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▶ ソルボンヌ・ユニヴェルシテの特許一覧 ▶ セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック−シーエヌアールエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】短鎖抗菌ペプチド
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20240524BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20240524BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240524BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240524BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240524BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20240524BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
C07K4/00 ZNA
A61P31/04
A61P31/12
A61P31/10
A61P33/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575380
(86)(22)【出願日】2021-06-11
(85)【翻訳文提出日】2024-02-05
(86)【国際出願番号】 IB2021000411
(87)【国際公開番号】W WO2022259007
(87)【国際公開日】2022-12-15
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518059934
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】511134470
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ ルシェルシェ サイエンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラドラム，アリ
(72)【発明者】
【氏名】コスタ アンドレ，ソニア マリア
(72)【発明者】
【氏名】ピエッセ，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】フロン，ティエリ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA13
4C084MA16
4C084MA22
4C084MA23
4C084MA28
4C084MA31
4C084MA32
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA43
4C084MA52
4C084MA57
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZB351
4C084ZB352
4C084ZB371
4C084ZB372
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA15
4H045EA20
4H045FA10
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、ＳＨｆ由来の新規な短鎖抗菌ペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、及び特に薬物、殺菌剤、防腐剤、バイオフィルム形成防止剤又は殺虫剤としてのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）の抗菌ペプチドであって、
Ｘ１は、Ｆ、ｈＦ、４ａ－Ｆ、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ、Ｗ、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ｈＦ、Ｋ、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ、Ｌ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｋ、ｈＦ、Ｒ、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｒ、ｈＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ、ＨｍＳ、Ｒ、Ｋ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｆ、Ｒ、Ｗ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆａｍｉｄｅ及びＲａｍｉｄｅから成る群から選択されるアミノ酸である、抗菌ペプチド、
並びに前記ペプチドの薬学的に許容され得る塩であって、
式中、配列番号２～１３のペプチドは除外される、
抗菌ペプチド及び薬学的に許容され得る塩。
【請求項2】
Ｘ１は、Ｆ、ｈＦ、ｐ－ｔＢｕＦ、４ａ－Ｆ、Ｗ、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ｈＦ、Ｋ、ｐ－ｔＢｕＦ、Ｌ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｋ、ｈＦ、Ｒ、ｐ－ｔＢｕＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｒ、ｈＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ、ＨｍＳ、Ｒ、Ｋ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｆ、Ｒ、Ｗ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆａｍｉｄｅ及びＲａｍｉｄｅから成る群から選択されるアミノ酸である、請求項１に記載の抗菌ペプチド。
【請求項3】
前記ペプチドが、正味の正電荷を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗菌ペプチド。
【請求項4】
前記正味の正電荷が、少なくとも＋２であり、好ましくは＋２～＋５の間に含まれることを特徴とする、請求項３に記載の抗菌ペプチド。
【請求項5】
前記ペプチドの疎水性の値が、５０～８０％で構成されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項6】
前記ペプチドが、少なくとも３つのアミノ酸Ｆを含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項7】
前記ペプチドが、環状であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項8】
前記ペプチドが、３Ｆ及び２Ｒ又は３Ｋを含むか、又は４Ｆ及び１又は２又は４Ｒを含むか、又は５Ｆ及び２又は３Ｒ又は３Ｋを含むか、又は６Ｆ及び１Ｒ又は２Ｒを含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項9】
前記ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸Ｆが、ｈＦによって及び／又は（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆによって置換されていることを特徴とする、請求項８に記載の抗菌ペプチド。
【請求項10】
（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆがｐ－ｔＢｕＦであることを特徴とする、請求項９に記載の抗菌ペプチド。
【請求項11】
前記ペプチドが、配列番号１４～配列番号７９から成る群から選択されるアミノ配列を含むことを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項12】
前記ペプチドが、配列番号１９、２５、２９、３０、３２、３３、３４、３８、３９、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５３、５５、５６、６５、６６又は７２から選択されるアミノ配列を含み、より好ましくは本発明のＡＭＰが配列番号５５又は５６を有することを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド。
【請求項13】
Ｘ１はアミノ酸Ｆであり、Ｘ２はアミノ酸ｐ－ｔＢｕＦであり、
Ｘ３はＫ、ｈＦ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５はアミノ酸Ｒであり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８はアミノ酸Ｆａｍｉｄｅである、請求項１又は２に記載の抗菌ペプチド。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗菌ペプチドと、薬学的に許容される支持体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項15】
薬物として使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド又は請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫による感染を予防及び／又は治療するために使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗菌ペプチド又は請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記ペプチドが殺菌剤、防腐剤又は殺虫剤であることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗菌ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な短鎖抗菌ペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、及び特に薬物、殺菌剤、防腐剤、バイオフィルム形成防止剤又は殺虫剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
