特表 2024-521368 環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-31

(54)【発明の名称】環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/57 20060101AFI20240524BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 9/64 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240524BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240524BHJP

   A61P 31/14 20060101ALN20240524BHJP

【ＦＩ】

C12N15/57 ZNA

C07K19/00

C07K16/00

C12N9/64

C12N15/62 Z

A61P11/00

A61K31/7088

A61K38/16

A61P31/14

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574669

(86)(22)【出願日】2022-06-03

(85)【翻訳文提出日】2024-02-01

(86)【国際出願番号】 CN2022097024

(87)【国際公開番号】W WO2022253340

(87)【国際公開日】2022-12-08

(31)【優先権主張番号】202110624105.4

(32)【優先日】2021-06-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202110765444.4

(32)【優先日】2021-07-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511015560

【氏名又は名称】中国科学院広州生物医薬及健康研究院

【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＨＥＡＬＴＨ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】１９０ Ｋａｉ Ｙｕａｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002734

【氏名又は名称】弁理士法人藤本パートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】劉 興国

(72)【発明者】

【氏名】劉 明

(72)【発明者】

【氏名】張 茂雷

(72)【発明者】

【氏名】▲シン▼ 広鎖

(72)【発明者】

【氏名】梁 珊

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA591

4C084ZA592

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA59

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

(57)【要約】

環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチド及びその使用を提供し、該環状ＲＮＡ分子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＲＮＡ配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された環状ＲＮＡ分子であって、前記環状ＲＮＡ分子は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＲＮＡ配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする単離された環状ＲＮＡ分子。

【請求項2】

前記環状ＲＮＡ分子はアンジオテンシン変換酵素２をコードするｍＲＮＡ配列の第２エキソン単独環化によって形成され、
任意選択に、前記環化は胎盤組織中に発生することを特徴とする請求項１に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項3】

前記環状ＲＮＡ分子は１）または２）に示すヌクレオチド配列の開始ヌクレオチドと末端ヌクレオチドが連結して形成され、前記開始ヌクレオチドは前記環状ＲＮＡ分子の１番目のヌクレオチドとして設定されることを特徴とする請求項１または２に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項4】

前記環状ＲＮＡ分子のコード領域は前記環状ＲＮＡ分子の１０４番目から４５番目のヌクレオチドを含み、
任意選択に、前記環状ＲＮＡコード領域の核酸配列は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＲＮＡ配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項5】

ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含むことを特徴とするポリペプチド。

【請求項6】

前記ポリペプチドはシグナルペプチド配列を含み、
任意選択に、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列はＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡであることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリペプチドは胎盤組織中に存在することを特徴とする請求項５または６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

融合タンパク質であって、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチドとＦｃを含み、前記ポリペプチドのＣ端はＦｃのＮ端に連結されることを特徴とする融合タンパク質。

【請求項9】

前記融合タンパク質は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

単離された核酸であって、請求項５－７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸。

【請求項11】

請求項８または９に記載の融合タンパク質をコードする前記核酸は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸の、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制するための薬物またはキットの調製における使用。

【請求項13】

新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制する方法であって、前記方法は、
新型コロナウイルスまたは感染対象細胞と請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸とを接触させるステップを含むことを特徴とする新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制する方法。

【請求項14】

前記接触は、
１）新型コロナウイルスと請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸とに第１の混合処理を行うステップと、
２）ステップ１）で得られた混合物と感染対象細胞とに第２混合処理を行い、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制するステップと、によって行われる請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ポリペプチドまたは融合タンパク質の混合系における最終濃度は１０μｇ／ｍＬまたは１６０μｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

新型コロナウイルス肺炎を治療または予防する方法であって、患者に、薬学的に許容できる請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸を投与するステップを含むことを特徴とする新型コロナウイルス肺炎を治療または予防する方法。

【請求項17】

請求項１～４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子、請求項５～７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸の、新型コロナウイルス肺炎の治療または予防における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年０６月０４日に中国国家知識産権局に提案された、出願番号が２０２１１０６２４１０５．４及び２０２１年０７月０７日に中国国家知識産権局に提案された、出願番号が２０２１１０７６５４４４．４の特許出願の優先権を主張し、その全部内容は援用により本願に組み込まれる。

【0002】

本発明はバイオ医薬の分野に関し、具体的に、本発明は、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチド及びその使用に関し、より具体的に、本発明は、単離された環状ＲＮＡ分子、単離された環状ＲＮＡ分子でコードされるポリペプチド、融合タンパク質、融合タンパク質をコードする単離された核酸、及び環状ＲＮＡ分子でコードされるポリペプチド、融合タンパク質、融合タンパク質をコードする単離された核酸の薬物またはキットの製造における使用、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制する方法、新型コロナウイルス肺炎を治療または予防する方法、及び新型コロナウイルス肺炎の治療または予防における使用に関する。

【背景技術】

【0003】

胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）は、妊娠中の胎児と母体との間の物質交換の重要な一時的な器官であるだけなく、胎児の発育中に病原性微生物による感染から胎児を保護することができ、胎盤細胞は妊娠母体から胎児へのウイルスの伝達を抑制する上で重要な役割を果たす可能性がある。新型コロナウイルス（ＣＯＶＩＤ－１９）のパンデミックは世界の健康に重大な影響を及ぼし、一部の研究グループは、ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスの母子垂直感染に一定の制限があると報告しており、データによると、新生児が母体からＣＯＶＩＤ－１９を感染させる割合は５％未満であり、胎盤組織に新型コロナを感染した母体からウイルスへの胎児の伝達を抑制する独特な抗ウイルス物質が存在することが示唆された。

