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特表2024-521287ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法、シークエンシング方法及びキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法、シークエンシング方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240524BHJP
C40B 40/08 20060101ALI20240524BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240524BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240524BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C40B40/08 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023564239
(86)(22)【出願日】2021-04-22
(85)【翻訳文提出日】2023-10-19
(86)【国際出願番号】 CN2021088984
(87)【国際公開番号】W WO2022222101
(87)【国際公開日】2022-10-27
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521151692
【氏名又は名称】深▲せん▼華大生命科学研究院
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ ▲竜▼奇
(72)【発明者】
【氏名】林 秀妹
(72)【発明者】
【氏名】石 泉
(72)【発明者】
【氏名】史 旭洋
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ ▲伝▼宇
(72)【発明者】
【氏名】黄 ▲亜▼▲靈▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ ▲亜▼
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR14
4B063QR20
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS12
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
本発明は、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法、シークエンシング方法及びキットを提供する。ここで、構築方法は、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、一本鎖ｃＤＮＡを環化して一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組合せを利用して一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅し、増幅断片を得るステップであって、ｃＤＮＡタグプライマーはｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行ってＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法であって、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、前記一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、
前記一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、
ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組合せを利用して前記一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅し、増幅断片を得るステップであって、前記ｃＤＮＡタグプライマーは前記ｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、
前記増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む、ことを特徴とするＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法。
【請求項2】
ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、前記一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップは、前記ｍＲＮＡを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを得るステップと、
前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、前記第１鎖ｃＤＮＡと相補的な第２鎖ｃＤＮＡの３’端に前記ｃＤＮＡタグ配列を含み、前記ｃＤＮＡタグ配列がｐｏｌｙ（Ａ）を含むステップと、
前記二本鎖ｃＤＮＡを融解し、前記一本鎖ｃＤＮＡを得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項3】
前記ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及び前記ｐｏｌｙ（Ａ）を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項4】
前記ｍＲＮＡは単一細胞サンプル由来であり、前記ｍＲＮＡは単一細胞ｍＲＮＡである、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項5】
前記単一細胞ｍＲＮＡが固相支持体に接続するように、液滴法を採用して前記単一細胞ｍＲＮＡを調製し、好ましくは前記固相支持体はマイクロビーズである、ことを特徴とする請求項４に記載の構築方法。
【請求項6】
前記単一細胞ｍＲＮＡが前記マイクロビーズに接続するように、液滴法を採用して前記単一細胞ｍＲＮＡを調製するステップは、それぞれ単一細胞懸濁液及び前記マイクロビーズを提供するステップであって、前記マイクロビーズにマイクロビーズタグ配列を付け、前記マイクロビーズタグ配列の末端にｐｏｌｙ（ｄＴ）を含むステップと、
前記単一細胞懸濁液及び前記マイクロビーズを液滴に包み込み、各液滴に１つの単一細胞及び１つの前記マイクロビーズを含み、前記マイクロビーズがｐｏｌｙ（ｄＴ）を介して前記単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）と結合することにより、前記単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡを前記マイクロビーズに接続し、前記単一細胞ｍＲＮＡを得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の構築方法。
【請求項7】
前記マイクロビーズタグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子タグ及び前記ｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、前記ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、前記第２ＰＣＲリンカーは前記第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、前記第２細胞タグは前記第１細胞タグと相補的であり、前記第２唯一分子標識は前記第１唯一分子標識と相補的である、ことを特徴とする請求項６に記載の構築方法。
【請求項8】
前記一本鎖ｃＤＮＡの５’端にＴＳＯプライマーの配列を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項9】
逆転写酵素及びＴＳＯリンカーを採用して前記ｍＲＮＡを逆転写することにより、前記第１鎖ｃＤＮＡを獲得し、ここで、前記逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有し、前記第１鎖ｃＤＮＡの３’端に前記ＴＳＯリンカーの相補配列を含み、前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記第２鎖ｃＤＮＡを獲得し、前記第２鎖ｃＤＮＡの５’端に前記ＴＳＯプライマーの配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の構築方法。
【請求項10】
前記ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である、ことを特徴とする請求項９に記載の構築方法。
【請求項11】
前記逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(登録商標)ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる、ことを特徴とする請求項９に記載の構築方法。
【請求項12】
前記第１鎖ｃＤＮＡに対してランダム増幅及び／又は完全長増幅を行い、前記二本鎖ｃＤＮＡを得る、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項13】
リンカー増幅プライマー及びＴＳＯプライマーを採用して前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記二本鎖ｃＤＮＡを得るか、又はリンカー増幅プライマー、ＴＳＯ－ランダムプライマー及び前記ＴＳＯプライマーを採用して前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記二本鎖ｃＤＮＡを得る、ことを特徴とする請求項１２に記載の構築方法。
【請求項14】
前記リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、前記ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３であり、前記ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である、ことを特徴とする請求項１３に記載の構築方法。
【請求項15】
前記一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップは、環化補助配列及びリガーゼの作用下で前記一本鎖ｃＤＮＡをループにさせるように接続し、接続産物を得るステップと、
前記接続産物を酵素切断してループにさせるように接続していない一本鎖ｃＤＮＡを消化し、前記一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、を含み、
ここで、前記環化補助配列は前記一本鎖ｃＤＮＡの両端の配列と相補的である、ことを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の構築方法。
【請求項16】
前記環化補助配列は配列番号５から選ばれる、ことを特徴とする請求項１５に記載の構築方法。
【請求項17】
前記遺伝子特異的プライマーはＴＣＲ遺伝子増幅に対するＴＣＲプライマー及び／又はＢＣＲ遺伝子増幅に対するＢＣＲプライマーである、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項18】
前記ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーであり、好ましくは配列番号６である、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項19】
前記増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップは、前記増幅断片にライブラリーリンカーを付加し、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項20】
前記増幅断片に対して酵素切断断片化を行い、酵素切断断片を獲得し、前記酵素切断断片に対して順次末端修復、Ａ付加及びライブラリーリンカー接続を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得る、ことを特徴とする請求項１９に記載の構築方法。
【請求項21】
前記ライブラリーリンカーの接続を行った後、さらに、前記ライブラリーリンカーの接続産物に対してＰＣＲ増幅を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることを含む、ことを特徴とする請求項１９又は２０に記載の構築方法。
【請求項22】
前記ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである、ことを特徴とする請求項１９に記載の構築方法。
【請求項23】
環化補助配列と、ＤＮＡリガーゼと、ｃＤＮＡタグプライマーと、及び（ａ）ランダムプライマー、（ｂ）ＴＣＲプライマー、（ｃ）ＢＣＲプライマーのうちの少なくとも１つとを含む、ことを特徴とするＲＮＡライブラリー構築キット。
【請求項24】
前記キットはＲＮＡ逆転写試薬をさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項25】
前記ＲＮＡ逆転写試薬はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素である逆転写酵素を含む、ことを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
前記逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる、ことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項27】
前記ＲＮＡ逆転写試薬はＴＳＯリンカーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項28】
前記ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である、ことを特徴とする請求項２７に記載のキット。
【請求項29】
前記キットはＴＳＯプライマー及びリンカー増幅プライマーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項30】
前記リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、前記ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３である、ことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
前記キットはＴＳＯ－ランダムプライマーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項32】
前記ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である、ことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
前記環化補助配列は配列番号５である、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項34】
前記ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーである、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項35】
前記ｃＤＮＡタグプライマーの配列は配列番号６である、ことを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
前記キットはエキソヌクレアーゼ及びライブラリーリンカーのうちの少なくとも１つをさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項37】
前記エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩから選ばれる、ことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
前記ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである、ことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項39】
前記ＭＧＩシークエンシングプラットフォームはバブルリンカーから選ばれ、前記ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーはＰ５及びＰ７リンカーから選ばれる、ことを特徴とする請求項３８に記載のキット。
【請求項40】
前記ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼから選ばれる、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項41】
前記キットは固相支持体をさらに含み、前記固相支持体に支持体タグ配列が設置され、但し、前記ｃＤＮＡタグプライマーは前記支持体タグ配列の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは、前記固相支持体はマイクロビーズであり、前記支持体タグ配列はマイクロビーズタグ配列である、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項42】
