第四級アンモニウム系のカチオン性脂質（ＰＣＣＬ）またはカチオン性ポリマー（ＰＣＣＰ）とともに合成粒子であることになり、ｓｉＲＮＡ複合体を産生し、続いてトランスフェクションを行うことになるが、毒性を低減するために、プロトン化可能なアミン基を含むｐＨ応答性脂質が一般的に必要であることになる。これに関して、トリ－フェニルホスホニウム（ＴＰＰ）結合ポリマー系送達システムは、その優れた安全性およびトランスフェクション能力のため、アンモニウム系システムに代わる非毒性の代替物として注目を集めている。また、ＴＰＰアンカー分子は、両親媒性の特性および非局在化した正電荷に起因して、生体適合性、膜融合、細胞取り込み、またミトコンドリア標的化の向上を呈する。

【0006】

高いトランスフェクション効率を提供することができる非毒性核酸送達ベクターに対するニーズがあり続けている。

【0007】

本発明は、ホスホニウム両親媒性物質に基づく新規の核酸送達方法を提供する。好ましくは、記載のホスホニウム両親媒性物質は、凝集体を形成し、その後、ホスホニウム－ｓｉＲＮＡ複合体を形成することによってｓｉＲＮＡなどの核酸を標的細胞に送達する能力を有する。本発明による例示的なホスホニウム両親媒性物質は、トリフェニルホスホニウムカチオン（ＴＰＰ＋）結合エスクレチンである（本明細書において「ミト－エスクレチン」または「Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ」と称され、これらの用語は本明細書において互換的に使用される）。

【0008】

Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃの分子構造は、８－炭素脂肪族鎖を介して親水性６，７－ジヒドロキシクマリン分子に連結された親油性ＴＰＰカチオンから成る。それ故に、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、同じ分子内に疎水基および親水基という相反する面を有する構造から成る両親媒性分子である。

【0009】

米国特許第９５８０４５２号には、アテローム性動脈硬化症の治療に対するミト－エスクレチンの使用が記載されている。ＰＣＴ出願第ＩＢ２０２０／０６１０４３号には、創傷、乾癬、脱毛の治療に対するミト－エスクレチンの使用が記載されている。しかしながら、これらの開示はいずれも、ミト－エスクレチンが核酸送達ベクターとして、好ましくはｓｉＲＮＡ送達ベクターとして有用である可能性も、ミト－エスクレチンが乳がんなどのがんの治療に有用である可能性も示唆していない。

【0010】

さらに最近、ミトコンドリア標的エスクレチン（Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ）が、酸化物質によって誘発される内皮機能障害を和らげることによって、アテローム性動脈硬化性疾患の進行を大幅に軽減することが証明された。それによって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、酸化物質が媒介する細胞異常を改善する一方で、優先的な乳がん細胞死を引き起こすことを示している。このような背景で、本発明では、自己組織化ナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡ送達ベクターなどの効率的な核酸送達ベクターとして機能させるために、ＴＰＰカチオンの疎水性特性、および６，７－ジヒドロキシクマリンの親水性特性を利用した。

【発明の概要】

【0011】

鋭意研究の結果、本発明者らは、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質が、負電荷を持つ薬剤とともに複合体を形成することを見いだした。負電荷を持つ治療剤は、治療剤または診断剤であってもよい。負電荷を持つ薬剤は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。より具体的には、特定の疾患または障害の治療または診断を標的とするｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡである。

【0012】

さらに本発明者らは、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体が、ナノ粒子または非ウイルスベクターに自己組織化されることを見いだした。それ故に本発明は、負電荷を持つ薬剤の標的細胞への送達方法、特に細胞膜を横断する薬剤の送達方法を提供する。

【0013】

随意に、本発明の複合体およびナノ粒子において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質複合体およびナノ粒子は、式Ｉの化合物であり、

【化1】

式中、
Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子であり、
Ｒ_１はアリール、シクロアルキル、またはヘテロアリールであり、
Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合もしくは三重結合を含むＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であるか、または、
－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－、または、
－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、
式中、
ｐは２または３であり、ｎは３～６の整数であり、ｍは２～４の整数であり、
Ｒ_２はＯ、ＮＨ、またはＳである。

【0014】

好ましくは、ＸはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、Ｒは水素である。

【0015】

一つの実施形態において、本発明の複合体およびナノ粒子において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、６，７－ジヒドロキシクマリン部分に共有結合されたトリフェニルホスホニウムカチオンである。より具体的に、複合体およびナノ粒子は、式ＩＩの化合物であり、

【化2】

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖、好ましくはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤またはハライドであり、
Ｒは水素である。

【0016】

一部の実施形態において、式Ｉまたは式ＩＩの化合物の複合体およびナノ粒子は、式ＩＩＩの化合物であり、

【化3】

Ｚは負電荷を持つ薬剤またはハライドである。

【0017】

さらなる研究では、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質またはその薬学的に許容可能な塩が、がんの治療または診断に有用であることも示されている。従って本発明はまた、がん、特に乳がんの治療において、およびがんの治療方法において使用する、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、上記方法は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質またはその薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする患者に投与することを含む。

【0018】

本発明の前述の態様および実施形態、ならびにその他の態様、目的、特徴、利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、正常な細胞の生存度に影響を与えることなく、乳がん細胞死を用量依存的および時間依存的に誘導する。（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞を、様々な濃度のＭｉｔｏ－Ｅｓｃ（１．２５～７．５μＭ）で処理した。細胞生存度を、２４時間および４８時間でトリパンブルー色素排除アッセイによって測定した。（Ｂ）細胞を親Ｅｓｃ（５～５０μＭ）で処理したことを除き、Ａと同じ。（Ｃ）ＭＣＦ１０Ａ（正常な乳腺上皮）細胞を、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ（５～５０μＭ）で処理したことを除き、Ａと同じ。（＊＝対照と有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。ｎｓ＝対照との有意差がない）。

【図2】（Ａ）ＤＬＳ：Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子のサイズ分布、（Ｂ）Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子のＳＥＭ画像：Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子の走査電子顕微鏡写真（スケールバー１００ｎｍ）、（Ｃ）Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子のＴＥＭ画像：Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子の透過電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）、試料はモリブデン酸アンモニウムでネガティブ染色した（スケールバー２００ｎｍ）。（Ｄ）および（Ｅ）Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃの結合能力：異なるＰ＋／Ｐ－比でのＭｉｔｏ－Ｅｓｃ、およびミト－イソスコポレチン、オクチルＴＰＰで形成されたｓｉＲＮＡリポプレックスのアガロースゲル電気泳動アッセイ。

