特表 2024-521439 Ｔ細胞を活性化する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-31

(54)【発明の名称】Ｔ細胞を活性化する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/07 20100101AFI20240524BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240524BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240524BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240524BHJP

【ＦＩ】

C12N5/07

C12N5/0783

C12N5/10

C12N15/09 Z

A61K35/17

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023575970

(86)(22)【出願日】2022-06-10

(85)【翻訳文提出日】2024-01-26

(86)【国際出願番号】 US2022032936

(87)【国際公開番号】W WO2022261392

(87)【国際公開日】2022-12-15

(31)【優先権主張番号】63/209,784

(32)【優先日】2021-06-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520032608

【氏名又は名称】パクト ファーマ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＡＣＴ ＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】フー， アンドリュー ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】トゥヌグントラ， ラムヤ エイチ．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA30

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

本開示は、新規な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。本明細書に開示のａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む。本開示のａＡＰＣは、目的のＴ細胞を活性化するかつ増殖させる「既製品化」ツールとして使用することができる。また、本開示は、本明細書に開示のａＡＰＣを使用してＴ細胞を活性化する方法、およびＴ細胞療法製品を製造する方法も提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。

【請求項2】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される、請求項１に記載のａＡＰＣ。

【請求項3】

リポソームが、リン脂質と機能化脂質との混合物を含む、請求項１または２に記載のａＡＰＣ。

【請求項4】

混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が、１０，０００：１と２５：１との間である、請求項３に記載のａＡＰＣ。

【請求項5】

前記比が、１０００：１と５０：１との間である、請求項４に記載のａＡＰＣ。

【請求項6】

前記比が、１００：１と５０：１と間である、請求項４または５に記載のａＡＰＣ。

【請求項7】

リン脂質が、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項8】

リポソームが、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項9】

機能化脂質が、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む、請求項３から８のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項10】

機能化脂質が、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である、請求項３から９のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項11】

機能化脂質が、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである、請求項１０に記載のａＡＰＣ。

【請求項12】

機能化脂質が、ビオチン－ＰＯＰＥである、請求項１０または１１に記載のａＡＰＣ。

【請求項13】

刺激性リガンドが、機能化脂質を介してリポソームに付着している、請求項１から１２のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項14】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項15】

ＣＤ３アゴニストが、抗ＣＤ３抗体である、請求項１４に記載のａＡＰＣ。

【請求項16】

ＣＤ２８アゴニストが、抗ＣＤ２８抗体である、請求項１４に記載のａＡＰＣ。

【請求項17】

抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である、請求項１５または１６に記載のａＡＰＣ。

【請求項18】

リポソームが、３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する、請求項１から１７のいずれか一項に記載のａＡＰＣ。

【請求項19】

リポソームが、５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する、請求項１８に記載のａＡＰＣ。

【請求項20】

リポソームが、１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する、請求項１８または１９に記載のａＡＰＣ。

【請求項21】

請求項１から２０のいずれか一項に記載のａＡＰＣの集団。

【請求項22】

集団のリポソームが、３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する、請求項２１に記載の集団。

【請求項23】

前記平均直径が、５０ｎｍと６００ｎｍとの間である、請求項２２に記載の集団。

【請求項24】

前記平均直径が、１００ｎｍと４００ｎｍとの間である、請求項２２または２３に記載の集団。

【請求項25】

Ｔ細胞の集団および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物であって、各ａＡＰＣが、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、組成物。

【請求項26】

リポソームが、リン脂質と機能化脂質との混合物を含む、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が、１０，０００：１と２５：１との間である、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記比が、１０００：１と５０：１との間である、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記比が、１００：１と５０：１との間である、請求項２７または２８に記載の組成物。

【請求項30】

リン脂質が、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

リポソームが、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

機能化脂質が、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

機能化脂質が、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

機能化脂質が、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

機能化脂質が、ビオチン－ＰＯＰＥである、請求項３３または３４に記載の組成物。

【請求項36】

刺激性リガンドが、機能化脂質を介してリポソームに付着している、請求項２５から３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される、請求項２５から３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである、請求項２５から３７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

ＣＤ３アゴニストが、抗ＣＤ３抗体である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

ＣＤ２８アゴニストが、抗ＣＤ２８抗体である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項41】

抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である、請求項３９または４０に記載の組成物。

【請求項42】

リポソームが、３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する、請求項２５から４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

リポソームが、５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する、請求項４２に記載の組成物。

【請求項44】

リポソームが、１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する、請求項４２または４３に記載の組成物。

【請求項45】

細胞増殖培地をさらに含む、請求項２５から４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

インターロイキン７（ＩＬ－７）およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をさらに含む、請求項２５から４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

Ｔ細胞の集団が、少なくとも１個のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む、請求項２５から４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

請求項２１から２５のいずれか一項に記載のＴ細胞の集団および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物。

【請求項49】

Ｔ細胞を１個以上の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に曝露することを含むＴ細胞を活性化する方法であって、各ａＡＰＣが、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法。

【請求項50】

リン脂質が、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項51】

リポソームが、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む、請求項４９または５０に記載の方法。

【請求項52】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

刺激性リガンドが、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

ＣＤ３アゴニストが、抗ＣＤ３抗体である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

ＣＤ２８アゴニストが、抗ＣＤ２８抗体である、請求項５３に記載の方法。

【請求項56】

抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体が、低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である、請求項５４または５５に記載の方法。

【請求項57】

Ｔ細胞の集団をａＡＰＣの集団と混合することをさらに含む、請求項４９から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

ａＡＰＣの集団のリポソームが、３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

平均直径が、３０ｎｍと４００ｎｍとの間である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

平均直径が、概して２００ｎｍである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

混合物が、ａＡＰＣとＴ細胞とを５：１（ａＡＰＣ：Ｔ細胞）と５０００：１との間の比で含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

Ｔ細胞が、ＮｅｏＴＣＲ細胞である、請求項４９から６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

Ｔ細胞の集団を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団に曝露することを含むＴ細胞療法製品を製造する方法であって、各ａＡＰＣが、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法。

【請求項64】

Ｔ細胞の集団のうちの少なくとも１個のＴ細胞の遺伝子編集をさらに含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

遺伝子編集が、ガイドＲＮＡ配列に結合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種でＴ細胞の集団をエレクトロポレーションすることを含み、種それぞれが内因性のＴＣＲα遺伝子座および／または内因性のＴＣＲβ遺伝子座を標的とする、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

曝露することが、遺伝子編集の前に行われる、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項67】

遺伝子編集が、非ウイルス性である、請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

Ｔ細胞の集団が、１個以上のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

治療を必要とする患者をＴ細胞療法で治療する方法であって、Ｔ細胞療法が、請求項６３から６９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１１日出願の米国仮出願第６３／２０９，７８４号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容は全体を参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

過去１０年間で、細胞療法が疾患を処置するための新規な療法として出現してきた。具体的には、製造されたＴ細胞（例えば、ＴＩＬ、ＣＡＲ－ＴおよびＮｅｏＴＣＲの各操作細胞）の使用が、関心が高まっている分野となっている。多くの療法が、がんの処置に関してそのような細胞療法の有効性を示す、小規模の研究段階の結果を生み出すことができるが、一方、これらの療法を患者へともたらすことに関する主たる制限事項は製造能力である。

【0003】

細胞療法の製造における極めて重要な工程の１つは、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化である。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する場合、ナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激の後にメモリーＴ細胞の表面マーカー表現型を徐々に獲得し、その結果、幹細胞様メモリー（Ｔｍｓｃ）Ｔ細胞からセントラルメモリー（Ｔｃｍ）Ｔ細胞、最終的にエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）Ｔ細胞に移行する。幼若Ｔ細胞、特にＴｍｓｃ細胞は、複数のがん免疫療法モデルにおいて優れた抗腫瘍効果を実証してきたが、ｉｎ ｖｉｖｏで点滴した場合に、より長い長期生存を示す。したがって、効率的な増殖を獲得するとともにＴｍｓｃ表現型を維持するために、抗腫瘍Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を最適化する必要がある。

【0004】

樹状細胞などの高度に免疫原性であるプロフェッショナルＡＰＣを使用した繰り返しまたは過剰な刺激により、とりわけ、高い抗原特異的結合力を保有するＴ細胞の場合、Ｔ細胞が不可避的に成熟させられ、Ｔ細胞活性化誘導性の細胞死（ＡＩＤＣ）がもたらされる。プロフェッショナルＡＰＣは、免疫原性が高度に強力であることから、細胞療法製品で使用するためのＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための最良の選択ではない。結果として、様々な人工抗原提示細胞またはＡＰＣアナログ（ａＡＰＣ）が開発されてきた。例えば、Ｋ５６２などのある特定の細胞株が使用されてきた。Ｋ５６２は、急性転化期の慢性骨髄性白血病の患者に由来したヒト赤白血病細胞株である。Ｋ５６２細胞は、内因性のＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄの各分子を発現しないが、効果的な免疫シナプスを形成するのに必要とされる接着分子であるＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現する。しかし、Ｋ５６２細胞の集団を培養することおよび維持することにはコストと時間がかかる。したがって、様々な非細胞性ａＡＰＣが開発され、市販されている。例えば、ＣＤ３（αＣＤ３）およびＣＤ２８（αＣＤ２８）に対する活性化抗体で機能化されたマイクロビーズまたはナノ粒子が普通に使用される。しかし、これらの市販の製品は活性化抗体を固相支持体に共有結合的に結合させることから、活性化分子は静的であり、このことは、刺激性リガンドが細胞膜内を移動してＴ細胞活性化におけるキーとなる工程であるＴＣＲクラスター形成を可能にする天然の抗原提示細胞とは異なる。

【0005】

現在の技術の制限として、以下が挙げられる：１）Ｔ細胞と活性化粒子間の相互作用は静的でありかつ非ネイティブである、２）ビーズまたはその他の不活性粒子は、細胞の過剰刺激をもたらすことになる慢性的な活性化を引き起こす可能性がある、３）ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖における不同性（ｄｉｓｐａｒｉｔｙ）、４）長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後にＣＤ８ Ｔ細胞の生存能力が、ＣＤ４細胞と比較して、より劣ること、ならびに５）サイトカイン放出の制御が欠如していること。

