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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】発酵液から目的の化合物を得る方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/52 20060101AFI20240524BHJP
【ＦＩ】
C12P7/52
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577732
(86)(22)【出願日】2022-06-16
(85)【翻訳文提出日】2023-12-15
(86)【国際出願番号】 KR2022008552
(87)【国際公開番号】W WO2022265429
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】10-2021-0078346
(32)【優先日】2021-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513132586
【氏名又は名称】ジーエス カルテックス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100121821
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 強
(72)【発明者】
【氏名】オム ムン－ホ
(72)【発明者】
【氏名】チャン ジュン－ホ
(72)【発明者】
【氏名】チョン サン－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】イ キョン－ジュン
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AD05
4B064CE03
4B064CE06
4B064CE08
4B064CE10
4B064CE11
4B064DA16
(57)【要約】
【課題】発酵液から目的の化合物を得る方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法に関する：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法に関する：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法：（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
【請求項2】
上記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行うとき、任意の工程を２回以上繰り返すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
上記工程（ａ）は、蒸発、濃縮および蒸留からなる群から選択される１つ以上によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
上記工程（ｃ）は、下記の（ｃ）’または（ｃ）’’によって行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法：（ｃ）’ ：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去する工程
（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理する工程。
【請求項5】
前記（ｃ）’’のクロマトグラフィーは、ＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記不溶性物質は、細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記巨大分子は、タンパク質、多糖類または脂質類であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記目的の化合物は、微生物の発酵によって生成された有機酸であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
上記（ｂ）の前記炭素源は、グリセロールまたはグルコースであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
上記（ｂ）の前記アルコールは、微生物の発酵によって生成されたアルコールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
上記（ｂ）の前記アルコールは、１，３－プロパンジオールであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
上記工程（ｂ）は、発酵液をＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィーに適用して行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させ、（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させ、（ｃ）’：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去し、その後、（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理し、（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させた後、目的の化合物を回収して化合物を得ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、発酵液から目的の化合物を得る方法に関する。
【背景技術】
【0002】
３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ＨＰ）は、化学的合成工程と微生物発酵工程によって生産することができ、近年、大腸菌、クレブシエラのようなバクテリアを用いて３－ＨＰを生産する方法が研究されている。例えば、韓国公開特許第１０－２０２０－００５１３７５号には、特定の遺伝子で形質転換された微生物を用いて３－ＨＰを生産する技術が開示されている。
【0003】
本発明は、微生物の培養によって生成された３－ＨＰを含む発酵液から３－ＨＰを分離して得る方法に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、発酵液から目的の化合物を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記目的を達成するために本発明は、