細菌間の抗生物質耐性の進化及び広がりは、今日、特に多剤耐性株の出現を伴う病院環境において、大きな公衆衛生問題である。集中的な研究努力により、これらの耐性株に対して有効な新しい抗生物質が開発されてきた。それにもかかわらず、使用により、これらの薬剤に対する耐性機構が出現し、薬剤の有効性が制限される。
【0003】
この現象を考慮すると、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、新しい治療薬の設計に非常に有望であると思われる。カチオン性抗菌ペプチドは、多細胞生物の自然免疫系の重要な成分の１つであると考えられており、病原体に対する第１選択防御を提供する。これらのペプチドの関心は、一方では、特に多剤耐性株によって引き起こされる感染症の治療における使用を可能にするペプチドの非常に広い活性スペクトルにある。第２に、ペプチドの作用様式は、微生物膜の透過処理又は迅速な断片化に基づいており、したがって、耐性機構が発達する可能性は低い。
【0004】
特に、ＡＭＰは、細菌バイオフィルムに対する潜在的な薬剤としてかなりの関心を集めている。バイオフィルムは、一緒にくっついてコミュニティを形成する細菌であり、自己生成マトリックス内に埋め込まれている。バイオフィルム細菌は、細菌の自由生活対応物よりもはるかに大きな抗生物質に対する耐性を示し、嚢胞性線維症、心内膜炎、膀胱炎に罹患した患者の慢性感染症、留置医療機器並びに齲蝕及び歯周炎に関与する歯垢形成によって引き起こされる感染症などの治療が困難な様々な病理学的状態の原因となる。抗生物質に対するバイオフィルム耐性は、主にそのようなコミュニティ内の細菌の増殖速度が遅く、代謝活性が低いためであり、ＡＭＰの使用が魅力的な治療アプローチであると思われる理由は、ＡＭＰの作用様式のために、増殖の遅い細菌又は増殖していない細菌にも作用する可能性が高いためである。
【0005】
抗菌ペプチドは、植物、昆虫、両生類及び哺乳動物において同定されている。両生類の皮膚はＡＭＰの主要な供給源であり、あらゆる種類のカエルは、一般に１０～１５個のＡＭＰで構成される特定のペプチドレパートリーを有する。
【0006】
アカガエル科のカエルは非常に多く、この科には現在合計２６属４２２種がいる（ｈｔｔｐｓ：／／ａｍｐｈｉｂｉａｎｓｏｆｔｈｅｗｏｒｌｄ．ａｍｎｈ．ｏｒｇ／参照）。これらのカエルは、１２ファミリーに分類された顕著な多様性のＡＭＰを合成及び分泌する（非特許文献１）。そのようなファミリーの１つであるｔｅｍｐｏｒｉｎは、小さなサイズ（一般に１３～１４残基）のＡＭＰを含み、その配列は種によって大きく異なる。１００個を超えるｔｅｍｐｏｒｉｎファミリーが同定されている。これらのｔｅｍｐｏｒｉｎは、例えばＲａｎａ ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ（非特許文献２）、Ｒａｎａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（非特許文献３）、Ｒａｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（非特許文献４）、Ｒａｎａ ｏｒｎａｔｉｖｅｎｔｒｉｓ（非特許文献５）及びＰｅｌｏｐｈｙｌａｘ（Ｒａｎａ）ｓａｈａｒｉｃｕｓ（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）などのいくつかのラナ種から単離されている。
【0007】
アカガエル科ペプチドの他の１２ファミリーとは異なり、ｔｅｍｐｏｒｉｎは、ジスルフィド架橋によって環化されたＣ末端ヘプタペプチドドメインである「ラナボックス」モチーフを欠いている（非特許文献９）。更に、大部分のｔｅｍｐｏｒｉｎは単一の塩基性残基を含み、これは生理学的ｐＨで＋２の正味電荷を与える。一般に、ｔｅｍｐｏｒｉｎは、グラム陽性菌及び酵母に対して特に活性であるが、抗真菌特性も示し（非特許文献１０）し、いくつかについては、抗ウイルス特性を示す（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【0008】
北アフリカのカエルであるＰｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃｕｓの皮膚から単離したｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨａは、リーシュマニア症の病原体であるリーシュマニア属原虫に対して抗寄生虫活性を示すことが分かった（非特許文献１４）。この発見に基づいて、改善された抗菌活性を示す該ｔｅｍｐｏｒｉｎの類似体は、αヘリックスの極性面の１つ又は複数のアミノ酸を塩基性アミノ酸で置換することによって得られた（特許文献１及び特許文献２）。著者らは、ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨａの類似体の細胞傷害性が低下していることを実証した。
【0009】
Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆ（ＳＨｆ）は、カエルＰｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃｕｓからも単離された非定型ＡＭＰであり、最も小さい天然のＴｅｍｐｏｒｉｎで、フェニルアラニンリッチペプチドあるという特徴を有し（非特許文献１５、非特許文献１６）、合成ＳＨｆ類似体を有し、いくつかの類似体については、グラム陽性及び／又はグラム陰性細菌に対する抗菌活性を示し、非溶血活性を有する。著者らは、類似体［ｐ－ｔＢｕＦ２、Ｒ５］ＳＨｆが非細胞傷害性であり、グラム陽性及び肺炎桿菌を除くグラム陰性細菌に対して抗菌活性を有することを実証した。彼らはまた、ＳＨｆのα－ＭｅＦ３類似体が、グラム陽性及び肺炎桿菌を含むグラム陰性細菌に対して強い活性を有するが、より高い溶血活性を示すことを実証した。これらのＳＨｆ類似体はいずれも、臨床的に関連する株に対して強い抗菌活性と低い細胞傷害性の両方を示さなかった。
【0010】
したがって、強力な抗菌活性を示し、哺乳動物細胞に対する毒性が大幅に低減した、改善されたＡＭＰが依然として大いに必要とされている。これらのＡＭＰをより容易かつ低コストで製造するために、これらのＡＭＰの大きさを縮小する必要性もある。
【0011】
興味深いことに、本発明者らは、溶血活性の低下と組み合わせて、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対する広範な抗菌活性を有する新しい短鎖ＳＨｆ類似体を設計した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】国際公開第２０１０／１０６２９３号パンフレット
【特許文献2】国際公開第２０１５／０４４３５６号パンフレット
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Ｃｏｎｌｏｎ，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｄｅｆｅｎｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｆｒｏｇ ｓｋｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ”，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１１ Ｊｕｌ，６８：２３０３－１５；Ｌａｄｒａｍ ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｓ，”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｆｒｏｇ ｓｋｉｎ：ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｍｉｓｅｓ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ），２０１６，２１：１３４１－７１
【非特許文献2】Ｓｉｍｍａｃｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｄ ｆｒｏｇ Ｒａｎａ ｔｅｍｐｏｒａｒｉａ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２４２：７８８－９２）
【非特許文献3】Ｓｉｍｍａｃｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｒａｎａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０３３：３１８－２３
【非特許文献4】Ｉｓａａｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａｔｙｐｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｒｏｗｎ ｆｒｏｇ Ｒａｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００２，２３：４１９－２５
【非特許文献5】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｍｏｕｎｔａｉｎ ｂｒｏｗｎ ｆｒｏｇ，Ｒａｎａ ｏｒｎａｔｉｖｅｎｔｒｉｓ”，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，２００１，５８：３４９－５６
【非特許文献6】Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ｒａｎｉｄ Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃａ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００８，２９：１５２６－３３
【非特許文献7】Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆ，ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｐｈｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５：１６８８０－９２