【0006】

本明細書に記載の方法および組成物は、患者の処置のための細胞療法の製造のためにｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化することに関する問題を解決することおよび満たされていない要求を満たすことを目的とする。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、目的のＴ細胞を活性化するかつ増殖させる「既製品化」ツールとして使用することができる新規な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。

【0008】

ある特定の実施形態では、本開示は、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。

【0009】

ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リポソームはリン脂質と機能化脂質の混合物を含む。

【0010】

ある特定の実施形態では、混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が１０，０００：１と２５：１との間である。ある特定の実施形態では、比は１０００：１と５０：１との間である。ある特定の実施形態では、比は１００：１と５０：１との間である。

【0011】

ある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせ、からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである。ある特定の実施形態では、機能化脂質はビオチン－ＰＯＰＥである。

【0012】

ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、機能化脂質を介してリポソームに付着している。ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。ある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0013】

ある特定の実施形態では、リポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する。ある特定の実施形態では、リポソームは５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する。ある特定の実施形態では、リポソームは１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する。

【0014】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示のａＡＰＣの集団を提供する。ある特定の実施形態では、集団のリポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する。ある特定の実施形態では、平均直径は５０ｎｍと６００ｎｍとの間である。ある特定の実施形態では、平均直径は１００ｎｍと４００ｎｍとの間である。

【0015】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、リポソームはリン脂質と機能化脂質の混合物を含む。

【0016】

ある特定の実施形態では、混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が１０，０００：１と２５：１との間である。ある特定の実施形態では、比は１０００：１と５０：１との間である。ある特定の実施形態では、比は１００：１と５０：１との間である。

【0017】

ある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせ、からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である。ある特定の実施形態では、機能化脂質は、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである。ある特定の実施形態では、機能化脂質はビオチン－ＰＯＰＥである。

【0018】

ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、機能化脂質を介してリポソームに付着している。ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。ある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0019】

ある特定の実施形態では、リポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する。ある特定の実施形態では、リポソームは５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する。ある特定の実施形態では、リポソームは１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する。

【0020】

ある特定の実施形態では、組成物は細胞増殖培地をさらに含む。ある特定の実施形態では、インターロイキン７（ＩＬ－７）およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をさらに含むこと。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団は少なくとも１個のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む。

【0021】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団および本明細書に開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物を提供する。

【0022】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を１個以上の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に曝露することを含むＴ細胞を活性化する方法であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法を提供する。

【0023】

ある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。

【0024】

ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。ある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0025】

ある特定の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞の集団をａＡＰＣの集団と混合することをさらに含む。ある特定の実施形態では、ａＡＰＣの集団のリポソームは、３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する。ある特定の実施形態では、平均直径は３０ｎｍと４００ｎｍとの間である。ある特定の実施形態では、平均直径は概して２００ｎｍである。ある特定の実施形態では、混合物は、ａＡＰＣとＴ細胞を５：１（ａＡＰＣ：Ｔ細胞）と５０００：１との間の比で含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＮｅｏＴＣＲ細胞である。

【0026】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団に曝露することを含むＴ細胞療法製品を製造する方法であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法を提供する。

【0027】

ある特定の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞の集団のうちの少なくとも１個のＴ細胞の遺伝子編集をさらに含む。ある特定の実施形態では、遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ配列に結合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種でＴ細胞の集団をエレクトロポレーションすることを含み、ここで、種それぞれが内因性のＴＣＲα遺伝子座および／または内因性のＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、曝露することは遺伝子編集の前に行われる。ある特定の実施形態では、遺伝子編集は非ウイルス性である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団は１個以上のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む。

【0028】

ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者をＴ細胞療法で処置する方法であって、Ｔ細胞療法は、本明細書に開示の製造方法によって得られる、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1-1】抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を呈示した表面を備えるａＡＰＣのワークフローを示す、図である。

【図1-2】抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を呈示した表面を備えるａＡＰＣのワークフローを示す、図である。

【図2】ＡおよびＢは、活性化フェーズ過程のＴ細胞クラスター形成のモニタリングを示す、図である。

【図3A-C】種々のａＡＰＣへの曝露に応答する活性化フェーズ過程のＴ細胞クラスター形成のモニタリングを示す、図である。

【図3D】種々のａＡＰＣへの曝露に応答する活性化フェーズ過程のＴ細胞クラスター形成のモニタリングを示す、図である。

【図4】０．１～２％ＰＯＰＥがＴｍｓｃの％の増加を示すこと、および４％ＰＯＰＥがＴｒａｎｓＡｃｔに匹敵するＴｍｓｃの％であったこと、を示す図である。

【図5】刺激性リガンドの投薬量の増加によりＴｔｍ／Ｔｅｍ集団が上昇し、Ｔｍｓｃ＋Ｔｃｍ集団が減少することを示す、図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本開示は、養子細胞療法の調製および製造に有用な人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む組成物および方法を提供する。本開示は、部分的には、リン脂質および刺激性リガンドを含むリポソームを含むａＡＰＣを創出する本発明者らの能力に基づくものである。本開示のａＡＰＣは、目的のＴ細胞を活性化するかつ増殖させる「既製品化の」ツールとして使用することができる。最終的に、本開示は、本明細書で開示の組成物および方法を使用して養子細胞療法（例えば、Ｔ細胞療法製品）を作製するための方法も提供する。本開示の非限定的な実施形態について、本明細書および実施例によって説明する。本開示の明確化のためであって、限定としてではなく、詳細な説明は以下の下位項目に分けられる：
１．定義；
２．人工抗原提示細胞；
３．Ｔ細胞の活性化；
４．ＮｅｏＴＣＲ製品；および
５．例示的実施形態。

【0031】

１．定義
別段に規定されていなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本開示の主題において使用される用語の多くの一般的定義を提供するものである：Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、ＬａｗおよびＭａｒｔｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｉｎｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０１９；Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＬａｗおよびＲｅｎｎｉｅ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０２０；Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｍａｃｋ、Ａｔｗｏｏｄ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｐａｒｉｓｈ、Ｓｍｉｔｈ、Ｖｅｌｌａ、およびＳｔｉｒｌｉｎｇ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００６；ならびにＰａｕｌ、Ｗｉｌｌｉａｍ．２０１３．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に明記されない限り、それらに帰する下の意味を有する。

【0032】

本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、態様および実施形態「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、ならびに態様および実施形態「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むと理解される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という各用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」または「概して（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という各用語は、当業者によって決定される特定の値に対して許容される誤差範囲内を意味し、これは、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野の実践ごとに、３または３を超える標準偏差内を意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に、生物系または方法に関して、この用語は、値の１桁の範囲内、例えば、５倍以内または２倍以内を意味することができる。

【0034】

本明細書において使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合性活性を呈する限り、種々の抗体構造を包含するが、これには、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性および三重特異性抗体）ならびに抗体断片（例えばｂｉｓ－Ｆａｂ）が含まれる。本明細書において使用される「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の部分を含むインタクトな抗体以外の分子をいう。抗体断片の例としては、それらに限定されないが、ｂｉｓ－Ｆａｂ；Ｆｖ；Ｆａｂ；Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ；Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0035】

「がん」および「腫瘍」という各用語は、本明細書では交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「がん」または「腫瘍」という各用語は、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍性細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。当該用語は、さらに、未制御の細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）によって通常には特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を指してまたはそれを記載するために使用される。がんは、様々な細胞タイプ、組織、または臓器を侵すおそれがあるが、これには、それらに限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、ファローピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群から選択される臓器、またはそれらの組織もしくは細胞タイプが含まれる。がんには、肉腫、癌腫、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが含まれる。がんの例としては、それらに限定されないが、本明細書に記載のものが挙げられる。「がん」または「腫瘍」および「増殖性疾患」という各用語は、本明細書で使用される場合、相互に排他的ではない。

【0036】

「処置する（Ｔｒｅａｔ）」、「処置（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、および「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は互換的に使用され、本明細書で使用される場合、臨床結果を始めとする有益なまたは望ましい結果を得ることを意味する。処置の望ましい効果には、それらに限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的なあらゆる病理的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の減速、病状の改善または緩和、および寛解または予後の改善が含まれる。一部の実施形態では、本発明のＮｅｏＴＣＲ製品は、増殖性疾患（例えばがん）の発生を遅延させるために、またはそのような疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0037】

本明細書で使用される「デキストラマー」は、その同族ＮｅｏＴＣＲに特異的に結合する多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体を意味する。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」または「ｎｅｏＥ」という各用語は、例えば、体細胞突然変異から生じかつ「非自己」として認識される、新たに形成された抗原決定基を指す。「ネオ抗原」、「ネオエピトープ」または「ｎｅｏＥ」を生み出す突然変異には、フレームシフトもしくは非フレームシフトインデル、ミスセンスもしくはナンセンス置換、スプライス部位変化（例えば、選択的スプライシングされた転写物）、ゲノム再編成もしくは遺伝子融合、任意のゲノムもしくは発現変化、または任意の翻訳後修飾が含まれ得る。

【0039】

本明細書で使用される「ＮｅｏＴＣＲ」および「ＮｅｏＥ ＴＣＲ」は、例えば遺伝子編集法によって、Ｔ細胞へと導入されるネオエピトープ特異的Ｔ細胞受容体を意味する。

【0040】

本明細書で使用される「ＮｅｏＴＣＲ細胞」は、１個以上のＮｅｏＴＣＲを発現するように精密操作された１個以上の細胞を意味する。ある特定の実施形態では、細胞はＴ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＮｅｏＴＣＲ製品が投与されることになる患者由来の自己細胞である。「ＮｅｏＴＣＲ細胞」、「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１ Ｔ細胞」および「ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１細胞」という各用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0041】