【0004】

ポリペプチド薬物はすでに臨床で広く使用されており、典型的な代表は、インスリンポリペプチド薬物である。ポリペプチドの薬物代謝産物はアミノ酸であり、アミノ酸は人体に必須の元素であり、ポリペプチド薬物はタンパク質薬物と類似しているため、ポリペプチド薬物の毒性が小さく、安全性が高い。大規模なタンパク質及び抗体薬物に比べて、ポリペプチド薬物は免疫原性が低く、且つ人工的に合成しやすく、注射及び鼻腔霧化の投与に適し、優れた創薬性を有する。

【0005】

近年の研究では、多くの生物体から大量に存在した環状ＲＮＡ分子が発見し、環状ＲＮＡは真核生物に広く存在し、個体の発育や疾病の発生発展において重要な生物機能を有する。新型コロナウイルスによる疫病はすでに全世界で流行しており、それによって引き起した疾病はまだ特効と副作用が小さい治療薬物がないため、新しい視野から、新型コロナウイルスに対抗する理想的な薬物を発見、開発する必要がある。

【発明の概要】

【0006】

本願は、発明者が以下の事実と問題に対する発見と認識に基づいて作成されたものである。

【0007】

新型コロナウイルスがＡＣＥ２（アンジオテンシン２）と結合して細胞に感染するが、発明者は、環状ＲＮＡ ｃｉｒｃＡｔｌａｓ統合データベースの深さ分析マイニングと実験を行ったところ、ヒト胎盤組織中でＡＣＥ２遺伝子が特異的に環化剪断を起こし、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２を形成し、且つ該環状ＲＮＡがコードするポリペプチド及び該ポリペプチドを利用して得られた組換えポリペプチドはＣＯＶＩＤ－１９が真核細胞を感染するのを抑制する能力を有することを発見した。

【0008】

このため、本発明の第１の態様では、本発明は、単離された環状ＲＮＡ分子を提供する。本発明の実施例によれば、前記環状ＲＮＡ分子は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＲＮＡ配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含む。

【0009】

本発明の実施例によれば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の具体的な配列は、
ＣＧＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＧＵＵＣＡＡＡＧＧＣＵＧＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＡＧＧＵＵＵＵＡＧＵＣＵＡＧＧＧＡＡＡＧＵＣＡＵＵＣＡＧＵＧＧＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＧＧＣＵＣＡＣＡＧＧＧＧＡＣＧＡＵＧＵＣＡＡＧＣＵＣＵＵＣＣＵＧＧＣＵＣＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＵＧＵＵＧＣＵＧＵＡＡＣＵＧＣＵＧＣＵＣＡＧＵＣＣＡＣＣＡＵＵＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＵＵＵＵＵＧＧＡＣＡＡＧＵＵＵＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＵＧＵＵＣＵＡＵＣＡＡＡＧＵＵＣＡＣＵＵＧＣＵＵＣＵＵＧＧＡＡＵＵＡＵＡＡＣＡＣＣＡＡＵＡＵＵＡＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣＡＡＡＡＣＡＵＧである。

【0010】

本発明の実施例による環状ＲＮＡ配列翻訳によるポリペプチドは細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0011】

本発明の実施例によれば、上記環状ＲＮＡ分子はさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0012】

本発明の実施例によれば、前記環状ＲＮＡ分子はアンジオテンシン変換酵素２をコードするｍＲＮＡ配列の第２エキソン単独環化によって形成される。

【0013】

本発明の実施例によれば、前記環化は胎盤組織中で発生する。

【0014】

本発明の実施例によれば、前記環状ＲＮＡ分子は、１）または２）に示すヌクレオチド配列の開始ヌクレオチドと末端ヌクレオチドとが連結することにより形成され、前記開始ヌクレオチドは、前記環状ＲＮＡ分子の１番目のヌクレオチドとして設定される。

【0015】

本発明の実施例によれば、前記環状ＲＮＡコード領域は前記環状ＲＮＡ分子の１０４番目から４５番目までのヌクレオチドを含む。

【0016】

本発明の実施例によれば、前記環状ＲＮＡコード領域の核酸配列は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＲＮＡ配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含む。

【0017】

本発明の実施例によれば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の具体的な配列は、
ＡＵＧＵＣＡＡＧＣＵＣＵＵＣＣＵＧＧＣＵＣＣＵＵＣＵＣＡＧＣＣＵＵＧＵＵＧＣＵＧＵＡＡＣＵＧＣＵＧＣＵＣＡＧＵＣＣＡＣＣＡＵＵＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＵＵＵＵＵＧＧＡＣＡＡＧＵＵＵＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＵＧＵＵＣＵＡＵＣＡＡＡＧＵＵＣＡＣＵＵＧＣＵＵＣＵＵＧＧＡＡＵＵＡＵＡＡＣＡＣＣＡＡＵＡＵＵＡＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＵＧＵＣＣＡＡＡＡＣＡＵＧＣＧＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＧＵＵＣＡＡＡＧＧＣＵＧＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＵＣＵＣＡＵＧＡである。

【0018】

本発明の実施例による環状ＲＮＡコード領域核酸配列翻訳によるポリペプチドは細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0019】

本発明の第２態様では、本発明は、ポリペプチドを提供する。本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含む。本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドは細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0020】

本発明の実施例によれば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の具体的な配列は、
ＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡＱＳＴＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹＮＴＮＩＴＥＥＮＶＱＮＭＲＰＴＱＶＱＲＬＩＲＥＫＩＳである。

【0021】

本発明の実施例によれば、上記ポリペプチドはさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0022】

本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドにシグナルペプチド配列が含まれる。

【0023】

本発明の実施例によれば、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列はＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡである。

【0024】

本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドは胎盤組織に存在する。

【0025】

本発明の第３の態様では、本発明は、融合タンパク質を提供する。本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質は第２態様に記載のポリペプチドとＦｃを含み、前記ポリペプチドのＣ端はＦｃのＮ端に接続される。本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質は細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0026】

本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質はさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0027】

本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含む。

【0028】

本発明の実施例によれば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の具体的な配列は、
ＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡＱＳＴＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦＹＱＳＳＬＡＳＷＮＹＮＴＮＩＴＥＥＮＶＱＮＭＲＰＴＱＶＱＲＬＩＲＥＫＩＳＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＤＰＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫである。

【0029】

本発明の第４の態様では、本発明は、単離された核酸を提供する。本発明の実施例によれば、前記単離された核酸は第２態様に記載のポリペプチドまたは第３の態様に記載の融合タンパク質をコードする。本発明の実施例による単離された核酸配列は適切な条件で発現することにより、前記ポリペプチドまたは融合タンパク質を大量に取得し、前記単離された核酸配列翻訳によるポリペプチドまたは融合タンパク質はいずれも細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0030】

本発明の実施例によれば、前記単離された核酸はさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0031】

本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質をコードする前記核酸は、１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列、２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む。

【0032】

本発明の実施例によれば、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の具体的な配列は、
ＡＴＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＡＡＣＡＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡである。

【0033】

本発明の第５の態様では、本発明は発現ベクターを提供する。本発明の実施例によれば、前記発現ベクターは第１の態様に記載のＲＮＡ分子または第４の態様に記載の単離された核酸を含む。本発明の実施例による前記発現ベクターによって翻訳されるポリペプチドは細胞に対する新型コロナウイルスの感染能力を顕著に抑制することができる。

【0034】

本発明の第６の態様では、本発明は組換え細胞を提供する。本発明の実施例によれば、前記組換え細胞は第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第４の態様に記載の単離された核酸または第５の態様に記載の発現ベクターを担持する。前記組換え細胞は強い新型コロナウイルス感染に抵抗する能力を備える。

【0035】

本発明の第７の態様では、本発明は薬物組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクターまたは第６の態様に記載の組換え細胞を含む。本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は、新型コロナウイルスによる細胞の感染に抵抗するために使用される。

【0036】

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物はさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0037】

本発明の実施例によれば、前記薬物組成物は溶液、粉末、マイクロスフェア、マイクロカプセルのうちの少なくとも１種を呈する。さらに、本発明の実施例による薬物は投与が容易であり、薬物効果を保持するのに適する。

【0038】

本発明の実施例によれば、前記薬物の投与量は特に制限されず、実用上で、投与対象の健康状況に応じて柔軟に選択することができる。

【0039】

本発明の第８の態様では、本発明は、第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクター、第６の態様に記載の組換え細胞または第７の態様に記載の薬物組成物の、薬物またはキットの調製における使用を提供し、前記薬物またはキットは、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制するために使用される。本発明の実施例によれば、前記薬物またはキットは新型コロナウイルスによる細胞の感染を顕著に抑制することができ、前記薬物またはキットは臨床診断または科学研究に用いることができる。

【0040】

本発明の第９の態様では、本発明は、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制する方法を提供し、前記方法は、新型コロナウイルスまたは感染対象細胞と第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクター、第６の態様に記載の組換え細胞または第７の態様に記載の薬物組成物を接触するステップを含む。本発明の実施例によれば、前記方法は、新型コロナウイルスによる細胞の感染を顕著に抑制することができる。

【0041】

本発明の実施例によれば、上記方法はさらに、以下の付加的な技術特徴の少なくとも１つを含んでもよい。

【0042】

本発明の実施例によれば、前記接触は生体内接触または生体外接触である。例えば、前記生体内接触は、直接顕微注射、経口、鼻腔投与、経皮投与、静脈注射、気道吸入、直腸投与の中の少なくとも１つによって実現することができ、即ち上記方式によって第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクター、第６の態様に記載の組換え細胞または第７の態様に記載の薬物組成物を被験者の体内に導入し、それを感染対象細胞、例えば肺上皮細胞に接触させる。例えば、前記生体外接触とは、第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクター、第６の態様に記載の組換え細胞または第７の態様に記載の薬物組成物を直接新型コロナウイルスまたは単離された感染対象細胞と、生体外で混合インキュベートまたは接触処理を行うことである。

【0043】

本発明の具体的な実施例によれば、前記接触は、１）新型コロナウイルスと第１の態様に記載のＲＮＡ分子、第２態様に記載のポリペプチド、第３の態様に記載の融合タンパク質、第４の態様に記載の単離された核酸、第５の態様に記載の発現ベクター、第６の態様に記載の組換え細胞または第７の態様に記載の薬物組成物に第１の混合処理を行うこと、２）ステップ１）で得られた混合物と感染対象細胞に第２混合処理を行い、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制することによって行われる。