前記支持体タグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子タグ及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含む、ことを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項43】
請求項１から２２のいずれか一項に記載のＲＮＡシークエンシングライブラリー構築方法を採用してＲＮＡシークエンシングライブラリーを構築し、及び前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーをシークエンシングするステップを含む、ことを特徴とするＲＮＡライブラリーのシークエンシング方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シークエンシング分野に関し、具体的には、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法、シークエンシング方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
単細胞技術の急速な発展に伴い、すぐに単細胞シークエンシングの時代を迎えた。単細胞技術も絶えず更新して世代交替し、単管増幅から現在液滴のハイスループットに基づくものまで、人的、時間、コスト、細胞捕獲量に極めて大きな変化があった。しかし、シークエンシングの読み取り長の制限により、完全長ｃＤＮＡはシークエンシングのために断裁してライブラリーを構築する必要がある場合が多い。Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２技術は、単管増幅の戦略を採用し、フローサイトメトリー及び顕微鏡切断などの技術を用いて単一細胞を対応する単孔に分け、溶解、転写及び増幅、断裁、ライブラリー構築を行う。単管ライブラリー構築には細胞由来を区別する特定のｂａｒｃｏｄｅがないため、ライブラリーを構築する際に１つの細胞の全ての配列をタグ付けし、最後に異なる細胞由来のライブラリーを合わせてシークエンシングすることしかできない。このようなシークエンシング戦略は全長を獲得するが、細胞の流量は限られており、同時にシークエンシングのコストも大きく上昇する。
【0003】
現在液滴のハイスループットシークエンシングに基づく戦略では、特定の分子標識を有する配列の１つの断片をマイクロビーズ上で合成することにより、ｃＤＮＡの両末端の配列を特異的に捕捉する。しかし、シークエンシングの読み取り長の制限のため、タグ付きの完全長ｃＤＮＡに対して直接シークエンシングを行うことができず、やはりさらに断裁する必要がある。断裁後のｃＤＮＡ配列の途中にある配列は、タグ付けなしでスクリーニングされるため、完全長を得ることができず、選択的スプライシングなどの重要な情報の多くが失われる。液滴のハイスループットシークエンシングに基づく戦略の具体的なステップは以下のとおりである。
【0004】
液滴マイクロ流体工学技術に基づいて油中水の液滴を採用して細胞及びマイクロビーズを包むことにより、１つの細胞及び１つの磁気ビーズを同時に含む液滴を獲得し、液滴内の他の成分はまた溶解液を含み、ここでマイクロビーズには特定の分子標識付きのＤＮＡ配列（ｂａｒｃｏｄｅ）及びＴＳＯ配列を大量含む。液滴が絶えず生成される過程で、液滴内の細胞が溶解液によって裂け、大量のｍＲＮＡが放出される。同時に、ｍＲＮＡは遊離のｐｏｌｙ（ｄＴ）に捕捉され、液滴内でＲＴ反応を完了し、同時にｍＲＮＡ末端にはＴＳＯ配列が付加され、第１鎖ｃＤＮＡ延長末端のＴＳＯの相補配列がマイクロビーズ上のＴＳＯに結合することにより、ｍＲＮＡがマイクロビーズ上に捕捉され、ＰＣＲ増幅によって５’配列に特定の分子標識を付けさせ、さらに例えば１０ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓのような５’ＲＮＡ単一細胞ハイスループットシークエンシングを実現する。しかし、現在１０ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓの大きな問題点は、そのコストが高いことである。
【0005】
市場で単細胞シークエンシング機器及びサービスを提供する会社は主に１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＢＤ、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社のＮａｄｉａなどがある。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社以外に、現在まだハイスループット５’ＲＮＡシークエンシングの方法がないが、５’ＲＮＡ ｓｅｑは、免疫レパートリーの獲得に不可欠な一環であり、例えば５’ＴＣＲ／ＢＣＲは免疫細胞の重要な成分として、ＴＣＲ／ＢＣＲ配列を獲得して免疫機序を深く理解することは極めて重要である。また、現在液滴ハイスループットに基づく完全長ｍＲＮＡ単細胞シークエンシング技術もまだ報告されていないが、完全長は遺伝子の多様性を把握し、機構を制御することに重要な役割を果たしている。
【0006】
以上のことから、現在単管の完全長ＲＮＡシークエンシング配列では、ハイスループット単細胞シークエンシングを実現することが困難であることが分かった。液滴マイクロ流体工学技術の不足は分子標識がｃＤＮＡの３’末端又は５’末端にしか設計できないため、ライブラリー構築過程で断裁し、スクリーニングした後、中間の配列は特定の分子標識がないため、断片由来を追跡できないため廃棄され、そのため完全長を得ることができない。また、現在１０ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓは、５’ＲＮＡ単細胞ハイスループットシークエンシングを実現しているが、ＴＳＯ相補に基づくｍＲＮＡ捕捉効率はｐｏｌｙ（ｄＴ）に基づく捕捉効率よりも高くなく、且つコストも高い。
【0007】
従って、単一細胞のＲＮＡ ５’末端又はＲＮＡ完全長に対するハイスループットシークエンシングを実現するために、依然として既存の方法を改良する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の主な目的は、従来技術ではＲＮＡ ５’末端又は完全長に対するハイスループットシークエンシングを実現することが困難であるという問題を解決するために、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法、シークエンシング方法及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を実現するために、本発明の一態様によれば、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法を提供し、当該構築方法は、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組み合わせを利用して一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅し、増幅断片を得るステップであって、ｃＤＮＡタグプライマーはｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む。
【0010】
さらに、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップは、ｍＲＮＡを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを得るステップと、第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、第１鎖ｃＤＮＡと相補的な第２鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含み、ｃＤＮＡタグ配列がｐｏｌｙ（Ａ）を含むステップと、二本鎖ｃＤＮＡを融解し、一本鎖ｃＤＮＡを得るステップと、を含む。
【0011】
さらに、ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ、第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含む。
【0012】
さらに、ｍＲＮＡは単一細胞サンプル由来であり、ｍＲＮＡは単一細胞ｍＲＮＡである。
【0013】
さらに、単一細胞ｍＲＮＡが固相支持体に接続するように、液滴法を採用して単一細胞ｍＲＮＡを調製し、好ましくは固相支持体はマイクロビーズである。
【0014】
さらに、単一細胞ｍＲＮＡがマイクロビーズに接続するように、液滴法を採用して単一細胞ｍＲＮＡを調製するステップは、それぞれ単一細胞懸濁液及びマイクロビーズを提供するステップであって、マイクロビーズにはマイクロビーズタグ配列を携帯しており、マイクロビーズタグ配列の末端にｐｏｌｙ（ｄＴ）を含むステップと、単一細胞懸濁液及びマイクロビーズを液滴に包み込み、且つ各液滴に１つの単一細胞及び１つのマイクロビーズを含み、マイクロビーズがｐｏｌｙ（ｄＴ）を介して単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）と結合することにより、単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡをマイクロビーズに接続し、単一細胞ｍＲＮＡを得るステップと、を含む。
【0015】
さらに、マイクロビーズタグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子タグ及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ、第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、第２ＰＣＲリンカーは第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、第２細胞タグは第１細胞タグと相補的であり、第２唯一分子標識は第１唯一分子標識と相補的である。
【0016】
さらに、一本鎖ｃＤＮＡの５’端にＴＳＯプライマーの配列を含む。
【0017】
さらに、逆転写酵素及びＴＳＯリンカーを採用してｍＲＮＡを逆転写することにより、第１鎖ｃＤＮＡを獲得し、ここで、転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有し、第１鎖ｃＤＮＡの３’端にＴＳＯリンカーの相補配列を含み、第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、第２鎖ｃＤＮＡを獲得し、第２鎖ｃＤＮＡの５’端にＴＳＯプライマーの配列を含む。
【0018】
さらに、ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である。
【0019】
さらに、逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる。
【0020】
さらに、第１鎖ｃＤＮＡに対してランダム増幅及び／又は完全長増幅を行い、二本鎖ｃＤＮＡを得る。
【0021】
さらに、リンカー増幅プライマー及びＴＳＯプライマーを採用して第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得るか、又はリンカー増幅プライマー、ＴＳＯ－ランダムプライマー及びＴＳＯプライマーを採用して第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得る。
【0022】
さらに、リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３であり、ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である。
【0023】
さらに、一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップは、環化補助配列及びリガーゼの作用下で一本鎖ｃＤＮＡをループにさせるように接続し、接続産物を得るステップと、接続産物を酵素切断してループにさせるように接続していない一本鎖ｃＤＮＡを消化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、を含み、ここで、環化補助配列は一本鎖ｃＤＮＡの両端の配列と相補的である。
【0024】
さらに、環化補助配列は配列番号５から選ばれる。
【0025】
さらに、遺伝子特異的プライマーはＴＣＲ遺伝子増幅に対するＴＣＲプライマー及び／又はＢＣＲ遺伝子増幅に対するＢＣＲプライマーである。
【0026】
さらに、ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーであり、より好ましくは配列番号６である。
【0027】
さらに、増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップは、増幅断片にライブラリーリンカーを付加し、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップを含む。
【0028】
さらに、増幅断片に対して酵素切断断片化を行い、酵素切断断片を獲得し、酵素切断断片に対して順次末端修復、Ａ付加及びライブラリーリンカー接続を行い、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得る。
【0029】
さらに、ライブラリーリンカー接続を行った後、さらに、ライブラリーリンカーの接続産物をＰＣＲ増幅し、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることを含む。
【0030】
さらに、ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである。
【0031】
本出願の第２態様によれば、ＲＮＡライブラリー構築キットを提供し、当該キットは、環化補助配列と、ＤＮＡリガーゼと、ｃＤＮＡタグプライマーと、及び（ａ）ランダムプライマー、（ｂ）ＴＣＲプライマー、（ｃ）ＢＣＲプライマーのうちの少なくとも１つとを含む。
【0032】
さらに、キットはＲＮＡ逆転写試薬をさらに含む。
【0033】
さらに、ＲＮＡ逆転写試薬はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素である逆転写酵素を含む。
【0034】
さらに、逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる。
【0035】
さらに、ＲＮＡ逆転写試薬はＴＳＯリンカーをさらに含む。
【0036】
さらに、ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である。
【0037】
さらに、キットはＴＳＯプライマー及びリンカー増幅プライマーをさらに含む。
【0038】
さらに、リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３である。
【0039】
さらに、キットはＴＳＯ－ランダムプライマーをさらに含む。
【0040】
さらに、ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である。
【0041】
さらに、環化補助配列は配列番号５である。
【0042】
さらに、ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーである。
【0043】
さらに、ｃＤＮＡタグプライマーの配列は配列番号６である。
【0044】
さらに、キットはエキソヌクレアーゼ及びライブラリーリンカーのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0045】
さらに、エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩから選ばれる。
【0046】
さらに、ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである。
【0047】
さらに、ＭＧＩシークエンシングプラットフォームはバブルリンカーから選ばれ、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーはＰ５及びＰ７リンカーから選ばれる。
【0048】
さらに、ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼから選ばれる。
【0049】
さらに、キットは固相支持体をさらに含み、固相支持体に支持体タグ配列が設置され、ここで、ｃＤＮＡタグプライマーは支持体タグ配列の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは固相支持体はマイクロビーズであり、支持体タグ配列はマイクロビーズタグ配列である。
【0050】
さらに、支持体タグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子タグ及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含む。
【0051】
本出願の第３態様によれば、ＲＮＡライブラリーのシークエンシング方法を提供し、当該シークエンシング方法は、前述したいずれかのＲＮＡシークエンシングライブラリー構築方法を採用してＲＮＡシークエンシングライブラリーを構築し、及びＲＮＡシークエンシングライブラリーをシークエンシングするステップを含む。
【発明の効果】
【0052】