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法を提供する：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法を提供する：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
【発明の効果】
【0006】
本発明の方法によって、発酵液から目的の化合物を高い収率で分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】本発明の化合物を得る方法を示す模式図である。
【図2】発酵液を微細ろ過機によって不溶性物質を分離した試験の結果である。
【図3】単一カラムクロマトグラフィーによって発酵液内の３－ＨＰ、１，３－プロパンジオールおよびグリセロールのピークを確認した結果である。
【図4】発酵液内のカルシウムイオンを沈殿して除去する過程を示す図である。
【図5】イオン交換による発酵液内のイオン濃度の変化を示す図である。
【図6】イオン交換によって発酵液内のイオンを除去する過程を示す図である。
【図7】電気透析によって発酵液内のイオンを除去する過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明は、
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程に関する。
発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程に関する。
【0009】
このとき、上記（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行うとき、任意の工程を２回以上繰り返すことができる。
【0010】
上記工程（ａ）は、蒸発、濃縮および蒸留からなる群から選択される１つ以上によって行うことができる。
【0011】
上記工程（ｃ）は、下記の（ｃ）’または（ｃ）’’によって行うことができる：
（ｃ）’：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去する工程
（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理する工程。
（ｃ）’：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去する工程
（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理する工程。
【0012】
前記不溶性物質は、細胞を含んでいてもよく、前記巨大分子は、タンパク質、多糖類または脂質類であってもよい。このとき、発酵液から不溶性物質の少なくとも一部を除去するか、巨大分子の少なくとも一部を除去するか、不溶性物質の少なくとも一部及び巨大分子の少なくとも一部を除去することができる。このとき、発酵液から不溶性物質の少なくとも一部を除去した後、巨大分子の少なくとも一部を除去することができる。または、このとき、発酵液から巨大分子の少なくとも一部を除去した後、不溶性物質の少なくとも一部を除去することができる。前記目的の化合物は、微生物の発酵によって生成された有機酸であってもよく、好ましくは、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ＨＰ）であってもよい。上記（ｂ）の前記炭素源は、グリセロールまたはグルコースであってもよい。上記（ｂ）の前記アルコールは、微生物の発酵によって生成されたアルコールであってもよく、例えば、１，３－プロパンジオールなどであってもよい。
【0013】
本発明の好ましい一具現例において、本発明の化合物を得る方法は、発酵液から不溶性物質の少なくとも一部を除去し、巨大分子の少なくとも一部を除去した後、第一に（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させ、（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させ、（ｃ）’：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去し、その後、（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理し、第二に（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させた後、目的の化合物を回収して、化合物を得て行うことができる。
【0014】
前記発酵液は、下記の工程１：発酵液の準備工程によって準備した発酵液であってもよい。
【0015】
前記発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去する工程は、下記の工程２：不溶性物質の分離工程または下記の工程３：巨大分子の除去及び脱色工程であってもよい。
【0016】
上記第一に（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程は、下記の工程４：発酵液内の３－ＨＰの濃度を増加させる工程であってもよい。
【0017】
上記（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程は、下記の工程５：発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させる工程であってもよい。
【0018】
上記（ｃ）’：発酵液に酸処理してイオン成分を沈殿させた後、除去する工程は、下記の工程６：発酵液におけるイオン成分を減少させる工程（沈殿及びろ過）であってもよい。
【0019】
上記（ｃ）’’：発酵液を電気透析、イオン交換およびクロマトグラフィーからなる群から選択される１つ以上で処理する工程は、下記の工程７：発酵液におけるイオン成分を減少させる工程（電気透析及びイオン交換）であってもよい。
【0020】
上記第二に（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程は、下記の工程８：発酵液における３－ＨＰの濃度を増加させる工程であってもよい。
【0021】
上記目的の化合物を回収する工程は、下記の工程９：回収工程であってもよい。
【0022】
工程１：発酵液の準備工程