【図3】ミトＥｓｃ投与によって乳がんの進行が退行したＳＣＩＤマウスモデル：（Ａ）各群からの代表的な腫瘍は、示された通りに表示されている。（Ｂ）グラフは終了日の平均腫瘍体積±ＳＥＭ（ｍｍ^３）を描写する。（Ｃ）グラフは腫瘍重量を示す。（Ｄ）平均壊死指数は三つの個別の腫瘍片で計算された。データは、４匹の動物の平均±ＳＥを表す。

【図4】Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＭｎＳＯＤ複合体は、ＭｎＳＯＤレベルを枯渇させることによって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが誘発する乳がん細胞死を増幅させる。（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＭｎＳＯＤ（４０ｎＭ）複合体、またはリポフェクトアミン－２０００／ｓｉＭｎＳＯＤ複合体のいずれかで４８時間インキュベートし、細胞生存度をトリパンブルー色素排除アッセイによって測定した。（Ｂ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、示された送達システムを用いてｓｉＭｎＳＯＤ（４０ｎＭ）で４８時間トランスフェクトし、ＭｎＳＯＤタンパク質レベルをイムノブロット法によって測定した。括弧は、ＧＡＰＤＨ（ローディング対照）に対して正規化されたＭｎＳＯＤの相対的な発現を示す。（＊＝対照と有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。ｎｓ＝対照との有意差がない。）。

【図5】共焦点イメージングを使用したＭｉｔｏ－ＥｓｃによるＣｙ－５ｓｉＲＮＡの細胞内送達の検出。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、示された送達システムを用いてＣｙ－５標識ｓｉＲＮＡ（４０ｎＭ）で２４時間トランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクションの有効性を評価した。サイトゾル中のＣｙ－５蛍光は青色で示されている（スケールバー１０倍）。

【図6】共焦点イメージングを使用したＣｙ－５ｓｉＲＮＡの細胞内送達の比較。ＭＣＦ－１０Ａ細胞を、異なる送達機構を使用してＣｙ－５標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクションの有効性を評価した。サイトゾル中のＣｙ－５蛍光は青色で示されている。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書で使用される以下の定義は、別段の明記がない限り適用される。特段の明記がない限り、単数形「ａ（一つの）」、「ａｎ（一つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は複数の参照を含むことが理解されるべきであるが、そうではないことが文脈から明らかである場合はこの限りではない。

【0021】

本発明における「アルキル」とは、直鎖状または分岐状炭化水素基を意味し、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、Ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－オクチルなどを含む。

【0022】

「アルケニル」は、直鎖状および分枝状の炭化水素基、および少なくとも一つの二重結合を意味し、エテニル、３－ブテン－１－イル、２－エテニルブチル、３－ヘキセン－１－イルなどを含むが、これらに限定されない。

【0023】

「アルキニル」は、直鎖状および分枝状の炭化水素基、および少なくとも一つの三重結合を意味し、エチニル、３－ブチン－１－イル、プロピニル、２－ブチン－１－イル、３－ペンチン－１－イルなどを含むが、これらに限定されない。

【0024】

「アリール」とは、単一の環（例えば、フェニル）、複数の環（例えば、ビフェニル）、または少なくとも一つが芳香族である複数の縮合環（例えば、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、ナフチル、アントリル、またはフェナントリル）を有する芳香族炭素環基を意味し、これは、例えばハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、トリフルオロメチル、低級アシルオキシ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシで一置換、二置換、または三置換されることができる。好ましいアリールはフェニルである。

【0025】

「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。ヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄であることが好ましい。

【0026】

「シクロアルキル」とは、３～８個の炭素原子を有する単環式または多環式のヒドロカルビル基、例えばシクロプロピル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロブチル、アダマンチル、ノルピナニル、デカリニル、ノルボルニル、シクロヘキシル、シクロペンチルを意味する。

【0027】

本発明における「ハライド」という用語は、フルオライド、ブロマイド、クロライド、ヨージドを意味する。

【0028】

「ヘテロアリール」とは、窒素、酸素、または硫黄から選択される少なくとも一つかつ最大で４つのヘテロ原子を含有する、５、６、または７員環の一つ以上の芳香族環系を意味する。そのようなヘテロアリール基としては、例えばチエニル、フラニル、チアゾリル、トリアゾリル、イミダゾリル、（イソ）オキサゾリル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、オキサチアジアゾリル、チアトリアゾリル、ピリミジニル、（イソ）キノリニル、ナフチリジニル、フタルイミジル、ベンズイミダゾリル、ベンズオキサゾリルが挙げられる。

【0029】

本明細書で使用される「治療有効量」は、標的となる疾患または障害を軽減するのに有効な治療剤の量を指す。

【0030】

本明細書で使用される「患者」とは、任意のヒトまたは非ヒト動物（例えば、霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）を指す。本明細書で使用される「治療」という用語は、疾患および／または障害を可能な限り迅速に治癒すること、および重篤な疾患への進行を予防することを指す。

【0031】

本発明は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質が、負電荷を持つ薬剤で自己凝集して、標的細胞（例えば、がん細胞）への薬剤の送達を促進するのに特に適切なベクターまたはナノ粒子を形成することができるという驚くべき発見に基づく。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。好ましくは、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、６，７－ジヒドロキシクマリン部分と共有結合したトリフェニルホスホニウムカチオンである。好ましい６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、オクチルタグ付きエスクレチン（ミト－エスクレチン）である。さらに、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、がん、特に乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療および診断に有用であることが、複数の研究によってさらに実証されている。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんにおいてである。

【0032】

一つの態様において、本発明は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体を提供する。

【0033】

負電荷を持つ薬剤は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。しかしながら、必要なのは、薬剤が負の電荷を有し、その結果、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に関連付けられることである。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。一部の実施形態において、治療剤は、標的細胞の細胞質への送達が意図されていて、それによって、標的細胞の細胞質内で、意図された治療効果を発揮する。一部の実施形態において、治療剤は、負電荷を持つ抗がん剤、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の疾患または障害の治療または診断、例えばがん、末梢神経疾患、急性肝性ポルフィリン症などの治療または診断に有効でありうる。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療に使用されることができる。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんである。

【0034】

あるいは、治療剤は、ＲＮＡワクチン、例えばウイルス（例えばコロナウイルス）に対するＲＮＡワクチンとすることができる。

【0035】

一つの実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質複合体は、式Ｉの化合物であり、

【化4】

【0036】

別の実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、６，７－ジヒドロキシクマリン部分と共有結合したトリフェニルホスホニウムカチオンとすることができる。より具体的に、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質複合体は、式ＩＩの化合物であり、

【化5】

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖、好ましくはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、
Ｚは負電荷を持つ薬剤またはハライドであり、
Ｒは水素、一つ以上の置換アルキル、一つ以上の置換アリール、または一つ以上の置換ヘテロ原子である。好ましくは、Ｒは水素である。

