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▶ フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】環状ポリリボヌクレオチドを濃縮する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240524BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240524BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12Q1/6806 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023571508
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 US2022029773
(87)【国際公開番号】W WO2022245901
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/190,001
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520445473
【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】コトラー，ランディ・ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】サロモン，ウィリアム・エドワード
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR14
4B063QS16
4B063QX02
(57)【要約】
本開示の方法を使用して、線状ポリリボヌクレオチドと、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとの混合物中の環状ポリリボヌクレオチド集団を濃縮することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、（ａ）環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を提供すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩが前記線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼと反応させることであって、前記エキソヌクレアーゼが前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成すること
を含み、
前記第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法。
【請求項2】
消化するステップ（ｂ）のＤＮアーゼＩが、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇの量である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
消化するステップ（ｂ）が、少なくとも１０分間実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
消化するステップ（ｂ）が約３７℃の温度で実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
消化するステップ（ｃ）の前記エキソヌクレアーゼが、５’エキソヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
消化するステップ（ｃ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記５’エキソヌクレアーゼが、Ｘｒｎ－１である、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｘｒｎ－１が、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇの量である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
消化するステップ（ｃ）の前記エキソヌクレアーゼが、３’エキソヌクレアーゼである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記３’エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＴである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
消化するステップ（ｃ）が、少なくとも１時間実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
消化するステップ（ｃ）が、約３７℃の温度で実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、（ａ）５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、前記線状ポリリボヌクレオチドの前記５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び前記線状ポリリボヌクレオチドの前記３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供すること、
（ｂ）前記線状ポリリボヌクレオチドの前記５’末端を前記線状ポリリボヌクレオチドの前記３’末端にライゲートし、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を作製すること；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、前記ＤＮアーゼＩが前記ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼと反応させることであって、前記エキソヌクレアーゼが前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成すること
を含み、
前記第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法。
【請求項14】
消化するステップ（ｃ）のＤＮアーゼＩが、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇの量である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
消化するステップ（ｃ）が、少なくとも１０分間実施される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
消化するステップ（ｃ）が、約３７℃の温度で実施される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
消化するステップ（ｄ）の前記エキソヌクレアーゼが、５’エキソヌクレアーゼである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
消化するステップ（ｄ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記５’エキソヌクレアーゼが、Ｘｒｎ－１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記Ｘｒｎ－１が、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇの量である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
消化するステップ（ｄ）の前記エキソヌクレアーゼが、３’エキソヌクレアーゼである、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記３’エキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＴである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
消化するステップ（ｄ）が、少なくとも１時間実施される、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
消化するステップ（ｄ）が、約３７℃の温度で実施される、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが５，３５８バイトである２０２２年５月１６日に作成された５１５０９－０４１ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿１６＿２２＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが５，３５８バイトである２０２２年５月１６日に作成された５１５０９－０４１ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿１６＿２２＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増加を示すため、線状ポリリボヌクレオチドと比較して半減期が長くなる。環状ポリリボヌクレオチドは内因的に発生することが公知であり、又は外因的に環状化することもできる。外因的な環状化反応では、結果として、環状化に成功したポリリボヌクレオチドに一部の残留している線状ポリリボヌクレオチドが加わった混合物が生じる。医薬品としての環状ポリリボヌクレオチド調製物中に線状ポリリボヌクレオチドが存在すると、予期せぬ望ましくない効果がもたらされ得る。したがって、線状ポリリボヌクレオチドと比べて環状ポリリボヌクレオチドを濃縮し、分離し、及び／又は精製する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。詳細には、本開示は、線状ポリリボヌクレオチドと、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとの混合物から、線状ポリデオキシリボヌクレオチドをＤＮアーゼＩで消化した後、続いて線状ポリリボヌクレオチドを５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼで消化することにより環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。
【0004】
ある態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を提供すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；及び第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼと反応させることであって、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し第２の消化された混合物を生成することを含み、第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法を提供する。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩは、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。
【0005】
一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩ消化するステップは、少なくとも１０分（例えば、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも１２時間、及び少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩ消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0006】
一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化するエキソヌクレアーゼは、５’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、Ｘｒｎ－１は、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。
【0007】
一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化するエキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＴである。
【0008】
一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成するという消化するステップは、少なくとも１時間（例えば、少なくとも９０分、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、及び少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し第２の消化された混合物を生成するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0009】
別の態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供すること、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートし、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を作製すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩがポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼと反応させることであって、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成することを含み、第２の消化された混合物が環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法を提供する。
【0010】
一部の実施形態において、第１の消化された混合物を産生するため線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化するＤＮアーゼＩは、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成するという消化するステップは、少なくとも１０分（例えば、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも１２時間、及び少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0011】
一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化するエキソヌクレアーゼは、５’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、Ｘｒｎ－１は、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。一部の実施形態において、第２の消化された混合物を産生するため線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化するエキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＴである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成するという消化するステップは、少なくとも１時間（例えば、少なくとも９０分、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、及び少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0012】
定義
本発明の理解を容易にするため、以下にいくつもの用語を定義する。本明細書に定義される用語は、本発明が関係する領域の当業者が一般に理解するとおりの意味を有する。「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図するものではなく、説明のためにその具体的な例が用いられ得る一般的な分類を包含する。本明細書の用語法は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、特許請求の範囲に概要が示される場合を除いては、その用法が本発明を限定することはない。
