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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-05-31
(54)【発明の名称】臍帯血免疫抑制細胞の薬剤学的用途
(51)【国際特許分類】
A61K 35/51 20150101AFI20240524BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240524BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240524BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240524BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240524BHJP
【ＦＩ】
A61K35/51
A61P9/10
A61P43/00 105
A61P29/00
C12N5/078
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577898
(86)(22)【出願日】2021-06-14
(85)【翻訳文提出日】2024-01-23
(86)【国際出願番号】 KR2021007420
(87)【国際公開番号】W WO2022265124
(87)【国際公開日】2022-12-22
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイトに公開された「［■■■ ■■］■■■・■■■ ■■■ ■ ■■■‘ＧｖＨＤ’■■ ■■ ■■■ ■■」（翻訳：［健康な家族］白血病・血液がん患者のもう一つの敵‘ＧｖＨＤ’をつかむ新薬開発に希望）の記事
(71)【出願人】
【識別番号】523472180
【氏名又は名称】バイジェンセル・インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】510058863
【氏名又は名称】ザ カトリック ユニバーシティ オブ コリア インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン・ジュン・ソン
(72)【発明者】
【氏名】テ・ギュ・キム
(72)【発明者】
【氏名】ス・オン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ス・ヒョン・ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ヒョン・イル・チョ
(72)【発明者】
【氏名】バン・グル・イム
(72)【発明者】
【氏名】ウン・ア・キム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA94X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BB19
4B065BC12
4B065BD14
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB59
4C087DA31
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA36
4C087ZB11
4C087ZB21
(57)【要約】
本発明は、臍帯血免疫抑制細胞の薬剤学的用途に関し、より詳細には、本発明は、機能と表現型の分析及び区別基準に従って選別されたヒト由来臍帯血免疫抑制細胞の抗炎症、抗線維化、心筋梗塞の予防または治療のための新しい細胞治療剤としての用途を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
臍帯血免疫抑制細胞を含む炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項2】
臍帯血免疫抑制細胞は、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５－及びＨＬＡ－ＤＲＬＯＷを含む細胞表現型を発現するものである、請求項１に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項3】
臍帯血免疫抑制細胞は、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉ、誘導性酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｉＮＯＳ））、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＩＤＯ））を含むＴ細胞抑制物質を発現するものである、請求項１に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項4】
臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカインの組み合わせを含む細胞培養培地で２～７週間培養して誘導されるものである、請求項１に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項5】
ＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカインの組み合わせは、１：０．８～０．３の濃度比で含まれる、請求項４に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項6】
臍帯血免疫抑制細胞は、炎症抑制細胞（Ｍ２マクロファージ）の分化及び移動の増加、伝染性細胞（Ｍ１マクロファージ）の分化及び移動の減少、心機能（ＥＳＶ（ｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）、ＦＳ（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、ＥＦ（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ））改善、心筋梗塞のサイズの減少または心筋梗塞時の心臓への移動性の増加を示す、請求項１に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物。
【請求項7】
ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を区分し、二重ＣＤ１５陽性細胞を陽性対照群としてＣＤ１４＋表現型を発現する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階と、ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞に対してＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋の細胞表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞のうちＨＬＡ－ＤＲLOW表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階と、
末梢血単核細胞及び臍帯血免疫抑制細胞０．１２５～２μｌ／ｍＬ濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ細胞の増殖能を確認し、
対照群として末梢血単核細胞及び０．０５～３２０ｎｇ／ｍＬ濃度の免疫抑制剤を０．１２５～２μl／ｍＬ濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ細胞の増殖能を確認し、前記臍帯血免疫抑制細胞のＴ細胞増殖能を対照群と比較する段階と、
前記臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカイン組み合わせを含む細胞培養培地で２～７週間培養して誘導されたものである、免疫抑制能に優れた臍帯血由来の臍帯血免疫抑制細胞の選別方法。
【請求項8】
ＣＤ１５陽性細胞は、顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、及びＣＤ１５遺伝子を発現するように遺伝子強化された細胞株のいずれかを含む、請求項７に記載の免疫抑制能に優れた臍帯血免疫抑制細胞の選別方法。
【請求項9】
ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞は、樹状細胞、単核球、及びＨＬＡ－ＤＲ遺伝子を発現するように遺伝子強化した細胞株のいずれかを含む、請求項７に記載の免疫抑制能に優れた臍帯血免疫抑制細胞の選別方法。
【請求項10】
末梢血単核細胞及び臍帯血免疫抑制細胞は、１：０．２５～１の細胞数の割合で共培養される、請求項７に記載の免疫抑制能に優れた臍帯血免疫抑制細胞の選別方法。
【請求項11】
免疫抑制剤は、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、タクロリムス、マイコフェノリック酸、アザチオプリン、ブレジニン、シロリムス及びエベロリムスからなる群から選ばれる１つ以上である、請求項７に記載の免疫抑制能に優れた臍帯血免疫抑制細胞の選別方法。
【請求項12】
治療有効量の臍帯血免疫抑制細胞を、これを必要とする対象体に投与する段階を含む、炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。