本発明の技術案を適用し、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを獲得し、且つ当該一本鎖ｃＤＮＡ鎖の３’端にｃＤＮＡタグ配列を付け、当該ｃＤＮＡタグ配列を付けた一本鎖ｃＤＮＡを、一本鎖ｃＤＮＡの２つの末端が連結し、即ちｍＲＮＡに対応する５’端及び３’端が連結するように環化し、さらに３’端ｃＤＮＡタグ配列によってｍＲＮＡの５’端の断片を標識する。そしてｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部と同じｃＤＮＡタグプライマー及びランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーによって一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅することにより、５’端の特定遺伝子の位置から始まる増幅断片、又は５’端の任意の位置から始まる増幅断片を得ることができ、最後にこれらの増幅断片を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングすることにより、ハイスループットシークエンシングの目的を実現する。従って、上記で取得したループ形成用の一本鎖ｃＤＮＡの長さが完全長ｃＤＮＡであるかランダム長さのｃＤＮＡであるかによって、研究目的に応じて、５’ＲＮＡシークエンシングライブラリー、又は完全長ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0053】
本出願の一部を構成する添付図面は、本発明のさらなる理解を提供するためのものであり、本発明の例示的な実施例及びその説明は、本発明を解釈するためのものであり、本発明を不当に限定するものではない。図面は下記の通りである。
【図1】本発明の実施例１における液滴を調製するチップ（ｃｈｉｐ）構成の模式図を示す。
【図2】本出願のＲＮＡ完全長ライブラリー構築原理及びそのライブラリー構築シークエンシングフローの模式図を示す。
【図3】本出願の５’ＲＮＡ末端ライブラリー構築原理及びそのライブラリー構築シークエンシングフローの模式図を示す。
【図4A】本出願の実施例１における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの完全長ｃＤＮＡ増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図4B】本出願の実施例１における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの完全長ｃＤＮＡ増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図5A】本出願の実施例２における細胞株サンプル及び固形組織サンプルのランダムプライマー増幅ｃＤＮＡ産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図5B】本出願の実施例２における細胞株サンプル及び固形組織サンプルのランダムプライマー増幅ｃＤＮＡ産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図6A】本出願の実施例１における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの一本鎖ｃＤＮＡ環化後のランダムプライマー増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図6B】本出願の実施例１における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの一本鎖ｃＤＮＡ環化後のランダムプライマー増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図7A】本出願の実施例２における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの一本鎖ｃＤＮＡ環化後のＴＣＲ／ＢＣＲプライマー増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図7B】本出願の実施例２における細胞株サンプル及び固形組織サンプルの一本鎖ｃＤＮＡ環化後のＴＣＲ／ＢＣＲプライマー増幅産物のＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ検出結果を示す。
【図8】本出願の好ましい一実施例において構築されたライブラリーのシークエンシング解析後オフラインデータ中の５’端及び３’端のシークエンシング断片による転写産物のカバレッジ状況の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0054】
なお、矛盾しない限り、本出願における実施例及び実施例における特徴は、互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
【0055】
用語解釈：
ＴＳＯ：テンプレート置換オリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏ、ＴＳＯ）であり、本出願において「ＴＳＯリンカー」と呼ばれることもあり、これは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素と組み合わせて用いられる。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は、ｍＲＮＡを逆転写する際に、第１鎖ｃＤＮＡの末端にＣＣＣを付加する（完全長転写産物にのみ付加する）。一方、ＴＳＯリンカーは、ＣＣＣと対で結合するｒＧｒＧ＋Ｇ（ｒＧはリボースグアニンヌクレオチドを表し、＋ＧはＬＮＡ修飾デオキシリボース-グアニンヌクレオチドを表す。）を携帯しており、それにより逆転写の際に第１鎖ｃＤＮＡ ３’末端ＣＣＣにｒＧｒＧ＋Ｇ以外のＴＳＯリンカーの相補配列を付ける。
ＴＳＯ：テンプレート置換オリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏ、ＴＳＯ）であり、本出願において「ＴＳＯリンカー」と呼ばれることもあり、これは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素と組み合わせて用いられる。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は、ｍＲＮＡを逆転写する際に、第１鎖ｃＤＮＡの末端にＣＣＣを付加する（完全長転写産物にのみ付加する）。一方、ＴＳＯリンカーは、ＣＣＣと対で結合するｒＧｒＧ＋Ｇ（ｒＧはリボースグアニンヌクレオチドを表し、＋ＧはＬＮＡ修飾デオキシリボース-グアニンヌクレオチドを表す。）を携帯しており、それにより逆転写の際に第１鎖ｃＤＮＡ ３’末端ＣＣＣにｒＧｒＧ＋Ｇ以外のＴＳＯリンカーの相補配列を付ける。
【0056】
ＴＳＯプライマー：ｃＤＮＡ第２鎖合成及びｃＤＮＡ増幅のために、第１鎖ｃＤＮＡ ３’末端に少なくとも部分的に結合することができる。具体的な一実施形態では、ＴＳＯプライマーは、ＴＳＯリンカーからｒＧｒＧ＋Ｇを除去した配列である。
【0057】
ランダムプライマー及びＴＳＯ－ランダムプライマー：本出願におけるランダムプライマーとは、塩基Ｎのみからなる配列、例えば、６～１２ｎｔのＮからなるランダム配列を指す。一方、ＴＳＯ－ランダムプライマーとは、塩基Ｎからなるランダムプライマーの上流にＴＳＯプライマーを含む配列を指す。
【0058】
支持体タグ配列：本出願において、ｍＲＮＡを捕捉するための固相支持体に接続されたタグ配列を指し、ｍＲＮＡを捕捉するためのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を少なくとも含む。いくつかの実施例では、当該支持体タグ配列は、５’から３’の順に細胞タグとｏｌｉｇｏ（ｄＴ）とを含み、ここでｏｌｉｇｏ（ｄＴ）はｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）と相補的であることによりｍＲＮＡを捕捉するために用いられ、細胞タグは同じ細胞由来のｍＲＮＡを標識するために用いられる。ある実施例では、同じ細胞内の異なるｍＲＮＡ分子をさらに標識するために、細胞タグとｏｌｉｇｏ（ｄＴ）との間に唯一分子標識（即ちＵＭＩ）を設置することができる。ある好ましい実施例では、後続のライブラリー構築をさらに便宜にするために、後続のＰＣＲ増幅のために、細胞タグの５’方向にＰＣＲリンカーを設置することもできる。いくつかの好ましい実施例では、当該固相支持体はマイクロビーズであり、マイクロビーズに設置されたタグ配列はマイクロビーズタグ配列として表記され、マイクロビーズから近い順に（つまり５’から３’の順に）ＰＣＲリンカー、細胞タグ、唯一分子標識（即ちＵＭＩ）及びｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を含む。
【0059】
ｃＤＮＡタグ配列：環化されたｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖ｃＤＮＡ上のタグ配列であり、ここでｐｏｌｙ（Ａ）は固相支持体上のｏｌｉｇｏ（ｄＴ）と相補的であることにより、固相支持体に捕捉されたｍＲＮＡの増幅を実現するために用いられる。いくつかの好ましい実施例では、当該ｃＤＮＡタグ配列は、ｐｏｌｙ（Ａ）に加えて、細胞由来をタグするための細胞タグを含む。ある好ましい実施例では、細胞タグとｏｌｉｇｏ（ｄＴ）との間に同じ細胞内の異なるｍＲＮＡ分子を標識するための唯一分子標識（即ちＵＭＩ）がさらに設置される。別の好ましい実施例では、細胞タグの３’方向に後続のライブラリー構築ステップにおけるＰＣＲ増幅のためのプライマーとして用いられるＰＣＲリンカーがさらに設置される。より好ましい実施例では、当該ｃＤＮＡタグ配列は、３’から５’の順にＰＣＲリンカー、細胞タグ、唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含む。本出願において、配列をより正確に区別するために、上記支持体タグ配列（又はマイクロビーズタグ配列）上のＰＣＲリンカー、細胞タグ、唯一分子標識（即ちＵＭＩ）をそれぞれ第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識と表記し、それに対応して、ｃＤＮＡタグ配列上のＰＣＲリンカー、細胞タグ、唯一分子標識（即ちＵＭＩ）をそれぞれ第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ、第２唯一分子標識と表記する。
【0060】
リンカー増幅プライマー：本出願におけるリンカー増幅プライマーは、つまりＰＣＲリンカーであり、ｃＤＮＡ増幅の観点から記述されており、ｃＤＮＡ増幅の際に、リンカー増幅プライマーとＴＳＯプライマーをプライマー組合せとして利用して増幅を行う。
【0061】
ｃＤＮＡタグプライマー：環化された一本鎖ｃＤＮＡを増幅する際に用いられる１本のプライマーを指し、環化された一本鎖ｃＤＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）に連結するタグ配列上の少なくとも一部（例えば、ｐｏｌｙ（Ａ）でもよいし、ｃＤＮＡタグ配列でもよい。）であり、ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーによる環化された一本鎖ｃＤＮＡの増幅後の、ｐｏｌｙ（Ｔ）付きの配列を増幅し、それにより５’ＲＮＡライブラリー又は完全長ＲＮＡライブラリーを構築するのに必要な増幅断片を得るために用いられる。
【0062】
ＴＣＲ／ＢＣＲプライマー：ＴＣＲ／ＢＣＲは、Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／Ｂ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、即ちＴ細胞受容体又はＢ細胞受容体遺伝子をコードするプライマーを指し、遺伝子特異的プライマーの一種であり、単一細胞Ｔ／Ｂ細胞受容体をシークエンシングし、さらに免疫機序を研究するために用いられる。
【0063】
環化補助配列：本出願において、一本鎖ｃＤＮＡを環化する際に、一本鎖ｃＤＮＡの５’端と３’端とを引き寄せて首尾を互いに近づけるための補助配列を指す。これは、おれぞれ一本鎖ｃＤＮＡの５’端と相補的な及び３’端と相補的な一セグメントの配列によって一本鎖ｃＤＮＡの５’端と３’端とを引き寄せ、互いに近接する５’端と３’端との中間に欠損が存在してもよく、ＤＮＡリガーゼの作用下で、欠損を補完し、さらに一本鎖ｃＤＮＡの環化を実現する。
【0064】
ｐｏｌｙ（Ａ）：ｍＲＮＡはｐｏｌｙ（Ａ）テール（ポリアデニル）を有することが当業者に周知であり、それに対応して、本出願に記載のＤＮＡに対応するｐｏｌｙ（Ａ）テールは、ｐｏｌｙ（ｄＴ）と相補的に対をなすポリデオキシアデニルを指す。
【0065】
背景技術で述べたように、既存のＲＮＡシークエンシング方法のうち、完全長ｍＲＮＡをシークエンシングできる方法はハイスループットを実現することが困難であり、ハイスループットシークエンシングを実現できる方法の大部分は３’端のｍＲＮＡシークエンシングを対象としており、５’端単一細胞シークエンシングは現在主に１０ｘ ｇｅｎｏｍｉｃｓを主とし、単一細胞完全長ｍＲＮＡのシークエンシングはまだ報告されておらず、この現状を改善するために、発明者らは、既存の単一細胞シークエンシング技術の欠陥と組み合わせて、既存の単一細胞ＲＮＡライブラリー構築方法に対して改良を行い、３’ＲＮＡ単一細胞ハイスループットに基づいてｃＤＮＡを捕捉した後、環化接続の方法によってｍＲＮＡの３’端のタグ配列をｍＲＮＡの５’端に転移し、又は３’端と１つのタグを共有し、同時に３’端及び／又は５’端のＲＮＡ単一細胞ハイスループットシークエンシングを実現することが報告されていないことを発見した。具体的には、発明者らはそれぞれ完全長ｃＤＮＡ単一細胞ハイスループットシークエンシングライブラリーの構築、及び５’端のＲＮＡ単一細胞ハイスループットシークエンシングライブラリーの構築について詳細な研究を行い、さらに実験設計を細分化してこの方法の実行可能性を確認し、具体的な原理及びステップはそれぞれ以下のとおりである。
【0066】
（一）ＲＮＡ完全長単一細胞シークエンシング戦略
３’端ＲＮＡ＿ｓｅｑ液滴の戦略に基づいてｍＲＮＡを捕捉し、逆転写してｃＤＮＡ完全長を生成する。そしてリンカー増幅プライマー、ＴＳＯプライマー及びＴＳＯ－ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、３’端の、固相支持体、例えばマイクロビーズ（英語はｂｅａｄｓ）由来のマイクロビーズタグ配列は、増幅されるためｃＤＮＡタグ配列に変換されて残存しており、５’端は、ＴＳＯ－ランダムプライマーの結合位置の違いにより長さ不定のＤＮＡ断片を形成する。さらに断片の長さが異なる断片を接続環化し、３’端のｃＤＮＡタグ配列と５’端ＴＳＯプライマーが首尾連結したループを形成する。さらにｃＤＮＡループと相補的なランダムプライマー及びｐｏｌｙ（Ａ）プライマーを用いてさらにループをテンプレートとして増幅し、これらの増幅産物を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングを行い、それによりｃＤＮＡ完全長を増幅するだけでなく、ハイスループットシークエンシングを実現できるという目的を達成する（図２に示す）。
３’端ＲＮＡ＿ｓｅｑ液滴の戦略に基づいてｍＲＮＡを捕捉し、逆転写してｃＤＮＡ完全長を生成する。そしてリンカー増幅プライマー、ＴＳＯプライマー及びＴＳＯ－ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを増幅し、３’端の、固相支持体、例えばマイクロビーズ（英語はｂｅａｄｓ）由来のマイクロビーズタグ配列は、増幅されるためｃＤＮＡタグ配列に変換されて残存しており、５’端は、ＴＳＯ－ランダムプライマーの結合位置の違いにより長さ不定のＤＮＡ断片を形成する。さらに断片の長さが異なる断片を接続環化し、３’端のｃＤＮＡタグ配列と５’端ＴＳＯプライマーが首尾連結したループを形成する。さらにｃＤＮＡループと相補的なランダムプライマー及びｐｏｌｙ（Ａ）プライマーを用いてさらにループをテンプレートとして増幅し、これらの増幅産物を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングを行い、それによりｃＤＮＡ完全長を増幅するだけでなく、ハイスループットシークエンシングを実現できるという目的を達成する（図２に示す）。
【0067】
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）ｍＲＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）を捕捉するためのＰＣＲリンカー配列を設計し、当該ＰＣＲリンカー配列は固相支持体（例えばマイクロビーズ）上に接続でき、当該ＰＣＲリンカーはｃＤＮＡ増幅の際にリンカー増幅プライマーとして用いることができ、第１鎖ｃＤＮＡ ３’端と相補的なＴＳＯプライマー、及びＴＳＯ－ランダムプライマーを設計し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した後、上記プライマーを用いて増幅し、異なるサイズのｃＤＮＡ断片を得る。
（１）ｍＲＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）を捕捉するためのＰＣＲリンカー配列を設計し、当該ＰＣＲリンカー配列は固相支持体（例えばマイクロビーズ）上に接続でき、当該ＰＣＲリンカーはｃＤＮＡ増幅の際にリンカー増幅プライマーとして用いることができ、第１鎖ｃＤＮＡ ３’端と相補的なＴＳＯプライマー、及びＴＳＯ－ランダムプライマーを設計し、第１鎖ｃＤＮＡを合成した後、上記プライマーを用いて増幅し、異なるサイズのｃＤＮＡ断片を得る。
【0068】
（２）環化接続の技術を利用し、ｃＤＮＡ断片中のｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖の３’端ｃＤＮＡタグ配列と５’端配列とを首尾連結し、不均一なサイズの環状ＤＮＡ分子を得る。
【0069】
