特表 2024-521472 ＩＬ－２および抗ＰＤ－１ベースの治療薬およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-05-31

(54)【発明の名称】ＩＬ－２および抗ＰＤ－１ベースの治療薬およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240524BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240524BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240524BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240524BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240524BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240524BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240524BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240524BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240524BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20240524BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/26

C07K19/00

C07K14/55

C07K16/28

C12N15/13

C12N15/12

C07K14/715

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K47/64

A61K38/20

A61K39/395 T

C12P21/02 K

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577131

(86)(22)【出願日】2022-06-13

(85)【翻訳文提出日】2024-01-05

(86)【国際出願番号】 US2022072895

(87)【国際公開番号】W WO2022266598

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,111

(32)【優先日】2021-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/365,375

(32)【優先日】2022-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】チア－ヤン・リン

(72)【発明者】

【氏名】ジャシ・ウー

(72)【発明者】

【氏名】ニコリン・ブロッホ

(72)【発明者】

【氏名】トン・チャン

(72)【発明者】

【氏名】サミュエル・デーヴィス

(72)【発明者】

【氏名】エリック・スミス

(72)【発明者】

【氏名】エリカ・ウルマン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG20

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA19

4C084CA53

4C084DA14

4C084NA13

4C084ZB26

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA04

4H045DA50

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗原結合性部分およびＩＬ２部分を含む融合タンパク質、ならびにその使用方法に関する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合タンパク質であって：（ｉ）ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗原結合性部分、および（ｉｉ）インターロイキン２（ＩＬ２）部分を含む融合タンパク質。

【請求項2】

抗原結合性部分は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

ヒトＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトモノクローナル抗体である、請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

抗原結合性部分は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：
ＨＣＤＲ１は配列番号４３、４、または２４のアミノ酸配列を含み；
ＨＣＤＲ２は配列番号４５、６、または２６のアミノ酸配列を含み；
ＨＣＤＲ３は配列番号４７、８、または２８のアミノ酸配列を含み；
ＬＣＤＲ１は配列番号１２、または３２のアミノ酸配列を含み；
ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；および
ＬＣＤＲ３は配列番号１６、または３５のアミノ酸配列を含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

抗原結合性部分は、（ｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；または（ｉｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５のそれぞれのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

抗原結合性部分は、配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のそれぞれのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む、請求項４または５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

抗原結合性部分は、配列番号４１、２、または２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および配列番号１０または３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

ＨＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

ＨＣＶＲは配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

ＨＣＶＲは配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

抗原結合性部分は、配列番号５５の重鎖定常領域および配列番号５６の軽鎖定常領域を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

抗原結合性部分は重鎖および軽鎖を含み、重鎖は配列番号６１、５７、または５９のアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号６２、５８、または６０のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

抗原結合性部分は、配列番号６１／６２、５７／５８、または５９／６０の重鎖／軽鎖配列対を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

抗原結合性部分は、配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒα）またはその断片を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

ＩＬ２またはその断片は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）またはその断片である、請求項１５に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である、請求項１６に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

ＩＬ２またはその断片は、リンカーを介してＩＬ２Ｒαまたはその断片のＣ末端に接続される、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

ＩＬ２部分は、リンカーを介して抗原結合性部分の重鎖定常領域のＣ末端に接続される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

リンカーは、配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

融合タンパク質であって：（ｉ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合するヒト抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む第１のポリペプチド；ならびに（ｉｉ）（ａ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および（ｂ）ＩＬ２部分を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質。

【請求項26】

ＨＣＶＲは、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含み、ならびにＬＣＶＲは、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：
ＨＣＤＲ１は配列番号４３、４、または２４のアミノ酸配列を含み；
ＨＣＤＲ２は配列番号４５、６、または２６のアミノ酸配列を含み；
ＨＣＤＲ３は配列番号４７、８、または２８のアミノ酸配列を含み；
ＬＣＤＲ１は配列番号１２、または３２のアミノ酸配列を含み；
ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；および
ＬＣＤＲ３は配列番号１６、または３５のアミノ酸配列を含む、
請求項２５に記載の融合タンパク質。

【請求項27】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；または（ｉｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。

【請求項28】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のアミノ酸配列をそれぞれ含む、請求項２６または２７に記載の融合タンパク質。

【請求項29】

ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、（ｉ）配列番号４１および１０；（ｉｉ）配列番号２および１０；または（ｉｉｉ）配列番号２２および３０のアミノ酸配列を含む、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項30】

第１のポリペプチドは、ＬＣＶＲに連結された軽鎖定常領域を含む、請求項２５～２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項31】

軽鎖定常領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。

【請求項32】

第２のポリペプチドは、ＨＣＶＲに連結された重鎖定常領域を含み、ＩＬ２部分は重鎖定常領域のＣ末端に連結される、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項33】

重鎖定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。

【請求項34】

第１のポリペプチドは、配列番号６２、５８、または６０の軽鎖配列を含む、請求項２５～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項35】

第２のポリペプチドは、配列番号６１、５７、または５９の重鎖配列を含む、請求項２５～３４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項36】

配列番号６１／６２、５７／５８、または５９／６０の重鎖／軽鎖配列対を含む、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む、請求項２５～３６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項38】

ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２Ｒαまたはその断片を含む、請求項２５～３７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項39】

ＩＬ２部分は、リンカーを介して重鎖定常領域のＣ末端に接続される、請求項２５～３８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項40】

ＩＬ２またはその断片は、リンカーを介してＩＬ２Ｒαまたはその断片のＣ末端に接続される、請求項３８または３９に記載の融合タンパク質。

【請求項41】

ＩＬ２またはその断片は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）またはその断片である、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項42】

ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項43】

ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む、請求項４０～４４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項46】

リンカーは、配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。

【請求項47】

ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項48】

第１のポリペプチドは、配列番号６２、５８、または６０のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項49】

第２のポリペプチドは、配列番号６３、６４、または６５のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項50】

第１のポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項51】

第１のポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項52】

第１のポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項２５～４９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項53】

融合タンパク質は、二量体融合タンパク質を形成する、請求項１～５２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

融合タンパク質は、それぞれの重鎖定常領域を介して二量体化する、請求項１～５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項55】

融合タンパク質は、ＰＤ－１への結合についてＲＥＧＮ２８１０、ペムブロリズマブまたはニボルマブと交差競合しない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項56】

融合タンパク質は、ＩＬ２と比較して、ヒトＩＬ２Ｒα／β／γおよびＩＬ２Ｒβ／γ複合体を活性化する活性の低下を示す、請求項１～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項57】

融合タンパク質は、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と比較して、ヒトＩＬ２Ｒαを活性化する活性の増大を示す、請求項１～５６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項58】

融合タンパク質は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、ＩＦＮ－γ放出のレベルによって測定されるように、Ｔ細胞を刺激する活性の増大を示す、請求項１～５７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項59】

融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγに対する減弱した結合を示す、請求項１～５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項60】

核酸または複数の核酸であって、請求項１～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸または複数の核酸。

【請求項61】

ベクターであって、請求項６０に記載の核酸または複数の核酸を含むベクター。

【請求項62】

宿主細胞であって、請求項６０に記載の核酸もしくは複数の核酸または請求項６１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項63】

請求項２５～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のベクター、および請求項２５～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質の第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターを発現する請求項６２に記載の宿主細胞。

【請求項64】

請求項１～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する方法であって、融合タンパク質または断片の産生を可能にする条件下で請求項６２または６３に記載の宿主細胞を培養すること、およびそのようにして産生された融合タンパク質またはその断片を回収することを含む方法。

【請求項65】

医薬組成物であって、請求項１～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。

【請求項66】

抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片をさらに含む、請求項６５に記載の医薬組成物。

【請求項67】

抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－１への結合について融合タンパク質と交差競合しない、請求項６６に記載の医薬組成物。

【請求項68】

癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～５９のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項６５～６７のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法。

【請求項69】

対象の体重に基づき０．００５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの量で融合タンパク質を対象に投与することを含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

対象に第２の治療薬または治療法を投与することをさらに含む、請求項６８または６９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、ＩＬ２ベースの治療薬およびその使用方法に関し、より具体的には、ＩＬ２部分、およびヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗原結合性部分を含む融合タンパク質、ならびにその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン２（ＩＬ－２またはＩＬ２）は、主に活性化Ｔ細胞によって産生される多能性サイトカインである。Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成および末梢血リンパ球の細胞傷害性細胞およびリンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞によるサイトカインおよび細胞溶解分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖および分化ならびにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を促進し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生成、増殖、活性化を刺激する（非特許文献１、および非特許文献２を参照）。ＩＬ２は、サプレッサーＴ細胞としても知られる末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持に関与している（例えば、非特許文献３を参照）。Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔ細胞の助力と活性化を阻害することによる細胞間接触、あるいはＩＬ－１０やＴＧＦβのような免疫抑制性サイトカインの放出によって、エフェクターＴ細胞が（自己の）標的を破壊するのを抑制する。Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、ＩＬ２によって誘導される抗腫瘍免疫を増強することが示された（非特許文献４）。

【0003】

しかし、ＩＬ２はその多面的作用のため、腫瘍増殖の抑制には最適ではない。抗腫瘍剤としてのＩＬ２の使用は、腫瘍応答に必要な投与量に伴う重篤な毒性によって制限されてきた。Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．が販売）はＩＬ２の組換え型で、転移性黒色腫と転移性腎癌の処置において承認されているが、その副作用は非常に重篤であるため、集中治療が可能な病院での使用のみが推奨されている。ＩＬ２療法の主な副作用は血管漏出症候群（ＶＬＳ）で、肺や肝臓に間質液が貯留し、肺水腫や肝障害を引き起こす。ＶＬＳに対する処置法は、ＩＬ２を中止する以外にない。ＩＬ２が誘発する肺水腫は、ＩＬ２が肺内皮細胞に直接結合することに起因することが示されており、この細胞は、低レベルから中レベルの機能的高親和性ＩＬ２受容体を発現している（非特許文献５）。癌治療のために開発されているＣＤ１２２指向性ＩＬ２治療法が一般的に受け入れられているにもかかわらず、このような分子は癌治療のための治療指標が低く、わずかな抗癌作用を得るためには高く毒性のある用量が必要であることが、驚くべきことに判明している。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｗａｌｄｍａｎｎ、２００６、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５９５～６０１

【非特許文献2】Ｍａｌｅｋ、２００８、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６：４５３～７９

【非特許文献3】Ｆｏｎｔｅｎｏｔら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：１１４２～５１

【非特許文献4】Ｉｍａｉら、２００７、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９８：４１６～２３

【非特許文献5】Ｋｒｉｅｇら、２０１０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１１９０６～１１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、治療効能および安全性プロファイルが改善された新規ＩＬ２治療法に対する緊急の必要性が当技術分野において存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、上記の必要性の１つまたはそれ以上に対処するものである。本開示の融合タンパク質は、腫瘍反応性Ｔ細胞を標的とするヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗原結合性部分を含む。抗原結合性部分は、腫瘍反応性Ｔ細胞上の活性を選択的に再構成するのに有用である。融合タンパク質は、ＩＬ２部分をさらに含み、ＩＬ２部分は、ＩＬ２Ｒαに結合したＩＬ２を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、修飾されていないＩＬ２配列を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、内因性ＩＬ２Ｒαと会合する能力を保持する。融合タンパク質は、トランス形に隔絶されたコンフォメーションのＩＬ２部分を含む。これは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞との係合を維持する；しかし、ＩＬ２部分の結合した立体配置は、ＩＬ２のマスキングおよびその活性の減衰に役立ち、したがって、全身毒性の低減につながる。例えば、本開示の融合タンパク質は、野生型ＩＬ２と比較して、マウスにおいて急性肺水腫（血管漏出）を誘導しない。本開示の融合タンパク質は、ＩＬ２単独またはＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片）との併用と比較して、増強された抗腫瘍効能および改善された治療指数を提供する。

【0007】

一態様では、開示された技術は：（ｉ）ヒトプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗原結合性部分、および（ｉｉ）インターロイキン２（ＩＬ２）部分を含む融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＤ－１に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：ＨＣＤＲ１は配列番号４３、４、または２４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号４５、６、または２６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号４７、８、または２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号１２または３２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３は配列番号１６または３５のアミノ酸配列を含む。

【0008】

一部の実施形態では、抗原結合性部分は、（ｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；または（ｉｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５のそれぞれのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のそれぞれのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号４１、２、または２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および配列番号１０または３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。一部の実施形態では、ＨＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＣＶＲは配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＣＶＲは配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号５５の重鎖定常領域および配列番号５６の軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は重鎖および軽鎖を含み、重鎖は配列番号６１、５７、または５９のアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号６２、５８、または６０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号６１／６２、５７／５８、または５９／６０の重鎖／軽鎖配列対を含む。

【0009】

一部の実施形態では、抗原結合性部分は、配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒα）またはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、リンカーを介してＩＬ２Ｒαまたはその断片のＣ末端に接続される。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、リンカーを介して抗原結合性部分の重鎖定常領域のＣ末端に接続される。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。

【0010】

別の態様では、開示された技術は：（ｉ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合するヒト抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む第１のポリペプチド；ならびに（ｉｉ）（ａ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および（ｂ）ＩＬ２部分を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含み、ならびにＬＣＶＲは、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：ＨＣＤＲ１は配列番号４３、４、または２４のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号４５、６、または２６のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号４７、８、または２８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号１２または３２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３は配列番号１６または３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；または（ｉｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のアミノ酸配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、（ｉ）配列番号４１および１０；（ｉｉ）配列番号２および１０；または（ｉｉｉ）配列番号２２および３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＬＣＶＲに連結された軽鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＨＣＶＲに連結された重鎖定常領域を含み、ＩＬ２部分は重鎖定常領域のＣ末端に連結される。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６２、５８または６０の軽鎖配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号６１、５７または５９の重鎖配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１／６２、５７／５８、または５９／６０の重鎖／軽鎖配列対を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２Ｒαまたはその断片を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、リンカーを介して重鎖定常領域のＣ末端に接続される。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、リンカーを介してＩＬ２Ｒαまたはその断片のＣ末端に接続される。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６２、５８または６０のアミノ酸配列を含む。

【0013】

一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号６３、６４または６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、二量体融合タンパク質を形成する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、それぞれの重鎖定常領域を介して二量体化する。

【0014】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ－１への結合についてＲＥＧＮ２８１０、ペムブロリズマブまたはニボルマブと交差競合しない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２と比較して、ヒトＩＬ２Ｒα／β／γおよびＩＬ２Ｒβ／γ複合体を活性化する活性の低下を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と比較して、ヒトＩＬ２Ｒαを活性化する活性の増大を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、ＩＦＮ－γ放出のレベルによって測定されるように、Ｔ細胞を刺激する活性の増大を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２ＲβおよびＩＬ２Ｒγに対する減弱した結合を示す。

【0015】

別の態様では、開示された技術は、核酸または複数の核酸であって、本明細書に開示された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸または複数の核酸に関する。別の態様では、開示された技術は、ベクターであって、本明細書に開示された核酸または複数の核酸を含むベクターに関する。別の態様では、開示された技術は、宿主細胞であって、本明細書に開示された核酸もしくは複数の核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示された融合タンパク質の第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のベクター、および本明細書に開示された融合タンパク質の第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターを発現する。

【0016】

別の態様では、開示された技術は、本明細書に開示された融合タンパク質を産生する方法であって、融合タンパク質または断片の産生を可能にする条件下で本明細書に開示された宿主細胞を培養すること、およびそのようにして産生された融合タンパク質またはその断片を回収することを含む方法に関する。

【0017】

別の態様では、開示された技術は、本明細書に開示された融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片をさらに含む。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－１への結合について融合タンパク質と交差競合しない。

【0018】

別の態様では、開示された技術は、癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示された融合タンパク質または医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、方法は対象の体重に基づき０．００５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの量で融合タンパク質を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、方法は対象に第２の治療薬または治療法を投与することをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A】実施例６に記載のｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示すグラフの図である。図１Ａおよび図１Ｂは、アイソタイプ対照Ａｂ、アイソタイプ対照ｈＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ＰＤ－１、ＲＥＧＮ１０４８６＋アイソタイプ対照Ａｂ処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ａ）および生存率（図１Ｂ）を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、アイソタイプ対照、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０５９７処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ｃ）および生存率（図１Ｄ）を示す。

【図1B】実施例６に記載のｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示すグラフの図である。図１Ａおよび図１Ｂは、アイソタイプ対照Ａｂ、アイソタイプ対照ｈＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ＰＤ－１、ＲＥＧＮ１０４８６＋アイソタイプ対照Ａｂ処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ａ）および生存率（図１Ｂ）を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、アイソタイプ対照、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０５９７処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ｃ）および生存率（図１Ｄ）を示す。

【図1C】実施例６に記載のｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示すグラフの図である。図１Ａおよび図１Ｂは、アイソタイプ対照Ａｂ、アイソタイプ対照ｈＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ＰＤ－１、ＲＥＧＮ１０４８６＋アイソタイプ対照Ａｂ処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ａ）および生存率（図１Ｂ）を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、アイソタイプ対照、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０５９７処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ｃ）および生存率（図１Ｄ）を示す。

【図1D】実施例６に記載のｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果を示すグラフの図である。図１Ａおよび図１Ｂは、アイソタイプ対照Ａｂ、アイソタイプ対照ｈＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ＰＤ－１、ＲＥＧＮ１０４８６＋アイソタイプ対照Ａｂ処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ａ）および生存率（図１Ｂ）を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、アイソタイプ対照、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０５９７処置マウスの腫瘍体積（ｍｍ^３）（図１Ｃ）および生存率（図１Ｄ）を示す。

【図2A】実施例８に記載の、抗α－ｈＰＤ１抗体（「αｈＰＤ１」または「ａｈＰＤ１」）親抗体のＰＤ１＋細胞への結合（図２Ａ）と、抗αｈＰＤ１抗体－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のＰＤ１＋細胞への結合（図２Ｂ）とを比較するＦＡＣＳ結合アッセイの結果を示すグラフのセットの図である。