【請求項13】
臍帯血免疫抑制細胞は、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５－及びＨＬＡ－ＤＲＬＯＷを含む細胞表現型を発現するものである、請求項１２に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。
【請求項14】
臍帯血免疫抑制細胞は、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉ、誘導性酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｉＮＯＳ））、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＩＤＯ））を含むＴ細胞抑制物質を発現するものである、請求項１２に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。
【請求項15】
臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦとＳＣＦのサイトカインの組み合わせを含む細胞培養培地で２～７週間培養して誘導されるものである、請求項１２に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。
【請求項16】
ＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカインの組み合わせは、１：０．８～０．３の濃度比で含まれる、請求項１５に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。
【請求項17】
臍帯血免疫抑制細胞は、炎症抑制細胞（Ｍ２マクロファージ）の分化及び移動の増加、伝染性細胞（Ｍ１マクロファージ）の分化及び移動の減少、心機能（ＥＳＶ（ｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）、ＦＳ（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、ＥＦ（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ））改善、心筋梗塞のサイズの減少または心筋梗塞時の心臓への移動性の増加を示す、請求項１２に記載の炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗炎症、抗線維化、心筋梗塞の予防または治療能のある臍帯血免疫抑制細胞の薬剤学的用途に関する。
【背景技術】
【0002】
臍帯血免疫抑制細胞は、強力な免疫抑制効果を有する臍帯血由来分化細胞の集合である。造血分化の様々な段階でマクロファージ(ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ)、樹状細胞(ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ)、顆粒球(ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ)を発達させる造血幹細胞前駆体であり、健康な個体ではこれらの細胞がないが、感染・炎症反応・がん・自己免疫などの病的な状態で末梢血液、リンパ器官、脾臓、がん組織などに蓄積する。ＳＣＨ、ＶＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦなどの促進因子、ＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３などのサイトカイン、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ３（Ｃ３）、シクロオキシゲナーゼ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２）とプロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）などが臍帯血免疫抑制細胞を増殖して活性化させる因子である。
【0003】
臍帯血免疫抑制細胞は、ほとんどが細胞－細胞間の直接接触を通じて免疫抑制作用をすることが知られており、半減期の短いサイトカインなどの物質を分泌して免疫抑制機能を行うことが知られている。現在まで知られている作用物質としては、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉと誘導性酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｉＮＯＳ））、活性酸素物質（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）、ペルオキシナイトライト（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ）などがあり、このうち、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）ＩとｉＮＯＳは、代表的なＴ－細胞抑制物質で、直接的にＴ－細胞の増殖を抑制する一方、ＲＯＳとペルオキシナイトライト（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ）は、Ｔ－細胞受容体の翻訳後の修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を通じて抗原認識能を抑制する。このような臍帯血免疫抑制細胞の機能と作用機序に対する研究に基づき、最近ではこれらの調節を通じて免疫反応の抑制のための新しい治療法を開発しようとする努力が加速化されている。
【0004】
臍帯血免疫抑制細胞を治療剤として開発するためには、臍帯血免疫抑制細胞が体外培養に分化増幅しなければならないが、ヒト由来臍帯血免疫抑制細胞の大量増幅に困難性があるのが実状である。最も大きな障害となる原因は、臍帯血抑制細胞の標準化と安定した培養技術が確立されておらず、その分類基準もあいまいなためである。また、血液内のＣＤ３４陽性細胞があまりにも少量であるため、ＣＤ３４陽性細胞の確保だけでなく、大量生産に多くの困難性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、ヒト由来臍帯血免疫抑制細胞の抗炎症、抗線維化、心筋梗塞の予防または治療的用途を提供することである。
【0006】
本発明の他の目的は、免疫抑制能に優れたヒト由来臍帯血免疫抑制細胞の選別方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記目的を達成するため、本発明は、臍帯血免疫抑制細胞を含む炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物を提供する。
【0008】
本発明は、さらに治療的有効量の臍帯血免疫抑制細胞を、これを必要とする対象体に投与する段階を含む、炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法を提供する。
【0009】
本発明は、さらにＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を区分し、二重ＣＤ１５陽性細胞を陽性対照群としてＣＤ１４＋表現型を発現する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階、
【0010】
ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞に対してＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋の細胞表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞のうちＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階、及び
【0011】
末梢血単核細胞及び臍帯血免疫抑制細胞を０．１２５～２μl／ｍＬの濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ細胞の増殖能を確認し、
【0012】
対照群として末梢血単核細胞及び０．０５～３２０ｎｇ／ｍＬ濃度の免疫抑制剤を０．１２５～２μl／ｍＬ濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ細胞の増殖能を確認し、前記臍帯血免疫抑制細胞のＴ細胞増殖能を対照群と比較する段階、
【0013】
前記臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカイン組み合わせを含む細胞培養培地で２～７週間培養して誘導されたものである、免疫抑制能に優れた臍帯血由来の臍帯血免疫抑制細胞の選別方法を提供する。
【発明の効果】
【0014】
本発明は、機能と表現型の分析及び区分基準によって優れた免疫抑制能を有するヒト由来臍帯血免疫抑制細胞を提供する効果がある。
【0015】