【0044】

本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドまたは融合タンパク質の混合系における最終濃度は１０μｇ／ｍＬまたは１６０μｇ／ｍＬである。本発明の実施例によれば、前記ポリペプチドの混合系における最終濃度は１０μｇ／ｍＬであると、新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染の能力が９１．６１％抑制され、最終濃度が１６０μｇ／ｍＬであると、新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は９５．５０％抑制され、前記融合タンパク質（組換えポリペプチド）の混合系における最終濃度が１０μｇ／ｍＬであると、新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は５２．１１％抑制され、最終濃度が１６０μｇ／ｍＬであると、新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は９２．１８％抑制されることができ、本発明の実施例によるポリペプチドまたは融合タンパク質の混合系における最終濃度投与は、薬物の薬効を保持するのに適する。

【0045】

本発明の第１０の態様では、本発明は新型コロナウイルス肺炎を治療または予防する方法を提供する。本発明の実施例によれば、患者に、薬学的に許容できる前記のＲＮＡ分子、ポリペプチド、融合タンパク質または前記の単離された核酸を投与する。本発明の実施例による前記方法は新型コロナウイルス肺炎を効果的に治療または予防することができる。

【0046】

本発明の第１１の態様では、本発明は、以上に記載のＲＮＡ分子、ポリペプチド、融合タンパク質または以上に記載の単離された核酸の新型コロナウイルス肺炎の治療または予防における使用を提供する。

【0047】

本発明の付加的な態様と利点を以下の説明では部分的に示し、部分的に以下の説明から明らかになり、または本発明の実践を通じて了解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

本発明の上記および／または付加的な態様と利点は、以下の図面を組み合わせた実施例の説明から明らかになり、理解しやすい。

【図1】本発明の実施例によるＡＣＥ２ ｍＲＮＡ分子の人体の各組織における発現量の状況の分布図である。

【図2】本発明の実施例による環状ＲＮＡ ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２の人体の各組織における発現量の状況の分布図である。

【図3】本発明の実施例による環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２形成の模式図であり、ＡＣＥ２ ＲＮＡは第２エキソン（Ｅｘｏｎ２）位置で剪切環化が発生して環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２を形成する。

【図4】本発明の実施例によるＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２のＰＣＲ生成物配列決定による環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２環化配列の検証結果図であり、ここで、ＰＣＲ結果図の左から右までの方向はＰＣＲ産物配列３’端から５’までの方向である。

【図5】本発明の実施例による環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２のインターフェイスのコードリーディングフレームを横断する分析図であり、ここで、環状ＲＮＡ分子のコード配列は環状ＲＮＡ分子配列の１０４番目から４５番目までのヌクレオチドが環化インターフェイスを横断するヌクレオチド配列であり、具体的な配列は図中の下線付きの配列である。

【図6】本発明の実施例によるＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチドとＡＣＥ２でコードするタンパク質のアミノ酸配列の比較分析図であり、ここで、ＡＣＥ２タンパク質アミノ酸配列と比較すると、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａはＡＣＥ２のＮ端の６２個のアミノ酸及び特異的な１４個のアミノ酸（ＲＰＴＱＶＱＲＬＩＲＥＫＩＳ）を担持するＣ末端を含む。

【図7】本発明の実施例による環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２分子翻訳によるポリペプチドの質量分析同定結果図である。

【図8】本発明の実施例によるＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａのアミノ酸配列のオンラインプログラム分析図である。

【図9】本発明の実施例によるＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの蛍光顕微鏡下における細胞局在図である。

【図10】本発明の実施例による化学合成ポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａから新型コロナ偽ウイルス感染細胞実験では偽ウイルスが担持するＥＧＦＰ遺伝子の発現量の差の倍数を検出する結果図である。

【図11】本発明の実施例による組換えタンパク質ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣから新型コロナ偽ウイルス感染細胞実験では偽ウイルスが担持するＥＧＦＰ遺伝子の発現量の差の倍数を検出する結果図である。

【発明を実施するための形態】

【0049】

以下、例が図面に示される本発明の実施例を詳細に説明する。以下、参考図面を介して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を説明するためのものであり、本発明に対する制限として理解すべきではない。

【0050】

用語解釈

【0051】

文中では、「新型コロナウイルス」、「コロナウイルス」、「ＣＯＶＩＤ－１９」という用語は、いずれも新型コロナウイルス肺炎を引き起こす病原体を指す。

【0052】

同一性については、本発明では、２つまたはより多くのヌクレオチド配列を比較するために、［第１の配列中の対応する位置のヌクレオチドと同じヌクレオチドの数を除算］することによって第１の配列と第２配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができる。［第２の配列中のヌクレオチド］から［１番目の配列中のヌクレオチドの総数］を引いて、［１００％］を掛け、ここで、第２のヌクレオチド配列中の各ヌクレオチドの欠損、挿入、置換または添加は、第１のヌクレオチド配列に対して単一のヌクレオチド（位置）上の違いと考えられる。

【0053】

または、標準的な設定を使用し、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０などの配列比較に使用される既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つまたは複数のヌクレオチド配列の間の配列の同一性程度を計算する。