本発明の化合物を得る方法は、発酵液の準備工程を含んでいてもよい。前記発酵液は、微生物を用いて発酵させた発酵液（発酵ブロス）、つまり培養液であってもよい。前記培養液は、３－ＨＰ及びその塩のほか、他の成分をさらに含んでいてもよい。例えば、前記培養液は、３－ＨＰのカルシウム塩を含んでいてもよい。前記他の成分は、微生物の培養に用いられた炭素源（例えば、グリセロールなど）、有機酸（例えば、アセット酸など）、塩（例えば、硫酸塩、リン酸塩など）、アルコール（例えば、ジオール）、糖、カルシウムなどであってもよい。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液の準備工程を含んでいてもよい。前記発酵液は、微生物を用いて発酵させた発酵液（発酵ブロス）、つまり培養液であってもよい。前記培養液は、３－ＨＰ及びその塩のほか、他の成分をさらに含んでいてもよい。例えば、前記培養液は、３－ＨＰのカルシウム塩を含んでいてもよい。前記他の成分は、微生物の培養に用いられた炭素源（例えば、グリセロールなど）、有機酸（例えば、アセット酸など）、塩（例えば、硫酸塩、リン酸塩など）、アルコール（例えば、ジオール）、糖、カルシウムなどであってもよい。
【0023】
前記発酵液内の３－ＨＰまたはその塩の濃度は、例えば、約１０，０００～２００，０００ｐｐｍ、例えば、約１２，０００～１９０，０００ｐｐｍ、例えば、約１５，０００～１８０，０００ｐｐｍ、例えば、約２０，０００～１５０，０００ｐｐｍ、例えば、約２５，０００～１３０，０００ｐｐｍ、例えば、約３０，０００～１１０，０００ｐｐｍであってもよい。具現例において、前記発酵液内の３－ＨＰまたはその塩の濃度は、例えば、約１０，０００ｐｐｍ以上、例えば、約１２，０００ｐｐｍ以上、例えば、約１５，０００ｐｐｍ以上、例えば、約２０，０００ｐｐｍ以上、例えば、約２５，０００ｐｐｍ以上、例えば、約３０，０００ｐｐｍ以上であってもよい。具現例において、前記発酵液内の３－ＨＰまたはその塩の濃度は、例えば、２００，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１９０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１８０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１５０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１３０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１１０，０００ｐｐｍ以下であってもよい。
【0024】
このとき、前記発酵液のｐＨを調節する工程をさらに含んでいてもよい。ｐＨは、酸またはアルカリを前記発酵液に処理して調節することができる。前記酸またはアルカリの種類は、特に制限されず、発酵液のｐＨを調節する際に使用する通常の酸またはアルカリを用いることができる。例えば、このとき、所望のｐＨは、３－ＨＰと分離しようとする化合物の種類およびその後の分離工程の方法に応じて異にして適宜調節することができる。
【0025】
工程２：不溶性物質の分離工程
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から不溶性物質の少なくとも一部を分離する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液は、工程１で準備した発酵液または工程１及び３を経た発酵液、つまり処理液であってもよい。前記不溶性物質は、微生物、つまり細胞、固形物などであってもよい。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から不溶性物質の少なくとも一部を分離する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液は、工程１で準備した発酵液または工程１及び３を経た発酵液、つまり処理液であってもよい。前記不溶性物質は、微生物、つまり細胞、固形物などであってもよい。
【0026】
前記不溶性物質の分離は、遠心分離機、ろ過工程などを用いて行うことができるものの、特に制限されない。これにより、発酵液から微生物、つまり細胞が分離され得る。
【0027】
例えば、微細ろ過によって微生物及び発酵液内の固形物を除去することができる。微細ろ過は、０．０４～５μｍの気孔サイズを有する高分子またはセラミックメンブレンに前記発酵液を通過させて行うことができる。このとき、微細ろ過操作は、フラックス（Ｆｌｕｘ）（メンブレンの単位面積及び単位時間当たり処理量）が減少する傾向により、２工程以上から構成することができる。一具現例において、フラックスが顕著に低下する時点で、回収率の増加のため発酵液にさらに水を投入することができる。
【0028】
工程３：巨大分子の除去及び脱色工程
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から巨大分子の少なくとも一部を分離する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液から巨大分子の少なくとも一部を分離する工程は、発酵液における巨大分子を除去して脱色する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液は、工程１で準備した発酵液または工程１及び２の段階を経た発酵液、つまり処理液であってもよい。前記巨大分子は、タンパク質、多糖類、脂質類などであってもよい。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から巨大分子の少なくとも一部を分離する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液から巨大分子の少なくとも一部を分離する工程は、発酵液における巨大分子を除去して脱色する工程を含んでいてもよい。このとき、前記発酵液は、工程１で準備した発酵液または工程１及び２の段階を経た発酵液、つまり処理液であってもよい。前記巨大分子は、タンパク質、多糖類、脂質類などであってもよい。
【0029】
一具現例において、上記巨大分子の除去及び脱色工程は、前記発酵液に活性炭及びろ過補助剤を混合した後、ろ過して行うことができる。具体的に、一具現例において、微生物を除去した発酵液に活性炭及びろ過補助剤（珪藻土、白土など）を混合した後、ろ過（例えば、フィルタプレスなど）して、巨大分子の除去及び脱色効果を得ることができる。前記ろ過は、通常に使用され得る粉末粒子のろ過方法（例えば、フィルタプレス、ドラムフィルタ、キャンドルフィルタ、リーフフィルタなど）を用いることができ、特に制限されない。
【0030】
活性炭の添加によって一部のタンパク質、多糖類などの巨大分子を除去することにより、その後、３－ＨＰの濃度を増加させる過程で発生し得る粘着性物質の発生を抑えることができる。活性炭の適用は、粉末活性炭のみならず、粒状活性炭の適用も可能である。例えば、発酵液重量に対して０．１～２ｗｔ％の粉末活性炭を添加した後、３０～８０℃の条件で、１～５時間攪拌した後、ろ過することにより、発酵液の色を除去することができた。１．５％の粉末活性炭を発酵液に混合した後、４０℃で１時間攪拌した後、ろ過時、発酵液のＡＰＨＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）カラー値は、２．７となった。また、粒状活性炭を発酵液重量に対して５～１５％の質量分率で適用するとき、粉末活性炭に類似する脱色性能を期待することができ、この場合、経済性を確保するためスチームなどを用いた活性炭の再生システムを併せて備える必要がある。