本明細書で使用される「ＮｅｏＴＣＲ製品」は、１個以上のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む薬学的製剤を意味する。ＮｅｏＴＣＲ製品は、自己の精密ゲノム操作のＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞からなる。標的化ＤＮＡ媒介性非ウイルス精密ゲノム工学手法を使用して、内因性のＴＣＲの発現を、腫瘍排他的ネオエピトープを標的とする末梢ＣＤ８＋ Ｔ細胞から単離された患者特異的ＮｅｏＴＣＲによって排除し、それによって置き換える。ある特定の実施形態では、結果として得られる操作ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ Ｔ細胞は、その表面上で、ネイティブ配列、ネイティブ発現レベルおよびネイティブＴＣＲ機能のＮｅｏＴＣＲを発現する。ＮｅｏＴＣＲ外部結合ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインの配列は、ネイティブＣＤ８＋ Ｔ細胞から単離されたＴＣＲから非改変である。ＮｅｏＴＣＲ遺伝子発現の調節は、ＮｅｏＴＣＲ遺伝子カセットがゲノムに統合されている場所の上流に位置するネイティブの内因性のＴＣＲプロモーターによって駆動される。この手法を通して、ＮｅｏＴＣＲ発現のネイティブのレベルが、未刺激および抗原活性化のＴ細胞状態で観察される。

【0042】

各患者向けに製造されたＮｅｏＴＣＲ製品は、同一の患者の末梢血から個別に単離されたｎｅｏＥ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞からクローン化された単一のｎｅｏＥ特異的ＴＣＲを発現するように精密ゲノム操作されている自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞の定められた用量となっている。

【0043】

本明細書で使用される「ＮｅｏＴＣＲウイルス製品」は、ゲノム工学がウイルス媒介法を使用して実施されることを除いて、ＮｅｏＴＣＲ製品に関する定義と同じ定義を有する。

【0044】

「薬学的製剤」は、この中に含有される活性成分の生物活性が効果的であることを可能とするような形態であり、製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほどに毒性であるさらなる成分を全く含有しない、調製物を指す。明確にするために、ＮｅｏＴＣＲ製品において使用される量にてのＤＭＳＯは許容できないほどに毒性であるとはみなされない。

【0045】

処置の目的に関して「対象」、「患者」、または「個体」は、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園動物、スポーツ動物、またはペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含めて、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

【0046】

本明細書で使用される「ＴＣＲ」は、Ｔ細胞受容体を意味する。

【0047】

本明細書で使用される「内因性の」という用語は、細胞または組織において通常に発現される核酸分子またはポリペプチドを指す。

【0048】

本明細書で使用される「外因性」という用語は、細胞内に内因的には存在しない核酸分子またはポリペプチドを指す。したがって、「外因性」という用語は、外来性、異種の、および過剰発現された核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞内で発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドを包含することになる。「外因性」核酸は、ネイティブの野生型細胞に存在しない核酸を意味する；例えば、外因性核酸は、配列によって、位置／場所によって、またはその両方によって内因性の対応物とは異なることができる。明確にするために、外因性核酸は、そのネイティブの内因性の対応物と比較して同じ配列を有しても異なる配列を有してもよい；それは、遺伝子工学によって細胞自体またはその前駆細胞へと導入することができ、必要に応じて、非ネイティブプロモーターまたは分泌配列などの代替制御配列に連結することができる。

【0049】

それがＴ細胞に関連する場合、「幼若」または「より幼若の」または「幼若Ｔ細胞」は、メモリー幹細胞（Ｔｍｓｃ）およびセントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）を意味する。これらの細胞は、特異的活性化時にＴ細胞増殖を有し、複数の細胞分裂に対してコンピテントである。それらの細胞はまた、再点滴後に生着し、それらの同族抗原への曝露時にエフェクターＴ細胞へと速やかに分化し、腫瘍細胞を標的としかつ殺滅するだけでなく、進行中のがんの監視および制御に対して持続する能力を有する。

【0050】

一連のＴ細胞の分化と成熟の連続の後では、２つの抗原経験サブタイプ：エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）および最終分化エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、が存在する。

【0051】

２．人工抗原提示細胞
本開示は、養子細胞療法の調製および製造のための人工抗原提示細胞を提供する。本開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞を活性化するために使用することができる様々な薬剤を呈示することができる脂質ベシクルまたは脂質ナノ粒子として設計された。ａＡＰＣの設計に使用されるキーとなるパラメーターおよび検討事項を表１に提供する。

【0052】

ａＡＰＣを使用することのキーとなる目標の１つは、可動性リガンドを備えた活性化剤を創り出すことであった。固定リガンド（例えば、ビーズ結合試薬またはプレートコートの試薬）は、Ｔ細胞活性化プラットフォームにとって理想的ではない。対照的に、長距離の膜拡散性によりリガンドの自然な移動が可能になり、このことは、自然なＴ細胞活性化およびＴ細胞とのより自然な相互作用を模倣するのに理想的である。このことに鑑みて、細胞療法の製造に向けて最適なＴ細胞活性化を可能とする適切な程度の流動性（拡散性）を有した組成物を見つけるために、様々な異なる脂質組成物（すなわち、異なる脂質の組合わせとその組合わせの異なる比）を用いて実験する必要があった。

【0053】

ａＡＰＣの設計に関するキーとなる検討事項の１つは、Ｔ細胞のクラスター形成がシグナルの伝達および活性化に影響を与えるという既知の事実であった。目標は、膜の流動性を提供して表面でのタンパク質の再配置を可能にすることができるａＡＰＣを設計すること、とした。

【0054】

αＣＤ３／αＣＤ２８ａ ＡＰＣのａＡＰＣ合成ワークフローの一例を図１に提供する。示されているように、本ａＡＰＣで使用される２つの脂質はＰＯＰＣおよびＰＯＰＥであり、ここで、ＰＯＰＥは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその他の刺激性リガンドの付着のためにビオチン化されている。

【0055】

概念実証実験をａＡＰＣを用いてスモールスケールで実施した。概念実証実験によって：１）本発明のａＡＰＣはＴ細胞に対して非毒性であることが確認され、２）リガンド呈示の許容される密度の範囲が定義され、３）投薬量の範囲（ａＡＰＣ：細胞）が定義され、４）ビオチン－ストレプトアビジンのビオチンの連結を介して刺激性リガンドをＡＰＣ上に呈示することはできることが確認された。リポソームは、Ｔ細胞の増殖および生存能力に悪影響を及ぼさない。リポソームとＴ細胞との比は、２５：１から１０，０００：１まで変化することができる。より好ましくは、比は１００：１、２５０：１、５００：１、１０００：１、２０００：１、３０００：１、４０００：１または５０００：１である。ａＡＰＣとＴ細胞との比およびａＡＰＣの平均直径は、同じ効果を維持するために反比例して変化してもよい、すなわち、より大きなリポソームをより小さなリポソームよりも低い投薬量で供給して、同一量のＴ活性化をもたらしてもよい。

【0056】

ある特定の実装形態では、Ｔ細胞の活性化を誘導するために２つ以上の刺激性リガンドを提示することが望ましい場合がある。複数の刺激性リガンドを、単一タイプのａＡＰＣ（例えば、αＣＤ３とαＣＤ２８の両方を呈示するａＡＰＣ）上で共役型として提示してもよく、または異なるタイプのａＡＰＣ（例えば、αＣＤ３のみを呈示する１つのａＡＰＣと、αＣＤ２８のみを呈示する第２のａＡＰＣ）上で非共役型として提示してもよい。同様に、特定の任意の刺激性リガンドを、同時に呈示される刺激性リガンドに対して等しい濃度で提示しても異なる濃度で呈示してもよい。

【0057】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、自然で、生物学的なセッティングでＴ細胞を活性化するシグナルを提供する。ＡＰＣは、三（３）つの主要なタイプのシグナル：１）ｐＭＨＣ：ＴＣＲ、２）細胞表面タンパク質を通した共刺激、および３）サイトカインによるＴ細胞運命決定、を使用してナイーブＴ細胞を方向付ける。

【0058】

２．１．リポソーム。
本明細書に例示の方法および手順に加えて、リポソームを調製するために当業者によって常套的に使用される種々の方法も本発明で用いることができる。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｂｌｏｏｄ １１５：４７７８～８６頁、２０１０；およびＬｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻、第２版（Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｔｏｋｙｏ）、第４章、６７～８０頁、第１０章、１６７～１８４頁および第１７章、２６１～２７６頁（１９９３））に記載の方法を使用することができる。より具体的には、適切な方法には、それらに限定されないが、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結乾燥法、および逆相エバポレーション法が含まれる。リポソームの構造は特に限定されず、単層および多層などの任意のリポソームであってもよい。

【0059】

本明細書に開示の本開示のリポソームは、典型的には、生理的ｐＨで中性であってもアニオン性であってもカチオン性であってもよい１つまたは２つ以上の脂質の組合わせを含む。ベシクルは、適切な任意の脂質または脂質の組合わせを含むか、またはそうでなければ、それらから形成されてもよい。同様に、コンジュゲートは、適切な任意の脂質を含んでもよく、またはそうでなければ、それらで形成されてもよい。一部の実施形態では、２、３、４、５、またはそれ超の異なる脂質コンジュゲート（例えば、異なる脂質と同じ標的部分、異なる脂質と異なる標的指向性部分、または同じ脂質と異なる標的指向性部分）の組合わせを同じベシクルに、挿入してもよく、またはそうでなければ、付加してもよい。

【0060】

本発明を実施するために使用される脂質または脂質形成物質には、リポソームまたはベシクル形成用の既知の物質が全て含まれる。有用な物質の例としては、リン脂質分子とコレステロールの組合わせが挙げられる。例示的なリン脂質分子としては、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）が挙げられる。特に好ましいのは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）を含む組合わせである。

【0061】

リポソーム組成物は、記載の方法を使用して作製することができ、平均直径３０ｎｍから２０００ｎｍ（２μｍ）まで、例えば、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１μｍ、１．２μｍ、１．５μｍおよび２μｍ、ならびに、サイズ分布５～５０％、１０～３０％または１５～２０％を有する。好ましくは、リポソーム組成物は５０ｎｍと６００ｎｍとの間の平均直径を、より好ましくは、１００ｎｍと４００ｎｍとの間の平均直径を有する。本明細書に記載の方法を使用して、細胞療法の製造過程でＴ細胞を活性化するためのベシクルを提供することができる。

