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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】フラボシトクロムＢ２の新規の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/04 20060101AFI20240524BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20240524BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240524BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240524BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240524BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240524BHJP
C12M 1/40 20060101ALI20240524BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20240524BHJP
C12N 11/02 20060101ALI20240524BHJP
【ＦＩ】
C12N9/04 Z
C12N15/53
C12N15/31
C12N15/62 Z
C12N1/19
C12M1/34 E
C12M1/40 B
C12N15/90 Z
C12N11/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023576198
(86)(22)【出願日】2022-06-09
(85)【翻訳文提出日】2024-02-06
(86)【国際出願番号】 EP2022065632
(87)【国際公開番号】W WO2022258733
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】21178543.1
(32)【優先日】2021-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523464015
【氏名又は名称】ディレクトセンス ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】ヘルツォーク，ペーター
(72)【発明者】
【氏名】シュタイナー，ベアーテ
(72)【発明者】
【氏名】フェリーチェ，アルフォンス
(72)【発明者】
【氏名】シュルツ，クリストファー
【テーマコード（参考）】
4B029
4B033
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB16
4B029CC03
4B029FA12
4B033NA23
4B033ND05
4B033ND08
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA80X
4B065AA80Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA28
4B065CA46
(57)【要約】
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列、または前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントを含み、前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列のＮ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなり、前記短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：ｉ．メチオニン；ｉｉ．任意選択でタグ配列；ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０～９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびにｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを有し、前記組換えＦＣｂ２のアミノ酸配列が、配列番号１４５とは異なる、組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列または該成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントを含む、組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）であって、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列のＮ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなり、該短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有し、
組換えＦＣｂ２のアミノ酸配列が、配列番号１４５とは異なる、
上記組換えＦＣｂ２。
【請求項2】
ｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、サッカロミセス・セレビシエＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号３７、３８および３９からなる群から選択されるか；またはｉｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、クルイベロマイセス・マルキシアヌスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号４０、４１および４２からなる群から選択されるか；または
ｉｉｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、ウィカハモマイセス・アノマルスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号４３もしくは４４であるか、またはアミノ酸配列ＭＳＡを有する、
請求項１に記載の組換えＦＣｂ２。
【請求項3】
タグ配列が、親和性タグ、溶解度増強タグおよび監視タグからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換えＦＣｂ２。
【請求項4】
配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えＦＣｂ２。
【請求項5】
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列または該成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントを含み、Ｎ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなる組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）を含む、電極であって、該短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、上記電極。
【請求項6】
ｉ．ＦＣｂ２をコードしている組換え核酸配列に作動的に連結された酵母内で機能的なプロモーターを含む酵母細胞であって、該ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：ａ）メチオニン；
ｂ）任意選択でタグ配列；
ｃ）ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｄ）０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｃ）のアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
からなる短縮されたシグナルペプチド配列で置きかえられている酵母細胞を準備する工程と、
ｉｉ．ＦＣｂ２の発現をもたらす培地中で前記酵母細胞を育生する工程と
を含む、組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）を産生する方法。
【請求項7】
ＦＣｂ２をコードしている組換え核酸配列が、酵母細胞のゲノム内に安定して組み込まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
酵母細胞が、メチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア・パストリス細胞または非メチロトローフ酵母細胞、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ細胞である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
ＦＣｂ２をコードしている核酸配列が、Ｓ．セレビシエ、Ｗ．アノマルス、Ｋ．マルキシアヌス、またはＯ．パラポリモルファから得られる、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、Ｓ・セレビシエＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号３７、３８および３９からなる群から選択されるか；またはｉｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、Ｋ．マルキシアヌスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号４０、４１および４２からなる群から選択されるか；または
ｉｉｉ．成熟ＦＣｂ２ペプチド配列が、Ｗ．アノマルスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列が、配列番号４３もしくは４４であるか、またはアミノ酸配列ＭＳＡを有する、
請求項９に記載の方法。
【請求項11】
組換えＦＣｂ２が、好ましくは、親和性タグ、溶解度増強タグおよび監視タグからなる群から選択されるＮ末端タグ配列、最も好ましくはＨｉｓタグを含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
組換えＦＣｂ２が、配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、３３、３４、３５および３６からなる群から選択される配列を有する、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
好ましくは酵母細胞を破壊して培地中に細胞内のＦＣｂ２を放出させることによって酵母細胞からＦＣｂ２を単離し、続いて培地からＦＣｂ２を精製する工程をさらに含む、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＦＣｂ２をコードする、核酸分子。
【請求項15】
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列または該成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントをコードし、Ｎ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなる核酸分子を含む、酵母宿主細胞であって、該短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、上記酵母宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え酵素、特にフラボシトクロムｂ２、および酵母細胞においてそのような酵素を生産する手段の分野に関する。本発明は、短縮されたＮ末端を含む組換えフラボシトクロムｂ２タンパク質に、特に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－乳酸の検出および測定は、様々な分野において重要である。食品および飲料産業、ならびに臨床的診断法において、製品の品質を決定するまたはヒトの疾患もしくは生理的状態に対するマーカーとしての機能を果たす鍵となる成分もしくは代謝産物の存在を決定する高度に選択的、高感度、迅速および信頼性が高い方法に対する必要性がある。Ｌ－乳酸は、これら代謝産物のうちの１つである。また、血液中の乳酸レベルの分析は、低酸素症、乳酸アシドーシス、ならびに薬物毒性試験、糖尿病および肝臓疾患における高乳酸血症、敗血症ならびにチアミン欠乏症の臨床的診断において重要である。また、運動選手の成績を監視し、最適な訓練レジメンを開発する際に測定される。
【0003】
乳酸含有量の決定は、Ｌ－乳酸のピルビン酸への酵素的酸化に一般に基づく。伝統的に、酵素的方法は、動物の筋肉もしくは心臓から単離されるＮＡＤ＋依存的乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、または発色系において使用される細菌性乳酸オキシダーゼ（ＬＯｘ）に基づく。他の多くの方法；例えば、分光光度法、蛍光測定、ｐＨ電位差測定ならびに電極上で検出されるＯ２消費およびＨ２Ｏ２形成に基づく電流測定バイオセンサが、同様に提案されてきた。実際の乳酸含有量は、ＮＡＤＨの分光光度検出またはＨ２Ｏ２の比色アッセイによって決定される。
【0004】
Ｋａｖｉｔａ Ｒ．ら（２０１６年）において、電気化学的乳酸検出に基づくバイオセンサが、検討されている。
フラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）は、乳酸ＤＥＴ（直接電子移動）認識素子に有望な候補となる酵素である。本酵素は、酵母における乳酸代謝に関与することが公知であり、Ｌ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素と一般に称される（ＥＣ１．１．２．３；フラボシトクロムｂ２、ＦＣｂ２、Ｌ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素）。ＦＣｂ２は、酵母ミトコンドリアにおいてＬ－乳酸からチトクロムｃへの電子移動を触媒する。
フラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）は、乳酸ＤＥＴ（直接電子移動）認識素子に有望な候補となる酵素である。本酵素は、酵母における乳酸代謝に関与することが公知であり、Ｌ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素と一般に称される（ＥＣ１．１．２．３；フラボシトクロムｂ２、ＦＣｂ２、Ｌ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素）。ＦＣｂ２は、酵母ミトコンドリアにおいてＬ－乳酸からチトクロムｃへの電子移動を触媒する。
【0005】
天然には、ＦＣｂ２は、ミトコンドリア膜間隙内に位置する。ミトコンドリア膜間隙へのタンパク質の取り込みについては、Ｅｄｗａｒｄｓ Ｒ．ら（２０２１年）に概説されている。それによると、ＦＣｂ２が、ストップトランスファー経路によってミトコンドリア膜間隙に取り込まれることが記述される。ＦＣｂ２は、Ｎ末端に正荷電を持つミトコンドリア標的化シグナル（ＭＴＳ）、それに続く疎水性セグメントで構成される２部構成のシグナルを含有する。ＭＴＳは、外膜のトランスロコン（ＴＯＭ）、また内膜のトランスロコン（ＴＩＭ２３）によって先行配列転位酵素関連モーター（ＰＡＭ）を介してマトリックス内へ標的される。ストップトランスファー疎水性シグナルは、ＴＩＭ２３に入り、移行停止を引き起こし、続いてこのセグメントが内膜へ側方拡散すると、マトリックスへのさらなる移行は遮断される。ＭＴＳは、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）によって切断され、成熟ＩＭＳタンパク質は、ＩＭＳプロテアーゼに媒介される第２の切断事象によって放出される。
【0006】
Ｂｅａｓｌｅｙら（１９９３年）は、パッセンジャータンパク質としてのチトクロム酸化酵素サブユニットＩＶ（ＣｏｘＩＶ）にＦＣｂ２の最初の１６７残基を融合させることによって、酵母ＦＣｂ２のミトコンドリア膜間隙への選別シグナルについて研究した。それにより、ＣｏｘＩＶの誤局在を引き起こす突然変異が、分析された。
【0007】
Ｈａｒｔｌら（１９８７年）は、膜間隙へのシトクロムｂ２およびｃ１の標的化を調査した。両方のタンパク質は、細胞質リボソーム上で合成され、ミトコンドリア内で、２つの工程でプロセシングされる。最初に、前駆体は、両方のミトコンドリア膜を横切ってマトリックスへと移行され、そこでマトリックスペプチダーゼのプロセシングにより中間サイズの形態になる。第２のタンパク質分解性プロセシングは、膜間隙において起こる。著者らは、これらタンパク質の中間サイズ形態の２部構成のシグナルペプチド中の疎水性区間が、マトリックスから膜間隙内への搬出を指令する輸送シグナルとして作用すると結論する。
【0008】
Ｋｏｌｌら（１９９２年）は、ミトコンドリア膜間隙へのＦＣｂ２の輸送に対するｈｓｐ６０の効果を開示している。
Ｃａｍｐｏら（２０１６年）は、ミトコンドリア内へタンパク質および核酸を取り込むためのミトコンドリアメガチャネルについて検討している。それによると、ミトコンドリアタンパク質のシグナル配列および選別経路が、記述されている。
Ｃａｍｐｏら（２０１６年）は、ミトコンドリア内へタンパク質および核酸を取り込むためのミトコンドリアメガチャネルについて検討している。それによると、ミトコンドリアタンパク質のシグナル配列および選別経路が、記述されている。
【0009】
Ｂｌａｃｋら（１９８９年）は、ハンゼヌラアノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の２つのＦＣｂ２酵素の成熟配列が著しく類似することを開示している。これら酵素のＮ末端リーダー配列は、有意な類似性を共有する。これらリーダー配列の異なる領域は、機能的に類似しており、関連する多数の特徴が見出されると推定される。Ｎ末端は、取り込まれるミトコンドリアタンパク質のほとんど全てに共通する特徴である塩基性アミノ酸を高度に含有する。ミトコンドリア膜間隙へ輸送される他のポリペプチドにおいて見出されたように、リーダー配列のＣ末端側終端の方に非荷電セグメントが存在する。一般的な切断機序を示す保存されている特徴は、成熟Ｎ末端の第１アミノ酸の酸性の性質である。
【0010】
ＥＰ３０８０２８３Ａ２は、アセト乳酸生成酵素をコードしているサッカロミセス・セレビシエＩＬＶ２遺伝子の短縮されたバージョンを開示しており、ミトコンドリア標的化シグナルは存在せず、アセト乳酸生成酵素の細胞質形態が、遺伝子にコードされている。天然には、ＩＬＶ２タンパク質は、ミトコンドリアマトリックス内に位置する。グリセロール産生を増強するための、細胞質アセト乳酸生成酵素をコードしている前記遺伝子を含む組換え酵母株が、さらに記述される。
【0011】
現在のところ、ＦＣｂ２は、酵母、例えばＳ．セレビシエまたはＨ．アノマラから酵素を単離することによって得られる。しかしながら、Ｓ．セレビシエ由来ＦＣｂ２は不安定であり、酵素は単離および精製が困難であり、このことが、例えば生物分析デバイスにおけるその適用に十分な酵素を生産することを困難にする。熱耐性メチロトローフ酵母ハンゼヌラポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から単離されるＦＣｂ２は、電流測定バイオセンサにおける生物学的認識素子としてこれまで使用された（Ｓｍｕｔｏｋら、２０１３年）。そこで、酵素は、直接電子移動の能力があることが示された。しかしながら、Ｈ．ポリモルファから単離されるＦＣｂ２の安定性も、限定されていた。
【0012】
ＷＯ０２１／１６７０１１Ａ１は、乳酸脱水素酵素を使用して乳酸を測定するデバイスについて開示している。
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来ＦＣｂ２のヘムドメインとアエロコッカスビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来の操作されたＬ－乳酸オキシダーゼとを含むキメラ融合タンパク質を生成して、多重化ＤＥＴ型乳酸およびグルコースセンサを作製した。融合タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された（Ｈｉｒａｋａら、２０２０年）。
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来ＦＣｂ２のヘムドメインとアエロコッカスビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来の操作されたＬ－乳酸オキシダーゼとを含むキメラ融合タンパク質を生成して、多重化ＤＥＴ型乳酸およびグルコースセンサを作製した。融合タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された（Ｈｉｒａｋａら、２０２０年）。
【0013】
したがって、本分野において、酵母において組換えＦＣｂ２、特に、例えば酵素的バイオセンサにおける乳酸ＤＥＴ認識素子としての使用に合わせて調整されうるＦＣｂ２バリアントを生産する手段を改善することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
組換えフラボシトクロムｂ２酵素を生産するための改善された手段を提供することが本発明の目的である。
本目的は、本発明の主題によって解決される。
本目的は、本発明の主題によって解決される。
【0015】
本発明は、短縮されたＮ末端シグナルペプチド配列を含む組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）に関する。本発明の発明者らは、収率が有意に向上され、有意に改善された活性を示す短縮されたシグナルペプチド配列を含む酵母ＦＣｂ２が作製されうることを、驚くべきことに発見した。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明によると天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列、または前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントを含む組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）であって、前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列のＮ末端は、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなり、前記短縮されたシグナルペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有し、
前記組換えＦＣｂ２のアミノ酸配列は、配列番号１４５とは異なる、組換えＦＣｂ２が提供される。
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有し、
前記組換えＦＣｂ２のアミノ酸配列は、配列番号１４５とは異なる、組換えＦＣｂ２が提供される。
【0017】
酵母におけるＦＣｂ２の生理的役割は、ミトコンドリア膜貫通空間におけるその存在を利用する。小胞体（および細胞輸送）における発現後またはその間に、ＦＣｂ２は、シグナルペプチドによって補助される細胞性分泌と同様に、ミトコンドリア膜内への組み込みの間に成熟を受けると考えられる。酵素をミトコンドリアの中に組み込むプロセスにおいて、ＦＣｂ２は、Ｎ末端で短縮され、成熟したより短い酵素は、ミトコンドリア内で次いで見られる。本プロセスは、共翻訳移行と称される。本発明者らにより特徴付けられたおよび特徴付けられていない推定のＦＣｂ２遺伝子のペプチド配列の分析から、ＦＣｂ２のＮ末端先行配列内にいくつかの配列パターンが同定され、このことは、これまでに同定されておらず、ミトコンドリア膜間隙内へのＦＣｂ２の移行に関与すると推定される、成熟ＦＣｂ２配列の上流に位置するＮ末端先行配列が存在する可能性を示す。
【0018】
多重配列整列化により、酵母ＦＣｂ２配列が、Ｎ末端先行配列中のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを共有することが明らかになり、本明細書においてその配列は、「シグナルペプチド配列」、「移行ペプチド配列」または「移行配列」とも称される。驚くべきことに、Ｎ末端メチオニンを除き、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまでまたはそれをさらに含めてシグナルペプチド配列を欠失させることにより、酵母における組換えＦＣｂ２の産生の有意な改善が提供される。特に、そのような短縮されたシグナルペプチド配列を含む組換えＦＣｂ２は、元のＦＣｂ２宿主である酵母のタンパク質プロセシングおよび補因子合成能力を使用して、非常に高い活性および高収率で産生されうる。そのため、本発明の特定のシグナルペプチド配列－短縮パターンにより、細胞質ゾルにおいて機能的に活性なＦＣｂ２を発現させることが可能になる。驚くべきことに、本発明者らは、細胞質ゾルにおいて機能的に活性なＦＣｂ２を成功裏に発現させるには、ミトコンドリア内へのＦＣｂ２の移行に関与することが公知のシグナルペプチド配列のＮ末端領域を欠失させるでは不十分であることを見出した。その代わりに、本発明者らは、活性なＦＣｂ２の細胞質発現を成功させるためには、シグナルペプチドが、特定のパターンに従ってなお一層短縮されなければならないことを驚くべきことに見出した。この短縮パターンは、酵母ＦＣｂ２配列に共通して高度に保存されているＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフに基づく。特に、本発明の組換えＦＣｂ２は、天然の酵母ＦＣｂ２配列から得られる成熟ＦＣｂ２配列および短縮されたシグナルペプチド配列を含むまたは含有し、短縮されたシグナルペプチドの配列は、酵母ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチドの配列に対応するが、本明細書に記載の短縮を含む。特に前記短縮は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまでまたはそれを含めた、天然のシグナルペプチド配列の欠失である。
【0019】
特に、本明細書に記述される短縮されたシグナルペプチド配列は、Ｎ末端メチオニン、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを含み、前記モチーフよりＮ末端のアミノ酸を全く含まないか、またはそれぞれの天然のシグナルペプチド配列内の前記モチーフよりＮ末端のアミノ酸を９個まで含み、前記９個までのアミノ酸より上流のアミノ酸を全く含まないかのいずれかである。特に、短縮されたシグナルペプチド配列は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／ＬモチーフのＮ末端アミノ酸を１、２、３、４、５、６、７、８または９個までおよびＮ末端メチオニンを含む。
【0020】
特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、酵母ミトコンドリア内、特にミトコンドリア膜間隙内に天然に見出されるＦＣｂ２ペプチドの配列である。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、酵母ミトコンドリア膜間隙に天然に見出されるＦＣｂ２の成熟形態に基づく配列を含み、シトクロムｂ２ドメイン、フラビンドメイン、シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するヒンジ領域およびＣ末端に尾部領域を含む。
【0021】
特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、少なくとも酵母ヘムドメインと酵母フラビンドメインを含む成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含む。
特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、配列番号１もしくは配列番号２を含むまたはそれからなる。
特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、配列番号１もしくは配列番号２を含むまたはそれからなる。
【0022】
特定の実施形態において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、酵母ミトコンドリア膜間隙に見出される天然のＦＣｂ２成熟ペプチド配列の機能的に活性なバリアントであり、それぞれの天然の成熟ＦＣｂ２配列と比較して、成熟ＦＣｂ２配列をコードしているヌクレオチド配列内に１つまたは複数の点突然変異を含む。特に、それは、１つもしくは複数のアミノ酸置換、付加または欠失、等を特別にもたらす１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個の点突然変異を含む。特に、天然の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的バリアントは、点突然変異を含む全長成熟ＦＣｂ２ペプチド配列であり、または酵素活性を保持している全長成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の断片である。特に、成熟ＦＣｂ２配列のバリアントは、それがＬ－乳酸をピルビン酸に変換する能力がある場合、機能的に活性である。特に、成熟ＦＣｂ２配列の機能的に活性なバリアントは、対応する野生型成熟ＦＣｂ２配列より少なくとも１０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはさらに高い酵素活性を有する。特に、成熟ＦＣｂ２配列の機能的に活性なバリアントは、対応する野生型成熟ＦＣｂ２配列より少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０％またはさらに高い酵素活性を有し、前記酵素活性は、ＣｙｔＣアッセイおよび基質としてＬ－乳酸を用いて決定される。
【0023】