【0031】
さらに他の具現例において、前記巨大分子の除去及び脱色工程は、前記処理液の膜分離によって行うことができる。このとき、前記膜分離方式は、限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）またはナノろ過などであってもよく、この場合、さらなる脱色工程なしで、巨大分子の除去及び脱色効果を得ることができる。
【0032】
このとき、限外ろ過は、５０００～１００，０００ＤａのＭＷＣＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ Ｃｕｔ－Ｏｆｆ）を有する限外ろ過膜を適用した後、１５０～３００Ｄａのナノろ過膜を適用することにより、３－ＨＰ塩の損失は最小化しつつ、タンパク質、多糖類、脂質類などの巨大分子のみを除去することができる。
【0033】
工程４：発酵液内の３－ＨＰの濃度を増加させる工程
本発明の化合物を得る方法は、発酵液内の３－ＨＰの濃度を増加させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程４の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程４の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３を経た後、工程５～８のいずれか１以上の段階を経た発酵液を経た処理液であってもよい、このとき、発酵液内の液体の少なくとも一部を蒸発させるか、または濃縮させるなどの方法によって３－ＨＰの濃度を増加させることができる。このとき、発酵液１Ｌ当たり１００～５００ｇの３－ＨＰ当量で濃度を増加させることができる。このとき、濃度の増加は、圧力の調節を伴い得、適宜な圧力下で行うことができ、例えば、絶対圧力を基準に約２０～３００ｍｂａｒ、例えば、約２５～２８０ｍｂａｒ、例えば、約３０～２５０ｍｂａｒ、例えば、約５０～２００ｍｂａｒ、例えば、約７０～１９０ｍｂａｒ、例えば、約８０～１８０ｍｂａｒで行うことができる。一具現例において、前記濃度の増加工程は、例えば、約２０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５ｍｂａｒ以下、例えば、約３０ｍｂａｒ以下、例えば、約５０ｍｂａｒ以下、例えば、約７０ｍｂａｒ以下、例えば、約８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。一具現例において、前記濃度の増加工程は、例えば、約３００ｍｂａｒ以下、例えば、約２８０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５０ｍｂａｒ以下、例えば、約２００ｍｂａｒ以下、例えば、約１９０ｍｂａｒ以下、例えば、約１８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液内の３－ＨＰの濃度を増加させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程４の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程４の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３を経た後、工程５～８のいずれか１以上の段階を経た発酵液を経た処理液であってもよい、このとき、発酵液内の液体の少なくとも一部を蒸発させるか、または濃縮させるなどの方法によって３－ＨＰの濃度を増加させることができる。このとき、発酵液１Ｌ当たり１００～５００ｇの３－ＨＰ当量で濃度を増加させることができる。このとき、濃度の増加は、圧力の調節を伴い得、適宜な圧力下で行うことができ、例えば、絶対圧力を基準に約２０～３００ｍｂａｒ、例えば、約２５～２８０ｍｂａｒ、例えば、約３０～２５０ｍｂａｒ、例えば、約５０～２００ｍｂａｒ、例えば、約７０～１９０ｍｂａｒ、例えば、約８０～１８０ｍｂａｒで行うことができる。一具現例において、前記濃度の増加工程は、例えば、約２０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５ｍｂａｒ以下、例えば、約３０ｍｂａｒ以下、例えば、約５０ｍｂａｒ以下、例えば、約７０ｍｂａｒ以下、例えば、約８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。一具現例において、前記濃度の増加工程は、例えば、約３００ｍｂａｒ以下、例えば、約２８０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５０ｍｂａｒ以下、例えば、約２００ｍｂａｒ以下、例えば、約１９０ｍｂａｒ以下、例えば、約１８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。
【0034】
例えば、５０ｍｂａｒ減圧の条件で、Ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒのＢａｔｈ温度条件を５０℃に維持して、３－ＨＰの濃度が５００ｇ／Ｌ以上になるまで濃縮することができた。４００ｇ／Ｌ以上の濃度条件では、濃縮を終了後、温度の低下により、３－ＨＰカルシウム塩の結晶が生成されることを確認することができ、それ以上の濃度増加により、濃縮過程でも結晶が生成されることを確認することができた。
【0035】
工程５：発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させる工程