【図2B】実施例８に記載の、抗α－ｈＰＤ１抗体（「αｈＰＤ１」または「ａｈＰＤ１」）親抗体のＰＤ１＋細胞への結合（図２Ａ）と、抗αｈＰＤ１抗体－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のＰＤ１＋細胞への結合（図２Ｂ）とを比較するＦＡＣＳ結合アッセイの結果を示すグラフのセットの図である。

【図3A】実施例９に記載の、特定の抗体混合物と比較した、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２＋ｈＩｇＧ４抗体の混合物の実験デザイン（図３Ａ）および得られたネイティブ質量スペクトル（図３Ｂ）を示す図である。

【図3B-1】実施例９に記載の、特定の抗体混合物と比較した、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２＋ｈＩｇＧ４抗体の混合物の実験デザイン（図３Ａ）および得られたネイティブ質量スペクトル（図３Ｂ）を示す図である。

【図3B-2】実施例９に記載の、特定の抗体混合物と比較した、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２＋ｈＩｇＧ４抗体の混合物の実験デザイン（図３Ａ）および得られたネイティブ質量スペクトル（図３Ｂ）を示す図である。

【図4A】実施例１０に記載の、抗体またはサイトカイン滴定に応答したＴ細胞のＩＦＮγ放出および増殖を示すグラフのセットの図である。Ｔ細胞と混合した同種ＰＢＭＣを、組換えＩＬ２、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０４８６）またはアイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２対照（ＲＥＧＮ９９０３）の用量滴定で処理し、ＩＦＮγ放出（図４Ａ）および増殖（図４Ｂ）を評価した。

【図4B】実施例１０に記載の、抗体またはサイトカイン滴定に応答したＴ細胞のＩＦＮγ放出および増殖を示すグラフのセットの図である。Ｔ細胞と混合した同種ＰＢＭＣを、組換えＩＬ２、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７、ＲＥＧＮ１０５９５、およびＲＥＧＮ１０４８６）またはアイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２対照（ＲＥＧＮ９９０３）の用量滴定で処理し、ＩＦＮγ放出（図４Ａ）および増殖（図４Ｂ）を評価した。

【図5A】実施例１１に記載の、ＲＥＧＮ２８１０の非存在下（図５Ａ）または存在下（図５Ｂ）における抗体またはサイトカイン滴定に応答したＴ細胞のＩＦＮγ放出を示すグラフのセットの図である。ＲＡＪＩ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ＰＤＬ１細胞をＴ細胞とインキュベートし、ＲＥＧＮ２８１０の非存在下（図５Ａ）または存在下（図５Ｂ）で、固定用量の抗ＣＤ３×ＣＤ２０（ＲＥＧＮ１９７９）および用量滴定のアイソタイプ対照（ＲＥＧＮ７５４０）、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（ＲＥＧＮ９９０３）、ｍＡｂ９０４８の可変領域を有する抗ＰＤ１抗体（ＲＥＧＮ１５１８７）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）、またはＲＥＧＮ９９０３＋ＲＥＧＮ１５１８７の組合せで処理した。ＩＦＮγ放出を測定した。

【図5B】実施例１１に記載の、ＲＥＧＮ２８１０の非存在下（図５Ａ）または存在下（図５Ｂ）における抗体またはサイトカイン滴定に応答したＴ細胞のＩＦＮγ放出を示すグラフのセットの図である。ＲＡＪＩ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ＰＤＬ１細胞をＴ細胞とインキュベートし、ＲＥＧＮ２８１０の非存在下（図５Ａ）または存在下（図５Ｂ）で、固定用量の抗ＣＤ３×ＣＤ２０（ＲＥＧＮ１９７９）および用量滴定のアイソタイプ対照（ＲＥＧＮ７５４０）、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（ＲＥＧＮ９９０３）、ｍＡｂ９０４８の可変領域を有する抗ＰＤ１抗体（ＲＥＧＮ１５１８７）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）、またはＲＥＧＮ９９０３＋ＲＥＧＮ１５１８７の組合せで処理した。ＩＦＮγ放出を測定した。

【図6A】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6B-1】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6B-2】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6C】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6D】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6E】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6F】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6G】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図6H】実施例１２に記載の、ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性評価を示すグラフの図であり、主に以下：非標的対照ＲＥＧＮ９９０４とＰＤ－１遮断抗体ＲＥＧＮ２８１０の組合せ（図６Ａおよび図６Ｂ）、比較対象の抗ＰＤ１標的「非α」（３ｍ）分子ＲＥＧＮ１３２３３（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）、ならびに、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ成分をすべて含むが、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒαが互いに逆の順序で融合した構築物（図６Ｇおよび６Ｈ）と比較する。

【図7A】実施例１３に記載のＩＬ２結合アッセイのグラフを示す図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ（図７Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＯＥ（図７Ｂ）を、ＩＬ２に直列に融合した抗体（ＲＥＧＮ８５１２；破線で灰色の開円）またはＩＬ２ＲａおよびＩＬ２に直列に融合した抗体（ＲＥＧＮ９９０４；実線で黒色の閉円）の滴定とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、二次抗体ＡＦ６４７抗ヒトＩｇＧで染色し、洗浄、固定し、ｉＱｕｅ Ｐｌｕｓフローサイトメーターで取得した。

【図7B】実施例１３に記載のＩＬ２結合アッセイのグラフを示す図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ（図７Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＯＥ（図７Ｂ）を、ＩＬ２に直列に融合した抗体（ＲＥＧＮ８５１２；破線で灰色の開円）またはＩＬ２ＲａおよびＩＬ２に直列に融合した抗体（ＲＥＧＮ９９０４；実線で黒色の閉円）の滴定とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、二次抗体ＡＦ６４７抗ヒトＩｇＧで染色し、洗浄、固定し、ｉＱｕｅ Ｐｌｕｓフローサイトメーターで取得した。

【図8A】実施例１４に記載の、Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２およびＡｂ－ＩＬ２－ＩＬ２ＲａのＩＬ２レポーターアッセイ比較を示すグラフの図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ／ｈＰＤ１（図８Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒａ／ｈＰＤ１（図８Ｂ）を、非標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色破線で黒色の開いた丸い記号、ＲＥＧＮ９９０３）、非標的ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ（灰色破線で灰色の四角い開いた記号）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色実線で黒色の閉じた丸い記号、ＲＥＧＮ１０５９７）、または抗ＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ（灰色実線で灰色の四角い閉じた記号）の滴定とともにインキュベートした。４時間３０分後、ＳＴＡＴ５活性を発光計測値により評価した。

【図8B】実施例１４に記載の、Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２およびＡｂ－ＩＬ２－ＩＬ２ＲａのＩＬ２レポーターアッセイ比較を示すグラフの図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ／ｈＰＤ１（図８Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒａ／ｈＰＤ１（図８Ｂ）を、非標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色破線で黒色の開いた丸い記号、ＲＥＧＮ９９０３）、非標的ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ（灰色破線で灰色の四角い開いた記号）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色実線で黒色の閉じた丸い記号、ＲＥＧＮ１０５９７）、または抗ＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ（灰色実線で灰色の四角い閉じた記号）の滴定とともにインキュベートした。４時間３０分後、ＳＴＡＴ５活性を発光計測値により評価した。

【図9A】実施例１４に記載の、Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２およびＡｂ－ＩＬ２（３ｍ）のＩＬ２レポーターアッセイ比較を示すグラフの図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ／ｈＰＤ１（図９Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒａ／ｈＰＤ１（図９Ｂ）を、非標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色破線で黒色の開いた丸い記号、ＲＥＧＮ９９０４）、非標的ＩＬ２（３ｍ）（灰色破線で灰色の菱形の開いた記号）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色実線で黒色の閉じた丸い記号、ＲＥＧＮ１０５９７）、または抗ＰＤ１－ＩＬ２（３ｍ）（灰色実線で灰色の菱形の閉じた記号）の滴定とともにインキュベートした。４時間後、ＳＴＡＴ５活性を発光計測値により評価した。

【図9B】実施例１４に記載の、Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２およびＡｂ－ＩＬ２（３ｍ）のＩＬ２レポーターアッセイ比較を示すグラフの図である。ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒａ ＫＯ／ｈＰＤ１（図９Ａ）またはＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒａ／ｈＰＤ１（図９Ｂ）を、非標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色破線で黒色の開いた丸い記号、ＲＥＧＮ９９０４）、非標的ＩＬ２（３ｍ）（灰色破線で灰色の菱形の開いた記号）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（黒色実線で黒色の閉じた丸い記号、ＲＥＧＮ１０５９７）、または抗ＰＤ１－ＩＬ２（３ｍ）（灰色実線で灰色の菱形の閉じた記号）の滴定とともにインキュベートした。４時間後、ＳＴＡＴ５活性を発光計測値により評価した。

【発明を実施するための形態】

【0020】

このような方法や条件は異なる場合があるため、本開示は、記載された特定の方法および実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図したものではなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、特に断らない限り、参照によってその全体が本明細書に組み入れる。

【0021】

融合タンパク質
一態様では、本開示は：（ｉ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗原結合性部分、および（ｉｉ）ＩＬ２部分を含む融合タンパク質を提供する。開示された融合タンパク質は、抗ｈＰＤ１抗体（ＲＥＧＮ２８１０など）と比較して、Ｔ細胞を刺激し、腫瘍増殖を阻害するのに驚くほど効果的である。特定の実施形態では、融合タンパク質は、抗ＰＤ－１標的ＩＬ２分子（ＲＥＧＮ１３２３３など）と比較して、より優れた安全性プロファイルを示す。

【0022】

開示された融合タンパク質は、単量体または多量体、例えば、二量体（ホモ二量体もしくはヘテロ二量体）または高次複合体である。簡単のために、ホモ二量体（または同じポリペプチドの高次多量体）である融合タンパク質は、それらの構成単量体によって記載される；しかし、適切な細胞株における構成単量体の組換え発現の際に、ホモ二量体（または高次多量体）分子が産生される。

【0023】

一部の実施形態では、抗原結合性部分は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＤ－１に結合する抗原結合性部分はヒトモノクローナル抗体である。

【0024】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合で連結した免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合性断片を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）ならびに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む）を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域が散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域にさらに細分化することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。一部の実施形態では、抗体（またはその抗原結合性断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞配列と同一であってもよいし、天然または人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの対照解析に基づいて定義することができる。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合性断片も含まれる。

【0025】

本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合性断片」、抗体の「抗原結合性部分」などの用語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成された、または遺伝子工学的に操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、タンパク質分解消化や、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術のような任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導することができる。このようなＤＮＡは既知であり、および／または、例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つまたはそれ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な立体配置に配列するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を作製するため、アミノ酸を修飾、付加または削除するためなどに、化学的または分子生物学的技術を用いて配列決定および操作することができる。

【0026】

抗原結合性断片の非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または束縛されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチド、が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合性断片」という表現に包含される。

【0027】

抗体の抗原結合性断片は一般的に、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、どのようなサイズやアミノ酸組成であってもよく、一般に、１つまたはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはフレームワーク配列と同じ位置にある少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_Ｌドメインに会合するＶ_Ｈドメインを有する抗原結合性断片では、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインは、任意の適切な配置で互いに対して位置することができる。例えば、可変領域は二量体であってもよく、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌの二量体を含んでいてもよい。あるいは、抗体の抗原結合性断片は単量体のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを含んでいてもよい。

【0028】

一部の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合的に連結した少なくとも１つの可変ドメインを含むことができる。本開示の抗体の抗原結合性断片内に見出される可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的で例示的な立体配置には：（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌ、が含まれる。上記の例示的な立体配置のいずれかを含む可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されるか、または完全もしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域によって連結される。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれ以上）のアミノ酸から構成され、その結果、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす。さらに、本開示の抗体の抗原結合性断片は、上記の可変ドメインおよび定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を、互いに非共有結合的な会合で、および／または１つもしくはそれ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインとの会合で（例えば、ジスルフィド結合によって）含むことができる。

【0029】

本明細書で開示された融合タンパク質に含まれる抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト抗体またはその抗原結合性断片であってもよい。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。本開示の融合タンパク質に含まれるヒト抗体またはその抗原結合性断片は、それにもかかわらず、例えばＣＤＲおよび特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発または部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含むことがある。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、マウスのような他の哺乳動物種の生殖細胞由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。

【0030】

本明細書で開示された融合タンパク質に含まれる抗体は、組換えヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体（以下にさらに記載する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体（以下にさらに記載する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入した動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら、（１９９２）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７～６２９５参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列と他のＤＮＡ配列とのスプライシングを伴う他の任意の手段により調製、発現、作製または単離された抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体が含まれる。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。一部の実施形態では、しかしながら、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物が使用される場合は、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来し、それに関連する配列であるが、ｉｎ ｖｉｖｏではヒト抗体生殖細胞レパートリー内に天然には存在しない可能性がある。

【0031】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理的条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定する方法は当技術分野でよく知られており、例えば平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。例えば、本開示の文脈で使用されるヒトＰＤ－１に「特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定される約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫ_ＤでヒトＰＤ－１またはその一部と結合する抗体を含む。しかしながら、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）生物種のＰＤ－１分子のような他の抗原に対して交差反応性を示すことがある。

【0032】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：ＨＣＤＲ１は配列番号４、２４、または４３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号６、２６、または４５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号８、２８、または４７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号１２、または３２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３は配列番号１６または３５のアミノ酸配列を含む。

【0033】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５；または（ｉｉｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のそれぞれのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。

【0034】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。

【0035】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２、２２、もしくは４１のアミノ酸配列、または配列番号２、２２、もしくは４１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および配列番号１０、もしくは３０のアミノ酸配列、または配列番号１０、もしくは３０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。

【0036】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

【0037】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

【0038】

一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４１のアミノ酸配列、または配列番号４１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

【0039】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５５の重鎖定常領域、または配列番号５５に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号５６の軽鎖定常領域、または配列番号５６に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。

【0040】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は、配列番号５７、５９、もしくは６１のアミノ酸配列、または配列番号５７、５９、もしくは６１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５８、６０、もしくは６２のアミノ酸配列、または配列番号５８、６０、もしくは６２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0041】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は、配列番号５７のアミノ酸配列、または配列番号５７に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号５８のアミノ酸配列、または配列番号５８に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0042】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は、配列番号５９のアミノ酸配列、または配列番号５９に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列、または配列番号６１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0043】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列、または配列番号６１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0044】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７／５８、５９／６０、または６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む。

【0045】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒα）またはその断片を含む。

【0046】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、野生型またはバリアントＩＬ２ドメインを含んでいてもよく、これは、場合によりリンカーを介して、ＩＬ－２ＲαのＩＬ２結合ドメインに融合される。ＩＬ－２ＲαのＩＬ２結合ドメインは、野生型またはバリアントＩＬ２ドメインのＮ末端またはＣ末端である。一部の実施形態では、ＩＬ－２ＲαのＩＬ２結合ドメインは、野生型またはバリアントＩＬ２ドメインのＮ末端である。

【0047】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0048】

真核細胞では、ヒトＩＬ２は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０アミノ酸が取り除かれ、成熟した分泌型ＩＬ２となる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０２（５９０６）：３０５～１０）。成熟ヒトＩＬ２は以下のアミノ酸配列：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号７５）
を有する。

【0049】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、ＩＬ２Ｒａ指向性であり、例えば、それらは、ＩＬ－２Ｒβと比較してＩＬ－２Ｒαに優先的に結合させる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をＩＬ２ドメインに有する。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、ＣＤ１２２指向性ではなく、例えば、それらは、ＩＬ－２Ｒαと比較してＩＬ－２Ｒβに優先的に結合させるアミノ酸置換をＩＬ２ドメインに有さない。

【0050】

一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβへの結合を減少させる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をＩＬ２ドメインに有する。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、最大５０倍（一部の実施形態では、最大１００倍）～１，０００倍減弱したヒトＩＬ－２Ｒβへの結合を有する可能性がある。一部の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβへの結合が減少したＩＬ２部分は、ＩＬ－２Ｒαへの親和性を保持するか、またはＩＬ－２Ｒαへの結合が減少することがある。例えば、一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、最大５０倍減弱したヒトＩＬ２－Ｒαへの結合を有することがある。一実施形態では、ＩＬ２ドメインは、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性を低下させ、ＩＬ２－Ｒαに対する親和性を維持する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。例示的なアミノ酸置換は、Ｎ８８Ｄである。ＩＬ２のＩＬ－２Ｒβに対する親和性を低下または消失させる他のアミノ酸置換は、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８ＤまたはＱ１２６Ｄである（例えば、米国特許公開第２００７／００３６７５２号を参照）。

【0051】

一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、ＩＬ２－Ｒαに対する親和性を低下させ、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性を維持するか、またはより低い程度に低下させる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ＣＤ１２２指向性ＩＬ２部分を生じる。例示的なＣＤ１２２指向性ＩＬ２ドメインは、Ｈ１６ＡおよびＦ４２Ａの両方の置換を含むものである。したがって、一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、Ｈ１６ＡおよびＦ４２Ａ置換を有するヒトＩＬ２のアミノ酸配列を含む。

【0052】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、ヒトＩＬ２の残基３に対応する位置において、ＩＬ２のＯ－グリコシル化部位を除去するアミノ酸置換を含む。Ｔ３における例示的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ、およびＴ３Ｐである。特定の実施形態では、置換はＴ３Ａである。

【0053】

一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、Ｃ１２５での置換を含んでいてもよい。Ｃ１２５は、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されているように、タンパク質の凝集を低下させるために、Ｓ、Ｖ、またはＡで置換することができる。一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、米国特許第５，２０６，３４４号に記載されているように、メチオニン１０４をアラニンなどの中性アミノ酸で置換することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、ＩＬ２のＮ末端アラニン残基を欠失することができ、ｄｅｓ－Ａ１ ＩＬ２を生じる。