【0054】

配列の同一性程度を決定するための幾つかの他の技術、コンピュータアルゴリズム及び設定は、例えばＷＯ ０４／０３７９９９、ＥＰ ０ ９６７ ２８４、ＥＰ １ ０８５ ０８９、ＷＯ ００／５５３１８、ＷＯ ００／７８９７２、ＷＯ ９８／４９１８５和ＧＢ ２３５７７６８－Ａに記載されている。

【0055】

同一性について、本発明では、２つまたは複数のアミノ酸配列を比較するために、第１のアミノ酸配列と第２アミノ酸配列との間の「配列同一性」のパーセントは、［第１のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数を［第２のアミノ酸配列中の対応する位置のアミノ酸残基］と同じ数で割ることにより、［第１のアミノ酸配列中のヌクレオチドの総数］であり、次に、［１００％］を掛け、各欠損、挿入、置換または添加は第１のアミノ酸配列と比べて、第２アミノ酸配列中のアミノ酸残基の「残基」は、単一のアミノ酸残基（位置）上の違い、即ち、本文で定義した「アミノ酸の違い」と考えられる。

【0056】

或いは、標準的な設定を再度使用して、上記のヌクレオチド配列の配列同一性程度を決定するためのアルゴリズムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列の間の配列同一性程度を計算することができる。

【0057】

通常、上記で概説した計算方法に基づいて２つのアミノ酸配列間の「配列の同一性」の割合を決定するために、最大アミノ酸残基の数を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列として、他方のアミノ酸配列を「第２」アミノ酸配列とする。

【0058】

同様に、２つのアミノ酸配列間の配列の同一性程度を決定する場合、技術者は所謂「保守的な」アミノ酸置換を考えることができ、それは、通常、その中のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸で置換されることと記述することができる。類似した化学構造を持つ他方のアミノ酸残基は、ポリペプチドの機能、活性またはその他の生物学的特性にほとんど影響しなく、または基本的に影響しない。このような保守的なアミノ酸置換は当該分野で知られており、例えば、ＷＯ ０４／０３７９９９、ＧＢ－Ａ－２３５７７６８、ＷＯ ９８／４９１８５、ＷＯ ００／４６３８３とＷＯ ０１／０９３００、及びＷＯ ０１／０９３００が挙げられる。ＷＯ ０４／０３７９９９及びＷＯ ９８／４９１８５からの関連する教示及びそこから引用された他の参考文献に基づいてこのような置換のタイプ及び／又は組み合わせを選択及び／又は（好ましく選択する）ことができる。

【0059】

本実施例の発明者は環状ＲＮＡ ｃｉｒｃＡｔｌａｓ統合データベースに深度分析マイニングを行い、発明者は、ＡＣＥ２遺伝子が胎盤組織中で１つの環状ＲＮＡ分子を特異的に形成したと発見し、前記環状ＲＮＡ分子はＡＣＥ２ ＲＮＡの第２エキソンで単独環化して形成され、発明者はこれをＣｉｒｃ－ＡＣＥ２と命名し、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２配列分析及び実験検証の結果、ＣｉｒｃＡＣＥ２は分泌シグナルペプチドを含むポリペプチドを翻訳することができることを示し、前記ポリペプチドは新しいポリペプチド分子として、発明者はそれをＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａと命名し、該ポリペプチドの長さは７６個のアミノ酸である。本発明は、化学合成ポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ及び真核細胞発現融合したヒト免疫グロブリンＧをＦＣ断片から組換えポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣを取得し、新型コロナ偽ウイルスによる体外でヒトｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞の感染の計画を利用してＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの抗ウイルス機能を検証したところ、化学合成ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチド及び組換えポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣは新型コロナ偽ウイルスの細胞感染能力を顕著に抑制し、本発明に関したＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチド及び組換えポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣはＣＯＶＩＤ－１９ウイルス感染を抑制する候補分子となることができる。

【0060】

以下、実施例を具体的に説明する。下記実施例に使用される実験方法は特別な説明がない限り、従来の方法である。下記実施例に使用される材料、試薬などは、特別な説明がない限り、商業的な方法で入手できる。

【0061】

実施例１ 環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２の単離された胎盤組織における識別と同定

【0062】

本実施例におけるヒト胎盤組織は臨床産婦人科妊婦の自然分娩後の廃棄された胎盤に由来する。

【0063】

１、単離された胎盤組織における環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２の識別

【0064】

ＡＣＥ２ ｍＲＮＡがヒトの複数の組織中で広く発現され、該遺伝子の人体の各組織における発現分布を図１に示す。

【0065】

発明者は環状ＲＮＡ ｃｉｒｃＡｔｌａｓ統合データベースに深度分析マイニングを行うことによって、単離された胎盤組織中でＡＣＥ２遺伝子が特異的に環化剪断して、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２を形成したと発見し、図２に示す。