フラボシトクロムｂ２バリアントの酵素活性は、チトクロムｃ、フェリシアン化物または２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）の比色還元を決定するアッセイなど、当業者に公知のアッセイによって容易に決定されうる。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｄｉｅｐ Ｌｅら（Ｄｉｅｐ Ｌｅら２００９年）によって記述されるＣｙｔＣアッセイで決定される少なくとも１Ｕ／ｍｇの酵素活性を含む。
【0024】
特に、本明細書に記述される成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、配列番号１もしくは配列番号２、または配列番号１もしくは配列番号２に対して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を含む。特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の配列同一性を含む。
【0025】
特定の実施形態によると、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、サッカロミセス・セレビシエＦＣｂ２（配列番号３）から得られ、Ｎ末端メチオニンを含む短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号３７、３８および３９からなる群から選択される。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号４、５および６からなる群から選択される配列を含むまたはそれからなる。特に、配列番号４、５、および６からなる群から選択される配列を含む本発明の組換えＦＣｂ２は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、好ましくは６－Ｈｉｓまたは８－Ｈｉｓタグをさらに含む。
【0026】
さらなる特定の実施形態によると、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）ＦＣｂ２（配列番号７）から得られ、Ｎ末端メチオニンを含む短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号４０、４１および４２からなる群から選択される。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号８、９および１０からなる群から選択される配列を含むまたはそれからなる。特に、配列番号８、９、および１０からなる群から選択される配列を含む本発明の組換えＦＣｂ２は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、好ましくは６－Ｈｉｓまたは８－Ｈｉｓタグをさらに含む。
【0027】
なおさらなる特定の実施形態によると、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、ウィカハモマイセス・アノマルス（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ）ＦＣｂ２（配列番号１１）から得られ、Ｎ末端メチオニンを含む短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号４３もしくは４４またはＭＳＡ（Ｍｅｔ－Ｓｅｒ－Ａｌａ）である。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号１２、１３および１４からなる群から選択される配列を含むまたはそれからなる。特に、配列番号８～１０からなる群から選択される配列を含む本発明の組換えＦＣｂ２は、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、好ましくは６－Ｈｉｓまたは８－Ｈｉｓタグをさらに含む。
【0028】
特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、本明細書に記載の短縮されたシグナルペプチド配列および対応する成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含み、それらは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｗ．アノマルス（Ｗ．ａｎｏｍａｌｕｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｏ．パラポリモルファ（Ｏ．ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラカンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、サッカロマイコデス・ルドウィギイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、ナウモボジマ・カステリ（Ｎａｕｍｏｖｏｚｙｍａ ｃａｓｔｅｌｌｉ）、ジゴサッカロミセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）、ジゴサッカロミセス・パラバイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｂａｌｉｉ）、ラカンセア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）、テトラピシスポラ・ファフィ（Ｔｅｔｒａｐｉｓｉｓｐｏｒａ ｐｈａｆｆｉｉ）、サッカロミセス・ユーバヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｕｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・クドリアブゼビイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロミセス・パラドクサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ヴァンデルワルトザイマ・ポリスポラ（Ｖａｎｄｅｒｗａｌｔｏｚｙｍａ ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）、ラカンセア・ダシエンシス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｄａｓｉｅｎｓｉｓ）、ウィカハモマイセス・シフェリイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ｃｉｆｅｒｒｉ）、クリベロマイセス・ドブジャンスキイ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｂｚｈａｎｓｋｉｉ）、カザツタニア・ナガニシイ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）、ジゴサッカロミセス・メリス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓ）、カザツタニア・ソルジェエンシス（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ｓａｕｌｇｅｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、ラカンセア・ファーメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、シベルリンドネラ・ファビアニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｆａｂｉａｎｉｉ）、シベルリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ）、カザツタニア・アフリカーナ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ラカンセア・ケベセンシス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｑｕｅｂｅｃｅｎｓｉｓ）、クライシア・カプスラータ（Ｋｕｒａｉｓｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）、トルラスポラ・デルブルエッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、コマガテラ・パストリス（Ｋｏｍｏｇａｔｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガテラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、ラカンセア・ノトファギ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）またはナウモボマイセス・ダイレネンシス（Ｎａｕｍｏｖｏｍｙｃｅｓ ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）から得られる。
【0029】
特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、サッカロミセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・マルキシアヌス、ウィカハモマイセス・アノマルス、ナウモボジマ・カステリまたはシベルリンドネラ・ファビアニイのＦＣｂ２から得られる成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含む。
【0030】
特定の実施形態において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２はタグ配列を含む。例えばポリヒスチジンタグなどのタグ配列は、組換えタンパク質生産における有効なツールである。全長ＦＣｂ２は、Ｎ末端ポリ－Ｈｉｓタグなどのタグ配列と共に発現させることが困難である。驚くべきことに、本明細書に記載の短縮されたシグナルペプチド配列を含む組換えＦＣｂ２は、Ｎ末端タグと共に発現されえ、これにより生産プロセスは有意に改善され、単純化される。
【0031】
特に、タグ配列は、親和性タグ、溶解度増強タグおよび監視タグからなる群から選択される。特に、タグ配列は、Ｎ末端タグである。
特に、親和性タグは、ポリヒスチジン（ポリＨ）タグ、ポリアルギニン（ポリＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、Ｓ－ｔａｇ、ＨＡタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、およびＳＵＭＯタグからなる群から選択され、特に、タグは、１つもしくは複数のＨｉｓを含むＨｉｓタグであり、より具体的には、ヘキサヒスチジンまたは８－Ｈｉｓタグである。
特に、親和性タグは、ポリヒスチジン（ポリＨ）タグ、ポリアルギニン（ポリＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、Ｓ－ｔａｇ、ＨＡタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、およびＳＵＭＯタグからなる群から選択され、特に、タグは、１つもしくは複数のＨｉｓを含むＨｉｓタグであり、より具体的には、ヘキサヒスチジンまたは８－Ｈｉｓタグである。
【0032】
特に、溶解度増強タグは、Ｔ７Ａ、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、Ｔ７Ａ４、Ｔ７Ａ５、Ｔ７Ｂ、Ｔ７Ｂ１、Ｔ７Ｂ２、Ｔ７Ｂ３、Ｔ７Ｂ３、Ｔ７Ｂ４、Ｔ７Ｂ５、Ｔ７Ｂ６、Ｔ７Ｂ６、Ｔ７Ｂ７、Ｔ７Ｂ８、Ｔ７Ｂ９、Ｔ７Ｂ１０、Ｔ７Ｂ１１、Ｔ７Ｂ１２、Ｔ７Ｂ１３、Ｔ７Ｃ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、ポリＡタグ、ポリＬｙｓタグ、タンパク質Ｄタグ（ｄＴＡＧ）、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択される。
【0033】
特に、監視タグは、ｍ－Ｃｈｅｒｒｙ、ＧＦＰおよびｆ－アクチンからなる群から選択される。
特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６から選択されるアミノ酸配列を有する。
特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0034】
本明細書において、天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列、または前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントを含み、Ｎ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなる組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）を含む電極であって、前記短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、電極がさらに提供される。
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、電極がさらに提供される。
【0035】
特に、組換えＦＣｂ２を含む電極は、試料中のＬ－乳酸を決定するために使用されうる。特に、組換えＦＣｂ２を含む電極は、酵素的バイオセンサにおいて乳酸ＤＥＴ認識素子として使用されうる。
【0036】
本明細書において、以下の工程：
ｉ．ＦＣｂ２をコードしている組換え核酸配列に作動的に連結された酵母内で機能的なプロモーターを含む酵母細胞であって、前記ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ａ）メチオニン；
ｂ）任意選択でタグ配列；
ｃ）ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｄ）０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｃ）のアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
からなる短縮されたシグナルペプチド配列で置きかえられている酵母細胞を準備する工程と、
ｉｉ．前記ＦＣｂ２の発現をもたらす培地中で前記酵母細胞を育生する工程と
を含む組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）を産生する方法が、さらに提供される。
ｉ．ＦＣｂ２をコードしている組換え核酸配列に作動的に連結された酵母内で機能的なプロモーターを含む酵母細胞であって、前記ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ａ）メチオニン；
ｂ）任意選択でタグ配列；
ｃ）ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｄ）０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｃ）のアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
からなる短縮されたシグナルペプチド配列で置きかえられている酵母細胞を準備する工程と、
ｉｉ．前記ＦＣｂ２の発現をもたらす培地中で前記酵母細胞を育生する工程と
を含む組換えフラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）を産生する方法が、さらに提供される。
【0037】
本明細書に提供される方法の特定の実施形態において、前記組換えＦＣｂ２をコードしている組換え核酸配列は、酵母細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。
特に、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア・パストリス［コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）］、クリベロマイセス・ラクティスまたは非メチロトローフ酵母細胞、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ細胞である。
特に、酵母細胞は、メチロトローフ酵母細胞、好ましくはピキア・パストリス［コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）］、クリベロマイセス・ラクティスまたは非メチロトローフ酵母細胞、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ細胞である。
【0038】
特に、ＦＣｂ２をコードしている核酸配列は、Ｓ．セレビシエ、Ｗ．アノマルス、Ｋ．マルキシアヌス、Ｏ．パラポリモルファ、ラカンセア・サーモトレランス、サッカロマイコデス・ルドウィギイ、ナウモボジマ・カステリ、ジゴサッカロミセスバイリイ、ジゴサッカロミセスパラバイリイ、ラカンセア・ミランティナ、テトラピシスポラ・ファフィ、サッカロミセス・ユーバヤヌス、サッカロミセス・クドリアブゼビイ、サッカロミセス・パラドクサス、ヴァンデルワルトザイマポリスポラ、カンジダ・グラブラータ、クリベロマイセス・ラクティス、ラカンセア・ダシエンシス、ウィカハモマイセス・シフェリイ、クリベロマイセス・ドブジャンスキイ、カザツタニア・ナガニシイ、ジゴサッカロミセス・メリス、カザツタニア・ソルジェエンシス、カンジダ・ボイジニイ、ラカンセア・ファーメンタティ、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー、シベルリンドネラ・ファビアニイ、シベルリンドネラ・ジャディニイ、カザツタニア・アフリカーナ、ラカンセア・ケベセンシス、クライシア・カプスラータ、トルラスポラ・デルブルエッキイ、コマガテラ・パストリス、コマガテラ・ファフィ、ラカンセア・ノトファギまたはナウモボマイセス・ダイレネンシスから得られる。
【0039】
特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、Ｓ．セレビシエＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号３７～３９からなる群から選択される。
特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、Ｋ．マルキシアヌスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号４０～４２からなる群から選択される。
特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、Ｋ．マルキシアヌスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号４０～４２からなる群から選択される。
【0040】
特に、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、Ｗ．アノマルスＦＣｂ２から得られ、短縮されたシグナルペプチド配列は、配列番号４３もしくは４４であるか、またはアミノ酸配列ＭＳＡ（Ｍｅｔ－Ｓｅｒ－Ａｌａ）のものである。
【0041】
特に、本明細書に提供される方法に従って生産される組換えＦＣｂ２は、好ましくは、親和性タグ、溶解度増強タグおよび監視タグからなる群から選択されるＮ末端タグ配列、最も好ましくはポリヒスチジンタグを含む。
【0042】
特に、本明細書に提供される方法に従って生産される組換えＦＣｂ２は、配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、３３、３４、３５および３６からなる群から選択される配列を有する。
【0043】
特に、プロモーターは、メタノール誘導可能なプロモーターであり、組換えＦＣｂ２の発現をもたらす培地は、メタノールを含む。
特に、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２の生産方法は、好ましくは酵母細胞を破壊して培地中に細胞内のＦＣｂ２を放出させることによって酵母細胞からＦＣｂ２を単離し、続いて培地からＦＣｂ２を精製する工程をさらに含む。
特に、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２の生産方法は、好ましくは酵母細胞を破壊して培地中に細胞内のＦＣｂ２を放出させることによって酵母細胞からＦＣｂ２を単離し、続いて培地からＦＣｂ２を精製する工程をさらに含む。
【0044】
特に、本明細書に提供される方法に使用される酵母細胞は、ピキア・パストリス、ハンゼヌラポリモルファ、ピキアミヌータ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）、カンジダ・ボイジニイからなる群から選択されるメチロトローフ酵母細胞、またはサッカロミセス・セレビシエ、クリベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ジゴサッカロミセス・バイリイ、ピキア・スティピテス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｅｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス、サッカロミセス・オキシデンタリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシーからなる非メチロトローフ酵母の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは、酵母細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、クリベロマイセス・ラクティスまたはピキア・パストリス細胞であり、最も好ましくは、酵母細胞はピキア・パストリス細胞である。
【0045】
本明細書記述される組換えＦＣｂ２をコードしている核酸分子が、本明細書においてさらに提供される。特に、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２をコードしている核酸分子は、配列番号１４５に示されるアミノ酸配列をコードしている核酸分子とは異なる。調節要素に作動的に連結された本明細書に記述される組換えＦＣｂ２を含む発現カセットが、本明細書にさらに提供される。特に、プロモーター、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２をコードしている配列および終了配列を含む発現カセットが、提供される。
【0046】
本明細書に記述される組換えＦＣｂ２を発現する酵母宿主細胞または酵母宿主細胞株が、本明細書にさらに提供される。
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列、または前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントをコードし、Ｎ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなる核酸分子を含む酵母宿主細胞であって、前記短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０～９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、酵母宿主細胞が、本明細書においてさらに提供される。
天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列、または前記成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントをコードし、Ｎ末端が、天然のシグナルペプチド配列を置きかえる短縮されたシグナルペプチド配列からなる核酸分子を含む酵母宿主細胞であって、前記短縮されたシグナルペプチド配列が、Ｎ末端からＣ末端へ以下の構造：
ｉ．メチオニン；
ｉｉ．任意選択でタグ配列；
ｉｉｉ．ＦＣｂ２の天然のシグナルペプチド配列のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフのすぐ上流にある９アミノ酸以下のアミノ酸配列に対応する、天然のシグナルペプチド配列の長さ０～９アミノ酸のアミノ酸配列；ならびに
ｉｖ．０、１の数を有するかまたは部分的に短縮されていてもよいＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフであって、数が０であるかまたはＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌが部分的に短縮されている場合、ｉｉｉのアミノ酸配列の長さが０である、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ
を有する、酵母宿主細胞が、本明細書においてさらに提供される。
【0047】
特に、宿主細胞は、ピキア・パストリス、ハンゼヌラポリモルファ、ピキアミヌータ、カンジダ・ボイジニイからなるメチロトローフ酵母の群から選択されるか、またはサッカロミセス・セレビシエ、クリベロマイセス・ラクティス、ヤロウィア・リポリティカ、アルクスラ・アデニニボランス、ジゴサッカロミセス・バイリイ、ピキア・スティピテス、クルイベロマイセス・マルキシアヌス、サッカロミセス・オキシデンタリス、ジゴサッカロマイセス・ルーキシーからなる非メチロトローフ酵母の群から選択される酵母細胞であり、好ましくは、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】ＳｃＦＣｂ２のミトコンドリア切断部位予測（ＴａｒｇｅｔＰ）である。
【図2】ＫｍＦＣｂ２のミトコンドリア切断部位予測（ＴａｒｇｅｔＰ）である。
【図3】ＷａＦＣｂ２のミトコンドリア切断部位予測（ＴａｒｇｅｔＰ）である。
【図4】ＣａｎｇＦＣｂ２のミトコンドリア切断部位予測（ＴａｒｇｅｔＰ）である。
【図5-1】出芽酵母サッカロミセス科のファミリーに厳選された、系統発生データからのＦＣｂ２ Ｎ’端末配列の多重配列整列化を示す図である。
【図5-2】同上。
【図6】ＷｅｂＬｏｇｏによる多重配列整列化を示す図である（「１ＦＣＢ」は、分析されている結晶構造、ＰＤＢ：１ＦＣＢから得られた切断され、成熟したＳｃＦＣｂ２の参照配列である）
【図7】ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ多重配列整列化を示す図である。下線：Ｓ．セレビシエおよびＷ．アノマルスＦＣｂ２の実験的に確認された切断および成熟したＮ末端の始まりの配列。灰色：発見されたＴｒａｎｓＰ認識モチーフ。サブテキスト中の「＊」、「：」および「．」は、構造的に関連する配列部分の保存の異なる程度を、良いものから悪いものに示す。
【図8】（Ａ）ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物のスクリーニングの容積活性を示す図である。（Ｂ）ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物の活性スクリーニング（ＣｙｔＣアッセイ）のデータの概要である。（Ｃ）ＴｒａｎｓＰ認識モチーフ（灰色）を持つＮ末端ＴｒａｎｓＰ配列および相対的活性を示す図である。
【図9】（Ａ）ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物のスクリーニングの容積活性を示す図である。（Ｂ）ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物の活性スクリーニング（ＣｙｔＣアッセイ）のデータの概要である。（Ｃ）ＴｒａｎｓＰ認識モチーフ（灰色）を持つＮ末端ＴｒａｎｓＰ配列および相対的活性を示す図である。
【図10】（Ａ）ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物のスクリーニングの容積活性を示す図である。（Ｂ）ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物の活性スクリーニング（ＣｙｔＣアッセイ）のデータの概要である。（Ｃ）ＴｒａｎｓＰ認識モチーフ（灰色）を持つＮ末端ＴｒａｎｓＰ配列および相対的活性を示す図である。
【図11】（Ａ）ＣｙｔＣアッセイの酵素単位［Ｕ／ｇ細胞ペレット］および（Ｂ）光学的吸光度の量による精製した酵素［ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット］での精製後に得られた活性、（Ｃ）精製された、ｈｉｓタグ付きＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ ＦＣｂ２構築物のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図である。
【図12-1】本明細書において参照されるアミノ酸配列を示す図である。
【図12-2】同上。
【図12-3】同上。
【図12-4】同上。
【図12-5】同上。
【図12-6】同上。
【図12-7】同上。
【図12-8】同上。
【図12-9】同上。
【図12-10】同上。
【図12-11】同上。
【図12-12】同上。
【図12-13】同上。
【図12-14】同上。
【図12-15】同上。
【図12-16】同上。
【図13-1】経時的に乳酸濃度を増大させながら添加することによる、３７℃および印加電位＋０．２ＶにおけるＦＣｂ２修飾カーボンペースト電極の較正を示す図である。ＷａＦＣｂ２（Ａ）、ＫｍＦＣｂ２（Ｄ）およびＣａｎｇＦＣｂ２（Ｇ）：乳酸の段階的増大後のセンサシグナルの段階的増大を示す図である。ＷａＦＣｂ２（Ｂ）、ＫｍＦＣｂ２（Ｅ）およびＣａｎｇＦＣｂ２（Ｈ）：３０ｍＭ乳酸存在下におけるセンサシグナルの経時的低下を示す図である。ＷａＦＣｂ２（Ｃ）、ＫｍＦＣｂ２（Ｆ）およびＣａｎｇＦＣｂ２（Ｉ）：乳酸濃度に対するセンサ電流密度の依存性を示す図である。酵素ロード量：０．８μｇ／ｍｍ２
【図13-2】同上。
【図13-3】同上。
【図14】電極の前処理による、カーボンペースト電極当たり０．８μｇ／ｍｍ２ ＫｍＦＣｂ２の電流密度の比較を示す図である。経時的に乳酸濃度を増大させながら添加することによる、３７℃および印加電位＋０．２ＶにおけるＦＣｂ２修飾カーボンペースト電極の較正を示す図である。Ａ：ＣＴＡＢ；Ｂ：ＥＧＤＧＥ；Ｃ：前処理なし。