【非特許文献8】Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｌｅｉｓｈｍａｎｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｄ，ａ １７－ｒｅｓｉｄｕｅ ｌｏｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄａｍａｇｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０１３，９５：３８８－９
【非特許文献9】Ｍａｎｇｏｎｉ，”Ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ，ａｎｔｉ－ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２００６，６３：１０６０－９
【非特許文献10】Ｒｏｌｌｉｎｓ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，”Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｅｍｐｏｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃｈｙｔｒｉｄ ｆｕｎｇｕｓ（Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｂａｔｉｄｉｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｏｂａｌ ａｍｐｈｉｂｉａｎ ｄｅｃｌｉｎｅｓ”，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２００３，４７：１１５７－６０
【非特許文献11】Ｃｈｉｎｃｈａｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｅｃｔｏｔｈｅｒｍｉｃ ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ ａｍｐｈｉｂｉａｎ ａｎｄ ｐｉｓｃｉｎｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，３２３：２６８－７５
【非特許文献12】Ｍａｒｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ａｍｐｈｉｂｉａｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｍｐｏｒｉｎ Ｂ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２０１８，６２：ｅ０２３６７－１７
【非特許文献13】Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｒｏｇ ｓｋｉｎ ａｎｔｉ－ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｓｈａ ａｎｄ ［Ｋ３］ＳＨａ ｔｏ ＬＬ－３７ ａｎｄ ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ｔｂ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １”，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１９，１１：７７
【非特許文献14】Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ｒａｎｉｄ Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃａ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００８，２９：１５２６－３３
【非特許文献15】Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆ，ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｐｈｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，２８５：１６８８０－９２
【非特許文献16】Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ－ｂａｓｅｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆ ａｎａｌｏｇｓ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，１０：２２５７－６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、新規な抗菌ペプチドである、ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆの類似体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0015】
したがって、本発明は、配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）の抗菌活性を示すペプチドであって、
式中、Ｘ１は、Ｆ（フェニルアラニン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）、４ａ－Ｆ（４－アミノフェニルアラニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｒ（アルギニン）及びＫ（リジン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｗ（トリプトファン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、Ｋ（リジン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）、Ｌ（ロイシン）及びＲ（アルギニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｋ（リジン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ（ロイシン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ（セリン）、ＨｍＳ（α－ヒドロキシメチルセリン）、Ｒ（アルギニン）、Ｋ（リジン）及びｈＦ（ホモフェニルアラニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ（アルギニン）及びＫ（リジン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ（イソロイシン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｗ（トリプトファン）及びｈＦ（ホモフェニルアラニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆ－ＮＨ２（フェニルアラニンアミド）及びＲ－ＮＨ２（アルギニンアミド）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
及び前記ペプチドの薬学的に許容される塩を含み、以下のペプチドは除外される、
ＦＦＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号２）、
ＦＦＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号３）、
ＦＦＦＬＲＲＩＦａｃｉｄ（配列番号４）、
ＦＳＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号５）、
ＦＦＦＬ（ＨｍＳ）ＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号６）、
ＦＦ（α－ＭｅＦ）ＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号７）、
（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号８）、
（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号９）、
Ｆ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１０）、
Ｆ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１１）、
ＦＦ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１２）、
ＦＦ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１３）、
ペプチドに関する。
式中、Ｘ１は、Ｆ（フェニルアラニン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）、４ａ－Ｆ（４－アミノフェニルアラニン）、Ｗ（トリプトファン）、Ｒ（アルギニン）及びＫ（リジン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｗ（トリプトファン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、Ｋ（リジン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）、Ｌ（ロイシン）及びＲ（アルギニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｋ（リジン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆ（Ｃ１～Ｃ４アルキルフェニルアラニン）及び好ましくはｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ（ロイシン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、ｈＦ（ホモフェニルアラニン）及びＷ（トリプトファン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ（セリン）、ＨｍＳ（α－ヒドロキシメチルセリン）、Ｒ（アルギニン）、Ｋ（リジン）及びｈＦ（ホモフェニルアラニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ（アルギニン）及びＫ（リジン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ（イソロイシン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｗ（トリプトファン）及びｈＦ（ホモフェニルアラニン）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆ－ＮＨ２（フェニルアラニンアミド）及びＲ－ＮＨ２（アルギニンアミド）から成る群から選択されるアミノ酸であり、