【0066】

２、単離された胎盤組織中の環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２配列決定同定

【0067】

環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２を特異的に検出するＰＣＲ検出プライマーを設計し、プライマーの上流配列は、５′ ＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＡ ３′であり、下流配列は、５′ ＴＣＴＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧ ３′であり、増幅された断片のサイズは１１４ｂｐである。Ｔｒｉｚｏｌ法で単離された胎盤組織検体の全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｖａｚｙｍｅ社）を用いて、ランダムプライマーでＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ増幅反応系及び条件は、ＰＣＲは５０μＬの全系であり、具体的に、２×ＰＣＲ ＭＩＸ（Ｖａｚｙｍｅ社）２５μＬ、上、下流プライマー（１０ｍＭ）各２μＬ、ｃＤＮＡテンプレート１μＬ、滅菌水で５０μＬ系まで補充する。反応条件は、９５℃でｃＤＮＡの予め変性、時間３ｍｉｎ、第１ステップの増幅：変性、温度９５℃、時間３０ｓ、アニール、温度６０℃、時間３０ｓ、延伸、温度７２℃、時間３０ｓ、３５回サイクル、ＰＣＲ反応サイクル後に７２℃で３ｍｉｎ延伸し続け、次に１６℃で保存する。ＰＣＲ産物は１．５％濃度のアガロースゲルで分離し、ゴムを切って精製した後、ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列測定を行う。図３から分かるように、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２はＡＣＥ２ ｍＲＮＡの２番目の単独エキソンが環化剪断して形成された環状のＲＮＡ分子である。図４に示すように、発明者はＰＣＲ産物Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定の方法で環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２の正確な環化インターフェイスを同定し、Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２ ＲＮＡの配列長さは２８９ｎｔであり、具体的な核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す。

【0068】

３、ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２のコード潜在能力分析

【0069】

ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２の核酸配列に基づいてＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒオンラインプログラムを用いてコード潜在能力分析を行い、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２には環状ＲＮＡインターフェイスを横断するリーディングフレームが含まれると発見し、図５に示すように、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチドのコード領域は２３１個の塩基からなり、塩基配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示し、ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳ポリペプチドの長さは７６個のアミノ酸であり、本発明においてそれをＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａと命名し、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示す。ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａとＲＮＡ ＡＣＥ２でコードしたタンパク質アミノ酸配列を比較して分析し、結果から、図６に示すように、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａにＡＣＥ２のＮ端の６２個のアミノ酸及び特異的な１４個のアミノ酸（ＲＰＴＱＶＱＲＬＩＲＥＫＩＳ）を担持するＣ末端が含まれることを示す。

【0070】

実施例２ 環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２翻訳によるポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの同定

【0071】

１、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２発現プラスミド設計構築

【0072】

環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２配列情報に基づいて、全遺伝子化学合成の方法で目的の配列を取得し、次に、配列を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩにより環状ＲＮＡ発現ベクターｐＣＤ５－ｃｉＲ（ギセイ生物）に構築した。

【0073】

２、赤色蛍光タンパク質融合発現プラスミドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ｍｃｈｅｒｒｙの構築

【0074】

環状ＲＮＡ発現ベクター ＣｉｒｃＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｖｅｃｔｏｒ（ＡｄｄｇｅｎｅＩＤ： ＃６０６４８）の環状ＲＮＡ発現設計方法に基づいて、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａと赤色蛍光タンパク質ｍｃｈｅｒｒｙが環状ＲＮＡ発現ベクターＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ｍｃｈｅｒｒｙを融合するように設計し、ｍｃｈｅｒｒｙ遺伝子断片自体の開始コドンＡＴＧと終了コドンを除去し、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの終了コドンの先端に挿入し、配列の両端にＣｉｒｃＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｖｅｃｔｏｒベクターの環化媒介配列を添加し、最終的に設計した発現フレームワークはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示し、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ｍｃｈｅｒｒｙ環状ＲＮＡ融合発現フレームワークを設計した後、全遺伝子化学合成の方法で発現フレームワークを取得し、次に、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ制限酵素部位で発現フレームワークをｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに構築した。

【0075】

３、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ｍｃｈｅｒｒｙはｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞をトランスフェクションする

【0076】

環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２発現産物にＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動、カウマブリリアントブルー染色を行い、ゴムを切って質量分析同定を行う。図７に示すように、環状ＲＮＡ Ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２によって翻訳された環化インターフェイスを横断したペプチドセグメントを質量分析同定し、質量分析したペプチドセグメント配列はＱＮＭＲＰＴＡＶＱＲであり、配列は、環状ＲＮＡ ｃｉｒｃ－ＡＣＥ２によって翻訳されていない末端の特異的アミノ酸配列を示し、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチドについてアミノ酸配列分析を行ったところ、分析にはｓｉｇｎａｌＰ－４．１オンラインプログラムを採用し、図８に示すように、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａに跨膜アミノ酸配列が含まれず、典型的な分泌シグナルペプチド配列が含まれ、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの分泌シグナルペプチド配列はＮ端の１７個のアミノ酸からなり、配列はＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡであると発見し、蛍光顕微鏡によって融合したｍｃｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質を利用してＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチドを局在的に観察したところ、ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチドが細胞外に分泌される特徴を有し、結果を図９に示す。

【0077】

実施例３ ポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａの化学合成方法

【0078】

本実施例はポリペプチドの化学合成を上海波▲タイ▼生物公司に委託し、ポリペプチドは固相合成法を用いた。ペプチド鎖合成：Ｆｍｏｃ／ＰｙＢＯＰ方法を用いた。Ｆｍｏｃ保護基の脱離には３０％のヘキサヒドロピリジンのＤＭＦ溶液を用いて、樹脂からのペプチド鎖の切り落としにはペプチド切断用試薬（トリフルオロ酢酸／結晶フェノール／水／エチレンジチオール／硫化メチルエチル／＝８１．５／５／５／５／２．５／１）を用いた。ポリペプチド精製及び検出：Ｃ１８逆相カラム、条件：Ａ相が９５％の水（メタノール配合比）、Ｂ相が９５％のメタノール（メタノール配合比）、次に、それぞれ０．１％のＴＦＡを添加し、通常の条件：サンプルをロードする前にＡ相でカラムを１５分間平衡化させ、その後、サンプルをロードし、Ａ相からＢ相まで２５分間勾配をつける。検出波長：２２０ｎｍ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ溶液でカラムを平衡化させ、サンプルをロードした後、ＡからＢ溶液までの勾配で２５ｍｉｎ溶出させ、目的のペプチドを収集し、合成したポリペプチドは質量分析装置を用いて質量分析同定を行う。

