特表 2024-521329 凍結乾燥タンパク質製剤を製造する迅速な方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-31

(54)【発明の名称】凍結乾燥タンパク質製剤を製造する迅速な方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/19 20060101AFI20240524BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240524BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240524BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240524BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240524BHJP

【ＦＩ】

A61K9/19

A61K39/395 Y

A61K39/395 W

A61K9/08

A61K47/12

A61K47/22

A61K47/18

A61K47/02

A61K47/26

A61K47/34

A61K47/10

A61P43/00 111

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023573384

(86)(22)【出願日】2022-06-01

(85)【翻訳文提出日】2023-12-11

(86)【国際出願番号】 US2022031694

(87)【国際公開番号】W WO2022256359

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】63/195,265

(32)【優先日】2021-06-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マコーミック，ジェフ

(72)【発明者】

【氏名】マコーリー，アーノルド

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA29

4C076CC03

4C076DD26Z

4C076DD41Z

4C076DD42Z

4C076DD43Z

4C076DD51Z

4C076DD58Z

4C076DD67

4C076EE23F

4C076FF12

4C076FF16

4C076FF61

4C076GG06

4C085AA13

4C085CC22

4C085EE01

4C085EE05

4C085EE07

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書では、改善された貯蔵安定性を示す、抗体又は二重特異性抗原結合分子などのタンパク質を含む凍結乾燥製剤を調製する迅速な方法が開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
（ａ）タンパク質、糖類及び界面活性剤を含む液体製剤を収容している凍結乾燥チャンバーを約－３５℃～約－５０℃の範囲の温度まで冷却して、凍結製剤を作製し、且つ前記チャンバーを約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度で約１．５時間～約５．０時間の時間にわたって保持する工程；
（ｂ）前記チャンバーを約－３０℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力まで加熱して、一次乾燥製剤を作製し、且つ前記チャンバーを約－３０℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約１２時間～約２４時間の時間にわたって保持する工程；
（ｃ）前記チャンバーを約２０℃～約３０℃の範囲の温度まで加熱して、二次乾燥製剤を作製し、且つ前記チャンバーを約２０℃～約３０℃の範囲の温度及び約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約５時間～約１２時間の時間にわたって保持して、前記凍結乾燥製剤を作製する工程
を含み；前記液体製剤は、約３～７のｐＨを有し、且つマンニトールを含有せず；及び前記方法は、アニーリング工程を欠く、方法。

【請求項2】

前記工程（ａ）の冷却は、約－４５℃の温度まで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記工程（ａ）の冷却は、約０．３℃／分～約１℃／分の範囲の速度で行われる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記工程（ａ）の冷却は、約０．５℃／分の速度で行われる、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記工程（ａ）の保持は、約－４５℃の温度で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記工程（ａ）の保持は、約１．５時間～約５時間の時間にわたって行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記工程（ａ）の保持は、約２～３時間にわたって行われる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記工程（ｂ）の加熱は、約－２５℃～－３０℃の温度まで行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記工程（ｂ）の加熱は、約０．１℃／分～約１℃／分の範囲の速度で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記工程（ｂ）の加熱は、約０．１℃／分～約０．５℃／分の範囲の速度で行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記工程（ｂ）の加熱は、約０．３℃／分の速度で行われる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記工程（ｂ）の加熱は、約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記工程（ｂ）の加熱は、約１００ｍＴｏｒｒの圧力で行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記工程（ｂ）の保持は、約－２５℃～約－３０℃の温度で行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記工程（ｂ）の保持は、約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記工程（ｂ）の保持は、約１００ｍＴｏｒｒの圧力で行われる、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記工程（ｂ）の保持は、約１０時間～約２５時間の時間にわたって行われる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記工程（ｂ）の保持は、約１７時間にわたって行われる、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記工程（ｃ）の加熱は、約２５℃の温度まで行われる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｃ）の加熱昇温速度は、約０．５℃／分までの範囲の速度で生じる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｃ）の前記加熱昇温速度は、約０．１℃／分～約０．５℃／分の範囲の速度で生じる、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記工程（ｃ）の加熱は、約０．４℃／分の速度で行われる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記工程（ｃ）の保持は、約２５℃の温度で行われる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記工程（ｃ）の保持は、約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記工程（ｃ）の保持は、約７０ｍＴｏｒｒの圧力で行われる、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記工程（ｃ）の保持は、約８時間にわたって行われる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記タンパク質は、抗体である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記タンパク質は、二重特異性抗原結合分子である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記二重特異性抗原結合分子は、半減期延長（ＨＬＥ）二重特異性抗原結合分子である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３１、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１５６、配列番号１６５、配列番号１７４、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７又は配列番号１８８に示されたアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子は、配列番号２２、配列番号７７、配列番号８７又は配列番号９７に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記タンパク質は、前記液体製剤中に約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記タンパク質は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記タンパク質は、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記タンパク質は、約１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記タンパク質は、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記工程（ａ）の液体製剤は、約４～６のｐＨを有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記工程（ａ）の液体製剤は、緩衝剤をさらに含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記緩衝剤は、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、リン酸緩衝剤、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝剤又はこれらの任意の組み合わせである、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記緩衝剤は、グルタミン酸を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記緩衝剤は、約５ｍＭ～約２００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記緩衝剤は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記緩衝剤は、約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記糖類は、単糖又は二糖である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記糖類は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース又はこれらの任意の組み合わせである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記糖類は、スクロースである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記糖類は、前記液体製剤中に約１～約１５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記糖類は、約６％～１２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記糖類は、約９％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、トリトンＸ－１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はこれらの組み合わせである、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記界面活性剤は、ポリソルベート８０である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記界面活性剤は、前記液体製剤中に約０．００１％～０．５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記界面活性剤は、約０．００１％～０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で存在する、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記界面活性剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記工程（ａ）の液体製剤は、約４～約５のｐＨを有する、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記工程（ａ）の液体製剤は、約４．２のｐＨを有し、且つ約１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、約９．０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約０．０１０％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記凍結乾燥製剤は、再構成時、４０℃で１か月にわたる貯蔵後に高分子量種の割合の０．５％以下の上昇を示す、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記凍結乾燥製剤は、再構成時、４０℃で１か月にわたる貯蔵後に高分子量種の割合の０．３％以下の上昇を示す、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法によって調製された凍結乾燥タンパク質製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、改善された貯蔵安定性を示す、抗体又は二重特異性抗原結合分子などのタンパク質を含む凍結乾燥製剤を調製する迅速な方法を提供する。

【0002】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出された、コンピュータにより読み込み可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、その全体が参照により組み込まれ、下記のように識別される：ファイル名：Ｉ－５６８４６＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：３４５，２８６バイト；作成日：２０２２年５月１２日。

【背景技術】

【0003】

抗体、抗体断片及び二重特異性抗原結合分子を含有する医薬品などのタンパク質系医薬品は、様々な疾患及び病態の治療のために一層重要になっている。しかしながら、タンパク質は、辛うじて安定であるにすぎず、化学的にも物理的にも非常に劣化しやすい。化学的劣化とは、脱アミド、酸化、開裂、クリッピング／断片化、新たなジスルフィド架橋の形成、加水分解、異性化又は脱グリコシル化などの共有結合を伴う改変を指す。物理的劣化には、タンパク質のアンフォールディング、表面への望ましくない吸着及び凝集が含まれる。これらの物理的及び化学的な不安定性への対処は、タンパク質医薬品の開発において最も難しい課題の１つである（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０）。

【0004】

半減期延長抗原結合分子（例えば、Ｆｃ分子などの半減期延長様式を含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））は、特にタンパク質凝集及び／又は他の劣化事象から保護する必要がある。ＢｉＴＥ（登録商標）分子のタンパク質凝集が問題となるのは、それが治療用タンパク質の生物学的活性及び品質（仕様）を弱めることがあるためである。さらに、ＢｉＴＥ（登録商標）分子の凝集は、最終生成物から凝集体を除去するために必要とされる綿密な精製工程により生成物収率を低下させる可能性がある。より最近では、凝集したタンパク質（ヒト化タンパク質又は完全なヒトタンパク質であっても）の存在により、患者は、活性タンパク質モノマーに対する免疫反応を起こすことになり、その結果、中和抗体及び薬物耐性の形成又は他の有害な副作用がもたらされるというリスクが顕著に増大する可能性があるといった懸念及びエビデンスも増加している（Ｍａｈｌｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，Ｓｅｐｔ ２００３，ｐｐ．１３２５－１３３６，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；３２（７）：３７２－８０