及び前記ペプチドの薬学的に許容される塩を含み、以下のペプチドは除外される、
ＦＦＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号２）、
ＦＦＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号３）、
ＦＦＦＬＲＲＩＦａｃｉｄ（配列番号４）、
ＦＳＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号５）、
ＦＦＦＬ（ＨｍＳ）ＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号６）、
ＦＦ（α－ＭｅＦ）ＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号７）、
（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号８）、
（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号９）、
Ｆ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１０）、
Ｆ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＦＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１１）、
ＦＦ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＬＳＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１２）、
ＦＦ（ｐ－ｔＢｕＦ）ＬＲＲＩＦａｍｉｄｅ（配列番号１３）、
ペプチドに関する。
【0016】
ＨｍＳは、α－ヒドロキシメチルセリンである。このアミノ酸は、以下の構造を有する。
【化1】
【0017】
α－ＭｅＦは、α－メチル－フェニルアラニンである。このアミノ酸は、以下の構造を有する。
【化2】
【0018】
アミノ酸ｈＦ（ホモフェニルアラニン）は、Ｆと比較して、その側鎖に更なる－ＣＨ２－をもたらす。この残基は、アミノ酸Ｆよりも疎水性である。このアミノ酸は、以下の構造を有する。
【化3】
【0019】
アミノ酸ｐ－ｔＢｕＦ（４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン）は、以下の構造を有する。
【化4】
【0020】
アミノ酸４ａ－Ｆ（４－アミノ－フェニルアラニン）は、以下の構造を有する。
【化5】
【0021】
本明細書で使用される「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」又は「微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）」という用語は、細菌、真菌、酵母、ウイルス及び／又は寄生虫を指す。
【0022】
本明細書で使用される「微生物感染」という用語は、細菌、真菌、酵母、ウイルス及び／又は寄生虫によって引き起こされる感染症を指す。
【0023】
本明細書で使用される「抗菌活性」という用語は、抗菌、抗ウイルス、抗真菌及び／又は抗寄生虫活性を指す。該活性は、ＩＣ５０又はＭＩＣなどの色々なパラメータを測定することによって評価されてもよい。
【0024】
「ＩＣ５０」又は「最大半量阻害濃度」は、微生物集団のインビトロ増殖を半減させるのに必要な物質の濃度である。「ＭＩＣ」又は「最小発育阻止濃度」は、該物質の存在下、一般に３７℃で１８～２４時間のインキュベーション後に微生物の増殖を完全に阻害する物質の最低濃度である。
【0025】
本発明はまた、本発明によるペプチドの薬学的に許容される塩を包含する。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸などの薬学的に許容され得る鉱酸の塩、酢酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、コハク酸、アスコルビン酸及び酒石酸などの薬学的に許容される有機酸の塩、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム又はアンモニウムの塩などの薬学的に許容される鉱物塩基の塩、又は薬学的技術において一般的に使用される塩形成性窒素を含有する有機塩基の塩であってもよい。該塩の調製方法は、当業者に周知である。
【0026】
好ましい実施形態によれば、配列：
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）の抗菌ペプチドであって、式中、
Ｘ１は、Ｆ、ｈＦ、ｐ－ｔＢｕＦ、４ａ－Ｆ、Ｗ、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ｈＦ、Ｋ、ｐ－ｔＢｕＦ、Ｌ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｋ、ｈＦ、Ｒ、ｐ－ｔＢｕＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｒ、ｈＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ、ＨｍＳ、Ｒ、Ｋ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｆ、Ｒ、Ｗ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆａｍｉｄｅ及びＲａｍｉｄｅから成る群から選択されるアミノ酸であり、
配列番号２～１３のペプチドは除外される、
抗菌ペプチド。
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）の抗菌ペプチドであって、式中、
Ｘ１は、Ｆ、ｈＦ、ｐ－ｔＢｕＦ、４ａ－Ｆ、Ｗ、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｗ、ｈＦ、Ｋ、ｐ－ｔＢｕＦ、Ｌ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ３は、Ｆ、Ｋ、ｈＦ、Ｒ、ｐ－ｔＢｕＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｒ、ｈＦ及びＷから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５は、Ｓ、ＨｍＳ、Ｒ、Ｋ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ、Ｆ、Ｒ、Ｗ及びｈＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８は、Ｆａｍｉｄｅ及びＲａｍｉｄｅから成る群から選択されるアミノ酸であり、
配列番号２～１３のペプチドは除外される、
抗菌ペプチド。
【0027】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗菌ペプチドは、
配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）を含み、式中、
Ｘ１はアミノ酸Ｆであり、
Ｘ２はアミノ酸ｐ－ｔＢｕＦであり、
Ｘ３はＫ、ｈＦ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５はアミノ酸Ｒであり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８はアミノ酸Ｆａｍｉｄｅであり、
配列番号１１のペプチドは除外される。
配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１）を含み、式中、
Ｘ１はアミノ酸Ｆであり、
Ｘ２はアミノ酸ｐ－ｔＢｕＦであり、
Ｘ３はＫ、ｈＦ及びＲから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ４は、Ｌ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ５はアミノ酸Ｒであり、
Ｘ６は、Ｒ及びＫから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｉ及びＦから成る群から選択されるアミノ酸であり、
Ｘ８はアミノ酸Ｆａｍｉｄｅであり、
配列番号１１のペプチドは除外される。
【0028】
この実施形態によれば、好ましいＡＭＰは、配列番号２５、２９及び３０、及び好ましくは配列番号２５である。
【0029】
好ましい実施形態によれば、ＡＭＰはｐＨ７で正の正味電荷を有し、好ましくは正の正味電荷は少なくとも＋２、より好ましくは＋３、＋４又は＋５である。正の正味電荷は、ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｅｐｃａｌｃ．ｃｏｍ／）によって提供される方法内で計算される。
【0030】
好ましい実施形態では、ＡＭＰの疎水性値は、５０～８０％、好ましくは６０～８０％、より好ましくは７０～８０％、更により好ましくは７５％で構成される。疎水性値は、ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓによって提供される方法の範囲内で計算してもよい（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅ２．ｃｏｍ／Ｎ＿ｐｅｐｔｉｄｅ＿ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ＿ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ．ｐｈｐ参照）。
【0031】