本発明の前記機能と表現型の分析及び区分基準によって選別されたヒト由来臍帯血免疫抑制細胞は、炎症抑制細胞（Ｍ２マクロファージ）の分化及び移動増加、炎症誘発細胞（Ｍ１マクロファージ）の分化及び移動減少、心機能（ＥＳＶ（ｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）、ＦＳ（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、ＥＦ（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ））の改善、心筋梗塞のサイズの減少または心筋梗塞時の心臓への移動性の増加を通じて炎症、線維化、心筋梗塞の予防または治療のための新しい細胞治療剤として使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図5】図５は、ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性対照群（遺伝子強化されたＫ５６２細胞株 (Genetically modified K562 cell line) 及び樹状細胞）を用いたＨＬＡ－ＤＲ表現型による臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の選別結果を示す。
【図9】図９は、臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）は、心筋梗塞部位のサイズ変化（抗繊維化：ｉｎｆａｒｔ ｓｉｚｅ）及び心機能指標（ＥＳＶ（ｅｎｄｓｙｓｔｏｌｉｃ ｖｏｌｕｍｅ）、ＦＳ（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、ＬＶＥＦ（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ））改善効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【0018】
本発明は、臍帯血免疫抑制細胞を含む炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物に関する。
【0019】
本発明の臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカインの組み合わせを含む細胞培養培地で一定時間培養して誘導されたものであってもよい。
【0020】
前記ＣＤ３４陽性細胞は、通常の分離方法を通じて分離したものであってもよく、例えば、ヒト抗－ＣＤ３４抗体を用いて分離したものであってもよい。
【0021】
本発明の臍帯血免疫抑制細胞は、前記ＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦを含む細胞培養培地で２週間～７週間、より具体的には、３週間～６週間培養して増幅及び分化されてもよい。より好ましくは、３週間～６週間維持されてもよいが、これに制限されるものではない。一具体例によれば、３週間～６週間培養時に３０％～９５％のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋発現を有する臍帯血免疫抑制細胞に分化誘導されてもよい。
【0022】
前記細胞培養培地は、動物細胞培養用安全培地であってもよい。例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、αＭＥＭ（αＭｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍなどがあるが、これに制限されるものではない。
【0023】
前記ＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦは、１：０．８～０．３の濃度比で細胞培養培地に添加されてもよい。
【0024】
好ましくは、前記ＧＭ－ＣＳＦは、５０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞培養培地に添加されてもよい。前記ＳＣＦは、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞培養培地に添加されてもよい。前記範囲内の場合、ＣＤ３４＋細胞の増殖が相対的に増加してもよい。一具体例によれば、ＣＤ３４陽性細胞をＧ－ＣＳＦ／ＳＣＦの下で３週間培養する場合、６００倍程度増殖するが、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの下では、１０００～３０００倍の細胞数で増殖されてもよい。
【0025】
前記ＣＤ３４陽性細胞の臍帯血免疫抑制細胞への分化条件は、ＣＯ２培養器で、５～１５％の二酸化炭素の通気量で３５～３７℃で行われてもよいが、これに特に制限されるものではない。
【0026】
前記条件の下で分化誘導及び増殖した臍帯血免疫抑制細胞は、培養初期ＣＤ３４＋細胞数に基づいて１０００～３０００倍の細胞数で増殖されてもよい。
【0027】
本明細書において、用語の「臍帯血免疫抑制細胞（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌ）」は、未成熟な骨髄系細胞で腫瘍や、自己免疫疾患、感染において顆粒球などが完全に分化が行われず、未成熟な状態で存在し、がん患者だけでなく、急性炎症性疾患、外傷、敗血症、寄生虫・真菌感染でも増加することが知られている。臍帯血免疫抑制細胞の機能は、活性化されたＴ細胞を効果的に抑制する役割を果たす。臍帯血免疫抑制細胞がＴ細胞を調節する機序は、酸化窒素合成酵素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）と活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）及びアルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）という酵素が必須アミノ酸であるＬ－アルギニン（Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）の代謝を最大化することでＴ細胞活性を抑制することが知られている。したがって、前記臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞から分化誘導された本発明の臍帯血免疫抑制細胞は、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５－及び設定範囲内、すなわち、３０％以下のＨＬＡ－ＤＲＬＯＷを含む細胞表現型を発現する単核構成（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ）臍帯血免疫抑制細胞であってもよい。本明細書において、前記ＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型の臍帯血免疫抑制細胞とは、ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現量に対して３０％以下の発現量を示す細胞を指す。前記臍帯血免疫抑制細胞は、さらに細胞表面マーカーとしてＰＤＬ－１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ６２L、ＣＸＣＲ４及びＩＣＡＭ－１の発現を含んでもよい。
【0028】
本発明の一具体例によれば、前記臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦの下で６週間培養して細胞表面を染色すると、ＨＬＡ－ＡＢＣ７０％、ＨＬＡ－ＤＲは３０％以下、ＣＤ４５は９０％以上発現され、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせの下で分化誘導された臍帯血免疫抑制細胞と比較して本発明のＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせの下で分化誘導された臍帯血免疫抑制細胞でのみＣＤ８３とＣＤ８０の１０％発現が観察された。ＣＤ８６は、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせによる臍帯血免疫抑制細胞で４０％程度発現されて共刺激分子の低い発現態様を示した。また、ＣＤ４０は、４０％、リンパ球マーカーであるＣＤ１ｄ、ＣＤ３、Ｂ２２０は、５％未満で発現された。Ｔ細胞の増殖や活性化を抑制することが知られているＰＤＬ－１は、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせによって培養された細胞でのみ３０％程度発現された。ＣＤ１３は、膜貫通糖タンパク質であって骨髄前駆体で発現され、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、骨髄細胞のアズール親和性顆粒内のタンパク質であって、両方とも臍帯血免疫抑制細胞で発現されるタンパク質である。ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞で、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞よりもＣＤ１３の発現が有意に増加した。ＭＰＯは、２つのそれぞれ異なる組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞においていずれも９０％以上発現された。
【0029】