本発明の理解を容易にするため、以下にいくつもの用語を定義する。本明細書に定義される用語は、本発明が関係する領域の当業者が一般に理解するとおりの意味を有する。「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図するものではなく、説明のためにその具体的な例が用いられ得る一般的な分類を包含する。本明細書の用語法は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、特許請求の範囲に概要が示される場合を除いては、その用法が本発明を限定することはない。
【0013】
本明細書で使用されるとき、値の範囲として提供される任意の値は、上限及び下限の両方、並びに上限及び下限の範囲内に含まれる任意の値を包含する。
【0014】
本明細書で使用されるとき、用語「３’エキソヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の３’末端から始まり、ヌクレオチド鎖の５’末端に向かって連続的に進む加水分解を用いて酵素がヌクレオチド鎖からヌクレオチドを取り除くようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を指す。３’エキソヌクレアーゼとしては、限定はされないが、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＲ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩが挙げられる。
【0015】
本明細書で使用されるとき、用語「５’エキソヌクレアーゼ」は、ヌクレオチド鎖の５’末端から始まり、ヌクレオチド鎖の３’末端に向かって連続的に進む加水分解を用いて酵素がヌクレオチド鎖からヌクレオチドを取り除くようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を指す。５’エキソヌクレアーゼとしては、限定はされないが、Ｘｒｎ－１、λエキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）が挙げられる。
【0016】
本明細書で使用されるとき、用語「５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼ」は、５’から３’に進みながら５’一リン酸を有するポリヌクレオチドを消化するエキソヌクレアーゼを指す（例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）及びＸｒｎ－１）。
【0017】
本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ」、「環状ポリリボヌクレオチド」、「環状ＲＮＡ」及び「環状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、遊離末端を有していない（即ち、遊離３’又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
【0018】
本明細書で使用されるとき、「環状化効率」という用語は、得られた環状ポリリボヌクレオチドのその非環状出発物質に対する測定値である。
【0019】
本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ調製物」、「環状ポリリボヌクレオチド調製物」及び「環状ＲＮＡ調製物」という用語は、互換的に使用され、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と、希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はそれらの組み合わせを含む組成物を意味する。
【0020】
本明細書で使用されるとき、用語「消化された混合物」とは、線状ポリリボヌクレオチドと、環状ポリリボヌクレオチドと、任意選択で線状ポリデオキシリボヌクレオチドとの混合物を消化用酵素（例えば、ＤＮアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼ）と接触させることにより産生される、線状ポリリボヌクレオチドと、環状ポリリボヌクレオチドと、任意選択で線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含む混合物を指す。
【0021】
本明細書で使用されるとき、用語「濃縮された集団」とは、環状及び線状ポリリボヌクレオチドの別の集団と比較して環状ポリリボヌクレオチドのパーセントが高いポリリボヌクレオチドの集団を指す。
【0022】
本明細書で使用されるとき、用語「断片」及び「一部分」は、ポリヌクレオチド分子よりも少なくとも１ヌクレオチド短いポリヌクレオチド分子の任意の一部を意味する。例えば、ヌクレオチド分子は線状ポリリボヌクレオチド分子であってもよく、及びその断片は、モノリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチド分子の一部分である任意の数の隣接ポリリボヌクレオチドであってもよい。
【0023】
本明細書で使用されるとき、「不純物」という用語は、組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物中に存在する望ましくない物質である。一部の実施形態において、不純物は、プロセス関連不純物である。一部の実施形態において、不純物は、最終組成物中の所望の産物以外、例えば活性薬物成分、例えば、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチド以外の産物関連物質である。本明細書で使用されるとき、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド以外の最終組成物、調製物、又は製品では望ましくない、組成物、調製物、又は製品の製造で使用される、存在する、又は生成される物質である。一部の実施形態において、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化に使用される酵素である。本明細書で使用されるとき、「産物関連物質」という用語は、組成物、調製物、又は製品、又はそれらの任意の中間体の合成中に生成される物質又は副産物である。一部の実施形態において、産物関連物質はデオキシリボヌクレオチド断片である。一部の実施形態において、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。一部の実施形態において、産物関連物質は、１つ又は複数の本明細書に記載のポリリボヌクレオチドの誘導体又は断片、例えば、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、又は４つのリボ核酸、モノリボ核酸、ジリボ核酸、又はトリリボ核酸の断片である。
【0024】
本明細書で使用されるとき、「線状対応物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。一部の実施形態において、線状対応物（例えば、環状化前の型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び同じ又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。一部の実施形態において、線状対応物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び異なる核酸修飾を有するか、又は環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有するが核酸修飾を有しておらず、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。一部の実施形態において、線状対応物であるポリリボヌクレオチド分子の断片は、線状対応物ポリリボヌクレオチド分子よりも短い線状対応物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。一部の実施形態において、線状対応物は、５’キャップをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、３’ＵＴＲをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
【0025】
本明細書で使用されるとき、「線状ＲＮＡ」、「線状ポリリボヌクレオチド」及び「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’末端及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であってもよいし、又は別の部分に結合していてもよい。線状ＲＮＡは、環状化されていない（例えば、事前に環状化されていない）ＲＮＡを含み、例えば、スプリントライゲーション、又は化学的、酵素的、リボザイム又はスプライシング触媒による環状化法による環状化のための出発物質として使用することができる。
【0026】
本明細書で使用されるとき、「混合物」という用語は、混合された２つ以上の異なる物質からなる材料を意味する。場合によっては、本明細書に記載の混合物は、２つ以上の異なる物質の均一な混合物であり得、例えば、混合物は、混合物の任意の所与のサンプル全体で、その成分（例えば、２つ以上の物質）が同じ割合を有し得る。場合によっては、本明細書で提供される混合物は、２つ以上の異なる物質の不均一な混合物であり得、例えば、混合物の成分（例えば、２つ以上の物質）の割合は、混合物全体で異なり得る。ある場合には、混合物は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含む。一部の実施形態において、この混合物は、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド、及び線状ポリデオキシリボヌクレオチドを含む。場合によっては、混合物は溶液であり、例えば、混合物は液相で存在する。場合によっては、液体溶液は、液体溶媒及び溶質を含むとみなすことができる。溶質を液体溶媒に混合することは、「溶解」プロセスと呼ぶことができる。場合によっては、液体溶液は、液体中に液体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した液体溶質）、液体中に固体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）、又は液体中に気体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）である。場合によっては、複数の溶媒及び／又は複数の溶質が存在する。場合によっては、混合物は、コロイド、液体懸濁液、又はエマルジョンである。場合によっては、混合物は固体混合物であり、例えば、混合物は固相で存在する。
【0027】
本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対して少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを意味する。
【0028】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド又はリボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。
【0029】
ポリデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボ核酸、又はＤＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグやマーカーなどの検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア）を含む、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択することができるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ、或いは、１つ又は複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ、又はその変異体）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、又はＵ、又はその変異体）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの誘導体若しくは変異体である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列、及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピンなどのその任意の構造的実施形態の両方を包含する。場合によっては、ポリヌクレオチド分子は環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離することができる。本明細書で具体化されるように、ポリヌクレオチド配列は、単離及び精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。
【0030】
ポリヌクレオチド、例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む１つ又は複数のヌクレオチド変異体を含み得る。修飾ヌクレオチドには、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分の修飾（例えば、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つ又は複数の原子で、及び／又は典型的には相補的なヌクレオチドとの水素結合を形成できない１つ又は複数の原子で）修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ ａｌｌｙ １）－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含み得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、高い１立方ｍｍ当たりのビット密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は下位二次構造を提供し得る。デノボ及び／又は増幅合成のための天然及び突然変異ポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４に記載されている。
【0031】
本明細書で使用されるとき、「疑似らせん状構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれている。
【0032】
本明細書で使用されるとき、用語「スプリントライゲーション反応産物」とは、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供すること、及び線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることの結果として産生される、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含む組成物を指す。
【0033】
本明細書で使用されるとき、用語「全リボヌクレオチド分子」及び「全ポリリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチド分子の全質量によって測定されるとおりの、線状ポリリボヌクレオチド分子、環状ポリリボヌクレオチド分子、単量体リボヌクレオチド、他のポリリボヌクレオチド分子、その断片、及びその修飾された変種を含めた、任意のリボヌクレオチド分子の総量を意味する。
【0034】
本明細書で使用されるとき、用語「単位」は、表１に酵素毎にまとめられるアッセイ方法の指定された方法の下、定義された触媒活性を果たすのに必要な酵素の量を指す。
【0035】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】Ｘｒｎ－１によって消化される線状ＲＮＡ（サイズ約２．５ｋｂ）の経時的変化を示す。
【図2】リガーゼなしに環状化プロセスを受けたＲＮＡのＸｒｎ－１消化の結果を示す。
【図3】環状化後のＲＮＡのＤＮアーゼＩ及びＸｒｎ－１処理の結果を示す。