【図15】３０ｍＭ乳酸を添加後の３７℃および印加電位＋０．２ＶにおけるＫｍＦＣｂ２修飾金またはカーボンペースト電極の応答を示す図である。Ａ：金－前処理なし；Ｂ：カーボンペースト－前処理なし。
【図16】ＫｍＦＣｂ２の温度安定性（Ａ）；ＫｍＦＣｂ２の熱容量曲線（Ｂ）を示す図である
【図17】ＣａｎｇＦＣｂ２の温度安定性（Ａ）；ＣａｎｇＦＣｂ２の熱容量曲線（Ｂ）を示す図である
【図18】ピキア・パストリスにおいて発現させたＦＣｂ２と比較した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させたＦＣｂ２のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す図である
【発明を実施するための形態】
【0049】
別段の指示または定義がない限り、本明細書に使用される全ての用語は、当業者において通常の意味を有し、当業者には明らかになろう。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（第４版）、１～３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２年）；Ｋｒｅｂｓら、「Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ」、Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（２０１７年）；Ｂｅｒｇら、「Ｓｔｒｙｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、２０１８年；およびＭｕｒｐｈｙ ＆ Ｗｅａｖｅｒ、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（第９版、またはより最近の版）、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｉｎｃ（２０１７年）などの標準的な専門書を参照のこと。
【0050】
特許請求の範囲の主題は、人工的産物またはそのような人工的産物を利用もしくは製造する方法のことを特に指し、その産物は、天然の（野生型）産物のバリアントでありうる。天然の構造に対してある程度の配列同一性がありうるが、例えば、単離された核酸配列、アミノ酸配列、発現構築物、形質転換された宿主細胞および修飾タンパク質および酵素のことを特に指す本発明の材料、方法ならびに使用は、「人工」または合成であり、したがって「自然法則」の結果と見なされないことは十分理解される。
【0051】
本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、同義的に使用することができ、さらなるメンバーまたは部分もしくは要素を許容する開いた定義として理解されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、構成される定義の特徴のさらなる要素を含まない最も詳細な定義と見なされる。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより広く、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」の定義を含有する。
【0052】
本明細書では用語「約」は、所与の値と同じ値または＋／－５％まで異なる値のことを指す。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、単数形、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り、複数形を含む。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、単数形、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り、複数形を含む。
【0053】
本明細書では、アミノ酸とは、６１種のトリプレットコドンによってコードされる２０種の天然に存在するアミノ酸のことを指す。これら２０種のアミノ酸は、中性荷電、正荷電および負荷電を有するものに分割されうる：
「中性」アミノ酸が、それぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に以下に示される：アラニン（Ａｌａ、Ａ；無極性、中性）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ；極性、中性）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ；無極性、中性）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ；極性、中性）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ；無極性、中性）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ；無極性、中性）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ；無極性、中性）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ；無極性、中性）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ；無極性、中性）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ；無極性、中性）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ；極性、中性）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ；極性、中性）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ；無極性、中性）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ；極性、中性）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ；無極性、中性）およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ；極性、陽性（１０％）中性（９０％））。
「中性」アミノ酸が、それぞれの３文字および１文字コードならびに極性と共に以下に示される：アラニン（Ａｌａ、Ａ；無極性、中性）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ；極性、中性）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ；無極性、中性）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ；極性、中性）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ；無極性、中性）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ；無極性、中性）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ；無極性、中性）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ；無極性、中性）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ；無極性、中性）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ；無極性、中性）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ；極性、中性）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ；極性、中性）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ；無極性、中性）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ；極性、中性）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ；無極性、中性）およびヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ；極性、陽性（１０％）中性（９０％））。
【0054】
「正」荷電アミノ酸は、以下の通りである：アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ；極性、正）およびリジン（Ｌｙｓ、Ｋ；極性、正）。
「負」荷電アミノ酸は以下の通りである：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ；極性、負）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ；極性、負）。本発明によると用語「酵素」とは、１つもしくは複数の化学もしくは生化学的反応を多少特異的に触媒もしくは促進するタンパク質もしくはポリペプチドで完全にまたは大部分構成される任意の物質を意味する。特に、用語「酵素」は、Ｌ－乳酸をピルビン酸に変換する能力があるタンパク質またはポリペプチドのことを指すために本明細書において使用される。
「負」荷電アミノ酸は以下の通りである：アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ；極性、負）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ；極性、負）。本発明によると用語「酵素」とは、１つもしくは複数の化学もしくは生化学的反応を多少特異的に触媒もしくは促進するタンパク質もしくはポリペプチドで完全にまたは大部分構成される任意の物質を意味する。特に、用語「酵素」は、Ｌ－乳酸をピルビン酸に変換する能力があるタンパク質またはポリペプチドのことを指すために本明細書において使用される。
【0055】
ヒトにおいて、ピルビン酸は、乳酸脱水素酵素（「ＬＤＨ」）によって乳酸に変換される。
酵母において、Ｌ－乳酸は、「フラボシトクロムｂ２」または「ＦＣｂ２」と本明細書において称されるＬ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素（ＥＣ１．１．２．３）によってピルビン酸に変換される。
酵母において、Ｌ－乳酸は、「フラボシトクロムｂ２」または「ＦＣｂ２」と本明細書において称されるＬ－乳酸チトクロムｃ酸化還元酵素（ＥＣ１．１．２．３）によってピルビン酸に変換される。
【0056】
本明細書に使用される用語「乳酸」とは、乳酸またはその塩のことを指す。
酵母におけるＦＣｂ２の生理的役割は、ミトコンドリア膜貫通空間におけるその存在を利用する。小胞体（および細胞輸送）における発現後またはその間に、ＦＣｂ２は、シグナルペプチド認識によって補助される、ミトコンドリア膜内への組み込みの間に成熟を受けると考えられる。
酵母におけるＦＣｂ２の生理的役割は、ミトコンドリア膜貫通空間におけるその存在を利用する。小胞体（および細胞輸送）における発現後またはその間に、ＦＣｂ２は、シグナルペプチド認識によって補助される、ミトコンドリア膜内への組み込みの間に成熟を受けると考えられる。
【0057】
特徴付けられたおよび推定のＦＣｂ２配列の多重配列整列化から、酵母ＦＣｂ２配列が、Ｎ末端先行配列においてＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを共有することが明らかになり、そのＮ末端先行配列は、「シグナルペプチド配列」、「シグナル配列」または「移行ペプチド配列」もしくは「移行配列」とも本明細書において称される。驚くべきことに、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまで、またはそれをさらに含めてＦＣｂ２のシグナルペプチド配列を欠失させることにより、組換えＦＣｂ２の生産の有意な改善が可能になる。特に、そのような短縮されたシグナルペプチド配列を含む組換えＦＣｂ２は、高収率で、有意に改善された活性で生産されうる。
【0058】
天然の酵母フラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）は、「ヒンジ」リンカーを介して接続される２つの機能的ドメインを有する（５７ｋＤａ単量体）。Ｓ．セレビシエ由来ＦＣｂ２は、最も研究されている代表例であり、結晶化されている（ＰＤＢ １ＦＣＢ）。以下のセクションが、Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２において同定されている：
－ 配列番号３のアミノ酸残基８８までのＮ末端先行配列。このいわゆる「移行ペプチド」は、移行に際して切断される；
－ シトクロム－ｂ２ドメイン：非共有結合性ヘムｂを含む＜１０ｋＤａドメイン：（配列番号３のアミノ酸残基８８～１６５に及ぶ）；
－ シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するドメイン接続リンカーを含むヒンジ領域（配列番号３の残基１７７～１９０に及ぶ）；
－ フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含有するおよそ４５ｋＤａのフラビンドメイン（配列番号３の残基１９７～５６３に及ぶ）；
－ Ｃ末端で伸長し、二量体の周りを包む尾部領域（配列番号３の残基５６７～５９１を含む）。
－ 配列番号３のアミノ酸残基８８までのＮ末端先行配列。このいわゆる「移行ペプチド」は、移行に際して切断される；
－ シトクロム－ｂ２ドメイン：非共有結合性ヘムｂを含む＜１０ｋＤａドメイン：（配列番号３のアミノ酸残基８８～１６５に及ぶ）；
－ シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するドメイン接続リンカーを含むヒンジ領域（配列番号３の残基１７７～１９０に及ぶ）；
－ フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含有するおよそ４５ｋＤａのフラビンドメイン（配列番号３の残基１９７～５６３に及ぶ）；
－ Ｃ末端で伸長し、二量体の周りを包む尾部領域（配列番号３の残基５６７～５９１を含む）。
【0059】
本発明の組換えＦＣｂ２は、少なくとも酵母シトクロムｂ２ドメインおよび酵母フラビンドメインを含み、それらは直接接続されてもまたはヒンジ領域を介して連結されてもよい。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｃ末端尾部領域も含む。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、酵母ミトコンドリア膜間隙に天然に見出されるＦＣｂ２の成熟形態に基づく配列を含み、シトクロムｂ２ドメイン、フラビンドメイン、シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するヒンジ領域およびＣ末端に尾部領域を含む。
【0060】
本発明の組換えＦＣｂ２は、短縮されたシグナルペプチド配列をさらに含み、短縮されたシグナルペプチドの配列は、天然のシグナルペプチドのシグナルに対応するが、本明細書に記載の短縮を含む。
【0061】
特定の実施形態において、本発明の組換えＦＣｂ２は、本明細書に記載の短縮されたシグナルペプチド配列で置きかえられたＮ末端先行配列を除いて、上で同定されたＦＣｂ２ Ｓ．セレビシエセクションの全てまたは異なる酵母の相同物を含む。
【0062】
本明細書では、用語「シグナルペプチド配列」とは、ＦＣｂ２のＮ末端先行配列のことを指す。シグナルペプチド配列は、ミトコンドリア内への酵素の移行後に切断されるＦＣｂ２タンパク質の配列である。天然のシグナルペプチド配列が切断されると、成熟ＦＣｂ２配列が残り、ミトコンドリア内でのその生理的役割は機能的である。天然のＦＣｂ２の成熟配列は、例えば酵母細胞からＦＣｂ２を単離し、単離されたタンパク質を配列決定することによって当業者によって容易に同定されうる。酵母ＦＣｂ２のシグナルペプチド配列および成熟配列は、結晶学など当業者に公知の他の通常の方法を使用して決定されてもよい。
【0063】
それにより、本明細書では用語「天然」とは、ミトコンドリア膜間隙内への輸送前の天然に存在するような、遺伝的にコードされており、プロセシングされていないアミノ酸配列のことを指す。したがって、天然のアミノ酸配列とは、天然のシグナルペプチド配列が天然のアミノ酸配列から切断され、成熟アミノ酸配列を生じる前のアミノ酸配列のことを指す。例えば、サッカロミセス・セレビシエ由来の全長ＦＣｂ２の天然のアミノ酸配列は、配列番号３に示される。そのため、配列番号３内のアミノ酸１～８０が、天然のシグナルペプチド配列である。成熟ＦＣｂ２の配列は、配列番号１に示され、この配列は、配列番号３内のアミノ酸１～８０を含まない。ＦＣｂ２の例から分かるように、天然のＮ末端は、ミトコンドリア膜間隙内への輸送の間にアミノ酸配列から切断されるので、配列番号１に示される成熟ＦＣｂ２の配列はＮ末端にメチオニンを含まない。
【0064】
本明細書では、用語「短縮されたシグナルペプチド配列」とは、Ｎ末端に欠失を含むＦＣｂ２のシグナルペプチド配列のことを指す。本明細書に記載の通り、本発明の組換えＦＣｂ２は、短縮されたシグナルペプチド配列を含み、短縮されたシグナルペプチドの配列は、天然のシグナルペプチドの配列に対応するが、天然のＮ末端から始まり、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフに及ぶまたは含む天然のシグナルペプチド配列の欠失を含む。したがって、特定の例において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを含むシグナルペプチド配列の全体の欠失を含む。
【0065】
本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｎ末端、したがって短縮されたシグナルペプチド配列のＮ末端でメチオニンをさらに含む。天然に見出される成熟ＦＣｂ２はＮ末端メチオニンを有さないので、本発明の組換えＦＣｂ２がＮ末端メチオニンを有するので、本発明の組換えＦＣｂ２は、天然のＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２と容易に区別されうる。
【0066】
真核生物においてタンパク質合成は、メチオニンによって開始される。リボソームは、配列ＡＵＧであるｍＲＮＡ中の開始コドンに遭遇すると、アミノ酸からのタンパク質の組立てである翻訳を開始する。ＡＵＧはアミノ酸メチオニンをコードし、本明細書に記述されるＦＣｂ２のそのようなタンパク質翻訳はメチオニンで開始する。
【0067】
別の特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の短縮されたシグナルペプチド配列は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを依然として含むが、前記モチーフよりＮ末端のアミノ酸を全く含まない、すなわち、短縮されたシグナルペプチド配列においてＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／ＬモチーフよりＮ末端の全てのアミノ酸が、Ｎ末端メチオニンを除いて、欠失している。
【0068】
さらに別の特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の短縮されたシグナルペプチド配列は、前記Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／ＬモチーフよりＮ末端のアミノ酸を９個まで含むが、Ｎ末端メチオニンを除いて、前記９個までのアミノ酸より上流のアミノ酸を全く含まない。特に、短縮されたシグナルペプチド配列は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／ＬモチーフのＮ末端アミノ酸を１、２、３、４、５、６、７、８または９個までおよびＮ末端メチオニンを含む。
【0069】
本明細書では、用語「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフ」とは、ＦＣｂ２のシグナルペプチド配列のアミノ酸配列中の３アミノ酸の保存配列のことを指す。前記モチーフの１位のアミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）のうちのいずれか１つであり、続いて２位は、任意のアミノ酸（Ｘ）、続いて３位は、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）またはロイシン（Ｌ）である。
【0070】
例えば、Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２のシグナルペプチド配列は、配列番号３のアミノ酸１～８０の範囲であり、配列番号１５を含む。Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２のシグナルペプチド配列中のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフは、アミノ酸配列ＩＤＮを有し、配列番号３の７８～８０位に位置する。
【0071】
本明細書では、用語「成熟ＦＣｂ２ペプチド配列」とは、酵母ミトコンドリア内、特にミトコンドリア膜間隙内に天然に見出される酵母ＦＣｂ２ペプチドの配列のことを指す。本明細書に記載の通り、本明細書に提供される組換えＦＣｂ２は、成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含む。本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、全長野生型成熟配列でありえ、その成熟配列は、酵母ミトコンドリア膜間隙内へのＦＣｂ２の移行と同時に移行ペプチドの特定の切断工程によって生成される。ＦＣｂ２は、ミトコンドリア膜間隙内に天然に存在するので、ＦＣｂ２のシグナルペプチドは、ミトコンドリア膜間隙内に最終的に局在化するまでに２回切断される。したがって、前記移行ペプチドの切断は、成熟ＦＣｂ２の定義されたＮ末端を最終的にもたらす。したがって、用語「成熟ＦＣｂ２ペプチド配列」とは、ミトコンドリア膜間隙内へＦＣｂ２が移行する間に特定のペプチダーゼの切断によって生成される定義されたＮ末端を持つＦＣｂ２配列のことを特に指す。当業者は、切断部位を決定するための特定のツールを使用することによって成熟ＦＣｂ２を決定することができる。例えば、当業者は、配列整列化によって、選択したＦＣｂ２配列を本明細書に提供されるＦＣｂ２配列と比較し、本明細書に開示されるＦＣｂ２のＮ末端のアミノ酸に対応する前記ＦＣｂ２のアミノ酸を決定することによって成熟タンパク質のＮ末端を予測することができる。特に、当業者は、配列番号３（サッカロミセス・セレビシエ由来の天然の、全長ＦＣｂ２）、配列番号７（クルイベロマイセス・マルキシアヌス由来の天然の、全長ＦＣｂ２）、配列番号１１（ウィカハモマイセス・アノマルス由来の天然の、全長ＦＣｂ２）、配列番号１６（カンジダ・グラブラータ由来の天然の、全長ＦＣｂ２）における本明細書に提供される全長ＦＣｂ２配列の配列と選択したＦＣｂ２の全長配列との多重配列整列化を実行し、ＴｒａｎｓＰ認識モチーフＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌおよび本明細書に提供される前記ＦＣｂ２配列のＮ末端成熟配列に対する整列化を検索し、選択した成熟ＦＣｂ２の対応するＮ末端を決定することができる。例えば、多重配列整列化を実行する方法は、ＥＭＢＬのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されるＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａである。
【0072】
本発明の特定の実施形態において、成熟ＦＣｂ２配列は、以下のＮ末端（Ｎ末端からＣ末端への配列の最初の５アミノ酸が示され、以下の配列が、完全な成熟ＦＣｂ２配列のＮ末端のみを反映しており、成熟ＦＣｂ２アミノ酸配列が、それぞれの配列の残りに統合されることは理解されるべきである）：
ＤＡＡＫＨ（配列番号１５７）、ＴＳＳＶＬ（配列番号１５８）、ＤＶＫＬＥ（配列番号１５９）、ＧＴＴＫＤ（配列番号１６０）、ＮＥＬＲＤ（配列番号１６１）、ＤＳＭＬＬ（配列番号１６２）、ＤＰＫＬＤ（配列番号１６３）、ＥＰＫＬＤ（配列番号１６４）、ＤＶＳＩＥ（配列番号１６５）、ＤＡＫＦＤ（配列番号１６６）、ＧＡＫＶＤ（配列番号１６７）、ＤＬＶＲＤ（配列番号１６８）、ＤＶＰＫＷ（配列番号１６９）、ＧＶＫＶＤ（配列番号１７０）、ＡＴＫＥＥ（配列番号１７１）、ＥＳＡＱＱ（配列番号１７２）、ＧＴＫＶＤ（配列番号１７３）、ＤＮＧＱＰ（配列番号１７４）、ＥＳＫＬＡ（配列番号１７５）、ＤＳＳＳＳ（配列番号１７６）、ＧＰＶＫＤ（配列番号１７７）、ＧＰＫＬＤ（配列番号１７８）、ＤＶＰＨＷ（配列番号１７９）、ＤＡＰＴＱ（配列番号１８０）、ＥＡＩＴＴ（配列番号１８１）、ＥＳＰＳＶ（配列番号１８２）、ＤＡＡＦＤ（配列番号１８３）、ＤＩＫＹＥ（配列番号１８４）、ＧＴＶＫＤ（配列番号１８５）、ＤＤＥＲＫ（配列番号１８６）、ＤＶＲＱＤ（配列番号１８７）、ＤＳＫＭＥ（配列番号１８８）のうち１つを有する天然のＦＣｂ２配列の配列である。
ＤＡＡＫＨ（配列番号１５７）、ＴＳＳＶＬ（配列番号１５８）、ＤＶＫＬＥ（配列番号１５９）、ＧＴＴＫＤ（配列番号１６０）、ＮＥＬＲＤ（配列番号１６１）、ＤＳＭＬＬ（配列番号１６２）、ＤＰＫＬＤ（配列番号１６３）、ＥＰＫＬＤ（配列番号１６４）、ＤＶＳＩＥ（配列番号１６５）、ＤＡＫＦＤ（配列番号１６６）、ＧＡＫＶＤ（配列番号１６７）、ＤＬＶＲＤ（配列番号１６８）、ＤＶＰＫＷ（配列番号１６９）、ＧＶＫＶＤ（配列番号１７０）、ＡＴＫＥＥ（配列番号１７１）、ＥＳＡＱＱ（配列番号１７２）、ＧＴＫＶＤ（配列番号１７３）、ＤＮＧＱＰ（配列番号１７４）、ＥＳＫＬＡ（配列番号１７５）、ＤＳＳＳＳ（配列番号１７６）、ＧＰＶＫＤ（配列番号１７７）、ＧＰＫＬＤ（配列番号１７８）、ＤＶＰＨＷ（配列番号１７９）、ＤＡＰＴＱ（配列番号１８０）、ＥＡＩＴＴ（配列番号１８１）、ＥＳＰＳＶ（配列番号１８２）、ＤＡＡＦＤ（配列番号１８３）、ＤＩＫＹＥ（配列番号１８４）、ＧＴＶＫＤ（配列番号１８５）、ＤＤＥＲＫ（配列番号１８６）、ＤＶＲＱＤ（配列番号１８７）、ＤＳＫＭＥ（配列番号１８８）のうち１つを有する天然のＦＣｂ２配列の配列である。
【0073】
本発明の別の実施形態によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列は、野生型酵母に見られる全長成熟配列の機能的に活性なバリアントでありえ、点突然変異など本明細書に記載の１つまたは複数の遺伝子修飾を含むが、酵素活性を保持する。特に、本明細書に記載の天然の成熟ＦＣｂ２ペプチド配列の機能的に活性なバリアントは、少なくともシトクロムｂ２ドメインおよびフラビンドメインを含む。
【0074】
本発明によると、組換えＦＣｂ２は、ＷＯ０２１／１６７０１１Ａ１に開示されるアミノ酸配列、配列番号１４５と異なる。特定の実施形態によると、組換えＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示されるアミノ酸配列と異なる。特定の実施形態によると、組換えＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示される配列番号１４５～１５６に示されるアミノ酸配列と異なる。特定の実施形態によると、組換えＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示される配列番号１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５および／または１５６に示されるアミノ酸配列と異なる。特定の実施形態によると、組換えＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示される配列番号１４５～１５６に示される前記アミノ酸配列の断片または短縮された形態と異なる。特定の実施形態によると、配列番号１４５は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示されるサッカロミセス・セレビシエＦＣｂ２のアミノ酸配列である。
【0075】
本発明によると、電極が組換えＦＣｂ２を含む場合、このＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示されるアミノ酸配列、配列番号１４６～１５６と異なる。特定の実施形態によると、電極が組換えＦＣｂ２を含む場合、このＦＣｂ２は、配列番号１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５および／または１５６に示されるアミノ酸配列と異なる。特定の実施形態によると、電極が組換えＦＣｂ２を含む場合、このＦＣｂ２は、ＷＯ２０２１／１６７０１１Ａ１に開示される配列番号１４６～１５６に示される前記アミノ酸配列の断片または短縮された形態と異なる。
【0076】
一実施形態によると、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２を含む電極は、試料中の乳酸またはヒドロキシ酸の決定のためのバイオセンサに使用されうる。
一実施形態によると、電極を含むバイオセンサが、提供されえ、前記電極は、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２を含む。前記バイオセンサは、乳酸またはヒドロキシ酸の分析物の決定に使用されうる。
一実施形態によると、電極を含むバイオセンサが、提供されえ、前記電極は、本明細書に記載の組換えＦＣｂ２を含む。前記バイオセンサは、乳酸またはヒドロキシ酸の分析物の決定に使用されうる。
【0077】
デヒドロゲナーゼドメインとも称されるＦＣｂ２のフラビンドメインは、そのエナンチオマー選択性、および低ミリモルまたはサブミリモル範囲のＫＭで一般に特徴付けられる天然の乳酸基質に対する特異性によって一般に特徴付けられる。ＦＭＮ補因子と共に作用する活性部位において触媒ヒスチジン塩基によって乳酸を酸化すると、２つの電子が引き抜かれ、ピルビン酸が反応産物として放出される。その後、フラビンドメインは、そのように得られた電子の、ＤＣＩＰのような適切な電子受容体またはパートナーシトクロムドメインへの輸送を支配するが、電子受容体である二原子酸素の受容には一般に応答しない。