また、前記ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞は、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞及びヒト末梢血液由来樹状細胞に対してアルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉ、誘導性酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｉＮＯＳ））、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＩＤＯ））を含むＴ細胞抑制物質の発現が増加している。
【0030】
前記ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞は、同種ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を有意に抑制させて、抗原特異的なＴ細胞免疫反応によるＩＦＮ－γの分泌を強力に減少させる。前記ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞は、ＣＤ４０抗体で刺激を受けたとき、ＩＬ－１０の分泌が有意に増加したことが観察され、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ－βは、ＣＤ４０抗体の刺激の有無に影響を受けずに高く分泌される。また、ＣＤ４Ｔ細胞がインビトロで臍帯血免疫抑制細胞の刺激を受けると、ＦｏｘＰ３を発現するＴｒｅｇ細胞が増加することが知られており、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにより誘導された臍帯血免疫抑制細胞でＣＤ４Ｔ細胞を刺激する場合、ＦｏｘＰ３発現が確認されるが、炎症サイトカインであるＩＬ－１７は、分泌しない。
【0031】
本発明の臍帯血免疫抑制細胞は、一具体例によれば、炎症抑制細胞（Ｍ２マクロファージ）の分化及び移動の増加、伝染性細胞（Ｍ１マクロファージ）の分化及び移動減少、心機能（ＥＳＶ（ｅｎｄ－ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｖｏｌｕｍｅ，収縮機ボリューム）、ＦＳ（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，分画短縮率）、ＥＦ（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ、左心室駆出率））改善、心筋梗塞のサイズの減少または心筋梗塞時の心臓への移動性の増加を通じて炎症、線維化、心筋梗塞の予防または治療のための細胞治療剤として使用されてもよい。
【0032】
本発明の炎症、線維化または心筋梗塞の予防または治療用組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
【0033】
前記薬剤学的に許容可能な担体は、医薬分野で通常使用される担体及びビヒクルを含み、具体的にイオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセリド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンサルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂などを含むが、これに制限されるものではない。
【0034】
また、本発明の組成物は、前記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などをさらに含んでもよい。
【0035】
一態様として、本発明による組成物は、非経口投与のための水溶性溶液として製造してもよく、好ましくは、ハンクス溶液(Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)、リンガー溶液(Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ)または物理的に緩衝された塩水などの緩衝溶液を使用してもよい。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加してもよい。
【0036】
本発明の組成物は、全身系または局所的に投与されてもよく、例えば、経口、非経口、例えば、坐剤、経皮、静脈、腹腔、筋肉内、病変内、鼻腔、脊椎管内投与で投与されてもよく、また、徐放型または連続的または反復的放出のための移植装置を使用して投与されてもよい。投与回数は、所望の範囲内で１日１回、または数回に分けて投与してもよく、投与期間も特に限定されるものではない。
【0037】
また、このような投与のために公知の技術で適切な剤形に製剤化されてもよい。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤または食用担体と混合するか、または硬質または軟質ゼラチンカプセルに密封されるか、または錠剤に圧形して投与してもよい。経口投与用の場合、活性化合物は賦形剤と混合して摂取型錠剤、頬側の錠剤、トロッキー、カプセル、エリクシール、サスペンション、シロップ、ウェハなどの形態で使用されてもよい。注射用、非経口投与用などの各種剤形は、当技術分野で公知の技法または通用する技法に従って製造してもよい。剤形投与は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などを使用してもよい。
【0038】
本発明の組成物の患者への投与量は、患者の身長、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間及び経路、一般的な健康、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの要素によって異なる。通常、臍帯血免疫抑制細胞は、１回投与時、通常、体表面積ｍ２あたり１０９～１０１０細胞前後で投与されてもよい。したがって、一般成人（約６０ｋｇ）を基準として約２×１０１０細胞が投与されることが適切であるが、前記投与量は、上述したように、患者の様々な条件及び併用投与される薬物の種類及び量に応じて変わり得る。したがって、薬学的に活性である本発明の臍帯血免疫抑制細胞は、１０６～１０１０ｃｅｌｌｓ／ｋｇ（体重）の量で投与されてもよく、前記例示範囲の以下または以上の投与も特に前記要素を考慮して投与される。投与法が連続注入であれば、１分あたり体重１ｋｇあたり１０３～１０９細胞単位の範囲内でなければならない。
【0039】
本発明は、さらに治療的有効量の臍帯血免疫抑制細胞をこれを必要とする対象体に投与する段階を含む、炎症、線維化または心筋梗塞の治療方法が提供される。
【0040】
本明細書で使用される「治療的有効量(ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ)」とは、炎症、線維化または心筋梗塞を改善、緩和または治療できる程度を意味する。
【0041】
前記個体は、ヒト、イヌ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、モルモット、サル、マウス、ラットなどを含んでもよい。
【0042】
本発明は、さらにＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を区分し、二重ＣＤ１５陽性細胞を陽性対照群としてＣＤ１４＋表現型を発現する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階、
【0043】
ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞に対してＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋の細胞表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞のうち、ＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階、
【0044】
末梢血単核細胞及び臍帯血免疫抑制細胞を０．１２５～２μｌ／ｍＬ濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ－細胞の増殖能を確認し、
【0045】
対照群として末梢血単核細胞及び０．０５～３２０ｎｇ／ｍＬ濃度の免疫抑制剤を０．１２５～２μｌ／ｍＬ濃度の磁性ビーズの下で共培養してＴ細胞の増殖能を確認し、前記臍帯血免疫抑制細胞のＴ細胞増殖能を対照群と比較する段階、
【0046】
前記臍帯血免疫抑制細胞は、ヒト臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＳＣＦのサイトカイン組み合わせを含む細胞培養培地で２～７週間培養して誘導されたものである、免疫抑制能に優れた臍帯血由来の臍帯血免疫抑制細胞の選別方法に関する。
【0047】
本発明の免疫抑制能に優れた臍帯血由来の臍帯血免疫抑制細胞の選別方法は、表現型選別基準、すなわち、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋の細胞表現型及びＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型を有する臍帯血免疫抑制細胞を選別する基準、及びＴ細胞増殖能を確認するための選別基準、すなわち、Ｔ細胞増殖能の確認が容易な磁性ビーズ及び／又は免疫抑制剤の濃度範囲を確認し、これを対照群として末梢血単核細胞と共培養してＴ細胞増殖能を比較することにより、免疫抑制能に優れた臍帯血由来の臍帯血免疫抑制細胞を選別することを特徴とする。