【非特許文献2】Ｍａｈｌｅｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．２００９ Ｓｅｐ；９８（９）：２９０９－３４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

タンパク質系医薬製剤は、貯蔵中の製剤中の抗体又は二重特異性抗原結合分子などのタンパク質の完全性の保存を促進するために、凍結乾燥され、固体で貯蔵されることが多い。しかしながら、多数の現行のタンパク質製剤の凍結乾燥法では、時間が経過しても好適な安定性を示し、且つ知られた方法に比べて迅速に製造される固体製剤が得られない。したがって、改善された貯蔵安定性を示す凍結乾燥タンパク質製剤を迅速に製造する新規の方法が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、凍結乾燥製剤を調製する方法であって、（ａ）タンパク質、［糖類及び界面活性剤］を含む液体製剤を収容している凍結乾燥チャンバーを約－３５℃～約－５０℃の範囲の温度まで冷却して、凍結製剤を作製し、且つチャンバーを約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度で約１．０時間～約３．０時間の時間にわたって保持する工程；（ｂ）チャンバーを約－３５℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力まで加熱して、一次乾燥製剤を作製し、且つチャンバーを約－３５℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約１２時間～約２４時間の時間にわたって保持する工程；（ｃ）チャンバーを約２０℃～約３０℃の範囲の温度まで加熱して、二次乾燥製剤を作製し、且つチャンバーを約２０℃～約３０℃の範囲の温度及び約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約５時間～約１２時間の時間にわたって保持して、凍結乾燥製剤を作製する工程を含み；液体製剤は、約３～７のｐＨを有し、且つマンニトールを含有せず；及び方法は、アニーリング工程を欠く、方法を提供する。

【0008】

別の態様では、本開示は、本開示の方法によって調製された凍結乾燥タンパク質製剤を提供する。

【0009】

さらなる態様及び利点は、以下の詳細な説明を精査することによって当業者に明らかになるであろう。本明細書に開示される方法は、様々な形態の実施形態を取り得るが、以下の説明では、本開示が例示であり、且つ本明細書に記載する特定の実施形態に本発明を限定することを意図されないという理解のもとで特定の実施形態を挙げる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】サイクルの完了後の乾燥製品ケーキを示し、その巨視的な崩壊の兆候及び全体的な品質が目視検査によって評価された。ＢＩＴＥ Ｂの製品ケーキは、許容可能であると決定され、いくつかの角度から撮影された写真を示す。

【図2】経時的にプロットされた高分子量（ＨＭＷ）種の相対面積％の値を示す。データは、研究の過程で凝集の不安定性がないことを示唆している。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書では、改善された安定性を示す、抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、半減期延長二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質を含む凍結乾燥製剤を迅速に調製する方法を開示する。本開示の加速凍結乾燥法は、有利には、凝集などの物理的劣化の減少並びにクリッピング及び脱アミド化の減少などの化学的劣化の減少をもたらす。さらに、本明細書に開示される加速凍結乾燥法は、抗体及び二重特異性抗原結合分子を含有する製剤などのタンパク質製剤を、低濃度及び高濃度のいずれであっても安定化させることができる。

【0012】

定義
本明細書で使用する場合、用語「医薬製剤」は、それを必要とする対象への投与に好適な製剤に関する。「対象」、又は「個体」、又は「動物」、又は「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、本発明の医薬製剤の投与が望ましい任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。哺乳動物対象としては、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛、などが挙げられ、ヒトが好ましい。本開示の医薬製剤は、安定であり、且つ薬学的に許容され、すなわちこの医薬製剤が投与される対象に重大な望ましくない局所的作用も全身的作用も引き起こすことなく所望の治療効果を発揮し得る。本開示の薬学的に許容される製剤は、無菌であり得る。具体的には、用語「薬学的に許容される」は、動物、より特にヒトでの使用に関して規制当局又は他の一般に認識されている薬局方により承認されていることを意味し得るが、規制当局によって承認されているものに限定されない。

【0013】

「安定性」又は「安定化」という用語は、医薬製剤全体の安定性に関し、特に活性成分（例えば、二重特異性抗原結合分子などのタンパク質）自体の具体的には製剤、充填、輸送、貯蔵及び投与中の安定性に関する。「安定な製剤」とは、その中のタンパク質（例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子）が貯蔵時及びプロセス（例えば、凍結／解凍、機械的混合及び凍結乾燥）中にその物理的及び／又は化学的完全性並びに生物学的活性を実質的に維持する製剤である。タンパク質の安定性は、高分子量（ＨＭＷ）種の形成、酵素活性の消失、ペプチド断片の生成及び電荷プロファイルのシフトによって測定することができる。

【0014】

本明細書で使用する用語「凝集」は、例えば、ファンデルワールス力又は化学結合による、分子間の直接的な相互引力を指す。特に、凝集は、蓄積し、塊になっているタンパク質であると理解されている。凝集体には、非晶質凝集体及びオリゴマーが含まれ得るが、典型的には高分子量（ＨＭＷ）種、すなわち非凝集分子である生成物分子よりも高分子量を有する分子と呼ばれる。

【0015】

本明細書で使用する用語「（タンパク質）凝集体」は、一般に、所望の既定の種（例えば、モノマー）ではなく、「オリゴマー」又は「マルチマー」などの高分子量のタンパク質種を包含する。この用語は、本明細書では、「高分子量」種及び「ＨＭＷ」という用語と互換的に使用される。タンパク質凝集体は、一般に、サイズ（小型（二量体）から大型の集合体（顕微鏡下でないと見えない粒子又は目に見える粒子）の範囲で、直径がナノメートル～マイクロメートルの範囲）、形態（ほぼ球状～線維状）、タンパク質構造（天然対非天然／変性）、分子間結合の種類（共有結合対非共有結合）、可逆性及び可溶性の点で異なり得る。可溶性凝集体は、およそ１～１００ｎｍのサイズ範囲を占め、タンパク質微粒子は、顕微鏡下でないと見えない（約０．１～１００ｎｍ）及び目に見える（＞１００ｎｍ）範囲を占める。前述のタンパク質凝集体の種類の全ては、一般に、この用語に包含される。したがって、用語「（タンパク質）凝集体」は、２つ以上のタンパク質モノマーが物理的に会合した又は化学的に結合したあらゆる種類の非天然種を指す。

【0016】

本明細書で使用する用語「低分子量（ＬＭＷ）」種は、二重特異性抗原結合分子などのタンパク質の断片を指す。

【0017】

本明細書で使用する「加速された凍結乾燥方法」という用語は、本明細書に記載の凍結乾燥タンパク質製剤の安定性を維持しながら、凍結乾燥デバイスにおいて異なる温度及び圧力を使用する既知の方法よりも少なくとも２５％速い凍結乾燥方法を指す。

【0018】

方法
本開示の一態様は、凍結乾燥製剤を迅速に調製する方法であって、アニーリング工程を欠く方法を提供する。本方法は、（ａ）約３～７のｐＨを有し、タンパク質、糖類及び界面活性剤を含み、且つマンニトールを欠く液体製剤を収容している凍結乾燥チャンバーを約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度まで冷却して、凍結製剤を作製し、且つチャンバーを約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度で約１時間～約３時間の時間にわたって保持する工程；（ｂ）チャンバーを約－３０℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力まで加熱して、一次乾燥製剤を作製し、且つチャンバーを約－３５℃～約－２０℃の範囲の温度及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約１２時間～約２４時間の時間保持する工程；及び（ｃ）チャンバーを約２０℃～約３５℃の範囲の温度まで加熱して、二次乾燥製剤を作製し、且つチャンバーを約２０℃～約３０℃の範囲の温度及び約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で約５時間～約１０時間の時間にわたって保持して、凍結乾燥製剤を作製する工程を含む。

【0019】

本明細書で使用する用語「温度」は、凍結乾燥チャンバーの内部の温度（凍結乾燥チャンバーの内部温度「内部温度」）を指し、サイクル中の凍結乾燥機の制御された「温度」は、チャンバーの棚を通してポンプで送り出されるシリコーンオイルの入口温度によって正確に測定される。換言すれば、それは、試料バイアルの底部に接触しているチャンバーの金属棚にポンプで送り込まれる液体の温度である。同様に、本明細書で使用する用語「圧力」は、凍結乾燥チャンバーの内部の圧力（すなわち凍結乾燥チャンバーの内部圧力「内部圧力」）を指す。