【0037】

一つの実施形態において、負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。好ましくは、Ｚは負電荷を持つ治療剤である。

【0038】

一つの実施形態において、Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合または三重結合を含むＣ１～Ｃ３０炭素鎖である。好ましくは、Ｘはオクチレン基である。

【0039】

一部の実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、ミト－エスクレチンである。より具体的に、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質複合体は、式ＩＩＩの化合物であり、

【化6】

Ｚは負電荷を持つ薬剤またはハライドである。

【0040】

米国特許第９５８０４５２号には、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩによる化合物の合成方法、特にミト－エスクレチンの合成方法が記載されている。

【0041】

随意に、複合体は、ＲＮＡ治療剤、例えばｓｉＲＮＡと組み合わせたミト－エスクレチンを含む。

【0042】

驚くべきことに、本発明の複合体は、ナノ粒子または非ウイルスベクターに自己組織化されることができることが見いだされた。これらのナノ粒子は、治療剤または診断剤を患者に送達するのに特に適切であり、特に、負電荷を持つ治療剤を標的細胞の細胞質内に送達するのに適切である。

【0043】

従って、本発明は、上述の複合体に加えて、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質を含むナノ粒子を提供する。

【0044】

ナノ粒子は負電荷を持つ薬剤を含むことが好ましい。負電荷を持つ薬剤は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。しかしながら、必要なのは、薬剤が負の電荷を有し、その結果、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に関連付けられることである。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。一部の実施形態において、治療剤は、標的細胞の細胞質への送達が意図されていて、それによって、標的細胞の細胞質内で、意図された治療効果を発揮する。一部の実施形態において、治療剤は、負電荷を持つ抗がん剤、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の疾患または障害の治療または診断、例えばがん、末梢神経疾患、急性肝性ポルフィリン症などの治療または診断に有効でありうる。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療に使用されることができる。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんである。あるいは、治療剤は、ＲＮＡワクチン、例えばウイルス（例えばコロナウイルス）に対するＲＮＡワクチンとすることができる。一部の実施形態において、薬剤はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の特定の疾患または障害の治療または診断を標的とすることができる。

【0045】

一部の実施形態において、ナノ粒子は１００～２００ｎｍ、例えば１５０～１８０ｎｍ、好ましくは約１６０～１７０ｎｍのサイズを有することができる。

【0046】

一部の実施形態において、ナノ粒子は３０～４０ｍＶの表面電荷を有することができる。

【0047】

一部の実施形態において、ナノ粒子は３０ｍＶ以上の表面電荷を有することができる。

【0048】

本発明は、本発明によるナノ粒子または複合体を含む組成物をさらに提供する。随意に、組成物は水溶液または懸濁液である。

【0049】

一部の実施形態において、本発明による組成物は薬学的に許容可能な形態である。

【0050】

特定の実施形態において、医薬組成物は経口投与用または非経口投与用に製剤化される。一部の実施形態において、医薬組成物は経口剤形として投与される。経口剤形は、錠剤、カプセル、分散錠、小袋、ふりかけ状のもの、液体、溶液、懸濁液、エマルションなどの形態であることが好ましい。経口剤形が錠剤である場合、錠剤は円形、球形、または楕円形などの任意の適切な形状とすることができる。錠剤は一体構造でも多層構造でもよい。一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の従来の薬学的に許容可能な賦形剤を使用する従来のアプローチによって得られることができる。錠剤調製のために適切な薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、希釈剤（例えば、第二リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ラクトース、グルコース、微結晶セルロース、セルロース粉末、ケイ化微結晶セルロース、ケイ酸カルシウム、デンプン、プレゼラチン化デンプン、またはポリオール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、およびスクロースなど））、結合剤（例えば、デンプン、プレゼラチン化デンプン、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムセルロース、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、クロスポビドン，またはそれらの組み合わせ）、崩壊剤（例えば、架橋セルロース、架橋－ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）、デンプングリコール酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン（ポリビドン、ポビドン）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロースナトリウム）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キサンタンガム、アルギン酸、または大豆多糖類）、湿潤剤（例えば、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウム、またはステアリン酸グリセリル）、または潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、水添植物油、またはステアリン酸亜鉛）が挙げられるがこれらに限定されない。そのように調製された錠剤は、コーティングされなくてもよく、または崩壊性およびその後の有効成分の経腸吸収性を変更するために、または安定性および／または外観を改善するために、コーティングされてもよい。いずれの場合でも、当技術分野で周知の従来のコーティング剤およびアプローチを用いることができる。

【0051】

特定の実施形態において、非経口投与は、薬学的に許容可能な非経口投与ビヒクルとともに、溶液、懸濁液、エマルション、粒子、粉末、または凍結乾燥粉末として製剤化されることができる、または別個に提供されることができる。こうしたビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、約１～１０％のヒト血清アルブミンがある。リポソーム、および固定油などの非水性ビヒクルも使用することができる。ビヒクルまたは凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）、および化学的安定性を維持する添加剤（例えば、緩衝剤および保存剤）を含有することができる。製剤は、公知のまたは適切な技法によって滅菌される。一部の実施形態において、非経口製剤は、滅菌水または生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含むが、これらに限定されない、一般的な賦形剤を含んでもよい。注射用の水性または油性の懸濁液は、公知の方法に従って、適切な乳化剤または加湿剤および懸濁剤を使用することによって調製されることができる。非経口投与経路としては、皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、髄腔内経路、または腹腔内が挙げられるが、これらに限定されない。

【0052】

本発明の製剤は、公知またはそうでなければ先行技術に記載のプロセス、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに開示されたプロセスによって調製されることができる。

【0053】

随意に、本発明の複合体またはナノ粒子は、がんの治療または診断に有用である可能性がある。好ましくは、例えば乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療にとって有用である可能性がある。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんにおいてである。

【0054】

本発明は、負電荷を持つ薬剤を送達する方法をさらに提供し、上記薬剤は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に複合体化される。随意に、薬剤と６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質の複合体は、上述の通り、ナノ粒子の形態である。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。好ましくは、本発明は、負電荷を持つ治療剤を送達する方法を提供し、上記薬剤は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に複合体化される。より好ましくは、治療剤と６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質の複合体は、ナノ粒子の形態である。

【0055】

本発明は、負電荷を持つ薬剤の細胞内送達方法をさらに提供し、上記方法は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に複合体化された上記薬剤の有効量を投与することを含む。随意に、薬剤と６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質の複合体は上述の通り、ナノ粒子の形態である。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。好ましくは、本発明は、負電荷を持つ治療剤の細胞内送達方法を提供し、上記方法は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と複合体を形成する上記治療剤の有効量を投与することを含む。複合体はナノ粒子の形態であることがより好ましい。