（３）配列を上流プライマーとして設計し、当該上流プライマーはｃＤＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）配列と同じであり、ランダムプライマーを用いて環状ＤＮＡ分子を増幅し、ｐｏｌｙ（Ｔ）付きの増幅配列を獲得し、ｐｏｌｙ（Ａ）プライマーとｐｏｌｙ（Ｔ）との結合を利用し、それにより増幅して異なる長さのＤＮＡ断片を獲得し、これらの断片に対して断裁、ライブラリー構築、及びシークエンシングを行い、それにより完全長のＲＮＡ配列を獲得し、具体的には実施例を参照されたい。
【0070】
具体的な一実施形態では、上記完全長ＲＮＡシークエンシングの全体的な技術経路は、液滴調製（マイクロビーズ相が溶解液を含む。）→ｍＲＮＡ捕捉→解乳→逆転写反応→ランダムプライマー増幅→増幅産物環化接続→環化産物ＰＣＲ増幅→断片化ライブラリー構築→シークエンシングである。具体的には実施例を参照されたい。
【0071】
（二）５’端ＲＮＡ単一細胞シークエンシング戦略
５’端ＲＮＡシークエンシングの取る戦略は、３’端ＲＮＡ＿ｓｅｑの液滴技術によってｍＲＮＡを獲得し、そしてｍＲＮＡを逆転写増幅し、完全長ｃＤＮＡを獲得し、増幅後の二本鎖完全長ｃＤＮＡのうちｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖ｃＤＮＡを環化接続し、ｍＲＮＡ ３’端と５’端配列末端とを首尾連結し、さらに環化ｃＤＮＡと相補的な遺伝子特異的プライマー（例えばＴＣＲ／ＢＣＲプライマー）又はランダムプライマー及びｐｏｌｙ Ａプライマーを用いてさらにループをテンプレートとして増幅し、これらの増幅産物を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングを行い、それにより５’端ＴＣＲ／ＢＣＲ配列捕捉又は他の目的遺伝子５’配列捕捉を実現する（図３に示す）。
５’端ＲＮＡシークエンシングの取る戦略は、３’端ＲＮＡ＿ｓｅｑの液滴技術によってｍＲＮＡを獲得し、そしてｍＲＮＡを逆転写増幅し、完全長ｃＤＮＡを獲得し、増幅後の二本鎖完全長ｃＤＮＡのうちｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖ｃＤＮＡを環化接続し、ｍＲＮＡ ３’端と５’端配列末端とを首尾連結し、さらに環化ｃＤＮＡと相補的な遺伝子特異的プライマー（例えばＴＣＲ／ＢＣＲプライマー）又はランダムプライマー及びｐｏｌｙ Ａプライマーを用いてさらにループをテンプレートとして増幅し、これらの増幅産物を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングを行い、それにより５’端ＴＣＲ／ＢＣＲ配列捕捉又は他の目的遺伝子５’配列捕捉を実現する（図３に示す）。
【0072】
具体的なステップは以下のとおりである。
（１）：ｍＲＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）を捕捉するためのＰＣＲリンカー配列を設計する。当該ＰＣＲリンカー配列は固相支持体（例えば磁気ビーズ）上に接続でき、ｃＤＮＡ増幅の際にリンカー増幅プライマーとして用いることができる。第１鎖ｃＤＮＡの３’端と相補的なＴＳＯプライマーを設計する。第１鎖ｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲリンカー配列とＴＳＯプライマーとからなるプライマー組合せを用いて増幅し、ｃＤＮＡ完全長断片を得る。
（１）：ｍＲＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）を捕捉するためのＰＣＲリンカー配列を設計する。当該ＰＣＲリンカー配列は固相支持体（例えば磁気ビーズ）上に接続でき、ｃＤＮＡ増幅の際にリンカー増幅プライマーとして用いることができる。第１鎖ｃＤＮＡの３’端と相補的なＴＳＯプライマーを設計する。第１鎖ｃＤＮＡを合成した後、ＰＣＲリンカー配列とＴＳＯプライマーとからなるプライマー組合せを用いて増幅し、ｃＤＮＡ完全長断片を得る。
【0073】
（２）環化接続技術を利用し、上記ｃＤＮＡ完全長断片のｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖を環化接続し、３’端のｃＤＮＡタグ配列と５’端のＴＳＯプライマーとが首尾連結した環状ＤＮＡ分子を得る。
【0074】
（３）ｐｏｌｙ（Ａ）プライマーを上流プライマーとして設計し、当該プライマーはｃＤＮＡ ３’端ｐｏｌｙ（Ａ）配列と同じであり、ｃＤＮＡループと相補的なＴＣＲ／ＢＣＲプライマー又はランダムプライマーを設計し、環状ＤＮＡ分子を増幅し、５’端ＴＣＲ／ＢＣＲの断片、又は５’端ランダム開始の増幅断片を得る。
【0075】
（４）ＴＣＲ／ＢＣＲプライマー増幅により得られた断片又は５’端ランダム開始の増幅断片に対してライブラリー構築シークエンシングを行い、さらにｍＲＮＡ ５’端のＴＣＲ／ＢＣＲ配列又は５’端ランダム開始の配列を得る。
【0076】
具体的な一実施形態では、５’端ＲＮＡシークエンシングの全体的な技術経路は、液滴調製（マイクロビーズの液相に細胞溶解液を含む。）→解乳→ｍＲＮＡ捕捉→逆転写反応→完全長ｃＤＮＡ増幅→増幅産物環化接続→ｐｌｏｙＡプライマー＋ＴＣＲ／ＢＣＲプライマー又はランダムプライマーを用いた環化産物のＰＣＲ増幅→断片化ライブラリー構築→シークエンシングである。
【0077】
以上から分かるように、本出願は３’液滴に基づく戦略を適用してｍＲＮＡを捕捉し、即ち固相支持体（例えば、マイクロビーズ）上にＰＣＲリンカー及び細胞タグ及びＵＭＩ（即ち唯一分子標識）配列を携帯しており、同時に末端にｐｏｌｙ（ｄＴ）を付加し、ｐｏｌｙ（ｄＴ）が成熟ｍＲＮＡ ３’末端のｐｏｌｙ（Ａ）テールと相補的であることにより、ｍＲＮＡを捕捉し、さらに逆転写して第１鎖ｃＤＮＡ完全長を合成する。そしてランダムプライマーを用いて増幅し及びループにさせるように接続する方式により、ｃＤＮＡの異なるサイズの断片又はｃＤＮＡ完全長を獲得し、それにより単一細胞ＲＮＡ ５’端及びＲＮＡ完全長シークエンシングを実現する。
【0078】
上記改良思想及び研究結果に基づいて、出願人は、本出願の技術案を提出する。典型的な一実施形態では、本出願は、ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法を提供し、当該構築方法は、
単一細胞ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、当該一本鎖ｃＤＮＡの３’末端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、
一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、
ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組合せを利用して増幅し、増幅断片を得るステップであって、ｃＤＮＡタグプライマーはｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、
増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む。
単一細胞ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、当該一本鎖ｃＤＮＡの３’末端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、
一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、
ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組合せを利用して増幅し、増幅断片を得るステップであって、ｃＤＮＡタグプライマーはｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、
増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む。
【0079】
上記構築方法は、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを獲得し、且つ当該一本鎖ｃＤＮＡ鎖の３’端にｃＤＮＡタグ配列を携帯しており、当該ｃＤＮＡタグ配列を携帯した一本鎖ｃＤＮＡを、一本鎖ｃＤＮＡの２つの末端が連結し、即ちｍＲＮＡに対応する５’端及び３’端が連結するように環化し、さらに３’端ｃＤＮＡタグ配列によってｍＲＮＡの５’端の断片を標識する。そしてｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部と同じｃＤＮＡタグプライマー及びランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーによって一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅することにより、５’端の特定遺伝子の位置から始まる増幅断片、又は５’端の任意の位置から始まる増幅断片を得ることができ、最後にこれらの増幅断片を断片化スクリーニングした後にライブラリー構築シークエンシングすることにより、ハイスループットシークエンシングの目的を実現する。従って、上記で取得したループ形成用の一本鎖ｃＤＮＡの長さが完全長ｃＤＮＡであるかランダム長さのｃＤＮＡであるかによって、完全長ＲＮＡシークエンシングライブラリー又は５’ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることができる。
【0080】
なお、上記構築方法は、そのサンプルのｍＲＮＡの逆転写一本鎖ｃＤＮＡを取得できれば、どのようなサンプルのＲＮＡライブラリー構築にも適用可能である。特に単一細胞ＲＮＡライブラリー構築に適用する。好ましい実施例では、ｍＲＮＡは単一細胞サンプル由来であり、ｍＲＮＡは単一細胞ｍＲＮＡである。
【0081】
単一細胞ｍＲＮＡを取得する方式について、従来技術における既知の方法を用いて取得することができる。本出願の好ましい実施例では、単一細胞ｍＲＮＡが固相支持体、好ましくはマイクロビーズに接続するように、液滴法を採用して単一細胞ｍＲＮＡを調製する。
【0082】
本出願の好ましい実施例では、単一細胞ｍＲＮＡがマイクロビーズに接続するように、液滴法を採用して単一細胞ｍＲＮＡを調製するステップは、それぞれ単一細胞懸濁液及びマイクロビーズを提供し、マイクロビーズにマイクロビーズタグ配列を付け、マイクロビーズタグ配列の末端にｐｏｌｙ（ｄＴ）を含むことと、単一細胞懸濁液とマイクロビーズを液滴に包み込み、且つ各液滴に１つの単一細胞及び１つのマイクロビーズを含み、マイクロビーズがｐｏｌｙ（ｄＴ）を介して単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）に結合し、それにより単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡをマイクロビーズに接続し、単一細胞ｍＲＮＡを得る。なお、上記単一細胞懸濁液には細胞溶解液が含まれているため、細胞核懸濁液と考えてもよい。当該液滴法は、マイクロビーズ上ｐｏｌｙ（ｄＴ）がｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）と結合することによりｍＲＮＡの捕捉を実現し、捕捉効率が高い。単一の油滴には単一のマイクロビーズと単一の細胞が対応しているため、マイクロビーズ上のマイクロビーズタグ配列も単一の細胞を特異的に標識することができる。
【0083】
上記構築方法において、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得する具体的な方法は、ｍＲＮＡに対応する３’端に上記ｃＤＮＡタグ配列を付けることができれば限定されない。上記のように、得られた一本鎖ｃＤＮＡの長さについても特に限定されるものではなく、完全長ｃＤＮＡであってもよいし、ランダム長さのｃＤＮＡであってもよく、いずれの場合も存在していてもよい。トランスクリプトーム情報を十分に掘り起こして利用することを可能にするために、本出願の好ましい実施例では、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、当該一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を付ける上記ステップは、ｍＲＮＡを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを得るステップと、第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、第１鎖ｃＤＮＡと相補的な第２鎖ｃＤＮＡの３’端に前述ｃＤＮＡタグ配列を含み、ｃＤＮＡタグ配列がｐｏｌｙ（Ａ）を含むステップと、二本鎖ｃＤＮＡを融解し、ｃＤＮＡタグ配列を含む一本鎖ｃＤＮＡを得るステップと、を含む。二本鎖ｃＤＮＡを融解するのは、後続の環化を行うためであり、二本鎖の場合、環化補助配列が環化しようとする鎖に効果的に結合することは困難である。ここで後続の環化方法は、ｃＤＮＡを首尾連結することができれば、限定されない。
【0084】
上記好ましい実施例では、単一細胞を捕捉するためのマイクロビーズ上のマイクロビーズタグ配列は好ましくは５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子タグ及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、第２ＰＣＲリンカーは第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、第２細胞タグは第１細胞タグと相補的であり、第２唯一分子標識は第１唯一分子標識と相補的である。つまり、第１鎖ｃＤＮＡの５’末端にマイクロビーズタグ配列を付けるが、増幅して得られた第２鎖ｃＤＮＡの３’末端に当該マイクロビーズタグ配列と相補的なｃＤＮＡタグ配列を付ける。
【0085】
一本鎖ｃＤＮＡの増幅を便宜にするために、その５’端にＴＳＯプライマーを含む配列が好ましい。具体的には５’端にＴＳＯプライマーの配列を付ける方法は限定されない。本出願の好ましい実施例では、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素及びＴＳＯリンカーを採用してｍＲＮＡを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを獲得し、第１鎖ｃＤＮＡの３’端にＴＳＯリンカーの相補配列を含み、第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、第２鎖ｃＤＮＡを獲得し、当該第２鎖の一本鎖ｃＤＮＡの５’端にＴＳＯプライマーの配列を含む。
【0086】
具体的には、第１鎖ｃＤＮＡを増幅する際に、ＴＳＯプライマーを採用すれば完全長第２鎖ｃＤＮＡが得られ、ＴＳＯ－ランダムプライマーを採用して増幅すれば、任意の長さの第２鎖ｃＤＮＡが得られるため、増幅プライマーの種類によっては、完全長又は任意の長さの二本鎖ｃＤＮＡが得られ、さらに融解後に完全長又は任意の長さの上記ｃＤＮＡタグ配列付きの一本鎖ｃＤＮＡが得られる。
【0087】
上記ＴＳＯリンカーの配列は、従来公知の配列を採用することができ、必要に応じて自ら設計することもできる。本出願のいくつかの好ましい実施例では、ＴＳＯリンカーの配列は、配列番号１である。上記逆転写酵素は、ＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓを含むが、これらに限定されない。
【0088】
なお、液滴法に基づいて単一細胞ｍＲＮＡを捕捉する方法は、現在、低コストでハイスループットなトランスクリプトームシークエンシングを実現する方法である。当該方法の核心は、液滴をマイクロリアクターとして利用し、且つ液滴に１つの細胞及び１つのタグ配列（通常第１細胞タグ配列（即ちＣｅｌｌ ｂａｒｃｏｄｅ）及び唯一分子標識（即ちＵｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ、ＵＭＩ）を予め含む。）を含む担体／支持体を含み、当該担体／支持体は好ましくはマイクロビーズである。液滴形成後、液滴中の細胞が溶解するとｍＲＮＡが放出され、且つマイクロビーズ上の捕捉配列と結合し、それによりｍＲＮＡの捕捉が実現される。通常液滴中でｍＲＮＡの濃縮が完了した後、全てのマイクロビーズで濃縮されたｍＲＮＡ（このときｍＲＮＡは既にマイクロビーズタグ配列と相補的なタグを付けており、同じロットで数千個の細胞を処理できる。）を合併して後続のライブラリー構築を行う。１０×ｇｅｎｏｍｉｃｓのｍＲＮＡライブラリー構築は、まさに上記原理を採用し、その欠点は主にｍＲＮＡの３’末端のライブラリー構築シークエンシングであり、ｍＲＮＡの完全長に対してライブラリー構築シークエンシングを実現しにくいことである。
【0089】
本出願の上記好ましい実施例では、液滴法によって単一細胞のｍＲＮＡを捕捉するステップは、上記方法と同じである。ｍＲＮＡを逆転写して第１鎖ｃＤＮＡを得る過程も従来法と同じであり、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を利用して逆転写して第１鎖完全長ｃＤＮＡを得ることができる。当該逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性により、第１鎖完全長ｃＤＮＡの末端に３つのＣを付加することができ、このとき、液滴中で遊離しているＴＳＯリンカー（例は実施例１の配列番号１を参照）の末端３ビットｒＧｒＧ＋Ｇが３つのＣに結合することができ、次に第１鎖完全長ｃＤＮＡの末端ＣＣＣの下流でＴＳＯリンカーと相補的な配列を合成する（例は実施例１の配列番号１の下線部の配列を参照）。そしてＴＳＯプライマー又はＴＳＯ－ランダムプライマーで第２鎖ｃＤＮＡの合成を完了する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡを有し、任意の長さの断片のｃＤＮＡも有し、且つｍＲＮＡの３’端に対応する一端にｃＤＮＡタグ配列を付ける。上記のように、本出願は、このような二本鎖ｃＤＮＡの一方の鎖（即ちｐｏｌｙ（Ａ）付きの一本鎖ｃＤＮＡ）を環化することによりｃＤＮＡタグ配列の転移を実現することができ、それによりｍＲＮＡの５’端を標識する非完全長の増幅断片、ひいては完全長の増幅断片を獲得し、これらの増幅断片をライブラリーに構築することによりｍＲＮＡの５’端及び／又は完全長シークエンシングを実現することができる。