【0062】

２．２．機能化脂質。
本発明の一実施形態によれば、ａＡＰＣを形成する脂質の画分は、脂質に直接的または間接的に、コンジュゲートされた、またはそうでなければ、連結された、機能性エレメントを含む。機能性エレメントは、反応性部分、低分子、タンパク質もしくはポリペプチド、炭水化物、核酸またはそれらの組合わせとすることができる。好ましい実施形態では、機能性エレメントのうちの少なくとも１つは、標的細胞、組織および／または機能化脂質ベシクルに関連した微小環境への当該脂質ベシクルの付着、結合または会合を高める標的指向性部分である。ある特定の実装形態では、形成している脂質の画分は、反応性リガンドで機能化された脂質である。含有している適切な反応性部分の、反応性リガンドの、および機能化脂質の、具体例を表２に列記する。

【0063】

好ましくは、反応性リガンドは、ビオチン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホ－ＮＨＳエステル、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、アミン、マレイミド、ジチオピリジニル、ピリジルジスルフィド、ピリジルジチオプロピオナート、およびＮ－ベンジルグアニンから選択される。チオールとも呼ばれるスルフヒドリルは、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）アミノ酸の側鎖でタンパク質中に存在する。スルフヒドリル反応性化学基には、ハロアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ－チオール、およびジスルフィド還元剤が含まれる。

【0064】

チオエーテルコンジュゲーション用に提供される様々な脂質は、マレイミド、Ｎ－［４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチリル］（ＭＰＢ）または４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＭＣＣ）基などの芳香族マレイミドを含有する。脂肪族シクロヘキサン環を含有するＭＣＣのマレイミド官能基は、ＭＰＢの芳香族フェニル基よりも水性反応環境における加水分解に対してより安定である。タンパク質またはポリペプチドを機能化脂質にコンジュゲートさせることは、当技術分野で周知されている方法に従って実施することができる。例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ、Ｓｈａｎ Ｗｏｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、１９９１）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２版、Ｇｒｅｇ Τ．Ｆｌｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｌｏｎｄｏｎ、英国、２００８）を参照されたい。代替的に、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８などの刺激性リガンドを、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を始めとする非共有結合手段を介して付着させることもできる。

【0065】

３．Ｔ細胞活性化
細胞療法製品用のＴ細胞の製造のためのｉｎ ｖｉｔｒｏセッティングでは、Ｔ細胞は、増殖するために刺激される必要がある。患者にとって治療上有益である十分な数の細胞を含む細胞製品を得るためには、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で増殖できることが必要であるので、細胞の増殖は細胞療法の開発と製造にとって極めて重要である。より具体的には、Ｔ細胞活性化によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖（すなわち、細胞製品の収量）およびＴ細胞分化（すなわち、細胞製品の品質）の程度が決定される。Ｔ細胞を、分裂促進因子で駆動することができる抗原非依存性刺激を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激する。このような刺激には主たる２つのシグナルが含まれ得る：１）シグナル１、抗ＣＤ３剤はＴＣＲ複合体のＣＤ３鎖に結合することになる；および２）シグナル２、抗ＣＤ２８剤はＴ細胞上のＣＤ２８に結合することになる。

【0066】

ポリクローナルＴ細胞増殖用の市販の製品には、超常磁性粒子（例えば、ＴｒａｎｓＡｃｔ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＰｒｏＭａｇ Ｂｉｎｄ０ＩＴ、ＭａｇＭａｘ、およびＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）、表面に埋め込まれたまたは表面に呈示されたポリマー複合体（例えば、Ｃｌｏｕｄｚ）、ならびに可溶型テトラマー抗体複合体（例えば、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）が含まれる。これらの市販の製品の主要な２つの制限とは：１）Ｔ細胞と活性化製品との間の相互作用が非ネイティブであること、および２）活性化製品のビーズ／不活性粒子が、Ｔ細胞の過剰刺激をもたらす慢性的な活性化を招くおそれがあることである。

【0067】

市販の製品に伴うさらなる問題としては以下が挙げられる：１）市販の製品は、個体の細胞療法に向けた所望のＴ細胞の特性を駆動するように調節可能ではないこと、２）市販の製品は、ロットによって組成や活性が異なることが多いこと、３）市販の製品は、治療上意義のある細胞数で細胞製品を製造することに必要な活性化を提供することができないことが多いこと、および４）市販の製品は非常に高価であること。

【0068】

４．ＮｅｏＴＣＲ製品
一部の実施形態では、それらの全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１７８８７およびＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２５４１５に記載の遺伝子編集技術およびＮｅｏＴＣＲ単離技術を使用して、ＮｅｏＴＣＲを発現するように精密ゲノム操作されることによって、がんである同一患者由来の自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞内で、ＮｅｏＴＣＲをクローン化する。換言すると、腫瘍特異的であるＮｅｏＴＣＲをがん患者で特定し、次いでそのようなＮｅｏＴＣＲをクローン化し、次いでクローン化されたＮｅｏＴＣＲを当該がん患者自身のＴ細胞に挿入する。次いで、ＮｅｏＴＣＲ発現Ｔ細胞を、「幼若」Ｔ細胞の表現型を保存する様式で増殖させ、結果として、大部分のＴ細胞がＴメモリー幹細胞とＴセントラルメモリー表現型を呈する、ＮｅｏＴＣＲ－Ｐ１製品（すなわちＮｅｏＴＣＲ製品）がもたらされる。

【0069】

これらの「幼若」または「より幼若」または低分化のＴ細胞の表現型は移植可能性の改善および点滴後の長時間の持続性を付与すると記載されている。したがって、「幼若」Ｔ細胞表現型から著しくなる、ＮｅｏＴＣＲ製品の投与は、移植可能性の改善、点滴後の長時間の持続性、およびエフェクターＴ細胞への速やかな分化が全身で腫瘍細胞を根絶することを通して、がんの患者に恩恵を与える可能性を有する。

【0070】

エクスビボでの作用機序の研究も、がん患者由来のＴ細胞を用いて製造したＮｅｏＴＣＲ製品を用いて行った。Ｔ細胞の殺傷活性、増殖およびサイトカイン産生の抗原特異性によって測定して、同等の遺伝子編集効率および機能活性が観察されたが、このことが実証するところは、本明細書に記載の製造方法が、出発物質としてがん患者由来のＴ細胞を含む製品を生成することに成功していること、である。

【0071】

ある特定の実施形態では、ＮｅｏＴＣＲ製品の製造方法は、ガイドＲＮＡ配列に結合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種のエレクトロポレーションを伴い、ここで、それぞれの種はゲノムＴＣＲα遺伝子座およびゲノムＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを標的である各ゲノム遺伝子座に送り込む特異性は、高度に特異的であると文献において先に記載されている。ＮｅｏＴＣＲ製品の包括的な試験を、それぞれＣＯＳＭＩＤおよびＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを使用して、可能性のあるオフターゲットゲノム切断部位を探索するｉｎ ｖｉｔｒｏ解析およびインシリコ解析で実施した。健康なドナーからの複数のＮｅｏＴＣＲ製品または同等の細胞生成物を、ディープシーケンシングによって候補オフターゲット部位の切断について評価したが、このことによって、選択されたヌクレアーゼは高度に特異的であるという公開された証拠が裏付けられた。

【0072】

精密ゲノム工学法のさらなる態様を、安全性について評価した。精密ゲノム工学の後のゲノム不安定性の証拠は、標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ）または標準的ＦＩＳＨ細胞遺伝学による複数のＮｅｏＴＣＲ製品の評価ではまったく見いだされなかった。ＮｅｏＴＣＲ配列のゲノムのどこかへのオフターゲット統合はまったく検出されなかった。細胞生成物中に残留Ｃａｓ９の証拠はまったく見いだされなかった。

【0073】

ＮｅｏＴＣＲ製品および精密ゲノム工学法の包括的な評価が指示するところは、ＮｅｏＴＣＲ製品が患者へ戻す点滴の後に良好な耐容性を示すことになること、である。

【0074】

本明細書に記載のゲノム工学手法によって、固形および液性腫瘍の患者のための個別化された養子細胞療法に向けた特注のＮｅｏＴＣＲ細胞（すなわち、ＮｅｏＴＣＲ製品）の高度に効率的な生成が可能となる。さらに、操作方法はＴ細胞での使用に限定されず、ナチュラルキラー細胞および造血幹細胞を含めて、他の初代細胞タイプにも成功裡に適用されてきた。

【0075】

５．例示的実施形態
ある特定の実施形態では、本開示は、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を提供する。

【0076】

本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リポソームはリン脂質と機能化脂質の混合物を含む。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が１０，０００：１と２５：１との間である。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、比は１０００：１と５０：１との間である。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、比は１００：１と５０：１との間である。

【0077】

本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、機能化脂質は、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、機能化脂質は、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である。

【0078】

本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、機能化脂質は、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、機能化脂質はビオチン－ＰＯＰＥである。

【0079】

本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、機能化脂質を介してリポソームに付着している。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0080】

本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リポソームは５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する。本明細書に開示のａＡＰＣのある特定の実施形態では、リポソームは１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する。

【0081】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示のａＡＰＣの集団を提供する。本明細書に開示のａＡＰＣの集団のある特定の実施形態では、集団のリポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する。本明細書に開示のａＡＰＣの集団のある特定の実施形態では、平均直径は５０ｎｍと６００ｎｍとの間である。本明細書に開示のａＡＰＣの集団のある特定の実施形態では、平均直径は１００ｎｍと４００ｎｍとの間である。

【0082】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団および人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、組成物を提供する。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リポソームはリン脂質と機能化脂質の混合物を含む。

【0083】

本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、混合物中のリン脂質と機能化脂質との比が１０，０００：１と２５：１との間である。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、比は１０００：１と５０：１との間である。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、比は１００：１と５０：１との間である。

【0084】

本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、機能化脂質は、ビオチン部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分、スルホ－ＮＨＳ部分、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）－ニッケル、マレイミド部分、またはＮ－ベンジルグアニンを含む。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、機能化脂質は、１－オレオイル－２－（１２－ビオチニル－（アミノドデカノイル））－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１－１２：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１６：０ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ビオチニル）（１８：１ビオチン－ＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）、（１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（ｃａｐビオチニル）（１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ）、ビオチン－ホスファチジルエタノールアミン（ビオチン－ＰＥ）、またはビオチン－１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ビオチン－ＰＯＰＥ）である。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、機能化脂質は、１８：１ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、１６：０ビオチン－Ｃａｐ－ＰＥ、またはビオチン－ＰＯＰＥである。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、機能化脂質はビオチン－ＰＯＰＥである。