【0078】
ヘム（ｈｅｍｅ）ドメインまたはヘム（ｈｅａｍ）ドメインと称されるＦＣｂ２のシトクロムドメインは、隣接するフラビンドメインから、生理的な場合と同様にチトクロムｃのような外部電子受容体、または人工電極へと電子を往復させる能力によって一般に特徴付けられる。一般に、「ｂ」型の含有されるヘム補因子は、ヘムの反対側にあるライゲートヒスチジンの支えによって配位される。
【0079】
特定の実施形態において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、配列番号３の残基１９７～５６３を含むもしくはそれからなるＳ．セレビシエＦＣｂ２のフラビンドメインおよび配列番号３の残基８８～１６５を含むもしくはそれからなるＳ．セレビシエＦＣｂ２のシトクロムドメインを含む、または異なる酵母のこれらドメインのそれぞれの相同物を含む。
【0080】
例えば、Ｓ．セレビシエにおいて、成熟ＦＣｂ２配列は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフの直後に始まり、アミノ酸ＥＰＫＬＤ（配列番号４５）で始まる。
特定の例において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２に基づく配列を含み、配列番号３７、３８または３９のうちいずれか１つを好ましくは含む本明細書に記述される短縮されたシグナルペプチド配列を含み：
－ 配列番号３のアミノ酸残基８８～１６５に及ぶシトクロム－ｂ２ドメイン；
－ 任意選択で、シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続する配列番号３の残基１７７～１９０に及ぶヒンジ領域；
－ 配列番号３の残基１９７～５６３に及ぶフラビンドメイン；および
－ 任意選択で、配列番号３の残基５６７～５９１を含む尾部領域を含む成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含む。
特定の例において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２に基づく配列を含み、配列番号３７、３８または３９のうちいずれか１つを好ましくは含む本明細書に記述される短縮されたシグナルペプチド配列を含み：
－ 配列番号３のアミノ酸残基８８～１６５に及ぶシトクロム－ｂ２ドメイン；
－ 任意選択で、シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続する配列番号３の残基１７７～１９０に及ぶヒンジ領域；
－ 配列番号３の残基１９７～５６３に及ぶフラビンドメイン；および
－ 任意選択で、配列番号３の残基５６７～５９１を含む尾部領域を含む成熟ＦＣｂ２ペプチド配列を含む。
【0081】
特定の例において、組換えＦＣｂ２の成熟ＦＣｂ２配列は、配列番号２、もしくは本明細書に記載の１つもしくは複数の遺伝子修飾、例えば点突然変異もしくは欠失などを含み、Ｓ．セレビシエのＦＣｂ２の少なくともシトクロムｂ２ドメインおよびフラビンドメインを含むその機能的に活性なバリアントを含むまたはそれからなる。
【0082】
本明細書では用語「活性」とは、例えば、酵素活性の文脈において、機能的に活性な分子のことを指すものとする。機能的酵素は、酵素基質を認識し、基質の転換産物への転換を触媒する触媒中心によって特に特徴付けられる。フラボシトクロムｂ２の場合、好ましい基質は、Ｌ－乳酸であり、転換産物はピルビン酸である。酵素バリアントは、標準的な試験系においてその酵素活性を決定した際に機能的であると考えられ、例えば、酵素活性は、親（修飾されていないまたは野生型の酵素）の活性の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、もしくはさらに１００％超のいずれかである。
【0083】
フラボシトクロムｂ２バリアントの酵素活性は、チトクロムｃ、フェリシアン化物または２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）の比色還元を決定するアッセイなど、当業者に公知のアッセイによって容易に決定されうる。特に、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２は、本明細書に記載されるおよびＤｉｅｐ Ｌｅら（Ｄｉｅｐ Ｌｅら２００９年）によって記述されるチトクロムｃアッセイによって決定される少なくとも１Ｕ／ｍｇの酵素活性を含む。
【0084】
一般に、チトクロムｃは、ヘムｂ２からのみ電子を受け取り、フェリシアン化物は、ヘムと酵素中のフラビンセミキノンの両方によって還元される。ＤＣＩＰは、ヘムｂから電子を受け取らないが、フラビンからのみ受け取る。
【0085】
例えばＤｉｅｐ Ｌｅらによって以前に記載されているように（Ｄｉｅｐ Ｌｅら２００９年）、フラボシトクロムｂ２バリアントの酵素活性は、３０℃および５５０ｎｍでチトクロムｃ（ＣｙｔＣ）の比色還元から酵素活性を評価するチトクロムｃアッセイによって決定されうる；モル吸光係数＝２０ｍＭ－１ｃｍ－１。アッセイ混合物は、１１ｍＭリン酸カリウム、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌでｐＨ７．４に緩衝され、１０ｍＭ乳酸、２０μＭ ＣｙｔＣを含有し、それは、最終電子受容体として作用し、全酵素の活性を、全ての部分的電子移動の産物として特に検出する（フラビンおよびヘムドメイン）。ＣｙｔＣアッセイは、両方のドメイン間の分子内電子移動（ＩＥＴ）および外部電子受容体への電子移動の効率の尺度を、電極上の酵素の応答の指標としてそれにより提供する。酵素活性の１単位は、アッセイ条件下で１分間に１μモルの乳酸を酸化させる酵素の量（Ｕ／ｍｇ）と定義される。乳酸の反応化学量論：乳酸１分子当たり２つの電子が獲得され、２分子のＣｙｔＣへと個々に移動されるので、ＣｙｔＣは１：２である。他の基質で活性を検出する場合、乳酸は、他の化合物に交換されうる。
【0086】
例えば、以前に記載されているように（Ｄｉｅｐ Ｌｅら２００９年）、フラボシトクロムｂ２バリアントの酵素活性は、３０℃および４２０ｎｍでフェリシアン化物（Ｆｅ（ＩＩＩ）ＣＮ６
３－）の比色還元を評価することによっても決定されうる；モル吸光係数＝１．０ｍＭ－１ｃｍ－１。アッセイ混合物は、ＣｙｔＣアッセイについて記述される通り処方されるが、ＣｙｔＣの代わりに１３ｍＭ フェリシアン化物を含有する。乳酸の反応化学量論：乳酸１分子当たり２つの電子が獲得され、２分子のフェリシアン化物へと個々に移動されるので、フェリシアン化物は１：２である。フェリシアン化物の還元は、ＦＭＮドメインでも同様に起こりうるので、ヘムによる最終電子移動に特異的でない。他の基質で活性を検出する場合、乳酸は、他の化合物に交換されうる。
【0087】
例えば（Ｇａｕｍｅら１９９５年）に以前に記載されているように、フラボシトクロムｂ２バリアントの酵素活性は、３０℃および６００ｎｍで２，６－ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）の比色還元を評価することによっても決定されうる；モル吸光係数＝２２ｍＭ－１ｃｍ－１。アッセイ混合物は、ＣｙｔＣアッセイについて記述される通り処方されるが、ＣｙｔＣの代わりに０．１ｍＭ ＤＣＩＰを含有する。乳酸の反応化学量論：乳酸分子当たり２つの電子が獲得され、１つのＤＣＩＰ分子を移動するので、ＤＣＩＰは１：１である。ＣｙｔＣおよびフェリシアン化物とは対照的に、ＤＣＩＰは、パートナーヘムに往復する前に、ＦＭＮドメインにおいて一次電子移動から電子を受容する。他の基質で活性を検出する場合、乳酸はまた、他の化合物に交換されうる。
【0088】
本明細書に使用される用語「活性の増大」、または「増大した活性」、等は、酵素の活性の検出可能な増大のことを指しうる。本明細書に使用される用語「活性の増大」、または「増大した活性」は、例えば本明細書に記載の短縮されたシグナルペプチド配列を含むＦＣｂ２バリアントなどの修飾された酵素が、特定の遺伝子修飾を持たない酵素のような、同型の相当する酵素より高い活性を示すことを意味しうる。例えば、修飾または操作された酵素の活性は、同型の操作されていない酵素、例えば、野生型酵素の活性よりも約５％もしくはそれ以上、約１０％もしくはそれ以上、約１５％もしくはそれ以上、約２０％もしくはそれ以上、約３０％もしくはそれ以上、約５０％もしくはそれ以上、約６０％もしくはそれ以上、約７０％もしくはそれ以上、または約１００％もしくはそれ以上高くてもよい。組換えまたは操作された細胞中の特定のタンパク質もしくは酵素の活性は、親細胞、例えば、操作されていない細胞中の同型のタンパク質もしくは酵素の活性より約５％もしくはそれ以上、約１０％もしくはそれ以上、約１５％もしくはそれ以上、約２０％もしくはそれ以上、約３０％もしくはそれ以上、約５０％もしくはそれ以上、約６０％もしくはそれ以上、約７０％もしくはそれ以上、または約１００％もしくはそれ以上高くてもよい。細胞中の酵素またはタンパク質の増大した活性は、当業者に公知の任意の方法によって検証されうる。
【0089】
用語「機能的バリアント」または「機能的に活性なバリアント」は、天然に存在する対立遺伝子バリアント、および突然変異体または他の任意の天然に存在しないバリアントも含む。当業者には公知であるように、相同物とも呼ばれる対立遺伝子バリアントは、核酸もしくはポリペプチドの生物学的機能を基本的に改変しないヌクレオチドもしくはアミノ酸の１つもしくは複数の置換、欠失または付加を有すると特徴付けられる核酸もしくはペプチドの選択的形態である。特に、機能的バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０アミノ酸残基の置換、欠失および／もしくは付加、またはその組合せを含んでもよく、特に、置換、欠失および／または付加は、保存的修飾であり、酵素の比活性度を低下させない。特に、本明細書に記載のＦＣｂ２の機能的に活性なバリアントは、本明細書に記載のＣｙｔＣアッセイで決定した通り、乳酸に対して少なくとも１Ｕ／ｍｇの特異的酵素活性を含む。
【0090】
特に、本明細書に記載の機能的バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０アミノ酸を超えないもしくは以下の置換、欠失および／または付加を含み、特に、それらは保存的修飾であり、酵素の比活性度を低下させない。特に、本明細書に記載の機能的に活性なバリアントは、１５個以下、好ましくは１０個もしくは５個以下のアミノ酸置換、欠失および／または付加を含み、特にそれらは保存的修飾であり、酵素の比活性度を低下させない。
【0091】
特に、本明細書に記述される機能的に活性なバリアントは、それぞれの野生型酵素の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％またはより高い酵素活性を含む。特定の例によると、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２が、Ｓ．セレビシエＦＣｂ２から得られる場合に、前記組換えＦＣｂ２は、配列番号３を含むＦＣｂ２の酵素活性の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％またはより高くを含む場合、機能的に活性なバリアントである。
【0092】
機能的バリアントは、例えば１つもしくは複数の点突然変異によるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の配列改変によって得られてもよく、配列改変は、例えば安定性などの酵素の特徴を保持するまたは改善する。そのような配列改変は、（保存的）置換、付加、欠失、突然変異および挿入を含みうるが、これに限定されない。保存的置換とは、側鎖および化学的特性が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、無極性脂肪族側鎖、無極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小さな側鎖、大きな側鎖、等を持つアミノ酸である。
【0093】
点突然変異は、異なるアミノ酸に対する、アミノ酸の１つもしくは複数の単一（非連続）または二重の置換もしくは交換、欠失もしくは挿入において操作していないアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の発現をもたらすポリヌクレオチドの操作として特に理解される。
【0094】
特定の実施形態によると、本明細書に記述されるＦＣｂ２は、１つまたは複数のタグ配列、特にＮ末端タグ配列を含む。特に、そのようなタグ配列は、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２のＮ末端メチオニンよりＣ末端である。そのようなタグ配列は、２、４、５、６もしくは１０アミノ酸より多い、２０もしくは５０個以下またはより多いアミノ酸の任意の数のアミノ酸を含んでもよい。特に、本明細書に使用されるタグ配列は、当業者に公知の任意のタグ配列でもよい。特に、本明細書に使用されるタグ配列は、親和性タグ、溶解度増強タグまたは監視タグから選択される。
【0095】
親和性タグは、それが結合しているタンパク質の精製に例えば使用されうるアミノ酸配列である。これら親和性タグは、クロマトグラフィー樹脂のような固体支持体の適切なリガンドに対してまたは樹脂に対して直接、高い親和性を有する。特定の樹脂に対する親和性タグを有するタンパク質の選択的結合により、タンパク質は、１つのクロマトグラフィー工程のみで非常に有効に精製されうる。特定の実施形態によると、本明細書に使用される親和性タグ配列は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、特にポリヒスチジンタグ、ポリアルギニンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）タグ、Ｓ－ｔａｇ、ＨＡタグ、ｃ－ＭｙｃタグおよびＳＵＭＯタグ、または融合されるタンパク質の効率的な精製に有用であることが公知の他の任意のタグから選択される。好ましくは、タグは、１つまたは複数のＨを含むＨｉｓタグ、特にヘキサヒスチジンタグである。特に、ポリまたはヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むタンパク質は、クロマトグラフィーを使用して、例えば固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって捕捉、精製されうる。
【0096】
溶解度増強タグは、本明細書に記述されるＦＣｂ２のＮ末端に融合されうる。溶解度増強タグは、宿主細胞、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）の細胞質ゾル中で発現されると、タグのないタンパク質の発現と比較して、可溶性タンパク質の力価を増大させうる。さらなる特定の実施形態によると、本明細書に使用される溶解度増強タグ配列は、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ポリＡｒｇ、ポリＬｙｓ、タンパク質Ｄタグ（ｄＴＡＧ）、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインおよびチオレドキシンまたは例えば、宿主細胞における発現の間に融合されるタンパク質の可溶性を改善することが公知の他の任意のタグから選択される。特に、溶解度増強タグは、Ｔ７タグ、好ましくはＴ７Ａ、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、Ｔ７Ａ４、Ｔ７Ａ５、Ｔ７Ｂ、Ｔ７Ｂ１、Ｔ７Ｂ２、Ｔ７Ｂ３、Ｔ７Ｂ３、Ｔ７Ｂ４、Ｔ７Ｂ５、Ｔ７Ｂ６、Ｔ７Ｂ６、Ｔ７Ｂ７、Ｔ７Ｂ８、Ｔ７Ｂ９、Ｔ７Ｂ１０、Ｔ７Ｂ１１、Ｔ７Ｂ１２、Ｔ７Ｂ１３およびＴ７Ｃからなる群から選択される。
【0097】
さらなる特定の実施形態によると、本明細書に使用される監視タグ配列は、ｍ－Ｃｈｅｒｒｙ、ＧＦＰもしくはｆ－アクチン、または紫外線、赤外線、ラマン、蛍光などのような、単純なｉｎ ｓｉｔｕ、インライン、オンラインもしくはアットライン検出器によって発酵、単離および精製を含めた生産工程中の組換え酵素を検出もしくは定量化するのに有用な他の任意のタグである。
【0098】
宿主細胞において本明細書に記述される組換えＦＣｂ２を産生する方法が、本明細書でさらに提供される。
ＦＣｂ２分子は、基質乳酸からＦＭＮ、ヘムｂを経て、最終的に電極へと直接電子移動を確立するために三次元構造内に組み込まれた補因子ＦＭＮおよびヘムｂを必要とするので、本発明の組換えＦＣｂ２の発現は、これら補因子を充分な量産生する能力がある宿主を使用して実行されなければならない。特にヘムｂ補因子を充分に産生するために、本発明による酵母生物が使用される。酵母細胞は、補因子としてヘムｂを有する組換えタンパク質を成功裏に産生することができる。対照的に、細菌性細胞は、充分な量の鉄補因子ヘムｂを産生することが一般にできない。また、発現系は、酵素の比活性度および安定性に影響を与える。本明細書で言及される用語「宿主細胞」は、本明細書に記述される発現産物をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物もしくは発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などの作用を受けやすい、さもなければ本明細書に記述される組換え酵素を導入する作用を受けやすい任意の酵母細胞型と理解される。特に、宿主酵母細胞は、酵素の発現を可能にする条件下で維持される。宿主酵母細胞は、一倍体、二倍体または倍数体細胞でありうる。
ＦＣｂ２分子は、基質乳酸からＦＭＮ、ヘムｂを経て、最終的に電極へと直接電子移動を確立するために三次元構造内に組み込まれた補因子ＦＭＮおよびヘムｂを必要とするので、本発明の組換えＦＣｂ２の発現は、これら補因子を充分な量産生する能力がある宿主を使用して実行されなければならない。特にヘムｂ補因子を充分に産生するために、本発明による酵母生物が使用される。酵母細胞は、補因子としてヘムｂを有する組換えタンパク質を成功裏に産生することができる。対照的に、細菌性細胞は、充分な量の鉄補因子ヘムｂを産生することが一般にできない。また、発現系は、酵素の比活性度および安定性に影響を与える。本明細書で言及される用語「宿主細胞」は、本明細書に記述される発現産物をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸構築物もしくは発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などの作用を受けやすい、さもなければ本明細書に記述される組換え酵素を導入する作用を受けやすい任意の酵母細胞型と理解される。特に、宿主酵母細胞は、酵素の発現を可能にする条件下で維持される。宿主酵母細胞は、一倍体、二倍体または倍数体細胞でありうる。
【0099】
また、「宿主細胞株」または「産生細胞株」についても本明細書に記述され、その株は、本明細書に記述される組換え酵素などの産生過程の産物を得るためにバイオリアクタにおいて育生／培養するのにすぐに使用できる酵母細胞株であると一般に理解される。本明細書に記載の酵母宿主または酵母細胞株は、所望の組換えタンパク質を産生するために育生／培養されうる組換え酵母生物と特に理解される。
【0100】
そのような宿主細胞の遺伝子修飾は、細胞内にポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを導入する修飾；親細胞の遺伝物質に変化をもたらす化学修飾（化学物質への曝露）を含めて、親細胞の遺伝物質の１つもしくは複数のヌクレオチドを置換、付加（すなわち、挿入）、または欠失させる修飾を含む。遺伝子修飾は、参照される種の異種性または同種性の修飾を含む。遺伝子修飾は、ポリペプチドのコード領域の修飾をさらに含む。遺伝子修飾は、遺伝子の発現またはオペロンの機能を変化させる非コード調節領域の修飾も含む。非コード領域は、５’非コード配列（コード配列の５’側）および３’非コード配列（コード配列の３’側）を含む。
【0101】
本明細書に使用される「遺伝子」とは、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２など特定のタンパク質をコードする核酸断片のことを指し、それは、５’非コード配列および３’非コード配列（コード配列に対する相対的位置を参照して３’および５’）など、少なくとも１つの調節配列を任意選択で含みうる。
【0102】
一部の実施形態において、本明細書に記述される組換えＦＣｂ２をコードしている遺伝子は、酵母細胞に導入されても、酵母細胞の内在性遺伝物質（例えば、染色体）に挿入されてもよい。この遺伝子は、内在性遺伝子を破壊するために酵母細胞の特定の内在性遺伝子の１つまたは複数の場所に挿入されてもよい。破壊しようとする特定の内在性遺伝子は、天然のＦＣｂ２遺伝子を含んでもよい。
【0103】
組換えＦＣｂ２をコードする遺伝子は、酵母細胞に導入されうるが、酵母細胞の内在性遺伝物質に挿入されえない。例えば、遺伝子は、プラスミドなどの発現ベクターに含まれ、酵母細胞の内在性遺伝物質から分離されたままでもよい。
【0104】
遺伝子は、発現可能な形態で酵母細胞内へ導入され、酵母細胞内でその遺伝子産物を生成するために発現されうる。発現可能な形態は、遺伝子が発現調節配列に作動的に連結される構造でありうる。例えば、遺伝子は、酵母細胞において発現可能になるように外来性エンハンサー、オペレーター、プロモーターおよび転写ターミネータから選択される少なくとも１つの配列に作動的に連結されてもよく、または酵母細胞において発現可能になる酵母細胞の内在性調節配列に連結されてもよい。
【0105】
遺伝子は、酵母細胞に遺伝物質を導入する公知の任意の方法を使用して酵母宿主細胞に導入されうる（例えば、Ｒ．Ｇｉｅｔｚら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０：８１６～８３１頁、２００１年４月を参照のこと）。導入には、スフェロプラスト法、無傷の酵母細胞の形質転換、エレクトロポレーションまたはその組合せを含みうる。例えば、無傷の酵母細胞の形質転換は、酵母細胞によるプラスミドなどのＤＮＡの取り込みを促進するために特定の一価のアルカリ陽イオン（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋およびＬｉ＋）をＰＥＧと組み合わせて使用してもよい。例えば、無傷の酵母細胞の形質転換は、ＰＥＧ、ＬｉＡｃ、担体ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび酵母細胞の水性溶液に熱ショックを適用することを含んでもよい。例えば、エレクトロポレーションは、酵母細胞およびプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡを含む混合培地に電気パルスを印加することを含んでもよい。
【0106】
酵母への導入において、遺伝子は、酵母細胞の親細胞の内在性遺伝物質に対する相同配列を持つベクター中に含まれてもよい。相同配列は、親酵母細胞の内在性遺伝物質中に存在する標的配列に相補的であり、したがって相同組換えによって標的配列と置換されうる。ベクターは、標的配列の５’末端および３’末端にそれぞれ相同な２つの配列を含んでもよい。この点に関して、導入は、接触中または後に選択圧下で酵母細胞を培養することを含んでもよい。選択圧とは、相同組換えが起こった細胞だけを選択することができる材料または状態を示しうる。選択圧は、抗生物質存在下で培養することを含みうる。この点に関して、ベクターは、酵母細胞に抗生物質抵抗性を与える遺伝子、例えば、抗生物質を分解する酵素をコードする遺伝子を含んでもよい。
【0107】
宿主細胞株に関して、用語「細胞培養」または「育生」（「培養する」が、本明細書において同義的に使用される）は、「発酵」とも称され、人工的な、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境において、細胞の成長、分化または活性もしくは休止状態での継続的な生存に有利に働く条件下で、産業界において公知の方法に従って特に制御されたバイオリアクタ内で細胞を維持することが意味される。育生する場合、細胞培養は、細胞培養の育生を支持するのに適切な条件下で培養容器中の細胞培養培地または基質と接触させられる。特定の実施形態において、酵母細胞を育生するまたは成長させるための当業者に周知の標準的な細胞培養技術に従って本明細書に記載の培養培地を使用して、細胞を培養する。
【0108】
酵母宿主細胞の育生は、１、２または多重相であってもよい。
特定の実施形態によると、細胞の成長および組換えタンパク質の産生は、単一相である。この場合、育生過程に使用される培地は、育生過程の最初からタンパク質の産生に必要とされるそれぞれの成分を含む。
特定の実施形態によると、細胞の成長および組換えタンパク質の産生は、単一相である。この場合、育生過程に使用される培地は、育生過程の最初からタンパク質の産生に必要とされるそれぞれの成分を含む。
【0109】
細胞培養培地は、制御された、人工的な、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で細胞を維持し、成長させるのに必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特徴および組成は、特定の細胞要件によって変化する。重要なパラメーターには、浸透圧、ｐＨおよび栄養素処方を含む。栄養素のフィードは、当業者に公知の方法に従って連続または非連続的様式で行われてもよい。
【0110】
細胞培養は、バッチ過程または半バッチ過程でもよい。バッチ過程とは、任意選択で本明細書に記載のＦＣｂ２の産生に必要な基質を含めて、細胞の育生に必要な全ての栄養素が、発酵中にさらなる栄養素の追加供給なく、初期培養培地中に含有される育生様式である。半バッチ過程では、フィード相が、バッチ相後に行われる。フィード相において、誘導物質、例えばメタノールなどの１つまたは複数の栄養素が、フィードによって培養に供給される。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、半バッチ過程である。特に、本明細書に記載の酵素をコードしている核酸構築物で形質転換した宿主細胞は、成長相培地内で培養され、本明細書に記述される組換えタンパク質を産生するために誘導相培地に移行される。
【0111】
別の実施形態において、本明細書に記述される宿主細胞は、連続様式、例えば恒成分培養で育生される。連続発酵過程は、バイオリアクタへの、定義され、一定で連続的な速度の新しい培養培地のフィードによって特徴付けられ、その際培養ブロスは、同じく定義された、一定で連続的な除去速度でバイオリアクタから同時に除去される。同じ一定レベルで培養培地、フィード速度および除去速度を保持することにより、育生パラメーターおよびバイオリアクタ内の条件は、一定のままである。
【0112】
本明細書に記載のポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現産物は、宿主細胞内で発現産物を発現させるためのそれぞれのコードポリヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列を導入するか、または発現系内にあるもしくは単離されたそれぞれの発現産物を導入するかいずれかによって宿主細胞に導入されうる。宿主細胞に発現カセット、ベクターを導入する、さもなければ（例えば、コード）ヌクレオチド配列を導入するための公知の任意の手順が、使用されうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。
【0113】
本発明により、産生過程を試行または産業規模で実行することが特に可能になる。
本明細書に記載のバイオマスの蓄積を可能にする成長培地は、特に基礎成長培地、一般に炭素供給源、窒素供給源、硫黄供給源およびリン酸供給源である。一般に、そのような培地は、さらなる微量元素およびビタミンを含み、アミノ酸、ペプトンまたは酵母抽出物をさらに含んでもよい。
本明細書に記載のバイオマスの蓄積を可能にする成長培地は、特に基礎成長培地、一般に炭素供給源、窒素供給源、硫黄供給源およびリン酸供給源である。一般に、そのような培地は、さらなる微量元素およびビタミンを含み、アミノ酸、ペプトンまたは酵母抽出物をさらに含んでもよい。
【0114】
発酵は、ｐＨ３～７．５で好ましくは実施される。
典型的な発酵時間は、２０℃～３５℃、好ましくは２２～３０℃の範囲の温度で約２４～１２０時間である。
典型的な発酵時間は、２０℃～３５℃、好ましくは２２～３０℃の範囲の温度で約２４～１２０時間である。
【0115】
特に、細胞は、本明細書に記述される組換え酵素を産生するのに適切な条件下で育生され、その酵素は細胞または培養培地から精製されうる。
本明細書では用語「外来性」とは、宿主細胞に導入された参照分子（例えば、核酸）のことを指す。核酸は、任意の適切な様式で宿主内に外部から導入されうる。例えば、核酸は、宿主細胞に導入され、宿主染色体中に挿入されえ、または核酸は、宿主染色体に組み込まれない発現ベクター（例えば、プラスミド）などの非染色体性遺伝物質として宿主に導入されうる。タンパク質をコードしている核酸は、発現可能な形態で（すなわち、核酸が転写され、翻訳されうるように）導入されるべきである。
本明細書では用語「外来性」とは、宿主細胞に導入された参照分子（例えば、核酸）のことを指す。核酸は、任意の適切な様式で宿主内に外部から導入されうる。例えば、核酸は、宿主細胞に導入され、宿主染色体中に挿入されえ、または核酸は、宿主染色体に組み込まれない発現ベクター（例えば、プラスミド）などの非染色体性遺伝物質として宿主に導入されうる。タンパク質をコードしている核酸は、発現可能な形態で（すなわち、核酸が転写され、翻訳されうるように）導入されるべきである。
【0116】
用語「内在性」とは、特定の遺伝子修飾（例えば、「野生型」細胞または親細胞の遺伝的構成物、形質もしくは生合成活性）の前に宿主細胞中にすでに存在している参照分子（例えば、核酸）のことを指す。
【0117】
用語「異種性」とは、参照種以外の供給源から得られる参照分子（例えば、核酸）のことを指し；用語「相同性」とは、宿主親細胞から得られる分子（例えば、核酸）または活性のことを指す。したがって、外来性分子（例えば、外来性コード核酸の発現）は、異種性（例えば、異なる種由来のコード核酸）または相同性（例えば、同じ種由来のコード核酸の追加のコピー）でもよい。
【0118】