本発明の化合物を得る方法は、発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程５の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程５の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４または工程６～８のいずれか１以上の工程を経た処理液であってもよい。前記グリセロールは、微生物を培養する際に使用していた炭素源であってもよく、前記アルコールは、１，３－プロパンジオール（１，３－ＰＤＯ）などのような微生物の培養産物であってもよい。炭素源としてグルコースが用いられる場合、工程５によって発酵液内のグルコースの濃度が減少し得る。このとき、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー（例えば、ＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィー）を適用して、発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させることができ、これは、本発明の方法で得られた３－ＨＰを用いて高分子重合を行う場合、製品の品質に影響を及ぼす重要な因子である。クロマトグラフィーまたはＳＭＢクロマトグラフィーを用いる場合、移動相をＦｅｅｄと共に注入して、１個以上の３－ＨＰが豊富な分画（分画Ａ）と、１個以上の３－ＨＰでない他の化合物が豊富な分画（分画Ｂ）を得ることができる。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程５の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程５の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４または工程６～８のいずれか１以上の工程を経た処理液であってもよい。前記グリセロールは、微生物を培養する際に使用していた炭素源であってもよく、前記アルコールは、１，３－プロパンジオール（１，３－ＰＤＯ）などのような微生物の培養産物であってもよい。炭素源としてグルコースが用いられる場合、工程５によって発酵液内のグルコースの濃度が減少し得る。このとき、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー（例えば、ＳＭＢ（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）クロマトグラフィー）を適用して、発酵液内のグリセロールまたはアルコールの濃度を減少させることができ、これは、本発明の方法で得られた３－ＨＰを用いて高分子重合を行う場合、製品の品質に影響を及ぼす重要な因子である。クロマトグラフィーまたはＳＭＢクロマトグラフィーを用いる場合、移動相をＦｅｅｄと共に注入して、１個以上の３－ＨＰが豊富な分画（分画Ａ）と、１個以上の３－ＨＰでない他の化合物が豊富な分画（分画Ｂ）を得ることができる。
【0036】
工程６：発酵液におけるイオン成分を減少させる工程（沈殿及びろ過）
本発明の化合物を得る方法は、発酵液におけるイオン成分を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程６の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程６の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、工程４、５、７および８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。一具現例において、前記工程５を行う場合、グリセロール及びアルコールが低減した発酵液のうち最大不純物は、発酵液を製造する段階において、ｐＨを調節するために流入したｐＨ調節剤のカチオンである。分離精製工程によって異なるｐＨ調節剤の使用が可能であるため、前記カチオンの種類は、様々になり得、通常は、カルシウム、マグネシウムなどのカチオンであるものの、これに制限されるものではない。３－ＨＰと弱い化学的結合によって様々な３－ＨＰ塩の形態で存在する、かかるカチオンは、酸処理によって沈殿物の形態に効率良く除去することができる。沈殿物の除去は、フィルタプレス、ドラムフィルタなどを用いることができるものの、これに制限されず、沈殿物を除去できる一般的な方法であれば用いることができる。これらの酸処理過程によって溶液のｐＨは、約１～３に減少し得る。例えば、ｐＨを約１．５～約２．５に減少させることができ、例えば、ｐＨを約１．５～２．０に減少させることができる。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液におけるイオン成分を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程６の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程６の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、工程４、５、７および８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。一具現例において、前記工程５を行う場合、グリセロール及びアルコールが低減した発酵液のうち最大不純物は、発酵液を製造する段階において、ｐＨを調節するために流入したｐＨ調節剤のカチオンである。分離精製工程によって異なるｐＨ調節剤の使用が可能であるため、前記カチオンの種類は、様々になり得、通常は、カルシウム、マグネシウムなどのカチオンであるものの、これに制限されるものではない。３－ＨＰと弱い化学的結合によって様々な３－ＨＰ塩の形態で存在する、かかるカチオンは、酸処理によって沈殿物の形態に効率良く除去することができる。沈殿物の除去は、フィルタプレス、ドラムフィルタなどを用いることができるものの、これに制限されず、沈殿物を除去できる一般的な方法であれば用いることができる。これらの酸処理過程によって溶液のｐＨは、約１～３に減少し得る。例えば、ｐＨを約１．５～約２．５に減少させることができ、例えば、ｐＨを約１．５～２．０に減少させることができる。
【0037】
工程７：発酵液におけるイオン成分を減少させる工程（電気透析及びイオン交換）
本発明の化合物を得る方法は、発酵液におけるイオン成分を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程７の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程７の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～６または８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。一具現例において、工程６で除去して残った少量のイオンが工程７でさらに除去され得る。工程７では、電気透析、イオン交換、ＳＭＢクロマトグラフィーのような工程を適用して、発酵液に残留するイオン成分を分離、低減することができる。前記イオンは、硫酸イオン、リン酸イオン、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、及びマグネシウムイオンなどであってもよい。