【0085】

本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、機能化脂質を介してリポソームに付着している。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、ＣＤ４０Ｌ、およびＬＦＡ－１からなる群から選択される。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0086】

本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リポソームは３０ｎｍと２μｍとの間の直径を有する。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リポソームは５０ｎｍと６００ｎｍとの間の直径を有する。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、リポソームは１００ｎｍと４００ｎｍとの間の直径を有する。

【0087】

本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、組成物は細胞増殖培地をさらに含む。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、組成物は、インターロイキン７（ＩＬ－７）およびインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をさらに含む。本明細書に開示の組成物のある特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団は少なくとも１個のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む。

【0088】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団および本明細書に開示の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団を含む組成物を提供する。

【0089】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞を１個以上の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に曝露することを含むＴ細胞を活性化する方法であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法を提供する。

【0090】

本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジン酸（ホスファチデート）（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスホイノシチド、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールリン酸（ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）、セラミドホスホリルコリン（スフィンゴミエリン）（ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（スフィンゴミエリン）（Ｃｅｒ－ＰＥ）、およびそれらの組合わせからなる群から選択される。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、リポソームは、１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および／または１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）を含む。

【0091】

本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ペプチド－ＭＨＣ複合体、多量体化ネオエピトープ－ＨＬＡ複合体、ＣＤ５８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７Ｈ２、Ｂ７ＲＰ１）、およびＣＤ４０Ｌからなる群から選択される。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、刺激性リガンドは、ＣＤ３アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、またはそれらの組合わせである。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、ＣＤ３アゴニストは抗ＣＤ３抗体である。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、ＣＤ２８アゴニストは抗ＣＤ２８抗体である。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体は低エンドトキシンアジドフリー（ＬＥＡＦ）抗体である。

【0092】

本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞の集団をａＡＰＣの集団と混合することをさらに含む。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、ａＡＰＣの集団のリポソームは、３０ｎｍと２μｍとの間の平均直径および５％から５０％のサイズ分布を有する。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、平均直径は３０ｎｍと４００ｎｍとの間である。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、平均直径は概して２００ｎｍである。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、混合物は、ａＡＰＣとＴ細胞を５：１（ａＡＰＣ：Ｔ細胞）と５０００：１との間の比で含む。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞はＮｅｏＴＣＲ細胞である。

【0093】

ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の集団を人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の集団に曝露することを含むＴ細胞療法製品を製造する方法であって、各ａＡＰＣは、リン脂質を含むリポソームと、リポソームの外面に呈示された刺激性リガンドとを含む、方法を提供する。

【0094】

本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、本方法は、Ｔ細胞の集団のうちの少なくとも１個のＴ細胞を遺伝子編集することをさらに含む。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ配列に結合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼの二重リボ核タンパク質種でＴ細胞の集団をエレクトロポレーションすることを含み、ここで、種それぞれが内因性のＴＣＲα遺伝子座および／または内因性のＴＣＲβ遺伝子座を標的とする。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、曝露することは遺伝子編集の前に行われる。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、遺伝子編集は非ウイルス性である。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞の集団は１個以上のＮｅｏＴＣＲ細胞を含む。

【0095】

ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者をＴ細胞療法で処置する方法を提供する。本明細書に開示の方法のある特定の実施形態では、Ｔ細胞療法は、本明細書に開示の製造方法によって得られる。

【実施例】

【0096】

以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上に提供した一般的な説明を前提とすると、種々の他の実施態様を実施することができること、が理解されよう。

【0097】

実施例１．利用可能な活性化剤の評価。
ＮｅｏＴＣＲ製品の製造で使用するための適合性について６種類の活性化剤を比較した。活性化剤には４種類の市販の製品を含めた：（ａ）ＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）（ヒト化ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストにコンジュゲートされているコロイド状ポリマーナノマトリックス、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、（ｂ）ＣＬＯＵＤＺ（商標）（完全ヒト化抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で誘導体化された、アルギン酸塩ベースのヒドロゲルで構成される直径１２～１００μｍのミクロスフェア、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、（ｃ）ＩＭＭＵＮＯＣＵＬＴ（商標）（抗ヒトＣＤ３単一特異性抗体複合体および抗ヒトＣＤ２８単一特異性抗体複合体、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および（ｄ）ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ＋ＣＤ２。加えて、Ｔ細胞を、ｃｏｍＰＡＣＴテトラマー（４つのビオチン化ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質に結合させたストレプトアビジンコア）およびｃｏｍＰＡＣＴ－デキストランコンジュゲート（ビオチン化ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質に結合させたストレプトアビジンコーティングデキストラン）に曝露させたが、これについては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，８７５，９０５号により詳細に記載されている）。ＴｒａｎｓＡｃｔおよびＣｌｏｕｄｚについても、ＩＬ２がＴ細胞活性化を改善しかつ細胞増殖および生理機能の改善につながるか判定するために、ＩＬ２の存在下および非存在下で試験した。

【0098】

編集したＴ細胞は、米国特許第１０，５８４，３５７号に先に記載されているように調製した。手短に、ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮した。濃縮したＴ細胞を試験試薬で刺激し、培地（ＴｅｘＭＡＣＳ、それぞれＩＬ－７およびＩＬ－１５ １２．５ｎｇ／ｍＬを含有する３％ヒト血清）とともに１３日間培養した。ＴｒａｎｓＡｃｔ、ＣｌｏｕｄｚおよびＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔは製造業者の指示の通りに使用した。２日目に、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＮｅｏＴＣＲをコードする遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性挿入のために、細胞にＮｅｏ－ＴＣＲ相同組換えテンプレートをエレクトロポレーションした。Ｔ細胞を１３日目まで培地中で培養し、その時点で遺伝子編集効率を決定した（表３）。

【0099】

ＣｌｏｕｄｚおよびＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔの活性化は遺伝子編集を促進したが、一方、遺伝子編集効率はＣＤ８ Ｔ細胞に特異的であり、ＣＤ８ Ｔ細胞に偏っていた（表４）。

【0100】

したがって、ＣｌｏｕｄｚおよびＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔは、ＣＤ４ Ｔ細胞とＣＤ８ Ｔ細胞の両方の効果的な遺伝子編集が望まれる細胞療法にとって良好な選択肢ではない。さらに、Ｃｌｏｕｄｚは直径約１２～１００μｍのポリマーであり、エレクトロポレーション前に（効率的な遺伝子編集を促進するため）および／または最終製品（患者に点滴するように設計されている最終細胞療法製品は好ましくはかかるポリマーが排除されている）からかかるポリマーを除去することは、時間とリソースを大量に消費する些細ではないタスクである。

【0101】

実施例２．ＰＯＰＣリポソームのＴ細胞耐容性
リポソームを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を模倣するように設計した。リポソームは、生体膜の曲率と剛性と同様のものを備える流体膜プラットフォームとして機能し、リポソーム上の抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の表面呈示によって、Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体、およびナイーブ細胞上の共刺激受容体ＣＤ２８を始めとする受容体にシグナルを供給する。

【0102】

本実施例に記載の実験では、様々な濃度の１８：１パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）リポソームに対する濃縮初代ＣＤ４／ＣＤ８細胞の耐容性について、リポソーム：細胞が１０：１、１００：１または１０００：１の比で、１３日間さらに調べる。ストック脂質をクロロホルムに可溶化した。ホウケイ酸塩バイアル中で、脂質を体積で過剰のクロロホルム中で混合して、所望の脂質組成物を得た。不活性ガスを使用して、大半のクロロホルム溶媒をエバポレートして薄い脂質フィルムを得る。脂質フィルム中の残留クロロホルムは、減圧下でデシケーター内で一晩一掃する。乾燥脂質を、添加剤を含まない室温の培養培地中で少なくとも２０分間水和させた。リポソーム形成を、（１）既知の細孔サイズのトラックエッチドメンブレンを通した押出しまたは（２）超音波処理によって行った。

【0103】

血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培地で培養した。翌日、ＣＤ８およびＣＤ４のポジティブＴ細胞を、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘ（登録商標）（ガス透過性急速増殖）プレートの１６ウェルに７．１５×１０^６個のＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を播種し、０日目と８日目に新鮮な培地（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、３％ｈＡＢ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）およびＴｒａｎｓＡｃｔを供給した。リポソームを２日目と８日目に供給した。Ｔ細胞の生存率およびカウントをアクリジンオレンジとＤＡＰＩの染色を介して、市販のセルカウンターを用いて、０日目、２日目、８日目と１３日目に評価した。

【0104】

表５に示すように、濃縮した、ＴｒａｎｓＡｃｔ活性化ＣＤ４／ＣＤ８の生存率および増殖能力の両方とも、１０００ａＡＰＣ／細胞の投薬量までブランクａＡＰＣの存在によって影響を受けなかった。

【0105】

実施例３．ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストのタイトレーション。
シグナル伝達分子抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の表面密度の影響を調べるために、０％、０．１％、１％、２％、および４％ビオチンＣＡＰ－ＰＥを含むＰＯＰＣを使用して、直径８００ｎｍのリポソームを上記のように調製したが、さらにモックコントロールも含める（製造業者の取扱説明書に従ったＴｒａｎｓＡｃｔ）。図１に例示するように、αＣＤ３抗体およびαＣＤ２８抗体をリポソームの表面に結合させた。手短に、ＣＤ３またはＣＤ２８に特異的なビオチンコンジュゲート抗体（両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉから入手）を、αＣＤ３：αＣＤ２８：ストレプトアビジン ３：３：２の比（効果的にはストレプトアビジン１分子当たり３：１の抗体分子）でストレプトアビジンと混合して、抗体－ストレプトアビジン三量体を形成した。次いで、これらの三量体をビオチン－ＣＡＰ－ＰＥ含有リポソームに過剰で添加して、刺激性リガンド、αＣＤ３およびαＣＤ２８を呈示するａＡＰＣを生成した。全ての条件を２重でランした。