【図4】酵素的精製方法によるスケールアップした環状化ＲＮＡの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法を使用すると、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を提供すること、及びスプリントライゲーション産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること、及び第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と反応させることであって、エキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）が線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物であって、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む混合物を生成することにより、環状ポリリボヌクレオチド集団を濃縮し得る。本開示はまた、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズするポリデオキシリボヌクレオチドとを提供すること、及び線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートし、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を作製すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと接触させることであって、ＤＮアーゼＩがポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；及び第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と接触させることであって、エキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）が線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物であって、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む混合物を生成することにより、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法も提供する。
【0038】
スプリントライゲーション反応産物は、線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分が消化されることを可能にするのに十分な濃度、時間、及び温度でＤＮアーゼＩと反応させてもよい。第１の消化された混合物は、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分が消化されることを可能にするのに十分な濃度、時間、及び温度でエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と反応させてもよい。
【0039】
環状ポリリボヌクレオチドを濃縮する方法
一態様において本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を提供すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；及び第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と反応させることであって、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成することを含み、第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法を提供する。
一態様において本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を提供すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩが線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；及び第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と反応させることであって、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成することを含み、第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法を提供する。
【0040】
別の態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートし、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物を作製すること；スプリントライゲーション反応産物をＤＮアーゼＩと反応させることであって、ＤＮアーゼＩがポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第１の消化された混合物を生成すること；第１の消化された混合物をエキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と反応させることであって、エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化し、第２の消化された混合物を生成することを含み、第２の消化された混合物が、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を含む、方法を提供する。
【0041】
ＤＮアーゼＩ消化
ある態様において、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物は、ＤＮアーゼＩと反応させる。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩは、線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する。
ある態様において、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物は、ＤＮアーゼＩと反応させる。一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩは、線状ポリデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する。
【0042】
一部の実施形態において、ＤＮアーゼＩは、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。一部の実施形態において、スプリントライゲーション反応産物のＤＮアーゼＩ消化は、少なくとも１０分（例えば、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも４５分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、１０分～２４時間、１０分～１８時間、１０分～１２時間、１０分～６時間、１０分～２時間、１０分及び１時間、１０分～４５分、１０分～３０分、１０分～１５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、スプリントライゲーション産物とのＤＮアーゼＩの反応は、３０℃～４２℃（例えば、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、及び約４１℃）の温度で実施される。一部の実施形態において、スプリントライゲーション産物とのＤＮアーゼＩの反応は、約３７℃の温度で実施される。
【0043】
エキソヌクレアーゼ消化
ある態様において、スプリントライゲーション混合物がＤＮアーゼＩと反応することにより産生される第１の消化された混合物は、エキソヌクレアーゼと反応させる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する。
ある態様において、スプリントライゲーション混合物がＤＮアーゼＩと反応することにより産生される第１の消化された混合物は、エキソヌクレアーゼと反応させる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する。
【0044】
一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、エキソリボヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１、ＲＮアーゼＲ、エキソヌクレアーゼＴ、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、ＲＮアーゼＤ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、５’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｘｒｎ－１又はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、λエキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｔ７エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＶＩＩである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＴである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＤである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＲである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、エキソリボヌクレアーゼＩＩである。
【0045】
一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。一部の実施形態において、Ｘｒｎ－１は、０．１Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ（例えば、０．１Ｕ／μｇ～０．８Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．６Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．４Ｕ／μｇ、０．１Ｕ／μｇ～０．２Ｕ／μｇ、０．２Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．４Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、０．６Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ、又は０．８Ｕ／μｇ～１Ｕ／μｇ）の量である。一部の実施形態において、スプリントライゲーション混合物がＤＮアーゼＩと反応することにより産生される第１の消化された混合物とのエキソヌクレアーゼの反応は、少なくとも１時間（例えば、１時間～２４時間、１時間～２０時間、１時間～１６時間、１時間～１２時間、１時間～１１時間、１時間～１０時間、１時間～９時間、１時間～８時間、１時間～７時間、１時間～６時間、１時間～５時間、１時間～４時間、１時間～３時間、及び１時間～２時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、スプリントライゲーション混合物がＤＮアーゼＩと反応することにより産生される第１の消化された混合物とのエキソヌクレアーゼの反応は、３０℃～４２℃（例えば、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、及び約４１℃）の温度で実施される。一部の実施形態において、スプリントライゲーション混合物がＤＮアーゼＩと反応することにより産生される第１の消化された混合物とのエキソヌクレアーゼの反応は、約３７℃の温度で実施される。
【0046】
環状ポリリボヌクレオチド
本開示は、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド及び線状ポリデオキシリボヌクレオチドの混合物から濃縮されてもよい環状ポリリボヌクレオチド集団を提供する。
本開示は、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド及び線状ポリデオキシリボヌクレオチドの混合物から濃縮されてもよい環状ポリリボヌクレオチド集団を提供する。
【0047】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの要素のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いている）か、遊離３’末端を欠いているか、ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフを欠いているか、又はこれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に開示されるとおりの任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを含む。
【0048】
一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。
【0049】
一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームの結合部位を収容するのに十分なサイズであり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、環状ポリリボヌクレオチドを生成する、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内の大きさであり得る。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントをＤＮＡから生成し、それらの５’及び３’遊離末端をアニールしてＲＮＡの「ストリング」を生成することが可能であり、これが最終的に環状化して、１つの５遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残り得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングして標的に送達する能力によって制限され得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
【0050】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、つまり、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた程度、例えば、エキソヌクレアーゼが存在しないときと同等又は同様の程度にしか分解されないことを意味し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドはエキソヌクレアーゼによって分解されない。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されたときの分解が低下している。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
【0051】
発現配列
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。かかるペプチドには、限定はされないが、小ペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が含まれ得る。ペプチドは線状又は分枝状であってもよい。かかるペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにかかる化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容可能な形態を有し得る。かかるペプチドには、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。かかるペプチドには、限定はされないが、小ペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が含まれ得る。ペプチドは線状又は分枝状であってもよい。かかるペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにかかる化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容可能な形態を有し得る。かかるペプチドには、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。
【0052】
コードされるポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸、又はこれらの間にある任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００アミノ酸未満、約３５，０００アミノ酸未満、約３０，０００アミノ酸未満、約２５，０００アミノ酸未満、約２０，０００アミノ酸未満、約１５，０００アミノ酸未満、約１０，０００アミノ酸未満、約９，０００アミノ酸未満、約８，０００アミノ酸未満、約７，０００アミノ酸未満、約６，０００アミノ酸未満、約５，０００アミノ酸未満、約４，０００アミノ酸未満、約３，０００アミノ酸未満、約２，５００アミノ酸未満、約２，０００アミノ酸未満、約１，５００アミノ酸未満、約１，０００アミノ酸未満、約９００アミノ酸未満、約８００アミノ酸未満、約７００アミノ酸未満、約６００アミノ酸未満、約５００アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３００アミノ酸未満の長さを有するか、又はそれ未満が有用であり得る。
【0053】
ポリペプチドは、相当量で作製されてもよい。このように、ポリペプチドは、作製することのできる任意のタンパク質性分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌させることのできる、又は細胞の細胞質、核、若しくは膜成分に局在させることのできるポリペプチドであってもよい。一部のポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部分、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節するもの）、抗原、サイトカイン、毒素、それが存在しないことが疾患に関連する酵素、及び動物では（例えば、動物の腸において）切断されるまで活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
【0054】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る治療用タンパク質は、抗酸化活性、結合、カーゴ受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節因子、分子伝達因子活性、栄養素貯蔵活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節因子活性、翻訳調節因子活性、又は輸送体活性を有する。治療用タンパク質の一部の例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補給用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば癌）、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害因子（例えば、オンコプロテインの阻害因子）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害因子、核内受容体活性化因子又は阻害因子、プロテアソーム阻害因子、酵素の競合阻害因子、タンパク質合成エフェクター又は阻害因子、ヌクレアーゼ、タンパク質断片又はドメイン、リガンド又は受容体、及びＣＲＩＳＰＲシステム又はその成分を挙げることができる。
【0055】
一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体調節因子、及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関係があるとされているタンパク質、例えば、創傷治癒のための、治療用タンパク質）が挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、酵素、例えば、オキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、及びデサチュラーゼが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えば、分泌酵素（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｅｎｚｙｍｅ）が挙げられる。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、血中で半減期が短い治療薬を有し得るか、又は細胞内局在性シグナルを持つタンパク質、若しくは分泌シグナルペプチドを持つタンパク質であり得る分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質、例えば、蛍光タンパク質、エネルギー伝達アクセプター、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ付加タンパク質、例えば、タンパク質タグ、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ；Ｅ－タグ、ＦＬＡＧタグ）、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｐｏｔタグ、Ｓｔｒｅｐタグ；ＴＣタグ、Ｔｙタグ、Ｖ５タグ；ＶＳＶタグ；又はＸｐｒｅｓｓタグを含む融合タンパク質又は操作されたタンパク質を発現する。
【0056】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、抗体断片、又はその一部分の発現をコードする。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが発現する抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、任意のアイソタイプであってよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、その更なる一部分など、抗体の一部分を発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部分を１つ以上発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、その各々が抗体の一部分を発現し、及びそれらが合わさったものが、抗体を構成することができる。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする一つの発現配列と、抗体の軽鎖をコードするもう一つの発現配列とを含む。ある場合には、この環状ポリリボヌクレオチドが細胞又は無細胞環境で発現すると、軽鎖及び重鎖が適切な修飾、折り畳み、又は他の翻訳後修飾に供され、機能性の抗体を形成することができる。
【0057】
調節要素
環状ポリリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を減少させることができる。一部の実施形態において、ある調節要素を用いて、ポリペプチドの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状ポリリボヌクレオチドに対する別のポリペプチドの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、ポリペプチド）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、ポリペプチド）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。一部の実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を減少させることができる。一部の実施形態において、ある調節要素を用いて、ポリペプチドの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状ポリリボヌクレオチドに対する別のポリペプチドの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、ポリペプチド）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、ポリペプチド）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。一部の実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
【0058】
翻訳を開始させるコドン、例えば、限定はされないが、開始コドン又は代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／又は構造に影響することは知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい；その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変更してもよい。
【0059】
一実施形態では、コドンをマスクするか又は隠し、マスクされた開始コドン又は代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低減するため、マスキング剤を開始コドン又は代替的な開始コドンの近傍で用いてもよい。別の実施形態では、代替的な開始コドンで翻訳が開始する可能性を高めるため、マスキング剤を用いて、環状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスクしてもよい。
【0060】
翻訳開始配列
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。一部の実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。一部の実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
【0061】
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【0062】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン、例えば、ＡＵＧでないコドンで開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０１６４］に記載のような代替的な翻訳開始配列で開始し得る。
【0063】
一部の実施形態において、翻訳は、ロカグレートを伴う真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）の処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングを遮断し、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写物からの未成熟な上流の翻訳開始及びタンパク質発現低下を引き起こすことによって抑制される、例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照）。
【0064】
スタガー要素
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタガー要素又は切断配列）を含み得る。「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。一部の実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。一部の実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタガー要素又は切断配列）を含み得る。「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。一部の実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。一部の実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
【0065】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。一部の実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、後続の発現配列から隔てられる。一部の実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
【0066】
スタガー要素の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７２］～［０１７５］に記載されている。
【0067】
連続的発現産物の産生を回避しながら、ローリングサークル翻訳を維持するため、スタガー要素を含めることで、翻訳中のリボソーム停止を誘導してもよい。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ又は複数の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳中にリボソームを停止させるように設計され得る。スタガー要素は、限定はされないが、２Ａ様、又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）配列を含んでもよい。一部の実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（配列番号２２）（式中、Ｘ１は、不在又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、不在又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。一部の実施形態において、この配列は、強力なαらせん性を有するアミノ酸の非保存配列と、それに続くコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（式中、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定例として、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３）、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、ＶＥＰＮＰＧＰ（配列番号５）、ＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号６）、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号７）、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号８）、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号９）、ＧＤＶＥＮＰＧＰ（配列番号１０）、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１１）、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ（配列番号１２）、ＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３）、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号１４）、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１５）、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号１６）、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ（配列番号１７）、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８）、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号１９）、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ（配列番号２０）、及びＤＳＥＦＮＰＧＰ（配列番号２１）が挙げられる。
【0068】
一部の実施形態において、本明細書に記載のスタガー要素は、本明細書に記載のコンセンサス配列のＧ及びＰの間などで、発現産物を切断する。１つの非限定例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するための少なくとも１つのスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接したスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に存在するスタガー要素を含むことで、各発現配列から個別のペプチド及び／又はポリペプチドの翻訳を引き起こす。
【0069】