このとき、イオン成分を例えば、約２０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１９，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１８，５００ｐｐｍ以下、例えば、約１８，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１７，５００ｐｐｍ以下、例えば、約１７，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１６，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１００～１５，５００ｐｐｍ、例えば、約１５０～１５，０００ｐｐｍに減少させることができる。一具現例において、減少したイオン成分の濃度は、例えば、０ｐｐｍ超、例えば、１０ｐｐｍ超、例えば、２０ｐｐｍ超、例えば、５０ｐｐｍ超であってもよい。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液におけるイオン成分を減少させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程７の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程７の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～６または８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。一具現例において、工程６で除去して残った少量のイオンが工程７でさらに除去され得る。工程７では、電気透析、イオン交換、ＳＭＢクロマトグラフィーのような工程を適用して、発酵液に残留するイオン成分を分離、低減することができる。前記イオンは、硫酸イオン、リン酸イオン、ナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、及びマグネシウムイオンなどであってもよい。このとき、イオン成分を例えば、約２０，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１９，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１８，５００ｐｐｍ以下、例えば、約１８，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１７，５００ｐｐｍ以下、例えば、約１７，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１６，０００ｐｐｍ以下、例えば、約１００～１５，５００ｐｐｍ、例えば、約１５０～１５，０００ｐｐｍに減少させることができる。一具現例において、減少したイオン成分の濃度は、例えば、０ｐｐｍ超、例えば、１０ｐｐｍ超、例えば、２０ｐｐｍ超、例えば、５０ｐｐｍ超であってもよい。
【0038】
工程８：発酵液における３－ＨＰの濃度を増加させる工程
本発明の化合物を得る方法は、イオン成分が減少した発酵液における３－ＨＰの濃度を増加させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程８の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程８の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～７のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。このとき、蒸発、濃縮などの方法を用いて、イオン成分が減少した処理液における３－ＨＰの濃度を高めることができる。
本発明の化合物を得る方法は、イオン成分が減少した発酵液における３－ＨＰの濃度を増加させる工程を含んでいてもよい。このとき、工程８の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た処理液であってもよい。または、工程８の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～７のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。このとき、蒸発、濃縮などの方法を用いて、イオン成分が減少した処理液における３－ＨＰの濃度を高めることができる。
【0039】
一具現例において、３－ＨＰのほか、他の成分を除去または濃度を低くした発酵液を蒸発及び／又は濃縮して、３－ＨＰの濃度を増加させることができる。一具現例において、工程１～７を経た後、工程８を行って３－ＨＰの濃度を増加させることができ、この場合、濃縮した発酵液は、水を除くほとんどの不純物が除去された水溶液の形態、つまり３－ＨＰ溶液であってもよい。この場合、水溶液の形態である濃縮した発酵液の３－ＨＰの濃度は、例えば、１５ｗｔ％以上、例えば、１６ｗｔ％以上、例えば、１７ｗｔ％以上、例えば、１８ｗｔ％以上、例えば、１９ｗｔ％以上、例えば、２０ｗｔ％以上であってもよい。このとき、水溶液の形態である、濃縮した発酵液の３－ＨＰの濃度は、約８０ｗｔ％以下であってもよい。このとき、蒸発、濃縮は、真空及び／又は熱を適用して行うことができ、水を蒸発させて除去することにより、３－ＨＰの濃度を調節することができる。
【0040】
例えば、真空蒸留を用いて発酵液を蒸留して、３－ＨＰの濃度を高める工程を行う場合、例えば、絶対圧力を基準に約１０～３００ｍｂａｒ、例えば、約２５～２８０ｍｂａｒ、例えば、約３０～２５０ｍｂａｒ、例えば、約５０～２００ｍｂａｒ、例えば、約７０～１９０ｍｂａｒ、例えば、約８０～１８０ｍｂａｒで行うことができる。具現例において、真空蒸留を用いて３－ＨＰの濃度を高める工程は、例えば、約２０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５ｍｂａｒ以下、例えば、約３０ｍｂａｒ以下、例えば、約５０ｍｂａｒ以下、例えば、約７０ｍｂａｒ以下、例えば、約８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。一具現例において、真空蒸留を用いて３－ＨＰの濃度を増加させる工程は、例えば、約３００ｍｂａｒ以下、例えば、約２８０ｍｂａｒ以下、例えば、約２５０ｍｂａｒ以下、例えば、約２００ｍｂａｒ以下、例えば、約１９０ｍｂａｒ以下、例えば、約１８０ｍｂａｒ以下で行うことができる。
【0041】
前記蒸留は、流下膜蒸留装置、ワイパー式薄膜蒸発装置、薄膜蒸発装置、遠心分子蒸留装置、薄膜上昇式蒸発装置などを用いて行うことができるものの、これに制限されず、多用途管で構成することができ、エネルギー効率化のために熱的再圧縮、機械的再圧縮工程を適用することができる。
【0042】
工程９：回収
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から３－ＨＰを回収する工程をさらに含んでいてもよい。このとき、工程９の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。３－ＨＰは、水溶液状態で回収することができる。