【0106】

ａＡＰＣ条件の２日目の生存率は、リガンド呈示の上昇とともに９７％から９４％にわずかに下向く傾向があったが、いずれもＴＡコントロール細胞の生存率と同等以上であり、ＴＡコントロールから予想された生存率と一致していた。全てのａＡＰＣ条件では、０日目から２日目まで細胞増殖があった；ＴＡコントロールでは細胞数がわずかに低下した。刺激性リガンドの提示が上昇すると、ＣＤ６９の発現が上昇し、Ｋｉ６７の発現が低下した（表６）。ＴＡコントロールは、０．１％ＰＥ条件と同様のレベルのＣＤ６９およびＫｉ６７を有した。全ての条件およびＴＡコントロールは実質的に同じＣＤ２５発現レベルを有した。

【0107】

８日目では、ＴＡコントロールを含めて、全ての条件で生存率が劣り、細胞増殖が劣った。生存率は、刺激性リガンドの提示の上昇とともに下向く傾向があった。ＣｌｏｕｄｚおよびＩｍｍｕｎｏｃｕｌｔとは異なり、本発明のリポソームで活性化された場合、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間で編集効率にほとんど差がなかった（データ示さず）。フロー上のＦＳＣ 対 ＳＳＣのリンパ球集団は極めて少なく、これらの細胞ではＴＣＲシグナルがなく、したがって、このことはアーチファクトである可能性があった。８日目では、生存率および細胞カウントは、Ｋｉ６７発現と正に相関し、ＣＤ６９発現と負に相関した。

【0108】

実験を繰り返し、より広範なａＡＰＣ投薬戦略の評価を１３日目まで細胞増殖に関して実施した。全てのａＡＰＣによる活性化は、ポジティブコントロールであるＴｒａｎｓＡｃｔで得られた活性化とおよそ同様であった（表７）。

【0109】

増殖倍率は２％ＰＯＰＥ ａＡＰＣ条件で最大であることが決定された。２％ＰＯＰＥ ａＡＰＣ条件に関するさらなる調査を実行して、遺伝子編集に対する効果を決定した。２％ＰＥ ａＡＰＣ条件では、１３日目に５０％の編集がそして最多数の編集細胞が示される。

【0110】

細胞表現型に対するリガンド密度の影響も調べた。図４に示すように、０．１～２％ＰＯＰＥで、％Ｔｍｓｃの上昇が示されており、４％ＰＯＰＥではＴｒａｎｓＡｃｔと同等の％Ｔｍｓｃであった。また、１～４％ＰＯＰＥで、ＴｒａｎｓＡｃｔ活性化細胞と比較して、エフェクター細胞、すなわち「より古い」Ｔ細胞がより低いこと、が示された。さらに、リガンド密度の上昇は、Ｔ細胞の集団のＣＤ４画分の増加と相関したが、それゆえ、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の分布は抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比を調整することによって調節可能である場合がある。

【0111】

結論。細胞増殖は、ａＡＰＣ表面上のリガンド密度の上昇および細胞あたりのａＡＰＣの投薬量の増加とともに有意に改善した。１～４％ＰＥ条件では、ＴｒａｎｓＡｃｔ活性化細胞集団に勝ってＮｅｏＴＣＲ＋の％が＞１６０％で改善した。様々なエレクトロポレーションシステムでさらなる試験を実行して、ａＡＰＣ活性化細胞の遺伝子編集率をさらに最適化することができる。さらに、抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８のモル比を調整して、ＣＤ４：ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を最適化することができる。

【0112】

実施例４．Ｔ細胞活性化のためのａＡＰＣ直径
ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートの１６ウェルに７．１５×１０^６個のＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を播種し、０日目に新鮮な培地（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、３％ｈＡＢ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）およびａＡＰＣを供給した。ａＡＰＣを１００リポソーム／細胞（直径３０、１００、２００、４００ｎｍ）で、活性化した濃縮ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞に２重で投薬した。これらのａＡＰＣは、１：１のαＣＤ３／αＣＤ２８および１％のビオチン－ＰＥ濃度で存在した。２日目に、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を活性化マーカーに関して評価し、その後に、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＮｅｏＴＣＲをコードする遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性挿入のために、Ｎｅｏ－ＴＣＲ相同組換えテンプレートであるＰＡＣＴ３５－ＴＣＲ８９をエレクトロポレーションした。培地を８日目に交換した。増殖した細胞の遺伝子編集および表現型状態の転帰を８日目と１３日目に評価した。Ｔ細胞の生存率およびカウントをアクリジンオレンジとＤＡＰＩの染色を介して、市販のセルカウンターを用いて、０日目、２日目、８日目と１３日目に評価した。

【0113】

ａＡＰＣ条件の２日目の生存率は、ａＡＰＣサイズの増大とともに９７％から９４％にわずかに下向く傾向があったが、いずれもＴＡコントロール細胞の生存率と同等以上であった（表８）。全てのａＡＰＣ条件では、０日目から２日目まで細胞増殖があった；ＴＡコントロールでは細胞数がわずかに減少した。

【0114】

３０ｎｍのａＡＰＣ条件では、未染色コントロール（同じドナー）と同様のレベルのＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＫｉ６７の発現を有したが、このことは、細胞を活性化するには刺激性リガンドが不十分であることを指摘している可能性がある（表９）。３０ｎｍ超のａＡＰＣによるａＡＰＣ条件では、ＴＡ活性化コントロールと同等のレベルのＣＤ２５が示された。ａＡＰＣサイズの増大により、Ｔ細胞上のＣＤ６９の発現が上昇した。３０超のａＡＰＣによるａＡＰＣ条件では、ＴＡコントロールと同等以上のＣＤ６９発現があった。３０ｎｍを除けば全てのａＡＰＣ条件では、ＴＡコントロールよりも高いＫｉ６７発現があった。ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＫｉ６７の発現は、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞との間で実質的に差がなかった（データ示さず）。同様に、遺伝子編集効率もリポソームサイズに関連してまったく傾向を示さなかった（データ示さず）。

【0115】

上記の検討事項に基づいて、ａＡＰＣからのＴ細胞の分離および精製を可能とするには直径２００ｎｍが最適であること、および、活性化には２％または４％のリガンド表面被覆が最適であること、が決定された。

【0116】

実施例５．Ｔ細胞活性化のためのａＡＰＣのアゴニスト負荷
αＣＤ３／αＣＤ２８抗体を異なるリポソーム（２００ｎｍ）上へと分けることを評価するために、別々のαＣＤ３三量体およびαＣＤ２８三量体を生成し、合計１００リポソーム／細胞（５０リポソーム／各種の細胞）へとａＡＰＣに結合させた。共役リガンド提示条件と非共役リガンド提示条件の両方で、０～２日目よりＴＡコントロールよりも細胞増殖が良好であった；共役条件 対 非共役条件において、生細胞が２０％超で存在した（データ示さず）。２つの条件間で活性化マーカーにまったく有意差はなかった。８日目の共役条件下で細胞増殖と編集細胞の総数がわずかにより高めであったが、２つの条件間のＮｅｏＴＣＲ＋の％またはＫＯの％に対して有意な影響はまったくなかった。

【0117】

上に提示の結果が示唆するところは、ａＡＰＣサイズおよびリガンド提示様相および密度へのＴ細胞活性化の依存性、である。これらの結果がまた指摘するところは、プロセス２日目に測定して、過剰刺激によって濃縮ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞の効果的な活性化状態が邪魔されていること、である。本研究では、以下の２つの手段を介する刺激性リガンド投薬量がより低いことの影響について調査した：（１）表面密度がより低いことおよび（２）Ｔ細胞あたりのａＡＰＣ投薬量がより低いこと。この目的のために、２００ｎｍのａＡＰＣサイズで０．０１～１％ＰＥのラージスケール（６ウェル）反復を実行した。１０ａＡＰＣ／細胞から１００ａＡＰＣ／細胞の範囲でａＡＰＣ投薬量をタイトレーションした。

【0118】

ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートの１６ウェルに７．１５×１０^７個のＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を播種し、０日目に新鮮な培地（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、３％ｈＡＢ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）およびａＡＰＣを供給した。２日目に、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を活性化マーカーに関して評価し、その後に、ＴＲＡＣ遺伝子座でのＮｅｏＴＣＲをコードする遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性挿入のために、Ｎｅｏ－ＴＣＲ相同組換えテンプレートであるＰＡＣＴ３５－ＴＣＲ８９をエレクトロポレーションした。培地を８日目に交換した。増殖した細胞の遺伝子編集および表現型状態の転帰を８日目と１３日目に評価した。Ｔ細胞の生存率およびカウントをアクリジンオレンジとＤＡＰＩの染色を介して、市販のセルカウンターを用いて、０日目、２日目、８日目と１３日目に評価した。活性化を２日目に評価した。Ｔ細胞表現型および疲弊について８日目と１３日目に評価した。

【0119】

最低レベルの刺激性リガンドを除く全てで、本発明のａＡＰＣは、活性化マーカー、ＣＤ２５およびＣＤ６９の発現をポジティブコントロールの発現と同様のレベルまで誘導した。見られるように、ａＡＰＣへの先行曝露により、増殖マーカーＫｉ６７の発現が誘導されたが、ポジティブコントロールよりも低いレベルであった。活性化マーカーと同様に、最低レベルの刺激性リガンドを除く全てが、同様のレベルのＫｉ６７の発現を示した。

【0120】

Ｋｉ６７発現は、ａＡＰＣで活性化したものと比較して、ＴＡ条件ではＣＤ４ Ｔ細胞でより高く、ＣＤ８ Ｔ細胞でより低かった（表１１）。刺激性リガンドが最も低いａＡＰＣ条件（１０ａＡＰＣ／細胞にて０．０１％ＰＥ）で、他の条件よりもＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＫｉ６７の発現が低かった。

【0121】

遺伝子編集を、Ｔ細胞の活性化および会合に対する抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の表面呈示およびａＡＰＣサイズのタイトレーションに関連して調べた。刺激性リガンドのモルがより高い条件では、刺激性リガンドがより低い条件と比較して、ＮｅｏＴＣＲ発現がより高かったが、ノックアウトのレベルは同等であった（データ示さず）。８日目までに、ａＡＰＣは、ＣＤ４：ＣＤ８比に対してまったく影響を及ぼさなかったが、この比は、ＴＡコントロールを含めて、試験した全ての条件で概して３：１であった。