【0090】
従って、実際の必要に応じて、上記第１鎖ｃＤＮＡをランダム増幅又は完全長増幅することができる。上記増幅断片のｍＲＮＡの５’端断片、ひいては完全長にわたる全被覆度をさらに向上させるために、本出願の好ましい実施例では、上記第１鎖ｃＤＮＡに対してランダム増幅及び／又は完全長増幅を行い、二本鎖ｃＤＮＡを得る。別の好ましい実施例では、リンカー増幅プライマー（例は実施例１の配列番号２を参照）、及びＴＳＯプライマー（例は実施例１の配列番号３を参照）及びＴＳＯ－ランダムプライマー（例は実施例１の配列番号４を参照）のうちの少なくとも１つを利用し、第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得る。
【0091】
ＴＳＯ－ランダムプライマーにより増幅して５’端の任意の位置から始まる二本鎖ｃＤＮＡ断片を得ることができ、それによりｍＲＮＡの５’端から３’端の全ての配列の断片を可能な限り完全に包含する。ＴＳＯプライマーは完全長二本鎖ｃＤＮＡ断片を確実に得ることができる。これらの不等長断片を環化することにより、不均一なサイズの一本鎖環状ＤＮＡ分子が得られ、全ての環状断片を増幅することにより、ｍＲＮＡの５’端の異なる位置を標識できる増幅断片が得られ、これらの増幅断片をライブラリー構築することにより、ｍＲＮＡの５’端及び／又は完全長の異なる位置を包含する断片のシークエンシングライブラリーが得られる。
【0092】
一本鎖ｃＤＮＡを環化する上記ステップは、既存の環化方法を採用すればよい。例えば、華大智造環化シークエンシング技術における環化手段を採用して実現する。本出願の好ましい実施例では、一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得る上記ステップは、環化補助配列及びリガーゼの作用下で一本鎖ｃＤＮＡをループにさせるように接続し、接続産物を得るステップと、接続産物を酵素切断してループにさせるように接続していない一本鎖ＤＮＡを消化し（二本鎖ＤＮＡが、融解した後に分離せずに直接に環化されてしまうと、ここで、環化していない二本鎖ＤＮＡが存在する可能性もある。）、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、を含み、ここで、環化補助配列（例は実施例１の配列番号５を参照）は、ループを形成する一本鎖ｃＤＮＡの両端の配列と相補的である（例えば、それぞれｃＤＮＡタグ配列における第２ＰＣＲリンカーと相補的であり、及びＴＳＯプライマーと相補的である）。
【0093】
より好ましい実施例では、まず二本鎖ｃＤＮＡを熱変性させ、二本鎖ｃＤＮＡを２本の一本鎖に融解させ、一本鎖状態で環化補助配列（環化しようとする一本鎖の両端配列に基づいて合理的に設計する。）を一本鎖とインキュベートし、環化補助配列が一本鎖の両端配列と相補することによって首尾両端を引き寄せ、さらにリガーゼの作用下で一本鎖環化を実現する。
【0094】
一本鎖環化ｃＤＮＡを得た後、実際の研究目的に応じて、ｐｏｌｙ（Ａ）プライマーとランダムプライマー又は特定タイプの遺伝子特異的プライマー（例えばＴＣＲ／ＢＣＲプライマー）を利用して増幅し、それにより５’端が標識された異なる増幅断片を得る。当該方法は、環化後増幅により、既存のｍＲＮＡの３’端を標識する方法をｍＲＮＡの５’端の目的断片を標識する方法に変換することを実現し、それによりｍＲＮＡの５’端シークエンシング及び／又は完全長シークエンシングを実現する。当該方法は、簡便であり、且つ既存の多様なシークエンシングプラットフォームのライブラリー構築ステップと互換性があり、単一細胞のｍＲＮＡ ５’端及び／又は完全長のハイスループットシークエンシングを実現するのに役立つ。
【0095】
好ましい実施例では、（ａ）ランダムプライマー、（ｂ）ＴＣＲ遺伝子プライマー、（ｃ）ＢＣＲ遺伝子プライマープライマーのうちの少なくとも１つとｃＤＮＡタグプライマーとの組合せを採用して一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅し、異なる需要を満たす増幅断片を獲得し、好ましくは、ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーであり、より好ましくは配列番号６である。前述のように、免疫レパートリーを研究する場合、ＴＣＲ及び／又はＢＣＲ遺伝子のプライマーを採用し、それにより免疫関連の遺伝子の発現状況を得る。
【0096】
増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、単一細胞のＲＮＡシークエンシングライブラリーを得る上記ステップは、通常の断片化ライブラリー構築フローを採用すればよい。本出願の好ましい実施例では、当該ステップは、増幅断片にライブラリーリンカーを付加すれば、ＲＮＡシークエンシングライブラリーを獲得可能であるステップを含む。具体的なリンカーの付加方式は、異なるシークエンシングプラットフォームの違いに応じて、適切なライブラリーリンカー及び操作方式を選択して付加することができる。本出願の好ましい実施例では、当該ステップは、増幅断片を酵素切断断片化し、酵素切断断片を得るステップと、酵素切断断片に対して順次末端修復Ａ付加及びリンカー接続を行い、単一細胞のＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む。より好ましくは、末端修復Ａ付加及びリンカー接続の後、得られた接続断片を増幅し、それによりシークエンシングの需要を満たすＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることをさらに含む。
【0097】
上記リンカー接続ステップにおいて、シークエンシングプラットフォームの違いに応じて、特定のシークエンシングプラットフォームに適するリンカーを合理的に選択することができる。例えば、ＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカーであってもよいし、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーであってもよい。それに対応して、リンカーに接続した接続断片を増幅するために採用される増幅プライマーも、対応するプラットフォームのリンカー配列とセットになっている。例えば、ＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカーを採用する場合、接続断片を増幅するプライマーもＭＧＩシークエンシングプラットフォームの増幅プライマーである。
【0098】
本出願の第２典型的な実施形態では、単一細胞ＲＮＡライブラリー構築キットをさらに提供し、当該キットは、環化補助配列と、ＤＮＡリガーゼと、ｃＤＮＡタグプライマーと、及び、（ａ）ランダムプライマー、（ｂ）ＴＣＲ遺伝子プライマー、（ｃ）ＢＣＲ遺伝子プライマーのうちの少なくとも１つとを含む。
【0099】
当該キットは、主に、上記ライブラリー構築方法における環化ステップ及び一本鎖環化ＤＮＡ上の目的遺伝子５’端の特定断片又は５’端の任意の位置から始まるランダム断片の増幅ステップに用いられる試薬に基づいて設計されたものであり、上記試薬を含むことにより、ライブラリーの構築を便宜かつ迅速に完了することができる。ここで、環化補助配列は、それぞれｍＲＮＡの５’端に対応して付加されたＴＳＯリンカー及びｍＲＮＡの３’端に対応するタグ配列と相補的に結合するので、その具体的な配列構成もタグ配列及びＴＳＯリンカー上の具体的な配列の違いによって異なる。
【0100】
上記キットにおけるＤＮＡリガーゼは、主に、ＤＮＡ鎖の、リン酸化修飾を有する一つの塩基と水酸基を有する一つの塩基とを接続するものであり、ＤＮＡ接続を実現できるＤＮＡリガーゼは、いずれも本出願に適用する。具体的には、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのような熱的に不安定なＤＮＡリガーゼであってもよいし、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅのような熱的に安定なＤＮＡリガーゼであってもよい。
【0101】
ライブラリーの構築を便宜にするために、好ましい実施例では、上記キットは、固相支持体をさらに含み、当該固相支持体に支持体タグ配列を付け、ここで、ｃＤＮＡタグプライマーは支持体タグ配列の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは当該固相支持体はマイクロビーズであり、支持体タグ配列はマイクロビーズタグ配列である。支持体タグ配列付きの固相支持体は、単一細胞ｍＲＮＡの捕捉を便利にすると同時に、ｍＲＮＡに支持体タグ配列と相補的なタグ配列を付けさせる。
【0102】
上記キットにおいて、タグ配列付きのマイクロビーズ（例えば、ゲルマイクロビーズ）は、既存のマイクロビーズを採用するものから選択して購入してもよいし、自ら調製してもよい。各マイクロビーズ上のタグ配列は、以下のＤＮＡ配列を含み、（１）ＰＣＲリンカーであり、ＰＣＲ増幅に用いられる。（２）細胞タグ（Ｃｅｌｌ ｂａｒｃｏｄｅ）であり、１つのマイクロビーズが１種類の細胞タグに対応する。（３）唯一分子標識（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ、ＵＭＩ）であり、同じ細胞中の異なるテンプレート分子を標識し、転写産物の存在量を定量するために用いられる。（４）捕捉配列であり、通常ｐｏｌｙ（ｄＴ）であり、ｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）テールに結合することによりｍＲＮＡを捕捉する。
【0103】
上記ライブラリー構築の利便性をさらに向上させるために、好ましくは当該キットはＲＮＡ抽出試薬及び／又はＲＮＡ逆転写試薬をさらに含み、ＲＮＡ逆転写試薬は逆転写酵素を含み、逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素（例えばＭＧＩのＡｌｐｈａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅであってもよいし、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素であってもよいし、ＴｈｅｒｍｏのＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶなどであってもよい）である。
【0104】
液滴法に基づくｍＲＮＡの捕捉及び逆転写に関連する試薬はセットで用いることができ、
ｐｏｌｙ（ｄＴ）がｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）テールに結合することによりｍＲＮＡを捕捉した後、逆転写酵素の作用下で第１鎖ｃＤＮＡの合成を実現し、第２鎖の合成を便宜にするために、通常の逆転写試薬は逆転写酵素の他にＴＳＯリンカー（例えば配列番号１に示す。）を含む。例えばターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を採用して第１ｃＤＮＡ鎖の末端にＣＣＣを付加し、そしてＴＳＯリンカー上のｒＧｒＧ＋Ｇを利用してＣＣＣと相補的に結合した後、さらにＴＳＯリンカー配列をテンプレートとして、ＣＣＣの後ろにＴＳＯリンカーの相補配列を付加する（即ち第１ｃＤＮＡ鎖の末端にＴＳＯの相補配列を接続することに相当する。）。
ｐｏｌｙ（ｄＴ）がｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）テールに結合することによりｍＲＮＡを捕捉した後、逆転写酵素の作用下で第１鎖ｃＤＮＡの合成を実現し、第２鎖の合成を便宜にするために、通常の逆転写試薬は逆転写酵素の他にＴＳＯリンカー（例えば配列番号１に示す。）を含む。例えばターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を採用して第１ｃＤＮＡ鎖の末端にＣＣＣを付加し、そしてＴＳＯリンカー上のｒＧｒＧ＋Ｇを利用してＣＣＣと相補的に結合した後、さらにＴＳＯリンカー配列をテンプレートとして、ＣＣＣの後ろにＴＳＯリンカーの相補配列を付加する（即ち第１ｃＤＮＡ鎖の末端にＴＳＯの相補配列を接続することに相当する。）。
【0105】
ｍＲＮＡの５’端の任意の位置から３’端の配列断片を得ることを可能にし、これにより不均一なサイズの複数の断片により、ｍＲＮＡ完全長を包含する全ての断片を獲得し、それにより５’端のシークエンシング又は完全長のシークエンシングを実現する。そのため、本出願の好ましい実施例では、上記キットは、ＴＳＯプライマー、ＴＳＯ－ランダムプライマー及びリンカー増幅プライマーをさらに含む。好ましくは、リンカー増幅プライマーの配列は、配列番号２であり、ＴＳＯプライマーの配列は、配列番号３であり、ＴＳＯプライマーＴＳＯ－ランダムプライマーは、配列番号４である。リンカー増幅プライマーは、第２ｃＤＮＡ鎖３’端（ｍＲＮＡ ３’端に対応する。）のｃＤＮＡタグ配列と結合することができるが、ＴＳＯ－ランダムプライマーは第１鎖ｃＤＮＡ ３’端（ｍＲＮＡ ５’端に対応する。）の任意の位置に結合することができ、それにより不均一なサイズのｃＤＮＡ断片を得ることができる。
【0106】
好ましくは、環化補助配列は配列番号５であり、好ましくは、ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーであり、より好ましくは配列番号６である。
【0107】
いくつかの好ましい実施例では、当該キットは、エキソヌクレアーゼ及びライブラリーリンカーのうちの少なくとも１つをさらに含む。ここで、エキソヌクレアーゼは、二本鎖ｃＤＮＡを一本鎖に融解して環化した後、環化に成功しなかった一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡを分解するために用いられ、例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩなどであってもよい。ライブラリー構築用リンカーは、ＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー（例えば１本がリニアリンカーであり、もう１本がバブルリンカーである二本鎖リンカーであり、ここで、リニアリンカーはＡ＋３１ｂｐ配列＋１０ｂｐ ｉｎｄｅｘ配列＋１７ｂｐであり、バブルリンカーは１７ｂｐのバブル配列、１７ｂｐバブル配列前の１３ｂｐ及び１７ｂｐバブル配列後の７ｂｐ＋Ｔを含み、リンカー全長は９７ｂｐである。）であってもよい。他のシークエンシングプラットフォームのリンカー、例えばＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカー（例えばＹ型Ｐ５及びＰ７リンカーであり、必要に応じてＰ５及びＰ７リンカーの一方又は両方にライブラリータグ配列を付け、後続のサンプル混合シークエンシングのライブラリーの生成データの分割を容易にする。）であってもよい。
【0108】
本出願の第３典型的な実施形態では、ＲＮＡシークエンシングの方法をさらに提供し、当該方法は、上記いずれかのＲＮＡシークエンシングライブラリー構築方法を採用してＲＮＡシークエンシングライブラリーを構築し、及びＲＮＡシークエンシングライブラリーをシークエンシングするステップを含む。前述したＲＮＡシークエンシングライブラリー構築方法を採用して構築されたＲＮＡシークエンシングライブラリーは、研究目的の違いによって、より多くのｍＲＮＡ ５’端を包含する断片であってもよいし、ｍＲＮＡ完全長を包含する断片であってもよく、従って現在市場で必要とされる５’端シークエンシングの需要、例えば免疫ペプチドライブラリーを構築する際の５’端シークエンシングの需要を満たすことができる。完全長ＲＮＡシークエンシングライブラリーをシークエンシングすることは、ある転写産物の選択的スプライシングの構造変異状況に対する研究を満たすことができる。
【0109】
なお、上記５’端ＲＮＡシークエンシングと完全長シークエンシングは同時に行うことも、単独で行うことも可能であり、具体的な応用シーンに応じて決定される。
【0110】
以下、具体的な実施例を参照して本出願の技術的効果をさらに説明する。
【0111】
以下の実施例は、細胞懸濁液準備、マイクロビーズ準備、液滴生成、解乳、逆転写ＲＴ反応、ｃＤＮＡ増幅、環化接続、環化産物増幅、断片化酵素のライブラリー構築、ハイスループットシークエンシングなどを含む。
【0112】
（実施例１）完全長ＲＮＡシークエンシング
本実施例は、図２に示す原理フローに従って調製し、具体的には以下のとおりである。
本実施例は、図２に示す原理フローに従って調製し、具体的には以下のとおりである。
【0113】
１．単一細胞懸濁液準備
１．１ 細胞株、固形組織について、適切な消化法／研磨法を採用して単一細胞／細胞核懸濁液を調製し、且つＰＢＳ（０．０４％ ＢＳＡを含む。）で１～２回洗浄し、且つ４０μｍの細胞篩を用いて濾過した。
１．１ 細胞株、固形組織について、適切な消化法／研磨法を採用して単一細胞／細胞核懸濁液を調製し、且つＰＢＳ（０．０４％ ＢＳＡを含む。）で１～２回洗浄し、且つ４０μｍの細胞篩を用いて濾過した。
【0114】
１．２ 細胞計数板又は計数器を用いて細胞／細胞核の濃度を検出した。
【0115】
１．３ 細胞濃度に応じて、１０万個の細胞／細胞核を吸引し、３００～５００ｇ、４°Ｃ、５ｍｉｎ遠心分離して細胞沈殿物を収集し、１００μＬの細胞再懸濁液（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ：０．０４％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ）を加えて細胞／細胞核を再懸濁した。
【0116】
２ マイクロビーズ準備
２．１ ２００μＬ（２２０，０００個）の磁気ビーズを０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに吸引し、磁気ラック上に置いて２ｍｉｎ静置し、上清を除去した。