本発明の化合物を得る方法は、発酵液から３－ＨＰを回収する工程をさらに含んでいてもよい。このとき、工程９の前記発酵液は、工程２及び／又は工程３の段階を経た後、さらに工程４～８のいずれか１以上の段階を経た処理液であってもよい。３－ＨＰは、水溶液状態で回収することができる。
【0043】
本発明の化合物を得る方法
本発明の化合物を得る方法は、上記に記載の工程の全てを実施することができ、２以上の工程を選択して実施することができ、３以上の工程を選択して実施することができる。また、本発明は、ここに記載の工程を任意に選択して、任意の順序に実施することができる。例えば、ろ過後、発酵液内のｐＨ濃度を増加させることができ、発酵液内のｐＨ濃度を増加させた後、ろ過を行うことができる。また、本発明は、ここに記載の工程のほか、さらに他の工程をさらに行うこともできる。
本発明の化合物を得る方法は、上記に記載の工程の全てを実施することができ、２以上の工程を選択して実施することができ、３以上の工程を選択して実施することができる。また、本発明は、ここに記載の工程を任意に選択して、任意の順序に実施することができる。例えば、ろ過後、発酵液内のｐＨ濃度を増加させることができ、発酵液内のｐＨ濃度を増加させた後、ろ過を行うことができる。また、本発明は、ここに記載の工程のほか、さらに他の工程をさらに行うこともできる。
【0044】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述する実施例を参照すれば明確になる。しかしながら、本発明は、以下で開示の実施例に限定されるものではなく、互いに異なる様々な形態に具現されるものである。但し、本実施例は、本発明の開示を完全にして、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義されるだけである。
【0045】
＜実験例１＞工程２：不溶性物質の分離試験
組換え大腸菌を用いてグリセロールを唯一の炭素源とする培地において、バッチ発酵によって３－ＨＰ発酵液を製造した。発酵液の上澄み液を、液体クロマトグラフィー法を用いて分析した結果、３－ＨＰが１００ｇ／Ｌ、１，３－ＰＤＯが０．５ｇ／Ｌ、アセット酸が０．３ｇ／Ｌ含まれており、グリセロールは、０．１ｇ／Ｌ以下で存在した。
組換え大腸菌を用いてグリセロールを唯一の炭素源とする培地において、バッチ発酵によって３－ＨＰ発酵液を製造した。発酵液の上澄み液を、液体クロマトグラフィー法を用いて分析した結果、３－ＨＰが１００ｇ／Ｌ、１，３－ＰＤＯが０．５ｇ／Ｌ、アセット酸が０．３ｇ／Ｌ含まれており、グリセロールは、０．１ｇ／Ｌ以下で存在した。
【0046】
前記発酵液を多孔性高分子膜でろ過して、不溶性物質を分離した。その結果、前記膜に入れた初期発酵液に対して９１％の３－ＨＰ（ろ過前に投入した発酵液の３－ＨＰ量に対してろ過した発酵液内の３－ＨＰ量）を回収することができた。
【0047】
その後、ろ過して残った発酵液に、初期発酵液用量（体積基準）に対して約１０％のＤI－ＷＡＴＥＲ（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ）を投入して攪拌した後、再びろ過を行った。これは、ろ過装置内に駆動のためＤＥＡＤ ＶＯＬＵＭＥ（装備を稼働するために要する空間、ここにある発酵液は、ろ過していない）が存在することから、上記のようなさらなる水の投入及び追ってろ過過程がさらに必要であるからである。
【0048】
その結果、初期発酵液内に含まれた３－ＨＰ量に対して９６．７％まで３－ＨＰの回収率を増加させることができた。すなわち、初期に比べて、ろ過液を９１％まで回収した後、一定量の水をさらに投入した後、再びろ過液をさらに生産することにより、９６．７％まで３－ＨＰの回収率を増加させることができる（図２）。
【0049】
＜実験例２＞工程５：単一カラムクロマトグラフィーによる１，３－プロパンジオール及びグリセロールのピークの確認
上記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を濃縮して、約３０ｗ／ｗ％の３－ＨＰ液を製造し、それを実験例２のＦｅｅｄとして使用した。確認の結果、前記Ｆｅｅｄには３－ＨＰがカルシウム塩の形態に含まれていた。３８０ｍｌのガラスカラムにカチオン交換樹脂を充填し、定量ポンプで３０％の３－ＨＰ発酵液２０ｍｌをパルスで満たし、ＤI－Ｗａｔｅｒを溶離剤として使用して、１０ｍｌ／ｍｉｎで、下方から上方の方向にイオン交換樹脂カラムを通過させた。カラムを通過した液から１０ｍｌずつサンプルを採取して、液体クロマトグラフィー法で分析した（単一カラムクロマトグラフィーで、５０℃の条件で、空間速度１ｈｒ－１に処理した）。
上記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を濃縮して、約３０ｗ／ｗ％の３－ＨＰ液を製造し、それを実験例２のＦｅｅｄとして使用した。確認の結果、前記Ｆｅｅｄには３－ＨＰがカルシウム塩の形態に含まれていた。３８０ｍｌのガラスカラムにカチオン交換樹脂を充填し、定量ポンプで３０％の３－ＨＰ発酵液２０ｍｌをパルスで満たし、ＤI－Ｗａｔｅｒを溶離剤として使用して、１０ｍｌ／ｍｉｎで、下方から上方の方向にイオン交換樹脂カラムを通過させた。カラムを通過した液から１０ｍｌずつサンプルを採取して、液体クロマトグラフィー法で分析した（単一カラムクロマトグラフィーで、５０℃の条件で、空間速度１ｈｒ－１に処理した）。
【0050】
その結果、１，３－ＰＤＯとグリセロールのピークが３－ＨＰのテール（ｔａｉｌ）近く類似に形成されることを確認することができた（図３）。よって、３－ＨＰ塩と樹脂との反発力を用いて、ＳＭＢクロマトグラフィーによって３－ＨＰを１，３－ＰＤＯ及びグリセロールと分離することができると類推できる。
【0051】
一方、同じイオン交換樹脂と３インチ径のカラムを適用して、ＳＭＢクロマトグラフィー実験を行った。３－ＨＰを含む発酵液を限外ろ過及び濃縮して製造した３－ＨＰ３００ｇ／ＬのＦｅｅｄがＳＭＢ装置に注入されており、Ｆｅｅｄの温度を２５～５０℃水準に維持しながら、溶離剤（Ｅｌｕｅｎｔ）（水）をＦｅｅｄに対して１～３倍の割合（重量基準）で注入しつつ、ＥｘｔｒａｃｔとＲａｆｆｉｎａｔｅのフロー比（＝Ｅ／Ｒ ｒａｔｉｏ）を０．１～５．０の間に調節することにより、Ｒａｆｆｉｎａｔｅのフローにおけるグリセロールと１．３－プロパンジオールを３０ｐｐｍ以下に除去することができ、Ｒａｆｆｉｎａｔｅにおける３－ＨＰの濃度は、７０ｇ／Ｌ～２５０ｇ／Ｌであった。また、１．３－プロパンジオールの残留量を５０ｐｐｍ水準に高める場合、９９．４％の回収率（Ｆｅｅｄで注入された３－ＨＰ量に対してＲａｆｆｉｎａｔｅに出る３－ＨＰ量）を達成することができた。
【0052】
＜実験例３＞工程６：カルシウムイオンの除去試験