【0020】

工程（ａ）。工程（ａ）では、液体製剤を収容している凍結乾燥チャンバーを約－３５℃～約－５０℃の範囲の温度（例えば、内部温度）まで冷却して、凍結製剤を作製し、且つ約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度（例えば、内部温度）で約２時間～約２４時間の時間にわたって保持する。いくつかの実施形態では、冷却は、約－４０℃～約－５０℃の範囲の温度（例えば、約－４０℃、－４１℃、－４２℃、－４３℃、－４４℃、－４５℃、－４６℃、－４７℃、－４８℃、－４９℃又は－５０℃）まで行われる。様々な例において、冷却は、約－４５℃の温度まで行われる。いくつかの例では、チャンバーの冷却は、約０．１℃／分～約１℃／分の範囲の速度で行われる。様々な実施形態において、冷却は、約０．５℃／分～約０．８℃／分の速度で行われる。いくつかの実施形態では、冷却は、約０．５℃／分、０．６℃／分、０．７℃／分、０．８℃／分、０．９℃／分又は１℃／分の速度で行われる。いくつかの例では、冷却は、約０．５℃／分の速度で行われる。いくつかの実施形態では、チャンバーの保持は、約－４０℃、－４１℃、－４２℃、－４３℃、－４４℃、－４５℃、－４６℃、－４７℃、－４８℃、－４９℃又は５０℃の温度で行うことができる。いくつかの実施形態では、保持は、約－４５℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥チャンバーの冷却温度と保持温度とは同じである。様々な実施形態において、保持は、約１時間～約３時間（例えば、約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間又は３時間）の時間、行われる。いくつかの例では、保持は、約２時間にわたって行われる。

【0021】

工程（ｂ）。工程（ｂ）では、凍結乾燥チャンバーを約－３５℃～約－２０℃の範囲の温度（例えば、内部温度）及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力（例えば、内部圧力）まで加熱して、一次乾燥製剤を作製し、且つ約－３５℃～約－２０℃の範囲の温度（例えば、内部温度）及び約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力（例えば、内部圧力）で約１２時間～約２４時間の時間にわたって保持する。いくつかの実施形態では、加熱は、約－３５℃－３４℃－３３℃－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃又は２０℃の温度まで行われる。様々な例において、加熱は、約－２７℃の温度まで行われる。いくつかの例では、加熱は、約０．１℃／分～約１℃／分の範囲の速度で行われる。様々な実施形態において、加熱は、約０．１℃／分～約０．５℃／分の速度（例えば、０．１℃／分、０．２℃／分、０．３℃／分、０．４℃／分又は０．５℃／分）で行われる。いくつかの例では、加熱は、約０．３℃／分の速度で行われる。様々な例において、加熱は、約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒ、又は約８０ｍＴｏｒｒ～約１２０ｍＴｏｒｒ、又は約８５ｍＴｏｒｒ～約１１５ｍＴｏｒｒ、又は約９０ｍＴｏｒｒ～約１１０ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる。いくつかの例では、加熱は、約９５ｍＴｏｒｒ、９６ｍＴｏｒｒ、９７ｍＴｏｒｒ、９８ｍＴｏｒｒ、９９ｍＴｏｒｒ、１００ｍＴｏｒｒ、１０１ｍＴｏｒｒ、１０２ｍＴｏｒｒ、１０３ｍＴｏｒｒ、１０４ｍＴｏｒｒ又は１０５ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。様々な実施形態において、加熱は、約１００ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。いくつかの実施形態では、チャンバーの保持は、約－３５℃、－３４℃、－３３℃、－３２℃、－３１℃、－３０℃、－２９℃、－２８℃、－２７℃、－２６℃、－２５℃、－２４℃、－２３℃、－２２℃、－２１℃又は－２０℃の温度で行われる。様々な実施形態において、保持は、約－２７℃の温度で行われる。様々な実施形態において、保持は、約７５ｍＴｏｒｒ～約１２５ｍＴｏｒｒ、又は約８０ｍＴｏｒｒ～約１２０ｍＴｏｒｒ、又は約８５ｍＴｏｒｒ～約１１５ｍＴｏｒｒ、又は約９０ｍＴｏｒｒ～約１１０ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる。いくつかの例では、加熱は、約９５ｍＴｏｒｒ、９６ｍＴｏｒｒ、９７ｍＴｏｒｒ、９８ｍＴｏｒｒ、９９ｍＴｏｒｒ、１００ｍＴｏｒｒ、１０１ｍＴｏｒｒ、１０２ｍＴｏｒｒ、１０３ｍＴｏｒｒ、１０４ｍＴｏｒｒ又は１０５ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。様々な実施形態において、加熱は、約１００ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥チャンバーが加熱される温度と保持温度とは同じである。いくつかの実施形態では、凍結乾燥チャンバーが加熱される圧力と保持圧力とは同じである。いくつかの実施形態では、凍結乾燥チャンバーを加熱温度と保持温度とは同じであり、且つ凍結乾燥チャンバーが加熱される圧力と保持圧力とは同じである。いくつかの例では、保持は、約１２時間～約２４時間（例えば、約１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間又は１８時間）の時間にわたって行われる。様々な例において、保持は、約１６～１７時間の時間、例えば１６．７時間にわたって行われる。

【0022】

工程（ｃ）。工程（ｃ）では、チャンバーを約２０℃～約３５℃の範囲の温度（例えば、内部温度）まで加熱して、二次乾燥製剤を作製し、且つ約２０℃～約３５℃の範囲の温度（例えば、内部温度）及び約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒの範囲の圧力（例えば、内部圧力）で約５時間～約１２時間の時間にわたって保持して、凍結乾燥製剤を作製する。いくつかの実施形態では、加熱は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃又は３５℃の温度まで行われる。様々な例において、加熱は、約２５℃の温度まで行われる。様々な実施形態において、加熱は、約０．３～０．５℃／分までの範囲の速度で行われ、二次乾燥製剤を作成する。いくつかの例では、加熱は、約０．０５℃／分～約０．５℃／分の速度で行われる。様々な例において、加熱は、約０．０５℃／分、０．１℃／分、０．１５℃／分、０．２℃／分、０．２５℃／分、０．３℃／分、０．３５℃／分、０．４℃／分、０．４５℃／分又は０．５℃／分の速度で行われる。いくつかの実施形態では、加熱は、約０．４℃／分の速度で行われる。いくつかの実施形態では、保持は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃又は３０℃の温度で行われる。様々な例において、保持は、約２５℃の温度で行われる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥チャンバーが加熱される温度は、保持温度と同じである。いくつかの実施形態では、保持は、約５０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒ、又は約７０ｍＴｏｒｒ～約１００ｍＴｏｒｒ、又は約６５ｍＴｏｒｒ～約７５ｍＴｏｒｒの範囲の圧力で行われる。いくつかの例では、保持は、約６５ｍＴｏｒｒ、６６ｍＴｏｒｒ、６７ｍＴｏｒｒ、６８ｍＴｏｒｒ、６９ｍＴｏｒｒ、７０ｍＴｏｒｒ、７１ｍＴｏｒｒ、７２ｍＴｏｒｒ、７３ｍＴｏｒｒ、７４ｍＴｏｒｒ又は７５ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。様々な実施形態において、保持は、約７０ｍＴｏｒｒの圧力で行われる。いくつかの例では、保持は、約５時間、６時間、７時間、８時間、９時間又は１０時間の時間、行われる。様々な例において、保持は、約８．１時間、８．２時間、８．３時間、８．４時間、８．５時間の時間にわたって行われ、１つの例では、保持は、約８．３時間の時間にわたって行われる。

【0023】

本明細書に開示されるいずれか（アニーリング工程あり又はなし）の方法の実施形態では、方法は、（ｄ）工程（ｃ）で得られた凍結乾燥製剤を含むチャンバーを約１℃～約１０℃の範囲の温度まで（又は約２℃～約７℃まで又は約５℃まで）冷却し、凍結乾燥製剤に、約２５０ｍＴｏｒｒ～約７５０ｍＴｏｒｒの範囲の（又は約３００ｍＴｏｒｒ～約６００ｍＴｏｒｒまで又は約５００ｍＴｏｒｒまで）圧力で不活性ガスを給気する工程をさらに含み得る。いくつかの例では、不活性ガスは、アルゴン、ヘリウム、窒素及びこれらの任意の組み合わせから選択される。様々な例において、不活性ガスは、窒素である。実施形態では、工程（ｄ）は、凍結乾燥製剤を収容している容器（例えば、バイアル）の施栓を容易にし得る。実施形態では、方法は、凍結乾燥製剤を約２℃～約８℃の範囲の温度で保存することをさらに含む。実施形態では、方法は、凍結乾燥製剤を水で再構成することをさらに含む。