好ましい実施形態によれば、ＡＭＰは、少なくとも３つのＦ（フェニルアラニン）を有する配列を含む。
【0032】
特定の実施形態によれば、本発明は、第１のアミノ酸Ｘ１が最後のＸ８アミノ酸に共有結合しており、配列番号２２のペプチドが環状ペプチドである環状形態の上記に定義されるＡＭＰに関する。
【0033】
好ましい実施形態では、ＡＭＰは、
－３個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び２個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）又は３個のアミノ酸Ｋ（リジン）、又は
－４個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び１個若しくは２個若しくは４個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）、又は
－５個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び２若しくは３個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）若しくは３個のアミノ酸Ｋ（リジン）、又は
－６個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び１若しくは２個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）を有する配列を含む。
－３個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び２個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）又は３個のアミノ酸Ｋ（リジン）、又は
－４個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び１個若しくは２個若しくは４個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）、又は
－５個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び２若しくは３個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）若しくは３個のアミノ酸Ｋ（リジン）、又は
－６個のアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）及び１若しくは２個のアミノ酸Ｒ（アルギニン）を有する配列を含む。
【0034】
好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのアミノ酸Ｆ（フェニルアラニン）を、ホモフェニルアラニン（ｈＦ）及び／又は（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆで置換する。好ましくは、（Ｃ１～Ｃ４アルキル）Ｆは４－ｔｅｒｔ－ブチル－フェニルアラニン（ｐ－ｔＢｕＦ）である。
【0035】
位置又はアミノ酸に関して本明細書で使用される「置換」という用語は、特定の位置のアミノ酸が別のアミノ酸によって置き換えられていること、又は配列番号１のものとは異なるアミノ酸が存在することを意味する。
【0036】
本発明のＡＭＰを構成するアミノ酸は、Ｌ又はＤ配置、好ましくはＬ配置であってもよい。
【0037】
好ましい実施形態によれば、ＡＭＰは、配列番号１４～配列番号７９から成る群から選択される配列を含む（表１参照）。
【表1】
【0038】
好ましくは、本発明のＡＭＰは、配列番号１９、２５、２９、３０、３２、３３、３４、３８、３９、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５３、５５、５６、６５、６６又は７２のペプチドの中から選択され、より好ましくは本発明のＡＭＰは、配列番号５５又は５６を有する。
【0039】
別の特定の実施形態によれば、本発明によるＡＭＰは、Ｘ２がｐ－ｔＢｕＦではない、又はＸ５がアルギニン（Ｒ）ではない、上で定義される配列番号１の配列を有し、配列番号３、４、９、１０、１１及び１３のペプチドは除外される。この実施形態によれば、ＡＭＰは、配列番号１９、３２、３３、３４、３８、３９、４１、４２、４３、４９、５０、５１、５３、５５、５６、６５、６６又は７２の中から選択される。
【0040】
この特定の実施形態によれば、本発明によるＡＭＰは、好ましくは、Ｘ２がｐ－ｔＢｕＦではなく、Ｘ５がアルギニン（Ｒ）ではない、配列番号１の配列を有する。この実施形態によれば、ＡＭＰは、配列番号３３、３４、４１、４２、５５又は５６の中から選択される。
【0041】
本発明によるＡＭＰは、古典的な化学合成（固相又は均一液相で、Ｂｅｈｒｅｎｄｔら、”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．，２０１６，２２：４－２７を参照する）又は酵素合成（Ｂｏｎｇｅｒｓ ａｎｄ Ｈｅｉｍｅｒ，”Ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９９４，１５：１８３－９３）によって得てもよい。
【0042】
本発明によるＡＭＰはまた、ペプチドをコードし、該ペプチドを発現する導入遺伝子を含む、本明細書に以下に記載されるような宿主細胞を培養すること、及び該宿主細胞又はペプチドが分泌された培地から該ペプチドを抽出することから成る方法によっても得てもよい。この方法では、天然アミノ酸を有するＡＭＰのみを得ることができる。
【0043】
別の態様では、本発明は、本発明によるＡＭＰをコードする核酸、該核酸を含む発現カセット又は発現ベクターに関する。本発明は更に、該核酸、発現カセット又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0044】
「核酸」は、ＤＮＡ又はＲＮＡに基づく任意の分子を意味すると理解される。これらは、合成又は半合成の組換え分子であってもよく、場合により増幅又はベクターにクローニングされ、化学的に修飾され、非天然塩基又は例えば修飾結合、修飾プリン若しくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む修飾ヌクレオチドを含む。
【0045】
本発明による核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの形態であってもよい。好ましい実施形態によれば、核酸は、当業者に周知の組換え技術によって合成された単離されたＤＮＡ分子である。
【0046】
本発明による核酸は、本発明によるペプチドの配列から推定されてもよく、コドン使用は、核酸が転写される宿主細胞に従って適合されてもよい。これらのステップは、当業者に周知の方法に従って実行されてもよく、そのいくつかは参照マニュアル”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１）に記載されている。
【0047】
本発明は更に、発現に必要とされる配列に作動可能に連結された本発明による核酸を含む発現カセットに関する。特に、核酸は、宿主細胞での発現を可能にするプロモーターの制御下にあってもよい。一般に、発現カセットは、転写の開始を可能にするプロモーター、本発明による核酸、及び転写ターミネーターから構成されるか、又はそれらを含む。「発現カセット」という用語は、作動可能に連結されたコード領域及び調節領域を含む核酸構築物を表す。「作動可能に連結される」という表現は、コード配列（目的の遺伝子）の発現及び／又はコードされたペプチドの標的化が転写プロモーター及び／又はシグナルペプチドの制御下にあるように要素が組み合わされることを示す。典型的には、プロモーター配列は、目的の遺伝子の上流に、そこから離れて配置され、発現の制御に適合する。同様に、シグナルペプチドの配列は、一般に、目的の遺伝子の配列の上流で、目的の遺伝子と同じ読み枠で、任意のプロモーターの下流で融合される。スペーサー配列は、発現及び／又は標的化を妨げない限り、調節エレメントと遺伝子との間に存在してもよい。好ましい実施形態では、該発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結された配列を活性化する少なくとも１つの「エンハンサー」を含む。
【0048】
本発明はまた、本発明による核酸又は発現カセット又は発現ベクターに関する。該発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、該細胞における本発明の核酸の発現を可能にするするために使用されてもよい。
【0049】
ベクターは、環状又は非環状の、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。有利には、ベクターは、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体の中から選択される。
【0050】
有利には、発現ベクターは、本発明による核酸の発現を可能にする調節エレメントを含む。これらのエレメントは、例えば、転写プロモーター、転写活性化因子、ターミネーター配列、開始コドン及び終止コドンを含んでもよい。発現が望まれる宿主細胞にしたがって該要素を選択する方法は、当業者に周知である。
【0051】
ベクターはまた、例えば、抗生物質耐性遺伝子又は宿主細胞ゲノムから欠失されたそれぞれの遺伝子の相補性を提供する選択可能な遺伝子などの、宿主細胞におけるその選択を可能にする要素を含んでもよい。そのような要素は当業者に周知であり、文献に広く記載されている。
【0052】
形質転換される宿主細胞が植物細胞である場合、発現ベクターは植物ベクターであることが好ましい。植物ベクターの例は文献に記載されており、特に、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｐＢＩＮ １９のＴ－ＤＮＡプラスミド（Ｂｅｖａｎ，”Ｂｉｎａｒｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８４，１２：８７１１－２１），ｐＰＺＰｌＯＯ（Ｈａｊｄｕｋｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ，ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐＰＺＰ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，２５：９８９－９４），ｔｈｅ ｐＣＡＭＢＩＡ ｓｅｒｉｅｓ（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＣＡＭＢＩＡ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含む。本発明のベクターは、複製起点及び／又は選択マーカー遺伝子及び／又は植物組換え配列を更に含んでもよい。