【0054】

一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、他の変異に加えて、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ ＩＬ２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ２、Ｍ１０４Ａ ＩＬ２、Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ２、およびＭ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ２から選択されるアミノ酸欠失および／または置換を有することができ、その受容体へのＩＬ２の結合を変化させることができる。これらおよび他の突然変異体は、米国特許第５，１１６，９４３号およびＷｅｉｇｅｒら、１９８９、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０：２９５～３００に記載されている。

【0055】

一部の実施形態では、ＩＬ２ドメインは、成熟ヒトＩＬ２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。

【0056】

一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、ＩＬ－２ＲαのＩＬ２結合ドメイン（「ＩＬ２－Ｒαドメイン」と称される）、例えば、ＩＬ２のＣ末端またはＮ末端で、場合によりリンカーを介して融合したＩＬ－２Ｒαの細胞外ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２－Ｒαドメインは、成熟ヒトＩＬ－２Ｒα細胞外ドメイン（ヒトＩＬ－Ｒαのアミノ酸２２～２７２に対応する）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ２－Ｒαドメインは、ヒトＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインのＩＬ２結合部分（ヒトＩＬ－２Ｒαのアミノ酸２２～１８６に対応する２つの「スシ」ドメインを含む）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ２－Ｒαドメインは、ヒトＩＬ－２Ｒαのアミノ酸２２～２４０に対応する、ヒトＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインの代替ＩＬ２結合部分を含んでいてもよい。

【0058】

一部の実施形態では、ＩＬ２－ＲαドメインまたはＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインのＩＬ２結合部分は、上記の配列のいずれか、すなわち、ＩＬ－２Ｒαのアミノ酸２２～１８６、ＩＬ－２Ｒαのアミノ酸２２～２４０、もしくはＩＬ－２Ｒαのアミノ酸２２～２７２のいずれか１つ、またはそのＩＬ２結合部分のいずれかに対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0059】

一部の実施形態では、ＩＬ２－ＲαドメインまたはＩＬ２結合部分は、ヒトＩＬ－２ＲαのＩＬ２結合部分に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなることができ、場合により結合部分は、ヒトＩＬ２－Ｒαの細胞外ドメインの（ａ）少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１６１アミノ酸、少なくとも１６２アミノ酸、少なくとも１６４アミノ酸もしくは少なくとも１６５アミノ酸、および／または（ｂ）最大２５１、最大２４０、最大２３０、最大２２０、最大２１０、最大２００、最大１９０、最大１８０もしくは最大１７０アミノ酸のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ヒトＩＬ－２Ｒαの部分は、前文の（ａ）および（ｂ）のいずれか１つ、例えば、ヒトＩＬ－２Ｒαから少なくとも１６０および最大１８０のアミノ酸、ヒトＩＬ－２Ｒαから少なくとも１６２および最大２００のアミノ酸、ヒトＩＬ－２Ｒαから少なくとも１６０および最大２２０のアミノ酸、ヒトＩＬ－２Ｒαから少なくとも１６４および最大１９０のアミノ酸などによって結合されている。

【0060】

一部の実施形態では、ＩＬ２－ＲαドメインまたはＩＬ２結合部分は、ＩＬ２－Ｒαのアミノ酸残基１８６のＣ末端に、最大５アミノ酸、最大１０アミノ酸、最大１５アミノ酸、最大２０アミノ酸、最大３０アミノ酸、または最大４０アミノ酸を付加的に有するかまたは有さない、アミノ酸２２～１８６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。

【0061】

一部の実施形態では、ＩＬ２－ＲαドメインまたはＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインは、例えば、アミノ酸Ｎ４９、アミノ酸Ｎ６８、アミノ酸Ｔ７４、アミノ酸Ｔ８５、アミノ酸Ｔ１９７、アミノ酸Ｔ２０３、アミノ酸Ｔ２０８、およびアミノ酸Ｔ２１６のうちの１つまたはそれ以上における置換によって、天然のＩＬ－２Ｒαの細胞外ドメインと比較して、少なくとも１つ少ないＯ－グリコシル化および／またはＮ－グリコシル化を有する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の置換は、アスパラギンから、アラニン、スレオニン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択されるアミノ酸への置換である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の置換は、スレオニンから、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択されるアミノ酸への置換である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の置換は、アミノ酸Ｓ５０（例えば、Ｓ５０Ｐ）、アミノ酸Ｓ５１（例えば、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｎ、Ｓ５１Ｄ、Ｓ５１Ｃ、Ｓ５１Ｑ、Ｓ５１Ｅ、Ｓ５１Ｇ、Ｓ５１Ｈ、Ｓ５１Ｉ、Ｓ５１Ｌ、Ｓ５１Ｋ、Ｓ５１Ｍ、Ｓ５１Ｆ、Ｓ５１Ｐ、Ｓ５１Ｗ、Ｓ５１Ｙ、もしくはＳ５１Ｖ）、アミノ酸Ｔ６９（例えば、Ｔ６９Ｐ）、アミノ酸Ｔ７０（例えば、Ｔ７０Ｒ、Ｔ７０Ｎ、Ｔ７０Ｄ、Ｔ７０Ｃ、Ｔ７０Ｑ、Ｔ７０Ｅ、Ｔ７０Ｇ、Ｔ７０Ｈ、Ｔ７０Ｉ、Ｔ７０Ｌ、Ｔ７０Ｋ、Ｔ７０Ｍ、Ｔ７０Ｆ、Ｔ７０Ｐ、Ｔ７０Ｗ、Ｔ７０Ｙ、もしくはＴ７０Ｖ、アミノ酸Ｃ１９２（例えば、Ｃ１９２Ｒ、Ｃ１９２Ｎ、Ｃ１９２Ｄ、Ｃ１９２Ｑ、Ｃ１９２Ｅ、Ｃ１９２Ｇ、Ｃ１９２Ｈ、Ｃ１９２Ｉ、Ｃ１９２Ｌ、Ｃ１９２Ｋ、Ｃ１９２Ｍ、Ｃ１９２Ｆ、Ｃ１９２Ｐ、Ｃ１９２Ｗ、Ｃ１９２Ｙ、もしくはＣ１９２Ｖ）、またはそれらの任意の組合せにおいてである。

【0062】

一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0063】

融合タンパク質は、分子の種々の成分を接続する１つまたはそれ以上のリンカー（例えば、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカー）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質の２つまたはそれ以上の成分は、ペプチドリンカーによって互いに接続される。限定ではなく例として、リンカーは、（ａ）ＩＬ２部分および抗原結合性部分；（ｂ）ＩＬ２部分内の異なるドメイン（例えば、ＩＬ２ドメインおよびＩＬ－Ｒαドメイン）；または（ｃ）抗原結合性部分内の異なるドメイン（例えば、抗ＰＤ－１抗体の異なる成分）を接続するために使用することができる。

【0064】

ペプチドリンカーは、２アミノ酸から６０アミノ酸以上の範囲であることができ、一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、３アミノ酸から５０アミノ酸、４アミノ酸から３０アミノ酸、５アミノ酸から２５アミノ酸、１０アミノ酸から２５アミノ酸、１０アミノ酸から６０アミノ酸、１２アミノ酸から２０アミノ酸、２０アミノ酸から５０アミノ酸、または２５アミノ酸から３５アミノ酸の長さの範囲である。

【0065】

一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、または少なくとも７アミノ酸の長さであり、場合により、最大３０アミノ酸、最大４０アミノ酸、最大５０アミノ酸、または最大６０アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、長さが５アミノ酸から５０アミノ酸の範囲であり、例えば、長さが５から５０、５から４５、５から４０、５から３５、５から３０、５から２５、または５から２０アミノ酸の範囲である。前述の他の実施形態では、リンカーは、長さが６アミノ酸から５０アミノ酸の範囲であり、例えば、長さが６から５０、６から４５、６から４０、６から３５、６から３０、６から２５、または６から２０アミノ酸の範囲である。前述のさらに他の実施形態では、リンカーは、長さが７アミノ酸から５０アミノ酸の範囲であり、例えば、長さが７から５０、７から４５、７から４０、７から３５、７から３０、７から２５、または７から２０アミノ酸の範囲である。

【0066】

一部の実施形態では、リンカーは、極性（例えば、セリン（Ｓ））または荷電（例えば、リジン（Ｋ））残基を含む。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、１つまたはそれ以上のグリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）残基を含む可撓性リンカーである。

【0067】

本開示の融合タンパク質において使用することができる可撓性リンカーの例としては、Ｃｈｅｎら、２０１３、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７～１３６９、およびＫｌｅｉｎら、２０１４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２７（１０）：３２５～３３０、により開示されているものが挙げられる。特に有用な可撓性リンカーは、グリシンおよびセリンの繰り返し、例えば、ＧｎＳもしくはＳＧｎの単量体または多量体であるか、またはそれらを含み、ｎは１～１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一実施形態では、リンカーは、Ｇ４Ｓ（ＧＧＧＧＳ；配列番号６７）の繰り返しの単量体または多量体、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎであるか、またはそれらを含む。

【0068】

ポリグリシンリンカーは、本開示の融合タンパク質において好適に使用することができる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、連続する２つのグリシン（２Ｇｌｙ）、連続する３つのグリシン（３Ｇｌｙ）、連続する４つのグリシン（４Ｇｌｙ）（配列番号６８）、連続する５つのグリシン（５Ｇｌｙ）（配列番号６９）、連続する６つのグリシン（６Ｇｌｙ）（配列番号７０）、連続する７つのグリシン（７Ｇｌｙ）（配列番号７１）、連続する８つのグリシン（８Ｇｌｙ）（配列番号７２）または連続する９つのグリシン（９Ｇｌｙ）（配列番号７３）を含む。

【0069】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分および抗原結合性部分は、リンカーを介して接続される。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、ペプチドカーを介して抗原結合性部分のＣ末端に連結される。一部の実施形態では、リンカーは配列番号５０のアミノ酸配列を含む。

【0070】

別の態様では、本開示は：（ｉ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合するヒト抗体の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む第１のポリペプチド；ならびに（ｉｉ）（ａ）ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；および（ｂ）ＩＬ２部分を含む第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。

【0071】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）を含み、ならびにＬＣＶＲは、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み：ＨＣＤＲ１は配列番号４、２４、または４３のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は配列番号６、２６、または４５のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は配列番号８、２８、または４７のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は配列番号１２、または３２のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は配列番号１４のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３は配列番号１６または３５のアミノ酸配列を含む。

【0072】

一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４、および１６；（ｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、１４、および３５；または（ｉｉｉ）配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のそれぞれのアミノ酸配列を含む。

【0073】

一部の実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号４３、４５、４７、１２、１４、および１６のそれぞれのアミノ酸配列を含む。

【0074】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号２、２２、もしくは４１のアミノ酸配列、または配列番号２、２２、もしくは４１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１０、もしくは３０のアミノ酸配列、または配列番号１０、もしくは３０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0075】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0076】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0077】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号４１のアミノ酸配列、または配列番号４１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0078】

一部の実施形態では、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、（ｉ）配列番号２および１０；（ｉｉ）配列番号２２および３０；または（ｉｉｉ）配列番号４１および１０のそれぞれのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、配列番号４１および１０のそれぞれのアミノ酸配列を含む。

【0079】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、ＬＣＶＲに連結された軽鎖定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号５６のアミノ酸配列、または配列番号５６に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0080】

一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＨＣＶＲとＩＬ２部分との間に配置された重鎖定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号５５のアミノ酸配列、または配列番号５５に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0081】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５８、６０、もしくは６２の軽鎖アミノ酸配列、または配列番号５８、６０、もしくは６２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0082】

一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号５７、５９、もしくは６１の重鎖アミノ酸配列、または配列番号５７、５９、もしくは６１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む。

【0083】

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７／５８、５９／６０、または６１／６２の重鎖／軽鎖配列対を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６１／６２の重鎖／軽鎖アミノ酸配列対を含む。

【0084】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、リンカーを介して重鎖定常領域のＣ末端に接続される。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号６７）の１つまたはそれ以上の繰り返しのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号５０または５２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは配列番号５０のアミノ酸配列を含む。

【0085】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、（ｉ）ＩＬ２またはその断片；および（ｉｉ）ＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒα）またはその断片を含む。

【0086】

一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、配列番号５３のアミノ酸配列、または配列番号５３に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0087】

一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、ヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα）またはその断片である。一部の実施形態では、ＩＬ２Ｒαまたはその断片は、配列番号５１のアミノ酸配列、または配列番号５１に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0088】

一部の実施形態では、ＩＬ２部分は、配列番号５４のアミノ酸配列、または配列番号５４に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0089】

一部の実施形態では、ＩＬ２またはその断片は、リンカーを介してＩＬ２Ｒαまたはその断片のＣ末端に連結される。一実施形態では、リンカーは配列番号５２のアミノ酸配列を含む。

【0090】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５８、６０、もしくは６２のアミノ酸配列、または配列番号５８、６０、もしくは６２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列、または配列番号６３、６４、もしくは６５に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0091】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列、または配列番号５８に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列、または配列番号６４に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0092】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６０のアミノ酸配列、または配列番号６０に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列、または配列番号６３に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0093】

一部の実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号６２のアミノ酸配列、または配列番号６２に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列、または配列番号６５に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0094】

また、本開示において、本明細書中に記載の融合タンパク質によって形成される二量体融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、二量体融合タンパク質は、ホモ二量体融合タンパク質であり、それぞれの構成単量体は、本明細書に記載の融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、それぞれの構成単量体は、本明細書中に記載の融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、二量体融合タンパク質の単量体は、それぞれの単量体の重鎖定常領域を介して二量体化する。

【0095】

生物学的活性
本開示の融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、およびＩＬ２Ｒγに対する減弱した結合を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＥＧＮ２８１０、ペムブロリズマブまたはニボルマブと競合しない。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２と比較して、ヒトＩＬ２Ｒα／β／γ三量体およびＩＬ２Ｒβ／γ二量体受容体複合体を活性化する活性の低下を示し、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物と比較して、ヒトＩＬ２Ｒα／β／γ三量体およびＩＬ２Ｒβ／γ二量体受容体複合体を活性化する活性の増大を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、ＩＦＮ－γ放出のレベルによって測定されるように、抗原活性化Ｔ細胞を刺激する活性の増大を示す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＩＬ２単独または抗ＰＤ－１抗体との併用と比較して、増強された抗腫瘍効能を示した。

【0096】

核酸および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または核酸を提供する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、単一の核酸によってコードされる。他の実施形態では、例えば、ヘテロ二量体分子または２つ以上のポリペプチド鎖を含む抗ＰＤ－１抗体からなる分子の場合、融合タンパク質は、複数（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の核酸によってコードされる。

【0097】

単一の核酸は、単一のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質、２つもしくはそれ以上のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質、または３つ以上のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質の一部をコードすることができる（例えば、単一の核酸は、３つ、４つもしくはそれ以上のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質の２つのポリペプチド鎖、または４つもしくはそれ以上のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質の３つのポリペプチド鎖をコードすることができる）。発現を別々に制御するために、２つまたはそれ以上のポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレームは、別々の転写調節エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）の制御下にあることができる。また、２つまたはそれ以上のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、同じ転写調節エレメントによって制御され、別々のポリペプチドへの翻訳を可能にする配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって分離される。

【0098】

一部の実施形態では、２つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質は、２つまたはそれ以上の核酸によってコードされる。融合タンパク質をコードする核酸の数は、融合タンパク質中のポリペプチド鎖の数と等しいか、またはそれ未満である（例えば、２つ以上のポリペプチド鎖が単一の核酸によってコードされる場合）。

【0099】

本開示の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であることができる。

【0100】

別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含む宿主細胞およびベクターを提供する。核酸は、本明細書でより詳細に後述するように、同一の宿主細胞または別個の宿主細胞中に存在する単一のベクターまたは別個のベクター中に存在することができる。

【0101】

一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のベクター、および本明細書に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターを発現する。

【0102】

一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質の第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１のベクター、および本明細書に記載の融合タンパク質の第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターを発現する。

【0103】

本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質または融合タンパク質成分、例えば半抗体のポリペプチド鎖の１つまたは２つをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。

【0104】

数多くのベクターシステムを用いることができる。例えば、１つのクラスのベクターは、例えばウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。別のクラスのベクターは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、フラビウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡエレメントを利用する。

【0105】

さらに、ＤＮＡを染色体に安定に組み込んだ細胞は、トランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、例えば、従属栄養宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結するか、または共形質転換によって同じ細胞に導入することができる。ｍＲＮＡを最適に合成するためには、付加的なエレメントが必要な場合もある。これらのエレメントには、スプライスシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、終結シグナルなどが含まれる。

【0106】

構築物を含む発現ベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、発現ベクターは適切な宿主細胞にトランスフェクションまたは導入される。これを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション、その他の従来技術など、様々な技術を採用することができる。得られたトランスフェクトされた細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収するための方法および条件は、当業者に公知であり、本明細書に基づいて、採用される特定の発現ベクターおよび哺乳動物宿主細胞に応じて変化または最適化される。

【0107】

本開示はまた、本開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の核酸を含むように遺伝子操作される。一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用することによって遺伝子操作される。「発現カセット」という語句は、そのような配列に適合する宿主において遺伝子の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を指す。このようなカセットは、プロモーター、イントロンを含むまたは含まないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含むことができる。例えば、誘導性プロモーターのような、発現に必要または有用な付加的因子もまた使用されることがある。

【0108】

本開示はまた、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞も提供する。

【0109】

細胞は、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であることができるが、これらに限定されない。適切な真核細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、およびＭＤＣＫＩＩ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

医薬組成物
本明細書に開示された融合タンパク質または二量体融合タンパク質は、融合タンパク質（例えば、二量体融合タンパク質）および１つまたはそれ以上の担体、賦形剤および／または希釈剤を含む組成物の形態であってもよい。