【0024】

さらに別の態様では、本開示は、本明細書に開示される方法によって調製された凍結乾燥タンパク質製剤を提供する。いくつかの実施形態では、タンパク質製剤は、アニーリング工程を欠く、本明細書に開示される方法によって調製される。

【0025】

凍結乾燥タンパク質製剤
本明細書に記載の凍結乾燥タンパク質製剤は、タンパク質、糖類、界面活性剤及び任意選択的に緩衝剤を含み、約３～約７（又は約３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５若しくは７）のｐＨを有する。いくつかの例では、ｐＨは、約４～約６である。いくつかの例では、製剤のｐＨは、約４又は約４．２である。様々な例において、製剤のｐＨは、約５である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、約６である。実施形態では、本明細書に開示される凍結乾燥製剤は、糖アルコールを含有しない。本明細書で使用する場合、「糖アルコール」は、各炭素原子に１つのヒドロキシ基が結合した直鎖状ポリオールを指す。本明細書で使用する糖アルコールの例としては、キシリトール、エリトリトール、マンニトール及びソルビトールが挙げられる。実施形態では、凍結乾燥製剤は、マンニトールを含有しない。

【0026】

タンパク質
いくつかの実施形態では、凍結乾燥製剤のタンパク質は、抗原結合タンパク質である。「抗原結合タンパク質」は、特異的な標的抗原（ＣＤ３及び／若しくはＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２又はＭＵＣ１７など）に結合するドメインを含むタンパク質である。抗原結合タンパク質は、抗原結合ドメインが、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する立体構造を取ることを可能にする骨格又はフレームワーク部分を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、凍結乾燥製剤の抗原結合タンパク質は、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗原結合抗体断片である。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、抗体である。用語「抗体」は、インタクトな抗原結合免疫グロブリンを指す。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含むＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体であり得る。様々な実施形態において、インタクトな抗体は、２本の全長重鎖及び２本の全長軽鎖を含む。抗体は、１つの可変領域及び１つの定常領域を有する。ＩｇＧ形式において、１つの可変領域は、一般に、約１００～１１０個以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗原認識に主に関与し、且つ異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に変動する。１つの可変領域は、通常、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７（前掲）も参照されたい）内にある。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。

【0028】

いくつかの実施形態では、製剤の抗体は、二重特異性抗原結合分子、すなわち２つの異なる標的（例えば、ＣＤ３及び第２の異なる標的）に結合する抗体である。本明細書で使用する用語「二重特異性」は、２つの異なる標的抗原に結合する抗原結合分子又は構築物を指し、すなわち、それは、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、第１の結合ドメインは１つの抗原又は標的（例えば、標的細胞の表面抗原）に結合し、第２の結合ドメインは別の抗原又は標的（例えば、ＣＤ３）に結合する。したがって、本開示による抗原結合分子は、２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を含む。用語「標的細胞表面抗原」は、細胞により発現される抗原性構造を指し、本明細書に記載されるような抗原結合分子又は抗原結合構築物がアクセス可能であるように細胞表面に存在する。標的細胞表面抗原は、タンパク質の細胞外部分などのタンパク質又は糖タンパク質などのタンパク質の炭水化物構造などの炭水化物構造であり得る。標的細胞表面抗原は、腫瘍抗原であり得る。本開示は、三重特異性抗原結合分子若しくは構築物（後者は、３つの結合ドメインを含む）又は３つを超える（例えば、４つ、５つ．．．）特異性を有する構築物などの多重特異性抗原結合分子若しくは構築物も包含する。

【0029】

本明細書で理解される二重特異性抗体及び／又は抗原結合分子若しくは構築物としては、従来型の二重特異性免疫グロブリン（例えば、ＢｓＩｇＧ）、付加された抗原結合ドメインを含むＩｇＧ（例えば、軽鎖又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端が、単一ドメイン抗体又は対になった抗体可変ドメイン（例えば、Ｆｖ又はｓｃＦｖ）などの追加の抗原結合ドメインに連結されている）、ＢｓＡｂ断片（例えば、二重特異性一本鎖抗体）、二重特異性融合タンパク質（例えば、エフェクター部分に融合された抗原結合ドメイン）及びＢｓＡｂコンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。二重特異性構築物の例としては、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））形式（リンカーによって結合される２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質）及びＦａｂ２二重特異性体並びに全長抗体を含む改変された構築物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ １［６］：１－９；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３［９］：１１２６－１１３６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５［１１］：１２９０－１２９７；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ １［２］：１２８－１４１；国際公開第２００９／０３２７８２号パンフレット及び同第２００６／０２０２５８号パンフレット；Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３［５］：３６１－３６７；米国特許出願公開第２００２／０１０３３４５号明細書；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１［１６］：１０７０６－１０７１４；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０［２０］：１９６６５－１９６７２；並びにＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２０１２ ＭＡｂｓ ４（２）：１８２を参照されたい（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0030】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される凍結乾燥製剤は、標的細胞表面抗原に結合する第１の結合ドメイン、Ｔ細胞表面のヒトＣＤ３に結合する第２の結合ドメイン及び任意選択的にアミノからカルボキシルの順にヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン－リンカー－ヒンジ－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインを含む第３のドメインを含む二重特異性抗原結合分子又は構築物を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の結合ドメインのそれぞれは、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。

【0031】

本明細書で使用する用語「結合ドメイン」は、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位、例えばＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２又はＭＵＣ１７及びＣＤ３にそれぞれに（特異的に）結合する／と相互作用する／を認識するドメインを指す。

【0032】

第１の結合ドメイン（例えば、ＣＤＨ１９、ＭＳＬＮ、ＤＬＬ３、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２又はＭＵＣ１７を認識する）の構造及び機能並びにまた第２の結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／又は機能は、抗体、例えば全長若しくは全免疫グロブリン分子の構造及び／若しくは機能に基づき、且つ／又は抗体若しくはその断片の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び／若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに由来する。実施形態では、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在を特徴とする。実施形態では、第２の結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小限の構造的要件も含む。実施形態では、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列を足場にグラフトするのではなく、ファージディスプレイ又はライブラリースクリーニング法によって作製するか又は得ることが想定される。

【0033】

いくつかの実施形態では、標的細胞の表面抗原に結合する第１の結合ドメイン及び／又はＣＤ３εに結合する第２の結合ドメインは、ヒト結合ドメインである。少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗原結合分子又は構築物は、齧歯類（例えばマウス、ラット、ハムスター又はウサギ）などの非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体構築物に関連する問題のいくつかを回避する。このような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗原結合分子若しくは構築物の迅速なクリアランスをもたらすか、又は患者による抗体又は抗原結合分子若しくは構築物に対する免疫応答を発生させる可能性がある。齧歯類由来の抗体又は抗原結合分子若しくは構築物の使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗原結合分子を生成することができる。

【0034】

いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、単鎖抗原結合分子を含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー及び可変軽鎖ドメインを含む。任意選択的に、可変軽鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端は、可変重鎖のＮ末端に結合される（Ｎ－ｖｈ－リンカー－ｖｌ－Ｃ）が、配置は切り換えることができる（Ｎ－ｖｌ－リンカー－ｖｈ－Ｃ）。代わりに、可変重鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端は、可変軽鎖のＮ末端に結合される（Ｎ－ｖｌ－リンカー－ｖｈ－Ｃ）が、配置は切り換えることができる（Ｎ－ｖｈ－リンカー－ｖ－Ｃ）。したがって、ｓｃＦｖの描写及び説明において、どちらの向きのｓｃＦｖも特定的に含まれる。

【0035】

本開示の抗原結合ポリペプチドの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメイン（ＶＨ／ＶＬ）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも又は含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本開示の抗原結合分子の一方の（可変及び／又は結合）ドメイン並びにもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を互いに連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、第３のドメインを本開示の抗原結合分子の他のドメインに融合させるためにも使用され得る。このようなペプチドリンカーの特徴は、重合活性を含まないことである。好適なペプチドリンカーとしては、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されたものがあり、これらの文献の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ペプチドリンカーは、本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子に他のドメイン又はモジュール又は領域（例えば、半減期延長ドメイン）を付加するためにも使用することができる。