【0056】

上述の方法において、負電荷を持つ薬剤は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と複合体を形成し、上記複合体は、ナノ粒子または非ウイルスベクターの形態にさらに仕上げられることができる。負電荷を持つ薬剤は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。しかしながら、必要なのは、薬剤が負の電荷を有し、その結果、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に関連付けられることである。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。一部の実施形態において、治療剤は、標的細胞の細胞質への送達が意図されていて、それによって、標的細胞の細胞質内で、意図された治療効果を発揮する。一部の実施形態において、治療剤は、負電荷を持つ抗がん剤、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の疾患または障害の治療または診断、例えばがん、末梢神経疾患、急性肝性ポルフィリン症などの治療または診断に有効でありうる。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療に使用されることができる。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんにおいてである。あるいは、治療剤は、ＲＮＡワクチン、例えばウイルス（例えばコロナウイルス）に対するＲＮＡワクチンとすることができる。一部の実施形態において、薬剤はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の特定の疾患または障害の治療または診断を標的とすることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、がんを標的にして、その特定の細胞の死を引き起こし、および／またはかかる細胞の細胞増殖および分裂を阻止するのに有効である可能性がある。例えば、ｓｉＲＮＡは、乳がん細胞を特異的に標的とすることができる。

【0057】

それ故に、本発明はまた、がんの進行を治療または改善する方法を提供し、上記方法は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ治療剤とのナノ粒子を含む薬学的に許容可能な組成物を患者に投与することを含む。

【0058】

一つの実施形態において、上記６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質はＭｉｔｏ－Ｅｓｃであり、上記治療剤は、がんに対して治療的に有効なｓｉＲＮＡである。

【0059】

さらなる一態様において、本発明は、がんの治療または診断に使用する６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。随意に、がんは乳がんである。

【0060】

がんの治療または診断に使用する６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式Ｉの化合物とすることができ、

【化7】

【0061】

別の実施形態において、がんの治療または診断に使用する６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、６，７－ジヒドロキシクマリン部分と共有結合したトリフェニルホスホニウムカチオンとすることができる。より具体的に、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式ＩＩの化合物であり、

【化8】

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖、好ましくはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、
Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子である。好ましくは、Ｒは水素である。

【0062】

【0063】

一つの実施形態において、負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。随意に、Ｚはブロマイドアニオンである。随意に、Ｚは負電荷を持つ治療剤、例えば治療されるがんを標的とするのに適切なｓｉＲＮＡである。一部の実施形態において、がんは乳がんである。

【0064】

一部の実施形態において、がんの治療に使用する６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式ＩＩＩのＭｉｔｏ－Ｅｓｃであり、

【化9】

Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンである。

【0065】

さらなる一態様において、本発明は、がん、例えば乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんを治療または診断する方法を提供する。より具体的に、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんを治療する方法であり、上記方法は、有効量の式Ｉの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含み、上記化合物は式ＩＩの化合物であり、

【化10】

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖、好ましくはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、
Ｚは、負電荷を持つ治療剤、またはハライド、メシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子である。好ましくは、Ｒは水素である。

【0066】

【0067】

随意に、Ｚはブロマイドアニオンである。随意に、Ｚは負電荷を持つ治療剤、例えば治療されるがんを標的とするのに適切なｓｉＲＮＡである。一部の実施形態において、がんは乳がんである。

【0068】

式Ｉまたは式ＩＩの化合物は、式ＩＩＩのＭｉｔｏ－Ｅｓｃであることが好ましく、

【化11】

式中、Ｚは負電荷を持つ薬剤またはハライドである。

【0069】

一つの態様において、本開示は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体に関する。

【0070】

別の態様において、本開示は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体を含むナノ粒子に関する。

【0071】

本開示の一つの実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式ＩＶの化合物であり、

【化12】

【0072】

代替的な一実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式Ｖの６，７－ジヒドロキシクマリン部分と共有結合したトリフェニルホスホニウムカチオンであり、

【化13】

【0073】

さらに代替的な実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質は、式ＶＩのオクチルタグ付きエスクレチン（ミト－エスクレチン／Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ）である。

【化14】

別の実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体は、式Ｉの化合物で表され、

【化15】

式中、
Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはメシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、置換アルキル、置換アリール、または置換ヘテロ原子であり、
Ｒ_１はアリール、シクロアルキル、またはヘテロアリールであり、
Ｘは非置換の、またはアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル側鎖で置換された、一つ以上の二重結合もしくは三重結合を含むＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖であるか、または、
－（ＣＨ_２）_ｐ－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｎ－、または、
－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_２－Ｒ_２－（ＣＨ_２）_ｍ－であり、
式中、
ｐは２または３であり、ｎは３～６の整数であり、ｍは２～４の整数であり、
Ｒ_２はＯ、ＮＨ、またはＳである。

【0074】

代替的な一実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体は、式ＩＩの化合物によって表され、

【化16】

式中、
ＸはＣ_１～Ｃ_３０炭素鎖、好ましくはＣ_６～Ｃ_１０炭素鎖であり、
Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはメシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンであり、
Ｒは水素、一つ以上の置換アルキル、一つ以上の置換アリール、または一つ以上の置換ヘテロ原子である。好ましくは、Ｒは水素である。

【0075】

さらに代替的な実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体は、式ＩＩＩの化合物で表され、

【化17】

式中、
Ｚは、負電荷を持つ薬剤、またはメシラート、トシラート、シトラート、タルトラート、マラート、アセタート、トリフルオロアセタートから選択される負電荷を持つ対イオンである。

【0076】

好ましい一実施形態において、Ｚは治療剤、診断剤、核酸から選択される、負電荷を持つ薬剤である。

【0077】

さらに別の実施形態において、負電荷を持つ薬剤は、核酸、例えばプラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。しかしながら、必要なのは、薬剤が負の電荷を有し、その結果、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に関連付けられることである。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。一部の実施形態において、治療剤は、標的細胞の細胞質への送達が意図されていて、それによって、標的細胞の細胞質内で、意図された治療効果を発揮する。一部の実施形態において、治療剤は、負電荷を持つ抗がん剤、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の疾患または障害の治療または診断、例えばがん、末梢神経疾患、急性肝性ポルフィリン症などの治療または診断に有効でありうる。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療に使用されることができる。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんである。

【0078】

あるいは、治療剤は、ＲＮＡワクチン、例えばウイルス（例えばコロナウイルス）に対するＲＮＡワクチンとすることができる。一部の実施形態において、薬剤はｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、任意の特定の疾患または障害の治療または診断を標的とすることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、がんを標的にして、その特定の細胞の死を引き起こし、および／またはかかる細胞の細胞増殖および分裂を阻止するのに有効である可能性がある。例えば、ｓｉＲＮＡは、乳がん細胞を特異的に標的とすることができる。