【0111】

組成物は、獣医学的用途またはヒトにおける医薬的用途のような特定の用途のために製剤化される。組成物の形態（例えば、乾燥粉末、液体製剤など）および使用される賦形剤、希釈剤および／または担体は、融合タンパク質または二量体融合タンパク質の意図される用途、および治療用途の場合、投与様式に依存する。

【0112】

治療用途の場合、組成物は、薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に依存して）任意の適切な形態であることができる。この医薬組成物は、経口、経皮、皮下、経鼻、静脈内、筋肉内、腫瘍内、くも膜下腔内、局所的または局在的などの種々の経路で患者に投与される。どのような場合にも最も適した投与経路は、特定の抗体、対象、疾患の性質および重症度、ならびに対象の身体状態に依存する。一部の実施形態では、医薬組成物は静脈内または皮下に投与される。

【0113】

医薬組成物は、１用量あたり所定量の本開示の融合タンパク質を含む単位剤形で都合よく提示される。単位用量に含まれる融合タンパク質の量は、処置される疾患、ならびに当技術分野で周知の他の要因に依存する。このような単位用量は、１回の投与に適した量の融合タンパク質を含む凍結乾燥粉末の形態であっても、液体の形態であってもよい。乾燥粉末単位剤形は、注射器、適量の希釈剤および／または投与に有用な他の成分とともにキットに包装される。液体の形態の単位剤形は、１回の投与に適した量の融合タンパク質が予め充填された注射器の形態で都合よく供給される。医薬組成物はまた、複数回の投与に適した量の融合タンパク質を含むバルクで供給される。

【0114】

医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液として保存するために、所望の純度を有する融合タンパク質を、当技術分野で通常使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（本明細書中では、これらすべてを「担体」と称する）、すなわち緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｆｉｅｒ）、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、および他の種々の添加剤 （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌ編、１９８０）参照）。このような添加物は、使用される用量と濃度において、レシピエントに無毒でなければならない。

【0115】

使用の方法
本開示の融合タンパク質は、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に細胞性免疫応答の増強が望ましい状態の処置に有用である。これらは、宿主の免疫応答が不十分または欠損している疾患状態を含んでもよい。本開示の融合タンパク質を投与することができる疾患状態は、例えば、細胞性免疫応答が特異的免疫の重要な機構となる腫瘍または感染症を含む。本開示の融合タンパク質を採用することができる特定の疾患状態には、癌、例えば腎細胞癌または黒色腫；免疫不全、特にＨＩＶ陽性患者、免疫抑制患者、慢性感染症などが含まれる。本開示の融合タンパク質は、それ自体または任意の適切な医薬組成物で投与される。

【0116】

一態様では、医薬品として使用するための本開示の融合タンパク質が提供される。さらなる態様では、疾患の処置に使用するための本開示の融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、処置の方法に使用するための本開示の融合タンパク質が提供される。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における疾患の処置に使用するための、本明細書に記載の融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、治療有効量の融合タンパク質を対象に投与することを含む、疾患を有する対象を処置する方法に使用するための融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。一部の実施形態では、疾患は癌である。

【0117】

一部の実施形態では、本方法は、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療薬、例えば、治療される疾患が癌である場合には抗癌剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本開示は、免疫系を刺激する際に使用するための融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、免疫系を刺激するために有効量の融合タンパク質を対象に投与することを含む、対象の免疫系を刺激する方法に使用するための融合タンパク質を提供する。

【0118】

本明細書の実施形態のいずれかに記載の「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加などのいずれか１つまたはそれ以上を含むことができる。

【0119】

さらなる態様では、本開示は、それを必要とする対象における疾患の処置のための医薬品の製造または調製における、本開示の融合タンパク質の使用を提供する。一実施形態では、医薬品は、疾患を有する対象に治療有効量の医薬品を投与することを含む、疾患を処置する方法に使用するためのものである。一部の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。一部の実施形態では、疾患は癌である。そのような一実施形態では、本方法は、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療薬、例えば、治療される疾患が癌である場合には抗癌剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、医薬品は、免疫系を刺激するためのものである。さらなる実施形態では、医薬品は、免疫系を刺激するために有効量の医薬を対象に投与することを含む、対象の免疫系を刺激する方法に使用するためのものである。

【0120】

一部の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害、好ましくは癌である。癌の非限定的な例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、および腎臓癌が挙げられる。本開示の融合タンパク質を用いて処置することができる他の細胞増殖性障害としては：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域、および泌尿生殖器系、に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。また、前癌状態または病変および癌転移も含まれる。一部の実施形態では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌からなる群から選択される。同様に、他の細胞増殖性障害もまた、本開示の融合タンパク質によって処置することができる。このような細胞増殖性障害の例としては：高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球症、および上記に列挙した器官系に位置する、新生物以外の任意の他の細胞増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、疾患は、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後の免疫応答、および感染症（例えば、ＨＩＶ）に関連する。より具体的には、融合タンパク質は、リンパ腫；自己免疫、移植拒絶反応、移植片対宿主病、虚血、および脳卒中を含む免疫細胞媒介性障害に関与する細胞の排除に使用することができる。当業者は、多くの場合、融合タンパク質が治癒を提供せず、部分的な利益のみを提供する場合があることを容易に認識する。一部の実施形態では、何らかの利益を有する生理学的変化はまた、治療的に有益であると考えられる。したがって、一部の実施形態では、生理学的変化を提供する融合タンパク質の量は、「有効量」または「治療有効量」と考えられる。処置を必要とする対象または患者は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。

【0121】

様々な時点にわたる単回または複数回の投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投与スケジュールが本明細書では企図される。

【0122】

本開示の融合タンパク質は、一般に、意図される目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患の状態を処置または予防するために使用する場合、本開示の融合タンパク質またはその医薬組成物は、治療有効量で投与または適用される。

【0123】

典型的な１日の投与量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲の可能性がある。状態に応じて、数日間またはそれ以上にわたる反復投与の場合、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。融合タンパク質の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１００ｍｇ／ｋｇ体重以上、およびそこから誘導可能な任意の範囲を含むこともある。本明細書に列挙した数値から誘導可能な範囲の非限定的な例では、上記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲を投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはそれらの任意の組合せ）の１回またはそれ以上の用量を患者に投与することができる。このような用量を、断続的に、例えば、１週間ごとまたは３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者が融合タンパク質の約２～約２０回、または例えば、約６回の用量を受けるように）。最初の高用量のローディング用量が投与され、次いで１回またはそれ以上の低用量が投与される。しかし、他の投与量レジメンも有用である。この治療の経過は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターできる。

【0124】

本明細書に記載の融合タンパク質の治療有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供する。融合タンパク質の毒性および治療効能は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定される。細胞培養アッセイおよび動物試験は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するために使用される。毒性と治療効能の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。一実施形態では、本開示に記載の融合タンパク質は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用に適切な投与量の範囲を策定する際に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、種々の因子、例えば、採用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などに依存して、この範囲内で変化することがある（例えば、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１、１頁を参照されたい）。

【0125】

毒性が低いため、本開示の融合タンパク質は、野生型ＩＬ２よりも高い最大治療用量を有することができる。

【0126】

本開示に記載の融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の他の薬剤または療法と組み合わせて投与される。例えば、本開示の融合タンパク質は、少なくとも１つの追加の治療剤または療法と共投与される。「治療剤」という用語は、そのような処置を必要とする対象における症状または疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、処置される特定の適応症に適した任意の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する活性成分から構成される。一部の実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着阻害剤、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は抗癌剤、例えば微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。

【0127】

特定の実施形態では、第２の治療剤または治療法は：放射線、手術、化学療法剤、腫瘍溶解性ウイルス、癌ワクチン、ＰＤ－１阻害剤、Ｂ７－Ｈ３阻害剤、Ｂ７－Ｈ４阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）阻害剤、ガレクチン９（ＧＡＬ９）阻害剤、Ｖドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有Ｔ細胞活性化抑制因子（ＶＩＳＴＡ）阻害剤、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）阻害剤、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）阻害剤、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＣＤ３８阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＣＤ２８活性化因子、４－１ＢＢ活性化因子、ＧＩＴＲアゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＯＸ４０調節剤、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、アンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）阻害剤、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）ワクチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、細胞毒素、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）阻害剤、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、Ｉ型インターフェロン、抗体薬物複合体、抗炎症薬、およびこれらの組合せ、から選択される。

【0128】

特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて使用され、抗体は、ヒトＰＤ－１への結合について融合タンパク質と交差競合しない。

【0129】

そのような他の薬剤は、好適には、意図された目的に有効な量で組み合わせて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害または処置のタイプ、および上述した他の要因に依存する。融合タンパク質は、一般に、本明細書の記載と同じ用量および投与経路で、または本明細書に記載の用量の約１～９９％の用量で、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の用量および任意の経路で使用される。

【0130】

上記のこのような併用療法は、併用投与（２つまたはそれ以上の治療剤が同じ組成物または別個の組成物に含まれる）および別個の投与を包含し、この場合、本開示の融合タンパク質の投与は、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前、同時、および／または後に起こり得る。本開示の融合タンパク質はまた、放射線療法および／または手術と組み合わせて使用することができる。

【0131】

さらなる定義
本開示に記載の組成物および方法の詳細な説明の理解を助けるために、本開示の様々な態様の明確な開示を容易にするために、（本明細書の他の箇所で開示されるものに加えて）いくつかの明示的な定義が提供される。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0132】

本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という用語は、共有結合的または非共有結合的に結合される２つまたはそれ以上のポリペプチド配列を含むタンパク質を意味する。例えば、本開示に包含される融合ポリペプチドは、第１のポリペプチドをコードする核酸配列と第２のポリペプチドをコードする核酸配列とを結合して単一のオープンリーディングフレームを形成するキメラ遺伝子構築物の翻訳産物を含むことができる。あるいは、融合タンパク質は、宿主細胞中で共発現することができる別々のベクター上の２つまたはそれ以上の遺伝子構築物によってコードされることがある。言い換えれば、「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、ペプチド結合によって、またはいくつかのペプチドを介して結合される２つまたはそれ以上のタンパク質の組換えタンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質はまた、２つのドメイン間にペプチドリンカーを含んでいてもよい。

【0133】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために互換的に使用される。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。用語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ペギル化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作をされたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログ、およびペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸を含む。

【0134】

本明細書中で使用される場合、ＩＬ－２の「野生型」形態は、野生型形態が突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸位置に野生型アミノ酸を有すること以外は、突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドと同じであるＩＬ－２の形態である。例えば、ＩＬ－２突然変異体が完全長ＩＬ－２（すなわち、任意の他の分子と融合または結合していないＩＬ－２）である場合、この突然変異体の野生型形態は完全長天然ＩＬ－２である。ＩＬ－２突然変異体がＩＬ－２とＩＬ－２の下流にコードされる別のポリペプチド（例えば、抗体鎖）との融合体である場合、このＩＬ－２突然変異体の野生型形態は、同じ下流ポリペプチドに融合した野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－２である。さらに、ＩＬ－２突然変異体がＩＬ－２の短縮型（ＩＬ－２の非短縮部分内の突然変異または修飾された配列）である場合、このＩＬ－２突然変異体の野生型形態は、野生型配列を有する同様に短縮されたＩＬ－２である。

【0135】

本明細書に開示される融合タンパク質は、１つまたはそれ以上の保存的修飾を含むことができる。１つまたはそれ以上の保存的修飾を有する融合タンパク質は、所望の機能的特性を保持することがあり、これは、当技術分野で公知の機能的アッセイを用いて試験することができる。本明細書中で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質の結合特性に有意な影響を及ぼさないかまたは変化させないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発など、当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）；β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）；および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。Ｃａｓタンパク質は、１つまたはそれ以上の保存的修飾を含む。１つまたはそれ以上の保存的修飾を有するＣａｓタンパク質は、所望の機能的特性を保持することがあり、これは、当技術分野で公知の機能的アッセイを用いて試験することができる。本明細書中で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質の結合特性に有意な影響を及ぼさないかまたは変化させないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発など、当技術分野で知られている標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）；非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）；β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）；および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

【0136】

本明細書中で使用される場合、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0137】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ギャップ長ペナルティーを１２とし、ギャップペナルティーを４とする、ＰＡＭ１２０重み付け残基表を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）へと組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１～１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４～４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができる。

【0138】

加えてまたは代替的に、本開示のタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施することができる。比較のためにギャップアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９～３４０２に記載のＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用することができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。

【0139】

本明細書で使用される場合、核酸またはその断片に言及する場合、「実質的同一性」または「実質的に同一」という用語は、別の核酸（またはその相補鎖）と適切なヌクレオチドの挿入または欠失で最適に整列させた場合に、後述のＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定されるように、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列の同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、ある例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがある。ポリペプチドに適用される場合、「実質的類似性」または「実質的に類似する」という用語は、デフォルトのギャップ重み付けを用いたＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどによって最適に整列された場合、２つのペプチド配列が少なくとも９０％の配列同一性を共有すること、さらに好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を補正するために、類似性のパーセントまたは程度を上方修正することができる。この調整を行う手段は、当業者によく知られている。例えば、参照によって本明細書に組み入れる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１を参照されたい。

【0140】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「組換え体」という用語は、例えば、ＤＮＡスプライシングおよびトランスジェニック発現を含む、組換えＤＮＡ技術として当技術分野で公知の技術または方法によって作製、発現、単離、または取得された本開示のタンパク質またはその断片を指す。この用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、または細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系で発現された融合タンパク質、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された融合タンパク質を指す。

【0141】

本明細書で使用される場合、融合タンパク質またはその成分（例えば、抗体のような標的部分）の文脈における「会合する」という用語は、２つまたはそれ以上のポリペプチド鎖間の機能的関係を指す。特に、「会合した」という用語は、機能的な融合タンパク質を産生するように、２つまたはそれ以上のポリペプチドが、例えば、分子相互作用を通して非共有結合的に、または１つまたはそれ以上のジスルフィド橋もしくは化学的架橋を通して共有結合的に、互いに会合していることを意味する。本開示の融合タンパク質に存在し得る会合の例には、Ｆｃ領域におけるホモ二量体またはヘテロ二量体Ｆｃドメイン間の会合、ＦａｂまたはｓｃＦｖにおけるＶＨ領域とＶＬ領域間の会合、ＦａｂにおけるＣＨ１とＣＬ間の会合、およびドメイン置換ＦａｂにおけるＣＨ３とＣＨ３間の会合が含まれる（しかし、これらに限定されない）。

【0142】

本明細書で使用される場合、融合タンパク質中のＩＬ２部分および／または標的部分に関して本明細書で使用される「一価」という用語は、それぞれ単一のＩＬ２部分および／または標的部分（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性部分）のみを有する融合タンパク質を意味する。

【0143】

本明細書で使用される場合、融合タンパク質中のＩＬ２部分および／または標的部分に関して本明細書で使用される「二価」という用語は、それぞれ２つのＩＬ２部分および／または標的部分（例えば、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性部分）を有する融合タンパク質を意味する。典型的には、ＩＬ２部分および／または標的部分について二価である融合タンパク質は、二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれか）である。

【0144】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を指す。一般に、それぞれの重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＨＣＤＲ－Ｈ３）があり、それぞれの軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。ＣＤＲの境界を特定するために使用できる例示的な規約には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡＢＭ定義、およびＩＭＧＴ定義が含まれる。例えば、Ｋａｂａｔ、１９９１、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（Ｋａｂａｔ番号付け方式）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７～９４８（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）；Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８～９２７２（ＡＢＭ番号付け方式）；およびＬｅｆｒａｎｃら、２００３、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５～７７（ＩＭＧＴ番号付け方式）を参照されたい。抗体中のＣＤＲ配列を同定するための公開データベースも利用可能である。

【0145】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、別の重鎖の対応する部分と対になる重鎖の部分を指す。「Ｆｃ領域」という用語は、２つの重鎖Ｆｃドメインの会合によって形成される抗体ベースの結合分子の領域を指す。Ｆｃ領域内の２つのＦｃドメインは、互いに同じであっても異なっていてもよい。天然の抗体では、Ｆｃドメインは通常同一であるが、一方または両方のＦｃドメインが、例えばノブ－イン－ホール相互作用を介して、ヘテロ二量体化を可能にするように有利に修飾される可能性がある。

【0146】

本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間後にベースラインと最大値の中間の応答を誘導する分子（融合タンパク質など）の最大半量の有効濃度を指す。ＥＣ５０は本質的に、最大効果の５０％が観察される抗体または融合タンパク質の濃度を表す。一部の実施形態では、ＥＣ５０値は、アッセイにおいて最大半量のＳＴＡＴ５活性化を与える融合タンパク質の濃度に等しい。

【0147】

エピトープ、または抗原決定基とは、本明細書に記載の、抗体または他の抗原結合性部分によって認識される抗原（例えば、標的分子）の一部分である。エピトープは、直鎖状であっても、コンフォメーション状であってもよい。

【0148】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類等の非哺乳動物を含む。注記した場合を除いて、「患者」または「対象」という用語は、本明細書では相互交換可能に用いられる。

【0149】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「標的分子」という用語は、本開示の融合タンパク質の標的部分によって特異的に結合され、細胞表面上または細胞外マトリックス中に発現される任意の生物学的分子（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、またはそれらの組合せ）を指す。

【0150】

本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、増殖性障害の進行、重症度および／もしくは持続期間の減少もしくは改善、または本開示の１つまたはそれ以上の融合タンパク質の投与によって生じる増殖性障害の１つまたはそれ以上の症状（好ましくは、１つまたはそれ以上の識別可能な症状）の改善を指す。特定の実施形態では、「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、腫瘍の増殖のような増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指すが、必ずしも患者によって識別可能である必要はない。他の実施形態では、「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、例えば識別可能な症状の安定化による物理的な、例えば物理的パラメータの安定化による生理学的な、またはその両方による増殖性障害の進行の抑制を指す。他の実施形態では、「処置する」、「処置」、および「処置すること」という用語は、腫瘍サイズまたは癌細胞数の減少または安定化を指す。