本明細書では、ポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列の発現に関する用語「発現」とは、ｍＲＮＡへのＤＮＡ転写、ｍＲＮＡプロセシング、非コードｍＲＮＡ成熟、ｍＲＮＡ輸出、翻訳、タンパク質折りたたみおよび／またはタンパク質輸送からなる群から選択される工程の少なくとも１つを包含することを意味する。所望のヌクレオチド配列を含有する核酸分子を使用して、そのようなヌクレオチド配列にコードされる発現産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ分子などの転写産物）を産生することもできる。所望のヌクレオチド配列を発現させるには、発現系を使用することが都合よく、その発現系は、宿主細胞または宿主細胞株に特定のヌクレオチド配列を発現させるために必要に応じてｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ発現系でありうる。一般に、宿主細胞は、所望のヌクレオチド配列およびそれに作動的に連結されたプロモーターを任意選択でさらなる発現制御配列もしくは他の調節配列と一緒に含む発現カセットを含む発現系でトランスフェクトまたは形質転換される。特定の発現系は、１つまたは複数の発現カセットを含むベクターなどの発現構築物を利用する。
【0119】
本明細書では用語「発現構築物」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列が宿主細胞中へ導入される媒体、例えばベクターまたはプラスミドを意味する。本明細書では「発現構築物」は、自己複製するヌクレオチド配列とゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列の両方を含む。
【0120】
用語「ベクター」、「ＤＮＡベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列（例えば外来遺伝子）が宿主細胞内に導入されうる媒体を意味する。本明細書では「ベクター」は、自己複製するヌクレオチド配列と人工染色体などのゲノムに組み込まれるヌクレオチド配列の両方を含む。プラスミドは、本発明の好ましいベクターである。
【0121】
特定の実施形態において、発現ベクターは、複数の発現カセットを含有してもよく、それぞれは、作動可能な連結で少なくとも１つのコード配列およびプロモーターを含む。
「カセット」とは、ＤＮＡコード配列または定義された制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのセグメントのことを指す。カセットの制限部位は、適当な読み枠にカセットを確実に挿入するように設計される。本明細書では「発現カセット」とは、発現系は、例えば、コードされているタンパク質または他の発現産物を含めたそれぞれの発現産物を産生するためにそのような発現カセットを使用できるように、作動可能な連結で所望のコード配列および制御配列を含有する核酸分子のことを指す。特定の発現系は、発現カセットで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞もしくは宿主細胞株を利用し、その後その宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現産物を産生することができる。宿主細胞の形質転換を実施するために、発現カセットは、宿主細胞に導入されるベクターに都合よく含まれてもよく；しかしながら、関連するＤＮＡはまた、宿主染色体内に組み込まれてもよい。コード配列は、特定のポリペプチドもしくはタンパク質の特定のアミノ酸配列をコードするか、もしくは他の任意の発現産物をコードする一般にコードＤＮＡまたはコードＤＮＡ配列である。
「カセット」とは、ＤＮＡコード配列または定義された制限部位でベクターに挿入されうる発現産物をコードするＤＮＡのセグメントのことを指す。カセットの制限部位は、適当な読み枠にカセットを確実に挿入するように設計される。本明細書では「発現カセット」とは、発現系は、例えば、コードされているタンパク質または他の発現産物を含めたそれぞれの発現産物を産生するためにそのような発現カセットを使用できるように、作動可能な連結で所望のコード配列および制御配列を含有する核酸分子のことを指す。特定の発現系は、発現カセットで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞もしくは宿主細胞株を利用し、その後その宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現産物を産生することができる。宿主細胞の形質転換を実施するために、発現カセットは、宿主細胞に導入されるベクターに都合よく含まれてもよく；しかしながら、関連するＤＮＡはまた、宿主染色体内に組み込まれてもよい。コード配列は、特定のポリペプチドもしくはタンパク質の特定のアミノ酸配列をコードするか、もしくは他の任意の発現産物をコードする一般にコードＤＮＡまたはコードＤＮＡ配列である。
【0122】
用語「発現ベクター」は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含み、その発現を提供する制御配列に作動的に連結されている直鎖または環状ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、適切な宿主生物中でのクローニングされた組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写およびそのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列を一般に含む。コードＤＮＡ配列または発現産物をコードしているＤＮＡ分子のセグメントは、定義された制限部位でベクターに好都合に挿入されうる。ベクターを作製するために、異種性外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１つまたは複数の制限部位に挿入されえ、次いで伝搬性のベクターＤＮＡと共にベクターによって宿主細胞内に運ばれる。ベクターは、発現系、例えば１つまたは複数の発現カセットを含むことが好ましい。発現カセットの制限部位は、適当な読み枠にカセットを確実に挿入するように設計される。
【0123】
発現を得るために、例えば本明細書に記述されるポリペプチドまたはタンパク質のいずれかなど、所望の発現産物をコードしている配列は、転写を指示するためのプロモーターを含有する発現ベクターに一般にクローニングされる。適切な発現ベクターは、コードＤＮＡを発現するのに適した調節配列を一般に含む。調節配列の例には、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する配列を含む。調節配列は、発現しようとするＤＮＡ配列に一般に作動的に連結される。
【0124】
プロモーターは、コードＤＮＡの発現を開始、調節、さもなければ媒介または制御するＤＮＡ配列と本明細書において理解される。プロモーターＤＮＡおよびコードＤＮＡは、同じ遺伝子由来または異なる遺伝子由来であってもよく、同じもしくは異なる生物由来であってもよい。組換えクローニングベクターは、クローニングまたは発現用の１つもしくは複数の複製系、宿主における選択用の１つもしくは複数のマーカー、例えば、抗生物質抵抗性、１つもしくは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）および１つもしくは複数の発現カセットを多くの場合含む。
【0125】
本明細書では用語「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性と理解され、配列同一性または配列相補性の程度によって記述される。親ヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したバリアント、相同物もしくはオルソログの配列同一性は、２つ以上の配列の同一性の程度を示す。２つ以上のアミノ酸配列は、ある程度、１００％以下で、対応する位置に同じまたは保存的アミノ酸残基を有することができる。２つ以上のヌクレオチド配列は、ある程度、１００％以下で、対応する位置に同じまたは保存的塩基対を有することができる。
【0126】
配列類似性検索は、過剰な（例えば、少なくとも５０％）配列同一性を持つ相同体を同定するのに有効で信頼性が高い戦略である。しばしば使用される配列類似性検索ツールは、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＨＭＭＥＲである。
【0127】
配列類似性検索は、過剰な類似性、および共通の祖先を反映する統計的に有意な類似性を検出することによってそのような相同タンパク質またはポリヌクレオチドを同定することができる。相同物は、オルソログを包含してもよく、それは、異なる生物における同じタンパク質、例えば、異なる生物または種におけるそのようなタンパク質のバリアントと本明細書において理解される。
【0128】
２つの相補配列の％相補性を決定するためには、％相補性が、上述のアルゴリズムを使用して第１の配列と第２の変換された配列の間の％同一性として次いで算出されうる前に、２つの配列のうち一方が、その相補配列へと変換される必要がある。
【0129】
本明細書に記述されるアミノ酸配列、相同体およびオルソログに関して「パーセント（％）同一性」とは、配列を整列させた後、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入し、どんな保存的置換も配列同一性の一部と考慮することなく、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。当業技術者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列化を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列化を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。配列同一性について決定されるパーセンテージの場合、完全なヌクレオチドまたはアミノ酸においてはありえない算術的小数位が、生じる可能性はありうる。この場合、パーセンテージは、全ヌクレオチドまたはアミノ酸に対して切り上げられるものとする。
【0130】
本明細書に記述される目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、標準的な方法を使用して、例えばＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．２．２９（２０１４年１月６日）を使用して決定される。
【0131】
例えば、核酸分子またはその部分、特にコードＤＮＡ配列のヌクレオチド配列に関して「パーセント（％）同一性」とは、配列を整列させた後、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入し、どんな保存的置換も配列同一性の一部として考慮することなく、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドと同一である候補ＤＮＡ配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。パーセントヌクレオチド配列同一性を決定することを目的とした整列化は、当業者の範囲内にある様々な手段、例えば公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成されうる。当業技術者は、比較される配列の全長にわたって最大の整列化を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、整列化を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【0132】
最適な整列化は、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されえ、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、ＭＡＦＦＴに基づくアルゴリズム：高速フーリエ変換を使用する多重整列化、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｅｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）を含む。
【0133】
本明細書に記述される例は、本発明の例示であり、本発明を限定することを意図するものではない。多くの修正および変更が、本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書に記述および例示される技術に対して行われてもよい。したがって、例は、単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものでないことは理解されるべきである。
【実施例】
【0134】
フラボシトクロムｂ２（ＦＣｂ２）は、「ヒンジ」リンカーを介して接続される２つの機能的ドメインを有する（５７ｋＤａ単量体）。Ｓ．セレビシエ由来ＦＣｂ２は、最も研究されている代表例であり、結晶化されている（ＰＤＢ：１ＦＣＢ）。以下のセクションが同定されている：
－ アミノ酸残基８８までのＮ末端アミノ酸残基は、ミトコンドリア内への細胞性標的化に関与すると仮定される。このいわゆる「移行ペプチド」は、移行に際して切断される；
－ シトクロム－ｂ２ドメイン：非共有結合性ヘムｂを含む＜１０ｋＤａドメイン：（アミノ酸残基８８～１６５に及ぶ）；
－ シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するドメイン接続リンカーを含むヒンジ領域（残基１７７～１９０に及ぶ）；
－ ＦＭＮを含有するおよそ４５ｋＤａのフラビンドメイン（残基１９７～５６３に及ぶ）；
－ Ｃ末端で伸長し、二量体の周りを包む尾部領域（残基５６７～５９１を含む）。
－ アミノ酸残基８８までのＮ末端アミノ酸残基は、ミトコンドリア内への細胞性標的化に関与すると仮定される。このいわゆる「移行ペプチド」は、移行に際して切断される；
－ シトクロム－ｂ２ドメイン：非共有結合性ヘムｂを含む＜１０ｋＤａドメイン：（アミノ酸残基８８～１６５に及ぶ）；
－ シトクロムｂ２ドメインとフラビンドメインを接続するドメイン接続リンカーを含むヒンジ領域（残基１７７～１９０に及ぶ）；
－ ＦＭＮを含有するおよそ４５ｋＤａのフラビンドメイン（残基１９７～５６３に及ぶ）；
－ Ｃ末端で伸長し、二量体の周りを包む尾部領域（残基５６７～５９１を含む）。
【0135】
酵母におけるＦＣｂ２の生理的役割は、ミトコンドリア膜貫通空間（ＩＭＳ）におけるその存在を利用しており、このミトコンドリアの下位区画におけるその存在は、Ｓ．セレビシエ由来ＦＣｂ２に関する２つの刊行物によって確認されている（Ｇｒａｎｄｉｅｒ－Ｖａｚｅｉｌｌｅら２００１年；Ｖｏｇｔｌｅら２０１２年）。酵母細胞内のＦＣｂ２の最終目的地は、実験的に確認することができたので、細胞質ゾルにおいて前駆体として合成される可能性が非常に高く、前駆体内の標的化シグナルの存在を利用して、ある区画から他の区画への指向性輸送が容易になる。
【0136】
生化学的データから、結晶構造がこれまでに解像されている唯一のＦＣｂ２、ＰＤＢ：１ＦＣＢ（ＸｉａおよびＭａｔｈｅｗｓ１９９０年）であるＳ．セレビシエ由来ＦＣｂ２に対して明確になったように（Ｇｈｒｉｒ、ＢｅｃａｍおよびＬｅｄｅｒｅｒ１９８４年；Ｌｅｄｅｒｅｒら１９８５年）、ＦＣｂ２配列の分析により、成熟ＦＣｂ２酵素には含有されず、組み込みの間に標的化シグナルまたはシグナルペプチドとして除去されると推定されるＮ末端配列部分を、ＦＣｂ２遺伝子が実際に含有することが明らかになった。ＳｃＦＣｂ２に加えて、文献は、ウィカハモマイセス・アノマルス由来ＦＣｂ２（ＷａＦＣｂ２、以前はハンゼヌラアノマラ）のデータを提供しており、文献が成熟ＷａＦＣｂ２を生じるＮ末端のプロセシングについて報告する通り、ミトコンドリア移行ペプチドの切断が示される（Ｈａｕｍｏｎｔら１９８７年；Ｂｌａｃｋら１９８９年）。
【0137】
ミトコンドリア内への取り込みは、共通配列を共有するのではなく、類似の物理化学的特性を持つ配列区間の存在を利用すると考えられている（Ａｂｅら、２０００年）。Ｓ．セレビシエミトコンドリアプロテオームのペプチダーゼ切断部位の分析は、ミトコンドリア膜を通る経路に応じて、先行配列中にいくつかの配列パターンを同定した。なお、これらパターンの保存が６５％以下であったことは、配列保存が本質的に不均質であることを際立たせた（Ｇａｋｈ、ＣａｖａｄｉｎｉおよびＩｓａｙａ、２００２年）。
【0138】
ＦＣｂ２のＩＭＳ内への輸送は、ミトコンドリアへの輸送、およびその後の２つの工程：（１）ミトコンドリア外膜を通って移動し、その後（２）膜間隙へ組み込まれる、を少なくとも含む必要がある。工程（２）に含まれる基本的な過程にもかかわらず、ＩＭＳへのＦＣｂ２酵素の最終的な標的化は、なお謎であり、ミトコンドリア外膜（およびその後内膜）を通る先行する工程（１）のより包括的な理解が、利用可能である。この初期工程は、受容体および膜に組み込まれた転位酵素によるシグナル認識、続いて起こる専門のミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）による切断を介する放出に支配される。ミトコンドリア前駆体タンパク質の配列分析について記述している刊行物により、ＭＰＰによって切断される先行配列の大多数に見られる３つの主要な特徴（Ｇａｋｈ、ＣａｖａｄｉｎｉおよびＩｓａｙａ、２００２年）、すなわち、
（ｉ）全体的に正荷電、
（ｉｉ）両親媒性αらせんを形成すると予測される能力、および
（ｉｉｉ）－２位（「Ｒ－２ルール」）におけるアルギニン残基の存在が明らかになった。
（ｉ）全体的に正荷電、
（ｉｉ）両親媒性αらせんを形成すると予測される能力、および
（ｉｉｉ）－２位（「Ｒ－２ルール」）におけるアルギニン残基の存在が明らかになった。
【0139】
４つの切断部位モチーフが報告されている：
・ｘＲｘ＜＞ｘ（Ｓ／ｘ） （Ｒ－２モチーフ）；
・ｘＲｘ（Ｙ／ｘ）＜＞（Ｓ／Ａ／ｘ）ｘ （Ｒ－３モチーフ）
・ｘＲｘ＜＞（Ｆ／Ｌ／Ｉ）ｘｘ（Ｓ／Ｔ／Ｇ）ｘｘｘｘ↓ （Ｒ－１０モチーフ、順次ＭＰＰ，ＭＩＰ）
・ｘｘ＜＞ｘ（Ｓ／ｘ） （Ｒモチーフなし）
Ｓ．セレビシエの７１個のミトコンドリアマトリックス標的化先行配列の調査において、Ｒ－２、Ｒ－３またはＲ－１０モチーフは、先行配列のおよそ６５％にしか見られなかった。したがって、ＭＰＰ切断部位におけるアミノ酸配列の縮重は、相対的に程度が高く、このため、そのような部位が、統計または他の方法によって予測されうる信頼レベルは限定される。これら予測は、ＭＰＰによる最初の切断に続く事実によってしばしば複雑であり、多くの先行配列は、基質認識の異なる要件で、異なる場所で他のペプチダーゼによって再び切断される。これは、ＦＣｂ２ Ｎ末端の二次プロセシングになる可能性が高い。
・ｘＲｘ＜＞ｘ（Ｓ／ｘ） （Ｒ－２モチーフ）；
・ｘＲｘ（Ｙ／ｘ）＜＞（Ｓ／Ａ／ｘ）ｘ （Ｒ－３モチーフ）
・ｘＲｘ＜＞（Ｆ／Ｌ／Ｉ）ｘｘ（Ｓ／Ｔ／Ｇ）ｘｘｘｘ↓ （Ｒ－１０モチーフ、順次ＭＰＰ，ＭＩＰ）
・ｘｘ＜＞ｘ（Ｓ／ｘ） （Ｒモチーフなし）
Ｓ．セレビシエの７１個のミトコンドリアマトリックス標的化先行配列の調査において、Ｒ－２、Ｒ－３またはＲ－１０モチーフは、先行配列のおよそ６５％にしか見られなかった。したがって、ＭＰＰ切断部位におけるアミノ酸配列の縮重は、相対的に程度が高く、このため、そのような部位が、統計または他の方法によって予測されうる信頼レベルは限定される。これら予測は、ＭＰＰによる最初の切断に続く事実によってしばしば複雑であり、多くの先行配列は、基質認識の異なる要件で、異なる場所で他のペプチダーゼによって再び切断される。これは、ＦＣｂ２ Ｎ末端の二次プロセシングになる可能性が高い。
【0140】
実施例１
ＦＣｂ２のＮ末端リーダー配列の特徴付け
Ｎ末端シグナルペプチドによるミトコンドリアへの細胞標的化を予測することが可能なオンラインツールは、少ししか現在利用できない
・Ｍｉｔｏｆａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｔｆ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ＭｉｔｏＦａｔｅｓ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｏｐ．ｃｇｉ）
・Ｐｒｅｄｏｔａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｕｒｇｉ．ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ．ｈｔｍｌ）
・ＴａｒｇｅｔＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）
最も確立されている、ＴａｒｇｅｔＰ－２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）は、様々な生物および区画について細胞性運命を予測することができる。サッカロミセス・セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）、ウィカハモマイセス・アノマルス（ＷａＦＣｂ２）およびカンジダ・グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）（配列番号３、７、１１、１６）の確立されたＦＣｂ２配列を用いて試験を実施して、予測に対する洞察を得た。
ＦＣｂ２リーダー配列の分析
・ＵｎｉｐｒｏｔおよびＮＣＢＩに対するＢＬＡＳＴ検索から得られたＦＣｂ２配列をアセンブリし、酵母（サッカロミセス科）からのエントリに制限した。全３７個の配列を集め、１ＦＣＢ結晶構造（配列番号１）は、成熟し、プロセシングされたＮ’－末端を含有するので陽性対照として役立った。Ｆａｓｔａファイルを、ＢＬＡＳＴ検索からダウンロードし、Ｊａｌｖｉｅｗにロードした。配列の重複を、リストから除去した。最も可能性がある配列整列化を、Ｇ－ＩＮＳ－Ｉプリセットを用いてＭＡＦＦＴアルゴリズムを使用して算出し、整列化を、明らかなエラーについて検査した。整列化を、構造的に関連する部分の保存されている「ＷＶＶＩ」までの最初の１６４位まで次いで短縮し、保存のためにカラー化した。
ＦＣｂ２のＮ末端リーダー配列の特徴付け
Ｎ末端シグナルペプチドによるミトコンドリアへの細胞標的化を予測することが可能なオンラインツールは、少ししか現在利用できない
・Ｍｉｔｏｆａｔｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｔｆ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ＭｉｔｏＦａｔｅｓ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔｏｐ．ｃｇｉ）
・Ｐｒｅｄｏｔａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｕｒｇｉ．ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ／ｐｒｅｄｏｔａｒ．ｈｔｍｌ）
・ＴａｒｇｅｔＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）
最も確立されている、ＴａｒｇｅｔＰ－２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴａｒｇｅｔＰ／）は、様々な生物および区画について細胞性運命を予測することができる。サッカロミセス・セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）、ウィカハモマイセス・アノマルス（ＷａＦＣｂ２）およびカンジダ・グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）（配列番号３、７、１１、１６）の確立されたＦＣｂ２配列を用いて試験を実施して、予測に対する洞察を得た。
ＦＣｂ２リーダー配列の分析
・ＵｎｉｐｒｏｔおよびＮＣＢＩに対するＢＬＡＳＴ検索から得られたＦＣｂ２配列をアセンブリし、酵母（サッカロミセス科）からのエントリに制限した。全３７個の配列を集め、１ＦＣＢ結晶構造（配列番号１）は、成熟し、プロセシングされたＮ’－末端を含有するので陽性対照として役立った。Ｆａｓｔａファイルを、ＢＬＡＳＴ検索からダウンロードし、Ｊａｌｖｉｅｗにロードした。配列の重複を、リストから除去した。最も可能性がある配列整列化を、Ｇ－ＩＮＳ－Ｉプリセットを用いてＭＡＦＦＴアルゴリズムを使用して算出し、整列化を、明らかなエラーについて検査した。整列化を、構造的に関連する部分の保存されている「ＷＶＶＩ」までの最初の１６４位まで次いで短縮し、保存のためにカラー化した。
【0141】
第２の工程において、これら関連する領域を、ＷｅｂＬｏｇｏオンラインツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）を使用して特定の残基の保存について分析した。
結果
サッカロミセス・セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図１）は、位置Ｒ－Ａ－Ｙ３２＜＞Ｇ３３に対して９３％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ３モチーフ（Ｒ－ｘ－Ｙ／ｘ＜＞Ｓ／Ａ／ｘ）を反映する（＜＞は、その位置で行われる切断を表す）。別のペプチダーゼ切断部位は、Ｎ８０／８１Ｅと推定される。この位置における切断は：Ｉ－Ｄ－Ｎ＜＞Ｅ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｄ．．．で切断する成熟ＦＣｂ２タンパク質配列をもたらすことになる。
結果
サッカロミセス・セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図１）は、位置Ｒ－Ａ－Ｙ３２＜＞Ｇ３３に対して９３％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ３モチーフ（Ｒ－ｘ－Ｙ／ｘ＜＞Ｓ／Ａ／ｘ）を反映する（＜＞は、その位置で行われる切断を表す）。別のペプチダーゼ切断部位は、Ｎ８０／８１Ｅと推定される。この位置における切断は：Ｉ－Ｄ－Ｎ＜＞Ｅ－Ｐ－Ｋ－Ｌ－Ｄ．．．で切断する成熟ＦＣｂ２タンパク質配列をもたらすことになる。
【0142】
Ｍｉｔｏｆａｔｅｓは、位置ＲＡ－Ｙ３２＜＞Ｇ３３で、９９．６％の信頼性で同じＭＰＰ（ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ）切断部位を認識した。追加のペプチダーゼ切断部位は、Ｍｉｔｏｆａｔｅｓによって全く予測されなかった。
クルイベロマイセス・マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図２）は、９２％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、これは、位置Ｒ－Ｙ３３＜＞Ｌ３４－Ｓに対してであり、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ２モチーフ（Ｒ－ｘ＜＞ｘ－Ｓ）を反映する。第２のペプチダーゼ切断部位が示されるが、定量化不能であった。
ウィカハモマイセス・アノマルス（ＷａＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図３）は、９２％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、これは、位置Ｑ－Ｒ－Ｆ２７＜＞Ｎ２８－Ｓに対してであり、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ２モチーフ（Ｒ－ｘ＜＞ｘ－Ｓ）を反映する。他のペプチダーゼ切断部位が示されるが、定量化不能であった。
カンジダ・グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図４）は、位置ＲＧ２９＜＞Ｉ３０に対して７８％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、Ｒ１０モチーフである可能性が高いＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断を反映する。他のペプチダーゼ切断部位は、見られない。
クルイベロマイセス・マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図２）は、９２％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、これは、位置Ｒ－Ｙ３３＜＞Ｌ３４－Ｓに対してであり、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ２モチーフ（Ｒ－ｘ＜＞ｘ－Ｓ）を反映する。第２のペプチダーゼ切断部位が示されるが、定量化不能であった。
ウィカハモマイセス・アノマルス（ＷａＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図３）は、９２％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、これは、位置Ｑ－Ｒ－Ｆ２７＜＞Ｎ２８－Ｓに対してであり、ＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断Ｒ２モチーフ（Ｒ－ｘ＜＞ｘ－Ｓ）を反映する。他のペプチダーゼ切断部位が示されるが、定量化不能であった。
カンジダ・グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）
ＴａｒｇｅｔＰ（図４）は、位置ＲＧ２９＜＞Ｉ３０に対して７８％の信頼性でミトコンドリア取り込みシグナル切断部位を認識し、Ｒ１０モチーフである可能性が高いＴＯＭ認識およびＭＰＰ切断を反映する。他のペプチダーゼ切断部位は、見られない。
【0143】
一般に、利用可能なツールが、ミトコンドリア取り込みの工程１に必要である古典的で標準的なＴＯＭ依存的ペプチダーゼ切断部位を検出しうることは明らかであった。加えて、ＳｃＦＣｂ２分析（図１）から分かるように、ＦＣｂ２関連位置にペプチダーゼ切断に対する指標があるように思われた。確認するために、公知のＦＣｂ２配列の詳細な配列整列化を実行した（図５Ａ、図５Ｂ）。
【0144】
保存されているＴＯＭ依存的ＭＰＰ切断部位は、図５Ｂ内で強調される整列化の６７位において良好な保存で同定され（図５において、位数は、それぞれの残基位置ではなく整列化の位置を示す）、これは、ＴａｒｇｅｔＰ予測の結果を裏付ける：ＭＰＰ Ｒ２モチーフ（Ｒ－ｘ＜＞ｘ－Ｓ）およびＲ３モチーフ（Ｒ－ｘ－Ｙ／ｘ＜＞Ｓ／Ａ／ｘ）。
【0145】