【0036】

いくつかの実施形態では、第３のドメインは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除外する抗体の定常領域を含むポリペプチドを指す、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」を含む。したがって、「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン並びにこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルなヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下位のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ＩｇＧ抗体である（いくつかのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない）を含む）。Ｆｃ領域の境界は異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６又はＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義される（ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う）。いくつかの実施形態では、アミノ酸の改変は、Ｆｃ領域に対してなされ、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体又はＦｃＲｎ受容体への結合を変化させる。

【0037】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される製剤は、ヒトＣＤ３及びヒトＣＤＨ１９、又はヒトＣＤ３及びヒトＭＳＬＮ、又はヒトＣＤ３及びヒトＤＬＬ３、又はヒトＣＤ３及びヒトＦＬＴ３、又はヒトＣＤ３及びヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ、又はヒトＣＤ３及びヒトＢＣＭＡ、又はヒトＣＤ３及びＰＳＭＡ、又はヒトＣＤ３及びヒトＣＤ３３、又はヒトＣＤ３及びヒトＣＤ１９、ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ７０、又はヒトＣＤ３及びヒトＭＵＣ１７、又はヒトＣＤ３及びヒトＣＬＤＮ１８．２、又はヒトＣＤ３及びヒトＣＬＤＮ６に結合する二重特異性抗原結合分子を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第１の結合ドメインは、（ａ）配列番号２４～２９、（ｂ）配列番号３４～３９、（ｃ）配列番号７８～８３、（ｄ）配列番号１０～１５、（ｅ）配列番号４６～５１、（ｆ）配列番号８８～９３、（ｇ）配列番号６７～７２、（ｈ）配列番号５６～６１、（ｉ）配列番号１１２～１１７、（ｊ）配列番号１００～１０５、（ｋ）配列番号１４８～１５３、配列番号１５７～１６２、若しくは配列番号１６６～１７１、若しくは配列番号１７５～１８０、（ｌ）配列番号１３２～１３７、又は（ｍ）配列番号１２３～１２８に示した６つのＣＤＲからなるセットを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号３０、４０、８４、１６、１７、５２、９４、７３、６２、１１８、１５４、１６３、１７２、１８１、１０６、１３８、１４３又は１２９に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一）であるアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号３０、４０、８４、１６、１７、５２、９４、７３、６２、１１８、１５４、１６３、１７２、１８１、１０６、１３８、１４３又は１２９に示されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号３１、４１、８５、１８、１９、５３、９５、７４、６３、１１９、１５５、１６４、１７３、１８２、１０７、１３９、１４４又は１３０に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一）であるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第１の結合ドメインは、配列番号３１、４１、８５、１８、１９、５３、９５、７４、６３、１１９、１５５、１６４、１７３、１８２、１０７、１３９、１４４又は１３０に示されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、（ａ）配列番号３０に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号３１に示したＶＬ領域；（ｂ）配列番号４０に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号４１に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｃ）配列番号８４に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号８５に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｄ）配列番号１６若しくは１７に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１８若しくは１９に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｅ）配列番号５２に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号５３に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｆ）配列番号９４に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号９５に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｇ）配列番号７３に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号７４に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｈ）配列番号６２に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号６３に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｉ）配列番号１１８に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１１９に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｊ）配列番号１５４、１６３、１７２若しくは１８１に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１５５、１６４、１７３若しくは１８２に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｋ）配列番号１０６に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１０７に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；（ｌ）配列番号１３８若しくは１４３に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１３９若しくは１４４に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域；又は（ｍ）配列番号１２９に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号１３０に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。

【0042】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号１～６に示した６つのＣＤＲからなるセットを含む。

【0043】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号７に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）であるアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号７に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号８に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％同一（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一）であるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子の第２の結合ドメインは、配列番号８に示されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ａ）配列番号７に示されたアミノ酸配列を含むＶＨ領域及び配列番号８に示されたアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９可変軽鎖ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９可変重鎖ドメインを含むＣＤ１９に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号８７に示されたアミノ酸配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む抗ＭＳＬＮ可変軽鎖ドメイン及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＭＳＬＮ可変重鎖ドメインを含むＭＳＬＮに結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号４３、４４又は４５に示されたアミノ酸配列を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ３可変軽鎖ドメイン及び配列番号７３のアミノ酸配列を含む抗ＤＬＬ３可変重鎖ドメインを含むＤＬＬ３に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号７６又は７７に示されたアミノ酸配列を含む。

【0049】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む抗ＦＬＴ３可変軽鎖ドメイン及び配列番号６２のアミノ酸配列を含む抗ＦＬＴ３可変重鎖ドメインを含むＦＬＴ３に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号６５又は６６に示されたアミノ酸配列を含む。

【0050】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ可変軽鎖ドメイン及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ可変重鎖ドメインを含むＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３３に示されたアミノ酸配列を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ可変軽鎖ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ可変重鎖ドメインを含むＢＣＭＡに結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号９８又は配列番号９７に示されたアミノ酸配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１９又は１０７のアミノ酸配列を含む抗ＰＳＭＡ可変軽鎖ドメイン及び配列番号１１８又は１０６のアミノ酸配列を含む抗ＰＳＭＡ可変重鎖ドメインを含むＰＳＭＡに結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２０又は１０８のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２１、１２２、１０９、１１０又は１１１に示されたアミノ酸配列を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８又は１９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３可変軽鎖ドメイン及び配列番号１６又は１７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３可変重鎖ドメインを含むＣＤ３３に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１８９又は１９０のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２０、２１、２２又は２３に示されたアミノ酸配列を含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤＨ１９可変軽鎖ドメイン及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む抗ＣＤＨ１９可変重鎖ドメインを含むＣＤＨ１９に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号５５に示されたアミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１５５、１６４、１７３又は１８２のアミノ酸配列を含む抗ＭＵＣ１７可変軽鎖ドメイン及び配列番号１５４、１６３、１７２又は１８１のアミノ酸配列を含む抗ＭＵＣ１７可変重鎖ドメインを含むＭＵＣ１７に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１５６、１６５、１７４又は１８３に示されたアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３９又は１４４のアミノ酸配列を含む抗ｃｌｄｎ１８．２可変軽鎖ドメイン及び配列番号１３８又は１４３のアミノ酸配列を含む抗ｃｌｄｎ１８．２可変重鎖ドメインを含むｃｌｄｎ１８．２に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１４０又は１４５のアミノ酸配列を含む第１の結合ドメイン及び配列番号９のアミノ酸配列を含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１４１、１４２、１４６又は１４７に示されたアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０可変軽鎖ドメイン及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０可変重鎖ドメインを含むＣＤ７０に結合する第１の結合ドメイン並びに配列番号７のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変重鎖ドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３可変軽鎖ドメインを含む第２の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３１に示されたアミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、製剤のタンパク質は、抗体である。様々な実施形態において、製剤のタンパク質は、二重特異性抗原結合分子である。いくつかの例では、製剤のタンパク質は、半減期延長二重特異性抗原結合分子である。半減期延長二重特異性抗原結合分子は、本明細書では既に説明している。いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質製剤は、配列番号１～１９０に示されたアミノ酸配列を含む。様々な実施形態において、本開示のタンパク質製剤は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３１、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１５６、配列番号１６５、配列番号１７４、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７又は配列番号１８８に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの例では、本開示のタンパク質製剤は、配列番号２２（ＢｉＴＥ Ａ）、配列番号７７（ＢｉＴＥ Ｂ）、配列番号８７（ＢｉＴＥ Ｃ）又は配列番号９７（ＢｉＴＥ Ｄ）に示されたアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、抗体又は二重特異性のもの（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗体構築物）などのタンパク質は、（凍結乾燥前の）液体製剤中に約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの範囲（又は約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ若しくは１００ｍｇ／ｍＬ）の量で存在する。様々な実施形態において、タンパク質は、液体製剤中に約０．１ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で存在する。いくつかの例では、タンパク質は、液体製剤中に約０．５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲（又は約０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２１ｍｇ／ｍＬ、２２ｍｇ／ｍＬ、２３ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２６ｍｇ／ｍＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、２８ｍｇ／ｍＬ、２９ｍｇ／ｍＬ若しくは３０ｍｇ／ｍＬ）の量で存在する。様々な例において、タンパク質は、液体製剤中に約１ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの範囲（又は約１ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、５．５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１０．５ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１１．５ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１２．５ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１３．５ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍｌ、１４．５ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１５．５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１６．５ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１７．５ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１８．５ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、１９．５ｍｇ／ｍＬ若しくは２０ｍｇ／ｍＬ）の量で存在する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、液体製剤中に約１ｍｇ／ｍＬの量で存在する。