【0048】
したがって、第１の段階は、細胞表現型、すなわち、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋の細胞表現型及びＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型を確認する段階である。
【0049】
前記ＣＤ１５陽性細胞は、顆粒球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）、及びＣＤ１５遺伝子を発現するように遺伝子強化された細胞株 (genetically modified cell line)、例えば、ＣＤ１５ＤＮＡ、ＣＤ１５遺伝子を含むレンチウイルス、ＣＤ１５ＩＶＴ ｍＲＮＡなどを用いて遺伝子強化した細胞株を使用してもよい。
【0050】
前記ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞は、樹状細胞、単核球、及びＨＬＡ－ＤＲ遺伝子を発現するように遺伝子強化した細胞株、例えば、ＨＬＡ－ＤＲ ＤＮＡ、ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子を含むレンチウイルス、ＨＬＡ－ＤＲ ＩＶＴ ｍＲＮＡなどを用いて遺伝子強化したＫ５６２細胞株を使用してもよい。
【0051】
前記ＨＬＡ－ＤＲＬＯＷ表現型は、ＨＬＡ－ＤＲを発現する陽性細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現量に対して３０％以下の発現量を示す臍帯血免疫抑制細胞を意味する。
【0052】
第２の段階は、末梢血単核細胞と磁性ビーズの共培養によるＴ細胞増殖誘導時にＴ細胞増殖能の確認が容易な磁性ビーズと対照群として使用する免疫抑制剤の濃度範囲を特定し、これを対照群として細胞表現型が確認された臍帯血免疫抑制細胞と末梢血単核細胞の共培養によるＴ細胞の増殖能を比較し、Ｔ細胞増殖抑制能に優れた臍帯血免疫抑制細胞を選別する段階である。
【0053】
末梢血単核細胞と共培養する磁性ビーズは、０．１２５～２μｌ／ｍＬの濃度で使用してもよい。前記範囲内の濃度を使用した場合、Ｔ細胞増殖を誘導したときに免疫抑制能分析が最も容易であった。
【0054】
前記末梢血単核細胞と磁性ビーズの共培養によるＴ細胞増殖誘導の際に対照群として使用する免疫抑制剤は、０．０５～３２０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用してもよい。前記範囲内の濃度を使用した場合、Ｔ細胞の増殖を誘導したときに免疫抑制能分析が最も容易であった。
【0055】
前記免疫抑制剤は、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、タクロリムス、マイコフェノリック酸、アザチオプリン、ブレジニン、シロリムス、またはエベロリムスなどから使用してもよい。
【0056】
前記末梢血単核細胞及び臍帯血免疫抑制細胞は、１：０．２５～１の細胞数の割合で共培養されてもよい。
【0057】
以下、本発明による実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が下記の実施例によって制限されるものではない。
【0058】
発明の実施のための形態
＜実施例１＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の誘導及び増殖
互いに異なる個体由来の臍帯血からＣＤ３４＋細胞を分離した後、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）のサイトカインの組み合わせで４８ウェルプレートでＩＭＤＭ培地を用いて１×１０５で培養を開始し、ＣＤ３４＋細胞の増幅を誘導した。
＜実施例１＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の誘導及び増殖
互いに異なる個体由来の臍帯血からＣＤ３４＋細胞を分離した後、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）のサイトカインの組み合わせで４８ウェルプレートでＩＭＤＭ培地を用いて１×１０５で培養を開始し、ＣＤ３４＋細胞の増幅を誘導した。
【0059】
その結果、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせでは、１週目に１０倍以上、２週目に１００倍以上、３週目に１，０００倍以上増幅したのに対し、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせでは３週目に６００倍に増幅した。したがって、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）の組み合わせがより効率的にＣＤ３４＋細胞を増幅させることが分かった。
【0060】
次に、臍帯血からＣＤ３４＋細胞を分離した後、ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＧ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）／ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で６週間培養した後にフローサイトメーターを通じて分析した。Ｌｉｎ－細胞をゲーティングした後にＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋の発現を確認した結果、ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦは、３週間にＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋３０％以上、６週間の長期間培養を通じて９０％程度の臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）群が発現することを確認した。一方、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦは、３週間に１５％程度で発現され、その後は次第に減少した細胞群が観察された。ＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせは、高効率で臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の分化を誘導することを確認した。
【0061】
次に、臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞から分化誘導された臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）において免疫抑制タンパク質の発現を測定した。
【0062】
このために、６週間培養された臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）においてｉＮＯＳ２、アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉ、ＩＤＯの発現を比較した結果、ｉＮＯＳ２とＩＤＯは、Ｇ－ＣＳＦ／ＳＣＦ組み合わせよりもＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦで有意に高く発現されることを観察した。アルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）ＩもＧ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせよりもＧＭ－ＣＳＦ／ＳＣＦの組み合わせにおいて高く発現されたが、２つの組み合わせの間の差は、有意性を示さなかった。
【0063】
＜実施例２＞表現型と機能による臍帯血免疫抑制細胞の区分基準
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）は、表現型と機能による区分基準がまだ確立されていない。したがって、明確な対照群を用いて機能と表現型によって正常な臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を区分し、これを用いて細胞を明確に定義し、その機能を確認した。
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）は、表現型と機能による区分基準がまだ確立されていない。したがって、明確な対照群を用いて機能と表現型によって正常な臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を区分し、これを用いて細胞を明確に定義し、その機能を確認した。
【0064】
（１）Ｔ細胞刺激のための磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ）の濃度差に応じて正常な機能を有する臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を選択するための免疫抑制能分析基準の確立