【0122】

刺激性リガンドの量が一定に保たれた場合に、Ｔ細胞の活性化および会合に対するａＡＰＣサイズの影響があるか判定するために活性化マーカーを解析した。ＣＤ６９およびＣＤ２５を活性化マーカーとして使用し、Ｋｉ６７を増殖マーカーとして使用した。ａＡＰＣ（０．１％ＰＥ）を、ａＡＰＣ／細胞が６～１００の可変用量条件で２００～８００ｎｍの範囲の間で選択した。刺激性リガンドのモルは、全ての条件で一定に保たれた（アッセイごとにαＣＤ３抗体およびαＣＤ２８抗体それぞれ３．０２ピコモル、またはＴ細胞あたり概して２５，０００の刺激性リガンド）。同様に、ベシクルおよび用量（ＡＰＣ）のサイズを、リポソームの総表面積が一定（１．２６×１０^７ｎｍ^２）になるように反比例して変化させた。ＣＤ２５、ＣＤ６９およびＫｉ６７の発現レベルは、サイズおよび等モルのアゴニストレベルにてのａＡＰＣ／細胞の投薬量とは無関係であった（表１２）。刺激性リガンドのモルが一定に保たれた場合、ａＡＰＣサイズ／投薬量はｎｅｏＴＣＲ発現に影響を及ぼさなかった（表Ｒ）。

【0123】

これらの実験が示すところは、濃縮ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化および編集に影響を及ぼすのは、サイズまたはａＡＰＣの投薬量ではなく、刺激性リガンドの総量であること、である。

【0124】

実施例６．Ｔ細胞との融合に対するリポソーム抵抗性
本発明のａＡＰＣは、様々な活性化シグナル伝達分子のコンジュゲートストレプトアビジン三量体を含むＰＯＰＣおよびビオチン－ＰＯＰＥ脂質などの脂質からなるリポソームコンストラクトである。このようなａＡＰＣは、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化に使用することができる。しかし、リポソームは、リガンド相互作用の過程で患者の細胞と融合する可能性がある。リポソームが患者細胞と融合するかどうか、またはその融合がどの程度に起こるかを確立するために、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄにコンジュゲートされている脂質、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥをリンパ球との脂質融合のマーカーとして使用した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８の三量体を生成し、リポソーム上のビオチン化脂質に結合させた（１％ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＰＯＰＣ中の１％ビオチン－ＰＯＰＥ）。

【0125】

フローサイトメトリーを使用して融合を評価した。－１（マイナス１）日目、解凍した濃縮ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を完全培地にプレーティングし、２４時間静止させた。０日目、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄリポソーム（αＣＤ３／αＣＤ２８を含むＴＲ－リポソーム（１％ＰＥ））を直径８００ｎｍで作製し、細胞あたり１０リポソームの用量で培養物に添加した。評価するタイムポイントは、静止の後、０日目、遠心分離前２日目、遠心分離後２日目、およびエレクトロポレーション後２日目とした。０日目に、５つのウェルに１０Ｍ細胞をプレーティングし、ａＡＰＣを１０ａＡＰＣ／細胞で添加した。０日目の２時間後、１つのウェルを採取し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈し、フローでランさせて、赤色シグナルおよびａＡＰＣの存在をチェックした。リポソームのベースラインの測定値を有するために、Ｔｘ－Ｒｅｄリポソームの平均蛍光強度（ＭＦＩ）も測定した。

【0126】

２日目に、ａＡＰＣ融合に対するエレクトロポレーションの影響を試験するために試料を評価した。細胞を培地へと再懸濁し、遠心分離前の試料のアリコートを、再懸濁前の培養物からの上清とともに採取し、次いで再懸濁後の試料を採取した。残りの培養物のうちの２つを再懸濁し、１００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後のＤ２の場合、上清を採取し、ペレットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁した。エレクトロポレーション後の試料の場合、上清を除去し、ペレットをＰ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）バッファー１００μＬに再懸濁し、Ｘキュベット中でエレクトロポレーションを行った。１０分後、細胞を培地に戻し、３７℃で２時間培養し、その後、フロー解析のために細胞を採取した。

【0127】

ａＡＰＣがＤ０からＤ２までの濃縮Ｔ細胞と相互作用するかどうか判定するために、Ｔ細胞およびａＡＰＣを２日の期間にわたりモニタリングした。Ｄ０に、２５０００個のＴ細胞の４つのウェルに１０ａＡＰＣ／細胞をプレーティングした。２つのウェルは完全なａＡＰＣを受けたが、一方、他の２つのウェルは刺激性リガンドのネガティブコントロールとしてブランクのａＡＰＣ（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ含、ビオチンＰＥ不含）を受けた。Ｔ細胞：ａＡＰＣ相互作用を評価するために、２日間にわたって２時間ごとに画像を取得した。

【0128】

細胞のプロセシングのタイムラインは以下の通りである：１）－１日目：ａＡＰＣ用の脂質［１％ＴＲ、１％ビオチン－ＰＥ］を乾燥させ、解凍し１０Ｍ／ウェルで細胞を静止させる；２）０日目：静止細胞に１０ａＡＰＣ／細胞、αＣＤ３／αＣＤ２８を含む直径８００ｎｍ、を添加する；Ｄ０融合を評価する；および３）２日目：Ｘキュベット条件４、５でエレクトロポレーションを行い、エレクトロポレーションの２時間後に融合を評価する；Ｄ０融合を評価する。

【0129】

ＴｒａｎｓＡｃｔ活性化細胞は互いにクラスター形成しており、これは、４８時間で最も視認可能である（データ示さず）。この現象は、ａＡＰＣ活性化条件では同程度には見られない。これは、（１）自己クラスター形成に必要なＬＦＡ－１ ＩＣＡＭ－１アップレギュレーションに必要な刺激性リガンドの欠如、または（２）ａＡＰＣによるＬＦＡ－１ ＩＣＡＭ－１相互作用の立体ブロッキング、が原因と考えられる。

【0130】

０日目に、ａＡＰＣの添加４時間後の細胞だけが何らかのＴｘＲｅｄシグナルを有した。このことが示唆するところは、Ｔ細胞は、定着する前に培養４時間までにａＡＰＣと会合すること、である。

【0131】

２日目には、培養上清試料だけがＴｘＲｅｄシグナルを有する。このことが実証するところは、初期サイズ８００ｎｍのａＡＰＣは培養物中で定着しないこと、である。遠心分離前の細胞にはＴｘＲｅｄシグナルがまったくなく、このことが示唆するところは、２日目までに定着後のａＡＰＣとの融合または会合はないこと、である。遠心分離後およびエレクトロポレーション後の細胞もＴｘＲｅｄシグナルを有さなかった。このことが示唆するところは、遠心分離はＴ細胞とのａＡＰＣの融合を促進せず、エレクトロポレーション前にａＡＰＣを排除するのに十分であること、である。

【0132】

実施例７．ａＡＰＣ用量およびリガンド密度駆動性Ｔ細胞クラスター形成
概要。Ｚｕｍｗａｌｄｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ １９１：３６８１～３６９３頁が示したところはＬＦＡ－１／ＩＣＡＭ－１相互作用が活性化Ｔ細胞どうし間のホモタイプ接着を媒介するが、なぜなら、Ｔ細胞はＬＦＡ－１もＩＣＡＭ－１も両方を発現するからであること、である。このようなホモ型凝集は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的なＴ細胞活性化のホールマークであり、Ｔ細胞クラスターはまたｉｎ ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞活性化の後にも観察された。ＩＣＡＭ－１は、ＩＬ－１２によって制御される早期Ｔ細胞活性化マーカーであり、Ｔ細胞クラスターの破壊は、活性化したＣＤ８ Ｔ細胞への抗原のアクセスも、ＣＴＬＡ－４およびエオメソデルミンの発現レベルも両方を調節することにより、ＣＤ８ Ｔ細胞エフェクター機能の発達を増強する早期Ｔ細胞活性化マーカーである。

【0133】

Ｔ細胞のクラスター形成は、細胞培養物の定期的に画像を取得するＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＩｎｃｕＣｙｔｅ装置でモニタリングすることができる。ａＡＰＣを異なるａＡＰＣ：Ｔ細胞比で投薬し、２時間ごとに画像を得てクラスター形成事象をモニタリングした。実験には、比較解析のため、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしてＴｒａｎｓＡｃｔ刺激Ｔ細胞および非刺激Ｔ細胞を含めた。ａＡＰＣ刺激によりＴ細胞クラスター形成事象が開始したが、しかし、クラスター形成の程度はＴｒａｎｓＡｃｔビーズ活性化細胞培養物に比べてはるかに低かった。

【0134】

上記の１３プロセス日の広範な研究を実施する代わりに、Ｔ細胞クラスター形成を、ラージスケールでの試験に必要とされるａＡＰＣ用量とリガンド密度コンストラクトの最適範囲を評価しかつ潜在的に絞り込むための代用として使用した。付加的に、これらの測定により、クラスター形成プロセスが２日目にてのエレクトロポレーション前の十分なＴ細胞活性化にとって不可欠な前駆体であるかどうかが明確となった。

【0135】

本実施例に記載の実験は、ａＡＰＣ表面の０．１～４％のαＣＤ３／αＣＤ２８リガンド密度およびまた１００～５０００ａＡＰＣ／細胞の用量範囲のスクリーニングについて記載する。

【0136】

ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮した。条件を、９６ウェルプレート形式で３重でプレーティングした。各ウェルに１００，０００個のＴ細胞およびａＡＰＣ（総量１０μＬ）を播種し、２時間ごとに捉えた画像で４８時間にわたりモニタリングした。ＴｒａｎｓＡｃｔは製造業者の取扱説明書に従って使用した。全てのリポソームは直径概して２００ｎｍとして調製した。測定値は、０日目（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮、細胞カウントと生存率、ＩｎｃｕＣｙｔｅ研究用のプレーティング）および２日目（画像解析）に取得した。全ての細胞を、ＴｅｘＭＡＣｓ ３％ＨＳ＋ＩＬ７およびＩＬ１５（両方とも１２．５ｎｇ／ｍＬ）中で培養した。