【0060】

糖類
本開示のタンパク質製剤は、糖類を含む。いくつかの実施形態では、糖類は、単糖又は二糖である。好適な糖類としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、糖類は、スクロースを含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、（凍結乾燥前の）液体製剤は、約１％～約１５ｗ／ｖ％、又は約４％～約１３ｗ／ｖ％、又は約６％～約１２ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％又は少なくとも１４ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％又は約１５ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１０．５％、約１１％、約１１．５％又は約１２ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約７％～約１２ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約９ｗ／ｖ％の濃度で糖類を含む。いくつかの実施形態では、糖類は、スクロースであり、液体製剤中に約６％～約１２ｗ／ｖ％の範囲の濃度で存在する。いくつかの例では、糖類は、スクロースであり、液体製剤中に約９ｗ／ｖ％の濃度で存在する。

【0062】

界面活性剤
本開示のタンパク質製剤は、界面活性剤を含む。好適な界面活性剤としては、ポリソルベート、ポロキサマー、ポリオキシエチレン又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。企図される界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、トリトンＸ－１００、ポリオキシエチレン、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベートを含む。いくつかの例では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

【0063】

本明細書に記載のタンパク質製剤は、１つの界面活性剤又は界面活性剤の混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、（凍結乾燥前の）液体製剤は、約０．００１％～約５ｗ／ｖ％（又は約０．００１％～約０．５％、又は約０．００４～約０．５ｗ／ｖ％、又は約０．００１～約０．０１ｗ／ｖ％、又は約０．００４～約０．０１ｗ／ｖ％）の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、少なくとも０．００１、少なくとも０．００２、少なくとも０．００３、少なくとも０．００４、少なくとも０．００５、少なくとも０．００７、少なくとも０．０１、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０又は少なくとも４．５ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．００１％～約０．５ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．００１％～約０．１ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．００１％～約０．０１ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．００１％、約０．００２％、約０．００３％、約０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％又は約０．５ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、液体製剤は、約０．００１％～約０．０１ｗ／ｖ％の濃度で界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０であり、ポリソルベート８０は、約０．０１ｗ／ｖ％の濃度で存在する。

【0064】

緩衝剤
本開示のタンパク質製剤は、任意選択的に緩衝剤を含む。好適な緩衝液としては、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、マレイン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、リン酸緩衝剤、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸緩衝剤又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、緩衝剤は、グルタミン酸を含む。

【0065】

緩衝剤は、製剤のｐＨを制御するためによく利用される。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約３～約７、又は約４～約６、約４～５、又は約４．２の製剤のｐＨを維持する濃度で添加される。製剤に対するｐＨの影響は、加速安定性試験及び熱量測定スクリーニング試験などのいくつかの手法のいずれか１つ以上を使用して特徴付けられ得る（Ｒｅｍｍｅｌｅ Ｒ．Ｌ．Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８（１６）：５２４１－７（１９９９））。

【0066】

タンパク質製剤中に存在する緩衝系は、生理学的に適合性があり、且つ所望のｐＨを維持するように選択される。緩衝剤は、（凍結乾燥前の）液体製剤中に約０．１ｍＭ～約１０００ｍＭ（１Ｍ）、又は約５ｍＭ～約２００ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で存在し得る。好適な緩衝剤濃度には、約２００ｍＭ以下の濃度が包含される。いくつかの実施形態では、（凍結乾燥前の）液体製剤中において、緩衝剤は、約１９０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１００ｍＭ、約８０ｍＭ、約７０ｍＭ、約６０ｍＭ、約５０ｍＭ、約４０ｍＭ、約３０ｍＭ、約２０ｍＭ、約１０ｍＭ又は約５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、少なくとも０．１、０．５、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、７００又は９００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、１、１．２、１．５、１．７、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０ｍＭ～１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０又は４０ｍＭ～５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭである。

【0067】

いくつかの実施形態では、（凍結乾燥前の）液体タンパク質製剤は、約４．２のｐＨを有し、且つ約１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、約９．０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。

【0068】

凍結乾燥タンパク質製剤の安定性
本明細書に開示される方法は、有利には、液体で再構成した際の、タンパク質の、凝集などの物理的劣化の減少並びにクリッピング及び脱アミド化などの化学的劣化の減少を示す凍結乾燥タンパク質製剤をもたらす。凍結乾燥タンパク質製剤の再構成に使用される液体は、当技術分野で知られている任意の好適な液体であり得る。実施形態では、凍結乾燥タンパク質製剤は、水で再構成することができる。さらに、本明細書で開示する凍結乾燥法は、抗体及び二重特異性抗原結合分子（例えば、半減期延長二重特異性抗体構築物）を含有する製剤などのタンパク質製剤を低濃度及び高濃度のいずれであっても安定化させることができる。

【0069】

抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）を含有する製剤などのタンパク質製剤の安定性は、いくつかの方法で定量化することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質製剤の安定性は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥ－ＨＰＬＣ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、超遠心分析（ＡＵＣ）、フィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）、等電点電気泳動法及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、抗体製剤などのタンパク質製剤の安定性は、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動法（ＣＥ－ＳＤＳ）及び／又はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって測定される部分解離によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、製剤の安定性は、還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム法（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって評価される。ｒＣＥ－ＳＤＳ法は、還元条件下で重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、非グリコシル化ＨＣ（ＮＧＨＣ）及び他の微細なピーク種及び基を分離する。

【0070】

いくつかの実施形態では、製剤の安定性は、抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質の高分子量（ＨＭＷ）種の量又は様々な時点の貯蔵条件後のタンパク質のＨＭＷ種の量の増加速度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、タンパク質のＨＭＷ種の量は、再構成後、およそ４℃又は４０℃で貯蔵した場合の１週間後、２週間後、１か月後、３か月後、６か月後又は１２か月後に決定される。いくつかの実施形態では、タンパク質のＨＭＷ種の増加速度は、再構成後、およそ４℃又は４０℃で貯蔵した場合の１週間後、２週間後、１か月後、３か月後、６か月後又は１２か月後に決定される。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質のＨＭＷ種は、ＳＥ－ＵＨＰＬＣによって測定される。

【0071】

抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質の安定性及び製剤がタンパク質の安定性を維持する能力は、長期間（例えば、数週間又は数か月）にわたって評価することができる。製剤の観点において、安定な製剤とは、その中の抗体又は二重特異性抗原結合分子（例えば、ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質が、貯蔵時並びに凍結／解凍、機械的混合及び凍結乾燥などのプロセス中、その物理的及び／若しくは化学的完全性並びに／又は生物学的活性を実質的に維持する製剤である。タンパク質の安定性は、例えば、高分子量（ＨＭＷ）凝集体の形成のレベル及び／又は速度、電荷プロファイルのシフト並びに粒径の変化を測定することによって評価することができる。

【0072】

いくつかの実施形態では、インタクトなＢｉＴＥ（登録商標）分子若しくは主要種、又は高分子量（ＨＭＷ）種（すなわち凝集体）、又は低分子量（ＬＭＷ）種（すなわち断片）など、タンパク質の任意の特定の種の相対値は、全生成物の各数値に対して表示される。例えば、いくつかの実施形態では、抗体又は二重特異性抗原結合分子などのタンパク質の２．５％以下（例えば、２．５％、又は２％、又は１．９％、又は１．８％、又は１．７％、又は１．６％、又は１．５％、又は１．４％、又は１．３％、又は１．２％、又は１．１％、又は１％、又は０．５％）は、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種として存在する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１か月以上（例えば、１か月、３か月又は６か月）にわたって４℃で貯蔵すると、１％未満（例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％）増加する。いくつかの実施形態では、１か月以上（例えば、１か月、３か月又は６か月）にわたって４℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．４％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％又は０．４％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、１％未満（例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、０．５％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１か月以上（例えば、１か月、３か月、６か月、９か月又は１２か月）にわたって４０℃で貯蔵すると、０．５％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％０．１％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１か月間、４０℃で貯蔵すると、０．５％未満増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、１か月間、４０℃で貯蔵すると、０．３％未満増加する。いくつかの実施形態では、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．７％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％又は０．７％）増加する。いくつかの実施形態では、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．５％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％及び０．５％）増加する。いくつかの実施形態では、１か月以上（例えば、１か月、３か月、６か月、９か月又は１２か月）にわたって４０℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．５％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％及び０．５％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の二重特異性抗原結合分子のＨＭＷ種は、ＳＥ－ＵＨＰＬＣによって測定される。