【0079】

好ましい一実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体は、Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体であり、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、式ＶＩの化合物によって表される。

【化18】

別の好ましい実施形態において、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ薬剤との複合体を含むナノ粒子は、Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびｓｉＲＮＡの複合体を含むナノ粒子であり、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、式ＶＩの化合物によって表される。

【化19】

随意に、本開示の複合体またはナノ粒子は、がんの治療または診断に有用である。好ましくは、例えば乳がん、子宮頸がん、肺がん、肝臓がんの治療にとって有用である可能性がある。より具体的には、トリプルネガティブ乳がん、ＥＲ陽性乳がんなどの乳がんにおいてである。

【0080】

本開示は、本開示の態様によるナノ粒子または複合体を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0081】

本開示はまた、がんの進行を治療または改善する方法を提供し、上記方法は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質と、負電荷を持つ治療剤とのナノ粒子または複合体を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。

【0082】

【0083】

【0084】

【0085】

本発明は、負電荷を持つ薬剤を送達する方法をさらに提供し、上記薬剤は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に複合体化される。随意に、薬剤と６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質の複合体は上述の通り、ナノ粒子の形態である。負電荷を持つ薬剤は、治療剤または診断剤であってもよい。好ましくは、本発明は、負電荷を持つ治療剤を送達する方法を提供し、上記薬剤は、６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質に複合体化される。より好ましくは、治療剤と６，７－ジヒドロキシクマリンホスホニウム両親媒性物質の複合体は、ナノ粒子の形態である。

【0086】

【0087】

本発明を、以下の実施例を参照することによって、以下に例示する。しかしながら、当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これらの実施形態および原理の無数の変形、修正、適用、拡張がなされることが可能であり、論じられた特定の方法および結果は単に本発明の例示であることを理解するであろう。

【実施例】

【0088】

【実施例1】

【0089】

化合物の合成
ミト－エスクレチンおよび対照ＴＰＰ分子の合成を、以下の合成プロトコルに従って行った。

【化20】

【化21】

１－（６－ヒドロキシベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－イル）エタン－１－オン（２）の合成手順：
セサモール（５．６ｇ、４０ｍｍｏｌ）の無水酢酸（２０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。溶液に三フッ化ホウ素／ジエチルエーテル錯体（１０ｍＬ）を緩徐に加え、次いで混合物を９０℃で３時間撹拌した。得られた混合物を飽和酢酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）に加え、室温で撹拌した。形成された固体を濾過によって除去し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留固体をメタノール中に懸濁させ、それによって洗浄し、次いで濾過によって収集し、乾燥させて、２（５．８５０ｇ、８０％）を得た。

【0090】

８－ヒドロキシ－６Ｈ［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］クロメン－６－オン（３）の合成手順：
窒素雰囲気下、２（５ｇ、１当量）の炭酸ジエチル（８０ｍＬ）溶液に、水素化ナトリウム（２．６６ｇ、４当量）を加え、混合物を０℃で３０分間攪拌した。得られた溶液を１００℃で３時間加熱し、次いで０℃に冷却し、５０％ＭｅＯＨ水溶液（１０ｍＬ）を慎重に加えた。エーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した後、反応混合物を２Ｎ塩酸でｐＨ２に酸性化し、沈殿した固体を濾過し、真空下で乾燥させて、３（４．９ｇ、８５％）を得た。

【0091】

６－オキソ－６Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］クロメン－８－イルトリフルオロメタンスルホネート（４）の合成手順：
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（４．３ｍＬ、１．３当量）を、乾燥ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の３（４ｇ、１当量）およびトリエチルアミン（３．５ｍＬ、１．３当量）の混合物に０℃で１０分間かけて滴下した。次いで、混合物を室温で１２時間撹拌した。その後、混合物を５０％エーテル：ヘキサンで希釈し、短いシリカのパッドを通して濾過し、濾液を濃縮して残渣を得て、これをフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、対応する生成物４（４．６ｇ、７０％）を得た。

【0092】

８－（８－ブロモオクト－１－イン－１－イル）－６Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］クロメン－６－オン（５）の合成手順：
丸底フラスコを高真空下で火炎乾燥させた。冷却時に、クマリン４（１．０ｇ、１当量）、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２（２０７ｍｇ、０．１当量）、ＣｕＩ（５６ｍｇ、０．１当量）、アセトニトリル（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（０．６１ｍＬ、１．５当量）、および８－ブロモオクチン（０．８３８ｇ、１．５当量）を加えた。反応混合物を６０℃で一晩撹拌した。反応（ＴＬＣでモニターした）の完了後、反応混合物を冷却し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、短いシリカゲル床を通して濾過した。濾液を濃縮して残渣を得て、これをフラッシュクロマトグラフィーで精製して、対応する生成物５（０．７９０ｇ、７０％）を得た。

【0093】

８－（８－ブロモオクチル）－６Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］クロメン－６－オン（６）の合成手順：
メタノール中のクマリン５（０．７ｇ）の混合物を十分に撹拌し、１ｍＬ／分、４０℃、４０ｂａｒの圧力で、１０％Ｐｄ／Ｃを充填したＨ－Ｃｕｂｅ反応器を通過させた。反応の完了後、溶媒を減圧下で蒸発させて、対応する生成物６（０．６４１ｇ、９０％）を得た。

【0094】

４－（８－ブロモオクチル）－６，７－ジヒドロキシ－２Ｈ－クロメン－２－オン（７）の合成手順：
８－（８－ブロモオクチル）－６Ｈ－［１，３］ジオキソロ［４，５－ｇ］クロメン－６－オン６（０．６ｇ、１．０当量）を、５０ｍＬの丸底フラスコ中で乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中に溶解させ、混合物を?７８℃に冷却した。ＢＢｒ３（ＤＣＭ中１．０Ｍ、４当量）を緩徐に滴下して加えた。反応物を室温まで上昇させ、１２時間撹拌した。ＭｅＯＨ（２ｍＬ）を加え、その後、さらに１５分間撹拌し、溶媒を真空下で除去した。粗生成物を、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製して、７（０．４２５ｇ、７３％）を黄色固体として得た。

【0095】

（８－（６，７－ジヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）オクチル）トリフェニルホスホニウム（８）の合成手順：
乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）中の化合物７（０．２ｇ、１当量）の撹拌溶液に、トリフェニルホスフィン（０．１５６ｇ、１．１当量）を加え、得られた混合物を窒素雰囲気下で１２０℃に１２時間加熱した。反応の完了後、ＤＭＦを減圧下で完全に留去して、粗生成物を得た。粗生成物をヘキサンおよびジエチルエーテルで数回洗浄して、８（０．２４０ｇ、８０％）を黄色固体として得た。