一部の実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソーム停止を誘導する、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含んでもよい。これらなどの例は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと、分子の骨格に対する変化によって区別される。修飾は、翻訳中にリボソーム停止を誘導し得る、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の修飾、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【0070】
一部の実施形態において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中に他の形態で存在する。例えば、いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終結配列、及び第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列の上流（それに対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１の発現配列及び第１の発現配列に連続する発現配列は、環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別々の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその連続する発現配列の連続的翻訳を可能にし得る。一部の実施形態において、第１のスタガー要素は、終結配列を含み、第１の発現配列の発現産物をその連続する発現配列の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の連続する配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、第２の発現配列に連続する発現配列の第２の翻訳開始配列の上流に存在する第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中に発現配列が１つだけ存在し、第１の発現配列及びその連続する発現配列は、同じ発現配列である。いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終結配列、及び下流の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかのそのような例では、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（に対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の連続する発現配列の継続的翻訳を可能にする。一部の実施形態において、第１のスタガー要素は、第１の発現配列の１回目の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、対応する環状ポリリボヌクレオチドにおいて、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍大きい。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。一部の実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
【0071】
ＩＲＥＳ
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２、３、４、及び５つの）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、結果として得られる１つ又は複数のペプチド及び／又は１つ又は複数のポリペプチドの分離につながる。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列の両側に隣接している。環状ポリリボヌクレオチドに含めるのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合する能力を有するＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルス（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳである。ＩＲＥＳの更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６６］～［０１６８］に記載されている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは配列内リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２、３、４、及び５つの）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、結果として得られる１つ又は複数のペプチド及び／又は１つ又は複数のポリペプチドの分離につながる。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列の両側に隣接している。環状ポリリボヌクレオチドに含めるのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合する能力を有するＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルス（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳである。ＩＲＥＳの更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６６］～［０１６８］に記載されている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは配列内リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
【0072】
翻訳
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。一部の実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。一部の実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
【0073】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全ポリペプチドの少なくとも９９％が別々のポリペプチドであるように設計される。一部の実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。一部の実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。一部の実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
【0074】
非翻訳領域
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。一部の実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。一部の実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
【0075】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。
【0076】
ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。
【0077】
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。例示的非翻訳領域については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。
【0078】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは終結要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。
【0079】
終結要素
環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含むことができ、各発現配列が終結要素を有しても、又は有しなくてもよい。終結要素の更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含むことができ、各発現配列が終結要素を有しても、又は有しなくてもよい。終結要素の更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
【0080】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡ配列の長さは１０ヌクレオチド長より長い。一実施形態において、ポリＡ配列は１５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド又はそれより長い）。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）の［０２０２］～［０２０４］にあるポリＡ配列の記載に従い設計される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いている）。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終結要素を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドはポリＡ配列を欠いており（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いており）、及びその１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
【0081】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、発現配列は終結要素を欠いているため、したがって環状ポリリボヌクレオチドは連続的に翻訳される。終結要素が除かれる結果、リボソームの停滞又は脱落がないため、ローリングサークル翻訳又は発現産物、例えば、ペプチド若しくはポリペプチドの連続発現が生じ得る。かかる実施形態において、ローリングサークル翻訳は、各発現配列を通して連続した発現産物を発現する。一部の他の実施形態において、発現配列の終結要素は、スタガー要素の一部であり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列が終結要素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチドにおけるローリングサークル翻訳又は続く（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の発現は実施される。かかる例では、リボソームが終結要素、例えば、終止コドンに出会うと発現産物からリボソームが脱落し、翻訳が終結し得る。一部の実施形態において、翻訳は、リボソーム、例えば、リボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触したまま残っている間に終結する。
【0082】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の終わりに終結要素を含む。一部の実施形態において、１つ以上の発現配列は、２つ以上の終結要素を連続して含む。かかる実施形態では、翻訳は終結し、ローリングサークル翻訳は終結する。一部の実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドとの会合から完全に遊離する。一部のかかる実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の続く（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の産生には、翻訳開始前にリボソームが環状ポリリボヌクレオチドと再び会合する必要があり得る。概して、終結要素は、翻訳の終結シグナルを送るインフレームのヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結要素は、限定はされないが、オフフレームの、又は－１及び＋１シフトしたリーディングフレーム（例えば、隠れた終止）など、翻訳を終結させ得るフレームシフトした終結要素である。フレームシフトした終結要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレオチドトリプレット、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含む。フレームシフトした終結要素は、細胞にとって有害となることの多いｍＲＮＡの誤読の防止において重要であり得る。
【0083】
ＲＮＡ結合部位
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を修飾する標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。標的ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列、又はＤＮＡ結合若しくはＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合する標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）に結合し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸に結合し、ＲＮＡに結合し、遺伝子転写に干渉する配列に結合し、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列に結合し、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列に結合し、又はＤＮＡ結合又はＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合することができる。標的アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合することができる。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへの標的アプタマー配列の結合によってＲＮＡと複合体を形成することができる。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を修飾する標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。標的ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列、又はＤＮＡ結合若しくはＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合する標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）に結合し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸に結合し、ＲＮＡに結合し、遺伝子転写に干渉する配列に結合し、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列に結合し、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列に結合し、又はＤＮＡ結合又はＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合することができる。標的アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合することができる。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへの標的アプタマー配列の結合によってＲＮＡと複合体を形成することができる。
【0084】
一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のうちの１つであり得る。標的ＲＮＡ結合部位は当業者に周知である。
【0085】