【0073】

いくつかの実施形態では、製剤の安定性は、抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質の低分子量（ＬＭＷ）種の量又は様々な時点の貯蔵条件下のタンパク質のＬＭＷ種の量の増加速度によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＬＭＷ種の量は、およそ４℃又は４０℃で貯蔵した場合の１週間後、２週間後、１か月後、３か月後、６か月後又は１２か月後に決定される。いくつかの実施形態では、ＬＭＷ種の増加速度は、およそ４℃又は４０℃で貯蔵した場合の１週間後、２週間後、１か月後、３か月後、６か月後又は１２か月後に決定される。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのＬＭＷ種は、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム法（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって測定される。いくつかの実施形態では、製剤中の二重特異性抗原結合分子のＬＭＷ種は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される。

【0074】

いくつかの実施形態では、抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質の２％未満（例えば、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％又は０．５％）は、再構成された凍結乾燥製剤中に低分子量（ＬＭＷ）種として存在する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＬＭＷ種の量は、１か月以上（例えば、１か月、３か月又は６か月）にわたって４℃で貯蔵すると、２％未満（例えば、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１％又は０．５％）増加する。いくつかの実施形態では、１か月以上（例えば、１か月、３か月又は６か月）にわたって４℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＬＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．７％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％又は０．７％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のＬＭＷ種の量は、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、１％未満（例えば、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％）増加する。いくつかの実施形態では、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）、４０℃で貯蔵すると、再構成された凍結乾燥製剤中のＬＭＷ種の量は、およそ０．１％～０．７％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％．又は０．７％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の二重特異性抗原結合分子のＬＭＷ種は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の二重特異性抗原結合分子のＬＭＷ種は、還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム法（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって測定される。

【0075】

いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質（すなわちメインピーク種）のパーセントは、製剤中の全タンパク質含量の９５％超である。

【0076】

いくつかの実施形態では、製剤は、１か月にわたって約４℃で貯蔵しても安定であり、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、少なくとも１か月の貯蔵中、およそ０．１％～０．７％（例えば、０．１％、又は０．２％、又は０．３％、又は０．４％、又は０．５％、又は０．６％、又は０．７％）増加する。いくつかの実施形態では、製剤は、３か月にわたって約４℃で貯蔵しても安定であり、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、少なくとも３か月の貯蔵中、およそ０．０％～０．２％（例えば、０％、又は０．１％、又は０．２％）増加する。いくつかの実施形態では、製剤は、６か月にわたって約４℃で貯蔵しても安定であり、再構成された凍結乾燥製剤中のＨＭＷ種の量は、少なくとも６か月の貯蔵中、およそ０．０％～０．４％（例えば、０％、又は０．１％、又は０．２％、又は０．３％、又は０．４％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の二重特異性抗原結合分子のＨＭＷ種は、ＳＥ－ＵＨＰＬＣによって測定される。

【0077】

いくつかの実施形態では、製剤は、１か月、３か月及び６か月にわたって約４℃で貯蔵しても安定であり、抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質のパーセントは、全タンパク質含量の９５％超である。いくつかの実施形態では、製剤は、１か月、３か月、６か月、１２か月及び４８か月にわたり、約４℃で貯蔵しても安定であり、再構成後の抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質のパーセントは、全タンパク質含量の９６％超である。

【0078】

本明細書に記載の製剤の安定性は、電荷分布、例えば抗体又は二重特異性抗原結合分子（ＨＬＥ二重特異性抗原結合分子）などのタンパク質の電荷変化ピークの量における変化によっても特徴付けられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の酸性ピーク（例えば、相対的に低い等電点（ｐＩ）を有する電荷変化である脱アミド化）の量は、少なくとも１か月（例えば、１か月、３か月、６か月又は１２か月）にわたって４℃で貯蔵された場合、２％未満（例えば、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％又はそれ未満）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の塩基性ピーク（例えば、相対的に高いｐＩを有する電荷変化）の量は、少なくとも１か月（例えば、１か月、３か月、６か月又は１２か月）にわたって４℃で貯蔵された場合、６％未満（例えば、６％、５％、４％、３％、２％又は１％）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のメインピークの量は、少なくとも１か月にわたり４℃で貯蔵された場合、４％未満（例えば、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１％又はそれ未満）減少する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のメインピークの量は、少なくとも３か月にわたり４℃で貯蔵された場合、６％未満（例えば、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％又はそれ未満）減少する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のメインピークの量は、少なくとも６か月にわたり４℃で貯蔵された場合、９％未満（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％又はそれ未満）減少する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のメインピークの量は、少なくとも１２か月にわたり４℃で貯蔵された場合、９％未満（例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％又はそれ未満）減少する。

【0079】

いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の酸性ピークの量は、少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）にわたり４０℃で貯蔵された場合、３０％未満（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中の塩基性ピーク（例えば、相対的に高いｐＩを有する電荷変化）の量は、少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、１か月間又は３か月間）にわたり４０℃で貯蔵された場合、１５％未満（例えば、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、４％、３％、２％、１％又はそれ未満）増加する。いくつかの実施形態では、再構成された製剤中のメインピークの量は、少なくとも１か月にわたり４℃で貯蔵された場合、４％未満（例えば、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１％又はそれ未満）減少する。いくつかの実施形態では、再構成された凍結乾燥製剤中のメインピークの量は、少なくとも３か月にわたり４℃で貯蔵された場合、６％未満（例えば、６％、５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％又はそれ未満）減少する。

【0080】

本開示の方法によって凍結乾燥されたタンパク質製剤は、相当する液体タンパク質製剤より優れた安定性を示す。例えば、ｐＨ４．２で、１ｍｇ／ｍＬの本開示の二重特異性抗原結合分子、１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）のスクロース及び０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有するタンパク質製剤であって、アニーリング工程を使用する本開示によって凍結乾燥され、次いで再構成されたタンパク質製剤の安定性を、ドデシル硫酸ナトリウムを用いる還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）を行って、２５℃及び４０℃で１か月間貯蔵した後に生じたクリッピングの程度を決定した。

【0081】

本開示の凍結乾燥法は、有利には、低濃度及び高濃度のいずれのタンパク質製剤も安定化させる。例えば、ｐＨ４．２で、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ及び２３ｍｇ／ｍＬの本開示の二重特異性抗原結合分子、１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）のスクロース並びに０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有する本開示のタンパク質製剤であって、アニーリング工程を使用して凍結乾燥され、次いで再構成されたタンパク質製剤を、４０℃で１か月間貯蔵した後、ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣに供して、高分子量種の割合（ＨＭＷ％）によって製剤中の凝集の程度を決定した。

【0082】

アニーリング工程を欠いた本開示の凍結乾燥法は、驚くべきことに、アニーリング工程を含んだ凍結乾燥法よりも、タンパク質製剤の優れた安定性をもたらすことが明らかとなった。例えば、ｐＨ４．２で、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ又は２３ｍｇ／ｍＬの本開示の二重特異性抗原結合分子、１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）のスクロース及び０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有するタンパク質製剤であって、アニーリング工程あり及びアニーリング工程なしで凍結乾燥させたタンパク質製剤を、再構成後にＳＥ－ＵＨＰＬＣに供して、各試料における凝集の量を決定した。

【0083】

以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図されない。

【実施例】

【0084】

一般手順
ドデシル硫酸ナトリウムを用いる還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）は、還元及び変性条件下でタンパク質をその流体力学的サイズの違いに基づいて分離する。タンパク質種は、アニオン性洗剤であるＳＤＳに結合し、ＳＤＳゲル緩衝剤が充填された裸の溶融石英キャピラリー内に電気動力学的に注入される。電圧はキャピラリー全体に印加され、その下においてＳＤＳでコーティングされたタンパク質が親水性ポリマーベース溶液中での移行におけるそれらの差によって分離される。タンパク質は、ＵＶ検出窓を通過するとき、光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器によって検出される。純度は、リーチ成分の正確なピーク面積率を決定することによって評価される。ｒＣＥ－ＳＤＳ法は、還元条件下で重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、非グリコシル化ＨＣ（ＮＧＨＣ）及び他の微細なピーク種及び基を分離する。ドデシル硫酸ナトリウムによる還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）を、試料をＳＤＳ－ＭＷ還元ゲル中で７０＋／－１０℃で１０分間、したがって６０～８０℃で１０分間インキュベートし、その後、室温に戻すことによって行った。インキュベーション後、試料を遠心分離し、次いで、電気動力学的注入により、内径５０μｍを有する裸の６７ｃｍ溶融石英キャピラリーに電気動力学的に注入した。キャピラリーの有効長は３０．２ｃｍであった。ＣＥ－ＳＤＳゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、Ｃａｌｉｆ．）及び３０ｋＶ実効電圧を用いて分離を行った。検出は、ＵＶ吸光度によって２２０ｎｍで実施した。