配列の良好な一致は、さらに下流の（図５Ａ）、ＦＣｂ２酵素の保存された構造領域（図５Ａ、１４３位以降）の直前にも見られた。潜在的（Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ）認識部位は、ＩＤＮ＜＞ＥＰＫＬＤとしてＳｃＦＣｂ２に反映される。ＳｃＦＣｂ２においてＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ認識部位は、保存されているＨｉｓ（整列化１５４位）から２５位上流の１２７～１２９位に位置する。
【0146】
１２７～１２９位の配列区間内に高度な保存が存在し：Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフを強調する（図６）。この区間は、二次プロセシングのためのこれまで不明であった認識配列を表すと予想される。
【0147】
ＳｃＦＣｂ２の結晶構造において、成熟Ｎ末端「ＥＰＬＫＤ．．．」は、この予測によく合致する。成熟した酵素の構造的に関連する部分は、さらに下流に位置すると予想される。なお、酵素の活性および安定性は、リーダー配列の部分による影響を受ける可能性があり、したがって、本明細書においてさらに試験された。
【0148】
図７における整列化から観察可能なように、ＦＣｂ２配列のＮ末端は、ＦＣｂ２酵素の選択されたセットに対して非常に不均質であるようにそれ自体を示す。なお、構造的に重要な領域の上流に、認識に関与する可能性があるおよそ５～１０残基のパターンがあるように見える。
【0149】
「Ｖ－ｘ－ｘ－Ｈ」は、構造部分の第１の保存部分であり、その領域の上流でヘムと相互作用し、アミノ酸の短い区間は、移行ペプチドペプチダーゼの認識に関与する可能性が高い。この部分は、酵母とより遠縁の子嚢菌配列中には存在しない。
【0150】
ＳｃＦＣｂ２の成熟したＮ末端は、ＥＰＫＬＤから始まり（ＰＤＢ：１ＦＣＢにおいて）、近縁の配列との類似点が、観察可能である。疎水性アミノ酸（Ｉ、Ｌ、Ｖ）、スペーサーおよびアスパラギンからなる認識モチーフがあるように見え、そのアスパラギンは、整列化においてＡ、Ｌで置換された場合もあった。
【0151】
推定認識モチーフ「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」の後では、荷電アミノ酸（Ｄ、Ｋ、Ｅ）が顕著であるように見えるが、明らかな相同性は同定されなかった（図６）。潜在的には、成熟したＮ末端は、そのすぐ後の残基から形成され、成熟酵素に対する構造的に関連する影響をすでに有する。
結論
成熟ＦＣｂ２タンパク質の構造的Ｎ末端は、一般によく保存されている。しかしながら、Ｎ末端の配列は、あまりよく保存されていないが、いくつかのモチーフが同定された：
－ 文献から予測されたＭＰＰモチーフＲ２／Ｒ３（ＴＯＭ取り込み）が、この研究における様々なＦＣｂ２バリアントに対して確認できた；および
－ 成熟タンパク質の構造的始まりの前に保存配列が同定され、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフと称された（また、本明細書において「ＴｒａｎｓＰ認識モチーフ」または単に「ＴｒａｎｓＰモチーフ」とさらに称される）。
結論
成熟ＦＣｂ２タンパク質の構造的Ｎ末端は、一般によく保存されている。しかしながら、Ｎ末端の配列は、あまりよく保存されていないが、いくつかのモチーフが同定された：
－ 文献から予測されたＭＰＰモチーフＲ２／Ｒ３（ＴＯＭ取り込み）が、この研究における様々なＦＣｂ２バリアントに対して確認できた；および
－ 成熟タンパク質の構造的始まりの前に保存配列が同定され、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフと称された（また、本明細書において「ＴｒａｎｓＰ認識モチーフ」または単に「ＴｒａｎｓＰモチーフ」とさらに称される）。
【0152】
同定されたＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフに基づいて、いくつかの発現プラスミドを、Ｓ．セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）、ウィカハモマイセス・アノマルス（ＷａＦＣｂ２）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（ＭａｘＦＣｂ２）、カンジダ・グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）、ナウモボジマ・カステリ（ＮａｃａＦＣｂ２）およびシベルリンドネラ・ファビアニイ（ＣｙｂｅｒＦＣｂ２）のＦＣｂ２バリアントに対して構築した。ＦＣｂ２バリアントをコードしている遺伝子配列は、異なる長さで推定のＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ認識モチーフまで短縮され、一部のバリアントは、Ｎ末端Ｈｉｓ－タグも備えた。
【0153】
実施例２
短縮された移行ペプチド配列を含むＦＣｂ２バリアントのスクリーニング
ＦＣｂ２バリアントの活性スクリーニングは、Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年によって公開されている最小培地、３つの育生ステージおよび遠心分離による培地交換を含むプロトコールを使用して成功した。産生株スクリーニングを、容積５００μＬで、９６ディープウェルプレート中で実行した。
短縮された移行ペプチド配列を含むＦＣｂ２バリアントのスクリーニング
ＦＣｂ２バリアントの活性スクリーニングは、Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年によって公開されている最小培地、３つの育生ステージおよび遠心分離による培地交換を含むプロトコールを使用して成功した。産生株スクリーニングを、容積５００μＬで、９６ディープウェルプレート中で実行した。
【0154】
異なる程度の短縮によって特徴付けられる以下の移行ペプチド（ＴｒａｎｓＰ）バリアントを、市販のＤＮＡ合成によって調製し、メタノール誘導可能な発現および選択用の抗生物質抵抗性遺伝子を利用して、Ｐ．パストリス コンピテント細胞にその後形質転換した（図８～図１０）：
－ １０ｘ ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｓｃ０２、Ｓｃ２２、Ｓｃ３３、Ｓｃ４２、Ｓｃ５２、Ｓｃ６２、Ｓｃ７２、Ｓｃ７７、Ｓｃ８２、Ｓｃ８６
－ １０ｘ ＷａＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｗａ０２、Ｗａ２２、Ｗａ２８、Ｗａ３７、Ｗａ４７、Ｗａ５７、Ｗａ６２、Ｗａ６７、Ｗａ７２、Ｗａ７４
－ １０ｘ ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｋｍ０２、Ｋｍ２２、Ｋｍ３４、Ｋｍ４２、Ｋｍ５２、Ｋｍ６２、Ｋｍ７２、Ｋｍ７７、Ｋｍ８２、Ｋｍ８７。
育生および発現
育生および発現をＫａｕｓｈｉｋら、２０２０年（Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年）による刊行物に提供される詳細なプロトコールに従って実施した。
細胞破壊
細胞破壊を、化学的タンパク質抽出試薬「Ｙ－Ｐｅｒ」を使用して実施し；破壊プロトコールは、供給元であるＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（７８９９１）による標準的な操作手順および提案される適合に基づく。
－ １０ｘ ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｓｃ０２、Ｓｃ２２、Ｓｃ３３、Ｓｃ４２、Ｓｃ５２、Ｓｃ６２、Ｓｃ７２、Ｓｃ７７、Ｓｃ８２、Ｓｃ８６
－ １０ｘ ＷａＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｗａ０２、Ｗａ２２、Ｗａ２８、Ｗａ３７、Ｗａ４７、Ｗａ５７、Ｗａ６２、Ｗａ６７、Ｗａ７２、Ｗａ７４
－ １０ｘ ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ：Ｋｍ０２、Ｋｍ２２、Ｋｍ３４、Ｋｍ４２、Ｋｍ５２、Ｋｍ６２、Ｋｍ７２、Ｋｍ７７、Ｋｍ８２、Ｋｍ８７。
育生および発現
育生および発現をＫａｕｓｈｉｋら、２０２０年（Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年）による刊行物に提供される詳細なプロトコールに従って実施した。
細胞破壊
細胞破壊を、化学的タンパク質抽出試薬「Ｙ－Ｐｅｒ」を使用して実施し；破壊プロトコールは、供給元であるＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（７８９９１）による標準的な操作手順および提案される適合に基づく。
【0155】
１．４０００ｒｃｆ、２０℃で１０分間、ディープウェルプレートを遠心分離する。
２．慎重に上清を除去する
３．ウェル当たり１５０μＬのＹ－ｐｅｒ酵母溶液を添加し、３４０ｒｐｍ、３３℃で３０分間撹拌する。蒸発を防止するために適切な蓋で閉じる。
２．慎重に上清を除去する
３．ウェル当たり１５０μＬのＹ－ｐｅｒ酵母溶液を添加し、３４０ｒｐｍ、３３℃で３０分間撹拌する。蒸発を防止するために適切な蓋で閉じる。
【0156】
４．ペレット化を助け、活性測定のために希釈するためにＰＢＳ緩衝液４５０μＬを添加する。
５．破片を、３０００ｒｃｆ、２０℃で１０分間ペレット化する。
５．破片を、３０００ｒｃｆ、２０℃で１０分間ペレット化する。
【0157】
６．ＣｙｔＣアッセイを使用する活性分析のために、上清２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移す。
ＣｙｔＣアッセイを使用する酵素活性測定
ＦＣｂ２バリアントの容積（上清容積当たり、ｍＬ）および比活性度（タンパク質量当たり、ｍｇ）の決定を、セロビオースデヒドロゲナーゼおよびグルコースについて同様に記述されているように５ｍＭ Ｌー乳酸を用いる確立されたＣｙｔＣアッセイを使用してプレートリーダー形式で実施した（Ｇｅｉｓｓ Ａ．Ｆ．ら、２０２１年）。
ＣｙｔＣアッセイを使用する酵素活性測定
ＦＣｂ２バリアントの容積（上清容積当たり、ｍＬ）および比活性度（タンパク質量当たり、ｍｇ）の決定を、セロビオースデヒドロゲナーゼおよびグルコースについて同様に記述されているように５ｍＭ Ｌー乳酸を用いる確立されたＣｙｔＣアッセイを使用してプレートリーダー形式で実施した（Ｇｅｉｓｓ Ａ．Ｆ．ら、２０２１年）。
【0158】
詳細には：酵素活性を、プレートリーダー構成で、５５０ｎｍでウマ心臓由来の８０μＭチトクロムｃの還元を追跡することによって決定した（ＣｙｔＣ、ε５５０ｎｍ＝１９．６ｍＭ－１ｃｍ－１、酵素係数＝０．９８）。酵素係数（ＥＦ）を使用して、２００μＬ規模構成における時間当たりの吸光度変化（Ａｂｓ分－１）の生測定値を、ＵｍＬ－１として表される容積活性に再計算した。アッセイ混合物を、標準的なＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液で緩衝し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で、それぞれの波長で、３０℃で３００秒間監視した。酵素試料が、非精製状態、すなわち粗抽出物または上清で存在した場合、活性は、％の最大活性と関連した。精製したＦＣｂ２バリアントのタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度によって決定した。理論的なモル吸収係数ε２８０ｎｍを、Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔ－Ｐａｒａｍ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）で算出した。
結果
ＴｒａｎｓＰ ＳｃＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
図８は、ＳｃＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｄ－Ｎ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物が、容積活性（収率）を増大させることを示す。測定は、高品質なものであり、標準偏差は合理的である。
結果
ＴｒａｎｓＰ ＳｃＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
図８は、ＳｃＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｄ－Ｎ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＳｃＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物が、容積活性（収率）を増大させることを示す。測定は、高品質なものであり、標準偏差は合理的である。
【0159】
「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」モチーフだけが移行ペプチドに残っている場合、最大活性（０．２３Ｕ／ｍＬ）はＳｃ７７に見られうる。これは、ＥＰＫＬＤがＮ末端を形成する天然のＳｃＦＣｂ２（１ＦＣＢ）の結晶構造と対照的である。
ＴｒａｎｓＰ ＫｍＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
ＫｍＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｑ－Ｎ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物も、容積活性（収率）を増大させる（図９）。ＳｃＦＣｂ２と類似して、ＴｒａｎｓＰ認識モチーフの「Ｉ－Ｑ－Ｎ」だけがＮ末端を形成する場合に、最大活性（１．７４Ｕ／ｍＬ）は、Ｋｍ７７に見られうる。
ＴｒａｎｓＰ ＫｍＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
ＫｍＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｑ－Ｎ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＫｍＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物も、容積活性（収率）を増大させる（図９）。ＳｃＦＣｂ２と類似して、ＴｒａｎｓＰ認識モチーフの「Ｉ－Ｑ－Ｎ」だけがＮ末端を形成する場合に、最大活性（１．７４Ｕ／ｍＬ）は、Ｋｍ７７に見られうる。
【0160】
全体として、活性は、ＳｃＦＣｂ２と比較しておよそ８倍高く、ＫｍＦＣｂ２で例外的な収率が明確になる。ＳｃＦＣｂ２とは対照的に、天然のＴｒａｎｓＰ構築物であるＫｍ０２については有意な活性を見ることはできなかった（最大３％）。
ＴｒａｎｓＰ ＷａＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
ＷａＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｓ－Ａ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＷａＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物も、容積活性（収率）を増大させる（図１０）。「Ｉ－ｘ－Ｎ」の部分だけがＮ末端を形成する場合、最大活性（２．１２Ｕ／ｍＬ）は、Ｗａ７２に見られうる。
ＴｒａｎｓＰ ＷａＦＣｂ２（Ｈｉｓなし）
ＷａＦＣｂ２では配列「Ｉ－Ｓ－Ａ」のものであるＴｒａｎｓＰ認識モチーフに達するまで、ＷａＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ構築物も、容積活性（収率）を増大させる（図１０）。「Ｉ－ｘ－Ｎ」の部分だけがＮ末端を形成する場合、最大活性（２．１２Ｕ／ｍＬ）は、Ｗａ７２に見られうる。
【0161】
全体の活性は、ＳｃＦＣｂ２と比較しておよそ１０倍高い。ＫｍＦＣｂ２と類似して、およびＳｃＦＣｂ２とは対照的に、天然のＴｒａｎｓＰでは僅かな活性しか見ることができなかった（１３％のみ）。
結論
９６ディープウェルプレートおよび最小培地を利用するこれまでに試験され、適合されたスクリーニングプロトコール（Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年）を利用して、ＦＣｂ２ ＴＲａｎｓＰバリアントをスクリーニングした。一般に、結果の混合スペクトルが、天然のＴｒａｎｓＰ構築物に対して得られた：
－ ＴｒａｎｓＰ配列を含む天然のＫｍＦＣｂ２の場合、いかなる活性も生むことはできなかった（３％）
－ ＴＲａｎｓＰ配列を含む天然のＷａＦＣｂ２の場合、僅かな活性を得た（１３％）
－ ＴｒａｎｓＰ配列を含む天然のＳｃＦＣｂ２の場合、有意な活性が報告される（７９％）
部分的短縮がある配列は、良好な結果を生まず、特定の配列の特徴が、適当なプロセシングまたは発現を妨げる可能性が高いと思われる。
結論
９６ディープウェルプレートおよび最小培地を利用するこれまでに試験され、適合されたスクリーニングプロトコール（Ｋａｕｓｈｉｋら、２０２０年）を利用して、ＦＣｂ２ ＴＲａｎｓＰバリアントをスクリーニングした。一般に、結果の混合スペクトルが、天然のＴｒａｎｓＰ構築物に対して得られた：
－ ＴｒａｎｓＰ配列を含む天然のＫｍＦＣｂ２の場合、いかなる活性も生むことはできなかった（３％）
－ ＴＲａｎｓＰ配列を含む天然のＷａＦＣｂ２の場合、僅かな活性を得た（１３％）
－ ＴｒａｎｓＰ配列を含む天然のＳｃＦＣｂ２の場合、有意な活性が報告される（７９％）
部分的短縮がある配列は、良好な結果を生まず、特定の配列の特徴が、適当なプロセシングまたは発現を妨げる可能性が高いと思われる。
【0162】
ＴｒａｎｓＰモチーフ「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」の予測は正確であり、Ｐ．パストリス発現プラットフォームにおけるＦＣｂ２の活性および収率に対するその影響が内在する。
【0163】
データは、高収率および発現の成功を容易にするために全ての移行ペプチドを除去する必要はないが、その前にある配列は良好な成績を妨害することを示唆する。移行ペプチドが「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」モチーフまで除去された配列は、３つ全てのバリアント、ＫｍＦＣｂ２、ＷａＦＣｂ２およびＳｃＦＣｂ２で最良に機能した。
【0164】
ＳｃＦＣｂ２の場合、所与の構成において最も高い容積活性（図８）は、「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」、前記モチーフのすぐ上流に１アミノ酸およびＮ末端Ｍｅｔを保有するＳｃ７７で示された。全体で、Ｓｃ７７のシグナルペプチドは、５アミノ酸を有する（配列「ＥＰＫＬＤ」は、本明細書の他の場所に記述される成熟Ｎ末端である）。
【0165】
ＫｍＦＣｂ２の場合、所与の構成において最も高い活性（図９）は、「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」、前記モチーフのすぐ上流に２アミノ酸およびＮ末端Ｍｅｔを保有するＫｍ７７で示された。全体で、Ｋｍ７７のシグナルペプチドは、６アミノ酸を有する（配列「ＡＴＫＥＥ」は、本明細書の他の場所に記述される成熟Ｎ末端である）。
【0166】
ＷａＦＣｂ２の場合、所与の構成において最も高い活性（図１０）は、「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」の短縮された形態＋Ｎ末端Ｍｅｔを保有するＷａ７２で示された。全体で、Ｗａ７２のシグナルペプチドは、３アミノ酸を有する（配列「ＤＶＰＨ」は、図７において本明細書に示される成熟Ｎ末端である）。
【0167】
ＳｃＦＣｂ２およびＫｍＦＣｂ２の場合、天然のシグナルペプチドのアミノ酸７７までの短縮が、最も高い容積活性をもたらした。ＷａＦＣｂ２において、天然のシグナルペプチドのアミノ酸７２までの短縮が、最も高い容積活性をもたらした。「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」モチーフを含めた全ての移行ペプチドが除去された配列も、よく機能し、高収率および発現の成功を示した。
【0168】
「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」モチーフの上流にある天然のシグナルペプチドの配列が、天然のシグナルペプチドを９アミノ酸より多く含む場合、容積活性はかなり低下する。図８に示すように、Ｓｃ２２、Ｓｃ３３、Ｓｃ４２、Ｓｃ５２およびＳｃ６２の容積活性は、非常に低い。したがって、図９に示すように、Ｋｍ０２、Ｋｍ２２、Ｋｍ３４、Ｋｍ４２、Ｋｍ５２およびＫｍ６２の容積活性も、非常に低い。そして最終的に、配列Ｗａ０２、Ｗａ２２、Ｗａ２８、Ｗａ３７、Ｗａ４７およびＷａ５７も、非常に低い容積活性を示す（図１０）。
【0169】
結果は、特定の短縮パターンのシグナル配列だけが、相当な収率／容積活性で機能的に発現されるＦＣｂ２をもたらすことを示す。
サッカロミセス・セレビシエの新生チトクロムＣ（ＣｙｔＣ）は、ヘム補因子を欠いているアポ酵素であり、ＣｙｔＣは、ミトコンドリア膜間隙（ＩＭＳ）に到達した後にヘムを結合させる専用のリアーゼ酵素と相互作用することによってのみ活性化されるとＤｉｅｋｅｒｔ Ｋ．ら（２００１年）によって特に報告されたので、細胞質ゾルにおいて機能的に活性なＦＣｂ２を発現させることが全く可能であることは、驚きであった。酵母においてＣｙｔＣとＦＣｂ２には複数の一致点が存在し：それらは、Ｎ末端マトリックス標的化シグナルおよびＣ末端疎水性区間からなる２部構成の先行配列を含む類似のリーダー配列構造を共有しており、両方とも非共有結合性ヘム補因子を有し、両方ともミトコンドリア膜間隙に存在し、両方とも呼吸器鎖の一部である。ＣｙｔＣとＦＣｂ２の両方とも、非共有結合ヘム補因子に依存的なので、ＦＣｂ２が、触媒活性を活性化するにはＩＭＳに位置する支持酵素の作用も必要であろうことが仮定されよう。ミトコンドリアの外側におけるＦＣｂ２活性は報告されておらず、細胞質ゾルにおけるＦＣｂ２の存在も、これまで報告されなかった。したがって、ミトコンドリア膜間隙内に位置しない機能的に活性なＦＣｂ２の発現は、予測不能であり、驚きであった。ＦＣｂ２が、ミトコンドリア膜間隙における活性化を必要とせず、ＦＣｂ２が、細胞質ゾルにおいて全く活性であることは、驚きであった。
サッカロミセス・セレビシエの新生チトクロムＣ（ＣｙｔＣ）は、ヘム補因子を欠いているアポ酵素であり、ＣｙｔＣは、ミトコンドリア膜間隙（ＩＭＳ）に到達した後にヘムを結合させる専用のリアーゼ酵素と相互作用することによってのみ活性化されるとＤｉｅｋｅｒｔ Ｋ．ら（２００１年）によって特に報告されたので、細胞質ゾルにおいて機能的に活性なＦＣｂ２を発現させることが全く可能であることは、驚きであった。酵母においてＣｙｔＣとＦＣｂ２には複数の一致点が存在し：それらは、Ｎ末端マトリックス標的化シグナルおよびＣ末端疎水性区間からなる２部構成の先行配列を含む類似のリーダー配列構造を共有しており、両方とも非共有結合性ヘム補因子を有し、両方ともミトコンドリア膜間隙に存在し、両方とも呼吸器鎖の一部である。ＣｙｔＣとＦＣｂ２の両方とも、非共有結合ヘム補因子に依存的なので、ＦＣｂ２が、触媒活性を活性化するにはＩＭＳに位置する支持酵素の作用も必要であろうことが仮定されよう。ミトコンドリアの外側におけるＦＣｂ２活性は報告されておらず、細胞質ゾルにおけるＦＣｂ２の存在も、これまで報告されなかった。したがって、ミトコンドリア膜間隙内に位置しない機能的に活性なＦＣｂ２の発現は、予測不能であり、驚きであった。ＦＣｂ２が、ミトコンドリア膜間隙における活性化を必要とせず、ＦＣｂ２が、細胞質ゾルにおいて全く活性であることは、驚きであった。
【0170】
シグナルペプチドの特定の短縮により、ＦＣｂ２のＮ末端は、異なるプロセシングを受け、本明細書で発現されるＦＣｂ２のＮ末端は、酵母細胞において天然に発現されるＦＣｂ２と同一ではない。本明細書に示されるように、ＦＣｂ２は、Ｎ末端でＭｅｔ、その後に成熟ＦＣｂ２配列を有するか、または別法としてＭｅｔ、その後に短縮された天然のシグナルペプチドを有する。一般に、タンパク質のＮ末端の人工的な修飾は、タンパク質の機能に対して有害な効果を有する場合がある。例えば、Ｐｅｔｒｏｖｉｃら（２０１８年）によって報告されたように、酵素、溶解性多糖オキシゲナーゼは、その活性に不可欠であるＮ末端メチル化メチオニンを保有する。本発明によるＦＣｂ２が、その成熟Ｎ末端の修飾にもかかわらず、人工メチオニンを付加するだけで活性であることは、驚きであった。また、定義されたＮ末端の前提条件とも一致して、ＦＣｂ２のシグナル配列の本明細書に提供される短縮の効果は、本発明の定義された短縮に限定され、より長いシグナル配列は、ＦＣｂ２の急速な機能喪失をもたらす。
【0171】
プロセスの多くのステージにおいて変性、分解または制御された崩壊が起こる可能性があるので、タンパク質のシグナルペプチドを改変することによる本明細書に示されるＦＣｂ２の場合のような翻訳後移行プロセスの人工的修飾は、活性の喪失をもたらす可能性がある。一般に、成熟ミトコンドリア膜間隙タンパク質の発現は、小胞体（ＥＲ）、細胞質ゾル、ミトコンドリアマトリックス、ミトコンドリア膜間隙の経路を通る無傷で安定なプレバージョンの存在を常に利用し、後に切断されたシグナル配列と後の「成熟」タンパク質の残りとの相互作用も利用する。
【0172】
Ｂｅａｓｌｅｙら（１９９３年）に記載の通り、ＦＣｂ２のシグナル配列は、２部構成であり、シグナルペプチドのＮ末端領域は、マトリックス標的化シグナルとしてミトコンドリアマトリックス内への移行に関与する。シグナルペプチドのＣ末端領域は、膜間隙への選別に必要である。Ｓ．セレビシエＦＣｂ２の特定の例において、Ｎ末端マトリックス標的化シグナルは、配列番号３に示す天然の全長シグナル配列のアミノ酸１～３２を含み、膜間隙内へ選別するためのシグナルペプチドは、配列番号３に示される天然のシグナル配列のアミノ酸３３～８０を含む。細胞質ゾルにおける機能的ＦＣｂ２の発現が、一般に全く可能であることはすでに驚きであったが、シグナルペプチドの２部構成の性質を考慮すると、この機能的発現が、マトリックス標的化シグナルを欠失させるだけでは不可能であったことは、なおさらに驚きであった。その代わり、データは、シグナルペプチドのさらなる短縮が必要であることを明らかに示す。ＦＣｂ２のマトリックス標的化シグナルの欠失により、ミトコンドリアマトリックス内への移行のためのシグナルがもはや存在しないので、これらＦＣｂ２は、細胞質ゾル内にとどまらなければならないが、このマトリックス標的化シグナルにだけ短縮を含むＦＣｂ２に対する活性は、見られないまたは僅かしか見られなかった。本明細書に示されたＦＣｂ２の特定の短縮されたシグナルペプチドを使用して、機能的ＦＣｂ２を細胞質ゾル内で発現させることができた。
【0173】
本発見は、本明細書に示す短縮されたシグナルペプチドのようにより長いシグナルペプチド配列を持つＦＣｂ２配列が、細胞質ゾルにおいて機能的に活性でないことを示す。本発明の特定の短縮パターンは、天然のシグナル配列の配列部分が、将来活性なＦＣｂ２と不活性なＦＣｂ２とを区別することを可能にする指針を示す。
【0174】
要約すると、ＴｒａｎｓＰモチーフ「Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌ」までまたはそれを含めたＦＣｂ２配列のＮ末端の短縮は、発現速度、活性および収率を有意に増大させる。
この効果は、異なる生物：Ｓ．セレビシエ、Ｋ．マルキシアヌスおよびＷ．アノマルス由来の３種の異なるＦＣｂ２配列について示された。以下の実施例３および実施例４において、実施例２のこれら発見および本明細書に提供されるシグナルペプチドの短縮を使用して、他の生物のＦＣｂ２の細胞質ゾルにおける機能的発現を予測できることが示される。
この効果は、異なる生物：Ｓ．セレビシエ、Ｋ．マルキシアヌスおよびＷ．アノマルス由来の３種の異なるＦＣｂ２配列について示された。以下の実施例３および実施例４において、実施例２のこれら発見および本明細書に提供されるシグナルペプチドの短縮を使用して、他の生物のＦＣｂ２の細胞質ゾルにおける機能的発現を予測できることが示される。
【0175】
実施例３
Ｈｉｓタグ付きＦＣｂ２バリアントの発現
この例は、生産プロセス（発現および精製）の結果ならびにＳ．セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）、Ｋ．マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）、Ｗ．アノマルス（ＷａＦＣｂ２）およびＣ．グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）由来ＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物の特徴付けを要約し、評価する。全て、Ｎ末端Ｈｉｓ８－タグおよび異なる３つの長さのｔｒａｎｓＰ配列を含有する。バリアントを、市販のＤＮＡ合成によって調製し、メタノール誘導可能な発現および選択用の抗生物質抵抗性遺伝子を利用して、Ｐ．パストリス コンピテント細胞にその後形質転換した：
－ ＴｒａｎｓＰ、全長＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ０２－Ｈｉｓ（配列番号１７）
Ｋｍ０２－Ｈｉｓ（配列番号１８）
Ｗａ０２－Ｈｉｓ（配列番号１９）
Ｃａｎｇ０２－Ｈｉｓ（配列番号２０）
－ ＴｒａｎｓＰ、－ＭＰＰ＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ３３－Ｈｉｓ（配列番号２１）
Ｋｍ３４／Ｈｉｓ（配列番号２２）
Ｗａ２８／Ｈｉｓ（配列番号２３）
－ ＴｒａｎｓＰ、陰性＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ８２／Ｈｉｓ（配列番号２４）
Ｋｍ８２／Ｈｉｓ（配列番号２５）
Ｗａ７４／Ｈｉｓ（配列番号２６）
Ｃａｎｇ８０／Ｈｉｓ（配列番号２７）
育生、細胞破壊および精製
細胞の成長および酵素発現の誘導を、Ｇｅｉｓｓら、２０２１年による刊行物に記述されているように実施し、僅かに変更した。育生ステージ後、培養液６００ｍＬから細胞ペレットおよそ１３ｇを得て、外部圧力１５００バールで操作する３０ｍＬフレンチプレス細胞ホモジナイザーを使用して、４サイクルで細胞破壊に供した。そのように発生した細胞残屑を、１００００ｒｃｆで３０分間遠心分離し、上清を得、粗抽出物を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）戦略を基本的に使用して、刊行物に記述されているように精製した。