２．１ ２００μＬ（２２０，０００個）の磁気ビーズを０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに吸引し、磁気ラック上に置いて２ｍｉｎ静置し、上清を除去した。
【0117】
２．２ 磁気ラックからＰＣＲチューブを取り外し、２００μＬ １ｘＢｕｆｆｅｒ Ｄ（１ｍＭ ＥＤＴＡ、９ｍｇ／ｍＬ ８５％ ＫＯＨ）を加えて磁気ビーズを懸濁し、室温で５ｍｉｎインキュベートした。
【0118】
２．３ 磁気ラックに置いて２ｍｉｎ静置し、上清を除去した。
【0119】
２．４ ＰＣＲチューブを磁気ラックに保持し、２００μＬ １ｘＢｕｆｆｅｒ Ｄを加え、３０ｓ静置して上清を除去した。
【0120】
２．５ ２００μＬ ＬＳＷＢ（５０ｍＭ ＴｒＴＳＯ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を加え、３０ｓ静置し、そして上清を除去した。その一つ前のステップを繰り返した。
【0121】
２．６ ２００μＬ 溶解液（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ：６％ Ｆｉｃｏｌｌ ＰＭ－４００、０．２％サルブタモール、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、Ｈ２Ｏ）を加え、３０ｓ静置し、そして上清を除去した。磁気ラックからＰＣＲチューブを取り外し、１００μＬ 溶解液及び５μＬ １Ｍ ＤＴＴを加えた。
【0122】
３ 液滴生成
３．１ チップ（ｃｈｉｐ）（図１参照）表面保護膜を剥離し、液滴発生装置（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のチップ溝領域に置いた。
３．１ チップ（ｃｈｉｐ）（図１参照）表面保護膜を剥離し、液滴発生装置（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のチップ溝領域に置いた。
【0123】
３．２ 収集蓋上の接続管Ａ端（収集管の底部に接触する接続管）をチップの出口（Ｏｕｔｌｅｔ）孔に挿入した。
【0124】
３．３ ５０ｍＬ注射器を固定ラックに置き、且つプッシュロッドを初期位置に調整した。平口針で注射器と収集管の蓋上の接続管Ｂ端（収集管の底部に接触しない接続管）を接続した。
【0125】
３．４ 収集管に２００μＬ 液滴生成油を加え、収集蓋を締め付け、且つ収集管を固定ラックに垂直に置いた。
【0126】
３．５ ピペットを用いて細胞を軽く吹き混ぜ、チップの細胞（ｃｅｌｌｓ）孔に１００μＬのステップ１．３で調製した細胞懸濁液を加え、ピペットの先端が孔底部に接触することを確保した。
【0127】
３．６ ピペットを用いて磁気ビーズを軽く吹き混ぜ、チップのマイクロビーズ（ｂｅａｄｓ）孔に１００μＬの磁気ビーズを加え、ピペットの先端が孔底部に接触することを確保した。
【0128】
３．７ 直ちに３５０μＬの液滴生成油をチップ油滴（Ｏｉｌ）孔に添加した。
【0129】
３．８ 迅速に注射器のプッシュロッドを係止スロットの位置に引っ張り、プッシュロッドを係止スロットに係合した。
【0130】
３．９ タイマーを開始して２０ ｍｉｎ計時し、液滴を収集した。
【0131】
３．１０ ２０ ｍｉｎ後に、直ちに収集管上の収集蓋を緩め、チップ出口孔の接続管を引き抜き、接続管を垂直に伸ばし、管内の液滴を収集管に流し、そして通常の収集管蓋に交換した。
【0132】
３．１１ 室温で２０ ｍｉｎ静置し、ｍＲＮＡ分子を磁気ビーズと十分に結合させた。
【0133】
４ 解乳
４．１ 解乳試薬を準備し、１５ｍＬの遠心管に１０ｍＬ ６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、酵素なし水で６ｘに希釈する。）及び２００μＬ ＰＦＯ（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｏｌ、Ｓｉｇｍａ、３７０５３３－２５Ｇ）を加えた。
４．１ 解乳試薬を準備し、１５ｍＬの遠心管に１０ｍＬ ６Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、酵素なし水で６ｘに希釈する。）及び２００μＬ ＰＦＯ（Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｏｌ、Ｓｉｇｍａ、３７０５３３－２５Ｇ）を加えた。
【0134】
４．２ 濾過装置と真空ポンプを接続し、圧力パラメータを０．０１ＭＰａ又は１００ｍｂａｒに調整し、真空ポンプを起動した。
【0135】
４．３ ２０ｍＬ ６Ｘ ＳＳＣを加え、装置を前処理した。
【0136】
４．４ 濾過膜に液体が残留しないと、収集管内の全ての液体を濾過膜表面に均一に注ぎ、且つ２ｍＬ ６Ｘ ＳＳＣで収集管を２回洗浄し、洗浄液を濾過装置に一括注いだ。
【0137】
４．５ 力を入れて１０ｍＬの解乳試薬を逆さにして均一に混合し、回に分けてゆっくりと濾過装置に注いだ。
【0138】
４．６ 濾過膜に液体が残留しないと、３０ｍＬ ６Ｘ ＳＳＣを連続して加え、回に分けて磁気ビーズを洗浄した。
【0139】
４．７ 濾過膜に液体が残留しないと、真空ポンプを閉じ、真空ポンプと濾過装置との接続を切断した。
【0140】
４．８ 注射器又はゴム栓で濾過装置の濾過口を塞いだ。
【0141】
４．９ ピペットを用いて１．０ｍＬの収集緩衝液を加え、且つ濾過膜表面全体を軽く約２０回吹き付け、磁気ビーズを懸濁させた。
【0142】
４．１０ 磁気ビーズを含む収集液を１．５ｍＬの低吸着遠心管に移送した。
【0143】
４．１１ さらに１．０ｍＬの収集緩衝液で、濾過膜表面全体を軽く約１０回吹き付け、残留した磁気ビーズを懸濁させた。
【0144】
４．１２ 磁気ビーズを含む収集液を１．５ｍＬの低吸着遠心管に移送し、磁気ラックに置き、２ｍｉｎ静置し、上清液をゆっくりと除去した。
【0145】
４．１３ 磁気ラックから遠心管を取り外し、１００μＬの収集緩衝液を用いて、順次２つの遠心管の片側に吸着する磁気ビーズを懸濁させ、液体を０．２ｍＬの低吸着ＰＣＲチューブに移送した。
【0146】
４．１４ 再び１００μＬの収集緩衝液を用いて、順次２つの遠心管の片側に吸着する磁気ビーズを懸濁させ、液体を上記０．２ｍＬの低吸着ＰＣＲチューブに移送した。
【0147】
４．１５ 磁気ビーズを入れたＰＣＲチューブを磁気ラックに置き、２ｍｉｎ静置し、上清液を除去した。
【0148】
４．１６ 磁気ビーズ吸着状態を保持し、２００μＬ ６Ｘ ＳＳＣを加え、３０ｓ静置し、上清液を除去した。
【0149】
４．１７ ２００μＬ ５Ｘ ＦＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＧＩ，０１Ｅ０２２ＭＳ）を加え、３０ｓ静置し、磁気ビーズを吸引することを回避しながら、上清をゆっくりと除去した。
【0150】
５ 逆転写反応
５．１ 氷上に逆転写反応系を調製する：５μＬ Ｈ２Ｏ、２０μＬ ５ｘ ＦＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）、２０μＬ ５Ｍ ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）、１０μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、７．５μＬ １００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μＬ ５０μＭテンプレート置換オリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏ、ＴＳＯリンカー）、５μＬ １００ｍＭ ＤＴＴ、５μＬ ２００Ｕ／μＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０６４０１４）、２．５μＬ ４０Ｕ／μＬ ＲＮＡ酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
５．１ 氷上に逆転写反応系を調製する：５μＬ Ｈ２Ｏ、２０μＬ ５ｘ ＦＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）、２０μＬ ５Ｍ ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）、１０μＬ １０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、７．５μＬ １００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μＬ ５０μＭテンプレート置換オリゴヌクレオチド（Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏ、ＴＳＯリンカー）、５μＬ １００ｍＭ ＤＴＴ、５μＬ ２００Ｕ／μＬ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ 逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８０６４０１４）、２．５μＬ ４０Ｕ／μＬ ＲＮＡ酵素阻害剤（ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
【0151】
ＴＳＯリンカー配列：配列番号１：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴｒＧｒＧ＋Ｇ－３′であり、＋Ｇは鎖ヌクレオチドを表し、ｒＧｒＧ＋Ｇを採用する原因はＲＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーション熱安定性がよりよいからである。
【0152】
５．２ １００μＬの逆転写反応系を吸引し、ステップ４．１７の磁気ビーズを入れたＰＣＲチューブに加え、吹き混ぜた。
【0153】
５．３ ４２℃、９０ｍｉｎ；１０サイクル（５０℃、２ｍｉｎ；４２℃、２ｍｉｎ）の条件に従って逆転写反応を行い、熱蓋温度を７５℃に設定した。磁気ビーズに沈降現象が存在するため、２０ｍｉｎごとに磁気ビーズを軽く弾いて混合し、短時間遠心分離した後、反応を継続した。
【0154】
５．４ 反応終了後、短時間遠心分離し、磁気ラックに置き、２ｍｉｎ静置し、反応液を除去した。
【0155】
５．５ 磁気ラックからＰＣＲチューブを取り外し、２００μＬ ＴＥ－ＳＤＳ （ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．５％ ＳＤＳ）を加え、均一に振とう混合し、反応を終了した。
【0156】
５．６ 短時間遠心分離した後、磁気ラックに置き、２ｍｉｎ静置し、液体を除去した。
【0157】
５．７ 磁気ビーズ吸着状態を保持し、２００μＬ ＴＥ－ＴＷ（ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）を加え、３０ｓ静置し、上清液を除去した。
【0158】
５．８ 上記ステップを繰り返した。
【0159】
５．９ 磁気ビーズ吸着を保持し、２００μＬ １０ｍＭ ＮＦ－Ｈ２Ｏを加え、３０ｓ静置して上清液を除去した。
【0160】
６．第１鎖ｃＤＮＡランダムプライマー増幅
６．１ ＰＣＲ反応系調製：４２μＬ Ｈ２Ｏ、４μＬ １０μＭ Ｔｎプライマー（即ちリンカー増幅プライマー）、２μＬ ２０μｍ ＴＳＯ－ランダムプライマー、２μＬ ２０μｍ ＴＳＯプライマー及び５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘ（ＫＡＰＡ：ＫＫ２６０２）。
６．１ ＰＣＲ反応系調製：４２μＬ Ｈ２Ｏ、４μＬ １０μＭ Ｔｎプライマー（即ちリンカー増幅プライマー）、２μＬ ２０μｍ ＴＳＯ－ランダムプライマー、２μＬ ２０μｍ ＴＳＯプライマー及び５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘ（ＫＡＰＡ：ＫＫ２６０２）。
【0161】
ここで、Ｔｎプライマー（即ちリンカー増幅プライマー）は、磁気ビーズに接続する一端から増幅を開始するために用いられ、その具体的な配列は、
配列番号２：５’－ＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧ－３’であり、
ＴＳＯプライマーは、ＴＳＯリンカーの一端から増幅を開始するために用いられ、その具体的な配列は、
配列番号３：５’Ｐｈｏｓ－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴ－３’であり、
ＴＳＯ－ランダムプライマーは、ｃＤＮＡの５’端の任意の位置から３’端方向に増幅するために用いられ、その具体的な配列は、
配列番号４：５’ｐｈｏｓ－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴＮＮＮＮＮＮ－３’である。
配列番号２：５’－ＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧ－３’であり、
ＴＳＯプライマーは、ＴＳＯリンカーの一端から増幅を開始するために用いられ、その具体的な配列は、
配列番号３：５’Ｐｈｏｓ－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴ－３’であり、
ＴＳＯ－ランダムプライマーは、ｃＤＮＡの５’端の任意の位置から３’端方向に増幅するために用いられ、その具体的な配列は、
配列番号４：５’ｐｈｏｓ－ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＡＴＮＮＮＮＮＮ－３’である。
【0162】
６．２ 下記の条件に従ってＰＣＲ反応を行った：９５℃、３ｍｉｎ；１０～１５サイクル（９８℃、２０ｓ；５８℃、２０ｓ；７２℃、３ｍｉｎ）；７２℃、５ｍｉｎ；４℃、維持する。
【0163】
６．３ ＰＣＲ終了後、１２０μＬ（１．２ｘ）ＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（ＶＡＺＹＭＥ：Ｎ４１１－０３）（室温で３０ｍｉｎ前平衡化する。）を用いてＰＣＲ産物を精製回收した。
【0164】
６．４ Ｑｕｂｉｔ蛍光計を用いてＰＣＲ精製産物を定量し及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザを用いて断片の分布状況を検出した（細胞株サンプル及び固形組織サンプルはそれぞれ図４Ａ及び４Ｂを参照）。
【0165】
７．ＤＮＡ環化
７．１ １００～２００ｎｇの上記ｃＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４５μＬまで補充し、５μＬ ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ １（２０μｍ）を加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、５ｓ瞬時遠心分離し、９５℃で３分間反応させ（熱蓋１０５℃で、一本鎖環化のためにｄｓＤＮＡを一本鎖に融解させる。）、迅速に氷上に５～１０分間置いた。
７．１ １００～２００ｎｇの上記ｃＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４５μＬまで補充し、５μＬ ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ １（２０μｍ）を加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、５ｓ瞬時遠心分離し、９５℃で３分間反応させ（熱蓋１０５℃で、一本鎖環化のためにｄｓＤＮＡを一本鎖に融解させる。）、迅速に氷上に５～１０分間置いた。
【0166】
ここで、ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ １（環化補助配列）の具体的な配列は、
配列番号５：５’－ＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴ－３’である。
配列番号５：５’－ＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＴ－３’である。
【0167】
７．２ 接続：
上記ＰＣＲチューブを氷浴に入れ、以下の表に従って反応系を調製した。
上記ＰＣＲチューブを氷浴に入れ、以下の表に従って反応系を調製した。
【表1】
【0168】
調製した接続産物を融解産物に加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、短時間遠心分離し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、３７℃で４５ｍｉｎインキュベートし、熱蓋温度を７５℃とした。
【0169】
７．３ 酵素切断消化：
一本鎖環化反応が終了しようとするとき、予め以下の表に従って氷上に酵素切断消化反応液を調製した。
一本鎖環化反応が終了しようとするとき、予め以下の表に従って氷上に酵素切断消化反応液を調製した。
【表2】
【0170】
ピペットを用いて４μＬの調製した酵素切断消化反応液（環化されていない一本鎖及び場合により未融解の二本鎖を消化するために用いられる。）を吸引して一本鎖環化産物に加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、瞬時遠心分離し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、熱蓋温度を７５℃とした。
【0171】
７．４ 酵素切断終了：酵素切断反応終了後、ＰＣＲチューブに３μＬの終了液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１ＭＥＤＴＡ）を加え、均一に混合し、短時間遠心分離して液体を管底部に収集した。
【0172】
７．５ ｃＤＮＡ環化ライブラリー精製：ＰＥＧ３２磁気ビーズを用いてステップ７．４で得られた環化産物を精製し、Ｑｕｂｉｔ蛍光計を用いて精製後のｃＤＮＡ環化産物を定量し、後続の増幅に備えた。
【0173】