ある種の標的ＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的過程を通じて遺伝子発現を阻害することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的には１５～５０塩基対（約１８～２５塩基対など）を有し、且つ細胞内にある発現させる標的遺伝子のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を備えたＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス、及びダイサー基質が挙げられる。標的結合部位の更なる例については、国際公開第２０２０／０２３６５５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１２９］～［０１４６］に記載されている。
【0086】
ＤＮＡ結合部位
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列など、標的ＤＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列の相補体を含む。不完全なエフェクター部分との結合に必要な標的結合配列及びゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列で構成されたｇＲＮＡ低分子合成ＲＮＡ。ガイドＲＮＡ配列は長さが１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）であり、標的化される核酸配列に相補的である。有効なガイドＲＮＡの設計においては、カスタムのｇＲＮＡ生成器及びアルゴリズムを使用することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、且つｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的となる配列へとヌクレアーゼを導くため）の両方を持つ操作された（合成の）シングルＲＮＡ分子であるキメラの「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用すると、遺伝子編集を達成することができる。化学的に修飾されたｇＲＮＡは、ゲノム編集において有効であり得る。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列など、標的ＤＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列の相補体を含む。不完全なエフェクター部分との結合に必要な標的結合配列及びゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列で構成されたｇＲＮＡ低分子合成ＲＮＡ。ガイドＲＮＡ配列は長さが１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）であり、標的化される核酸配列に相補的である。有効なガイドＲＮＡの設計においては、カスタムのｇＲＮＡ生成器及びアルゴリズムを使用することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、且つｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的となる配列へとヌクレアーゼを導くため）の両方を持つ操作された（合成の）シングルＲＮＡ分子であるキメラの「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用すると、遺伝子編集を達成することができる。化学的に修飾されたｇＲＮＡは、ゲノム編集において有効であり得る。
【0087】
ｇＲＮＡは、特異的なＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接するか又はその範囲内にある配列）を認識することができる。
【0088】
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。遺伝子編集には、環状ポリリボヌクレオチドが、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計することができる。ｇＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９又は他のエキソヌクレアーゼと相互作用してＤＮＡを切断するための少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド又はそれ以上を含んでもよく、例えば、Ｃｐｆ１は、検出可能なＤＮＡ切断用の少なくとも約１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列と相互作用する。
【0089】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡに結合することのできる標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列の二次構造は、ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、標的アプタマー配列によるＤＮＡへの結合によりＤＮＡと複合体を形成する。
【0090】
ＤＮＡに結合する環状ポリリボヌクレオチド配列の更なる例については、国際公開第２０２０／０２３６５５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１５１］～［０１５３］に記載されている。
【0091】
タンパク質結合
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
【0092】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を逃避する。一部の実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性又は外来性としての環状ポリリボヌクレオチドの隠蔽を補助するヌクレオチド配列である。
【0093】
線状ＲＮＡへのリボソーム会合の伝統的機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端へのリボソーム結合を含む。リボソームは、５’末端から開始コドンに移動するとすぐに、第１のペプチド結合が形成される。本発明によると、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部開始（即ち、キャップ非依存性）は、遊離末端又はキャップ末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、ポリペプチド伸長を開始コドンで開始させる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む、１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。
【0094】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを内包する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２３）（ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有し、それにもう一つの「Ｇ」が後続する。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【0095】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを特異的標的に標的化し、又は局在化する。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
【0096】
一部の実施形態において、タンパク質結合部位として、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【0097】
修飾
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、詳細には、親ポリリボヌクレオチドと比べて１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよく、本発明の範囲内に包含される。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、詳細には、親ポリリボヌクレオチドと比べて１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよく、本発明の範囲内に包含される。
【0098】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ又は複数の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定されている１００を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。一部の実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０３１１］中に記載されるような群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
【0099】
環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ）又は置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。更なる修飾は、本明細書中に記載されている。
【0100】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を増加させるための少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。一部の実施形態において、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを低下）させ得る。
【0101】
一部の実施形態において、修飾は、化学又は細胞誘導修飾を含んでもよい。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定例が、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からのＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎ、“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”によって記載されている。
【0102】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫逃避を増強し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、又は、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（ここで参照により本明細書中に援用される）に記載されたものによって合成及び／又は修飾されてもよい。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ－、ジ－及びトリ－）、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基、又はパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対を形成する塩基との置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基を含む。修飾リボヌクレオチド塩基はまた、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンを含んでもよい。一部の実施形態において、塩基修飾は、いくつかの機能的効果を挙げると、環状ポリリボヌクレオチドの、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。一部の実施形態において、修飾は、双直交性のヌクレオチド、例えば、非天然塩基を含む。例えば、Ｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａ（ここで参照により援用される）を参照されたい。
【0103】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの１つ又は複数のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位又は４’位）又は糖の置換、並びに骨格修飾は、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドの具体例として、限定はされないが、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含む、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合、例えば、ヌクレオシド間修飾を含む、環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドは、特に、骨格内にリン原子を有しないものを含む。本願を意図して、また時として当該技術分野で参照されるとおり、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。特定の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有するリボヌクレオチドを含むことになる。
【0104】
修飾された環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’－５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接ペアが、３’－５’と５’－３’又は２’－５’と５’－２’で結合される、反転極性を有するものを含んでもよい。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負又は正に荷電され得る。
【0105】
環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸塩骨格）に対して修飾され得る。本明細書では、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」及び「リン酸ジエステル」という語句は、互換可能に用いられる。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ又は複数を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書に記載のような別のヌクレオシド間結合による大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例として、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ジチオリン酸は、硫黄によって置換された両方の非結合酸素を有する。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による結合酸素の置換によって修飾され得る。
【0106】
ａ－チオ置換リン酸部分は、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに非天然ホスホロチオエート骨格結合を介して安定性を与えるように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞環境下で、増強されたヌクレアーゼ抵抗性と、それに続く延長された半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫応答を低減することが予想される。
【0107】
具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α－チオヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジン）を含む。
【0108】
亜リン酸原子を含まないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられてもよい他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。
【0109】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－ｌ－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを含んでもよい。更なる例として、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－ｌ－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
【0110】