【0151】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、異常細胞の制御不能な（急速であることが多い）増殖を特徴とする疾患を指す。癌細胞は、局所的に、または血流やリンパ系を介して身体の他の部分に広がる可能性がある。様々な癌の例が本明細書に記載されており、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、副腎癌、自律神経節癌、胆道癌、骨癌、子宮内膜癌、眼球癌、卵管癌、生殖器癌、大腸癌、髄膜癌、食道癌、腹膜癌、下垂体癌、陰茎癌、胎盤癌、胸膜癌、唾液腺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、上部気道消化管癌、尿路癌、膣癌、外陰癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0152】

本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、本明細書において「癌」という用語と互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固形腫瘍および液性腫瘍、例えば、びまん性腫瘍または循環性腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「癌」または「腫瘍」という用語は、悪性癌および腫瘍と同様に、前悪性癌および腫瘍を含む。

【0153】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸が導入された細胞を指す。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞、およびこのような細胞の子孫または潜在的子孫を指すことが理解される。特定の修飾は突然変異または環境影響いずれかのために、続く世代において生じるので、このような後代は、親細胞と実際同一ではない場合もあるが、本明細書における用語の範囲内に依然として含まれる。典型的な宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞などの真核宿主細胞である。

【0154】

本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などへ）転写される過程、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物およびコードされたポリペプチドを総称して「遺伝子産物」と呼ぶことがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来の場合、発現には真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれる。

【0155】

本明細書で使用される場合、「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、本来の環境から除去された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。例えば、ベクターに含まれる治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本開示の目的上、単離されたものと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中で精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、通常ポリヌクレオチド分子を含む細胞中に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に、または本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本開示のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写物、ならびにポジティブ鎖およびネガティブ鎖の形態、ならびに二本鎖の形態を含む。本開示に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されたこのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターのような調節エレメントであってもよく、またはそれを含んでもよい。

【0156】

本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、いずれも正常な機能を損なうヒトまたは動物の身体またはその一部の異常な状態を反映しているという点で、一般的に、「障害」および「状態」（医学的状態における）という用語と同義であることを意図しており、互換的に使用され、典型的には特徴的な徴候および症状によって示され、ヒトまたは動物の生命の期間または質を低下させる。

【0157】

本明細書で使用される場合、「組成物」または「医薬組成物」という用語は、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤のような他の成分と組み合わせて、本開示の融合タンパク質と共に有用な少なくとも１つの成分の混合物を指す。医薬組成物は、生物への本開示の１つまたはそれ以上の成分の投与を容易にする。

【0158】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または希釈剤のような、組成物の生物学的活性または特性を損なわず、比較的無毒性である、すなわち、その材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、対象に投与することができる材料を指す。

【0159】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を含み、本開示の化合物を、それが意図される機能を発揮するように、対象内または対象へ運搬または輸送することに関与する。典型的には、このような化合物は、ある臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に運搬または輸送される。それぞれの塩または担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に害を与えないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能する物質の例としては：ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび座薬用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；潤滑剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；香料；保存剤；酸化防止剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤；固化剤；懸濁化剤；界面活性剤；保水剤；担体；安定剤；および医薬製剤に使用される他の非毒性の適合性物質、またはそれらの任意の組合せ、が挙げられる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本開示の１つまたはそれ以上の成分の活性と適合性であり、対象に生理学的に許容される、任意のおよびすべてのコーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。補足的活性化合物も組成物中に組み込まれる。

【0160】

本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、生物学的状態の任意の変化、すなわち、増加、減少などを指すことを意味する。

【0161】

本明細書で使用される場合、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、一般に、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書で使用される；疑義を避けるために、「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％の増加、または少なくとも約３０％の増加、または少なくとも約４０％の増加、または少なくとも約５０％の増加、または少なくとも約６０％の増加、または少なくとも約７０％の増加、または少なくとも約８０％の増加、または少なくとも約９０％の増加、または１００％を含み１００％までの増加、または１０～１００％の間の任意の増加、または基準レベルと比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の増加、または基準レベルと比較して２倍から１０倍以上の間の任意の増加を意味する。

【0162】

本明細書で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。

【0163】

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語およびその変形は、特に断りのない限り、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびに追加の主題を包含することを意味する。

【0164】

本明細書で使用される場合、「一実施形態では」、「様々な実施形態では」、「一部の実施形態では、」などの語句が繰り返し使用される。このような語句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、文脈がそうでないことを指示しない限り、そうであってもよい。

【0165】

本明細書で使用される場合、「および／または」または「／」という用語は、この用語が関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組合せ、または項目のすべてを意味する。

【0166】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という語は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要な場合には、定義から「実質的に」という語を取り除くことができる。

【0167】

本明細書で使用される場合、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。一部の実施形態では、「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特に断らない限り、または文脈から明らかな場合を除き（そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下のいずれかの方向（より大きい、またはより小さい）に収まる値の範囲を指す。本明細書において別段の指示がない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能性の点で同等である、記載された範囲に近接した値、例えば重量パーセントを含むことを意図している。

【0168】

本明細書で開示される場合、値の多数の範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間に、文脈が明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値も具体的に開示されていることが理解される。明記された範囲内の任意の明記された値または介在値と、その明記された範囲内の任意の他の明記された値または介在する値との間のそれぞれの小範囲は、本開示に包含される。これらの小さい範囲の上限値および下限値は、それぞれ独立に、範囲に含まれることも除外されることもあり、いずれか、どちらでもない、または両方の限界値が小さい範囲に含まれるそれぞれの範囲も、本開示に包含され、明記された範囲内の特に除外された限界値に従う。明記された範囲に限界値の一方または両方が含まれる場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除外した範囲も本開示に包含される。

【0169】

本明細書で使用される場合、「それぞれ」という用語は、項目のコレクションに関連して使用される場合、コレクション内の個々の項目を特定することを意図しているが、必ずしもコレクション内のすべての項目を指すわけではない。明示的な開示または文脈が明確に指示する場合は、例外が生じる可能性がある。

【0170】

本明細書に提供されたすべての任意の例、または例証的な語（例えば、「のような」）の使用は、本発明をよりよく説明するためのものに過ぎず、別途特許請求の範囲に記載される本発明の範囲に制限をかけるものではないことが意図される。本明細書中の語は、本開示の実施にとって不可欠な任意の特許請求の範囲に記載されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

【0171】

本明細書において他に示されない限り、または情況により明白に否定されない限り、本明細書に記載されたすべての方法は、任意の適当な順序で実施される。提供されるいずれの方法に関しても、方法の工程は同時に発生してもよいし、順次発生してもよい。方法の工程が順次起こる場合、特に断りのない限り、工程はどのような順序で起こってもよい。方法が工程の組合せを含む場合、本明細書において特に断りのない限り、工程のそれぞれの組合せまたはサブ組合せは、本開示の範囲内に包含される。

【0172】

本明細書に引用される各刊行物、特許出願書類、特許書類、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない限りにおいて、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。本明細書に開示された刊行物は、本開示の出願日前の開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本開示が先行開示によるそのような公開に優先する権利を持たないことを認めるものと解釈すべきではない。さらに、提供された公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、独立に確認する必要がある場合がある。

【0173】

本明細書に記載の実施例および実施形態は説明目的のためのみであり、ならびに様々の修飾またはそれに照らした変更は当業者に示唆され、本出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることは理解される。

【実施例】

【0174】

以下の実施例は、本開示の方法および組成物の製造方法および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために記載されたものであり、本発明者らが本発明と考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。同様に、本開示は、本明細書に記載される任意の特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、実施形態の修飾および変形は、本明細書を読むことにより当業者には明らかであり、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、若干の実験誤差および逸脱は説明されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏度、室温は約２５℃、圧力は大気圧または大気圧付近である。

【実施例1】

【0175】

ヒトＰＤ－１に対するヒト抗体の作製
ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを用いて、ＰＤ－１タンパク質に対するヒト抗体を作製した。このマウスにアジュバント存在下、ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００５００９．２の約２５～１７０アミノ酸のＰＤ－１断片を免疫した。抗体免疫応答はＰＤ－１特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が得られた場合、脾臓細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて生存率を保ち、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、ＰＤ－１特異的抗体を産生する細胞株を同定するために選択した。

【0176】

参照によりその全体を本明細書に特に組み入れる、米国特許第７，５８２，２９８号に記載されているように、骨髄腫細胞と融合することなく抗原陽性マウスＢ細胞から抗ＰＤ－１抗体を直接単離した。

【0177】

この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた。

【0178】

上記で開示したように作製された例示的な抗体はｍＡｂ２９５１２、ｍＡｂ７７９８、ｍＡｂ９０４８と命名され、表１および表２で同定されたＨＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＶＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列および核酸配列を有する。

【0179】

例示的な抗ＰＤ－１抗体を、当技術分野で知られている標準的な分子生物学的技術を用いてＩＬ２ベースの試薬を構築する際に使用した。表４に試薬のアミノ酸配列を開示する。

【0180】

本実施例の方法に従って作製された例示的タンパク質の生物学的特性は、以下に記載される実施例において詳細に記載される。

【実施例2】

【0181】

重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列
表１は、例示的な抗ＰＤ－１抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列、ＣＤＲ配列のアミノ酸配列識別子を示す。

【0182】

【表1】

【0183】

例示的な抗ＰＤ－１抗体の対応する核酸配列識別子を表２に示す。

【0184】

【表2】

【0185】

抗体はヒトまたはマウスのＦｃアイソタイプを有することがある。当業者には理解されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができるが（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる、など）、いずれにせよ、表１に示す数値識別子で示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず、同一または実質的に類似していると予想される。

【0186】

ヒンジ領域のセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ１０８Ｐ）を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含むｍＡｂ２９５１２、ｍＡｂ７７９８、およびｍＡｂ９０４８の例示的な抗体は、それぞれＨ４Ｈ２９５１２、ＲＥＧＮ２８１０、およびＨ４Ｈ９０４８と命名された。表３に、これらの抗体の完全長重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列識別子を示す。

【0187】

【表3】

【0188】

ＲＥＧＮ２８１０（セミピリマブとしても知られる；ＬＩＢＴＡＹＯ（登録商標））は、米国特許第９，９８７，５００号で初めて開示され、その後、皮膚扁平上皮癌、基底細胞癌、非小細胞肺癌の処置のために承認されている。

【0189】

表４は、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２試薬のアミノ酸配列識別子を示す。

【0190】

【表4】

【0191】

ＩＬ２部分は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むリンカーを介して重鎖定常領域（配列番号５５）のＣ末端に接続される。ＲＥＧＮ１０５９５については、重鎖（ＨＣ）配列番号５７は、ＨＣＶＲ（配列番号２）、重鎖定常領域（配列番号５５）、リンカー（配列番号５０）、およびＩＬ２部分（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。ＲＥＧＮ１０４８６については、重鎖（ＨＣ）配列番号５９は、ＨＣＶＲ（配列番号２２）、重鎖定常領域（配列番号５５）、リンカー（配列番号５０）、およびＩＬ２部分（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。ＲＥＧＮ１０５９７については、重鎖（ＨＣ）配列番号６１は、ＨＣＶＲ（配列番号４１）、重鎖定常領域（配列番号５５）、リンカー（配列番号５０）、およびＩＬ２部分（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む。

【0192】

以下の実施例で使用される対照構築物：
比較のため、以下の対照構築物を以下の実施例に含めた：「Ｃｏｍｐ １」：ＷＯ２００８／１５６７１２（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ）に記載の抗体「ＭＫ－３４７５」のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列を有するモノクローナル抗ＰＤ－１抗体；「Ｃｏｍｐ ２」：ＷＯ２００６／１２１１６８（Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｉｎｃ／Ｅ Ｒ Ｓｑｕｉｂｂ）に記載の抗体「５Ｃ４」のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列を有するモノクローナル抗ＰＤ－１抗体；および「ＲＥＧＮ１３２３３」：配列番号４１／１０のＶＨ／ＶＬ配列を含み、ＣＤ２５結合が消失したＩＬ２バリアント（ＩＬ２（３ｍ））に連結された抗ＰＤ－１抗体（Ｋｌｅｉｎら、２０１７、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。

【実施例3】

【0193】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物と親二価抗ＰＤ１抗体との結合動態
抗ＰＤ１－ＩＬ２ＲΑ－ＩＬ２融合構築物と親二価抗ＰＤ１抗体との結合動態を評価するために、Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現させたヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１．ｍｍＨ、配列番号６６）と精製抗ＰＤ－１親ｍＡｂおよび抗ＰＤ１－ＩＬ２ＲΑ－ＩＬ２融合構築物との結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００または４０００装置を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて測定した。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ－１００８－３９）を用いてアミンカップリングにより誘導体化した。すべてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）を含む緩衝液中で行った。ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液で調製した異なる濃度のｈＰＤ－１．ｍｍＨ（３倍希釈で１００から３．７ｎＭ、または３倍希釈で９０ｎＭから３．３３ｎＭの範囲）を、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の捕捉表面上に、３０または５０μＬ／分の流速で注入した。抗体と試薬の会合を４分または５分間モニターし、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中の解離を１０分間モニターした。それぞれのサイクルの最後に、抗ＰＤ－１ ｍＡｂまたは抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物捕捉表面を、２０ｍＭリン酸を１２秒間注入して再生した。すべての結合動態実験は２５℃で行った。

【0194】

速度論的結合（ｋ_ａ）および解離（ｋ_ｄ）速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを用いて、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルにフィッティングすることにより決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）と解離半減期（ｔ１／２）は動力学速度定数から次のように計算した：

【数1】

【0195】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物と親二価抗ＰＤ１抗体の結合動態を表５に要約する。

【0196】

【表5】

【実施例4】

【0197】

抗ＰＤ－１ ｍＡｂと抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の交差競合
抗ＰＤ－１ ｍＡｂと抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の交差競合を評価するために、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と市販の抗ＰＤ－１ ｍＡｂの結合競合を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、Ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いたリアルタイム、ラベルフリーのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイを用いて決定した。実験全体は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含む緩衝液（Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液）中、２５℃で行い、プレートは１０００ｒｐｍの速度で振とうした。２つの抗体がｈＰＤ－１．ｍｍＨ（配列番号６６）上のそれぞれのエピトープに結合するために互いに競合できるかどうかを評価するために、ｈＰＤ－１．ｍｍＨの２０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルにバイオセンサーを２分間浸漬することにより、まず約０．３４ｎｍのｈＰＤ－１．ｍｍＨをＨＩＳ１Ｋ抗体コートＯｃｔｅｔバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ、＃１８－５１２０）に捕捉した。次に、抗原を捕捉したバイオセンサーを、５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ－１溶液を含むウェルに５分間浸漬することにより、一次抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物（以降、ｍＡｂ－１と呼ぶ）で飽和させた。続いて、二次抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物（以降、ｍＡｂ－２と呼ぶ）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含むウェルにバイオセンサーを３分間浸漬した。実験のそれぞれの工程の間に、すべてのバイオセンサーをＯｃｔｅｔ ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で洗浄した。実験期間中、リアルタイムの結合反応をモニターし、それぞれの工程の終了時の結合反応を記録し、ｍＡｂ－１と前複合体化したｈＰＤ－１．ｍｍＨに対するｍＡｂ－２の結合反応を比較し、異なる抗ＰＤ－１抗体の競合的／非競合的挙動を、５０％阻害閾値を用いて決定した。

【0198】

表６は、結合の順序とは無関係に、両方向で競合する抗体の関係を定義したものである。

【0199】

【表6】

【0200】

表６は、ＲＥＧＮ１０４８６とその親抗体ＲＥＧＮ２８１０が、ｈＰＤ－１への結合においてＲＥＧＮ１０５９５またはＲＥＧＮ１０５９７と交差競合しなかったことを示す。

【実施例5】

【0201】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物の細胞株工学的ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能特性評価
ＹＴ／レポーター細胞のエンジニアリング：ヒトＴ／ＮＫ細胞白血病ＹＴ細胞株を、シグナル伝達および転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）－ルシフェラーゼレポーター構築物でエレクトロポレーションし、Ｉｓｃｏｖｅｓ＋２０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンで維持した。ＩＬ－２に高い反応性を示す単一細胞クローンを同定し、ＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ ｃｌ．４と新たに命名した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いてＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）をこのクローンでノックアウトし、得られた細胞株ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒα ＫＯをフローサイトメトリーで検証した。次いで、ヒトＩＬ２ＲαをＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒα ＫＯ細胞株（受託番号ＮＰ＿０００４０８．１のアミノ酸Ｍ１－Ｉ２７２）に安定的に再導入し、得られた細胞株ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒαをフローサイトメトリーで検証し、Ｉｓｃｏｖｅｓ＋２０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン＋１５μｇ／ｍＬブラストサイジンで維持した。ＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ ｃｌ．４、ＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒα ＫＯ、およびＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒα細胞を、ヒトＰＤ１（受託番号ＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸Ｍ１－Ｌ２８８、２Ｑ＝＞Ｅ突然変異）を安定に発現するように操作し、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８添加培地で細胞を選択した。細胞をフローサイトメトリーで検証し、ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１、ＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＩＬ２Ｒα ＫＯ／ｈＰＤ１、およびＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ｈＩＬ２Ｒα／ｈＰＤ１と新たに命名した。

【0202】

ＰＤ１レポーター細胞のエンジニアリング：アクチベータータンパク質１（ＡＰ１）ルシフェラーゼレポーター構築物を安定に発現するようにＪｕｒｋａｔ Ｅ６－１細胞を操作し、抗生物質耐性細胞を選択し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋１μｇ／ｍＬピューロマイシンで維持した。得られたレポーター細胞のプールを、ヒトＰＤ１（受託番号ＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸Ｍ１－Ｌ２８８、２Ｑ＝＞Ｅ突然変異）を発現するように操作し、高ＰＤ－１発現クローン細胞株を蛍光活性化細胞選別法によって単離し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋１μｇ／ｍＬピューロマイシンで維持した。得られたクローンをＪｕｒｋａｔ／ＡＰ１－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１ ｃｌ．４Ｅ５と新たに命名した。