【0053】
ベクターは、当業者に周知の分子生物学の古典的技術によって構築してもよい。
【0054】
本発明は、細胞を形質転換又はトランスフェクトするための本発明による核酸、発現カセット又は発現ベクターの使用に関する。宿主細胞は、一過性又は安定な様式で形質転換／トランスフェクトされてもよく、核酸、カセット又はベクターを、エピソームの形態又は染色体の形態で細胞に含有されてもよい。本発明は、本発明による核酸、カセット又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。
【0055】
一実施形態によれば、宿主細胞は微生物、好ましくは細菌又は酵母である。
【0056】
別の実施形態によれば、宿主細胞は、動物細胞、例えばＣＯＳ又はＣＨＯ細胞（米国特許第４８８９８０３号、米国特許第５０４７３３５号）などの哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞は非ヒト及び非胚性である。
【0057】
更に別の実施形態によれば、宿主細胞は植物細胞である。本明細書で使用される「植物細胞」という用語は、植物に由来し、カルスなどの未分化組織、及び胚、植物部分、植物又は種子などの分化組織を構成してもよい任意の細胞を指す。
【0058】
本発明はまた、本発明による抗菌ペプチドを産生するための方法であって、本発明による核酸、発現カセット又は発現ベクターで細胞を形質転換又はトランスフェクトすること、トランスフェクト／形質転換された細胞を培養すること、及び該細胞によって産生されたペプチドを回収することを含む、方法に関する。組換えペプチドを産生するための方法は、当業者に周知である。例えば、不死化ヒト細胞株における産生のための国際公開第０１／７０９６８号パンフレット、植物における産生のための国際公開第２００５／１２３９２８号パンフレット及びトランスジェニック動物の乳における産生のための米国特許出願公開第２００５－２２９２６１号明細書に記載されている特定の方法を挙げてもよい。
【0059】
本発明はまた、無細胞とも呼ばれるインビトロ発現系に本発明による核酸、カセット又は発現ベクターを挿入すること、及び該系によって産生されたペプチドを回収することを含む、本発明による抗菌ペプチドの製造方法に関する。多くのインビトロ又は無細胞発現系が市販されており、該系の使用は当業者に周知である。
【0060】
本発明はまた、本発明によるペプチドに特異的に結合する抗体に関する。
【0061】
本発明は、本発明によるペプチドに特異的な抗体に関する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体、その断片（例えば、フラグメントＦ（ａｂ）´２、Ｆ（ａｂ））、一本鎖抗体若しくはミニボディ、又は本発明のペプチドを認識する初期抗体のドメイン、特にＣＤＲ（相補性決定領域）を含む任意のポリペプチドを指す。例えば、これらは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法に従ってハイブリドーマから調製されてもよい。抗体を調製するための様々な方法は、当業者に周知である。
【0062】
本発明はまた、本発明によるペプチドを検出するための本発明による抗体の使用に関する。本発明はさらに、特に免疫学的アッセイのための、本発明によるペプチドの定量的測定を行うための本発明による抗体の使用に関する。該測定は、特に、本発明による宿主細胞又はトランスジェニック植物での本発明のペプチドの発現の決定を可能にすることができる。
【0063】
さらなる態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つのＡＭＰと、薬学的に許容される支持体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0064】
該医薬組成物は、本発明の少なくとも２つ以上のＡＭＰの混合物を含んでもよく、好ましくは、配列番号２５、２９及び３０から成る群から選択される少なくとも２つのＡＭＰの混合物を含む。
【0065】
薬学的に許容される支持体は、皮膚又は粘膜と直接接触する布地、不織布又は医療機器であることができる。本発明のペプチドは、それらに組み込むことができる。これらの支持体は、固定システムの布地、不織布若しくは医療機器への生分解によって、又は後者と身体との摩擦によって、身体の水分によって、皮膚のｐＨによって又は体温によって、本発明のペプチドを放出する。同様に、布地及び不織布を使用して、身体と直接接触する衣類を作製することができる。好ましくは、本発明のペプチドを含有する布地、不織布及び医療機器は、皮膚又は粘膜の状態、障害及び／又は病状の治療及び／又はケアのために使用される。
【0066】
好ましい布地、不織布、衣類、医療機器は、包帯、ガーゼ、Ｔシャツ、靴下、パンティホース、下着、ガードル、手袋、おむつ、生理用ナプキン、包帯、創傷被覆材、ベッドカバー、ワイプ、ヒドロゲル、接着剤パッチ、非接着剤パッチ、微小電気パッチ及び／又はフェイスマスクである。
【0067】
本発明による組成物に使用することができる薬学的に許容される賦形剤は、当業者に周知であり（Ｇｅｎｎａｒｏ，”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０；Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｈｏｖｇａａｒｄ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２０００；Ｋｉｂｂｅ，”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、特に生理食塩水及びリン酸緩衝液を含む。
【0068】
本発明による医薬組成物は、局所投与又は全身投与、特に経口投与、舌下投与、皮膚投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、局所投与、気管内投与、鼻腔内投与、経皮投与、直腸投与、眼内投与又は耳介内投与に適してもよい。好ましくは、本発明による医薬組成物は、皮膚、経口、局所、又は経皮投与に適している。
【0069】
特定の実施形態によれば、本発明による医薬組成物は局所投与に適している。
【0070】
本発明による医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、ペースト剤、軟膏、クリーム剤、絆創膏、ポーション、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、パッチ、スプレー又はエアロゾルの形態であってもよい。
一実施形態によれば、本発明による組成物は、１～２０００ｍｇの本発明によるペプチドを含む。好ましくは、本発明による組成物は、１０～１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００又は１５００ｍｇの本発明によるペプチドを含む。
一実施形態によれば、本発明による組成物は、１～２０００ｍｇの本発明によるペプチドを含む。好ましくは、本発明による組成物は、１０～１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００又は１５００ｍｇの本発明によるペプチドを含む。
【0071】
本発明による組成物は、他の抗菌剤、特にＡＭＰ又は抗生物質などの追加の活性物質をさらに含んでもよい。組成物はまた、本発明によるペプチドの活性を増強することができる物質を更に含んでもよい。
【0072】
本発明は更に、薬物としての本発明によるＡＭＰに関する。好ましくは、薬物は、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫によって引き起こされる感染症を治療することを意図している。
【0073】
微生物感染は、グラム陰性菌に起因してもよい。特に、グラム陰性菌は、大腸菌及びシュードモナス属、サルモネラ属、アシネトバクター属又はクレブシエラ属の細菌から成る群から選択されてもよい。好ましくは、グラム陰性菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から成る群から選択される。
【0074】
微生物感染は、グラム陽性菌に起因してもよい。特に、グラム陽性菌は、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、リステリア属又はエンテロコッカス属の細菌から成る群から選択されてもよい。好ましくは、グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）及びエンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）から成る群から選択される。
【0075】
微生物感染はまた、真菌に起因してもよい。特に、真菌は、カンジダ属又はアスペルギルス属に由来してもよい。例えば、真菌は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びカンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）から成る群から選択されてもよい。
【0076】
特定の実施形態によれば、処置は治癒的又は予防的であってもよい。
【0077】