Ｄｙｎａｂｅａｄを２μｌを用いてＴ細胞を刺激する場合に産生された臍帯血免疫抑制細胞の免疫抑制能を完全に観察することは困難であった。したがって、Ｄｙｎａｂｅａｄに対する適正濃度を確立するために濃度別にＤｙｎａｂｅａｄを用いてＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の増殖の抑制に変化があるかどうかを測定した。具体的にＰＢＭＣは、ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）で標識してＴ細胞を刺激する磁性ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄを２μｌ、１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１２５μｌを用いてＣＢＩＣと１：１、１：０．５、１：０．２５（ＰＢＭＣ：ＣＢＩＣ）比で６日間共培養した。次に、ａｎｔｉ－ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を用いて細胞表面染色後のＴ細胞の増殖能を確認した。
Ｄｙｎａｂｅａｄを２μｌを用いてＴ細胞を刺激する場合に産生された臍帯血免疫抑制細胞の免疫抑制能を完全に観察することは困難であった。したがって、Ｄｙｎａｂｅａｄに対する適正濃度を確立するために濃度別にＤｙｎａｂｅａｄを用いてＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の増殖の抑制に変化があるかどうかを測定した。具体的にＰＢＭＣは、ＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）で標識してＴ細胞を刺激する磁性ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄを２μｌ、１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１２５μｌを用いてＣＢＩＣと１：１、１：０．５、１：０．２５（ＰＢＭＣ：ＣＢＩＣ）比で６日間共培養した。次に、ａｎｔｉ－ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を用いて細胞表面染色後のＴ細胞の増殖能を確認した。
【0065】
図１に示すように、Ｄｙｎａｂｅａｄ０．１２５μｌでＴ細胞増殖を行った時、免疫抑制能分析が最も容易であることを確認した。
【0066】
（２）免疫抑制剤の濃度差に応じて正常な機能を有する臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を選択するための免疫抑制能分析基準の確立
【0067】
Ｄｙｎａｂｅａｄを２μｌを用いてＴ細胞を刺激する場合に対照群として使用されたＲａｐａｍｙｃｉｎとＣＳＡの免疫抑制能を完全に観察することは困難であった。Ｄｙｎａｂｅａｄに対する適正濃度を確立するために濃度別にＤｙｎａｂｅａｄを用いて、ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の増殖の抑制に変化があるかどうかを測定した。具体的には、ＣＢＩＣの免疫抑制能の分析基準を確立するために対照群としてＲａｐａｍｙｃｉｎとＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ（ＣｓＡ）を濃度別（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ；５ｎｇ／ｍＬ～３２０ｎｇ／ｍＬ、ＣｓＡ；０．０５ｎｇ／ｍＬ～３．２ｎｇ／ｍＬ）に連続希釈して使用した。ＰＢＭＣは、ＣＦＳＥで標識してＴ細胞を刺激する磁性ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄを２μｌ、１μｌ、０．５μｌ、０．２５μｌ、０．１２５μｌを用いてＣＢＩＣと１：１、１：０．５、１：０．２５（ＰＢＭＣ：ＣＢＩＣ）比で６日間共培養した。次に、ａｎｔｉ－ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体を用いて細胞表面染色後のＴ細胞の増殖能を確認した。
【0068】
図２に示すように、Ｄｙｎａｂｅａｄ０．１２５μｌでＴ細胞増殖を行ったとき、免疫抑制能分析が最も容易であることを確認した。
【0069】
（３）表現型に応じて正常な臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を選択するための表現型分析基準の確立
６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、ａｎｔｉ－ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、ａｎｔｉ－ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
【0070】
その結果、臍帯血免疫抑制細胞の表現型を確認し、詳細な分析基準が確立された。臍帯血免疫抑制細胞は、大きく２つに分類されるが、顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞（Ｇ－ＣＢＩＣ）または単核球－骨髄性免疫抑制細胞（Ｍ－ＣＢＩＣ）に分類される。顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１４－の表現型を示し、単核球－骨髄性免疫抑制細胞は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５－ＣＤ１４＋の表現型を示すことが知られている。ＣＢＩＣは、共通してＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋の表現型を示し、ＣＤ１５とＣＤ１４の発現により顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞と単核球－骨髄性免疫抑制細胞に区分されてもよい。単核球－骨髄性免疫抑制細胞は、一般に免疫抑制反応が顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞よりも強いと知られている。
【0071】
図３に示すように、実施例で誘導された臍帯血免疫抑制細胞は、骨髄性免疫抑制細胞の共通表現型であるＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋を示し、細部表現型は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋で、単核球－骨髄性免疫抑制細胞の表現型と類似していることを確認した。
【0072】
（４）陽性対照群を用いて臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の中で他の細胞が混在するかどうかを区分する表現型分析基準の確立
ＣＤ１５陽性対照群である顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）とＣＤ１５＋遺伝子強化細胞株、ＣＤ１４陽性対照群である単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）とＣＤ１４＋遺伝子強化細胞株を基準に区分すると、ＣＢＩＣの表現型は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋／ＣＤ１５で確認される。また、ＣＤ１４とＣＤ１５の二重陽性細胞は存在しないことが知られている。したがって、６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、ａｎｔｉ－ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１５抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
ＣＤ１５陽性対照群である顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）とＣＤ１５＋遺伝子強化細胞株、ＣＤ１４陽性対照群である単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）とＣＤ１４＋遺伝子強化細胞株を基準に区分すると、ＣＢＩＣの表現型は、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋／ＣＤ１５で確認される。また、ＣＤ１４とＣＤ１５の二重陽性細胞は存在しないことが知られている。したがって、６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、ａｎｔｉ－ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１５抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
【0073】
図４に示すように、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋細胞は、９３．９～９９．６％レベルであるため、ＣＤ１５＋が混在していないことが確認できる。
【0074】
（５）ＨＬＡ－ＤＲ陽性対照群を用いて正常な臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を単核球と区分して選択するためのＨＬＡ－ＤＲ表現型分析基準の確立