前記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を、濃縮過程を経て約２０ｗ／ｖ％の３－ＨＰ液を作り、実験例３のＦｅｅｄとして使用した。Ｆｅｅｄをイオンクロマトグラフィー法で分析した結果、Ｃａイオンの濃度が約４０，０００ｐｐｍ存在し、Ｆｅｅｄ内の３－ＨＰの濃度は、２１３ｇ／Ｌであった。
前記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を、濃縮過程を経て約２０ｗ／ｖ％の３－ＨＰ液を作り、実験例３のＦｅｅｄとして使用した。Ｆｅｅｄをイオンクロマトグラフィー法で分析した結果、Ｃａイオンの濃度が約４０，０００ｐｐｍ存在し、Ｆｅｅｄ内の３－ＨＰの濃度は、２１３ｇ／Ｌであった。
【0053】
前記Ｆｅｅｄ（３－ＨＰ発酵液）１３００ｇをガラスビーカーに入れた後、１５％の硫酸溶液約８７０ｇを定量ポンプを用いて、３０ｍＬ／ｍｉｎの速度で入れて、２００ｒｐｍで攪拌した。硫酸溶液を全部入れた後、約１時間程さらに攪拌した。生成された白色硫酸カルシウム粒子を０．２マイクロフィルタで真空ろ過した。
【0054】
その結果、１３０ｇ／Ｌの３－ＨＰが含まれ、Ｃａイオンがほとんど除去されたｐＨ２～３のろ過液を得ることができた。ろ過紙の上端には、濡れた状態の白色固形物が約２９０ｇ残っていた。白色固形物は、水分が約４０重量％以上含有された石膏（Ｇｙｐｓｕｍ）である。
【0055】
沈殿反応の進行は、ｐＨと電気伝導度をモニタリングすることで確認することができた。沈殿過程が終わった後、ろ過液内のＣａイオンの濃度は、５００ｐｐｍ以下の水準と確認された（図４）。
【0056】
＜実験例４＞工程７：イオン交換試験
実験例３によってｐＨが低くなった発酵液のうち３－ＨＰは、非解離酸の形態で存在し、イオン交換樹脂処理によって発酵液のうち残留しているイオンをさらに除去することができる。上記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を実験例３のように、硫酸反応によってカルシウムを除去した後、イオン含量が約１６，６００ｐｐｍであるＦｅｅｄを作って、実験例４のＦｅｅｄとして使用した。その結果、Ｆｅｅｄ２５０ｍＬをカチオン交換樹脂６５ｍＬ、アニオン交換樹脂４０ｍＬに５ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入して通過させる場合、３－ＨＰとその他非解離状態の有機酸は、イオン交換樹脂を通過し、最終イオン濃度は、約２００ｐｐｍの水準と確認された（図５）。よって、イオン交換樹脂の通過過程で、３－ＨＰを回収するために投入された水の量のため、３－ＨＰの濃度は、最初１２５ｇ／Ｌから７５ｇ／Ｌに減少したが、これを鑑みても、Ｆｅｅｄ内のイオンの９８％を除去可能であることを確認した（図６）。
実験例３によってｐＨが低くなった発酵液のうち３－ＨＰは、非解離酸の形態で存在し、イオン交換樹脂処理によって発酵液のうち残留しているイオンをさらに除去することができる。上記実験例１で製造された、ろ過した発酵液を実験例３のように、硫酸反応によってカルシウムを除去した後、イオン含量が約１６，６００ｐｐｍであるＦｅｅｄを作って、実験例４のＦｅｅｄとして使用した。その結果、Ｆｅｅｄ２５０ｍＬをカチオン交換樹脂６５ｍＬ、アニオン交換樹脂４０ｍＬに５ｍＬ／ｍｉｎの流速で注入して通過させる場合、３－ＨＰとその他非解離状態の有機酸は、イオン交換樹脂を通過し、最終イオン濃度は、約２００ｐｐｍの水準と確認された（図５）。よって、イオン交換樹脂の通過過程で、３－ＨＰを回収するために投入された水の量のため、３－ＨＰの濃度は、最初１２５ｇ／Ｌから７５ｇ／Ｌに減少したが、これを鑑みても、Ｆｅｅｄ内のイオンの９８％を除去可能であることを確認した（図６）。
【0057】
前記カチオン交換樹脂及びアニオン交換樹脂を１回通過させる、１段階イオン交換では除去されていないイオンがあったが、これらのイオンは、２価カチオン（Ｍｇ、Ｃａ）とカリウムであり、これは、さらなる少量のカチオン交換樹脂処理によって除去することができるだろう。
【0058】
＜実験例５＞工程７：電気透析試験
実験例１で作られた、ろ過した発酵液を実験例３と同様の処理過程を経て、実験例５のＦｅｅｄとして使用した。前記Ｆｅｅｄ内のイオン含量は、約１６，６００ｐｐｍであった。処理対象であるイオンの濃度が３０００ｐｐｍ以上であるため、効率の良いイオン成分を除去するためには、電気透析またはＳＭＢクロマトグラフィーを適用して、主なイオン成分を除去することが好ましい。発酵液内のイオン成分は、電気透析、イオン交換、ＳＭＢクロマトグラフィーのいずれか工程のみで除去することもできるが、好ましくは、２つ以上の工程の組み合わせによってイオン除去の効率性を高めることが、廃水の発生や運営コストを低減する側面から有利であることが予想された。
実験例１で作られた、ろ過した発酵液を実験例３と同様の処理過程を経て、実験例５のＦｅｅｄとして使用した。前記Ｆｅｅｄ内のイオン含量は、約１６，６００ｐｐｍであった。処理対象であるイオンの濃度が３０００ｐｐｍ以上であるため、効率の良いイオン成分を除去するためには、電気透析またはＳＭＢクロマトグラフィーを適用して、主なイオン成分を除去することが好ましい。発酵液内のイオン成分は、電気透析、イオン交換、ＳＭＢクロマトグラフィーのいずれか工程のみで除去することもできるが、好ましくは、２つ以上の工程の組み合わせによってイオン除去の効率性を高めることが、廃水の発生や運営コストを低減する側面から有利であることが予想された。
【0059】
前記イオンの含量が約１６，６００ｐｐｍであるＦｅｅｄ１Ｌを不均質イオン交換膜（１０ｓｅｔ：カチオン交換膜とアニオン交換膜を１０枚交互に積層する）が取り付けられた電気透析装置を用いて、発酵液内に残留するイオン性物質を除去した。発酵液は、カチオン交換膜及びアニオン交換膜の間を流れ、その流量は、０．６ＧＰＭ（２．２７ＬＰＭ）である。イオン交換膜の間には８Ｖの電圧が荷電した。発酵液内のイオン量の変化は、発酵液の電気伝導度の変化から分かる。前記透析を４時間行った結果、発酵液の電気伝導度は、２１．３７ｍＳ／ｃｍから１．３５ｍＳ／ｃｍに低下した。これにより、９５％程度のイオン除去が可能であることを確認した（図７）。
【産業上の利用可能性】
【0060】
本発明は、発酵液から不溶性物質または巨大分子の少なくとも一部を除去した後、下記の（ａ）～（ｃ）のいずれか１以上の工程を行い、目的の化合物を回収して化合物を得る方法に関する：
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
（ａ）発酵液内の目的の化合物の濃度を増加させる工程
（ｂ）発酵液内の残余炭素源またはアルコールの濃度を減少させる工程
（ｃ）発酵液内のイオン成分の濃度を減少させる工程。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】