治療される対象は動物、好ましくは哺乳動物である。特定の実施形態によれば、治療される対象はヒトである。別の実施形態によれば、治療される対象は、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、繁殖動物、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）又は使役動物である。この獣医学的使用は、抗生物質を回避して微生物感染症を治療するためのものである。バイオフィルムは、院内感染の約６０％の原因である。バイオフィルムは本質的に、埋め込まれた生体材料の微生物コロニー形成に起因する。細菌バイオフィルムの根絶は、プランクトン状態の細菌に対して通常活性な抗生物質が、バイオフィルムに組織化された構造に対してはるかに効果的でないことが判明することが多いことを考慮すると、主要な臨床的問題である。このタイプのバイオフィルムに対するＡＭＰの効果は、ｔｅｍｐｏｒｉｎ－Ａ（Ｃｉｒｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ｔｅｍｐｏｒｉｎ Ａ ａｎｄ ＲＮＡＩＩＩ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ａ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｒａｔ Ｐｏｕｃｈ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｇｒａｆｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｔｏ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００３，１０８：７６７－７１）を用いて行われた以前の研究で実証されている。
【0078】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、嚢胞性線維症、心内膜炎、膀胱炎、留置型医療機器によって引き起こされる感染症、歯垢形成又は歯周炎などのバイオフィルム形成を伴う微生物感染症を治療するために使用される。
【0079】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、多剤耐性細菌によって引き起こされる細菌感染症を治療するために使用される。治療される細菌感染症としては、例えば、菌血症、敗血症、皮膚及び軟部組織感染症、肺炎、静脈ライン又は他のカテーテルに関連する感染症、キャニル及び／又はデバイス、表在性皮膚及び／又は粘膜感染症が挙げられる。細菌感染症としては、重度の院内感染、易感染性患者の感染、臓器移植患者の感染、集中治療室（ＩＣＵ）での感染、熱傷の重度の感染、重度のコミュニティ感染、嚢胞性線維症患者の感染が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。
【0080】
本発明はまた、治療有効用量の本発明によるペプチド、核酸、カセット又はベクターを投与することを含む、微生物感染症を治療する方法に関する。
【0081】
本明細書で使用される「治療有効用量」という用語は、感染に関与する細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫に対する抗菌活性を観察するために必要な本発明によるペプチド、核酸、カセット又はベクターの量を指す。投与される本発明によるペプチド、核酸、カセット又はベクターの量及び処置の期間は、処置される対象の生理学的状態、病原体および該病原体に対するペプチドの抗菌活性に従って当業者によって決定される。
【0082】
更に別の態様では、本発明は、殺菌剤、保存剤又は殺虫剤としての本発明によるペプチドの使用に関する。
【0083】
「殺菌剤」という用語は、表面（例えば、壁、ドア、医療機器）、液体（例えば、水）又は気体（例えば、麻酔ガス）上のペプチドの抗菌活性を指す。
【0084】
一実施形態によれば、本発明によるペプチドは、細菌バイオフィルムの除去に使用される。好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、特に外科用又は補綴用機器を消毒するために使用される。
【0085】
本発明はまた、本発明によるＡＭＰでコーティングされた又はそれを含む少なくとも１つの表面を有する本体を含む医療機器又はインプラントに関する。本発明はまた、本発明によるペプチドのコーティングを適用すること、又は装置若しくはインプラントの少なくとも１つの表面と接触させることを含む、医療用装置又はインプラントを調製する方法に関する。
【0086】
この種の医療機器又はインプラント並びにその使用及び調製方法は、例えば特許出願ＷＯ２００５／００６９３８に記載されている。
【0087】
本発明によるペプチドでコーティングされた又はそれを含む表面は、ポリエチレン、ダクロン、ナイロン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ラテックス、シリコーンエラストマーなどの熱可塑性材料若しくはポリマー材料、又は金などの金属材料で構成されてもよい。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、そのＮ末端又はＣ末端を介して、官能基化表面、好ましくは金属表面に共有結合している。任意選択で、ペプチドは、スペーサーアームを介して表面に付着されてもよい。
【0088】
好ましくは、表面は、０．４～３００ｍｇ／ｃｍ２の密度でペプチドによりコーティングされてもよい。
【0089】
あるいは、装置又はインプラント、特に骨及び関節補綴装置は、本発明によるペプチドを含むセメント混合物でコーティングされてもよい。
【0090】
ペプチドは、別の活性分子、好ましくは抗生物質と組み合わせてもよい。
【0091】
装置又はインプラントは、例えば、血管内カテーテル、腹膜カテーテル、胸膜カテーテル及び泌尿器カテーテル、心臓弁、心臓ペースメーカ、血管シャント、冠状動脈障害、歯科インプラント又は整形外科用若しくは眼内プロテーゼであってもよい。
【0092】
本発明は、本発明による少なくとも１つのペプチドを含む食品組成物に関する。
【0093】
食品は、微生物による感染のリスクを排除又は防止し、それによって食品の保存性を改善するために、本発明によるペプチドで処理されてもよい。この場合、ペプチドは保存剤として使用される。
【0094】
本発明によるペプチドは、殺虫剤として使用されてもよい。この場合、ペプチドは、植物病原体による植物の感染症を予防又は治療するために使用される。
【0095】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つのペプチドを含む農薬組成物に関する。
【0096】
本発明によるＡＭＰは、ＬＣ５０＞２００μＭで有害であると考えられていないｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆと比較して、抗菌活性及び同様の細胞溶解活性を示す。
【0097】
好ましくは、本発明によるＡＭＰは、細胞溶解活性を示さないか又は弱い細胞溶解活性を示す。特に、本発明のペプチドは、赤血球について３０μＭを超える、好ましくは４０μＭ、５０、１００、２００、５００、６００、８００μＭ超のＬＣ５０を有してもよい。ＬＣ５０値は、例えば、ラット、イヌ、ウサギ、ブタ、ネコ又はヒト赤血球、好ましくはラット又はヒト赤血球、より好ましくはヒト赤血球で得られてもよい。
【0098】
本明細書で使用される「致死濃度、５０％」又は「ＬＣ５０」という用語は、集団の半分を死滅させるのに必要な物質の濃度を指す。ＬＣ５０は、物質の毒性の定量的指標である。
【0099】
細胞傷害性の低下に加えて、本発明のペプチドは、少なくとも１つの細菌株、ウイルス株、真菌株又は寄生虫株に対して、好ましくは、ｔｅｍｐｏｒｉｎ－ＳＨｆの抗菌活性と同等又はそれ以上の抗菌活性を有する。
【0100】
有利には、本発明のＳＨｆ類似体は、グラム陰性及びグラム陽性細菌に対して抗菌活性を有し、また非細胞傷害性である。それらはサイズが小さいので、より容易に合成できる。
【0101】
本発明は、類似体の合成及び抗菌試験を示す非限定的な実施例に言及する、続く追加の説明を用いてよりよく理解されるであろう。
【実施例】
【0102】
材料及び方法
【0103】
ペプチド合成
全てのＳＨｆ類似体は、前述のように固相標準Ｆｍｏｃ化学プロトコルを使用して合成したが（Ｒａｊａ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｙｌｌｏｓｅｐｔｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｉｎｔｅｄ－ｂｅｌｌｙ ｌｅａｆ ｆｒｏｇ，Ｐｈｙｌｌｏｍｅｄｕｓａ ｓａｕｖａｇｉｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８：ｅ７０７８２）、以下の変更を用いた。合成は、Ｐｒｏｔｉｄｅ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＬＬ樹脂（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、０．１９ｍｍｏｌ／ｇ置換）を用い、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ペプチド合成プラットフォーム、ＩＢＰＳ、フランス、パリのソルボンヌ大学）で行った。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）での脱保護後洗浄の後、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／オキシマ活性化法を用いたカップリングを行った。ペプチジル樹脂を、９４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、２．５％ Ｈ２Ｏ及び２．５％ １，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）を含有する酸性混合物とのインキュベーション（室温で３時間）によって開裂及び脱保護した。樹脂を濾過により除去し、ペプチドを冷エーテル中に沈殿させた。次いで、粗物質を、０．１％ＴＦＡ／水中のアセトニトリル（０．０７％ＴＦＡ）の２０～７０％直線勾配によって（１％アセトニトリル／分）５ｍＬ／分の流量で溶出するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）半分取カラム（１０μｍ、２５０×１０ｍｍ）での半分取ＲＰ－ＨＰＬＣにかけた。ペプチド純度を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析（フランス、パリのソルボンヌ大学にあるＩＢＰＳの質量分析及びプロテオミクスプラットフォーム）によって評価した。