臍帯血免疫抑制細胞の表現型研究は、まだ完璧ではなく、細胞を完全に分類するには困難性があった。顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞は、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）と表現型が類似しており、単核球－骨髄性免疫抑制細胞は、単核球(ｍｏｎｏｃｙｔｅ)と表現型が類似している。
臍帯血免疫抑制細胞の表現型研究は、まだ完璧ではなく、細胞を完全に分類するには困難性があった。顆粒球－骨髄性免疫抑制細胞は、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）と表現型が類似しており、単核球－骨髄性免疫抑制細胞は、単核球(ｍｏｎｏｃｙｔｅ)と表現型が類似している。
【0075】
本発明では、単核球－骨髄性免疫抑制細胞と単核球の表現型をＨＬＡ－ＤＲを高発現する樹状細胞とＫ５６２細胞株を用いてＨＬＡ－ＤＲ陰性の表現型を区分し、これにより単核球と表現型が異なる臍帯血免疫抑制細胞を最終的に製造した。
【0076】
具体的には、抗－ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いて６週間培養したＣＢＩＣ細胞の表面を染色した後、フローサイトメーターを通じて分析した。ＨＬＡ－ＤＲを発現する樹状細胞とＫ５６２細胞株にａｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いて細胞表面を染色した後、対照群として使用した。
【0077】
図５に示すように、対照群より低いＨＬＡ－ＤＲの表現型を確認することができ、これはＭ－ＣＢＩＣの表現型であるＨＬＡ－ＤＲ Ｌｏｗに適していると考えられた。
【0078】
（６）臍帯血免疫抑制細胞のロット別表現型及び品質確認結果
６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、抗ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
６週間培養したＣＢＩＣの表現型を分析するため、抗ＣＤ３３／ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１４抗体を用いて細胞表面染色後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、染色していないＣＢＩＣを対照群として使用した。
【0079】
図６に示すように、ＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋発現率が最小９３．９％最大９９．７０％、中間（平均）９６．９４％で、３９回の測定がいずれも基準値である９０％を上回って再現され、反復的に品質が維持された。
【0080】
（７）臍帯血免疫抑制細胞内に免疫抑制タンパク質であるｉＮＯＳ２、Ａｒｇｉｎａｓｅ １、ＩＤＯの発現確認
６週間培養したＣＢＩＣの細胞内物質を分析するため、Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ ｂｕｆｆｅｒを用いて１０分間３７℃で固定した後、Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを入れて氷上に３０分間静置して細胞外壁に穿孔を誘導した。その後、抗－ｉＮＯＳ２／Ａｒｇｉｎａｓｅ／ＩＤＯ抗体を入れて細胞内染色を行った後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、細胞内に染色抗体を入れていないＣＢＩＣを対照群として使用した。
６週間培養したＣＢＩＣの細胞内物質を分析するため、Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ ｂｕｆｆｅｒを用いて１０分間３７℃で固定した後、Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを入れて氷上に３０分間静置して細胞外壁に穿孔を誘導した。その後、抗－ｉＮＯＳ２／Ａｒｇｉｎａｓｅ／ＩＤＯ抗体を入れて細胞内染色を行った後、フローサイトメーターを通じて分析した。このとき、細胞内に染色抗体を入れていないＣＢＩＣを対照群として使用した。
【0081】
図７に示すように、臍帯血免疫抑制細胞もロット間の差がなく、免疫抑制物質であるアルギナーゼ（Ａｒｇｉｎａｓｅ）Ｉ、誘導性酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｉＮＯＳ））、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＩＤＯ））を発現した。
【0082】
（８）臍帯血免疫抑制細胞の試験管内の免疫抑制能の確認
臍帯血免疫抑制細胞によるヒトヘルパーＴ細胞の増殖抑制機能を分析するために正常成人のＣＦＳＥ（５μＭ濃度利用）が標識されたＣＤ４Ｔ細胞（１×１０５）をＤｙｎａｂｅａｄを用いて９６ウェルプレートで６日間培養した。
臍帯血免疫抑制細胞によるヒトヘルパーＴ細胞の増殖抑制機能を分析するために正常成人のＣＦＳＥ（５μＭ濃度利用）が標識されたＣＤ４Ｔ細胞（１×１０５）をＤｙｎａｂｅａｄを用いて９６ウェルプレートで６日間培養した。
【0083】
図８に示すように、Ｄｙｎａｂｅａｄを通じてヒトヘルパーＴ細胞の増殖が発生したのに対し、臍帯血免疫抑制細胞（１×１０５）が培養されたグループでは、ヘルパーＴ細胞の増殖が抑制された。
【0084】
＜実施例３＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の心筋梗塞部位のサイズ変化（抗線維化）及び心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の心筋梗塞部位の抗線維化と心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果を実験するため、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して心筋梗塞部位をＭＴ染色を通じて心筋梗塞部位のサイズを確認した。また、心臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン固定し、４μｍセクションで切片を作製した後、Ｍａｓｓｏｎ－Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。スライドスキャナーでスキャンした後、ｉａｍｇｅ Ｊで分析した。
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の心筋梗塞部位の抗線維化と心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果を実験するため、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して心筋梗塞部位をＭＴ染色を通じて心筋梗塞部位のサイズを確認した。また、心臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン固定し、４μｍセクションで切片を作製した後、Ｍａｓｓｏｎ－Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。スライドスキャナーでスキャンした後、ｉａｍｇｅ Ｊで分析した。
【0085】
図９に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて臍帯血免疫抑制細胞を投与したマウスで投与しない対照群と比較したとき、心筋梗塞部位のサイズが減少することを確認した。
【0086】
次に、心機能を確認するため、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して心機能を超音波を通じて確認した。ＭＲＩは、ＢｉｏＳｐｅｃ ４７／４０（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行い、二重心電図ＥＣＧ及び呼吸ゲーティングを行った。ＭＲイメージ獲得のために針電極でＥＣＧ信号を得た。内径が７２ｍｍの求積ケージＲＦ共振器（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して信号を送受信し、ＭＲイメージ獲得のために前脚と後脚に固定された針電極でＲ－ｗａｖｅを用いてＥＣＧ信号を得た。イメージングパラメータ：ＦＯＶ＝６０×６０ｍｍ２、マトリックスサイズ＝２５６×２５６、スライス厚＝１．５ｍｍ、スライス数＝１、ＴＲ＝８ｍｓ、ＴＥ＝２．８ｍｓ、ｆｌｉｐ ａｎｇｌｅ＝３０°、平均数＝６、ｔｏｔａｌ ｓｃａｎ ｔｉｍｅ＝３ ｍｉｎ １６ｓ。噴出率（ＥＦ）及び断片低短縮（ＦＳ）は、乳頭筋レベルでＭモード追跡を通じて測定した。
【0087】
図９に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて臍帯血免疫抑制細胞を投与したマウスで投与しない対照群と比較したとき、心機能指標が向上することを確認した。
【0088】
＜実施例４＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の炎症抑制細胞及び伝染性細胞に対する効果
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の炎症抑制細胞及び伝染性細胞