ＣｙｔＣアッセイを使用する酵素活性測定
容積（上清容積当たり、ｍＬ）および比活性度（タンパク質量当たり、ｍｇ）の決定を、セロビオースデヒドロゲナーゼおよびグルコースについて同様に記述されているように５ｍＭ Ｌー乳酸を用いる確立されたＣｙｔＣアッセイを使用してプレートリーダー形式で実施した（Ｇｅｉｓｓ Ａ．Ｆ．ら、２０２１年）。詳細には：酵素活性を、プレートリーダー構成で、５５０ｎｍでウマ心臓由来の８０μＭチトクロムｃの還元を追跡することによって決定した（ＣｙｔＣ、ε５５０ｎｍ＝１９．６ｍＭ－１ｃｍ－１、酵素係数＝０．９８）。酵素係数（ＥＦ）を使用して、２００μＬ規模構成における時間当たりの吸光度変化（Ａｂｓ分－１）の生測定値を、ＵｍＬ－１として表される容積活性に再計算した。アッセイ混合物を、標準的なＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液で緩衝し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で、それぞれの波長で、３０℃で３００秒間監視した。精製したＦＣｂ２バリアントのタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度によって決定した。理論的なモル吸収係数ε２８０ｎｍを、Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔ－Ｐａｒａｍ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）で算出した。
純度
精製したＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物のＳＤＳ ＰＡＧＥを実施した：
－ 全ての試料を、無菌ｈｑ水中におよそ０．４ｍｇ／ｍＬに希釈した
－ 希釈した酵素試料１０μＬを、９９℃で５分間加熱した２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液１０μＬと混合し、次いで氷上に５分間置いた
－ 試料１４μＬを、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＥＴＡＮ ＴＧＸゲルポケットにロードした
－ Ｐｒｅｓｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）５μＬを参照とした
－ ゲルを、９０Ｖで５分間、次いで１５０Ｖでおよそ５０分間流す
－ タンパク質バンドの可視化を、紫外線照明で実現した
結果
全てのＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物の発現および精製プロセスの結果を、表１に要約する。
Ｈｉｓタグ付きＦＣｂ２バリアントの発現
この例は、生産プロセス（発現および精製）の結果ならびにＳ．セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）、Ｋ．マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）、Ｗ．アノマルス（ＷａＦＣｂ２）およびＣ．グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）由来ＦＣｂ２ ＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物の特徴付けを要約し、評価する。全て、Ｎ末端Ｈｉｓ８－タグおよび異なる３つの長さのｔｒａｎｓＰ配列を含有する。バリアントを、市販のＤＮＡ合成によって調製し、メタノール誘導可能な発現および選択用の抗生物質抵抗性遺伝子を利用して、Ｐ．パストリス コンピテント細胞にその後形質転換した：
－ ＴｒａｎｓＰ、全長＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ０２－Ｈｉｓ（配列番号１７）
Ｋｍ０２－Ｈｉｓ（配列番号１８）
Ｗａ０２－Ｈｉｓ（配列番号１９）
Ｃａｎｇ０２－Ｈｉｓ（配列番号２０）
－ ＴｒａｎｓＰ、－ＭＰＰ＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ３３－Ｈｉｓ（配列番号２１）
Ｋｍ３４／Ｈｉｓ（配列番号２２）
Ｗａ２８／Ｈｉｓ（配列番号２３）
－ ＴｒａｎｓＰ、陰性＋Ｈｉｓ：
Ｓｃ８２／Ｈｉｓ（配列番号２４）
Ｋｍ８２／Ｈｉｓ（配列番号２５）
Ｗａ７４／Ｈｉｓ（配列番号２６）
Ｃａｎｇ８０／Ｈｉｓ（配列番号２７）
育生、細胞破壊および精製
細胞の成長および酵素発現の誘導を、Ｇｅｉｓｓら、２０２１年による刊行物に記述されているように実施し、僅かに変更した。育生ステージ後、培養液６００ｍＬから細胞ペレットおよそ１３ｇを得て、外部圧力１５００バールで操作する３０ｍＬフレンチプレス細胞ホモジナイザーを使用して、４サイクルで細胞破壊に供した。そのように発生した細胞残屑を、１００００ｒｃｆで３０分間遠心分離し、上清を得、粗抽出物を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）戦略を基本的に使用して、刊行物に記述されているように精製した。
ＣｙｔＣアッセイを使用する酵素活性測定
容積（上清容積当たり、ｍＬ）および比活性度（タンパク質量当たり、ｍｇ）の決定を、セロビオースデヒドロゲナーゼおよびグルコースについて同様に記述されているように５ｍＭ Ｌー乳酸を用いる確立されたＣｙｔＣアッセイを使用してプレートリーダー形式で実施した（Ｇｅｉｓｓ Ａ．Ｆ．ら、２０２１年）。詳細には：酵素活性を、プレートリーダー構成で、５５０ｎｍでウマ心臓由来の８０μＭチトクロムｃの還元を追跡することによって決定した（ＣｙｔＣ、ε５５０ｎｍ＝１９．６ｍＭ－１ｃｍ－１、酵素係数＝０．９８）。酵素係数（ＥＦ）を使用して、２００μＬ規模構成における時間当たりの吸光度変化（Ａｂｓ分－１）の生測定値を、ＵｍＬ－１として表される容積活性に再計算した。アッセイ混合物を、標準的なＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝液で緩衝し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で、それぞれの波長で、３０℃で３００秒間監視した。精製したＦＣｂ２バリアントのタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度によって決定した。理論的なモル吸収係数ε２８０ｎｍを、Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔ－Ｐａｒａｍ（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）で算出した。
純度
精製したＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物のＳＤＳ ＰＡＧＥを実施した：
－ 全ての試料を、無菌ｈｑ水中におよそ０．４ｍｇ／ｍＬに希釈した
－ 希釈した酵素試料１０μＬを、９９℃で５分間加熱した２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液１０μＬと混合し、次いで氷上に５分間置いた
－ 試料１４μＬを、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＥＴＡＮ ＴＧＸゲルポケットにロードした
－ Ｐｒｅｓｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）５μＬを参照とした
－ ゲルを、９０Ｖで５分間、次いで１５０Ｖでおよそ５０分間流す
－ タンパク質バンドの可視化を、紫外線照明で実現した
結果
全てのＴｒａｎｓＰ－Ｈｉｓ構築物の発現および精製プロセスの結果を、表１に要約する。
【0176】
【表1】
【0177】
要約すると、表１および図１１Ａ／Ｂ／Ｃは、４つ全てのＨｉｓタグ付きバリアント（ＳｃＦＣｂ２、ＫｍＦＣｂ２、ＷａＦＣｂ２およびＣａｎｇＦＣｂ２）を示す：移行ペプチド配列が短いほど、発現および精製収率は高くなり、比活性度ならびにヘム補因子の吸光度によるＦＣｂ２酵素のスペクトル純度の指標となるＲＺ値（Ａ４１２ｎｍ／Ａ２７６ｎｍ）が高くなる。
Ｓ．セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｓｃ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：Ｈｉｓタグ付きＳｃＦＣｂ２は、全長移行ペプチドを含む場合、発現させることができなかった。酵素を得ることはできなかった。
Ｓ．セレビシエ（ＳｃＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｓｃ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：Ｈｉｓタグ付きＳｃＦＣｂ２は、全長移行ペプチドを含む場合、発現させることができなかった。酵素を得ることはできなかった。
【0178】
ＴｒａｎｓＰ Ｓｃ３３－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：トランスＰ－ＭＰＰおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＳｃＦＣｂ２を発現させ、ＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった。
【0179】
－ ０．０１９Ｕおよび０．０６ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：０．３４％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：酵素の不純物または分解産物を示す
＞純粋なまたは完全に発現された酵素は得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｓｃ８２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＳｃＦＣｂ２を発現させ、ＩＭＡＣによって成功裏に精製することができた
－ ８．６Ｕおよび０．３４ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１０９％）
－ 比活性度：２５．７Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．３４
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａの強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
実施例２に示すように、全長ＳｃＦＣｂ２（全ての移行ペプチドを含む）を発現させることができた。しかしながら、Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを付加した場合、全長ＳｃＦＣｂ２はもはや発現されない。この実施例に示すように、移行ペプチドを欠失させた場合、完全に活性なＨｉｓタグ付きＳｃＦＣｂ２を成功裏に発現させ、精製することができる。
Ｋ．マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＫｍＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ０．３７Ｕおよび０．１５ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：３％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ６０ｋＤａのバンド、しかし一部の不純物もある（図１１Ｃ）
＞純粋でなく、あまり活性がない酵素が、得られた
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ３４－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：トランスＰ－ＭＰＰおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有する、ＫｍＦＣｂ２を発現させることはできたが、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ７．４Ｕおよび０．８６ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１５％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ６０ｋＤａの強いバンドを示す（図１１Ｃ）
＞純粋な酵素を得たが、活性低下を示す
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ８２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＫｍＦＣｂ２を、成功裏に発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって精製した
－ ２４０Ｕおよび５ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１５３％）
－ 比活性度：４７．４Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：１．５６
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
Ｗ．アノマルス（ＷａＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＷａＦＣｂ２を発現させることはできなかった、さらに使用したプロトコールに従って精製できなかった
＞いかなる酵素も得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ２８－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：トランスＰ－ＭＰＰおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有する、ＷａＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ０．０４Ｕおよび０．０３ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：０．４％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：不純物または分解産物を示す（図１１Ｃ）
＞純粋なまたは完全に発現された酵素は得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ７４－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＷａＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって精製できた
－ ８．３Ｕおよび０．２１ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：３７％）
－ 比活性度：１７．５Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．５２
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
Ｃ．グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｃａｎｇ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＣａｎｇＦＣｂ２を発現させることはできなかった、さらに使用したプロトコールに従って精製できなかった
→いかなる酵素も得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｃａｎｇ８０－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＣａｎｇＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって成功裏に精製できた
－ ６７Ｕおよび１．３ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：６７％）
－ 比活性度：５３Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．４５
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
→完全に発現させ、活性な酵素を得た
結論
ＦＣｂ２の発現および精製収率（および比活性度）に対するＮ末端配列の明確な効果が示される：
ＴｒａｎｓＰ、全長＋Ｈｉｓ（Ｓｃ０２、Ｋｍ０２、Ｗａ０２、Ｃａｎｇ０２）：ＦＣｂ２を完全に発現させることはできず、したがってＩＭＡＣによってさらに精製することはできなかった。
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：酵素の不純物または分解産物を示す
＞純粋なまたは完全に発現された酵素は得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｓｃ８２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＳｃＦＣｂ２を発現させ、ＩＭＡＣによって成功裏に精製することができた
－ ８．６Ｕおよび０．３４ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１０９％）
－ 比活性度：２５．７Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．３４
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａの強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
実施例２に示すように、全長ＳｃＦＣｂ２（全ての移行ペプチドを含む）を発現させることができた。しかしながら、Ｎ末端Ｈｉｓ－タグを付加した場合、全長ＳｃＦＣｂ２はもはや発現されない。この実施例に示すように、移行ペプチドを欠失させた場合、完全に活性なＨｉｓタグ付きＳｃＦＣｂ２を成功裏に発現させ、精製することができる。
Ｋ．マルキシアヌス（ＫｍＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＫｍＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ０．３７Ｕおよび０．１５ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：３％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ６０ｋＤａのバンド、しかし一部の不純物もある（図１１Ｃ）
＞純粋でなく、あまり活性がない酵素が、得られた
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ３４－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：トランスＰ－ＭＰＰおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有する、ＫｍＦＣｂ２を発現させることはできたが、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ７．４Ｕおよび０．８６ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１５％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ６０ｋＤａの強いバンドを示す（図１１Ｃ）
＞純粋な酵素を得たが、活性低下を示す
ＴｒａｎｓＰ Ｋｍ８２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＫｍＦＣｂ２を、成功裏に発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって精製した
－ ２４０Ｕおよび５ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：１５３％）
－ 比活性度：４７．４Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：１．５６
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
Ｗ．アノマルス（ＷａＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＷａＦＣｂ２を発現させることはできなかった、さらに使用したプロトコールに従って精製できなかった
＞いかなる酵素も得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ２８－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：トランスＰ－ＭＰＰおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有する、ＷａＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって十分に精製することができなかった
－ ０．０４Ｕおよび０．０３ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：０．４％）
－ Ｃｙｔｃによる比活性度の減少；ＲＺ値の減少
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：不純物または分解産物を示す（図１１Ｃ）
＞純粋なまたは完全に発現された酵素は得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｗａ７４－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＷａＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって精製できた
－ ８．３Ｕおよび０．２１ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：３７％）
－ 比活性度：１７．５Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．５２
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
＞完全に発現させ、活性な酵素を得た
Ｃ．グラブラータ（ＣａｎｇＦＣｂ２）
ＴｒａｎｓＰ Ｃａｎｇ０２－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：完全な移行ペプチドおよび追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含み、ＣａｎｇＦＣｂ２を発現させることはできなかった、さらに使用したプロトコールに従って精製できなかった
→いかなる酵素も得られなかった
ＴｒａｎｓＰ Ｃａｎｇ８０－Ｈｉｓ ＦＣｂ２：移行ペプチドを含有しないが、追加のＮ末端Ｈｉｓ８－タグを含有し、ＣａｎｇＦＣｂ２を発現させ、使用したプロトコールに従ってＩＭＡＣによって成功裏に精製できた
－ ６７Ｕおよび１．３ｍｇ酵素／ｇ細胞ペレット（精製収率：６７％）
－ 比活性度：５３Ｕ／ｍｇ；ＲＺ値：１．４５
－ ＳＤＳ ＰＡＧＥ：およそ５８ｋＤａに強いバンドが示される（図１１Ｃ）
→完全に発現させ、活性な酵素を得た
結論
ＦＣｂ２の発現および精製収率（および比活性度）に対するＮ末端配列の明確な効果が示される：
ＴｒａｎｓＰ、全長＋Ｈｉｓ（Ｓｃ０２、Ｋｍ０２、Ｗａ０２、Ｃａｎｇ０２）：ＦＣｂ２を完全に発現させることはできず、したがってＩＭＡＣによってさらに精製することはできなかった。
【0180】
ＴｒａｎｓＰ、－ＭＰＰ＋Ｈｉｓ（Ｓｃ３３、Ｋｍ３４、Ｗａ２８）：ＦＣｂ２を十分に発現させることはできず、低下した比活性度および異なるＲＺ値でＩＭＡＣによって精製する。
【0181】
ＴｒａｎｓＰ、陰性＋Ｈｉｓ（Ｓｃ８２、Ｋｍ８２、Ｗａ７４、Ｃａｎｇ８０）：ＦＣｂ２を成功裏に発現させ、ＩＭＡＣによって精製することができた。
さらに、本発明によるシグナルペプチドの短縮を含むＣａｎｇ８０を、細胞ペレット中で高い活性および収率で機能的に発現させることができたので、実施例２の短縮されたシグナルペプチドに関連する発見を使用して、細胞質ゾルにおけるＦＣｂ２の機能的発現を予測できることが示される（図１１）。
さらに、本発明によるシグナルペプチドの短縮を含むＣａｎｇ８０を、細胞ペレット中で高い活性および収率で機能的に発現させることができたので、実施例２の短縮されたシグナルペプチドに関連する発見を使用して、細胞質ゾルにおけるＦＣｂ２の機能的発現を予測できることが示される（図１１）。
【0182】
実施例４
短縮された移行ペプチド配列を含む新たなＦＣｂ２構築物の収率および生化学的性質
新たなＦＣｂ２配列の選択は、系統発生的関係のバイオインフォマティクス分析および利用可能なオンラインツール：ＢｌａｓｔＰ（配列検索、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＮＧＰｈｙｌｏｇｅｎｙ（系統発生、ｈｔｔｐｓ：／／ｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒ／）、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（構造予測、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）およびＳＣｏｏＰ（安定性予測、ｈｔｔｐ：／／ｂａｂｙｌｏｎｅ．ｕｌｂ．ａｃ．ｂｅ／ＳＣｏｏＰ）を使用する熱安定性の予測に基づいた。発現構築物を、実施例３におけるこれまでの知見に従って設計し、天然のＮ末端を、保存されているＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまで短縮し、Ｈｉｓ８－タグを、最初のメチオニンの後に付加した。
短縮された移行ペプチド配列を含む新たなＦＣｂ２構築物の収率および生化学的性質
新たなＦＣｂ２配列の選択は、系統発生的関係のバイオインフォマティクス分析および利用可能なオンラインツール：ＢｌａｓｔＰ（配列検索、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＮＧＰｈｙｌｏｇｅｎｙ（系統発生、ｈｔｔｐｓ：／／ｎｇｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒ／）、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（構造予測、ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）およびＳＣｏｏＰ（安定性予測、ｈｔｔｐ：／／ｂａｂｙｌｏｎｅ．ｕｌｂ．ａｃ．ｂｅ／ＳＣｏｏＰ）を使用する熱安定性の予測に基づいた。発現構築物を、実施例３におけるこれまでの知見に従って設計し、天然のＮ末端を、保存されているＩ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまで短縮し、Ｈｉｓ８－タグを、最初のメチオニンの後に付加した。
【0183】
バリアントの細胞内発現を、振盪フラスコ形式で再び実施し、得られた細胞ペレットを、細胞破壊および実施例３に記述されるＩＭＡＣによる精製の前に冷凍貯蔵した。バリアントを、実施例３に記述されるプロセスと同様に分析した。
【0184】
この例は、Ｉ／Ｌ／Ｖ－ｘ－Ｎ／Ａ／Ｌモチーフまで短縮されたシグナル配列を含む新たなＦＣｂ２バリアントの結果（発現、精製および生化学的特徴付け）を要約する。
－ ウィカハモマイセス・アノマルスＦＣｂ２（ＷａＦＣｂ２、配列番号２８）
－ クリベロマイセス・マルキシアヌスＦＣｂ２（ＫｍＦＣｂ２、配列番号２９）
－ キャンディアグラブラータＦＣｂ２（ＣａｎｇＦＣｂ２、配列番号３０）
－ シベルリンドネラ・ファビアニイＦＣｂ２（ＣｙｂｅｒＦＣｂ２、配列番号３１）
－ ナウモボジマ・カステリＦＣｂ２（ＮａｃａＦＣｂ２、配列番号３２）
結果
新たなＦＣｂ２バリアント全ての収率および生化学的特徴付けの結果を、表２に要約する：［ＷａＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号２８；ＫｍＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号２９；ＣａｎｇＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３０；ＣｙｂｅｒＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３１；ＮａｃａＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３２］
－ ウィカハモマイセス・アノマルスＦＣｂ２（ＷａＦＣｂ２、配列番号２８）
－ クリベロマイセス・マルキシアヌスＦＣｂ２（ＫｍＦＣｂ２、配列番号２９）
－ キャンディアグラブラータＦＣｂ２（ＣａｎｇＦＣｂ２、配列番号３０）
－ シベルリンドネラ・ファビアニイＦＣｂ２（ＣｙｂｅｒＦＣｂ２、配列番号３１）
－ ナウモボジマ・カステリＦＣｂ２（ＮａｃａＦＣｂ２、配列番号３２）
結果
新たなＦＣｂ２バリアント全ての収率および生化学的特徴付けの結果を、表２に要約する：［ＷａＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号２８；ＫｍＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号２９；ＣａｎｇＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３０；ＣｙｂｅｒＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３１；ＮａｃａＦＣｂ２（Ｈｉｓ）：配列番号３２］