【0096】

４－（８－ブロモオクチル）－６，７－ジメトキシ－２Ｈ－クロメン－２－オン（９）の合成手順：
１０ｍｌの乾燥アセトン中の化合物７（０．２ｇ、１当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（０．３０２ｇ、４当量）およびＭｅＩ（０．３０８ｇ、４当量）を加えた。上記の混合物を、室温で６時間攪拌した。ＴＬＣで示された通りの反応の完了後、反応混合物を濾過し、溶媒を真空での蒸発によって除去して粗生成物を得て、続いてクロマトグラフィーによって、９（０．１６５ｇ、７６％）を黄色固体として得た。

【0097】

（８－（６，７－ジメトキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）オクチル）トリフェニルホスホニウム（１０）の合成手順：
乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）中の化合物９（０．１２０ｇ、１当量）の溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０８７ｇ、１．１当量）を加え、得られた混合物を窒素雰囲気下で１２０℃に１２時間加熱した。反応の完了後、ＤＭＦを減圧下で完全に留去して、粗生成物を得た。粗生成物をヘキサンおよびジエチルエーテルで数回洗浄して、１０（０．１２７ｇ、７２％）を黄色固体として得た。

【0098】

オクチルトリフェニルホスホニウム（１２）の合成手順：
乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）中の化合物１１（０．２ｇ、１当量）の溶液に、トリフェニルホスフィン（０．２９８ｇ、１．１当量）を加え、得られた混合物を窒素雰囲気下で１２０℃に１２時間加熱した。反応の完了後、ＤＭＦを減圧下で完全に留去して、粗生成物を得た。粗生成物を酢酸エチルおよびジエチルエーテルで数回洗浄して、１２（０．２７７ｇ、７１％）を無色の液体として得た。

【0099】

すべての化合物を、^１ＨＮＭＲ分光法によって確認した。

【0100】

実施例２～４の材料および方法
細胞培養：
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（トリプルネガティブ乳がん細胞株、ＡＴＣＣ）細胞、およびＭＣＦ－１０Ａ細胞（正常な乳腺上皮細胞、ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、重炭酸ナトリウム（２６ｍＭ）、Ｌ－グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ_２および９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃のインキュベーター内で維持した。

【0101】

透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）：
透過電子顕微鏡法による研究を、ＴｅｃｎａｉＴ１２顕微鏡（ＦＥＩ）を用いて１２０ｋＶで実施し、画像はＳＩＳＣＣＤカメラを使用して撮影した。試料を２００または４００メッシュ炭素被覆銅グリッド（ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）上でモリブデン酸アンモニウムでネガティブ染色した。顕微鏡写真を記録する前に、グリッドを空気乾燥させた。

【0102】

走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）：
Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子の電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）分析を、ＣａｒｌＺｅｉｓｓＳＩＧＭＡＨＤ電界放出形走査電子顕微鏡で行った。

【0103】

Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子のサイズおよび表面電荷の測定：
光子相関分光法およびＺｅｔａｓｉｚｅｒ３０００ＨＳＡ（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）の電気泳動移動度によって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子のサイズ（流体力学的直径）および表面電荷（ゼータ電位）を測定した。サンプル屈折率１．３３、粘度０．８８ｃＰ、温度２５℃の脱イオン水中で、サイズを測定した。サイズは３回測定された。粘度０．８８ｃＰ、誘電率７８．５、温度２５℃というパラメータを使用して、ゼータ電位を測定した。

【0104】

アガロースゲル電気泳動遅延アッセイ：
ゲル電気泳動を、トリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液（４０ｍＭ）中のアガロースゲル（１．５％ｗ／ｖ）を用いて、臭化エチジウムを１滴加えて（ＥｔＢｒストック溶液の濃度：Ｈ_２Ｏ中０．６２５ｍｇ／ｍｌ）、１００Ｖで３０分間行った。記載されたＰ^＋／Ｐ^－比で、ｓｉＲＮＡをＭｉｔｏ－Ｅｓｃ、ミト－イソスコポレチン、オクチルＴＰＰカチオンと複合体化することによって、ｓｉＲＮＡリポプレックスを調製した。試料を室温で３０分間インキュベートした後、ウェルに添加した。ｓｉＲＮＡバンドを３６５ｎｍの紫外線照射下で可視化した。

【0105】

Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびＭｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＲＮＡ複合体の細胞傷害性：
ｓｉＭｎＳＯＤを用いたＭｉｔｏ－ＥｓｃまたはＭｉｔｏ－Ｅｓｃリポプレックスの細胞傷害性を評価するために、トリパンブルー色素排除アッセイを用いた。簡潔に述べると、細胞を１ウェル当たり３×１０^４細胞の密度で１２ウェルプレートに播種し、トランスフェクション前に一晩培養した。培地を０．５ｍＬの新鮮な無血清ＤＭＥＭで置き換えた。ｓｉＭｎＳＯＤ（４０ｎＭ）を、対照用のリポフェクトアミン－２０００または２．５μＭのＭｉｔｏ－Ｅｓｃのいずれかと、無血清ＤＭＥＭ培地中で３０分間複合体化させてから、プレートに添加した。細胞を４８時間インキュベートし、実験終了時に細胞をトリプシン処理し、８００ｇで２分間回転させ、１ｍＬの新鮮な培地に再懸濁した。細胞懸濁液（１０μｌ）を同量のトリパンブルーと混合し、自動セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して計数した。

【0106】

ウェスタンブロット法：
処理終了時、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル－２、３を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で細胞ペレットを溶解させた。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロース膜上にブロットし、５％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、洗浄し、一次抗体（１：１０００）とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜を洗浄し、抗ウサギ／マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ連結二次抗体（１：５０００）で１時間インキュベートした。ＥＣＬ試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＧＥ）を膜上に塗布し、その後、化学発光システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて現像した。

【0107】

ＭｎＳＯＤｓｉＲＮＡトランスフェクション：
細胞を、１ウェル当たり３×１０^４細胞の密度で１２ウェルプレート中で培養した（使用前日にガラスカバーリップを包含している）。簡潔に述べると、蛍光ｓｉＲＮＡまたはｓｉＭｎＳＯＤ（４０ｎＭ）を、陽性対照用のリポフェクトアミン－２０００、またはＭｉｔｏ－Ｅｓｃ（２．５μＭ）のいずれかと、無血清ＤＭＥＭ培地中で３０分間複合体化させてから、プレートに添加した。細胞をｓｉＲＮＡ複合体で６時間インキュベートした後、培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地１ｍＬで置き換え、細胞を２４時間さらにインキュベートした。