環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ又は複数又はすべてのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵの任意の１つ若しくは複数若しくはすべて）は、環状ポリリボヌクレオチド、又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されてもされなくてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、イノシンを含み、それは環状ポリリボヌクレオチドを内因性ＲＮＡとウイルス性のＲＮＡとして特徴づける免疫系に寄与し得る。イノシンの組み込みはまた、ＲＮＡ安定性の改善／分解の減少を媒介し得る。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４（その全体が参照により援用される）を参照されたい。
【0111】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（又はその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドが、修飾される。一部の実施形態において、修飾は、発現を増強し得るｍ６Ａ；免疫応答を減弱し得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳リードスルー（スタガー要素）を増強し得るプソイドウリジン、安定性を増強し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転位（例えば、核局在化）を補助する２，２，７－トリメチルグアノシンを含んでもよい。
【0112】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の様々な位置に存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることで、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下しないことを理解するであろう。修飾はまた、非コード領域修飾であってもよい。環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量、又はヌクレオチドの１つ若しくは複数のタイプ、即ち、Ａ、Ｇ、Ｕ若しくはＣの任意の１つ若しくは複数のいずれかに対して）約１％～約１００％、又は任意の間の百分率（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【0113】
産生方法
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
【0114】
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本開示の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組み合わせなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
【0115】
一部の実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環化又はコンカテマー化の機構は、スプリントライゲーション方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
【0116】
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
【0117】
環状化
ある態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドが環化されるか、又はコンカテマー化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前にインビトロで環化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環化されてもよい。
ある態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドが環化されるか、又はコンカテマー化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前にインビトロで環化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環化されてもよい。
【0118】
細胞外環状化
一部の実施形態において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供することにより産生される。一部の実施形態において、次に線状ポリリボヌクレオチドの５’末端が線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートされると、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物が産生される。
一部の実施形態において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’及び３’末端を有する線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズする第１の領域及び線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズする第２の領域を有するポリデオキシリボヌクレオチドとを提供することにより産生される。一部の実施形態において、次に線状ポリリボヌクレオチドの５’末端が線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートされると、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むスプリントライゲーション反応産物が産生される。
【0119】
一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成する。例の反応において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一部の実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ、ＲＮＡリガーゼＩＩ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ又はＴ４ＤＮＡリガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状環状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
【0120】
一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用される。一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる環状化のための線状ポリリボヌクレオチドが、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、例えば、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、例えば、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。
【0121】
一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’三リン酸をＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることにより、核酸の５’三リン酸が５’一リン酸に変換されたものを含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団は、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼで消化する前にＲｐｐＨと接触させる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリリボヌクレオチドと、線状ポリデオキシリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団は、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼで消化する前にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと接触させる。
【0122】
代わりに、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つすべてのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
【0123】
一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、ＩＶＴ及びＲＮＡポリメラーゼを使用して合成され、ここでＩＶＴに使用されるヌクレオチド混合物は、５’一リン酸を持つＲＮＡが優先的に産生されるように、グアノシン三リン酸と比べて過剰量のグアノシン一リン酸を含有し得る；精製したＩＶＴ産物は、スプリントＤＮＡを使用して環状化し得る。
【0124】
一部の実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。一部の実施形態において、提供される環状化方法は、約１０％～約１００％の環状化効率を有し；例えば、環状化効率は、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び約９９％であり得る。一部の実施形態において、環状化効率は、約２０％～約８０％である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの４０％～９５％（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの６０％～９５％（例えば、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。
【0125】
一部の実施形態において、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。一部の実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
【0126】
環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
【0127】
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。例示的な複製要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２８０］～［０２８６］に記載されている。
【0128】
線状及び環状ＲＮＡの検出
環状ＲＮＡ医薬調製物中の線状ＲＮＡの存在は、予期せぬ、時に望ましくない効果を及ぼし得る。したがって、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡと比べて濃縮し、分離し、及び／又は精製し得る；線状ＲＮＡをモニタし、評価し、及び／又は制御することのできる方法（例えば、環状ＲＮＡ調製物の製造方法）；及びかかる医薬組成物及び調製物を使用する方法。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ調製物は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ調製物は、線状ＲＮＡと比べて濃縮されるか、又は線状ＲＮＡが減少するように精製される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド集団は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物に閾値レベルの環状ポリリボヌクレオチドが含まれるように濃縮される。
環状ＲＮＡ医薬調製物中の線状ＲＮＡの存在は、予期せぬ、時に望ましくない効果を及ぼし得る。したがって、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡと比べて濃縮し、分離し、及び／又は精製し得る；線状ＲＮＡをモニタし、評価し、及び／又は制御することのできる方法（例えば、環状ＲＮＡ調製物の製造方法）；及びかかる医薬組成物及び調製物を使用する方法。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ調製物は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ調製物は、線状ＲＮＡと比べて濃縮されるか、又は線状ＲＮＡが減少するように精製される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド集団は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物に閾値レベルの環状ポリリボヌクレオチドが含まれるように濃縮される。
【0129】
概して、医薬調製物中の要素の検出及び定量化は、目的の成分（例えば、環状ＲＮＡ、線状ＲＮＡ、断片、不純物等）若しくは類似の材料（例えば、環状ＲＮＡの標準として環状ＲＮＡ構造と同じ配列の線状ＲＮＡ構造を使用する）のいずれかである参照標準の使用を含み、又は試験試料からの内部標準若しくはシグナルの使用を含む。一部の実施形態において、標準を使用して、既知量又は相対量の材料についての検出器からの応答（レスポンスファクター）を確立する。一部の実施形態において、レスポンスファクターは、１つ又は複数の濃度の標準から（例えば、線形回帰分析を用いて）決定される。一部の実施形態において、次にレスポンスファクターを使用して、その成分に起因するシグナルから目的の材料の量が決定される。一部の実施形態において、レスポンスファクターは、１の値であるか、又は１の値を有すると仮定される。
【0130】
一部の実施形態において、医薬組成物中の環状ＲＮＡと比べた線状ＲＮＡの検出及び定量化が、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドとの比較を用いて決定される。一部の実施形態において、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドを使用し、及び１のレスポンスファクターを仮定して作成した検量線を使用して、医薬組成物中の全リボヌクレオチドの質量が決定される。一部の実施形態において、複数の既知量の線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度によって作成した検量線を医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度と比較することにより、医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのｗ／ｗパーセンテージが決定される。一部の実施形態において、ゲルベースの電気泳動法の間にバンドが生成され、バンド強度がゲルイメージャ（例えば、Ｅ－ｇｅｌイメージャ）によって測定される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
【0131】
一部の実施形態において、医薬組成物中の全ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。一部の実施形態において、医薬組成物中の線状ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）のニックＲＮＡ、線状ＲＮＡ、又は線状ＲＮＡとニックＲＮＡとの組み合わせを含む。例えば、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下の線状ポリリボヌクレオチド分子、又はこれらの間にある任意のパーセンテージである。一部の実施形態において、調製物中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージのニックポリリボヌクレオチド分子である。一部の実施形態において、調製物中に存在する線状及びニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージの線状ポリリボヌクレオチド分子とニックポリリボヌクレオチド分子との組み合わせである。
【0132】