【0137】

本実験モデルにおけるａＡＰＣの無毒性を確認するために、細胞を０、１０、１００、および１０００リポソーム／細胞の各濃度でＰＯＰＣリポソーム（０％ＰＥ）の存在下での培養物中で増殖させ、ＴｒａｎｓＡｃｔで活性化した。リポソームの非存在を含めて、リポソーム／細胞の濃度全体にわたり増殖速度に差はなかった。このことにより、ａＡＰＣは毒性ではないことが確認される。

【0138】

Ｔ細胞のクラスター形成を活性化フェーズ過程でモニタリングした（図２Ａおよび２Ｂ）。これらの実験の場合、２５，０００個のＴ細胞を、０．１％と４％との間のＰＥを含むａＡＰＣとともにそしてａＡＰＣ：細胞が１００：１と５０００：１との間の投薬量で９６ウェルプレートにプレーティングした（各条件を３重でプレーティングした）。活性化期間過程で６時間ごとに画像を得た。活性化過程のＴ細胞のＩＣＡＭ－１依存性ホモ型クラスター形成をモニタリングした。

【0139】

ａＡＰＣ投薬量の増加とともにＴ細胞のクラスター形成が改善することになるか判定するために実験を行った。全ての条件について、活性化誘導性クラスター形成に関してＩｎｃｕＣｙｔｅ上で評価した。図３Ａに、投薬量を１０００：１のａＡＰＣ：細胞で一定に保った場合の、ＣＤ３アゴニストおよびＣＤ２８アゴニストに応じたクラスター形成を例示する。クラスター形成の量は、リガンド密度が０．１％ＰＥから２％ＰＥへと上昇するにつれて増加したが、４％ＰＥでは実質的に低下した。図３Ｂに、全てのリポソームがＰＯＰＣ中に１％ＰＥを含有する場合での、クラスター形成に対する投薬量の影響を例示する。クラスター形成は、１００ａＡＰＣ：細胞から１０００ａＡＰＣ：細胞までの投薬量とともに増加したが、この１０００ａＡＰＣ：細胞のポイントにて、さらなるリポソームの供給はほとんど効果がなかった。図３Ｃが実証するところは、１０００：１の用量にての２％ＰＥを有するａＡＰＣによって、２０００：１の用量にての１％ＰＥを有するａＡＰＣよりもわずかに多くのクラスター形成が誘導されること、である。活性化細胞の画像を図３Ｄに提供する。

【0140】

実施例８．最適化したラージスケールキュベットベースのエレクトロポレーションによるラージスケールａＡＰＣ－リガンド密度
概要。最適化したラージスケールキュベットベースのエレクトロポレーションシステム（１ｍＬキュベット）を使用したエレクトロポレーション用に濃縮ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を活性化するためのａＡＰＣの使用を評価した。上で、ＴｒａｎｓＡｃｔコントロールと比較してノックインが同等でありかつノックアウトが改善されている状況を伴って、スモールスケールにてのＣＤ４およびＣＤ８用のアクチベーターとしてａＡＰＣを使用すること、が実証された。また、ラージスケールの１ｍＬキュベットの最適化したエレクトロポレーションシステムを使用して、エレクトロポレーション効率が改善されることも実証された。本実施例で記載する実験では、ラージスケールの１ｍＬキュベット最適化エレクトロポレーションシステムでのＴｒａｎｓＡｃｔ活性化と比較した異なる３つのａＡＰＣリガンド表面密度について試験した。

【0141】

ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮した。７１．５Ｍ細胞を６ウェルＧ－Ｒｅｘプレートで各条件ごとに活性化した。リガンド密度を１～４％ＰＥの範囲とし、投薬量を１０００から４０００までのａＡＰＣ：細胞の範囲とし、一方、概して２００ｎｍの一定の平均直径を維持した。２日目に、各条件からの５０Ｍ細胞をＰ３バッファー中のＰＡＣＴ０３５ ＴＣＲ０８９でエレクトロポレーションした。本研究は、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を補充したＴｅｘＭＡＣＳ中で１３日間ランした。培地を８日目に交換した。増殖した細胞の遺伝子編集および表現型状態の転帰を８日目と１３日目に評価した。Ｔ細胞の生存率およびカウントをアクリジンオレンジとＤＡＰＩの染色を介して、市販のセルカウンターを用いて、２日目、８日目と１３日目に評価した。

【0142】

１３日目にてのａＡＰＣ評価が示したところは、最高の刺激性リガンド投薬量によって最高の編集がもたらされるが、より低い刺激性リガンドよりもわずかに低い増殖がもたらされること、である（表１３）。ＴｒａｎｓＡｃｔは増殖および編集が最も低かった。ａＡＰＣ活性化条件で１３日目でＷＴが最高でも３．６％であったが、一方、ＴｒａｎｓＡｃｔ条件で１４．３％であった（データ示さず）。全ての条件でＣＤ４＋細胞が１３～２０％の間であったこと、および、刺激性リガンドの投薬量が増加するとＴｔｍ／Ｔｅｍ集団が増加し、Ｔｍｓｃ＋Ｔｃｍ集団が減少することも示された（図６）。

【0143】

１３日目に、ＮｅｏＴＣＲ＋発現が高くかつ野生型細胞の％が低いという状態で、インターメディエートスケールにてａＡＰＣを用いて濃縮ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を首尾よく活性化することができる。刺激性リガンドの投薬量が増加するにつれて、Ｔｔｍ／Ｔｅｍ集団の増加が観察された。リガンド投薬量が最も低い場合、ＴｒａｎｓＡｃｔと比較してＣＤ８ Ｔ細胞のＴｍｓｃ／Ｔｃｍ集団の改善が観察された。

【0144】

実施例９．ａＡＰＣ表面での抗ＣＤ３抗体と抗：ＣＤ２８抗体との比のダイナミックレンジ
概要。本実施例で行われた実験は、ａＡＰＣの表面での抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８比の効果を決定するために設計した。

【0145】

結果。ａＡＰＣ上のリガンド呈示をタイトレーションすることができることを確認するために、リポソームを上記のように調製したが、ビオチン化フルオロフォア（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８－ビオチン化、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４－ビオチン化）をビオチン化刺激性リガンドの代わりに使用した。異なるコンストラクトの個々のＭＦＩの幾何平均によって示されたところは、様々なａＡＰＣ種を解明し創出することができること、である（表１４）。

【0146】

ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮した。

【0147】

次の疑問は、エレクトロポレーションの活性化およびプライミングに最適なリガンド比を特定することができるかどうかであった。ＣＤ８ポジティブＴ細胞およびＣＤ４ポジティブＴ細胞を、アフェレーシスにより血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、製造業者のプロトコールに従って磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用したポジティブ選択によって濃縮し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘプレートの１６ウェルに７．１５×１０^６個のＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を播種し、０日目に新鮮な培地（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、３％ｈＡＢ、ＩＬ－７、ＩＬ－１５）およびａＡＰＣを供給した。細胞培地を８日目に交換した。αＣＤ２８呈示の範囲は細胞の増殖および生存率に影響を与えないように見えた。対照的に、αＣＤ３呈示の範囲は影響を及ぼした。具体的には、５：１では細胞増殖の向上が示され、αＣＤ３：αＣＤ２８比を１０：１まで上昇させるとセルヘルスが改善した（表１５）。

【0148】

遺伝子編集に対するリガンド比の影響を評価するために、２日目のエレクトロポレーションの前に、細胞をａＡＰＣ（１％ＰＥ、直径２００ｎｍ、１０００ａＡＰＣ：細胞にて、異なるリガンド比で）とともに４４～４８時間培養した。２日目に、各条件下で培養した５，０００万個の細胞にヌクレオフェクションを行い、次いでａＡＰＣを補充した新鮮な培地で培養した。８日目に培地を交換した。抗ＣＤ２８表面呈示の増加により編集効率が向上し、その結果、αＣＤ２８の５×増加によりＮｅｏＴＣＲ＋細胞の２３％増加がもたらされた。対照的に、抗ＣＤ３表面呈示の増加により編集効率が低下し、その結果、αＣＤ３刺激の１０倍増加でＮｅｏＴＣＲ＋の１７％低下があった（表１５；活性化マーカーは測定したが、データ示さず）。

【0149】

低エンドトキシン、アジドフリー（ＬＥＡＦ）製剤のリガンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＵＯ抗体（クローンＯＫＴ３、１５Ｅ８）およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ ＬＥＡＦ抗体（クローンＯＫＴ３、２８．２））が細胞増殖および／または遺伝子編集効率に影響を与えるか判定するための実験も実施した。データが示したところは、ＬＥＡＦ活性化因子を含むａＡＰＣは細胞増殖を改善するだけでなく、２×より大きい細胞増殖による２×より大きい乳酸蓄積があったことから、ａＡＰＣ活性化Ｔ細胞の培地消費速度も上昇すること、である。さらに示されたところは、表面リガンド密度１％でさえも（ａＡＰＣ活性化Ｔ細胞は２５％より高いＮｅｏＴＣＲ^＋の％をもたらす）こと、およびａＡＰＣ活性化Ｔ細胞によって２倍より大きな総編集細胞が得られること、である。要約すると、共刺激リガンドの１％表面積被覆にてのＢｉｏｌｅｇｅｎｄ ＬＥＡＦ抗体である、ａＡＰＣによって、より高いエレクトロポレーション効率が駆動され、より多数の編集細胞がもたらされること、が示された。

【0150】

本発明を、いくつかの説明した実施形態に関連して、ある程度の長さで、いくつかの特性を用いて説明してきたが、本発明は、そのようなあらゆる特性もしくは実施形態またはいずれかの特定の実施形態に限定されるべきことを意図するものではなく、先行技術の点でこのような特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供し、したがって、本発明の意図する範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。

【0151】

本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含めて本明細書が優先するものとする。加えて、見出し項目、物質、方法および実施例は、例示的なものにすぎず、限定しようとするものではない。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3A-C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】