に対する効果を確認した。このために、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して免疫効果マーカーであるＭ１、Ｍ２マクロファージを免疫組織化学技法（ＩＨＣ）で確認した。また、パラフィン包埋切片を脱パラフィン及び再水和(ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ)し、１次抗体ＣＤ６８、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６を４℃でオーバーナイトの間反応させた後、２次抗体ＲＴで１ｈｒ反応させた。ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で確認した（ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ；Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の炎症抑制細胞及び伝染性細胞
に対する効果を確認した。このために、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して免疫効果マーカーであるＭ１、Ｍ２マクロファージを免疫組織化学技法（ＩＨＣ）で確認した。また、パラフィン包埋切片を脱パラフィン及び再水和(ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ)し、１次抗体ＣＤ６８、ｉＮＯＳ、ＣＤ２０６を４℃でオーバーナイトの間反応させた後、２次抗体ＲＴで１ｈｒ反応させた。ＤＡＰＩ染色後、蛍光顕微鏡で確認した（ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ；Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【0089】
図１０に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて臍帯血免疫抑制細胞を投与したマウスで投与しない対照群と比較したとき、Ｍ１（ＣＤ６８＋ｉＮＯＳ）マクロファージの減少及びＭ２（ＣＤ６８＋ＣＤ２０６）マクロファージの増加を確認した。
【0090】
＜実施例５＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を対象体に投与して心筋梗塞部位のサイズの変化（抗繊維化）及び心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を濃度別に対象体に投与し、心筋梗塞部位のサイズ変化（抗線維化）及び心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果を確認した。このために、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して心筋梗塞部位をＭＴ染色を通じて心筋梗塞部位のサイズを確認した。心臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン固定した。 ４μｍのセクションで切片を作製した後、Ｍａｓｓｏｎ－Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。スライドスキャナーでスキャンした後、ｉａｍｇｅ Ｊで分析した。
臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を濃度別に対象体に投与し、心筋梗塞部位のサイズ変化（抗線維化）及び心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）に対する効果を確認した。このために、ＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して心筋梗塞部位をＭＴ染色を通じて心筋梗塞部位のサイズを確認した。心臓組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン固定した。 ４μｍのセクションで切片を作製した後、Ｍａｓｓｏｎ－Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色した。スライドスキャナーでスキャンした後、ｉａｍｇｅ Ｊで分析した。
【0091】
図１１に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて対照群と比較したとき、２×１０６、８×１０６グループ群で心筋梗塞部位のサイズが減少することを確認した。
【0092】
次に、ＬＡＤライゲーションモデルに臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して超音波を行って心機能を確認した。ＭＲＩは、ＢｉｏＳｐｅｃ ４７／４０（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｅｔｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行い、二重心電図ＥＣＧ及び呼吸ゲーティングを行った。ＭＲイメージ獲得のために針電極からＥＣＧ信号を得た。内径７２ｍｍの求積ケージＲＦ共振器（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して信号を送受信した。ＭＲイメージ獲得のために前脚と後脚に固定された針電極でＲ－ｗａｖｅを用いてＥＣＧ信号を得た。イメージングパラメータ：ＦＯＶ＝６０×６０ｍｍ２、マトリックスサイズ＝２５６×２５６、スライス厚＝１．５ｍｍ、スライス数＝１、ＴＲ＝８ｍｓ、ＴＥ＝２．８ｍｓ、ｆｌｉｐ ａｎｇｌｅ＝３０°、平均数＝６、ｔｏｔａｌ ｓｃａｎ ｔｉｍｅ＝３ ｍｉｎ １６ｓ。噴出率（ＥＦ）及び断片低短縮（ＦＳ）は、乳頭筋レベルでＭモード追跡を通じて測定した。
【0093】
図１１に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて臍帯血免疫抑制細胞を投与したマウスで投与しない対照群と比較したとき、２週目に対照群と比較してｌｏｗ（０．５×１０６）、ｍｉｄ（２．０×１０６）、Ｈｉｇｈ（８．０×１０６）グループの心機能指標が向上する傾向を示し、４週目にｌｏｗグループが２週目と比較したとき、心機能指標が低下し、ｍｉｄとｈｉｇｈグループは、維持（２つのグループ間の差はない）される傾向を示した。
【0094】
結論として、臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）を対象体に投与して心筋梗塞部位の抗線維化と心機能指標（ＥＳＶ，ＦＳ，ＥＦ）改善効果を用量依存的に示した。
【0095】
＜実施例６＞臍帯血免疫抑制細胞の生存率確認結果
臍帯血免疫抑制細胞を血管注射して生存率用量反応性を確認するためにＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して生存率を確認した。また、心筋梗塞誘発後、３０日間生存率を確認した。
臍帯血免疫抑制細胞を血管注射して生存率用量反応性を確認するためにＬＡＤライゲーションモデルを確立し、臍帯血免疫抑制細胞を投与した後、投与しない対照群（ＰＢＳ）と比較して生存率を確認した。また、心筋梗塞誘発後、３０日間生存率を確認した。
【0096】
図１２に示すように、心筋梗塞マウスモデルにおいて臍帯血免疫抑制細胞を投与したマウスで投与しない対照群と比較したとき、臍帯血免疫抑制細胞注入群の生存率が高いことを確認した。
【0097】
＜実施例７＞臍帯血免疫抑制細胞（ＣＢＩＣ）の心筋梗塞マウスの心臓への移動性確認結果
ＬＡＤライゲーションモデルに臍帯血免疫抑制細胞を投与し、正常マウスの投与群と比較して移動性を確認した。心筋梗塞及び対照マウスのリンパ節、肺、肝臓、腎臓、脾臓、心臓組織を摘出してｇＤＮＡを抽出した。表１に記載の条件に従って定量ＰＣＲ法でｈｕｍａｎ ＡＬＵ（ＡＬＵ）遺伝子を分析した（順方向プライマー：５’－ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡ－３’、逆方向プライマー：５’－ＡＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴ－３’）。
ＬＡＤライゲーションモデルに臍帯血免疫抑制細胞を投与し、正常マウスの投与群と比較して移動性を確認した。心筋梗塞及び対照マウスのリンパ節、肺、肝臓、腎臓、脾臓、心臓組織を摘出してｇＤＮＡを抽出した。表１に記載の条件に従って定量ＰＣＲ法でｈｕｍａｎ ＡＬＵ（ＡＬＵ）遺伝子を分析した（順方向プライマー：５’－ＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡ－３’、逆方向プライマー：５’－ＡＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴ－３’）。
【0098】
【表1】
【0099】
図１３に示すように、心筋梗塞マウスモデルでは、正常マウスに比べて臍帯血免疫抑制細胞の心臓への移動性が２～３倍高いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0100】
本発明は、炎症、線維症、心筋梗塞の予防または治療の分野に適用しうる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】