【0108】

共焦点顕微鏡撮像：
簡潔に述べると、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１ｍＬの完全ＤＭＥＭ中、１ウェル当たり３×１０^４細胞の密度で、１２ウェルプレートのカバーリップ上に播種し、１２時間培養した。蛍光（Ｃｙ－５）ｓｉＲＮＡを、リポフェクトアミン－２０００（陽性対照）、またはＭｉｔｏ－Ｅｓｃ（２．５μＭ）、または親エスクレチン（２．５μＭ）、または種々のカチオン性脂質のいずれかと、無血清ＤＭＥＭ培地中で３０分間複合体化させてから、プレートに添加した。これらのリポプレックスを細胞に加え、６時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。最後に、スライドを据え付け、共焦点顕微鏡を使用して細胞を撮像した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃリポプレックスを有する蛍光標識ｓｉＲＮＡを上述の通りに調製し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で２４時間インキュベートした。細胞をＤＡＰＩによって染色して、核を染色した。細胞を据え付け、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本、東京）で観察した。

【実施例2】

【0109】

乳がん細胞生存度に対するＭｉｔｏ－Ｅｓｃの効果
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞およびＭＣＦ－１０Ａ（正常な乳腺上皮細胞）を、Ｍｉｔｏ－ＥｓｃおよびＥｓｃで処理した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、１．５～７．５μＭでＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の用量依存的な細胞死を有意に引き起こした一方で、親エスクレチン（Ｅｓｃ）は、５０μＭから細胞傷害性を誘導した（図１Ａおよび図１Ｂ）。

【0110】

興味深いことに、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、ＭＣＦ－１０Ａ細胞のような正常な乳腺上皮細胞において、示された濃度（５～５０μＭ）のいずれでも顕著な毒性を示さなかった（図１Ｃ）。これによって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが、がん細胞において優先的に抗増殖効果を誘導することが示されている。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、ＭＣＦ－１０Ａ細胞と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞のミトコンドリア画分に有意に多く蓄積することが見いだされた。乳がん細胞におけるＭｉｔｏ－Ｅｓｃの蓄積の増加は、ミトコンドリアスーパーオキシド産生の増強を誘発し、その結果、乳がん細胞死につながるミトコンドリア膜電位の脱分極を起こした。

【0111】

乳がん細胞を含むがん細胞におけるＭｉｔｏ－Ｅｓｃの取り込みが増強されるのは、正常細胞と比較して、がん細胞が有するより大きい過分極膜電位（ΨＩＭ）に起因すると恐らく考えられる。非局在化カチオン（ＤＬＣ）は、がん細胞の細胞内区画に容易に侵入する。さらに、正常細胞（約－１４０ｍＶ）と比較して、がん細胞のミトコンドリア膜電位（約－２２０ｍＶ）が過分極していることは、ミトコンドリア画分にＤＬＣがより多く蓄積することにつながる。この現象は、抗がん関連ｓｉＲＮＡと組み合わせて抗増殖効果を最大化して、がん細胞に細胞傷害性を優先的に誘導するために、ｓｉＲＮＡ治療薬において非常に重要である可能性がある。

【0112】

それ故に、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、正常細胞と比較してがん細胞においてより多く蓄積し、それ故に、有意に低い濃度でがん細胞死を優先的に引き起こす。

【実施例3】

【0113】

異なるがん細胞株における生存度に対するＭｉｔｏ－Ｅｓｃの効果：
異なるがん細胞株ＨｅＬａ（子宮頸部）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＭＣＦ－７（ＥＲ陽性乳房）、Ａ５４９（肺）、ＤＵ－１４５（前立腺）がん細胞、ＭＣＦ－１０Ａ（正常な乳腺上皮細胞）に対するＭｉｔｏ－Ｅｓｃの細胞傷害性を、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ（０．５～１００μＭ）で２４時間処理することによって決定し、細胞生存度をスルホローダミンＢアッセイによって測定した。

【0114】

表１に示す通り、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、ＨｅＬａ（子宮頸部）、ＨｅｐＧ２（肝臓）、ＭＣＦ－７（ＥＲ陽性乳房）、Ａ５４９（肺）細胞の用量依存的な細胞死を有意に引き起こした一方で、ＭＣＦ－１０Ａ細胞などの正常な乳腺上皮細胞において顕著な毒性を示さなかった。これによって、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが、がん細胞において優先的に抗増殖効果を誘導することが示されている。

【表1】

【実施例4】

【0115】

ナノ粒子へのＭｉｔｏ－Ｅｓｃの自己組織化：
Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃの自己組織化特性を探索した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃの水溶液（１％ＥｔＯＨ）の粒子サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して測定した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、サイズが１６６±３０ｎｍ、表面電荷が３３±０．４ｍＶのナノサイズの粒子を形成した（図２Ａ）。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃの自己組織化ナノ粒子のサイズおよび形態を、それぞれ走査電子顕微鏡法および透過電子顕微鏡法によって調査した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、２００ｎｍ未満の球形ナノ粒子を形成した（図２Ｂおよび２Ｃ）。この知見は、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが水溶液中で自己組織化構造を達成できることを示す。

【実施例5】

【0116】

インビボ同所性腫瘍モデル：
ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体の中へのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の接種：実験には６週齢のメスＳＣＩＤマウスを使用した。最初に、１０ｎＭのＱｔｒａｃｋｅｒ標識溶液（ＱｔｒａｃｋｅｒＣｅｌｌＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＱ２５０７１ＭＰ）を、１．５ｍＬの微量遠心管中で構成要素Ａおよび構成要素Ｂをそれぞれ１０μＬ予め混合することによって調製し、室温で５分間インキュベートした。この混合物を０．２ｍＬの新鮮な完全増殖培地に加え、３０秒間ボルテックスし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を含有する７５ｃｍ２組織培養フラスコに加え、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベートした。サブコンフルエントな標識細胞を採取し、計数した。

【0117】

細胞（１×１０^６）を０．１ｍｌの無血清培地中に懸濁した。これに０．１ｍｌのマトリゲルを加え、穏やかに混合して、均一な細胞懸濁液を得た。ＳＣＩＤマウスをケタミン／キシラジンカクテル（５０μＬ／２０ｇマウス）で麻酔し、各マウスに、上述の１×１０^６個のＱ－Ｔｒａｃｋｅｒ標識ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、第４対の乳腺脂肪体に同所性移植し、細胞の接種後に脂肪体を縫合した。切開が治癒するまで毎日、感染を防止するために切開部位をポビドン－ヨウ素で手当てした。マウスをチェックして腫瘍の発生を確認し、腫瘍が３００ｍｍ^３以上の体積に達した時点で治療を開始した。マウスを秤量し、４群（１群当たりｎ＝４）に分け、エスクレチン（６ｍｇ／ｋｇ、ｂｄ．ｗｔ）またはミト－エスクレチン（３および６ｍｇ／ｋｇ．ｂｄ．ｗｔ）のいずれかを２週間、腹腔内（ｉ．ｐ）投与した。屠殺の日に、ノギスを使用して腫瘍体積を測定した。マウスを麻酔し、頸椎脱臼を使用して屠殺した。腫瘍を慎重に切除し、秤量し、さらなる病理組織学的分析のために液体窒素中に保存した。