一部の実施形態において、標準は、試料と同じ条件下で実行される。例えば、標準は、試料と同じ種類のゲル、同じ緩衝液、及び同じ露光量で実行される。更なる実施形態では、標準は、試料と並行して実行される。一部の実施形態において、要素の定量化は対象調製物からの複数の試料で（例えば、２回又はトリプリケートで）繰り返され、平均結果が求められる。一部の実施形態において、線状ＲＮＡの定量化は、並列キャピラリー電気泳動法を用いて（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＵＶ検出を伴う分析的ＨＰＬＣを用いて）測定される。
【0133】
或いは、存在する線状及び環状ＲＮＡの量を測定するため、２組のプライマー：ライゲーション部位にわたる１つと、ＯＲＦに特異的な１つとを使用したｑＰＣＲ逆転写（ＲＴ－ｑＰＣＲ）。ライゲーション部位にわたるプライマーは、環状ＲＮＡのレベルに関して報告する一方、ＯＲＦに特異的なプライマーは、環状及び線状両方のＲＮＡに関して報告する。一部の実施形態において、逆転写反応は、逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ：ＲＮアーゼＨ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマーで製造者の指示に従い実施される。一部の実施形態において、増幅されたＰＣＲ産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析され、臭化エチジウム染色によって可視化される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮倍数を推定するために、デンシトメトリーを用いてＰＣＲ産物を定量化してもよく、全ＲＮＡ試料の濃度を紫外吸光度により測定してもよい。
【0134】
他の実施形態
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
【0135】
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれることが具体的且つ個々に示されたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0136】
本開示を限定するのではなく例示することが意図される以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために提示される。実施例は、本開示を純粋に例示するものであることが意図されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【0137】
実施例１：ＧＦＰをコードする環状ＲＮＡのインビトロ作製
本例は、環状ポリリボヌクレオチドのインビトロ作製について記載する。
本例は、環状ポリリボヌクレオチドのインビトロ作製について記載する。
【0138】
ＩＲＥＳ及びＧＦＰをコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素で環状ポリリボヌクレオチドを設計した。この環状ポリリボヌクレオチドは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて生成した。簡潔に言えば、上記の要素を含むＤＮＡセグメントからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写により、未修飾の線状ＲＮＡ修飾を合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、及びＲＮＡ精製システムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡをスプリントＤＮＡを使用して環状化した。
【0139】
以下のとおりのスプリントライゲーションにより、環状ポリリボヌクレオチドを生成した：転写された線状ポリリボヌクレオチド及びＤＮＡスプリント（５’－ＣＡＡＴＣＧＡＣＧＧＴＣＣＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＣＴＧ－３’；配列番号１）を混合してアニールし、ＲＮＡリガーゼで処理することにより、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を作製した。
【0140】
実施例２：時間の経過に伴う５’エキソヌクレアーゼによる線状ＲＮＡの消化
本例は、５’エキソヌクレアーゼを使用して線状ポリリボヌクレオチドを分解できることを実証する。
本例は、５’エキソヌクレアーゼを使用して線状ポリリボヌクレオチドを分解できることを実証する。
【0141】
この環状化反応の副産物は、未反応の線状ポリリボヌクレオチドである。環状化反応後の未反応の線状ポリリボヌクレオチドを取り除くため、一本鎖５’エキソヌクレアーゼ、Ｘｒｎ－１を使用して、環状化されていない線状ＲＮＡを分解した。Ｘｒｎ－１消化の動態を理解するため、実施例１に記載されるとおり作製した環状及び線状の両方のポリリボヌクレオチドを含む１μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を１×ＮＥＢ３緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中１Ｕ（１μｌ）Ｘｒｎ－１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、総反応容積を１０μＬとして消化した。時間の経過に伴う反応を完了に関してモニタした；各時点でＸｒｎ－１消化物の一部を取り出し、次に２５ｍＭ ＥＤＴＡを使用してクエンチした。ポリリボヌクレオチド混合物を０、１、又は２時間のいずれかにわたって消化した後、反応をクエンチし、次にＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを備えた４１５０ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で製造者の指示に従いキャピラリー電気泳動法を用いて消化物を分離し、可視化した（図１）。ゼロ時点（レーン２）は、核酸を加える前にＸｒｎ－１酵素が完全にはクエンチされていなかったため、幾らかの消化を示した。１時間後、未反応の線状ＲＮＡは明らかな分解を受けており、もはや完全長でなく、約２．５ｋｂのサイズである（図１）。
【0142】
実施例３：エキソヌクレアーゼによる線状ＲＮＡの酵素的除去の前に、環状化後のアニールしたＤＮＡスプリントの除去が必要である
本例は、ＤＮＡスプリントの存在によってエキソヌクレアーゼによる線状ポリリボヌクレオチドの消化が妨げられたことを実証する。
本例は、ＤＮＡスプリントの存在によってエキソヌクレアーゼによる線状ポリリボヌクレオチドの消化が妨げられたことを実証する。
【0143】
１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中の実施例１に記載されるとおり作製した１００ｐｍｏｌのＲｐｐＨ処理した線状インビトロ転写ＲＮＡと２μＭスプリントＤＮＡの組み合わせにより、モック環状化反応（リガーゼのない環状化）を実施し、ＲＮＡリガーゼの存在なしに最終反応容積を９７μＬとして７５℃で１０分間インキュベートした。次にこの混合物を２０分間冷却して室温になった時点で反応物に４０ＵのマウスＲＮアーゼ阻害因子（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、容積を１００μＬに至らせた。この試料を振盪しながら３７℃で４時間、続いて温度を８０℃に上昇させて５分間インキュベートした。モック環状化後、試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ｖ／ｖ／ｖ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒａｄｅ １ Ｐｈａｓｅ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で抽出し、エタノール沈殿させて、定量化した。精製したＲＮＡ（５μｇ）又はＤＮＡスプリント（対照、２０ｐｍｏｌ）を、最終反応容積を１００μＬとした０．４Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害因子含有１×ＮＥＢ３緩衝液中５ＵのＸｒｎ－１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と反応させた。３７℃で１時間インキュベートした後、ＤＮＦ－４７１ ＲＮＡキット（１５ ＮＴ）を製造者の指示に従い使用して（Ａｇｉｌｅｎｔ）、試料を５３００フラグメントアナライザーでキャピラリー電気泳動法により分離し、可視化した（図２）。図１のレーン３及び４と比較して、図２のレーン３は、アニーリングのステップにより、スプリントＤＮＡ（白抜きの矢印）が線状ポリリボヌクレオチド（黒色の矢印）を一本鎖エキソヌクレアーゼによる消化から部分的に保護することが可能になることを実証している。
【0144】
実施例４：ＤＮアーゼＩ及び５’エキソヌクレアーゼを使用したスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡの濃縮
本例は、ＤＮアーゼＩ及び５’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用してスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡが濃縮されたことを実証する。
本例は、ＤＮアーゼＩ及び５’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用してスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡが濃縮されたことを実証する。
【0145】
線状ポリリボヌクレオチドの除去を改善するため、エキソヌクレアーゼ消化前にＤＮアーゼＩを加えてスプリントＤＮＡを除去した。簡潔に言えば、最終容積を１９４μＬとして２００ｐｍｏｌ ＲＮＡを２μＭスプリントＤＮＡ及び１×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩＩ緩衝液と共に７５℃で１０分間インキュベートすることにより、実施例１に記載されるとおり作製したＲｐｐＨ処理後の線状ＲＮＡを環状化した。この混合物を室温で２０分間冷却した後、続いて４μＬリガーゼ及び２μＬ ＲＮアーゼ阻害因子（８０Ｕ）を加えた。試料を３００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４時間インキュベートし、インキュベーション後にエタノール沈殿させて、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を得た。このライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物（５００ｎｇ）を、２５μＬの最終容積の０．１μＬ ＤＮアーゼＩ（０．２Ｕ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．３μＬ（１２Ｕ）ＲＮアーゼ阻害因子及び１×ＤＮアーゼＩ緩衝液と反応させた。試料を３７℃で３０分間インキュベートし、４ｍＭ ＥＤＴＡでクエンチし、及び７５℃で１０分間熱失活させた後、続いてエタノール沈殿させて、それを２２μｌの水に再懸濁した。試料（２０μＬ）を０．５μｌ Ｘｒｎ－１及び０．３μｌ（１２Ｕ）ＲＮアーゼ阻害因子と１×ＮＥＢ３緩衝液中に最終容積が２５μＬとなるように合わせ、３７℃で１時間インキュベートした。次に反応物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、エタノール沈殿させ、続いてＤＮＦ－４７１ ＲＮＡキット（１５ ＮＴ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ ５３００フラグメントアナライザーを製造者の指示に従い使用してキャピラリー電気泳動法により分析した（図３）。このＲＮＡは環状化に成功し、ＤＮアーゼＩ消化後もＸｒｎ－１によって消化されなかった（図３；レーン３の黒色の矢印）。
【0146】
実施例５：環状化後のＲＮＡを酵素的に精製すると、ゲル抽出と比べて収率が改善される
本例は、環状化後のＲＮＡを酵素的に精製すると、ゲル抽出と比べて収率が改善されたことを実証する。
本例は、環状化後のＲＮＡを酵素的に精製すると、ゲル抽出と比べて収率が改善されたことを実証する。
【0147】
酵素的精製を環状化後のＲＮＡの既述のゲル精製と比較した。スケールアップした環状化反応（２００又は５００ｐｍｏｌ ＲＮＡ）を上記に記載したとおり実施し、ここでは反応の終わりに塩化カルシウム（０．５ｍＭ最終濃度）及び３０μＬ ＤＮアーゼＩを加えた。この反応物を３７℃で１０分間インキュベートした。次にＤＮアーゼＩ反応を５ｍＭ ＥＤＴＡ（最終濃度）によりクエンチし、及び反応物を６５℃でさらに熱失活させた後、続いてフェノール：クロロホルム（ｃｈｏｒｏｆｏｒｍ）：イソアミルアルコール抽出及びエタノール沈殿を行った。ＲＮＡを定量化し、次に２００μｇのＲＮＡを、総容積を２００μｌとした２μｌ ＲＮアーゼ阻害因子及び１×ＮＥＢ３緩衝液を含有する反応液中の４０μｌ Ｘｒｎ－１により消化した。この試料を３７℃で６時間インキュベートし、続いてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、５０μｌの最終容積の水へとエタノール沈殿させた。結果として得られるＲＮＡ及び中間体ＲＮＡを、ＤＮＦ－４７１ ＲＮＡキット（１５ ＮＴ）を製造者の指示に従い使用したＡｇｉｌｅｎｔ５３００フラグメントアナライザーでキャピラリー電気泳動法により分離し、可視化した（図４）。
【0148】
既述のゲル抽出方法又は上記に記載される酵素的方法のいずれかを用いて精製した環状化後のＲＮＡの収率を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ紫外可視分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分析した。これらの収率を、環状化後に線状ＲＮＡのゲル電気泳動精製又は酵素的精製に投入されたＲＮＡの量のパーセンテージとして比較した。線状ＲＮＡを除去し、残りの環状ＲＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出してエタノール沈殿させた後、酵素的方法によれば収率が約３０倍に増加し、純度が改善された（表２）。
【0149】
【表2】
【0150】
実施例６：ＤＮアーゼＩ及び３’エキソヌクレアーゼを使用したスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡの濃縮
本例は、ＤＮアーゼＩ及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用したスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡの濃縮について記載する。
本例は、ＤＮアーゼＩ及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用したスプリントライゲーション後の環状ＲＮＡの濃縮について記載する。
【0151】
環状ＲＮＡの酵素的精製方法は、線状ＲＮＡがエキソヌクレアーゼに感受性を示す遊離末端を有する一方、環状化したＲＮＡは遊離末端を有しないため、それがエキソヌクレアーゼから保護されているという特性を生かしている。この目的で、上記に記載したＸｒｎ－１など、５’エキソヌクレアーゼの代わりになるのは、ＲＮアーゼＲなどの３’エキソヌクレアーゼである。
【0152】
一部の実施形態において、ライゲーション反応によるＲＮＡの環状化後、反応物をＤＮアーゼＩで処理した後、続いて１Ｕ／μｇ ＲＮＡを使用してＲＮアーゼＲ反応緩衝液中３７℃で１０分間インキュベートすることによりＲＮアーゼＲでエキソヌクレアーゼ処理する。ＲＮアーゼＲの濃度は下げてもよく、インキュベーション時間を延ばすことと組み合わせてもよい。ＲＮアーゼＲ ３’エキソヌクレアーゼによる処理後、反応物を６５℃で２０分間熱失活させて、次にフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出及びエタノール沈殿を用いて精製する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
配列表
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが５，２２７バイトである２０２３年３月１５日に作成された５１５０９－０４１ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３＿１５＿２３＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが５，２２７バイトである２０２３年３月１５日に作成された５１５０９－０４１ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３＿１５＿２３＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】