【0203】

ＨＥＫ２９３／抗ＣＤ３／ＰＤ－Ｌ１細胞のエンジニアリング：ＨＥＫ２９３に、ヒトＣＤ７９ａ（受託番号ＮＰ＿００１７７４．１のｈＩｇａ：Ｍ１－Ｐ２２６）、ヒトＣＤ７９ｂ（受託番号ＮＰ＿０００６１７．１のｈＩｇｂ：Ｍ１－Ｅ２２９）、抗ＣＤ３可変ドメイン（抗ＣＤ３ ｍＩｇＥ重鎖、抗ＣＤ３ κ軽鎖；クローン２７０６Ｎ、ＩｇＥ ｇｅｎｂａｎｋ＃ＡＡＢ５９４２４．１、ＣｅｍＸ－ｍｉｇｉｓ－Ｃｙｔｏ／ＴＭ ＰＩＲ＃ＰＩＨ１２１５）およびヒトＰＤ－Ｌ１（受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸Ｍ１－Ｔ２９０）をコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、次いで単細胞選別し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８＋１００μｇ／ｍＬハイグロマイシン＋１μｇ／ｍＬピューロマイシンで維持した。抗ＣＤ３およびＰＤ－Ｌ１の発現をフローサイトメトリーで確認し、得られたクローン株を２９３／ａＣＤ３／ｈＰＤ－Ｌ１ ｃｌ．Ａ３と新たに命名した。

【0204】

Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯおよびＲａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ＰＤ－Ｌ１細胞のエンジニアリング：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いて、Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を除去した。Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ細胞を単一細胞クローニングし、得られたクローン（Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ ｃｌ．１Ｄ６）をヒトＰＤ－Ｌ１（受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸Ｍ１－Ｔ２９０）を発現するように操作した。得られた細胞株Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤ－Ｌ１をフローサイトメトリーで検証し、ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳ＋ＨＥＰＥＳ＋ＮａＰｙｒ＋Ｐ／Ｓ／Ｇ＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンで維持した。

【0205】

ＰＤ１アンタゴニストアッセイ
膜結合型抗ｈＣＤ３εおよびヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、Ｊｕｒｋａｔ／ＡＰ１－Ｌｕｃ／ｈＰＤ－１レポーターＴ細胞とインキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞上の抗ＣＤ３を介して、レポーター細胞上のＴ細胞受容体と複合体化したＣＤ３がクラスター化すると、転写因子ＡＰ１が活性化され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動する。レポーターＴ細胞におけるルシフェラーゼ発現は、阻害性受容体ＰＤ－１とＨＥＫ２９３細胞上のＰＤ－Ｌ１との相互作用によって抑制されることがあるが、このことはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１軸をブロックする抗体の添加によって克服することができる。

【0206】

１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇを添加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用し、細胞懸濁液と抗体希釈液を調製した。スクリーニングの前日、操作したＪｕｒｋａｔ／ＡＰ１－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１レポーター細胞を細胞３×１０^５個／ｍＬに希釈した。アッセイ当日、細胞を遠心沈殿し、アッセイ培地に再懸濁し、９６ウェル白色平底プレートに２９３／ａＣＤ３／ｈＰＤ－Ｌ１細胞２．５×１０^４個／ウェルでプレーティングした。次いで、１１段階の滴定範囲（５００ｎＭ～４７７ｆＭ）で連続希釈（１：４）した非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２［抗ＰＳＭＡ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（無関係な（ＰＳＭＡ）抗体と融合したＩＬ２Ｒα－ＩＬ２）、抗ＰＤ１（ＲＥＧＮ２８１０、Ｈ４Ｈ２９５１２またはＨ４Ｈ９０４８）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、ＲＥＧＮ１０５９７）または１２番目の滴定範囲は組換えタンパク質を含まないアイソタイプ対照（アイソタイプ対照１またはアイソタイプ対照２）をプレーティングした細胞に添加し、続いてＪｕｒｋａｔ／ＡＰ１－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１レポーター細胞２．５×１０^４個／ウェルを添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした後、１００μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬をウェルに加え、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光した光は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて相対発光量（ＲＬＵ）で測定した。抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１２点の用量反応曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は以下の式で計算した：

【数2】

【0207】

ＩＬ２レポーターアッセイ
本実験では、操作したＹＴレポーター細胞を、組換えＩＬ２－Ｆｃ、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のいずれかを介して刺激した。機能的ＩＬ２受容体は、ＩＬ２Ｒサブユニット（ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、およびＩＬ２Ｒγ）の差次的アセンブリーによって形成され、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγサブユニットのアセンブリーは低親和性受容体を含み、３つのサブユニット（ＩＬ２Ｒα／ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ２Ｒγ）すべてを含む受容体は高親和性受容体を形成する。ＩＬ２Ｒによるサイトカインの結合は、ＳＴＡＴ５の活性化につながり、この活性化によって操作された細胞株におけるルシフェラーゼ産生が駆動する。低親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβ／γ）または高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒα／β／γ）の存在下での抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の相対的効力を評価するために、内因性ＩＬ２Ｒαを発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃレポーター細胞を、ＩＬ２Ｒαを欠損または過剰発現するように操作した。レポーター細胞は内因性ＰＤ１を発現しているが、ＰＤ１発現レベルが抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２効力に及ぼす影響を評価するために、ＰＤ１を過剰発現させた誘導体を作製した。

【0208】

１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇを添加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用し、細胞懸濁液と抗体希釈液を調製した。スクリーニングの前日、ＩＬ２Ｒαを過剰発現または欠失し、ＰＤ１を内因性に発現または過剰発現している操作したレポーターＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ細胞を細胞３×１０^５個／ｍＬに希釈した。アッセイ当日、レポーター細胞２．５×１０^４個／ウェルを９６ウェル白色平底プレートに新鮮なアッセイ培地にプレーティングし、１１段階の滴定範囲（２００ｎＭ～１９１ｆＭ）で連続希釈（１：４）したＩＬ２－Ｆｃ（配列番号７４）、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、ＲＥＧＮ１０５９７、またはアイソタイプ対照、とインキュベートした。１２番目の滴定範囲は組換えタンパク質を含まない。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で５時間インキュベートした後、１００μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬をウェルに加え、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光した光は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＲＬＵで測定した。抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１２点の用量反応曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は以下の式で計算した：

【数3】

【0209】

ＰＤ１競合アッセイ
非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のいずれかによる刺激の前に、抗ＰＤ１二価抗体またはアイソタイプ対照を操作したＹＴレポーター細胞に添加した。二価の抗ＰＤ１と抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２との競合は、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２がＰＤ－１発現ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃレポーター細胞を標的とし、したがって活性化する能力を鈍らせるであろう。ＰＤ１過剰発現レポーター細胞は、標的化効率を最大化し、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２との抗ＰＤ１二価競合を最もよく検出できるようにするために使用される。

【0210】

１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇを添加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用し、細胞懸濁液と抗体希釈液を調製した。スクリーニングの前日、ＩＬ２Ｒαをノックアウトまたは過剰発現させたＹＴ／Ｓｔａｔ５－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１レポーター細胞を細胞３×１０^５個／ｍＬに希釈した。アッセイ当日、レポーター細胞２．５×１０^４個／ウェルをアッセイ培地中、９６ウェル白色平底プレートにプレーティングし、抗ＰＤ１二価抗体またはアイソタイプ対照抗体（５段階、５００ｎＭ～０．０５ｎＭまでの１：１０希釈、６番目は組換えタンパク質を含まない）の滴定を添加し、続いて非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、またはＲＥＧＮ１０５９７（６２．５ｎＭ～５９．６ｆＭ；１１段階の希釈範囲で１：４の連続希釈、１２番目は組換えタンパク質を含まない）の滴定を添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした後、１００μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬をウェルに加え、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光した光は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＲＬＵで測定した。抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１２点の用量反応曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は以下の式で計算した：

【数4】

【0211】

初代Ｔ細胞刺激アッセイ
初代Ｔ細胞を、マイトマイシン処理したＲａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ細胞との４日間の共培養により刺激した。Ｒａｊｉ細胞は内因的にＣＤ２０を発現しているので、ＣＤ２０×ＣＤ３二重特異性抗体を添加して初代Ｔ細胞を活性化した。アイソタイプ対照、ＩＬ２、抗ＰＤ１、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（ＲＥＧＮ９９０４）または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５またはＲＥＧＮ１０５９７）の滴定を共培養の間に添加し、Ｔ細胞活性への影響を、均一で洗浄なしのＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて細胞培養上清中のＩＦＮ－γの放出を測定することにより決定した。

【0212】

ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を用いて、製造業者の推奨プロトコールに従い、健康なドナーのロイコパックから単離した。Ｔ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＰＢＭＣから単離した。細胞を遠心沈殿し、刺激培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＮａＰｙｒ、ＮＥＡＡ、０．０１ｍＭ ＢＭＥを添加したＸ－ＶＩＶＯ １５細胞培養培地）に再懸濁し、細胞１×１０^５個／ウェルを９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯおよびＲａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、一次刺激培地中、２０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで、細胞１０×１０^６個／ｍＬの濃度で、３７℃で１時間処理し、細胞増殖を停止させた。次いで細胞を、２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェルあたり５×１０^４細胞を加えた。その後、０．５ｎＭの抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体を、抗ＰＤ１の滴定、ＩＬ２、ＲＥＧＮ２８１０＋ＩＬ２の組合せ、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５もしくはＲＥＧＮ１０５９７）、またはアイソタイプ対照抗体（アイソタイプ対照１もしくはアイソタイプ対照２）と組み合わせて、９段階で５００ｎＭ～０．３ｐＭの範囲で１：６の連続希釈、１０番目の希釈点は０．５ｎＭ一定の二重特異性抗体のみを含む、で添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で９６時間インキュベートした。ＩＦＮ－γは、それぞれのサンプルウェル中のＩＦＮ－γのｐｇ／ｍＬを外挿するために、既知のＩＦＮ－γ濃度のサンプルを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを用いて細胞培養上清について定量した。測定は、マルチラベルプレートリーダー Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。サイトカインのＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１０点の用量反応曲線上の４パラメータのロジスティック方程式から決定し、１０番目希釈点は０．５ｎＭ一定の二重特異性抗体のみを含んでいた。

【0213】

結果の要約および結論
ＰＤ１アンタゴニストアッセイ：
抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物が、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１を介するＴＣＲシグナル伝達の抑制をブロックする能力を、ＡＰ１レポーター細胞ベースのバイオアッセイを用いて評価した。２９３／ａＣＤ３／ｈＰＤ－Ｌ１細胞をＪｕｒｋａｔ／ＡＰ１－Ｌｕｃ／ｈＰＤ１レポーター細胞とインキュベートすると、ＰＤ－Ｌ１によるＰＤ１活性化によりレポーター活性が低下する。二価の抗ＰＤ１抗体または抗体融合ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２タンパク質がＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害し、レポーター活性をレスキューする能力を評価した。操作したレポーター細胞について、ＥＣ_５０および誘導倍率の値を表７に要約する。

【0214】

レポーター細胞を対照タンパク質（アイソタイプ対照Ａｂ １、アイソタイプ対照Ａｂ ２、または非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２）で処理した場合、ルシフェラーゼ活性の増加は検出されなかった。対照的に、レポーター細胞を抗ＰＤ１抗体、ＲＥＧＮ２８１０または対応する抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、ＲＥＧＮ１０４８６とインキュベートすると、同様の効力（それぞれ３．６６８Ｅ－０９と５．３５１Ｅ－０９）でルシフェラーゼ活性が増強された（それぞれ１９．２１０倍と１７．７４０倍）。一方、二価のＰＤ１抗体であるＨ４Ｈ２９５１２とＨ４Ｈ９０４８はルシフェラーゼ活性を増強せず、対応する抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒ－ＩＬ２タンパク質であるＲＥＧＮ１０５９５とＲＥＧＮ１０５９７は弱い効力（それぞれ１．２６６Ｅ－０８と１．２６４Ｅ－０８）で低いルシフェラーゼ活性（それぞれ２．７２５倍と３．０３８倍）を誘導した。

【0215】

ＩＬ２レポーターアッセイ：
抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物がＰＤ１標的ＩＬ－２受容体シグナル伝達を誘導する能力を、ＳＴＡＴ５－レポーターアッセイを用いて評価した。内因性ＩＬ２Ｒαを発現する、ＩＬ２Ｒα発現を欠く（ＫＯ細胞）、またはＩＬ２Ｒαを過剰発現する、ならびに内因性または過剰発現ＰＤ１を発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃレポーター細胞を、アイソタイプ対照、ＩＬ２－Ｆｃ、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、またはＲＥＧＮ１０５９７）と共インキュベートし、ＳＴＡＴ５レポーター活性を評価した。誘導倍率の値およびＥＣ_５０をそれぞれ表８および９に要約する。

【0216】

ＩＬ２と比較して、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２は、ＩＬ２Ｒαの発現に関係なく、ＳＴＡＴ５レポーター活性の誘導の減少を示した。ＰＤ１標的分子は、ＩＬ２Ｒαの発現に関係なく、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と比較して高い効力を示した。さらに、ＰＤ１をレポーター細胞上で過剰発現させると、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の効力はＩＬ２と同様の効力に向かってさらに増大した。

【0217】

ＰＤ－１競合アッセイ：
抗ＰＤ１二価ｍＡｂが抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物を妨害する能力を、ＳＴＡＴ５－レポーターバイオアッセイを用いて評価した。ＩＬ２Ｒαを過剰発現するか、またはＩＬ２Ｒαの発現を欠き、ＰＤ１を過剰発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃレポーター細胞を、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２またはＰＤ１標的抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、またはＲＥＧＮ１０５９７）の滴定とインキュベートする前に、５００ｎＭのアイソタイプ対照または抗ＰＤ１二価ｍＡｂ（ＲＥＧＮ２８１０、Ｃｏｍｐ １またはＣｏｍｐ ２）のいずれかとインキュベートした。インキュベーション後、ＳＴＡＴ５レポーター活性を評価した。抗ＰＤ１二価ｍＡｂと抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２との競合は、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２によるＰＤ１標的化の喪失をもたらし、レポーター活性の低下をもたらすであろう。ＥＣ_５０値を表１０に要約する。

【0218】

二価のＰＤ１ ｍＡｂが存在しない場合、ＰＤ１標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、ＲＥＧＮ１０５９７）は非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ９９０４）と比較して大きな効力を有していた。ＲＥＧＮ１０４８６の効力はレポーター細胞をＰＤ１抗体（ＲＥＧＮ２８１０、Ｃｏｍｐ １またはＣｏｍｐ ２）とインキュベートすることにより強く低下したが、ＲＥＧＮ１０５９５とＲＥＧＮ１０５９７の効力への影響はＩＬ２Ｒαの発現にかかわらず最小であった。抗ＰＤ１（ＲＥＧＮ２８１０、Ｃｏｍｐ １またはＣｏｍｐ ２）の添加は、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の効力に影響を及ぼさなかった。

【0219】

初代Ｔ細胞刺激アッセイ：
Ｔ細胞刺激を増強する抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ－２の能力を、ＩＦＮ－γサイトカイン産生を測定する機能的初代Ｔ細胞アッセイで評価した。マイトマイシンＣで処理したＲａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯまたはＲａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤ－Ｌ１細胞とインキュベートしたＴ細胞を、一定量の０．５ｎＭの抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体とアイソタイプ対照の滴定、ＩＬ２、抗ＰＤ１二価抗体（ＲＥＧＮ２８１０）の単独もしくはＩＬ２との組合せ、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０４８６、ＲＥＧＮ１０５９５、もしくはＲＥＧＮ１０５９７）で処理した。Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞の４日間の共インキュベーションは、測定可能なＩＦＮ－γ放出をもたらした。Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ細胞の存在下で、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、ＩＬ２、またはＩＬ２とＲＥＧＮ２８１０の併用でＴ細胞を処理すると、同レベルのＩＦＮγ放出が起こるが、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２、アイソタイプ対照抗体、およびＲＥＧＮ２８１０は、より低いレベルのＩＦＮγ放出をもたらした。ｈＰＤ－Ｌ１を発現しているＲＡＪＩ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ細胞の存在下では、ＰＤ－Ｌ１を発現していないＲＡＪＩ細胞と比較して、アイソタイプ対照処理サンプルでは全体的なＩＦＮｙ放出が減少した。非標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２およびＲＥＧＮ２８１０による処理は、アイソタイプ対照と比較して、ＩＦＮｙ放出の同程度の増加をもたらすが、ＩＬ２、ＲＥＧＮ１０５９７およびＲＥＧＮ１０５９５による処理は、さらに大きな応答をもたらした。最大の応答は、ＲＥＧＮ１０４８６またはＩＬ２とＲＥＧＮ２８１０の併用で観察された。抗体の用量範囲にわたるＥＣ_５０と最大インターフェロン放出値を表１１に要約する。

【0220】

【表7】

【0221】

【表8】

【0222】

【表9】

【0223】

【表10】

【0224】

【表11】

【実施例6】

【0225】

ＰＤ１×ＬＡＧ３ヒト化マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効能評価
試験１：
ヒトＰＤ１×ＬＡＧ３ノックインマウス（Ｂｕｒｏｖａ Ｅ．ら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１９（１８）（１１）２０５１～２０６２に記載）に、０日目に３×１０^５ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種し、平均腫瘍サイズが９５ｍｍ^３に達した７日目に無作為化した。次いで、マウスにアイソタイプ対照Ａｂ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ｈＰＤ１抗体（０．３３ｍｇ／ｋｇ）、または抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）＋アイソタイプ対照Ａｂ（０．３３ｍｇ／ｋｇ）を半週ごとに合計４回、腹腔内投与した。それぞれの処置群における平均腫瘍体積（ｍｍ^３＋ＳＥＭ）をプロットした（図１Ａ）。腫瘍サイズはｖ＝ａｂ＾２／２として計算し、ここでａは最長腫瘍直径を表し、ｂは垂直腫瘍直径である。図１Ａの矢印は処置日数を示す。