【0079】

実施例４ ｃｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣポリペプチド組換え発現プラスミド構築及び真核細胞発現精製

【0080】

１、ポリペプチド組換え発現プラスミドの構築

【0081】

ｃｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａのコード核酸配列及びヒトの免疫グロブリンＩＧｇ配列に基づいて、組換え発現フレームワークを設計し、その核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示し、セグメント化されたＰＣＲ増幅及びＰＣＲを重ねて接合して増幅する計画を用いてｃｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣ発現フレームワークを取得し、次に、フレームワークをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ部位でｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに連結する。

【0082】

２、プラスミド真核細胞のトランスフェクションの発現

【0083】

細胞を２．５－３．０ｍｉｌｌｉｏｎ／ｍＬの密度まで培養し、温度が３７℃で、回転数が１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ_２条件下で２Ｌの培養瓶を用いて５００ｍＬの細胞を培養し、５００ｍＬの細胞ごとに０．５ｍｇのプラスミドをトランスフェクションし、ＰＥＩはプラスミドの量の２．７倍でトランスフェクションする。まず、１０ｍＬの新鮮な培地（５００ｍＬを例とする）を準備し、５０μｇのプラスミドを添加し、均一に混合し、その分のＰＥＩをゆっくりと添加し、５～１０ｍｉｎ（培地は元の透明状態からやや濁っていることが観察された）インキュベートし、インキュベートが終了した後に細胞に添加し、細胞を３３℃で、ＣＯ_２が８％で、回転数が１２０ｒｐｍの条件下で発現し、６日間発現した後、細胞上清を収集でき、発現が終了する。

【0084】

３、ｃｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣ組換えポリペプチドの精製

【0085】

収集管に管当たり５ｍＬの中和液（１ Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）を添加し、ＡＫＴＡ ｐｒｕｅカラム（ＡＫＴＡ ｐｒｕｅカラム：ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （Ｃｙｔｉｖａ公司、カタログ番号：１７０４０３０１））をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭリン酸塩）で平衡化し、細胞上清液は５００ｍＬであり、精製カラムに添加する体積を１５００ｍＬとし、カラムにロードした後にＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭリン酸塩）で不純物タンパク質８０ｍＬを洗浄し、Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．０）で１００ｍＬ溶出し、収集管は管あたり５ｍＬで、ピーク位置の収集管を取ってゲルを泳動し、タンパク質を含む収集管を決定し、タンパク質を濃縮し、最後にタンパク質をＰＢＳに置換する。

【0086】

実施例５ ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチド、組換えＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣによるＣＯＶＩＤ－１９新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染の実験

【0087】

商業化された新型コロナウイルスＳタンパク質組換え偽ウイルスの使用とヒトＡＣＥ２全長遺伝子２９３Ｔ細胞株ｈＡＣＥ２－２９３Ｔ（広州派真生物公司）の安定した過剰発現により、ウイルスが細胞に侵入する過程をシミュレートすることができ、化学的に合成したＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）及び２９３Ｔで真核発現させて得られた組換えポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をそれぞれ新型コロナ偽ウイルスと混合してインキュベートし、次に、ｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞を感染し、具体的な操作は、９６ウェルプレートにｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞を敷き、密度が１×１０^４個の細胞／ウェルであり、細胞接着を１２時間行い、偽ウイルスＣＯＶＩＤ－１９感染実験を実施し、各ウェルの細胞に５μＬの偽ウイルス（約１万個のウイルス粒子）、及び異なる濃度のポリペプチドを添加し、偽ウイルスとポリペプチドは割合で生体外で１００μＬのＤＭＥＭ完全培地内で混練し、常温で３０ｍｉｎ放置し、偽ウイルスが細胞を感染する前に最終濃度が８μｇ／ｍＬのポリブレンアミンを添加する。

【0088】

新型コロナ偽ウイルスに担持したＥＧＦＰ遺伝子配列によって、感染後の細胞を抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ＱＰＣＲ蛍光定量検出を行い、化学合成ＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａポリペプチド及び組換えＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣの新型コロナ偽ウイルスＣＯＶＩＤ－１９による細胞の感染における作用を定量的に検出し、具体的な操作は以下の通りであり、偽ウイルスでｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞を１５ｈ感染した後、細胞培地を引き抜き、各ウェルに１００μＬの細胞ゲノムＤＮＡを直接添加して溶解液を抽出し、細胞を９６ウェルプレートに混練して溶解した後、１．５ｍＬ遠心管に移り、次に、ゲノムＤＮＡを抽出し、無菌水で抽出したＤＮＡを溶解し、１μＬのゲノムＤＮＡを取ってＱＰＣＲ蛍光定量検出を行い、偽ウイルスに担持したＥＧＦＰ遺伝子を細胞ゲノムに整合した状況を検出し、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部参照として、新型コロナ偽ウイルスによるｈＡＣＥ２－２９３Ｔ細胞の感染能力を評価する。