全てのＳＨｆ類似体は、前述のように固相標準Ｆｍｏｃ化学プロトコルを使用して合成したが（Ｒａｊａ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｈｙｌｌｏｓｅｐｔｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｉｎｔｅｄ－ｂｅｌｌｙ ｌｅａｆ ｆｒｏｇ，Ｐｈｙｌｌｏｍｅｄｕｓａ ｓａｕｖａｇｉｉ”，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１３，８：ｅ７０７８２）、以下の変更を用いた。合成は、Ｐｒｏｔｉｄｅ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＬＬ樹脂（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、０．１９ｍｍｏｌ／ｇ置換）を用い、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ自動マイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ペプチド合成プラットフォーム、ＩＢＰＳ、フランス、パリのソルボンヌ大学）で行った。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）での脱保護後洗浄の後、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／オキシマ活性化法を用いたカップリングを行った。ペプチジル樹脂を、９４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、２．５％ Ｈ２Ｏ及び２．５％ １，２－エタンジチオール（ＥＤＴ）を含有する酸性混合物とのインキュベーション（室温で３時間）によって開裂及び脱保護した。樹脂を濾過により除去し、ペプチドを冷エーテル中に沈殿させた。次いで、粗物質を、０．１％ＴＦＡ／水中のアセトニトリル（０．０７％ＴＦＡ）の２０～７０％直線勾配によって（１％アセトニトリル／分）５ｍＬ／分の流量で溶出するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）半分取カラム（１０μｍ、２５０×１０ｍｍ）での半分取ＲＰ－ＨＰＬＣにかけた。ペプチド純度を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析（フランス、パリのソルボンヌ大学にあるＩＢＰＳの質量分析及びプロテオミクスプラットフォーム）によって評価した。
【0104】
細菌株及び酵母株
【0105】
以下の株を使用した：
グラム陰性菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、
グラム陽性菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３、多剤耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １９６１５、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ Ｌｉ ４ ｐＶＳ ２、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２、
グラム陰性菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ ２７８５３、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ １３８８３、
グラム陽性菌：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３、多剤耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ １９６１５、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ Ｌｉ ４ ｐＶＳ ２、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９２１２、
【0106】
抗菌活性試験
各株について、約１０６細菌／ｍＬ（指数増殖期）の標準接種材料を調製した。この目的のために、株の１つを予め接種したＬＢ寒天上で単離したコロニーを、ＢＨＩ寒天上で単離したコロニーからＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）中で増殖させた化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを除いて、４ｍＬのＬＢブロス培地中で培養した。次いで、液体培養物を、細菌が指数増殖期に達するように振盪しながら３７℃で２～３時間インキュベートした。遠心分離後、ほとんどの細菌懸濁液をミューラーヒントン（ＭＨ）ブロス培地で、約１０６ｃｆｕ／ｍＬ（ｃｆｕ：コロニー形成単位）の濃度に相当する０．０１のＯＤ６３０ｎｍに希釈した。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＬＢ）並びにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ（ＢＨＩ）には異なる培地を使用した。
各株について、約１０６細菌／ｍＬ（指数増殖期）の標準接種材料を調製した。この目的のために、株の１つを予め接種したＬＢ寒天上で単離したコロニーを、ＢＨＩ寒天上で単離したコロニーからＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）中で増殖させた化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを除いて、４ｍＬのＬＢブロス培地中で培養した。次いで、液体培養物を、細菌が指数増殖期に達するように振盪しながら３７℃で２～３時間インキュベートした。遠心分離後、ほとんどの細菌懸濁液をミューラーヒントン（ＭＨ）ブロス培地で、約１０６ｃｆｕ／ｍＬ（ｃｆｕ：コロニー形成単位）の濃度に相当する０．０１のＯＤ６３０ｎｍに希釈した。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＬＢ）並びにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ（ＢＨＩ）には異なる培地を使用した。
【0107】
各ペプチドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、ブロス培地中での増殖阻害試験によって決定した。ＭＩＣは、３７℃で１８～２４時間のインキュベーション後に試験した細菌株の増殖を阻害することができるペプチドの最低濃度として定義される。試験は、滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。一連の漸増濃度のペプチド（２～４００μＭ）を最初に滅菌ＭｉｌｌｉＱ水中で調製した。各ペプチド濃度の５０μＬを５０μＬの細菌懸濁液（１０６ｃｆｕ／ｍＬ）を含むウェルに混合した。次いで、マイクロタイタープレートを振盪しながら３７℃で１８～２４時間インキュベートした。細菌増殖は、プレートリーダーで６３０ｎｍでＯＤ（濁度）を測定することによって決定した。試験を各ペプチド濃度について３回ずつ行い、少なくとも３回の独立した実験を行ってＭＩＣ値を決定した。
【0108】
増殖阻害陰性対照は、ペプチドを含有する溶液を５０μＬの滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で置き換えることによって得た。細菌増殖の完全な阻害を可能にする陽性対照は、ペプチドを含有する溶液を５０μＬの０．７％ホルムアルデヒドで置き換えることによって得た。
【0109】
細胞傷害性アッセイ
溶血実験は、以前に記載されたプロトコル（Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ｒａｎｉｄ Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃａ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００８，２９：１５２６－３３）に従って、健常な成人ドナー（フランス、パリのＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｓａｎｇ）から得られたヒト赤血球を使用して行った。
溶血実験は、以前に記載されたプロトコル（Ａｂｂａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｎｅｗ ｔｅｍｐｏｒｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ ｒａｎｉｄ Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｓａｈａｒｉｃａ”，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００８，２９：１５２６－３３）に従って、健常な成人ドナー（フランス、パリのＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｓａｎｇ）から得られたヒト赤血球を使用して行った。
【0110】
簡単に説明すると、合成ペプチド（１～２００μＭ、最終濃度）を、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で赤血球（２×１０７細胞）と共に３７℃で１時間インキュベートした（１００μＬ、最終容量）。遠心分離（１２，０００×ｇ、１５秒）後、上清の吸光度を４５０ｎｍで測定した。５０％溶血を生じるペプチドの平均濃度であるＬＣ５０値を、０．１％トリトン（ｖ／ｖ）に相当する陽性対照（１００％溶血）を用いて三連で実行した３回の独立した実験から決定した。
【0111】
結果
ＳＨｆ、公知のＳＨｆ類似体及び本発明のＡＭＰの生物学的活性（抗菌活性及び細胞傷害性）を表２に提供する。
ＳＨｆ、公知のＳＨｆ類似体及び本発明のＡＭＰの生物学的活性（抗菌活性及び細胞傷害性）を表２に提供する。
【0112】
【表2】
ＬＣ５０：溶解濃度５０％
ＥＣ：大腸菌(Escherichia coli)；ＰＡ：緑膿菌（Psudomonas aeruginosa）；
ＡＢ：アシネトバクター・バウマンニ(Acinetobacter baumannii）；
ＫＰ：肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）；ＳＡ：黄色ブドウ球菌(Stapylococcus aureus)；
ＳＰ：化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）；ＬＩ：Listeria ivanovii；
ＥＦ：エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)
ＮＥ：評価せず。
【配列表】
【国際調査報告】