【0226】

それぞれの処置群におけるＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線もプロットした（図１Ｂ）。生存の喪失は、腫瘍が深い潰瘍化を示したとき、または腫瘍がいずれかの寸法で２０ｍｍに達したとき、または総容積で２２５０ｍｍ^３に達したときに安楽死と定義された。

【0227】

試験２：
ヒトＰＤ１×ＬＡＧ３ノックインマウスに、０日目に３×１０^５ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種し、平均腫瘍サイズが１０５ｍｍ^３に達した７日目に無作為化した。次いで、マウスにアイソタイプ（０．５ｍｇ／ｋｇ）または３つの異なるクローンの抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）を半週ごとに合計４回、腹腔内投与した。それぞれの処置群における平均腫瘍体積（ｍｍ^３＋ＳＥＭ）を示した（図１Ｃ）。腫瘍サイズはｖ＝ａｂ＾２／２として計算し、ここでａは最長腫瘍直径を表し、ｂは垂直腫瘍直径である。図中の矢印は処置日数を示す。

【0228】

それぞれの処置群におけるＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線もプロットした（図１Ｄ）。生存の喪失は、腫瘍が深い潰瘍化を示したとき、または腫瘍がいずれかの寸法で２０ｍｍに達したとき、または総容積で２２５０ｍｍ^３に達したときに安楽死と定義された。

【0229】

結果の要約および結論
試験１では、抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の抗腫瘍効能を、２つの個別成分であるアイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と等モルの親抗ｈＰＤ１遮断抗体の組合せと比較して評価した。

【0230】

アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ｈＰＤ１は、試験された用量では効果的な腫瘍制御を与えることができなかったが、同じモル用量の抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋アイソタイプ処置は、確立された腫瘍を退縮させることができ、処置されたマウスの大部分で長期無腫瘍生存をもたらした（図１Ａ～Ｂ）。この結果は、抗ｈＰＤ１標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の抗腫瘍効能が、非標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２と親抗ｈＰＤ１抗体の組合せよりも優れていることを実証した。

【0231】

試験２では、抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の３つの異なるクローンの抗腫瘍活性を比較した。抗ｈＰＤ１クローンの１つは強力に遮断するが、他の２つはｈＰＤ１シグナル伝達を最小限に遮断する。抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子の３つのクローンすべてが同程度に強力な抗腫瘍効能を示し、同様の長期無腫瘍生存率をもたらした（図１Ｃ～Ｄ）。この結果は、抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２療法の強固な抗腫瘍効能には、その遮断活性よりも抗ｈＰＤ１を標的としたＩＬ２Ｒα－ＩＬ２の送達が主に関与していることを示している。また、抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子を非競合ＰＤ１遮断試薬と組み合わせることで、治療効能をさらに高めることができる可能性も示された。

【実施例7】

【0232】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の溶液中における組換え単量体ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、またはＩＬ２Ｒγタンパク質に結合する能力
ヒトＩＬ－２受容体α結合
Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグで発現させたヒトＩＬ２Ｒα（ｈＩＬ２Ｒα．６Ｈ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号１０３０５－ＲＬ－０５０）と、Ｃ末端ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合を有する精製抗ＰＤ１抗体との結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ－２００装置を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー技術を用いて測定した。ｈＩｇＧ捕捉表面を調製するために、ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面をモノクローナル抗ヒトＦａｂ抗体（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号２８－９５８３－２５）の混合物でアミンカップリングにより誘導体化した。すべてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）を含む緩衝液中、２５℃で行った。抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物および対照は、３μｇ／ｍＬ溶液を８μＬ／分で１分間注入することにより、この抗ｈＦａｂ表面に捕捉した。次いで、ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液で調製した１μＭのｈＩＬ２Ｒα．６Ｈ溶液を、５０μＬ／分の流速で捕捉抗体ＩＬ２融合構築物捕捉表面上に注入した。ＩＬ２融合抗体の会合を１分間モニターし、その後ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液中で１分間解離させた。結合反応は注入終了時に測定し、表１２に示す。それぞれのサイクルの最後に、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物捕捉表面を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を３０秒間注入して再生した。

【0233】

ヒトＩＬ－２受容体β／γ結合
Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現させたヒトＩＬ２受容体β（ｈＩＬ２Ｒβ）（ｈＩＬ２Ｒβ．ｍｍＨ、ＲＥＧＮ９１６９）またはＣ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグで発現させたヒトＩＬ２受容体γ（ｈＩＬ２Ｒγ）（ｈＩＬ２Ｒγ．ｍｍＨ、ＲＥＧＮ１１８３）と抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物との結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ－２００装置を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー技術を用いて測定した。ＣＭ５ Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面は、モノクローナル抗ヒトＦａｂ抗体（Ｃｙｔｉｖａ、カタログ番号２８－９５８３－２５）の混合物を用いてアミンカップリングにより誘導体化した。すべてのＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰランニング緩衝液）を含む緩衝液中、２５℃で行った。すべてのＩＬ２受容体成分は同じ緩衝液で調製した。抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物および対照は、３μｇ／ｍＬ溶液を８μｌ／分で１分間注入することにより、この抗ｈＦａｂ表面に捕捉した。

【0234】

ＩＬ２ＲγはＩＬ２ＲβまたはＩＬ２Ｒα／βに依存したＩＬ２に対する親和性を持つことが文献（Ｌｉｐａｒｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００２）で報告されている。したがって、ＩＬ２Ｒβの添加は、検出可能な三元複合体の形成を可能にする。結合前のＩＬ２Ｒβの存在下でＩＬ２Ｒγの結合を探索するために逐次結合実験を設計した。抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２表面に、１μＭ ＩＬ２Ｒβ．ｍｍＨを５０μｌ／分で３０秒間注入した後、直ちに１μＭ ＩＬ２Ｒβ．ｍｍｈおよび１μＭ ＩＬ２Ｒγ．ｍｍＨの混合溶液を１分間注入した。それぞれの注入終了時の結合シグナルを記録した。結果を表１３に示す。それぞれのサイクルの最後に、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物捕捉表面を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を３０秒間注入して再生した。

【0235】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の活性を計算するために、抗ＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα融合物の捕獲量、ＩＬ２受容体相互作用の化学量論、および相互作用タンパク質の分子量に基づいて、理論的最大シグナル（ＴＲｍａｘ）を最初に計算した。次いで、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物の活性を、計算されたＴＲｍａｘのパーセンテージとして表した。さらに、ＴＲｍａｘ結果のパーセンテージを、次式を用いて対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５およびＲＥＧＮ８５１２）に対して正規化した：

【数5】

【0236】

結果、要約および結論
抗ＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒα融合構築物は、非減弱（ＩＬ２のみ）の対照と比較して、ｈＩＬ２Ｒαへの結合が大幅に減少した。

【0237】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物は、非減弱（ＩＬ２のみ）の対照と比較して、部分的に減少した結合シグナルでｈＩＬ２Ｒβと結合する能力を示した。結合したｈＩＬ２Ｒβの存在下で、ｈＩＬ２Ｒγの最小限結合が、非減弱ＩＬ２対照構築物と比較して観察された。

【0238】

【表12】

【0239】

【表13】

【実施例8】

【0240】

ＦＡＣＳ結合アッセイによる抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物および親ｍＡｂの細胞結合特性
αｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２タンパク質とそれぞれの親抗ｈＰＤ１抗体とのｈＰＤ１結合を比較するために、内因性レベルのｈＰＤ１を発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５ ｌｕｃ／Ｃｌ４細胞をＦＡＣＳ洗浄液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ洗浄液に細胞１×１０＾６個／ｍｌで再懸濁した。次いで、細胞（１００μｌ／ウェル）を９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。細胞を遠心沈殿し（１２００ＲＰＭ、５分）、ｍＡｂクローンＩＤに列挙された様々な抗体希釈液１００μｌ／ウェルに再懸濁した。抗体滴定は、ＦＡＣＳ洗浄液を用いて６倍希釈し、２０μｇ／ｍｌから調製した。細胞を抗体とともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳ洗浄液を用いて細胞を２回洗浄し、未結合の抗体を除去した。次いで、細胞をＡＰＣ－抗ヒトＦｃγ二次抗体の１：２００希釈液１００μｌ／ウェルに再懸濁した。細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳ洗浄液を用いて細胞を２回洗浄し、未結合の抗体を除去した。次いで、細胞を１６０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ洗浄液に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いて結合試験を行った。

【0241】

抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２タンパク質とそれぞれの抗ｈＰＤ１親抗体はＰＤ１＋細胞に同程度に結合する（図２Ａ、２Ｂ）。抗ｈＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２タンパク質結合は、対応する親型ｍＡｂよりもわずかに低い親和性（約２倍）を示す。

【実施例9】

【0242】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のＦａｂ交換およびネイティブ質量分析（ＭＳ）の解析
Ｆａｂ交換およびネイティブ質量分析（ＭＳ）の解析を用いて、ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２融合分子のコンフォメーションを決定した。ＲＥＧＮ１０５９７、ＲＥＧＮ８５０９、ＲＥＧＮ２８１０およびＲＥＧＮ４７５をそれぞれペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；タンパク質１０μｇあたり１ＩＵＢミリユニット）で４５℃、１時間処理して、それぞれの重鎖定常領域からグリカン鎖を完全に除去した。次いで、脱グリコシル化タンパク質サンプルを、図３Ａおよび以下の表１４に従って混合し、それぞれの混合物を、２ｍＭ ＤＴＴの存在下、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、処理したタンパク質混合物を、ネイティブＬＣ－ＭＳプラットフォーム（仮特許第１０７２４号を参照）で、質量分析結合ネイティブ脱塩サイズ排除クロマトグラフィー分析（ＳＥＣ－ＭＳ）に供した。脱塩ＳＥＣは、ＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラム（４．６×３０ｍｍ、２００Å、１．７μｍ）を用い、１５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）を０．２ｍＬ／分の流速で、均一溶媒流で行った。質量測定はＴｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲ質量分析計で行った。

【0243】

【表14】

【0244】

ヒンジ領域のジスルフィド結合が破壊されると、ＩｇＧ４分子は高速でＦａｂ交換を行い、その産物はネイティブＭＳ解析によってモニターすることができる。２つのＩｇＧ４抗体の混合物（混合物１）または１つのＩｇＧ４抗体＋抗ｈＣＤ２０－ＩＬ２の混合物（混合物２）を用いた対照実験では、部分還元条件下でＦａｂ交換が、ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ消化条件下でＦｃ交換が認められた（図３Ｂ）。ＦａｂまたはＦｃ交換産物は、ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋ＩｇＧ４分子の混合物（混合物３）について、それぞれ部分還元条件下またはＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ消化条件下で観察されず、このことは、ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子が主に不活性型で存在し、ＩＬ２ＲαとＩＬ２との間の強い鎖間相互作用がＦａｂ（またはＦｃ）交換を禁止していることを示唆する（図３Ｂ）。要約すると、Ｆａｂ交換およびネイティブＭＳの解析は、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子が主にトランス隔絶されたコンフォメーションに存在することを示す。

【実施例10】

【0245】

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイによる抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物のヒト初代Ｔ細胞活性化増強能の評価
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いて、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２構築物がヒト初代Ｔ細胞活性化を増強する能力を評価した。同種ドナーのＰＢＭＣはＴ細胞を刺激し、増殖とサイトカインの放出をもたらす。組換えＩＬ－２の添加はＴ細胞の活性化をさらに補助する。したがって、このアッセイを用いて、ＰＤ１標的ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２がＴ細胞増殖とＴ細胞活性化の指標となるＩＦＮｇの放出にどのような影響を与えるかを評価した。

【0246】

ヒト初代細胞の単離
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ドナー１）またはＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ドナー２）から入手した２人の健康なドナーの末梢血のロイコパックから、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ単離キットを用い、製造業者の推奨プロトコールに従ってヒトＰＢＭＣを単離した。ドナー２のＣＤ３＋ Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３＋ Ｔ Ｃｅｌｌ単離キットを用い、製造業者の推奨プロトコールに従ってＰＢＭＣから単離した。

【0247】

アッセイ手順：
単離したドナー２のＣＤ３＋ Ｔ細胞を、初代培養培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１Ｘ非必須アミノ酸、０．０１ｍＭ β－メルカプトエタノールを添加したＸ Ｖｉｖｏ １５培地）に細胞１×１０＾６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。ドナー１のＰＢＭＣ（細胞１０×１０＾６個／ｍｌ）を、３７℃／５％ＣＯ_２で、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを初代培養液で希釈したもので１時間処理した（細胞増殖を停止させるため）。初代培養液で３回洗浄した後、ＰＢＭＣを再懸濁し、Ｔ細胞とＰＢＭＣの最終的な比率が１：３（１ｍｌあたり１×１０＾６ Ｔ細胞＋３×１０＾６ ＰＢＭＣ）になるように、ドナー２のＴ細胞に加えた。ＣＤ３＋Ｔ細胞／ＰＢＭＣ混合物を６日間インキュベートした後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ３＋Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いて製造者の使用説明書に従って、Ｔ細胞を再単離した。その後、単離した細胞を初代細胞培養培地で２４時間休ませた。１００，０００個のＴ細胞を丸底マイクロタイタープレートのウェルに加え、新鮮なマイトマイシンＣ処理ドナー１ＰＢＭＣを細胞３００，０００個／ウェルでウェルに加えた。抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７、ＲＥＧＮ１０５９５またはＲＥＧＮ１０４８６）、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２対照（ＲＥＧＮ９９０３）、抗ＰＤ１（ＲＥＧＮ２８１０）、組換えＩＬ２、または適合ＩｇＧ４およびＩｇＧ４アイソタイプ対照（それぞれＲＥＧＮ１９４５およびＲＥＧＮ７５４０）を、１０００ｎＭから０．５９５ｐＭの範囲の９段階で１：６の希釈で滴定し、最後の１０番目は抗体なし（曲線上の最低点で表示）とした。それぞれの条件を３回実施した。３７℃／５％ＣＯ_２で７２時間インキュベーションした後、マイクロタイタープレートを遠心分離して細胞をペレット化し、５０μｌの培地上清を回収した。回収した上清から５μｌを、ヒトＩＦＮγＡｌｐｈａＬＩＳＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）アッセイで、製造業者のプロトコールに従って試験した。測定は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で行った。ペレット化した細胞を、３Ｈ－チミジン（１．２５ｍＣｉ／ｍｌ）を含む初代刺激培地に再懸濁し、３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした。プレートは、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて処理し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。数値は、１分あたりのカウント数（ＣＰＭ）として記録した。抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）ソフトウェアを用い、１０点の用量反応曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。

【0248】

同種ＰＢＭＣの存在下で、組換えＩＬ－２、抗ＰＤ－１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７、ＲＥＧＮ１０５９５、ＲＥＧＮ１０４８６）またはアイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２対照（ＲＥＧＮ９９０３）の用量滴定で処理したＴ細胞は、ＩＦＮγ放出および増殖において用量依存的な増加をもたらした（図４Ａ、４Ｂおよび表１５）。組換えＩＬ２は、最も高い最大サイトカイン放出および最も強力な増殖をもたらし、次いで抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子が続いた。アイソタイプ標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２は、ＰＤ－１標的と比較して、サイトカイン放出および増殖の効力が減少した。ＲＥＧＮ２８１０はＩＦＮγのみ用量依存的にわずかに増加させたが、適合ＩｇＧ４およびＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（それぞれＲＥＧＮ１９４５およびＲＥＧＮ７５４０）はサイトカイン放出や増殖に影響を与えなかった。

【0249】

【表15】

【実施例11】

【0250】

Ｒａｊｉベースの初代Ｔ細胞刺激アッセイにおける抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物とアイソタイプ対照ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２＋抗ＰＤ１構築物の比較
ヒト初代Ｔ細胞活性化を増強する抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２構築物の能力を、Ｒａｊｉ細胞ベースの初代Ｔ細胞アッセイを用いて評価した。ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体存在下で、ＣＤ８０とＣＤ８６をノックアウトし、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤ－Ｌ１）と共培養することによりＴ細胞を刺激し、Ｔ細胞からサイトカインを放出させた。組換えＩＬ－２の添加はＴ細胞の活性化をさらに補助する。したがって、このアッセイを用いて、ＰＤ１標的ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２がＴ細胞活性化の指標となるＩＦＮγのＴ細胞放出にどのような影響を与えるかを評価した。

【0251】

ヒト初代細胞の単離：
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手した健康なドナーの末梢血のロイコパックから、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｕｍａｎ ＰＢＭＣ単離キットを用い、製造業者の推奨プロトコールに従ってヒトＰＢＭＣを単離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３＋Ｔ Ｃｅｌｌ単離キットを用い、製造業者の推奨プロトコールに従ってＰＢＭＣから単離した。