【実施例6】

【0118】

効果的なｓｉＲＮＡ送達ベクターとしてのＭｉｔｏ－Ｅｓｃ：
アガロースゲル電気泳動遅延アッセイのためのＭｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＲＮＡ複合体化：
Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃナノ粒子溶液を、所望の最終Ｐ＋：Ｐ－電荷比に応じて様々な濃度で調製した。Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＲＮＡ複合体の２０μＬ溶液を調製して、各溶液中のｓｉＲＮＡの一定量を維持し（１０μＬ中１μｇ）、Ｐ＋：Ｐ－電荷比に応じてＭｉｔｏ－Ｅｓｃの量を変化させた。調製した混合物を５分間穏やかにボルテックスし、室温で３０分間インキュベートして複合体を形成した。１μｇのｓｉＲＮＡを２、４、６、８、１０、１２、１４μｇのＭｉｔｏ－Ｅｓｃと複合体化することによって、それぞれ１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１のＰ＋：Ｐ－電荷比を得た。

【0119】

Ｍｉｔｏ－ＥｓｃのｓｉＲＮＡ結合効率：
Ｍｉｔｏ－ＥｓｃがｓｉＲＮＡを結合する効率を、アガロースゲル電気泳動によって確認した。また、安定なｓｉＲＮＡ複合体の形成における水素結合の重要性を評価するために、ジヒドロキシ基をメチル基で保護することによってミト－イソスコポレチンを合成した。陰性対照としてオクチルＴＰＰカチオンを使用した。

【化22】

以前の知見において、Ｍｉｔｏ－ＥｓｃのみがｓｉＲＮＡを４：１～７：１のＰ＋／Ｐ電荷比で結合することができ、その結果ｓｉＲＮＡの移動を遅らせることが見いだされた（図２Ｄ）。対照的に、ミト－イソスコポレチンおよびオクチルＴＰＰは、７：１のＰ＋／Ｐ－電荷比であってもｓｉＲＮＡの移動を遅らせることができないことから明らかである通り、ｓｉＲＮＡを結合しなかった。これらの結果は、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃにおけるジヒドロキシ置換の存在が、ｓｉＲＮＡとの安定した複合体を形成するだけでなく、自己組織化ナノ粒子の形成を促進することを示した。

【0120】

しかしながら、さらなる実験で、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃとミト－イソスコポレチンの両方が、それぞれ４：１～７：１および６：１～７：１のＰ＋／Ｐ電荷比でｓｉＲＮＡを結合し、その結果ｓｉＲＮＡの移動を遅らせることを見いだした（図２Ｅ）。対照的に、オクチルＴＰＰはやはり、７：１のＰ＋／Ｐ－電荷比であってもｓｉＲＮＡの移動を遅らせることができないことから明らかである通り、ｓｉＲＮＡを結合しなかった。これらの結果は、水素結合が安定なｓｉＲＮＡ複合体の形成に関与していないことを示す。

【0121】

ｓｉＲＮＡ送達ベクターとしてのＭｉｔｏ－Ｅｓｃの効率を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞で試験した。リポプレックスは、カスタムＭｎＳＯＤｓｉＲＮＡ配列で形成された。乳がん細胞におけるＭｎＳＯＤレベルの枯渇は抗増殖効果を引き起こすことに留意されたい。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、低減された血清（約２％）を含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地中で６時間、リポプレックスで処理し、その後、培地を血清含有培地（１０％血清）で置き換えてさらに４８時間処理し、トリパンブルー色素排除法によって細胞生存度を測定した。並行して、ｓｉＭｎＳＯＤもリポフェクトアミン－２０００（陽性対照）と複合体化させた。ｓｉＭｎＳＯＤと複合体化されたＭｉｔｏ－Ｅｓｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において９４％の細胞死を誘導し、その一方でリポフェクトアミン－２０００とｓｉＭｎＳＯＤとの複合体は６６％の細胞死を誘導したことが見いだされた（図３Ａ）。

【0122】

さらに、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃ／ｓｉＭｎＳＯＤ複合体およびリポフェクトアミン－２０００／ｓｉＭｎＳＯＤ複合体の遺伝子サイレンシング効率は、免疫ブロット法による場合と同程度に、ＭｎＳＯＤタンパク質レベルを有意に減少させた。対照的に、親エスクレチン複合体もオクチルＴＰＰカチオン複合体も、ＭｎＳＯＤ発現を減少させることができなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが乳がん細胞死を優先的に誘導するだけでなく、ｓｉＲＮＡとの安定した複合体を形成するためのすべての構造的要件も有していることを示唆する。それ故に、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃは、治療用ｓｉＲＮＡを首尾よく送達し、乳がん細胞における細胞傷害能を最大化し、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが効果的なｓｉＲＮＡ送達ベクターとして働くことを証明する。

【0123】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＭＣＦ－１０Ａ細胞におけるＭｉｔｏ－Ｅｓｃ凝集体を用いたｓｉＲＮＡの細胞内送達を、蛍光標識したＣｙ－５ｓｉＲＮＡを使用する共焦点イメージング技法によってさらに検証した。図３に示す結果と一致して、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃはリポフェクトアミン－２０００と同様に、Ｃｙ－５ｓｉＲＮＡの細胞内送達を有意に引き起こした（図４、青色蛍光）。特に、非がん性乳腺上皮細胞株ＭＣＦ－１０Ａにおいて、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃを介したｓｉＲＮＡ送達の効率は、リポフェクトアミン－２０００よりも低く、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃによるがん細胞選択的なｓｉＲＮＡ送達の可能性を示した（図５）。対照的に、親エスクレチン、ミト－イソスコポレチン、オクチルＴＰＰは、Ｃｙ－５ｓｉＲＮＡを細胞内に送達することができなかったが、これはそれらがｓｉＲＮＡとの安定した複合体を形成することができないことに恐らく起因する。これらの結果は、Ｍｉｔｏ－Ｅｓｃが効果的なｓｉＲＮＡ送達ベクターとして働くことを立証する。

【図1】