８ ｃＤＮＡランダムプライマーＰＣＲ増幅
８．１ 初期に１０～５０ｎｇの環化ＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４２μＬまで補充し、４μＬ ２０μｍ ｐｏｌｙ（Ａ）プライマー、４μＬランダムプライマー（配列番号１２：５’－ＮＮＮＮＮＮ－３’）、５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘを加えた。このようなプライマーは、異なるサイズの環化産物に対して、異なる長さの断片の増幅を行うことができ、それにより可能な限りｃＤＮＡの完全長配列をカバーすることができる。
８．１ 初期に１０～５０ｎｇの環化ＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４２μＬまで補充し、４μＬ ２０μｍ ｐｏｌｙ（Ａ）プライマー、４μＬランダムプライマー（配列番号１２：５’－ＮＮＮＮＮＮ－３’）、５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘを加えた。このようなプライマーは、異なるサイズの環化産物に対して、異なる長さの断片の増幅を行うことができ、それにより可能な限りｃＤＮＡの完全長配列をカバーすることができる。
【0174】
ｐｏｌｙ（Ａ）プライマーの具体的な配列は、
配列番号６：５’ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’である。
配列番号６：５’ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’である。
【0175】
８．２ 下記の条件に従ってＰＣＲ反応を行った：９５℃、３ｍｉｎ；１０～１５サイクル（９８℃、２０ｓ；６０℃、２０ｓ；７２℃、３０ｓ）；７２℃、５ｍｉｎ；４℃、維持する。
【0176】
８．３ ０．５×+０．７×のＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いてＰＣＲ産物精製を行い、スクリーニングされた断片（長さが１５０～８００ｂｐである。）をＱｕｂｉｔ定量し及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ バイオアナライザを用いて断片の分布状況を検出した（細胞株サンプル及び固形組織サンプルはそれぞれ図６Ａ及び図６Ｂを参照）。
【0177】
９ ｃＤＮＡライブラリー構築
９．１ ＤＮＡ断片化：
ステップ８．３で得られたｃＤＮＡ濃度に応じて、１００～２００ｎｇ（約０．１～０．２ｐｍｏｌ）の断裁対象ｃＤＮＡを新しい０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、体積が≦１６μＬであり、１６μＬ未満の部分をＨ２Ｏで補充した。以下の表に従って氷上に断片化反応液を調製した。
９．１ ＤＮＡ断片化：
ステップ８．３で得られたｃＤＮＡ濃度に応じて、１００～２００ｎｇ（約０．１～０．２ｐｍｏｌ）の断裁対象ｃＤＮＡを新しい０．２ｍＬ ＰＣＲチューブに取り、体積が≦１６μＬであり、１６μＬ未満の部分をＨ２Ｏで補充した。以下の表に従って氷上に断片化反応液を調製した。
【表3】
【0178】
ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、熱蓋を７５℃とし、３７ ℃で１０ｍｉｎインキュベートし、反応終了後にＰＣＲチューブに３０μＬ ０．１Ｍ ＥＤＴＡを加え、ボルテックスして均一に混合し、反応を終了した。
【0179】
９．２ 断片化産物精製：上記断裁されたＤＮＡ産物に対して、０．６×+０．２×のＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いて精製スクリーニング（３００～５００ｂｐの断片を保留する。）を行い、且つＱｕｂｉｔ蛍光計を用いて濃度定量を行った。
【0180】
９．３ 以下の表に従って氷上に末端修復反応液を調製した：
【表4】
【0181】
ピペットを用いて１０μＬの調製した末端修復反応液を吸引してステップ９．２の精製後の断片化産物に加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、瞬時遠心分離し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、３７℃、３０ｍｉｎ、６５℃、１５ｍｉｎ、４℃、維持した。
【0182】
９．４ ライブラリーリンカー接続
以下の表に従って氷上にリンカー接続反応液を調製した：
以下の表に従って氷上にリンカー接続反応液を調製した：
【表5】
【0183】
ライブラリーリンカーの具体的な配列は、
配列番号７：５’－Ｐｈｏｓ－ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡ－３’、
配列番号８：３’－ＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴ－５’である。
配列番号７：５’－Ｐｈｏｓ－ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡ－３’、
配列番号８：３’－ＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＴ－５’である。
【0184】
ピペットを用いて３０μＬの調製したリンカー接続反応液をゆっくりと吸引し、末端修復産物に加え、ボルテックス振とうして均一に混合し、瞬時遠心分離して反応液を管底部に収集し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、２３℃、３０ｍｉｎ、４℃、維持した。
【0185】
９．５ 接続産物精製：１．０×のＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いて精製し、且つＱｕｂｉｔ蛍光計を用いて接続産物に対して濃度測定を行った。
【0186】
９．６ リンカー接続産物ＰＣＲ増幅
リンカー接続産物増幅のプライマーの具体的な配列は、
ＦＰ：５’－ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号９）、
ＲＰ：５’－ＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴ－３’（配列番号１０）であり、
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはタグ配列であり、ＮはＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇのいずれかを表し、異なるライブラリーを区別するために用いられる。遠心管に以下の表に従ってＰＣＲ反応混合液を調製した。
リンカー接続産物増幅のプライマーの具体的な配列は、
ＦＰ：５’－ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号９）、
ＲＰ：５’－ＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴ－３’（配列番号１０）であり、
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮはタグ配列であり、ＮはＡ／Ｔ／Ｃ／Ｇのいずれかを表し、異なるライブラリーを区別するために用いられる。遠心管に以下の表に従ってＰＣＲ反応混合液を調製した。
【表6】
【0187】
ピペットを用いて５４μＬの調製したＰＣＲ反応混合液を吸引して精製後の接続産物に加え、ボルテックス振とうして均一に混合し、瞬時遠心分離して反応液を管底部に収集し、ＰＣＲ増幅を行う：９５℃、３ｍｉｎ；１０～１５サイクル（９８℃、２０ｓ；６０℃、２０ｓ；７２℃、３０ｓ）；７２℃、５ｍｉｎ；４℃、維持する。
【0188】
９．７ ＰＣＲ増幅産物断片スクリーニング：（０．６×+０．６×）ＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いて精製し、且つＱｕｂｉｔを用いて産物定量を行った。
【0189】
１０ ハイスループットシークエンシング
１０．１ 変性：２００～４００ｎｇの上記ｃＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４７μＬまで補充し、３μＬ ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ ２（２０μｍ）を加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、５ｓ瞬時遠心分離し、９５℃で３分間反応させ（熱蓋１０５℃）、迅速に氷上に５～１０分間置いた。
（ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ ２：５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧ－３’）（配列番号１１、下線部分の配列は配列番号１０におけるＦＰ配列の最初の１１位と同じである。）。
１０．１ 変性：２００～４００ｎｇの上記ｃＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４７μＬまで補充し、３μＬ ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ ２（２０μｍ）を加え、短時間ボルテックスして均一に混合し、５ｓ瞬時遠心分離し、９５℃で３分間反応させ（熱蓋１０５℃）、迅速に氷上に５～１０分間置いた。
（ｓｐｌｉｎｔ ｏｌｉｇｏ ２：５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＣＡＡＧ－３’）（配列番号１１、下線部分の配列は配列番号１０におけるＦＰ配列の最初の１１位と同じである。）。
【0190】
１０．２ 接続：
上記ＰＣＲチューブを氷浴に置き、以下の表に従って反応系を調製した。
上記ＰＣＲチューブを氷浴に置き、以下の表に従って反応系を調製した。
【表7】
【0191】
調製した接続産物を融解産物に加え、短時間ｖｏｒｔｅｘして均一に混合し、短時間遠心分離し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、熱蓋温度を７５℃とした。
【0192】
１０．３ 酵素切断消化：
一本鎖環化反応が終了しようとするとき、予め以下の表に従って氷上に酵素切断消化反応液を調製した。
一本鎖環化反応が終了しようとするとき、予め以下の表に従って氷上に酵素切断消化反応液を調製した。
【表8】
【0193】
ピペットを用いて４μＬの調製した酵素切断消化反応液を吸引して一本鎖環化産物に加え、短時間ｖｏｒｔｅｘして均一に混合し、瞬時遠心分離し、ＰＣＲチューブをＰＣＲ装置に置き、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、熱蓋温度を７５℃とした。
【0194】
１０．４ 酵素切断終了：酵素切断反応終了後、ＰＣＲチューブに３μＬの終了液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を加え、ｖｏｒｔｅｘして均一に混合し、短時間遠心分離して液体を管底部に収集し、
１０．５ 環化ライブラリー精製：ＰＥＧ３２磁気ビーズを用いて環化産物を精製し、Ｑｕｂｉｔ蛍光計を用いて精製後の産物を定量し、ライブラリー質量＞０．５ｎｇ／μＬを要求し、ライブラリー検出に合格し、ＭＧＩＳＥＱ２０００ハイスループットシーケンサーを用いてシークエンシングを行った。
１０．５ 環化ライブラリー精製：ＰＥＧ３２磁気ビーズを用いて環化産物を精製し、Ｑｕｂｉｔ蛍光計を用いて精製後の産物を定量し、ライブラリー質量＞０．５ｎｇ／μＬを要求し、ライブラリー検出に合格し、ＭＧＩＳＥＱ２０００ハイスループットシーケンサーを用いてシークエンシングを行った。
【0195】
（実施例２）５’端ＲＮＡ単一細胞シークエンシング
本実施例は、図２に示す原理フローに従って調製し、具体的には以下のとおりである。
本実施例は、図２に示す原理フローに従って調製し、具体的には以下のとおりである。
【0196】
（一）単一細胞ｍＲＮＡ捕捉及び第１鎖ｃＤＮＡ合成
ステップは前の完全長ＲＮＡシークエンシングステップと一致する。
ステップは前の完全長ＲＮＡシークエンシングステップと一致する。
【0197】
（二）ｃＤＮＡ増幅のステップは以下のとおりである。
１ ＰＣＲ反応系調製：４２μＬ Ｈ２Ｏ、４μＬ １０μＭ Ｔｎプライマー（即ち前述リンカー増幅プライマー配列番号２）、４μＬ ＴＳＯプライマー（即ち前述配列番号４）、５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘ。
１ ＰＣＲ反応系調製：４２μＬ Ｈ２Ｏ、４μＬ １０μＭ Ｔｎプライマー（即ち前述リンカー増幅プライマー配列番号２）、４μＬ ＴＳＯプライマー（即ち前述配列番号４）、５０μＬ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘ。
【0198】
２ 下記の条件に従ってＰＣＲ反応を行った：９５℃、３ｍｉｎ；１３～２０サイクル（９８℃、２０ｓ；５８℃、２０ｓ；７２℃、３ｍｉｎ）；７２℃、５ｍｉｎ；４℃、維持する。
【0199】
３ ＰＣＲ終了後、６０μｌ（０．６Ｘ）ＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（室温で３０ｍｉｎ前平衡化する。）を用いてＰＣＲ産物を精製回收した。
【0200】
４ Ｑｕｂｉｔ蛍光計を用いてＰＣＲ精製産物を定量し及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザを用いて断片の分布状況を検出した（細胞株サンプル及び固形組織サンプルはそれぞれ図５Ａ及び５Ｂを参照）。
【0201】
（三）ｃＤＮＡ環化
環化過程は上記完全長ＲＮＡシークエンシングステップと同じである。
環化過程は上記完全長ＲＮＡシークエンシングステップと同じである。
【0202】
（四）５’ＲＮＡ増幅
１、初期に１０～５０ｎｇの環化ＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４２μｌまで補充し、４μＬ ２０μＭ ｐｏｌｙ（Ａ）プライマー（配列番号６：５’－ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）、４μＬ ２０μＭ ＴＣＲ／ＢＣＲプライマー（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖ（Ｄ）Ｊ 配列：ＰＮ－１０００００５，ＰＮ－１００００１６）又はランダムプライマー（５’－ＮＮＮＮＮＮ－３’）、５０ｕｌ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘを加えた。
１、初期に１０～５０ｎｇの環化ＤＮＡ産物を取り、ＮＦ－Ｈ２Ｏで体積を４２μｌまで補充し、４μＬ ２０μＭ ｐｏｌｙ（Ａ）プライマー（配列番号６：５’－ｐｈｏｓ－ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’）、４μＬ ２０μＭ ＴＣＲ／ＢＣＲプライマー（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖ（Ｄ）Ｊ 配列：ＰＮ－１０００００５，ＰＮ－１００００１６）又はランダムプライマー（５’－ＮＮＮＮＮＮ－３’）、５０ｕｌ ２ｘ ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ ｍｉｘを加えた。
【0203】
２ 下記の条件に従ってＰＣＲ反応を行った：９５℃、３ｍｉｎ；１３～２０サイクル（９８℃、２０ｓ；６０℃、２０ｓ；７２℃、３０ｓ）；７２℃、５ｍｉｎ；４℃、維持する。
【0204】
３ ０．５×+１．０×のＶＡＨＴＳＴＭ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ磁気ビーズを用いてＰＣＲ産物精製を行い、スクリーニングされた断片をＱｕｂｉｔ定量し及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザを用いて断片の分布状況を検出した（細胞株サンプル及び固形組織サンプルはそれぞれ図７Ａ及び７Ｂを参照し、ここで図７ＡはＴＣＲ特異的プライマー増幅の２１００検出結果を示し、図７ＢはＢＣＲ特異的プライマー増幅の２１００検出結果を示す）。
【0205】
（五）ｃＤＮＡ ５’ライブラリー構築（後続のステップは実施例１と同じであり、説明を省略する）。
検出及び検証：
実施例２で構築されたライブラリーに対してＭＧＩシークエンシングプラットフォームのシークエンシング機器を採用してシークエンシングし、且つオフラインデータの５’端及び３’端のシークエンシング断片による転写産物のカバレッジ状況を解析し、具体的な結果を図８に示す。ここで、階調が浅いのは５’端のカバレッジ状況に対応し、階調が深いのは３’端のカバレッジ状況に対応する。図８から分かるように、本発明の方法は、転写産物５’端及び３’端の情報を効果的に捕捉することができる。
検出及び検証：
実施例２で構築されたライブラリーに対してＭＧＩシークエンシングプラットフォームのシークエンシング機器を採用してシークエンシングし、且つオフラインデータの５’端及び３’端のシークエンシング断片による転写産物のカバレッジ状況を解析し、具体的な結果を図８に示す。ここで、階調が浅いのは５’端のカバレッジ状況に対応し、階調が深いのは３’端のカバレッジ状況に対応する。図８から分かるように、本発明の方法は、転写産物５’端及び３’端の情報を効果的に捕捉することができる。
【0206】
以上の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者によって種々の変更及び変形が可能である。本発明の趣旨及び原理を逸脱しない範囲でなされた任意の修正、均等物、改良などは、本発明の保護範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0015】