【0185】
【表2】
【0186】
要約すると、全てのバリアントが、優れた収率、および生産に適した比活性度を示した。実施例４において、本発明によるシグナルペプチドの短縮を使用して、細胞の細胞質ゾルにおいて高い収率および比活性度を持つ機能的酵素としてＦＣｂ２配列の発現を予測できることが示される。本データは、示したＦＣｂ２全ての細胞質ゾルにおける機能的発現が、本発明によるシグナルペプチドの特定の短縮の技術的特徴のため可能になることを示す。
【0187】
実施例５
ＦＣｂ２バリアント修飾カーボンペースト電極の直接電子移動
ＷａＦＣｂ２、ＫｍＦＣｂ２、ＣａｎｇＦＣｂ２を、Ｇｅｉｓｓら（２０２１年）から適合させた２工程プロトコールに従って市販のカーボンペースト電極（ＤＲＰ－Ｃ１１０型；Ｍｅｔｒｏｈｍ／ＤｒｏｐＳｅｎｓ）上に固定化した。最初に、電極を、０．１Ｍ ＮａＯＨに溶解したエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１％（容積／容積）溶液に６０℃で１時間浸した。水による洗浄工程および窒素による乾燥後、酵素溶液（１０ｍｇ ｍＬ－１）１μＬを、作用電極に塗布し、シリカゲル存在下で、室温で１時間乾燥させた。修飾した作用電極の電気化学的読み取りを、定電位電解装置（ＥｍＳｔａｔ３、ＰａｌｍＳｅｎｓ）およびスクリーン印刷カーボンカウンターならびにＡｇ｜ＡｇＣｌ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ）疑似参照電極を使用して行った。乳酸濃度の増大に対する電流応答を、８ｇＬ－１ ＮａＣｌおよび０．２ｇＬ－１ ＫＣｌ、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に垂直に浸漬したセンサについて３７℃、印加電位＋０．２Ｖで疑似参照電極と対比して測定した。電流密度を、電流を酵素で被覆した作用電極領域と関連付けることによって算出した。
結果
試験したＦＣｂ２バリアント全てが、乳酸濃度の増大と共に増大するセンサシグナルを示し、低ｍＭ範囲で飽和し、経時的に低下する（図１３を参照のこと）。起こりうる不活性化または電極表面からの酵素層の脱離が経時的に進行し、架橋または膜のような対抗する安定化の方策が適用されないので、この低下は予想されうる。センサシグナルは、媒介物が存在しないので、酵素と電極間の直接電子移動から生じる。バリアントの間のセンサ電流の差異は、異なる酵素活性ならびに電極表面上の（異なる）酵素構造および配向によって支配される直接電子移動の能力の変動から生じている可能性がある。
ＦＣｂ２バリアント修飾カーボンペースト電極の直接電子移動
ＷａＦＣｂ２、ＫｍＦＣｂ２、ＣａｎｇＦＣｂ２を、Ｇｅｉｓｓら（２０２１年）から適合させた２工程プロトコールに従って市販のカーボンペースト電極（ＤＲＰ－Ｃ１１０型；Ｍｅｔｒｏｈｍ／ＤｒｏｐＳｅｎｓ）上に固定化した。最初に、電極を、０．１Ｍ ＮａＯＨに溶解したエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１％（容積／容積）溶液に６０℃で１時間浸した。水による洗浄工程および窒素による乾燥後、酵素溶液（１０ｍｇ ｍＬ－１）１μＬを、作用電極に塗布し、シリカゲル存在下で、室温で１時間乾燥させた。修飾した作用電極の電気化学的読み取りを、定電位電解装置（ＥｍＳｔａｔ３、ＰａｌｍＳｅｎｓ）およびスクリーン印刷カーボンカウンターならびにＡｇ｜ＡｇＣｌ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ）疑似参照電極を使用して行った。乳酸濃度の増大に対する電流応答を、８ｇＬ－１ ＮａＣｌおよび０．２ｇＬ－１ ＫＣｌ、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に垂直に浸漬したセンサについて３７℃、印加電位＋０．２Ｖで疑似参照電極と対比して測定した。電流密度を、電流を酵素で被覆した作用電極領域と関連付けることによって算出した。
結果
試験したＦＣｂ２バリアント全てが、乳酸濃度の増大と共に増大するセンサシグナルを示し、低ｍＭ範囲で飽和し、経時的に低下する（図１３を参照のこと）。起こりうる不活性化または電極表面からの酵素層の脱離が経時的に進行し、架橋または膜のような対抗する安定化の方策が適用されないので、この低下は予想されうる。センサシグナルは、媒介物が存在しないので、酵素と電極間の直接電子移動から生じる。バリアントの間のセンサ電流の差異は、異なる酵素活性ならびに電極表面上の（異なる）酵素構造および配向によって支配される直接電子移動の能力の変動から生じている可能性がある。
【0188】
実施例６
前修飾したカーボンペースト電極に対する直接電子移動
ＤＥＴを改善するために、市販のカーボンペースト電極（ＤＲＰ－Ｃ１１０型；Ｍｅｔｒｏｈｍ／ＤｒｏｐＳｅｎｓ）の表面を、２つの手段で前修飾した：
１：陽イオン性洗剤である臭化セチルトリメチルアミン（ＣＴＡＢ）を、電極を０．２％（重量／容積）溶液に３０分間浸漬することによって塗布し、次いで水でゆすぎ、窒素中で乾燥させた。
前修飾したカーボンペースト電極に対する直接電子移動
ＤＥＴを改善するために、市販のカーボンペースト電極（ＤＲＰ－Ｃ１１０型；Ｍｅｔｒｏｈｍ／ＤｒｏｐＳｅｎｓ）の表面を、２つの手段で前修飾した：
１：陽イオン性洗剤である臭化セチルトリメチルアミン（ＣＴＡＢ）を、電極を０．２％（重量／容積）溶液に３０分間浸漬することによって塗布し、次いで水でゆすぎ、窒素中で乾燥させた。
【0189】
２：エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）を、Ｇｅｉｓｓら（２０２１年）から適合させた２工程プロトコールに従って塗布した。最初に、電極を、０．１Ｍ ＮａＯＨ中の１％（容積／容積）（ＥＧＤＧＥ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液に６０℃で１時間浸し、次いで水でゆすぎ、窒素中で乾燥させた。
【0190】
対照：前処理なし。電極は、納品されたものを使用した。
ＫｍＦＣｂ２を、１０ｍｇ ｍＬ－１溶液１μＬを添加し、シリカゲル存在下で、室温で１時間乾燥させることによって前処理した電極上に固定化した。修飾した作用電極の電気化学的読み取りを、定電位電解装置（ＥｍＳｔａｔ３、ＰａｌｍＳｅｎｓ）カーボンペーストカウンター電極およびＡｇ｜ＡｇＣｌ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ）疑似参照電極を使用して行った。乳酸濃度の増大に対する電流応答を、８ｇＬ－１ ＮａＣｌおよび０．２ｇＬ－１ ＫＣｌ、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に垂直に浸漬したセンサについて３７℃、印加電位＋０．２Ｖで疑似参照電極と対比して測定した。電流密度を、電流を作用電極領域当たりの酵素量と関連付けることによって算出した。
結果
前修飾したカーボンペースト電極に固定化したＫｍＦＣｂ２は、３０ｍＭ乳酸に対して３０００ｎＡ ｍｍ－２を超える高い電流密度を発生することができる。電流は、媒介物質が存在しないので、媒介されない電子移動から生じるが、電流密度は、前修飾の型によってモジュレートされる；図１４を参照のこと。
ＫｍＦＣｂ２を、１０ｍｇ ｍＬ－１溶液１μＬを添加し、シリカゲル存在下で、室温で１時間乾燥させることによって前処理した電極上に固定化した。修飾した作用電極の電気化学的読み取りを、定電位電解装置（ＥｍＳｔａｔ３、ＰａｌｍＳｅｎｓ）カーボンペーストカウンター電極およびＡｇ｜ＡｇＣｌ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ）疑似参照電極を使用して行った。乳酸濃度の増大に対する電流応答を、８ｇＬ－１ ＮａＣｌおよび０．２ｇＬ－１ ＫＣｌ、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に垂直に浸漬したセンサについて３７℃、印加電位＋０．２Ｖで疑似参照電極と対比して測定した。電流密度を、電流を作用電極領域当たりの酵素量と関連付けることによって算出した。
結果
前修飾したカーボンペースト電極に固定化したＫｍＦＣｂ２は、３０ｍＭ乳酸に対して３０００ｎＡ ｍｍ－２を超える高い電流密度を発生することができる。電流は、媒介物質が存在しないので、媒介されない電子移動から生じるが、電流密度は、前修飾の型によってモジュレートされる；図１４を参照のこと。
【0191】
実施例７
金およびカーボンペースト電極における直接電子移動
本例は、作製したＦＣｂ２バリアントが、金またはカーボンペーストなどのバイオセンサに関連する導電材料への直接電子移動（ＤＥＴ）を実行する能力を実証する。
金およびカーボンペースト電極における直接電子移動
本例は、作製したＦＣｂ２バリアントが、金またはカーボンペーストなどのバイオセンサに関連する導電材料への直接電子移動（ＤＥＴ）を実行する能力を実証する。
【0192】
ＫｍＦＣｂ２を、１０ｍｇ ｍＬ－１酵素溶液１μＬを添加し、シリカゲル存在下で、室温で１時間乾燥させることによって金（Ｚｅｎｓｏｒ Ｒ＆Ｄ ｃｏ．Ｌｔｄ）またはカーボンペースト作用電極（ＤＲＰ－Ｃ１１０型；Ｍｅｔｒｏｈｍ／ＤｒｏｐＳｅｎｓ）上に固定化した。修飾した作用電極の電気化学的読み取りを、定電位電解装置（ＥｍＳｔａｔ３、ＰａｌｍＳｅｎｓ）、金またはカーボンペーストカウンター電極およびＡｇ｜ＡｇＣｌ（０．１４Ｍ ＮａＣｌ）疑似参照電極を使用して行った。３０ｍＭ乳酸添加後の電流応答を、８ｇＬ－１ ＮａＣｌおよび０．２ｇＬ－１ ＫＣｌ、ｐＨ７．４を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に垂直に浸漬したセンサについて３７℃、印加電位＋０．２Ｖで疑似参照電極と対比して測定した。電流密度を、電流を酵素で被覆した作用電極領域と関連付けることによって算出した。
結果
金またはカーボンペースト電極上に固定化したＫｍＦＣｂ２は、３０ｍＭ乳酸を添加した場合に、例えば、チオールに基づく自己組織化単分子層のような促進層を必要とせずに、明らかな接触電流を発生する；図１５を参照のこと。媒介物質が存在しないので、電流は直接電子移動から生じた。
結果
金またはカーボンペースト電極上に固定化したＫｍＦＣｂ２は、３０ｍＭ乳酸を添加した場合に、例えば、チオールに基づく自己組織化単分子層のような促進層を必要とせずに、明らかな接触電流を発生する；図１５を参照のこと。媒介物質が存在しないので、電流は直接電子移動から生じた。
【0193】
実施例８
温度安定性
異なるＦＣｂ２酵素の安定性を、温度範囲：３０℃、３４℃、３９℃、４１℃、４７℃、５１℃、５５℃および６０℃に対して決定した。ＦＣｂ２酵素のインキュベーションのために、サーモサイクラーを使用した。それぞれの酵素試料を、１００ｍＭ ＰＰＢ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中でおよそ０．４～１ｍｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。それにより、アリコート７０μＬを、各時点でインキュベートし（３つ組の活性測定）、７０μＬを、参照測定のために氷上に貯蔵した。試料を３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を氷上に１０分間置いた。残りの活性を、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中のＣｙｔＣで、３０℃、５５０ｎｍで５分間アッセイした。その後、Ｔ５０を決定した。Ｔ５０温度またはＴ５０％温度は、酵素の残存活性が、定義された時間にわたる熱チャレンジ後に５０％減少する温度を反映する。ＫｍＦＣｂ２およびＣａｎｇＦＣｂ２に対するＴ５０を以下の表３に示す。
温度安定性
異なるＦＣｂ２酵素の安定性を、温度範囲：３０℃、３４℃、３９℃、４１℃、４７℃、５１℃、５５℃および６０℃に対して決定した。ＦＣｂ２酵素のインキュベーションのために、サーモサイクラーを使用した。それぞれの酵素試料を、１００ｍＭ ＰＰＢ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中でおよそ０．４～１ｍｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。それにより、アリコート７０μＬを、各時点でインキュベートし（３つ組の活性測定）、７０μＬを、参照測定のために氷上に貯蔵した。試料を３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を氷上に１０分間置いた。残りの活性を、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中のＣｙｔＣで、３０℃、５５０ｎｍで５分間アッセイした。その後、Ｔ５０を決定した。Ｔ５０温度またはＴ５０％温度は、酵素の残存活性が、定義された時間にわたる熱チャレンジ後に５０％減少する温度を反映する。ＫｍＦＣｂ２およびＣａｎｇＦＣｂ２に対するＴ５０を以下の表３に示す。
【0194】
【表3】
【0195】
測定した温度範囲に及ぶ残りの活性を示すデータを、ＫｍＦＣｂ２（Ａ）については図１６Ａ、ＣａｎｇＦＣｂ２（Ａ）については図１７Ａに示した。ＫｍＦＣｂ２の熱容量曲線を、図１６Ｂに示し；ＣａｎｇＦＣｂ２の熱容量曲線を、図１７Ｂに示す。熱容量は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定された。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、試料の温度依存的構造転移、したがって安定性を試験することを可能にする温度勾配に対する熱消費を測定する。一般に、データは、融解温度（Ｔｍ）として示され、タンパク質の熱安定性の指標である。精製した酵素試料は、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中に１．０ｍｇ／ｍＬで使用された。測定を、参照細胞における同じＰＢＳ緩衝液に対してＰＥＡＱ ＤＳＣ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ設備で実行した。各試料スキャンを２回行った。１回目のスキャンは、熱消費データを示す。２回目のスキャン（再スキャン）のデータは、ピークが決定されない場合、１回目のスキャンから完全に変性した酵素を示し、データ評価においてブランクとして使用されうる。１℃／分工程（６０℃／時間）の増大で２０～１００℃の温度上昇を実行した。また、冷却および再スキャンには、同じ率の温度変化を使用した。データ処理を、バックグラウンドとして再スキャン、融解温度の決定に非２状態フィッティングを使用して、ＰＥＡＱ Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアで行った。
【0196】
ＫｍＦＣｂ２およびＣａｎｇＦＣｂ２の融解温度（Ｔｍ１およびＴｍ２）を、以下の表４に示す。
【0197】
【表4】
【0198】
実施例９
大腸菌におけるＦＣｂ２の発現
酵母細胞におけるＦＣｂ２の発現と比較して、大腸菌ＢＬ２１細胞におけるＦＣｂ２の発現を試験し、ｐＥＴ２１ Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２の発現研究をこの例に示す。それにより、ｐＥＴ２１ Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２を大腸菌ＢＬ２１発現株に形質転換した。８つの形質転換コロニーのＣｙｔＣ活性を、ディープウェルプレート形式で産生株スクリーニングで確認した。最も高い活性（８Ｕ／ｍＬ）を示すウェルの新たな画線を調製して、発現研究のための単一コロニーを得た。ここで、Ｈｉｓ ＫｍＦＣｂ２を、大腸菌ＢＬ２１においてＴＢＡｍｐ培地４×２５０ｍＬ規模で発現させた。細胞ペレットを採取し、さらなる精製研究用として－２０℃で貯蔵した。
大腸菌におけるＦＣｂ２の発現
酵母細胞におけるＦＣｂ２の発現と比較して、大腸菌ＢＬ２１細胞におけるＦＣｂ２の発現を試験し、ｐＥＴ２１ Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２の発現研究をこの例に示す。それにより、ｐＥＴ２１ Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２を大腸菌ＢＬ２１発現株に形質転換した。８つの形質転換コロニーのＣｙｔＣ活性を、ディープウェルプレート形式で産生株スクリーニングで確認した。最も高い活性（８Ｕ／ｍＬ）を示すウェルの新たな画線を調製して、発現研究のための単一コロニーを得た。ここで、Ｈｉｓ ＫｍＦＣｂ２を、大腸菌ＢＬ２１においてＴＢＡｍｐ培地４×２５０ｍＬ規模で発現させた。細胞ペレットを採取し、さらなる精製研究用として－２０℃で貯蔵した。
【0199】
前培養（終夜培養液）のために、ＴＢＡｍｐ培地２×６ｍＬを、大腸菌ＢＬ２１ ｐＥＴ２１ Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２の同じコロニーで接種した。インキュベーションを、振盪しながら３７℃で終夜実行した。
【0200】
本培養（発酵）を、ＴＢＡｍｐ培地４×２５０ｍＬ規模で実行した。ＴＢＡｍｐ培地２５０ｍＬを、１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ（調節板なし、無菌）に満たした。培地を終夜培養液２．５ｍＬで接種し、３７℃、１５０ｒｐｍでインキュベートした。
【0201】
１時間後、ＯＤ６００が最低０．５に達するまで確認を始めた。培養液を、ＩＰＴＧ（５００ｍＭ）５０μＬで誘導し、２０℃、２５０ｒｐｍで次の日までさらにインキュベートした（発現時間およそ２０時間）。
【0202】
ＯＤ６００：
１時間インキュベーション：フラスコ１：０．０６；フラスコ２：０．０５；フラスコ３：０．０６；フラスコ４：０．０６
２時間インキュベーション：フラスコ１：０．１８；フラスコ２：０．２０；フラスコ３：０．１９；フラスコ４：０．１９
２時間４０分間インキュベーション：フラスコ１：０．５１；フラスコ２：０．５３；フラスコ３：０．５２；フラスコ４：０．５４
細胞採取：各フラスコの培養液を、予冷した５００ｍＬ遠心分離ビーカーに移し、４℃、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭ ＫＰＰ（ｐＨ６．５）に再懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを、風袋を計量したファルコンチューブへ移し、緩衝液でさらに２回洗浄した。
１時間インキュベーション：フラスコ１：０．０６；フラスコ２：０．０５；フラスコ３：０．０６；フラスコ４：０．０６
２時間インキュベーション：フラスコ１：０．１８；フラスコ２：０．２０；フラスコ３：０．１９；フラスコ４：０．１９
２時間４０分間インキュベーション：フラスコ１：０．５１；フラスコ２：０．５３；フラスコ３：０．５２；フラスコ４：０．５４
細胞採取：各フラスコの培養液を、予冷した５００ｍＬ遠心分離ビーカーに移し、４℃、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを、５０ｍＭ ＫＰＰ（ｐＨ６．５）に再懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを、風袋を計量したファルコンチューブへ移し、緩衝液でさらに２回洗浄した。
【0203】
細胞ペレットの重量：１：２．５ｇ；２：２．４ｇ；３：３．１ｇ；４：２．７ｇ
ペレットを、－３０℃で貯蔵した。
結果として、４つのピンク色の細胞ペレット２．５ｇ～３．１ｇを採取した。
ペレットを、－３０℃で貯蔵した。
結果として、４つのピンク色の細胞ペレット２．５ｇ～３．１ｇを採取した。
【0204】
最終的に、Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２を大腸菌ＢＬ２１において発現させた。４つのピンク色の細胞ペレット２．５～３．１ｇを採取し、精製のために－２０℃で貯蔵した。
以下において、大腸菌ＢＬ２１において発現させたＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２のＩＭＡＣ精製研究について記述し、得られた比活性度を、酵母、より具体的にはピキア・パストリスにおいて発現させたＫｍＦＣｂ２の活性と比較する。
以下において、大腸菌ＢＬ２１において発現させたＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２のＩＭＡＣ精製研究について記述し、得られた比活性度を、酵母、より具体的にはピキア・パストリスにおいて発現させたＫｍＦＣｂ２の活性と比較する。
【0205】
大腸菌の細胞破壊：２．４および３．１ｇの２つの凍結細胞ペレットを氷上で解凍し、緩衝液Ａに再懸濁した（１０ｍＬまで満たした）。細胞破壊直前に、ＰＭＳＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）２０００μＬを細胞懸濁液に添加した。細胞懸濁液を、液体が自由に流れ、粘性がなくなるまで、フレンチプレスにおいて４回の連続サイクルでホモジナイズした。プロセスの全体を通じて低温を維持した。
【0206】
細胞破壊後、溶解物３０ｍＬを、５０ｍＬ遠心分離ビーカー内に慎重に移した。追加の緩衝液Ａ １０ｍＬを使用してチューブをゆすぎ、遠心分離ビーカーへ移した。容積を、緩衝液Ａで４０ｍＬにした。遠心分離を、２００００ｒｐｍ（４８０００ｇ）で、４℃で３０分間実施した。遠心分離後、上清を緩衝液Ａで１００ｍＬまで満たし、濾過した。
【0207】
ＩＭＡＣ精製を、５ｍＬカラムを使用して実行した。異なる結合および溶出緩衝液を、使用した：
・緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＰＰＢ（カリウム）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾル、ｐＨ６．５
・緩衝液Ｂ：５０ｍＭ ＰＰＢ（カリウム）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、７５０ｍＭイミダゾル、ｐＨ６．５
精製した酵素を、１００ｍＭ ＰＰＢ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に再緩衝した。
・緩衝液Ａ：５０ｍＭ ＰＰＢ（カリウム）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾル、ｐＨ６．５
・緩衝液Ｂ：５０ｍＭ ＰＰＢ（カリウム）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、７５０ｍＭイミダゾル、ｐＨ６．５
精製した酵素を、１００ｍＭ ＰＰＢ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に再緩衝した。
【0208】
大腸菌Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２の精製表を、以下の表５に示す。
【0209】
【表5】
【0210】
比活性度およびＲＺ値、大腸菌対Ｐ．パストリス発現酵素：
・大腸菌Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２：２．２Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：０．２
・Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２：１８０Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：１．５
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、大腸菌ＣＥ、大腸菌ＫｍＦＣｂ２最終Ｉ、大腸菌ＫｍＦＣｂ２最終ＩＩ、Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２、Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２に対して実行した。
・大腸菌Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２：２．２Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：０．２
・Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２：１８０Ｕ／ｍｇ；ＲＺ：１．５
ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を、大腸菌ＣＥ、大腸菌ＫｍＦＣｂ２最終Ｉ、大腸菌ＫｍＦＣｂ２最終ＩＩ、Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２、Ｐ．パストリスＨｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２に対して実行した。
【0211】
ＳＤＳ ＰＡＧＥ用の試料を、以下によって調製した：
・精製した酵素試料を、Ｈ２Ｏでおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈する
・大腸菌ＣＥを、Ｈ２Ｏでおよそ３ｍｇ／ｍＬに希釈する
・試料１５μＬを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２×濃度）１５μＬと混合する
・試料２５μＬ、タンパク質標準５．５μＬをゲルにロードする
・ゲルを、９０Ｖで５分間、次いで１５０Ｖでおよそ５０分間流す
ＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を図１８に示す。大腸菌ＢＬ２１におけるＦＣｂ２の発現は、大腸菌ＣＥの５８ｋＤａ程度で太いバンドを示す。大腸菌およびＰ．パストリスの精製Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２は、同じバンドパターンを示す：
・およそ５８ｋＤａのバンドは、ＦＣｂ２（理論サイズ５７．８ｋＤａ）を示す
・およそ３７ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンドは、酵素をより長く４℃で貯蔵するほどより強くなる
しかしながら、大腸菌において発現させた精製ＦＣｂ２は、ピキア・パストリスにおいて発現させた精製ＦＣｂ２より明らかに赤色でない色を示した。
・精製した酵素試料を、Ｈ２Ｏでおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈する
・大腸菌ＣＥを、Ｈ２Ｏでおよそ３ｍｇ／ｍＬに希釈する
・試料１５μＬを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（２×濃度）１５μＬと混合する
・試料２５μＬ、タンパク質標準５．５μＬをゲルにロードする
・ゲルを、９０Ｖで５分間、次いで１５０Ｖでおよそ５０分間流す
ＳＤＳ ＰＡＧＥの結果を図１８に示す。大腸菌ＢＬ２１におけるＦＣｂ２の発現は、大腸菌ＣＥの５８ｋＤａ程度で太いバンドを示す。大腸菌およびＰ．パストリスの精製Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２は、同じバンドパターンを示す：
・およそ５８ｋＤａのバンドは、ＦＣｂ２（理論サイズ５７．８ｋＤａ）を示す
・およそ３７ｋＤａおよび２５ｋＤａのバンドは、酵素をより長く４℃で貯蔵するほどより強くなる
しかしながら、大腸菌において発現させた精製ＦＣｂ２は、ピキア・パストリスにおいて発現させた精製ＦＣｂ２より明らかに赤色でない色を示した。
【0212】
最終的に、大腸菌由来Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２を、大腸菌ＢＬ２１において完全に発現させ、ＩＭＡＣによって精製できた。２つの精製した酵素試料：それぞれおよそ４５ｍｇ；１００Ｕ（４０％収率）。比活性度は、２．２Ｕ／ｍｇおよびＲＺ：０．２であった。ＳＤＳ ＰＡＧＥは、酵素の正しいサイズ（およそ５８ｋＤａ）を裏付けた。しかしながら、大腸菌Ｈｉｓ８ ＫｍＦＣｂ２は、正しいサイズを有したが、低いＲＺ値を示した。なお、ＣｙｔＣとの低い比活性度および酵素溶液の色は、ヘムを含まない完全に発現された酵素を示す。
【0213】
さらに、大腸菌対Ｐ．パストリスにおける最終電子移動能力を、電子受容体としてＤＣＩＰおよびＣｙｔＣを使用して比較した。以下の表６は、異なる発現のＫｍＦＣｂ２におけるＣｙｔＣとＤＣＩＰ活性の比較を示す。
【0214】
【表6】
【0215】
記述されているように、ＫｍＦＣｂ２は、Ｐ．パストリスにおいて短縮された形式（ＭＨＨＨＨＨＨＨＨ－ＱＮＡＴＫＥＥＬＮ：配列番号１８９）で、細胞内で産生され、Ｎ末端Ｈｉｓ８－タグを含んだ。それを、機械的細胞破壊によって培養液から単離し、明らかに均一になるまでＩＭＡＣクロマトグラフィーによって精製した。大腸菌ＫｍＦＣｂ２は、同じ設計であり、大腸菌において細胞内発現され、Ｎ末端Ｈｉｓ８－タグも利用した。それは、機械的細胞破壊（フレンチプレス）によって細胞ペレットから同様に放出され、その後のＩＭＡＣクロマトグラフィーによって単離され、２つの部分的に重なり合ったピーク（ＩおよびＩＩ）で溶出された。スペクトル比の大幅な減少およびＣｙｔＣ活性の実質的消失、ＣｙｔＣ：ＤＣＩＰ比のシフトは、発現宿主の変化によるヘム補因子の欠如の明らかな証拠である。これは、精製酵素溶液の画像からも観察可能である。ＣｙｔＣによる残りの最小限の活性は、試料中の、ヘムを組み込んだホロ酵素のごく一部を指す可能性がある（大腸菌ｂ型ヘムの合成は、限定されるが、完全に存在しないとは限らない）。あるいは、それは、ＦＭＮ ＤＨ部分と電極との遅く、非特異的な相互作用（ＦＭＮ拡散）の結果である可能性がある。興味深いことに、ＤＣＩＰ活性は、３つの調製物間で同程度であり、発現宿主に有意に依存しないようである。その後の電極測定において、直接電子電流は、いずれの大腸菌産生ＫｍＦＣｂ２試料においても記録できなかった。
【0216】
【表7-1】
【0217】
【表7-2】
【0218】
【表7-3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図12-5】
【図12-6】
【図12-7】
【図12-8】
【図12-9】
【図12-10】
【図12-11】
【図12-12】
【図12-13】
【図12-14】
【図12-15】
【図12-16】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】