【0085】

凍結乾燥ケーキの目視検査。サイクルの完了後、乾燥製品ケーキを、その巨視的な崩壊の兆候及び全体的な品質を目視検査によって評価した。ＢＩＴＥ Ｂの製品ケーキは、許容可能であると決定され、いくつかの角度から撮影された写真を図１に示す。インタクトな視覚的ケーキ構造は、サイクルパラメータが試料バイアル全体で適切な乾燥及び均質性を可能にするという予備的指標として機能する。

【0086】

サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）。ＳＥ－ＵＨＰＬＣは、タンパク質をその流体力学的体積の違いに基づいて分離する。より高い流体力学的体積を有する分子は、より小さい体積を有する分子より先に溶出する。試料を、ＳＥ－ＵＨＰＬＣカラム（ＢＥＨ２００、４．６×１５０ｍｍ、（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１８６００５２２６））にロードし、均一濃度で分離させ、溶出液をＵＶ吸光度によってモニターした。純度は、全積分面積と比較した各分離成分の割合を算出することによって決定した。ＳＥ－ＵＨＰＬＣの設定は以下のとおりである：流量：０．４ｍＬ／分、実行時間：９分、ＵＶ検出：２２０ｎｍ（２８０ｎｍは抗体を含むタンパク質のために選択される一般的な波長であるが、大部分の二重特異性分子は２２０ｎｍで検出される）。カラム温度：周囲温度、標的タンパク質負荷：１０μｇ、タンパク質適合性フローセル：５ｍｍ。このサイクルを用いて許容される水分含量が達成可能であることを決定した後、ＢｉＴＥ Ｂの乾燥製品バイアルを、５℃、２５℃及び４０℃で、合計４週間、安定に置いた。この期間中、試料バイアルを２週及び４週に抜き取り、それらの凝集をＳＥ－ＵＨＰＬＣによって評価した。サンプルを再構成し、旋回させて混合し、そのまま注入した。高分子量（ＨＭＷ）種の相対面積％値が図２に経時的にプロットされており、このデータは、研究の過程で凝集の不安定さがないことを示唆しており、提案されたサイクルを使用することによって凝集が導入されなかったという結論を裏付けている。

【0087】

カールフィッシャー滴定（水分含量）。提案されたサイクルの乾燥効率をより正確に評価するために、製品ケーキの水分含量をカールフィッシャー滴定によって評価した。許容基準は５ｗ／ｗ％程度の水分含有量を許容するが、水分含量は２％未満であることが非常に好ましい。本発明のサイクルを使用して乾燥したＢＩＴＥ Ｂ製品ケーキを、以前に最先端のＢｉＴＥを使用して製造されたケーキと比較し、表１に示すように、水分含量が許容可能であり、且つ競争力のあるものであることがわかった。

【0088】

【表1】

【0089】

タンパク質製剤。ｐＨ４．２で、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ又は２３ｍｇ／ｍＬの濃度のインタクトな二重特異性抗原結合分子、１０ｍＭのＬ－グルタミン酸、９％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含むタンパク質製剤を調製した。このタンパク質製剤を、（アニーリング工程のない）凍結乾燥用バイアルに入れた。

【0090】

実施例１
アニーリング工程なしでの二重特異性抗原結合分子製剤の凍結乾燥
Ｓｃｈｏｔｔ ＩＳＯ ６ＲガラスバイアルからなるＦＩＨ ＢｉＴＥプラットフォーム条件を満たす充填バイアルに、１．３ｍＬの溶液を充填し、Ｄ－７７７ ２０ｍｍエラストマーフルオロポリマーで栓をした。サイクルの開発及び分析制御の目的のために、Ｇ４２ＳｕＴ（１０ｍＭのグルタミン酸、９．０ｗ／ｗ％のスクロース、０．０１％のポリソルベート８０、ｐＨ４．２）と称する製剤緩衝液を、全体を通して使用した。ＢＩＴＥ Ｂ製剤を含有する試料バイアルもＧ４２ＳｕＴ中において１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で製剤化する。ＳＥ－ＵＨＰＬＣ法では、ＢＩＴＥ Ｂをシステム適合性の目的で使用する。カールフィッシャー滴定のための標準として、水分含量１％及び５％の標準を使用する。

【0091】

加速凍結乾燥サイクル
約３２．７時間の最終時間で、これは、従来の凍結乾燥サイクルと比較して、およそ６７％の時間の減少を表す。さらに、このサイクルでは、アニーリングとして知られる任意選択的なフェーズが除かれ、これは、乾燥均一性をより促進すると考えられるが、最近、凍結乾燥ＢｉＴＥ様分子中の生成物凝集と相関している。

【0092】

液体タンパク質製剤を上記のように調製し、凍結乾燥チャンバーに導入した。チャンバーを５℃のロード温度から－４５℃まで０．５℃／分の速度で冷却し、－４５℃で２時間保持した。その後、０．３℃／分で昇温させ、約－２７℃の温度及び１００ｍＴｏｒｒのチャンバー圧で１６．７時間一次乾燥を行った。２次乾燥を、０．４℃／ｍｉｎの速度及び７０ｍＴｏｒｒの圧力で２５℃に昇温させ、７０ｍＴｏｒｒの圧力で８．３時間にわたって行った。バイアルの施栓を可能にするために、チャンバーの温度を５℃まで低下させ、５００ｍＴｏｒｒにおいて凍結乾燥チャンバーに窒素を給気した。凍結乾燥タンパク質製剤を含有するバイアルを凍結乾燥チャンバーから取り出し、さらなる処理及び解析まで、２～８℃で貯蔵した。本発明のサイクルを使用する全サイクル時間は、以前のサイクル条件を使用する７０時間（正確には７２．７時間）を超えるサイクル時間に対して、３２．７時間であった。表２に、加速及び確立された凍結乾燥サイクルのパラメータを示す。

【0093】

【表2】

【0094】

上記の説明は、明確な理解のために示されているにすぎず、そこから、余計な限定があるものと解釈すべきではなく、なぜなら、本発明の範囲に含まれる改変形態が当業者に明らかであり得るためである。

【0095】

本明細書及び続く特許請求の範囲を通して、文脈上別段の解釈が必要でない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などの変形は、明記された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を排除するものではないことが理解されるであろう。

【0096】

値の範囲を記載する場合、記載されている特徴は、範囲内にある個々の値であり得ることを理解すべきである。例えば、「約ｐＨ４～約ｐＨ６のｐＨ」は、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５（これらに限定されない）など、及びそのような値間の任意の値であり得る。さらに、「約ｐＨ４～約ｐＨ６のｐＨ」は、目的の製剤のｐＨが保管中にｐＨ４～ｐＨ６の範囲において２ｐＨ単位で変動するという意味で解釈されるべきではなく、むしろ溶液のｐＨについてその範囲内で値が選択され得、ｐＨがそのｐＨ付近で緩衝を維持されることを意味する。

【0097】

用語「約」が使用される場合、列挙された数に対してその列挙された数の５％、１０％、１５％又はそれを超えるものが加えられるか又は減じられることを意味する。意図される実際の変動は、文脈から決定可能である。

【0098】

本明細書を通して、組成物が成分又は材料を含むものとして記載される場合、別段の記載がない限り、組成物は、列挙された成分又は材料の任意の組み合わせから実質的になるか又はそれらからなり得ることも企図される。同様に、方法が特定の工程を含むと記載される場合、その方法は、別段の記載がない限り、列挙された工程の任意の組み合わせから実質的になるか又はそれらからなり得ることも企図される。本明細書に例示的に開示される本発明は、好適には、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又は工程の不在下で実施され得る。

【0099】

本明細書に開示される方法及びその個々の工程の実施は、手動で且つ／又は電子機器によって提供される自動化を用いて若しくは自動化を利用して行うことができる。方法を特定の実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば、その方法に関連した行為を行う他の方法を用い得ることを容易に理解するであろう。例えば、様々な工程の順序は、別段の記載がない限り、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく変更され得る。加えて、個々の工程のいくつかを組み合わせるか、省略するか又は追加の工程にさらに細分することができる。

【0100】

本明細書に記載の全ての特許、刊行物及び参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本開示と、組み込まれる特許、刊行物及び参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先されるべきである。

【図1】

【図2】

【配列表】

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【国際調査報告】