さらに、マイクロビーズタグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ、第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、第２ＰＣＲリンカーは第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、第２細胞タグは第１細胞タグと相補的であり、第２唯一分子標識は第１唯一分子標識と相補的である。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0047】
さらに、ＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカーはバブルリンカーから選ばれ、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーはＰ５及びＰ７リンカーから選ばれる。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0050】
さらに、支持体タグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含む。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0084】
上記好ましい実施例では、単一細胞を捕捉するためのマイクロビーズ上のマイクロビーズタグ配列は好ましくは５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、第２ＰＣＲリンカーは第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、第２細胞タグは第１細胞タグと相補的であり、第２唯一分子標識は第１唯一分子標識と相補的である。つまり、第１鎖ｃＤＮＡの５’末端にマイクロビーズタグ配列を付けるが、増幅して得られた第２鎖ｃＤＮＡの３’末端に当該マイクロビーズタグ配列と相補的なｃＤＮＡタグ配列を付ける。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0105】
ｍＲＮＡの５’端の任意の位置から３’端の配列断片を得ることを可能にし、これにより不均一なサイズの複数の断片により、ｍＲＮＡ完全長を包含する全ての断片を獲得し、それにより５’端のシークエンシング又は完全長のシークエンシングを実現する。そのため、本出願の好ましい実施例では、上記キットは、ＴＳＯプライマー、ＴＳＯ－ランダムプライマー及びリンカー増幅プライマーをさらに含む。好ましくは、リンカー増幅プライマーの配列は、配列番号２であり、ＴＳＯプライマーの配列は、配列番号３であり、ＴＳＯ－ランダムプライマーは、配列番号４である。リンカー増幅プライマーは、第２ｃＤＮＡ鎖３’端（ｍＲＮＡ ３’端に対応する。）のｃＤＮＡタグ配列と結合することができるが、ＴＳＯ－ランダムプライマーは第１鎖ｃＤＮＡ ３’端（ｍＲＮＡ ５’端に対応する。）の任意の位置に結合することができ、それにより不均一なサイズのｃＤＮＡ断片を得ることができる。
【手続補正6】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法であって、ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、前記一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップと、
前記一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、
ランダムプライマー又は遺伝子特異的プライマーとｃＤＮＡタグプライマーとからなるプライマー組合せを利用して前記一本鎖環化ｃＤＮＡを増幅し、増幅断片を得るステップであって、前記ｃＤＮＡタグプライマーは前記ｃＤＮＡタグ配列の少なくとも一部であるステップと、
前記増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップと、を含む、ことを特徴とするＲＮＡシークエンシングライブラリーの構築方法。
【請求項2】
ｍＲＮＡの逆転写産物である一本鎖ｃＤＮＡを取得するステップであって、前記一本鎖ｃＤＮＡの３’端にｃＤＮＡタグ配列を含むステップは、前記ｍＲＮＡを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを得るステップと、
前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、二本鎖ｃＤＮＡを得るステップであって、前記第１鎖ｃＤＮＡと相補的な第２鎖ｃＤＮＡの３’端に前記ｃＤＮＡタグ配列を含み、前記ｃＤＮＡタグ配列がｐｏｌｙ（Ａ）を含むステップと、
前記二本鎖ｃＤＮＡを融解し、前記一本鎖ｃＤＮＡを得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項3】
前記ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及び前記ｐｏｌｙ（Ａ）を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項4】
前記ｍＲＮＡは単一細胞サンプル由来であり、前記ｍＲＮＡは単一細胞ｍＲＮＡである、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項5】
前記単一細胞ｍＲＮＡが固相支持体に接続するように、液滴法を採用して前記単一細胞ｍＲＮＡを調製し、好ましくは前記固相支持体はマイクロビーズである、ことを特徴とする請求項４に記載の構築方法。
【請求項6】
前記単一細胞ｍＲＮＡが前記マイクロビーズに接続するように、液滴法を採用して前記単一細胞ｍＲＮＡを調製するステップは、それぞれ単一細胞懸濁液及び前記マイクロビーズを提供するステップであって、前記マイクロビーズにマイクロビーズタグ配列を付け、前記マイクロビーズタグ配列の末端にｐｏｌｙ（ｄＴ）を含むステップと、
前記単一細胞懸濁液及び前記マイクロビーズを液滴に包み込み、各液滴に１つの単一細胞及び１つの前記マイクロビーズを含み、前記マイクロビーズがｐｏｌｙ（ｄＴ）を介して前記単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡのｐｏｌｙ（Ａ）と結合することにより、前記単一細胞懸濁液中のｍＲＮＡを前記マイクロビーズに接続し、前記単一細胞ｍＲＮＡを得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の構築方法。
【請求項7】
前記マイクロビーズタグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識及び前記ｐｏｌｙ（ｄＴ）を含み、それに対応して、前記ｃＤＮＡタグ配列は３’から５’方向に順次第２ＰＣＲリンカー、第２細胞タグ，第２唯一分子標識及びｐｏｌｙ（Ａ）を含み、ここで、前記第２ＰＣＲリンカーは前記第１ＰＣＲリンカーと相補的であり、前記第２細胞タグは前記第１細胞タグと相補的であり、前記第２唯一分子標識は前記第１唯一分子標識と相補的である、ことを特徴とする請求項６に記載の構築方法。
【請求項8】
前記一本鎖ｃＤＮＡの５’端にＴＳＯプライマーの配列を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項9】
逆転写酵素及びＴＳＯリンカーを採用して前記ｍＲＮＡを逆転写することにより、前記第１鎖ｃＤＮＡを獲得し、ここで、前記逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有し、前記第１鎖ｃＤＮＡの３’端に前記ＴＳＯリンカーの相補配列を含み、前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記第２鎖ｃＤＮＡを獲得し、前記第２鎖ｃＤＮＡの５’端に前記ＴＳＯプライマーの配列を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の構築方法。
【請求項10】
前記ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である、ことを特徴とする請求項９に記載の構築方法。
【請求項11】
前記逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(登録商標)ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる、ことを特徴とする請求項９に記載の構築方法。
【請求項12】
前記第１鎖ｃＤＮＡに対してランダム増幅及び／又は完全長増幅を行い、前記二本鎖ｃＤＮＡを得る、ことを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項13】
リンカー増幅プライマー及びＴＳＯプライマーを採用して前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記二本鎖ｃＤＮＡを得るか、又はリンカー増幅プライマー、ＴＳＯ－ランダムプライマー及び前記ＴＳＯプライマーを採用して前記第１鎖ｃＤＮＡを増幅し、前記二本鎖ｃＤＮＡを得る、ことを特徴とする請求項１２に記載の構築方法。
【請求項14】
前記リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、前記ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３であり、前記ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である、ことを特徴とする請求項１３に記載の構築方法。
【請求項15】
前記一本鎖ｃＤＮＡを環化し、一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップは、環化補助配列及びリガーゼの作用下で前記一本鎖ｃＤＮＡをループにさせるように接続し、接続産物を得るステップと、
前記接続産物を酵素切断してループにさせるように接続していない一本鎖ｃＤＮＡを消化し、前記一本鎖環化ｃＤＮＡを得るステップと、を含み、
ここで、前記環化補助配列は前記一本鎖ｃＤＮＡの両端の配列と相補的である、ことを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の構築方法。
【請求項16】
前記環化補助配列は配列番号５から選ばれる、ことを特徴とする請求項１５に記載の構築方法。
【請求項17】
前記遺伝子特異的プライマーはＴＣＲ遺伝子増幅に対するＴＣＲプライマー及び／又はＢＣＲ遺伝子増幅に対するＢＣＲプライマーである、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項18】
前記ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーであり、好ましくは配列番号６である、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項19】
前記増幅断片に対して断片化ライブラリー構築を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップは、前記増幅断片にライブラリーリンカーを付加し、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得るステップを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の構築方法。
【請求項20】
前記増幅断片に対して酵素切断断片化を行い、酵素切断断片を獲得し、前記酵素切断断片に対して順次末端修復、Ａ付加及びライブラリーリンカー接続を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得る、ことを特徴とする請求項１９に記載の構築方法。
【請求項21】
前記ライブラリーリンカーの接続を行った後、さらに、前記ライブラリーリンカーの接続産物に対してＰＣＲ増幅を行い、前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーを得ることを含む、ことを特徴とする請求項１９又は２０に記載の構築方法。
【請求項22】
前記ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである、ことを特徴とする請求項１９に記載の構築方法。
【請求項23】
環化補助配列と、ＤＮＡリガーゼと、ｃＤＮＡタグプライマーと、及び（ａ）ランダムプライマー、（ｂ）ＴＣＲプライマー、（ｃ）ＢＣＲプライマーのうちの少なくとも１つとを含む、ことを特徴とするＲＮＡライブラリー構築キット。
【請求項24】
前記キットはＲＮＡ逆転写試薬をさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項25】
前記ＲＮＡ逆転写試薬はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素である逆転写酵素を含む、ことを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項26】
前記逆転写酵素はＭＧＩのＡｌｐｈａ逆転写酵素、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ又はＭａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓから選ばれる、ことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項27】
前記ＲＮＡ逆転写試薬はＴＳＯリンカーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項28】
前記ＴＳＯリンカーの配列は配列番号１である、ことを特徴とする請求項２７に記載のキット。
【請求項29】
前記キットはＴＳＯプライマー及びリンカー増幅プライマーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項30】
前記リンカー増幅プライマーの配列は配列番号２であり、前記ＴＳＯプライマーの配列は配列番号３である、ことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項31】
前記キットはＴＳＯ－ランダムプライマーをさらに含む、ことを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項32】
前記ＴＳＯ－ランダムプライマーの配列は配列番号４である、ことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
前記環化補助配列は配列番号５である、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項34】
前記ｃＤＮＡタグプライマーはｐｏｌｙ（Ａ）プライマーである、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項35】
前記ｃＤＮＡタグプライマーの配列は配列番号６である、ことを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
前記キットはエキソヌクレアーゼ及びライブラリーリンカーのうちの少なくとも１つをさらに含む、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項37】
前記エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩから選ばれる、ことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
前記ライブラリーリンカーはＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカー又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーである、ことを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項39】
前記ＭＧＩシークエンシングプラットフォームのリンカーはバブルリンカーから選ばれ、前記ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットフォームのリンカーはＰ５及びＰ７リンカーから選ばれる、ことを特徴とする請求項３８に記載のキット。
【請求項40】
前記ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼから選ばれる、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項41】
前記キットは固相支持体をさらに含み、前記固相支持体に支持体タグ配列が設置され、但し、前記ｃＤＮＡタグプライマーは前記支持体タグ配列の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは、前記固相支持体はマイクロビーズであり、前記支持体タグ配列はマイクロビーズタグ配列である、ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項42】
前記支持体タグ配列は５’から３’方向に順次第１ＰＣＲリンカー、第１細胞タグ、第１唯一分子標識及びｐｏｌｙ（ｄＴ）を含む、ことを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項43】
請求項１から２２のいずれか一項に記載のＲＮＡシークエンシングライブラリー構築方法を採用してＲＮＡシークエンシングライブラリーを構築し、及び前記ＲＮＡシークエンシングライブラリーをシークエンシングするステップを含む、ことを特徴とするＲＮＡライブラリーのシークエンシング方法。
【手続補正7】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1】
【国際調査報告】