【0252】

ＲａｊｉベースのＴ細胞アッセイの手順：
Ｔ細胞を遠心沈殿し、刺激培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸、０．０１ｍＭ β－メルカプトエタノールを添加したＸ Ｖｉｖｏ １５培地）に再懸濁し、細胞１×１０^５個／ウェルを９６ウェル丸底プレートにプレーティングした。Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤ－Ｌ１細胞（細胞１×１０^７個／ｍｌ）を、細胞増殖を停止させるため、３７℃／５％ＣＯ_２、刺激培地で希釈した２０ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣで１時間処理した。次いで、２％ＦＢＳを含むＤ－ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、刺激培地に再懸濁し、１ウェルあたり５×１０^４個の細胞を加えた。その後、０．５ｎＭの抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（ＲＥＧＮ１９７９）を、２０ｎＭの一定のアイソタイプ対照（ＲＥＧＮ１９４５）または抗ＰＤ１（ＲＥＧＮ２８１０）と共に加えた。アイソタイプ対照（ＲＥＧＮ７５４０）、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２抗体（ＲＥＧＮ９９０３）、ｍＡｂ９０４８のＶＲを持つ抗ＰＤ１抗体（ＲＥＧＮ１５１８７）、抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）、またはＲＥＧＮ９９０３＋ＲＥＧＮ１５１８７の等モル滴定のいずれかの滴定を、１分子あたり５００ｎＭから０．３ｐＭまでの９段階、１：６の連続希釈でウェルに添加し、第１０番目の希釈点では０．５ｎＭ一定のＲＥＧＮ１９７９および２０ｎＭ ＲＥＧＮ２８１０またはＲＥＧＮ１９４５のみを含んでいた。それぞれの条件を２回実施した。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で９６時間インキュベートした。ＩＦＮγは、製造業者のプロトコールに従って、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを用いて細胞培養上清について定量した。測定は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。サイトカインのＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１０点の用量反応曲線上の４パラメータのロジスティック方程式から決定し、１０番目希釈点は０．５ｎＭ一定のＲＥＧＮ１９７９と２０ｎＭ ＲＥＧＮ２８１０またはＲＥＧＮ１９４５のみを含んでいた。

【0253】

結果の要約
Ｒａｊｉ／ＣＤ８０ ＫＯ／ＣＤ８６ ＫＯ／ｈＰＤＬ１の存在下で、ＲＥＧＮ２８１０の存在下または非存在下で、アイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ９９０３）または抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）の用量滴定で処理したＴ細胞は、ＩＦＮγ放出において驚くほど有意な用量依存性の増加をもたらした（表１６および図５Ａ、５Ｂ）。抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子は、最も高い最大サイトカイン放出をもたらし、続いてアイソタイプ－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２分子の単独または抗ＰＤ１抗体ＲＥＧＮ１５１８７との併用が続いた。適合ＩｇＧ４およびＩｇＧ４ｓアイソタイプ対照（それぞれＲＥＧＮ１９４５およびＲＥＧＮ７５４０）は、ＩＦＮγ放出に影響を与えなかった。

【0254】

【表16】

【実施例12】

【0255】

抗ＰＤ１－ＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合構築物のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効能と安全性プロファイル
最初の実験では、単剤ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効能を評価した。ヒトＰＤ１×ＬＡＧ３ノックインマウス（Ｂｕｒｏｖａ Ｅ．ら、２０１９に記載）に、０日目に３×１０^５ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種し、平均腫瘍サイズが１０５ｍｍ^３に達した７日目に無作為化した。それぞれの無作為化された群のマウスは、特定の用量レベルで表示された分子の腹腔内注射を半週に１回、合計４回受けた。それぞれの処置群における平均腫瘍体積（ｍｍ^３＋ＳＤ）をプロットした（図６Ａ）。腫瘍サイズはｖ＝ａ・ｂ＾２／２として計算し、ここでａは最長腫瘍直径を表し、ｂは垂直腫瘍直径である。図中の矢印は処置日数を示す。それぞれの処置群における個々の腫瘍成長曲線および完全な腫瘍拒絶を受けたマウスの頻度を示した（図６Ｂ）。

【0256】

０．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのＲＥＧＮ１０５９７単剤療法は、１ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ９９０４と１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ２８１０の併用療法よりも優れた抗腫瘍活性を示し、処置したマウスにおいてより高い頻度で腫瘍が完全に退縮した。また、０．２ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１０５９７処置でも中間の抗腫瘍効能が観察された（図６Ａ、６Ｂ）。

【0257】

第２の実験では、ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ活性および毒性プロファイルを、ＩＬ２Ｒａへの結合が阻害された抗ＰＤ１標的ＩＬ２ムテインである比較対象ＲＥＧＮ１３２３３と比較した。ヒトＰＤ１×ＬＡＧ３ノックインマウス（Ｂｕｒｏｖａ Ｅ．ら、２０１９に記載）に、０日目に３×１０^５ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種し、平均腫瘍サイズが７０ｍｍ^３に達した７日目に無作為化した。それぞれの無作為化された群のマウスは、特定の用量レベルで標示された分子の腹腔内注射を半週に１回、合計４回受けた。それぞれの処置群における平均腫瘍体積（ｍｍ^３＋ＳＤ）（図６Ｃ）、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線（図６Ｄ）、および体重変化の割合（平均値＋ＳＤ）（図６Ｅ）をプロットした。図６Ａの矢印は処置日数を示す。完全な腫瘍拒絶を受けたマウスの頻度を、（図６Ｄ）において選択した群について示した。１３日目に、全群から血液を採取し、フローサイトメトリーにより分析した。総白血球数を示した（図６Ｆ）。

【0258】

ＲＥＧＮ１０５９７およびＲＥＧＮ１３２３３の両単剤療法は、ＲＥＧＮ２８１０とそれぞれの非標的対照（ＲＥＧＮ１０５９７についてはＲＥＧＮ９９０４、ＲＥＧＮ１３２３３についてはＲＥＧＮ１３２３４）との組合せよりも優れた抗腫瘍効能を示し、両群の処置マウスの大部分において完全な腫瘍退縮を示した（図６Ｃ、６Ｄ）。

【0259】

しかしながら、処置したマウスにおいて明らかな体重変化を引き起こさなかったＲＥＧＮ１０５９７とは異なり、同じ用量のＲＥＧＮ１３２３３処置は、循環リンパ球の顕著な増加を伴う有意な体重減少をもたらした（図６Ｅ）。この毒性の差は、ＲＥＧＮ１０５９７およびＲＥＧＮ１３２３３の異なるＩＬ－２部分に起因すると思われるが、同様の体重減少および白血球数の増加がＲＥＧＮ１３２３４処置群において観察された（図６Ｅ、６Ｆ）。マルチパラメータフローサイトメトリーによる白血球のさらなる免疫表現型解析により、ＲＥＧＮ１０５９７はＰＤ－１^＋ ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞をより選択的に拡大したのに対し、ＲＥＧＮ１３２３３はこれらの細胞を拡大しただけでなく、ＣＤ４４^＋ ＣＤ６２Ｌ^＋ ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞集団も大幅に拡大したことが明らかになった。

【0260】

これらの結果から、ＲＥＧＮ１０５９７と比較対象分子であるＲＥＧＮ１３２３３はともに強固な抗腫瘍効能を示したが、ＲＥＧＮ１０５９７は、より幅広いＣＤ８^＋ ＴおよびＮＫ細胞集団を拡大したＲＥＧＮ１３２３３と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤ１^＋ Ｔ細胞をより選択的に拡大する能力があるためと思われ、安全性プロファイルがより優れていることが示された。

【0261】

第３の実験では、ＲＥＧＮ１０５９７のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効能を、ＲＥＧＮ１０５９７と同じ部分をすべて含むが、ＩＬ２部分とＩＬ２Ｒα部分が逆の順序で互いに融合している分子であるａＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒαの抗腫瘍効能と比較した。ヒトＰＤ１×ＬＡＧ３ノックインマウス（Ｂｕｒｏｖａ Ｅ．ら、２０１９に記載）に、０日目に３×１０^５ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種し、平均腫瘍サイズが１２０ｍｍ^３に達した９日目に無作為化した。それぞれの群のマウスは、次いで特定の用量レベルで表示された分子の腹腔内注射を週に１回、合計２回受けた。（図６Ｇ）。それぞれの処置群における平均腫瘍体積（ｍｍ^３＋ＳＤ）をプロットした。腫瘍サイズはｖ＝ａ・ｂ＾２／２として計算し、ここでａは最長腫瘍直径を表し、ｂは垂直腫瘍直径である。図中の矢印は処置日数を示す（図６Ｈ）。それぞれの処置群におけるＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線も示した。生存の喪失は、腫瘍が深い潰瘍化を示したとき、または腫瘍がいずれかの寸法で２０ｍｍに達したとき、または総容積で２２５０ｍｍ^３に達したときに安楽死と定義された。完全な腫瘍拒絶を受けたマウスの頻度を、選択した群について示した。

【0262】

ｉｎ ｖｉｖｏで強固な抗腫瘍活性を示したＲＥＧＮ１０５９７とは異なり、ａＰＤ１－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒαの同用量または高用量は、最小限の腫瘍増殖制御を示した。この結果は、ＲＥＧＮ１０５９７におけるＩＬ２Ｒα－ＩＬ２融合の正しい順序が、ｉｎ ｖｉｖｏでのその強力な抗腫瘍活性にとって重要であることを示している（図６Ｇ、６Ｈ）。

【実施例13】

【0263】

Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２融合分子のＩＬ２受容体へのフロー結合
機能的ＩＬ２受容体は、ＩＬ２Ｒサブユニット（ＩＬ２Ｒａ＝ＣＤ２５、ＩＬ２Ｒｂ＝ＣＤ１２２、ＩＬ２Ｒｇ＝ＣＤ１３２）の差次的アセンブリーによって形成され、免疫細胞上に発現する中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒｂ／ＩＬ２Ｒｇ）および高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒａ／ＩＬ２Ｒｂ／ＩＬ２Ｒｇ）をもたらす（ＰＭＩＤ：１６２９３７５４）。中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒｂ／ｇ、ＩＬ２Ｒａノックアウト）または高親和性受容体（ＩＬ２Ｒｂ／ｇおよびＩＬ２Ｒａ過剰発現）を発現する細胞に対するＩＬ２およびＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２キメラ抗体の結合能を、フローサイトメトリーを用いて評価した。

【0264】

ＹＴ細胞は内因性にヒトＰＤ１を発現しているが、過剰発現ＰＤ－１細胞（ＰＤ１ ＯＥ）を作製した。ヒトＩＬ２およびヒトＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２キメラ抗体（＝一次抗体）の細胞への結合を調べるために、３つのＩＬ２受容体サブユニットすべてを内因性に発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＰＤ１ ＯＥレポーター細胞を遺伝子修飾して、ＩＬ２Ｒａサブユニットのノックアウトによる中親和性ＩＬ２受容体（ＣＤ２５ ＫＯ）、またはＩＬ２Ｒａの過剰発現による高親和性受容体（ＣＤ２５ ＯＥ）を細胞表面に発現するようにした。これらの細胞への抗体の結合は、蛍光標識二次抗体を用いてフローサイトメトリーによって検出した。簡単に説明すると、ＣＤ２５ ＫＯまたはＣＤ２５ ＯＥであるＰＤ１ ＯＥ ＹＴ細胞を染色緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ）に再懸濁し、９６ウェルプレートに１ウェルあたり３×１０^５細胞を播種し、１：５に連続希釈した一次抗体［アイソタイプ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ８５１２）またはアイソタイプ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ９９０４）］とともに氷上で３０分間インキュベートした。最終抗体濃度は７６８ｆＭから３００ｎＭの範囲であり、「二次抗体のみ」と表示した抗体なしの対照も含まれる。インキュベーション後、サンプルを氷冷染色緩衝液で洗浄し、続いてＡＦ６４７標識抗ヒトＩｇＧ抗体と氷上で３０分間インキュベートした。未結合の二次抗体を除去し、サンプルを氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、生存率色素で染色し、氷冷染色緩衝液で１回洗浄し、室温で３０分間固定し、染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｐｌｕｓフローサイトメーターで分析する前にろ過し、幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を測定した。二次抗体のみに対する最大結合倍率の算出には以下の式を用いた：

【数6】

【0265】

結果の要約
表１７は、ＣＤ２５ノックアウトまたは過剰発現細胞に結合する抗体－ＩＬ２または抗体－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２キメラ構築物の最大幾何ＭＦＩ値および誘導倍率値を要約したものである。アイソタイプＩＬ２分子（ＲＥＧＮ８５１２）およびアイソタイプＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２分子（ＲＥＧＮ９９０４）の用量依存的結合が、中親和性ＩＬ２Ｒβ／γ受容体（ＣＤ２５ ＫＯ）または高親和性ＩＬ２Ｒα／β／γ受容体（ＣＤ２５ ＯＥ）のいずれかを発現する操作されたＹＴ細胞の両方で観察された（図７Ａ、７Ｂ；表１７）。予想されたように、ＣＤ２５ ＯＥ細胞上では、両方の構築物について最大結合倍率が大きかった。しかし、Ａｂ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２の結合は、ＩＬ２Ｒα／β／γ－およびＩＬ２Ｒβ／γ－発現細胞株の両方においてＡｂ－ＩＬ２と比較して大きく減少し、融合タンパク質中のＩＬ２Ｒａの存在によるＩＬ－２の「マスキング」を示唆した。

【0266】

【表17】

【実施例14】

【0267】

ＰＤ１－ＩＬ２Ｒ２－ＩＬ２分子の効力を評価するバイオアッセイ
機能的ＩＬ２受容体は、ＩＬ２Ｒサブユニット（ＩＬ２Ｒａ＝ＣＤ２５、ＩＬ２Ｒｂ＝ＣＤ１２２、ＩＬ２Ｒｇ＝ＣＤ１３２）の差次的アセンブリーによって形成され、免疫細胞上に発現する中親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒβ／γ）および高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒα／β／γ）をもたらす（ＰＭＩＤ：１６２９３７５４）。

【0268】

ＩＬ２またはＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２またはＩＬ－２－ＩＬ２Ｒａキメラ抗体の生物活性を評価するために、ＩＬ２が操作されたＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ上の中親和性または高親和性ＩＬ２受容体に結合すると、ＳＴＡＴ５駆動ルシフェラーゼ発現が活性化される細胞ベースのレポーターアッセイを確立した。ＹＴ細胞は内因性にヒトＰＤ１を発現しているが、過剰発現ＰＤ－１細胞（ＰＤ１ ＯＥ）を作製した。３つのＩＬ２受容体サブユニットすべてを内因性に発現するＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃ／ＰＤ１ ＯＥレポーター細胞を遺伝子修飾して、ＩＬ２Ｒａサブユニットのノックアウトによる中親和性ＩＬ２受容体（ＣＤ２５ ＫＯ）、またはＩＬ２Ｒａの過剰発現による高親和性受容体（ＣＤ２５ ＯＥ）を細胞表面に発現するようにした。

【0269】

１０％ＦＢＳとＰ／Ｓ／Ｇを添加したＲＰＭＩ１６４０をアッセイ培地として使用し、細胞懸濁液と抗体希釈液を調製した。スクリーニングの前日、操作されたＹＴ／ＳＴＡＴ５－Ｌｕｃレポーター細胞（ＣＤ２５ ＫＯ／ＰＤ１ ＯＥおよびＣＤ２５ ＯＥ／ＰＤ１ ＯＥ）を細胞３×１０^５個／ｍＬに希釈した。アッセイ当日、細胞を遠心沈殿し、アッセイ培地に再懸濁し、９６ウェル白色平底プレートにレポーター細胞２．５×１０^４個／ウェルでプレーティングし、１１段階の滴定範囲（２００ｎＭ～２１ｆＭ）で連続希釈（１：５）（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ）、または１１段階の滴定範囲（２５０ｎＭ～２３８ｆＭ）で連続希釈（１：４）（図２Ａ、２Ｂ）し、１２番目の滴定範囲は組換えタンパク質を含まないアイソタイプ－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２［ＲＥＧＮ９９０３またはＲＥＧＮ９９０４］、アイソタイプ－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ、アイソタイプ－ＩＬ２（３ｍ）［ＲＥＧＮ１３２３４］、抗ＰＤ１（アーム９０４８）－標的－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２［ＲＥＧＮ１０５９７］、抗ＰＤ１（アーム９０４８）－標的－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａまたは抗ＰＤ１（アーム９０４８）－標的－ＩＬ２（３ｍ）［ＲＥＧＮ１３２３３］とインキュベートした。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で４時間３０分（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ）または４時間（図２Ａ、２Ｂ）インキュベートした後、１００ｍＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬をウェルに加え、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光した光は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてＲＬＵで測定した。抗体のＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用い、１２点の用量反応曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は以下の式で計算した：

【数7】

【0270】

結果の要約
アイソタイプＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ９９０３）、アイソタイプ－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａ、抗ＰＤ１標的－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）および抗ＰＤ１標的－ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａは、レポーター細胞上のＩＬ２Ｒａ発現の非存在下（図８Ａ）または存在下（図８Ｂ）の両方で、ＳＴＡＴ５駆動レポーター発現の用量依存的増加をもたらした（表１８）。ＰＤ－１標的分子は、アイソタイプ標的分子と比較して増強された効力を示した。ＩＬ２－ＩＬ２Ｒａキメラ分子は、レポーター細胞上のＩＬ２Ｒａ発現の有無にかかわらず、ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２キメラ分子と比較して低下した効力を示した。

【0271】

【表18】

【0272】

アイソタイプＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ９９０３）、アイソタイプ－ＩＬ２（３ｍ）（ＲＥＧＮ１３２３４）、抗ＰＤ１標的－ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２（ＲＥＧＮ１０５９７）および抗ＰＤ１標的－ＩＬ２（３ｍ）（ＲＥＧＮ１３２３３）は、レポーター細胞上のＩＬ２Ｒａ発現の非存在下（図９Ａ）または存在下（図９Ｂ）の両方で、ＳＴＡＴ５駆動レポーター発現の用量依存的増加をもたらした（表１９）。ＰＤ１標的分子は、レポーター細胞におけるＩＬ２Ｒａ発現の非存在下（ＲＥＧＮ１３２３３：５３ｐＭ、ＲＥＧＮ１０５９７：８４ｐＭ）またはレポーター細胞上のＩＬ２Ｒａの存在下（ＲＥＧＮ１３２３３：４６ｐＭ、ＲＥＧＮ１０５９７：３７ｐＭ）において同様の効力を示した。ＰＤ１標的の非存在下では、ＩＬ２Ｒａ－ＩＬ２キメラ分子はＩＬ２（３ｍ）キメラ分子と比較して低下した効力を示した。

【0273】

【表19】

【0274】

本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本開示の様々な修飾が、前述の説明および添付の図から当業者に明らかになるであろう。このような修飾は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B-1】

【図3B-2】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B-1】

【図6B-2】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【配列表】

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【国際調査報告】