【0089】

ＱＰＣＲ検出：ＱＰＣＲ検出は蛍光定量反応キットＱＰＣＲキット（Ｖａｚｙｍｅ公司）の明細書に従って反応系を配置し、ＱＰＣＲ反応系は２０μＬ、１０μＬの２ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘであり、上、下流プライマー（１０μＭ）をそれぞれ０．４μＬ添加し、テンプレートＤＮＡを１μＬ添加し、最終的に無菌脱イオン水で２０μＬまで補充し、蛍光定量ＰＣＲ反応条件：９５℃でｃＤＮＡ予め変性、時間５ｍｉｎ、第１ステップの増幅：変性、温度９５℃、時間１０ｓ、アニール、温度６０℃、時間３５ｓ（このステップで蛍光信号を収集し）、４０回サイクル、次に、融解曲線分析を行い、温度６０℃～９５℃で蛍光信号を収集する。ＱＰＣＲ検出プライマーの配列は、ＥＧＦＰ－上流プライマー：５′ ＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴ ３′、ＥＧＦＰ－下流プライマー：５′ ＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣ ３′、プライマー増幅のサイズは１１９ｂｐである。

【0090】

図１０から分かるように、化学的に合成したポリペプチドＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａは１０μｇ／ｍＬ濃度で新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は９１．６１％抑制され、１６０μｇ／ｍＬ濃度で新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は９５．５０％抑制されることができる。図１１から分かるように、組換えＣｉｒｃＡＣＥ２－７６ａａ－ＦＣは１０μｇ／ｍＬ濃度で新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は５２．１１％抑制され、１６０μｇ／ｍＬ濃度で新型コロナ偽ウイルスによる細胞の感染能力は９２．１８％抑制され、具体的な結果を図１１に示す。

【0091】

【表1-1】

【0092】

【表1-2】

【0093】

【表1-3】

【0094】

本明細書の説明では、「一実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、または「いくつかの例」という参考用語などの説明は、該実施例または例を組み合わせて説明する具体的な特徴、構造、材料または特点は本発明の少なくとも１つの実施例または例に含まれる。本明細書では、上記用語例示的な叙述は必ずしも同じ実施例または例を対象とする必要がない。また、説明する具体的な特徴、構造、材料または特点はいずれかまたは複数の実施例または例では適切な方式で結合することができる。なお、互いに衝突しない場合、当業者は本明細書に説明される異なる実施例または例以及び異なる実施例または例の特徴を結合と組み合わせることができる。

【0095】

本発明の実施例を提示し記述したが、上記実施例は例示的なものであり、本発明を制限するためのものとして理解することができなく、当業者であれば、本発明の範囲で上記実施例について様々な変化、修正、置換および変形が可能であることが理解できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2024521368000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-03-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された環状ＲＮＡ分子であって、前記環状ＲＮＡ分子は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すＲＮＡ配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする単離された環状ＲＮＡ分子。

【請求項2】

前記環状ＲＮＡ分子はアンジオテンシン変換酵素２をコードするｍＲＮＡ配列の第２エキソン単独環化によって形成され、
任意選択に、前記環化は胎盤組織中に発生することを特徴とする請求項１に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項3】

前記環状ＲＮＡ分子は１）または２）に示すヌクレオチド配列の開始ヌクレオチドと末端ヌクレオチドが連結して形成され、前記開始ヌクレオチドは前記環状ＲＮＡ分子の１番目のヌクレオチドとして設定されることを特徴とする請求項１または２に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項4】

前記環状ＲＮＡ分子のコード領域は前記環状ＲＮＡ分子の１０４番目から４５番目のヌクレオチドを含み、
任意選択に、前記環状ＲＮＡコード領域の核酸配列は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すＲＮＡ配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するＲＮＡ配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するＲＮＡ配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するＲＮＡ配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３に記載の環状ＲＮＡ分子。

【請求項5】

ポリペプチドであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含むことを特徴とするポリペプチド。

【請求項6】

前記ポリペプチドはシグナルペプチド配列を含み、
任意選択に、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列はＭＳＳＳＳＷＬＬＬＳＬＶＡＶＴＡＡであることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリペプチドは胎盤組織中に存在することを特徴とする請求項５または６に記載のポリペプチド。

【請求項8】

融合タンパク質であって、請求項５に記載のポリペプチドとＦｃを含み、前記ポリペプチドのＣ端はＦｃのＮ端に連結されることを特徴とする融合タンパク質。

【請求項9】

前記融合タンパク質は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

単離された核酸であって、請求項８に記載の融合タンパク質をコードすることを特徴とする単離された核酸。

【請求項11】

前記核酸は、
１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列、
２）１）と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列配列、好ましくは、少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、より好ましくは、少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

請求項１または２に記載のＲＮＡ分子、請求項５または６に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸を含む、新型コロナウイルスによる細胞の感染を抑制するための薬物またはキット。

【請求項13】

請求項１または２に記載のＲＮＡ分子、請求項５または６に記載のポリペプチド、請求項８または９に記載の融合タンパク質、請求項１０または１１に記載の単離された核酸を含む、新型コロナウイルス肺炎を治療または予防するための治療薬。

【国際調査報告】